CN101052718A - 变异型淀粉样蛋白质 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种可作为改良疫苗疗法的抗原分子等进行使用的新型淀粉样蛋白质(人变异型淀粉样蛋白质)。该人变异型淀粉样蛋白质是由40、42或43个氨基酸构成的正常型(野生型)淀粉样蛋白质(Aβ1－40、Aβ1－42、Aβ1－43)分别缺失第22位Glu、第21位Ala或第23位Asp的蛋白质。

Description

变异型淀粉样蛋白质

技术领域

本发明涉及一种存在于家族性阿尔茨海默病患者体内的变异型淀粉样蛋白质及其利用的发明。

背景技术

淀粉样蛋白质是一种不仅存在于阿尔茨海默病、Down氏症(先天性痴呆)中，也会出现于正常老化的脑组织中的一种组织性病变。该淀粉样蛋白质由富含疏水性氨基酸的40个～42/43个氨基酸所构成，并由作为其前体的淀粉样前体蛋白质(amyloid precursor protein，以下称为“APP”)水解切断而产生的。APP为由695个、751个或770个氨基酸所构成的一次跨膜型1型膜蛋白质，其氨基酸末端在细胞外侧。氨基酸数目的不同决定了位于细胞外侧的被称为Kunitz型的蛋白质酶抑制剂活性部位的有无。

在神经细胞中，由695个氨基酸构成的APP(以下称为“APP695”，该氨基酸序列由序列号2所示)为主成分。一方面，由770个氨基酸构成的APP(以下称为“APP770”，其cDNA碱基序列及氨基酸序列由序列号3所示)含有在APP695分子类(molecular specie)中没有的氨基酸序列(序列号3中从Glu至第363位的Lys的75个氨基酸)。是除了这一段插入氨基酸序列以外，具有与APP695完全相同的氨基酸序列的分子类。除了APP695、APP770之外还有被称为APP751的同工型，它是与APP770相比不含从APP770的第345位的Met至第363位的Lys的19个氨基酸，总共由751个氨基酸所构成的。APP751和APP770共同插入的氨基酸序列(以APP770的氨基酸序列为例，从第289位的Glu至第344位的Ala的56个氨基酸)具有Kunitz型蛋白质酶抑制剂活性，并被认为在神经细胞之外的细胞中进行表达。

APP695为主要在神经细胞中表达的同工型，是具有1次跨膜结构域(从第625位的甘氨酸到第648位的亮氨酸的24个氨基酸)的1次跨膜型蛋白质。淀粉样蛋白质由从APP695(序列号2)的位于细胞外侧的第597位的天冬氨酸，到细胞膜内的第636位的缬氨酸的40个氨基酸的短蛋白质分子类、及到第638位的丙氨酸或第639位的苏氨酸的42个或43个氨基酸构成的长蛋白质分子类所构成。

对于淀粉样蛋白质的生理活性，其神经细胞毒性已经由实验所证实(非专利文献1、2)，被认为是阿尔茨海默病发病的关键分子。由淀粉样前体蛋白质产生淀粉样蛋白质必须经过2个阶段的重要反应。在第1阶段中，通过β蛋白质分泌酶(secretase)切断淀粉样前体蛋白质，使淀粉样蛋白质的氨基末端一侧被切除。在第2阶段，通过γ蛋白质分泌酶的切断作用，淀粉样蛋白质的羧基末端一侧被切断，产生游离的淀粉样蛋白质和APP的细胞质片段的脱离。虽然根据从前的了解，认为第2阶段的切断点在淀粉样蛋白质的羧基末端的伽马(γ)部位(序列号3的APP770的第711位的Val和第712位的Ile之间、第713位的Ala和第714位的Thr之间、或第714位的Thr和第715位的Val之间)处产生，但是根据最近的发现，切断点还会在从5至10个氨基酸残基的下游(羧基末端方向)的细胞质附近的艾普西隆(ε)部位(序列号3的APP770的第719位的Thr和第720位的Leu之间、或第720位的Leu和第721位的Val之间)处产生。

阿尔茨海默病的脑内神经病变，通常在丧失意识、记忆力降低、丧失记忆、判断力降低、行动异常等临床异常症状发生之前就产生了。神经病变包括淀粉样蛋白质的沉淀和神经元纤维化、细胞脱落变性等，其中淀粉样蛋白质的沉淀是其最初的病理反应。

在阿尔茨海默病的发展过程中，认为该病是由淀粉样蛋白质的产生、沉淀而引起的淀粉样蛋白质假说被公认是重要的假说，其根据是已有的家族性阿尔茨海默病的研究。

γ蛋白质分泌酶被倾向于认为是由作为早期发病性家族性阿尔茨海默病的致病基因而被发现的在14号染色体上的早老基因1(Presenilin1)(非专利文献3)和早老基因2(非专利文献4、5)表达的基因产物，但仍未进一步确认。

由于APP也是早期发病型家族性阿尔茨海默病的致病基因(非专利文献6)，显示作为阿尔茨海默病之一的痴呆症的病因与多种因素有关。

如上所述，淀粉样蛋白质含有2种结构成分。1种为从天冬氨酸开始至第40位的缬氨酸结束的短淀粉样蛋白质成分(以下记作“Aβ1-40”)、及与该40个氨基酸的构成成分相同的从天冬氨酸开始的仅长出2个残基或3个残基的氨基酸的至第42位的丙氨酸或第43位的Thr结束的42个或43个氨基酸构成的长淀粉样蛋白质成分(以下分别记作“Aβ1-42”或“Aβ1-43”，有时两者也可合并记作“Aβ1-42/43”)。在后面所述的长成分中，Aβ1-42疏水性很高更加具有难溶性。通过以该长成分作为核在其上附加短成分，形成直径约为5到6nm的纤维状的淀粉样纤维。

在早老基因1或早老基因2上存在基因变异时，显示长淀粉样蛋白质的Aβ1-42/43的产生。一般认为通过该变异效果，使被认为决定着淀粉样蛋白质聚合的阈值的长淀粉样蛋白质成分大量形成，加速致病反应。

已经确定APP上有很多基因的变异，典型的变异可大致分为在淀粉样蛋白质的氨基末端的前面的Sweden变异(Met670Asn、Lys671Leu：对应于APP770的氨基酸编号。以下，对于变异型也相同。)、Dutch变异(Glu693Gln)、London变异(Val717Ile)及Australia变异(Leu723Pro)。在Sweden变异中，2种淀粉样蛋白质成分的产生增加，London变异或Australia变异中只有Aβ1-42/43的产生增加。关于Dutch变异的意义仍在讨论之中，尚未得出结论。

脱辅基脂蛋白质E的危险因子等位基因为E4。已经在统计学上证明，只有一方的染色体等位基因为E4时，阿尔茨海默病的发病将提前8～10年，而双方的染色体等位基因为E4/E4时，阿尔茨海默病的发病将提前16～20年(非专利文献7)。

一般认为抑制β蛋白质分泌酶及γ蛋白质分泌酶的活性将抑制淀粉样蛋白质的产生，并可成为停止或延迟阿尔茨海默病的发展的治疗药物。在APP水解的第1阶段中，除了β蛋白质分泌酶以外也有α分泌酶反应，第2阶段的γ蛋白质分泌酶反应通过两者在第1阶段中共同发生可期待有更广谱的效果。

对于γ分泌酶的确定还尚未得出最终的结论，但已经证明早老基因1具有重要的作用。通过缺失该早老基因1的功能的动物实验或细胞培养的实验，证明其与脑神经发育或脊椎形成异常或淋巴球发育等异常的发生有关。也即该早老基因1除了产生淀粉样蛋白质以外还具有多种多样的作用。

必须考虑γ蛋白质分泌酶的非特异性的活性抑制可能会诱发产生癌变诱变等严重的副作用(非专利文献8)。另一方面，在流行病学中，近来暗示非甾体抗炎剂(NSAIDs：Non Steroidal Anti-Inflammatory Drugs)具有抗痴呆作用，由于已经证明其可选择性的抑制Aβ1-42/43的产生(非专利文献9、10)，其作用机制为Rho激酶(非专利文献11)，因而被逐渐作为重要的候补抗痴呆药物，但仍需要进一步研究其使用浓度等。

以合成多肽Aβ1-42作为抗原的疫苗疗法(非专利文献12)，被作为有希望的治疗方法进行研究，但被指出有引起严重脑炎的副作用(非专利文献13)。与该疫苗疗法有关的使用抗淀粉样抗体的间接疫苗疗法或间接免疫疗法(非专利文献14)备受瞩目，但在临床上仍有进一步研究的必要。对于疫苗疗法的副作用，尽管已经指出了有将Aβ4-10的氨基末端一侧作为抗原的淀粉样蛋白质的抗原部位、使诱导的抗体为IgG2b型同种型、及通过经口服给药的肠道免疫法等方法使副作用减弱的可能性，但作为改良方法尚未确定。

文献列表

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非专利文献2：Yankner，B.A.et al.，Neurotrophic andneurotoxic effects of amyloid beta protein：reversal bytachykinin neuropeptides.(1990)Science.1990 250(4978)：279-82

非专利文献3：Sherrington，R.et al.，Cloning of a genebearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer’s disease.(1995)Nature，375(6534)，754-760

非专利文献4：Levy-Lahad，E.et al.，Candidate gene for thechromosome 1 familial Alzheimer’s disease locus.(1995)Science269(5226)，973-977

非专利文献5：Rogaev，E.I.et-al.，Familial Alzheimer’sdisease in kindreds with missense mutations in a gene onchromosome 1 related to the Alzheimer’s disease type 3 gene.(1995)Nature 376(6543)，775-778

非专利文献6：Goate，A.et al.，Segregation of a missensemutation in the amyloid precursor protein gene with familialAlzheimer’s disease.(1991)Nature 349(6311)，704-6

非专利文献7：Corder，E.H.et al.，Gene dose ofapolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer’sdisease in late onset families.(1993)Sicence 261(5123)，921-3

非专利文献8：Hardy，J.and Israel，A.Alzheimer’sdisease.In search of gamma-secretase.(1999)Nature398(6727)，466-7

非专利文献9：Lim，G.P.et al.，Ibuprofen suppresses plaquepathology and inflammation in a mouse model for Alzheimer’sdisease.(2000)J Neurosci 20，5709-14

非专利文献10：Weggen，S.et al.，A subset of NSAIDs loweramiloidgenic Abeta 42 independently of cyclooxygenase activity.(2001)Nature 414；212-6

非专利文献11：Zhou，Y.et al.，Nonsteroidalanti-inflammatory drugs can lower amyloidogenic Aβ42 byinhibiting Rho.(2003)Science 302；1215-7

非专利文献12：Schenk，D.，et al.，Immunization with amyloidbattenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPPmouse.(1999)Nature.400，173-6

非专利文献13：Nicoll，J.A.R.et al.，Neuropathology ofhuman Alzheimer disease after immunization withamyloid-peptide：a case report.(2003)Nature Med.9：448-452

非专利文献14：DeMattos et al.，(2002)Science295：2264-7.；Pfeifer，M.et al.Cerebral hemorrhage after passive anti-Aβimmunotherapy.(2002)Science 298；1379-)

发明内容

本发明为鉴于如上所述的现有的技术中存在的问题而开发的，其课题为提供一种可作为改良疫苗疗法的抗原分子等的新型的淀粉样蛋白质(人变异型淀粉样蛋白质)。

另外，本发明的课题为使用上述变异型淀粉样蛋白质及编码所述蛋白质的基因材料，提供一种淀粉样相关疾病的诊断方法、及用于该目的的材料。

进一步，本发明的课题为基于上述变异型淀粉样蛋白质的产生机制，提供针对于淀粉样相关疾病的有效治疗药物成分的筛选方法。

进而，本发明的课题为提供一种利用上述变异型淀粉样蛋白质或其基因材料的抗淀粉样相关疾病药物。

综上所述，本发明提供以下发明内容以解决上述各课题。

发明的第1项内容为，由在序列号2的氨基酸序列中，具有以下氨基酸序列的氨基酸序列构成的人变异型淀粉样蛋白质：

(1)第597-636位序列中缺失第618位Glu的39个氨基酸的序列；

(2)第597-638位序列中缺失第618位Glu的41个氨基酸的序列；

(3)第597-639位序列中缺失第618位Glu的42个氨基酸的序列；

(4)第597-636位序列中缺失第617位Ala的39个氨基酸的序列；

(5)第597-638位序列中缺失第617位Ala的41个氨基酸的序列；

(6)第597-639位序列中缺失第617位Ala的42个氨基酸的序列；

(7)第597-636位序列中缺失第619位Asp的39个氨基酸的序列；

(8)第597-638位序列中缺失第619位Asp的41个氨基酸的序列；或

(9)第597-639位序列中缺失第619位Asp的42个氨基酸的序列。

也即发明第1项内容的变异型淀粉样蛋白质为由40、42或43个氨基酸构成的正常型(野生型)淀粉样蛋白质(Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ1-43)的分别缺失第22位Glu、第21位Ala或第23位Asp的蛋白质。在以下的说明中，由上述(1)至(9)的氨基酸序列构成的变异型淀粉样蛋白质分别如下所述进行记载：(1)Aβ1-40(Δ22E)、(2)Aβ1-42(Δ22E)、(3)Aβ1-43(Δ22E)、(4)Aβ1-40(Δ21A)、(5)Aβ1-42(Δ21A)、(6)Aβ1-43(Δ21A)、(7)Aβ1-40(Δ23D)、(8)Aβ1-42(Δ23D)、(9)Aβ1-43(Δ23D)。

需要说明的是，上述分别由(1)、(2)及(3)的氨基酸序列构成的变异型淀粉样蛋白质((1)Aβ1-40(Δ22E)、(2)Aβ1-42(Δ22E)、(3)Aβ1-43(Δ22E))为本发明人等从家族性阿尔茨海默病患者中分离鉴定的缺失变异型的淀粉样蛋白质。另一方面，上述分别由(4)至(9)的氨基酸序列构成的变异型淀粉样蛋白质为，通过该技术领域中众所周知的知识和方法，具有与由上述(1)至(3)的氨基酸序列构成的变异型淀粉样蛋白质相同的功能，但推测具有很高的可能性的变异型淀粉样蛋白质。也即，通过现有的蛋白质结构预测软件(例如Chou-Fasman 2^nd Structure Prediction Program：GENETXYversion 8.1.8[GENETXY Co.，Tokyo]中含有的蛋白质2级结构预测软件)分析正常型或野生型淀粉样蛋白质的结构，确认在第1～25位的氨基酸序列中，存在由在第7位的不规则卷曲结构分开的2个α螺旋，在从第30位至羧基末端存在β结构。也即正常型或野生型淀粉样蛋白质的结构为“α螺旋-α螺旋-β结构”。另外一方面，对公知的变异型淀粉样蛋白质的Dutch变异(Glu693Gln)及上述(1)～(3)的氨基酸序列构成的本发明的变异型淀粉样蛋白质Aβ1-40(Δ22E)、Aβ1-42(Δ22E)、Aβ1-43(Δ22E)进行同样的分析时，其结构为“α螺旋-β结构-β结构”。因此，本发明的变异型淀粉样蛋白质，具有其结构为“α螺旋-β结构-β结构”的特征，缺失上述第22位Glu的前后任一个氨基酸残基(Ala或Asp)的变异型淀粉样蛋白质(Δ212A或Δ23D)的结构也是“α螺旋-β片层结构-β结构”。这与缺失从第22位Glu至前后两个氨基酸(Phe及Val)的变异型淀粉样蛋白质的结构为与正常(野生型)淀粉样蛋白质相同的“α螺旋-α螺旋-β结构”这一事实有明显的不同。

需要说明的是，发明第1项内容的变异型淀粉样蛋白质中，在不丧失其特征活性(例如与野生型淀粉样蛋白质相比的低毒性或凝集性等)的范围内，还包括缺失N末端及/或C末端的1或数个氨基酸残基的蛋白质。

如上所述，发明的第1项内容的变异型淀粉样蛋白质中，包含在家族性阿尔茨海默病存在的“天然”的变异型淀粉样蛋白质Aβ1-40(Δ22E)、Aβ1-42(Δ22E)、Aβ1-43(Δ22E)、及与这些天然蛋白质具有相同功能的“非天然”的变异型淀粉样蛋白质Aβ1-40(Δ21A)、Aβ1-42(Δ21A)、Aβ1-43(Δ21A)、Aβ1-40(Δ23D)、Aβ1-42(Δ23D)及Aβ1-43(Δ23D)。需要说明的是，此时的“非天然”的含义指在目前尚未从患者身上分离鉴定的意思，以大量患者为对象进行研究时，缺失第21位Ala或第23位Asp的变异型淀粉样蛋白质为天然存在的可能性是存在的。

发明的第2项内容为上述发明的第1项内容的人变异型淀粉样蛋白质的一部分，是由含有序列号2中缺失的氨基酸残基前后的氨基酸残基的5～28个氨基酸序列构成的肽。

发明的第3项内容为，编码上述发明的第1项内容的人变异型淀粉样蛋白质的前体的变异型淀粉样前体蛋白质的人变异型淀粉样前体蛋白质基因(以下也记载为“变异APP基因”或“缺失变异型APP基因”)。

发明的第4项内容为上述发明的第3项内容的人基因的转录产物的mRNA。

发明的第5项内容为由上述发明的第4项内容的mRNA合成cDNA，是具有缺失了序列号1中的第1852-1854碱基的碱基序列的cDNA。

发明的第6项内容为上述发明的第1项内容的能特异性识别人变异型淀粉样蛋白质的抗体。

进一步，发明的第7项内容为，上述发明的第1项内容的人变异型淀粉样蛋白质的寡聚物为抗原制成的抗体，是特异识别寡聚物状的淀粉样蛋白质的抗体。

发明的第8项内容为以检测上述发明的第1项内容的人变异型淀粉样蛋白质的存在为特征的淀粉样相关疾病的诊断方法。

发明的第9项内容为以检测上述发明的第3项内容的人基因或上述发明的第4项内容的mRNA的存在为特征的淀粉样相关疾病的诊断方法。

发明的第10项内容为表达上述发明的第3项内容的人变异型淀粉样前体蛋白质基因的细胞。

发明的第11项内容为在体内具有上述发明第1项内容的变异型淀粉样蛋白质的非人类动物以及来源于该非人类动物的组织及细胞。

发明的第12项内容为一种筛选方法，是探索淀粉样相关疾病的治疗药物成分的方法，其特征为使其与上述发明的第10项内容的细胞或上述发明第11项内容的非人类动物或来源于该非人类动物的组织以及细胞相接触，以测定该细胞或组织中的人变异型淀粉样蛋白质的变动及活性。

发明的第13项内容为含有上述发明的第1项内容的变异型淀粉样蛋白质的抗淀粉样相关疾病的药物。

发明的第14项内容为含有上述发明的第2项内容的肽的抗淀粉样相关疾病的药物。

发明的第15项内容为含有上述发明的第5项内容的cDNA的抗淀粉样相关疾病的药物。

发明的第16项内容为含有上述发明的第6项或第7项内容的抗体的抗淀粉样相关疾病的药物。

在本发明中，可以用缺失变异型APP基因及该片段与目前的野生型APP或已有报道的家族性变异型APP进行比较验证。其结果可以期待探明淀粉样蛋白质的代谢，及期待从新型的分子结构、作用、效果探明病理学原因。

在本发明中，缺失变异型APP基因及该片段可用于新型细胞、动物或新型药物及化合物的筛选。

而在本发明中，使用由缺失变异型全长淀粉样蛋白质Aβ1-40(Δ22E)、Aβ1-40(Δ21A)或Aβ1-40(Δ23D)构成的氨基酸39个、由缺失变异型全长淀粉样蛋白质Aβ1-42(Δ22E)、Aβ1-42(Δ21A)或Aβ1-42(Δ23D)构成的氨基酸41个、由缺失变异型全长淀粉样蛋白质Aβ1-43(Δ22E)、Aβ1-43(Δ21A)或Aβ1-43(Δ23D)构成的氨基酸42个，由于可以该缺失变异作用与已报道的野生型淀粉样蛋白质的信息进行比较利用，因此是优选的。

另外，在本发明中，由于该变异在家族性阿尔茨海默病患者中被检测出，因此可期待其诱导痴呆症病态，而为了强调该变异的效果，预定使用具有除去淀粉样蛋白质的细胞膜内部分Aβ29-40或Aβ29-42/43的部分序列的cDNA或肽。另外，为了血脑屏障或分子稳定性的提高，可考虑使用通过解离基团修饰诱导亲水性变化的修饰体。

本发明的变异型淀粉样蛋白质或其修饰体为由缺失型变异APP得到的水解物，其性质确认为目前未知的蛋白质凝集能显著降低的活性。

需要说明的是，本发明中“蛋白质”及“肽”指由通过肽键互相结合的多个氨基酸残基构成的分子。

另外，本发明中的“淀粉样相关疾病”指例如包括阿尔茨海默病或先天愚型症在内的，已知由淀粉样蛋白质直接或间接作为病因参与或怀疑有该可能性的疾病、以及在神经病变中确认了淀粉样蛋白质的疾病。“诊断”指对被检测者是否患有淀粉样相关疾病的判定，对是否存在将来患淀粉样相关疾病的危险性的判定、以及对是否存在治疗后再复发淀粉样相关疾病的危险性的判定。另外，在诊断中还包含对患有淀粉状物质相关疾病或其危险性为何种程度的测定。

该发明中的其它用语或概念在发明的实施方案的说明或实施例中有详细规定。需要说明的是，用于基本上是采用IUPAC-IUBCommission on Biochemical Nomenclature的用语，或基于在该领域中惯常使用的用语的意义。另外为了实施发明而使用的各种技术，除了特别明确表示其出处的技术，只要是从事本领域的人员可基于公知的文献等容易且确实的进行实施。例如，基因工程学及分子生物学技术可根据下述方法进行实施：J.Sambrook，E.F.Fritsch & T.Maniatis，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2^nd edition)”，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring  Harbor，NewYork(1989)；D.M.Glover et al.ed.，“DNA Cloning”，2^nd ed.，Vol.1to 4，(The Practical Approach Series)，IRL Press，OxfordUniversity Press(1995)；Ausubel，F.M.et al.，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，N.Y.，1995；日本生化学会编、“新生化实验讲座1、基因研究法II”、东京化学同人(1986)；日本化学会编、“新生化实验讲座2、核酸III(DNA重组技术)”、东京化学同人(1992)；R.Wu ed.，“Methods inEnzymology”，Vol.68(Recombinant DNA)，Academic Press，NewYork(1980)；R.Wu et al.ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.100(Recombinant DNA，Part B)& 101(Recombinant DNA，Part C)，Academic Press，New York(1983)；R.Wu et al.ed.，“Methods inEnzymology”，Vol.153(Recombinant DNA，Part D)，154(RecombinantDNA，Part E)& 155(Recombinant DNA，Part F)，Academic Press，NewYork(1987)等中记载的方法在其中引用的文献中记载的方法或与其基本上相同的方法或改良的方法。另外，本发明中的医药的制备可通过下述方法进行实施：Remington’s Pharmaceutical Sciences，18^thEdition，ed.A.Gennaro，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990等中记载的方法、或其中引用的文献中记载的方法或与其基本上相同的方法或改良的方法。

附图说明

图1为从变异淀粉样前体蛋白质分泌的变异型淀粉样蛋白质的质量分析的结果。

图2为用于测定变异型淀粉样蛋白质的抗原性的斑点测试(dottest)的结果。

图3为用于测定相对于变异型淀粉样蛋白质和野生型淀粉样蛋白质的变异型淀粉样蛋白质的抗原性的斑点测试的结果。

图4为用于测定抗变异型淀粉样蛋白质抗体的特异性的免疫沉淀测试的结果。

图5为研究抗变异型淀粉样蛋白质抗体的组织染色性的结果。

图6为用于研究变异型淀粉样蛋白质和神经免疫反应的关系的使用抗变异型淀粉样蛋白质抗体进行的荧光免疫组织2重染色的结果。

具体实施方式

本发明的变异型淀粉样蛋白质，以天然的蛋白质Aβ1-40(Δ22E)、Aβ1-42(Δ22E)、Aβ1-43(Δ22E)为例，可从例如家族性阿尔茨海默病患者的细胞进行分离生产。或者非天然的变异型淀粉样蛋白质Aβ1-40(Δ21A)、Aβ1-42(Δ21A)、Aβ1-43(Δ21A)、Aβ1-40(Δ23D)、Aβ1-42(Δ23D)及Aβ1-43(Δ23D)可通过公知的肽合成法获得。由于用于合成的材料及合成的各步骤中使用的方法是众所周知的方法，因此本领域人员可适当的进行合成、分离、纯化等以制造作为目的的变异型淀粉样蛋白质。另外，通过利用大肠杆菌、酵母、枯草杆菌、昆虫细胞、动物细胞、植物细胞的本身公知的宿主的基因重组技术，可以制造本发明的变异型淀粉样蛋白质。化学合成例如可按照下述的实施例的方法进行，只要能获得目的基因及肽或其化合物，可使用任何一种方法。例如可适当的组合使用众所周知的方法的Boc(叔丁基羟基羰基)化反应、DMSO氧化、碱性反应、酸性反应、环氧化反应、硅胶柱色谱法、烷基化反应、皂化反应、加热反应、脱碳酸反应、缩合反应、反相高效液相色谱法等进行。或例如按照顺序对构成变异型淀粉样蛋白质的氨基酸残基进行反应，适当有效的实施反应物纯度的测定的方法。进一步，还可在不同时间通过常温、高温、冷冻熔融处理等对合成的肽进行改变。具体而言，可按照Merrifield，R.B.J.Solid phase peptide synthesis I.Thesynthesis of tetrapeptide.J.Amer.Chem.Soc.85，2149-2154，1963；Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis.A Practical Approach.Chan，W.C.and White，P.D.，Oxford University Press，2000中记载的方法进行。

本发明中的变异型淀粉样蛋白质还可以含有用于促进合成的纯化的修饰、用于提高物理和化学稳定性的修饰、针对生物体内的代谢的稳定性和不稳定性、附加条件等活性化修饰、以及实现包括通过血脑屏障的脏器运送效率的提高和降低的控制修饰。此处所说的控制修饰可例示如下：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(序列号4)的11个氨基酸构成的序列(Schwarze，S.R.，Ho，A.，Vocero-Akbani，A.& Dowdy，S.F.In vivo protein transduction：Delivery of a biologically active protein into the mouse Science285：1569-1572)。通过含有N末端侧以肽键连接的该控制序列，可使变异型淀粉样蛋白质易于通过血脑屏障，可更有效率的到达脑内的目标部位。

本发明的变异型淀粉样蛋白质的其它修饰中，还包含乙酰化、酰基化、ADP-核糖化、氨基化、黄素共价键、边缘部分的共价键、核苷或核苷衍生物的共价键、脂类或脂类衍生物的共价键、磷脂酰肌醇的共价键、交联架桥结构、环化、二硫化、交联架桥共价键的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸酯的形成、甲酰化、γ羧基化、糖基化、GPI锚的形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白质水解过程、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、脂质结合、硫酸化、硒化、精氨酰化等tRNA介导的氨基酸在蛋白质上的添加、以及泛素化等。

另外，为了易于对本发明的变异型淀粉样蛋白质或将其作为免疫原制备的抗体进行检测或纯化，或附加别的功能，进行的结构的添加、改变、替换在技术上是容易实现的，上述产物也被包含在本发明的范围内。需要说明的是，用于附加修饰采用FLAG-tag、β半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、IgG等免疫球蛋白质Fc片段或GFP等基因工程方法的产物也包含于被发明的范围内。

发明的第6项内容的抗体，可选择本发明的变异型淀粉样蛋白质或其修饰体、或其分解物(部分肽段等)，将其作为抗原进行制备。部分肽段，例如可由20个以下的氨基酸残基、优选由20个以下5个以上的氨基酸残基所构成。抗体的制备也可组合使用上述的抗原。抗原可以不必是被发明的变异型淀粉样蛋白质或其修饰体、或其分解物本身，也可为具有外露于立体结构外部的、在变异APP的该缺失部位附近的一级序列的蛋白质。

另外，为了制备针对本发明的变异型淀粉样蛋白质的免疫特异性抗体，优选使用含有上述在该缺失部位附近的结构的氨基酸序列的化合物作为抗原。上述抗体，只要在免疫学上可与该部位结合或识别，其种类及量并无特别限定。抗体的结合或识别的有无可通过公知的抗原抗体反应决定。“免疫特异性”指其对于该化合物的亲合性比现有技术中的其它的相关蛋白质或化合物更大。

抗体的生产可通过下述方法实施：将本发明的变异型淀粉样蛋白质或其修饰物、或其分解物作为抗原，在存在或不存在佐剂的情况下，单独或结合在载体上或共存的状态下，进行针对抗原的体液性应答及/或细胞性应答的免疫诱导。

另外，发明的第7项内容的抗体，可采用例如有机合成的变异型淀粉样蛋白质的肽制作为寡聚物，制备以该寡聚物状变异型淀粉样蛋白质为抗原的抗体。该抗体如实施例所示具有以下新颖而有用的特性：其不可识别无论是构成老人斑的纤维状淀粉样蛋白质的单体形状的淀粉样蛋白质为野生型、或是变异型，只可以特异识别寡聚物状的野生型及变异型淀粉样蛋白质。

具体而言，抗体可如下进行制作：采用上述淀粉样蛋白质的Freund完全佐剂的混悬液在小鼠中进行免疫注射，在1个月以后改用Freund不完全佐剂的混悬液进行免疫，7天后重复进行同样的免疫操作即可获得抗体。或在培养条件下通过对淋巴细胞或其前体细胞进行免疫刺激也可实施免疫诱导。载体只要本身对宿主不产生有害作用，并无特别限定，可例举出纤维素、生理盐水、缓冲化生理盐水、右旋葡萄糖、水、甘油、乙醇、聚合氨基酸、白蛋白及它们的混合物等，但并不局限于此。免疫的动物可适当的采用小鼠、大鼠、兔、山羊、马、牛等。多克隆抗体可通过公知的方法作为血清获得，或通过从血清中回收抗体的方法获得。优选的方法可举出免疫亲和层析色谱法。

单克隆抗体的生产可通过下述方法进行：从上述免疫诱导的动物中回收含有抗体活性的组织(例如脾脏或淋巴结)或培养细胞，通过性状转化方法导入至本身公知的永久增殖性细胞(例如P3X63Ag8株等骨髓瘤细胞株)。例如，对由上述抗体生产细胞和永久增殖细胞制作的杂交瘤进行克隆化，筛选产生特异性识别本发明相关的变异型淀粉样蛋白质的抗体的杂交瘤，从该杂交瘤的培养液中回收抗体。作为实际的例子，有在杂交瘤法(Kohler G.and Milstein C.(1975)Nature256，495-497)、trioma法(Kozbor et al.ImmunologyToday(1983)4：72)、及EBV法(Cole et al.Monoclonal antibodiesand cancer therapy，Alan R.Liss，Inc.，(1985)：77-96)中记载的各种技术方法。

上述抗体，可用于本发明的变异型淀粉样蛋白质的测定、检出、定量，或通过亲和层析色谱法等制备和纯化变异型淀粉样蛋白质。上述抗体可使用本身公知的方法改变为人源性抗体。

具体而言，针对于本发明的变异型淀粉样蛋白质的特异性抗体，具有增加本发明的变异型淀粉样蛋白质的活性的活性效果，可用于作为淀粉样蛋白质生成抑制剂的筛选中的化合物的标准物质，或作为筛选方法。使用针对于本发明的变异型淀粉样蛋白质的抗体的检测法可举出放射免疫检测法、竞争结合检测法、高效液相色谱法、蛋白质印迹分析法即ELISA检测法等、以及这些方法的组合。

发明的第8项内容及第9项内容分别为淀粉样相关疾病的诊断方法，其特征为测定本发明的第1项内容的人变异型淀粉样蛋白质基因的表达产物。即，本发明的变异型淀粉样蛋白质为从家族性阿尔茨海默病患者分离鉴定的致病蛋白质，通过测定其存在量，可诊断阿尔茨海默病等的淀粉样相关疾病。而在本发明的变异型淀粉样蛋白质为外源性给药时，也可以测定其存在量。

在以mRNA做为表达产物对象时，例如可使用定量的探针杂交法。使用标记DNA探针的杂交法具体而言可采用例如Allele-specificOligonucleotide Probe法、Oligonucleotide Ligation Assay法、Invader法等公知的方法。或者，以从被检验者分离出的mRNA为模板，通过定量RT-PCR可测定mRNA的量。

另外，作为基因表达产物以变异型淀粉样蛋白质为对象的时候，优选使用发明的第6项内容的抗体，特别是通过使用标记化的抗体，可以简便且高精度的进行检测。标记可使用酶、放射性同位素或荧光色素。由于酶的转换数大，即使与抗体结合也很稳定，只要能满足使底物特异性的着色等条件并无特别限制，可采用通常使用的EIA的酶、例如过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖-6-磷酸化脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。另外，还可使用酶抑制剂或辅酶等。这些酶与抗体的结合，可通过使用马来酸酐缩亚胺化合物等交联剂采用公知的方法进行。底物可根据使用的酶的种类使用公知物质。例如使用过氧化物酶作为酶的时候，可采用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺；当使用碱性磷酸酶时，可采用对硝基苯酚等。放射性同位素可使用¹²⁵I、³H等通常在RIA中使用的物质。荧光色素可使用异硫氰酸酯荧光素(FITC)或四甲基罗丹明异硫氰酸酯荧光素(TRITC)等在通常的荧光抗体法中使用的物质。使用酶时，通过酶作用分解加入发色基团，以光学方法测定底物的分解量求出酶活性，将其换算为抗体结合量，通过与标准值的比较计算出抗体量。使用放射性同位素时，放射性同位素放出的放射线量通过液闪计数器等测定。另外，使用荧光色素时，可通过组合荧光显微镜的测定装置测定荧光量即可。另外，优选使用第一抗体和标记化的第二抗体的三明治法(使用酶作为标记时为“ELISA”)。

下面，对发明的第10项内容的细胞及第11项内容的动物进行说明。该动物或细胞可通过例如下述在细胞中导入变异型淀粉样蛋白质或其肽的方法等方法获得：在动物中注射变异型淀粉样蛋白质溶液的方法、使金属胶体和变异型淀粉样蛋白质结合对动物进行给药的方法、按照使用逆转录病毒载体或腺病毒载体的基因治疗方法在动物或细胞中导入发明的第2项内容的变异APP基因或其cDNA的方法、磷酸钙法、使用核糖体或红血球血影细胞的方法、电穿孔法、使用玻璃珠的微量注入法等。

另外，上述动物或细胞，可通过公知的转基因动物制备法(例如Proc.Natl.Acad.Scl.USA 77；7380-7384，1980)进行生产。即，可将发明的第2项内容的变异APP基因导入至非人类动物(优选为小鼠或大鼠)的全能分化性细胞中，使该细胞发育为个体，通过筛选在体细胞中的基因组中插入了变异APP基因的个体以制备目的转基因动物。向全能分化性细胞中导入基因的方法，在考虑转基因动物个体的产出效率或向下一代导入基因的转入效率时，最优选外源基因DNA的物理注入方法(微量注入法)。注入基因的受精卵，接着移植至母代的输卵管中，发育为个体而出生的动物与母代动物一同喂养，从身体的一部分(尾部尖端)提取DNA，通过DNA印迹分析或PCR检测法确认导入的外源基因的存在，得到了在二倍染色体的一方导入了外源基因的第一代杂合子动物，通过与另一该类杂合子进行交配获得纯合子动物。该发明的转基因动物中，包含第一代杂合子动物、与另一杂合子交配得到的纯合子动物、它们的子代动物、或它们的胎儿。

发明的第12项内容为以上述的细胞或动物为对象，筛选淀粉样相关疾病的治疗药物成分的方法。具体而言，为例如使动物或细胞与候选物质相接触，按照与上述发明的第8或第9项内容的诊断方法一样的方法，对在细胞或动物组织(中枢神经系统组织)中表达的变异APP基因的表达产物(mRNA或变异型淀粉样蛋白质)的量进行测定。另外，对在细胞或动物组织中表达的变异型淀粉样蛋白质的活性产生影响的物质确定为治疗药物成分。

另外，在该筛选方法中使用的候选物质中，含有例如有机或无机化合物(特别是低分子量的化合物)、蛋白质、肽等。这些物质可为功能和结构已知或未知的均可。或者，使用“组合化学库”也是用于确定目标物质的候选物质群的有效方法。组合化学库为通过化学合成或生物学合成，结合试剂等大量的化学的“模块”生成很多种化学组合物的集合。例如肽类组合物库等直线性组合化学库，是通过设定模块(氨基酸)，针对于需要的化合物的长度(也即肽的大小)通过所有可能的方法连接而形成的。通过基于化学的模块的该类组合化学库，可以合成大量化学组合物。例如，通过基于100个可替换的化学的模块的系统的组合化学库，结果可以产生1亿个4倍体化合物或100亿个5倍体化合物(例如参照Gallop et al.，(1994)37(9)：1233-1250)。组合化学库的制备及筛选，在本技术领域内是众所周知的(例如参照美国专利第6,004,617号；参照5,985,365号)。或者还可使用各种市售的组合化学库。

发明第13～16项内容分别为含有本发明的变异型淀粉样蛋白质、肽、cDNA、抗体的抗淀粉样相关疾病药物。该药物针对于阿尔茨海默病等淀粉样相关疾病，控制淀粉样蛋白质的产生量或其脑内积蓄量，通过此功能用于上述疾病的预防、治疗、及改善症状等目的。也即，可提供发明第6项内容及发明第7项内容的抗体作为解决目前的间接免疫疗法中的副作用的问题。而变异型淀粉样蛋白质或肽、或cDNA，可在生物体内，作为用于产生阻碍或抑制野生型淀粉样蛋白质的聚合的有效的抗体的抗原分子发挥作用。

上述的各成分，可通过公知的方法、手段作为可以导入生物体或细胞内的形态进行制剂化。作为药剂形态，例如为cDNA时，可将重组了cDNA的表达载体，重组至例如具有生物体识别分子功能的中空纳米粒子、或公知的病毒载体(逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等)中即可。通过基因治疗方法将该药物导入至生物体内，可在生物细胞内表达变异型淀粉样蛋白质。还可以使用将cDNA进行肌肉注射的基因治疗法。另外，为了制成可将变异型淀粉样蛋白质、肽或抗体导入至生物体内的形态，例如可在不改变其结构和功能的情况下，使变异型淀粉样蛋白质、肽或抗体混合于其药理学上允许的载体溶液中进行制剂化。还有从生物体组织或细胞中取出至体外，在体外条件下采用这些蛋白质或肽进行处理诱导所期望的性状后再返回至生物体内的方法。另外，在生物体内取出的组织或细胞中导入cDNA表达载体后返回至生物体内也可能成为实施治疗的一种方式。上述情况下，可通过例如微量注射法导入至细胞。或可采用通过脂质体导入至细胞内的方法(BioPORTER(Gene Therapy Systems公司，美国)、Chariot(ActiveMotif公司，美国)等)。另外，本发明的抗淀粉样相关疾病药物，可实施提高向该脑组织的运送效率的适当的制剂化处理。

进一步，作为有效成分的变异型淀粉样蛋白质或该肽、cDNA或抗体可单独使用，或可组合其修饰物或分解物进行使用。进一步还可与治疗上有利的其它化合物合并使用。本发明的医药的全身给药的优选方案为注射，尤其为静脉注射。还可采用皮下、肌肉或腹腔内等其他注射途径。作为用于全身给药的其它的方法，有使用胆汁酸盐或adrenal acid或其它表面活性剂等浸透剂的经粘膜或透皮给药方法。另外，肠溶处方或胶囊处方如果适当的进行处方，也可进行口服给药。这些医药品组合物的给药可为局部状态，也可为膏药、糊剂、凝胶剂等形态。

实施例

以下，基于实施例对本发明进行具体的说明，但本发明并不局限于下述实施例。

实施例1

缺失变异型APP碱基序列的确定

从家族性阿尔茨海默病患者的血液中提取基因组DNA，使用得到的DNA作为模板，基于目前已知的致病基因的早老基因1(PSEN1)、早老基因2(PSEN2)及APP，对编码其cDNA的全碱基序列进行PCR扩增后，通过ABI公司PRISM型310测序仪(Perkin-Elmer，CA)进行分析。其结果发现在野生型APP基因cDNA的淀粉样蛋白质编码区域(序列号1)上1个部位的变异(序列号1的第1852-1854位的3个碱基gaa的缺失)。

实施例2

由缺失变异型APP基因cDNA合成的淀粉样蛋白质的结构的确定

由实施例1得到的变异APP基因cDNA，由于在淀粉样蛋白质的内部存在变异，以β蛋白质分泌酶或γ蛋白质分泌酶切断部位进行研究。然后表达APP，在已知可以产生、分泌淀粉样蛋白质的人培养细胞HEK细胞中导入变异APP基因cDNA的表达载体。进行2天的表达，获得培养上清，在岛津公司AXIMA-CFR中对使用抗淀粉样蛋白质抗体免疫沉淀的组份进行质量分析。结果在图1中表示。

如图1所表示，作为在人培养细胞HEK细胞中表达的变异APP基因cDNA所分泌的淀粉样蛋白质的Aβ1-40(ΔE)的分子量得到的实验观察值为4200.51。这与缺失Aβ1-40的第22位的Glu的分子量的理论计算值4200.69大致一致。总之，该缺失变异型APP在保持与目前相同的β蛋白质分泌酶或γ蛋白质分泌酶切断部位的状态下，产生、分泌缺失变异型淀粉样蛋白质。也即，变异型淀粉样蛋白质的氨基末端为从Asp开始至Val结束的Aβ1-40，是其中不含第22位的Glu的变异型淀粉样蛋白质。

实施例3

由缺失变异型APP合成的淀粉样蛋白质的定量

证明在人培养细胞HEK细胞中表达的缺失变异型APP，产生、分泌如表1所示的大致与野生型APP相同的2种变异型淀粉样蛋白质。

                 表1

	Aβ42(pg/ml)	Aβ40(pg/ml)
			对照	0	0
野生型APP	26	200
			变异型APP	24	190

需要说明的是表1的对照指使用溶解于生理盐水的空的表达载体。另外，Aβ42表示Aβ1-42及Aβ1-43或Aβ1-42(ΔE)及Aβ1-43(ΔE)，Aβ40表示Aβ1-40或Aβ1-40(ΔE)。

实施例4

变异型淀粉样蛋白质的毒性

本实施例中使用的变异型淀粉样蛋白质为有机合成的肽，通过氨基酸序列及质量分析证明，其具有与从细胞分泌的变异型淀粉样蛋白质相同的氨基酸序列、质量。使用该合成肽研究神经细胞毒性时，显示具有比目前的野生型淀粉样蛋白质更低的毒性。其结果在表2中表示。

                表2

	对照	野生型Aβ	变异型Aβ
				生存率(％)	100	40	90

表2中的野生型Aβ或变异型Aβ表示Aβ1-40、或Aβ1-40(ΔE)，对照表示具有野生型Aβ1-40的氨基酸序列的反向氨基酸序列的Aβ40-1。

实施例5

变异型淀粉样蛋白质的凝集性

本实施例中使用的变异型淀粉样蛋白质为有机合成的肽，通过氨基酸序列及质量分析证明，其具有与从活细胞分泌的变异型淀粉样蛋白质相同的氨基酸序列、质量。使用该肽通过硫磺素T结合能力对蛋白质凝集能进行研究时，显示本发明的变异型淀粉样蛋白质的凝集活性远远比目前的野生型淀粉样蛋白质低。其结果在表3中表示。

	0Hr	12Hr	24Hr
				野生型Aβ	0	61	100
变异型Aβ	0	2	2

表3中的野生型Aβ表示Aβ1-42，变异型Aβ表示Aβ1-42(ΔE)。将在100mg/ml(PBS)的条件下，37℃、24小时的野生型Aβ1-42的凝集能活性作为100％。

实施例6

变异型淀粉样蛋白质的抗原性

本实施例中使用的变异型淀粉样蛋白质采用有机合成的肽，在37℃下进行24小时加热处理，制作寡聚物。寡聚物的鉴定中，确认以蛋白质印迹法检测出2倍体、3倍体以上的大型的变异型淀粉样复合物，以电子显微镜未观察到淀粉样纤维，与硫磺素的结合反应呈阴性。

制作以该寡聚物状变异型淀粉样蛋白质作为抗原的抗体。为实现该目的，以溶解于PBS的肽与Freund完全佐剂的混悬液对小鼠进行免疫注射。1个月后，改用Freund不完全佐剂的混悬液进行免疫，7天后重复进行同样的免疫操作。采血从小鼠尾部静脉采取100毫升，确认其反应性。

准备数个点印迹抗原肽的PVDF膜带，干燥后在含有20％牛血清的PBS中进行封闭后，将各带分别置于小型反应箱中，与稀释至150倍的小鼠血清(No.1至8)进行反应(图2)。膜带然后使用用生物素标记的抗小鼠IgG山羊抗体作为第二抗体，然后反应为抗生物素蛋白质和生物素的复合物。检测根据DAB发色评价抗体效价。最左边的膜带为作为对照与识别N末端的山羊抗体进行反应的例子。

在图2中，显示点印迹测试的各膜带，为了与横的膜带相区别稍稍向上下移动而进行点印迹。各膜带中，从上面开始分别点印迹10ng、1ng、0.1ng、0.01ng、PBS、白蛋白质。稀释至150倍的抗血清至少需要1ng的抗原量，其以下的抗原量无法进行检出。而且在牛血清白蛋白(BSA)中不进行反应。重要的是，点印迹测试的所有8只的小鼠血清中无一例外被确定为识别寡聚物肽的抗体，确认具有寡聚物状变异型淀粉样蛋白质的高且具有重现性的抗原性。

另外，以变异型淀粉样蛋白质作为抗原制成的抗变异型淀粉样蛋白质抗体被确认不仅与变异型淀粉样蛋白质，也与野生型淀粉样蛋白质相反应(图3)。图3为除了使用野生型淀粉样蛋白质代替变异型淀粉样蛋白质之外，通过同样的操作进行的点印迹测试。膜带中，从上面开始分别点印迹100ng、10ng、1ng的野生型淀粉样蛋白质、然后是PBS、白蛋白。

实施例7

抗变异型淀粉样蛋白质抗体的特异性

抗变异型淀粉样蛋白质抗体的特异性如下确认，以得到的抗血清使变异型淀粉样蛋白质寡聚物发生免疫沉淀后，通过蛋白质印迹方法以其它的常用淀粉样物质抗体进行检出。

图4中所示的免疫沉淀测试的最左边的膜带表示作为对照与识别N末端的山羊抗体发生反应，以相同的抗体检出的例子。箭头标记淀粉样蛋白质的电泳图案，从最下开始往上为单倍体(分子量4kDa)、2倍体(分子量8kDa)、3倍体(分子量12kDa)、4倍体(分子量16kDa)、5倍体以上(分子量20kDa以上)。此处研究的小鼠血清(No2、3及4)仅识别结合2倍体以上的寡聚物。通常的淀粉样物质抗体也识别单倍体，但抗变异型淀粉样蛋白质抗体不识别单倍体。

下面，对抗变异型淀粉样蛋白质抗体的寡聚物抗体活性进行定量测定(表4)。在该测定中，在96孔塑料板中，变异型淀粉样蛋白质寡聚物分别与100ng、10ng、1ng、或PBS、牛血清白蛋白(BSA)结合。以20％牛血清PBS进行封闭，以各稀释至450倍的小鼠血清(No.2、3、4)进行检测。使用过氧化物酶标记的抗小鼠IgG山羊抗体作为第二抗体。

                            表4

寡聚蛋白质血清	100ng	10ng	1ng	PBS	BSA
						#2	1.25	0.45	0.06	0.05	0.08
#3	1.50	0.26	0.08	0.05	0.08
						#4	1.19	0.16	0.07	0.07	0.30
PBS	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02

通过表4，可知抗变异型淀粉样蛋白质寡聚物抗体不与BSA或单聚物状变异型淀粉样蛋白质反应，仅与寡聚物发生特异性反应。

实施例8

抗变异型淀粉样蛋白质抗体的组织染色性

在实施例6中制作的抗变异型淀粉样蛋白质抗体的特异性，使用福尔马林固定的阿尔茨海默病脑组织切片通过荧光抗体染色进行研究(图5)。抗变异型淀粉样蛋白质抗体作为第一抗体在4℃下反应一晚，在含有0.05％Tween-20的PBS中洗净脑组织切片，与Texas Red标记的第二抗体的抗小鼠IgG抗体反应2小时，再次洗涤后包埋在含有抗荧光褪色剂的封入剂中。观察采用共聚焦激光显微镜(Axiovert100；Zeiss，Germany)实施。

结果如图5所示，其染色性观察为呈神经元的点状分布，与寡聚物状淀粉样蛋白质的已有文献(非专利文献8；R.H.Takahashi，C.G.Almeida，P.F.Kearey，F.Yu，M.T.Lin，T.A.Milner，G.K.Gouras，Oligomerization of Alzheimer’s hamyloid within processes andsynapses of cultured neurons and brain，(2004)J.Neurosci.24：3592-3599；R.Kayed，E.Head，J.L.Thompson，T.M.Mclntire，S.C.Milton，C.W.Cotman，C，G.Glabe，Common structure of solubleamyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis，(2003)Science 300：486-489)一致。

即，确认了以寡聚物状淀粉样蛋白质作为抗原制成的抗变异型淀粉样蛋白质抗体虽然识别寡聚物状淀粉样蛋白质，但不识别形成纤维状淀粉样蛋白质的老人斑。

实施例9

抗变异型淀粉样蛋白质抗体和神经免疫反应

以现有的疫苗治疗(D.Schenk，R.Barbour，W.Dunn，et al.Immunization with amyloid-beta attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse，(1999)Nature 400：173-177)诱导的抗体为以野生型淀粉样蛋白质(Abeta_1-42)为抗原的抗体，可对老人斑进行染色(C.Hock，U.Konietzko，A.Papassotiropoulos，etal.，generation of antibodies specific for beta-amyloid byvaccination of patients with Alzheimerdisease，(2002)Nat Med8：1270-1275)。另外，有该抗体引起的脑炎反应的副作用的报告(J.A.Nicoll，D.Wilkinson，C.Holmes，P.Steart，H.Markham，R.O.Weller，Neuropathology of human Alzheimer’s diseasefollowing immunization with amyloid beta peptide：a case report，(2003)Nat Med 9：448-452；J.-M.Orgogozo，S.Gilman，J.-F.Dartigues，B.Laurent，M.Puel，L.C.Kirby，P.Jouanny，B.Dubois，L.Eisner，S.Flitman，B.F.Michel，M.Boada，A.Frank，& C.Hock，Subacute meningoencephalitis in a subset of patientswith AD after Abeta42 immunization，(2003)Neurology 61：46-54)。

为了使作为炎症反应的标记物的活化的补体分子(C3d)与抗变异型淀粉样蛋白质抗体的染色相比较，混合作为第一抗体的抗变异型淀粉样蛋白质小鼠抗体和抗C3d兔抗体，在4℃下反应一晚，在含有0.05％Tween-20的PBS中洗净PBS脑组织切片，将作为第二抗体的TexasRed标记的抗小鼠IgG抗体与FITC标记的抗兔IgG抗体的混合液反应2小时，再次洗涤后包埋在含有抗荧光褪色剂的封入剂中。观察采用共聚焦激光显微镜(Axiovert100；Zeiss，Germany)实施。

结果如图6所示。图6表示同一切片的2重染色图像。分别检出了下述荧光图像：图6(a)为抗变异型淀粉样蛋白质小鼠抗体染色图像，图6(b)为抗C3d兔抗体染色图像。与现有的报告(P.Eikelenboom，F.C.Stam，Immunoglobulins and complement factors in senileplaques，(1982)Acta Neuropathol 57：239-242；P.Eikelenboom，C.E.Hack，J.M.Rozemuller，F.C.Stam，Complement activation inamyloid plaques in Alzheimer’s dementia，(1989)Virchows Arch56：259-262；P.Eikelenboom，J.M.Rozemuller，F.L.van Muiswinkel，Inflammation and Alzheimer’s disease：relationships betweenpathogenic mechanism and clinical expression，(1998)Exp Neurol154：89-98；P.L.McGeer，E.G.McGeer，Inflammation，autotoxicityand Alzheimer disease，(2001)NeuroBiology of Aging 22：799-809；P.Eikelenboom，A.J.M.Rozemuller，J.J.M.Hoozemans，R.Veerhuis，& W.A.van Gool，Neuroinflammation and Alzheimer Disease：Clinical and Therapeutic Implications，Alzheimer Disease &Associated Disorders，(2000)14，Suppl.1：S54-S61)一致，可观察到活化的神经免疫补体反应标记物的C3d与老人斑的分布一致。但是，C3d的阿尔茨海默病脑组织的局部存在，与抗变异型淀粉样蛋白质抗体染色图像的寡聚物状淀粉样蛋白质的局部存在一致。

产业上利用的可能性

本发明提供与阿尔茨海默病等的淀粉样相关疾病的病态的新型的变异型淀粉样蛋白质与其基因，利用该特性的新型医药组合物、诊断方法被提供用于本发明物质参与的疾病、特别是阿尔茨海默病等的淀粉样相关疾病的临床、基础研究领域。

                           序列表

<110>森启

<120>变异型淀粉样蛋白质

<130>05F076PCT

<150>JP2004-294292

<151>2004-10-06

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2088

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2088)

<223>

<400>1

atg ctg ccc ggt ttg gca ctg ctc ctg ctg gcc gcc tgg acg gct cgg    48

Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg

1               5                   10                  15

gcg ctg gag gta ccc act gat ggt aat gct ggc ctg ctg gct gaa ccc    96

Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro

            20                  25                  30

cag att gcc atg ttc tgt ggc aga ctg aac atg cac atg aat gtc cag    144

Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln

        35                  40                  45

aat ggg aag tgg gat tca gat cca tca ggg acc aaa acc tgc att gat    192

Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp

    50                  55                  60

acc aag gaa ggc atc ctg cag tat tgc caa gaa gtc tac cct gaa ctg    240

Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu

65                  70                  75                  80

cag atc acc aat gtg gta gaa gcc aac caa cca gtg acc atc cag aac    288

Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn

                85                  90                  95

tgg tgc aag cgg ggc cgc aag cag tgc aag acc cat ccc cac ttt gtg    336

Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val

            100                 105                 110

att ccc tac cgc tgc tta gtt ggt gag ttt gta agt gat gcc ctt ctc    384

Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu

        115                 120                 125

gtt cct gac aag tgc aaa ttc tta cac cag gag agg atg gat gtt tgc    432

Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys

    130                 135                 140

gaa act cat ctt cac tgg cac acc gtc gcc aaa gag aca tgc agt gag    480

Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu

145                 150                 155                 160

aag agt acc aac ttg cat gac tac ggc atg ttg ctg ccc tgc gga att    528

Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile

                165                 170                 175

gac aag ttc cga ggg gta gag ttt gtg tgt tgc cca ctg gct gaa gaa    576

Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu

            180                 185                 190

agt gac aat gtg gat tct gct gat gcg gag gag gat gac tcg gat gtc    624

Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val

        195                 200                 205

tgg tgg ggc gga gca gac aca gac tat gca gat ggg agt gaa gac aaa    672

Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys

    210                 215                 220

gta gta gaa gta gca gag gag gaa gaa gtg gct gag gtg gaa gaa gaa    720

Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu

225                 230                 235                 240

gaa gcc gat gat gac gag gac gat gag gat ggt gat gag gta gag gaa    768

Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu

                245                 250                 255

gag gct gag gaa ccc tac gaa gaa gcc aca gag aga acc acc agc att    816

Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile

            260                 265                 270

gcc acc acc acc acc acc acc aca gag tct gtg gaa gag gtg gtt cga    864

Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg

        275                 280                 285

gtt cct aca aca gca gcc agt acc cct gat gcc gtt gac aag tat ctc    912

Val Pro Thr Thr Ala Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu

    290                 295                 300

gag aca cct ggg gat gag aat gaa cat gcc cat ttc cag aaa gcc aaa    960

Glu Thr Pro Gly Asp Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys

305                 310                 315                 320

gag agg ctt gag gcc aag cac cga gag aga atg tcc cag gtc atg aga    1008

Glu Arg Leu Glu Ala Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg

                325                 330                 335

gaa tgg gaa gag gca gaa cgt caa gca aag aac ttg cct aaa gct gat    1056

Glu Trp Glu Glu Ala Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp

            340                 345                 350

aag aag gca gtt atc cag cat ttc cag gag aaa gtg gaa tct ttg gaa    1104

Lys Lys Ala Val Ile Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu

        355                 360                 365

cag gaa gca gcc aac gag aga cag cag ctg gtg gag aca cac atg gcc    1152

Gln Glu Ala Ala Asn Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala

    370                 375                 380

aga gtg gaa gcc atg ctc aat gac cgc cgc cgc ctg gcc ctg gag aac    1200

Arg Val Glu Ala Met Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn

385                 390                 395                 400

tac atc acc gct ctg cag gct gtt cct cct cgg cct cgt cac gtg ttc    1248

Tyr Ile Thr Ala Leu Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe

                405                 410                 415

aat atg cta aag aag tat gtc cgc gca gaa cag aag gac aga cag cac    1296

Asn Met Leu Lys Lys Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His

            420                 425                 430

acc cta aag cat ttc gag cat gtg cgc atg gtg gat ccc aag aaa gcc    1344

Thr Leu Lys His Phe Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala

        435                 440                 445

gct cag atc cgg tcc cag gtt atg aca cac ctc cgt gtg att tat gag    1392

Ala Gln Ile Arg Ser Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu

    450                 455                 460

cgc atg aat cag tct ctc tcc ctg ctc tac aac gtg cct gca gtg gcc    1440

Arg Met Asn Gln Ser Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala

465                 470                 475                 480

gag gag att cag gat gaa gtt gat gag ctg ctt cag aaa gag caa aac    1488

Glu Glu Ile Gln Asp Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn

                485                 490                 495

tat tca gat gac gtc ttg gcc aac atg att agt gaa cca agg atc agt    1536

Tyr Ser Asp Asp Val Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser

            500                 505                 510

tac gga aac gat gct ctc atg cca tct ttg acc gaa acg aaa acc acc    1584

Tyr Gly Asn Asp Ala Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr

        515                 520                 525

gtg gag ctc ctt ccc gtg aat gga gag ttc agc ctg gac gat ctc cag    1632

Val Glu Leu Leu Pro Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln

    530                 535                 540

ccg tgg cat tct ttt ggg gct gac tct gtg cca gcc aac aca gaa aac    1680

Pro Trp His Ser Phe Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn

545                 550                 555                 560

gaa gtt gag cct gtt gat gcc cgc cct gct gcc gac cga gga ctg acc    1728

Glu Val Glu Pro Val Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr

                565                 570                 575

act cga cca ggt tct ggg ttg aca aat atc aag acg gag gag atc tct    1776

Thr Arg Pro Gly Ser Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser

            580                 585                 590

gaa gtg aag atg gat gca gaa ttc cga cat gac tca gga tat gaa gtt    1824

Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val

        595                 600                 605

cat cat caa aaa ttg gtg ttc ttt gca gaa gat gtg ggt tca aac aaa    1872

His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys

    610                 615                 620

ggt gca atc att gga ctc atg gtg ggc ggt gtt gtc ata gcg aca gtg    1920

Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val

625                 630                 635                 640

atc gtc atc acc ttg gtg atg ctg aag aag aaa cag tac aca tcc att    1968

Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile

                645                 650                 655

cat cat ggt gtg gtg gag gtt gac gcc gct gtc acc cca gag gag cgc    2016

His His Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg

            660                 665                 670

cac ctg tcc aag atg cag cag aac ggc tac gaa aat cca acc tac aag    2064

His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys

        675                 680                 685

ttc ttt gag cag atg cag aac tag                                    2088

Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn

    690                 695

<210>2

<211>695

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg

1               5                   10                  15

Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro

            20                  25                  30

Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln

        35                  40                  45

Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp

    50                  55                  60

Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu

65                  70                  75                  80

Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn

                85                  90                  95

Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val

            100                 105                 110

Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu

        115                 120                 125

Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys

    130                 135                 140

Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu

145                 150                 155                 160

Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile

                165                 170                 175

Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu

            180                 185                 190

Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val

        195                 200                 205

Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys

    210                 215                 220

Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu

225                 230                 235                 240

Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu

                245                 250                 255

Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile

            260                 265                 270

Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg

        275                 280                 285

Val Pro Thr Thr Ala Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu

    290                 295                 300

Glu Thr Pro Gly Asp Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys

305                 310                 315                 320

Glu Arg Leu Glu Ala Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg

                325                 330                 335

Glu Trp Glu Glu Ala Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp

            340                 345                 350

Lys Lys Ala Val Ile Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu

        355                 360                 365

Gln Glu Ala Ala Asn Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala

    370                 375                 380

Arg Val Glu Ala Met Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn

385                 390                 395                 400

Tyr Ile Thr Ala Leu Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe

                405                 410                 415

Asn Met Leu Lys Lys Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His

            420                 425                 430

Thr Leu Lys His Phe Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala

        435                 440                 445

Ala Gln Ile Arg Ser Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu

    450                 455                 460

Arg Met Asn Gln Ser Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala

465                 470                 475                 480

Glu Glu Ile Gln Asp Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn

                485                 490                 495

Tyr Ser Asp Asp Val Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser

            500                 505                 510

Tyr Gly Asn Asp Ala Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr

        515                 520                 525

Val Glu Leu Leu Pro Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln

    530                 535                 540

Pro Trp His Ser Phe Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn

545                 550                 555                 560

Glu Val Glu Pro Val Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr

                565                 570                 575

Thr Arg Pro Gly Ser Gly Leu Thr Ash Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser

            580                 585                 590

Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val

        595                 600                 605

His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys

    610                 615                 620

Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val

625                 630                 635                 640

Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile

                645                 650                 655

His His Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg

            660                 665                 670

His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys

        675                 680                 685

Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn

    690                 695

<210>3

<211>3641

<212>DNA

<213>智人

<220>

<221>CDS

<222>(195)..(2507)

<223>

<300>

<308>GenBank/NM_000484

<309>2004-01-30

<313>(1)..(3641)

<400>3

gctgactcgc ctggctctga gccccgccgc cgcgctcggg ctccgtcagt ttcctcggca    60

gcggtaggcg agagcacgcg gaggagcgtg cgcgggggcc ccgggagacg gcggcggtgg    120

cggcgcgggc agagcaagga cgcggcggat cccactcgca cagcagcgca ctcggtgccc    180

cgcgcagggt cgcg atg ctg ccc ggt ttg gca ctg ctc ctg ctg gcc gcc      230

                Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala

                1               5                   10

tgg acg gct cgg gcg ctg gag gta ccc act gat ggt aat gct ggc ctg      278

Trp Thr Ala Arg Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu

        15                  20                  25

ctg gct gaa ccc cag att gcc atg ttc tgt ggc aga ctg aac atg cac      326

Leu Ala Glu Pro Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His

    30                  35                  40

atg aat gtc cag aat ggg aag tgg gat tca gat cca tca ggg acc aaa      374

Met Asn Val Gln Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys

45                  50                  55                  60

acc tgc att gat acc aag gaa ggc atc ctg cag tat tgc caa gaa gtc      422

Thr Cys Ile Asp Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val

                65                  70                  75

tac cct gaa ctg cag atc acc aat gtg gta gaa gcc aac caa cca gtg      470

Tyr Pro Glu Leu Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val

            80                  85                  90

acc atc cag aac tgg tgc aag cgg ggc cgc aag cag tgc aag acc cat      518

Thr Ile Gln Asn Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His

        95                  100                 105

ccc cac ttt gtg att ccc tac cgc tgc tta gtt ggt gag ttt gta agt      566

Pro His Phe Val Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser

    110                 115                 120

gat gcc ctt ctc gtt cct gac aag tgc aaa ttc tta cac cag gag agg    614

Asp Ala Leu Leu Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg

125                 130                 135                 140

atg gat gtt tgc gaa act cat ctt cac tgg cac acc gtc gcc aaa gag    662

Met Asp Val Cys Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu

                145                 150                 155

aca tgc agt gag aag agt acc aac ttg cat gac tac ggc atg ttg ctg    710

Thr Cys Ser Glu Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu

            160                 165                 170

ccc tgc gga att gac aag ttc cga ggg gta gag ttt gtg tgt tgc cca    758

Pro Cys Gly Ile Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro

        175                 180                 185

ctg gct gaa gaa agt gac aat gtg gat tct gct gat gcg gag gag gat    806

Leu Ala Glu Glu Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp

    190                 195                 200

gac tcg gat gtc tgg tgg ggc gga gca gac aca gac tat gca gat ggg    854

Asp Ser Asp Val Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly

205                 210                 215                 220

agt gaa gac aaa gta gta gaa gta gca gag gag gaa gaa gtg gct gag    902

Ser Glu Asp Lys Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu

                225                 230                 235

gtg gaa gaa gaa gaa gcc gat gat gac gag gac gat gag gat ggt gat    950

Val Glu Glu Glu Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp

            240                 245                 250

gag gta gag gaa gag gct gag gaa ccc tac gaa gaa gcc aca gag aga    998

Glu Val Glu Glu Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg

        255                 260                 265

acc acc agc att gcc acc acc acc acc acc acc aca gag tct gtg gaa    1046

Thr Thr Ser Ile Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu

    270                 275                 280

gag gtg gtt cga gag gtg tgc tct gaa caa gcc gag acg ggg ccg tgc    1094

Glu Val Val Arg Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys

285                 290                 295                 300

cga gca atg atc tcc cgc tgg tac ttt gat gtg act gaa ggg aag tgt    1142

Arg Ala Met Ile Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys

                305                 310                 315

gcc cca ttc ttt tac ggc gga tgt ggc ggc aac cgg aac aac ttt gac    1190

Ala Pro Phe Phe Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp

            320                 325                 330

aca gaa gag tac tgc atg gcc gtg tgt ggc agc gcc atg tcc caa agt    1238

Thr Glu Glu Tyr Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser

        335                 340                 345

tta ctc aag act acc cag gaa cct ctt gcc cga gat cct gtt aaa ctt    1286

Leu Leu Lys Thr Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu

    350                 355                 360

cct aca aca gca gcc agt acc cct gat gcc gtt gac aag tat ctc gag    1334

Pro Thr Thr Ala Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu

365                 370                 375                 380

aca cct ggg gat gag aat gaa cat gcc cat ttc cag aaa gcc aaa gag    1382

Thr Pro Gly Asp Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu

                385                 390                 395

agg ctt gag gcc aag cac cga gag aga atg tcc cag gtc atg aga gaa    1430

Arg Leu Glu Ala Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu

            400                 405                 410

tgg gaa gag gca gaa cgt caa gca aag aac ttg cct aaa gct gat aag    1478

Trp Glu Glu Ala Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys

        415                 420                 425

aag gca gtt atc cag cat ttc cag gag aaa gtg gaa tct ttg gaa cag    1526

Lys Ala Val Ile Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln

    430                 435                 440

gaa gca gcc aac gag aga cag cag ctg gtg gag aca cac atg gcc aga    1574

Glu Ala Ala Asn Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg

445                 450                 455                 460

gtg gaa gcc atg ctc aat gac cgc cgc cgc ctg gcc ctg gag aac tac    1622

Val Glu Ala Met Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr

                465                 470                 475

atc acc gct ctg cag gct gtt cct cct cgg cct cgt cac gtg ttc aat    1670

Ile Thr Ala Leu Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn

            480                 485                 490

atg cta aag aag tat gtc cgc gca gaa cag aag gac aga cag cac acc    1718

Met Leu Lys Lys Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr

        495                 500                 505

cta aag cat ttc gag cat gtg cgc atg gtg gat ccc aag aaa gcc gct    1766

Leu Lys His Phe Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala

    510                 515                 520

cag atc cgg tcc cag gtt atg aca cac ctc cgt gtg att tat gag cgc    1814

Gln Ile Arg Ser Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg

525                 530                 535                 540

atg aat cag tct ctc tcc ctg ctc tac aac gtg cct gca gtg gcc gag    1862

Met Asn Gln Ser Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu

                545                 550                 555

gag att cag gat gaa gtt gat gag ctg ctt cag aaa gag caa aac tat    1910

Glu Ile Gln Asp Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr

            560                 565                 570

tca gat gac gtc ttg gcc aac atg att agt gaa cca agg atc agt tac    1958

Ser Asp Asp Val Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr

        575                 580                 585

gga aac gat gct ctc atg cca tct ttg acc gaa acg aaa acc acc gtg    2006

Gly Asn Asp Ala Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val

    590                 595                 600

gag ctc ctt ccc gtg aat gga gag ttc agc ctg gac gat ctc cag ccg    2054

Glu Leu Leu Pro Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro

605                 610                 615                 620

tgg cat tct ttt ggg gct gac tct gtg cca gcc aac aca gaa aac gaa    2102

Trp His Ser Phe Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu

                625                 630                 635

gtt gag cct gtt gat gcc cgc cct gct gcc gac cga gga ctg acc act    2150

Val Glu Pro Val Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr

            640                 645                 650

cga cca ggt tct ggg ttg aca aat atc aag acg gag gag atc tct gaa    2198

Arg Pro Gly Ser Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu

        655                 660                 665

gtg aag atg gat gca gaa ttc cga cat gac tca gga tat gaa gtt cat    2246

Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His

    670                 675                 680

cat caa aaa ttg gtg ttc ttt gca gaa gat gtg ggt tca aac aaa ggt    2294

His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly

685                 690                 695                 700

gca atc att gga ctc atg gtg ggc ggt gtt gtc ata gcg aca gtg atc    2342

Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile

                705                 710                 715

gtc atc acc ttg gtg atg ctg aag aag aaa cag tac aca tcc att cat    2390

Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His

            720                 725                 730

cat ggt gtg gtg gag gtt gac gcc gct gtc acc cca gag gag cgc cac    2438

His Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His

        735                 740                 745

ctg tcc aag atg cag cag aac ggc tac gaa aat cca acc tac aag ttc    2486

Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe

    750                 755                 760

ttt gag cag atg cag aac tag acccccgcca cagcagcctc tgaagttgga       2537

Phe Glu Gln Met Gln Asn

765                 770

cagcaaaacc attgcttcac tacccatcgg tgtccattta tagaataatg tgggaagaaa  2597

caaacccgtt ttatgattta ctcattatcg ccttttgaca gctgtgctgt aacacaagta  2657

gatgcctgaa cttgaattaa tccacacatc agtaatgtat tctatctctc tttacatttt  2717

ggtctctata ctacattatt aatgggtttt gtgtactgta aagaatttag ctgtatcaaa  2777

ctagtgcatg aatagattct ctcctgatta tttatcacat agccccttag ccagttgtat  2837

attattcttg tggtttgtga cccaattaag tcctacttta catatgcttt aagaatcgat  2897

gggggatgct tcatgtgaac gtgggagttc agctgcttct cttgcctaag tattcctttc    2957

ctgatcacta tgcattttaa agttaaacat ttttaagtat ttcagatgct ttagagagat    3017

tttttttcca tgactgcatt ttactgtaca gattgctgct tctgctatat ttgtgatata    3077

ggaattaaga ggatacacac gtttgtttct tcgtgcctgt tttatgtgca cacattaggc    3137

attgagactt caagcttttc tttttttgtc cacgtatctt tgggtctttg ataaagaaaa    3197

gaatccctgt tcattgtaag cacttttacg gggcgggtgg ggaggggtgc tctgctggtc    3257

ttcaattacc aagaattctc caaaacaatt ttctgcagga tgattgtaca gaatcattgc    3317

ttatgacatg atcgctttct acactgtatt acataaataa attaaataaa ataaccccgg    3377

gcaagacttt tctttgaagg atgactacag acattaaata atcgaagtaa ttttgggtgg    3437

ggagaagagg cagattcaat tttctttaac cagtctgaag tttcatttat gatacaaaag    3497

aagatgaaaa tggaagtggc aatataaggg gatgaggaag gcatgcctgg acaaaccctt    3557

cttttaagat gtgtcttcaa tttgtataaa atggtgtttt catgtaaata aatacattct    3617

tggaggagca aaaaaaaaaa aaaa                                           3641

<210>4

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：合成的寡肽

<400>4

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1               5                   10

Claims (16)

1.人变异型淀粉样蛋白质，由在序列号2的氨基酸序列中，具有以下氨基酸序列的氨基酸序列所构成：

(1)第597-636位序列中缺失第618位Glu的39个氨基酸的序列；

(2)第597-638位序列中缺失第618位Glu的41个氨基酸的序列；

(3)第597-639位序列中缺失第618位Glu的42个氨基酸的序列；

(4)第597-636位序列中缺失第617位Ala的39个氨基酸的序列；

(5)第597-638位序列中缺失第617位Ala的41个氨基酸的序列；

(6)第597-639位序列中缺失第617位Ala的42个氨基酸的序列；

(7)第597-636位序列中缺失第619位Asp的39个氨基酸的序列；

(8)第597-638位序列中缺失第619位Asp的41个氨基酸的序列；或

(9)第597-639位序列中缺失第619位Asp的42个氨基酸的序列。

2.肽，是权利要求1的人变异型淀粉样蛋白质的一部分，包括5～28个含有序列号2中缺失的氨基酸残基前后的氨基酸残基的氨基酸序列。

3.人变异型淀粉样前体蛋白质基因，编码权利要求1的人变异型淀粉样蛋白质的前体的变异型淀粉样前体蛋白质。

4.mRNA，是权利要求3的人基因的转录产物。

5.cDNA，是由权利要求4的mRNA所合成的cDNA，具有缺失了序列号1中的第1852-1854位碱基的碱基序列。

6.抗体，特异性识别权利要求1的人变异型淀粉样蛋白质。

7.抗体，是以权利要求1的人变异型淀粉样蛋白质的寡聚物为抗原制成的抗体，特异性地识别寡聚物状的淀粉样蛋白质。

8.淀粉样相关疾病的诊断方法，其特征为，检测权利要求1的人变异型淀粉样蛋白质的存在。

9.淀粉样相关疾病的诊断方法，其特征为，检测权利要求3的人基因或权利要求4的mRNA的存在。

10.细胞，表达权利要求3的人变异型淀粉样前体蛋白质基因。

11.在体内具有权利要求1的变异型淀粉样蛋白质的非人类动物以及来源于该非人类动物的组织及细胞。

12.探索淀粉样相关疾病的治疗药物成分的筛选方法，其特征为，使被检物质与权利要求10的细胞或权利要求11的非人类动物或来源于该非人类动物的组织以及细胞相接触，以测定该细胞或组织中的人变异型淀粉样蛋白质的变动及活性。

13.含有权利要求1的变异型淀粉样蛋白质的抗淀粉样相关疾病的药物。

14.含有权利要求2的肽的抗淀粉样相关疾病的药物。

15.含有权利要求5的cDNA的抗淀粉样相关疾病的药物。

16.含有权利要求6或7的抗体的抗淀粉样相关疾病的药物。

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