DE60304037T2 - Pluripotenzdeterminierender faktor und deren anwendungen - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Pluripotenz bestimmende Faktoren und Ihren Gebrauch. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf das Erhalten und Ableiten von Kulturen pluripotenter Zellen der Maus, des Menschen oder anderer Spezies. Von bestimmten Linien der Maus können embryonale Stammzellen abgeleitet und in einem pluripotenten Zustand in Kultur gehalten werden mittels eines Cytokins, das Signal Transduktion durch den LIF-Rezeptor/gp130-Komplex aktiviert. Dieser Ansatz ist jedoch auf Mäuse beschränkt und ist nicht ausreichend für die Vermehrung von menschlichen, pluripotenten Zellen.
  • Die Entdeckung der extrazellulären Aktivität ESRF (Dani et al., 1998) hat einen Beleg für einen LIF-Rezeptor/gp130-unabhängigen Weg zur Erhaltung von ES-Zellidentität geliefert. Allerdings ist ESRF unvollständig charakterisiert und die molekulare Natur anderer extrazellulärer Regulatoren als der von gp130 Cytokinen ist unbekannt.
  • Desweiteren ist die transkriptive Bestimmung von Pluripotenz nicht vollständig verstanden. Eine wichtige Rolle wurden dem gp130 Zeil STAT3- und dem POU-Faktor Oct-4 zugeschrieben, doch keine dieser beiden ist alleine ausreichend, um ES-Zellidentität zu spezifizieren.
  • WO 02/097090 beschreibt die Identifikation von ECAT- (mit ES-Zellen assoziiertes Transkript) Genen durch Abfragen von Nukleotidsequenzdatenbanken und nachfolgende Analyse des Expressionsmusters von ECAT-Genen von Mäusen und Menschen. WO 02/097090 beschreibt ebenfalls die Verwendung von Sonden zum Identifizieren von ES-Zellen und zur selektiven Isolierung von ES-Zellen unter Verwendung von ECAT-Genen. Oct-4 ist ein ECAT-Gen und ein spezifischer Marker von pluripotenten Zellen, obwohl es ebenfalls in Oozyten, sich teilenden Embryonen und in Eizylinder-Stadien exprimiert wird.
  • WO 01166697 beschreibt Kulturen von ES-Zellen in einem Medium frei von tierischem Serum und in Anwesenheit von Fibroblast-Wachstumsfaktor. Vorzugsweise werden die ES-Zellen in Anwesenheit einer Fibroplast-Nährschicht gezüchtet.
  • WO 97/30151 der vorliegenden Anmelder beschreibt ESRF, ein Cytokin, das in der Lage ist, die Differenzierung von ES-Zellen zu verhindern.
  • WO 96/22693 bezieht sich auf die Erhaltung von sich selbst erneuernden hämatopoietischen Stammzellen. Insbesondere beschreibt WO 96/22693 einen "F-Faktor", der in der Lage ist, hämatopoietische Stammellen in einem undifferenzierten Zustand zu erhalten und die Proliferation von undifferenzierten hämatopoietischen Stammzellen zu unterstützen.
  • Berger C.N. und Sturm K.S., Growth Factors 1997, Band 14, Seiten 145-159, beschreibt die Selbsterneuerung von ES-Zellen in Abwesenheit von exogenem LIF und Feeder-Zellen. Berger und Sturm beschreiben jedoch nicht die Isolierung irgendeines Faktors, der in der Lage ist, die Selbsterneuerung von ES-Zellen unter diesen Bedingungen zu fördern.
  • Die Genbank-Zugriffsnummern AK010332, 2001, und AK022643, 2000, stellen Sequenzen von cDNAs der Maus und des Menschen für Homeobox-Domain enthaltende Proteine zur Verfügung. Keine Funktion ist diesen Molekülen zugeschrieben.
  • Es ist bekannt, dass die Pluripotenz von menschlichen embryonalen Stammzellen und embryonalen Keimzellen durch Cokultivierung mit einer Nährstoffschicht heterologener Zellen (Amit et al., Dev. Biol. 2000) oder Extrakten davon (Xu et al., Nat. Biotech 2001) erhalten wird. Die Abhängigkeit von Feeder-Zellen gibt jedoch Anlass zu einer Anzahl von Problemen. Cokultivierung von Feeder-Zellen und pluripotenten Zellen können gefährdete Kulturbedingungen maskieren. Bei der Cokultivierung besteht das Risiko einer Kontamination der daraus erhaltenen pluripotenten Kultur/des differenzierten Produkts. Um Feeder-Zellextrakt zu herzustellen, was eine Alternative zur Benutzung der Zellen ist, muss eine separate Feeder-Zellpopulation aufrechterhalten und verarbeitet und der Extrakt aufbewahrt werden. Das der Extrakt uncharakteritisch ist stellt er eine weitere Quelle zur Kontamination des Produktes dar. Die Analyse und Manipulation der Differenzierung von pluripotenten Zellen wird gefährdet durch die Anwesenheit von Feeder-Zellen oder undefinierten Extrakten.
  • In Relation zu vielen anderen Spezies, insbesondere Schweinen, Rindern und Ratten, ist es immer noch nicht möglich, pluripotente ES-Zellen abzuleiten und in Kultur stabil zu erhalten.
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist, eine verbesserte Kultur pluripotenter Zellen der Maus und des Menschen bereitzustellen und ein Ziel spezieller Ausführungsarten der Erfindung ist, die Abhängigkeit von Feeder-Zellen in pluripotenter Zellkultur zu beseitigen. Ein weiteres Ziel ist, die Ableitung und Aufrechterhaltung pluripotenter Zellen von anderen Spezies bereitzustellen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt dementsprechend Verwendungen von Faktoren bereit, die Pluripotenz in Säugetieren bestimmen und die charakterisiert sind durch ein Polypeptid, das wenigstens 50% Sequenzidentität mit SEQ ID NO:4 hat. Eine pharmazeutische Zusammensetzung nach der Erfindung enthält einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und einen das Polypeptid enthaltenden Faktor. Ein Zellkulturmedium umfasst einen das Polypeptid enthaltenden Faktor.
  • Es wurde gefunden, dass in einer Kultur von ES-Zellen der Faktor ausreichend ist, diesen Zellen Pluripotenz zu verleihen. Nach der Erfindung kann der Faktor in einer pluripotenten Zelle auf einem Niveau aufrechterhalten werden, das in der Erhaltung eines sich selbsterneuernden pluripotenten Phänotyps resultiert. Der Faktor kann endogen sein – ein zellulärer Spiegel des Faktors, der durch Aktivierung eines endogenen Gens aufrechterhalten wird – oder in die Zelle eingeführt sein, um dadurch die stabile Aufrechterhaltung des pluripotenten Phänotyps der Zellen zu ermöglichen.
  • Ein spezieller Faktor nach der Erfindung wirkt intrazellulär, hält eine Zelle in einem pluripotenten Zustand und ist, in Zellkultur, konstitutiv aktiv. In diesem Zusammenhang zeigt die Referenz auf intrazelluläre Aktion an, dass der Ort der Aktivität sich innerhalb der Zelle befindet.
  • Der Faktor ist deshalb zum Beispiel kein Ligand für einen Zelloberflächenrezeptor wie dies bei LIF und anderen Cytokinen der Fall ist, und er kann unabhängig von Signalisieren von gp130 Rezeptoren wirken.
  • Weitere Pluripotenz bestimmende Faktoren nach der Erfindung erhalten pluripotente, in ES-Zellmedium ohne gp130-Aktivatoren kultivierte Zellen in einem pluripotenten Zustand aufrecht. Der Faktor ist demnach in der Lage, Säugetierzellen in einem pluripotenten Zustand in Abwesenheit von gp130-Aktivierung aufrechtzuerhalten und kann die Aufrechterhaltung von Pluripotenz in Kulturmedium ohne Cytokine fördern, die gp130-Rezeptorkomplexe aktivieren. In unten gegebenen Beispielen haben wir gezeigt, dass Zellen, die bevorzugte Faktoren nach der Erfindung exprimieren, von dem Erfordernis der gp130-Stimulation befreit sind und eine reduzierte oder gar nicht vorhandene Differenzierung in Antwort auf Retinoidsäure, 3-Methoxybenzamid und Aggregation zeigen – ihre Differenzierung ist demnach unterdrückt in Antwort auf diese Stimulationen. Der Faktor spezieller Beispiele ist desweiteren nicht ein stromabwärts gerichtetes transkriptionelles Ziel von gp130. Die Faktoren nach der Erfindung wurden isoliert und sind geeignet zur Aufrechterhaltung von tierischen pluripotenten Zellen, tierischen Zellen einschliesslich denen von Mäusen, Menschen, Primaten, Schafen, Ratten, Schweinen, Kühen und anderen Tieren. Ein Faktor nach der Erfindung erhält Pluripotenz einer menschlichen ES-, EC- oder EG-Zelle oder anderer menschlicher pluripotenter Zellen aufrecht. Ein anderer Faktor nach der Erfindung erhält Pluripotenz einer ES-, EC- oder EG Zelle der Maus aufrecht und wirkt intrazellulär und ist konstitutiv aktiv. Ein weiterer Faktor nach der Erfindung erlaubt die kontinuierliche Vermehrung pluripotenter Zellen von nicht-permissiven Linien der Maus in Kultur.
  • Ein Vorteil der Erfindung liegt in dem Vermögen, pluripotente Zellen in Kultur stabil zu vermehren. Faktoren nach der Erfindung können in Kulturen verwendet werden, um Zellen des Menschen oder der Maus in einem proliferativen, pluripotenten Zustand aufrechtzuerhalten. Die Erfindung offeriert desweiteren die Möglichkeit, pluripotente Zellen von anderen Spezies als Mensch und Maus zu isolieren und zu erhalten – was bisher nicht möglich war.
  • Ein Faktor einer speziellen Ausführungsart ist ein Transkriptionsfaktor. Er wirkt innerhalb des Kerns, was zu einer Selbsterneuerung der ES-Zelle führt. Ein bevorzugter Faktor, wie er unten in einem Beispiel beschrieben und verwendet wird, enthält eine Homeodomain.
  • Im Gebrauch eines Faktors nach der Erfindung erhält der Faktor Zellen in einem pluripotenten Zustand aufrecht in Abwesenheit einer Feeder-Schicht oder einem Feeder-Zellextrakt und in Abwesenheit eines gp130-Cytokins. Entsprechend ist die Zugabe des Faktors ausreichend, Pluripotenz von Zellen in Kultur aufrechtzuerhalten. Der Faktor kann zu einem Standard ES-Zellkulturmedium zugegeben werden oder direkt in Zellen eingeführt werden, zum Beispiel durch Elektroporation oder Mikroinjektion, oder in der Zelle produziert werden durch eine Vielzahl von hierin beschriebenen Verfahren. In speziellen Beispielen der Erfindung, wie sie detaillierter unten beschrieben sind, unterstützen Vektoren, die den Faktor exprimieren, cytokinunabhängige ES-Zellvermehrung sowohl durch episomale Transfektion von Zellen als auch durch chromosomale Integration in Zellen; eine weitere, durch Beispiele nicht speziell belegte Möglichkeit besteht darin, die Expression einer endogenen, für den Faktor kodierenden Sequenz zu induzieren oder zu erhöhen, um dadurch die Selbsterneuerung von ES-Zellen zu ermöglichen.
  • In einer weiteren Ausführungsart der Erfindung ist der Faktor identifizierbar durch seine Eigenschaft, auf LIF nicht ansprechende Zellen in einem pluripotenten Zustand aufrechtzuerhalten.
  • Der Faktor ist geeigneterweise ein Polypeptid mit 200 bis 400 Aminosäuren. Speziell wird ein menschlicher Pluripotenz bestimmender Faktor repräsentiert durch SEQ ID NO 4; im Vergleich dazu wird ein Pluripotenz bestimmender Faktor der Maus repräsentiert durch SEQ ID NO 2, ein Pluripotenz bestimmender Faktor der Ratte durch SEQ ID NO 6, und ein Pluripotenz bestimmender Faktor des Makaken durch SEQ ID NO 8.
  • Ein zweiter Aspekt der Erfindung liegt in einem Faktor, der eine Zelle in einem pluripotenten Zustand erhält, intrazellulär wirkt und eine Homeodomain umfasst, insbesondere eine Homeodomain, die wenigstens 50% Sequenzidentität mit der Homeodomain von SEQ ID NO 4 hat oder, in Beziehung auf einen Faktor für Zellen einer gegebenen Spezies, eine, die wenigstens 50% Sequenzidentität mit einer Homoedomain eines Pluripotenz bestimmendem Faktors der gleichen Spezies hat. Generell hat eine Homeodomain eine Länge um 60 Aminosäuren und umfasst der Faktor eine Homeodomain, in der jedes 20. Aminosäurefragment wenigstens 35% Sequenzidentität mit der Homeodomain von SEQ ID NO:4 hat. Bevorzugt erhält der Faktor auf LIF nicht ansprechende Zellen in einem pluripotenten Zustand.
  • Ein Faktor einer weiteren Ausführungsart ist einer, der kultivierte Epiblast-Zellen nicht permissiver Linien von Mäusen in einem pluripotenten Zustand aufrechterhält in Abwesenheit von Feeder-Zellen und in Abwesenheit von Feeder-Zellextrakt. Ein zweiter solcher Faktor ist einer, der von einem menschlichen Embryo abgeleitete Zellen (einschliesslich ES- und EG-Zellen) in einem pluripotenten Zustand aufrechterhält in Abwesenheit von Feeder-Zellen und in Abwesenheit von Feeder-Zellextrakt.
  • Die Vermeidung von Feeder-Zellen oder von Feeder-Zellextrakt hat den Vorteil, die Kontamination der Kultur mit unerwünschten Zellen zu reduzieren. Mäusezellen wurden eingesetzt als Feeder-Zellen für menschliche pluripotente Zellkulturen, so dass die Erfindung das Risiko einer Kontaminierung der menschlichen pluripotenten Zellpopulation durch nicht-menschliche Zellen signifikant reduziert und eventuell sogar eliminieren kann. Wenn von ES-Zellen abgeleitete Produkte in Transplantationstherapien eingesetzt werden sollen, ist eine Garantie der Abwesenheit nichtmenschlicher Zellen wahrscheinlich essentiell, sowohl zur einleitenden Isolation von Zellen als auch für die nachfolgende Vermehrung.
  • Desweiteren werden durch die Erfindung Konjugate des Faktors mit einer anderen, funktionalen Domain bereitgestellt. Ein erstes solches Konjugat umfasst erste und zweite Domains, wobei die erste Domain einen Faktor nach der Erfindung enthält und die zweite Domain die Aufnahme der ersten Domain in eine Zelle fördert z.B. Protein-Transduktionsdomains von Antennapedia, HIV-1 TAT Protein oder HSV-1 VP22 Schwarze et al., 2000). Das Konjugat kann deshalb verwendet werden als eine Kulturmediumkomponente. Die zweite Domain kann auch eine Kernlokalisierungssequenz enthalten, um die Weiterleitung des Faktors zum Kern nach seiner Aufnahme in eine Zelle zu unterstützen.
  • Um die Freisetzung der ersten Domain von der zweiten bei der Verwendung zu ermöglichen, kann die erste Domain eines bevorzugten Konjugats abgespalten werden von der der zweiten Domain innerhalb der Zelle. Die erste Domain kann mit der zweiten Domain verbunden sein durch eine Disulfidbrücke – was die Freigabe der ersten Domain in der reduzierenden Umgebung der Zelle erlaubt. Die erste Domain kann mit der zweiten Domain kovalent verbunden sein, was die Aufspaltung der Verbindung durch eine in der Zelle vorhandene Protease erlaubt. Es ist desweiteren möglich, dass die zweite Domain eine Sequenz enthält, die die Regulation der Aktivität des Faktors erlaubt, zum Beispiel einen Steroid-Hormonrezeptor (Pciard, 2000).
  • Weitere isolierte Polypeptide nach der Erfindung umfassen (a) Polypeptidmoleküle mit einer Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO:4 vorhanden; (b) natürlich vorkommende Varianten von (a); (c) Orthologe von (a) oder (b), und (d) biologisch aktive und diagnostisch oder therapeutisch nützliche Fragmente, Analoga und Derivative davon.
  • Das Polypeptid nach der vorliegenden Erfindung kann ein rekombinantes Polypeptid, ein natürliches Polypeptid oder ein synthetisches Polypeptid, vorzugsweise ein rekombinantes Polypeptid, sein.
  • Die Begriffe "Fragment", "Derivat" und "Analogon" bedeuten in Bezug auf das Polypeptid nach der Erfindung ein Polypeptid, welches im wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität wie das Polypeptid behält. Das Fragment, Derivat oder Analogon des erfindungsgemässen Polypeptids kann eines sein (i), in dem einer oder mehrere der Aminosäurereste substituiert ist/sind mit einem konservierten oder nicht-konservierten Aminosäurerest (vorzugsweise mit einem konservierten Aminosäurerest) und wobei dieser substituierte Aminosäurerest einer sein oder nicht sein kann, der durch den genetischen Code kodiert wird, oder (ii), in dem einer oder mehrere der Aminosäurereste eine Substituent Gruppe enthält/enthalten, oder (iii), in dem das reife Polypeptid mit einer anderen Verbindung verschmolzen ist, wie einer Verbindung zur Erhöhung der Halbwertszeit des Polypeptids (zum Beispiel Polyethylenglykol), oder (iv), in dem die zusätzlichen Aminosäuren verschmolzen sind mit dem reifen Polypeptid, um zum Beispiel die Reinigung des reifen Polypeptids zu erleichtern. Von solchen Fragmenten, Derivaten und Analoga wird angenommen, dass sie innerhalb der Reichweite von Fachpersonen nach der hier gegeben Lehre Liegen.
  • Die Polypeptide nach der Erfindung können ebenfalls dazu verwendet werden, Antikörper herzustellen, die spezifisch an Pluripotenz bestimmender Faktor Epitope, an Peptide oder Polypeptide binden. Verfahren zur Herstellung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper sind im Stand der Technik gut bekannt (siehe zum Beispiel Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999; und Hurrel, J.G.R, Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Ress, Inc. Boca Raton, Fla., 1982, welche per Referenz hier eingeführt werden). Polyklonale Antikörper können erzeugt werden aus einer Vielzahl von Tieren, wie z.B. von Pferden, Kühen, Ziegen, Schafen, Hunden, Hühnern, Hasen Mäusen und Ratten.
  • Die Immunogenität eines Pluripotenz bestimmender Faktor Polypeptids kann erhöht werden durch die Verwendung eines Adjuvants, wie z.B. Alum (Aluminium-Hydroxid) oder Freund's vollständiges oder unvollständiges Adjuvant. Für die Immunisierung geeignete Polypeptide beinhalten ebenfalls Fusionspolypeptide wie z.B. Fusionen von Pluripotenz bestimmender Faktor oder einem Teil davon mit einem Immunoglobulin Polypeptid oder mit Maltose Bindungsprotein. Das Polypeptid Immunogen kann ein Molekül mit voller Länge oder ein Teil davon sein. Wenn der Polypeptidteil "haptenartig" ist, kann dieser Teil mit Vorteil verbunden sein mit einem makromolekularen Träger (wie z.B. Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH), Rinderserum Albumin (BSA) oder Tetanus Toxoid) zur Immunisierung.
  • So wie er hier gebraucht wird, schliesst der Begriff "Anitkörper" polyklonale Antikörper, affinity-gereinigte polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, und Antige-Bindungsfragmente, wie z.B. (F(ab')2 und Fab proteolytische Fragmente ein. Genetisch hergestellte intakte Antikörper oder Fragmente, wie z.B. chimäre Antikörper, Fv-Fragmente, Einzelkettenantikörper und dergleichen, sowie auch synthetische Antigen-Bindungspeptide und -polypeptide sind ebenfalls eingeschlossen. Nichtmenschliche Antikörper können humanisiert werden durch Pfropfen von ausschliesslich nichtmenschlichen CDRs auf menschliches Gerüst und konstante Regionen, oder durch Einschliessen der gesamten nicht-menschlichen variablen Domains (wahlweise durch "Einhüllen" mit einer menschenähnlichen Oberfläche durch Ersetzen exponierter Reste, wobei das Ergebnis ein "furnierter" Antikörper ist). In einigen Fällen können humanisierte Antikörper nichtmenschliche Reste zurückbehalten innerhalb der menschlichen variable region framework Domainen, um passende Bindungscharakteristiken zu erhöhen. Durch Humanisierung von Antikörpern kann die biologische Halbwertszeit vergrössert werden und das Potential für immunologische Gegenreaktionen bei der Verabreichung an Menschen wird reduziert. Alternative Techniken zur Erzeugung oder Auswahl von Antikörpern, die hier verwendbar sind, umfassen in vitro Aussetzen von Lymphozyten einem Pluripotenz bestimmender Faktor Protein oder Pepid, und Auswahl von Antikörper Display-Bibliotheken in Phage oder ähnlichen Vektoren (zum Beispiel durch Verwendung von immobilisiertem oder gekennzeichnetem Pluripotenz bestimmender Faktor Protein oder Peptid).
  • Antikörper werden als spezifisch bindend angesehen, wenn sie an ein Pluripotenz bestimmender Faktor Polypeptid mit einer Affinität (Ka) von 106 M–1 oder grösser binden, vorzugsweise 107 M–1 oder grösser, weiter bevorzugt 108 M–1 oder grösser, und am meisten bevorzugt 109 M–1 oder grösser. Die Bindungsaffinität eines Antikörpers kann einfach bestimmt werden durch bekannte Techniken (z.B. durch Scatchard Analyse).
  • Eine den Fachpersonen bekannte Vielzahl von Assays kann angewendet werden, um Antikörper zu detektieren, die spezifisch an Pluripotenz bestimmender Faktor Proteine oder Peptide binden. Beispielhafte Assays sind im Detail beschrieben in Using Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (Eds,), Cold Spring Harbor Laboratory Ress, 1999. Representative Beispiele solcher Assays umfassen: gleichlaufende Immunoelektrophorese, Radioimmunassay, Radioimmunpräzipitation, Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA), Dot Blot Assay oder Western Blot Assay, Verhinderungs- oder Wettbewerbs-Asay, und Sandwich-Assay. Zusätzlich können Antikörper gescreent werden auf Bindung an natürliches gegen mutantes Pluripotenz bestimmender Faktor Protein oder Peptide.
  • Die Polypeptide nach der vorliegenden Erfindung enthalten zusätzlich das Polypeptid SEQ ID NO:4 (insbesondere das reife Polypeptid) so wie auch Polypeptide, die wenigstens 50% Ähnlichkeit (vorzugsweise wenigstens 50% Identität) mit dem Polypeptid von SEQ ID NO:4 haben und weiter bevorzugt wenigstens 90% Ähnlichkeit (weiter vorzugsweise wenigstens 90% Identität) mit dem Polypeptid von SEQ ID NO:4 haben und noch weiter bevorzugt wenigstens 95% Ähnlichkeit (noch weiter vorzugsweise wenigstens 95% Identität) mit dem Polypeptid von SEQ ID NO:4 haben und die ebenfalls Teile solcher Polypeptide enthalten, wobei diese Teile generell wenigstens 30 Aminosäuren und bevorzugt wengistens 50 Aminosäuren enthalten.
  • "Ähnlichkeit" zwischen zwei Polypeptiden wird bestimmt durch Vergleich der Aminosäuresequenz und deren konservierte Aminosäuren-Substituenten eines Polypeptids mit der Sequenz eines zweiten Polypeptids. Mehrere verschiedene Methoden sind bekannt zur Berechnung der Sequenzähnlichkeit und -identität. Generell ist ein geeigneter Weg zur Ausführung dieser Berechnungen die Durchführung von Datenbankrecherchen unter Verwendung eines Programms wie Smith-Waterman, BLAST oder FASTA, und unter Verwendung einer oder vorzugsweise zwei oder selbst drei Ähnlichkeitstafeln. Die Blosum und PAM (Point Accepted Mutation) Matritzen sind geeignete Aminosäuren-Ähnlichkeitsmatritzen für Datenbankrecherchen und Sequenz-Ausrichtung. Wenn Smith-Waterman oder FASTA verwendet wird, ist es wichtig sicherzustellen, dass die open gap penalty gross genug ist, und wenn die ersten Durchläufe keine homologen Sequenzen aufdecken, kann es geeignet sein, es mit einem anderen Algorithmus zu versuchen – das ist insbesondere der Fall, wenn man mit einem heuristischen Alogrithmus beginnt, BLAST oder FASTA.
  • Ein noch weiterer Aspekt der Erfindung liegt in Verbindungen, die den Faktor oder ein Konjugat enthalten und die eine pharmazeutische Verbindung mit dem Faktor oder dem Konjugat wie beschrieben zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptalen Träger einschliessen; und ein Zellkulturmedium mit dem Faktor oder dem Konjugat wie beschrieben.
  • Zellkulturmedium enthaltend einen Faktor und/oder ein Konjugat nach der Erfindung kann zusätzlich enthalten eine oder mehrere Komponenten ausgewählt aus den Gruppen bestehend aus GMEM, Serumersatz, essentiellen Aminosäuren, β-Mercaptoethanol, Pyruvat und Glutamin.
  • Das Kulturmedium enthält optional weiter einen Aktivator von gp130, wobei geeignete Aktivatoren Cytokine beinhalten, die als LIF-Rezeptor wirken, z.B. LIF, und IL-6 in Kombination mit löslichem IL-6-Rezeptor. Das Kulturmedium kann für die Erhaltung von pluripotenten Zellen verwendet werden, speziell von ES-, EC- und EG-Zellen und für die Selbsterneuerung pluripotenter Zellen, besonders von ES-, EC- und EG-Zellen. Das Medium kann weiter verwendet werden für die Erhaltung von somatischen Zellen, insbesondere somatischen Stammzellen, und in einer besonderen Ausführungsart der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zur Selbsterneuerung von somatischen Zellen, umfassend die Kultivierung der Zellen in Anwesenheit des Mediums und bevorzugt Vermehrung der Zellen in dem Medium. Eine noch weitere Verwendung des Kulturmediums ist zur Erhaltung und/oder Vermehrung von Zellen, die von pluripotenten Zellen abgeleitet sind.
  • Eine andere Anwendung der Erfindung liegt in der Vergrösserung der Zellpopulationen, zum Beispiel in der Vergrösserung von somatischen Zellen. Eine ex vivo Therapie, die ausgeführt werden kann unter Auswertung der Erfindung, umfasst die Entnahme einer Population von Zellen von einem Patienten, Kultivierung der Zellen in dem Kulturmedium nach der Erfindung, um so die Zellpopulation zu vergrössern, und danach Transplantieren oder Wiedereinführen der Zellen in den Patienten.
  • Weitere Kulturverfahren nach der Erfindung umfassen Erhalten und/oder Vermehren von Zellen durch Verwenden einer Kombination eines Faktors nach der Erfindung und Expression von Oct-4 und/oder Aktivierung von Oct-4. Der Faktor kann eingeführt werden als der Faktor per se oder via ein Konjugat oder unter Verwendung von Vektoren wie hierin beschrieben. Oct-4-Expression kann erreicht werden durch aufregulierende Expression eines endogenen Oct-4-Gens oder durch Einführen eines Oct-4 enthaltenden Expressionsvektors in die Zellen. Eine Kombination des Faktors nach der Erfindung und Oct-4 kann verwendet werden zum Erhalten und/oder Selbst-Erneuern und/oder Vermehren von Zellen. Insbesondere kann diese Kombination verwendet werden, erhöhte Selbsterneuerung pluripotenter Zelen und/oder erhöhte Erhaltung von Pluripotenz bereitzustellen. Die Kombination kann darüberhinaus zur Gewinnung plutipotenter Zellpopulationen verwendet werden. Es hat sich herausgestellt, dass eine Kombination des Faktors und Oct-4 zu einer verbesserten Selbsterneuerung pluripotenter Zellen führt, und diese Verbesserung wird ausgenutzt bei der Gewinnung neuer pluripotenter Zelllinien, insbesondere von menschlichen Zellen jedoch auch von Zellen anderer Tiere, einschliesslich mäuseartigen wie Ratte oder Maus; Primaten wie Affen, insbesondere Makaken; Schweinen; Schafen; und pluripotenten Zellen von Rindern.
  • Pluripotente Zellen, speziell ES-Zellen, werden geeigneterweise gewonnen durch Transfektieren von blastocystischen Zellen vor dem oder während des Ausplattierens, zum Beispiel zum Zeitpunkt, in dem Feeder-Zellen üblicherweise verwendet werden, oder zu dem Zeitpunkt, in dem die innere Zellmasse auf einer Platte ausgebreitet wird. Die Transfektion kann ausgeführt werden mit Zellen auf Feeder-Schichten oder nicht auf Feeder-Schichten, obwohl ein Vorteil darin liegt, jeden Kontakt zwischen den zu transfektierenden Zellen und Feeder-Zellen zu vermeiden. Es ist bekannt, dass Transgenese pluripotenter Zellen auf dieser Stufe erreichbar ist, einschliesslich für präimplantierte Embryos, und dementsprechend Transfektion, so dass ein Faktor nach der Erfindung exprimiert wird verwendet wird zur Gewinnung stabiler, pluripotenter Zellpopulationen.
  • Eine andere Verwendung der beschriebenen Technologie liegt in zellularer und nuklearer Reprogrammierung, wodurch die Erfindung ebenfalls ein Verfahren bereitstellt zur Reprogrammierung des Kerns einer somatischen Zelle, umfassend in Kontakt bringen der Zelle mit einem Faktor nach der Erfindung und Aktivieren von gp130-Signalisation in der Zelle, oder umfassend in Kontakt bringen der Zelle mit einem Faktor nach der Erfindung und Expimieren von Oct-4 in der Zelle. Zum Beispiel wird die Reprogrammierung ausgeführt durch Transfizieren der Zelle mit einem ersten Vektor, der eine Nukleotidsequenz enthält, die einen Faktor nach der Erfindung kodiert, und mit einem zweiten Vektor, der eine Nukleotidsquenz enthält, die einen LIF-Rezeptorliganden kodiert oder die eine Nukleotidsequenz enthält, die Oct-4 kodiert.
  • Die Erfindung stellt zusätzlich Polynukleotide bereit, welche die Faktoren nach der Erfindung kodieren. Bei der Verwendung des Faktors können eine Anzahl verschiedener Verfahren vorgeschlagenen werden zur Kontrolle oder Steuerung der Expression des Faktors, um dadurch Pluripotenz von Zellen in Kultur oder sonstwo zu fördern. Es ist demnach optional in das Polynukleotid eine Sequenz einzuschliessen, die die Expression des Faktors reguliert. Diese Sequenz kann ein Promotor sein und kann auch ein Promotor sein, dessen Aktivität reguliert ist. Weitere Polynukleotide nach der Erfindung kodieren die oben beschriebenen Konjugate.
  • Um den Spiegel des Faktors in einer bestimmten Zelle zu kontrollieren, kann ein den Faktor kodierendes und in der Zelle enthaltenes Gen aktiviert werden. Sowohl endogene als auch heterogene Promotoren sowie andere regulatorische Elemente können verwendet werden, sowie auch Faktoren, die auf diese regulatorischen Elemente einwirken. Eine Möglichkeit besteht in der Verwendung eines Polynukleotids zum Einsetzen einer regulatorischen Sequenz in das Genom einer Zelle, wobei die regulatorische Sequenz, wenn sie eingesetzt ist, die Expression eines den Faktor kodierenden Gens reguliert. Auf diese Weise kann ein endogenes Gen angedreht oder seine Expression erhalten werden. Die regulatorische Sequenz kann eingesetzt werden durch homologe Rekombination in das residente, den Faktor kodierende Gen. Die regulatorische Sequenz kann ein regulierter Promotor sein – zum Beispiel kann ein induzibler Promotor verwendet werden, so dass der Faktor exprimiert wird wenn das Kulturmedium einen Induzierer enthält; Entfernen des Induzierers führt zu reduzierter Expression des Faktors und zu Verlust an pluripotentem Phänotyp. Sequenzen, die die Entfernung oder Inaktivierung des Promotors ermöglichen können ebenfalls eingesetzt werden, um weitere Kontrolle der Expression des Faktors zu erhalten.
  • Ein anderes Verfahren, den Spiegel eines Faktors in einer Zelle zu kontrollieren besteht darin, sequenzspezifische DNA-bindende Polypeptid Domains zu designen oder auszuwählen, die Sequenzen erkennen im Promotor des endogenen PDF-Gens, zum Beispiel durch Verwendung von Phage Display (Isalan and Choo, 2001 Methods in Enzymology 340 p 593-609). Solche sequenzspezifischen DNA-bindenden Domains können dazu verwendet werden, die Transkription des endogenen PDF-Gens durch Fusion mit transkriptionalen Aktivierungsdomains zu aktivieren oder zu erhalten. Im anderen Falle kann die Fusion solcher sequenzspezifischer DNA-bindenden Polypeptid Domains mit Silencer-Domains dazu verwendet werden, PDF-Expression zu reduzieren. Zusätzlich können dieser Fusionen verbunden werden mit anderen Domainen, die die Aufnahme des Fusionsproteins in die Zelle fördern. Auf diese Weise können Moleküle, die auf das endogene PDF-Gen selbst einwirken, an Zellen verabreicht werden oder in Zellen exprimiert werden.
  • Die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung können in der Form von RNA vorliegen oder in der Form von DNA, welche DNA cDNA einschliesst, genomische DNA, und synthetische DNA. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein und wenn sie einzelsträngig ist, kann sie der kodierende Strang oder der nicht-kodierende (antisense) Strang sein. Die kodierende Sequenz, die das reife Polypeptide kodiert, kann identisch sein zu der kodierenden Sequenz, die SEQ ID NO:3 zeigt, kann eine unterschiedliche kodierende Sequenz sein, welche kodierende Sequenz, als Ergebnis der Redundanz oder Degenerierung des genetischen Codes, dasselbe reife Polypeptid wie die DNA kodiert.
  • Die isolierten Polynukleotide nach der Erfindung können kodieren (a) Polypeptidmoleküle umfassend eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO:4 vorhanden; (b) natürlich vorkommende Varianten von (a); (c) Orthologe von (a) oder (b), und (d) biologisch aktive und diagnostisch oder therapeutisch nützliche Fragmente, Analoga und Derivative davon.
  • Das Polynukleotid, das diese Polypeptide kodieren können ebenfalls zusätzliche kodierende Sequenz und/oder nicht-kodierende Sequenz enthalten wie z.B. Introns oder nicht-kodierende Sequenz 5' und/oder 3' der für das reife Polypeptid kodierenden Sequenz. Von daher beinhalten Referenzen auf "Polynukleotide" die Referenz auf ein Polynukleotid, das lediglich für das Polypeptid kodierende Sequenzen enthält als auch auf ein Polynukleotid, das zusätzliche kodierende und/oder nicht kodierende Sequenzen enthält.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiter auf Varianten der oben beschriebenen Polynukleotide, die Fragmente kodieren, Analoga und Derivate des Polypeptids und die die spezifizierte Aminosäuresequenz aufweisen. Die Varianten der Polynukleotide können natürlich vorkommende Varianten des Polynukleotids oder nicht-natürlich vorkommende Varianten des Polynukleotids sein.
  • Die Erfindung umfasst demnach Polynukleotide wie gezeigt in SEQ ID NO:3, die dasselbe reife Polypeptid kodieren sowie Varianten solcher Polypeptide, welche Varianten für ein Fragment, ein Derivat oder ein Analogon des Faktors kodieren. Solche Nukleotide umfassen Löschungsvarianten, Subsitutionsvarinaten und Additions- oder Insertvarianten.
  • Wie oben angedeutet kann das Polynukleotid eine kodierende Sequenz haben, die eine natürlich vorkommende Variante der kodierenden Sequenz wie in SEQ ID NO:3 gezeigt ist. Wie im Stand der Technik bekannt ist, kann eine abwechselnde Form einer Polynukleotidsequenz eine Substitution, Löschung oder Addition von einem oder mehreren Nukleotiden haben, was die Funktion des kodierten Polypeptids nicht wesentlich verändert.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiter auf Polynukleotide, welche zu einer oder mehreren der hierzuvor beschriebenen Sequenzen hybridrisieren, sofern wenigstens 70%, vorzugsweise wenigstens 90% und weiter bevorzugt wenigstens 95% Identität zwischen den Sequenzen besteht. Die vorliegende Erfindung bezieht sich speziell auf Polynukleotide, die unter strengen Bedingungen zu den hierzuvor beschriebenen Polynukleotiden hybridisieren. So wie hierin gebraucht bedeutet der Begriff "strenge Bedingungen", dass Hybridisierung lediglich auftritt, wenn wenigstens 95% und vorzugsweise 97% Identität zwischen den Sequenzen vorhanden ist. Die Polynukleotide, die mit den hierin beschriebenen Polynukleotiden in einer bevorzugten Ausführungsart hybridisieren, kodieren Polypeptide, die entweder im wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität behalten wie das reife, durch die cDNA von SEQ ID NO:3 kodierte Polypeptid.
  • Im anderen Falle kann das Polynukleotid wenigstens 20 Basen, vorzugsweise wenigstens 30 Basen und weiter bevorzugt wenigstens 50 Basen haben, die mit einem Polynukleotid nach der Erfindung hybridisieren und welches eine Identität zu diesem aufweist wie hiervor beschrieben und welches Aktivität behalten oder nicht behalten kann. Solche Polynukleotide können zum Beispiel eingesetzt werden als Sonde für das Polynukleotid von SEQ ID NO:3, zum Beispiel zur Rückgewinnung des Polynukleotids oder als eine diagnostische Sonde oder als ein PCR Primer.
  • Noch weiter bereitgestellt durch die vorliegende Erfindung sind Vektoren zum Gebrauch zur Expression des Faktors nach der Erfindung. Ein erster Vektor enthält ein Polynukleotid nach der Erfindung wie oben beschrieben. Ein in einem Beispiel der Erfindung beschriebener und verwendeter Vektor, wie er weiter unten detaillierter noch beschrieben wird, ist designed zur Transfektion einer Zelle, derart, dass der Faktor in der Zelle exprimiert wird und dass die transfizierte Zelle in einem pluripotenten Zustand erhalten wird. Generell enthalten solche Vektoren die folgenden operativ miteinander verbundenen Elemente: einen Transkriptions-Promotor; ein DNA-Segment enthaltend ein Polynukleotid nach der Erfindung; und ein Polyadenyl-Signal. Einen weitere Möglichkeit für den Vektor besteht darin, zusätzlich für einen selektiven Macker zu kodieren, wobei die Selektion dazu dient, Zellen zu identifizieren, die den Vektor aufgenommen haben und ihn exprimieren. Der Vektor kann zum Beispiel antibiotische Resistenz kodieren, mit der Zugabe von Antibiotikum zu der Zellkultur, die dazu verwendet wird, erfolgreiche Transfektanten zu identifizieren. Nach der Transfektion der Zelle kann der Vektor chromosomal integriert oder extra-chromosomal gehalten und die kodierende Sequenz so auf dem Vektor exprimiert werden, dass ein Spiegel des Faktors in der Zelle erhalten wird, der ausreicht, um die Zelle in einem pluripotenten Zustand zu erhalten.
  • Ein besonderer Vektor ist geschaffen worden für die Transfektion einer Zelle, die das grosse Polyoma T-Antigen exprimiert oder beinhaltet. Solch ein Vektor könnte einen Polyoma-Ursprung einer Replikation in der Weise haben, dass der Vektor in der Zell stabil erhalten bleibt, wenn das grosse Polyoma-T-Antigen präsent ist.
  • Weitere Kontrolle und Flexibilität kann auf das System übertragen werden, indem ein Promoter im Vektor verwendet wird, dessen Aktivität kontrolliert werden kann. Dadurch kann der Promoter, sich der Transfektion anschliessend, in einem nichtaktiven Zustand sein, was es dem Benutzer ermöglicht, zu wählen, wann der Promoter aktiviert wird – beispielsweise kann ein induzierter Promoter aktiviert werden, der Induktor kann dem Kulturnährboden zugefügt werden. Als Alternative kann der Promoter anfänglich aktiv sein, aber in der Weise, dass seine Aktivität reduziert oder durch Hinzufügung einer Suppressorsubstanz zum Kulturnährboden abgeschaltet wird – dies ermöglicht es dem Benutzer, nach einer Periode des Erhaltens der Zellen in einem pluripotenten Zustand, zu entscheiden, die Expression des über die Pluripotenz entscheidenden Faktors zu stoppen, was es ermöglicht, die Zellen zu differenzieren und die Kultur wesentlich von verbliebenen pluripotenten Zellen zu reinigen. Bei der Vorbereitung difterenzierter Abkömmlinge gibt es die Notwendigkeit, undifferenzierte Zellen zu entfernen, und demnach erteilt dieses Element der Erfindung diese Möglichkeit. Ein brauchbares System ist das Tet-Regulationssystem (Baron & Bujard, 2000). Der Vektor kann zusätzlich in der Weise konstruiert werden, dass seine nachfolgende Entfernung oder die Entfernung der Sequenz, die den Faktor kodiert, durch seitenspezifische Rekombination möglich ist.
  • Ein Vektor gemäss einer weitereN Ausgestaltung der Erfindung umfasst eine Nukleotidsequenz, die einen Regulationsfaktor kodiert, worin der Regulationsfaktor ein Gen reguliert, dass den Faktor der Erfindung reguliert. Der Regulationsfaktor ist geeignet, um zu aktivieren oder einzuschalten oder andererseits die Expression aus einem Gen zu vergrössern, was ein endogenes Gen sein kann oder auch extrachromosomal lokalisert sein kann. Dieser besondere Vektor hat eine Anzahl von Verwendungen. Eine transgenische Linie von Tieren kann vorbereitet werden, in denen ein Gen, dass den über die Pluripotenz bestimmenden Faktor kodiert, im Wesentlichen ausgeschaltet werden kann. Die transgenischen Tiere können dann genutzt werden, um Embryos und pluripotente Zellen zu generieren, die von dorther explantiert und mit diesem Faktor in der Weise transfektiert werden, dass der Regulationsfaktor des Vektors die Expression des über die Pluripotenz bestimmenden Faktors anschaltet, was die Erhaltung einer Kultur von pluripotenten Zellen erlaubt.. Alternativ kann ein binäres transgenisches Tier produziert werden, was sowohl den Vektor für den Regulationsfaktor als auch das regulierbare Gen des über die Pluripotenz bestimmenden Faktors beinhaltet. Das Letztere kann dann induziert werden, um in vivo Stammzellen zu immobilisieren.
  • Ein vorrangiger Gebrauch des Faktors, ob direkt oder durch Expression einer Nukleotidsequenz, die den Faktor kodiert, ist die Erhaltung von Zellen in einem pluripotenten Zustand. Die Polynukleotide können eine Sequenz sein, die für die Zelle endogen ist, beispielsweise kann die arteigene Sequenz aktiviert werden, um den Erhalt der Pluripotenz zu erzielen, oder es kann eine Nukleotidsequenz verwendet werden, die in die Zelle eingeführt wird. Die eingeführte Sequenz kann auch auf einem Plasmid sein. Ein Nukleotid, das den Faktor verschlüsselt, könnte auch auf einem dauerhaft integrierten Transgen liegen.
  • Die Erfindung stellt daher eine Methode zur Verfügung, um pluripotente Zellpopulationen zu erhalten, umfassend, Zugabe eines Faktors der Erfindung zu dieser Population. Eine weitere Kulturmethode ist es, eine Zelle durch Aktivierung eines Genes in der Zelle, das den Faktor der Erfindung kodiert, in einem pluripotenten Zustand zu erhalten. Eine noch weitere Methode zum Erhalt einer Zelle in einem pluripotenten Zustand umfasst die Erhaltung oder Vergrösserung der Expression eines Gens in der Zelle, das den Faktor gemäss der Erfindung kodiert.
  • Die über die Pluripotenz bestimmenden Faktoren der Erfindung können auch verwendet werden, um die Potenz einer somatischen oder nicht-pluripotenten Zelle zu vergrössern. Daher umfasst die Methode der Erfindung das Vergrössern der Potenz einer Zelle dadurch, dass die Zelle einem pluripotenten Faktor ausgesetzt wird; dieses Ausgesetztsein wird wahlweise durchgeführt durch Einführung des Faktors in die Zelle oder durch Exprimieren einer Nukleotidsequenz, die den Faktor kodiert, in die Zelle. Die Ausweitung der Potenz der Zelle kann wie eine Reprogrammierung des Kernes der Zelle sein, führend zu einer somatischen oder nicht-pluripotenten Zelle, die in eine pluripotente Stammzelle umgeformt wird. Alternativ kann der Effekt des Faktors der Erfindung auf die Zelle dazu führen, dass ihre Potenz erhöht wird, aber bislang wird die Potenz nicht so weit vergrössert, dass die Zelle auf pluripotentem Niveau Leistung erbringt. Sobald die Zelle Ihre Potenz vergrössert hat, kann die Zelle einer Ausdifferenzierung hinunter bis zu einer verschiedenen Abstammung unterliegen, und dann kann der Faktor der Erfindung nützlich sein bei der Respezifizierung der Abstammung einer gegebenen Zelle.
  • Der Faktor ermöglicht eine Anzahl von verschiedenen Strategien zur Beschaffung pluripotenter Zellen, die verfolgt werden können. Bei einer solchen Strategie wird eine pluripotente nichtmenschliche Zelle durch Schaffung eines transgenischen Lebewesens isoliert; das Lebewesen, das ein Konstrukt beinhaltet, in dem eine Nukleotidsequenz den Faktor der Erfindung kodiert, ist unter Kontrolle eines regulierten Promoters. Ein transgenisches Embryo wird dann erhalten aus dem transgenischen Lebewesen und einer Zelle, eine derartige wie eine epiblastische Zelle oder eine primordiale Keimzelle, die aus dem Embryo erhalten wird. Durch Aktivierung des Promotors wird der Faktor in der Zelle exprimiert und anschliessend können die pluripotenten Zellen isoliert werden. Bei diesem Ansatz wird daher das transgenische Lebewesen als initialer Schritt geschaffen, und dieser Ansatz ist besonders geeignet, wo Vorgehensweisen für die Schaffung von transgenischen Lebewesen existieren. Bei einem anderen Ansatz, der als Beispiel für Arten angenommen werden kann, in denen es nicht möglich oder in denen es technisch anfordernder ist, transgenische Lebewesen zu erzeugen, wird ein Nukleotid, das den Faktor der Erfindung kodiert, in eine Zelle in einer frisch isolierten Zellpopulation eingeführt und danach eine pluripotente Zelle isoliert. Bei der letzten Methode werden die Zellen aus den frisch isolierten Zellpopulationen schnell transfektiert, dass heisst, ohne dass es den Zellen erlaubt wird, in der Kultur ausreichend lange zu bleiben, um sich zu differenzieren, wird zumindest eine Zelle so transfektiert, dass der Faktor in dieser Zelle exprimiert wird. Wie erwähnt kann diese Methode besonderen Nutzen haben beim Derivatisieren und Erhalten pluripotenter Zellen aus Säugetieren oder anderen Lebewesen, in denen es nicht möglich ist, transgene Tiere zu machen. Daher sind mit dieser Erfindung auch transgene Lebewesen inbegriffen, die durch diese Methoden erschaffbar sind, und transgene Lebewesen, die eine Nukleotidsequenz enthalten, die einen Faktor gemäss der Erfindung unter Kontrolle eines regulierbaren Promoters kodieren.
  • Hierin sind Methoden beschrieben, in denen der Faktor und die funktionalen Analogien, Varianten, Bruchstücke verwendet werden, um die Erhaltung der Pluripotenz zu erhalten. Ein weiterer Vorteil der Erfindung und der Erkennung der über die Pluripotenz bestimmenden Faktoren ist, dass wir nun die Gelegenheit haben, Antagonisten gegen diese über die Pluripotenz bestimmenden Faktoren, deren Antagonisten gebraucht werden können, um die Aktivität der über die Pluripotenz bestimmenden Faktoren zu blockieren oder um andererseits als Antagonisten gegen solche Faktoren zu wirken, zu entwickeln. Antagonisten gegen diese Faktoren können gebraucht werden, um Differenzierungen von pluripotenten Zellen zu fördern, und dies hat einen Nutzen zum Beispiel in Situationen, in denen es erwünscht es, pluripotente Zellen entweder aus der Kultur oder in vivo zu entfernen. Die bisherige Erfindung ermöglicht also die Produktion von Lebewesen, die dominant negativ für den Faktor sind, wie zum Beispiel solche Lebewesen, die dominant negative Varianten oder dominant negative Mutanten des Gens aufweisen, das den Faktor kodiert.
  • Auch gibt es so durch die Erfindung eine Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch akzeptablen Träger plus einen Antagonisten des Faktors der Erfindung umfasst. Antagonisten können verwendet werden, um pluripotente Zellen vor Einführung von von pluripotenten Zellen abgeleiteten Abkömmlingen in einen Patienten effektiv zu entfernen, wie zum Beispiel in der Zelltherapie, um zum Beispiel Teratome und/oder andere Tumore aufgrund einer Kontamination von Material durch pluripotente Zellen zu vermeiden. Dies kann in vivo oder in vitro angewendet werden. Ein anderer Gebrauch von Antagonisten der Erfindung ist der als Kontrazeptivum. Ein weiterer Gebrauch des Antagonisten der Erfindung ist generell der für die Behandlung von Tumoren, speziell für Tumore, die verbunden sind mit unpassender Expression eines Faktors der Erfindung.
  • Zellen werden durch die Erfindung zur Verfügung gestellt, in denen die Expression oder Aktivität eines Faktors der Erfindung manipuliert wurde. Diese Zellen können in einem pluripotenten Zustand erhalten werden. Eine erste Zelle der vorliegenden Erfindung exprimiert einen Faktor der Erfindung über eine Zeitperiode von länger als 2 Wochen. Weitere Zellen der Erfindung sind (1) eine Zelle, die einen Vektor der Erfindung umfasst, (2) eine pluripotente, menschliche Zelle, die in einem pluripotenten Zustand in Abwesenheit von Feederzellextrakt erhalten wird, und (3) eine Zelle, die einen Faktor gemäss der Erfindung kodiert, worin sich das Gen aktiviert hat.
  • Zellen der Erfindung können auch zu einem Screen nach Molekülen verwendet werden, die in die Funktion des Faktors der Erfindung eingreifen. Eine solcher Screen umfasst das Kultivieren einer pluripotenten Zelle in der Gegenwart eines Faktors der Erfindung, wobei der Faktor zum Beispiel präsent ist durch Bereitstellung in Zellkulturmedium oder durch Expression in der Zelle, Kultivierung der Zelle in Gegenwart einer Testsubstanz anschliessender Beobachtung, ob es irgendeine Veränderung in dem pluripotenten Phänotyp der Zelle gibt. Dieses Assay kann verwendet werden, um Antagonisten dieses Faktors oder um andere Moleküle, die seine Aktivität beeinträchtigen, auszuwählen. Die Abschirmung kann also verwendet werden, um Testsubstanzen mit der Funktion einer induzierten Differenzierung der Zelle zu identifizieren.
  • Zellen dieser Erfindung können zusätzlich genutzt werden bei Assays zur Arzneistoffentdeckung. Zellen dieser Erfindung können auch genutzt werden für die Zelltherapie, und so umfasst eine Methode der Erfindung es, den Faktor der Erfindung dafür zu verwenden, pluripotente Zellen abzuleiten und/oder aufrechtzuerhalten, davon Zellen für die Zelltherapie abzuleiten und diese Zellen in der Zelltherapie zu verwenden.
  • Eine Screeningmethode dieser Erfindung zum Screening einer cDNA-Bibliothek umfasst die Durchführung eines Screens in pluripotenten Zellen und das Auswählen eines sich selbsterneuernden Phänotypen. Die Überprüfung kann pluripotente Zellen nutzen, die auf Cytokine nicht reagieren, und hat dabei den Vorteil, dass sowohl extrinsische als auch intrinsische Faktoren hierbei identifiziert werden können.
  • Die Erfindung stellt weiterhin eine Methode zum Screening einer cDNA-Bibliothek zur Verfügung, die das Ausführen eines Komplementierungs-Assays in pluripotenten Zellen umfasst. Die Methode kann benutzt werden, um eine cDNA zu identifizieren, die mit einem sich selbsterneuernden Phänotyp verglichen wird.
  • Die Erfindung stellt jetzt noch weiter eine Methode zum Screening eines Faktors, der eine pluripotente Zelle in einem pluripotenten Zustand erhält, zur Verfügung, die folgendes umfasst:
    Bereitstellung einer pluripotenten Zelle, die den über die Pluripotenz bestimmenden Faktor der Erfindung, welcher die Zelle stabil in einem pluripotenten Zustand und in dem die Expression des Faktors kontrolliert werden kann, exprimiert;
    Ausführen einer Manipulation der Zelle;
    Reduktion der Expression des über die Plurpotenz bestimmenden Faktors; und
    Auswahl einer Zelle, die in einem pluripotenten Zustand erhalten ist.
  • Manipulationen können so aufgebaut werden, dass sie in einem Screening für extrinsische Faktoren, in Zelloberflächenrezeptoren, in cDNAs oder in anderen Faktoren enden, und geeignete Manipulationen schliessen eine genetische Manipulation der Zelle und eine Manipulation des Kulturmediums oder des Kulturzustandes, in dem die Zelle kultiviert wird, ein. Das Screening kann dabei geeigneter gemacht werden zur Identifizierung eines Faktors, der die Expression eines endogenen Gens, das den über die Pluripotenz bestimmenden Faktor der Erfindung oder eines weiteren Faktors, der die Zelle in einem pluripotenten Zustand erhält, regelt. Vorzugsweise wird die Expression eines Faktors durch die Regulierung eines regulierbaren Promoters in funktionsfähiger Kombination mit einer Nukleotidsequenz, die den Faktor kodiert, kontrolliert, was es ermöglicht, die Expression des Faktors zu reduzieren, um dadurch die Aktivität des über Pluripotenz bestimmenden Faktors durch Hinzufügen eines Hemmers ins Medium, in dem die Zeile kultiviert wird, zu beseitigen. Zellen, die in einem pluripotenten Zustand bleiben, können isoliert und charakterisiert werden, um die Identität des Faktors festzulegen, der den über die Pluripotenz bestimmenden Faktor ersetzt hat.
  • Eine weiterer Screen der Erfindung ist einer für die Identifizierung der Regulation der endogenen Gene; und die Erfindung stellt ferner eine Methode zum Screening eines Faktors, der die Expression eines endogenen Genes, das den über die Pluripotenz bestimmenden Faktor der Erfindung kodiert, reguliert, umfassend:
    • (1) Analysieren von Regionen des Genoms, die an endogene Gene für die Präsenz eines Transkriptionsfaktors, der an den Seiten gebunden ist, und
    • (2) Überprüfen von Fragmenten dieser Regionen mit einem Extrakt aus ES-Zellen, um eine Komponente des Extraktes zu identifizieren, die an Fragmente gebunden ist.
  • Die Regionen des Genoms, die das endogene Gen flankieren und die die auf pluripotente Zellen beschränkte Expression des Faktors bestimmen, werden bevorzugt identifiziert, geeigneterweise durch Transfektion von Reporter-Konstrukten, so dass der Screen eine oder mehrere Komponenten im ES-Zellextrakt identifizieren kann, die mutmassliche Transkriptionsfaktoren für den Pluripotenz bestimmenden Fakor sind. Eine weitere Analyse der Resultate des Screenings kann eine Untersuchung einschliessen, ob die Kontrolle des mutmasslichen Transkriptionsfaktors, wie zum Beispiel über eine extrazellluläre Substanz, bereits identifiziert wurde. Die so identifizierten Kontrollfaktoren können genutzt werden, um pluripotente Säugetierzellen herzuleiten oder zu erhalten.
  • Der Ausdruck „ortholog" bezeichnet ein Polypeptid oder Protein, das aus einer anderen Art erhalten wird, die das funktionelle Gegenstück des Polypeptids oder Proteins aus einer anderen Art ist. Sequenzunterschiede zwischen „Orthologien" sind das Resultat der Artenbildung.
  • Der Ausdruck „Allelvariante" bezeichnet zwei oder mehrere alternative Formen eines Genes, die die gleiche chromosomale Stelle besetzen. Allelvarianten entstehen natürlicherweise durch Mutation und können in phänotypischen Polymorphismen innerhalb einer Population enden. Genmutationen können stumm sein (kein Wechsel in den kodierten Polypeptiden) oder können Polypeptide kodieren, die eine veränderte Aminosäuresequenz haben.
  • Der Ausdruck „Expressionsvektor" bezeichnet ein DNA-Molekül, linear oder kreisförmig, das ein Segment umfasst, das ein Polypeptid von Interesse kodiert und das operativ verbunden ist mit zusätzlichen Segmenten, die seine Transkription zur Verfügung stellen. Solch zusätzliche Segmente können einen Promoter und Abschlusssequenzen einschliessen, und können optional eine oder mehrere Quellen für Replikation, eine oder mehrere wählbare Marker, einen Enhancer, ein Polyadenylatinsignal und dergleichen einschliessen. Der Expressionsfakor ist im allgemeinen abgeleitet von einem Plasmid oder einer viralen DNA oder kann Elemente von beidem enthalten.
  • Der Ausdruck „isoliert" bedeutet, wenn er auf ein Polynukleotidmolekül angewendet wird, dass das Polynukleotid aus seiner natürlichen genetischen Umgebung entfernt wurde, dass es somit frei von irrelevanter oder belangloser Kodiersequenz ist und dass es in einer angemessenen Form für den Gebrauch innerhalb der gentechnischen Proteinproduktionssysteme ist. Derartig isolierte Moleküle sind jene, die getrennt werden von ihrer natürlichen Umgebung und cDNA und andere Genomklone einschliessen. Isolierte DNA-Moleküle der gegenwärtigen Erfindung sind generell frei von anderen Genen mit denen sie gewöhnlich verbunden sind, können aber natürlich auftretende 5'- und 3'-benachbarte Regionen einschliessen, die regelnde Elemente wie Promotoren, Enhancer und Terminatoren beinhalten. Die Identifizierung von assoziierten Regionen wird einem von gewöhnlichem Fachkönnen offensichtlich (siehe auch das Beispiel, Dynan und Tijan, Nature 316:774-778, 1985). Wenn der Ausdruck „isoliert" auf ein Protein angewendet wird, zeigt er an, dass das Protein in einem anderen Zustand als in seiner natürlichen Umgebung vorgefunden wird, Blut und Tiergewebe ausgenommen. In einer bevorzugten Form ist das isolierte Protein im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, besonders von Proteinen tierischen Ursprungs. Es wird bevorzugt, das Protein in einer hochgereinigten Form, das heisst mehr als 95% rein, besser noch mehr als 99% rein zur Verfügung zu stellen.
  • Der Ausdruck „operativ verbunden" bedeutet, wenn er sich auf DNA-Segmente bezieht, dass die Segmente so angeordnet sind, dass sie in Kombination mit ihrem beabsichtigten Ziel funktionieren, zum Beispiel beginnen Transkripte mit dem Promoter und fahren fort mit dem kodierenden Segment zu der Polyadenylation-Seite.
  • Der Ausdruck „Polynukleotid" bezeichnet ein einzel- oder doppelsträngiges Polymer einer Desoxyribonukleotid- oder einer Ribonukleotidbase, die vom 5'- zum 3'-Ende gelesen wird. Polynukleotide schliessen RNA und DNA ein und können von natürlichen Quellen isoliert, in vitro synthetisiert oder zubereitet werden aus natürlichen oder synthetischen Molekülen.
  • Der Begriff "Komplement" bezeichnet in Bezug auf Polynukleotidmoleküle jene Polynukleotidmoleküle, die gegenüber einer Referenzsequenz eine komplementäre Basensequenz und umgekehrte Orientierung aufweisen. Beispielsweise ist die Sequenz 5'ATGCACGGG3' komplementär zu 5'CCCGTGCAT3'.
  • Der Begriff "degenerierte Nukleotidsequenz" bezeichnet eine Sequenz von Nukleotiden, die (gegenüber einem Referenz-Polynukleotidmolekül, das ein Polypeptid kodiert) ein oder mehrere degenerierte Kodone aufweist. Degenerierte Kodone enthalten verschiedene Nukleotid-Tripletts, kodieren jedoch den selben Aminosäurerest (z. B. GAU- und GAC-Tripletts kodieren jeweils Asp).
  • Der Begriff "Promotor" bezeichnet einen Abschnitt eines Gens, der DNA-Sequenzen enthält, die die Bindung für RNA-Polymerase und die Initiierung der Transkription bereitstellen. Promotor-Sequenzen finden sich gewöhnlich, aber nicht immer, in den 5' nicht kodierenden Regionen des Gens.
  • 1 zeigt das Plasmid pPyCAGIP.
  • 2 zeigt die Integration und nachfolgende Entfernung eines IoxP-flankierten Pluripotenz bestimmenden Faktor-Transgens.
  • 3 zeigt die Sequenzanalyse von PDF cDNA, worin:
    • (A) Alignment der PDF-Homeodomain mit den am engsten verwandten Vertretern einiger verschiedener Klassen von Homeodomain-Protein zeigt. Generiert wurde das Alignment mit Clustal W und in Bezug auf PDF unter Verwendung von MacBoxshade schattiert: dunkelgrau für Identität bei allen Sequenzen; mittelgrau für Identität mit PDF; hellgrau für Ähnlichkeit zu PDF. Der Prozentanteil. der Identitäten hinsichtlich der PDF-Homeodomain sind rechterhand angeführt.
    • (B) den paarweisen Vergleich von Mäuse (Mm)-PDF und Human (Hs)-Orthologon (hypothetisches Protein FLJ12581) zeigt. Identische Reste sind umrandet.
    • (C) zeigt, dass die 3' UTR der Mäuse-PDF cDNA ein B2-Repeat enthält. Die Nummerierung erfolgt gemäß PDF cDNA- und B2-Sequenz-Zugangsnummer K00132. Der gesplittete RNA-Polymerase III-Promotor von B2 ist umrandet. Sternchen bezeichnen Basen, hinsichtlich derer sich die hier beschriebene PDF cDNA und die RIKEN cDNA AK010332 unterscheiden.
    • (D) die Aktivität des Human-Orthologons von PDF in Mäuse-ES-Zellen darstellt. LRK1-Zellen wurden mit pPyCAGIP (kein Insert) oder einem ein hPDF ORF-Insert tragenden Derivat transfiziert. Die Anzahl alkalische Phosphatase-positiver Kolonien ohne umgebenden differenzierten Zellen wurde gezählt und als der Prozentsatz des Verhältnisses der Anzahl in Abwesenheit von Cytokin gebildeter zur Anzahl in Gegenwart von IL6/sIL6R gebildeter Kolonier ausgedrückt.
  • 4 zeigt, dass die in-vitro-Expression auf pluripotente Zellen beschränkt ist, wobei:
    • (A) die komparative Hybridisierung von RNA von MEFs und von MEF/ES-Zell-Cokulturen, die zur Konstruktion von Bibliotheken verwendet werden, zeigt. Jede Spur wurde mit 1 μg pA+ RNA beladen, die mit Sonden für PDF cDNA (links), GAPDH (rechts) und PDF ORF (Mitte) hybridisiert wurde. Die Positionen der Migration der RNA-Marker der angegebenen Größen (kb) sind linkerhand gezeigt.
    • (B) PDF-Transkripte zeigt, die durch in-situ-Hybridisierung einer MEF/ES-Zell-Cokultur (links) und einer von differenzierten Zellen umgebenen Kolonie undifferenzierter Zellen in einer E14Tg2a-Kultur (rechts) detektiert wurden; die Striche stehen für 50 μm.
    • (C) zeigt, dass die Expression in Zelllinien auf ES-, EC- und EG-Zellen beschränkt ist. Bei den verwendeten RNAs handelte es sich um PSMB, PC13.5, F9, PSA4, P19, EC-Zellen, CGRB, ES-Zellen; PE, parietales Endoderm; PYS, parietaler Dottersack; NIH3T3, Fibroblasten; BAFB03, pro-B-Zellen, MEL, Erythroleukämie; B9, Plasmacytom.
    • (D) zeigt, dass PDF-Expression auf ES-Zelldifferenzierung reprimiert ist. RNAs stammten aus E14Tg2a-Zellen, die durch Anwendung von RA oder MBA über die angeführte Anzahl von Tagen zur Differenzierung gebracht wurden.
    • (E) mangelnde nachweisbare Expression von PDF in Geweben von Erwachsenen zeigt. Bei den RNAs handelte es sich um 1, Epididymis; 2, Hoden; 3, CGR8; 4, Fett; 5, Niere; 6, Leber; 7, Herz; 8, Milz; 9, Gehirn; 10, Knochenmark; 11, Zunge; 12, Auge; 13, Eileiter; 14, Thymus; 15, Skelettmuskel; 16, Haut; 17, Eierstock; 18, Samenbläschen; 19, Lunge.
    • (F) zeigt, dass PDF RNA in EC-Zellen exprimiert wird. Die verwendeten RNAs stammten aus embryonalen Karzinom- (GCT27C4) und Lymphoid- (Jurka-) Zellen. Northern Blot-Analyse erfolgte mittels sequenzieller Hybridisierung unter Verwendung von Sonden für PDF, GAPDH und Oct4 (C, D), PDF und GAPDH (E) sowie hPDF und GAPDH (F).
  • 5 zeigt die Expression von PDF in vivo, worin PDF mRNA durch in-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer ORF-Sonde visualisiert wurde und:
    • (A) Embryos vor der Implantierung zeigt. Die obere Reihe zeigt Embryos im 1-, 2-, 6- und 8-Zellstadium und eine Morula im Spätstadium. Die untere Reihe zeigt Blastozysten in frühen, expandierten, bebrüteten und implantierten Stadien. Alle Tafeln sind in der selben Vergrößerung zu sehen.
    • (B) E11.5 Genitalfurchen von weiblichen (oben) und männlichen (unten) Embryos zeigt.
  • 6 illustriert die Reversibilität von gp130-unabhängiger Selbsterneuerung, worin:
    • (A) ein Diagramm eines Konstrukts bereitstellt. Die CAG-Kassette leitet die Expression eines PDF-IRES-pacpA-Transkripts. Darauf folgt eine Transkription-Terminatorsequenz (STOP, SPA C2 MAZ) und eine egfppA-Kassette. Die IoxP-Sites befinden sich im zweiten Exon der CAG-Kassette und zwischen der Terminatorsequenz und egfp, so dass CAG nach Cre-vermittelter Rekombination die Expression von egfp leitet.
    • (B) Northern Blot-Analyse von Transgen-Transkripts vor (PDF-IRES-pac, pac Sonde) und nach (gfp) Cre-Exzision zeigt. Der Blot wurde mit den angegebenen Sonden sequenziell hybridisiert. E, E14Tg2a; EF1, das Floxed-Transgen tragender E14Tg2a-Subklon; EF1C1, EF1-Subklon nach Cre-vermittelter Exzision.
    • (C) zeigt, dass die Umkehr der PDF-Expression die LIF-abhängige Selbsterneuerung wiederherstellt. ES-Zellen (ZIN40), das gefloxte PDF-Transgen exprimierende ES-Zellen und deren Cre-exzidierte Derivatlinien wurden nach Ausplattieren mit klonaler Dichte unter den angegebenen Kulturbedingungen analysiert; 0, kein Zusatz; LIF, 100 u/ml LIF, hLIF-05, für die Blockierung von 10 Einheiten/ml LIF ausreichender LIF-Antagonist. Nach 6-tägiger Kultivierung wurde der Prozentsatz an alkalische Phosphatase-positiven Kolonien ohne erkennbare differenzierte Zellen quantifiziert.
    • (D) die Morphologie von PDF exprimierenden Zellen und deren Cre-exzidiertem Derivat in Abwesenheit von Cytokin (0), in 100 u/ml LIF (LIF) oder in Gegenwart von für die Blockierung von 10 Einheiten/ml LIF (hLIF-05) ausreichendem LIF-Antagonisten zeigt. Die Zellen wurden in klonaler Dichte ausplattiert und nach 4-tägiger Kultivierung untersucht.
    • (E) Northern Blot-Analyse von RNA aus Kulturen von das gefloxte Transgen (EF4) exprimierenden E14Tg2a-Derivaten oder eines Cre-exzidierten Subklons (EF4C3), deren Herstellung 0, 1, 2, 3 oder 4 Tage nach Exposition gegenüber RA oder MBA erfolgte, mit darauffolgender Hybridisierung an Oct4.
  • 7 zeigt die Reversibilität der gp130-unabhängigen ES-Zellenidentität, worin:
    • (A) Differenzierung durch Aggregierung zeigt. Das gefloxte Transgen (EF4) exprimierende E14Tg2a-Derivate oder der Cre-exzidierte Subklon (EF4C3) wurden durch Platzieren jeweils einzelner Embryoidkörper in eine Vertiefung einer Schale mit 48 Vertiefungen und täglicher Bewertung jeder Vertiefung auf die Anwesenheit schlagender Zellen auf kardiale Differenzierung beurteilt.
    • (B) die Differenzierung durch Aggregierung in Gegenwart von Retinolsäure zeigt. Das gefloxte Transgen (EF4) exprimierende E12Tg2a und Derivate oder der Cre-exzidierte Subklon (EF4C3) wurden mittels TuJ Immunohistochemie auf Neurogenese beurteilt.
    • (C) den Anteil an Cre-deletierten Zellen im Embryo zur Hälfte der Trächtigkeit zeigt. EF1C1-Zellen wurden in eine MF1-Blastozyste injiziert und nach Übertragung in eine Nährmutter bei E9.5 auf grüne Fluoresenz untersucht.
  • 8 zeigt das Verhältnis von PDF zu anderen bekannten Mediatoren von Selbsterneuerung, worin:
    • (A) zeigt, dass der Anteil an Cytokin-unabhängigen Kolonien mit dem Niveau episomaler PDF-Expression korreliert. LRK1-Zellen wurden mit ansteigende Expressionsniveaus von PDF (pPyPPGK < pPyPCAG < pPyCAGIP) leitenden episomalen Vektoren transfiziert. Nach 12-tägiger Selektion wird der Anteil an selbsterneuernden Kolonien in Abwesenheit von Cytokin zur Anzahl jener in Gegenwart von IL6/sIL6R ausgedrückt. Daten stellen den Durchschnitt zweier unabhängiger Experimente dar.
    • (B) zeigt, dass PDF kein STAT3-Target darstellt. Chimäre GCSFR-gp130-Variantmoleküle exprimierende ES-Zellen, in denen alle vier STAT3-Bindungsstellen durch Mutation von Tyrosin-Kodons zu Phenylalanin (Y126-275F) aufgehoben wurden oder in denen das negative regulatorische Tyrosin ähnlich mutiert wurde (Y118F), wurden vor der RNA-Darstellung über die angegebene Zeit (min) hinweg mit LIF (L) oder GCSF (G) stimuliert. Northern Blot-Analyse wurde mittels sequenzieller Hybridisierung mit Sonden für PDF, GAPDH oder das STAT3-Targetgen SOCS3 durchgeführt.
    • (C) zeigt, dass PDF bei der Selbsterneuerung Oct4 nicht ersetzen kann. ES-Zellen, in denen auf Doxycyclin reagierendes Oct4-Transgen Selbsterneuerung aufrechterhält (ZHBTc4.1), wurden mit linearisierten pPyCAGIP-Derivaten, die kein Insert (MT), Oct4 (Oct) oder PDF (PDF) trugen, transfiziert und unter Bedingungen, unter denen das Transgen weiter exprimiert (0) oder abgeschaltet (Dox) wird, in Gegenwart von LIF kultiviert. Nach Puromycin-Selektion wurden die Platten gefärbt und der Prozentsatz an undifferenzierten Kolonien bestimmt.
  • 9 stellt die Erhaltung von pluripotenten GCT 27X-1-hEC-Zellen in einem konditionierten Medium dar, worin:
    • (A) die GCT 27X-1 pluripotente hEC-Zellinie zeigt, die routinemäßig auf einer Feeder-Schicht mitotisch inaktivierter STO-Zellen gehalten wird.
    • (B) pluripotente Kulturen in routinemäßiger Dichte zeigt, die auch in Abwesenheit von Feeder-Zellen, jedoch mit Zusatz von konditioniertem Medium, das aus der Dottersack-Karzinom-Zelllinie hEC 44 abgeleitet wird, auf 25% v/v im routinemäßig verwendeten Kulturmedium erhalten werden können.
    • (C) zeigt, dass der Entzug dieses konditionierten Mediums von den Feeder-freien GCT 27X-1-Zellkulturen, in klonaler Dichte gezeigt, zur Initiierung von Zelldifferenzierung und zum Verlust des pluripotenten Phänotyps führt. Die Aufnahme erfolgte unter Phasenkontrastoptik, 10x (A, B), 4x (C).
  • 10 zeigt die Northern Blot-Analyse der endogenen hPDF-Expression in GCT 27X-1-hEC-Zellen, in der poly A+ mRNA (3-3,5 μg), die aus entweder auf STO Feeder-Zellen (27X-1 +STO) oder ohne Feeder-Zellen, jedoch unter Zusatz von konditioniertem Medium (27X-1 -STO +CM) kultivierten GCT 27X-1-Zellen, hergestellt wurde, auf einem Denaturierungsgel aufgetrennt und mit einer für die humane PDF-Kandidatsequenz spezifische cDNA-Sonde mittels Northern Blot-Hybridisierung analysiert wurde. Bei der Hybridisierung wurden poly A+ mRNAs, die aus einer STO-Zellkultur (STO) und aus einer E14Tg2a-Mäuse-ES-Zellkultur (E14Tg2a) hergestellt wurden, als Kontrollen mitgeführt. In beiden GCT 27X-1-Kulturen wurden ein größeres Transkript von ~2,4 kb und ein kleineres Hybridisierungs-Transkript von ~5,6 kb detektiert, womit die endogene Expression des hPDF-Gens in pluripotenten hEC-Zellkulturen bestätigt wurde. Eine in der Mäuse-ES-Zelllinie nachweisbare, sehr schwache Hybridisierungsbande von ~2,2 kb weist auf ein homologes Transkript in pluripotenten Mäusezellen hin. Erwartungsgemäß war kein Hybridisierungssignal für STO-Zell-mRNA nachweisbar. Es wird autoradiographische Exposition über 8 Stunden bei –70°C zwischen intensifying Screens gezeigt.
  • 11 stellt ein Flussdiagramm bereit, das die Teststrategie zum Nachweis der Erhaltung von Selbsterneuerung bei einer die hPDF cDNA exprimierenden humanen pluripotenten Zelllinie beschreibt (CM = konditioniertes Medium).
  • 12 illustriert das gefloxte hPDF- und GFP-Kontrollvektorkonstrukt, worin:
    • (A) das gefloxte 8,8 kb große hPDF-Konstrukt zeigt, das den offenen Leserahmen (ORF) für die hPDF cDNA (~900 bp), der unter einem humanen CMV IE (Cytomegalovirus immediate early enhancer) arbeitet, und den humanen Actin-Promotor stromaufwärts einer die IRES-vermittelte Expression des Puromycin-Resistenzgens bereitstellenden bicistronischen Reporter-Kassette enthält. Das verbesserte GFP (eGFP)-Reporter-Gen befindet sich stromabwärts der IoxP-Sites und stellt bei Vorliegen von Cre-vermittelter Rekombination die Sichtbarmachung mittels Fluoreszenz bereit.
    • (B) den pPyCAGegfpIP ("GFP-Kontroll")-Vektor zeigt, der ein ähnliches Konstrukt darstellt, in dem die hPDF-Sequenz in (A) durch die stromaufwärts der IRES-Puromycin-Reporter-Kassette befindliche eGFP-Sequenz ersetzt wird und zur Bereitstellung von "nicht hPDF"-exprimierenden Kontroll-Transfektanten eingesetzt wurde.
  • 13 illustriert die morphologische Beurteilung von transfektierten GCT 27X-1-Kolonien. Stabile transfektierte gefloxte hPDF- und GFP-Kontrollkolonien waren nach 10-15-tägiger Selektionskultur in Puromycin ohne STO-Feeder-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von konditioniertem Medium etabliert. Die Morphologie der Kolonie wurde nach Leishman-Färbung als (A) "dicht": jene Kolonien mit Erhaltung eines dichten pluripotenten hEC-Phänotyps; (B) "mittel": jene Kolonien, die unter Erhaltung eines gewissen hEC-Phänotyps sich zu differenzieren beginnen; und (C) "lose": jene Kolonien, die vollständig lose und differenziert vorlagen, bewertet. Unter Phasenkontrastoptik, 4x, fotografiert.
  • 14 illustriert die Morphologie von hPDF-exprimierenden hEC-Zellen in einem klonalen Assay, in der a-d hPDF-exprimierende hEC-Klonlinien zeigen, die ab der Transfektion in Gegenwart (hPDF D7) und Abwesenheit (hPDF E7) von konditioniertem Medium kontinuierlich expandierten und bei klonaler Dichte 12-14 Tage lang mit (+CM) oder ohne (–CM) konditioniertem Medium kultiviert wurden; und e-h zeigen einen transfizierten GFP-Kontrollklon (GFP C15) und Wildtyp-hEC-Zellen (27X-1), die ebenfalls unter den gleichen Bedingungen kultiviert wurden. In Abwesenheit von konditioniertem Medium sind nur hPDF-exprimierende hEC-Zellen in der Lage, einen pluripotenten hEC-Phänotyp zu bewahren, während GFP-Kontroll- und Wildtyp-hEC-Zellen zur Differenzierung induziert werden. Unter Phasenkontrastoptik, 10x, fotografiert.
  • 15 zeigt die Selbsterneuerung von hPDF-exprimierenden hEC-Zellen in einem klonalen Assay. hPDF-exprimierende hEC-Klonlinien (hPDF D7 und E7), ein transfizierter GFP-Kontrollklon (GFP C15) und Wildtyp-hEC-Zellen (27X-1) wurden bei klonaler Dichte 12-14 Tage lang in Gegenwart (+CM, a-h) und Abwesenheit (–CM, i-p) von konditioniertem Medium kultiviert. Die Identifikation pluripotenter hEC-Zellen innerhalb von Kolonien erfolgte mittels indirekter Immunfluoreszenzfärbung auf den CD30-Marker (b, d, f, h, j, l, n, p), hier im Vergleich zu Hoechst UV-Fluoreszenz auf alle Zellen innerhalb der selben Kolonie (a, c, e, g, i, k, m, o) gezeigt. In Abwesenheit von konditioniertem Medium sind nur hPDF-exprimierende hEC-Kolonien in der Lage, einen pluripotenten Phänotyp zu wahren, während transfizierte Kontroll- und Wiltyp-hEC-Zellen zur Differenzierung induziert wurden, außer sie wurden in konditioniertem Medium gehalten. Im Vergleich zu hPDF D7-Zellen zeigten die hPDF E7-Kolonien in Abwesenheit von konditioniertem Medium generell eine dichtere Morphologie und stärkeren Nachweis des CD30-Markers. Die Kolonien wurden bei 20-facher Vergrößerung unter Verwendung von 535/50 nm (CD30) und UV 330-380 nm (Hoechst) -Filtern dargestellt.
  • 16 illustriert die Selbsterneuerung von hPDF-exprimierenden hEC-Zellen in routinemßig durchgeführter Kultur. Die hPDF-exprimierende hEC-Zelllinie E7 ist seit dem Zeitpunkt der Transfektion fortwährend in Abwesenheit sowohl von STO-Feeder-Zellen als auch konditioniertem Medium expandiert worden. Diese klonale Zelllinie, hier nach Routinepassage gezeigt, zeigt nach mehr als 8-wöchiger Kultivierung unter diesen Bedingungen weiterhn Selbsterneuerung von hEC-Zellen. Unter Phasenkontrastoptik, 10x, fotografiert.
  • Beispiel 1
  • Screen-Design
  • Ein funktioneller Screen einer cDNA-Bibliothek wurde zur Erfüllung zweier Kriterien entwickelt. Erstens sollte die Häufigkeit, mit der cDNA in Zellen eingeführt und über die Dauer des Screens hinweg belassen werden kann, groß genug sein, um das Screening einer komplexen Bibliothek von 105-106 unabhängiger cDNAs durchführen zu können. Dies wird durch den kombinierten Einsatz von LRK1-Zellen (nachstehend beschrieben), die das große T-Antigen des Tumorvirus Polyoma exprimieren, und den den Polyoma-Ursprung enthaltenden Vektor pPyCAGIP (1) erfüllt. Unter den von uns getesteten Vektoren liefert dieses Plasmid das höchste cDNA-Expressionsniveau (Daten nicht gezeigt). Ferner ermöglicht die Puromycin-Selektion im Vergleich zu Selektionen mit Blasticidin S, Hygromycin B und Zeocin die rascheste Eliminierung nicht transfizierter ES-Zellen, wobei 95% der nicht transfizierten Zellen innerhalb 1 Tages abgetötet werden (Daten nicht gezeigt). Somit wird eine potenzielle Quelle verwirrender biologischer Aktivitäten schnell aus den Kulturen entfernt. Zweitens sollte die beim Screening spezifisch abzuzielende Eigenschaft in der transfizierten Zelllinie in ausreichend geringem Ausmaß vorhanden sein, dass der Screen ohne hinderlich hohes Hintergrundgeräusch ablaufen kann. Idealerweise liegt diese Eigenschaft in der Wirtszelllinie nicht vor, kann jedoch darin exprimiert werden. LRK1-Zellen erfüllen dieses kritische Kriterium. Während in-vitro-Differenzierung steigt die Expression aus dem LIF-Locus (Rathjen et al. 1990) und eine Anzahl von ES-Kolonien lässt sich in dem differenzierten Zellen-Monolayer ausnehmen (Dani et al., 1998). Viele dieser erneut auftauchenden Kolonien kommen aufgrund der Wirkung von LIF zum Vorschein (Dani et al. 1998). E14/T-Zellen, die diese Reaktion auf LIF beibehalten, zeigen diese Hintergrund-Selbsterneuerung nach Differenzierung. Im Gegensatz dazu bilden LRK1-Zellen, die nicht länger auf über LIFR wirkende Cytokine ansprechen, nach Entzug von IL6 und sIL6R eine viel geringere Anzahl von Kolonien. Diese Verringerung der Hintergrund-Selbsterneuerung reicht aus, um ein Bibliotheks-Screen unter Verwendung dieser Zellen durchführen zu können.
  • Herstellung von LRK1-Zellen
  • Für die Durchführung eines cDNA-Bibliotheks-Screenings mit hoher Effizienz bedurfte es einer Zelllinie, die mit hoher Frequenz mit Polyoma-Ursprung enthaltenden Vektoren supertransfiziert werden konnte. Die Wahl fiel auf die Zelllinie E14/T, ein Derivat von E14Tg2a-Zellen, die mit dem Plasmid pMGD20neo transfiziert worden war (Gassmann et al. 1995) und die Replikation eines supertransfizierenden Plasmids unterstützte, da diese Linie nach Entzug von LIF die Fähigkeit zur effizienten Differenzierung bewahrte. Diese Linie wurde zwei Runden auf den LIFR-Locus abzielenden Gen-Targetings unterzogen. Der eingesetzte Targeting-Vektor verwendete die gleichen Homologiearme wie zuvor beschrieben (Li, Sendtner & Smith, 1995), jedoch wurde die selektierbare Markerkassette in der ersten und der zweiten Gen-Targeting-Runde durch eine IRESBSDrpA- bzw. eine IREShphpA-Kassette ersetzt. Die erhaltene Zelllinie (LRK1) bewahrte eine hohe Supertransfektionseffizienz und sprach nicht mehr auf LIF oder andere Cytokine, die die ES-Zell-Selbsterneuerung mittels Stimulation von LIFR leiten kann, an. LRK1-Zellen wurden routinemäßig in Gegenwart von IL6 und sIL6R gehalten, was die Stimulation von ES-Zell-Selbsterneuerung über gp130 ermöglichte (Yoshida et al., 1994).
  • Konstruktion der Bibliothek
  • Cokulturen von gamma-bestrahlten primären Mäuseembryo-Fibroblasten und ES-Zellen (ZHTc6-Zellen; Niwa et al. 2000) wurden angelegt und in Cytokin-freiem Standardmedium für ES-Zellen gehalten. Die Zellzahl in den Cokulturen war derart, dass die MEFs ein konfluentes Monolayer bildeten, und die ES-Zellen derart ausgesät wurden, um nach 3 Tagen Wachstum in größerer Anzahl als MEFs vorzuliegen. Die Färbung der repräsentativen Platte für alkalische Phosphatase (einen Marker für ES-Zellen) erlaubte die Schätzung der Anzahl an zum Zeitpunkt der Zelllyse vorhandenen ES-Zellen. Dies ergab ein Verhältnis von ES RNA/MEF RNA von 12:1. Es wurde RNA aus 20 F180-Kolben mit Zellen und polyadenylierte RNA hergestellt. Die Qualität der RNA wurde durch Prüfung eines Northern Blots für LIFR-Transkripts kontrolliert; nur RNA, die eine scharfe 11 kb Bande ohne nachweisbare Degenerierung lieferte, wurde weiter verwendet. cDNA wurde aus polyadenylierter RNA durch Oligo-d(T)-Priming unter Verwendung von im Superscript-Plasmid-System für cDNA-Synthese und Plasmid-Kloning bereitgestellten Reagentien synthetisiert (Life Technologies). cDNA wurde auf Polyacrylamidgel fraktioniert und nach Gewinnung von cDNA > 1 kb durch Elektroelution in XhoI/NotI-verdaute pPyCAGIP ligiert. Eine Bibliothek von 7,4 × 105 primären Rekombinanten wurde nach Elektroporation von E.coli-Stamm DH10B hergestellt. DNA wurde aus Bakterien nach Wachstum über Nacht in im Durchmesser 15 cm großen Petrischalen, die jeweils mit 5 × 104-105 Kolonien beimpft worden waren, hergestellt.
  • Bibliotheks-Screen
  • DNA (25 μg) aus entweder der Bibliothek oder einem leeren Vektor wurde durch Elektroporation in LRK1-Zellen eingeführt (6 × 106), und die Zellen wurden mit 106/9 cm Schale oder 5 × 104/9 cm Schale ausgesät und in IL6/sIL6R kultiviert. Nach 2 Tagen wurde das Medium gewechselt und enthielt Puromycin, den hochdichten Platten wurde das Cytokin entzogen. Auf den Platten geringer Dichte wurde das Cytokin belassen, um die Transfektionseffizienz zu überwachen. Das Medium wurde bis 9 Tage nach der Transfektion alle 2 Tage gewechselt. Zu diesem Zeitpunkt waren auf den Scheintransfektionsplatten keine lebenden Zellen mehr vorhanden, und die ausschließlich mit leerem Vektor transfizierten Platten enthielten nur differenzierte Zellen. Im Gegensatz dazu enthielten einige der mit Bibliotheks-DNA transfizierten Platten Kolonien, die morphologisch wie undifferenzierte Zellen aussahen. Daher wurde aus von Zellen von diesen Platten extrachromosomale DNA hergestellt und auf E.coli DH10B übertragen. DNA wurde aus Pools von 104 Bakterienkolonien hergestellt und erneut in LRK1-Zellen eingeführt, und der vorstehend beschriebene Selektionsprozess wurde wiederholt. Von den 10 gescreenten Pools schienen zwei positiv, und extrachromosomale DNA wurde aus diesen 14 Tage nach der Transfektion hergestellt. Die DNA eines dieser Pools wurde wie nachstehend ausführlich beschrieben weiter untersucht. Nach der Übertragung auf E.coli DH10B, wurde DNA aus einem Pool von ungefähr 250 Kolonien hergestellt, erneut in die LRK1-Zellen eingeführt, und der Selektionsprozess wurde wiederholt. DNA wurde aus Zellen 14 oder 19 Tage nach der Transfektion hergestellt. Diese wurden auf E.coli DH10B übertragen, und 12 Miniprep-DNAs wurden aus der 14 Tage nach der Transfektion geernteten DNA hergestellt, und 9 Minipreps aus der 19 Tage nach der Transfektion geernteten DNA. Die Sequenzierung dieser DNAs erfolgte unter Verwendung eines stromaufwärts des 5'Kloning-Sites gelegenen Oligonukleotids.
  • Bestätigung der Ergebnisse
  • Die Sequenzanalyse der 9 DNAs, die 19 Tage nach der Transfektion hergestellt worden waren, zeigte, dass eines dieser Plasmide eine partielle cDNA enthielt, in einem Fall konnte die Sequenz nicht interpretiert werden, und 2 ergaben die gleiche Sequenz, die einer Volllängensequenz in der Genbank-Datenbank entsprach. Vier der verbleibenden 5 Plasmide fehlte ein cDNA-Insert und enthielten im Vergleich zueinander innerhalb der IRES Deletionen bis auf 2 Basenpaare. Dem letzten Plasmid fehlte ein cDNA-Insert und es wies eine Deletion auf, die weitere 275 Basenpaare aus der IRES entfernte. Zur Bestätigung, dass einige dieser Plasmide Selbsterneuerungsaktivität verliehen, wurde ein Pool, das alle 9 Plasmide zu gleichen Gewichten enthielt, hergestellt, in LRK1-Zellen transfiziert und dem vorstehend beschriebenen Selektionsprozess unterzogen. Im Gegensatz zu Zellen, die parallel mit einem leeren Vektor als Kontrolle transfiziert worden waren und alle differenzierten, zeigten die mit dem Pool von 9 Plasmid-DNAs transfizierten Zellen eine undifferenzierte Morphologie. Zur Bestimmung, welche der 9 Plasmide Selbsterneuerungsaktivität verliehen, wurden individuelle Plasmide in LRK1-Zellen transfiziert und der zuvor beschriebene Selektionsprozess wiederholt. Plasmide, die die partielle cDNA trugen, die nicht interpretierbare Sequenz sowie Vertreter einer der 2 Klassen von Deletionen innerhalb der IRES, verliehen keine Selbsterneuerungsaktivität. Im Gegensatz dazu gaben die beiden Plasmide, die der Volllängensequenz in der Genbank-Datenbank entsprachen, den Selbsterneuerungsphänotyp wieder. Die Beurteilung erfolgte sowohl morphologisch als auch durch andauernde Expression des Markers alkalische Phosphatase über 10 Tage hinweg.
  • Sequenzanalyse der 14 Tage nach der Transfektion hergestellten 12 DNAs zeigte, dass 4 davon der selben Sequenz entsprachen wie die 2 zuvor eingehend beschriebenen Plasmide. Eine davon wurde in LRK1-Zellen transfiziert und war in der Lage, Cytokin-unabhängige Selbsterneuerung gemäß Beurteilung anhand der Beibehaltung einer undifferenzierten Kolonie-Morphologie, andauernde Expression von alkalischer Phosphatase über mindestens 14 Tage und andauernde Oct4-Expression über mindestens 8 Tage zu verleihen. Ferner zeigte ein Vergleich von Transfektionen der PDF cDNA mit einem ähnlichen Plasmid, in dem die cDNA-Sequenzen auf den offenen Leserahmen beschränkt waren, dass die PDF-Aktivität innerhalb des ORF lag.
  • Beispiel 2
  • Reversible Expression eines Pluripotenz bestimmenden Faktor (PDF)-Transgens
  • Zum Nachweis, dass der Erhalt eines Cytokin-unabhängigen pluripotenten Phänotyps in Folge von Expression von PDF in ES-Zellen reversibel war, wurde ein Transgen hergestellt, in dem der die Transkriptionseinheit kodierende PDF durch Sitespezifische Rekombination exzidiert werden konnte.
  • Ausgegangen wurde von der Modifikation eines im ersten Bibliotheks-Screen identifizierten Plasmid-kodierenden PDF mittels Platzierung eines IoxP-Sites zwischen den Promotor und das Translationsinitiierungskodon von PDF und eines zweiten IoxP-Sites nach dem Polyadenylierungssignal. Dem stromabwärts befindlichen IoxP-Site folgte die Kodierungssequenz eines GFP-Indikatorgens und ein Polyadenylierungssignal. Auf diese Weise konnten Zellen, die das IoxP-flankierte PDF-Gen exzidiert hatten, aufgrund ihrer geänderten Fluoreszenzfarbe identifiziert werden (siehe 2).
  • Der Plasmid kodierende PDF wurde in dem Vektorrückgrat linearisiert und in Keimlinien-kompetente E14Tg2a-Zellen transfiziert. Zellen wurden für das Wachstum in gp130-stimulierendes Cytokin-freiem Medium selektiert. Individuelle Klone wurde auf grüne Fluoreszenz geprüft und nicht fluoreszierende Klone wurde in Abwesenheit von Cytokin 2 Wochen lang expandiert. Zur Eliminierung der Selbsterneuerungswirkungen von juxtakrinen LIF-Familienmitgliedern, wurde dem Medium während dieses Zeitraums der LIF-Antagonist hLIF-05 zugesetzt. Die erste dieser Kulturen wurde wie zuvor gehalten, während die andere in LIF gehalten und mit ein Plasmid kodierender Cre (pCAGGCreGS) transfiziert wurde. Nach 2 Tagen wurden die Zellen mit geringer Dichte ausplattiert und einzelne Kolonien unter dem Mikroskop untersucht. Grün fluoreszierende Kolonien wurden expandiert und ihre Genom-DNA analysiert, um die Exzision von transgenen PDF-Sequenzen zu bestätigen.
  • Zellen, die sowohl das gefloxte PDF-Gen oder das exzidierte Transgen trugen, wurden dann separat in Blastozysten injiziert und die Empfängerblastozysten in Nährmütter transferiert. Danach wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten Embryos herauspräpariert und analysiert. Mittels Fluoreszenzmikroskopie konnte der Anteil von das exzidierte Transgen tragenden Zellen an fötalen Geweben aller drei Keimschichten bestimmt werden. Einige Chimären ließ man das Licht der Welt erblicken und sich danach paaren, um die Übertragung der Keimlinie von den manipulierten ES-Zellen nachzuweisen.
  • Beispiel 3
  • Analyse der Expression von PDF mRNA in pluripotenten Zellen
  • Northern Blot-Analyse zeigt, dass PDF mRNA in EC- und in ES-Zellen exprimiert wird, jedoch nicht in Zelllinien, die nicht pluripotent sind, wie etwa NIN3T3-Fibroblastenzellen und B9-Myeloidzellen. Darüber hinaus verringert sich die Expression von PDF, wenn ES-Zellen durch Zusatz von Retinolsäure zu den Kulturen zur Differenzierung induziert werden. In-situ-Hybridisierungsexperimente zeigen, dass PDF mRNA in der inneren Zellmasse von Embryos am Tag 3,5 der Entwicklung vorliegt, nicht jedoch in Blastozysten in einem späteren Stadium oder in Embryos im Eizylinderstadium. Daher korreliert die Expression mit Zellen, die entweder selbst etablierte pluripotente Stammzelllinien oder pluripotente Embryozellen, aus denen Stammzellen etabliert werden können, darstellen.
  • Somit bestätigte die Analyse durch Northern Blot, dass PDF mRNA in ES-Zell/MEF-Cokulturen, aus der die cDNA-Bibliothek synthetisiert wurde, exprimiert wird (4A). Diese Analyse bestätigte ebenso die Hybridisierung von PDF cDNA an kleine B2-Transkripte. Die B2-Hybridisierung wurde bei Verwendung einer auf den PDF ORF restringierten Sonde eliminiert. Daher kam bei nachfolgenden Northern Blot- und in- situ-Analysen die ORF-Sonde zum Einsatz. In MEFs alleine war keine Expression nachweisbar, ebensowenig gab es Hinweise auf die Induktion von PDF-Expression in mit ES-Zellen co-kultivierten Fibroblasten (4B). Dies weist darauf hin, dass in der Cokultur die ES-Zellen die Quelle der PDF cDNA darstellten. Analyse einiger Zelllinien zeigte, dass die PDF-Expression höchst restringiert und in parietalem Endoderm, im Dottersack, in der Fibroblaste und in hämatopoetischen Zellen nicht nachweisbar war (4C). Nachweisbar war die Expression in ES-Zellen, EG-Zellen und in sowohl LIF-abhängigen (PSA4) als auch LIF-unabhängigen embryonalen Karzinom-Zelllinien.
  • Die Untersuchung des Human-Orthologons von PDF zeigte, dass die entsprechende mRNA zwar in einer embryonalen Karzinom-Zelllinie, jedoch nicht in einer Lymphoid-Zelllinie exprimiert wurde (4E). Einige Gewebe ausgewachsener Mäuse wurden auf PDF mRNA untersucht, jedoch war eine Expression mittels Northern Hybridisierung der gesamten RNA nicht nachweisbar (4F). Als nächstes wurde die Expression von PDF mRNA während ES-Zell-Differenzierung analysiert. Das Niveau an PDF mRNA wurde durch induzierte Differenzierung mittels Behandlung mit sowohl Retinolsäure als auch 3-Methoxybenzamid rasch verringert (4D). Die Untersuchung mittels in-situ-Hybridisierung an ES-Zellkulturen, in denen das LIF-Niveau zur Ermöglichung der Bildung von Kolonien mit einer Mischung aus differenzierten und undifferenzierten Zellen gesenkt wurde, zeigte, dass sich die PDF-Expression auf die undifferenzierten Zellen beschränkte (4B).
  • Pdf mRNA findet sich in pluripotenten ES- und EG-Zellen, und sowohl Mäuse- als auch humanen EC-Zellen, ist jedoch scheinbar in anderen Typen von Zelllinien nicht vorhanden (4 und nicht gezeigte Daten). Pdf-Expression wird zu einem frühen Zeitpunkt während der ES-Zell-Differenzierung down-reguliert, was auf eine enge Beziehung zur Identität von pluripotenten Stammzellen hinweist.
  • Beispiel 4
  • Erhalten pluripotenter Stammzellen von humanen Embryonen in Abwesenheit von Feedern/Feeder-Extrakt
  • Humane ES-Zellen werden auf einer Feeder-Schicht von gamma-bestrahlten Mäuseembryofibroblasten (MEF) in 80%igem DMEM-Medium, versetzt mit 100 Einheiten/ml LIF, 1 mM Glutamin, 0,1 mM 2-Mercaptoethanol, 1% nicht essenziellen Aminosäuren, 4 ng/ml basischem Fibroblastenwachstumsfaktor und 20% KnockOut SR (eine serumfreie Formulierung) (GIBCO-BRL), kultiviert.
  • Das in 1 gezeigte Plasmid (ebenso wie ähnliche Plasmide, bei denen die Mäuse-PDF-Sequenz durch eine humane PDF-Sequenz ersetzt ist) wird in das Vektorrückgrat linearisiert und in humane ES-Zellen transfiziert. Zur Transfektion kommt das in Eiges et al. beschriebene ExGen 500-Verfahren zur Anwendung, nur dass das Protokoll auf die Verwendung von 107 humanen ES-Zellen erhöht wird. Am Tag nach der Transfektion werden die Zellen trypsiniert und in zwei Teile geteilt. Eine Hälfte der Zellen wird in einer Dichte von 104/cm2 auf eine Schicht von Puromycin-resistenten MEFs ausplattiert, die andere Hälfte in einer Dichte von 104/cm2 auf Puromycinsensitiven MEFs. Zwei Tage nach erneuter Ausplattierung werden die Zellen auf den Puromycin-sensitiven MEFs trypsiniert und mit 104/cm2 auf gelatinbeschichtete Kunststoffschalen ausplattiert. Beide Kultursätze werden mit Puromycin versetzt, und das Medium wird alle 3-4 Tage ersetzt. Nach etwa 14 Tagen werden einige der auf Feedern wachsenden, Puromycin-resistenten humanen ES-Zellkolonien mittels Trypsinierung und direkte Ausplattierung auf gelatinbeschichtete Schalen auf deren Fähigkeit, in Abwesenheit einer Feeder-Schicht zu wachsen, untersucht.
  • Puromycin-resistente ES-Zelllinien werden über 6 Wochen hinweg auf deren Fähigkeit, mehreren aufeinanderfolgenden Passagen und der Subklonierung in Abwesenheit einer Feeder-Schicht unterzogen werden zu können, beurteilt.
  • Anschließend an die Exzision der gefloxten PDF-Expressionskassette wird wie beschrieben das Differenzierungspotential dieser Zellen geprüft (Eiges et al. 2001).
  • Beispiel 5
  • Charakterisierung der PDF cDNA
  • Im Rahmen einer Suche nach wiedererkennbaren Domains in der PDF-Sequenz mit SMART (http://smart.embl-heidelberg.de (Letunic et al., 2002; Schultz et al., 1998)) fand sich eine Homeodomain zwischen den Aminosäureresten 96 und 155; eine weitere offensichtliche Beziehung zu früher charakterisierten Proteinen bestand nicht. Die weitere Analyse mittels BLAST zeigte, dass PDF am engsten mit einigen Mitgliedern der NK2-Familie verwandt war. Die Identität ging jedoch in keinem Fall über 50% hinaus (3). Daher handelt es sich bei PDF entweder um ein Gründungsmitglied einer neuartigen Homeodomain-Familie oder um eine einzigartige Homeodomain-Variante (Shashikant et al., 1991).
  • Ein Vergleich des PDF mit der am engsten verwandten Humansequenz ergab eine Gesamtidentität von 60%. Die Sequenzkonservierung war am ausgeprägtesten über der Homeodomain, wo die Identität der beiden Sequenzen 87% betrug (3B). Dies geht weit über das zwischen den Homeodomains von PDF und anderen Mäuseproteinen beobachtete Identitätsniveau hinaus und weist darauf hin, dass es sich hier um das Human-Orthologon zu PDF handelt. Von den 8 nicht identischen Aminosäuren sind 6 in dem N-terminalen Arm um a-Helix 1 lokalisiert, Regionen der Homeodomain, die als loser mit dem DNA-Target assoziiert erachtet werden. Außerhalb der Homeodomain gibt es 4 Regionen, in denen ein zusammenhängendes Stück von mehr als 4 Aminosäureresten konserviert ist. Von diesen konservierten Regionen liegt nur eine, ein serinreiches Motiv, N-terminal zur Homeodomain, die übrigen liegen C-terminal zur Homeodomain. Die Humansequenz enthält zwischen dem ersten und dem zweiten dieser C-terminalen Identitätsmotive eine Insertion von sieben Aminosäuren. In der Mäusesequenz befindet sich zwischen der Homeodomain und den C-terminalen konservierten Sequenzen ein Stück von 46 Aminosäuren, in dem es sich bei jedem fünften Rest um Tryptophan handelt. Ferner stehen innerhalb dieser Sequenz die ersten 31 Aminosäuren für eine simple Reiteration der Sequenz WnsQTWTNPTW (n = G, S, N und s = S, N). Die Konservierung der Sequenz beim Menschen ist weniger markant und umfasst eine kurze Deletion hinsichtlich der Mäusesequenz. Allerdings handelt es sich mit Ausnahme des 16. Rests weiterhin bei jedem fünften Rest um Tryptophan.
  • In der 3'UTR der PDF mRNA liegt ein entgegen der Transkriptionsrichtung von PDF orientiertes B2-Repetetivelement vor (3C). Es ist nicht klar, ob diese Sequenz durch RNA-Polymerase III transkribiert wird, wenngleich die Sequenz des gesplitteten Promotors sehr wohl darauf schließen läßt (Galli et al., 1981). Da B2-Elemente in Embryozellen in großen Mengen exprimiert werden (Ryskov et al., 1983), ist es möglich, dass das Vorliegen des B2 innerhalb der 3'UTR der PDF mRNA, entweder direkt durch transkriptionelle Interferenz oder auf indirektere Mittel, zu der Regulierung von PDF-Genexpression beitragen kann.
  • Beispiel 6
  • Analyse der hPDF-Funktion in Mäuse-ES-Zellen
  • Die Fähigkeit des humanen PDF-Orthologons, die Aktivität von Mäuse-PDF zu replizieren, wurde durch Platzieren des humanen ORF in den pPyCAGIP-Vektor und Transfektion von Mäuse-ES-Zellen überprüft. Dies zeigte, dass die Humansequenz zur Steuerung der Cytokin-unabhängigen Selbsterneuerung von Mäuse-ES-Zellen in der Lage war (3). Diese Aktivität war gegenüber dem Mäuse-PDF herabgesetzt, was am ehesten auf die erhebliche Sequenzdivergenz zurückzuführen ist. Die Spezifität des Effekts von PDF wurde mittels eines ähnlichen Experiments getestet, wobei der ORF eines der dem PDF am nächsten verwandten Mäuse-Homeobox-Gens (Nkx2.5) in ES-Zellen exprimiert wurde. In diesem Fall war keine Cytokin-unabhängige Selbsterneuerung augenfällig; die erhaltenen Zellen erschienen sogar in Gegenwart von LIF morphologisch differenziert. Dies ist ein Hinweis darauf, dass Cytokin-Unabhängigkeit speziell durch PDF verliehen wird, und keine Gemeinsamkeit von Homeodomain-Proteinen darstellt.
  • Beispiel 7
  • In-vivo-Expression von mPDF
  • Wir untersuchten die Verteilung von PDF mRNA in vivo (5). Während der frühen Spaltungsstadien ist keine Expression zu beobachten. Erste Anzeichen von PDF mRNA-Expression zeigen sich bei kompaktierten Morulae. Es überrascht, dass das Hybridisierungssignal auf innen liegende Zellen, die spätere innere Zellmasse, begrenzt ist. In E3.5 ist die Blastozystenexpression auf Zellen der inneren Zellmasse restringiert und fehlt beim Trophectoderm. Bei Blastozysten in einem späteren Stadium ist die PDF mRNA noch weiter auf den Epiblast restringiert und von dem primitiven Endoderm ausgeschlossen. PDF-Transkripte erscheinen im Verlauf ansteigend mit Höchstniveaus zwischen Morulae im Spätstadium und der Blastozyste im mittleren Stadium. Bei unmittelbar vor der Implantatierung stehenden Blastozysten fiel das PDF mRNA-Niveau auf unter die Visualisierungsgrenze. Bedeutsam ist jedoch, dass die Transkripte im Epiblast von Blastozysten in Diapause weiterhin nachweisbar waren. Wir untersuchten auch die PDF-Expression in primordialen Keimzellen, da diese in pluripotente EG-Zellen konvertiert werden können (Matsui et al., 1992). Eine Expression ist in den migratorischen Keimzellen bei E8.5 nicht sichtbar, jedoch ist PDF mRNA in den Genitalfurchen von E11.5-Embryos leicht nachweisbar, wobei das Muster auf eine Begrenzung auf die primordialen Keimzellen hinweist (5B).
  • Beispiel 8
  • Beziehung zwischen PDF und anderen bekannten Mediatoren von Pluripotenz
  • Die Dosis-Response von ES-Zellen auf ansteigende PDF-Spiegel wurde durch episomale Expression in LRK1-Zellen beurteilt. Dies wurde mittels Transfektion episomaler, die cDNA-Expression auf unterschiedlichen Niveaus steuernder Konstrukte bewerkstelligt (8A). Der Anteil der erhaltenen Kolonien, die in Abwesenheit von Cytokin selbsterneuerbar waren, korrelierte mit dem für die Episomen auf Grundlage ähnlicher die gfp-Expressionsniveaus bestimmender Studien erwarteten Expressionsniveau (Daten nicht gezeigt). Wie bereits bei integrierte PDF-Transgene tragenden Zellen beobachtet wurde, erhöht der Zusatz von LIF zu Kulturen von PDF-Episomen tragenden Zellen ferner die Selbsterneuerung, sowohl was die Beurteilung der Anzahl gebildeter selbsterneuernder Kolonien als auch der Kolonien-Morphologie betrifft. Im Wesentlichen identische Ergebnisse wurden durch Transfektion derselben DNAs in die von CCE abgeleitete, das große T-Antigen des Tumorvirus Polyoma exprimierende Zelllinie MG1.19 erhalten (Gassmann et al., 1995).
  • Wir untersuchten, ob der kooperative Effekt von gp130-Signal und PDF-Überexpression darauf zurückzuführen ist, dass es sich bei dem PDF-Gen um ein transkriptionelles Target von STAT3 handelt. Die Verwendung von chimären Rezeptoren, bei denen der intrazelluläre Teil von gp130 mit dem extrazellulären Teil von GCSF-R verbunden ist, ermöglicht es, STAT3-Targets in ES-Zellen zu untersuchen. Eine Analyse der acht bekannten SOCS-Familienmitglieder, die alle potenzielle STAT-Targets sind, zeigte, dass nur SOCS3 in ES-Zellen durch LIF wesentlich stimuliert wird (8B, Daten nicht gezeigt). Diese Stimulation liegt nicht vor, wenn den vier STAT-Bindungsstellen in dem Rezeptor durch Mutation von Tyrosin zu Phenylalanin die Bindung von STAT3 untersagt ist (8B). Hingegen wird die SOCS3-Induktion erhöht und erhalten, wenn das negative regulatorische Tyrosin in ähnlicher Weise mutagenisiert wird, ein mit der in diesen Zellen beobachteten Aufrechterhaltung der STAT3-Aktivierung übereinstimmendes Ergebnis (Burdon et al., 1999). Im Gegensatz zu der Situation bei SOCS3, zeigt sich bei chimäre Rezeptoren exprimierenden Zellen weder nach LIF-Stimulation noch nach G-CSF-Stimulation eine Induktion von PDF-Expression (8B).
  • Beispiel 9
  • Beziehung zwischen PDF und Oct4
  • Anschließend wurde die Fähigkeit von PDF, Oct4 bei der Selbsterneuerung von ES-Zellen zu ersetzen, unter Verwendung von ZHBTc4.1-Zellen untersucht. Diese Zellen tragen zwei Null-Allele für Oct4, allerdings kann ihre Selbsterneuerung durch die Anwesenheit eines auf Doxycyclin reagierenden Oct4-Transgens aufrecht erhalten werden (Niwa et al., 2000). Wird die Expression des Oct4-Transgens durch Verabreichung von Doxycyclin reprimiert, kommt es zur Zelldifferenzierung. ZHBTc4.1-Zellen wurden mit kein Insert, Oct4 oder PDF tragenden linearisierten pPyCAGIP-Sequenzen transfiziert. Wie zuvor dokumentiert verhindert dieses Oct4-Plasmid die durch Doxycyclin induzierte Repression des Oct4-Transgens herbeigeführte Differenzierung (Niwa et al., 2002). Der PDF-Expressionsvektor konnte dies jedoch nicht (8C). Somit kann PDF zwar den ES-Zell-Phänotyp in Abwesenheit von gp130-vermittelter gp130-Stimulation aufrecht erhalten, nicht jedoch in Abwesenheit von Oct4.
  • Beispiel 10
  • ES-Zellidentität wird durch PDF-Expression getreu erhalten
  • Wir untersuchten die Konsequenzen von PDF-Transfektion in ES-Zellen, die kein Polyoma-LT enthalten. Ein IoxP enthaltendes Konstrukt wurde derart eingesetzt, dass die PDF cDNA anschließend durch Cre-Rekombinase exzidiert werden konnte. Nach Isolation stabiler Integranten kann dann Site-spezifische Rekombination dazu verwendet werden, den PDF ORF zu entfernen und gleichzeitig GFP unter die Kontrolle des CAG-Promotors zu stellen (6A). Durch die Exzision des PDF-Transgens lässt sich jede durch temporäre Transgenexpression herbeigeführte genetische oder epigenetische Veränderung an Zellen beurteilen. Bei diesen Experimenten war es unser Ziel, die Fähigkeit von PDF überexprimierenden Zellen zur klonalen Propagierung in Abwesenheit von gp130-Signal zu testen. Wir wollten zwei Punkte untersuchen: erstens, ob forcierte PDF-Expression die Differenzierung in einer Reihe von Umständen verhinderte, und zweitens, ob Pluripotenz und Embryokolonisierung in Abwesenheit von gp130-Signal erhalten werden konnte.
  • Klonale Transfektanten wurden durch Selektion in Puromycin isoliert, und die Expression von PDF-Transgen-mRNA wurde mittels Northern-Analyse bestätigt ( 6B). Zellen wurden mit geringer Dichte ausgesät und mindestens 7 Tage lang mittels zweier Passagen in Gegenwart von dem LIF-Antagonisten hLIF-05 expandiert (Vernallis et al., 1997). hLIF-05 blockiert die Fähigkeit aller bekannter LIF-R-Liganden zur Belegung des LIF-R/gp130-Komplexes. Mutterzellen, die parallel behandelt wurden, produzierten ausschließlich differenzierte Zellen, die nicht expandierten. Die gefloxte PDF-IRES-pac-Kassette enthaltende Linien hingegen erhielten eine undifferenzierte Morphologie und proliferierten weiter. Anschließend wurde LIF zugesetzt und die Zellen vorübergehend mit Cre transfiziert. Kolonien, in denen die PDF-Expressionskassette eliminiert worden war, wurden durch Expression von GFP und Wiederherstellung von Puromycinsensitivität identifiziert. Bei dieser Vorgehensweise wurden zwei unabhängige ES-Zelllinien, E14Tg2a und ZIN40, eingesetzt. Chromosomenbilder wurden für einige der resultierenden Klone untersucht, wobei sich in allen Fällen vornehmlich 40XY fanden.
  • Koloniebildende Assays wurden zur rigorosen Beurteilung des Phänotyps von PDS-Transfektanten und deren Cre-behandelten Derivate durchgeführt. Zellen wurden in klonaler Dichte in mit LIF, ohne LIF oder mit dem LIF-Antagonisten hLIF-05 versetztem Medium ausplattiert. Nach 6-tägiger Kultivierung wurden die Platten auf alkalische Phosphatase-Aktivität gefärbt und der Anteil an Kolonien, die ausschließlich aus undifferenzierten Zellen bestanden, quantifiziert (6C). Weder die Mutter- noch die GFP-exprimierenden Zellen formten vollständig undifferenzierte Kolonien in Abwesenheit von LIF oder in Gegenwart des LIF-Antagonisten. PDF-Transfektanten jedoch bildeten deutliche Anzahlen derartiger reiner Stammzellenkolonien. Nach Zusatz von LIF stieg dieser Anteil auf > 80% der Kolonien an. Nach Cre-vermittelter Exzision des Transgens ging diese erhöhte Reaktion auf LIF ebenfalls verloren.
  • Der Unterschied im Anteil an das PDF-Transgen exprimierenden Zellen, die vollständig undifferenzierte Kolonien in Gegenwart oder Abwesenheit von LIF bilden, geht mit einer Veränderung der Morphologie der Kolonien einher (6D). In beiden Fällen setzen sich die Kolonien aus kleinen undifferenzierten Zellen mit wenig Zytoplasma und hervorragenden Nucleoli zusammen. Ohne LIF wachsen die PDF-Expressoren zu einem Monolayer und sind im Wesentlichen von Mutter- oder Cre-behandelten ES-Derivatzellen, die in Abwesenheit von LIF kultiviert wurden, zu unterscheiden. Die Kombination von LIF und PDF-Expression veranlasst die Kolonien jedoch, eine dicht gepackte Morphologie anzunehmen, in der die Zellen vorzugsweise aneinander haften anstatt über das Substratum hinaus zu wachsen. Dies ähnelt dem "klassischen" Aussehen von auf Feeder-Schichten kultivierten ES-Zellen.
  • Die forcierte Expression von PDF ermöglicht den ES-Zellen die Selbsterneuerung in Abwesenheit von gp130-Stimulation, Kulturbedingungen, unter denen Mutterzellen differenzieren. Als nächstes bestimmten wir, ob PDF-Expressorzellen sich bei Exposition gegenüber Mitteln, die normalerweise eine Differenzierung herbeiführen, selbsterneuern oder differenzieren würden. Wurden PDF-exprimierende Zellen nach Exposition gegenüber 3-Methoxybenzamid (MBA) bzw. all-trans Retinolsäure (RA) vier Tage lang kultiviert, erhielten sie ein undifferenziertes Aussehen, wohingegen bei Kulturen sowohl der GFP-Derivate als auch der Mutterzellen morphologische Differenzierung auftrat (Daten nicht gezeigt). Dieses morphologische Merkmal spiegelt sich auf molekularer Ebene im Vergleich zur dramatischen Down-Regulierung bei Cre-Derivaten in fortwährender Expression von Oct4 durch PDF-Expression wider (6E). Diese Daten belegen, dass PDF-Transfektanten nicht auf Befehle, die normalerweise die Differenzierung in Monolayer-Kulturen steuern, reagieren, jedoch nach Transgen-Exzision die Fähigkeit zur Differenzierung wiederhergestellt ist.
  • Die Fähigkeit PDF-exprimierender Zellen, auf zelluläre Interaktionen, die Differenzierung induzieren, zu reagieren, wurde dann durch Aggregation in Suspensionskultur untersucht, Bedingungen, die zur Bildung multidifferenzierter Embryoidkörper aus ES-Mutterzellen führen. (Doetschman et al., 1985). Nach acht Tagen in der Aggragationskultur wurden die Embryoidkörper jeweils einzeln in eine Vertiefung einer Schale mit 48 Vertiefungen platziert und nachfolgend täglich auf spontane Kontraktionen bewertet, den Hinweis auf Differenzierung von Kardiomyozyten. 7A zeigt, dass die Häufigkeit von Kardiogenese bei PDF-Expressoren im Vergleich zu deren Cre-Derivaten um etwa 50% herabgesetzt ist. Ferner ist die Ausbildung von Herzzellen aus PDF-Expressoren gegenüber deren Cre-Derivate verzögert. Die Graphik in 7 unterbewertet eigentlich die Differenz zwischen den beiden Klassen, da Vertiefungen mit das gefloxte Transgen exprimierenden Zellen nur kleine Bereiche mit Schlagaktivität enthielten, während diese Bereiche bei Vertiefungen mit Cre-Derivaten ausgedehnt waren und in manchen Fällen den gesamten Bewuchs einschlossen. Embryoidkörper wurden ebenfalls während der letzten 4 Tage der Aggregationskultur Retinolsäure ausgesetzt und unter die neuronale Differenzierung fördernden Bedingungen ausplattiert (Bain et al., 1995; Li et al, 1998). E14Tg2a-Zellen bildeten große Anzahlen an Zellen mit neuronaler Morphologie, die neuronspezifisches b-Tubulin vom Typ III (TuJ) exprimierten (7B). Die ununterbrochene Anwesenheit von LIF hemmte die Differenzierung von TuJ-positiven Zellen. Die Ausbildung TuJ-positiver Zellen war ebenso in Kulturen blockiert, die von das gefloxte Transgen exprimierenden ES-Zellen abgeleitet waren, war jedoch in deren Cre-Derivaten wiederhergestellt. Allerdings waren die in den Vertiefungen von den E14Tg2a- (+LIF) und EF4-Kulturen verbleibenden Zellen im Aussehen nicht identisch. Erstere enthielten viele Zellen mit der Morphologie von ES-Zellen, wohingehen die PDF-Expressoren in ihrem Aussehen dispergierter waren, was auf eine mögliche Teildifferenzierung schließen lässt. Diese Beobachtungen zeigen, dass PDF-exprimierende ES-Zellen in einem Umfeld multizellulärer Aggregate keine effiziente Differenzierung durchmachen, wenngleich Differenzierung doch zu einem gewissen Grade induziert wird. Am bedeutsamsten ist, dass Cre-Derivatzelllinien nicht durch ihre Phase klonaler, von erhöhter PDF-Expression vorangetriebener Expression beeinträchtigt scheinen, da ihr Potenzial zur Differenzierung unter allen untersuchten Bedingungen jenem normaler ES-Zellen vergleichbar ist.
  • Schließlich untersuchten wir, ob forcierte PDF-Expression die Anforderung von LIF-R/gp130-vermitteltem Signalisieren zur Erhaltung von Embryokolonisierungseigenschaften umgeht. PDF-Transfektanten (in Abwesenheit von LIF isoliert und anschließend in Gegenwart von LIF-Antagonist über 1 Woche lang kultiviert), aus denen PDF-Sequenzen durch Cre-vermittelte Exzision entfernt worden waren, wurden in Mäuse-Blastozysten injiziert. Bisher haben wir Cre-Derivatlinien aus einem der PDF-Transfektanten beurteilt. Bei der Untersuchung der erhaltenen Chimären zur Hälfte der Trächtigkeit zeigte sich anhand GFP-Expression ein weitgehender Anteil der Zellen an Geweben des sich entwickelnden Embryos (7D). Embryos, bei denen ähnliche Injektionen durchgeführt worden waren, wurden ausgetragen und führten zum Erhalt lebender Chimären (Tabelle 1)
  • Diese Ergebnisse belegen: (i) dass das PDF-Transgen exprimierende Zellen sich unabhängig von Cytokin selbsterneuern; (ii) dass LIF kooperativ mit dem PDF-Transgen agiert, um eine verbesserte Fähigkeit zur Selbsterneuerung zu verleihen; und (iii) dass die Effekte der PDF-Transgenexpression nach Exzision des Transgens vollständig reversibel sind.
  • Figure 00470001
    Tabelle 1 Aus Cre-Derivaten von PDF-Transfektanten erhaltene lebend geborene Chimären.
  • Beispiel 11
  • Expression von PDF cDNA in humanen pluripotenten Zelllinien
  • In dieser Studie zeigten wir die Faktoren-abhängige Erhaltung von Pluripotenzialität nach Expression der humanen cDNA für Pluripotenz bestimmenden Faktor (pluripotency determining factor – PDF) in einer humanen pluripotenten EC-Zelllinie. Für diese klonal abgeleitete Zelllinie, Germ Cell Tumour 27X-1 (GCT 27X-1), freundlicherweise von Assoc. Prof. Martin Pera, Monash Institute for Reproduction and Development (MIRD,) Melbourne, Australien, bereitgestellt, war zuvor gezeigt worden, dass sie Dottersack, Trophoblast, Haut, Knorpel, Drüsenepithel, Neurectoderm und andere für die drei primitiven Keimschichten bei Fremdtransplantaten repräsentative Gewebe hervorbringt. Die selbe Zelllinie zeigt auch in vitro spontane Differenzierung in somatische und extraembryonale Zelltypen (Pera et al., 1998). Die GCT 27X-1-Zelllinie wird routinemäßig entweder auf einer Schicht mitotisch inaktivierter Mäuse-STO-Feeder-Zellen (9a) oder bei Abwesenheit von Feeder-Zellen unter Zusatz eines nicht charakterisierten Faktors, der von der Feeder-freien Kultur einer vom humanem Dottersack-Karzinom abgeleiteten Zelllinie – GCT 44 (freundlicherweise von Martin Pera, MIRD, Melbourne, Australien, bereitgestellt)(9b) – sezerniert wird, gehalten. Wird den GCT 27X-1-Zellkulturen geringer und klonaler Dichte dieses konditionierte Medium entzogen, führt dies zu ihrer vollständigen Differenzierung (9c).
  • Der hPDF-Transkriptionsfaktor wird endogen in pluripotenten GCT 27X-1-hEC-Zellen exprimiert (10), weshalb ihm eine Rolle in der Erhaltung der Selbsterneuerung in dieser und anderen humanen pluripotenten Zelllinien zugesprochen wird.
  • Wir zeigen hier den Verlust der Piuripotenzialität in GCT 27X-1 Feeder-freien Zellkulturen als Reaktion auf den Entzug des von Dottersack-Karzinom-Zellen abgeleiteten konditionierten Mediums und die Erhaltung von Pluripotenzialität auf klonaler Ebene bei Expression von exogenem hPDF.
  • Diese Befunde zeigen, dass der hPDF-Transkriptionsfaktor eine Grundlage für robuste Kultursysteme für humane ES-Zellen bereitstellt.
  • Experimentelle Vorgehensweise
  • Ein Konstrukt, das eine den offenen Leserahmen für das hPDF-Gen umfassende humane cDNA-Sequenz enthielt, wurde sowohl durch Lipofektion- als auch Elektroporationsverfahren in die GCT 27X-1-Zellen transfiziert. Stabile Transfektanten-Kolonien wurden in Abwesenheit von Feeder-Zellen, mit und ohne Zusatz von von GCT 44 abgeleitetem, für die Unterstützung von hEC-Zellwachstum und Erhaltung erfoderlichem konditioniertem Medium etabliert. Stabilie Kolonien wurden in Gegenwart des Antibiotikums Puromycin selektiert und jene, die die Erhaltung eines dichten hEC-Phänotyps zeigten (mittels Morphologie beurteilt), wurden ausgewählt und unter beiden Konditionen expandiert. Diese klonalen hPDF-exprimierenden Zelllinien wurden anschließend sowohl bei routinemäßiger als auch klonaler Dichte auf ihre Fähigkeit, einen pluripotenten Phänotyp in Abwesenheit von konditioniertem Medium aufrecht zu erhalten, überprüft; als Kontrolle dienten Wildtyp-GCT 27X-1-Zellen und mit einem ähnlichen Konstrukt transfizierte GCT 27X-1-Zellen, denen jedoch die hPDF-Sequenz fehlte.
  • Definitiv undifferenzierter hEC-Zellphänotyp in PDF-exprimierenden Zellen wurde durch Immunfluoreszenzfärbung auf den Marker Cluster Designation 30 (CD30), ein Mitglied der Tumornekrosefaktor-Rezeptoren-Superfamilie, bestätigt. Bei CD30 handelt es sich um einen für humane EC-Zellen spezifischen Marker, der während in-vitro-Differenzierung down-reguliert wird (Latza et al, 1995; Pera et al., 1997). Es besteht kein Hinweis auf Anwesenheit von CD30 auf Mäuse-EC- oder Mäuse-ES-Zellen.
  • Die vorliegende experimentelle Vorgehensweise ist in dem Flussdiagramm kurz dargestellt (11).
  • Material und Methodik
  • Vektorkonstrukte
  • Ein 8,8 kb großes Konstrukt mit der Bezeichnung gefloxtes hPDF (12a) enthält den offenen Leserahmen für die hPDF cDNA (900 bp), der unter einem humanen CMV IE (Cytomegalovirus immediate early enhancer) arbeitet, und den humanen Actin-Promotor stromaufwärts einer die IRES-vermittelte Expression des Puromycin-Resistenzgens bereitstellenden bicistronischen Reporter-Kassette, alle innerhalb von IoxP-Rekombinations-Sites. Zusätzlich enthält der Vektor das verbesserte GFP- Reporter-Gen stromabwärts der IoxP-Sites, das bei Vorliegen von Cre-vermittelter Rekombination die Sichtbarmachung mittels Fluoreszenz bereitstellt.
  • Ein ähnliches nicht gefloxtes Konstrukt, pPyCAGegfpIP ("GFP-Kontroll"-Vektor) (12b), in dem die hPDF-Sequenz in dem gefloxten hPDF-Vektor durch das stromaufwärts der IRES-Puromycin-Reporter-Kassette befindliche eGFP-Gen ersetzt wird, wurde zur Bereitstellung von "nicht hPDF"-exprimierenden transfizierten hEC-Zellen als Kontrolle in jedem Experiment eingesetzt.
  • hEC-Zellkultur
  • GCT 27X-1-Zellen wurden routinemäßig auf einer Feeder-Schicht mitotisch inaktivierter Mäuse-STO-Zellen in einem 1:1 v/v αMEM/Ham F-12-Medium (Invitrogen, Groningen, Niederlande), versetzt mit 2 mM L-Glutamin (Invitrogen), 2,7 g/l Natriumbicarbonat (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) und 10% FCS (Commonwealth Serum Laboratories, CSL, Melbourne, Australien), kultiviert und unter 5% CO2 bei 37°C gehalten. Die Zellen wurden alle 7 Tage unter Verdau mit einer in dem obigen Medium hergestellten 5 mg/ml Dispaselösung (Sigma) passagiert und mit einer Dichte von mindestens 1/10 der Ernte erneut ausplattiert.
  • Für Transfektionsexperimente und klonale Assays wurden GCT 27X-1-Zellen ohne STO-Feeder-Zellen, jedoch unter Zusatz des aus der Feeder-freien Kultur einer von humanem Dottersack-Karzinom abgeleiteten Zelllinie CGT 44 (freundlicherweise von Martin Pera, MIRD, Melbourne, Australien, bereitgestellt) erhaltenen konditionierten Mediums zu 25 Vol.-% in dem zuvor beschriebenen supplementierten αMEM/Ham F-12-Medium kultiviert. Einzelne Zellsuspensionen wurden durch Trypsin-Verdau mit einer in PBS-Puffer hergestellten Lösung aus 0,025% Trypsin (Invitrogen)/1 mM EDTA (Sigma)/1 % Hühnerserum (Invitrogen) hergestellt. Zellkulturen wurden mit klonaler Dichte mit 200-300 Zellen/cm2 und Kulturen mit geringer Dichte mit 5000 Zellen/cm2 gesät.
  • Die GCT 44-Zelllinie wurde routinemäßig auf mitotisch inaktivierten Mäuse-STO-Feeder-Zellen in einem glucosereichen DMEM-Medium (Invitrogen), versetzt mit 2 mM L-Glutamin (Invitrogen), 3,7 g/l Natriumbicarbonat (Sigma) und 10% FCS (CLS), kultiviert und unter 5% CO2 bei 37°C gehalten, jedoch durch Verdau mit einer in PBS-Puffer hergestellten Lösung aus 0,25% Trypsin (Invitrogen)/1 mM EDTA (Sigma) passagiert. Zu Tag 7, 10 und 14 wurde konditioniertes Medium aus den Feeder-freien Kulturen entnommen, sterilfiltriert und bis zu 2 Monate lang bei 4°C aufbewahrt. Jede Charge des konditionierten Mediums wurde auf die Fähigkeit, Feeder-freie klonale Kulturen von GCT 27X-1-hEC-Zellen wie oben beschrieben zu erhalten, getestet (Daten nicht gezeigt).
  • Die Mäuse-STO-Feeder-Zellen (freundlicherweise von Martin Pera, MIRD, Melbourne, Australien, bereitgestellt) wurden routinemäßig in glucosereichem DMEM-Medium (Invitrogen), das wie oben für die GCT 44-Kultur beschrieben versetzt war, gehalten. Die Routine-STO-Kulturen wurden zweimal wöchentlich durch Verdau mit einer in PBS-Puffer hergestellten Lösung aus 0,25% Trypsin (Invitrogen)/1 mM EDTA (Sigma) passagiert. Die mitotische Inaktivierung von STO-Zellen wurde durch 2-3-stündiges Inkubieren einer Routine-Kultur in einer in (wie oben) versetztem DMEM-Medium hergestellten 16 μg/ml Mitomycin-Lösung und zweimaliges Waschen mit PBS vor der Trypsinierung bewerkstelligt.
  • Zur routinemäßigen morphologischen Untersuchung der hEC-Zellen wurden die Kulturen fixiert und wie zuvor beschrieben einer Leishman-Färbung unterzogen (O'Brien, 2001).
  • Zellkulturen wurden routinemäßig durch Phasenkontrastmikroskopie unter Verwendung von entweder einem Leica DMIL (Leica Microscopy Systems, Wetzlar, Deutschland) oder einem Nikon Diaphot 300 (Nikon Inc., Melville, NY, USA) -Mikroskop untersucht. Fluoreszierende Kontroll-GFP-Zellkulturen wurden unter einem Nikon Diaphot 300-Mikroskop unter Verwendung eines 470/40 nm Nikon-Filters untersucht. Fluoreszenzdaten wurden auf einem Leica DFC300 F-Bildgebungssystem erhoben. Alle Zellkulturen wurden in Kunststoffmaterialien von Gewebekulturqualität, erhältlich von Falcon (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ, USA) oder Nunc (Roskilde, Dänemark), durchgeführt.
  • Stabile integrative Transfektion von hEC-Zellen
  • Die gefloxten hPDF- und GFP-Kontroll-Vektoren wurden jeweils durch Standardverdau mit Pvu/Restriktionsenzym linearisiert und sowohl mittels Elektroporations- als auch Lipofektionsverfahren in GCT 27X-1-Zellen transfiziert.
  • Elektroporation: Eine Einzelzellsuspension von 20-30 × 106 hEC-Zellen wurde durch Trypsin-Verdau hergestellt und mit 40 μg linearisierter DNA transfiziert; dazu verwendete man einen BTX ECM830 Quadratwellen-Elektroporator (BTX, San Diego, CA, USA), der auf die Abgabe von elektrischen Ladungen von 0,8 kV und eine Zeitkonstante von 0,1 ms (3 μF Kapazität) eingestellt war.
  • Lipofektion: 2 × 106 hEC-Zellen wurden einen Tag vor der Transfektion auf einer 78,5 cm2 großen Kulturschale gesät. Lipofektion erfolgte durch 6-stündiges Inkubieren der Zellen in serumfreiem Medium mit Lipofectamin 2000-Reagens (Invitrogen) zu 60 μg (1 μg/μl-Lösung) und 20 μg linearisierter DNA, entsprchend den Herstellerangaben. Zellen wurden 48 Stunden nach der Lipofektion trypsiniert und mit der gleichen Dichte wie für die elektroporierten Zellen ausplattiert.
  • Die transfizierten Zellen und nicht transfizierten Kontrollzellen wurden mit einer Dichte von 2 × 106 Zellen in 78,5 cm2 großen Schalen (~25 5000 Zellen/cm2) ausplattiert und bis zu 15 Tage lang sowohl mit als auch ohne konditioniertem Medium, das alle 3-4 Tage erneuert wurde, kultiviert. 2-3 Tage nach der Transfektion wurde Puromycin-Selektion, anfangs bei 0,4 μg/ml gefolgt von 1,0 μg/ml ab 10 Tagen bis 15 Tage nach der Transfektion, zur effektiven Selektion stabiler Integranten durchgeführt. Puromycinresistente hEC-Kolonien wurden in 2,0 cm2 große Vertiefungen überführt und dort für nachfolgendes Einfrieren und weitere Analysen expandiert. Um die Erhaltung selbsterneuernder GFP-Kontroll-hEC-Zelllinien zu gewährleisten, wurden nur Kolonien aus Platten mit konditioniertem Medium entnommen und expandiert. Die Vorgehensweisen für die stabile integrative Transfektion von hEC-Zellen entsprachen im Wesentlichen den zuvor für Mäuse-ES-Zellen beschriebenen (O'Brien, 2001).
  • CD30-Immunfärbung
  • Die Herstellung der hEC-Zellkulturen für die indirekte Immunfluoreszenzfärbung mit einem Maus-anti-Human-CD30 monoklonalen Antikörper (Dako, Glostrup, Dänemark) erfolgte durch zweimaliges Waschen mit PBS-Puffer, 10-minütiges Fixieren in Ethanol auf Eis und Aufbewahrung bei –20°C. Die Färbung erfolgte unter Verwendung einer 1:20-Verdünnung des Primärantikörpers in einem in PBS-Puffer hergestellten Färbediluens mit 0,1% Triton X-100 (Sigma)/2% Ziegenserum (Invitrogen)/13,3 Vol.-% BSA (Invitrogen). In dem obigen Diluens-Puffer wurde ein CyTM3-konjugierter Ziegen-anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Westgrove, USA) in einer Verdünnung von 1:200 eingesetzt. CD30-positive Zellen wurden unter einem 535/50 nm Nikon-Filter und komparative Hoechst (Sigma) – Färbung unter einem UV 330-360 nm Nikon-Filter begutachtet. Fluoreszenzdaten wurden auf einem Leica DFC300 F-Bildgebungssystem erhoben. Die Vorgehensweisen für die Immunfluoreszenzfärbung entsprachen der Beschreibung in den Laborprotokollen von SCS Ltd.
  • Northern Blot-Analyse
  • Poly A+ mRNA wurde aus subkonfluenten Kulturen von GCT 27X-1-Zellen, die sowohl auf STO-Feeder-Zellen als auch ohne Feeder-Zellen, jedoch in Gegenwart des wie oben beschriebenen konditionierten Mediums, kultiviert wurden, hergestellt. Zusätzlich wurde poly A+ mRNA aus Routine-Kulturen von STO-Zellen und E14Tg2a-Mäuse-ES-Zellen hergestellt, als Kontrollen für die nachfolgende Hybridisierung. RNA-Lysate wurden direkt aus Zellkulturen hergestellt und poly A+ mRNA mittels Affinitätschromatographie an Oligo(dT)-Cellulose (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) wie zuvor beschrieben isoliert (O'Brien, 2001).
  • Extrahierte mRNA-Proben (3-3,5 μg) wurden einer Elektrophorese auf 1 % w/v Agarose/0,66 M Formaldehyd-Denaturierungsgel in 1 × MOPS-Puffer unterzogen. Die RNA wurde auf N+-geladene Hybond-Membranen (Amersham Pharmacia Biotech, Amersham, Buckinghamshire, GB) transferiert und mit einem 32P-markierten (Amersham Pharmacia Biotech) 960 bp großen hPDF cDNA-Fragment, das mittels Eco RI-Restriktions-Enzymverdau aus dem pPyCAGhPDFIP-Vektor (Vektor freundlicherweise von IanChambers, ISCR, Edinburg, GB, bereitgestellt) isoliert worden war, hybridisiert. Ein 800 bp großes Hind III/EcoR I-Fragment der Gapdh-Kodiersequenz wurde zur erneuten Hybridisierung einiger Membranen zur Bereitstellung einer Ladungskontrolle für mRNA-Proben (Plasmid-DNA freundlicherweise von Kate Loveland, MIRD, Melbourne, Australien, bereitgestellt) verwendet. Die Exposition der Membranen erfolgte bis zu 24 Stunden zwischen intensifying Screens auf Biomax MS- (Kodak, Cedex, Frankreich) und Hyperfilm MP-(Amersham Pharmacia Biotech) Röntenfilmen. Blotting, Hybridisierung und Routinemolekularprozedere wurden gemäß den Ausführungen von Sambrook et al. (1989) durchgeführt.
  • Ergebnisse
  • Selbsterneuerung und Differenzierung von GCT 27X-1-Zellen
  • Routinekulturen der GCT 27.X-1-hEC-Zellen wurden wie unter Methodik beschrieben etabliert. Die Erhaltung eines pluripotenten Phänotyps wurde basierend auf der Beurteilung der Morphologie bei Kultivierung auf einer Schichte von STO-Feeder-Zellen (9a) bzw. in Abwesenheit von STO-Feeder-Zellen, jedoch in Gegenwart von von GCT 44-abgeleitetem konditioniertem Medium sowohl bei Routine- (9b) als auch klonaler Dichte (14g) nachgewiesen. Wurde den Feeder-freien Kulturen von hEC-Zellen das konditionierte Medium entzogen, so waren einsetzende Zelldifferenzierung und völliger Verlust von Pluripotenz in Kulturen geringer und klonaler Dichte nachweisbar (9c). Es wurde ferner gezeigt, dass, während Feeder-freie hEC-Kulturen nicht in der Lage waren, in weniger als 25% (v/v) konditioniertes Medium enthaltenden Kulturen eine pluripotente Morphologie aufrechtzuerhalten, der Ersatz des Routinekulturmediums durch mehr als 75% (v/v) konditioniertes Medium das Überleben und Wachstum der Kulturen nicht zur Gänze unterstützen konnte (Daten nicht gezeigt).
  • Endogene Expression von hPDF in hEC-Zellen
  • Zur Bestätigung der endogenen Expression des hPDF-Gens in pluripotenten GCT 27X-1-Zellen wurde ein poly A+ mRNA Northern Blot durchgeführt und mit einer radioaktiv markierten Sonde, die 900 bp einer in dem gefloxten hPDF-Vektor enthaltenen hPDF cDNA-Sequenz entsprach, hybridisiert. Die Ergebnisse in 10 zeigen den starken Nachweis durch die hPDF-Sonde einer ~2,4 kb großen Hybridisierungsbande in GCT 27X-1-Zellen, die sowohl auf Feeder-Zellen als auch ohne Feeder-Zellen, aber in Gegenwart von konditioniertem Medium gewachsen waren. Ein zweites, geringer ausgeprägtes Hybridisierungstranskript von ~5,6 kb Größe wurde ebenfalls für beide Kulturen nachgewiesen und durch Wiederholungstests auf unterschiedlichen RNA-Präparationen bestätigt (Daten nicht gezeigt). In aus einer Routinekultur von ausschließlich STO-Zellen hergestellter mRNA war keine Hybridisierungsbande nachweisbar. Eine schwache ~2,2 kb große Hybridisierungsbande wurde in Mäuse-E14Tg2a-ES-Zellen-mRNA nachgewiesen und weist auf ein in pluripotenten Mäusezellen exprimiertes homologes PDF-Transkript hin. Relative Mengen an poly A+ mRNA wurden mittels Rehybridisierung einer Membrane mit dem Housekeeping-Gen Gapdh in verschiedenen Gelspuren bestimmt. Dies war ein Hinweis darauf, dass das Mäuse-PDF-Transkript im Vergleich zu den in hEC-Zellen nachgewiesenen Transkripten auf viel niedrigeren Niveaus nachgewiesen wurde (Daten nicht gezeigt).
  • Das ~2,4 kb große in GCT 27X-1-hEC-Zell-mRNA nachgewiesene Transkript entspricht dem zuvor für eine aus der selben Mutterlinie abgeleitete nullipotente hEC-Zelllinie, GCT 27C4, beobachteten.
  • Transfektion von hPDF- und Kontroll-GFP-Vektoren
  • Bei den Versuchstransfektionsexperimenten mit dem GFP-Kontrollvektor lieferten Elektroporations- und Lipofektionsstrategien in GCT 27X-1-Zellen vergleichbare Ergebnisse (Daten nicht gezeigt). Die Transfektion von GCT 27X-1-hEC-Zellen mit dem gefloxten hPDF-Vektor wurde sowohl mittels Elektroporation als auch Lipofektion durchgeführt, wobei zum Vergleich eine Transfektion mit dem GFP-Kontrollvektor nur mittels der Lipofektionsmethode erfolgte (Tabelle 2).
  • Stabile integrative Kolonien, die den gefloxten hPDF-Vektor beherberten, wurden als Feeder-freie Kulturen sowohl in Gegenwart als auch Abwesenheit von konditioniertem Medium etabliert. Stabile integrative Kolonien, die den GFP-Kontrollvektor beherbergten, wurden unter den gleichen Bedingungen für die selbe Anzahl von ausplattierten Zellen etabliert. Stabile, mäßig große Kolonien wurden für beide Vektoren in 10-15 Tagen etabliert, wobei Kontrollplatten mit Puromycin für nicht transfizierte Zellen nach dieser Zeit im Wesentlichen kein Wachstum aufwiesen.
  • Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen für den gefloxten hPDF-Vektor eine geringfügig höhere Effizienz bei der Transfektion von GCT 27X-1-Zellen mittels Lipofektion als Elektroporation, zeigen scheinbar jedoch in der Anzahl stabiler hPDF-Integranten-Kolonien in Gegenwart von konditioniertem Medium keinen Unterschied zu jenen ohne konditioniertes Medium im Vergleich zu GFP-Kontroll-Transfektanten. Während die Kultur transfizierter Zellen ohne konditioniertes Medium nicht die mögliche Etablierung von Kolonien zu behindern scheint, unterscheidet sich deren Morphologie jedoch für gefloxte hPDF- und GFP-Kontroll-Transfektanten, wie in dem nachstehendem Abschnitt erörtert wird (siehe Tabelle 3).
  • Eine äquivalente Anzahl von Primärkolonien, die alle einen dichten pluripotenten hEC-Phänotyp aufwiesen, wurden entnommen und aus beiden Bedingungen für die hPDF-Transfektanten expandiert. Während GFP-Kontrollkolonien ohne konditioniertes Medium zur Beobachtung der Morphologie in stabilen Kolonien etabliert wurden (siehe Tabelle 3), wurden diese nicht entnommen, weil man in diesen Kolonien in diesem Zeitrahmen das Einsetzen von Differenzierung erwartete.
  • Es wurde beobachtet, dass transfizierte hPDF-Zellen anscheinend gleich viel Zeit für die Etablierung von Kolonien, sowohl in Gegenwart als auch Abwesenheit von konditioniertem Medium, benötigten, jedoch nach Selektierung jener, die ohne konditioniertes Medium wuchsen, weniger schnell expandierten als jene, die mit konditioniertem Medium kultiviert wurden. Ähnliches ist für PDF-exprimierende Mäuse-ES-Zellen, die sich in Kulturen mit und ohne LIF etablierten, beobachtet worden (siehe Beispiel 8). Bemerkenswert ist auch, dass in konditioniertem Medium expandierte GFP-Kontrollkolonien in konditioniertem Medium eine etwas raschere Wachstumsrate aufwiesen als ihr hPDF-Pendant.
  • Morphologische Beobachtungen bei hPDF- und GFP-Kontroll-Transfektanten
  • Stabile Transfektanten-Kolonien, die sich nach Transfektion mit dem gefloxten hPDF- und GFP-Kontroll-Vektoren etablierten und in Gegenwart und Abwesenheit von konditioniertem Medium kultiviert wurden, wurden nach Leishman-Färbung morphologisch miteinander verglichen (Tabelle 3). Die Kolonien wurden als "dicht", "mäßig" oder "lose" bewertet, um jene Puromycin-resistenten Kolonien zu beschreiben, die einen dichten pluripotenten Phänotyp aufrecht erhielten, jene, die sich bei beginnender Differenzierung zu einem gewissen Grade einen hEC-Phänotyp aufrecht erhielten, bzw. jene, die vollständig lose und differenziert vorlagen (13a–c).
  • Die Untersuchung der Koloniemorphologie primärer Transfektanten, wie in Tabelle 3 gezeigt, zeigt, dass, während hPDF-Transfektanten im Vergleich zu GFP-Kontroll-Transfektanten ein höheres Maß an dichter hEC-Morphologie in konditioniertem Medium zeigten, sich die Fähigkeit von hPDF-Transfektanten, einen pluripotenten Phänotyp ohne konditioniertes Medium zu erhalten, gegenüber GFP-Kontrollkolonien erhöhte, bei denen ein verstärkt loser, differenzierter Phänotyp zu beobachten war.
  • Wenngleich die Variation bei der Morphologie für aus jedem Vektor hervorgehenden Transfektanten durch die Stelle, an der die DNA in das Genom integriert wird, möglicherweise beeinflusst werden kann, scheinen jene aus der Transfektion mit dem gefloxten hPDF resultierenden fähiger zu sein, einen pluripotenten Phänotyp zu etablieren und zu erhalten, dies zu noch größerem Ausmaß unter Bedingungen, die normalerweise in Kolonien Differenzierung und den Verlust der Pluripotenz initiieren würden.
  • Im Allgemeinen waren Kolonien, die auf den hPDF-Transfektionsplatten ohne konditioniertes Medium kultiviert wurden, kleiner als in konditioniertem Medium wachsende Kolonien, obwohl viele einen dichten pluripotenten Phänotyp aufwiesen. Es bleibt auch die Möglichkeit, dass bei exogenen hPDF exprimierenden hEC-Zellen in Gegenwart von konditioniertem Medium ein synergistischer Effekt auftritt.
  • Erhaltung von Pluripotenz bei hPDF-exprimierenden Transfektanten
  • Die Fähigkeit von hPDF-exprimierenden stabilen Transfektantenlinien, unter Bedingungen, die normalerweise GCT 27X-1-Zelldifferenzierung initiieren, einen pluripotenten Phänotyp aufrechtzuerhalten, wurde durch indirekte Immunfluoreszenzfärbung mit dem CD30-Marker, der spezifisch für pluripotente hEC-Zellen ist und nicht in differenzierenden Zelltypen exprimiert wird, bestätigt.
  • Sechs hPDF-exprimierende Zelllinien, einschließlich einer ab der Transfektion ohne konditioniertes Medium etablierten und kultivierten Zelllinie, wurden mit klonaler Dichte sowohl in Gegenwart als auch Abwesenheit von konditioniertem Medium kultiviert. Vier der GFP-Kontroll-hEC-Transfektanten-Zelllinien (zur Selbsterneuerung in konditioniertem Medium gehalten) sowie nicht transfizierte GCT 27X-1-hEC-Zellen (ebenfalls seit dem Zeitpunkt der Transfektion in konditioniertem Medium ohne Feeder-Zellen gehalten) wurden parallel mit klonaler Dichte unter den gleichen Bedingungen wie die hPDF-Linien kultiviert. Die morphologische Analyse und indirekte Immunfluoreszenzfärbung mit CD30 erfolgte dann, wenn GFP-Kontrolle und GCT 27X-1-Zellen, die ohne konditioniertes Medium kultiviert worden waren, vollständige oder essentielle Differenzierung der Kolonien aufwiesen. Es wurde beobachtet, dass nicht transfizierte GCT 27X-1-Zellen rascher expandierte Kolonien bildeten als GFP-Kontroll- und hPDF-Zelllinien.
  • Es wurde gezeigt, dass hPDF cDNA-exprimierende Zelllinien mit und ohne konditioniertem Medium bei klonaler Dichte einen pluripotenten Phänotyp erhielten, während die GFP-Kontrollzellen und GCT 27X-1-Zellen Pluripotenz nur dann aufrechterhalten konnten, wenn konditioniertes Medium in der Kultur vorlag.
  • Die Ergebnisse in 14 zeigen die Morphologie zweier hPDF-Klone, die aus den Transfektionsplatten unter ständiger Gegenwart (hPDF-Klon D7) oder ständiger Abwesenheit (hPDF-Klon E7) von konditioniertem Medium expandiert und bei klonaler Dichte mit und ohne konditioniertem Medium kultiviert wurden (14a-d). Sowohl der hPDF D7- als auch E7-Klon zeigt die Fähigkeit, unter beiden Bedingungen hEC-Kolonien mit pluripotentem Zellphänotyp zu etablieren und zu erhalten. Parallel angelegte klonale Kulturen eines GFP-Kontroll-Klons, C15, und von nicht transfizierten GCT 27X-1-Zellen bestätigen die Fähigkeit dieser Zellen, pluripotente hEC-Kolonien nur in ständiger Gegenwart von konditioniertem Medium etablieren und erhalten zu können. In Abwesenheit von konditioniertem Medium werden C15 und GCT 27X-1-Zellen zur Differenzierung angeregt, wobei nur wenige oder überhaupt keine hEC-Zellen in lose gebildeten Kolonien verbleiben (14e-h).
  • Die Ergebnisse in 15 bestätigen die obigen Beobachtungen zur Morphologie bei vergleichsweiser Immunfluoreszenzfärbung mit CD30 und Hoechst einzelner aus hPDF D7, hPDF E7, GFP C15 und GCT 27X-1-Zelllinien etablierter Kolonien, die in Gegenwart und Abwesenheit von konditioniertem Medium kultiviert wurden. Alle Zelllinien zeigten die Fähigkeit zur Erhaltung selbsterneuernder CD30-positiver Kolonien bei Kultivierung in Abwesenheit von Feeder-Zellen und Gegenwart von konditioniertem Medium (15a-h). Da die GCT 27X-1-Zellen rascher große expandierte Kolonien etablierten als die transfizierten Zellen, hatte bei vielen davon am Rand eine Differenzierung eingesetzt, wie dies bei Überwuchs zu erwarten wäre (15g-h). Bei Abwesenheit sowohl von Feeder-Zellen als auch konditioniertem Medium waren nur hPDF-exprimierende hEC-Zellen in der Lage, CD30-positive Kolonien zu erhalten, während GFP-Kontroll und GCT 27X-1-hEC-Zellen keine selbsterneuernden Kolonien erhalten konnten (15i-p). Wiederum ließen sich jegliche in den GCT 27X-1-Kolonien beobachteten verbleibenden CD30-positiven Zellen der rascheren Expansion und Überwucherung dieser Kolonien zuschreiben (15o-p).
  • Es war zu beobachten, dass die hPDF E7-Zelllinie generell im Vergleich zu den hPDF D7-Zellen eine dichtere hEC-Kolonien-Morphologie (14a-d; 15a, c, i, k) und stärkeren Nachweis des CD30-Markers (15b, d, j, l) aufwiesen; dies kann die Stelle der willkürlichen DNA-Integration in das Genom jedes Klons widerspiegeln. Die hPDF E7-Zelllinie wurde anfänglich in Abwesenheit von sowohl STO-Feeder-Zellen als auch konditioniertem Medium nach der Transfektion etabliert. Nach mehr als 8-wöchiger kontinuierlicher Expansion unter diesen Kulturbedingungen zeigt die hPDF E7-hEC-Zelllinie weiterhin einen Phänotyp selbsterneuernder hEC-Zellen (16).
  • Dies zeigt, dass die exogene Expression der humanen PDF cDNA in einer humanen pluripotenten Zelllinie zur Erhaltung eines pluripotenten Phänotyps unter Bedingungen, die normalerweise in diesen Zellen die Differenzierung und den Verlust der Fähigkeit zur Selbsterneuerung bewirken, führt.
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  • Figure 00630001
  • Tabelle 2: Stabile integrative Transfektion von GCT 27X-1-Zellen mit einem hPDF-Vektor. Pluripotente GCT 27X-1 Zellen wurden transfektiert mit dem gefloxten hPDF-Vektor sowohl durch Elektroporations- als auch durch Lipofektionsstrategien und stabile transfektante Kolonien wurden erstellt ohne STO-Feeder-Zellen in Anwesenheit und Abwesenheit von konditioniertem Medium (+/–CM), unter Puromycin-Selektion. Um Kontrollzellinien bereitzustellen wurden GCT 27X-1-Zellen, transfektiert durch Lipofektion mit dem GFP-Kontrolvektor, unter denselben Bedingungen erstellt. Äquivalente Zahlen von Kolonien wurden gepickt and expandiert von allen Bedingungen, ausgenommen die GFP-Kontrollen, die lediglich von konditionierten Mediumplatten gepickt wurden, um hEC-Kolonien zu erhalten.
  • Figure 00640001
  • Tabelle 3: Morphologie von stabil integrativen hPDF- und Kontoll-GFP transfizierten GCT 27X-1-Zellen in unterschiedlichen Kulturbedingungen. Transfizierte Zellen wurden gesät mit einer Dichte von 25,500 Zellen/cm2 und Kolonien wurden erstellt unter Puromycin-Selektion während 10-15 Tagen, in Anwesenheit und Abwesenheit von konditioniertem Medium (+/– CM). Die Kolonien wurden gezählt nach einem dichten, mittleren oder losen Phänotyp in Bezug auf Pluripotenz, nach Anfärben mit Leishman's Farbstoff. Die angegebenen gefloxten hPDF-Koloniezahlen wurden von Electroporations-Transfektionsplatten genommen. SEQUENCE LISTING
    Figure 00650001
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Claims (47)

  1. Verfahren in vitro zum Erhalten einer pluripotenten Zellpopulation, die von einer von einem menschlichen Embryo abgeleiteten Zellpopulation verschieden ist, umfassend das Verabreichen eines Faktors an diese Population, der intrazellulär wirkt und der auf einer Zelle in Abwesenheit von gp130 Aktivierung Pluripotenz erhält oder verleiht, während der Faktor wenigstens 50% Sequenzidentität mit dem Polypeptid SEQ ID NO:4 hat.
  2. Verfahren in vitro zum Erhalten einer Zelle, die von einer von einem menschlichen Embryo abgeleiteten Zelle verschieden ist, in einem pluripotenten Zustand, umfassend das Aktivieren eines Gens, das einen Faktor kodiert, der intrazellulär wirkt und der auf einer Zelle in Abwesenheit von gp130 Aktivierung Pluripotenz aufrechterhält oder verleiht, während der Faktor wenigstens 50% Sequenzidentität mit dem Polypeptid SEQ ID NO:4 hat.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Gen ein endogenes Gen ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen auf einem episomalen Plasmid angeordnet oder stabil integriert ist.
  5. Verfahren in vitro zum Erhalten einer Zelle, die von einer von einem menschlichen Embryo abgeleiteten Zelle verschieden ist, in einem pluripotenten Zustand, umfassend Aufrechterhalten oder Erhöhen der Expression eines Gens in der Zelle, das einen Faktor kodiert, der intrazellulär wirkt und der auf einer Zelle in Abwesenheit von gp130 Aktivierung Pluripotenz aufrechterhält oder verleiht, wohingegen der Faktor wenigstens 50% Sequenzidentität mit dem Polypeptid SEQ ID NO:4 hat.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, wobei der Faktor die Pluripotenz einer menschlichen Stammzelle, die von einer von einem menschlichen Embryo abgeleiteten Zelle verschieden ist, erhält oder einer solchen Zelle Pluripotenz verleiht.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, wobei der Faktor die Pluripotenz einer Mäuse-Stammzelle erhält oder einer solchen Zelle Pluripotenz verleiht.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, wobei der Faktor die Pluripotenz einer Stammzelle aus einem nicht-permissiven Stamm von Mäusen erhält oder einer solchen Zelle Pluripotenz verleiht.
  9. Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei der Faktor ein Transkriptionsfaktor ist.
  10. Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei der Faktor eine Homeodomain enthält.
  11. Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei der Faktor embryonale Mäusestammzellen in einem pluripotenten Zustand erhält.
  12. Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei der Faktor embryonale Mäusekeimzellen in einem pluripotenten Zustand erhält.
  13. Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei der Faktor auf LIF nicht reagierende Zellen in einem pluripotenten Zustand erhält.
  14. Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei der Faktor ein Polypeptid mit 200 bis 400 Aminosäuren ist.
  15. Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei der Faktor wenigstens 90% Sequenzidentität mit dem Polypeptid SEQ ID NO:4 hat.
  16. Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei der Faktor wenigstens 95% Sequenzidentität mit dem Polypeptid SEQ ID NO:4 hat.
  17. Verfahren nach einem vorangehenden Anspruch, wobei der Faktor die Sequenz von SEQ ID NO:4 hat.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, wobei der Faktor eine Zelle in einem pluripotenten Zustand erhält, intrazellulär wirkt und eine Homeodomain enthält, die 50% oder mehr Sequenzidentität mit der Homeodomain von SEQ ID NO:4 hat.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Faktor auf LIF nicht reagierende Zellen in einem pluripotenten Zustand erhält.
  20. Verfahren nach Anspruch 18 oder Anspruch 19, wobei der Faktor ES-Zellen von nicht-premissiven Stämmen von Mäusen in Abwesenheit von Feeder-Zellen und in Abwesenheit von Feeder-Zellextrakt in einem pluripotenten Zustand erhält.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, wobei der Faktor die Ableitung und Erhaltung von Stammzellen von nicht-permissiven Stämmen von Mäusen in Abwesenheit von Feeder-Zellen und in Abwesenheit von Feeder-Zellextrakt in einem pluripotenten Zustand unterstützt.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Faktor Transkription reguliert.
  23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei der Faktor eine Homeodomain enthält.
  24. Verfahren nach einem der Ansprüche 21-23, wobei der Faktor ein Polypeptid mit 200 bis 400 Aminosäuren ist.
  25. Verfahren nach einem der Ansprüche 21-24, wobei der Faktor in auf LIF nicht reagierenden Zellen aktiv ist.
  26. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und einen Faktor enthaltend ein Polypeptid mit wenigstens 50% Sequenzidentität mit SEQ ID NO:4 zur Verwendung in Medizin.
  27. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei das Polypeptid wenigstens 90% Sequenzidentität mit SEQ ID NO:4 hat zur Verwendung in Medizin.
  28. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 26 oder 27, wobei der Faktor so ist, wie er in einem der Ansprüche 1, 2 oder 5-25 weiter definiert ist, zur Verwendung in Medizin.
  29. Zellkulturmedium umfassend einen Faktor enthaltend ein Polypeptid mit wenigstens 50% Sequenzidentität mit SEQ ID NO:4.
  30. Zellkulturmedium nach Anspruch 29, umfassend einen Faktor, der ein Polypeptid enthält, das wenigstens 90% Sequenzidentität mit SEQ ID NO:4 hat.
  31. Zellkulturmedium nach den Ansprüchen 29 oder 30, wobei der Faktor so ist, wie er in einem der Ansprüche 1, 2 oder 5-25 weiter definiert ist.
  32. Zellkulturmedium nach Anspruch 31, weiter enthaltend einen Aktivator von gp 130.
  33. Zellkulturmedium nach Anspruch 32, enthaltend einen LIF Rezeptorliganden wie z.B. LIF.
  34. Zellkulturmedium nach Anspruch 32 enthaltend IL-6 und löslichen IL-6 Rezeptor.
  35. Zelle, die von einer von einem menschlichen Embryo abgeleiteten Zelle oder einer menschlichen Keimzelle verschieden ist und in welcher die Expression oder Aktivität eines Faktors wie in einem der Ansprüche 1, 2 oder 5-25 definiert manipuliert worden ist.
  36. Pluripotente menschliche Zelle, die von einer von einem menschlichen Embryo abgeleiteten Zelle oder einer menschlichen Keimzelle verschieden ist und die in einem pluripotenten Zustand erhalten wird durch einen Faktor wie in einem der Ansprüche 1, 2 oder 5-25 definiert in der Abwesenheit von Feeder-Zellen und in der Abwesenheit von Feeder-Zellextrakt.
  37. Zelle die von einer von einem menschlichen Embryo abgeleiteten Zelle oder einer menschlichen Keimzelle verschieden ist, umfassend ein Gen, das einen Faktor kodiert wie in einem der Ansprüche 1, 2 oder 5-25 definiert, wobei das Gen aktiviert worden ist.
  38. Verwendung eines Faktors wie in einem der Ansprüche 1, 2 oder 5-25 definiert zum Erhalten einer Zelle, die von einer von einem menschlichen Embryo abgeleiteten Zelle verschieden ist, in einem pluripotenten Zustand in vitro.
  39. Verfahren zur Isolierung einer pluripotenten Zelle, die von einer von einem menschlichen Embryo abgeleiteten Zelle verschieden ist, umfassend: Einführen eines für einen Faktor wie in einem der Ansprüche 1, 2 oder 5-25 definiert kodierenden Nukleotids in eine Zelle in einer frisch isolierten Zellpopulation.
  40. Verfahren zu Isolierung einer pluripotenten nicht-menschlichen Zelle, umfassend: Erzeugen eines transgenen Tiers, wobei das transgene Tier ein Konstrukt enthält, auf welchem ein für einen Faktor wie in einem der Ansprüche 1, 2 oder 5-25 definiert kodierendes Nukleotid unter Kontrolle eines regulierten Promotors ist, Erhalten eines transgenen Embryos von dem transgenen Tier, Erhalten von Zellen des transgenen Embryos oder Tiers, und Aktivieren des Promotors, um dadurch den Faktor in der Zelle zu exprimieren.
  41. Verfahren zur Erzeugung eines transgenen nicht-menschlichen Tiers, umfassend: Exprimieren oder Zurverfügungstellen eines Faktors wie in einem der Ansprüche 1, 2 oder 5-25 definiert in einer Zelle, wodurch eine Kultur pluripotenter Zellen erhalten wird; Ausführen einer genetischen Manipulation von einer oder mehreren Zellen; im wesentlichen Auslöschen der Expression des Faktors in den Zellen oder Entfernen des Faktors aus den Zellen; und Erhalten aus den Zellen ein nicht-menschliches transgenes Tier.
  42. Nicht-menschliches transgenes Tier das erhalten werden kann durch das Verfahren von Anspruch 41.
  43. Transgenes nicht-menschliches Tier enthaltend eine Nukeotidsequenz, die einen Faktor wie in einem der Ansprüche 1, 2 oder 5-25 definiert unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors kodiert.
  44. Verfahren zum Screenen nach einem Faktor, der eine pluripotente Zelle, die von einer von einem menschlichen Embryo abgeleiteten Zelle verschieden ist, in einem pluripotenten Zustand erhält, umfassend: Zurverfügungstellen einer pluripotenten Zelle, die einen Faktor wie er in einem der Ansprüche 1, 2 oder 5-25 definiert exprimiert und die stabil erhalten wird i in einem pluripotenten Zustand und in welcher die Expression des Faktors kontrolliert werden kann; Ausführen einer Manipulation der Zelle; Reduzieren der Expression des Faktors; und Selektion nach einer Zelle, die in einem pluripotenten Zustand erhalten ist.
  45. Verfahren nach Anspruch 44, wobei die Manipulation ausgewählt ist aus: einer genetischen Manipulation der Zelle, wobei der Screen geeignet ist zur Identifizierung eines Faktors, der die Expression eines endogenen Gens steuert, das für einen Faktor wie in einem der Ansprüche 1, 2 oder 5-25 definiert kodiert, der die Zelle in einem pluripotenten Zustand aufrechterhält; und einer Manipulation von Kulturmedium oder von Kulturbedingungen, in welchem/n die Zelle kultiviert wird.
  46. Verfahren nach Anspruch 44 oder 45, bei welchem die Expression des Faktors gesteuert wird durch Regulieren eines regulierbaren Promotors in operativer Kombination mit einer Nukeotidsequenz, die den Faktor kodiert.
  47. Verfahren nach Anspruch 45, umfassend die Verringerung der Expression des Faktors durch Zugabe eines Repressors zu einem Medium, in welchem die Zelle kultiviert wird.
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