JP4163955B2 - 構造的に異常な形のタウタンパク質およびそれに対する特異抗体 - Google Patents
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Description
実施例1
タウオン特異的なDC11ファミリーのモノクローナル抗体の製造
免疫用抗原としての可溶性および不溶性タウオンの製造(図1)
ヒトAD脳からタウオンを単離するため、新しいアプローチをKopke et al.(1993)、およびGreenbergおよびDavies(1990)に記載の方法に一部基づいて開発した。死後遅延(PMD)が短いADのBraakのI-III期に特徴的な変化を示すヒト脳を選んだ。enthorinalおよびtransenthorinal領域、扁桃および海馬領域を含む側頭葉のブロックを選んだ。該組織を解剖し、速やかに最小必須培地(Gibco)に浸漬した。組織を細かくきざみ、150μmメッシュのワイヤースクリーンに通した。この段階で、脳試料を2つの部分標本:試料Aと試料Bに分けた。
6週齢のBalb/cマウスを3群(A、B、C)に分けた。最初の2群(A、B)をFreundの完全アジュバント(Sigma)中の抗原50μgでプライムし、Freundの不完全アジュバント中の同じ抗原(Ag)50μgで3週間間隔で5回ブーストした。A群では、すべての用量をフットパッドに注射し、B群ではAgの用量を皮下投与した。第3群のマウスはPBSを用いて脾臓内に直接1用量のみ注射し(脾臓内免疫)、該プライミングの1週間後、脾臓を融合に用いた。融合の3日前に、AおよびB群のマウスをPBS中の免疫原50μgで静脈内注射した。免疫したマウスから得た脾臓細胞を、Kontsekova et al.、1988の方法に従ってNS/0ミエローマ細胞と融合させた。 108個の脾臓細胞を2x107個のNS/0ミエローマ細胞(比5:1)と混合し、10%ジメチルスルホキシドを添加した無血清Dulbecco変法Eagle培地(DMEM)中の50%PEG 1550(Serva)1ml中で1分間融合させた。融合細胞を20%ウマ血清、L-グルタミン(2mM)、ヒポキサンチン(0.1mM)、アミノプテリン(0.004mM)、チミジン(0.016mM)、およびゲンタシン(40U/ml)を含むDMEMに96ウェルプレートに脾臓細胞を2.5x105個/ウェルの濃度で再懸濁した。細胞を37℃で10日間インキュベーションし、増殖したハイブリドーマの抗タウオン特異的モノクローナル抗体の産生をELISAおよび免疫組織化学によりスクリーニングした。
ELISAを用いて、ハイブリドーマ培養上清中の、タウオンに対するモノクローナル抗体を検出した。固相には上記のごとく製造(下記の修飾あり)したタウオンを用いた。急速真空濃縮した分画からのタウのプールをポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、トランケートされた形のタウタンパク質を、Donofrio et al.、(1986)の方法に従って電気溶出して回収し、SDS-PAGEにより評価した。マイクロタイタープレートを4℃でPBS中の異常にトランケートされたタウタンパク質(10μg/ml、50μl/ウェル)で一夜コートした。非特異結合を減らすため1%無脂肪乾燥ミルクでブロックした後、プレートをPBS-0.05% Tween20で洗浄し、培養上清50μl/ウェルと37℃で1時間インキュベーションした。結合したモノクローナル抗体をホースラディッシュパーオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウスIg(DAKO)を用いて検出した。o-フェニレンジアミン溶液をパーオキシダーゼ基質に用いて反応を発現させ、50μl 2M H2SO4で反応を止めた。マルチスキャンMCC/340 ELISAリーダー(Labsystems)を用いて492nmの吸光度を測定した。陰性コントロールの少なくとも二倍の読み取り値を陽性とみなした。
正常タウでは陰性で抗タウオンELISAで陽性と同定されたモノクローナル抗体の以下の特異性をAD脳組織を用いて再スクリーニングした。
DC-11モノクローナル抗体のファミリーを用いる異常にトランケートされたタウタンパク質(タウオン)の定量的測定
タウオンを上記のごとく単離した。モノクローナル抗体DC30(正常および病的タウの両方を認識する)とDC-11モノクローナル抗体のファミリー(異常にトランケートされたタウに特異的)の組み合わせは、AD脳から調製した被検試料中のタウオンの定量を可能にする。プロテインAカラムクロマトグラフィにより無血清培地から抗体を精製した。高結合マイクロタイタープレート(Nunc)のウェルを、4℃で、PBS中の濃度10μg/ml(50μl/ウェル)のDC-11モノクローナル抗体混合物で一夜コートした。ウェルの非特異結合をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の1%無脂肪乾燥ミルク200μlを加え、室温で60分間飽和させた。プレートをPBS-0.05% Tween20(v/v)で3回洗浄した。PBS中に100-1000pg/mlの範囲の濃度の組換えタウオンを含む連続希釈標準物、および50μlの量のAD-タウオンを含む被検試料を加えた。37℃で60分間インキュベーションした後、プレートを洗浄し、PBSで1/5000に希釈したホースラディッシュパーオキシダーゼ結合抗体DC-30を37℃60分間加えた(50μl/ウェル)。最終洗浄後、50μlのオルソフェニレンジアミン溶液および0.003% H2O2を加え、プレートを遮光して20分間インキュベーションした。50μlの2M H2SO4で反応を止めた。ELISAリーダーのマルチスキャンMC344(Labsystems、Finland)を用いて492nmの吸光度を読み取った。
組換えタウオンの標準曲線を得られた値から作製し、被検試料中のタウオンの対応する濃度を標準曲線から求めた。
モノクローナル抗体DC-11を用いるウエスタンブロッティングによるタウオンの検出
精製組換え完全長ヒトタウおよび異常にトランケートされたタウタンパク質-タウオンを5-20%勾配SDS-ポリアクリルアミドゲルにロードし、Laemmli(1970)に従って変性条件下で泳動した。SDS-PAGE後、ポリビニルジフルオリド膜(Milipore)へのトランスファーを、冷却しながら350mAで1時間、10mM CAPS緩衝液(pH12)を用いて行った。ブロッティング後、膜をPBSで洗浄し、室温で1時間、PBS中の1%乾燥無脂肪ミルクでブロックした。トランスファーしたタンパク質を4℃で一夜、モノクローナル抗体DC-11とインキュベーションした。PBS-0.05% Tween 20(v/v)で洗浄した後、ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリンを1/1000希釈で用い、室温で1時間インキュベーションした。次に、膜をPBS-Tween20で4回洗浄し、基質溶液(12mg 4-クロロ-1-ナフトール、4ml メタノール、16ml PB、0.03%v/v H2O2)で発現させ、H2Oで反応を止めた。結果は、抗体DC-11は異常にトランケートされたタウ-タウオンのみを認識するのに対し、モノクローナル抗体DC-30は、翻訳後修飾の状態に関わらず、多くの種(ヒト、サル、乳牛、ブタ、ラット、マウス)のすべての既知タウアイソフォームを広く認識する汎タウ抗体であることを示唆した。
タウオンの免疫組織化学的同定
モノクローナル抗体DC-11ファミリーは、種々のタイプの免疫組織化学的方法におけるAD脳中のタウオンの可視化に適している。
死体解剖で取り出したAD患者の脳を1cm間隔で体長軸を通るプレートに切断し、-20℃で保存した。海馬、enthorinal、側頭、前頭、後頭、および頭頂皮質のブロックを4%緩衝パラホルムアルデヒドで4℃にて4日間以上固定した。一連の前頭部切片(50μm)をビブラトームで切り出し、4℃でPBS(pH7.0)に保存した。自由に浮遊させたビブラトーム切片を98%冷ギ酸で2分間前処理し、PBS/TritonX100中の免疫前血清とインキュベーションした。用いた血清は二次抗体と同じ動物種由来であった。切片のインキュベーションはモノクローナル抗体DC-11と37℃で60分間行った。二次ビオチン化抗体(Vectastain Eliteキット、Vector)とのインキュベーションは室温で1時間行った。免疫反応物を、アビジン-ビオチン-パーオキシダーゼ複合体(Vectastain Eliteキット、Vector)、および100μl H2O2含有0.1M酢酸緩衝液(pH6)10ml中の、6mg 3-3-ジアミノベンジジン-4HCl(SIGMA)、250mg NiCl2(MERCK)を用いて可視化した。切片をPBS/Tritonで洗浄して反応を止めた(Kiss et al.、1988; Cuello et al.、1993、Thorpe and Kerr、1994)。
自由に浮遊させたビブラトーム切片を98%冷ギ酸で2-3分間前処理し、PBS/TritonX100中の免疫前血清とインキュベーションした。用いた血清は二次抗体と同じ動物種由来であった。切片をブロッキング溶液(5%ウマ血清、PBS、0.1%Triton)中の1:1000希釈の第一パーオキシダーゼ結合モノクローナル抗体DC-11と37℃で60分間インキュベーションし、PBS(pH7.2)中の0.06% DAB、0.01% H2O2で発現させた。PBS/Tritonで切片を洗浄して反応を止めた。該切片と第二モノクローナル抗体とのインキュベーションは、37℃で60分間行った。ビオチン化抗体(Vectastain Eliteキット、Vector)とのインキュベーションは、室温で1時間行った。反応をアビジン-ビオチン-パーオキシダーゼ複合体(Vectastain Eliteキット、Vector)および0.1 M酢酸緩衝液中の、0.06% 3-3-ジアミノベンジジン-4HCl(SIGMA)、0.01% H2O2、2.5% NiCl2(MERCK)で可視化し、切片を0.1M酢酸緩衝液で洗浄して反応を止めた(Kiss et al.、1988; Cuello、1993)。
免疫組織化学染色終了後、切片をガラススライドに置き、56℃で60分間恒温槽中に置いた。インキュベーション後、スライドを5分間蒸留水に浸漬し、4℃で5-10分間ファストクレシルバイロレット溶液で染色し、水でリンスし、ほとんどの該クレシルバイオレット染色が除去されるまで96%エタノールに移し、キシレンで透徹し、Entellan(エンテラン)でマウントした。
自由に浮遊させたビブラトーム切片(30μm)を98%冷ギ酸で2分間前処理し、PBS/TritonX100中の免疫前血清とインキュベーションした。切片を最初の一次モノクローナル抗体DC-11と37℃で60分間インキュベーションし、次いで当該分野で用いられる標準的方法に従って室温でPBS/Tritonで1:500に希釈したFITC結合ヤギ抗マウス二次抗体(Immunotech)で30分間インキュベーションした。PBSで洗浄後、切片を37℃で60分間TRITC結合一次抗体とインキュベーションし、0.1%パラフェニレンジアミン/グリセロール溶液を用いてマウンドした。
タウオンによる微小管構築および微小管結合アッセイ
チューブリンの精製
チューブリンを地元の屠殺場から得た新鮮なブタ脳から、微小管重合および解重合の温度依存性サイクル、次いでホスホセルロース(Watman P11ホスホセルロース)イオン交換クロマトグラフィ(Valee、1986)により単離した。
精製タウオン(5mM)を、+4℃の構築用緩衝液(100mM PIPES pH6.9、2mM EGTA、1mM MgSO4)中の予め不純物を除去し精製したチューブリン(10mM)およびGTP(1mM)と混合した。このチューブリン濃度は、自発構築に重要な濃度以下である(Black、1987)。試料を予め37℃に加熱した水晶キュベットにピペットで入れた。濁度変化を、サーモスタットで制御した分光光度計(LKB)で分光光度法により測定し、30分間、10秒間間隔でOD350の変化を記録した。
タウオンと微小管の結合曲線を先に記載のごとく測定した(Gustke、1992)。精製チューブリンを結合用緩衝液(100mM PIPES pH6.9、1mM EGTA、1mM MgSO4、1mM DTT)中のGTP(1mM)およびタキソール(20μM)の存在下で37℃、10分間インキュベーションした。微小管をそれぞれタウオンまたは正常タウタンパク質と他のMAPとの結合に干渉しないタキソールで安定化し(Valee、1986; Wallis、1993)、微小管構築の効果を排除した。タウオンをそれぞれ濃度2.5mM、5mM、7.5mM、10mM、15mM、20mMで加えた。37℃、43000xgで35分間遠心後、ペレットをP緩衝液(50mM PIPES pH6.9、1mM EGTA、0.2mM MgCl2、5mM DTT、500mM NaCl)に再懸濁した。上清およびペレットをSDS-PAGEゲルにて分析し(Laemmli、1970)、銀染色した(Bloom、1987)。ゲルをHPScanJet(Hewlett-Packard)スキャナーでスキャンし、公開されたドメインNIH Imageプログラム(U. S. National Institutes of Healthが開発、インターネットhttp://rsb. info. nih. gov/nih-image/で利用可能)を用いてMacintoshコンピューターで分析した。バンド強度を較正曲線と内部標準の方法を用いて濃度に変換した。
組換えタウオンの調製
組換えトランケート型タウタンパク質を技術マニュアルに従って「Erase a Base System」(Promega)を用いて調製した。該システムは、5'オーバーハングから出発する挿入DNAのエクソヌクレアーゼIII特異的消化に基づく。消化速度は一定温度で同様であった。タウ遺伝子を、NdeI-EcoRI制限部位を介してpET17bベクターにクローンし、pET/T40を得た。遺伝子のC末端に、KpnI制限部位、およびKpnI部位の下流の3つすべてのリーディングフレームに3つの終止コドンを加えた。EcoRI酵素はexoIIIの基質である5'末端のオーバーハングを残す。KpnIはexoIII消化に抵抗性の3'末端オーバハングを残す。EcoRIで二重消化したpET/T40ベクター1μg、KpnI/NEB、およびエタノール沈殿物を20μl 1xExoIII緩衝剤で希釈し、37℃/dig.速度450塩基/分で80uのexoIIIで消化した。2.5μl試料を30秒間隔でExoIIIを添加した後、氷上で1試料につき、7.5μlのSl-ヌクレアーゼ混合物/1.5u S1-ヌクレアーゼ中に移した。回収試料を室温で30分間インキュベーションし、残っている一本鎖尾部を除去した。クレノーDNAポリメラーゼを用いて平滑末端を作製した。DH5alfaコンピテント細胞を試料のライゲーション混合物で直接形質転換した。サブクローンをPstI-XhoI制限でスクリーニングし、適切な構築物をpETベクター中のT7プライマーを用いてシーケンスした。
タウオンをE. coli BL21(DE3)を用いて発現した(Studier、1986)。単一細菌クローンを500mlのLB AMP(LB培地、100μg/mlアンピシリン)に接種した。細菌培養をOD600が0.6-0.8に達するまで37℃でロータリー振盪器を用いて増殖させ、次いでIPTG(0.4mM、最終濃度)を加えて誘導した。3時間後、細菌細胞を4℃、5000gで15分間遠心してペレットとし(Sigma 6K15、ローター12500)、細胞ペレットを液体窒素で急速凍結し、さらに用いるまで-70℃で保存した。細胞溶解物を調製するため、細胞ペレットを緩衝液A(20mM PIPES pH6.9、50mM NaCl、1mM EGTA、1mM MgSO4、2mM DTT、0.1mM PMSF)に再懸濁し、細胞を氷上で6分間超音波処理して崩壊させ、+2℃、45000rpmで15分間遠心して細胞デブリスを除去した(ローターTLA-120.2、Beckmann Optima TLX)。上清を0.22μmフィルター(Millipore)で濾過し、タウオンをホスホセルロース(セルロースホスフェートWhatman P11)カラムを用いるイオン交換クロマトグラフィにより速やかに精製した。試料をロードした後、カラムを10ベッド容量の緩衝液Aで洗浄した。タウオンを緩衝液A中のNaCl(50mM-0.5M)の直線勾配20mlで溶出した。1mlの分画を回収し、タンパク質を含むものをSDS-PAGEで確認した。タウオンを含む分画をプールし、PBSで4℃、3x60分間透析した。透析物の部分標本を真空乾燥し(SpeedVac)、-20℃で保存した。組換えタウオンを、連続希釈ウシ血清アルブミン(BSA)を質量標準マーカーにしてPAGEにより定量した。ゲルをクーマシーブルーで染色し、乾燥し、BSAおよびタウバンドの強度をScion Image(Beta 3b、Scion Corp.)を用いて計算した。BSAの較正曲線を構築し、タウオンの定量に用いた。
ヒトAD脳からのタウオンの単離
ヒトAD脳からタウオンを単離するため、Kopkeら(1993)、およびGreenbergおよびDavies(1990)に記載の方法に一部基づく新しいアプローチを開発した。死後遅延(PMD)の短いADのBraakのI-III期に特徴的な変化を示すヒト脳を選んだ。enthorinalおよびtransenthorinal領域、扁桃、および海馬領域を含む側頭葉のブロックを選んだ。組織を解剖し、最小必須培地(Gibco)に速やかに浸漬した。組織を細切し、150μmメッシュのワイヤースクリーンに強引に通した。この段階で脳試料を2つの部分標本(試料Aおよび試料B)に分けた。
ヒト、ブタ、および乳牛脳組織からの正常タウの精製
Lindwall and Cole.、1984の方法の改良法によりタウを精製した。脳組織を0.1mM MES、0.5mM MgCl2、1mM EGTA、1M NaCl pH6.5中でホモゲナイズし(1mg/ml)、4℃、100000xgで90分間遠心した。上清に2-メルカプトエタノールを0.5%(v/v)加え、100℃で5分間加熱し、4℃、20000xgで30分間遠心した。この第二上清を(NH4)2SO4で45%飽和とし、上記のごとく20000xgで遠心し、得られたペレットをNaClを含まないMES緩衝液に細懸濁した。2.5%(v/v)過塩素酸で沈殿し、さらに20000xgで遠心した後、最終上清を5mM Tris、pH7.4で4℃、一夜透析した。
タウオンによる繊維のもつれ中の正常タウの隔離および凝集
増加する量の正常タウ(5-100μg/100μl)を、分画1から単離した固定量のタウオン(10μg/100μl)と混合した。反応を、終量100mlの結合用緩衝液(2mM EGTA、2%ウシ血清アルブミン、0.5mM MgCl2、1μMアプロチニン、および20μMロイペプチン含有100mM MES pH7.6)中で行った。混合物を室温で45分間相互作用させ、次いで結合用緩衝液中の80%ショ糖150μlを重層し、100000xgで1時間遠心した。最上層の150μlを除去し、残りを超音波処理して、ラジオイムノ-ドット-ブロットアッセイによりタウオンと正常タウの相互作用を測定した。ショ糖層中のタウの存在はタウオンによる健康なタウの隔離を示唆する。
DC-11モノクローナル抗体のファミリーによるニューロン変性の阻害
神経芽細胞腫(neuronal blastoma)細胞および成長因子をトリプリケートでペトリ皿上にプレートした。第一群はタウオンのみを与え、第二群にはタウオンとDC-11モノクローナル抗体混合物を与えた。
細胞に室温で5分間、80mM PIPES、1mM MgCl2、1mM EGTA、pH6.6を含む0.2% TritonX 100を浸透させた。細胞の固定は、氷上で同じ緩衝液中の2%パラホルムアルデヒドを用いて15分間行った。タウオンを間接免疫蛍光アビジンローダミン検出系(Sigma)により検出した。
細胞を分化誘導因子を用いて増殖させた。分化レベルを評価した。抗体処理せずにタウオンを与えた細胞では分化能が有意に低下した。しかしながら、タウオンと抗体の混合物で処理した群は無関係なタンパク質で処理したコントロール群に匹敵するレベルで分化した。
Claims (13)
- 寄託されたハイブリドーマ細胞株 DC-11 または DC-11/I(ECACC の寄託番号 00082216 および 00082215) が産生する抗体と結合することにより正常ヒトタウと免疫学的に区別でき、441アミノ酸からなる最長ヒトタウアイソフォームの少なくともアミノ酸残基300〜アミノ酸残基400を含む、N末端 または両N および C末端がトランケートされている、トランケートされた形のヒトタウタンパク質、との特異性を有する抗体であって、正常タウタンパク質と結合せず、該トランケートされた形のヒトタウタンパク質と特異的である抗体。
- 該トランケートされた形のヒトタウタンパク質に対する該抗体の特異性がヒトタウタンパク質のリン酸化レベルと独立している請求項 1 記載の抗体。
- 寄託されたハイブリドーマ細胞株 DC-11 または DC-11/I(ECACC の寄託番号 00082216 および 00082215) により産生される抗体。
- 請求項1〜 3 のいずれかに記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。
- 寄託されたハイブリドーマ細胞株 DC-11 または DC-11/I(ECACC の寄託番号 00082216 および 00082215) が産生する抗体と結合することにより正常ヒトタウと免疫学的に区別できる、N末端 または両N および C末端がトランケートされている、トランケートされた形のヒトタウタンパク質。
- 該トランケートされた形のヒトタウタンパク質がさらにタウ凝集を開始するための核形成中心として作用する能力により正常ヒトタウと区別することができることを特徴とする、請求項 5 記載のトランケートされた形のヒトタウタンパク質。
- 該トランケートされた形のヒトタウタンパク質がさらに正常ヒトタウ由来の微小管を分解する能力により正常ヒトタウと区別することができることを特徴とする、請求項 5 または 6 記載のトランケートされた形のヒトタウタンパク質。
- 441アミノ酸からなる最長ヒトタウアイソフォームの少なくともアミノ酸残基300〜アミノ酸残基400を含むことを特徴とする、請求項 5 〜 7 のいずれかに記載のトランケートされた形のヒトタウタンパク質。
- 請求項1〜 3 のいずれかに記載の抗体および試料を提供するための適切な容器を含む、脳組織または体液試料中の請求項5 〜 8 のいずれかに記載のトランケートされた形のヒトタウタンパク質を検出または単離するためのキット。
- 該トランケートされた形のヒトタウタンパク質と結合する該抗体、好ましくは二次抗体、特に特異的に標識される二次抗体の結合事象を検出するための方法をさらに含むことを特徴とする請求項9記載のキット。
- 該トランケートされた形のヒトタウタンパク質、特に該トランケートされた形のヒトタウタンパク質の標準的調製物を定量するための方法をさらに含むことを特徴とする請求項9または10記載のキット。
- 患者の脳組織または体液試料中の請求項5 〜 8 のいずれかに記載のトランケートされた形のヒトタウタンパク質のin vitro検出方法であって、該試料を請求項1〜 3 のいずれかに記載の抗体と混合し、該トランケートされた形のヒトタウタンパク質と該抗体の結合事象の存在を検出し、所望により該抗体と結合している該トランケートされた形のヒトタウタンパク質の量を測定することを含む方法。
- アルツハイマー病患者を治療するための薬物を製造するための請求項1〜 3 のいずれかに記載の抗体の使用。
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