CN1492879A - tau蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对在构象上不同于正常tau且不与正常tau蛋白结合的异常截短形式的tau蛋白具有特异性的抗体、在构象上不同的tau蛋白(“tauons”)和与阿尔茨海默病和相关tauo病(tauopathies)有关的诊断和治疗方面。

Description

tau蛋白
本发明涉及阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)和其它tauo病(tauopathies)。
阿尔茨海默病(AD)是最常见的慢性神经变性疾病，其在临床上的特征在于进行性和不可逆的认知和行为功能丧失。这种疾病可能持续10年以上，从轻度症状开始到极其严重的表现。AD危害了约10％的65岁以上人群和20％的80岁以上人群。随着西方社会的不断增长，患病人数正在上升：仅在美国就已经有500万患者，且截至到2000年年底，世界上大约有1800万人患痴呆。在他们中，认为有大约三分之二的病例、即1200万人将成为阿尔茨海默病。它是心脏病、癌症和中风之后的西方世界中的第四大杀手。患痴呆的人的数量正在快速增加。到2025年，在发达国家患痴呆的人的数量将会为1980年的2倍。护理这些患者的社会成本是巨大的。例如，据估计美国社会用于诊断和控制AD、主要是用于监护的成本目前每年在800亿美元。目前，既没有AD症状发生前的诊断试验、也不能治愈AD。因此，在临床上是在症状发生而基本上排除其它形式的痴呆后才能诊断该病。巴伐利亚精神病学家Alois Alzheimer在93年前的1907年观察到的AD大脑中的传统指征老年(神经炎)斑和神经原纤维缠结(NFT)的累积仍然保留为AD的神经病理学特征。
胞内神经原纤维结构(神经原纤维缠结、营养不良性轴突和神经纤维网丝)的常见共同特征在于成对螺旋纤丝(PHFs)。PHFs的主要蛋白亚单位是异常高磷酸化形式的微管结合蛋白tau(Grundke-Iqbal等，1986；Wischik等，1988 a，b)。带有神经原纤维改变的神经元变性，且这种变性的程度直接与受侵害个体的痴呆程度有关(Blessed等，1968)。
正常tau是主要分布至轴突的微管结合蛋白。tau蛋白参与调节神经元且可能是神经胶质细胞体中的微管(MT)装配、空间结构和特性(Drewes等，1998；Drubin和Kirschner，1986；LoPresti等，1995)。tau蛋白由位于第17染色体上的单一基因编码，且在来自成人大脑的组织提取物中以多同种型(isoform)被检测到(Goedert等，1989；Himmler A.，1989；Kos ik等，1989)。tau蛋白的异质性部分是由于可选剪接所导致的，从而在成人大脑中产生6个同种型。这些不同的同种型的区别在于在氨基末端区上存在或不存在29-或58-氨基酸插入片段，以及在称作微管结合结构域的tau羧基末端区上添加或缺失了衔接重复(可以重复3或4次)。该区由不完全重复的31或32个氨基酸残基组成。在人体中，最小的tau同种型在MT结合结构域上含有带有三个衔接重复的352个氨基酸残基且不含氨基末端插入片段，而最长同种型含有441个残基，带4个重复片段和两氨基末端插入片段。为简便起见，在本专利申请中所有的编号均指的是含有Goedert等(1989)的全部插入片段(441个氨基酸长)的最长人tau蛋白同种型htau40。
已知许多神经疾病带有含微管结合蛋白tau的丝状细胞包涵体，这些神经疾病例如有：阿尔茨海默病(AD)、进行性核上麻痹(PSP)、皮质基底(corticobasal)的变性(CBD)、皮克病(Pick’sdisease)(PiD)和共同称作带有与第17染色体相关的帕金森综合征的额颞痴呆的一组相关疾病(FTDP-17)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob disease)(CJD)、拳击性痴呆(dementia pugilistica)(DP)、格-施-沙病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)(GSSD)、雷维小体病和亨廷顿舞蹈病(Huntington disease)(Dickinson等，1998；DiFiglia等，1997；Forno，1986；Hirano和Zimmerman，1962；Nishimura等，1995；Prusiner 1996；Reed等，1998；Roberts，1998；Schmidt等，1996；Shankar等，1989；Spillantini等，1998)。尽管这些疾病中包含的病因学、临床症状、病理学发现和生化组成不同，但是出现的证据提示涉及正常细胞蛋白聚集成各种丝状包涵体的机制相差无几。认为启动生成用于纤丝装配的核心或种子的微管结合蛋白tau的最初构象改变是关键特征。该过程可以受到正常蛋白质的翻译后修饰、某些基因的突变或缺失和结合正常蛋白质且由此改变其构象的因素的影响。tau蛋白是极为亲水性的。可以易于从大脑组织或培养细胞中提取它。比较而言，提取自阿尔茨海默病态大脑组织的丝状tau是相对不溶性的。不溶性和正常可溶性的tau在翻译后修饰的程度不同，除磷酸化外，还包括糖基化、糖化、遍在蛋白化和外消旋化(Kenessey等，1995；Ko等，1999；Mori等，1987；Wang等，1996；Yan等，1994)。
尚不了解修饰tau蛋白以参与AD中纤丝形成的机制。tau是已知的最可溶性蛋白之一(Cleveland 1977 a，b；Lee等1988)，且由此AD中它的聚集特别令人费解。tau的磷酸化影响了tau形成聚集物的可能性，从而产生了刺激或抑制作用，推断这取决于磷酸化位点(Crowther等，1994；Schneider等，1999)。许多体外研究证明在有还原剂二硫苏糖醇(DTT)、不饱和游离脂肪酸类、RNA或糖胺聚糖类存在的情况下，正常tau可以被转化成纤丝(Goedert等，1996；Kampers等，1996；Perez等，1996；Wilson和Binder，1997)。此外，通过Cys322上氧化生成的交联tau的存在也可以加速纤丝形成过程(Schweers等，1995)。不同纤丝装配研究中不同的参数已经包括了tau蛋白浓度、pH，而温育的离子强度高于生理条件下存在于胞质中的离子强度许多倍。扫描透射电镜(STEM)对体外形成的tau纤丝进行的检验显示这些纤丝不同于天然成对螺旋纤丝(Ksiezak-Reding，1998)。在没有聚糖或RNA存在的情况下，在含有未磷酸化或磷酸化野生型tau、正常tau的样品中没有可检测到的PHF-样纤丝。对化学交联的肝素处理的tau的研究表明肝素处理诱导tau蛋白中的构象改变(Paudel和Li，1999)。与体外数据共同提示：(a)微管结合结构域对tau纤丝装配而言是重要的；和(b)tau纤丝的形成要求tau的构象改变。这些研究同时表明所述的tau修饰中没有一种能够单独诱导与阿尔茨海默病的临床表现相关的丝状tau形成。对引起导致疾病情况中纤丝形成的tau改变而言重要的因素的确定和描述对开发症状发生前的诊断标记和干预tauo病进展的治疗剂而言是重要的。
因此本发明的一个目的是提供用于阿尔茨海默病或其它tauo病中的早期治疗干预的可靠药物靶物。此外，希望提供能够特异性检测该药物靶物并与之发生相互作用的特异性单克隆抗体。这种抗体不仅应适合于在症状发生前检测所述分子、而且也应适合于抑制和消除该分子，由此适合于阿尔茨海默病或其它tauo病的症状发生前的诊断、治疗和预防。
使用本发明实现了这些目的，而本发明在一个方面中涉及对构象上不同于正常tau的tau蛋白的异常形式具有特异性的抗体，所述的抗体对正常tau蛋白而言是非特异性的。这类tau蛋白的异常形式代表一族新的分子，它们是在构象上不同于正常tau的tau蛋白的位于神经元内和神经元外的可溶和不溶性的、优选异常截短的形式(Novak等，1991，1993)。使用本发明可以证实这些构象不同形式的在本说明书中称作″tauons″的tau蛋白是种子、即与阿尔茨海默病临床表现相关的丝状tau形成的自我繁殖过程中的成核中心，由此tauons是阿尔茨海默病的重要治疗靶物。本发明的tauons可以是异常截短的tau蛋白。使用本发明的抗体可以在体外和神经元内抑制tauons的生物活性。这些抗体具有在AD症状发生前的I、II和III期中对存在的tauons进行染色的能力，从而使它们适合于该病的症状发生前的诊断。对本发明的抗体而言，关键是仅不同构象形式的tau蛋白(即″tauon″)由这种抗体识别，而正常的tau蛋白不与本发明的抗体结合。
在本发明的过程中，将微管结合蛋白tau的AD截短形式纯化至同质且证实是来自阿尔茨海默病态神经元的丝状tau分离物的主要部分。氨基酸序列数据显示tauons的主链与蛋白质tau的主链没有区别，而tauons在免疫学上区别于正常人tau的方面可能在于本发明构象特异性单克隆抗体所揭示的不同构象。这类抗体的具体实例是由保藏在欧洲细胞培养物保藏所(ECACC)、保藏号为00082216的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体DC-11和保藏在ECACC、保藏号为00082215的杂交瘤细胞系DC-11/I产生的单克隆抗体DC-11/I。由本发明提供的该族单克隆抗体通过识别tauon-特定构象而不识别正常人可溶性tau来确定。与正常人tau相比不同的构象在病理学上是由迄今为止来自阿尔茨海默病患者测试样品中tau分子N-末端或C-末端或两末端上的异常截短所导致的。令人关注的是不同构象与tau同种型和磷酸化水平无关。这种使tauons获得典型构象的不可缺少的病理学要求是存在大量脯氨酸和微管结合结构域和截短侧翼区。此外，tauons区别于正常tau的方面可能在于其病理活性，即tauons代表启动tau聚集和由正常tau和微管蛋白装配的tauons解装配微管的种子、即成核中心。与本发明抗体、尤其是DC-11族单克隆抗体一起预保温的tauons没有表现出解装配的能力或由正常tau和微管蛋白装配微管。此外，tauons在对分化的人神经元微注射时明显导致由微管结合的tau部分取代内源性tau、神经元收缩并使细胞变性。如果将tauons与本发明的单克隆抗体一起微注射，那么在分化的神经元中没有观察到神经变性改变。这一结果表明本发明的抗体、尤其是DC-11单克隆抗体抑制神经元内tauons活性，且由此可以用作胞内药物(例如用作胞内治疗抗体、即内体(intrabodies))。在免疫组织学方面，正如使用本发明抗体所观察到的，tauons已经在AD的transenthorinal和enthorinal区中的前-α-神经元内的症状发生前I、II和III期出现，因此，在适当偶联示踪物后，可以将本发明的抗体用于活体的AD症状发生前的诊断。
优选本发明的抗体与抗体DC-11相比表现出对tau的构象不同形式(″tauon″)至少50％、优选至少90％的特异性。可以通过任意用于检测抗体特异性的标准试验检测特异性，例如ELISA试验、放射性免疫测定、使用悬臂连接的结合配偶体的原子力显微术等。
一般来说，与构象不同的tau蛋白、尤其是其异常截短形式发生特异性反应而不与正常可溶性tau反应的所有抗体也包括在本发明的范围内。
优选地，认为本发明的抗体与分子发生″特异性反应″，条件是它能够与分子结合而由此使该分子与所述抗体偶联。术语″表位″指的是可以由抗体识别和结合的抗原部分。抗原可以带有一个或一个以上的表位。″抗原″能够诱导动物产生能够结合该抗原表位的抗体。上述所指的特异性反应指的是该抗原可以以高度选择性方式与其相应的抗体发生免疫反应，而不与由其它抗原产生的众多其它抗体发生免疫反应。
本发明特别优选的抗体来源于保藏的杂交瘤细胞系DC-11(ECACC保藏号00082216)和DC-11/I(ECACC保藏号00082215)，它们表现出高度特异性和选择性，且与tau的构象不同形式(″tauon″)反应而不与正常的可溶性tau反应。可以通过任意用于检测抗体特异性的标准试验检测特异性，例如ELISA试验、放射性免疫测定等。
本文所用的″抗体″用以指包括完整分子及其片段及其合成和生物衍生物，诸如：例如不含Fab、F(ab’)2和Fv片段，游离或例如在pIII或pVIII或其它表面蛋白上的丝状噬菌体表面或细菌表面上表达，其能够结合抗原。Fab、F(ab’)2和Fv片段缺乏完整抗体的Fc片段、从循环中更为快速地清除，且可以具有较低的非特异性抗体组织结合能力。此外，易于改造Fv抗体(通常称作小抗体(minibody))以在其C-末端上携带特异性示踪物，并用于AD的活体早期症状发生前诊断，这是因为由本发明抗体识别的AD的I、II和III期与智力下降无关。
在本发明中，优选单克隆抗体或单克隆抗体片段。因此，本发明在另一个方面中还涉及产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞系。
本申请中所用的术语″tau″指的是如M.Goedert等1989所述的含有全部可选的剪接插入片段的人微管结合蛋白tau的最长同种型。
按照本申请的另一个方面，本发明涉及属于tau蛋白的构象不同形式的tau蛋白的异常截短形式，所述的tau蛋白的构象不同形式可由本发明的抗体特异性识别。
因此，本发明涉及一族新的位于神经元内和神经元外的可溶和不溶性异常截短形式的tau蛋白，它们在构象上不同于正常的tau且称作″tauons″。
″tauons″由此是可以由本发明所述抗体特异性识别的tau蛋白的构象不同形式。用于本发明的tauons包括SEQ ID No.1的序列，且可以进一步侧翼接有其它氨基酸(参见SEQ ID No.2、3)。tauons适宜在约100-400个氨基酸范围内，且在该范围内代表tau蛋白的截短形式。本发明的tauons可以在N-或C-末端或两末端被异常截短(参见附图2-13)。本文所用的术语″异常截短的″指的是用本发明提供的tauon特异性单克隆抗体在患病的AD神经元中鉴定的tau肽(″tauons″)。
可以通过使用许多任意众所周知的合成重组技术来制备人tau蛋白的异常截短形式tauons。简单地说，在本领域中广泛实施了用于转化细胞、构建载体、提取信使RNA、制备cDNA文库的大部分技术，且大部分本领域技术人员熟知描述具体条件和步骤的标准来源资料。然而，为方便起见，将下面的段落用作指导原则。
用于产生重组蛋白质的最常用原核生物系统为大肠杆菌(E.coli)，然而，也可以使用其它微生物菌株，诸如：芽孢杆菌属(Bacilli)，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；假单胞菌属(Pseudomonas)的不同种类；或其它细菌菌株。在这类原核系统中，使用了含有来源于与宿主相容的种类的复制位点和控制序列的质粒载体。常用的原核控制序列包括用于转录起始的启动子，可选的操纵子以及核糖体结合位点序列。
目前各种真核宿主也用于产生重组外源蛋白质。当在细菌中时，可以用直接产生所需蛋白的表达系统转化真核宿主，但更常见的情况是提供信号序列来实现蛋白质的分泌。真核系统具有另外的优点，即它们能够加工可以在编码高级生物体蛋白质的基因组序列中出现的内含子。真核系统还提供了各种加工机制，这些机制例如使某些氨基酸残基糖基化、氧化或发生衍生作用、构象控制等。
常用的真核系统包括酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、鸟类细胞和高级植物细胞。所列实例并未穷尽。合适的启动子是可得到的，它们对用于这些宿主类型中的每一种而言是相容性和可操作的，且是终止序列和增强子，诸如：例如杆状病毒多角体启动子。如上所述，启动子可以是组成型的或诱导型的。例如，在哺乳动物系统中，可以通过添加重金属离子来诱导MTII启动子。
用于构建适合于所需宿主的表达系统的具体实例对本领域技术人员而言是公知的。为了所述蛋白质的重组生产，将编码它的DNA适当连入所选择的表达系统，然后将该系统转入相容的宿主细胞，随后在发生外源基因表达的条件下培养和维持该细胞。通过裂解该细胞或从培养基中回收这种方式产生的本发明tauons，这是本领域技术人员所公知的。
可以通过首先用连接混合物转化适宜的宿主来证实用于质粒构建的正确连接。正如本领域中可理解的，用氨苄青霉素、四环素或其它抗生素抗性或使用其它标记来筛选成功的转化体，这取决于质粒的构建方式。
本发明由此涉及tauons制品、尤其是基本上不含其它蛋白的来自人或重组来源的tauons制品、尤其是来自正常tau蛋白的tauons制品。可以通过一定方法来提供这类制品，所述的方法包括使用本发明抗体进行免疫亲和的步骤。优选本发明的制品在总蛋白中含有80％以上的tauons、尤其是95％以上的tauons。
此外，本发明还涉及用于检测阿尔茨海默病脑组织样品或体液样品中构象上不同于正常tau的tau蛋白的异常截短形式tauons的试剂盒，该试剂盒包括本发明的抗体和用于装载所述探针的适宜容器。能够在试剂盒中提供所述抗体以用于检测或分离tauons。借助于本发明抗体可以检测tauon蛋白，并从包括transenthorinal、enthorinal区和海马的阿尔茨海默病态神经元在内的各种来源中分离它。可以将按照这种方式分离的tauons进一步用作例如对小鼠进行免疫接种的免疫原，以便构建产生针对tauons而不识别正常全长tau的特异性单克隆抗体的杂交瘤。该方法包括下列步骤：鉴定来自阿尔茨海默病态脑组织transenthorinal、enthorinal和海马区的神经元并使其释放入防止tauons异常构象的溶液中。
在制备和纯化后，将tauons用作免疫原，每隔一个月经皮下注入小鼠。将来自这些动物的脾脏用于构建产生针对tauons的单克隆抗体的杂交瘤。使用首先由Khler和Milstein介绍的充分建立的杂交瘤技术生产这些杂交瘤(参见M.Khler和C.Milstein，“分泌预定特异性抗体的融合细胞的连续培养”(″Continuous Culturesof Fused Cells Secreting Antibody of Pre-DefinedSpecificity″)，《自然》(Nature)，256，pp.495-497，1975)。在足够长时间的免疫接种后，从动物的脾脏、淋巴结或外周血液中得到产生抗体的淋巴细胞。优选这些淋巴细胞获自脾脏。然后通常在有诸如聚乙二醇(PEG)这样的融合剂存在的情况下使脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合。按照标准技术可以将任意数量的骨髓瘤细胞系用作融合配偶体；例如P3-NS 1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653骨髓瘤细胞系。随后使包含所需杂交瘤的所得细胞生长在诸如HAT培养基这样的选择培养基中，其中未融合的亲本骨髓瘤或淋巴细胞最终死亡。仅杂交瘤细胞存活，且可以在限制条件下生长至得到分离的克隆。例如，通过使用已经用于免疫接种的抗原的免疫测定技术筛选杂交瘤上清液中存在的具有所需特异性的抗体。然后在有限稀释条件下或在软琼脂上亚克隆阳性克隆，且可以分离产生的单克隆抗体。可以使用本领域中所公知的技术使按照这些方法生产的杂交瘤在体外或体内增殖(腹水中)。用于纯化(purfying)单克隆抗体的常用方法包括硫酸铵沉淀、离子交换、层析法和亲和层析法(例如，参见H.Zola等，“用于单克隆抗体产生和性质鉴定的技术”(″Techniques forthe Production and Characterization of MonoclonalAntibodies″)-《单克隆杂交瘤抗体：技术与应用》(MonoclonalHybridoma Antibodies：Techniques and Applications)，J.G.R.Hurell(编辑)，pp.51-52(CRC Press 1982))。
优选本发明的试剂盒进一步含有用于检测所述抗体与所述构象不同的tau蛋白之间结合情况的工具。优选次级抗体、尤其是特异性标记的次级抗体。此外，在本发明范围内可以使用磁珠技术以及应用抗体的其它蛋白质鉴定方法。该方法包括在来自人的测试样品中鉴定异常截短的tau蛋白tauon的步骤。本文所用的″测试样品″指的是来自怀疑含有tauons的人的生物样品。测试样品可以包括含异常截短的tau蛋白的脑组织，诸如海马组织或额皮质组织；或所述的测试样品可以包括脑脊液(CSF)。在一个优选的实施方案中，所述的测试样品包括CSF，且所鉴定的蛋白是CSF-tauon。异常截短的tau蛋白tauons的鉴定适宜包括鉴定测试样品中的抗原的步骤，该抗原能够结合与异常截短的tau蛋白tauons发生特异性反应的抗体，其中所述的tauons包含序列(SEQ ID No.1)，且侧翼接有氨基酸以使得所述的tauons的长度在约100-400个氨基酸的范围，且特征在于不同于正常可溶性蛋白tau的tauon的特异构象；或该抗原能够结合与异常截短的tau蛋白tauons发生特异性反应的抗体，其中所述的tauons包含序列(SEQ ID No.1)，且侧翼接有氨基酸以使得所述的tauons的长度在约100-400个氨基酸的范围，且特征在于不同于正常可溶性蛋白tau的tauon特异构象。tauon的存在表明与AD患者和其它患tauo病(tauopathies)的患者体内tauons的累积有关的疾病。
本发明的另一个方面涉及患者体液中构象上不同于正常tau的tau蛋白的异常截短形式的检测方法，该方法包括下列步骤：将所述体液与本发明的抗体混合、检测所述抗体与构象不同的tau蛋白(tauon)之间存在的结合情况，且可选地测定与所述抗体结合的构象不同的tau蛋白的量。tauon的存在表明包括AD和其它tauo病(tauopathies)在内的疾病的人体内tauons的累积有关的疾病。患者的体液可以是来自怀疑含有tauons的人的任意生物测试样品。这种体液可以包括脑组织，诸如海马组织或额组织或皮质组织或脑脊液(CSF)。在一个优选的实施方案中，所述的体液包括CSF且所鉴定的蛋白质是CSF-tauons。
正如本领域中可以理解的，可以通过生化或细胞化学方法或通过诸如许多免疫测定生产商的手册中所述的酶免疫测定法便利地完成这种对tauons的鉴定。当使用生化方法时，优选使用0.01-10g、尤其是0.5-1g的含有患病tau蛋白的组织；使其在凝胶上迁移并通过Western印记来鉴定。认为这类技术确实适于在没有已经证实不与本发明抗体反应的年龄匹配的对照组的情况下进行。细胞化学方法染色已经证实与正常组织无反应性。
通过ELISA检测来自患AD的患者和患非-AD神经性疾病以及正常受试者的CSF以便对tauons的水平进行定量。与患非AD神经性疾病的患者和对照组相比，AD患者体内的CSF tauon水平显著增加。在AD中，发现这种显著增加与发作的年龄、载脂蛋白E基因型和临床阶段无关。对AD CSF蛋白的Western印记显示了几种具有与异常截短的tau蛋白一致的50-15kD的表观分子量免疫反应带。这些结果表明CSF-tauons反映出由AD进展导致的患病tau渐进累积。
本发明的抗体在另一个方面中可以用于制备治疗阿尔茨海默病患者的药物。可以将该抗体以生物技术方式修饰成装配有靶向序列的单链分子，其能够将所述的分子转运入表达tauons的成神经细胞瘤细胞。在本AD细胞模型内，抗体结合tauons并干扰其病理作用(正常tau的结合)，且增加tau蛋白的异常截短形式的降解。使用异常截短的tau蛋白及其与阿尔茨海默病严重程度的相关性进行的体外试验(tau蛋白结合、纤丝装配、微管解装配)证实它们是重要的药物靶物。
通过下列实施例和附图来更具体地描述本发明，但它们不应用来限制本发明。
附图1表示tauon制备的概述；附图2表示tauon氨基酸序列的总示意图；附图3表示最小tauon；附图4表示C-末端截短的tauon；附图5表示N-末端截短的tauon；附图6表示tau的示意图；附图7表示人tau 37；附图8表示人tau 39；附图9表示人tau 40；附图10表示人tau 43；附图11表示人tau 44；附图12表示人tau 46；且附图13表示大鼠的大tau。
                        实施例
实施例1
对tauons具有特异性的DC11族单克隆抗体的制备
作为免疫接种用抗原的可溶性和不溶性tauons的制备(附图1)
为了从人AD大脑中分离tauons，部分基于Kopke等(1993)以及Greenberg和Davies(1990)所述的方法开发了一种新方法。选择表现出具有短期死后延缓(post mortem delay)(PMD)的AD I.-III.Braak’s阶段改变特征的人大脑。选择包括enthorinal和transenthorinal区、扁桃体和海马区的颞叶块。解剖该组织并立即浸入最低必需培养基(Gibco)中。将组织精细切碎并压过150μm目网筛。在该阶段将大脑样品分成两个等分部分：样品A和样品B。
将样品A进一步在20mM pH8的TRIS、0.32M蔗糖、10mMβ-巯基乙醇、5mM EGTA、1mM EDTA、5mM MgSO4、5mM苄脒、10mM甘油磷酸、6mM苯甲基磺酰氟、50mM氟化钠、5μg/ml亮抑酶肽、1.5μg/ml胃酶抑制剂和2μg/ml抑酶肽中处理并在4℃下以25000xg离35分钟以除去细胞碎片。然后以200000xg40分钟使上清液沉淀。在室温下将所得沉淀用8M脲萃取70分钟并在室温下以300000xg旋转45分钟。将上清液对频繁更换的pH7.6的10mMTRIS透析24小时且然后对100mM MES、0.5mM MgCl2、1mMEDTA、2mM EGTA、1mM二硫苏糖醇、0.75mM NaCl、0.1mM苯甲基磺酰氟和50mM NaF、pH2.7透析24小时。通过以200 000xg离心40分钟而除去沉淀的蛋白质。将200 000xg上清液对pH6.4的25mM MES、0.5mM MgCl2、0.1mM EDTA和1mM二硫苏糖醇透析、且随后在用相同缓冲液平衡的磷酸纤维素柱上进行分级分离。使2mg/ml的蛋白质上柱并用20ml线性梯度的NaCl(0-1M)的平衡缓冲液溶液洗脱。通过Western印迹评价用0.1-0.8M NaCl洗脱的蛋白质，并通过真空离心蒸发浓缩(speed vacuum)设备浓缩。
将样品B放入玻璃匀化器内10个体积的冷缓冲液(10mM TRIS，1mM EGTA，0.8M NaCl，10％蔗糖，pH7.4)中。在4℃下以27000xg离心30分钟后，保留上清液并将沉淀与所述缓冲液一起匀化，且以27000xg离心30分钟。合并来自两次离心的27000xg上清液、调节至1％(wt/vol)N-月桂酰基肌氨酸和1％(vol/vol)β-巯基乙醇，并在37℃下的摇动器上保温3小时。在以35000rpm离心30分钟后，将沉淀在补充了1％巯基乙醇的5ml匀化缓冲液中匀化并通过0.45μm滤膜过滤。将滤液以35000rpm离心1小时。将沉淀重新悬浮于pH6.8的50mM Tris中，并用2.5％甲酸萃取2分钟，且然后以10000xg离10分钟以沉淀不溶性物质。在4℃下将上清液对pH7.4的10mM Tris透析过夜，并如上所述进行离心。使用真空离心蒸发浓缩设备浓缩所得上清液(级分II)，并通过SDS-PAGE、随后通过Western印迹评价。保留来自用2.5％甲酸萃取后含有不溶性tauons(级分III)的样品B的沉淀并用于免疫接种和斑点试验。合并级分(I、II和III)中的Tauons，并用作对小鼠进行免疫接种的抗原(参见附图1)。
产生DC-11族单克隆抗体的杂交瘤的制备
将6周龄Balb/c小鼠分成3组(A，B，C)。使前2组(A，B)接触溶于弗氏完全佐剂(Sigma)的50μg抗原，且间隔3周加强接种5次溶于弗氏不完全佐剂的50μg相同抗原(Ag)。在A组中，将所有剂量注入足垫，在B组中经皮下给予Ag的剂量。对第3组小鼠仅将溶于PBS中的一个剂量直接注入脾(脾内免疫接种)，并在该接触抗原后的1周将脾用于融合。融合前3天时经静脉内对A组和B组中的小鼠注射50μg溶于PBS的免疫原。按照Kontsekova等1988的方法使来自免疫接种小鼠的脾细胞与NS/O骨髓瘤细胞融合。将108个脾细胞与2×107个NS/O骨髓瘤细胞混合(比例5∶1)，并在补充了10％二甲亚砜的不含血清的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)内的1ml50％PEG 1550(Serva)中融合1分钟。将融合的细胞以2.5×105个脾细胞/孔的密度重新悬浮于96-孔平板上的DMEM中，该DMEM含有20％马血清、L-谷氨酰胺(2mM)、次黄嘌呤(0.1mM)、氨基蝶呤(0.004mM)、胸苷(0.016mM)和艮他霉素(40U/ml)。将细胞在37℃下保温10天，并通过ELISA和免疫组织化学筛选用于产生抗-tauon特异性单克隆抗体的生长的杂交瘤。
通过ELISA进行抗tauons抗体筛选
将ELISA用于检测针对tauons的杂交瘤培养物上清液中的单克隆抗体。使用如上所述制备且具有下列改变的tauons作为固相。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳从级分中分离真空离心蒸发浓缩的合并物，并通过按照Donofrio等(1986)的方法经电洗脱回收tau蛋白的截短形式，且通过SDS-PAGE评价。在4℃下用异常截短的tau蛋白PBS溶液将微量滴定板包被过夜(10μg/ml，50μl/孔)。在用1％脱脂奶粉封闭以减少非特异性结合后，将该平板用PBS-0.05％ Tween 20洗涤，并在37℃下与50μl/孔的培养物上清液一起保温1小时。用与辣根过氧化物酶(DAKO)缀合的绵羊抗小鼠Ig检测结合的单克隆抗体。用邻苯二胺溶液作为过氧化物酶底物使反应显色，并用50μl 2M H2SO4终止该反应。使用Multiscan MCC/340 ELISA读出器(Labsystems)测定492nm处的吸收度。将至少两倍于阴性对照值的读取值看作是阳性的。
按照Kontsekova等1991的步骤在软琼脂上进一步亚克隆阳性培养物。重新筛选用于产生特异性抗-tauon单克隆抗体的分离的亚克隆。
抗tauon抗体的免疫组织化学筛选
如下在AD大脑组织上重新筛选在抗-tauon ELISA中鉴定为阳性而对正常tau鉴定为阴性的单克隆抗体的特异性：
在冠状板上将尸解时取出的AD患者的大脑切成1cm间隔的切片并储存在-20℃下。将海马、enthorinal、颞、额、枕和顶叶皮层块固定在4℃的4％缓冲低聚甲醛中4天以上。在振动切片机上切一系列额切片(50μm)并储存在4℃下的PBS(pH7.0)中。用98％冷甲酸将自由移动的振动切片机切片预处理2-3分钟、与PBS/Triton X 100中的免疫前血清一起保温。所用的血清与第二抗体来自相同动物种类。在37℃下将切片与ELISA(如上所述)中阳性的单克隆抗体一起保温60分钟。
在室温下与第二生物素化抗体(Vectastain Elite试剂盒，Vector)保温1小时。使用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(Vectastain Elite试剂盒，Vector)和6mg 3-3-二氨基联苯胺-4HCl(SIGMA)、250mg NiCl2(MERCK)的含100μl H2O2的10ml 0.1M乙酸盐缓冲液(pH6)使免疫反应显色。通过在PBS/Triton中洗涤切片终止反应(Kiss等，1988；Cuello等，1993，Thorpe和Kerr，1994)。
实施例2
使用DC-11族单克隆抗体对异常截短的tau蛋白(tauons)进行的定量测定
如上所述分离tauons。单克隆抗体DC 30(识别正常和病理性tau)与DC-11族单克隆抗体(对异常截短的tau具有特异性)的组合对由AD-大脑制备的测试样品中的tauons进行量化。通过蛋白质A柱层析法从不含血清的培养基中纯化抗体。在4℃下用浓度为10μg/ml(50μl/孔)的DC-11单克隆抗体混合物的PBS溶液将高结合微量滴定板(Nunc)的孔包被过夜。通过加入200μl 1％的脱脂奶粉的磷酸缓冲盐水(PBS)在室温下60分钟而将孔中的非特异性结合饱和。将该平板用PBS-0.05％Tween 20(v/v)洗3次。加入含浓度为100-1000pg/ml的重组tauons的PBS液的连续稀释的标准品和含有50μl用量的AD-tauons测试样品。在37℃下保温60分钟后，洗涤平板，并加入在PBS中1/5000稀释的辣根过氧化物酶缀合的抗体DC30(50μl/孔)、在37℃下持续60分钟。在最终的洗涤后，向各孔中加入50μl的邻苯二胺溶液和0.003％H2O2，并将平板在黑暗中保温20分钟。用50μl的2M H2SO4使反应终止。用ELISA读出器Multiscan MC344(Labsystems，Finland)上读取492nm处的吸收度。
根据获得的数值构建重组tauons的标准曲线，并根据标准曲线确定测试样品中tauons的相应浓度。
实施例3
通过Western印迹、使用单克隆抗体DC-11检测tauons。
使纯化的重组全长tau和异常截短的tau蛋白tauons上样5-20％梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶，并使其在Laemmli(1970)的变性条件下迁移。SDS-PAGE后，在pH12的10mM CAPS缓冲液中，将转移到聚氟乙烯膜(Milipore)上的步骤在350mA、冷却下进行1小时。印记后在PBS中洗涤该膜，并在室温下用1％脱脂奶粉PBS液封闭1小时。将转移的蛋白质与单克隆抗体DC-11一起在4℃下保温过夜。在用PBS-0.05％Tween 20(v/v)洗涤后，使用按1/1000稀释的用辣根过氧化物酶标记的大鼠抗小鼠免疫球蛋白并在室温下保温1小时。然后将该膜在PBS-Tween 20中洗涤4次、用底物溶液(12mg 4-氯-1-萘酚(naphtol)、4ml甲醇、16ml PB、0.03％v/v H2O2)使反应显色，并在H2O中终止该反应。结果表明抗体DC-11仅识别异常截短的tau即tauons，相反，单克隆抗体DC 30是普遍识别所有已知来自许多种类(人、猴、牛、猪、大鼠、小鼠)的tau同种型的全tau抗体，而与其翻译后修饰的状态无关。
实施例4
tauons的免疫组织化学鉴定
DC-11族单克隆抗体适合于在不同类型免疫组织化学方法中使AD-大脑中的tauons显色。
光学显微镜标记
在冠状板上将尸解时取出的患AD患者的大脑切成1cm间隔的切片并储存在-20℃下。将海马、entorhinal、颞、额、枕和顶叶皮层块固定在4℃的4％缓冲低聚甲醛中4天以上。在振动切片机上切一系列额切片(50μm)并储存在4℃下的PBS(pH7.0)中。用98％冷甲酸将自由移动的振动切片机切片预处理2分钟、与PBS/Triton X 100中的免疫前血清一起保温。所用的血清与第二抗体来自相同动物种类。在37℃下将切片与单克隆抗体DC-11一起保温60分钟。在室温下与第二生物素化抗体(Vectastain Elite试剂盒，Vector)保温1小时。使用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(VectastainElite试剂盒，Vector)和6mg 3-3-二氨基联苯胺-4 HCl(SIGMA)、250mg NiCl2(MERCK)的含100μl H2O2的10ml 0.1M乙酸盐缓冲液(pH6)使免疫反应显色。通过在PBS/Triton中洗涤切片终止反应(Kiss等，1988；Cuello等，1993，Thorpe和Kerr，1994)。
光学显微镜双标记
用98％冷甲酸将自由移动的振动切片机切片预处理2-3分钟、与PBS/Triton X 100中的免疫前血清一起保温。所用的血清与第二抗体来自相同动物种类。在37℃下将切片与在封闭溶液(5％马血清、PBS、0.1％Triton)中按1∶1000稀释的第一种过氧化物酶缀合的单克隆抗体DC-11一起保温60分钟、在0.06％DAB、0.01％H2O2的PBS溶液(pH7.2)中展开。通过在PBS/Triton中洗涤切片终止反应。在37℃下将相同切片与第二单克隆抗体一起保温60分钟。在室温下与生物素化抗体(Vectastain Elite试剂盒，Vector)保温1小时。使用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(Vectastain Elite试剂盒，Vector)和0.06％3-3-二氨基联苯胺-4 HCl(SIGMA)、0.01％H2O2、2.5％NiCl2(MERCK)的0.1M乙酸盐缓冲液使免疫反应显色，并通过在0.1M乙酸盐缓冲液中洗涤切片终止反应(Kiss等，1988；Cuello，1993)。
使用快速甲酚紫(cresyl violet)进行的复染
在完成免疫组织化学染色后，将切片置于载玻片上并放入56℃下的恒温器中60分钟。在保温后将载玻片浸入蒸馏(destilled)水中5分钟、在4℃下用快速甲酚紫溶液染色5-10分钟、用水冲洗并转入96％乙醇，直到除去大部分甲酚紫染色、用二甲苯(xylen)净化并用Entellan固定。
免疫荧光染色
用98％冷甲酸将自由移动的振动切片机切片(30μm)预处理2分钟、与PBS/Triton X 100中的免疫前血清一起保温。在37℃下将切片与第一种初级单克隆抗体DC-11一起保温60分钟，然后在室温下与按照本领域中所用的标准方法与在PBS/Triton中按1∶500稀释的FITC-缀合的山羊抗体小鼠次级抗体(Immunotech)一起保温30分钟。在用PBS洗涤后，在37℃下将切片与TRITC-缀合的初级抗体一起保温60分钟，并固定在0.1％对苯二胺/甘油溶液中。
实施例5
使用tauons进行的微管装配和微管结合试验
微管蛋白纯化
通过温度依赖性微管聚合与解聚循环、随后通过磷酸纤维素(Watman P11磷酸纤维素)离子交换层析法(Valee，1986)从自当地屠宰厂获得的鲜猪脑中分离微管蛋白。
微管装配试验
在+4℃下将纯化的tauons(5mM)与预净化的纯化微管蛋白(10mM)和GTP(1mM)在装配缓冲液(100mM PIPES pH6.9，2mM EGTA，1mM MgSO4)中混合。该微管蛋白的浓度低于自发装配的临界浓度(Black，1987)。将样品用移液管吸入预热至37℃的石英池中。在热稳定控制的分光光度计(LKB)中以分光光度方式测定浊度的改变，并记录为10s间隔的OD350改变、持续30分钟的期限。
微管结合试验
如上所述确定含微管的tauons的结合曲线(Gustke，1992)。在37℃下，在有GTP(1mM)和紫杉醇(20μM)存在的情况下，将纯化的微管蛋白在结合缓冲液(100mM PIPES pH6.9、1mM EGTA、1mMMgSO4、1mM DTT)中保温10分钟。用分别不干扰tauons或正常tau蛋白及其它MAPs结合的紫杉醇稳定微管(Valee，1986；Wallis，1993)，由此消除微管装配的影响。加入浓度分别为2.5mM、5mM、7.5mM、10mM、15mM、20mM的Tauons。在37℃下以43000xg离心35分钟后，将沉淀重新悬浮于P缓冲液(50mM PIPES pH6.9、1mM EGTA、0.2mM MgCl2、5mM DTT、500mM NaCl)中。在SDS-PAGE凝胶上分析上清液与沉淀(Laemmli，1970)、用银染色(Bloom，1987)。在HPScanJet(Hewlett-Packard)扫描仪上扫描凝胶，并应用公共域NIH Image程序(美国国家健康研究所(U.S.NationalInstitutes of Health)研发并可在国际互连网上获得，网址http：//rsb.info.nih.gov/nih-image/)在Macintosh计算机上进行分析。使用内标法和校正曲线将带强度转化成浓度。
实施例6
重组tauons的制备
使用″Erase a Base System″(Promega)、按照技术手册制备tau蛋白的重组截短形式。该系统基于从5’突出端开始特异性消化插入DNA的外切核酸酶III。在恒温下消化率是均匀的。通过NdeI-EcoRI限制位点将tau基因克隆入pET17b载体产生pET/T40。向该基因的C-末端添加KpnI限制位点和KpnI位点的全部三个读框下游中的三个终止密码子。EcoRI酶留下5’突出端作为exoIII的底物。KpnI留下耐exoIII消化的3’突出端。将用EcoRI、KpnI/NEB双消化和乙醇沉淀的1μg pET/T40载体在20μl lxExoIII缓冲液中稀释，并在37℃/消化率450个碱基/分钟条件下用80u exoIII消化。在添加ExoIII后，就1份样品而言，间隔30s将2.5μl样品转入冰上的7.μl S1-核酸酶混合物/1.5u S1-核酸酶中。在室温下将收集的样品保温30分钟以除去剩余的单链尾。用Klenow DNA聚合酶形成钝端。直接用样品的连接混合物转化DH5α感受态细胞。通过PstI-XhoI限制性酶切筛选亚克隆，并使用pET载体中T7-引物对合适的构建体测序。
重组tauons的表达、纯化和定量
在大肠杆菌BL21(DE3)(Studier，1986)中表达Tauons。将单细菌菌落接种入500ml的LB AMP(LB培养基，100μg/ml氨苄青霉素)。使细菌培养物在37℃下的旋转摇动器上生长，直到其OD600达到0.6-0.8，然后通过添加IPTG(0.4mM终浓度)诱导。3小时后，通过在4℃下以5000g离心15分钟使细菌细胞沉淀(Sigma 6K15，转子12 500)，将细胞沉淀迅速冷冻在液氮中，且储存在-70℃下至进一步应用为止。为了制备细胞裂解物，将细菌沉淀重新悬浮于缓冲液A中：(20mM PIPES pH6.9、50mM NaCl、1mM EGTA、1mMMgSO4、2mM DTT、0.1mM PMSF)，通过在冰上超声处理6分钟使细胞破碎，并通过在+2℃下以45000rpm离心15分钟而除去细胞碎片(转子TLA-120.2，Beckmann Optima TLX)。通过0.22μm滤膜(Millipore)过滤上清液，并立即在磷酸纤维素柱(磷酸纤维素Whatman P 11)上通过离子交换层析纯化tauons。在使样品上柱后，用10个床体积的缓冲液A洗涤该柱。用20ml线性梯度的NaCl(50mM-0.5M)缓冲液A洗脱Tauons。收集1ml级分，并在SDS-PAGE上鉴定含有蛋白质的那些级分。合并含有tauons的级分，并在4℃下对PBS透析3×60分钟。将来自透析液的等分部分真空干燥(SpeedVac)并储存在-20℃下。通过PAGE、使用连续稀释的牛血清白蛋白(BSA)作为质量标准标记对重组tauons进行定量。用考马斯蓝染色凝胶、干燥并使用Scion Image(Beta 3b，Scion Corp.)计算BSA和tau带的强度。构建BSA的校正曲线并用于对tauons定量。
实施例7
从人AD-大脑中分离tauons
为了从人AD大脑中分离tauons，部分基于Kopke等(1993)以及Greenberg和Davies(1990)所述的方法开发了一种新的方法。选择表现出具有短期死后延缓(PMD)的AD I.-III.Braak’s阶段改变特征的人大脑。选择包括enthorinal和transenthorinal区、扁桃体和海马区的颞叶块。解剖该组织并立即浸入最低必需培养基中(Gibco)。将组织精细切碎并压过150μm目网筛。在该阶段将大脑样品分成两个等分部分：样品A和样品B。
将样品A进一步在20mM pH8的TRIS、0.32M蔗糖、10mMβ-巯基乙醇、5mM EGTA、1mM EDTA、5mM MgSO4、5mM苄脒、10mM甘油磷酸、6mM苯甲基磺酰氟、50mM氟化钠、5μg/ml亮抑酶肽、1.5μg/ml胃酶抑制剂和2μg/ml抑酶肽中处理并在4℃下以25000xg离心35分钟以除去细胞碎片。然后以200000xg 40分钟使上清液沉淀。在室温下将所得沉淀用8M脲萃取70分钟并在室温下以300000xg旋转45分钟。将上清液对频繁更换的pH7.6的10mMTRIS透析24小时，且然后对100mM MES、0.5mM MgCl2、1mMEDTA、2mM EGTA、1mM二硫苏糖醇、0.75mM NaCl、0.1mM苯甲基磺酰氟和50mM NaF、pH2.7透析24小时。通过以200 000xg离心40分钟而除去沉淀的蛋白质。将200000xg上清液对pH6.4的25mM MES、0.5mM MgCl2、0.1mM EDTA和1mM二硫苏糖醇透析，且随后在用相同缓冲液平衡的磷酸纤维素柱上进行分级分离。使2mg/ml的蛋白质上柱并用线性梯度的NaCl(0-1M)的平衡缓冲液溶液洗脱。通过Western印迹评价用0.1-0.8M NaCl洗脱的蛋白质，并通过真空离心蒸发浓缩设备浓缩。
将样品B放入玻璃匀化器内10个体积的冷缓冲液(10mM TRIS，1mM EGTA，0.8M NaCl，10％蔗糖，pH7.4)中。在4℃下以27000xg离心30分钟后，保留上清液，并将沉淀与所述缓冲液一起匀化，且以27000xg离心30分钟。合并来自两次27 000xg离心的上清液、调节至1％(wt/vol)N-月桂酰基肌氨酸和1％(vol/vol)β-巯基乙醇，并在37℃下的摇动器上振动保温3小时。在以35000rpm离心30分钟后，将沉淀在补充了1％巯基乙醇的5ml匀化缓冲液中匀化并通过0.45μm滤膜过滤。将滤液以35 000rpm离心1小时。将沉淀重新悬浮于pH6.8的50mM Tris中，并用2.5％甲酸萃取2分钟，然后以10 000xg离心10分钟以沉淀不溶性物质。将上清液对pH7.4的10mM Tris在4℃下透析过夜，并如上所述进行离心。使用真空离心蒸发浓缩设备浓缩所得上清液，并通过SDS-PAGE、随后通过Western印迹评价。
实施例8
从人、猪和牛大脑组织中纯化正常tau
通过对Lindwall和Cole.，1984方法进行修改的方法纯化tau。将大脑组织(1mg/ml)在0.1mM MES、0.5mM MgCl2、1mM EGTA、1M NaCl pH6.5中匀化，并在4℃下以100000xg离心90分钟。将上清液制成0.5％(v/v)2-巯基乙醇溶液、在100℃下加热5分钟并在4℃下以20 000xg离心30分钟。将该第二次的上清液制成45％的(NH4)2SO4饱和溶液，且如上所述以20 000xg离心，并将所得沉淀重新悬浮于不含NaCl的MES缓冲液中。在用2.5％(v/v)高氯酸沉淀并进一步以20 000xg离心后，将最终的上清液对pH7.4的5mM Tris 4℃透析过夜。
实施例9
由tauons逐渐导致的正常tau结合和聚集成纤丝缠结
将量逐渐增加的正常tau(5-100μg/100ul)与固定量的分离自级分I的(10μg/100ul)tauons混合。使该反应在100ml终体积的结合缓冲液(含有2mM EGTA、2％牛血清白蛋白、0.5mM MgCl2、1μM抑酶肽和20μM亮抑酶肽的pH7.6的100mM MES)中进行。在室温下使该混合物发生相互作用45分钟，然后置于150μl 80％蔗糖结合缓冲液溶液，以100 000xg离心1小时。除去上部的150μl，并对剩余部分超声处理以便通过放射性免疫-斑点-印记测定法测定tauons与正常tau之间的相互作用。蔗糖层中存在tau表明tauon结合了健康的tau。
实施例10
DC-11族单克隆抗体抑制神经元变性
将神经元母细胞瘤细胞和生长因子一式三份置于培养皿上。第一组仅接受tauons，而第二组接受tauons和DC-11单克隆抗体的混合物。
用免疫荧光检测转染的tauons
在室温下将细胞在含有80mM PIPES、1mM MgCl2、1mM EGTA，pH6.6的0.2％Triton X 100中透化5分钟。在相同缓冲液中用2％低聚甲醛将细胞冰上固定15分钟。通过间接免疫荧光抗生物素蛋白罗丹明检测系统(Sigma)检测Tauons。
神经元分化早期抑制的检测
使细胞与分化诱导因子一起生长。评价分化水平。带有tauons而不含抗体的该组细胞具有的分化能力显著下降。然而，用tauons和抗体混合物处理的组分化至与来自用无关蛋白处理的对照组的细胞相差无几的水平。
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序列表
<110>AXON Neuroscience Forschungs-und Entwicklungs Gmb
<120>Tau蛋白
<130>R 36957
<140>
<141>
<160>10
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>101
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>1
Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu
  1               5                 10                  15
Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys
             20                  25                  30
Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys
         35                  40                  45
Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val
     50                  55                  60
Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg
 65                  70                  75                  80
Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys
                 85                  90                 95
Ser Pro Val Val Ser
            100
<210>2
<211>400
<212>PRT
<213>人类
<400>2
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
  1               5                  10                  15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
             20                  25                  30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
         35                  40                  45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
     50                  55                  60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val
65                   70                  75                  80
Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu
                 85                  90                  95
Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro
            100                 105                 110
Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val
        115                 120                 125
Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly
    130                 135                 140
Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro
145                 150                 155                 160
Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro
                165                 170                 175
Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly
            180                 185                 190
Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser
        195                 200                 205
Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys
    210                 215                 220
Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys
225                 230                 235                 240
Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val
                245                 250                 255
Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly
            260                 265                 270
Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln
        275                 280                 285
Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly
    290                 295                 300
Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser
305                 310                 315                 320
Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln
                325                 330                 335
Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser
            340                 345                 350
Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn
        355                 360                 365
Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala
    370                 375                 380
Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser
385                 390                 395                 400
<210>3
<211>142
<212>PRT
<213>人类
<400>3
Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu
  1               5                  10                  15
Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys
             20                  25                  30
Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys
         35                  40                  45
Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val
     50                  55                  60
Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg
 65                  70                  75                  80
Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys
                 85                  90                  95
Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val
            100                 105                 110
Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr
        115                 120                 125
Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
    130                 135                 140
<210>4
<211>381
<212>PRT
<213>人类
<400>4
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
  1               5                  10                  15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
             20                  25                  30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
         35                  40                  45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
     50                  55                  60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly
 65                  70                  75                  80
Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala
                 85                  90                  95
Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys
            100                 105                 110
Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala
        115                 120                 125
Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala
    130                 135                 140
Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro
145                 150                 155                 160
Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr
                165                 170                 175
Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg
            180                 185                 190
Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser
        195                 200                 205
Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu
    210                 215                 220
Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln
225                 230                 235                 240
Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser
                245                 250                 255
Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro
            260                 265                 270
Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp
        275                 280                 285
Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro
    290                 295                 300
Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu
305                 310                 315                 320
Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser
                325                 330                 335
Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser
            340                 345                 350
Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu
        355                 360                 365
Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
    370                 375                 380
<210>5
<211>410
<212>PRT
<213>人类
<400>5
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
  1               5                  10                  15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
             20                  25                  30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
         35                  40                  45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
     50                  55                  60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val
 65                  70                  75                  80
Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu
                 85                  90                  95
Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro
            100                 105                 110
Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val
        115                 120                 125
Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly
    130                 135                 140
Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro
145                 150                 155                 160
Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro
                165                 170                 175
Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly
            180                 185                 190
Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser
        195                 200                 205
Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys
    210                 215                 220
Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys
225                 230                 235                 240
Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val
                245                 250                 255
Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly
            260                 265                 270
Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr
        275                 280                 285
Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly
    290                 295                 300
Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln
305                 310                 315                 320
Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly
                325                 330                 335
Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys
            340                 345                 350
Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val
        355                 360                 365
Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly
    370                 375                 380
Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu
385                 390                 395                 400
Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
                405                 410
<210>6
<211>441
<212>PRT
<213>人类
<400>6
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
  1               5                  10                  15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
             20                  25                  30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
         35                  40                  45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
     50                  55                  60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val
 65                  70                  75                  80
Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu
                 85                  90                  95
Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro
            100                 105                 110
Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val
        115                 120                 125
Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly
    130                 135                 140
Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro
145                 150                 155                 160
Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro
                165                 170                 175
Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly
            180                 185                 190
Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser
        195                 200                 205
Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys
    210                 215                 220
Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys
225                 230                 235                 240
Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val
                245                 250                 255
Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly
            260                 265                 270
Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln
        275                 280                 285
Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly
    290                 295                 300
Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser
305                 310                 315                 320
Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln
                325                 330                 335
Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser
            340                 345                 350
Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn
        355                 360                 365
Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala
    370                 375                 380
Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser
385                 390                 395                 400
Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser
                405                 410                 415
Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val
            420                 425                 430
Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
        435                 440
<210>7
<211>383
<212>PRT
<213>人类
<400>7
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
  1               5                  10                  15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
             20                  25                  30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Ala Glu Glu Ala
         35                  40                  45
Gly Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val
     50                  55                  60
Thr Gln Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp
 65                  70                  75                  80
Asp Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro
                 85                  90                  95
Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg
            100                 105                 110
Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly
        115                 120                 125
Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser
    130                 135                 140
Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro
145                 150                 155                 160
Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met
            180                 185                 190
Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu
        195                 200                 205
Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu
    210                 215                 220
Asp Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys
225                 230                 235                 240
His Val Pro Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp
                245                 250                 255
Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His
            260                 265                 270
Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe
        275                 280                 285
Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His
    290                 295                 300
Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe
305                 310                 315                 320
Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr
                325                 330                 335
Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn
            340                 345                 350
Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala
        355                 360                 365
Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
    370                 375                 380
<210>8
<211>352
<212>PRT
<213>人类
<400>8
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
  1               5                  10                  15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
             20                  25                  30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Ala Glu Glu Ala
         35                  40                  45
Gly Ile Gly Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val
     50                  55                  60
Thr Gln Ala Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp
 65                  70                  75                  80
Asp Lys Lys Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro
                 85                  90                  95
Arg Gly Ala Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg
            100                 105                 110
Ile Pro Ala Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly
        115                 120                 125
Glu Pro Pro Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser
    130                 135                 140
Pro Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro
145                 150                 155                 160
Pro Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys
                165                 170                 175
Ser Pro Ser Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met
        180                 185                 190
Pro Asp Leu Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu
        195                 200                 205
Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val
    210                 215                 220
Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His
225                 230                 235                 240
His Lys Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp
                245                 250                 255
Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr
            260                 265                 270
His Val Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr
        275                 280                 285
Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val
    290                 295                 300
Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser
305                 310                 315                 320
Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu
                325                 330                 335
Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
            340                 345                 350
<210>9
<211>412
<212>PRT
<213>人类
<400>9
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly
  1               5                  10                  15
Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His
             20                  25                  30
Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu
         35                  40                  45
Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser
     50                  55                  60
Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly
 65                  70                  75                  80
Asp Thr Pro Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala
                 85                  90                  95
Arg Met Val Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys
            100                 105                 110
Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala
        115                 120                 125
Ala Pro Pro Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala
    130                 135                 140
Lys Thr Pro Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro
145                 150                 155                 160
Lys Ser Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr
                165                 170                 175
Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg
            180                 185                 190
Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser
        195                 200                 205
Ser Ala Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu
    210                 215                 220
Lys Asn Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln
225                 230                 235                 240
Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser
                245                 250                 255
Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro
            260                 265                 270
Gly Gly Gly Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys
        275                 280                 285
Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly
    290                 295                 300
Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg
305                 310                 315                 320
Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly
                325                 330                 335
Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn
            340                 345                 350
Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro
        355                 360                 365
Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser
    370                 375                 380
Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala
385                 390                 395                 400
Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
                405                 410
<210>10
<211>686
<212>PRT
<213>大鼠
<400>10
Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Asp Thr Met Glu Asp Gln Ala Gly
  1               5                  10                  15
Asp Tyr Thr Met Leu Gln Asp Gln Glu Gly Asp Met Asp His Gly Leu
             20                  25                  30
Lys Glu Ser Pro Pro Gln Pro Pro Ala Asp Asp Gly Ser Glu Glu Pro
         35                  40                  45
Gly Ser Glu Thr Ser Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val
     50                  55                  60
Thr Ala Pro Leu Val Glu Glu Arg Ala Pro Asp Lys Gln Ala Thr Ala
 65                  70                  75                  80
Gln Ser His Thr Glu Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly
                 85                  90                  95
Ile Gly Asp Thr Pro Asn Met Glu Asp Gln Ala Ala Gly His Val Thr
            100                 105                 110
Gln Glu Pro Gln Lys Val Glu Ile Phe Ser Gln Ser Leu Leu Val Glu
        115                 120                 125
Pro Gly Arg Arg Glu Gly Gln Ala Pro Asp Ser Gly Ile Ser Asp Trp
    130                 135                 140
Thr His Gln Gln Val Pro Ser Met Ser Gly Ala Pro Leu Pro Pro Gln
145                 150                 155                 160
Gly Leu Arg Glu Ala Thr His Gln Pro Leu Gly Thr Arg Pro Glu Asp
                165                 170                 175
Val Glu Arg Ser His Pro Ala Ser Glu Leu Leu Trp Gln Glu Ser Pro
            180                 185                 190
Gln Lys Glu Ala Trp Gly Lys Asp Arg Leu Gly Ser Glu Glu Glu Val
        195                 200                 205
Asp Glu Asp Ile Thr Met Asp Glu Ser Ser Gln Glu Ser Pro Pro Ser
    210                 215                 220
Gln Ala Ser Leu Ala Pro Gly Thr Ala Thr Pro Gln Ala Arg Ser Val
225                 230                 235                 240
Ser Ala Ser Gly Val Ser Gly Glu Thr Thr Ser Ile Pro Gly Phe Pro
                245                 250                 255
Ala Glu Gly Ser Ile Pro Leu Pro Ala Asp Phe Phe Ser Lys Val Ser
            260                 265                 270
Ala Glu Thr Gln Ala Ser Pro Pro Glu Gly Pro Gly Thr Gly Pro Ser
        275                 280                 285
Glu Glu Gly His Glu Ala Ala Pro Glu Phe Thr Phe His Val Glu Ile
    290                 295                 300
Lys Ala Ser Ala Pro Lys Glu Gln Asp Leu Glu Gly Ala Thr Val Val
305                 310                 315                 320
Gly Ala Pro Ala Glu Glu Gln Lys Ala Arg Gly Pro Ser Val Gly Lys
                325                 330                 335
Gly Thr Lys Glu Ala Ser Leu Leu Glu Pro Thr Asp Lys Gln Pro Ala
            340                 345                 350
Ala Gly Leu Pro Gly Arg Pro Val Ser Arg Val Pro Gln Leu Lys Ala
        355                 360                 365
Arg Val Ala Gly Val Ser Lys Asp Arg Thr Gly Asn Asp Glu Lys Lys
    370                 375                 380
Ala Lys Gly Ala Asp Gly Lys Thr Gly Ala Lys Ile Ala Thr Pro Arg
385                 390                 395                 400
Gly Ala Ala Thr Pro Gly Gln Lys Gly Thr Ser Asn Ala Thr Arg Ile
                405                 410                 415
Pro Ala Lys Thr Thr Pro Ser Pro Lys Thr Pro Pro Gly Ser Gly Glu
            420                 425                 430
Pro Pro Lys Ser Gly Glu Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro
        435                 440                 445
Gly Thr Pro Gly Ser Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro
    450                 455                 460
Thr Arg Glu Pro Lys Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser
465                 470                 475                 480
Pro Ser Ala Ser Lys Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro
                485                 490                 495
Asp Leu Lys Asn Val Arg Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys
            500                 505                 510
His Gln Pro Gly Gly Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp
        515                 520                 525
Leu Ser Asn Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His
    530                 535                 540
Val Pro Gly Gly Gly Ser Val His Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu
545                 550                 555                 560
Ser Lys Val Thr Ser Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys
                565                 570                 575
Pro Gly Gly Gly Gln Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys
            580                 585                 590
Asp Arg Val Gln Ser Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val
        595                 600                 605
Pro Gly Gly Gly Asn Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg
    610                 615                 620
Glu Asn Ala Lys Ala Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys
625                 630                 635                 640
Ser Pro Val Val Ser Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val
                645                 650                 655
Ser Ser Thr Gly Ser Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr
            660                 665                 670
Leu Ala Asp Glu Val Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu
        675                 680                 685

Claims (12)

1.对构象上不同于正常tau的tau蛋白的异常形式具有特异性的抗体，所述的抗体对正常tau蛋白是非特异的。
2.权利要求1的抗体，该抗体来源于在ECACC中保藏的具有保藏号00082215和00082216的杂交瘤细胞系DC-11和DC-11/I。
3.权利要求1或2的抗体，该抗体与由所述在ECACC中保藏的具有保藏号00082215和00082216的杂交瘤细胞系DC-11或DC-11/I产生的抗体相比，对所述tau的构象上不同形式具有至少50％的特异性、尤其是具有至少90％的特异性。
4.权利要求1-3中任意一项的抗体，其特征在于它是合成抗体。
5.产生权利要求1-4中任意一项的抗体的杂交瘤细胞系。
6.构象上不同于正常tau的tau蛋白的异常截短形式，所述tau蛋白的构象上不同形式可由权利要求1-4中任意一项的抗体特异性识别。
7.权利要求6的tau蛋白形式，其特征在于该蛋白质与正常tau相比在N-末端或C-末端或两末端上被异常截短，且所述的tau蛋白形式至少包括正常tau蛋白质序列中的100个氨基酸-400个氨基酸。
8.用于检测或分离脑组织或体液样品中构象上不同于正常tau的tau蛋白的异常截短形式的试剂盒，该试剂盒包括权利要求1-4中任意一项的抗体和用于装载探针的适宜容器。
9.权利要求8的试剂盒，其特征在于它进一步含有用于检测所述抗体与所述构象不同的tau蛋白之间结合情况的工具，优选次级抗体、尤其是特异性标记的次级抗体。
10.权利要求8或9的试剂盒，其特征在于它进一步含有用于对所述构象不同的tau蛋白、尤其是构象不同的tau蛋白标准制品定量的工具。
11.患者脑组织或体液中构象不同于正常tau的tau蛋白的异常截短形式的检测方法，该方法包括下列步骤：将所述的体液与权利要求1-4中任意一项的抗体混合、检测所述抗体与所述构象不同的tau蛋白之间存在的结合情况，且可选地测定与所述抗体结合的构象不同的tau蛋白的量。
12.权利要求1-4中任意一项的抗体在制备用于治疗阿尔茨海默病患者的药物中的应用。
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