MX2007004149A - Proteina amiloide variante. - Google Patents

Abstract

Se provee una proteina amiloide novedosa (proteina amiloide variante humana) util como una molecula de antigeno o similar para mejorar una terapia de vacuna; esta proteina amiloide variante humana es una proteina con delecion de Glu en 22av0, Ala en 21 avo, o Asp en 23avo en una proteina amiloide normal (tipo silvestre) (A??1-40, A??1-42, o A??1-43) que consiste de 40, 42 o 43 aminoacidos.

Description

PROTEINA AMILOIDE VARIANTE CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a una proteína amiloide variante que existe en pacientes con enfermedad de Alzheimer familiar así como a la utilización y desarrollo de dicha proteína amiloide variante.

TÉCNICA ANTECEDENTE Una proteína amiloide es un tipo de lesión de tejido que se observa en tejido cerebral no sólo de pacientes con enfermedad de Alzheimer y síndrome de Down sino también de sujetos con edad normal. La proteína amiloide consiste de 40 a 42 ó 43 aminoácidos ricos en aminoácido hidrofóbico y pueden ser producidos por digestión hidrolítica de una proteína precursora de amiloide (de aquí en adelante referida como APP) que es un precursor de la misma. APP consiste de 695, 751 ó 770 aminoácidos, que es una proteína de membrana de tipo 1 con el dominio de membrana individual, y tiene su amino terminal fuera de la célula. La diferencia en el número de aminoácidos depende de la presencia o ausencia de un sitio activo de inhibidor de proteasa de un denominado tipo Kunitz en la región extracelular. Un componente principal de neurona es APP que consiste de 695 aminoácidos (de aquí en adelante referida como APP695). A su vez, APP que consiste de 770 aminoácidos (de aquí en adelante referida como APP770 de la cual la secuencia de bases de ADNc y secuencia de aminoácidos se muestran como SEQ ID NO 3) incluye una secuencia de aminoácidos (75 aminoácidos de Glu a Lys en la posición 363 de SEQ ID NO 3) que no está incluida en la especie molecular de APP695. APP770 es una especie molecular que tiene la secuencia de aminoácidos idéntica a la de APP695 distinta a la secuencia de aminoácidos de inserción antes identificada. Una isoforma llamada APP751 se conoce además de APP695 y APP770, y esta APP consiste de 751 aminoácidos y carece de 19 aminoácidos (Met en la posición 345 a Lys en la posición 363) de APP770. La secuencia de aminoácidos (56 aminoácidos de Glu en la posición 289 a Ala en la posición 344 en la secuencia de aminoácidos de APP770) insertada tanto en APP751 como APP770 tiene actividad inhibidora de proteasa de tipo Kunitz y se considera que se expresa en células distintas a la neurona. APP695 es una isoforma que se expresa principalmente en la neurona y es una proteína de membrana de tipo 1 capaz de pasar a través de la membrana celular una vez y que tiene un dominio de transmembrana (24 aminoácidos de glicina en la posición 625 a leucina en la posición 648). La proteína amiloide consiste de una especie molecular de proteína más corta que tiene 40 aminoácidos de APP 695 (SEQ ID NO 2) de ácido asparagínico en la posición 597 a valina en la posición 636 que existe fuera de la célula y una especie molecular de proteína más larga que tiene 42 ó 43 aminoácidos que terminan en alanina en la posición 638 o treonina en la posición 639.

La bioactividad de la proteína amiloide ha sido probada experimentalmente y su toxicidad de membrana se considera que es un factor clave para el inicio de la enfermedad de Alzheímer (documentos que no son patente 1 y 2). Para producir la proteína amiloide a partir de APP, se necesitan reacciones importantes de dos etapas. En la primera etapa, el amino terminal de la proteína amiloide es separado por digestión de APP por ß secretasa. En la segunda etapa, el carboxilo terminal de la proteína amiloide es digerida por ? secretasa, causando así la disociación de la proteína amiloide y el fragmento citoplásmico de APP. De conformidad con los hallazgos convencionales, se ha considerado que la digestión de segunda etapa ocurre en la posición gamma (?) que es el carboxilo terminal de la proteína amiloide (entre Val en la posición 711 e He en la posición 712, entre Ala en la posición 713 y Thr en la posición 714, o entre Thr en la posición 714 y Val en la posición 715 de APP770 de SEQ ID NO 3); sin embargo, se ha reportado recientemente que la digestión de segunda etapa ocurre en la posición épsilon (e)(entre Thr en la posición 719 y Leu en la posición 720 o entre Leu en la posición 720 y Val en la posición 721 de APP770 de SEQ ID NO 3) que está cerca del citoplasma y hacia el extremo 5' del residuo de aminoácido 5 po 10 aminoácidos (en la dirección carboxilo terminal). La lesión neuronal intracerebral de la enfermedad de Alzheimer ocurre en anticipación de síntomas anormales clínicos tales como desorientación, declinación de memoria, amnesia, declinación en intelecto, y trastorno del comportamiento. La lesión neuronal incluye deposición de proteína, alteración fibrilar neural, y disfunción celular, y la deposición de proteína amiloide es la reacción patológica inicial. Se considera que la hipótesis de amiloide, en la cual se piensa como hipótesis que la producción y deposición de proteína amiloide son las causas de la enfermedad de Alzheimer, es importante entender el progreso de la enfermedad de Alzheimer, y una de las base para la importancia se encuentra en el estudio de la enfermedad de Alzheimer familiar. El concepto de que la ? secretasa es un producto génico de presenilina 1 (Documento que no es patente 3) y presenilina 2 (documentos que no son patente 4 y 5) presentes en el cromosoma 14, que se han descubierto que son los genes responsables para la enfermedad de Alzheimer familiar de inicio temprano, ha sido aceptado ampliamente; sin embargo, no se ha completado este concepto. Puesto que APP también es un gen responsable de la enfermedad de Alzheimer familiar de inicio temprano (documento que no es patente 6), se ha demostrado que muchos factores están involucrados en la etiología de la enfermedad de Alzheimer que es un tipo de demencia. Como se describe en lo anterior, la proteína amiloide consiste de dos componentes. Uno de ellos es el componente de proteína amiloide más corta (de aquí en adelante referida como Aß1-40) empezando a partir de ácido asparagínico para terminar en valina en la posición 40, y los otros es el componente de proteína amiloide más largo que consiste de 42 ó 43 aminoácidos empezando a partir de ácido asparagínico (el mismo que Aß1 -40 que consiste de 40 aminoácidos) y es más largo que Aß1 -40 por aminoácidos de dos o tres residuos para terminar en Ala en la posición 42 o Thr en la posición 43 (de aquí en adelante referida como Aß1 -42 o Aß1-43, o colectivamente Aß1 -42/43). En los componentes más largos, Aß1-42 es más alto en propiedad hidrofóbica y más insoluble. Una fibrilla amiloide similar a fibra que tiene un diámetro de 5 a 6 nm está formada del componente más largo y el componente más corto en donde el componente más largo sirve como un núcleo y el componente más corto está unido al núcleo. Se ha demostrado que la producción de Aß1 -42/43 que es la proteína amiloide más larga se incrementa cuando una variante de gen está presente en presenilina 1 o presenilina 2. Se considera que el componente de proteína amiloide más largo que se considera que es un determinante de un valor de umbral para la polimerización de proteína amiloide se forma en gran cantidad debido a este efecto variante, acelerando así la reacción etiológica. Muchas variantes de mutación se han identificado en APP, y las variantes típicas generalmente se clasifican en variante sueca (Met670Asn, Lys671 Leu de conformidad con la numeración de aminoácidos de APP770; lo mismo se aplica a las siguientes variantes) precediendo al amino terminal de la proteína amiloide, variante holandesa (Glu693Gln), variante de Londres (Val717lle), y variante de Australia (Leu723Pro). La producción de los dos componentes de proteína amiloide se incrementa en la variante sueca, y sólo la producción de Aß1 -42/43 se incrementa en la variante de Londres y la variante de Australia. La importancia de la variante holandesa está a la mitad de la discusión, y aún no se ha sacado una conclusión. E4 se conoce como un alelo de factor de riesgo de apolipoproteína E. Se ha probado estadísticamente que el inicio de la enfermedad de Alzheimer es adelantado por 8 a 10 años en el caso en donde sólo uno de los alelos del cromosoma es E4 o por 16 a 20 años en el caso en donde los dos alelos del cromosoma son E4 (documento que no es patente 7). Se considera que la inhibición de la actividad de ß secretasa y ? secretasa suprime la producción de proteína amiloide y se puede usar como un fármaco terapéutico para detener o retardar el progreso de la enfermedad de Alzheimer. Una reacción de a secretasa ocurre además de la reacción de ß secretasa en la primera etapa de hidrólisis de APP, y la reacción de la ? secretasa ocurre en las segundas etapas de la reacción de la a secretasa y la reacció de la ß secretasa; por lo tanto, se espera un efecto de espectro más amplio de la reacción de la ? secretasa. Aunque una última conclusión para la identificación de la ? secretasa no se ha obtenido aún, se ha probado que presenilina 1 tiene la función importante. De conformidad con experimentos de animales y experimentos en células cultivadas de las cuales la acción de la presenilina 1 es inactivada, se reporta que se producen anormalidades en la generación de nervio cerebral, formación de la columna vertebral, o generación de células linfáticas. Es decir, la presenilina 1 tiene varios efectos distintos a los de la proteína amiloide. Es necesario considerar que la supresión de actividad no específica de la ? secretasa puede inducir una reacción adversa severa tal como inducción de transformación maligna (documento que no es patente 8). A su vez, se ha sugerido que los fármacos antiinflamatorios no esteroideos epidemiológicamente tienen un efecto anti-demencia, y se ha probado que los fármacos antiinflamatorios no esteroideos selectivamente inhiben las producciones de Aß1 -42/43 (documentos que no son patente 9 y 10) y tienen una función de Rho cinasa (documento que no es patente 11 ), volviéndose así un candidato importante de fármaco anti-demencia. Sin embargo, las concentraciones en uso y similares aún requieren examinación. Aunque la terapia de vacuna (documento que no es patente 12) usando un péptido sintético Aß1-42 como un antígeno se ha estudiado como un método de tratamiento prometedor, una reacción adversa de causar una encefalitis severa se ha indicado como un efecto colateral (documento que no es patente 13). En relación con la terapia de vacuna, la terapia de vacuna indirecta o la inmunoterapia indirecta usando un anticuerpo anti-amiloide (documento que no es patente 14) ha atraído la atención, pero requieren examinación adicional desde el punto de vista clínico. Se ha indicado que el efecto adverso de la terapia de vacuna puede reducirse al cambiar la posición de antígeno de la proteína amiloide usada como el antígeno al amino terminal del Aß4-10, induciendo el antígeno de isotipo lgG2b, inmunización de intestino a través de administración oral, o similar, pero dichos métodos no han sido confirmados como medidas de alivio.

Lista de documentos que no son patente 1. Yankner, B.A. et al., Neurotoxicity of a fragment of the amyloid precursor associated with Alzheimer's disease. (1989) Science. 245(4916): 417-20. 2. Yankner, B.A., Neurotrophic and neurotoxic effects of amyloid beta protein: reversal by tachykinin neuropeptides. (1990) Science. 1990 250(4978): 279-82. 3. Sherrington, R. et al., Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. (1995) Nature, 375(6534), 754-760. 4. Levy-Lahad, E. et al., Candidate gene for the chromosome 1 familial Alzheimer's disease locus. (1995) Science, 269(5226), 973-977. 5. Rogaev, E.l. et-al. Familial Alzheimer's disease in kindreds with missense mutations in a gene on chromosome 1 related to the Alzheimer's disease type 3 gene. (1995) Nature 376(6543), 775-778. 6. Goate, A. et al., Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer's disease. (1991 ) Nature, 349(6311 ), 704-6. 7. Corder, E.H. et al., Gene dose of apolipoprotein E type 4 alíele and the risk of Alzheimer's disease in late onset families. (1993) Science. 261 (5123): 921 -3. 8. Hardy, J. and Israel, A. Alzheimer's disease. In search of gamma-secretase. (1999) Nature. 398(6727), 466-7. 9. Lim, G.P. et al., Ibuprofen suppresses plaque pathology and inflammation in a mouse model for Alzheimer's disease. (2000) J Neurosci 20 : 5709-14. 10. Weggen, S. et al., A subset of NSAIDs lower amiloidgenic Abeta42 indipendently of cyclooxygenase activity. (2001 ) Nature 414 : 212-6. 11. Zhou, Y. et al., Nonsteroidal anti-inflammatory drugs can lower amyloidogenic Aß42 by inhibiting Rho. (2003) Science 302 : 1215-7. 12. Schenk, D., et al. Immunization with amyloid b-attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse. (1999) Nature. 400, 173-6. 13. Nicoll, J.A.R. et al., Neuropathology of human Alzheimer disease after immunization with amyloid-peptide: a case report. (2003) Nature Med. 9: 448-452. 14. DeMattos et al. (2002) Science295: 2264-7.; Pfeifer, M. et al. Cerebral hemorrhage after passive anti-Aß immunotherapy. (2002) Science 298: 1379.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se ha logrado en vista de los problemas anteriormente descritos de las tecnologías convencionales, y un objeto de la misma es proveer una proteína amiloide novedosa (proteína amiloide variante humana) útil como una molécula de antígeno y similar para mejorar la terapia de vacuna. Otro objeto de esta invención es proveer una medición de diagnóstico para enfermedades amiloides usando la proteína amiloide variante anterior y materiales genéticos que codifican la proteína amiloide variante y un material para la medición de diagnóstico. Otro objeto más de esta invención es proveer un método para determinar selectivamente un componente de agente terapéutico efectivo para las enfermedades amiloides basadas en el mecanismo de producción de la proteína amiloide variante. Otro objeto más de esta invención es proveer un fármaco para enfermedad anti-amiloide usando la proteína amiloide variante o el material genético de la misma. Esta invención provee las siguientes invenciones para resolver los problemas antes descritos. Una primera invención es una proteína amiloide variante, que, en SEQ ID NO. 2, consiste de la secuencia de aminoácidos de: (1 ) 39 aminoácidos con deleción de Glu en 618avo en presencia de 597avo a 636avo; (2) 41 aminoácidos con deleción de Glu en 618avo en presencia de 597avo a 638avo; (3) 42 aminoácidos con deleción de Glu en la posición 618avo en presencia de 597avo a 639avo; (4) 39 aminoácidos con deleción de Ala en 617avo en presencia de 597avo a 636avo; (5) 41 aminoácidos con deleción de Ala en 617avo en presencia de 597avo a 638avo; (6) 42 aminoácidos con deleción de Ala en 617avo en presencia de 597avo a 639avo; (7) 39 aminoácidos con deleción de Asp en 619avo en presencia de 597avo a 636avo; (8) 41 aminoácidos con deleción de Asp en 619avo en presencia de 597avo a 638avo; o (9) 42 aminoácidos con deleción de Asp en 619avo en presencia de 597avo a 639avo. De manera más específica, la proteína amiloide variante de la primera invención es una proteína con deleción de Glu en 22avo, Ala en 21 avo, o Asp en 23avo en la proteína amiloide normal (tipo silvestre) que consiste de 40, 42 ó 43 aminoácidos (Aß1 -40, Aß1-42, Aß1-43). En la siguiente descripción, las proteínas amiloides variantes que consisten de las secuencias de aminoácidos (1 ) a (9) algunas veces se refieren como sigue: (1 ) Aß1-40 (?22E), (2) Aß1-42 (?22E), (3) Aß1-43 (?22E), (4) Aß1-40 (?21A), (5) Aß1-42 (?21A), (6) Aß1-43 (?21A), (7) Aß1-40 (?23D), (8) Aß1-42 (?23D), (9) Aß1-43 (?23D). Nótese que las proteínas amiloides variantes (Aß1-40 (?22E), Aß1 -42 (?22E), Aß1-43 (?22E)) son proteínas amiloides variantes de deleción que los inventores aislados e identificados de pacientes con enfermedad de Alzheimer familiar. Las proteínas amiloides variantes de las secuencias de aminoácidos (4) a (9) se suponen con alta probabilidad de tener una función similar a las proteínas amiloides variantes de las secuencias de aminoácidos (1 ) a (3). De manera más específica, por un análisis de estructura de una proteína amiloide de tipo normal o de tipo silvestre con el uso de un programa de predicción de estructura de proteína existente (por ejemplo, un programa de predicción de segunda estructura de proteína incluido en Chou-Fasman 2nd Structure Prediction Program: GENETXY versión 8.1.8, producto de GENETXY Co., Tokio), se confirma que dos a hélices compartidas por una estructura helicoidal irregular en aproximadamente el 7o aminoácido existe en el 1 er a 25avo aminoácidos y que una estructura ß existe en una región del 30avo aminoácido al carboxilo terminal. Es decir, la estructura de la proteína amiloide normal o de tipo silvestre es "hélice a - hélice a - estructura ß". A su vez, por análisis de la variante holandesa (Glu693Gln) que es la proteína amiloide variante conocida y las proteínas amiloides variantes (Aß1 -40 (?22E), Aß1-42 (?22E), Aß1 -43 (?22E)) de esta ¡nvención que consiste de las secuencias de aminoácidos (1 ) a (3) de la misma manera como se describió antes, se confirma que una estructura de estas proteínas amiloides variantes es "hélice a - estructura ß - estructura ß". Por lo tanto, las proteínas amiloides variantes de esta invención se caracterizan porque tiene la estructura de "hélice a - estructura ß - estructura ß", y la proteína amíloide variante (?21A o ?23D) de la cual el residuo de aminoácido (Ala o Asp) que precede o sigue a Glu en la posición 22 es deletado tiene la estructura de "hélice a - estructura ß - estructura ß". Este hecho es aparentemente diferente del hecho de que una estructura de una proteína amiloide variante de la cual un aminoácido que precede o sigue secundariamente a Glu en la posición 22 (Phe y Val) tiene la estructura "hélice a - hélice a - estructura ß) misma que la de la proteína amiloide normal (tipo silvestre). Nótese que la proteína amiloide variante de la primera invención incluye proteínas de las cuales uno o más residuos de aminoácidos en el N-terminal o C-terminal son deletados siempre que sus actividades características (por ejemplo, toxicidad y propiedad de aglutinación menores que las de la proteína amiloide de tipo silvestre) no son inactivadas. Como se describió en lo anterior, la proteína amiloide variante de la primera invención incluye las natural proteínas amíloides variantes Aß1 -40 (?22E), Aß1-42 (?22E), y Aß1-43 (?22E) que existen en pacientes con enfermedad de Alzheimer familiar y las proteínas amiloides variantes no naturales Aß1-40 (?21A), Aß1-42 (?21A), Aß1-43 (?21A), Aß1-40 (?23D), Aß1-42 (?23D), y Aß1 -43 (?23D) que tienen la función idéntica a la de las proteínas naturales. También, como se usa aquí, el término "no natural" significa que la proteína no ha sido aislada e identificada de un paciente, y hay una probabilidad de la existencia de una natural proteína amiloide de la cual Ala en la posición 21 o Asp en la posición 23 es deletada se confirmará a través de la examinación de un buen número de pacientes. Una segunda invención es un péptido que es una parte de la proteína amiloide variante humana de la primera invención, que comprende de 5 a 28 aminoácidos que preceden y siguen al residuo de aminoácido deletado en SEQ ID NO 2. Una tercera invención es un gen humano (de aquí en adelante referida como gen de APP variante o gen de APP variante de deleción en algunos cases) que codifica una proteína precursora de amiloide variante para la proteína amiloide variante humana de la primera invención. Una cuarta invención es un ARNm, que es un producto de transcripción del gen humano de la tercera invención. Una quinta invención es un ADNc sintetizado a partir del ARNm de la cuarta invención, que consiste de la secuencia de bases de SEQ ID NO 1 con deleción de bases en 1852avo a 1854avo. Una sexta invención es un anticuerpo que reconoce específicamente la proteína amiloide variante humana de la primera invención. Una séptima invención es un anticuerpo preparado usando un oligómero de la proteína amiloide variante humana de la primera invención como un antígeno y que reconoce específicamente una proteína amiloide oligomérica. Una octava invención es un método de diagnóstico de enfermedades amiloides, que comprende detectar una existencia de la proteína amiloide humana de la primera invención. Una novena invención es un método de diagnóstico de enfermedades amiloides, que comprende detectar una existencia del gen humano de la tercera invención o el ARNm de la cuarta invención.

Una décima invención es una célula que expresa el gen humano de la tercera ¡nvención. Una onceava invención es un animal no humano que tiene in vivo la proteína amiloide variante de la primera invención, y un tejido y una célula derivados del animal no humano. Una doceava invención es un método para determinar selectivamente un componente de agente terapéutico para las enfermedades amiloides, que comprende poner en contacto la célula o el animal no humano de la décima invención, el tejido, o la célula derivada del animal no humano de la onceava invención con una sustancia de prueba, y medir el comportamiento y actividad de una proteína amiloide variante humana en la célula o el tejido. Una treceava invención es un fármaco para enfermedad anti-amiloide que contiene la proteína amiloide variante de la primera invención. Una catorceava invención es un fármaco para enfermedad anti-amiloide que contiene el péptido de la segunda ¡nvención. Una quinceava invención es un fármaco para enfermedad anti-amiloide que contiene el ADNc de la quinta invención. Una dieciseisava invención es un fármaco para enfermedad anti-amiloide que contiene el anticuerpo de la sexta invención o la séptima invención. En esta invención, es posible comparar el gen de APP variante de deleción y un fragmento del mismo con la APP de tipo silvestre convencional o la APP variante familiar reportada. Como resultado, se espera que el nuevo mecanismo molecular, acción y efecto que contribuyen al esclarecimiento del metabolismo de la proteína amiloide ayuden a dilucidar la patología. También, en esta invención, es posible usar un gen y animal novedosos usando el gen de APP variante de deleción y el fragmento del mismo para una determinación selectiva del fármaco y compuesto novedosos. También, en esta invención, el uso de 39 aminoácidos que comprenden la proteína amiloide de longitud completa variante de deleción Aß1-40 (?22E), Aß1-40 (?21A), o Aß1-40 (?23D), 41 aminoácidos que comprenden la proteína amiloide de longitud completa variante de deleción Aß1-42 (?22E), Aß1-42 (?21A), o Aß1-42 (?23D), o 42 aminoácidos que comprenden proteína amiloide de longitud completa variante de deleción Aß1 -43 (?22E), Aß1-43 (?21A), o Aß1-43 (?23D) es ventajosa para comparar un efecto de variante de deleción de la misma con la información de la proteína amiloide de tipo silvestre reportada. También, en esta invención, la patología de la demencia se espera que sea inducida ya que la variante ha sido identificada en pacientes con enfermedad de Alzheimer familiar, y se supone que la porción de Aß29-40 dentro de la membrana o el ADNc o el péptido que tiene una secuencia parcial de la cual Aß29-42/43 es excluida se usa para enfatizar sobre un efecto de variante. También, es posible concebir un material modificado al inducir un cambio en propiedad hidrofílica a través de la modificación del grupo disociado para el propósito de mejorar la barrera de vaso sanguíneo-cerebro o estabilidad molecular. La proteína amiloide variante o el material modificado de la misma es un producto de degeneración de la APP variante de deleción, y una propiedad de aglutinación de proteína considerablemente reducida de la misma que no se conocía se confirmó. Como se usa aquí, cada uno de "proteína" y "péptido" significa una molécula que consiste de muchos residuos de aminoácido que son unidos mediante unión de péptido. Además, como se usa aquí, "enfermedad por amiloide" significa enfermedades, tales como enfermedad de Alzheimer y síndrome de Down, en las cuales la proteína amiloide participa directamente o indirectamente como etiología o con la cual se sospecha esa participación y enfermedades en las cuales la proteína amiloide se observa en lesión neuronal. Como se usa aquí, "diagnóstico" significa un juicio de si un examinador sufre o no de la enfermedad por amiloide, un juicio de si hay o no un riesgo de padecer la enfermedad por amiloide en el futuro, y un juicio de si hay o no un riesgo de recurrencia de la enfermedad por amiloide después del tratamiento. También, el diagnóstico incluye una medición de un grado de cada enfermedad por amiloide y el riesgo. Otros términos y conceptos en esta invención se definirán con detalle en la descripción de modalidades y ejemplos. Nótese que los términos son de conformidad con la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB o basados en los términos usados idiomáticamente en la técnica.

También, varias tecnologías usadas para poner en práctica la invención distinta a las tecnologías cuyas fuentes se nombran aquí pueden ser puestas en práctica por un experto en la técnica sin fallar con base en publicaciones conocidas y similares. Por ejemplo, las tecnologías en el campo de la biogenética y la biología molecular son puestas en práctica por los métodos descritos o los otros métodos descritos en las publicaciones citada en J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, "Molecular Cloning: A laboratory manual (2a edición)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2a ed., Vol. 1 a 4, (la serie de enfoque práctico), IRL Press, Oxford University Press (1995); Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N. Y., 1995; Nihon Seikagakukai ed., "Zoku Seikagaku Jikken Koza 1 , Idensi Kenkyuho II", Tokyo Kagaku Dojin (1986); Nihon Seikagakukai ed., "Shin Seikagaku Jikken Koza 2, Kakusan lll (Kumikae DNA Gijutsu)", Tokyo Kagaku Dojin (1992); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68 (ADN recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology" Vol. 100 (Recombinant DNA, Part B) y 101 (Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology" Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987); y similares o por métodos que son sustancialmente los mismos que aquellos descritos anteriormente y métodos modificados de los mismos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un resultado de análisis de masa de una proteína amiloide variante secretada de una proteína precursora variante de amiloide. La figura 2 es un resultado de una prueba de puntos conducida para evaluar antigenicidad de proteína amiloide variante. La figura 3 es un resultado de una prueba de puntos conducida para evaluar antigenicidad de la proteína amiloide variante sobre la proteína amiloide variante y una proteína amiloide de tipo silvestre. La figura 4 es un resultado de precipitación inmune conducida para evaluar especificidad de un anticuerpo anti-proteína amiloide variante. La figura 5 es un resultado de inmunocitoquímica con el anticuerpo anti-proteína amiloide variante. Las figuras 6A-6B son un resultado de una doble tinción de tejido inmune fluorescente conducido para examinar una relación entre una proteína amiloide variante usando el anticuerpo anti-proteína amiloide variante y una reacción neuroinmune.

MEJOR MODO PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN Es posible aislar y generar proteínas amiloides variantes de esta invención como una proteína natural Aß1 -40 (?22E), Aß1 -42 (?22E), o Aß1 -43 (?22E), por ejemplo, de una célula de un paciente con enfermedad de Alzheimer familiar. Es posible obtener proteínas amiloides variantes no naturales Aß1-40 (?21A), Aß1-42 (?21A), Aß1-43 (?21A), Aß1-40 (?23D), Aß1-42 (?23D), y Aß1-43 (?23D) también conocidas por un método de síntesis de péptido conocido. Puesto que los materiales para la síntesis y métodos usados en los pasos realizados en la síntesis son bien conocidos, el experto en la técnica puede producir la proteína amiloide variante deseada según se requiera al realizar apropiadamente síntesis, aislamiento, purificación y similares. También, es posible producir las proteínas amiloides variantes de esta invención por una tecnología recombinante de genes usando hospederos conocidos tales como E. coli, levadura, Bacillus subtilis, una célula de insecto, una célula animal, y una célula vegetal. Se puede conducir una síntesis química de conformidad con los ejemplos descritos más adelante en esta especificación, por ejemplo, pero es posible utilizar cualquier método siempre que un gen deseado y péptido o un compuesto del mismo sean obtenidos por el método. Por ejemplo, es posible combinar métodos bien conocidos tales como la reacción para producir Boc (t-butiloxicarbonilo), la oxidación con DMSO, la reacción alcalina, la reacción acida, la reacción de epoxidación, la cromatografía sobre gel de sílice, la reacción de alquilación, la reacción de saponificación, la reacción de calentamiento, la reacción de descarboxilación, la reacción de condensación, la cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase inversa, y similares. También, se puede realizar un método en donde los residuos de aminoácido que constituyen la proteína amiloide variante secuencialmente se hacen reaccionar con evaluación de la eficiencia y pureza del producto de reacción según se requiera. Además, el péptido sintetizado puede ser alterado a una temperatura ordinaria a alta temperatura, por congelamiento y descongelamiento, o similar durante un período deseado. De manera más específica, el método se puede realizar de conformidad con Merrifield, R. B. J. Solid phase peptide synthesis I. The synthesis of tetrapeptide. J. Amer, Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963; Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach. Chan, W. C. y White, P. D., Oxford University Press, 2000. Las proteínas amiloides variantes de esta ¡nvención pueden incluir una modificación para promover síntesis y purificación, modificación para promover estabilidad física y química, modificación para activar estabilidad e inestabilidad al metabolismo in vivo, acondicionamiento, y similares, y modificación de control para causar un incremento y una reducción en eficiencia de suministro de trans-órgano incluyendo el tránsito en la barrera vaso sanguíneo-cerebro. Ejemplos de la modificación de control incluyen una secuencia que consiste de 11 aminoácidos de Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg (SEQ ID NO 4) (Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A. & Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: Delivery of a biologically active protein into the mouse, Science 285: 1569-1572). Al incluir la secuencia de control que es enlazada por el enlace peptídico en el N-terminal, es posible facilitar el tránsito de la proteína amiloide variante a través de la barrera hematocerebral para alcanzar un sitio objetivo del cerebro a una eficiencia mejorada.

Otros ejemplos de la modificación de las proteínas amiloides variantes de esta invención incluyen adición de aminoácido a proteína mediada por ARN de transferencia, tal como acetilación, acilación, ribosilación de ADP, amidación, enlace covalente de flavina, enlace covalente de la porción hem, enlace covalente de nucleótido o derivado de nucleótido, enlace covalente de lípido o derivado de lípido, enlace covalente de fosfatidilinositol, entrelazamiento, ciclización, enlace de disulfuro, desmetilación, formación de enlace covalente de de entrelazamiento, formación de cistina, formación de pirogultamato, formilación, gamma-carboxilación, glicosilación, formación de anclaje de GPl, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento de hidrólisis de proteína, fosforilación, prenilación, racemización, enlace de lípidos, sulfatación, selenoilación, y arginilación; ubiquinación; y similares. Además, es técnicamente fácil añadir, cambiar y convertir una estructura para el propósito de facilitar detección o purificación de la proteína amiloide variante de esta invención o el anticuerpo preparado usando la proteína amiloide variante como un inmunógeno o para el propósito de añadir otra función, y dichos productos son abarcados por el alcance de esta invención. Además, un fragmento Fc de globina inmune tal como FLAG-etiqueta, ß galactosidasa, alcalifosfatasa, e IgG y productos tales como GFP obtenidos por un método biogenético son abarcados por el alcance de esta invención como la adición de modificación. Es posible crear el anticuerpo de la sexta invención al seleccionar la proteína amiloide variante de esta ¡nvención, su material modificado, o su material degenerado (péptido parcial o similar) y usando el material seleccionado como un antígeno. El péptido parcial comprende 20 o menos residuos de aminoácidos, preferiblemente menos residuos de aminoácidos tales como, por ejemplo, 5 residuos de aminoácidos. Los antígenos se pueden usar en combinación para crear el anticuerpo. El antígeno no es necesariamente la proteína amiloide variante de esta invención, el material, o el material degenerado como tal y puede ser una proteína que tiene una secuencia primaria cerca del sitio variante de deleción de la APP variante expuesta al exterior de la conformación. También, a fin de crear el anticuerpo inmunoespecífico para la proteína amiloide variante de esta invención, es preferible usar un compuesto que contiene la secuencia de aminoácidos anteriormente descrita de la estructura cerca de la variante de deleción. Dichos anticuerpos no están particularmente limitados siempre que se unan inmunológicamente al sitio o reconozcan el sitio. La unión o capacidad del reconocimiento del anticuerpo se decide con base en una reacción de antígeno-anticuerpo conocida. Como se usa aquí, "inmunoespecífico" significa que la afinidad al compuesto es sustancialmente mayor que la de las proteínas o compuestos relacionados en la técnica. La producción del anticuerpo se pone en práctica realizando inducción inmune que tiene respuesta humoral o respuesta celular al antígeno usando, como el antígeno, la proteína amiloide variante de esta invención, el material modificado de la misma, o el material de degeneración de la misma solo o en un estado de ser unido a un vehículo en presencia o ausencia de un adyuvante. Es posible crear el anticuerpo de la séptima invención al crear un oligómero a partir de un péptido obtenido por síntesis orgánica de la proteína amiloide variante y después usando la proteína amiloide variante oligomérica como el antígeno. Este anticuerpo tiene características novedosas y útiles que no reconoce proteínas amiloides monoméricas tanto variantes como de tipo silvestre tales como proteína amiloide fibrilar formando placa senil, pero específicamente reconoce las proteínas amiloides oligoméricas de tipo silvestre y variantes. De manera más específica, la creación del anticuerpo es implementada inmunizando a un ratón al inyectar una suspensión de la proteína amiloide con adyuvante completo de Freund, seguido por inyección de una suspensión de la proteína amiloide con adyuvante incompleto de Freund después de un mes, y después repitiendo la misma operación de inmunización después de 7 días. También, es posible crear anticuerpo mediante inducción de inmunidad a través de estimulación inmune de una célula linfática o una célula precursora de la misma bajo la condición de cultivo. El vehículo no está particularmente limitado siempre que no cause efecto adverso sobre el hospedero, y ejemplos del mismo incluyen pero no se limitan a celulosa, una solución normal, solución salina normal reguladora de pH, dextrosa, agua, glicerol, etanol, aminoácido polimerizado, albúmina, una mezcla de los mismos y similares. Como el animal que ha de ser inmunizado, se usa adecuadamente un ratón, una rata, un conejo, una cabra, un caballo, una vaca y similares. Un anticuerpo policlonal se puede obtener como un suero o un método conocido o por un método de recuperación de anticuerpo del suero. Un método preferible puede ser una cromatografía de afinidad inmune. La producción de un anticuerpo monoclonal se realiza de tal manera que un tejido (del vaso o nodo linfático, por ejemplo,) o una célula cultivada que contiene actividad de anticuerpo es recuperada el animal al que se induce inmunidad, y después introduciendo un transformante en una célula permanentemente proliferativa conocida (cepa de mieloma como por ejemplo, P3X63Ag8). Por ejemplo, un hibridoma creado a partir de la célula productora de anticuerpos y la célula permanentemente proliferativa es sometido a clonación y después un hibridoma que produce el anticuerpo que reconoce específicamente la proteína amiloide variante de conformidad con esta invención se selecciona para recolectar el anticuerpo de un medio de cultivo del fibridoma. Ejemplos prácticos incluyen los métodos descritos en el método de hibridoma (Kohier G. y Milstein C. (1975) Nature 256, 495-497, el método de trioma (Kozbor et al. Immunology Today (1983) 4:72), y el método de EBV (Colé et al. Monoclonal antibodies and cáncer therapy Alan R. Liss, Inc., (1985):77-96), y algunos otros métodos. Es posible usar el anticuerpo para identificación, detección y cuantificación de las proteínas amiloides variantes de esta invención o para preparación y purificación de las proteínas amiloides variantes a través de la cromatografía de afinidad y similares. Es posible modificar el anticuerpo en un anticuerpo humano utilizando un método conocido. De manera más específica, el anticuerpo que muestra actividad de incrementar la actividad de la proteína amiloide variante de ésta invención entre anticuerpos específicos de las proteínas amiloides variantes de ésta invención es útil como un calibrador para un compuesto que ha de ser sometido a determinación selectiva de un fármaco inhibidor de generación de proteína amiloide o como un medio de determinación selectiva. Ejemplos de pruebas que usan los anticuerpos para las proteínas amiloides variantes de ésta invención incluyen los radio inmune ensayos, el ensayo de unión competitiva, la cromatografía de líquidos de alto rendimiento, el análisis de Western blot, el ensayo de ELISA y una combinación de los mismos. La octava invención y la novena invención son métodos de diagnóstico de enfermedad por amiloide caracterizados por la medición de un producto de expresión de un gen de proteína amiloide variante humano de la primera ¡nvención. Es decir, la proteína amiloide variante de esa ¡nvención es una proteína causante aislada e identificada del paciente con enfermedad de Alzheimer familiar, y es posible diagnosticar las enfermedades por amiloide tales como la enfermedad de Alzheimer a través de la medición de abundancia de la proteína amiloide variante. Además, en el caso en donde la proteína amiloide variante de esta invención se administra exógenamente, es posible medir la abundancia de la misma.

En el caso en donde un ARNm es el producto de expresión, es posible conducir la medición al realizar hibridación de zona cuantitativa o mediante el uso de una micro disposición. Como un método de hibridación que usa una sonda de ADN estándar, es posible utilizar el método de sonda de oligonucleótidos específico de alelo, el ensayo de ligación de oligonucleótido, el método invasor y métodos conocidos similares. También, es posible medir la cantidad de ARNm por RT-PCR cuantitativa usando un ARNm aislado de una muestra examinada como una plantilla. Además, en el caso en donde la proteína amiloide variante es el producto de expresión de gen, es preferible usar el anticuerpo de la sexta invención. Particularmente, el uso de un anticuerpo marcado hace posible lograr la detección con conveniencia y alta precisión. Una enzima, radioisótopo o un fluorocromo se puede usar para enmarcar. La enzima no está particularmente limitada siempre que satisfaga las condiciones tales como tener un número de recambio grande, ser estable cuando se une al anticuerpo, y teñir específicamente la matriz, y aquellas ordinariamente usadas para ElA, tales como peroxidasa, ß-galactosidasa, alcalifosfatasa, glucosa oxidasa, acetilcolinesterasa, deshidrogenasa glucosa-6-fosforilada, y similares se pueden usar como la enzima. También, se puede usar un inhibidor de enzima, co-enzima, y similar. La reunión de la enzima al anticuerpo se puede realizar utilizando un método conocido que usa un agente entrelazador tal como un compuesto de maleimida o similar. Como la matriz, se puede usar una sustancia conocida dependiendo del tipo de la enzima que se ha de usar. Por ejemplo, se usa 3,3'5,5'-tetrametilbencidina en el caso de usar peroxidasa como la enzima o paramitrogenol o similar se usa en el caso de usar alcalifosfatasa como la enzima. Como el radioisótopo, se pueden usar aquellos usados en RÍA ordinario, tales como 125l y 3H. Como el fluorocromo, se pueden usar aquellos usados en método de anticuerpo fluorescente ordinario, tales como isoticianato de fluorescencia (FITC) e isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC). En el caso de usar la enzima, una matriz capaz de colorearse por degeneración a través de un defecto enzimático se añade; la actividad de la enzima se determina por medición óptica de una cantidad de degeneración de la matriz; la actividad de la enzima es convertida a una cantidad de anticuerpo unida; y una cantidad de anticuerpo se calcula a través de la comparación con un valor estable. En el caso de usar el radio isótopo, una cantidad de radiación generada desde el isótopo radioactivo se mide mediante un contador de escintilación o similar. En el caso de usar el fluorocromo, una cantidad de fluorescencia se mide usando un dispositivo de medición combinado con un microscopio de fluorescencia. También, es posible realizar la medición usando un citómetro de flujo. Además, un método de intercalado (el método de ELISA cuando se una enzima para mareaje) que usa un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario marcado se puede usar preferiblemente. De aquí en adelante, se describirá la célula de la décima invención y el animal de la onceava invención. Es posible crear el animal o la célula por un método de inyectar la solución de proteína amiloide variante a un animal, un método de administrar una sustancia obtenida por un coloide de metal y la proteína amiloide variante a un animal, un método de introducir el gen APP variante de la segunda invención o el ADNc del mismo en un animal o una célula de acuerdo con la terapia génica usando un vector de retrovirus o un vector de adenovirus, un método de fosfato de calcio, un método para usar un liposoma o un fantasma de glóbulos rojos, un método de electropolación, un método de introducir la proteína amiloide variante o el péptido de la misma en una célula mediante un método de micro inyección usando una pipeta de vidrio, y similares. Además, es posible crear en animal y la célula de conformidad con un método de creación animal transgénico conocido (Proc. Nati. Acad. Sel. USA 77; 7380-7384, 1980). De manera más específica, es posible crear un animal transgénico deseado al introducir el gen APP variante de la segunda invención de una célula totipotencial de un animal no humano (preferiblemente un ratón o una rata) para generar un material sólido a partir de la célula y después seleccionar el material sólido en el cual el gen APP variante se incorpora en un genoma de una célula somática. Como el método de introducción de gen en la célula totipotencial, una inyección física de un ADN de gen exógeno (método de microinyección) es óptimo en vista de una eficiencia de producción de animal transgénico sólido y una eficiencia de transferencia del gen introducido a la siguiente generación. Un óvulo fertilizado en el cual el gen se inyectó es transplantado en una trompa de falopio de un progenitor adoptivo, y después un animal que nace como un individuo es llevado junto al progenitor adoptivo, seguido por extracción de un ADN a partir de una parte del cuerpo (punta de la cola o similar). Después de eso, se realiza análisis de Southern blot o un ensayo de PCR para confirmar la existencia de un gen exógeno en el ADN extraído. Un animal heterocigótico primario en el cual el gen exógeno es introducido en uno de los cromosomas diploides se obtienen como se describió antes, y es posible obtener un animal homocigótico al aparearse los animales heterocigóticos. El animal transgénico de esa invención ¡ncluye el animal heterocigótico primario, el animal homocigótico obtenido al aparear los animales heterocigóticos descendientes de los mismos y embriones de los mismos. La doceava invención es el método para sondear un componente de agente terapéutico para las enfermedades por amiloide usando la célula o el animal. De manera más específica, una sustancia candidata es llevada a contacto con el animal o la célula, y una cantidad de un producto de expresión (ARNm o una proteína amiloide variante) de un gen APP variante que expresa el tejido del animal (tejido del sistema nervioso central) en la célula con los mismos métodos que aquellos métodos de diagnóstico de la octava y novena invenciones. La sustancia candidata capaz de reducir la cantidad de producto de expresión se usa como el componente de agente terapéutico. También, una sustancia que influye en la actividad de la proteína amiloide variante que expresa en la célula o el tejido animal se determina como el componente de agente terapéutico. La sustancia candidata que ha de ser usada para el método de determinación selectiva incluye un compuesto orgánico o inorgánico (particularmente compuesto de peso molecular bajo), una proteína, un péptido y similar, por ejemplo. De éstas sustancias, las funciones y estructuras pueden ser conocidas o desconocidas. También, una biblioteca química combinatoria es un medio efectivo como un grupo de sustancias candidatas para especificar la sustancia deseada de manera eficiente. La biblioteca química combinatoria es una recopilación de composiciones químicas generadas al combinar varios bloques de construcción química de reactivos y similares por una síntesis química o una síntesis biológica. Por ejemplo, una biblioteca química combinatoria lineal tal como una biblioteca de péptidos se forma al combinar un conjunto de bloques de construcción (aminoácidos) con una longitud de un compuesto dado (el tamaño del péptido) por todos los métodos posibles. Es posible sintetizar varias composiciones químicas a través de la mezcla combinatoria de bloques de construcción químicos. Por ejemplo, la mezcla combinatoria sistémica de 100 bloques de construcción químicos conmutativos da por resultado 100 millones de compuestos tetraméricos o 10 mil millones de compuestos pentaméricos (véase Gallop et al., (1994) 37(9): 1233-1250, por ejemplo). La preparación y determinación selectiva de la biblioteca química combinatoria son bien conocidas en la técnica véase, por ejemplo, patentes de los Estados Unidos Nos. 6,004,617 y 5,985,365. también, es posible usar varias bibliotecas comercialmente disponibles. La décimo tercera a décimo sexta invenciones son fármacos de enfermedad pro-amiloide cada uno de los cuales contiene la proteína amiloide variante, el péptido, el ADNc o el anticuerpo de la invención. Cada uno de los fármacos controla una cantidad de producción de proteína amiloide o una cantidad de acumulación cerebral de la misma para prevenir y tratar las enfermedades así como aliviar los síntomas. De manera más específica, los anticuerpos de la sexta invención y la séptima invención se proveen para resolver problemas de reacción adversa en la terapia inmune indirecta convencional. La proteína amiloide variante, el péptido, o el ADNc funciona como una molécula de oxígeno para producir un anticuerpo efectivo para inhibir o suprimir polimerización de la proteína amiloide de tipo silvestre in vivo. Cada uno de los componentes se formulan por métodos y medios conocidos en la forma que es capaz de ser introducidos en el cuerpo vivo o célula viva. En el caso del ADNc, una forma de fármaco puede ser tal que un vector de expresión en el cual el ADNc está integrado es integrado en nanopartículas gruesas que presentan moléculas de bioreconocimiento o un vector de virus conocido (retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociado), por ejemplo. Mediante la introducción de dicho fármaco al cuerpo vivo mediante un método de terapia génica, es posible expresar la proteína amiloide variante en células vivas. También es posible adoptar un método de terapia génica de inyectar una solución de ADNc en el músculo. Además, a fin de formular la proteína amiloide variante, el péptido, o el anticuerpo en la forma introducible en un cuerpo vivo, es posible mezclar la proteína amiloide variante, el péptido o el anticuerpo con una solución de vehículo que no cambie las estructuras y funciones de los mismos y que es farmacológicamente aceptable. También es posible utilizar un método en donde un órgano o una célula tomada de un cuerpo vivo es sometida a un tratamiento con una proteína o el péptido in Vitro para inducir un carácter deseado y después el órgano o la célula es regresado al cuerpo vivo. También, un método en donde un vector de expresión de ADNc es introducido en un órgano o una célula tomada de un cuerpo vivo y después el órgano o la célula es regresada al cuerpo vivo puede utilizarse como un modo de la terapia. En tal caso, el método de microinyección se puede utilizar para la introducción en la célula, por ejemplo. También, un método de introducción intracelular que usa lípido (BioPORTER (Gene Therapy Systems, E.U.A.), Chariot (Active Motif, E.U.A.), y similares) se puede utilizar. Además, cada uno de los fármacos de la enfermedad anti-amiloide en esta invención se puede formular en una forma apropiada que incremente la eficiencia de transporte de los mismos al tejido cerebral. La proteína amiloide variante, el péptido, el ADNc o el anticuerpo, que son los ingrediente efectivos, se pueden usar solos o en combinación con un material modificado de los mismos o un material degenerado de los mismos. Además, la proteína amiloide variante, el péptido, el ADNc o el anticuerpo se pueden usar concomitantemente con un compuesto que es ventajoso para la terapia. Un modo preferible de una administración sistémica del fármaco de esta invención es la inyección, particularmente inyección intravenosa. También es posible usar otra vía de inyección tal como inyección subcutánea, inyección intramuscular o inyección intraperitoneal. Otros medios para la administración sistémica es una administración de transmucosa o transdérmica que usa un agente de penetración tal como una sal de ácido biliar y ácido suprarenal y otros agentes tensioactivos. Además, cuando una formulación entérica o una formulación de cápsula se hace de manera exitosa, es posible una administración oral. La administración de las composiciones de fármaco pueden ser tópicas y una forma puede ser una pomada, una pasta, un gel o similares.

EJEMPLO De aquí en adelante, esta invención se describirá en particular con base, en pero sin limitarse a, los siguientes ejemplos.

EJEMPLO 1 Determinación de la secuencia de bases de APP de variante por deleción ADN genérico se extrajo de la sangre de un paciente con la enfermedad de Alzheimer familiar, y la secuencias de bases totales codificando cada una de ellas un ADNc de cada uno de presenilin 1 (PSEN1 ), presenilin 2 (PSEN2), y APP, que se sabe que son genes causantes, fueron sometidos a amplificación por PCR usando el ADN obtenido como la matriz y después analizados con el uso de un secuenciador PRISM modelo 310 fabricado por ABI (Perkin-Elmer, CA). Como resultado, se encontró una variante en una región codificadora de proteína amiloide (SEQ ID NO 1 ) del ADNc del gen APP del tipo silvestre (de lesión de tres bases gaa en las posiciones 1852 a 1854 de SEQ ID NO 1 ).

EJEMPLO 2 Determinación de la estructura de proteína amiloide sintetizada a partir de ADNc del gen APP variante por deleción Puesto que el ADNc del gen APP variante obtenido en el ejemplo 1 tenía la variante dentro de la proteína amiloide, se examinó un sitio de digestión con ß-secretasa o ?-secretasa. Después, un vector de expresión del ADNc del gen APP variante se introdujo en las células HEK de células cultivadas humanas que se sabe que expresan APP así como producen y secretan proteína amiloide. La expresión se dejó que ocurriera mediante dos días para obtener un sobrenadante de cultivo, y la fracción inmuno precipitada obtenida al cruzar un anticuerpo de proteína amiloide se sometió a un análisis de masa con el uso de AXIMA-CFR fabricado por Shimadzu Corporation. El resultado se muestra en la figura 1 Como es evidente a partir de la figura 1 , un valor de observación experimental obtenido como un peso molecular de Aß1-40 (?E) que es la proteína amiloide secretada ADNc del gen APP variante expresado en las células HEK de células cultivadas humanas fue 4200.51. Este peso molecular fue casi el mismo que el del valor del cálculo teórico 4200.69 de un peso molecular en el caso de una deleción de Glu en la posición 21 de Aß1-40. Es decir, se demostró que la proteína amiloide variante por deleción se produce y secreta en un estado en donde los sitios de digestión de ß-secratasa y ?-secratasa convencionales son retenidos en ésta APP variante por deleción. De manera más específica, se demostró que la proteína amiloide variante es Aß1-40 en donde un amino terminal empieza con Asp y termina con Val con Glu en la posición 22 siendo deletado.

EJEMPLO 3 Cuantificación de proteína amiloide sintetizada a partir de APP variante por deleción Se demostró el APP variante por deleción expresado en células HEK de células cultivadas humanas produce y secreta dos tipos de proteínas amiloide variantes similares al APP del tipo silvestre como se muestra en el cuadro 1.

CUADRO 1 Nótese que un vector de expresión vacante disuelto en una solución salina normal se usó como el control en el cuadro 1. También, Aß42 representa Aß1-42 y Aß1-43 o Aß1-42 (?E) yAß1-43 (?E) y representa Aß40 representa Aß1 -40 o Aß1 -40 (?E).

EJEMPLO 4 Toxicidad de proteína amiloide variante La proteína amiloide variante usada en el cuadro 4 fue un péptido orgánicamente sintetizado que tiene una secuencia de aminoácidos y una masa que es la misma de aquellos de la proteína amiloide variante secretada de las células de acuerdo con la secuencia de aminoácidos y análisis de masa. A través de la examinación de toxicidad de neurona con el uso de péptido sintético, se demostró que el péptido sintético tiene una toxicidad menor que la proteína amiloide de tipo silvestre convencional. Los resultados se muestran en el cuado 2.

CUADRO 2 En el cuadro 2, el Aß del tipo silvestre o Aß variante representa Aß1 -40 o Aß1 -40 (?E), y el control representa Aß1 -40 que tiene una secuencia de aminoácidos inversa de una secuencia de aminoácidos de Aß1-40 del tipo silvestre.

EJEMPLO 5 Propiedad aglutinante de proteína amiloide variante La proteína amiloide variante usada en el cuadro 4 fue un péptido orgánicamente sintetizado que tiene una secuencia de aminoácidos y una masa que es la misma de aquellos de la proteína amiloide variante secretada de las células de acuerdo con la secuencia de aminoácidos y análisis de masa. A través de la examinación de la propiedad aglutinante de proteína mediante el uso del péptido por capacidad de unión de tioflavina T, se demostró que la actividad de aglutinación de la proteína amiloide variante de ésta ¡nvención es considerablemente menor que la proteína amiloide de tipo silvestre convencional. El resultado se muestra en el cuadro 3.

CUADRO 3 En el cuadro 3, Aß de tipo silvestre representa Aß1-42, y Aß variante representa Aß1-42 (?E). La actividad aglutinante de Aß1-42 de tipo silvestre bajo las condiciones de 100 microgramos/ml (PBS) a 37°C durante 24 horas se fijó a 100%.

EJEMPLO 6 Antigenicidad de proteína amiloide variante El péptido orgánicamente sintetizado de la proteína amiloide variante se calentó a 37°C durante 24 horas para crear un oligómero. La identificación del oligómero fue conducida al confirmar los puntos detección del complejo amiloide grande (dimérico, trimérico o más) por Western blot; ausencia de fibra amiloide probada por observación con microscopio electrónico; y reacción de unión a tioflavina negativa. Un anticuerpo que tenía proteína amiloide variante oligomérica como un antígeno se creó. Para este propósito, una suspensión de un péptido disuelto en PBS y solución de adyuvante completo de Freund se inmuno inyectó en un ratón. Después de un mes, el ratón fue inmunizado con una suspensión que contenía adyuvante incompleto de Freund en lugar de adyuvante completo de Freund, y la misma operación de inmunización se repitió después de 7 días. La sangre en una cantidad de 100 microlitros se recogió de la vena de la cola del ratón y la reactividad de la misma se confirmó. Se preparó una pluralidad de tiras de membrana de PVDF con el péptido de antígeno. Después de secar las tiras de membrana de PVDF fueron bloqueadas con PBS que contenía 20% de suero de vaca. Después, las tiras de membrana se colocaron por separado en cajas de reacción pequeñas para hacerse reaccionar con suero de ratón 1/150 diluidos (No. 1 a 78) (Figura 2). Las tiras de membrana se sometieron a una reacción con un complejo de avidina-biotina mediante el uso de anticuerpo de cabra IgG antiratón marcado biotinilado como un anticuerpo secundario. La detección se realizó observando títulos de anticuerpo a través de coloración con DAB. La tira de membrana que está más a la izquierda es un ejemplo de una reacción que usa como control un anticuerpo de conejo capaz de reconocer un margen N-terminal. Haciendo referencia a la figura 2, las tiras de membrana mostradas en la prueba de mancha fueron manchadas como si fueran desplazadas en una dirección vertical una de otra para distinguir una de la otra. Las tiras de membrana fueron manchadas con 10 ng, 1 ng, 0.1 ng, y 0.01 ng, PBS y albúmina en este orden desde la parte superior. Se reveló que el antisuero de la dilución de 1/150 requiere por lo menos 1 ng de antígeno y no se detecta cuando la cantidad de antígeno es menor que 1 ng. Además, no hubo reacción con albúmina de suero de de bovino (BSA). El hecho importante es que el anticuerpo capaz de reconocer el péptido de oligómero se identificó en todos los sueros de ratón de los 8 ratones de prueba sin excepción, y que la antigenicidad alta irreproducible de la proteína amiloide variante oligomérica se confirmó. Además, se confirmó que un anticuerpo anti-proteína amiloide variante doblado al cruzar la proteína amiloide variante como un antígeno reacciona no solo con la proteína amiloide variante si no también con la proteína amiloide de tipo silvestre (Figura 3). Haciendo referencia a la figura 3, la prueba se condujo de la misma manera como se describió antes excepto que se usó la proteína amiloide de tipo silvestre en lugar de la proteína amiloide variante. La tira de membrana se manchó con 10 ng, 1 ng, 0.1 ng, y 0.01 ng de la proteína amíloide de tipo silvestre, PBS, y albúmina en ese orden desde la parte superior.

EJEMPLO 7 Especificidad de anticuerpo anti-proteína amiloide variante La especificidad del anticuerpo anti-proteína amiloide variante se confirmó de tal manera que el oligómero de proteína amiloide variante fue inmuno precipitado usando el antisuero obtenido y después detectado usando otro anticuerpo amiloide ordinario por Western blot. La tira de membrana que está más a la izquierdas en la prueba de inmuno precipitación mostrada en la figura 4 es un ejemplo de una reacción que usa como control un anticuerpo de conejo capaz de reconocer un margen N-terminal y detección con el uso del mismo anticuerpo. Las flechas indican patrones de electroforesis de las proteínas amiloides, y la forma monomérica (peso molecular: 4kDa), la forma dimérica (peso molecular: 8 kDa), la forma trimérica (peso molecular: 12 kDa), la forma tetramérica (peso molecular: 16 kDa), y la forma pentamérica o más grande (peso molecular: 20 kDa) se muestra en este orden desde la parte inferior a la parte superior. Se reveló que los sueros de ratón examinados aquí (Nos. 2, 2, y 4) reconocen y se unen a los oligómeros triméricos o más grandes. El anticuerpo amiloide ordinario reconoce la forma monomérica, pero el anticuerpo de proteína amiloide variante no reconoce la forma monomérica. Enseguida, la actividad de anticuerpo de oligómero del anticuerpo anti-proteína amiloide variante se midió cuantitativamente (cuadro 4). En esta medición, 100 ng, 10 ng, y 1 ng del oligómero de proteína amiloide variante, PBS, o albúmina de vaca se unió a una placa de plástico de 96 agujeros que después se bloqueó mediante 20% de PBS de suero de vaca para probar sueros de ratón 1/450 diluidos (Nos. 2, 3, y 4). Un anticuerpo de cada IgG anti-ratón marcado con peroxidasa se usó como un anticuerpo secundario.

CUADRO 4 Es evidente a partir del cuadro 4 que el anticuerpo de oligómero de proteína amiloide antivariante no reacciona con BSA ni la proteína amiloide monomérica si no que reacciona específicamente con la proteína amiloide oligomérica.

EJEMPLO 8 Inmunohistoquímica con anticuerpo anti-proteína amiloide variante La especificidad del anticuerpo anti-proteína amiloide variante se examinó a través de tinción con anticuerpo fluorescente usando sección de tejido cerebral con enfermedad de Alzheimer fijado con formalina (figura 5). El anticuerpo anti-proteína amiloide variante se hizo reaccionar a 4°C durante la noche como un anticuerpo primario, y después el lavado de sección de tejido cerebral se lavó con PBS que contenía 0.05% de Tween 20, seguido por reacción con anticuerpo anticonejo marcado con rojo de Texas que se usó como un anticuerpo secundario por 2 horas, y después se lavó nuevamente para hacer encapsulado con un agente encapsulante que contenía un agente anti-fotoblanqueador fluorescente. La observación se condujo usando un microscopio de barrido por láser confocal (Axiovert 100; producto de Zeiss, Alemania). El resultado es como se muestra en la figura 5, y la capacidad de tinción fue tal que una distribución en forma de puntos en la membrana se observó, la cual coincide con publicaciones reportadas de la proteína amiloide oligomérica (documento que no es patente 8; R. H. Takahashi, C. G. Almeida, P. F. Kearey, F. Yu, M. T. Lin, T. A. Milner, G. K. Gouras, Oligomerization of Alzheimer's amyloid within processes and synapses of cultured neurons and brain, (2004) J. Neurosci. 24: 3592-3599; R. Kayed, E. Head, J. L. Thompson, T. M. Mclntire, S. O Milton, C. W. Cotman, C. G. Glabe, Common structure of soluble amyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis, (2003) Science 300: 486-489). De manera más específica, se confirmó que el anticuerpo anti-proteína amiloide variante creado al usar la proteína amiloide oligomérica como el anticuerpo reconoce la proteína amiloide oligomérica pero no reconoce la placa senil que forma la proteína amiloide fibrosa.

EJEMPLO 9 Anticuerpo de proteína amiloide antivariante y reacción nueuro inmune Anticuerpos inducidos por terapia de vacuna convencional (D. Schenk, R. Barbour, W. Dunn, et al. Immunization with amyloid-beta attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse, (1999) Nature 400: 173-177) usan la proteína amiloide de tipo silvestre (Abeta?.42) como el antígeno y placa senil teñida (C. Hock, U. Konietzko, A. Papassotiropoulos, et al., Generation of antibodies specific for beta-amyloid by vaccination of patients with Alzheimerdisease, (2002) Nat Med 8: 1270-1275). Además, se ha reportado que el efecto adverso de una reacción de encefalitis ha sido causado por el anticuerpo (J. A. Nicoll, D. Wilkinson, C. Holmes, P. Steart, H. Markham, R. O. Weller, Neuropathology of human Alzheimer's disease following immunization with amyloid beta peptide: a case report, (2003) Nat Med 9: 448-452; J. M. Orgogozo, S. Gilman, J. F. Dartigues, B. Laurent, M. Puel, L. C. Kirby, P. Jouanny, B. Dubois, L. Eisner, S. Flitman, B. F.

Michel, M. Boada, A. Frank, & C. Hock, Subacute meningoencephalitis in a subset of patients with AD after abeta42 immunization, (2003) Neurology 61 : 46-54). A fin de comparar una molécula de complemento (C3d) activada como un marcador de reacción inflamatoria con las cepas con el anticuerpo anti-proteína amiloide variante, un anticuerpo anti-proteína amiloide variante de ratón y un anticuerpo de conejo anti-C3d se mezclaron para usarse como anticuerpos primarios y después se hicieron reaccionar a 4°C durante la noche, y después la sección de tejido cerebral se lavó con PBS que contenía 0.05% de Tween 20, seguido por reacción con una solución de mezcla de anticuerpo IgG de antiratón marcado con rojo de texas y un anticuerpo IgG de anticonejo marcado con FITC, que se usaron como los anticuerpos secundarios, durante dos horas, y después se lavaron nuevamente para ser encapsulados con un agente encapsulante que contenía un agente antifotoblanqueador fluorescente. La observación se condujo usando un microscopio de barrido de láser con focal (Axiovert 100; proeducto de Zeiss, Alemania). El resultado es como se muestra en las figuras 6A-6B. En las figuras 6A-6B se muestran imágenes de doble tinción de la misma sección. En la figura 6A se muestra la imagen teñida de anticuerpo de ratón con proteína amiloide antivariante, y en la figura 6B se muestra la imagen teñida de anticuerpo de conejo anti-C3d, que se detectaron como imágenes fluorescentes diferentes. Como es coincidente con el reporte convencional (P. Eikelenboom, F. C. Stam, Immunoglobulins and complement factors in senile plaques, (1982) Acta Neuropathol 57: 239-242; P. Eikelenboom, C. E. Hack, J. M. Rozemuller, F. C. Stam, Complement activation in amyloid plaques in Alzheimer's dementia, (1989) Virchows Arch 56: 259-262; P. Eikelenboom, J. M. Rozemuller, F. L. van Muiswnkel, Inflammation and Alzheimer's disease: relationships between pathogenic mechanisms and clinical expression, (1998) Exp Neurol 154: 89-98; P. L. McGeer, E. G. McGeer, inflammation, autotoxicity and Alzheimer disease, (2001 ) Neurobiology of Aging 22: 799-809; P. Eikelenboom, A. J. M. Rozemuller, J.J.M. Hoozemans, R. Veerhuis, & W. A. van Gool, Neuroinflammation and Alzheimer Disease: Clinical and Therapeutic Implications, Alzheimer Disease & Associated Disorders, (2000) 14, Suppl. 1 : S54-S61 ), C3d que es un marcador de reacción de complemento neuro-inmume activado tiene una distribución coincidente con la placa senil. Sin embargo, la localización de tejido cerebral de enfermedad de Alzheimer de C3d no coincide con la localización de proteína amiloide oligomérica que es la imagen teñida de anticuerpo anti-proteína amiloide variante.

Aplicabilidad industrial Esta invención provee una proteína amiloide variante novedosa y su gen relacionado con patología de enfermedades por amiloide tales como enfermedad de Alzheimer, y una composición de fármaco novedosa y una medición de diagnóstico que utiliza la característica son útiles en los campos de estudios clínicos y básicos particularmente de las enfermedades por amiloide tales como enfermedad de Alzheimer.

Claims (7)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una proteína amiloide variante humana, que, en SEQ ID NO. 2, consiste de la secuencia de aminoácidos de: (1 ) 39 aminoácidos con deleción de Glu en 618avo en presencia de 597avo a 636avo; (2) 41 aminoácidos con deleción de Glu en 618avo en presencia de 597avo a 638avo; (3) 42 aminoácidos con deleción de Glu en la posición 618avo en presencia de 597avo a 639avo; (4) 39 aminoácidos con deleción de Ala en 617avo en presencia de 597avo a 636avo; (5) 41 aminoácidos con deleción de Ala en 617avo en presencia de 597avo a 638avo; (6) 42 aminoácidos con deleción de Ala en 617avo en presencia de 597avo a 639avo; (7) 39 aminoácidos con deleción de Asp en 619avo en presencia de 597avo a 636avo; (8) 41 aminoácidos con deleción de Asp en 619avo en presencia de 597avo a 638avo; o (9) 42 aminoácidos con deleción de Asp en 619avo en presencia de 597avo a 639avo.

2.- Un péptido que es parte de la proteína amiloide variante humana de la reivindicación 1 , que comprende 5 a 28 aminoácidos que preceden y siguen al residuo de aminoácido deletado en SEQ ID NO 2.

3.- Un gen humano que codifica una proteína precursora variante de amiloide para la proteína amiloide variante humana de la reivindicación 1.

4.- Un ARNm, que es un producto de transcripción del gen humano de la reivindicación 3.

5.- Un ADNc sintetizado a partir del ARNm de la reivindicación 4, que consiste de la secuencia de bases de SEQ ID NO 1 con deleción de bases en 1852avo a 1854avo.

6.- Un anticuerpo que reconoce específicamente la proteína amiloide variante humana de la reivindicación 1. 7 '.- Un anticuerpo preparado usando un oligómero de la proteína amiloide variante humana de la reivindicación 1 como un antígeno y que reconoce específicamente una proteína amiloide oligomérica. 8.- Un método de diagnóstico de enfermedades amiloides, que comprende detectar una existencia de la proteína amiloide humana de la reivindicación 1. 9.- Un método de diagnóstico de enfermedades amiloides, que comprende detectar una existencia del gene humano de la reivindicación 3 o el ARNm de la reivindicación 4. 10.- Una célula que expresa el gen humano de la reivindicación 3. 11.- Un animal no humano que tiene in vivo la proteína amiloide variante de la reivindicación 1 , y un tejido y una célula derivada del animal no humano. 12.- Un método para determinar selectivamente un componente de agente terapéutico para las enfermedades amiloides, que comprende poner en contacto la célula de la reivindicación 10 o el animal no humano, el tejido, o la célula derivada del animal no humano de la reivindicación 11 con una sustancia de prueba, y medir el comportamiento y actividad de una proteína amiloide variante humana en la célula o el tejido. 13.- Un fármaco para enfermedad anti-amiloide que contiene la proteína amiloide variante de la reivindicación 1. 14.- Un fármaco para enfermedad anti-amiloide que contiene el péptido de la reivindicación 2. 15.- Un fármaco para enfermedad anti-amiloide que contiene el ADNc de la reivindicación 5. 16.- Un fármaco para enfermedad anti-amiloide que contiene el anticuerpo de la reivindicación 6 ó

7.