KR20040062981A - 프로스타글란딘 ｅ 합성효소 ２ 유전자의 붕괴 - Google Patents
프로스타글란딘 ｅ 합성효소 ２ 유전자의 붕괴 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 붕괴된 프로스타글란딘 E 합성효소 2 유전자를 함유하는 유전자-변형된 비-인간 포유동물 및 동물 세포 뿐만 아니라, 프로스타글란딘 E 합성효소 2를 억제하는 약제를 투여하는 것을 포함하는 염증-매개 질병의 치료 방법을 특징으로 한다.
Description
프로스타글란딘 E2(PEG2)는, PGH2의 분해에 의해 또는 프로스타글란딘 E 합성효소(PGES)로 촉매화된 반응에 의해 프로스타글란딘 H2(PGH2)로부터 유래된 주요 프로스타노이드이다 [Jakobsen 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 96:7220-25, 1999]. 시클로옥시게나제 (COX)-1 또는 COX-2에 의해 촉매화된 반응에서 형성되는 PGH2는, 프로스타글란딘, 프로스타시클린 및 트롬복산을 포함하여, 형성된 모든 프로스타노이드 생성물에 대한 전구체로서 작용한다 [Smith 및 Marnett, Biochem. Biophys.Acta 1083:1-17, 1991; Vane 및 Botting, Inflamm. Res. 44:1-10, 1995; Herschman, Biochim. Biophys. Acta 1299:125-140, 1996].
PGE2에 대한 특이적 모노클로날 항체에 관한 연구는, PGE2가 염증에 기여하는 주된 프로스타노이드임을 나타낸다 [Portanova 등, J.Exp.Med.184:883-91,1996]. PGE2의 주사는 혈장 유출 및 외상수용기의 감작과 함께 혈관확장을 통해 염증을 유발한다 [Vane 및 Botting, Inflamm.Res. 47(Suppl.2); S78, 1997]. 또한, PGE2는 기질 메탈로프로테인아제의 생성을 자극하고 [Mehindate 등, J.Immunol. 155:3570, 1995], 혈관신생을 자극하고 [Ben-Av 등, FEBS Lett. 372:83, 1995], T 림프구 세포사멸(apoptosis)을 억제한다 [Goetzl 등, J.Immunol. 154:1041, 1995].
PGES의 한 형태(PGES1 또는 cPGES)는 다양한 포유동물 세포주의 세포기질에서 구조적으로 발현되고, 일반적으로 세균 지질다당류(LPS)에 의한 자극에 의해 변경되지 않는다 [Tanioko 등, J.Biol.Chem. 42:32775, 2000]. PGES의 유도성 형태(PGES2, iPGES 또는 mPGES-1)가 마이크로좀 구획에 편재된다. mPGES-1이 PGES2를 위한 특정한 명명법임 되었음에 주목한다. PGES2 효소는 에이코사노이드 및 글루타티온 대사에 연관된 막-관련 단백질의 요소로서 동정되었으며, 인터류킨(IL)-1β에 의해 유도된다 [Jakobsen 등, Proc. Natl.Acad.Sci. USA 96:7220, 1999; Thoren 및 Jakobsen, Eur.J.Biochem. 267:6428, 2000]. 효소는 본래 마이크로좀 글루타티온 S-트랜스퍼라제 1-유사 1로 불리웠다 [Jakobsen 등, Protein Sci. 8:689, 1999].
많은 연구들이, COX-2 및 PGES2가 대등한 방식으로 조절된다는 것을 나타내었으며, PGES2가 염증, 발열 효과 및 세포 생육 조절에 관련된 COX-2-매개 반응에서 PGE2의 형성과 연관되는 주요 효소임을 시사하고 있다 [Yamagata 등, J.Neuroscience 21:2669-77, 2001; Murakami 등, J.Biol.Chem. 275:32783-92,2000]. 따라서, PGES2를 억제하는 약제가, 대안적인 치료제 또는 이에 추가로 COX-2 억제제를 제공하는 것으로 제안된다 [Stichtenoth 등, J.Immunol. 167:469-74, 2001]. 그러나, 염증 반응에서의 PGES2의 역할 및 PGES2 활성을 변조하는 것과 연관된 치료적 관련성을 더욱 한정하기 위해서, PGES2 녹아웃(knockout) 생쥐 및 PGES2 녹아웃 ES 세포를 포함하는 추가의 연구 수단이 요구되고 있다.
발명의 요약
본 발명은, 붕괴된 PGES2 유전자에 대해 동형접합 또는 이형접합인 유전자-변형된 비-인간 포유동물 및 동물 세포를 특징으로 한다.
첫번째 측면에서, 본 발명은 변형에 의해 붕괴된 PGES2 유전자가 얻어지는 유전자-변형된 비-인간 포유동물을 특징으로 한다. 바람직하게는, 포유동물은 설치류, 더욱 바람직하게는 생쥐이고/이거나, 포유동물은 실험적으로 유발된 염증 모델에 대해 약화된 반응, 예를들어 감소된 관절 염증, 감소된 백혈구 침윤, 관절 표면에서 감소된 프로테오글리칸 손실 및/또는 감소된 염증 통증 검출을 나타낸다. 다른 바람직한 구현양태에서, 포유동물은 붕괴된 ApoE 유전자를 더욱 포함한다.
본 발명의 두번째 측면은, 변형이 붕괴된 PGES2 유전자를 포함하는, 유전자-변형된 포유동물 세포를 특징으로 한다. 바람직한 구현양태에서, 세포는 배아 줄기(ES) 세포, ES-유사 세포, 또는 ES 세포-유래 마크로파지이고, PGE2로 보충된 배지에서 세포를 배양하고/하거나, 세포는 쥐 또는 인간의 세포이다. 다른 바람직한 구현양태에서, 세포는 염증 조건하에서 감소된 PGE2 생성을 나타낸다. 다른 바람직한 구현양태에서, 붕괴된 PGES2 유전자를 생성하는 변형을 함유한 유전자-변형된비-인간 포유동물로부터 세포를 단리한다.
세번째 측면에서, 본 발명은, PGES2 유전자를 붕괴시키는 유전자 변형에 대해 동형접합인 유전자 변형된 동물 세포의 발현 양상을 야생형 세포와 비교하는 것을 포함하는, 동물 세포에서 변형된 PGES2 활성의 결과로서 변형된 발현을 나타내는 유전자의 동정 방법을 특징으로 한다.
본 발명의 네번째 측면은, 프로스타글란딘 E 합성효소 2를 억제하는 약제를 투여하는 것을 포함하는, 염증-매개 질병의 치료 방법을 특징으로 한다. 이러한 염증은 만성 염증 (예를들어, 류마티스양 관절염 및 Th1-매개 질환, 예컨대 다발성 경화증) 및 급성 염증 통증 (예를들어, 부상-매개 통증)을 포함한다. 바람직하게는, 관절 염증, 백혈구 침윤, 관절 표면에서의 프로테오글리칸 손실 및/또는 염증 통증 검출을 감소시키기에 충분한 양으로 약제를 투여한다.
당업자라면, 본 발명을 설명하기 위하여 본 명세서 및 청구의 범위에서 사용된 용어들을 충분히 이해할 것이다. 그럼에도 불구하고, 달리 제공되지 않는 한, 하기 용어들은 바로 아래에 설명된 것과 같다.
"유전자-변형된" 비-인간 포유동물 또는 동물 세포는, 유전 공학에 의해, 비-인간 포유동물 또는 동물 세포 내로, 또는 선조 비-인간 포유동물 또는 동물 세포 내로 도입된 변형에 대해 이형접합 또는 동형접합이다. 변형을 도입하기 위해 이용될 수 있는 유전 공학의 표준 방법은, 동종 재조합, 바이러스 벡터 유전자 포획(trapping), 방사선조사, 화학적 돌연변이유발, 및 안티센스 RNA 단독 또는 촉매적 리보자임과의 조합을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 형질전환 발현을 포함한다.유전자를 붕괴시키기 위한 유전자 변형의 바람직한 방법은, 예를들어 동종 재조합 또는 바이러스 벡터 유전자 포획에 의하여, "외래 핵산 서열"을 유전자 좌 내에 삽입함으로써 내인성 유전자를 변형시키는 방법이다. "외래 핵산 서열"은 유전자에서 비-자연적으로 발생하는 외인성 서열이다. 외래 DNA의 이러한 삽입은, PGES2 유전자의 임의 영역, 예를들어 인핸서, 프로모터, 조절인자 영역, 비코딩(non-coding) 영역, 코딩(coding) 영역, 인트론 또는 엑손에서 발생할 수 있다. 유전자 붕괴를 위해 가장 바람직한 유전 공학 방법은 동종 재조합이고, 여기에서 외래 핵산 서열이 단독으로 또는 내인성 유전자 서열 일부의 결실과 함께 표적화 방식으로 삽입된다.
"붕괴된" PGES2 유전자란, PGES2 유전자의 야생형을 보통 발현하는 세포에서, 붕괴된 유전자에 의해 코딩된 PGES2 폴리펩티드의 세포 활성이 감소되거나 제거되도록 유전자 변형된 PGES2 유전자를 의미한다. 유전자 변형이 세포에서 PGES2 유전자의 모든 야생형 복제를 효율적으로 제거할 때 (예를들어, 유전자-변형된 비-인간 포유동물 또는 동물 세포는 PGES2 유전자 붕괴에 대해 동형접합이거나 또는 본래 존재하는 PGES2 유전자의 야생형 복제 만이 붕괴된다), 야생형 PGES2 유전자를 발현하는 대조 세포에 비하여, 유전자 변형은 PGES2 폴리펩티드 활성을 저하시킨다. 이러한 PGES2 폴리펩티드 활성의 감소는, 감소된 PGES2 유전자 발현에서 비롯되거나 (즉, PGES2 mRNA 수준이 효과적으로 감소되어 PGES2 폴리펩티드의 수준을 저하시킨다) 및/또는 붕괴된 PGES2 유전자가 야생형 PGES2 폴리펩티드에 비하여 변경된, 예를들어 감소된 기능 또는 안정성을 가진 돌연변이 폴리펩티드를 코딩하기때문에 일어난다. 바람직하게는, 유전자-변형된 비-인간 포유동물 또는 동물 세포에서의 PGES2 폴리펩티드의 활성은 야생형 수준의 50% 이하, 더욱 바람직하게는 25% 이하, 더욱 더 바람직하게는 10% 이하로 감소된다. 가장 바람직하게는, PGES2 유전자 붕괴 결과로서, 공지된 방법에 의해 평가시에 PGES2 활성이 검출될 수 없게 된다.
붕괴된 PGES2 유전자를 함유하는 "유전자-변형된 비-인간 포유동물"이란, 예를들어 원하는 유전자 변형을 보유한 포배 또는 배아를 형성한 다음 자궁내 발생을 위하여 포배 또는 배아를 보모(foster mother)에게 이식함으로써 독창적으로 생성된 비-인간 포유동물을 의미한다. 유전자 변형된 포배 또는 배아는, 생쥐의 경우에, 유전자-변형 배아 줄기 (ES) 세포를 생쥐 포배 내에 이식함으로써, 또는 ES 세포를 사배체 배아와 응집시킴으로써 만들어질 수 있다. 다른 방법에서, ES 세포 및 상실배 단계 (8세포) 배아 (배수체)를 사용한 응집에 의해 키메라 동물을 생성할 수 있다. 대안적으로, 핵 이입에 의해 유전자-변형 배아의 다양한 종이 수득될 수 있다. 핵 이입의 경우에, 공여체 세포는 체세포 또는 분화다능 줄기 세포이고, PGES2 유전자를 붕괴시키는 바람직한 유전자 변형을 함유하도록 조작된다. 이어서, 이 세포의 핵을 핵적출된 수정 또는 처녀생식 난모세포 내로 이입한다; 얻어진 배아를 복원시키고 포배로 발생시킨다. 상기 방법 중의 어느 하나에 의해 생성된 유전자 변형된 포배를 당업자에게 공지된 표준 방법에 따라 보모 내로 이식한다. "유전자 변형된 비-인간 포유동물"은, 자손이 PGES2 유전자를 붕괴시키는 유전자 변형의 적어도 하나의 복제를 물려받는 한, 상기 기재된 방법에 의해 만들어진 비-인간 포유동물의 모든 자손을 포함한다. 유전자 변형된 비-인간 포유동물의 모든 체세포 및 생식계 세포는 변형을 함유하는 것이 바람직하다. 붕괴된 PGES2 유전자를 함유하도록 유전자 변형된 바람직한 비-인간 포유동물은 설치류, 예컨대 생쥐 및 쥐, 고양이, 개, 토끼, 기니아 피그, 햄스터, 양, 돼지 및 흰담비를 포함한다.
붕괴된 PGE2 유전자를 함유하는 "유전자 변형된 동물 세포"란, 붕괴된 PGES2 유전자를 함유하도록 유전자 조작에 의해 만들어진 인간 세포를 포함한 동물 세포 뿐만 아니라 붕괴된 PGES2 유전자를 물려받은 자세포를 의미한다. 이러한 세포들은 당 기술분야에 공지된 표준 방법에 따라 배양액 중에서 유전자 변형될 수도 있다. 배양액 중에서 세포를 유전자 변형시키기 위한 대안으로서, PGES2 유전자 붕괴를 함유하는 유전자 변형된 비-인간 포유동물로부터 비-인간 포유동물 세포를 단리할 수도 있다. 본 발명의 동물 세포는 1차 세포 또는 조직 표본 뿐만 아니라 배양액-적응된 종양형성 또는 형질전환 세포주로부터 수득될 수 있다. 이러한 세포 및 세포주는 예를들어 내피세포, 상피세포, 소도세포, 뉴론 및 기타 신경조직-유래 세포, 중피세포, 골세포, 림프구, 연골세포, 조혈세포, 면역세포, 주요 선 또는 기관의 세포 (예를들어, 고환, 간, 폐, 심장, 위, 췌장, 신장 및 피부), 근육 세포(골격근, 유연근 및 심장근으로부터의 세포 포함), 외분비 또는 내분비 세포, 섬유아세포, 및 배아 및 기타 분화전능 또는 분화다능 줄기세포 (예를들어, ES 세포, ES-유사 세포 및 배아 생식계(EG) 세포 및 기타 줄기 세포, 예컨대 선조 세포 및 조직-유래 줄기 세포)로부터 유래된다. 바람직한 유전자 변형 세포는 ES 세포, 더욱 바람직하게는 생쥐 또는 쥐 ES 세포, 가장 바람직하게는 인간 ES 세포이다.
"ES 세포" 또는 "ES-유사 세포"란, 무한적으로 자기 재생가능할 뿐만 아니라 3개의 모든 배아 생식 층을 나타내는 세포 유형으로 분화될 수 있는, 배아로부터, 원시 생식 세포로부터 또는 기형암종으로부터 유래된 분화다능 줄기 세포를 의미한다.
"변형된 PGES2 활성"이란, 세포 내에서 기능성 PGES2 효소 수준의 변화를 유발하는 PGES2 유전자의 유전자 조작 결과로서, 또는 PGES2 활성을 촉진하거나 길항작용하는 약리학적 약제의 투여 결과로서 얻어지는, PGES2 효소의 활성 변화를 의미한다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 이하 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이다. 본 발명을 특정한 구현양태와 연관시켜 설명하였으나, 실행가능한 다른 변화 및 변형도 본 발명의 일부이고 청구범위의 범위내에 있는 것으로 이해된다. 본 출원은, 일반적으로 당 기술분야 내에 알려져 있거나 통상적으로 실행되는 개시내용으로부터의 변경을 포함하여, 본 발명의 원리에 따르고 부당한 실험없이도 확인가능한 균등물, 변형, 용도 또는 개작을 포함하는 것으로 생각된다. 핵산 및 폴리펩티드를 제조하고 사용하는 것에 관한 추가의 지침은 분자 생물학, 단백질 과학 및 면역학의 표준 교과서에서 찾아볼 수 있다 (예를들어, [Davis 등, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevir Sciences Publishing, Inc., New York, NY 1986]; [Hames 등, Nucleic Acid Hybridization, IL Press, 1985]; [Molecular Cloning, Sambrook 등, Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel 등, John Wiley and Sons]; [Current Protocols in Human Genetics, Eds.Dracopoli 등, John Wiley and Sons]; [Current Protocols in Protein Science, Eds. John E. Coligan 등, John Wiley and Sons]; 및 [Current Protocols in Immunology, Eds. John E. Coligan 등, John Wiley and Sons] 참조). 여기에 언급된 모든 발행물은 그 전체 내용이 참고문헌으로 인용된다.
본 발명은, 붕괴된 프로스타글란딘 E 합성효소 2 유전자를 함유하는 유전자-변형된 비-인간 포유동물 및 동물 세포 뿐만 아니라, 프로스타글란딘 E 합성효소 2를 억제하는 약제를 투여하는 것을 포함하는 염증-매개 질병의 치료 방법을 특징으로 한다.
도 1은, PGES2 유전자 표적 벡터, 내인성 쥐 PGES2 유전자에서 벡터의 동종 재조합을 위한 부위, 및 유전자 표적화를 입증하기 위해 사용되는 프라이머의 위치의 구현양태를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는, 붕괴된 PGES2 대립유전자에 관하여 야생형(+/+), 이형접합체(+/-) 및 녹아웃(-/-) 생쥐의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)-기본 유전자형 결정의 결과를 나타낸다.
도 3은, PGES2 녹아웃(-/-), PGES2 이형접합체(+/-) 및 야생형(+/+) ES 세포로부터의 ES 세포 시험관내 유래 마크로파지(ESMs)에서, PGE2 생성에 대해 미치는 아라키돈산(AA)으로의 10분 자극 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는, PGES2 -/-, PGES2 +/- 및 +/+ ES 세포로부터의 ESMs에서, PGE2 생성에 대해 미치는 다양한 농도의 지질다당류(LPS)로의 자극 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는, PGES2 -/-, PGES2 +/- 및 +/+ ES 세포로부터의 ESMs에서, PGE2 생성에 대해 미치는 칼슘 이온운반체 A23187로의 10분(10') 자극 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은, PGES2 녹아웃(-/-). PGES2 이형접합체 (+/-), 및 야생형 (+/+) ES 세포로부터의 ESMs에서, PGE2 생성에 대해 미치는 아라키돈산(AA)으로의 10분 자극 후에 10㎍/ml LPS로의 24시간 자극의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 7은, PGES2 -/- 및 PGES2 +/+ 콜라겐 면역화 수컷 및 암컷 생쥐에서 시간에 대한 관절염 스코어를 나타낸다.
도 8은, PGES2 -/- 및 PGES2 +/+ 콜라겐 면역화 수컷 및 암컷 생쥐에서 시간에 대한 관절염 발병율 %를 나타낸다.
도 9는, 혼합된 성별의 PGES2 -/- 및 PGES2 +/+ 콜라겐 면역화 생쥐에서 시간에 대한 관절염 스코어를 나타낸다.
도 10은, 혼합된 성별의 PGES2 -/- 및 PGES2 +/+ 콜라겐 면역화 생쥐에서 시간에 대한 관절염 발병율%를 나타낸다.
도 11은, 유사한 면역 프로토콜을 받은 동물에서 지연형 과민 반응 후에 PGES2 +/+ 및 PGES2 -/-에서의 발 부피 변화를 나타낸다.
도 12는, 피록시캄 대 비히클(vehicle)로 처리된 PGES +/+ 및 PGES -/- 생쥐에 대하여 시간 간격에서의 신장 횟수를 나타낸다.
붕괴된 PGES2 유전자를 함유하는 유전자 변형된 비-인간 포유동물 및 동물 세포
1. 유전자 변형된 비-인간 포유동물 및 동물 세포
본 발명의 유전자 변형된 비-인간 포유동물 및 인간 세포를 포함한 유전자 변형된 동물 세포는, PGES2 유전자를 붕괴시키는 변형에 대해 이형접합성 또는 동형접합성이다. 세포는 배양액 중에서 세포를 유전자 조작함으로써 유래될 수 있거나, 또는 비-인간 포유동물 세포의 경우에 유전자-변형된 비-인간 포유동물로부터 세포를 단리할 수 있다.
PGES2 유전자 좌는, 화학적 돌연변이유발 [Rinchik, Trends in Genetics 7: 15-21, 1991, Russell, Environmental & Molecular Mutagenesis 23 (Suppl.24); 23-29, 1994], 방사선 조사 [Russell, 상동]. PGES2 유전자 안티센스 RNA 단독 또는 촉매적 RNA 리보자임 서열과의 조합의 형질전환 발현 [Luyckx 등, Proc.Natl.Acad.Sci. 96:12174-79, 1999; Sokol 등, Transgenic Research 5:363-71, 1996; Efrat 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91: 2051-55, 1994; Larsson 등, Nucleic Acids Research 22: 2242-48, 1994]을 포함하여, 당 기술분야에 공지된 유전자 변형을 위한 여러 기술 중의 하나에 의해 붕괴되고, 이하 언급되는 바와 같이 PGES2 유전자 좌 내로 외래 핵산 서열을 삽입함으로써 PGES2 유전자가 붕괴된다. 바람직하게는 동종 재조합에 의해 또는 바이러스 벡터의 삽입에 의해 외래 서열이 삽입된다. 가장 바람직하게는, PGES2 유전자 붕괴 방법은 동종 재조합이고 내인성 PGES2 유전자 서열의 일부의 결실을 포함한다.
외래 서열의 통합은 하나 이상의 하기 메카니즘을 통해, 즉 PGES2 유전자 전사 또는 번역 과정을 방해함으로써 (예를들어, 프로모터 인식을 방해하거나, PGES2 유전자 내로 전사 종료 부위 또는 번역 정지 코돈을 도입함으로써); 또는 PGES2 유전자 코딩 서열이 정상적인 기능을 가진 PGES2 폴리펩티드를 더 이상 코딩하지 않도록 이 서열을 왜곡시킴으로써 (예를들어, PGES2 유전자 코딩 서열 내에 외래 코딩 서열을 삽입하거나, 격자이동 돌연변이 또는 아미노산(들) 치환을 도입하거나, 또는 이중 교배의 경우에 기능성 PGES2 단백질의 발현을 위해 필요한 PGES2 유전자 코딩 서열의 일부를 결실시킴으로써), PGES2 유전자를 붕괴시킨다.
본 명세서를 기초로 하여, 본 발명의 유전자-변형 비-인간 포유동물 및 동물 세포를 생성하기 위해 세포의 게놈에서 PGES2 유전자 좌 내에 외래 서열을 삽입하기 위하여, 당 기술분야에 공지된 표준 방법, 예컨대 에렉트로포레이션(electroporation), 칼슘-포스페이트 침전, 레트로바이러스 감염, 마이크로주입, 유전자총(biolistics), 리포좀 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 트랜스펙션, 트랜스페린 감염에 따라 외래 DNA 서열을 세포 내에 도입한다 (예를들어, [Neumann 등, EMBO J. 1:841-845, 1982; Potter 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81: 7161-65, 1984]; [Chu 등, Nucleic Acids Res. 15: 1311-26, 1987]; [Thomas and Capecchi, Cell 51: 503-12, 1987]; [Baum 등, Biotechniques 17: 1058-62, 1994]; [Biewenga 등, J.Neuroscience Methods 71: 67-75, 1997]; [Zhang 등, Biotechniques 15:868-72, 1993]; [Ray and Gage, Biotechniques 13: 598-603, 1992]; [Lo, Mol.Cell.Biol. 3:1803-14, 1983]; [Nickoloff 등, Mol.Biotech. 10: 93-101, 1998; Linney 등, Dev.Biol.(Orlando) 213: 207-16, 1999]; [Zimmer and Gruss, Nature 338: 150-153, 1989]; 및 [Robertson 등, Nature 323:445-48, 1986] 참조). 세포내에 외래 DNA를 도입하기 위해 바람직한 방법은 에렉트로포레이션이다.
2. 동종 재조합
동종 재조합의 방법은, PGES2 유전자를 함유한 세포 내에 PGES2 유전자 표적화 벡터를 도입함으로써, 붕괴를 위해 PGES2 유전자를 표적으로 한다. 붕괴를 위해 PGES2 유전자를 표적화하는 벡터의 능력은, PGES2 유전자에 상동성인, 다시말해서 관련된 벡터에서 뉴클레오티드 서열을 사용하는 것으로부터 유래된다. 이러한 상동성 영역은 벡터와 PGES2 유전자의 내인성 서열 사이의 하이브리드형성을 수월하게 한다. 하이브리드형성 시에, 표적화 벡터와 게놈 서열 사이에서 교배 가능성이 크게 증가한다. 이러한 교배에 의해 PGES2 유전자 좌 내에 벡터 서열이 통합되고 PGES2 유전자가 기능적으로 붕괴된다.
표적화를 위해 사용된 벡터의 구축에 관한 일반적인 원리는 문헌 [Bradley등, Biotechnol. 10: 534, 1992]에서 검토된다. 동종 재조합에 의해 DNA를 삽입하기 위하여 2개의 상이한 유형의 벡터가 사용될 수 있다: 삽입 벡터 또는 치환 벡터. 삽입 벡터는 원형 DNA이고, 이중 가닥 파단을 가진 PGES2 유전자 상동성 영역을 함유한다. 상동성 영역과 내인성 PGES2 유전자 사이의 하이브리드형성 후에, 이중 가닥 파단에서 한번의 교배 사건의 결과로, 교배 부위에서 내인성 유전자 내에 전체 벡터 서열이 삽입된다.
동종 재조합에 의해 본 발명의 유전자 변형 비-인간 포유동물 및 동물 세포를 생성하기 위해 더욱 바람직한 벡터는 치환 벡터이고, 이것은 원형이라기 보다는 직선형이다. PGES2 유전자 내로의 치환 벡터 통합은, 이중 교배 사건, 다시말해서 표적화 벡터와 PGES2 유전자 사이의 2개의 하이브리드 형성 부위에서 교배를 필요로 한다. 이러한 이중 교배 사건의 결과로, 2개의 교배 부위 사이에 삽입된 벡터서열이 PGES2 유전자 내로 통합되고, 2개의 교배 부위 사이에 원래 놓여있던 상응하는 내인성 PGES2 유전자 서열이 결실된다 (예를들어, 문헌 [Thomas and Capecchi 등, Cell 51: 503-12, 1987]; [Mansour 등, Nature 336: 348-52, 1988]; [Mansour 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87: 7688-7692, 1990] 및 [Mansour, GATA 7: 219-227, 1990] 참조).
본 발명의 유전자 변형된 비-인간 포유동물 및 동물 세포를 생성하기 위한 표적화 벡터 내의 상동성 영역은 일반적으로 적어도 100개 뉴클레오티드 길이이다. 가장 바람직하게는, 상동성 영역은 적어도 1 내지 5킬로베이스(kb) 길이이다. 상동성 영역을 위해 필요한 최소의 길이 또는 최소의 연관성 정도가 증명되어 있지 않긴 하지만, 동종 재조합을 위한 표적화 효율은 일반적으로 표적화 벡터와 PGES2 유전자 좌 사이의 길이 및 연관성 정도에 상응한다. 치환 벡터가 사용되는 경우에, 동종 재조합 시에 내인성 PGES2 유전자의 일부가 결실되고, 추가의 고려사항은 내인성 PGES2 유전자의 결실된 부분의 크기이다. 내인성 PGES2 유전자의 일부가 1kb 길이보다 크다면, 재조합 효율을 향상시키기 위하여 1kb보다 긴 상동성 영역을 가진 표적화 카세트가 추천된다. 본 명세서를 기초로 하여, 동종 재조합을 위해 효과적인 서열의 선택 및 이용에 관한 지침이 문헌 (예를들어 [Deng and Capecchi, Mol.Cell.Biol. 12: 3365-3371, 1992; Bollag 등, Annu.Rev.Genet. 23: 199-225, 1989] 및 [Waldman and Liskay, Mol.Cell.Biol. 8: 5350-5357, 1988] 참조).
당업자가 인식할 수 있는 바와 같이, p블루스크립트(pBluescript)-관련 플라스미드 (예, 블루스크립트 KS+11), pQE70, pQE60, pQE-9. pBS, pD10, 파지스크립트, phiX174, pBK 파지미드, pNH8A, pNH16a, pNH18Z, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, 및 pRIT5 PWLNEO, pSV2CAT, pXT1, pSG(스트라타겐), pSVK3, PBPV, PMSG 및 pSVL, pBR322 및 pBR322-기초 벡터, pMB9, pBR325, pKH47, pBR328, pHC79, 파지 카론(Charon) 28. pKB11, pKSV-10, pK19 관련 플라스미드, pUC 플라스미드 및 플라스미드의 pGEM 시리즈를 포함하여, 본 발명의 PGES2 유전자 표적화 벡터의 구축에서 다양한 종류의 클로닝 벡터가 벡터 주쇄로서 사용된다. 이러한 벡터들은 다양한 상업적 공급원 (예를들어, 미국 인디아나주 인디아나폴리스의 뵈링거 만하임 바이오케미칼스 (Boehringer Mannheim Biochemicals); 미국 캘리포니아주 발렌시아 퀴아겐(Quigen); 미국 캘리포니아주 라졸라의 스트라타겐 (Stratagene); 미국 위스콘신주 매디슨의 프로메가 (Promega); 및 미국 메사츄세츠주 베버리 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs))로부터 입수가능하다. 그러나, 예를들어 플라스미드, 바이러스 또는 그의 일부와 같은 기타 벡터들이 원하는 숙주에서 복제가능하고 생존가능한 이상 이들을 사용할 수 있다. 또한, 벡터는 변형되어지는 게놈을 가진 숙주에서 벡터를 복제할 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 벡터의 사용은 재조합이 일어나는 동안에 상호작용 기간을 연장시킬 수 있고 이것은 표적화 효율을 증가시킨다 ([Molecular Biology,ed. Ausubel 등, Unit 9.16, 도 9.16.1] 참조).
본 발명의 표적화 벡터를 증식시키기 위해 사용되는 특정한 숙주는 중요하지 않다. 그의 예는 이.콜리(E.coli) K12 RR1 [Bolivar 등, Gene 2:95, 1997], 이.콜리 K12 HB101 (ATCC No. 33694), 이.콜리 MM21 (ATCC NO.336780), 이.콜리 DH1(ATCC No. 33849), 이.콜리 균주 DH 5α 및 이.콜리 STBL2를 포함한다. 대안적으로, 시.세레비지애(C.cerevisiae) 또는 비.섭틸리스(B.subtilis)와 같은 숙주가 사용될 수 있다. 상기 언급된 숙주는 상업적으로 입수가능하다 (예를들어 미국 캘리포니아주 라졸라의 스트라타겐 및 미국 미들랜드주 락빌의 라이프 테크놀로지(Life Technologies)).
표적화 벡터를 생성하기 위하여, PGES2 유전자 표적화 구조물을 상기 기재된 벡터 주쇄에 첨가한다. 본 발명의 PGES2 유전자 표적화 구조물은 적어도 하나의 PGE2 유전자 상동성 영역을 갖는다. PGES2 유전자 상동성 영역을 형성하기 위하여, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 프라이머를 생성하기 위한 기초로서 PGES2 게놈 또는 cDNA 서열을 사용한다. 고 적합도 PCR 증폭에 의해 PGES2 서열의 바람직한 영역을 증폭시키기 위하여 이러한 프라이머들을 사용한다 [Mattila 등, Nucleic Acids Res. 19:4967, 1991; Eckert and Kunkel 1:17, 1991; 및 미국 특허 4,683,202]. 게놈 서열은 게놈 클론 라이브러리로부터 또는 게놈 DNA의 제제로부터, 바람직하게는 PGES2 유전자 붕괴를 위해 표적화된 동물 종으로부터 수득된다. PGES2 표적화 벡터를 형성하는데 있어서 쥐 PGES2 cDNA 서열이 사용될 수 있다 (진뱅크(Genbank) NM 022415 및 AB041997).
바람직하게는, 본 발명의 표적화 구조물은 포지티브 마커 단백질을 코딩하는 외인성 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 벡터 통합 후에 포지티브 마커의 안정한 발현은, 이상적으로 세포 생존성을 손상시키지 않으면서, 동정가능한 특징을 세포에 부여한다. 따라서, 치환 벡터의 경우에, 2개의 플랭킹 상동성 영역 사이에 마커 유전자가 위치하고, 그 결과 통합 후에 마커 유전자가 발현을 위해 위치하는 방식으로 이중 교배 사건에 따라서 PGES2 유전자 내로 통합된다.
포지티브 마커 단백질이 선택가능한 단백질인 것이 바람직하고; 세포 내에서 이러한 단백질의 안정한 발현은 선택가능한 표현형 특징을 부여하며, 다시말해서 이 특징이 다른 치사 조건하에서 세포의 생존을 증진시킨다. 즉, 선택가능한 조건을 부과함으로써, 생존성을 기초로 하여, 포지티브 선택가능한 마커-코딩 벡터 서열을 안정하게 발현하는 세포를, 벡터 서열을 성공적으로 통합하지 못한 다른 세포로부터 단리할 수 있다. 포지티브 선택가능한 마커 단백질 (및 그의 선택 시약)의 예는 neo(G418 또는 카노마이신), hyg (히그로마이신), hisD (히스티디놀), gpt (크산틴), ble (블레오마이신), 및 hprt (하이포크산틴)을 포함한다 (예를들어, Capecchi and Thomas, 미국 특허 5,464,764호 및 Capecchi, Science 244: 1288-92, 1989 참조). 선택가능한 마커에 대한 대체물로서 사용될 수 있는 다른 포지티브 마커는 리포터 단백질, 예컨대 β-갈락토시다제, 반딧불이 루시퍼라제 또는 GFP를 포함한다 (예를들어, 문헌 [Current Protocols in Cytometry, Unit 9.5, 및 Current Protocols in Molecular Biology, Unit 9.6, John Wiley & Sons, New York, NY 2000] 참조).
상기 기재된 포지티브 선택 단계는, PGES2 유전자 좌에서 표적화 동종 재조합에 의해 벡터를 통합한 세포를, 임의의 염색체 위치 내로 벡터 서열을 무작위하게 비-동종 통합한 세포와 구별하지 못한다. 따라서, 동종 재조합을 위해 치환 벡터를 사용할 때, 네가티브 선택가능한 마커 단백질 또는 적절한 대안물을 코딩하는뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 일례의 네가티브 선택가능한 마커는, 마커를 발현하는 세포가 특정한 시약에 노출될 때 생존성을 소실하도록 한다 (즉, 마커 단백질이 특정한 선택가능한 조건 하에서 세포에 대해 치명적이 된다). 네가티브 선택가능한 마커 (및 그의 치사성 시약)의 예는 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제 (간시클로비르 또는 1,2-데옥시-2-플루오로-α-d-아라비노푸란실-5-요오도우라실), Hprt (6-티오구아닌 또는 6-티오크산틴) 및 티프테리아 독소, 리신 독소 및 시토신 데아미나제 (5-플루오로시토신)을 포함한다.
네가티브 선택가능한 마커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 치환 벡터의 2개의 상동성 영역 밖에 위치한다. 이러한 배치가 제공되면, 통합이 무작위적 비-동종 재조합에 의해 일어나는 경우에, 세포가 네가티브 선택가능한 마커 만을 통합하고 안정하게 발현할 것이다. 따라서, 네가티브 조건을 부과함으로써, 무작위 비-동종 재조합에 의해 표적화 벡터를 통합한 세포가 생존성을 소실한다.
일련의 포지티브 및 네가티브 선택 단계는 동종 재조합에 의해 벡터 통합을 겪고 따라서 잠재적으로 붕괴된 PGES2 유전자를 가진 세포 만을 더욱 효율적으로 선택하도록 설계될 수 있기 때문에, 포지티브 및 네가티브 선택가능한 마커의 상기-기재된 조합이 바람직하다. 포지티브-네가티브 선택 체계, 선택가능한 마커 및 표적화 구조물의 추가의 예는 예를들어 미국 특허 5,464,764호, WO 94/06908 및 문헌 [Valancius and Smithies, Mol.Cell.Biol.11:1402, 1991]에 기재되어 있다.
벡터 통합시에 안정하게 발현되는 마커 단백질을 위하여, 마커 코딩 서열이 벡터 통합시에 내인성 PGES2 유전자 프로모터에 작동성으로 연결되도록 표적화 벡터를 설계할 수도 있다. 이어서, PGES2 유전자를 보통 발현하는 세포에서 PGES2 유전자 프로모터에 의해 마커의 발현이 진행된다. 대안적으로, 벡터의 표적화 구조물에 있는 각각의 마커는 PGES2 유전자 프로모터와는 독립적으로 발현을 진행시키는 자신의 프로모터를 함유할 수 있다. 이러한 후자의 체계는, PGES2 유전자를 전형적으로 발현하지 않는 세포에서 마커의 발현을 가능하게 한다는 장점을 갖고 있다 [Smith and Berg, Cold Spring Harbor Symp. Quant.Biol. 49:171, 1984; Sedivy and Sharp, Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 86:227, 1989; Thomas and Capecchi, Cell 51:503, 1987].
마커 유전자 발현을 진행하기 위해 사용될 수 있는 외인성 프로모터는 세포-특이적 또는 단계-특이적 프로모터, 구성 프로모터 및 유도성 또는 조절성 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터의 비-제한적 예는 헤르페스 심플렉스 티미딘 키나아제 프로모터, 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터/인핸서, SV40 프로모터, PGK 프로모터, PMC1-neo, 메탈로티오네인 프로모터, 아데노바이러스 후 프로모터, 박시니아 바이러스 7.5K 프로모터, 아비안 베타 글로빈 프로모터, 히스톤 프로모터 (예를들어, 마우스 히스톤 H3-614), 베타 액틴 프로모터, 뉴론-특이적 에놀라제, 근육 액틴 프로모터, 및 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터(예를들어, [Sambrook 등, Molecular Cloning, Vols I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989] 및 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY 2000] 참조); 스트라타겐 (미국 캘리포니아주 라졸라)를 포함한다.
세포가 벡터 서열을 표적화 PGES2 유전자 좌 내로 통합하는지의 여부를 입증하기 위하여, PGES2 유전자 좌 내로 원하는 벡터 통합의 존재를 확인하기 위해, 원하는 벡터 통합 사건을 위해 특이적인 프라이머 또는 게놈 프로브를 PCR 또는 사우던 블롯 분석과 조합하여 사용할 수 있다 [Erlich 등, Science 252:1643-51, 1991; Zimmer and Gruss, Nature 338:150, 1989; Mouellic 등, Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 87:4712, 1990; 및 Shesely 등, Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 88:4294, 1991].
3. 유전자 포획
본 명세서를 근거로 하여, PGES2 유전자를 붕괴시키기 위해 PGES 유전자 좌 내에 외래 핵산 서열을 삽입하기 위해 이용될 수 있는 다른 방법은 유전자 포획이다. 이 방법은, 유전자 포획 벡터 코딩 서열을 무작위 방식으로 유전자 내에 삽입하기 위해, 모든 포유동물 세포에 엑손을 mRNA로 스플라이스하는 세포 장치가 존재한다는 장점을 갖고 있다. 일단 삽입되면, 유전자 포획 벡터는 돌연변이를 일으키고 이것은 포획된 PGES2 유전자를 붕괴시킬 수 있다. 동종 재조합과는 반대로, 돌연변이유발을 위한 이러한 시스템은 무작위 돌연변이를 상당히 일으킨다. 따라서, 붕괴된 PGES2 유전자를 함유하는 유전자-변형 세포를 수득하기 위해서, 이러한 특정한 돌연변이를 함유하는 세포를, 각종 유전자에서의 무작위 돌연변이를 함유하는 세포의 풀로부터 동정하고 선택해야 한다.
유전자 변형 생쥐 세포 및 기타 세포 유형에서 사용하기 위한 유전자 포획 시스템 및 벡터가 문헌에 기재되어 있다 (예를들어, [Allen 등, Nature 333: 852-55, 1988]; [Bellen 등, Genes Dev. 3: 1288-1300, 1989]; [Bier 등, Genes Dev.3: 1273-1287, 1989]; [Bonnerot 등, J.Virol. 66: 4982-91, 1992]; [Brenner 등, Proc.Nat.Acad.Sci. USA 86:5517-21, 1989]; [Chang 등, Virology 193: 737-47, 1993]; [Friedrich and Soriano, Methods Enzymol. 225:681-701, 1993]; [Friedrich and Soriano, Genes Dev. 5: 1513-23, 1991]; [Goff, Methods Enzymol. 152: 469-81, 1987]; [Gossler 등, Science 244: 463-65, 1989]; [Hope, Develop. 113:399-408, 1991]; [Kerr 등, Cold Spring Harb. Symp.Quant.Biol.2: 767-776, 1989]; [Reddy 등, J.Virol. 65:1507-1515, 1991]; [Reddy 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 89:6721-25, 1992]; [Skarnes 등, Genes Dev. 6:903-918, 1992]; [von Melchner and Ruley, J.Virol. 63: 3227-3233, 1989] 및 [Yoshida 등, Transgen.Res. 4:277-87, 1995] 참조).
프로모터 트랩 또는 5' 벡터는, 5'에서 3' 순서로, 스플라이스 수용체 서열에 이어서 엑손을 함유하고, 이것은 전형적으로 번역 개시 코돈 및 개방 판독 프레임 및/또는 내부 리보좀 진입 부위를 특징으로 한다. 일반적으로, 이러한 프로모터 트랩 벡터는 프로모터 또는 작동적으로 연결된 스플라이스 공여체 서열을 함유하지 않는다. 그 결과, 숙주 세포의 세포 게놈 내로 통합된 후에, 프로모터 트랩 벡터 서열이 상류 유전자의 정상적인 스플라이싱을 방해하고, 말단 엑손으로서 작용한다. 벡터 코딩 서열의 발현은, 적절한 판독 프레임에서 붕괴된 유전자의 인트론 내로 통합되는 벡터에 의존된다. 이러한 경우에, 세포내 스플라이싱 장치는 벡터 코딩 서열의 상류에 있는 포획된 유전자로부터 엑손을 스플라이스한다 [Zambrowicz 등, WO 99/50426, 미국 특허 6,080,576호].
상기 기재된 프로모터 트랩 벡터와 유사한 효과를 생성하기 위한 대안적인 방법은, 프로모터 트랩 벡터의 스플라이스 수용체와 번역 개시 코돈 또는 폴리아데닐화 서열 사이의 영역에 존재하거나 또는 그것으로 공학적으로 조작된 정지 코돈의 내포된 세트를 함유하는 벡터이다. 또한, 독립적인 리보좀 진입 벡터(IRES)를 함유하도록 코딩 서열을 공학적으로 조작하여, 그 결과 숙주 세포 게놈 내의 통합 부위와 무관한 방식으로 코딩 서열이 발현될 수 있다. 전형적으로, 그러나 필수적인 것은 아니지만, 정지 코돈의 내포된 세트와 함께 IRES를 사용한다.
다른 유형의 유전자 포획 체계는 3' 유전자 트랩 벡터를 사용한다. 이러한 유형의 벡터는, 인접한 코딩 서열의 발현을 매개하는 프로모터 영역, 코딩 서열, 및 코딩 서열 엑손의 3' 말단을 한정하는 스플라이스 공여체 서열을, 작동적인 조합으로 함유한다. 숙주 세포 게놈 내로 통합된 후에, 벡터 프로모터에 의해 발현된 전사체는, 통합된 유전자 트랩 벡터 서열의 하류에 위치한 포획된 서열로부터의 스플라이스 수용체 서열로 스플라이스된다. 따라서, 벡터의 통합 결과로, 3' 유전자 트랩 카세트의 코딩 서열 및 말단 엑손과 그의 폴리아데닐화 시그날을 포함하는 하류 세포 엑손을 포함하는 융합 전사체가 발현된다. 이러한 벡터가 유전자 내로 통합될 때, 세포 스플라이싱 장치가 포획된 유전자의 3' 엑손의 상류에 있는 벡터 코딩 서열을 스플라이스한다. 이러한 벡터의 한가지 장점은, 유전자 트랩 카세트 내의 프로모터에 의해 3' 유전자 트랩 벡터의 발현이 진행되고, 이것이 숙주 세포에서 보통 발현되는 유전자 내로의 통합을 필요로 하지 않는다는 것이다 (Zambrowicz 등, WO 99/50426). 3' 유전자 트랩 벡터 내로 혼입될 수 있는 전사프로모터 및 인핸서의 예는, 표적화 벡터에 관해 상기 언급된 것을 포함한다.
프로모터 또는 3' 유전자 트랩 벡터를 위한 구조 성분으로서 사용되는 바이러스 벡터 주쇄는, 표적 세포의 게놈 내로 삽입될 수 있는 다양한 범위의 벡터로부터 선택될 수 있다. 적절한 주쇄 벡터는 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 가성광견병 바이러스, 알파-헤르페스 바이러스 벡터 등을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 바이러스 벡터, 특히 비복제 세포를 변형시키기 위해 적절한바이러스 벡터에 관한 철저한 검토 및 외인성 폴리뉴클레오티드 서열의 발현과 함께 이러한 벡터의 사용 방법은 문헌 [Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications, Eds.Caplitt and Loewy, Academic Press, San Diego, 1995]에서 찾아볼 수 있다.
바람직하게는, 유전자 포획을 위해 레트로바이러스 벡터가 사용된다. 이러한 벡터는 미국 특허 5,449,614호에 기재된 것과 같은 레트로바이러스 포장 세포주와 함께 사용될 수 있다. 비-생쥐 포유동물 세포가 유전자 변형을 위한 표적 세포로서 사용되는 경우에, 적절한 벡터를 포장하기 위하여 암포트로픽(amphotropic) 또는 향범성 포장 세포주가 사용될 수 있다 [Ory 등, Proc.Natl.Acad.Sci., USA 93:11400-11406, 1996]. 여기에 기재된 3' 유전자 트랩 벡터를 생성하기 위해 적합할 수 있는 대표적인 레트로바이러스 벡터가 예를들어 미국 특허 5,521,076호에 기재되어 있다.
유전자 포획 벡터는 동종 재조합을 위해 사용되는 포획 벡터에 관해 상기 언급된 하나 이상의 포지티브 마커 유전자를 함유할 수 있다. 표적화 벡터에서 사용하는 것과 유사하게, 세포 게놈 내로 벡터를 통합시키는 세포를 동정하고 선택하기 위해서 유전자 포획 벡터에서 포지티브 마커를 사용한다. 독립적인 리보좀 진입 부위(IRES)를 함유하도록 마커 유전자를 공학적으로 조작할 수도 있고, 그 결과 표적 세포 게놈 내로 벡터가 통합된 위치와는 무관한 방식으로 마커가 발현될 것이다.
상당히 무작위적 방식으로 감염된 숙주 세포의 게놈 내에 유전자 트랩 벡터가 통합된다면, 무작위적 벡터 통합을 겪은 세포 집단으로부터, 붕괴된 PGES2 유전자를 가진 유전자-변형 세포를 동정해야 한다. 바람직하게는, 세포 집단에서의 유전자 변형은 충분한 무작위성 및 빈도를 가지며, 그 결과 세포 집단은 세포의 게놈에서 발견되는 필수적으로 모든 유전자에서 돌연변이를 나타내고, 이것은 붕괴된 PGES2 유전자를 가진 세포를 집단으로부터 동정하기 쉽도록 한다 (예를들어, 문헌[Zambrowicz 등, WO 99/50426; Sands 등, WO 98/14614; 미국 특허 6,080,576호] 참조).
PGES2 유전자 서열에서의 돌연변이를 동정하기 위하여, 예를들어 역 전사 및 PCR을 사용하여, 돌연변이 세포 집단 중에서 붕괴된 PGES2 유전자를 함유하는 개별적인 돌연변이 세포주를 동정한다. 이러한 방법은 클론을 모음으로써 간소화될 수 있다. 예를들어, 붕괴된 PGES2 유전자를 함유하는 개개의 클론을 찾기 위하여, 유전자 트랩 벡터에 정착된 하나의 프라이머 및 PGES2 유전자 서열에 위치한 다른 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행한다. 포지티브 RT-PCR 결과는, 벡터 서열이PGES2 유전자 전사체에 코딩된다는 것을 나타내고, 이것은 PGES2 유전자가 유전자 트랩 통합 사건에 의해 붕괴되었음을 암시한다 (예를들어 Sands 등, WO 98/14614, 미국 특허 6,080,576호 참조).
4. 시간적, 공간적 및 유도성 PGES2 유전자 붕괴
본 발명의 특정한 구현양태에서, 특정한 발생 또는 세포 순환 단계 (시간적 붕괴)에서 또는 특정한 세포 유형(공간적 붕괴)에서 내인성 PGES2 유전자의 기능적 붕괴가 발생한다. 다른 구현양태에서, 특정한 조건이 존재할 때 PGES2 유전자 붕괴가 유도될 수 있다. 특정한 발생 단계에서, 특정한 조직 또는 세포 유형에서, 또는 특정한 환경 조건하에서 PGES2 유전자를 활성화 또는 불활성화시키기 위하여, Cre-Lox 시스템과 같은 재조합효소 절개 시스템을 사용할 수 있다. 일반적으로, Cre-Lox 테크놀로지를 사용한 방법은 예를들어 문헌 [Torres and Kuhn, Laboratory Protocols for Conditional Gene Targeting, Oxford University Press, 1997]에 기재된 바와 같이 수행된다. Cre-Lox 시스템을 위해 설명된 것과 유사한 방법이 FLP-FRT 시스템을 이용하여 사용될 수도 있다. 동종 재조합 또는 바이러스 삽입에 의해 유전자를 조절적으로 붕괴시키기 위하여 재조합효소 절개 시스템을 사용하는 것에 관한 추가의 지침이 예를들어 미국 특허 5,626,159호, 미국 특허 5,527,695호, 미국 특허 5,434,066호, WO 98/29533, [Orban 등, Proc.Nat.Acad.Sci. USA 89:6861-65, 1992] [O'Gorman 등, Science 251:1351-55, 1991; Saucer 등, Nucleic Acids Research 17:147-61, 1989] [Barinaga, Science 265:26-28, 1994] 및 [Akagi 등, Nucleic Acids Res. 25:1766-73, 1997]에 제공된다. 당업자가 알 수 있듯이,비-인간 포유동물 또는 동물 세포를 유전자 변형시키기 위하여 하나 이상의 재조합효소 시스템이 사용될 수 있다.
Cre-Lox 시스템과 같은 재조합효소 시스템을 사용하여, 시간적, 공간적 또는 유도성 방식으로 PGES2 유전자를 붕괴시키기 위해 동종 재조합을 사용할 때, PGES2 유전자 코딩 영역의 일부를, loxP 부위에 인접한 PGES2 유전자 코딩 영역을 포함하는 표적화 구조물로 대체시킨다. 이러한 유전자 변형을 보유하는 비-인간 포유동물 및 동물 세포는 기능적, loxP-인접 PGES2 유전자를 함유한다. PGES2 유전자 붕괴의 시간적, 공간적 또는 유도성 측면은 추가의 형질전환유전자인 Cre 재조합효소 형질전환유전자의 발현 패턴에 의해 유발되고, 이것은 각각 바람직한 공간적-조절, 시간적-조절 또는 유도성 프로모터의 제어하에 비-인간 포유동물 또는 동물 세포에서 발현된다. Cre 재조합효소는 재조합을 위해 loxP 부위를 표적으로 한다. 따라서, Cre 발현이 활성화될 때, 샌드위치형으로 삽입된 PGES2 유전자 코딩 서열을 절개하기 위해 LoxP 부위를 재조합시키고, 그 결과 PGES2 유전자가 기능적으로 붕괴된다 [Rajewski 등, J.Clin.Invest. 98:600-03, 1996; St.-Onge 등, Nucleic Acids Res. 24:3875-77, 1996; Agah 등, J.Clin.Invest. 100:169-79, 1997; Brocard 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 94:14559-63, 1997; Feil 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 93:10887-90, 1996; 및 Kuhn 등, Science 269:1427-29, 1995].
표준 형질전환 기술을 통해, 또는 유전자-변형된 비-인간 포유동물의 경우에, 하나의 교배친(parent)이 loxP 인접한 PGES2 유전자를 함유하고 다른 교배친이 원하는 프로모터의 제어하에서 Cre 재조합효소 형질전환유전자를 함유하는 것인 유전자-변형된 비-인간 포유동물을 교배시킴으로써, Cre 재조합효소 형질전환유전자 및 loxP-인접 PGES2 유전자를 모두 함유하는 세포가 생성될 수 있다. 재조합효소 시스템 및 시간적, 공간적 또는 조절적으로 PGES2 유전자를 붕괴시키는 특정한 프로모터를 사용하는 것에 관한 추가의 지침은 예를들어 문헌 [Sauer, Meth. Enz. 225: 890-900, 1993, Gu 등, Science 265: 103-06, 1994, Araki 등, J.Biochem. 122: 977-82, 1997, Dymecki, Proc.Natl.Acad.Sci. 93: 6191-96, 1996, 및 Meyers 등, Nature Genetics 18: 136-41, 1998]에 기재되어 있다.
테트라사이클린 반응성 이원 시스템을 사용함으로써 PGES2 유전자의 유도성 붕괴를 달성할 수 있다 [Gossen and Bujard, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:5547-51, 1992]. 이러한 시스템은 내인성 PGES2 유전자 조절 요소 내에 Tet 프로모터를 도입하고, 테트라사이클린-조절가능한 조절인자(TetR)를 발현하는 형질전환유전자를 도입하기 위해 세포를 유전자 변형시키는 것과 연관된다. 이러한 세포에서, 테트라사이클린의 투여는 TetR을 활성화시키고, 다시말해서 PGES2 유전자 발현을 억제하며, 따라서 PGES2 유전자를 붕괴시킨다 [St.-Onge 등, Nucleic Acids Res. 24:3875-77, 1996, 미국 특허 5,922,927호].
예를들어 WO 98/29533호 및 미국 특허 6,288,639호에 기재된 유전자 변형 방법과 같은 유전자 포획을 사용할 때, PGES2 유전자의 시간적, 공간적 및 유도성 붕괴를 위해 상기 기재된 시스템이 채택될 수 있다.
5. 유전자-변형된 비-인간 포유동물 및 동물 세포의 생성
동물로부터 유래된 실질적으로 모든 유형의 체세포 또는 줄기 세포에서PGES2 유전자를 붕괴시키기 위해 상기 기재된 유전자 변형 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 유전자-변형 동물 세포는, 이에 제한되지는 않지만 인간 세포를 포함한 포유동물 세포 및 조류 세포를 포함한다. 이러한 세포들은 배양액-순응된 종양형성 또는 형질전환된 세포주와 같은 동물 세포 주를 유전공학적으로 조작하는 것에서 유래될 수 있거나, 또는 원하는 PGES2 유전자 변형을 보유한 유전자-변형된 비-인간 포유동물로부터 단리될 수 있다.
세포는 붕괴된 PGES2 유전자에 대해 이형접합성이거나 동형접합성일 수도 있다. PGES2 유전자 붕괴를 위해 동형접합성인 세포를 수득하기 위하여(PGES2-/-), 양쪽 대립유전자의 직접적이고 연속적인 표적화를 수행할 수 있다. 이 방법은 포지티브 선택가능한 마커를 재순환시킴으로써 촉진될 수 있다. 이 체계에 따르면, Cre-Lox P 시스템을 사용하여 하나의 대립유전자를 붕괴시킨 후에 포지티브 선택가능한 마커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제거한다. 따라서, 두번째 PGES2 유전자 대립유전자를 붕괴시키기 위한 연속 표적화 차례에서 동일한 벡터를 사용할 수 있다 [Abuin and Bradley, Mol.Cell.Biol. 16:1851-56, 1996; Sedivy 등, T.I.G. 15:88-90, 1999; Cruz 등, Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 88: 7170-74, 1991; Mortensen 등, Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 88: 7036-40, 1991; Riele 등, Nature (London) 348: 649-651, 1990].
PGES2-/-인 ES 세포를 수득하기 위한 대안적인 방법은, PGES2 유전자 붕괴를 위해 이형접합성인 세포(PGES2+/-) 집단으로부터 세포를 동형유전자 접합시키는 것이다. 이 방법은, 선택가능한 약물 내성 마커를 발현하는 PGES2+/- 표적화 클론을매우 높은 약물 농도에 대해 선택하는 체계를 사용하고; 이러한 선택은 약물 내성 마커를 코딩하는 2개의 서열 복제를 발현하는 세포를 선호하며, 따라서 PGES2 유전자 붕괴에 대해 동형접합성이다 [Mortensen 등, Mol.Cell.Biol. 12:2391-95, 1992]. 또한, 이하 더욱 언급되는 바와 같이, 생식계 세포에서 PGES2+/-인 비-인간 포유동물을 결합시킴으로써 생성된 유전자-변형 PGES2-/- 비-인간 포유동물로부터 유전자-변형 동물 세포를 수득할 수 있다.
원하는 세포 또는 세포주의 유전자 변형 후에, 당 기술분야에 공지된 표준 PCR 또는 사우던 블로팅 방법에 따른 PCR 분석에 의하여 PGES2 유전자 좌를 변형 부위로서 확인할 수 있다 (예를들어, 미국 특허 4,683,202호; 및 문헌 [Erlich 등, Science 252: 1643, 1991] 참조). 보통 PGES2 유전자를 발현하는 세포에서 PGES2 유전자 메신저 RNA (mRNA) 수준 및/또는 PGES2 폴리펩티드 수준이 감소된다면, PGES2 유전자의 기능적 붕괴가 더욱 입증될 수 있다. 역 전사효소 매개 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR), 노던 블로트 분석, 또는 원위치(in situ) 하이브리드형성을 사용함으로써 PGES2 유전자 mRNA 수준의 측정을 수득할 수 있다. 세포에 의해 생성되는 PGES2 폴리펩티드 수준의 정량화는 예를들어 당 기술분야에 공지된 표준 면역분석 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 면역분석은, 이에 한정되지는 않지만, RIAs(방사능면역분석), ELISA(효소-결합 면역흡착분석), "샌드위치" 면역분석, 면역라디오메트릭 측정법, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 분석, 원위치 면역 분석(예를들어, 콜로이드 골드, 효소 또는 방사성동위원소 표지), 웨스턴 블롯트, 2-차원 겔 분석, 침전 반응, 면역형광 분석, 단백질 A 분석 및 면역전기영동 분석과 같은 기술을 사용하는 경쟁적 및 비-경쟁적 분석 시스템을 포함한다.
바람직한 유전자-변형 동물 세포는 배아 줄기(ES) 세포 및 ES-유사 세포이다. 이러한 세포는 다양한 종, 예컨대 생쥐 (Evans 등, Nature 129: 154-156, 1981; Martin, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 78: 7634-7638, 1981), 돼지 및 양 ([Notanianni 등, J.Reprod.Fert.Suppl. 43: 255-260, 1991]; [Campbell 등, Nature 380: 64-68, 1996]) 및 인간을 포함한 영장류 (Thomson 등, 미국 특허 5,843,780호, Thomson 등, Science 282: 1145-1147. 1995; 및 Thomson 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 92: 7844-7848, 1995)의 이식전 배아 및 포배로부터 유래된다.
이러한 유형의 ES 세포는 분화다능이다. 다시말해서, 적절한 조건하에서 이들은 3개의 모든 배아 생식층: 외배엽, 중배엽 및 내배엽으로부터 유래된 다양한 종류의 세포 유형으로 분화된다. 배양 조건에 의존하여, ES 세포의 샘플을 줄기 세포로서 무한적으로 배양할 수 있고, 이에 의해 단일 샘플내에서 다양한 종류의 상이한 세포 유형으로 분화되거나, 또는 특정한 세포 유형, 예컨대 마크로파지-유사 세포, 신경 세포, 심장근육세포, 연골세포, 지방세포, 유연근 세포, 내피세포, 골격근 세포, 각질세포, 및 조혈세포, 예컨대 호산구, 비만세포, 적혈구 전구세포, 또는 거대핵세포로 분화되는 것이 지시된다. 지시된 분화는, 예를들어 문헌 [Keller 등, Curr.Opin.Cell Biol. 7:862-69, 1995, Li 등, Curr.Biol. 8: 971, 1998, Klug 등, J.Clin.Invest. 98:216-24, 1996, Lieschke 등, Exp.Hematol. 23: 328-34, 1995, Yamane 등, Blood 90: 3516-23, 1997; 및 Hirashima 등, Blood 93:1253-63, 1999]에 기재된 바와 같이, 배양 조건 중에 특정한 생육 인자 또는 기질 성분을 포함시킴으로써 달성된다.
유전자 변형을 위해 사용되는 특정한 배아 줄기 세포는 중요하지 않다; 일례의 쥐 ES 세포 주는 AB-1 [MaMahon and Bradley, Cell 62: 1073-85, 1990], E14 [Hooper 등, Natrue 326: 292-95, 1987], D3 [Doetschman 등, J.Embryol.Exp.Morph. 87: 27-45, 1985], CCE [Robertson 등, Nature 323: 445-48, 1986], RW4 (미국 미조리주 세인트루이스의 게놈 시스템스(Genome Systems)) 및 DBA/1LacJ [Roach 등, Exp.Cell Res. 221: 520-25, 1995]를 포함한다. 공개된 절차 [Robertson, 1987, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Ed. E.J. Robertson, Oxford: IRI Press, pp.71-112, 1987; Zjilstra 등, Nature 342: 435-438, 1989; 및 Schwartzberg 등, Science 246: 799-803, 1989]에 따라서, 유전자 변형 생쥐를 생성하기 위해 유전자-변형 쥐 ES 세포를 사용할 수 있다.
ES 세포가 PGES2 유전자의 바람직한 기능적 붕괴를 함유하는지를 확인한 후에, 당 기술분야에 공지된 방법 [Capecchi, Trends Genet 5:70, 1989]에 따라서 키메라 생쥐의 발생을 위해 적절한 포배 숙주 내에 ES 세포를 주입한다. 본 발명에서 사용되는 특정한 생쥐 포배는 중요하지 않다. 이러한 포배의 예는 C57BL6 생쥐, C57BL6 알비노 생쥐, 스위스 웹스터 비근교 생쥐, CFLP 생쥐 및 MFI 생쥐로부터 유래된 것을 포함한다. 스위스 웹스터 생쥐는 통상적으로 입수가능한 것, 다시말해서 찰스 리버 래보러토리즈 (Charles River Laboratories)로부터의 CD-1 생쥐이다. 대안적으로, 응집 웰에서 4배체 배아들 사이에 ES 세포가 샌드위치형태로 삽입될 수도 있다 [Nagy 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90: 8424-8428, 1003].
이어서, 유전자-변형된 ES 세포를 함유하는 포배 또는 배아를 거짓임신 암컷 생쥐에 이식하고, 자궁내 발생시킨다 [Hogan 등, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, NY 1988] 및 [Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J.Robertson,ed., IRL Press, Washington, D.C., 1987]. PGES2 유전자 붕괴에 대해 키메라인 것을 동정하기 위하여, 보모에게 태어난 자손을 선별할 수도 있다. 일반적으로, 이러한 자손은 유전자-변형된 공여체 ES 세포로부터 유래된 일부 세포 뿐만 아니라 원래의 포배로부터 유래된 다른 세포를 함유한다. 이러한 상황에서, 공여체 ES 세포로부터 유래된 세포를 포배의 다른 세포와 구별하기 위하여, 코트 색 선택 방법이 사용되는 경우에, 자손을 먼저 모자이크 코트 색에 대해 선별할 수 있다. 대안적으로, 유전자-변형된 세포를 함유하는 생쥐를 동정하기 위하여 자손의 꼬리 조직으로부터의 DNA를 사용할 수도 있다.
생식 계 세포에서 PGES2 유전자 붕괴를 함유하는 키메라 생쥐의 결합은, 모든 생식 계 세포와 체세포에서 PGES2 유전자 붕괴를 소유한 후손을 생성한다. PGES2 유전자 붕괴에 대해 이형접합성인 생쥐를 교배하여 동형접합체를 생성할 수 있다 (예를들어, 미국 특허 5,557,032호 및 미국 특허 5,532,158호 참조).
세포로부터 전체 동물로 유전자 변형을 전달하기 위해 상기 기재된 ES 세포 기술의 대안적인 방법은 핵 이입을 사용하는 것이다. 생쥐 이외에 다른 유전자-변형된 비-인간 포유동물, 예를들어 양 [McCreath 등, Nature 29:1066-69, 2000; Campbell 등, Nature 389: 64-66, 1996; 및 Schnieke 등, Science 278:2130-33, 1997] 및 소 [Cibelli 등, Science 280: 1256-58, 1998]를 형성하기 위하여 이러한 방법이 사용될 수 있다. 간략하게, 체세포 (예를들어, 섬유아세포) 또는 분화다능 줄기 세포(예, ES-유사 세포)가 핵 공여체로서 선택되고, PGES2 유전자의 기능적 붕괴를 함유하도록 유전자-변형된다. PGES2 유전자를 돌연변이시키기 위해 체세포 내에 DNA 벡터를 삽입할 때, PGES2 유전자 내로의 벡터 통합이 PGES2 유전자 프로모터의 제어 하에서 마커를 발현시키도록, 프로모터가 없는 마커를 벡터에서 사용하는 것이 바람직하다 [Sedivy and Dutriaux, T.I.G. 15:88-90, 1999; McCreath 등, Nature 29:1066-69, 2000]. 적절한 PGES2 유전자 붕괴를 가진 공여체 세포로부터의 핵을 핵적출된 수정 또는 단위생식 난세포로 이입한다 [Campbell 등, Nature 380:64, 1996; Wilmut 등, Nature 385:810, 1997]. 배아를 재구성하고, 상실배/포배 단계로 발생되도록 배양시키고, 자궁내 발생을 위해 전체 기간 동안 보모 내로 이입시킨다.
본 발명은 또한 유전자-변형된 비-인간 포유동물 및 유전자-변형된 동물 세포의 후손을 포함한다. 후손이 PGES2 유전자를 붕괴시키는 유전자 변형에 대해 이형접합성 또는 동형접합성인 반면, 이들은 PGES2 유전자 본래의 유전자 붕괴 이외에도 계속되는 세대에서 일어날 수도 있는 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인하여 교배친 비-인간 포유동물 및 동물 세포와 유전적으로 동일하지 않을 수도 있다.
당업자에게 공지된 기술을 사용하여 조직 또는 기관으로부터 비-인간 유전자변형 동물로부터의 세포를 단리할 수 있다. 하나의 구현양태에서, 본 발명의 유전자 변형 세포가 불사화된다. 이 구현양태에 따르면, 텔로머라제 유전자, 종양유전자, 예를들어 mos 또는 v-src, 또는 세포자멸사-억제 유전자, 예를들어 bcl-2를 세포 내로 유전자 공학조작함으로써 세포가 불사화될 수 있다. 대안적으로, 당업자에게 공지된 기술을 사용하는 하이브리드형성 파트너와의 융합에 의해 세포가 불사화될 수 있다.
6. "인간화" 비-인간 포유동물 및 동물 세포
인간 PGES2 서열을 발현하기 위하여 (이하, 간단히 "인간화"라 언급함), 붕괴된 내인성 PGES2 유전자를 함유하는 본 발명의 비-인간 동물 세포의 경우에 유전자-변형된 비-인간 포유동물을 더욱 변형시킬 수 있다. 세포를 인간화시키기 위해 바람직한 방법은 동종 재조합에 의하여 내인성 PGES2 서열을 인간 PGES2 서열을 코딩하는 핵산 서열로 대체하는 것을 포함한다 [Jakobsson 등, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:7220-25, 1999]. 벡터는 5' 및 3' 상동성 팔 및 포지티브/네가티브 선택 체계에 대한 표적화 벡터로서 전통적으로 사용된 것과 유사하다. 그러나, 벡터는, 재조합 후에, 내인성 서열을 위한 인간 PGES2 코딩 서열을 대체하거나, 또는 인간 PGES2를 코딩하는 내인성 서열을 변형시키는 염기쌍 변화, 엑손 치환 또는 코돈 치환에 영향을 미치는 서열을 또한 포함한다. 일단 동종 재조합체가 동정되면, Cre 또는 Flp-매개 부위 특이적 재조합을 사용함으로써 선택-기준 서열 (예, neo)을 절개할 수 있다 [Dymecki, Proc.Natl.Acad.Sci. 93: 6191-96, 1996].
내인성 서열 대신에 인간 PGES2 서열을 대체할 때, 이러한 변화를 내인성 번역 출발 부위의 하류에 직접 도입하는 것이 바람직하다. 이러한 배치는 PGES2 유전자의 내인성 시간적 및 공간적 발현 패턴을 보존한다. 인간 서열은 적절한 처리 또는 전체 게놈 서열을 위해 3' 말단에 부착된 폴리 A 꼬리를 가진 전체 길이 cDNA 서열일 수 있다 [Shiao 등, Transgenic Res. 8: 295-302, 1999]. 내인성 유전자의 발현을 그의 인간 대응쌍으로 대체하기 위한 유전자 변형 세포 및 비-인간 포유동물의 방법에 관한 추가의 지침은 예를들어 문헌 [Sullivan 등, J.Biol.Chem. 272:17972-80, 1997, Reaume 등, J.Biol.Chem. 271: 23380-88, 1996] 및 [Scott 등, 미국 특허 5,777,194호]에서 찾아볼 수 있다.
이러한 "인간화" 유기체를 생성하기 위한 다른 방법은, 내인성 유전자를 붕괴시킨 다음, 전핵(pronuclear) 마이크로주입에 의해 인간 서열을 코딩하는 형질전환유전자를 녹아웃 배아 내에 도입하는 것을 포함하는 2단계 방법이다.
7. 유전자-변형 비-인간 포유동물 및 동물 세포를 위한 사용
PGES2 유전자의 붕괴를 위해 동형접합성(-/-) 및 이형접합성(+/-)인 본 발명의 비-인간 포유동물 및 동물 세포의 표현형을 조사함으로써, PGES2 기능 및 치료적 연관성을 밝혀낼 수 있다. 예를들어, PGES2가 특정한 질병 모델, 예를들어 관절염 또는 암에서 발현되는 표현형 또는 증상을 유발하는지, 감소시키는지 또는 예방하는지의 여부를 결정하기 위하여, 유전자-변형 PGES2 -/- 비-인간 포유동물 및 동물 세포를 사용할 수 있다. 증상 또는 표현형이 야생형 (PGES2 +/+) 또는 PGES2 +/- 비-인간 포유동물 또는 동물 세포에 비하여 PGES2 -/- 비-인간 포유동물 또는동물 세포에서 상이하다면, 증상 또는 표현형과 연관된 기능을 조절하는데 있어서 PGES2 폴리펩티드가 중요한 역할을 한다. PGES2 기능을 평가하기 위해 사용될 수 있는 동물 모델의 예는, 만성 및 급성 염증 반응 및 아픔에 반응하는 기능을 시험하기 위한 모델 (예를들어, 콜라겐 유발 관절염, 백혈구 주화성에 대한 공기 파우치 모델, 카라기난 유발 부종 및 아세트산-유발 라이딩(writhing)), 심장콩팥 기능을 평가하기 위한 모델 (예를들어, 소듐 섭취의 함수로서 뇨 프로스타글란딘 분비 측정) 및 혈전증을 평가하기 위한 모델 (예를들어, 출혈 시간 및 혈소판 응집 측정)을 포함한다.
또한, 약제가 PGES2 작용약 또는 길항약으로서 동정되는 상황하에서 (예를들어, 약제가 PGES2 +/+ 또는 PGES2 +/- 비-인간 포유동물 또는 동물 세포에 투여될 때 하나 이상의 PGES2 폴리펩티드 활성을 상당히 변경시킨다), PGES2의 (길항)촉진작용으로부터의 결과로 알려진 것 이외에도 약제에 의해 유발되는 다른 효과들을 특징화하기 위하여, 본 발명의 유전자-변형 PGES2 -/- 동물 세포가 유용하다(다시말해서, 비-인간 포유동물 및 동물 세포가 네가티브 대조로서 사용될 수 있다). 예를들어, PGES2 폴리펩티드 활성과 연관된 것으로 알려지지 않은 PGES2 +/+ 비-인간 포유동물 또는 동물 세포에서 약제의 투여가 효과를 일으킨다면, 약제를 상응하는 PGES2 -/- 비-인간 포유동물 또는 동물 세포에 투여함으로써, 약제가 PGES2의 변조를 통해 유일하게 또는 주로 효과를 발휘하는지의 여부를 결정할 수 있다. PGES -/- 비-인간 포유동물 또는 동물 세포에서 이러한 효과가 부재하거나 또는 상당히 감소된다면, 효과가 적어도 부분적으로 PGES2에 의해 조정된다. 그러나,PGES2 -/- 비-인간 포유동물 또는 동물 세포가 PGES2 +/+ 또는 PGES2 +/- 비-인간 포유동물 또는 동물 세포에 필적하는 정도로 효과를 나타낸다면, 이러한 효과는 PGES2 신호화와 연관되지 않은 경로에 의해 조정된다.
또한, 약제가 PGES2 경로를 통해 효과를 발휘할 수 있을 것으로 추측된다면, PGES2 -/- 비-인간 포유동물이 이 가설을 시험하기 위한 네가티브 대조로서 유용하다. 약제가 PGES2를 통해 작용한다면, 약제의 투여시에 PGES2 -/- 비-인간 동물이 PGES2 +/+ 비-이간 포유동물에서 관찰되는 것과 유사한 효과를 나타내어서는 안된다.
각각의 야생형 대조에 비해 PGES2 +/- 또는 PGES2 -/- 비-인간 포유동물 또는 동물 세포에서 발현이 상향조절된 유전자를 동정하기 위하여, 본 발명의 유전자 변형된 비-인간 포유동물 및 동물 세포가 사용될 수 있다. 본 명세서를 기초로 하여 이러한 유전자를 동정하기 위하여 당업자에게 공지된 기술이 사용될 수 있다. 예를들어, PGES2 발현의 부족을 상쇄하기 위하여, PGES2 +/- 또는 PGES2 -/- 생쥐에서 발현이 상향조절된 유전자를 동정하기 위해 DNA 분석을 사용할 수 있다. DNA 분석은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를들어 아피메트릭스(Affymetrix)로서 통상적으로 입수가능하다 (예를들어, 미국 특허 5,965,352호; [Schena 등, Science 270:467-470, 1995]; [DeRisi 등, Nature Genetics 14:457-460, 1996]; [Shalon 등, Genome Res. 6:639-645, 1996]; 및 [Schena 등, Proc.Natl.Acad.Sci. (USA) 93:10539-11286, 1995] 참조).
A. 라이브러리 하이브리드형성
DBA/1lacJ 게놈 람다 파지 라이브러리(스트라타겐)를 하이브리드형성하기 위하여, 335개 뉴클레오티드 부분 cDNA 단편 (진뱅크 AB041007의 생쥐 PGES2 cDNA 서열의 뉴클레오티드 35-369)을 사용하였다. 3개의 중복 PGES2 게놈 클론을 단리하고, p블루스크립트 SK+ (스트라타겐)의 NotI 부위 내에 서브클론화하였다. 이러한 클론들을 제한효소 지도작성하고, 모든 3개의 엑손을 포함하여 PGES2 게놈 좌의 24kb를 함유하는지를 결정하였다.
B. 표적화 벡터 구축
PGES2 게놈 클론 #24.2-8로부터 1.0kb Nhe I/Bgl II 단편을 단리하고, 리트머스(Litmus) 28 벡터(미국 메사츄세츠주 베버리의 뉴 잉글랜드 바이오랩스)의 Xba I/BamH I 부위 내로 서브클론화하였다. 이러한 1.0kb 단편을 Kpn I/Eco RI 소화로 리트머스 벡터로부터 재-단리하고, pJNS2-Frt 표적화 벡터 주쇄의 Kpn I/Eco RI 부위 내에 클론화하여[Dombrowicz 등, Cell 75: 969-76, 1993] 5' 상동성 팔로서 작용하도록 하였다. 이러한 중간체 클론을 PGES2 5'-JNS2Frt 클론 #10으로서 명명하였다. 8.8kb Not I/Sph I 제한 단편으로서 게놈 클론 #24.2-8로부터 3'상동성 팔을 단리하였다. 이러한 8.8kb 단편을 클론화 벡터 리트머스 39 (뉴 잉글랜드 바이오랩스)의 Eag I/Sph I 부위 내로 서브클론화하고, 8.8kb Sal I 단편으로서 리트머스 39 벡터로부터 재-단리하였다. 이러한 Sal I 단편을 PGES2 5'-JNS2Frt 클론 #10의 Xho 부위 내에 클론화하였다. 양쪽 상동성 팔을 함유하는 이러한 최종 표적화 벡터 클론 (PGES2-KO 클론 #5로 명명)은, PGES2 게놈 좌의 3.0kb를 PGK-네오마이신 카세트로 대체하도록 설계되었다. 3.0kb 결실된 단편은 엑손 1의 일부 및 전체 엑손 2를 함유하였으며, 이것은 진뱅크 AB041997의 cDNA 서열의 뉴클레오티드 35-256을 코딩한다 (도 1).
C. ES 세포 스크리닝
PGES2-KO 클론 #5 표적화 벡터를 NotI으로 선형화하고, DBA/1LacJ ES 세포 내로 일렉트로포레이트하였다 [Roach 등, Exp.Cell.Res. 221:520-25, 1995]. 15% ES 세포 정성 태아 소 혈청 (ILTI, #10439-024), 0.1mM 2-메르캅토에탄올(시그마 케미칼, #M-7522), 0.2mM L-글루타민 (ILTI, #25030-081), 0.1mM MEM 비-필수 아미노산 (ILTI, #11140-050), 1000유닛/ml 재조합 생쥐 백혈병 억제 인자 (케미콘 인터내셔날 인코포레이티드(Chemicon International Inc.), 미국 캘리포니아주 테메쿨라, #ESG-1107) 및 페니실린/스트렙토마이신(ILTI, #15140-122)가 보충된 녹아웃 DMEM (인비트로겐 라이프 테크놀로지스 인코포레이티드(Invitrogen Life Technologies, Inc.) (ILTI), 미국 캘리포니아주 칼스배스, #10829-018)로 구성된 줄기 세포 배지(SCML)에서, 1차 배아 섬유아세포(PEF) 피더 층으로 처리된 미토마이신 C(미국 미조리주 세인트 루이스의 시그마 케미칼) 상에서 배양액 중에 분화다능 ES 세포를 유지하였다.
240V의 전압, 50μF의 전기용량 및 360 Ohms의 저항에서 BTX 일렉트로 세포 조작장치 600 (BTX 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 샌디에고)를 사용하여, SCML 및 25㎍ 선형 표적화 벡터 내에서 1×107세포의 에렉트로포레이션을 수행하였다. 200㎍/ml G418 (ILTI, #11811-031) 및 2μM 간시클로비르 (신텍스, 미국 캘리포니아주 팔로 알토)를 함유하는 SCML 중에서 에렉트로포레이션 후 24시간에 포지티브/네가티브 선택을 시작하였다. 8 내지 12일의 선택 후에 마이크로피펫을 사용하여 내성 콜로니를 골라내었다. Mohn 및 Koller의 문헌[Mohn, DNA Cloning 4 (ed. Hames), 143-184, Oxford University Press, New York 1995]에 기재된 바와 같이 내성 ES 세포 콜로니의 팽창 및 스크리닝을 수행하였다.
G418 및 간시클로비르 선택을 견디고 생존한 79개 ES 세포 클론으로부터 DNA를 단리하고, Nhe I 및 Eco RV 제한 효소로 소화시켰다. 소화물을 0.7% 아가로스 겔 (바이오위태커 몰레큘라 어플리케이션(BioWhittaker Molecular Applications), 미국 메인주 로크랜드)상에서 전기영동하고, 사우던 분석을 위해 하이본드(Hybond) N+ (아머샴 파마시아 바이오테크, 영국 버킹햄셔) 나일론 막으로 전달하였다. 3' 측 위에서 동종 재조합을 스크리닝하기 위한 프로브로서, 1.1kb Kpn I/Nhe I 게놈 단편, 8.8kb 3' 상동성 팔의 3'를 사용하였다. 네오마이신 카세트에 도입된 Eco RV 때문에, 1.1kb 프로브는 표적화 대립유전자에 대하여 12.5kb 내인성 Nhe I 단편 및 11.0kb 단편을 인식한다. 스크리닝된 79개 클론으로부터, 1.1kb 3'프로브 (클론 #22, #70, #78 및 #84)를 가진 4개의 표적화 클론을 동정하였다. 1.0kb 5' 상동성 팔의 5'인 400 bp Not I/Bgl II 단편을 사용하여 4개의 클론에 대해 5' 측 위에서 재조합을 확인하였다. 이러한 400bp 프로브는, 네오마이신 카세트와 함께 도입된 새로운 Eco RV 부위 때문에, 표적화 대립유전자에 대하여 12.0kb 내인성 Spe I/Eco RV 단편 및 3.5kb 단편을 인식한다.
D. 녹아웃 마우스 생성 및 유전자형 결정
표적화 클론 #22 및 #70으로부터의 ES 세포를 C57BL/6J 암컷로부터 단리된 포배 단계 배아 내로 미세주입하였다 (더 잭슨 래보러토리(The Jackson Laboratoy, 미국 메인주 바 하버).
양쪽 클론들에 대해 수컷 키메라를 동정하고, 생식계 PGES2 이형접합성(+/-) 자손(offspring)을 생성하기 위해 DBA/1lacJ 암컷 (더 잭슨 래보러토리)에 역-교배시켰다. 네오-833F (5' gcaggatctcctgtcatctcacc 3') (SEQ ID NO:1) 및 네오-1023R (5' gatgctcttcgtccagatcatcc 3') (SEQ ID NO:2)의 프라이머 세트를 사용하여 네오마이신 유전자의 존재에 대해 PCR에 의해 이형접합 동물을 유전자형 결정하였다. 이러한 프라이머 세트는 PGES2 표적화 대립유전자로부터 190 bp 단편을 증폭시킨다.
관찰되어진 정상적인 멘델비를 사용하여 이형접합성 결합 (이형접합성×이형접합성)으로부터 동형접합성 PGES 녹아웃 생쥐(PGES2 KO)를 생성하였다. 이형접합성 결합으로부터의 동물을 2개의 올리고 세트(하나의 세트는 표적화 대립유전자(Neo PCR)에 대해 특이적이고, 다른 세트는 (녹아웃 영역 내에서)PGES2 대립 유전자에 대해 특이적이다)를 사용하여 PCR에 의해 유전자형 결정하였다. Neo PCR은 이형접합체 선별을 위해 사용되는 것과 동일한 프라이머 세트를 사용한다. PGES2 PCR에 대한 올리고는 PGES2KO-409F (5' tcccaggtgttgggatttagacg 3') (SEQ ID NO:3) 및 PGES2KO-821R (5' taggtggctgtactgtttgttgc 3') (SEQ ID NO:4)이었다. 이러한 올리고는 412bp 단편을 증폭시키고, 3.0kb 녹아웃 영역 내에 함유된다.
따라서, 유전자형을 결정함에 있어서, 야생형 동물은 PGES2 PCR에 대해 포지티브이고, 네오 PCR에 대해 네가티브이다. PGES2 이형접합성 동물은 양쪽 PCR 반응에 대해 포지티브이고, PGES2 KO 동물은 PGES2 PCR에 대해 네가티브이고(양쪽 대립유전자에 영역이 존재하지 않기 때문에), 네오 PCR에 대해 포지티브이다 (도 2).
수컷 및 암컷 야생형 및 PGES2 KO의 초기 조직병리학 (각각의 성별 및 유전자형에 대해 n=1)은 검출가능한 차이를 나타내지 않았다. PGES2 KO 생쥐 및 야생형 생쥐의 수정 사이에도 검출가능한 차이가 존재하지 않았다.
E. PGES2/ApoE 이중 KO 생쥐
PGES2 KO 생쥐를 ApoE 녹아웃 생쥐에 교배시킴으로써 PGES2/ApoE 이중 KO 생쥐를 생성하였다 (C57/B16 배경, 찰스 리버 래보러토리즈). PGES2+/- / ApoE-/- 및 PGES2-/- / ApoE -/- 생쥐가 생성되었다.
F. PGES2 KO ES 세포
DBA/1 LacJ 세포주[Roach 등, Exp.Cell Res. 221:520-525, 1995]로부터 유래된 DBA-252 생쥐 ES 세포주를 사용하였다. 15% ES 세포 정성 태아 소 혈청 (ILTI, #10439-024), 0.1mM 2-메르캅토에탄올(시그마 케미칼, #M-7522), 0.2mM L-글루타민 (ILTI, #25030-081), 0.1mM MEM 비-필수 아미노산 (ILTI, #11140-050), 1000유닛/ml 재조합 생쥐 백혈병 억제 인자 및 50㎍/ml의 겐타마이신 (ILTI, #15710-064)가 보충된, 기본 배지 녹아웃 D-MEM (ILTI, #10829-018)을 함유하는 줄기 세포 배지(SCML)에서, 1차 배아 섬유아세포(PEF) 피더 층으로 처리된 미토마이신 C 상에서 배양액 중에 분화다능 ES 세포를 유지하였다.
실시예 B에 언급된 바와 같이, 260V의 전압, 50μF의 전기용량 및 360 Ohms의 저항에서 BTX 일렉트로 세포 조작장치 600 (BTX 인코포레이티드)를 사용하여, 400㎕ SCML 및 25㎍ 선형 PGES2 KO 표적화 벡터 내에서 1×107DBA-252 ES 세포의 일렉트로포레이션을 수행하였다. 일렉트로포레이션 후에, 세포를 미토마이신 C 처리된 PEFs 상에서 4개의 100mm 조직 배양 접시에서 SCML에 평판도말하였다. 일렉트로포레이션 후 24시간 째에, SCML에 175 ㎍/ml G418 및 2μM 간시클로비르를 첨가함으로써 포지티브/네가티브 선택을 개시하였다. ES 세포 게놈 내에 표적화 벡터를 동종 재조합하면, 마우스 PGES2 유전자가 결실되고 네오마이신 내성 유전자가 삽입되었다. G418 선택 7 내지 9일 후에, G418 내성 콜로니를 인발 마이크로피펫으로 뽑아내어 24-웰 조직 배양 접시의 각각의 웰로 옮기고, 클론 ES 세포주로 확장시켰다. 동종 재조합에 의해 유전자 표적화를 나타내는 형질전환 ES 세포주를 사우던 분석에 의해 동정하였다.
PGES KO (-/-) ES 세포를 생성하기 위하여 PGES2 표적화(+/-) ES 세포 클론 #22 및 #70을 사용하였다. 클론을 해동시키고, SCML중에 175 ㎍/ml G418에서 PEFs 상에 2일간 유지시킨 다음, G418 농도를 2 mg/ml로 증가시켰다 [Mortensen 등, Mol.Cell.Biol. 12:2391-95, 1992]. 높은 G418 선택에서 7 내지 10일 후에, 생존한 ES 세포 콜로니를 해리시키고, 2 - 5×105세포/ml를 SCML 중의 2mg/ml G418에서 새로운 PEFs 상에 평판도말하였다. 높은 G418 선택후 추가로 4-7일 후에, 인발 마이크로피펫으로 내성 콜로니를 뽑아내고, SCML중의 2mg/ml G418에서 PEFs를 갖지 않은 24-웰 조직 배양 접시의 각각의 웰에 옮겼다. 야생형 대립유전자의 손실을 나타내는 PGES2 KO(-/-) ES 세포주를 사우던 분석에 의해 동정하였다.
G. PGES2 KO ES 세포-유래 마크로파지
ES 세포 시험관내 분화(IVD) 마크로파지를 발생시키기 위하여 DBA-252 WT (+/+) 및 PGES KO (-/-) ES 세포 클론 #22D, #22F 및 #70V를 사용하였다. SCML중에서 PEF 피더 없이 WT 및 KO PGES2 ES 세포 클론을 유지시켰다. 배상체(EB) 형성에 앞서 2일 전에, 15% ES 세포 정성 태아 소 혈청, 0.2mM L-글루타민, 0.1mM MEM 비-필수 아미노산, 1000 단위/ml 재조합 생쥐 백혈병 억제 인자, 50㎍/ml 겐타마이신 및 0.1mM 2-메르캅토에탄올(시그마 #M-7522)로 보충된 아이스코브의 MDM(ILTI, #31980-030)의 기본 배지를 함유하는 I-SCML 배지로 모든 ES 세포주를 옮겼다.
배상체 단계: WT 및 KO ES 세포 클론을 해리시키고, 15% ES 세포 정성 태아 소 혈청, 2mM L-글루타민, 300㎍ 트랜스페린 (ILTI, #13008-016), 50 ㎍/ml L-아스코르브산(시그마 케미칼, #A-4403), 5% PFHM-II (ILTI, #12040-093), 4×10-4M 모노티오글리세롤(MTG) 및 50 ㎍/ml 겐타마이신으로 보충된 아이스코브의 MDM의 기본 배지를 함유하는 MacEB 배지에서 세균학 100mm 접시 내에서 현탁 배양으로 배양시켰다. 현탁액 중에서 ES 세포를 6일간 생육시켜 EB 세포 응집물을 형성하였다.
전구체 마크로파지 단계: EB를 6일째에 해리시키고, 10% FBS (ILTI, #10439-024), 5% PFHM-II (ILTI, #12040-093), 2mM L-글루타민, 3ng/ml M-CSF (시그마,#M-9170), 1ng/ml IL-3 (페프로 테크 인코포레이티드(Pepro Tech, Inc.), 미국 뉴저지주 로키힐, #213-13) 및 50㎍/ml 겐타마이신으로 보충된 아이스코브 MDM의 기본배지를 함유하는 MacI 배지에서 조직 배양 접시에 평판도말하였다. 이러한 세포 집단이 합쳐질 때, 마크로파지 전구체가 비-부착성 덩어리로서 발생되었으며, 14일 내지 30일에 걸쳐 하루씩 걸러 수집할 수 있다.
ES 세포-유래 마크로파지: 마크로파지 전구체의 비-부착성 덩어리를 원심분리에 의해 배지로부터 수집하였다. 10% FBS, 5% PFHM-II, 2mM L-글루타민, 3ng/ml M-CSF 및 50㎍/ml 겐타마이신으로 보충된 기본 배지 아이스코브 MDM을 함유하는 MacII 배지에 세포 펠릿을 재현탁시켰다. 세포를 조직 배양 접시 또는 멀티-웰 접시 위에 평판도말하고, 특징결정에 앞서 1 내지 5일 동안 배양하였다.
PGES2 KO ES 세포-유래 마크로파지에서 야생형 표현형의 구제: PGES2 KO ES 세포 클론 #22F로부터 유래된 ES 세포 IVD 마크로파지는 DBA-252 WT 및 PGES2 +/- 클론 #22 ES 세포-유래 마크로파지에 비하여 생존성 및 성장 특징의 감소를 나타내는 것으로 관찰되었다. 표현형이 PGES2 생성 손실의 결과인지를 결정하기 위하여, PGE2 (사이맨 케미칼스 #14010)을 0.1, 1.0 또는 10 μM의 투여량으로 모든 분화 단계에서 배지에 첨가하였다.
PGE2 없이 배양된 PGES2 KO 클론 #22F로부터의 마크로파지는 야생형의 대략 절반의 밀도를 가졌다. 0.1 또는 1.0μM PGE2에서 배양된 PGES2 KO 클론 #22F로부터의 마크로파지는 야생형과 밀도가 균등하였으며, 10.0μM PGE2에서 배양된 PGES2 KO 클론 22F로부터의 마크로파지는 야생형의 약 75%의 밀도를 가졌다.
H. PGES2 KO ES 세포-유래 마크로파지의 특징결정
분화 14일 내지 21일에, PGES2 KO, PGES2 이형접합체 및 야생형 ES 세포로부터 유래된 ES 세포 IVD 마크로파지(ESMs)를 MacII (실시예 G 참조) 배지에서 5 ×105세포/웰 (96 웰 플레이트)로 평판도말하였다. 세포를 37℃ (5% CO2, 95% 습도)에서 밤새 생육시킨 다음, 다양한 조건하에서 자극시켰다: 1) 지시된 농도의 지질다당류(LPS)의 존재하에서 24시간동안 ESMs를 배양하였다 (포스페이트 완충염수(PBS)중에서 1mg/ml 원액의 LPS (이.콜리 0111:B4, 시그마 케미칼)를 세포 배지중에 희석하여 0.001 내지 100 ㎍/ml 범위의 원하는 최종 농도를 얻었다); 2) ESMs를 100 μM 아라키돈산(AA) (카이맨 케미칼 컴퍼니, 미국 미시간주 앤 알버)와 함께 10분간 배양하였다 (최종 농도를 달성하기 위해 세포 배지에 희석된 100% 에탄올 중의 10mM AA의 원액) (도 4); 3) 칼슘 이오노포어 A23187(칼바이오켐, 미국 캘리포니아주 샌디에고)과 함께 ESMs를 10분간 배양하였다 (100% DMSO 중의 10μM) (도 5); 및 4) 세포 배지 중에 10㎍/ml LPS의 존재하에 ESMs를 24시간동안 배양한 다음 세포 배지중에 100 μM AA와 함께 10분간 배양하였다 (도 6).
각각의 배양 기간이 끝났을 때, 세포 상층액을 단리하고, PGE2에 대해 분석할 때까지 -20℃에서 보관하였다. ELISA 검출 키트(카이맨 케미칼)를 사용하여 PGE2 측정을 수행하였다. 표준 곡선의 동적 범위 내에서 신호를 얻기 위하여 모든 샘플을 희석하였다. 도 3 내지 도 6에 나타낸 데이타는 3개의 독립적인 실험을 나타낸 것이고, 각 실험은 중복 수행되었다.
도 3에 나타낸 것과 같이, 결과는 PGES2가 염증 조건 (예를들어 LPS 자극)하에서 세포외 PGE2 방출의 원인이 되는 중심 PGE2 합성효소임을 증명한다. 그러나, 도 4, 도 5 및 도 6에 나타낸 것과 같이, 결과는 PGES2 유전자의 붕괴가 더욱 급성의 자극 조건 (예를들어, 아라키돈산 또는 칼슘 이오노포어(A23187) 자극)하에서 ESM이 PGE2를 방출하는 것을 막지 않는다는 것을 나타낸다. 이러한 결과들은, PGES2가 염증 동안에 PGE2의 생성을 위해 중요한 유전자임을 나타낸다.
I. 염증 모델에서 PGES2 KO의 특징결정
2개의 염증 실험 모델인, 콜라겐-유발 관절염 (만성 염증 모델) 및 아세트산-유발 라이딩 (급성 염증/통증 모델)에서 PGES2 KO 생쥐를 평가하였다. DBA1/lacJ 유전자 배경 위에서 번식된 연령/성별-조화 동물을 사용하여 모든 실험을 수행하였다. 이러한 유전자 배경은 콜라겐-유발 관절염(CIA)을 위해 가장 바람직하다. 항체 생성 및 지연형 과민 반응의 평가에 의해 PGES2 KO 및 야생형 동물의 면역 반응을 특징화함으로써, CIA에서의 표현형을 더욱 평가하였다. 요약하면, CIA 및 아세트산-유발 라이딩 모델의 결과는, 신경병적 통증 검출과는 반대로, PGE2-매개 만성 염증, 급성 염증 및 급성 염증성 통증 검출에 있어서 PGES2의 역할을 나타낸다.
콜라겐-유발 관절염
0일에서, 콜라겐 및 하기 시약: 아세트산(빙초산) (시그마 케미칼, #33,882-6), 병아리 유형 II 콜라겐 (콘드렉스(Chondrex), 미국 워싱턴주 레이몬드, #20001-1), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) H37RA (벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson), 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스, #231,141) 및 프로이드 불완전 아쥬반트 (시그마 케미칼, #F-5506)을 사용하여 제조된 완전 프로이드 아쥬반트의 용액을 사용하여 생쥐를 면역화시켰다. 용액이 슬러쉬로 될 때까지 0.1M 아세트산을 -80℃ 냉각기에 10분동안 위치시켰다. 이어서, 이러한 아세트산 용액의 분취량(5ml)을 10mg 병아리 콜라겐 바이알(2mg/ml)에 첨가한 다음, 호일로 싸고 4℃에서 밤새 진동시키면서 유지시켰다. 이어서, 20ml의 프로이드 불완전 아쥬반트를 유리 티슈 분쇄기(50ml)에 놓고, 40mg의 엠.투베르쿨로시스 (20mg/ml)를 첨가하고, 균일한 현탁액이 관찰될 때까지 혼합하였다 (즉, 완전 프로이드 아쥬반트). 동일 부피의 각각의 용액을 약 15분 동안 혼합이 어려울 때까지 혼합하였다. 이어서, 모든 생쥐를 꼬리의 바닥에서 면도하였다. 0일 및 20일에 꼬리의 바닥에서 각각의 동물에 0.1ml를 피하 주사하였다.
20일에 두번째 면역화를 수행하였다. 25일째에, 생쥐가 첫번째 관절염 신호를 발현하기 시작하였다 (적색의 부풀은 관절). 50일 째에, 평균 관절염 스코어가 최대에 이르렀다. 도 7 내지 도 10에 나타낸 것과 같이, 관절염의 발병 및 중증도가 PGES2 KO 생쥐에서 약화되었다. 야생형 대조는, 56일째에 단지 1.1±0.4의 스코어에 이르르는 PGES2 KO 동물에 비하여, 5.5±0.7의 관절염 스코어를 가진 최대의 중증도에 이르렀다(도 7 및 도 9). PGES2 KO 군에서 발병이 상당히 경감되었다 (도 8 및 10). 또한, 조직학적 시험은, 야생형에 비하여, 콜라겐-처리된 PGES2 KO 관절의 표면에서 프로테오글리칸 손실이 없음을 나타내었다.
관절염 차이가 PGES2 KO 동물에서의 부족한 항체 생성의 결과인지를 결정하기 위하여, 마우스 IgG 유형 II 콜라겐 항체 ELISA 키트 (콘드렉스, 미국 워싱턴주 레드몬드, #2031), 염소 항-생쥐 IgG-HRP (사우던 바이오테크, 미국 알라바마주 버밍햄, #1031-05), 염소 항-생쥐 IgG1-HRP (사우던 바이오테크 #1070-05), 염소 항-생쥐 IgG2a-HRP (사우던 바이오테크, #1080-05) 및 염소 항-생쥐 IgG2b-HRP (사우던 바이오테크, #1090-05)를 사용하여, ELISA에 의해 유형 II 콜라겐(항원)에 대한 항체 수준을 결정하였다.
두번째 단계 이외에는, 키트에 제공된 지시를 따랐다. 동결건조된 항-IgG 항체를 사용하는 것 대신에, 두번째 희석 완충액 (콘드렉스 키트의 용액 C) 중에 희석된 HRP-공액 아이소타입-특이적 항체를 사용하였다.
야생형 및 PGES2 KO 동물 양쪽 모두, 유형 II 콜라겐에 대하여 상당한 수준의 IgG1, IgG2a 및 전체 IgG 항체를 생성하였다. 2개의 유전형으로부터의 생쥐들 사이에서 항체 생성에 검출가능한 차이가 존재하지 않았으며, 이것은 관절염의 차이가 특정한 항원에 대한 면역 반응을 나타내는 PGES2 KO 동물의 무능력에 기인하지 않음을 시사하는 것이다.
야생형 및 PGES2 KO 생쥐 사이의 관절염의 중증도 및 발병율 차이의 기초가 되는 메카니즘을 결정하기 위하여, 유사한 콜라겐 면역 프로토콜을 받은 동물에서 지연형 과민(DTH) 반응을 유발하였다. 0일 째에 생쥐의 꼬리의 바닥에서 주사하였다. 17일 째에, 10㎍ (15㎕)의 콜라겐을 오른쪽 발의 배면 부위에 주사하였다. 대조로서 각각의 동물의 왼쪽 발을 사용하고, 동일한 부위에 15㎕의 염수를 주사하였다. 18일 째에, 플레티스모미터를 사용하여 발 두께를 결정하였다. 야생형 생쥐는 대측 염수-처리된 발에 비하여 콜라겐-처리된 발에서 상당한 팽윤을 나타내었다. 조직병리학적 분석에 의해 결정시에, 부종이 백혈구의 침윤과 연관되었다. PGES2 KO 생쥐로부터 콜라겐-처리된 발에서의 부종 형성은, 야생형 또는 PGES2 KO 동물로부터의 염수-처리된 발의 부종 형성과 유사하였다 (도 11). 이러한 결손은 주사 부위를 침습하는 백혈구의 수가 상당히 감소되는 것과 동시에 일어났고, 이것은 염증에서 PGES2의 역할과 일치한다.
또한, 호중구, 림프구, 단핵구, 호염기구 및 호산구 계수에 대하여 PGES2 KO 및 야생형 생쥐로부터 단리된 혈액을 분석하였다. 건강한 동물과 병에 걸린 동물 사이에서 검출가능한 차이가 관찰되지 않았으며, 이것은 전체 면역학적 결함이 CIA 모델에서 관찰되는 PGES2 KO 표현형을 유발하지 않았음을 나타낸다.
아세트산-유발 라이딩
생쥐를 무작위추출하고, 비히클(0.5% w/w 메틸셀룰로스, 시그마 케미칼, #M0512) 또는 10mg/kg 피록시캄 (시그마 케미칼, #P5654)를 경구 투여하였다. 1시간 후에, 16㎕/체중g의 0.7% 아세트산을 복강내 투여하였다. 생쥐를 5-구획 상자에 넣고, 아세트산 주입 후 20분동안 신장 횟수를 세었다.
PGES2 KO 생쥐는 야생형 생쥐에 비하여 감소된 통증 반응을 나타내었다 (도 12). 피록시캄으로의 처리는 야생형 생쥐에서 반응을 감소시켰으나, PGES2 KO 생쥐에 대해서는 효과가 없었다.
염증성 프로스타글란딘 6-케토 PGF1α (PG12의 안정한 대사물질) 및 PGE2의 생체내 수준을 특징화하였다. 아세트산 용액의 주입은 기준선 수준 위로 양쪽 프로스타글란딘의 상당한 상승을 유발하였다. 처리와 무관하게, 어느 유전형에서도 6-케토 PGF1α 수준에서의 검출가능한 차이가 기록되지 않았다. 반대로, PGE2 수준은 야생형 동물에 비하여 PGES2 KO 군에서 52% 감소되었으며, 이것은 PGES2 KO 동물에서 관찰되는 경감된 라이딩 반응과 일치한다.
척추 또는 척추상방 수준에서의 반응과 같은 통증 반응을 변조시키는 PGES2 억제/붕괴 능력을 더욱 특징화하기 위하여, 핫플레이트 분석으로 PGES2 KO 및 야생형 동물에서 회수 잠복시간을 측정하였다. 52.5, 55.5 또는 58.5℃에서 반응의 차이가 측정되지 않았다.
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<120> DISRUPTION OF THE PROSTAGLANDIN E SYNTHASE 2 GENE
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taggtggctg tactgtttgt tgc 23
Claims (10)
- 변형에 의해 PGES2 유전자가 붕괴되어진, 유전자-변형된 비-인간 포유동물.
- 제1항에 있어서, 상기 포유동물이 생쥐인 포유동물.
- 제1항에 있어서, 상기 포유동물이 붕괴된 ApoE 유전자를 더욱 포함하는 것인 포유동물.
- 변형이 붕괴된 PGES2 유전자를 포함하는 것인, 유전자-변형된 동물 세포.
- 제4항에 있어서, 상기 세포가 배아 줄기(ES) 세포 또는 ES-유사 세포인 동물 세포.
- 제4항에 있어서, 상기 세포가 ES 세포-유래 마크로파지인 동물 세포.
- 제4항에 있어서, 상기 세포가 붕괴된 PGES2 유전자를 일으키는 변형을 함유하는 유전자-변형된 비-인간 포유동물로부터 단리된 것인 동물 세포.
- 제4항에 있어서, PGE2로 보충된 배양 배지에서 상기 세포가 사용되는 것인동물 세포.
- 프로스타글란딘 E 합성효소 2를 억제하는 약제를 투여하는 것을 포함하는, 염증-매개 질병의 치료 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 약제가 관절 염증을 감소시키고, 백혈구 침윤을 감소시키고, 관절 표면에서 프로테오글리칸 손실을 감소시키고(시키거나) 염증 통증 검출을 감소시키기에 충분한 양으로 투여되는 방법.
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