WO2022119008A1 - 비 자발적 에멀전 확산법을 이용한 조직 재생용 지지체 조성물의 제조방법 - Google Patents

비 자발적 에멀전 확산법을 이용한 조직 재생용 지지체 조성물의 제조방법 Download PDF

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WO2022119008A1
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freeze
weight
drying
prepared
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김경균
최명
김상진
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(주)리젠바이오참
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    • C08L29/02—Homopolymers or copolymers of unsaturated alcohols
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    • C08L67/04—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids, e.g. lactones

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a support composition for tissue regeneration using a non-spontaneous emulsion diffusion method, and more particularly, it does not use a toxic organic solvent that induces cytotoxicity, and uses the difference in physical energy characteristics between molecules in a polymer. , It relates to a method for preparing a support composition for tissue regeneration using a non-spontaneous emulsion diffusion method for generating particles using non-solvent technology (NST).
  • NST non-solvent technology
  • Tissue engineering uses the correlation between the structure and function of living tissue by integrating and applying the basic concepts and technologies of life science and engineering to create a support similar to living tissue and transplant it back into the body to maintain and restore the function of our body. aim to
  • scaffolding approaches to reconstruct damaged and diseased tissues.
  • Scaffolding technology uses the surface chemical and morphological effects of scaffolds to play an important role in not only the initial recruitment of cells but also differentiation and tissue formation after their migration.
  • an ideal biodegradable polymer scaffold it should be made of a non-toxic, biocompatible material that does not cause blood coagulation or inflammatory reaction after transplantation, and should have mechanical properties that can sufficiently maintain its shape structurally during the cell growth process.
  • the support not only facilitates cell adhesion, but also secures sufficient space between cells, so that oxygen and nutrients are well supplied by the diffusion of body fluids, and new blood vessels are formed smoothly so that cells can grow and differentiate successfully. It must have a structural form.
  • Representative methods for preparing such a polymer support include solvent casting/particulate leaching (SCPL), thermally induced phase separation (TIPS), microsphere sintering, electrospining, hydrodgel method, and the like.
  • SCPL solvent casting/particulate leaching
  • TIPS thermally induced phase separation
  • microsphere sintering microsphere sintering
  • electrospining hydrodgel method, and the like.
  • the scaffolds made with these techniques are used for the regeneration of different tissues, and since the properties required by each tissue are different, it is difficult to apply the scaffold made by one method to multiple tissues.
  • a scaffold made by electrospinning is applied to skin tissue or myocardial tissue, and 3D printing technology or microsphere sintering technology is used to regenerate hard bone tissue.
  • An object of the present invention is to solve the problems of the conventional method for producing biodegradable polymer particles by microsphere sintering and spontaneous emulsion diffusion method, suppress the use of toxic organic solvents, and at the same time reduce the immersion time by water during the manufacturing process.
  • Another object of the present invention is to provide a method for manufacturing a support composition for tissue regeneration using an eco-friendly, non-spontaneous emulsion diffusion method that minimizes the number of polluted water generated during the manufacturing process and prioritizes the stability of the manufacturing space.
  • An object of the present invention is a biocompatible polymer dissolution step of dissolving by applying thermal energy to an amphiphilic biocompatible polymer, a biodegradable polymer particle forming step of mixing a biodegradable polymer in a solution dissolved through the biocompatible polymer dissolving step to form particles, the Non-spontaneous emulsion diffusion method, characterized in that it consists of a centrifugation step of adding purified water to the mixture prepared through the biodegradable polymer particle forming step and centrifuging, and a freeze-drying step of freeze-drying the centrifuged mixture through the centrifugation step It is achieved by providing a method for preparing a support composition for tissue regeneration using
  • the amphiphilic biocompatible polymer is at least one selected from the group consisting of poly(ethyleneoxide-propyleneoxide-ethyleneoxide), [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer and polyvinyl alcohol, and the weight average molecular weight is It is assumed that it is 300 to 100000 Da.
  • the biodegradable polymer is poly-lactic-co-glycolic acid (PLGA), polydioxanone (PDO, PDS), polycaprolactone (PCL), polyhydroxybutyrate ( PHB), polylactic acid (PLA, PLLA, PDLA) and polyglycolic acid (PGA), polyparadioxanonecoepsilonecapronlactone (PDCL), polyglycoliccoepsilonecapronlactone (PGCL) and polyelactic epsilon It shall consist of at least one selected from the group consisting of capronlactone (PLCL).
  • the biodegradable polymer has a particle size of 1 to 300 ⁇ m.
  • the biodegradable polymer reaction step is made by mixing 1200 to 2400 parts by weight of an amphiphilic biocompatible polymer in 100 parts by weight of the biodegradable polymer.
  • the biocompatible polymer reaction step is made at a temperature of 60 to 220 °C, a pressure of -0.01 to 2 m bar, and a stirring speed of 10 to 500 rpm.
  • the biocompatible polymer reaction step is made by mixing 1200 to 2400 parts by weight of an amphiphilic biocompatible polymer with 100 parts by weight of the biodegradable polymer and irradiating ultrasonic waves.
  • the centrifugation step is made by adding 800 to 2000 parts by weight of purified water to 100 parts by weight of the mixture prepared through the biodegradable polymer reaction step.
  • the amphiphilic biocompatible polymer has a mass concentration of 12 to 13% by weight.
  • the centrifugation step is performed at a speed of 3000 to 15000 rpm for 1 to 10 minutes.
  • the hydrogel mixing step of mixing the lyophilized mixture with the hydrogel through the freeze-drying step and freezing and freeze-drying is further performed.
  • the freezing is made at a temperature of -40 to -30 °C, and the freeze-drying is made at a temperature of -30 to -20 °C and -1 m bar or less.
  • the hydrogel is made of at least one selected from the group consisting of sodium carboxymethyl cellulose and its derivatives, hyaluronic acid and its derivatives, dextran and its derivatives.
  • the hydrogel mixing step is made by mixing the lyophilized mixture and the hydrogel in a weight ratio of 1:9 to 9:1.
  • the object of the present invention can also be achieved by providing a soft tissue repair agent comprising a support composition for tissue regeneration prepared by the method for preparing a support composition for tissue regeneration using the non-spontaneous emulsion diffusion method.
  • the method for preparing a support composition for tissue regeneration using a non-spontaneous emulsion diffusion method is a biocompatible polymer under non-solvent temperature characteristics and amphiphilic properties of [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer by applying the molecular arrangement characteristics It exhibits an excellent effect of providing a support composition for tissue regeneration in which both crystalline and amorphous cultures, which exhibit high mechanical strength while reducing hydrolysis time, exist simultaneously.
  • 1 shows a photograph of particle formation when the ratio of terpolymer to PLLA exceeds 1 to 12.
  • FIGS. 2 a and b are photographs showing particle formation when the ratio of terpolymer to PLLA is 1 to 240, and the particle size is 75 ⁇ m or less.
  • 3 a and b are photographs showing particle formation when the ratio of terpolymer to PLLA is 1 to 12, and the particle size is 75 to 180 ⁇ m.
  • Figure 4a is a particle size analysis data when the ratio of the terpolymer to PLLA is 1 to 240.
  • b is the particle size analysis data when the ratio of terpolymer to PLLA is 1:200.
  • c is the particle size analysis data when the ratio of terpolymer to PLLA is 1 to 150.
  • d is the particle size analysis data when the ratio of terpolymer to PLLA is 1 to 100.
  • e is the particle size analysis data when the ratio of terpolymer to PLLA is 1:50.
  • f is the particle size molecular data when the ratio of terpolymer to PLLA is 1 to 12.
  • Figure 5a is data for measuring the dispersion stability of the formulation during the manufacturing process when the ratio of terpolymer to PLLA is 1:240 It is a data for confirming aggregation or flocculation of particles.
  • b is the data for measuring the dispersion stability of the formulation during the manufacturing process when the ratio of terpolymer to PLLA is 1:1. It is a data to confirm aggregation or flocculation.
  • c is data for measuring the dispersion stability of the formulation during the manufacturing process when the ratio of terpolymer to PLLA is 1:1. It is a data to confirm aggregation or flocculation.
  • 6a is an SEM photograph of the particles prepared and measured when the ratio of polyvinyl alcohol to PLLA is 1 to 240.
  • b is an SEM photograph of the particles prepared and measured when the ratio of polyvinyl alcohol to PLLA is 1 to 12.
  • 7a is an SEM photograph of the particles prepared and measured when the ratio of polyvinyl alcohol to PDO is 1 to 240.
  • b is an SEM photograph of the particles prepared and measured when the ratio of polyvinyl alcohol to PDO is 1 to 12.
  • FIG. 8 a is SEM data measured after preparing particles using ultrasonic waves when the ratio of terpolymer to PLLA is 1 to 240.
  • b is SEM data measured after preparing particles using ultrasonic waves when the ratio of terpolymer to PLLA is 1 to 100.
  • c is SEM data measured after preparing particles using ultrasonic waves when the ratio of terpolymer to PLLA is 1 to 12.
  • 9a is an SEM photograph measured after mixing 75 ⁇ m or less of PDO particles and sodium carboxylmethyl cellulose in a ratio of 7 to 3 and freeze-drying.
  • b is an SEM photograph measured after mixing 75 ⁇ m or less of PDO particles and hyaluronic acid in a ratio of 7 to 3 and freeze-drying.
  • c is an SEM photograph measured after mixing PLLA particles of 75 ⁇ m or less with sodium carboxylmethyl cellulose in a ratio of 7 to 3 and freeze-drying.
  • d is an SEM photograph measured after mixing PLLA particles of 75 ⁇ m or less with hyaluronic acid in a ratio of 7 to 3 and freeze-drying.
  • e is an SEM photograph measured after mixing 75 ⁇ m or less of PCL particles and sodium carboxymethyl cellulose in a ratio of 7 to 3 and freeze-drying.
  • f is an SEM photograph measured after mixing 75 ⁇ m or less of PDO particles and hyaluronic acid in a ratio of 7 to 3 and freeze-drying.
  • 11 is an optical micrograph of particles formed when the biodegradable polymer exceeds the ratio presented in the present invention.
  • 13 a is a photograph of the skin surface measurement result after hyaluronic acid injection.
  • b is a photograph of the skin surface measurement result after injection of polylactic acid particles.
  • c is a photograph of the skin surface measurement result after injection of polydioxanone particles.
  • 14 a is a measurement data of skin volume change after injection of hyaluronic acid.
  • b is the measurement data of skin volume change after injection of polylactic acid particles.
  • c is the measurement data of skin volume change after injection of polydioxanone particles.
  • 15A is a photograph of tissue regeneration over time after hyaluronic acid injection. (H&E stain 100 times)
  • b is a picture of tissue regeneration over time after injection of polylactic acid particles. (H&E stain 100 times)
  • c is a picture of tissue regeneration over time after injection of polydioxanone particles. (H&E stain 100 times)
  • 16 is a photograph of tissue formation over time after mixing polydioxanone particles, polyelactic acid particles, and hyaluronic acid in a ratio of 1 to 0.25 to 0.4. (H&E stain 100 times)
  • the method for preparing the support composition for tissue regeneration using the non-spontaneous emulsion diffusion method according to the present invention is a biocompatible polymer dissolution step of dissolving by applying thermal energy to an amphiphilic biocompatible polymer, and biodegradability in a solution dissolved through the biocompatible polymer dissolving step
  • the focus on whether or not particles are formed means that the thermodynamic model is theoretically cited in the equilibrium process.
  • Equation 1 Considering the change in the free energy of a solution that occurs when a virtual solution with radius R moves into the air, the change in Gibbs' free energy ( ⁇ G droplet ) of the solution is expressed by Equation 1.
  • ⁇ G droplet G air (T, P air )-G sol (T,P aco )+(4 ⁇ R 2 )r
  • G air (T, P air ) represents the free energy in air when the temperature is “T” and the pressure is “P air ".
  • G sol (T, Paco ) represents the free energy in solution when the temperature is “T” and the pressure is " Paco ".
  • r means the surface tension of the solution.
  • Equation 2 is theoretically established.
  • ⁇ G droplet -4/3 ⁇ R 3 ( Paco - P air ) + (4 ⁇ R 2 )r
  • the pressure in the air is similar to the vapor pressure of the liquid “(P sat )” and can be defined in the present invention.
  • Equation 3 can be derived as the atomization number (At) by the interaction between pressure (negative pressure) and surface tension.
  • Equation 4 when the ratio presented in Equation 3 is smaller than "1", it becomes possible to generate particles with a radius of "R".
  • the critical condition for liquid formation is applied to the process in which particles of a given size are generated in the present invention, external energy is transmitted and the pressure (negative pressure) in the region close to the fluid-air interface overcomes the fluid-air interface tension. This provides a condition that a part of the fluid can escape into the air. In other words, the larger the pressure (negative pressure) and the smaller the surface tension, the better the granulation progresses. (Equation 4)
  • P 0 denotes an external energy pressure
  • d denotes a distance from external energy
  • ⁇ denotes an attenuation coefficient
  • Equation 5 Equation 5
  • Equation 5 " ⁇ ” is the shear viscosity of the fluid, “ ⁇ ” is the density of the fluid, “f” is the external energy frequency, and “C” is the velocity of external energy passing through the fluid. Particleization of the present invention can be achieved by calculating the damping constant of a given solution using Equation 5.
  • the [PEO n -PPO m -PEO n ] triblock copolymer which is an amphoteric polymer used in the present invention, is affected by particle formation according to the molecular weight, composition, content, temperature and pH of the copolymer.
  • [PEO n -PPO m -PEO n ] When the temperature changes above the critical micelle concentration in the post-washing part, a reversible sol-gel transition occurs depending on the hydration level of the triblock copolymer molecules.
  • the final concentration of the [PEO n -PPO m -PEO n ] triblock copolymer in the water washing process after particle formation should be maintained at 12 to 13 weight percent or less.
  • the elasticity of the surface is increased at the solution-air interface, and the degree of repulsion between molecules varies due to the phase structure difference in each temperature section. is made possible to create
  • the biocompatible polymer dissolution step is a step of dissolving the amphiphilic biocompatible polymer by applying heat energy, and is made by heating the amphiphilic biocompatible polymer to a temperature of 60 to 220 ° C.
  • the amphiphilic biocompatible polymer is poly ( ethyleneoxide-propyleneoxide-ethyleneoxide), [PEOn-PPOm-PEOn] is one or more selected from the group consisting of triblock copolymer and polyvinyl alcohol, and it is preferable to use one having a weight average molecular weight of 300 to 100000 Da.
  • the [PEO n -PPO m -PEO n ] triblock copolymer used in the present invention is a triblock copolymer consisting of a unit structure of polyethylene (PEO) and polypropylene (PPO).
  • PEO polyethylene
  • PPO polypropylene
  • the PEO-PPO-PEO terpolymer having a relatively low content of PEO units and a relatively large weight average molecular weight of the polymer, and a PEO unit having a relatively high weight average molecular weight of the polymer One selected from among the relatively small PEO-PPO-PEO terpolymers or it can be used in combination.
  • amphiphilic polymer used by the present invention is poly(ethyleneoxide-propyleneoxide-ethyleneoxide) or [PEO n -PPO m -PEO n ] triblock copolymer, and its commercial name is Pluronic. It is also called Poloxamer, a name given by Irving Schmolka, who patented the substance in 1973.
  • [PEO n -PPO m -PEO n ] used in the present invention has PPO located in the middle of the structure and PEO is spread on both sides.
  • PPO has less polarity than ethylene oxide (EO), and the polyethylene oxide (PEO) on both sides has a polar structure and forms a hydrophilic part, so that a quasi-hydrophilic part and a hydrophilic part, which are block copolymers, exist at the same time to have amphiphilicity. .
  • [PEO n -PPO m -PEO n ] used in the present invention has slightly different physical properties depending on n and m indicating the length of the hydrophilic part and the semi-hydrophilic part.
  • the part expressed in 3-digit numbers is the part related to the composition, and the value obtained by multiplying the first digit (the first two digits in the case of three digits) by 300 means the approximate molecular weight of the polypropylene oxide block, and the last number multiplied by 10
  • the value means the content of the polyethylene oxide block. Therefore, the molecular weight of the terpolymer to be presented in the present invention is not limitedly expressed, but is attributed to its properties.
  • [PEO n -PPO m -PEO n ] used in the present invention exhibits a micelle structure within an appropriate temperature and concentration range in an aqueous solution state. That is, based on the relative solubility difference between polyethylene oxide and polypropylene oxide, semi-hydrophilic polypropylene oxide is located in the core, and has a spherical shape in which hydrophilic polyethylene oxide is located in the shell side.
  • two different [PEO n -PPO m -PEO n ] triblock copolymers having different mixing ratios of n and m are mixed and used in an appropriate weight ratio.
  • the PEO-PPO-PEO terpolymer typically has an ethylene oxide (Oxyethylene) unit content of 70 to 85% by weight and a weight average molecular weight (Mw) of 9,000 to 15,000 g/mol.
  • ethylene oxide (Oxyethylene) unit content 70 to 85% by weight and a weight average molecular weight (Mw) of 9,000 to 15,000 g/mol.
  • Mw weight average molecular weight
  • a PEO-PPO-PEO terpolymer having a typical ethylene oxide (Oxyethylene) unit content of 76 to 85% by weight and a weight average molecular weight (Mw) of 7,000 to 11,000 g/mol is used.
  • the PEO-PPO-PEO terpolymer is mixed and used in a mixing ratio of 80 to 99% by weight of the first copolymer and 1 to 20% by weight of the second copolymer.
  • polyvinyl alcohol having a melting point of around 200 degrees among biocompatible polymers may be used.
  • polyvinyl alcohol is used to replace [PEO n -PPO m -PEO n ] triblock copolymer Particles are generated when this is done, but there is a problem that leads to a decrease in productivity in the desired shape and yield part.
  • the biodegradable polymer particle forming step is a step of mixing and granulating the biodegradable polymer in the solution dissolved through the biocompatible polymer dissolving step, and 1200 to 2400 parts by weight of the amphiphilic biocompatible polymer is mixed with 100 parts by weight of the biodegradable polymer. It is put into the reactor, and is made at a temperature of 60 to 220° C., a pressure of -0.01 to 2 m bar, and a stirring speed of 10 to 500 rpm.
  • the biodegradable polymer is poly-lactic-co-glycolic acid (PLGA), polydioxanone (PDO, PDS), polycaprolactone (PCL), polyhydroxybutyrate (PHB), polylactic acid (PLA, PLLA, PDLA) and polyglycolic acid (PGA), polyparadioxanonecoypsiloncapronlactone (PDCL), polyglycoliccopsilonecapronlactone (PGCL) and polyelactic epsiloncapronlactone (PLCL) It is preferable that it consists of one or more selected from the group consisting of,
  • the biodegradable polymer used in the present invention has a melting point (Mp) of 100 ⁇ 10°C and a glass transition temperature (Tg) of 50 ⁇ 10°C poly-lactic-co-glycolic acid (PLGA), melting point (Mp) is 110 ⁇ 10°C, glass transition temperature (Tg) is -5 ⁇ 10°C polydioxanone (PDO, PDS), melting point (Mp) is 60 ⁇ 10°C, glass transition temperature (Tg) ) is -60 ⁇ 10°C polycaprolactone (PCL), melting point (Mp) is 175 ⁇ 10°C, glass transition temperature (Tg) is 2 ⁇ 10°C polyhydroxybutyrate (PHB), melting point ( Polylactic acid (PLA, PLLA, PDLA) and polyglycolic acid (Mp) of 175 ⁇ 10°C, glass transition temperature (Tg) of 63 ⁇ 10°C, and melting point (Mp) of 200 ⁇ 10°C It is more preferable to use at least one selected from the group consisting
  • biodegradable polymer of the intermediate material prepared by the above method is preferably formed in a particle size of 1 to 300 ⁇ m.
  • the biodegradable polymer reaction step may consist of mixing 1200 to 2400 parts by weight of the amphiphilic biocompatible polymer with 100 parts by weight of the biodegradable polymer and irradiating ultrasonic waves.
  • the size of the particles is reduced as shown in FIG. 11 . That is, the hydrophobic portion of the [PEO n -PPO m -PEO n ] triblock copolymer is relatively increased, and the repulsive force between particles in the aqueous solution is increased to form fine particles, which makes it impossible to use for the purpose of the present invention.
  • the particle size is relatively increased as shown in FIG. 12 . That is, the hydrophobic portion of the [PEO n -PPO m -PEO n ] triblock copolymer is relatively reduced, and the repulsive force between the particles in the aqueous solution is reduced to form large particles, making it impossible to use for the purpose of the present invention.
  • the centrifugation step is a step of adding purified water to the mixture prepared through the biodegradable polymer reaction step and centrifuging, and 800 to 2000 parts by weight of purified water is added to 100 parts by weight of the mixture prepared through the biodegradable polymer reaction step. , by centrifugation at a speed of 3000 to 15000 rpm for 1 to 10 minutes.
  • the centrifugation step it is preferable to carry out in a state in which the energy source is removed before adding purified water. It is preferable to add purified water in this removed state so that the polymerized polymer mixture can be washed.
  • the content of purified water is 800 parts by weight or more, sedimentation of particles does not occur after particle generation, and although not limited to the above method, it can be obtained by sedimentation of particles within a short time through centrifugation.
  • the freeze-drying step is a step of freeze-drying the mixture centrifuged through the centrifugation step, and consists of a process of freeze-drying the mixture centrifuged through the centrifugation step at -40 degrees or less and -1 m bar, Although not limited to this method, it is most appropriate as a method of minimizing the risk of particles. However, it is okay to dry the particles by a general method implemented in the industry.
  • a hydrogel mixing step of mixing the lyophilized mixture with the hydrogel through the freeze-drying step and freezing and freeze-drying is further performed, the freeze-dried mixture and the hydrogel are 1:9 to 9 It is preferable to be mixed in a weight part of :1.
  • the freezing is made at a temperature of -40 to -30 °C
  • the freeze-drying is preferably made at a temperature of -30 to -20 °C and -1 m bar or less.
  • the hydrogel is made of at least one selected from the group consisting of sodium carboxymethyl cellulose and its derivatives, hyaluronic acid and its derivatives, dextran and its derivatives.
  • Example 9 Preparation of polylactic acid (PLA, PLLA, PDLA) particles
  • Example 10 Preparation of polylactic acid (PLA, PLLA, PDLA) particles
  • PLGA poly-lactic-co-glycolic acid
  • PDO polydioxanone
  • PCL polycaprolactone
  • PHB polyhydroxybutyrate
  • PLB polylactic acid
  • PDA polylactic acid
  • PLLA polylactic LA
  • PDLA polyglycolic acid
  • PGA polyglycolic acid
  • PDCL polyparadioxanonecoipsiloncapronlactone
  • PGCL polyglycoliccopsilonecapronlactone
  • polyvinyl alcohol in 1g of polyelactic epsiloncapronlactone (PLCL) is added and stirred. During stirring, the temperature is maintained at 60 to 220°C, and the pressure is applied at -0.01 to 2mbar. Then, 2L of purified water was added, washed and centrifuged to obtain particles.
  • poly-lactic-co-glycolic acid PLGA
  • polydioxanone PDO, PDS
  • polycaprolactone PCL
  • polyhydroxybutyrate PHB
  • polylactic acid PLA, PLLA, PDLA
  • polyglycolic acid PGA
  • polyparadioxanonecoypsiloncapronlactone PDCL
  • polyglycoliccoepsiloncapronlactone PGCL
  • polyvinyl alcohol in 1g of polyelactic epsiloncapronlactone PLCL
  • the temperature is maintained at 60 to 220°C
  • the pressure is applied at -0.01 to 2mbar.
  • 2L of purified water is added, washed and centrifuged to obtain particles.
  • Example 21 Formulation of polydioxanone particles prepared by NST method
  • Example 22 Formulation of polydioxanone particles prepared by NST method
  • Example 23 Formulation of poly-lactic-co-glycolic acid particles prepared by NST method
  • Poly-lactic-co-glycolic acid particles having a size of 300 ⁇ m or less were mixed with an aqueous solution of hyaluronic acid having an average molecular weight of 10 to 3000 kDa and an aqueous solution of hyaluronic acid in a weight ratio of 1 to 9. After freeze-drying and freeze-drying, an injection-type filler was prepared.
  • Example 24 Formulation of poly-lactic-co-glycolic acid particles prepared by NST method
  • Poly-lactic-co-glycolic acid particles having a size of 300 ⁇ m or less were mixed with an aqueous solution of hyaluronic acid having an average molecular weight of 10 to 3000 kDa and an aqueous solution of hyaluronic acid in a weight ratio of 9 to 1 After freeze-drying and freeze-drying, an injection-type filler was prepared.
  • Example 25 Formulation of polycaprolactone particles prepared by NST method
  • An aqueous solution of hyaluronic acid having an average molecular weight of 10 to 3000 kDa and an aqueous solution of hyaluronic acid having an average molecular weight of 10 to 3000 kDa is mixed with polycaprolactone particles having a size of 300 ⁇ m or less in a weight ratio of 1 to 9, followed by freezing and freeze-drying and injection A type of filler was prepared.
  • Example 26 Formulation of polycaprolactone particles prepared by NST method
  • An aqueous solution of hyaluronic acid having an average molecular weight of 10 to 3000 kDa and an aqueous solution of hyaluronic acid having an average molecular weight of 10 to 3000 kDa is mixed with polycaprolactone particles having a size of 300 ⁇ m or less in a weight ratio of 9 to 1, followed by freezing and freeze-drying and injection A type of filler was prepared.
  • Example 27 Formulation of polyhydroxybutyrate particles prepared by NST method
  • Example 28 Formulation of polyhydroxybutyrate particles prepared by NST method
  • An aqueous solution of hyaluronic acid having an average molecular weight of 10 to 3000 kDa and an aqueous solution of hyaluronic acid having an average molecular weight of 10 to 3000 kDa is mixed with polyhydroxybutyrate particles having a size of 300 ⁇ m or less in a weight ratio of 9 to 1, followed by freezing and freeze-drying.
  • An injection-type filler was prepared.
  • Example 29 Formulation of polylactic acid particles prepared by NST method
  • An aqueous solution of hyaluronic acid having an average molecular weight of 10 to 3000 kDa and an aqueous solution of hyaluronic acid having an average molecular weight of 10 to 3000 kDa is mixed with polylactic acid particles having a size of 300 ⁇ m or less in a weight ratio of 1 to 9, followed by freezing and freeze-drying.
  • An injection-type filler was prepared.
  • Example 30 Formulation of polylactic acid particles prepared by NST method
  • An aqueous solution of hyaluronic acid having an average molecular weight of 10 to 3000 kDa and an aqueous solution of hyaluronic acid having an average molecular weight of 10 to 3000 kDa is mixed with polylactic acid particles having a size of 300 ⁇ m or less in a weight ratio of 9 to 1, followed by freezing and freeze-drying.
  • An injection-type filler was prepared.
  • Example 31 Formulation of polyglycolic acid particles prepared by NST method
  • Example 32 Formulation of polyglycolic acid particles prepared by NST method
  • An aqueous solution of hyaluronic acid having an average molecular weight of 10 to 3000 kDa and an aqueous solution of hyaluronic acid having an average molecular weight of 10 to 3000 kDa is mixed with polyglycolic acid particles having a size of 300 ⁇ m or less in a weight ratio of 9 to 1, followed by freezing and freeze-drying.
  • An injection-type filler was prepared.
  • Example 33 Formulation of polyparadioxanonecoipsiloncapronlactone particles prepared by NST method
  • An aqueous solution of hyaluronic acid having an average molecular weight of 10 to 3000 kDa and an aqueous solution of hyaluronic acid having an average molecular weight of 10 to 3000 kDa is mixed with a weight ratio of particles to pure hyaluronic acid in a weight ratio of 1 to 9 and then frozen And lyophilized to prepare an injection-type filler.
  • Example 34 Formulation of polyparadioxanonecoipsilonecapronlactone particles prepared by NST method
  • An aqueous solution of hyaluronic acid having an average molecular weight of 10 to 3000 kDa and an aqueous solution of hyaluronic acid having an average molecular weight of 10 to 3000 kDa is mixed with a weight ratio of particles to pure hyaluronic acid in a weight ratio of 9 to 1 and then frozen And lyophilized to prepare an injection-type filler.
  • Example 35 Formulation of polyglycolic copsilone capronlactone particles prepared by NST method
  • An injection-type filler was prepared by freeze-drying.
  • Example 36 Polyglycolic copsilone capronlactone prepared by NST method Formulation of particles
  • Example 37 Formulation of polyelastic epsilon capron lactone particles prepared by NST method
  • Example 38 Formulation of polyelastic epsilon capronlactone particles prepared by NST method
  • An aqueous solution of hyaluronic acid having an average molecular weight of 10 to 3000 kDa and an aqueous solution of hyaluronic acid having an average molecular weight of 10 to 3000 kDa is mixed with polyelastic epsilon capronlactone particles having a size of 300 ⁇ m or less in a weight ratio of 9 to 1, followed by freezing and An injection-type filler was prepared by freeze-drying.
  • Example 39 Formulation of polydioxanone particles prepared by NST method
  • Example 40 Formulation of polydioxanone particles prepared by NST method
  • Example 41 Formulation of poly-lactic-co-glycolic acid particles prepared by NST method
  • an aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose having an average molecular weight of 10 to 300 kDa and an aqueous solution of 2 wt After mixing in a weight ratio of , freeze-dried and freeze-dried to prepare an injection-type filler.
  • Example 42 Formulation of poly-lactic-co-glycolic acid particles prepared by NST method
  • an aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose having an average molecular weight of 10 to 300 kDa was added in a weight ratio of 9 to 1 After mixing in a weight ratio of , freeze-dried and freeze-dried to prepare an injection-type filler.
  • Example 43 Formulation of polycaprolactone particles prepared by NST method
  • polycaprolactone particles having a size of 300 ⁇ m or less After mixing the polycaprolactone particles having a size of 300 ⁇ m or less with an aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose having an average molecular weight of 10 to 300 kDa and an aqueous solution of 2 wt.
  • An injection-type filler was prepared by freeze-drying and freeze-drying.
  • Example 44 Formulation of polycaprolactone particles prepared by NST method
  • polycaprolactone particles having a size of 300 ⁇ m or less After mixing the polycaprolactone particles having a size of 300 ⁇ m or less with an aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose having an average molecular weight of 10 to 300 kDa and an aqueous solution of 2 wt.
  • An injection-type filler was prepared by freeze-drying and freeze-drying.
  • Example 45 Formulation of polyhydroxybutyrate particles prepared by NST method
  • An aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose having an average molecular weight of 10 to 300 kDa and an aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose having an average molecular weight of 10 to 300 kDa was mixed with a polyhydroxybutyrate particle having a size of 300 ⁇ m or less in a weight ratio of 1 to 9 by weight ratio of the particles to pure sodium carboxymethyl cellulose. After freeze-drying and freeze-drying, an injection-type filler was prepared.
  • Example 46 Formulation of polyhydroxybutyrate particles prepared by NST method
  • An aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose having an average molecular weight of 10 to 300 kDa and an aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose having an average molecular weight of 10 to 300 kDa is mixed with a polyhydroxybutyrate particle having a size of 300 ⁇ m or less in a weight ratio of 9 to 1 by weight ratio of the particles to pure sodium carboxymethyl cellulose After freeze-drying and freeze-drying, an injection-type filler was prepared.
  • Example 47 Formulation of polylactic acid particles prepared by NST method
  • Example 48 Formulation of polylactic acid particles prepared by NST method
  • An aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose having an average molecular weight of 10 to 300 kDa and an aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose having an average molecular weight of 10 to 300 kDa was mixed with polylactic acid particles having a size of 300 ⁇ m or less in a weight ratio of 9 to 1 by weight ratio of particles to pure sodium carboxymethyl cellulose. After freeze-drying and freeze-drying, an injection-type filler was prepared.
  • Example 49 Formulation of polyglycolic acid particles prepared by NST method
  • Example 50 Formulation of polyglycolic acid particles prepared by NST method
  • An aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose having an average molecular weight of 10 to 300 kDa and an aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose having an average molecular weight of 10 to 300 kDa was mixed with a polyglycolic acid particle having a size of 300 ⁇ m or less in a weight ratio of 9 to 1 by weight ratio of the particles to pure sodium carboxymethyl cellulose. After freeze-drying and freeze-drying, an injection-type filler was prepared.
  • Example 51 Formulation of polyparadioxanonecoipsilonecapronlactone particles prepared by NST method
  • An aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose having an average molecular weight of 10 to 300 kDa and an aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose having an average molecular weight of 10 to 300 kDa was added to the polyparadioxanone copsilon capron lactone particles having a size of 300 ⁇ m or less, and the weight ratio of the particles to pure sodium carboxymethyl cellulose was 1 to 9 by weight After mixing in a ratio, freeze-dried and freeze-dried to prepare an injection-type filler.
  • Example 52 Formulation of polyparadioxanonecoipsilonecapronlactone particles prepared by NST method
  • An aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose having an average molecular weight of 10 to 300 kDa and an aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose having an average molecular weight of 10 to 300 kDa was added to the polyparadioxanone coipsilone capron lactone particles having a size of 300 ⁇ m or less.
  • the weight ratio of the particles to pure sodium carboxymethyl cellulose was 9 to 1 After mixing in a ratio, freeze-dried and freeze-dried to prepare an injection-type filler.
  • Example 53 Formulation of polyglycolic copsilone capronlactone particles prepared by NST method
  • An aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose having an average molecular weight of 10 to 300 kDa and an aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose having an average molecular weight of 10 to 300 kDa was added to the polyglycolic copsilone capronlactone particles having a size of 300 ⁇ m or less.
  • the weight ratio of the particles to pure sodium carboxymethyl cellulose was 1 to 9 After mixing, freeze-drying and freeze-drying were performed to prepare an injection-type filler.
  • Example 54 Polyglycolic copsilone capronlactone prepared by NST method Formulation of particles
  • Example 55 Formulation of polyelactic epsilon capronlactone particles prepared by NST method
  • An aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose having an average molecular weight of 10 to 300 kDa and an aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose having an average molecular weight of 10 to 300 kDa was added to the polyelactic epsilon capronlactone particles having a size of 300 ⁇ m or less.
  • the weight ratio of the particles to pure sodium carboxymethyl cellulose was 1 to 9 After mixing, freeze-drying and freeze-drying were performed to prepare an injection-type filler.
  • Example 56 Polyelactic epsilon capronlactone prepared by NST method Formulation of particles
  • An aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose having an average molecular weight of 10 to 300 kDa and an aqueous solution of sodium carboxyl methyl cellulose having an average molecular weight of 10 to 300 kDa was added to the polyelactic epsilon capron lactone particles having a size of 300 ⁇ m or less. After mixing, freeze-drying and freeze-drying were performed to prepare an injection-type filler.
  • Example 57 Formulation of polydioxanone particles prepared by NST method
  • Example 58 Formulation of polydioxanone particles prepared by NST method
  • Example 59 Formulation of poly-lactic-co-glycolic acid particles prepared by NST method
  • Poly-lactic-co-glycolic acid particles having a size of 300 ⁇ m or less were mixed with an aqueous solution of dextran having an average molecular weight of 10 to 1000 kDa in a 2 weight percent weight ratio of 1 to 9 in a weight ratio of particles to pure dextran. After freeze-drying and freeze-drying, an injection-type filler was prepared.
  • Example 60 Formulation of poly-lactic-co-glycolic acid particles prepared by NST method
  • Poly-lactic-co-glycolic acid particles having a size of 300 ⁇ m or less were mixed with an aqueous solution of dextran having an average molecular weight of 10 to 1000 kDa and an aqueous solution of 2 wt. After freeze-drying and freeze-drying, an injection-type filler was prepared.
  • Example 61 Formulation of polycaprolactone particles prepared by NST method
  • Polycaprolactone particles having a size of 300 ⁇ m or less are mixed with an aqueous solution of dextran having an average molecular weight of 10 to 1000 kDa and an aqueous solution of 2 wt.
  • a type of filler was prepared.
  • Example 62 Formulation of polycaprolactone particles prepared by NST method
  • Polycaprolactone particles having a size of 300 ⁇ m or less are mixed with an aqueous solution of dextran having an average molecular weight of 10 to 1000 kDa and an aqueous solution of 2 wt.
  • a type of filler was prepared.
  • Example 63 Formulation of polyhydroxybutyrate particles prepared by NST method
  • Polyhydroxybutyrate particles having a size of 300 ⁇ m or less are mixed with an aqueous solution of dextran having an average molecular weight of 10 to 1000 kDa and an aqueous solution of 2 wt.
  • An injection-type filler was prepared.
  • Example 64 Formulation of polyhydroxybutyrate particles prepared by NST method
  • Polyhydroxybutyrate particles having a size of 300 ⁇ m or less are mixed with an aqueous solution of dextran having an average molecular weight of 10 to 1000 kDa and an aqueous solution of 2 wt.
  • An injection-type filler was prepared.
  • Example 65 Formulation of polylactic acid particles prepared by NST method
  • Polylactic acid particles having a size of 300 ⁇ m or less are mixed with an aqueous solution of dextran having an average molecular weight of 10 to 1000 kDa and an aqueous solution of 2 wt.
  • An injection-type filler was prepared.
  • Example 66 Formulation of polylactic acid particles prepared by NST method
  • Polylactic acid particles having a size of 300 ⁇ m or less are mixed with an aqueous solution of dextran having an average molecular weight of 10 to 1000 kDa and an aqueous solution of 2 wt.
  • An injection-type filler was prepared.
  • Example 67 Formulation of polyglycolic acid particles prepared by NST method
  • Polyglycolic acid particles having a size of 300 ⁇ m or less are mixed with an aqueous solution of dextran having an average molecular weight of 10 to 1000 kDa and an aqueous solution of 2 wt.
  • An injection-type filler was prepared.
  • Example 68 Formulation of polyglycolic acid particles prepared by NST method
  • Polyglycolic acid particles having a size of 300 ⁇ m or less are mixed with an aqueous solution of dextran having an average molecular weight of 10 to 1000 kDa and an aqueous solution of 2 wt.
  • An injection-type filler was prepared.
  • Example 69 Formulation of polyparadioxanonecoipsiloncapronlactone particles prepared by NST method
  • An aqueous solution of dextran having an average molecular weight of 10 to 1000 kDa and an aqueous solution of 2 weight percent of polyparadioxanone copsilon capronlactone having a size of 300 ⁇ m or less is mixed with a weight ratio of particles to pure dextran in a weight ratio of 1 to 9 and then frozen And lyophilized to prepare an injection-type filler.
  • Example 70 Formulation of polyparadioxanonecoipsiloncapronlactone particles prepared by NST method
  • Polyparadioxanone copsiloncapronlactone particles having a size of 300um or less are mixed with an aqueous solution of dextran having an average molecular weight of 10 to 1000 kDa in a 2 weight percentage weight ratio of particles to pure dextran in a weight ratio of 9 to 1 and then frozen And lyophilized to prepare an injection-type filler.
  • Example 71 Formulation of polyglycolic copsilone capronlactone particles prepared by NST method
  • Example 72 polyglycolic copsilone capronlactone prepared by NST method Formulation of particles
  • Example 73 Formulation of polyelastic epsilon capronlactone particles prepared by NST method
  • An aqueous solution of dextran having an average molecular weight of 10 to 1000 kDa and an aqueous solution of dextran having an average molecular weight of 10 to 1000 kDa is mixed in a weight ratio of 1 to 9 in a weight ratio of 1 to 9, and then frozen and An injection-type filler was prepared by freeze-drying.
  • Example 74 Polyelactic epsilon capronlactone prepared by NST method Formulation of particles
  • Polyelactic epsilon capronlactone particles having a size of 300 ⁇ m or less are mixed with an aqueous solution of dextran having an average molecular weight of 10 to 1000 kDa and an aqueous solution of 2 wt. And lyophilized to prepare an injection-type filler.
  • Test Example 1 Particle size analysis experiment according to mixing ratio and type of biodegradable polymer
  • Poly-lactic-co-glycolic acid (PLGA), polydioxanone (PDO, PDS), polycaprolactone (PCL), polyhydroxybutyrate (PHB), polylactic acid (PLA, PLLA, PDLA) and polyglycolic acid (PGA), polyparadioxanonecoipsiloncapronlactone (PDCL), polyglycoliccoepsiloncapronlactone (PGCL), and biodegradable polymers of polyelactic epsiloncapronlactone (PLCL) in Example 1
  • Table 1 shows the average size of the particles prepared by the method of Example 20 through a particle size analyzer. In the experimental method, 1 g of each particle was taken and dispersed in a 0.1% polyvinyl alcohol aqueous solution at a ratio of 1% to measure the particle size.
  • Example 1 As shown in Table 1, Example 1, Example 3, Example 5, Example 7, Example 9, Example 11, Example 13, Example 15, Example 17, as the content of the biodegradable polymer increased, The particle size is shown to decrease. However, the difference in particle size according to the type of biodegradable polymer is not significant. In Example 2, Example 4, Example 6, Example 8, Example 10, Example 12, Example 14, Example 16, and Example 18, when the content of the biodegradable polymer was relatively increased, the particle size was also seems to increase However, the difference in particle size according to the type of biodegradable polymer is not significant.
  • Examples 19 to 20 showed that the size of the particles was increased compared to the somewhat [PEO n -PPO m -PEO n ] triblock copolymer, and the size distribution of the particles was also wide at the same time as the measurement by preparing biodegradable particles using polyvinyl alcohol. Controlling the size of is not as easy as the above method.
  • Test Example 2 Morphological observation experiment of particles according to the mixing ratio and the type of biodegradable polymer prepared in Test Example 1
  • micro-particles prepared in each example were visually analyzed for the morphology of the particles using an optical microscope with a magnification of 10.
  • Example 2 in the existing Examples 1 to 18, all shapes are spherical. However, when biodegradable particles were prepared using polyvinyl alcohol, in Example 19, partially amorphous particles were formed, and in Example 20, plate-shaped particles were generated.
  • Test Example 3 Test on whether support is formed according to the mixing ratio of particles and hydrogel according to the mixing ratio and the type of biodegradable polymer prepared in Test Example 1
  • This test example is to test whether it is possible to mold into a desired shape through the mixing process. First, the particles and hydrogel are mixed and put into a molding mold, then rapidly frozen and freeze-dried at -80 degrees for 24 hours or more to change the shape and This is an experiment to confirm retention.
  • Test Example 4 In vitro decomposition behavior test when polydioxanone (PDO) and polyelactic acid (PLLA) prepared in Test Example 3 were prepared in a weight ratio of 3 to 7 with hyaluronic acid
  • This test is an experiment on the decomposition behavior of polydioxanone/hyaluronic acid complex and polyelactic acid/hyaluronic acid complex.
  • the experimental method is 3cm (horizontal) ⁇ 3cm (length) ⁇ 1cm ( Height) is 3cm 3 of a sponge-type support prepared and measured for 1 day, 7 days, 14 days, and 30 days in an incubator at 36 ° C.
  • polydioxanone which has a relatively superior decomposition period, acts as a main support
  • polydioxanone which has a short decomposition period, is decomposed in vivo, and at the same time stimulates the collagen layer, so tissue regeneration is expected to be more stable.
  • Test Example 5 Polydioxanone (PDO), polylactic acid (PLLA), and in vivo skin surface and volumetric comparison experiment with hyaluronic acid.
  • This experiment is an experiment to see the results on the safety, durability, and biodegradability of each polydioxanone, polyelactic acid, and hyaluronic acid. It is a basic experiment to predict the efficacy of mixing the above three components in the future.
  • This experiment is a polydioxanone 10 to 75um particles, polylactic acid produced by the NST method. After each injection of 10 to 75um particles and an aqueous solution of 2% by weight of hyaluronic acid with a molecular weight of 1200kDa, safety, durability, and biodegradability were measured through PRimoslite three-dimensional optical skin surface measurement and volume measurement.
  • the volume change of hyaluronic acid continued to increase until the 4th week, and then gradually decreased, and the polyelactic acid particles and polydioxanone particles gradually decreased over time. And the volume of polydioxanone particles increased by the filler after 12 weeks was not confirmed.
  • Test Example 6 Comparative experiment for histological evaluation in vivo with polydioxanone (PDO), polylactic acid (PLLA), and hyaluronic acid.
  • polydioxanone 10 to 75um particles, polylactic acid produced by the NST method This is an experiment for systematic evaluation over time after each injection of an aqueous solution of 2% by weight of hyaluronic acid having a molecular weight of 10 to 75um and a molecular weight of 1200kDa.
  • tissue was extracted according to the lapse of time, stained by MT (Masson's Trichrome) method, and then infiltrated collagen fibers by filler injection were confirmed. It has the same purpose as the Verhoeff-Van Gieson stain for identifying collagen fibers, but because it is easy to distinguish between collagen fibers and intercellular fibers, collagen fibers and nuclei are stained blue, while cytoplasm, keratin, muscle fibers, and intra-cellular fibers are colored red. dyed All tissue slides were visually measured using an optical microscope at 100x magnification.
  • collagen fibers increased between the particles of each filler from 4 weeks after injection of all hyaluronic acid, polydioxanone particles, and polyelactic acid particles.
  • Test Example 7 Polydioxanone (PDO), polyelactic acid (PLLA), histological evaluation experiments according to time in vivo of a mixture of hyaluronic acid.
  • polydioxanone 10 to 75um particles, polylactic acid produced by the NST method This is an experiment for systematic evaluation over time after injecting a mixture of hyaluronic acid with a particle size of 10 to 75um and a molecular weight of 1200kDa.
  • the proportion of the mixture used in this experiment is polydioxanone particles.
  • Hyaluronic acid was used by mixing a ratio of 1 to 0.25 to 0.4 parts by weight.
  • tissue was extracted according to the lapse of time, stained by MT (Masson's Trichrome) method, and then infiltrated collagen fibers by filler injection were confirmed. It has the same purpose as the Verhoeff-Van Gieson stain for identifying collagen fibers, but because it is easy to distinguish between collagen fibers and intercellular fibers, collagen fibers and nuclei are stained blue, while cytoplasm, keratin, muscle fibers, and intra-cellular fibers are colored red. dyed All tissue slides were visually measured at 100x magnification using an optical microscope.
  • the initial increase rate was similar to that of using each component alone, and the biodegradation ability was average. In addition, it was proved to be excellent in the tissue collagen layer regeneration effect.
  • crystalline culture and amorphous culture exhibiting high mechanical strength while reducing hydrolysis time exist simultaneously, and thus, a support composition for tissue regeneration with high added value can be used in the field.

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Abstract

본 발명은 비 자발적 에멀전 확산법을 이용한 조직 재생용 지지체 조성물의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 비 용매하에서 생체적합성 고분자 각각의 온도 특성 및 양친성을 가진 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer의 분자배열특성을 응용하여 가수분해시간을 감소시키면서도 높은 기계적 강도를 나타내는 결정성 배양 및 비 결정성배양이 동시에 존재하는 조직 재생용 지지체 조성물을 제공한다.

Description

비 자발적 에멀전 확산법을 이용한 조직 재생용 지지체 조성물의 제조방법
본 발명은 비 자발적 에멀전 확산법을 이용한 조직 재생용 지지체 조성물의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 세포독성을 유발하는 독성 유기 용매를 사용하지 않고 고분자 내 분자상호간의 물리학적인 에너지 특성 차이를 이용하며, 무용매기술(NST:Non-Solvent Technology)을 이용하여 입자를 생성하는 비 자발적 에멀전 확산법을 이용한 조직 재생용 지지체 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
조직공학은 생명과학 및 공학의 기본 개념과 기술을 통합 응용하여 생체조직의 구조와 기능 사이의 상관관계를 활용하여 생체조직과 유사한 지지체를 만들어 다시 체내로 이식하여 우리 몸의 기능을 유지, 복원하는 것을 목적으로 한다.
최근 조직 재생 분야는 손상되고 병든 조직을 재건하기 위한 스케폴딩 접근법을 활용하고 있다. 스케폴딩 기술이란 지지체의 표면 화학 및 형태학적 효과를 이용하여 세포의 초기 가입(recruitment) 뿐만 아니라 이들의 이동 이후의 분화 및 조직 형성에 있어 중요한 역할을 한다. 이상적인 생분해성 고분자 지지체의 경우 이식 후 혈액응고나 염증반응이 일어나지 않는 무독성의 생체 적합성을 갖는 물질로 이루어져야 하고, 세포의 성장과정에서 구조적으로 그 형태를 충분히 유지할 수 있는 기계적인 물성을 가져야 한다. 또한 지지체는 세포의 접착이 잘 일어날 뿐 아니라 세포와 세포 사이에 충분한 공간이 확보되어 체액의 확산에 의해 산소나 영양분의 공급이 잘 일어나고, 신생 혈관 형성도 원활히 이루어져서 성공적으로 세포가 성장, 분화할 수 있는 구조적 형태를 가져야 한다.
이러한 고분자 지지체를 제조하기 위한 대표적인 방법으로 solvent casting/particulate leaching(SCPL), thermally induced phase separation(TIPS), microsphere sintering, electrospining, hydrodgel 법 등의 방법이 있다.
이들 기술로 만들어진 지지체는 각기 다른 조직의 재생을 위해서 사용되며 각각의 조직들이 요구하는 특성이 다르기 때문에 하나의 방법으로 만들어진 지지체를 여러 조직에 적용시키기는 어렵다. 그 예로 전기방사법으로 만들어진 지지체는 피부조직이나 심근조직에 적용되고, 3D 프린팅 기술이나 마이크로입자 소결법(microsphere sintering) 기술은 단단한 뼈조직의 재생을 위해 사용되고 있다.
이와 같은 마이크로입자 소결법으로 지지체를 제조하는 방법에서 지지체 입자를 열로 소결하여 제조할 경우 입자의 표면을 제어하기가 어렵고 생분해성 고분자들의 분해온도 이상까지 올라가기 때문에 생분해성 고분자의 고유의 물리적 성질이 바뀔 수 있는 단점이 있다.
생분해성 고분자 마이크로 입자 소결법의 다른 방법인 유기용매로 입자를 소결하는 방법은 고분자를 녹이는 용매와 고분자를 녹이지 못하는 비 용매를 적절한 비율로 혼합하여 마이크로 입자를 침수시키면, 상기 용매에 의하여 고분자 입자의 표면이 녹게 되어 주변의 입자들과 붙게 되면서 비용매 보다 끊는점이 낮아 더 빨리 증발하게 되고, 용매가 증발하게 되면 비용매에 의해서 더 이상 입자들은 녹지 못하고 입자들은 단단하게 소결되는 원리에 의한다. 그러나 이와 같은 유기 용매로 입자를 소결하는 방법의 경우 대부분의 독성 유기용매가 오히려 입자 표면에 영향을 주거나 잔류 독성 유기용매가 입자내부에 존재하는 가능성도 있다. 또한 입자의 형태 및 크기도 제어하지 못하는 문제점이 발생된다. 그리고 상기의 문제를 해결하기 위해 유기 용매에 침수시키는 시간을 줄이게 되면 생분해성 고분자의 물리적 성질 및 형태학적인 모폴로지에 영향을 주어 최종적으로 입자와 입자가 서로 응집되는 현상이 발생하는 단점이 있다. 이러한 방법또한 입자 내부에 독성 유기용매가 잔류하는 문제점이 발생한다.
본 발명의 목적은 종래 마이크로 입자 소결법(microsphere sintering) 및 자발적 에멀젼 확산법에 의한 생분해성 고분자 입자의 제조 방법의 문제점을 해결하고, 독성 유기용매의 사용을 억제시키는 동시에 제조과정 중 물에 의한 침수 시간을 줄여 가수분해를 최소화 시키면서 생분해성 고분자의 초기 특성을 유지하여 입자를 제조할 수 있는 비 자발적 에멀전 확산법을 이용한 조직 재생용 지지체 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 제조과정에서 발생되는 오염수를 최소화 하는 동시에 제조공간의 안정성을 최우선으로 하는 친환경적인 비 자발적 에멀전 확산법을 이용한 조직 재생용 지지체 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 양친성 생체적합성 고분자에 열에너지를 가하여 용해시키는 생체적합성고분자용해단계, 상기 생체적합성고분자용해단계를 통해 용해된 용액에 생분해성 고분자를 혼합하여 입자화시키는 생분해성고분자입자화단계, 상기 생분해성고분자입자화단계를 통해 제조된 혼합물에 정제수를 투입하고 원심분리하는 원심분리단계 및 상기 원심분리단계를 통해 원심분리된 혼합물을 동결건조하는 동결건조단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 비 자발적 에멀전 확산법을 이용한 조직 재생용 지지체 조성물의 제조방법을 제공함에 의해 달성된다.
본 발명의 바람직한 특징에 따르면, 상기 양친성 생체적합성 고분자는 poly(ethyleneoxide-propyleneoxide-ethyleneoxide), [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer 및 폴리비닐알코올로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상이며, 중량평균분자량이 300 내지 100000Da인 것으로 한다.
본 발명의 더 바람직한 특징에 따르면, 상기 생분해성 고분자는 폴리-락틱-코-글리콜릭 액시드(PLGA), 폴리디옥사논 (PDO, PDS), 폴리카프로락톤 (PCL), 폴리하이드록시부티레이트 (PHB), 폴리락틱액시드(PLA, PLLA,PDLA) 및 폴리글리콜릭액시드(PGA), 폴리파라디옥사논코입실론카프론락톤(PDCL), 폴리글리콜릭코입실론카프론락톤(PGCL) 및 폴리엘락틱입실론카프론락톤(PLCL)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로 이루어지는 것으로 한다.
본 발명의 더욱 바람직한 특징에 따르면, 상기 생분해성 고분자는 입자크기가 1 내지 300㎛인 것으로 한다.
본 발명의 더욱 더 바람직한 특징에 따르면, 상기 생분해성고분자반응단계는 생분해성 고분자 100 중량부에 양친성 생체적합성 고분자 1200 내지 2400 중량부를 혼합하여 이루어지는 것으로 한다.
본 발명의 더욱 더 바람직한 특징에 따르면, 상기 생체적합성고분자반응단계는 60 내지 220℃의 온도와 -0.01 내지 2m bar의 압력 및 10 내지 500rpm의 교반속도로 이루어지는 것으로 한다.
본 발명의 더욱 더 바람직한 특징에 따르면, 상기 생체적합성고분자 반응단계는 생분해성 고분자 100 중량부에 양친성 생체적합성 고분자 1200 내지 2400 중량부를 혼합하고 초음파를 조사하여 이루어지는 것으로 한다.
본 발명의 더욱 더 바람직한 특징에 따르면, 상기 원심분리단계는 상기 생분해성고분자반응단계를 통해 제조된 혼합물 100 중량부에 정제수 800 내지 2000 중량부를 투입하여 이루어지는 것으로 한다.
본 발명의 더욱 더 바람직한 특징에 따르면, 상기 양친성 생체적합성 고분자는 질량농도가 12 내지 13 중량%인 것으로 한다.
본 발명의 더욱 더 바람직한 특징에 따르면, 상기 원심분리단계는 3000 내지 15000rpm의 속도로 1 내지 10분 동안 이루어지는 것으로 한다.
본 발명의 더욱 더 바람직한 특징에 따르면, 상기 동결건조단계 이후에는 동결건조단계를 통해 동결건조된 혼합물을 하이드로겔과 혼합하고 동결 및 동결건조하는 하이드로겔혼합단계가 더 진행되는 것으로 한다.
본 발명의 더욱 더 바람직한 특징에 따르면, 상기 동결은 -40 내지 -30℃의 온도로 이루어지며, 상기 동결건조는 -30 내지 -20℃의 온도와 -1m bar 이하에서 이루어지는 것으로 한다.
본 발명의 더욱 더 바람직한 특징에 따르면, 상기 하이드로겔은 소듐카르복실메틸셀룰로오스 및 그 유도체, 히알루론산 및 그 유도체, 덱스트란 및 그 유도체로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로 이루어지는 것으로 한다.
본 발명의 더욱 더 바람직한 특징에 따르면, 상기 하이드로겔혼합단계는 동결건조된 혼합물과 하이드로겔이 1:9 내지 9:1의 중량부로 혼합되어 이루어지는 것으로 한다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 비 자발적 에멀전 확산법을 이용한 조직 재생용 지지체 조성물의 제조방법으로 제조되는 조직 재생용 지지체 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 연조직 수복제를 제공함에 의해서도 달성될 수 있다.
본 발명에 따른 비 자발적 에멀전 확산법을 이용한 조직 재생용 지지체 조성물의 제조방법은 비 용매하에서 생체적합성 고분자 각각의 온도 특성 및 양친성을 가진 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer의 분자배열특성을 응용하여 가수분해시간을 감소시키면서도 높은 기계적 강도를 나타내는 결정성 배양 및 비 결정성배양이 동시에 존재하는 조직 재생용 지지체 조성물을 제공하는 탁월한 효과를 나타낸다.
도 1은 삼원공중합체와 PLLA의 비율이 1 대 12를 초과했을 때 입자형성 사진을 나타낸 것이다.
도 2의 a, b는 삼원공중합체와 PLLA의 비율이 1 대 240일 때 입자 형성 사진을 나타낸 것으로, 입자 크기는 75um 이하이다.
도 3의 a, b는 삼원공중합체와 PLLA의 비율이 1 대 12일 때 입자 형성 사진을 나타낸 것으로, 입자크기는 75 내지 180um이다.
도 4의 a는 삼원공중합체와 PLLA의 비율이 1 대 240 일때 입경분석 자료이다.
b는 삼원공중합체와 PLLA의 비율이 1 대 200 일때 입경분석 자료이다.
c는 삼원공중합체와 PLLA의 비율이 1 대 150 일때 입경분석 자료이다.
d는 삼원공중합체와 PLLA의 비율이 1 대 100 일때 입경분석 자료이다.
e는 삼원공중합체와 PLLA의 비율이 1 대 50 일때 입경분석 자료이다.
f는 삼원공중합체와 PLLA의 비율이 1 대 12 일때 입경분자 자료이다.
도 5의 a는 삼원공중합체와 PLLA의 비율이 1대 240일 때 제조과정 중 제제(formulation)의 분산 안정성을 측정하기 위한 자료로, 입자의 분산, 에멀젼(emulsion) 및 서스펜션(suspension) 중 고형 입자의 응집(aggregation) 또는 엉김(flocculation)을 확인하기 위한 자료이다.
b는 삼원공중합체와 PLLA의 비율이 1대 100일 때 제조과정 중 제제(formulation)의 분산 안정성을 측정하기위한 자료로서 입자의 분산, 에멀젼(emulsion) 및 서스펜션(suspension) 중 고형 입자의 응집(aggregation) 또는 엉김(flocculation)을 확인하기 위한 자료이다.
c는 삼원공중합체와 PLLA의 비율이 1대 12일 때 제조과정 중 제제(formulation)의 분산 안정성을 측정하기위한 자료로서 입자의 분산, 에멀젼(emulsion) 및 서스펜션(suspension) 중 고형 입자의 응집(aggregation) 또는 엉김(flocculation)을 확인하기 위한 자료이다.
도 6의 a는 폴리비닐알콜과 PLLA의 비율이 1 대 240일 때 제조하여 측정한 입자의 SEM 사진이다.
b는 폴리비닐알콜과 PLLA의 비율이 1 대 12일 때 제조하여 측정한 입자의 SEM 사진이다.
도 7의 a는 폴리비닐알콜과 PDO의 비율이 1 대 240일 때 제조하여 측정한 입자의 SEM 사진이다.
b는 폴리비닐알콜과 PDO의 비율이 1 대 12일 때 제조하여 측정한 입자의 SEM 사진이다.
도 8의 a는 삼원공중합체와 PLLA의 비율이 1 대 240일 때 초음파를 이용하여 입자를 제조한 후 측정한 SEM 자료이다.
b는 삼원공중합체와 PLLA의 비율이 1 대 100일 때 초음파를 이용하여 입자를 제조한 후 측정한 SEM 자료이다.
c는 삼원공중합체와 PLLA의 비율이 1 대 12일 때 초음파를 이용하여 입자를 제조한 후 측정한 SEM 자료이다.
도 9의 a는 75um 이하의 PDO입자와 소듐카르복실메틸셀룰로오즈를 7대 3으로 혼합하여 동결건조한 후 측정한 SEM 사진이다.
b는 75um 이하의 PDO입자와 히알루론산을 7대 3으로 혼합하여 동결건조한 후 측정한 SEM 사진이다.
c는 75um 이하의 PLLA입자와 소듐카르복실메틸셀룰로오즈를 7대 3으로 혼합하여 동결건조한 후 측정한 SEM 사진이다.
d는 75um 이하의 PLLA입자와 히알루론산을 7대 3으로 혼합하여 동결건조한 후 측정한 SEM 사진이다.
e는 75um 이하의 PCL입자와 소듐카르복실메틸셀룰로오즈를 7대 3으로 혼합하여 동결건조한 후 측정한 SEM 사진이다.
f는 75um 이하의 PDO입자와 히알루론산을 7대 3으로 혼합하여 동결건조한 후 측정한 SEM 사진이다.
도 10은 본 발명의 에너지 범위 즉 온도 압력 범위 밖에서 재생용 지지체 조성물을 입자화 하였을 때 측정한 광학 현미경 사진이다.
도 11은 생분해성 고분자가 본 발명에서 제시된 비율을 초과할 때 형성된 입자의 광학현미경 사진이다.
도 12는 생분해성 고분자가 본 발명에서 제시된 비율 미만일 때 형성된 입자 의 광학현미경 사진이다.
도 13 a는 히알루론산 주입 후 피부 표면 측정 결과 사진이다.
b는 폴리엘락틱산 입자 주입 후 피부 표면 측정 결과 사진이다.
c는 폴리디옥사논 입자 주입 후 피부 표면 측정 결과 사진이다.
도 14 a는 히알루론산 주입 후 피부 부피변화 측정 자료이다.
b는 폴리엘락틱산 입자 주입 후 피부 부피변화 측정 자료이다.
c는 폴리디옥사논 입자 주입 후 피부 부피변화 측정 자료이다.
도 15 a는 히알루론산 주입 후, 시간에 따른 조직 재생 사진이다.(H&E stain 100배)
b는 폴리엘락틱산 입자 주입 후, 시간에 따른 조직 재생 사진이다.(H&E stain 100배)
c는 폴리디옥사논 입자 주입 후, 시간에 따른 조직 재생 사진이다.(H&E stain 100배)
도 16은 폴리디옥사논 입자, 폴리엘락틱산 입자, 히알루론산을 1 대 0.25대 0.4로 혼합한 후 시간의 경과에 따른 조직 형성 사진이다.(H&E stain 100배)
이하에는, 본 발명의 바람직한 실시예와 각 성분의 물성을 상세하게 설명하되, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 발명을 용이하게 실시할 수 있을 정도로 상세하게 설명하기 위한 것이지, 이로 인해 본 발명의 기술적인 사상 및 범주가 한정되는 것을 의미하지는 않는다.
본 발명에 따른 비 자발적 에멀전 확산법을 이용한 조직 재생용 지지체 조성물의 제조방법은 양친성 생체적합성 고분자에 열에너지를 가하여 용해시키는 생체적합성고분자용해단계, 상기 생체적합성고분자용해단계를 통해 용해된 용액에 생분해성 고분자를 혼합하고 입자화시키는 생분해성고분자입자화단계, 상기 생분해성고분자입자화단계를 통해 제조된 혼합물에 정제수를 투입하고 원심분리하는 원심분리단계 및 상기 원심분리단계를 통해 원심분리된 혼합물을 동결건조하는 동결건조단계로 이루어진다.
또한, 달리 명시되지 않는 한, 본 발명에서 사용된 성분, 반응 조건, 성분의 함량을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은, 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로, 모든 경우 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 발명 내에서 수치범위가 개시되는 경우, 이러한 범위는 연속적이며, 달리 언급되지 않는 한 이러한 범 위의 최소값으로부터 최대값이 포함된 모든 값을 포함한다. 더 나아가, 이러한 범위가 정수를 지칭하는 경우, 달리 언급되지 않는 한 최소값으로부터 최대값이 포함하는 모든 정수가 포함된다.
본 발명에서는 입자의 형성 여부의 초점은 평형 과정에서 열역학적 모델을 이론적으로 인용한 것을 의미한다.
즉, 입자의 형성이 평형상태와 차이가 있는 동적인 과정에서 발생되어진다.
본 발명에서 형성되는 입자의 형성과정을 아래의 수식을 통해 설명 되어질 수 있다.
반지름이 R인 가상의 용액이 공기 중으로 이동하는 상황에서 발생하는 용액의 자유에너지 변화를 고려하면, 용액의 깁스(Gibbs)의 자유에너지 변화(ΔGdroplet)는 수식 1에 의해 표현 되어진다.
ΔGdroplet = Gair (T, Pair)-Gsol (T,Paco)+(4πR2)r
(수식 1)
여기서, "Gair (T, Pair)"는 온도가 "T"이고 압력이 "Pair" 일 때 공기 중에서의 자유에너지를 나타낸다.
"Gsol (T,Paco)"는 온도가 "T"이고 압력이 "Paco" 일 때 용액 속에서의 자유 에너지를 나타낸다.
여기서 "r"은 용액의 표면장력을 의미한다.
그리고, 깁스(Gibbs)방정식에 의하여 "dG = VdP - SdT" 로 표현되고 "V"는 부피를 의미하여, "S"는 엔트로피를 의미한다.
따라서, 여기에 등온 과정과 액체의 비압축성을 적용하면 "dG ≒ VΔP"가 성립된다.
상기의 관계를 수식 1에 적용하면 수식 2가 이론적으로 성립된다.
ΔGdroplet = -4/3 πR3 (Paco - Pair) + (4πR2)r
(수식 2)
그런데, 입자화는 용액의 표면 근처에서 발생하므로 공기 중의 압력은 액체의 증기압 "(Psat)"과 유사한 것으로 본 발명 에서는 정의 할 수 있다.
수식 2에서 "ΔGdroplet" 가 음의 값을 가질 때 특정한 크기를 가지는 액체가 생성될 수 있으며, 이 조건은 첫 번째 항에 있는 압력(음압)이 충분히 커서 두 번째 항에 있는 표면장력을 극복 할 때 만족될 수 있다. 따라서 수식 2에서 "ΔGdroplet" 가 "0"이 되는 조건을 임계조건으로 설정하면 압력(음압)과 표면장력의 상호 작용에 의하여 Atomization number (At)로 수식 3을 이끌어 낼 수 있다.
At = [3r / (Paco - Psat)R]
(수식 3)
즉, 수식 3에서 제시된 비율이 "1"보다 작을 때 반지름 "R"인 입자의 생성이 가능해 진다. 액체 형성에 대한 임계조건을 본 발명에서 주어진 크기의 입자가 생성되는 과정에 적용하면, 외부의 에너지가 전달되어 유체-공기 계면에 근접한 영역에서의 압력(음압)이 유체-공기의 계면 장력을 극복하여 유체의 일부가 공기 중으로 이탈될 수 있는 조건을 갖춘다. 즉 압력(음압)이 클수록, 표면 장력이 작을수록 입화가 잘 진행되어 짐을 의미 한다. (수식 4)
Paco = P0 exp(-2αd)
(수식 4)
"P0" 는 외부에너지 압력을 의미하며, "d"는 외부에너지로부터의 거리, 그리고 "α"는 감쇠 상수(attenuation coefficient)를 나타낸다.
따라서 수식 5가 나타내어 진다.
α = [(8ηπ2f2)/(3ρC3)]
(수식 5)
상기의 수식 5에서 "η"는 유체의 전단 점도, "ρ"는 유체의 밀도, "f"는 외부에너지 진동수, 그리고 "C"는 유체를 통과하는 외부에너지의 속도를 나타낸다. 수식 5를 이용하여 주어진 용액의 감쇠 상수를 계산하여 본 발명의 입자화를 이룰 수 있다.
따라서 본 발명에서 사용되어 지는 양쪽성 고분자폴리머인 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer 는 공중합체의 분자량, 조성, 함유량, 온도 그리고 pH에 따라서 입자형성에 영향을 받게 되는데, 특히 입자형성 후 수세 부분에서 임계 마이셀 농도이상에서 온도가 변할 때 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer 분자들의 수화 정도에 따라 가역적인 졸-겔전이 현상이 나타난다.
즉, [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer의 농도가 수세과정 중 15 내지 30 중량일 때, 온도에의해 분자간의 수소결합이 증가하여 겔 상태가 형성되어 용액의 점도가 급격히 상승된다. 이러한 점도변화는 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer 의 농도가 12 내지 13중량 백분율일 때 10도와 24도의 온도에서의 점도가 동일한 수준을 나타내지만 24도의 온도 이상일 때 점도는 최소값을 나타내는 18도부근을 지나면서 온도 상승에 의한 겔 형성이 진행된다. 같은 의미로 두 온도 사이에서의 점도 수치는 동일하지만 각각의 상 구조의 차이는 나타난다. 두 온도 구간의 수용액의 탄성율(storage modulus)은 겔 이 형성되는 시점을 중심으로 현저하게 증가된다.
즉, 입자형성 후 수세과정에서 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer의 최종 농도는 12 내지 13중량 백분율 이하로 유지하여야 한다.
본 발명에서 입자화가 이루어지는 영역이 용액-공기의 계면에서 표면의 탄성은 증가되어 각각의 온도구간에서의 상 구조 차이로 인하여 분자들간의 반발정도가 달라지기 때문에 공기와 액체 계면간의 압력 변화로 인한 입자의 생성이 가능해진다.
상기 생체적합성고분자용해단계는 양친성 생체적합성 고분자에 열에너지를 가하여 용해시키는 단계로, 양친성 생체적합성 고분자를 60 내지 220℃의 온도로 가열하여 이루어지는데, 이때, 상기 양친성 생체적합성 고분자는 poly(ethyleneoxide-propyleneoxide-ethyleneoxide), [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer 및 폴리비닐알코올로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상이며, 중량평균분자량이 300 내지 100000Da인 것을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되어지는 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer 는 폴리에틸렌(PEO)과 폴리프로필렌(PPO)의 단위체 구조로 이루어진 삼원공중합체(Triblock copolymer)이다. 본 발명에서는 상기 삼원공중합체로서 PEO 단위체의 함량이 상대적으로 낮으면서 고분자의 중량평균분자량이 상대적으로 큰 PEO-PPO-PEO 삼원공중합체와, PEO 단위체의 함량이 상대적으로 높으면서 고분자의 중량평균분자량이 상대적으로 작은 PEO-PPO-PEO 삼원공중합체 중 선택된 한종 혹은 병행해서 사용가능하다.
또한, 본 발명에 의해 사용되는 양친성 고분자는 poly(ethyleneoxide-propyleneoxide-ethyleneoxide) 혹은 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer이며 상업적 이름은 Pluronic이다. 또는 1973년 이 물질로 특허를 등록한 Irving Schmolka가 붙인 이름인 Poloxamer로 불리기도 한다.
또한, 본 발명에서는 사용되는 [PEOn-PPOm-PEOn]는 구조 가운데 PPO가 위치하고 양 옆으로 PEO가 펼쳐져 있다. PPO는 극성이 에틸렌옥사이드 (EO)보다는 덜하며, 양 옆의 폴리에틸렌옥사이드 (PEO)는 극성 구조로서 친수성(hydrophilic)부분을 이루게 되어 블록 공중합체인 준 친수성 부분과 친수성 부분이 동시에 존재하여 양친성을 가진다.
또한, 본 발명에 사용되는 [PEOn-PPOm-PEOn] 는 친수성 부분과 준 친수성 부분의 길이를 나타내는 n 과 m에 따라 조금씩 다른 물성을 지니며, 현재 사용되어지는 삼원공중합체 문자 뒤 2-3자리 숫자로 표현되는 부분은 조성과 관계된 부분으로 첫 자리 숫자(세 자리일 경우 처음 두 자리)에 300을 곱한 값이 폴리프로필렌옥사이드 블록의 대략적인 분자량을 의미하며, 마지막 숫자에 10을 곱한 값이 폴리에틸렌옥사이드 블록의 함량을 의미한다. 따라서 본 발명에서 제시하고자 하는 삼원공중합체의 분자량을 한정하여 표현하지 아니하고 그 특성에 기인하고자 한다.
또한, 본 발명에 사용되는 [PEOn-PPOm-PEOn]는 수용액상태에서 적절한 온도와 농도 범위 내에서 micelle구조를 보인다. 즉, 폴리에틸렌옥사이드와 폴리프로필렌옥사이드의 상대적인 용해도 차이를 바탕으로 core 부분에 준 친수성인 폴리프로필렌옥사이드가 자리잡고 있으며, shell 쪽에는 친수성인 폴리에틸렌옥사이드가 자리잡고 있는 구 형태를 띤다.
또한, 본 발명에서는 n과 m의 혼합비율이 서로 상이한 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer 서로 다른 2종을 적정 중량비로 혼합 사용한다.
또한, 본 발명에서는 상기 제1 공중합체로서 대표적으로 산화에틸렌(Oxyethylene) 단위체 함량이 70내지85 중량%이고, 중량평균분자량(Mw)이 9,000내지15,000 g/mol인 PEO-PPO-PEO 삼원공중합체를 사용한다. 그리고, 상기 제2 공공중합체로서 대표적으로 산화에틸렌(Oxyethylene) 단위체 함량이 76내지85 중량%이고, 중량평균분자량(Mw)이 7,000 내지 11,000 g/mol인 PEO-PPO-PEO 삼원공중합체를 사용한다. 또한, 상기 PEO-PPO-PEO 삼원공중합체는 제1 공중합체 80 내지 99 중량%와 제2 공중합체 1 내지 20 중량%의 배합비로 혼합 사용한다.
또한, 상기 생체적합성고분자용해단계에서 생체적합성 고분자중 녹는점이 200도 부근인 폴리비닐 알코올도 사용할 수도 있는데, 본 발명에서 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer 대체용으로 폴리비닐알코올을 사용하였을 때 입자는 부분적으로 생성되나 원하는 형태 및 수율부분에서 생산성 저하로 이어지는 문제점이 발생한다.
하지만 본 발명에서 설명하였듯이 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer만 국한되는 것이 아니라 폴리비닐알코올도 사용가능함을 언급한다.
상기 생분해성고분자입자화단계는 상기 생체적합성고분자용해단계를 통해 용해된 용액에 생분해성 고분자를 혼합하고 입자화시키는 단계로, 생분해성 고분자 100 중량부에 양친성 생체적합성 고분자 1200 내지 2400 중량부를 혼합하고 반응기에 투입하고, 60 내지 220℃의 온도와 -0.01 내지 2m bar의 압력 및 10 내지 500rpm의 교반속도로 이루어진다.
이때, 상기 생분해성 고분자는 폴리-락틱-코-글리콜릭 액시드(PLGA), 폴리디옥사논 (PDO, PDS), 폴리카프로락톤 (PCL), 폴리하이드록시부티레이트 (PHB), 폴리락틱액시드(PLA, PLLA,PDLA) 및 폴리글리콜릭액시드(PGA), 폴리파라디옥사논코입실론카프론락톤(PDCL), 폴리글리콜릭코입실론카프론락톤(PGCL) 및 폴리엘락틱입실론카프론락톤(PLCL)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로 이루어지는 것이 바람직하며,
본 발명에서 사용하는 생분해성 고분자는 녹는점(Mp)이 100±10℃이며, 유리전이온도가(Tg)가 50±10℃인 폴리-락틱-코-글리콜릭 액시드(PLGA) , 녹는점(Mp)이 110±10℃이며, 유리전이온도(Tg)가 -5±10℃인 폴리디옥사논 (PDO, PDS), 녹는점(Mp)이 60±10℃이며, 유리전이온도(Tg)가 -60±10℃인 폴리카프로락톤 (PCL), 녹는점(Mp)이 175±10℃이며, 유리전이온도(Tg)가 2±10℃인 폴리하이드록시부티레이트 (PHB), 녹는점(Mp)이 175±10℃ 이며, 유리전이온도가 (Tg) 63±10℃이며, 녹는점(Mp)이 200±10℃인 폴리락틱액시드(PLA, PLLA,PDLA) 및 폴리글리콜릭액시드(PGA), 폴리파라디옥사논코입실론카프론락톤(PDCL), 폴리글리콜릭코입실론카프론락톤(PGCL) 및 폴리엘락틱입실론카프론락톤(PLCL)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 상기 방법으로 제조된 중간물질의 생분해성 고분자는 입자크기가 1 내지 300㎛로 형성되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 생분해성고분자반응단계는 생분해성 고분자 100 중량부에 양친성 생체적합성 고분자 1200 내지 2400 중량부를 혼합하고 초음파를 조사하는 과정으로 이루어질 수도 있다.
이때, 생분해성 고분자의 함량이 상기의 범위 미만이거나 초과했을 경우 생분해성 고분자입자와 용액사이의 반발 및 응집현상이 발생되어 입자가 생성되지 않을 수 있다.
또한, 생분해성 고분자가 상기의 범위 이상 이면 도 11과 같이 입자의 크기가 감소한다. 즉 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer의 소수성 부분이 상대적으로 증가되어 수용액내의 입자상호간의 반발력이 증가되어 미세한 입자가 형성되어 본 발명의 목적에는 사용이 불가능해진다.
또한, 생분해성 고분자가 상기의 범위 이하 이면 도 12와 같이 입자의 크기가 상대적으로 증가한다. 즉 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer의 소수성 부분이 상대적으로 감소되어 수용액내의 입자상호간의 반발력이 감소하여 큰 입자가 형성되어 본 발명의 목적에는 사용이 불가능해진다.
또한, 상기의 방법에서 제시된 폴리비닐 알코올을 사용시 친수성 부분만 증가시켜 상대적으로 입자의 형성시 높은 온도에서는 입자의 크기가 증가되나 상대적으로 온도 즉 에너지원을 제거시 입자의 상호 응집현상이 발생되어 입자의 제형의 제어가 어려워지는 문제점이 발생되나 입자가 형성하지 않는 것을 의미하는 것은 아니다.
상기 원심분리단계는 상기 생분해성고분자반응단계를 통해 제조된 혼합물에 정제수를 투입하고 원심분리하는 단계로, 상기 생분해성고분자반응단계를 통해 제조된 혼합물 100 중량부에 정제수 800 내지 2000 중량부를 투입하고, 3000 내지 15000rpm의 속도로 1 내지 10분 동안 원심분리하여 이루어진다.
또한, 상기 원심분리단계에서는 정제수를 투입하기 전에 에너지원이 제거된 상태에서 실시하는 것이 바람직한데, 즉 상기의 깁시의 수식에서 언급하였듯이 입자생성의 중요한 변수는 엔탈피 변화이므로 목적한 바를 이루기 위해 에너지원이 제거된 상태에서 정제수를 투입하여 중합된 고분자 혼합물이 세척될 수 있도록 하는 것이 바람직하다.
이때 정제수의 함량이 800 중량부 이상이면 입자생성 후 입자의 침강현상이 발생하지 않고, 상기의 방법에서 국한되는 것은 아니나 원심분리를 통해 단시간내에 입자를 침강하여 수득할 수 있다.
즉, [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer의 농도가 수세과정 중 15 내지 30 중량일 때, 온도에의해 분자간의 수소결합이 증가하여 겔 상태가 형성되어 용액의 점도가 급격히 상승된다. 이러한 점도변화는 특정 온도 구간의 수용액의 탄성율(storage modulus)이 증가되어 입자의 수세 과정에 어려움을 유발할 수 있다.
따라서 입자형성 후 수세과정에서 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer의 최종 용액 농도는 12 내지 13중량 백분율 이하로 유지하는 것이 바람직하다.
상기 동결건조단계는 상기 원심분리단계를 통해 원심분리된 혼합물을 동결건조하는 단계로, 상기 원심분리단계를 통해 원심분리된 혼합물을 -40도 이하와 -1m bar에서 동결건조하는 과정으로 이루어지며, 이 방법에 국한되는 것은 아니지만 입자의 리스크를 최소화시키는 방법으로 가장 적절하다. 그러나 본 업계에서 시행하는 일반적인 방법으로 입자를 건조시켜도 무방하다.
또한, 상기 동결건조단계 이후에는 동결건조단계를 통해 동결건조된 혼합물을 하이드로겔과 혼합하고 동결 및 동결건조하는 하이드로겔혼합단계가 더 진행되는데, 동결건조된 혼합물과 하이드로겔이 1:9 내지 9:1의 중량부로 혼합되어 이루어지는 것이 바람직하다.
또한, 상기 동결은 -40 내지 -30℃의 온도로 이루어지며, 상기 동결건조는 -30 내지 -20℃의 온도와 -1m bar 이하에서 이루어지는 것이 바람직하다.
이때, 상기 하이드로겔은 소듐카르복실메틸셀룰로오스 및 그 유도체, 히알루론산 및 그 유도체, 덱스트란 및 그 유도체로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로 이루어진다.
이하에서는, 비 자발적 에멀전 확산법을 이용한 조직 재생용 지지체 조성물의 제조방법 및 그 제조방법을 통해 제조된 조직 재생용 지지체 조성물(입자)의 물성을 실시예를 들어 설명하기로 한다.
실시예 1 : 폴리-락틱-코-글리콜릭 액시드(PLGA) 입자의 제조
폴리-락틱-코-글리콜릭 액시드 1g에 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer를 240g을 투입하여 교반한다. 교반시 온도는 60 내지 220℃를 유지하며 압력은 -0.01 내지 2mbar을 가한다. 그리고 정제수를 2L 투입하여 세척과정 및 원심분리하여 입자를 수득하였다.
실시예 2 : 폴리-락틱-코-글리콜릭 액시드(PLGA) 입자의 제조
폴리-락틱-코-글리콜릭 액시드 1g에 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer를 12g을 투입하여 교반한다. 교반시 온도는 60 내지 220℃를 유지하며 압력은 -0.01 내지 2mbar을 가한다. 그리고 정제수를 2L 투입 하여 세척과정 및 원심분리하여 입자를 수득하였다.
실시예 3 : 폴리디옥사논 (PDO, PDS) 입자의 제조
폴리디옥사논 1g에 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer를 240g을 투입하여 교반한다. 교반시 온도는 60 내지 220℃를 유지하며 압력은 -0.01 내지 2mbar을 가한다. 그리고 정제수를 2L 투입 하여 세척과정 및 원심분리하여 입자를 수득하였다.
실시예 4 : 폴리디옥사논 (PDO, PDS) 입자의 제조
폴리디옥사논 1g에 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer를 12g을 투입하여 교반한다. 교반시 온도는 60 내지 220℃를 유지하며 압력은 -0.01 내지 2mbar을 가한다. 그리고 정제수를 2L 투입 하여 세척과정 및 원심분리하여 입자를 수득하였다.
실시예 5 : 폴리카프로락톤 (PCL) 입자의 제조
폴리카프로락톤 1g에 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer를 240g을 투입하여 교반한다. 교반시 온도는 60 내지 220℃를 유지하며 압력은 -0.01 내지 2mbar을 가한다. 그리고 정제수를 2L 투입 하여 세척과정 및 원심분리하여 입자를 수득하였다.
실시예 6 : 폴리카프로락톤 (PCL) 입자의 제조
폴리카프로락톤 1g에 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer를 12g을 투입하여 교반한다. 교반시 온도는 60 내지 220℃를 유지하며 압력은 -0.01 내지 2mbar을 가한다. 그리고 정제수를 2L 투입 하여 세척과정 및 원심분리하여 입자를 수득하였다.
실시예 7 : 폴리하이드록시부티레이트 (PHB) 입자의 제조
폴리하이드록시부티레이트 1g에 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer를 240g을 투입하여 교반한다. 교반시 온도는 60 내지 220℃를 유지하며 압력은 -0.01 내지 2mbar을 가한다. 그리고 정제수를 2L 투입 하여 세척과정 및 원심분리하여 입자를 수득하였다.
실시예 8 : 폴리하이드록시부티레이트 (PHB) 입자의 제조
폴리하이드록시부티레이트 1g에 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer를 12g을 투입하여 교반한다. 교반시 온도는 60 내지 220℃를 유지하며 압력은 -0.01 내지 2mbar을 가한다. 그리고 정제수를 2L 투입 하여 세척과정 및 원심분리하여 입자를 수득하였다.
실시예 9 : 폴리락틱액시드(PLA, PLLA,PDLA) 입자의 제조
폴리락틱액시드 1g에 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer를 240g을 투입하여 교반한다. 교반시 온도는 60 내지 220℃를 유지하며 압력은 -0.01 내지 2mbar을 가한다. 그리고 정제수를 2L 투입 하여 세척과정 및 원심분리하여 입자를 수득하였다.
실시예 10 : 폴리락틱액시드(PLA, PLLA,PDLA) 입자의 제조
폴리락틱액시드 1g에 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer를 12g을 투입하여 교반한다. 교반시 온도는 60 내지 220℃를 유지하며 압력은 -0.01 내지 2mbar을 가한다. 그리고 정제수를 2L 투입 하여 세척과정 및 원심분리하여 입자를 수득하였다.
실시예 11 : 폴리글리콜릭액시드(PGA) 입자의 제조
폴리클리콜릭액시드 1g에 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer를 240g을 투입하여 교반한다. 교반시 온도는 60 내지 220℃를 유지하며 압력은 -0.01 내지 2mbar을 가한다. 그리고 정제수를 2L 투입 하여 세척과정 및 원심분리하여 입자를 수득하였다.
실시예 12 : 폴리글리콜릭액시드(PGA) 입자의 제조
폴리클리콜릭액시드 1g에 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer를 12g을 투입하여 교반한다. 교반시 온도는 60 내지 220℃를 유지하며 압력은 -0.01 내지 2mbar을 가한다. 그리고 정제수를 2L 투입 하여 세척과정 및 원심분리하여 입자를 수득하였다.
실시예 13 : 폴리파라디옥사논코입실론카프론락톤(PDCL) 입자의 제조
폴리파라디옥사논코입실론카프론락톤 1g에 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer를 240g을 투입하여 교반한다. 교반시 온도는 60 내지 220℃를 유지하며 압력은 -0.01 내지 2mbar을 가한다. 그리고 정제수를 2L 투입 하여 세척과정 및 원심분리하여 입자를 수득하였다.
실시예 14 : 폴리파라디옥사논코입실론카프론락톤(PDCL) 입자의 제조
폴리파라디옥사논코입실론카프론락톤 1g에 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer를 12g을 투입하여 교반한다. 교반시 온도는 60 내지 220℃를 유지하며 압력은 -0.01 내지 2mbar을 가한다. 그리고 정제수를 2L 투입 하여 세척과정 및 원심분리하여 입자를 수득하였다.
실시예 15 : 폴리글리콜릭코입실론카프론락톤(PGCL) 입자의 제조
폴리클리콜릭코입실론카프론락톤 1g에 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer를 240g을 투입하여 교반한다. 교반시 온도는 60 내지 220℃를 유지하며 압력은 -0.01 내지 2mbar을 가한다. 그리고 정제수를 2L 투입 하여 세척과정 및 원심분리하여 입자를 수득하였다.
실시예 16 : 폴리글리콜릭코입실론카프론락톤(PGCL) 입자의 제조
폴리클리콜릭코입실론카프론락톤 1g에 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer를 12g을 투입하여 교반한다. 교반시 온도는 60 내지 220℃를 유지하며 압력은 -0.01 내지 2mbar을 가한다. 그리고 정제수를 2L 투입 하여 세척과정 및 원심분리하여 입자를 수득하였다.
실시예 17 : 폴리엘락틱입실론카프론락톤(PLCL) 입자의 제조
폴리엘락틱입실론카프론락톤 1g에 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer를 240g을 투입하여 교반한다. 교반시 온도는 60 내지 220℃를 유지하며 압력은 -0.01 내지 2mbar을 가한다. 그리고 정제수를 2L 투입 하여 세척과정 및 원심분리하여 입자를 수득하였다.
실시예 18 : 폴리엘락틱입실론카프론락톤(PLCL) 입자의 제조
폴리엘락틱입실론카프론락톤 1g에 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer를 12g을 투입하여 교반한다. 교반시 온도는 60 내지 220℃를 유지하며 압력은 -0.01 내지 2mbar을 가한다. 그리고 정제수를 2L 투입 하여 세척과정 및 원심분리하여 입자를 수득하였다.
실시예 19 : 폴리비닐알코올을 이용한 입자의 제조
각각의 폴리-락틱-코-글리콜릭 액시드(PLGA) ,폴리디옥사논 (PDO, PDS), 폴리카프로락톤 (PCL), 폴리하이드록시부티레이트 (PHB), 폴리락틱액시드(PLA, PLLA,PDLA) 및 폴리글리콜릭액시드(PGA), 폴리파라디옥사논코입실론카프론락톤(PDCL), 폴리글리콜릭코입실론카프론락톤(PGCL), 폴리엘락틱입실론카프론락톤(PLCL) 1g에 폴리비닐알코올를 240g을 투입하여 교반한다. 교반시 온도는 60 내지 220℃를 유지하며 압력은 -0.01 내지 2mbar을 가한다. 그리고 정제수를 2L 투입 하여 세척과정 및 원심분리하여 입자를 수득하였다.
실시예 20 : 폴리비닐알코올을 이용한 입자의 제조
각각의 폴리-락틱-코-글리콜릭 액시드(PLGA) ,폴리디옥사논 (PDO, PDS), 폴리카프로락톤 (PCL), 폴리하이드록시부티레이트 (PHB), 폴리락틱액시드(PLA, PLLA,PDLA) 및 폴리글리콜릭액시드(PGA), 폴리파라디옥사논코입실론카프론락톤(PDCL), 폴리글리콜릭코입실론카프론락톤(PGCL), 폴리엘락틱입실론카프론락톤(PLCL) 1g에 폴리비닐알코올를 12g을 투입하여 교반한다. 교반시 온도는 60 내지 220℃를 유지하며 압력은 -0.01 내지 2mbar을 가한다. 그리고 정제수를 2L 투입 하여 세척과정 및 원심분리하여 입자를 수득한다.
실시예 21 : NST 공법으로 제조된 폴리디옥사논 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리디온사논입자에 평균 분자량 10 내지 3000kDa인 2중량 백분율인 히알루론산 수용액을 입자 대 순수히알루론산의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 22 : NST 공법으로 제조된 폴리디옥사논 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리디온사논입자에 평균 분자량 10 내지 3000kDa인 2중량 백분율인 히알루론산 수용액을 입자 대 순수히알루론산의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 23 : NST 공법으로 제조된 폴리-락틱-코-글리콜릭 액시드 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리-락틱-코-글리콜릭 액시드 입자에 평균 분자량 10 내지 3000kDa인 2중량 백분율인 히알루론산 수용액을 입자 대 순수히알루론산의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 24 : NST 공법으로 제조된 폴리-락틱-코-글리콜릭 액시드 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리-락틱-코-글리콜릭 액시드 입자에 평균 분자량 10 내지 3000kDa인 2중량 백분율인 히알루론산 수용액을 입자 대 순수히알루론산의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 25 : NST 공법으로 제조된 폴리카프로락톤 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리카프로락톤 입자에 평균 분자량 10 내지 3000kDa인 2중량 백분율인 히알루론산 수용액을 입자 대 순수히알루론산의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 26 : NST 공법으로 제조된 폴리카프로락톤 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리카프로락톤 입자에 평균 분자량 10 내지 3000kDa인 2중량 백분율인 히알루론산 수용액을 입자 대 순수히알루론산의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 27 : NST 공법으로 제조된 폴리하이드록시부티레이트 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리하이드록시부티레이트 입자에 평균 분자량 10 내지 3000kDa인 2중량 백분율인 히알루론산 수용액을 입자 대 순수히알루론산의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 28 : NST 공법으로 제조된 폴리하이드록시부티레이트 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리하이드록시부티레이트 입자에 평균 분자량 10 내지 3000kDa인 2중량 백분율인 히알루론산 수용액을 입자 대 순수히알루론산의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 29 : NST 공법으로 제조된 폴리락틱액시드 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리락틱액시드 입자에 평균 분자량 10 내지 3000kDa인 2중량 백분율인 히알루론산 수용액을 입자 대 순수히알루론산의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 30 : NST 공법으로 제조된 폴리락틱액시드 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리락틱액시드 입자에 평균 분자량 10 내지 3000kDa인 2중량 백분율인 히알루론산 수용액을 입자 대 순수히알루론산의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 31 : NST 공법으로 제조된 폴리글리콜릭액시드 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리글리콜릭액시드 입자에 평균 분자량 10 내지 3000kDa인 2중량 백분율인 히알루론산 수용액을 입자 대 순수히알루론산의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 32 : NST 공법으로 제조된 폴리글리콜릭액시드 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리글리콜릭액시드 입자에 평균 분자량 10 내지 3000kDa인 2중량 백분율인 히알루론산 수용액을 입자 대 순수히알루론산의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 33 : NST 공법으로 제조된 폴리파라디옥사논코입실론카프론락톤 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리파라디옥사논코입실론카프론락톤 입자에 평균 분자량 10 내지 3000kDa인 2중량 백분율인 히알루론산 수용액을 입자 대 순수히알루론산의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 34 : NST 공법으로 제조된 폴리파라디옥사논코입실론카프론락톤 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리파라디옥사논코입실론카프론락톤 입자에 평균 분자량 10 내지 3000kDa인 2중량 백분율인 히알루론산 수용액을 입자 대 순수히알루론산의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 35 : NST 공법으로 제조된 폴리글리콜릭코입실론카프론락톤 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리글리콜릭코입실론카프론락톤 입자에 평균 분자량 10 내지 3000kDa인 2중량 백분율인 히알루론산 수용액을 입자 대 순수히알루론산의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 36 : NST 공법으로 제조된 폴리글리콜릭코입실론카프론락톤 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리글리콜릭코입실론카프론락톤 입자에 평균 분자량 10 내지 3000kDa인 2중량 백분율인 히알루론산 수용액을 입자 대 순수히알루론산의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 37 : NST 공법으로 제조된 폴리엘락틱입실론카프론락톤 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리엘락틱입실론카프론락톤 입자에 평균 분자량 10 내지 3000kDa인 2중량 백분율인 히알루론산 수용액을 입자 대 순수히알루론산의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 38 : NST 공법으로 제조된 폴리엘락틱입실론카프론락톤 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리엘락틱입실론카프론락톤 입자에 평균 분자량 10 내지 3000kDa인 2중량 백분율인 히알루론산 수용액을 입자 대 순수히알루론산의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 39 : NST 공법으로 제조된 폴리디옥사논 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리디온사논입자에 평균 분자량 10 내지 300kDa인 2중량 백분율인 소듐카르복실메틸셀룰로오즈 수용액을 입자 대 순수 소듐카르복실메틸셀룰로오즈의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 40 : NST 공법으로 제조된 폴리디옥사논 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리디온사논입자에 평균 분자량 10 내지 300kDa인 2중량 백분율인 소듐카르복실메틸셀룰로오즈 수용액을 입자 대 순수 소듐카르복실메틸셀룰로오즈의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 41 : NST 공법으로 제조된 폴리-락틱-코-글리콜릭 액시드 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리-락틱-코-글리콜릭 액시드 입자에 평균 분자량 10 내지 300kDa인 2중량 백분율인 소듐카르복실메틸셀룰로오즈 수용액을 입자 대 순수 소듐카르복실메틸셀룰로오즈의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 42 : NST 공법으로 제조된 폴리-락틱-코-글리콜릭 액시드 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리-락틱-코-글리콜릭 액시드 입자에 평균 분자량 10 내지 300kDa인 2중량 백분율인 소듐카르복실메틸셀룰로오즈 수용액을 입자 대 순수 소듐카르복실메틸셀룰로오즈의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 43 : NST 공법으로 제조된 폴리카프로락톤 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리카프로락톤 입자에 평균 분자량 10 내지 300kDa인 2중량 백분율인 소듐카르복실메틸셀룰로오즈 수용액을 입자 대 순수 소듐카르복실메틸셀룰로오즈의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 44 : NST 공법으로 제조된 폴리카프로락톤 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리카프로락톤 입자에 평균 분자량 10 내지 300kDa인 2중량 백분율인 소듐카르복실메틸셀룰로오즈 수용액을 입자 대 순수 소듐카르복실메틸셀룰로오즈의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 45 : NST 공법으로 제조된 폴리하이드록시부티레이트 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리하이드록시부티레이트 입자에 평균 분자량 10 내지 300kDa인 2중량 백분율인 소듐카르복실메틸셀룰로오즈 수용액을 입자 대 순수 소듐카르복실메틸셀룰로오즈의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 46 : NST 공법으로 제조된 폴리하이드록시부티레이트 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리하이드록시부티레이트 입자에 평균 분자량 10 내지 300kDa인 2중량 백분율인 소듐카르복실메틸셀룰로오즈 수용액을 입자 대 순수 소듐카르복실메틸셀룰로오즈의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 47 : NST 공법으로 제조된 폴리락틱액시드 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리락틱액시드 입자에 평균 분자량 10 내지 300kDa인 2중량 백분율인 소듐카르복실메틸셀룰로오즈 수용액을 입자 대 순수 소듐카르복실메틸셀룰로오즈의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 48 : NST 공법으로 제조된 폴리락틱액시드 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리락틱액시드 입자에 평균 분자량 10 내지 300kDa인 2중량 백분율인 소듐카르복실메틸셀룰로오즈 수용액을 입자 대 순수 소듐카르복실메틸셀룰로오즈의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 49 : NST 공법으로 제조된 폴리글리콜릭액시드 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리글리콜릭액시드 입자에 평균 분자량 10 내지 300kDa인 2중량 백분율인 소듐카르복실메틸셀룰로오즈 수용액을 입자 대 순수 소듐카르복실메틸셀룰로오즈의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 50 : NST 공법으로 제조된 폴리글리콜릭액시드 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리글리콜릭액시드 입자에 평균 분자량 10 내지 300kDa인 2중량 백분율인 소듐카르복실메틸셀룰로오즈 수용액을 입자 대 순수 소듐카르복실메틸셀룰로오즈의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 51 : NST 공법으로 제조된 폴리파라디옥사논코입실론카프론락톤 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리파라디옥사논코입실론카프론락톤 입자에 평균 분자량 10 내지 300kDa인 2중량 백분율인 소듐카르복실메틸셀룰로오즈 수용액을 입자 대 순수 소듐카르복실메틸셀룰로오즈의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 52 : NST 공법으로 제조된 폴리파라디옥사논코입실론카프론락톤 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리파라디옥사논코입실론카프론락톤 입자에 평균 분자량 10 내지 300kDa인 2중량 백분율인 소듐카르복실메틸셀룰로오즈 수용액을 입자 대 순수 소듐카르복실메틸셀룰로오즈의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 53 : NST 공법으로 제조된 폴리글리콜릭코입실론카프론락톤 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리글리콜릭코입실론카프론락톤 입자에 평균 분자량 10 내지 300kDa인 2중량 백분율인 소듐카르복실메틸셀룰로오즈 수용액을 입자 대 순수 소듐카르복실메틸셀룰로오즈의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 54 : NST 공법으로 제조된 폴리글리콜릭코입실론카프론락톤 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리글리콜릭코입실론카프론락톤 입자에 평균 분자량 10 내지 300kDa인 2중량 백분율인 소듐카르복실메틸셀룰로오즈 수용액을 입자 대 순수 소듐카르복실메틸셀룰로오즈의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 55 : NST 공법으로 제조된 폴리엘락틱입실론카프론락톤 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리엘락틱입실론카프론락톤 입자에 평균 분자량 10 내지 300kDa인 2중량 백분율인 소듐카르복실메틸셀룰로오즈 수용액을 입자 대 순수 소듐카르복실메틸셀룰로오즈의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 56 : NST 공법으로 제조된 폴리엘락틱입실론카프론락톤 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리엘락틱입실론카프론락톤 입자에 평균 분자량 10 내지 300kDa인 2중량 백분율인 소듐카르복실메틸셀룰로오즈 수용액을 입자 대 순수 소듐카르복실메틸셀룰로오즈의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 57 : NST 공법으로 제조된 폴리디옥사논 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리디온사논입자에 평균 분자량 10 내지 1000kDa인 2중량 백분율인 덱스트란 수용액을 입자 대 순수 덱스트란의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 58 : NST 공법으로 제조된 폴리디옥사논 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리디온사논입자에 평균 분자량 10 내지 1000kDa인 2중량 백분율인 덱스트란 수용액을 입자 대 순수 덱스트란의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 59 : NST 공법으로 제조된 폴리-락틱-코-글리콜릭 액시드 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리-락틱-코-글리콜릭 액시드 입자에 평균 분자량 10 내지 1000kDa인 2중량 백분율인 덱스트란 수용액을 입자 대 순수 덱스트란의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 60 : NST 공법으로 제조된 폴리-락틱-코-글리콜릭 액시드 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리-락틱-코-글리콜릭 액시드 입자에 평균 분자량 10 내지 1000kDa인 2중량 백분율인 덱스트란 수용액을 입자 대 순수 덱스트란의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 61 : NST 공법으로 제조된 폴리카프로락톤 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리카프로락톤 입자에 평균 분자량 10 내지 1000kDa인 2중량 백분율인 덱스트란 수용액을 입자 대 순수 덱스트란의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 62 : NST 공법으로 제조된 폴리카프로락톤 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리카프로락톤 입자에 평균 분자량 10 내지 1000kDa인 2중량 백분율인 덱스트란 수용액을 입자 대 순수 덱스트란의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 63 : NST 공법으로 제조된 폴리하이드록시부티레이트 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리하이드록시부티레이트 입자에 평균 분자량 10 내지 1000kDa인 2중량 백분율인 덱스트란 수용액을 입자 대 순수 덱스트란의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 64 : NST 공법으로 제조된 폴리하이드록시부티레이트 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리하이드록시부티레이트 입자에 평균 분자량 10 내지 1000kDa인 2중량 백분율인 덱스트란 수용액을 입자 대 순수 덱스트란의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 65 : NST 공법으로 제조된 폴리락틱액시드 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리락틱액시드 입자에 평균 분자량 10 내지 1000kDa인 2중량 백분율인 덱스트란 수용액을 입자 대 순수 덱스트란의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 66 : NST 공법으로 제조된 폴리락틱액시드 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리락틱액시드 입자에 평균 분자량 10 내지 1000kDa인 2중량 백분율인 덱스트란 수용액을 입자 대 순수 덱스트란의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 67 : NST 공법으로 제조된 폴리글리콜릭액시드 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리글리콜릭액시드 입자에 평균 분자량 10 내지 1000kDa인 2중량 백분율인 덱스트란 수용액을 입자 대 순수 덱스트란의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 68 : NST 공법으로 제조된 폴리글리콜릭액시드 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리글리콜릭액시드 입자에 평균 분자량 10 내지 1000kDa인 2중량 백분율인 덱스트란 수용액을 입자 대 순수 덱스트란의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 69 : NST 공법으로 제조된 폴리파라디옥사논코입실론카프론락톤 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리파라디옥사논코입실론카프론락톤 입자에 평균 분자량 10 내지 1000kDa인 2중량 백분율인 덱스트란 수용액을 입자 대 순수 덱스트란의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 70 : NST 공법으로 제조된 폴리파라디옥사논코입실론카프론락톤 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리파라디옥사논코입실론카프론락톤 입자에 평균 분자량 10 내지 1000kDa인 2중량 백분율인 덱스트란 수용액을 입자 대 순수 덱스트란의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 71 : NST 공법으로 제조된 폴리글리콜릭코입실론카프론락톤 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리글리콜릭코입실론카프론락톤 입자에 평균 분자량 10 내지 1000kDa인 2중량 백분율인 덱스트란 수용액을 입자 대 순수 덱스트란의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 72 : NST 공법으로 제조된 폴리글리콜릭코입실론카프론락톤 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리글리콜릭코입실론카프론락톤 입자에 평균 분자량 10 내지 1000kDa인 2중량 백분율인 덱스트란 수용액을 입자 대 순수 덱스트란의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 73 : NST 공법으로 제조된 폴리엘락틱입실론카프론락톤 입자의 제형화
300um 이하의 크기를 가지는 폴리엘락틱입실론카프론락톤 입자에 평균 분자량 10 내지 1000kDa인 2중량 백분율인 덱스트란 수용액을 입자 대 순수 덱스트란의 중량 비율을 1 내지 9 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
실시예 74 : NST 공법으로 제조된 폴리엘락틱입실론카프론락톤 입자의 제형화
*300um 이하의 크기를 가지는 폴리엘락틱입실론카프론락톤 입자에 평균 분자량 10 내지 1000kDa인 2중량 백분율인 덱스트란 수용액을 입자 대 순수 덱스트란의 중량 비율을 9 내지 1 의 중량 비율로 혼합한 후 동결 및 동결건조하여 인젝션 타입의 필러제를 제조하였다.
시험예 1. : 혼합비율 및 생분해성고분자 종류에 따른 입자 크기 분석 실험
폴리-락틱-코-글리콜릭 액시드(PLGA) ,폴리디옥사논 (PDO, PDS), 폴리카프로락톤 (PCL), 폴리하이드록시부티레이트 (PHB), 폴리락틱액시드(PLA, PLLA,PDLA) 및 폴리글리콜릭액시드(PGA), 폴리파라디옥사논코입실론카프론락톤(PDCL), 폴리글리콜릭코입실론카프론락톤(PGCL), 폴리엘락틱입실론카프론락톤(PLCL)의 생분해성 고분자를 실시예 1 내지 실시예 20의 방법으로 제조하여 입경분석기를 통해 입자의 평균 크기를 표 1에 나타내었다. 실험방법은 각각의 입자를 1g 취하여 0.1% 폴리비닐알코올 수용액에 1% 비율로 분산시켜 입경 크기를 측정하였다.
<표 1>
Figure PCTKR2020017567-appb-I000001
상기 표 1에서 보듯이 실시예 1, 실시예 3, 실시예 5, 실시예 7, 실시예 9, 실시예 11, 실시예 13, 실시예 15, 실시예 17은 생분해성 고분자의 함량이 증가할수록 입자의 크기는 감소함을 보인다. 그러나 생분해성 고분자의 종류에 의한 입자 크기 차이는 크지 않음을 보인다. 실시예 2, 실시예 4, 실시예 6, 실시예 8, 실시예 10, 실시예 12, 실시예 14, 실시예 16, 실시예 18은 생분해성 고분자의 함량이 상대적으로 증가하면 입자의 크기또한 증가함을 보인다. 그러나 생분해성 고분자의 종류에 의한 입자 크기 차이는 크지 않음을 보인다. 실시예 19 내지 20은 폴리비닐알코올을 사용하여 생분해성 입자를 제조하여 측정한바 다소 [PEOn-PPOm-PEOn] triblock copolymer에 비해 입자의 크기가 증가됨을 보이며 입자의 크기 분포도 또한 넓은 동시에 입자의 크기 제어가 상기의 방법보다는 쉽지는 않다.
시험예 2. : 시험예 1에서 제조된 혼합비율 및 생분해성고분자 종류에 따른 입자의 형태학적관찰 실험
<표 2>
Figure PCTKR2020017567-appb-I000002
본 시험예에서는 각각의 실시예에서 제조된 마이크로 입자를 10배율의 광학현미경을 이용하여 입자의 모폴로지를 육안으로 분석하였다.
실시예 2에서는 기존의 실시예 1 내지 18에서는 모든 형상이 구형을 이룬다. 그러나 폴리비닐알코올을 사용하여 생분해성 입자를 제조하여을 때 실시예 19에서는 부분적으로 비정형의 입자가 형성되는 현상이 발생하고 실시예 20에서는 판상의 입자가 생성되었다.
시험예 3 : 시험예 1에서 제조된 혼합비율 및 생분해성고분자 종류에 따른 입자와 하이드로겔 혼합비율에 따른 지지체 형성 여부 실험
본 시험예는 혼합과정을 거처 원하는 형태로 성형이 가능한지 여부를 실험하기 위한것으로서 먼저 입자와 하이드로겔을 혼합하여 성형몰드에 투입 후 급속동결 및 -80도에서 24시간이상 동결건조하여 형태의 변화 및 유지를 확인하기 위한 실험이다.
본 실험은 실시예 21 내지 74의 혼합물을 동결 및 동결건조 과정을 거쳐 확인하였다. 확인결과 상기의 범위내에서는 원하는 형태로 성형이 가능함을 보였다.
시험예 4 : 시험예 3에서 제조된 폴리디옥사논(PDO), 폴리엘락틱산(PLLA)을 히알루론산과의 중량비율을 3대 7로 제조하였을 때 in vitro상에서의 분해 거동 실험
본 시험은 폴리디옥사논/히알루론산 복합체, 폴리엘락틱산/히알루론산 복합체의 분해 거동을 실험한 것으로서, 실험 방법은 1×PBS, pH 7.2 100ml에 3cm(가로)×3cm(세로)×1cm(높이)가 3cm3인 스폰지 타입의 지지체를 제조하여 36℃ 인큐베이터에 1일, 7일, 14일, 30일동안 측정하여 지지체의 무게 감소율을 측정한 자료이다.
실험결과는 하기 표 3와 같았다.
<표 3>
Figure PCTKR2020017567-appb-I000003
본 실험의 결과에서는 A 및 B의 무게 감소가 현저히 발생되는 이유는 최초 히알루론산에 의해 무게가 감소되며 폴리디옥사논도 분해가 서서히 일어남을 알 수 있다. 그러나 폴리디옥사논의 함량이 높을수록 분해 속도의 차이는 발생한다. C 및 D의 경우 폴리엘락틱산은 무게 감소률이 폴리디옥사논보다는 우수함을 나타내었다. 따라서 상기의 표 3의 실험결과를 토대로 NST공법으로 제조된 폴리디옥사논 과 폴리엘락틱산을 적절히 배합하면 두 생분해성 고분자의 장점을 잘 활용할 수 있을 것이다. 즉 상대적으로 분해기간이 월등한 폴리엘락틱산이 주 지지체 역할을 하면서 분해기간이 짧은 폴리디옥사논이 in vivo상에서 분해되는 동시에 콜라겐층을 자극하여 조직재생이 더 안정적으로 이루어질 것으로 보인다. (시험예 5에서 확인)
시험예 5 : 폴리디옥사논(PDO), 폴리엘락틱산(PLLA), 히알루론산과의 in vivo상에서의 피부 표면 및 부피측정 비교 실험.
본 실험은 폴리디옥사논, 폴리엘락틱산, 히알루론산 각각의 안전성 및 지속성, 생분해능에 대한 결과를 보기 위한 실험으로 향후 상기의 세가지 성분을 혼합했을때의 효능을 예측하기 위한 기초 실험이다.
본 실험은 NST공법으로 제조된 폴리디옥사논 10 내지 75um의 입자, 폴리엘락틱산 10 내지 75um의 입자, 분자량이 1200kDa인 히알루론산 2중량 백분율인 수용액을 각각 주입 후, PRimoslite 3차원 광학 피부표면 측정과 부피측정 를 통해 안전성 및 지속성, 생분해능을 측정하였다.
도 13, 도 14에서 보듯이 히알루론산은 부피 변화가 4주차까지는 지속적으로 증가한 후 서서히 감소하는 경향을 보이며 폴리엘락틱산 입자와 폴리디옥사논 입자는 시간 경과에 따라 서서히 감소하는 것을 보였다. 그리고 폴리디옥사논 입자는 12주 경과 후 필러에 의해 증가된 부피는 확인되지 않았다.
시험예 6 : 폴리디옥사논(PDO), 폴리엘락틱산(PLLA), 히알루론산과의 in vivo상에서의 조직학적평가 비교 실험.
본 실험은 NST공법으로 제조된 폴리디옥사논 10 내지 75um 의 입자, 폴리엘락틱산 10 내지 75um의 입자, 분자량이 1200kDa인 히알루론산 2중량 백분율인 수용액을 각각 주입 후 시간 경과에 따른 조직적인 평가를 실시하기 위한 실험이다.
본 시험은 각각의 시간 경과에 따라 조직을 적출하여 MT(Masson's Trichrome) 방법으로 염색한 후 필러 주입에 의한 침윤된 교원섬유를 확인하였다. 교원섬유를 확인하기 위한 Verhoeff-Van Gieson stain과 목적이 같지만 교원섬유와 세포 간 섬유의 구별이 용이하여 Collagen fiber, nuclei는 파란색으로 염색되고 cytoplasm, keratin, muscle fibers, intra-cellular fibers는 붉은색으로 염색된다. 모든 조직 슬라이드는 광학 현미경을 이용하여 100배율로 육안 측정하였다.
측정결과 히알루론산, 폴리디옥사논 입자, 폴리엘락틱산 입자는 모두 주입 후, 4주부터 각 필러의 입자 사이에 교원섬유가 증가하였다.
따라서 시험 5와 6의 결과를 종합적으로 판단하면, 각각의 유효성은 입증되었다. 그리고 3종을 혼합하여 사용하면 결과적으로 조직재생에 효과가 상승할 것으로 기대되어진다.
시험예 7 : 폴리디옥사논(PDO), 폴리엘락틱산(PLLA), 히알루론산 혼합물의 in vivo상에서의 시간에 따른 조직학적평가 실험.
본 실험은 NST공법으로 제조된 폴리디옥사논 10 내지 75um 의 입자, 폴리엘락틱산 10 내지 75um 의 입자, 분자량이 1200kDa 인 히알루론산 혼합물을 주입 후 시간 경과에 따른 조직적인 평가를 실시하기 위한 실험이다.
본 실험에서 사용된 혼합물의 비율은 폴리디옥사논 입자. 폴리엘락틱산 입자. 히알루론산을 1 대 0.25대 0.4의 무게 중량부 비율을 혼합하여 사용하였다.
본 시험은 각각의 시간 경과에 따라 조직을 적출하여 MT(Masson's Trichrome) 방법으로 염색한 후 필러 주입에 의한 침윤된 교원섬유를 확인하였다. 교원섬유를 확인하기 위한 Verhoeff-Van Gieson stain과 목적이 같지만 교원섬유와 세포 간 섬유의 구별이 용이하여 Collagen fiber, nuclei는 파란색으로 염색되고 cytoplasm, keratin, muscle fibers, intra-cellular fibers는 붉은색으로 염색된다. 모든 조직 슬라이드는 광학 현미경을 이용하여 100배율로 육안 측정하였다.
조직학적 판단결과 각각의 성분 단독으로 사용보다 초기 증가율은 유사하였고 생분해 능력은 평균치 이며 고체 성질에 가까운 물성을 지녔음에도 불구하고 자연스럽게 퍼지는 장점이 있다. 또한 조직의 콜라겐층 재생 효과에도 탁월함을 입증하였다.
본 발명에 따른 비 자발적 에멀전 확산법을 이용한 조직 재생용 지지체 조성물의 제조방법은 가수분해시간을 감소시키면서도 높은 기계적 강도를 나타내는 결정성 배양 및 비 결정성배양이 동시에 존재하여 부가가치가 높은 조직 재생용 지지체 조성물을 분야에 이용될 수 있다.

Claims (10)

  1. 양친성 생체적합성 고분자에 열에너지를 가하여 용해시키는 생체적합성고분자용해단계;
    상기 생체적합성고분자용해단계를 통해 용해된 용액에 생분해성 고분자를 혼합하고 입자화시키는 생분해성고분자입자화단계;
    상기 생분해성고분자입자화단계를 통해 제조된 혼합물에 정제수를 투입하고 원심분리하는 원심분리단계; 및
    상기 원심분리단계를 통해 원심분리된 혼합물을 동결건조하는 동결건조단계;로 이루어지며,
    상기 생분해성 고분자는 폴리-락틱-코-글리콜릭 액시드(PLGA), 폴리하이드록시부티레이트(PHB), 폴리파라디옥사논코입실론카프론락톤(PDCL), 폴리글리콜릭코입실론카프론락톤(PGCL) 및 폴리엘락틱입실론카프론락톤(PLCL)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로 이루어지고,
    상기 양친성 생체적합성 고분자는 중량평균분자량이 300 내지 100000Da인 폴리비닐알코올이며,
    상기 양친성 생체적합성 고분자는 질량농도가 12 내지 13 중량%이고,
    상기 동결건조단계 이후에는 동결건조단계를 통해 동결건조된 혼합물을 하이드로겔과 혼합하고 동결 및 동결건조하는 하이드로겔혼합단계가 더 진행되며,
    상기 하이드로겔은 소듐카르복실메틸셀룰로오스 및 그 유도체로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 비 자발적 에멀전 확산법을 이용한 조직 재생용 지지체 조성물의 제조방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 생분해성 고분자는 입자생성크기가 1 내지 300㎛인 것을 특징으로 하는 비 자발적 에멀전 확산법을 이용한 조직 재생용 지지체 조성물의 제조방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 생분해성고분자입자화단계는 생분해성 고분자 100 중량부에 양친성 생체적합성 고분자 1200 내지 2400 중량부를 혼합하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 비 자발적 에멀전 확산법을 이용한 조직 재생용 지지체 조성물의 제조방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 생분해성고분자입자화단계는 60 내지 220℃의 온도와 -0.01 내지 2m bar의 압력 및 10 내지 500rpm의 교반속도로 이루어지는 것을 특징으로 하는 비 자발적 에멀전 확산법을 이용한 조직 재생용 지지체 조성물의 제조방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 생분해성고분자입자화단계는 생분해성 고분자 100 중량부에 양친성 생체적합성 고분자 1200 내지 2400 중량부를 혼합하고 초음파를 조사하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 비 자발적 에멀전 확산법을 이용한 조직 재생용 지지체 조성물의 제조방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 원심분리단계는 상기 생분해성고분자입자화단계를 통해 제조된 혼합물 100 중량부에 정제수 800 내지 2000 중량부를 투입하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 비 자발적 에멀전 확산법을 이용한 조직 재생용 지지체 조성물의 제조방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 원심분리단계는 3000 내지 15000rpm의 속도로 1 내지 10분 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 비 자발적 에멀전 확산법을 이용한 조직 재생용 지지체 조성물의 제조방법.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 동결은 -40 내지 -30℃의 온도로 이루어지며,
    상기 동결건조는 -30 내지 -20℃의 온도와 -1m bar 이하에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 비 자발적 에멀전 확산법을 이용한 조직 재생용 지지체 조성물의 제조방법.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 하이드로겔혼합단계는 동결건조된 혼합물과 하이드로겔이 1:9 내지 9:1의 중량부로 혼합되어 이루어지는 것을 특징으로 하는 비 자발적 에멀전 확산법을 이용한 조직 재생용 지지체 조성물의 제조방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 따른 비 자발적 에멀전 확산법을 이용한 조직 재생용 지지체 조성물의 제조방법으로 제조되는 조직 재생용 지지체 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 연조직 수복제.
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