ES2339427T3 - Anticuerpos contra formas conformacionalmente anormales de proteina tau presente en tejidos con enfermedad de alzheimer. - Google Patents

Abstract

Anticuerpo con una especificidad por las formas truncadas de la proteína tau humana, que está truncada en el extremo N-terminal o bien tanto en el extremo N-terminal como en el extremo C-terminal, tal como se determina en ELISA, empleándose dichas formas truncadas de la proteína tau humana purificadas mediante electroforesis, en muestras de tejido de cerebro con enfermedad de Alzheimer fijadas con paraformaldehido tamponado al 4% a 4ºC utilizando inmunohistoquímica, o tal como se determina mediante transferencia Western, utilizando dichas formas truncadas de las proteínas tau humanas purificadas sobre geles de SDS-poliacrilamida y transferidas a membranas PVDF, siendo dichas formas truncadas diferentes conformacionalmente de la tau humana normal, dicha forma diferente conformacionalmente de la proteína tau es específicamente reconocible por un anticuerpo producido por la linea celular de hibridoma depositada DC-11 o DC-11/I con los números de depósito 00082215 y 00082216 de la ECACC y dichas formas truncadas comprenden, como mínimo, del residuo de aminoácido 300 al residuo 400 de la isoforma de tau humana más larga que comprende 441 aminoácidos, no uniéndose dicho anticuerpo a la proteína tau normal y siendo dicho anticuerpo especifico de dichas formas truncadas de la proteína tau humana.

Description

Anticuerpos contra formas conformacionalmente anormales de proteína tau presente en tejidos con enfermedad de alzheimer.

La presente invención se refiere a la enfermedad de Alzheimer y a otras tauopatías.

La enfermedad de Alzheimer (AD) es el trastorno neurodegenerativo crónico más común que se caracteriza clínicamente por una pérdida progresiva e irreversible de la función cognitiva y del comportamiento. La enfermedad puede persistir durante 10 años, progresando desde síntomas leves hasta manifestaciones extremadamente graves. La AD afecta aproximadamente al 10 de la población con edad por encima de los 65 años y al 20 de la población con edad por encima de los 80 años. Como resultado del crecimiento de las sociedades occidentales, el número de personas afectadas está aumentando: solamente en Estados Unidos ya existen cinco millones de afectados y a finales del año 2000, en el mundo habrán aproximadamente 18 millones de personas con demencia. De éstas, se cree que aproximadamente dos tercios de los casos, es decir, 12 millones, tendrán enfermedad de Alzheimer. Es la cuarta causa de muerte en el mundo occidental, por detrás de las enfermedades cardiacas, cáncer y derrame cerebral. El número de personas con demencia está aumentando rápidamente. En 2025, el número de personas con demencia será del doble en los paises desarrollados con respecto a 1980. El coste que supondrá a la sociedad el cuidado de estos enfermos es enorme. Por ejemplo, los costes para la sociedad de los Estados Unidos que implican el diagnóstico y tratamiento de la AD, principalmente para el cuidado y vigilancia, se estiman actualmente en 80 mil millones de dólares americanos anuales. Actualmente, no se dispone de ningún ensayo para el diagnóstico presintomático ni curación para la AD. Por lo tanto, la enfermedad se diagnostica clínicamente después de la aparición de los síntomas, principalmente por eliminación de otras formas de demencia. La acumulación de los indicadores clásicos, placas seniles (neuríticas) y ovillos neurofibrilares (NFT) en los cerebros con AD, observados hace 93 años por el psiquiatra bávaro Alois Alzheimer en 1907, siguen siendo la característica neuropatológica de la AD.

El denominador común de las estructuras neurofibrilares intracelulares (ovillos neurofibrilares, neuritas distróficas, e hilos del neurópilo) son filamentos helicoidales emparejados (PHF). La subunidad de proteína principal de los PHF es la proteína tau asociada a microtúbulos en una forma hiperfosforilada de forma anormal (Grundke-Iqbal y otros, 1986; Wischik y otros, 1988 a,b). Las neuronas con cambios neurofibrilares degeneran y en los individuos afectados el grado de esta degeneración se correlaciona directamente con el grado de demencia (Blessed y otros,
1968).

La tau normal es una proteína asociada a microtúbulos que se distribuye principalmente en los axones. La proteína tau forma parte de la modulación del ensamblaje, organización espacial y comportamiento de los microtúbulos (MT) en las neuronas y probablemente en los cuerpos de las células gliales (Drewes y otros, 1998; Drubin y Kirschner, 1986; Lo-Presti y otros, 1995). Las proteínas tau están codificadas por un único gen localizado en el cromosoma 17, pero se detectan como múltiples isoformas en extractos de tejido de cerebros adultos (Goedert y otros, 1989; Himmler A., 1989; Kosik y otros, 1989). La heterogeneidad de las proteínas tau es debida, en parte, al corte y empalme alternativo, que da lugar a seis isoformas en el cerebro humano adulto. Estas isoformas distintas se diferencian por la presencia o ausencia de inserciones de 29 ó 58 aminoácidos en la región amino terminal y por la adición o eliminación de una repetición en tándem (que se puede repetir 3 ó 4 veces) en una región carboxi terminal de tau, a la que se hace referencia como dominio de unión a microtúbulos. Esta región comprende repeticiones imperfectas de 31 ó 32 residuos de aminoácidos. En los humanos, la isoforma de tau más pequeña contiene 352 residuos de aminoácidos con tres repeticiones en tándem en el dominio de unión a MT y ninguna inserción en el extremo amino terminal, mientras que la isoforma más grande contiene 441 residuos con cuatro repeticiones y ambas inserciones en el extremo amino terminal. Para simplificar, todas las numeraciones de la presente solicitud de patente hacen referencia a la isoforma más larga de la proteína tau humana, htau40, que contiene todas las inserciones (longitud de 441 aminoácidos) según Goedert y otros (1989).

Se conocen muchas enfermedades neurológicas que tienen inclusiones celulares filamentosas que contienen la proteína tau asociada a microtúbulos, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer (AD), parálisis supranuclear progresiva (PSP), degeneración corticobasal (CBD), enfermedad de Pick (PiD) y un grupo de trastornos relacionados denominados colectivamente como demencia frontotemporal con Parkinsonismo unido al cromosoma 17 (FTDP-17), esclerosis lateral amiotrópica (ALS), enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), demencia pugilistica (DP), enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSSD), enfermedad de cuerpos de Lewy y enfermedad de Huntington (Dickinson y otros, 1998; DiFiglia y otros, 1997; Forno, 1986; Hirano y Zimmerman, 1962; Nishimura y otros, 1995; Prusiner 1996; Reed y otros, 1998; Roberts, 1998; Schmidt y otros, 1996; Shankar y otros, 1989; Spillantini y otros, 1998). Aunque la etiología, los síntomas clínicos, los descubrimientos patológicos y la composición bioquímica de las inclusiones en estas enfermedades son diferentes, existe una prueba emergente que sugiere que los mecanismos implicados en la agregación de las proteínas celulares normales para formar diversas inclusiones filamentosas son comparables. Se cree que la alteración inicial en la conformación de la proteína tau asociada a microtúbulos, que inicia la generación de núcleos o semillas para el ensamblaje de los filamentos, es un aspecto clave. Este proceso puede estar influenciado por la modificación postraduccional de las proteínas normales, mediante mutación o eliminación de ciertos genes y por factores que se unen a las proteínas normales y, por lo tanto, alteran su conformación. La proteína tau es muy hidrofílica. Se puede extraer fácilmente del tejido del cerebro o de células cultivadas. En comparación, la tau filamentosa extraída de tejidos de cerebros enfermos de Alzheimer es relativamente insoluble. Además de la forforilación, la tau insoluble y la tau normal soluble se diferencian en el grado de modificaciones postraduccionales, que incluyen la glicosilación, glicación, ubiquitinación y racemización (Kenessey y otros, 1995; Ko y otros, 1999; Mori y otros, 1987; Wang y otros, 1996; Yan y otros, 1994).

Se desconoce el mecanismo mediante el cual la proteína tau se modifica para participar en la formación de filamentos en la AD. Tau es una de las proteínas conocidas más solubles (Cleveland 1977 a, b; Lee y otros 1988) y, por lo tanto, su agregación en la AD es particularmente enigmática. La fosforilación de tau afecta al potencial de tau para formar agregados, produciendo efectos estimuladores o bien inhibidores, dependiendo supuestamente del lugar de la fosforilación (Crowther y otros, 1994; Schneider y otros, 1999). Muchos estudios in vitro demuestran que en presencia del agente reductor, ditiotreitol (DTT), ácidos grasos insaturados libres, ARN o glicosaminoglicanos, la tau normal se puede transformar en filamentos (Goedert y otros, 1996; Kampers y otros, 1996; Perez y otros, 1996; Wilson y Binder, 1997). Además, el proceso de formación de filamentos también se puede acelerar por la presencia de la tau reticulada generada mediante la oxidación en la Cys322 (Schweers y otros, 1995). Entre los parámetros que se han variado en los diferentes estudios del ensamblaje de los filamentos se han incluido la concentración de la proteína tau, el pH y la fuerza iónica de la incubación es varias veces superior a la que existe en el citoplasma bajo condiciones fisiológicas. El análisis de los filamentos tau formados in vitro mediante microscopía electrónica de barrido y transmisión (STEM) mostró que estos filamentos difieren de los filamentos helicoidales emparejados nativos (Ksiezak-Reding, 1998). En ausencia de glicanos o ARN, no se detectan filamentos similares a los PHF en muestras que contienen tau de tipo salvaje sin fosforilar o fosforilada; tau normal. Los estudios de tau reticulada químicamente, tratada con heparina, indican que el tratamiento con heparina induce un cambio conformacional en la proteína tau (Paudel y Li, 1999). Si se consideran todos los datos in vitro éstos sugieren (a) que el dominio de unión a microtúbulos es importante para el ensamblaje de los filamentos de tau; y (b) que la formación de los filamentos de tau requiere uno o varios cambios conformacionales de tau. Simultáneamente estos estudios muestran que ninguna de las modificaciones descritas de tau por si solas es capaz de inducir formaciones de tau filamentosas que se correlacionan con la expresión clínica de la enfermedad de Alzheimer. La identificación y descripción de los factores importantes para la iniciación de los cambios en tau que conducen a la formación de filamentos en las condiciones de la enfermedad serian importantes para el desarrollo de marcadores de diagnóstico presintomáticos y de agentes terapéuticos para interferir en la progresión de las tauopatías.

Novak y otros (Acta Virologica 38(3): 174-189 (1994) y EMBO J 12(1): 365-370 (1993)) describieron un anticuerpo monoclonal, mab 423, que reconoce un epítopo que no existe en los tejidos de cerebro humano enfermos y se crea artificialmente con una proteasa de amplio espectro "Pronasa".

Los anticuerpos monoclonales Alz50 y MC1 que se dan a conocer en Jiecha y otros (Neuroscience Research 55: 713-723 (1999) y Weaver y otros (Neurobiology of Aging 21(5): 719-727 (2000) reconocen proteína tau nativa derivada de tejido de cerebro humano sano e isoformas de tau recombinantes de tau humana normal.

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es dar a conocer un anticuerpo monoclonal especifico capaz de la detección e interacción especificas con este fármaco diana. Este anticuerpo no debería ser adecuado solamente para la detección presintomática de la molécula sino también para la inhibición y eliminación de esta molécula, siendo adecuado, por consiguiente, para el diagnóstico presintomático, tratamiento y prevención de la enfermedad de Alzheimer y otras tauopatías.

Estos objetivos se encuentran en la dirección de la presente invención que se refiere en un aspecto a un anticuerpo con especificidad por las formas truncadas de la proteína tau humana, que está truncada en el extremo N terminal o bien tanto en el extremo N terminal como en el C terminal, tal como se determina en ELISA, utilizando dichas formas truncadas de proteína tau humana purificada por electroforesis, en muestras de tejido de cerebro con enfermedad de Alzheimer fijadas con paraformaldehido tamponado al 4% a 4ºC utilizando inmunohistoquímica, o tal como se determina mediante transferencia Western utilizando dichas formas truncadas de proteínas tau humanas purificadas en geles de SDS-poliacrilamida y transferidas a membranas de PVDF (difluoruro de polivinilo), siendo dichas formas truncadas diferentes conformacionalmente de la tau humana normal, dicha forma de la proteína tau diferente conformacionalmente es reconocible específicamente por un anticuerpo producido por la linea celular de hibridoma depositada DC-11 o DC-11/I con los números de depósito 00082215 y 00082216 de la ECACC y dichas formas truncadas comprenden, como mínimo, del residuo de aminoácido 300 al residuo de aminoácido 400 de la isoforma tau humana más larga que comprende 441 aminoácidos, no uniéndose dicho anticuerpo a la proteína tau normal y siendo dicho anticuerpo específico de dichas formas truncadas de la proteína tau humana. Dichas formas anormales de las proteínas tau representan una familia nueva de moléculas localizadas intra y extraneuronalmente solubles e insolubles, preferentemente formas de proteínas tau truncadas de forma anormal, que son diferentes conformacionalmente de la tau normal (Novak y otros, 1991, 1993). Podría mostrarse que estas formas diferentes conformacionalmente de las proteínas tau, que se denominan "tauones" en la presente especificación, son semillas, centros de nucleación en un proceso de autopropagación de las formaciones de tau filamentosas que es correlativo con la expresión clínica de la enfermedad de Alzheimer, por lo que los tauones son dianas terapéuticas importantes de la enfermedad de Alzheimer. Los tauones pueden ser proteínas tau truncadas de forma anormal. La actividad biológica de los tauones se puede inhibir in vitro y dentro de las neuronas mediante los anticuerpos según la presente invención. Estos anticuerpos tienen la capacidad de teñir la presencia de los tauones en las etapas presintomáticas I, II y III de la AD, lo que los hace adecuados para el diagnóstico presintomático de esta enfermedad. Para los anticuerpos según la presente invención es crítico que este anticuerpo sólo reconozca la forma diferente conformacionalmente de la proteína tau (es decir, el "tauon") mientras que la proteína tau normal no se une a los anticuerpos según la presente invención.

En el curso de la presente invención se purificaron formas truncadas de proteína tau asociada a microtúbulos de AD hasta homogeneidad y se demostró que eran una parte principal de los aislamientos de tau filamentosa de las neuronas enfermas de Alzheimer. Los datos de secuencia de aminoácidos indicaron que el esqueleto de los tauones es indistinguible respecto al de la proteína tau pero los tauones podrían distinguirse inmunológicamente de la tau humana normal mediante la conformación diferente, tal como revelan los anticuerpos monoclonales específicos de conformación según la presente invención. Entre los ejemplos específicos de dichos anticuerpos se encuentran el anticuerpo monoclonal DC-11 que produce la linea celular de hibridoma que fue depositada en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) bajo el depósito No. 00082216 y el anticuerpo monoclonal DC-11/I que produce la linea celular de hibridoma DC-1/I y fue depositado en la ECACC bajo el depósito No. 00082215. Esta familia de anticuerpos monoclonales que se da a conocer con la presente invención se define mediante el reconocimiento de conformación especifica de tauon sin el reconocimiento de la tau humana normal soluble. La conformación diferente comparada con la tau humana normal, se atribuyó patológicamente al truncamiento anormal del extremo N terminal o tanto del extremo N terminal como del extremo C terminal de la molécula tau en las muestras ensayadas en los pacientes con enfermedad de Alzheimer. De forma interesante, la conformación diferente era independiente de la isoforma de tau y del nivel de fosforilación. El requisito patológico indispensable para que los tauones adquieran la conformación tipica es la presencia de dominios ricos en prolina y de unión a microtúbulos y de una o varias regiones flanqueantes truncadas. Además, los tauones se podrían distinguir de la tau humana normal por sus actividades patológicas, concretamente los tauones representan una semilla, un centro de nucleación, que inicia la agregación de tau y los tauones desensamblan microtúbulos ensamblados de la tau normal y de tubulina. Los tauones preincubados con anticuerpos según la presente invención, especialmente anticuerpos monoclonales de la familia DC-11 no mostraron capacidad alguna de desensamblaje o de ensamblaje de microtúbulos de la tau normal y de tubulina. Además, los tauones, tras la microinyección, provocan en neuronas humanas diferenciadas un desplazamiento significativo de la tau endógena de la fracción de tau unida a microtúbulos, la retracción de los procesos neuronales y la degeneración de las células. Si los tauones se microinyectan conjuntamente con anticuerpos monoclonales según la presente invención, no se observan cambios neurodegenerativos en las neuronas diferenciadas. Esto muestra que los anticuerpos según la presente invención, especialmente los anticuerpos monoclonales DC-11, inhiben la actividad de los tauones intraneuronalmente y, por lo tanto, se podrían utilizar como fármacos intracelulares (por ejemplo, como anticuerpos intracelulares terapéuticos, intracuerpos). De forma inmunohistológica, tal como se observa con los anticuerpos según la presente invención, los tauones ya se encuentran en las fases presintomáticas I, II y III en pre-\alpha-neuronas, tanto en la región transentorrinal como entorrinal de la AD, por lo tanto, después del acoplamiento adecuado de los trazadores, los anticuerpos según la presente invención se podrían utilizar para el diagnóstico presintomático intravital
de la AD.

Preferentemente, el anticuerpo presenta una especificidad, como mínimo, del 50%, preferentemente, como mínimo, del 90% por la forma diferente conformacionalmente de tau ("tauon") comparada con el anticuerpo DC-11. La especificidad se puede ensayar mediante cualquier ensayo estándar disponible para la detección de especificidad de anticuerpo, por ejemplo, ensayos ELISA, radioinmunoensayos, microscopía de fuerza atómica con parejas de unión enlazadas al cantilever, etc.

Preferentemente, se dice que el anticuerpo según la presente invención es "reactivo específicamente" con una molécula si es capaz de unirse con una molécula para acoplar, de este modo, la molécula al anticuerpo. El término "epitopo" se pretende que haga referencia a la parte de un antígeno que puede ser reconocida por el anticuerpo y unirse al mismo. Un antígeno puede tener uno o más epitopos. Un "antígeno" es capaz de inducir que un animal produzca un anticuerpo capaz de unirse a un epitopo de ese antígeno. La reacción específica a la que se ha hecho referencia anteriormente se pretende que indique que el antígeno inmunoreaccionará, de una forma altamente selectiva, con su anticuerpo correspondiente y no con la multitud de otros anticuerpos que pueden ser provocados por otros
antígenos.

Anticuerpos especialmente preferentes según la presente invención provienen de las líneas celulares de hibridoma depositadas DC-11 (ECACC depósito No. 00082216) y DC-11/I (ECACC depósito No. 00082215) presentan una especificidad y selectividad elevadas y reaccionarán con formas de tau conformacionalmente diferentes ("tauon"), pero no lo harán con tau normal soluble. La especificidad se puede ensayar mediante cualquier ensayo estándar disponible para la detección de especificidad de anticuerpo, por ejemplo, ensayos ELISA, radioinmunoensayos, etc.

Tal como se utiliza en el presente documento "anticuerpo" se pretende que incluya moléculas intactas y fragmentos de las mismas, asi como derivados sintéticos y biológicos de las mismas, tales como, por ejemplo, fragmentos Fab, F(ab')_{2} y F_{v} libres o expresados, por ejemplo, sobre la superficie de fagos filamentosos sobre pIII o pVIII u otras proteínas de superficie, o sobre la superficie de bacterias, que son capaces de unirse a un antígeno. Los fragmentos Fab, F(ab')_{2} y F_{v} carecen de los fragmentos F_{c} de un anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación y pueden tener menos unión a tejido no especifica del anticuerpo. Además, el anticuerpo F_{v} (frecuentemente denominado minicuerpo) se puede diseñar fácilmente para transportar en su extremo C terminal un trazador específico y utilizase para el diagnóstico presintomático temprano de la AD, dado que las fases I, II y III de la AD que se reconocen por los anticuerpos según la presente invención no están asociadas al deterioro intelectual.

En la presente invención, son preferentes anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpos monoclonales. Por lo tanto, según otro aspecto de la presente invención también se refiere a las líneas celulares de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal según la presente invención.

El término "tau", tal como se utiliza en la presente solicitud, se refiere a la isoforma más larga de la proteína tau humana asociada a microtúbulos que contiene todas las inserciones por corte y empalme alternativo, tal como describen M. Goedert y otros, 1989.

Por consiguiente, se da a conocer una nueva familia de moléculas localizadas intra y extraneuronalmente, una forma soluble e insoluble truncada de forma anormal de proteínas tau que son diferentes conformacionalmente de la tau normal y se denominan "tauones", que se pueden detectar mediante los métodos de detección de la presente invención utilizando los anticuerpos de la presente invención.

Los "tauones", por lo tanto, son formas diferentes conformacionalmente de la proteína tau que son reconocidas específicamente por los anticuerpos según la presente invención. Los tauones comprenden la secuencia SEQ ID No. 1 y pueden estar flanqueados por otros aminoácidos (véase SEQ ID No. 2, 3). Los tauones, de forma conveniente, se encuentran en el intervalo de aproximadamente 100 a 400 aminoácidos y representan formas truncadas de la proteína tau en este intervalo. Los tauones pueden estar truncados de forma anormal en el extremo N terminal o en ambos extremos terminales (véase figuras 2-13). El término "truncado de forma anormal", tal como se utiliza en el presente documento, hace referencia a péptidos tau ("tauones") identificados en neuronas enfermas de la AD con anticuerpos monoclonales específicos de tauon que se dan a conocer con la presente invención.

Las formas truncadas de forma anormal de las proteínas tau humanas, tauones, se pueden preparar utilizando cualquiera de las numerosas técnicas recombinantes sintéticas bien conocidas. Brevemente, la mayor parte de las técnicas que se utilizan para transformar células, construir vectores, extraer ARN mensajero, preparar bibliotecas de ADNc y similares se practican ampliamente en la técnica, y la mayor parte de los especialistas que las practican están familiarizados con los materiales y recursos estándares que describen las condiciones y procedimientos específicos. Sin embargo, por conveniencia, los siguientes párrafos pueden servir de guía.

El sistema procariota más comúnmente utilizado para la producción de proteínas recombinantes sigue siendo E. Coli, sin embargo, también se pueden utilizar otras cepas microbianas, tales como Bacilos, por ejemplo, Bacillus subtilis, diversas especies de Pseudomonas, u otras cepas bacterianas. En dichos sistemas procariotas, se utilizan vectores de plásmidos que contienen sitios de replicación y secuencias de control derivadas de una especie compatible con el huésped. Entre las secuencias de control procariotas utilizadas comúnmente se incluyen los promotores para la iniciación de la transcripción, opcionalmente con un operador, junto con las secuencias de sitio de unión a ribosoma.

Actualmente también están disponibles una gran variedad de huéspedes eucariotas para la producción de proteínas foráneas recombinantes. Tal como en las bacterias, los huéspedes eucariotas se pueden transformar con sistemas de expresión que producen la proteína deseada directamente, pero de forma más común, se proporcionan secuencias de señal para provocar la secreción de la proteína. Los sistemas eucariotas tienen la ventaja adicional de que son capaces de procesar intrones que pueden estar presentes en las secuencias genómicas que codifican proteínas de organismos superiores. Los sistemas eucariotas también proporcionan una gran variedad de mecanismos de procesamiento que dan como resultado, por ejemplo, la glicosilación, oxidación o derivatización de ciertos residuos de aminoácidos, el control conformacional, etc.

Entre los sistemas eucariotas utilizados de forma común se incluyen levaduras, células de insectos, células de mamíferos, células de aves y células de plantas superiores. La lista no es exhaustiva. Están disponibles promotores adecuados que son compatibles y operables para la utilización en cada uno de estos tipos de huésped, así como lo son las secuencias de terminación y los potenciadores, tales como, por ejemplo, el promotor de poliedro de baculovirus. Tal como se ha indicado anteriormente, los promotores pueden ser constitutivos o bien inducibles. Por ejemplo, en sistemas mamíferos, el promotor MTII se puede inducir mediante la adición de iones de metales pesados.

Los especialistas en la técnica conocen los detalles para la construcción de sistemas de expresión adecuados para el huésped deseado. Para la producción recombinante de la proteína, la codificación del ADN de forma adecuada está ligada al sistema de expresión de elección y el sistema, a continuación, se transforma en la célula del huésped compatible, que a continuación, se cultiva y se mantiene bajo condiciones en las que tiene lugar la expresión del gen foráneo. Los tauones producidos de esta forma se recuperan del cultivo, mediante el lisado de las células o bien a partir del medio de cultivo, tal como los especialistas en la técnica conocen de forma adecuada.

Las uniones correctas para la construcción de plásmidos se pueden confirmar mediante la transformación primera de un huésped adecuado con la mezcla de unión. Los transformantes satisfactorios se seleccionan mediante ampicilina, tetraciclina u otra resistencia a antibióticos o utilizando otros marcadores, dependiendo del modo de la construcción del plásmido, tal como se entiende en la técnica.

La presente solicitud, por lo tanto, da a conocer la preparación de tauones, especialmente a partir de fuentes humanas o recombinantes, estando libres esencialmente de otras proteínas, especialmente a partir de proteínas tau normales. Dichas preparaciones se pueden aportar mediante procedimientos que implican una etapa de inmunoafinidad utilizando los anticuerpos según la presente invención. Preferentemente, la preparación según la presente invención contiene más del 80% de tauones, especialmente más del 95% de tauones, respecto a la proteína total.

Además, la presente invención también se refiere a un kit, tal como se define en las reivindicaciones, para la detección de tauones, formas truncadas de forma anormal de la proteína tau, que son diferentes conformacionalmente de la tau normal en una muestra de tejido de cerebro con enfermedad de Alzheimer o en una muestra de un fluido corporal que comprende un anticuerpo según la presente invención y un recipiente adecuado para proporcionar la muestra. Es posible proporcionar los anticuerpos en un kit para la detección o aislamiento de tauones. Con la ayuda de los anticuerpos según la presente invención las proteínas tauones se pueden detectar y aislar de varias fuentes, entre las que se incluyen neuronas enfermas de Alzheimer de la región transentorrinal, entorrinal y del hipocampo. Los tauones aislados de este modo se pueden utilizar adicionalmente como inmunógenos para la inmunización, por ejemplo, de ratones para la construcción de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales específicos contra tauones que no reconocen la tau normal de longitud completa. Este método comprende la identificación y liberación de neuronas de la región transentorrinal, entorrinal y del hipocampo de tejidos de cerebro enfermo de Alzheimer en la solución que conserva la conformación anormal de tauones.

Después de la preparación y purificación, los tauones se utilizan como inmunógenos y se inyectan por vía subcutánea en ratones en intervalos mensuales. Los bazos de estos animales se utilizan para la construcción de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales contra tauones. Éstos se pueden producir utilizando técnicas de hibridoma bien establecidas, introducidas por primera vez por Köhler y Milstein (véase M. Köhler y C. Milstein, "Cultivos continuos de células fusionadas que secretan anticuerpos con especificidad predefinida" ("Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Pre-Defined Specificity"), Nature, 256, págs. 495-497, 1975). Después de una inmunización suficientemente larga, se obtienen linfocitos del animal que producen anticuerpos a partir del bazo, de los nódulos linfáticos o bien de la sangre periférica. Preferentemente, los linfocitos se obtienen a partir del bazo. Los linfocitos esplénicos se fusionan, a continuación, con una linea celular de mieloma, habitualmente en presencia de un agente de fusión, tal como polietilenglicol (PEG). Se puede utilizar cualquier numero de líneas celulares de mieloma como pareja de fusión según técnicas estándares; por ejemplo, las líneas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653. Las células resultantes, que incluyen los hibridomas deseados, se hacen crecer, a continuación, en un medio selectivo, tal como un medio HAT, en el cual la célula de mieloma o linfocito parental sin fusionar finalmente muere. Sólo sobreviven las células de hibridoma y se pueden hacer crecer bajo condiciones limitantes para obtener clones aislados. Se hace un cribado de los sobrenadantes de los hibridomas para detectar la presencia de anticuerpos de la especificidad deseada, por ejemplo, mediante técnicas de inmunoensayo que utilizan el antígeno que se habla utilizado para la inmunización. A continuación, los clones positivos se pueden subclonar bajo condiciones de dilución limitantes o sobre agar blando y el anticuerpo monoclonal producido se puede aislar. Los hibridomas producidos según estos métodos se pueden propagar in vitro o in vivo (en fluido de ascitos) mediante técnicas conocidas en la materia. Entre los métodos utilizados comúnmente para la purificación de anticuerpos monoclonales se incluyen la precipitación con sulfato amónico, el intercambio iónico, la cromatografía y la cromatografía de afinidad (véase por ejemplo, H. Zola y otros, "Técnicas para la producción y caracterización de anticuerpos monoclonales" ("Techníques for the Production and Characterization of Monoclonal Antibodies"), en Monoclonal Hibridoma Antibodies: Techniques and Applications, J. G. R. Hurell (editores), págs. 51-52 (CRC Press 1982)).

Preferentemente, el kit según la presente invención contiene adicionalmente medios para la detención del fenómeno de unión de dicha unión del anticuerpo a dicha proteína tau diferente conformacionalmente. Preferentemente, los anticuerpos secundarios, especialmente los anticuerpos secundarios que están marcados específicamente. También se puede utilizar la tecnología de partículas magnéticas dentro del alcance de la presente invención, así como otros métodos de identificación de proteínas que utilizan anticuerpos. El método comprende la identificación en una muestra de ensayo de la persona, del tauon, que es una proteína tau truncada de forma anormal. La "muestra de ensayo", tal como se utiliza en el presente documento, hace referencia a la muestra biológica de la persona que se sospecha que contiene tauones. La muestra de ensayo puede comprender tejido de cerebro que tiene proteínas tau truncadas de forma anormal, tal como tejido del hipocampo o tejido de la corteza frontal, o la muestra de ensayo puede comprender fluido cerebroespinal (CSF). En una realización preferente, la muestra de ensayo comprende CSF y la proteína identificada es CSF-tauon. La identificación de proteínas tau truncadas de forma anormal, tauones, comprende, de forma conveniente, la identificación en la muestra de ensayo de antígenos capaces de unirse a anticuerpos específicamente reactivos con proteínas tau truncadas de forma anormal, tauones, que comprenden la secuencia (SEQ ID No: 1) y flanqueada por aminoácidos de modo que dichos tauones se encuentran en el intervalo desde aproximadamente 100 hasta 400 aminoácidos de longitud y se caracterizan por la conformación especifica del tauon diferente a la de la proteína tau normal soluble, o anticuerpos específicamente reactivos con proteínas tau truncadas de forma anormal, tauones, que comprenden la secuencia (SEQ ID No. 1) y flanqueada por aminoácidos de tal modo que dichos tauones se encuentran en el intervalo desde aproximadamente 100 hasta 400 aminoácidos de longitud y se caracteriza por la conformación especifica del tauon diferente a la de la proteína tau normal soluble. La presencia de un tauon indica una enfermedad asociada a la acumulación de tauones en pacientes con AD y otros afectados de tauopatías.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método, tal como se define en las reivindicaciones, para la detección de una forma de la proteína tau truncada de forma anormal que es diferente conformacionalmente de la tau normal en un fluido corporal de un paciente que comprende una mezcla de dicho fluido corporal con un anticuerpo según la presente invención, la detección de la presencia de un fenómeno de unión entre el anticuerpo y la proteína tau diferente conformacionalmente (tauon) y la medición, de forma opcional, de la cantidad de proteína tau diferente conformacionalmente unida a dicho anticuerpo. La presencia de un tauon indica una enfermedad asociada a la acumulación de los tauones en una persona, que incluye la AD y otras tauopatías. El fluido corporal de un paciente puede ser cualquier muestra de ensayo biológica de una persona que se sospecha que contiene tauones. Este fluido corporal puede comprender tejido de cerebro, tal como tejido del hipocampo o frontal o un tejido de la corteza o fluido cerebroespinal (CSF). En una realización preferente ele fluido corporal comprende CSF y la proteína identificada es CSF-tauones.

Esta identificación de los tauones se puede conseguir de forma conveniente mediante medios bioquímicos o citoquímicos o mediante inmunoensayos enzimáticos, tales como los que se describen en muchos manuales de productores de inmunoensayos, tal como se conoce en la técnica. Cuando se utilizan medios bioquímicos, se utilizan preferentemente de 0,01 a 10 g, especialmente de 0, 5 a 1 g de tejido que contiene proteína tau enferma, se separa en un gel y se identifica mediante transferencia Western. Dicha técnica se cree que es adecuada en ausencia de controles que coinciden con la edad que se ha demostrado que no son reactivos con anticuerpos según la presente invención. Los métodos citoquímicos, la tinción, han demostrado que no tienen reactividad con el tejido normal.

Se estudió el CSF de pacientes con AD y pacientes con enfermedades neurológicas diferentes de AD, así como de individuos normales mediante ELISA para cuantificar el nivel de tauones. El nivel de CSF-tauon aumentó significativamente en pacientes con AD si se comparaba con el de pacientes con enfermedades neurológicas diferentes de AD y con el de los controles. En la AD, el aumento significativo se encontró independientemente de la edad de partida, del genotipo E de apolipoproteína y de la fase clínica. Las transferencias Western de las proteínas CSF de AD revelan algunas bandas inmunoreactivas con peso molecular aparente entre 50 y 15 kD que es coherente con las proteínas tau truncadas de forma anormal. Estos resultados indican que los CSF-tauones reflejan esa acumulación progresiva de tau enferma causada por la progresión de la AD.

Según un aspecto adicional, los anticuerpos según la presente invención se pueden utilizar para la preparación de fármacos para el tratamiento de pacientes con enfermedad de Alzheimer. Los anticuerpos se pueden modificar biotecnológicamente en moléculas de cadena simple equipadas con una secuencia dirigida capaz de liberarlas en células de neuroblastoma que expresan tauones. Dentro del presente modelo celular de AD, los anticuerpos se unen a tauones e interfieren con sus efectos patológicos (secuestro de tau normal) y aumentan la degradación de formas de la proteína tau truncadas de forma anormal. Los ensayos in vitro (secuestro de la proteína tau, ensamblaje de filamentos, desensamblaje de microtúbulos) con proteínas tau truncadas de forma anormal y su correlación con la gravedad de enfermedad de Alzheimer muestran que son importantes dianas de fármacos.

La presente invención se describirá con más detalle mediante los siguientes ejemplos y figuras a los cuales la presente invención no debería limitarse.

La figura 1 muestra una vista general de la preparación de tauones;

la figura 2 muestra una representación esquemática a modo de resumen de las secuencias de aminoácidos de los tauones; la figura 3 muestra un tauon mínimo;

la figura 4 muestra un tauon truncado en el extremo C terminal;

la figura 5 muestra un tauon truncado en el extremo N terminal;

la figura 6 muestra una representación esquemática de tau;

la figura 7 muestra la tau 37 humana;

la figura 8 muestra la tau 39 humana;

la figura 9 muestra la tau 40 humana;

la figura 10 muestra la tau 43 humana;

la figura 11 muestra la tau 44 humana;

la figura 12 muestra la tau 4 6 humana; y

la figura 13 muestra la tau grande de rata.

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Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de los anticuerpos monoclonales de la familia DC 11 específicos de tauones Preparación de tauones solubles e insolubles como antígenos para inmunización (figura 1)

Para el aislamiento de tauones de cerebros AD humanos, se desarrolló una estrategia nueva que está basada parcialmente en los métodos descritos por Kopke y otros, (1993) y Greenberg y Davies (1990). Se seleccionaron cerebros humanos que mostraban cambios característicos en las fases I.-III. de Braak de la AD con un retraso post-mortem corto (PMD). Se seleccionaron bloques del lóbulo temporal que incluían las regiones entorrinal y transentorrínal, la amígdala y la región del hipocampo. El tejido se diseccionó y se sumergió inmediatamente en medio esencial mínimo (Gibco). El tejido se cortó de forma fina y se presionó a través de un tamiz de alambre de 150 \mum mesh. En esta fase la muestra de cerebro se dividió en dos alícuotas: muestra A y muestra B.

La muestra A se volvió a procesar en TRIS 20 mM, pH 8, sacarosa 0,32 M, \beta-mercaptoetanol 10 mM, EGTA 5 mM, EDTA 1 mM, MgSO_{4} 5 mM, benzamidina 5 mM, glicerolf os f ato 10 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 6 mM, fluoruro sódico 50 mM, 5 \mug/ml de leupeptina, 1,5 \mug/ml de pepstatina y 2 \mug/ml de aprotinina y se centrifugó a 25000 x g durante 35 minutos a 4ºC para eliminar los restos celulares. A continuación, el sobrenadante se hizo sedimentar a 200000 x g durante 40 minutos. El sedimento resultante se extrajo con urea 8 M a temperatura ambiente durante 70 minutos y se hizo centrifugar a 300000 x g durante 45 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se dializó durante 24 horas contra el TRIS 10 mM pH 7,6 con cambios frecuentes y, a continuación, se dializó durante 24 horas contra MES 100 mM, MgCl_{2} 0,5 mM, EDTA 1 mM, EGTA 2 mM, ditiotreitol 1 mM, NaCl 0,75 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,1 mM y NaF 50 mM, pH 2,7. Las proteínas precipitadas se eliminaron mediante centrifugación a 200000 x g durante 40 min. El sobrenadante de 200000 x g se dializó contra MES 25 mM, pH 6,4, MgCl, 0,5 mM, EDTA 0,1 mM y ditiotreitol 1 mM y posteriormente se fraccionó sobre una columna de Fosfato de Celulosa que se equilibró con el mismo tampón. La columna se cargó con 2 mg/ml de proteínas y se eluyó con 20 ml de gradiente lineal de NaCl (0-1 M) en tampón equilibrante. Las proteínas que se eluyeron con NaCl 0,1-0,8 M se analizaron mediante transferencia Western y se concentraron mediante un aparato de vacío con velocidad.

La muestra B se colocó en 10 volúmenes de tampón frío (TRIS 10 mM, EGTA 1 mM, NaCl 0,8 M, sacarosa al 10., pH 7,4) en un homogeneizador de vidrio. Después de la centrifugación a 27000 x g durante 30 minutos a 4ºC, el sobrenadante se rescató y el sedimente se homogeneizó con el tampón y se centrifugó a 27000 x g durante 30 minutos. Los sobrenadantes de 27000 x g de ambas centrifugaciones se combinaron, se ajustaron al 1. (peso/volumen) de N-lauroilsarcosina y al 1% (volumen/volumen) de \beta-mercaptoetanol y se incubaron a 37ºC durante 3 horas en un mezclador. Después de la centrifugación a 35000 rpm durante 30 minutos, el sedimento se homogeneizó en 5 ml de tampón homogeneizador complementado con el 1% de mercaptoetanol y se filtró a través de un filtro de 0,45 \mum. El filtrado se centrifugó a 35 000 rpm durante 1 hora. El sedimento se resuspendió en Tris 50 mM, pH 6,8 y se extrajo con ácido fórmico al 2,5 ó durante 2 minutos y, a continuación, se centrifugó a 10000 x g durante 10 minutos hasta sedimentar el material insoluble. El sobrenadante se dializó durante la noche a 4ºC contra Tris 10 mM, pH 7,4 y se centrifugó de igual forma que anteriormente. El sobrenadante resultante (fracción II) se concentró mediante un aparato de vacío con velocidad y se analizó mediante SDS-PAGE seguido de una transferencia Western. El sedimento de la muestra B después de la extracción con ácido fórmico al 2,5' que contenía los tauones insolubles (fracción III) se rescató y se utilizó para inmunizaciones y ensayo dot. Los tauones de las fracciones (I, II y III) se almacenaron y se utilizaron como antígenos (véase figura 1) para la inmunización de ratones.

Preparación de hibridomas que producen la familia de anticuerpos monoclonales DC-11

Se dividieron en tres grupos (A, B, C) ratones Balb/c de seis semanas de vida. Los dos primeros grupos (A,B) se cebaron con 50 \mug de antígeno en adyuvante de Freund completo (Sigrria) y se estimularon cinco veces en intervalos de tres semanas con 50 \mug del mismo antígeno (Ag) en adyuvante de Freund incompleto. En el grupo A todas las dosis se inyectaron en la almohadilla de la pata y en el grupo B las dosis de Ag se administraron por vía subcutánea. El tercer grupo de ratones se inyectaron sólo con una dosis directamente en el bazo en PBS (inmunización intraesplénica) y una semana más tarde dichos cebadores fueron los bazos utilizados para la fusión. Tres días antes de la fusión, los ratones en los grupos A y B se inyectaron por vía intravenosa con 50 \mug de inmunógeno en PBS. Las células del bazo de ratones inmunizados se fusionaron con células de mieloma NS/0 según el método de Kontsekova y otros, 1988. Se mezclaron 10^{8} esplenocitos con 2 x 10^{7} células de mieloma NS/0 (proporción 5:1) y se fusionaron durante 1 minuto en 1 ml de PEG 1550 al 50% (Serva) en medio Eagle modificado de Dulbecco libre de suero (DMEM) complementado con el 10% de dimetilsulfóxido. Las células fusionadas se resuspendieron en DMEM que contenía el 20 de suero de caballo, L glutamina (2 mM), hipoxantina (0,1 mM), aminopterina (0, 004 mM), timidina (0,01.6 mM) y gentamicina (40 U/ml) a una densidad de 2,5 x 10^{5} células de bazo por pocillo sobre placas de 96 pocillos. Las células se incubaron durante 10 días a 37ºC y los hibridomas que crecían se cribaron para la producción de anticuerpos monoclonales específicos anti-tauon mediante ELISA y mediante inmunohistoquímica.

Cribado de anticuerpos anti-tauones mediante ELISA

Se utilizó un ELISA para detectar anticuerpos monoclonales en sobrenadantes de cultivos de hibridoma que se dirigieron contra tauones. Como fase sólida se utilizaron tauones preparados tal como se ha descrito anteriormente con la siguiente modificación. Se separó la parte reservada de la tau de las fracciones concentrada al vacío con velocidad mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida y se recuperaron las formas truncadas de la proteína tau mediante electroelución según el método de Donofrio y otros, (1986) y se evaluaron mediante SDS-PAGE. Se recubrieron placas de microtitulación durante la noche con proteínas tau truncadas de forma anormal (10 \mug/ml, 50 \mul/pocillo) a 4ºC en PBS. Después del bloqueo con leche secada desnatada al 1% para reducir la unión no específica, las placas se lavaron con PBS-0,05% de Tween 20 y se incubaron con 50 \mul/pocillo de sobrenadante de cultivo durante 1 hora a 37ºC. Se detectaron los anticuerpos monoclonales unidos con Ig de oveja anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante (DAKO). La reacción se reveló con una solución de o-fenilendiamína como sustrato de la peroxidasa y se paró con 50 \mul de H_{2}SO_{4} 2 M. Se midió la absorbancia a 492 nm mediante un lector de ELISA Multiscan MCC/340 (Labsystems). Se consideraron positivas las lecturas, como mínimo, del doble del valor de los controles
negativos.

Los cultivos positivos se volvieron a subclonar en agar blando según el procedimiento de Kontsekova y otros, 1991. Los subclones aislados se volvieron a cribar para la producción de anticuerpos monoclonales específicos anti-tauones.

Cribado inmunohistoquímico de anticuerpos anti-tauones

Se volvieron a cribar los anticuerpos monoclonales identificados como positivos en ELISA anti-tauon y los negativos sobre tau normal en tejidos de cerebros de AD para su especificidad, de la siguiente forma.

Los cerebros de pacientes con AD extraídos durante una autopsia se seccionaron en intervalos de 1 cm en la placa coronal y se almacenaron a -20ºC. Los bloques del hipocampo, entorrinal, de la corteza temporal, frontal, occipital y parietal se fijaron en paraformaldehido al 4% tamponado a 4ºC durante mas de 4 días. Se cortaron series de secciones frontales (50 \mum) en un vibratome y se almacenaron en PBS (pH 7,0) a 4ºC. Se pretrataron secciones de vibratome flotante libre durante 2-3 minutos con ácido fórmico frío al 98%, incubado con suero preinmune en PBS/Triton X 100. El suero utilizado era de la misma especie animal que el del anticuerpo secundario. La incubación de las secciones se realizó con el anticuerpo monoclonal positivo en ELISA (tal como se ha descrito anteriormente) durante 60 minutos a 37ºC.

La incubación con el segundo anticuerpo biotinilado (kit Vectastain Elite, Vector) se llevó a cabo durante 1 hora a temperatura ambiente. Las inmunoreacciones se visualizaron con el complejo avidina-biotina-peroxidasa (kit Vectastain Elite, Vector) y 6 mg de 3-3-diaminobenzidina-4 HC1 (SIGMA), 250 mg de NiCl_{2} (MERCK) en 10 ml de tampón acetato 0,1 M (pH 6) con 100 \mul de H_{2}O_{2}. La reacción se terminó lavando las secciones en PBS/Triton (Kiss y otros, 1988; Cuello y otros, 1993, Thorpe y Kerr, 1994).

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Ejemplo 2 Determinación cuantitativa de las proteínas tau truncadas de forma anormal (tauones) utilizando la familia DC-11 de anticuerpos monoclonales

Los tauones se aislaron tal como se ha descrito anteriormente. La combinación del anticuerpo monoclonal DC 30 (que reconoce tanto la tau normal como la patológica) y la familia DC-11 de anticuerpos monoclonales (específicos para tau truncada de forma anormal) permite la cuantificación de tauones en las muestras ensayadas preparadas a partir de cerebros AD. Los anticuerpos se purificaron a partir de un medio libre de suero mediante una cromatografía en columna de proteína A. Los pocillos de placa de microtitulación de elevada unión (Nunc) se recubrieron con una mezcla de anticuerpos monoclonales DC-11 a una concentración de 10 \mug/ml (50 \mul/pocillo) en PBS durante la noche a 4ºC. La unión no especifica en los pocillos se saturó añadiendo 200 \mul de leche secada desnatada al 1% en solución salina tamponada de fosfato (PBS) durante 60 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con PBS-Tween 20 al 0,05-: (v/v). Se añadieron los patrones diluidos en serie que contenían tauones recombinantes a concentraciones que oscilaban entre 100-1000 pg/ml en PBS, asi como las muestras de ensayo que contenían tauones AD en una cantidad de 50 \mul. Después de la incubación durante 60 minutos a 37ºC, las placas se lavaron y el anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante DC30 diluido 1/5000 en PBS se añadió (50 \mul/pocillo) durante 60 minutos a 37ºC. Después de un lavado final, se añadieron a los pocillos 50 \mul de solución de ortofenilendiamína y el 0,003% e H_{2}O_{2} y las placas se incubaron en oscuridad durante 20 minutos. La reacción se paró con 50 \mul de H_{2}O_{2} 2 M. Se leyó la absorbancia a 492 nm en un lector de ELISA Multiscan MC344 (Labsystems, Finlandia).

Se construyó la curva patrón de los tauones recombinantes a partir de los valores obtenidos y se determinaron las concentraciones correspondientes de tauones en las muestras ensayadas a partir de la curva patrón.

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Ejemplo 3 Detección de tauones mediante transferencia Western utilizando el anticuerpo monoclonal DC-11

Se cargaron tau humana de longitud completa recombinante purificada y proteínas tau truncadas de forma anormal, tauones, sobre geles de SDS-poliacrilamida con un gradiente del 5-20%. y se separaron bajo condiciones desnaturalizadas según Laemmli (1970). Después del SDS-PAGE, se llevó a cabo la transferencia sobre una membrana de difluoruro de polivínilo (Milipore) en un tampón CAPS 10 mM pH 12 durante 1 hora a 350 mA con frío. Después de la transferencia, la membrana se lavó en PBS y se bloqueó con leche secada desnatada al 1% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Las proteínas transferidas se incubaron durante la noche a 4ºC con anticuerpo monoclonal DC-11. Después del lavado con PBS-Tween 20 al 0,05% (v/v), se utilizó inmunoglobulina de rata anti-ratón marcada con peroxidasa de rábano picante a una dilución de 1/1000 y se incubó 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, la membrana se lavó cuatro veces en PBS-Tween 20, se reveló con solución de sustrato (12 mg de 4-cloro-1-naftol, 4 ml de metanol, 16 ml de PB, H_{2}O_{2} al 0,03% v/v) y la reacción se paró en H_{2}O. Los resultados indicaron que el anticuerpo DC-11 reconocía solamente las tau truncadas de forma anormal, tauones, al contrario, el anticuerpo monoclonal DC 30 es un anticuerpo de tau que reconoce universalmente todas las isoformas conocidas de tau de muchas especies (humana, de mono, vaca, cerdo, rata, ratón) independientemente de su estado de modificaciones postraduccionales.

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Ejemplo 4 Identificación inmunohistoquímica de tauones

La familia de anticuerpos monoclonales DC-11 es adecuada para la visualización de tauones en cerebros AD en diferentes tipos de procedimientos inmunohistoquímicos.

Marcado con microscopio óptico

Los cerebros de pacientes con AD extraídos durante una autopsia se seccionaron en intervalos de 1 cm en la placa coronal y se almacenaron a -20ºC. Los bloques del hipocampo, entorrinal, de la corteza temporal, frontal, occipital y parietal se fijaron en paraformaldehido al 4% tamponado a 4ºC durante más de 4 días. Se cortaron series de secciones frontales (50 \mum) en un vibratome y se almacenaron en PBS (pH 7,0) a 4ºC. Se pretrataron secciones de vibratome flotante libre durante 2-3 minutos con ácido fórmico frío al 98%, incubado con suero preinmune en PBS/Triton X 100. El suero utilizado era de la misma especie animal que la del anticuerpo secundario. La incubación de las secciones se realizó con el anticuerpo monoclonal DC-11 durante 60 minutos a 37ºC. La incubación con el segundo anticuerpo biotinilado (kit Vectastain Elite, Vector) se llevó a cabo durante 1 hora a temperatura ambiente. Las inmunoreacciones se visualizaron con el complejo avidina-biotina-peroxidasa (kit Vectastain Elite, Vector) y 6 mg de 3-3-diaminobenzidina-4 HCl (SIGMA), 250 mg de NiCl_{2} (MERCK) en 10 ml de tampón acetato 0,1 M (pH 6) con 100 \mul de H_{2}O_{2}. La reacción se terminó lavando las secciones en PBS/Triton (Kiss y otros, 1988; Cuello y otros, 1993, Thorpe y Kerr, 1994).

Marcado doble con microscopio óptico

Se pretrataron secciones de vibratome flotantes libres durante 2-3 minutos con ácido fórmico frío al 98%, incubado con suero preinmune en PBS/Triton X 100. El suero utilizado provenia de la misma especie animal que la del anticuerpo secundario. Las secciones se incubaron con un primer anticuerpo monoclonal DC-11 conjugado con peroxidasa a una dilución de 1:1000 en solución de bloqueo (5% de suero de caballo, PBS, 0,1% de Tritón) durante 60 minutos a 37ºC, se revelaron en DAB al 0,06%, H_{2}O_{2} al 0,01% en PBS (pH 7,2). La reacción se terminó lavando las secciones en PBS/Triton. La incubación de las mismas secciones con el segundo anticuerpo monoclonal ser realizó durante 60 minutos a 37ºC. La incubación con el anticuerpo biotinilado (kit Vectastain Elite, Vector) se llevó a cabo durante 1 hora a temperatura ambiente. La reacción se visualizó con el complejo avidina-biotina-peroxidasa (kit Vectastain Elite, Vector) y el 0,06% de 3-3-diaminobenzidina-4 HCL (SIGMA), el 0,01% de H_{2}O_{2}, el 2,5% de NiCl_{2} (MERCK) en tampón acetato 0,1 M y se terminó lavando las secciones en tampón acetato 0,1 M (Kiss y otros, 1988; Cuello,
1993).

Contratinción con violeta de cresilo rápido

Tras la finalización de la tinción inmunohistoquímica, las secciones se colocaron en portaobjetos de vidrio y se colocaron en un termostato durante 60 minutos a 56ºC. Después de la incubación los portaobjetos se sumergieron en agua destilada durante 5 minutos, se tiñeron en una solución de violeta de cresilo rápido durante 5-10 minutos a 4ºC, se aclararon con agua y se transfirieron a etanol al 96% hasta que la mayor parte de la tinción del violeta de cresilo se eliminó, se aclaró con xileno y se montó con Entellan.

Tinción inmuno fluorescente

Se pretrataron secciones de vibratome flotante libre (30 \mum) durante 2 minutos con ácido fórmico frío al 98%, incubadas con suero preinmune en PBS/Triton X 100. Las secciones se incubaron con un primer anticuerpo monoclonal DC-11 durante 60 minutos a 37ºC y, a continuación, se incubaron durante 30 minutos con un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado con FITC (Immunotech) diluido 1:500 en PBS/Triton a temperatura ambiente según métodos estándares utilizados en la técnica. Después del lavado con PBS, las secciones se incubaron con un anticuerpo primario conjugado con TRITC durante 60 minutos a 37ºC y se montaron en solución de parafenilendiamina al 0,1%/glicerol.

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Ejemplo 5 Ensayos de ensamblaje de microtúbulos y de unión a microtúbulos con los tauones Purificación de tubulina

Se aisló tubulina a partir de cerebros frescos de cerdo, obtenidos del matadero local, mediante ciclos de polimerización y despolimerización de microtúbulos dependientes de la temperatura, seguidos de cromatografía de intercambio iónico en fosfocelulosa (fosfocelulosa Watman P11) (Valee, 1986).

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Ensayo de ensamblaje de microtúbulos

Se mezclaron tauones purificados (5 mM) con tubulina purificada preaclarada (10 mM) y GTP (1 mM) en el tampón de ensamblaje (PIPES 100 mM pH 6,9, EGTA 2 mM, MgSO_{4} 1 mM) a +4ºC. Esta concentración de tubulina está por debajo de la concentración critica del ensamblaje espontáneo (Black, 1987). Las muestras se pipetearon en cubetas de cuarzo precalentadas a 37ºC. Se midió espectrofotométricamente el cambio de turbidez en un espectrofotómetro controlado termostáticamente (LKB) y se registró como cambio de OD_{350} en intervalos de 10 segundos durante un periodo de 30 minutos.

Ensayo de unión de microtúbulos

Se midieron las curvas de unión de los tauones con microtúbulos tal como se ha descrito previamente (Gustke, 1992). La tubulina purificada se incubó a 37ºC en presencia de GTP (1 mM) y taxol (20 \muM) en el tampón de unión (PIPES 100 mM pH 6,9, EGTA 1 mM, MgSO_{4} 1 mM, DTT 1 mM) durante 10 minutos. Los microtúbulos se estabilizaron con taxol que no interfiere en la unión de los tauones o de la proteína tau normal y otras MAP, respectivamente (Valee, 1986; Wallis, 1993) eliminando de este modo el efecto del ensamblaje de los microtúbulos. Los tauones se añadieron en concentraciones de 2,5 mM, 5 mM, 7,5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, respectivamente. Después de la centrifugación durante 35 minutos, 43000 x g, 37ºC los sedimentos se resuspendieron en tampón P (PIPES 50 mM pH 6,9, EGTA 1 mM, MgCl_{2} 0,2 mM, DTT 5 mM, NaCl 500 mM). El sobrenadante y los sedimentos se analizaron sobre geles de SDS-PAGE (Laemmli, 1970), teñidos con plata (Bloom, 1987). Los geles se escanearon sobre un escáner HPScanJet (Hewlett-Packard) y el análisis se llevó a cabo en un ordenador Macintosh utilizando el programa de dominio público NIH Image (desarrollado en el Instituto Nacional de Salud de Estados Unidos "U.S. National Institutes of Health" y disponible en la dirección de Internet http://rsb.info.nih.gov/nih-image/). Las intensidades de las bandas se convirtieron en concentraciones utilizando el método de los patrones internos y las curvas de calibración.

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Ejemplo 6 Preparación de tauones recombinantes

Las formas truncadas recombinantes de la proteína tau se prepararon utilizando el sistema "Erase a Base System" (Promega) según el manual técnico. El sistema se basa en la digestión especifica de la exonucleasa III del ADN insertado, empezando desde la parte sobresaliente en 5'. La velocidad de digestión fue uniforme a temperatura constante. El gen tau se clonó en un vector pET17b a través de sitios de restricción NdeI-EcoRI que producían pET/T40. En el extremo C del gen se añadió el sitio de restricción KpnI y tres codones de parada en los tres marcos de lectura más abajo del sitio KpnI. El enzima EcoRI deja extremos 5' sobresaliendo, el sustrato de exoIII. KpnI deja extremos 3' sobresaliendo, los cuales son resistentes a la digestión de exoIII. Se diluyó 1 \mug de vector pET/T40 digerido doblemente con EcoRI, KpnI/NEB y precipitado con etanol en 20 \mul de tampón 1 x ExoIII y se digirió mediante 80 u de exoIII a 37ºC/velocidad de digestión 450 bases/minuto. Se transfirieron muestras de 2,5 \mul después de la adición a intervalos de 30 segundos en una mezcla de 7,5 \mul de nucleasa S1/1,5 u de nucleasa S1 por 1 muestra en hielo. Las muestras recogidas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos para eliminar las colas de cadena simple que quedaban. Se utilizó ADN polimerasa Klenow para hacer extremos romos. Se transformaron células competentes DH5alfa directamente con mezclas ligantes de las muestras. Los subclones se cribaron mediante la restricción de PstI-XhoI y se secuenciaron construcciones adecuadas utilizando un cebador T7 en el vector pET.

Expresión, purificación y cuantificacion de tauones recombinantes

Se expresaron tauones en E. coli BL21 (DE3) (Studier, 1986). Se inocularon colonias de bacterias simples en 500 ml de LB AMP (medio LB, 100 \mug/ml de ampicilina). Los cultivos bacterianos se hicieron crecer a 37ºC en un mezclador rotativo hasta que su OD_{600} alcanzó 0,6-0,8 y, a continuación, se indujeron añadiendo IPTG (concentración final 0,4 mM). Después de 3 horas las células bacterianas se hicieron sedimentar mediante centrifugación a 5000 g durante 15 minutos a 4ºC (Sigma 6K15, rotor 12500), y los sedimentos de las células se congelaron rápidamente en nitrógeno liquido y se almacenaron a -70ºC hasta una utilización posterior. Para la preparación de lisados celulares, el sedimento bacteriano se resuspendió en tampón A: (PIPES 20 mM pH 6,9, NaCl 50 mM, EGTA 1 mM, MgSO_{4} 1 mM, DTT 2 mM, PMSF 0,1 mM), las células se alteraron mediante sonicación sobre hielo ruante 6 minutos y los restos de células se eliminaron mediante centrifugación a 45000 rpm, 15 minutos a +2ºC (rotor TLA-12O.2, Beckmann Optima TLX). Los sobrenadantes se filtraron a través de filtros de 0,22 \mum (Millipore) y los tauones se purificaron inmediatamente mediante cromatografía de intercambio iónico sobre columna de fosfocelulosa (fosfato de celulosa Whatman P11). Después de cargar la muestra la columna se lavó con 10 volúmenes de lecho del tampón A. Los tauones se eluyeron con 20 ml de un gradiente lineal de NaCl (50 mM-0,5 M) en el tampón A. Las fracciones de 1 ml se recogieron y las que contenían proteínas se identificaron sobre SDS-PAGE. La fracción que contenia los tauones se reservó y se dializó contra PBS 3 x 60 minutos a 4ºC. Alícuotas del dializado se secaron al vacío (SpeedVac) y se almacenaron a -20ºC. Los tauones recombinantes se cuantificaron mediante PAGE, utilizando albúmina de suero bovino (BSA) diluida en series como marcador patrón de masa. El gel se tiñó con azul Coomassie, se secó y la intensidad del BSA y de las bandas de tau se calculó utilizando Scion Image (Beta 3b, Scion Corp.). Se construyó la curva de calibración para la BSA y se utilizó para la cuantificación de los tauones.

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Ejemplo 7 Aislamiento de tauones de cerebro humano AD

Para el aislamiento de tauones de cerebros humanos AD se desarrolló una nueva estrategia basada parcialmente en los métodos descritos por Kopke y otros, (1993) y Greenberg y Davies (1990). Se seleccionaron cerebros humanos que mostraban cambios característicos de la etapa de Braak I.-III. de la AD con un retraso post-mortem corto (PMD). Se seleccionaron bloques del lóbulo temporal, que incluían las regiones entorrinal y transentorrinal, la amígdala y la región del hipocampo. El tejido se diseccionó e inmediatamente se sumergió en un medio esencial mínimo (Gibco). El tejido se cortó finamente y se pasó a través de un tamiz de alambres de 150 \mum mesh. En esta fase las muestras de cerebro se dividieron en dos alícuotas: muestra A y muestra B.

La muestra A se procesó adicionalmente en TRIS 20 mM, pH 8, sacarosa 0,32 M, \beta-mercaptoetanol 10 mM, EGTA 5 mM, EDTA 1 mM, MgSO_{4} 5 mM, benzamidina 5 mM, glicerolfosfato 10 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 6 mM, fluoruro sódico 50 mM, 5 \mug/ml de leupeptina, 1,5 \mug/ml de pepstatina y 2 \mug/ml de aprotinina y se centrifugó a 25000 x g durante 35 minutos a 4ºC hasta eliminar los restos de células. A continuación el sobrenadante se hizo sedimentar a 200000 x durante 40 minutos. El sedimento resultante se extrajo con urea 8 M a temperatura ambiente durante 70 minutos y se centrifugó a 300000 x g durante 45 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se dializó durante 24 horas contra el TRIS 10 mM pH 7,6 con cambios frecuentes y, a continuación, se dializó durante 24 horas contra MES 100 mM, MgCl_{2} 0,5 mM, EDTA 1 mM, EGTA 2 mM, ditiotreitol 1 mM, NaCl 0,75 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0,1 mM y NaF 50 mM, pH 2,7. Las proteínas precipitadas se eliminaron mediante centrifugación a 200000 g durante 40 minutos. El sobrenadante de 200000 x g se dializó contra MES 25 mM, pH 6,4, MgCl_{2} 0,5 mM, EDTA 0,1 mM y ditiotreitol 1 mM y posteriormente se fraccionó sobre una columna de Fosfato de Celulosa que se equilibró con el mismo tampón. La columna se cargó con 2 mg de proteínas y se eluyó con un gradiente lineal de NaCl (0-1M) en tampón equilibrante. Las proteínas se eluyeron con NaCl 0,1-0,8 M se evaluaron mediante transferencia Western y se concentraron mediante un aparato de vacío con velocidad.

La muestra B se colocó en 10 volúmenes de tampón frío (TRIS 10 mM, EGTA 1 mM, NaCl 0,8 M, sacarosa al 10, pH 7,4) en un homogeneizador de vidrio. Después de la centrifugación a 27000 g durante 30 minutos a 4?C, el sobrenadante se recuperó y el sedimento se homogeneizó con el tampón y se centrifugó a 27000 x g durante 30 minutos. Los sobrenadantes de 27000 x g de las dos centrifugaciones se combinaron, se ajustaron hasta el 1% (peso/vol) de N-lauroilsarcosina y el 1% (vol/vol) de \beta-mercaptoetanol y se incubaron a 37ºC durante 3 horas mientras se agitaban en un mezclador. Después de la centrifugación a 35000 rpm durante 30 minutos, el sedimento se homogeneizó en 5 ml de tampón homogeneizante complementado con el 1% de mercaptoetanol y se filtró a través de un filtro de 0,45 \mum. El filtrado se centrifugó a 35000 rpm durante 1 hora. El sedimento se resuspendió en Tris 50 mM, pH 6,8 y se extrajo con ácido fórmico al 2, 5durante 2 minutos y, a continuación, se centrifugó a 10000 x g durante 10 minutos hasta sedimentar el material insoluble. El sobrenadante se dializó durante la noche a 4ºC contra Tris 10 mM, pH 7,4 y se centrifugó tal como anteriormente. El sobrenadante resultante se concentró mediante un aparato de vacio con velocidad y se evaluó mediante SDS-PAGE seguido de transferencia Western.

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Ejemplo 8 Purificación de la tau normal a partir de tejidos de cerebro humano, de cerdo y de vaca

Se purificó la tau mediante la modificación del método de Lindwall y Cole., 1984. Se homogeneizó tejido de cerebro (1 mg/ml) en MES 0,1 mM, MgCl_{2} 0,5 mM, EGTA 1 mM, NaCl 1 M pH 6,5 y se centrifugó a 100000 x g a 4ºC durante 90 minutos. El sobrenadante se preparó hasta el 0,5% (v/v) de 2-mercaptoetanol, se calentó a 100ºC durante 5 minutos y se centrifugó a 20000 x g a 4ºC durante 30 minutos. Este segundo sobrenadante se llevó hasta el 45 de saturación en (NH_{4})_{2}SO_{4} y se centrifugó a 20000 x g tal como anteriormente y el sedimento resultante se resuspendió en tampón MES sin NaCl. Después de la precipitación con ácido perclórico al 2,5% (v/v) y una centrifugación adicional a 20000 x g el sobrenadante final se dializó contra Tris 5 mM, pH 7,4 durante la noche a 4ºC.

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Ejemplo 9 Secuestro y agregación de la tau normal en ovillos de filamentos por los tauones

Se mezclaron cantidades crecientes de tau normal (5-100 \mug/100 \mul) con cantidades fijas de tauones aislados de la fracción I (10 \mug/100 \mul). La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 100 ml de tampón de unión (MES 100 mM pH 7,6 que contenia EGTA 2 mM, 2% de albúmina de suero bovino, MgCl_{2} 0,5 mM, aprotinina 1 \muM y leupeptina 20 \muM). La mezcla se dejó interaccionar durante 45 minutos a temperatura ambiente, a continuación se superpuso sobre 150 \mul de sacarosa al 80% en el tampón de unión y se centrifugó durante 1 hora a 100 000 x g. Los 150 \mul de la parte superior se eliminaron y el resto se sonicó para la determinación de la interacción entre tauones y tau normal mediante ensayo radioinmuno-dot-blot. La presencia de tau en la capa de sacarosa indica el secuestro de la tau sana por parte de los tauones.

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Ejemplo 10 Inhibición de la degeneración de las neuronas por la familia de anticuerpos monoclonales DC-11

Se colocaron en placas Petri por triplicado células de blastoma neuronal y factor de crecimiento. El primer grupo solamente recibió tauones y el segundo recibió tauones y la mezcla de anticuerpos monoclonales DC-11.

Detección de los tauones transfectados por inmunofluorescencia

Las células se permeabilizaron durante 5 minutos a temperatura ambiente en Tritón X 100 al 2% que contenia PIPES 80 mm, MgCl_{2} 1 mM, EGTA 1 mM, pH 6,6. La fijación de las células se llevó a cabo en paraformaldehido al 2% en el mismo tampón durante 15 minutos sobre hielo. Los tauones se detectaron por el sistema de detección con avidina rodamina de inmunofluorescencia indirecta (Sigma).

Detección de la inhibición temprana de la diferenciación neuronal

Las células se hicieron crecer con los factores inductores de diferenciación. Se evaluó el nivel de diferenciación. El grupo de células que contenían tauones sin anticuerpos tenia una capacidad de diferenciación significativamente alterada. Sin embargo, el grupo tratado con la mezcla de tauones y anticuerpos se diferenció a un nivel comparable con el de las células del grupo de control tratado con la proteína irrelevante.

Referencias

Black MM (1987) "Comparación de los efectos de la proteína 2 asociada a microtúbulos y de la tau en la densidad de empaquetamiento de los microtúbulos ensamblados in vitro" ("Comparison of the effects of microtubule-associated protein 2 and tau on the packing density of in vitro assembled microtubules") Proc Natl Acad Sci USA 84: 7783-7787.

Blessed G, Tomlison BE, Roth M (1968) "La asociación entre las mediciones cualitativas de la demencia y el cambio senil en la materia gris cerebral de sujetos con edad avanzada" ("The association between qualitative measaures of dementia and senile change in cerebral grey matter of elderly subjects"). Br J Psychiatry 114: 797-811.

Bloom H, Beier H, Gross HS (1987) "Tinción con plata mejorada de proteínas, ARN y ADN vegetales en geles de poliacrilamida" ("Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels"). Electrophoresis 8: 93-99.

Cleveland DW, Hwo S Y, Kirschner MW (1977a) "Propiedades físicas y químicas del factor de tau purificado y el papel de tau en el ensamblaje de microtúbulos" ("Physical and chemical properties of purified tau factor and the role of tau in microtubule assembly"). J Mol Biol 116: 227-247.

Cleveland DW, Hwo SY Kirschner MW (1977b) "Purificación de tau, una proteína asociada a microtúbulos que induce el ensamblaje de los microtúbulos a partir de la tubulina purificada" ("Purification of tau a microtubule-associated protein that induces assembly of microtubules from purified tubulin"). J Mol Biol 116: 207-225.

Crowther RA, Olesen OF, Smith MJ, Jakes R, Goedert M (1994) "Ensamblaje de los filamentos de tipo Alzheimer de la proteína tau de longitud completa" ("Assembly of Alzheimer-like filaments from full-length tau protein"). FEBS Letter 337:135-138.

Cuello AC, Cote SL, Ribeiro-Da-Silva A (1993): "Protocolos actuales de inmunohistoquirnica con microscopio de luz." ("Current protocols for light microscopy immunohistochemistry"). Immunohistochemistry II John Wiley e hijos Cichester, 148-167.

Dickson DW, Feany MB, Yen S-H, Mattiace LA; Davies P (1998) "Patología del citoesqueleto en demencia degenerativa diferente de Alzheimer: nuevas lesiones en la enfermedad de cuerpos de Lewy difusa, enfermedad de Pick y degeneración corticobasal" ("Cytoskeletal pathology in non-Alzheimer degenerative dementia: new lesions in diffuse Lewy body disease, Pick's disease, and corticobasal degeneration"). J Neural Transm 47: 31-46.

DiFiglia M, Sapp E, Chase KO, Davies SW, Bates GP, Vonsattel JP, Aronin N (1997) "Agregación de huntington en las inclusiones intranucleares neuronales y neuritas distróficas en el cerebro" ("Aggregation of huntingtin in neuronal intra-nuclear inclusions and dystrophic neurites in brain"), Science 277: 1990-1993.

Donofrio JC, Coonrod JD, Karathanasis V, Coelingh KV (1986) "Electroelución para la purificación de matriz de la proteína de gripe A para la utilización en inmunoensayo" ("Electroelution for purification of influenza A matrix protein for use in immunoassay"). 13: 107-120.

Drewes G, Ebneth A, Mandelkow EM (1998) "MARCas de MAP y dinámica de los microtúbulos" ("MAPs MARKs and microtubule dynamics"). Trends Biochem Sci 23: 307-311.

\newpage

Drubin DG, Kirschner MW (1986) "Función de la proteína tau en células vivas" ("Tau protein function in living cells"). J Cell Biol 103: 2739-2746.

Forno LS (1986) "El cuerpo de Lewy en la enfermedad de Parkinson" ("The Lewy body in Parkinson's disease"), En: Yahr MD, Bergmann KJ (editores) Parkinson's Disease, Advances in Neurology, Vol. 45, Raven Press: New York págs. 35-43.

Goedert M, Spillantini MG, Jakes R, Rutherford D, Crowther RA (1989) "Isoformas múltiples de la proteína tau humana asociada a microtúbulos: secuencias y localización en los ovillos neurofibrilares de la enfermedad de Alzheimer" ("Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in Neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease"). Neuron 3: 519-526.

Goedert M, Jakes R, Spillantini M, Hasegawa M, Smith MJ, Crowther RA (1996) "Ensamblaje de la proteína tau asociada a microtúbulos en filamentos de tipo Alzheimer inducido por glicosaminoglicanos sulfatados" ("Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulfated glycosaminoglycans"). Nature 383: 550-553.

Greenberg SH, Davies P (1990) "Una preparación de los filamentos helicoidales emparejados de Alzhemier que manifiesta proteínas tau diferentes mediante electroforesis en gel de poliacrilamida" ("A preparation of Alzheimer paired helical filaments that displays distinct tau proteins by polyacrylamide gel electrophoresis"). Proc Natl Acad Sci USA 87: 5827-5831.

Grundke-Iqbal I, Iqbal K, Tung Y-C, Quinlan M, Wisniewski HM, Binder LI. (1986) "Fosforilación anormal de la proteína tau asociada a microtúbulos en la patología del citoesqueleto de Alzheimer" ("Abnormal phosphorylation of the microtubule associated protein tau in Alzheimer cytoskeletal pathology"). Proc Natl Acad Sci USA 83: 4913-17.

Gustke N, Steiner B, Mandelkow EM, Biernat J, Meyer HE, Goedert M, Mandelkow E (1992) "La fosforilación de tipo Alzheimer de la proteína tau reduce la unión de los microtúbulos e implica motivos Ser-Pro y Thr-Pro" ("The Alzheimer-like phosphorylation of tau protein reduces microtubule binding and involves Ser-Pro and Thr-Pro motifs"). FEBS Lett 307: 199-205.

Himmer A (1989) "Estructura del gen de tau bovino: los transcritos por corte y empalme alternativo generan una familia de proteínas" ("Structure of the bovine tau gene: alternatively spliced transcripts generates a protein family"). Mol Cell Biol 9: 1389-1396.

Hirano A, Zimmerman HM (1962) "Cambios neurofibrilares de Alzheimer" ("Alzheimer's neurofibrillary changes"). Arch Neurol 7: 73-88.

Kampers T, Friedhoff P, Biernat J, Mandelkow EM, Mandelkow E (1996) "El ARN estimula la agregación de la proteína tau asociada a microtúbulos en los filamentos helicoidales emparejados de tipo Alzheimer" ("RNA stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments"). FEBS Lett 399: 344-349.

Kenessey A, Yen S-H, Liu W-K, Yang X-R, Dunlop DS (1995) "Detección de D-aspartato en proteínas tau asociadas con los filamentos helicoidales emparejados de Alzheimer" ("Detection of D-aspartate in tau proteins associated with Alzheimer paired helical filaments"). Brain Res 675: 183-189.

Kiss A, Palkovits M, Skirboll LR (1988) "Tinción inmunohistoquímica tripemente coloreada con microscopio óptico en la misma sección de vibratome utilizando la técnica del complejo avidina-biotina-peroxidasa" ("Light microscopic triple-colored immunohistochemical staining on the same vibratome section using the avidin-biotin-peroxidase complex technique"). Histochem 88: 353-356.

Kopke E, Tung Y-Ch, Shaikh S, Alonso AC, Iqbal K, Grundke-Iqbal I (1993) "Fosforilación anormal de la proteína tau asociada a microtúbulos de una reserva de filamentos helicoidales no emparejados en la enfermedad de Alzheimer" ("Microtubule-associated protein tau abnormal phosphorylation of a non-paired helical filament pool in Alzheimer disease"). J Biol Chem 268: 24374-24384.

Kontseková E, Novák M, Kontsek P, Borncký L, Lesso J. (1988) "El efecto de la densidad celular postfusión en el establecimiento de hibridomas" ("The effect of postfusion cell density on establishment of hybridomas"). Folia Biol (Praque) 34:18-22.

Kontseková E, Novák M, Máciková I, Kontsek P. (1991) "Método en una etapa para el establecimiento de hibridomas resistentes a 8-azaguanina adecuados para la preparación de triomas" ("One-step method for establishing 8-azaguanine-resistant hybridomas suitable for the preparation of triomas"). J Immunol Methods 145: 247-250.

Kosik KS, Orecchio LD, Bakalis S, Neve RL (1989) "Expresión regulada por medio del revelado de la secuencia de tau especifica" ("Developmentally regulated expression of specific tau sequence"). Neuron 2: 1389-1397.

Ksiezak-Reding H, Yang G, Simón M, Wall JS (1998) "Los filamentos de tau ensamblados difieren de los filamentos helicoidales emparejados nativos, tal como se determina por microscopía electrónica de transmisión y barrido STEM" ("Assembled tau filaments differ from native paired helical filaments as determined by scanning transmission electrón microscopy STEM"). Brain Res. 814: 86-98.

Laemmli U K (1970) "Escisión de las proteínas estructurales durante el ensamblaje de la cabeza del bacteriófago T4" ("Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4"). Nature 227: 680-685.

Lindwall G, Cole RD (1984) "La purificación de la proteína tau y la existencia de dos estados de fosforilacion de tau en el cerebro" ("The purificaron of tau protein and the Occurrence of two phosphorylation states of tau in brain"). J Biol Chem: 259:12241-12245.

Ko LW, Ko EC, Nacharaju P, Liu WK, Chang E, Kenessey A, Yen SH (1999) "Un estudio inmunoquímico sobre la glicación de tan en filamentos helicoidales emparejados" ("An immunochemical study on tan glycation in paired helical filaments"). Brain Res. 830:301-313.

LoPresti P, Szuchet S, Papasozomenos SC, Zinkowski PR, Binder LI (1995) "Implicaciones funcionales de la proteína tau asociada a microtúbulos: localización de oligodendrocitos" ("Functional implications for the microtubule-associated protein tau: localization in oligodendrocytes"). Proc Natl Acad Sci USA 92:10369-10373.

Mori H, Rondo J, Ihara Y (1987) "Ubiquitina en un componente de los filamentos helicoidales emparejados en la enfermedad de Alzheimer" ("Ubiquitin in a component of paired helical filaments in Alzheimer's disease"). Science 235: 1641-1644.

Nishimura T, Ideda K, Akiyama H, Kondo H, Kato M, Li F, Iseki E, Kosaka K (1995) "Investigación inmunohistoquímica de las estructuras positivas de tau en la corteza cerebral de pacientes con parálisis supranuclear progresiva" ("Immunohistochemical investigation of tau-positive structures in the cerebral cortex of patients with progressive supranuclear palsy"). Neurosci Lett 201: 123-126.

Novák M, Kabat J, Wischik CM (1993) "Caracterización molecular de la unidad de tau mínima resistente a proteasa del filamento helicoidal emparejado de la enfermedad de Alzheimer" ("Molecular characterization of the minimal protease resistant tau unit of the Alzheimer's disease paired helical filament") J EMBO, Vol. 12, págs. 365-370.

Novák M, Jakes R, Edwards PC, Milstein C, Wischik CM (1991) "Diferencia entre la proteína tau del núcleo de filamento helicoidal emparejado de Alzheimer y la tau normal revelado mediante análisis de epítopo de anticuerpos monoclonales 423 y 7.51" ("Difference between the tau protein of Alzheimer paired helical filament core and normal tau revealed by epitope analysis of monoclonal antibodies 423 and 7.51"). Proc Natl Acad Sci USA 88: 5837-5841.

Paudel H, Li W (1999) "Cambio conformacional inducido por hepaina en la proteína tau asociada a microtúbulos detectada por reticulación química y mapeo de fosfopéptidos" ("Heparin-induced conformational change in microtubule-associated protein tau as detected by chemical cross-linking and phosphopeptide mapping"). J Biol Chem 274: 8029-8038.

Perez M, Valpuesta J M, Medina M, Montejo de Garcini E, Avila J (1996) "Polimerización de tau en filamentos en presencia de heparina: la secuencia mínima de tau requerida para la interacción tau-tau" ("Polymerization of tau into filaments in the presence of heparin: the minimal sequence required for tau-tau interaction"). J Neurochem 67:1183-1190.

Prusiner SB (1996) "Enfermedades de priones humanos y neurodegeneración" ("Human prion diseases and neurodegeneration"). Curr Topics Microbiol Immunol 207:1-17.

Reed LA Schmidt ML, Wszolek ZK, Balin BJ, Soontomniyomkij V, Lee VM, Trojanowski JQ, Schelper RL (1998) "La neuropatología de parkinsonismo dominante autosomal unido al cromosoma 17 y demencia (``degeneración pallido-ponto-nigral'')" ("The neuropathology of a cromosome 17-linked autosomal dominant parkinsonism and dementia (``pallido-ponto-nigral degeneration'')"). J Neumpathol Exp Neurol 57: 588-601.

Roberts GW (1988) "Inmunocitoquímica de los ovillos neurofibrilares en la demencia pugilística y la enfermedad de Alzheimer: Prueba para la génesis común" ("Immunocytochemistry of neurofibrillary tangles in dementia pugilistica and Alzheimer's disease: Evidence for common genesis"). Lancet 2:1456-458.

Schneider A, Bieeemat J, Von Bergen M, Mandelkow E, Mandelkow EM (1999) "La fosforilación que separa la proteína tau de los microtúbulos (Ser262, Ser214) también la protege contra la agregación en los filamentos helicoidales emparejados de Alzheimer" ("Phosphorylation that detaches tau protein from microtubule (Ser262, Ser214) also protects it against aggregation into Alzheimer paired helical filaments"). Biochemistry 38: 3549-3558.

Schweers O, Mandelkow EM, Biernat J, Mandelkow E (1995) "La oxidación de la cisteina 322 en el dominio de repetición de la proteína tau asociada a microtúbulos controla el ensamblaje in vitro de los filamentos helicoidales emparejados" ("Oxidation of cysteine-322 in the repeat domain of microtubule-associated protein tau controls the in vitro assembly of paired helical filaments"). Proc Natl Acad Sci USA 92: 8463-8467.

Shankar SK, Yanagihara R, Garruto RM, Grundke-Iqbal I, Kosik KS, Gajdusek DC (1989) "Caracterización inmunocitoquímica de los ovillos neurofibrilares en la esclerosis lateral amiotrófica y el parkinsonismo-demencia de Guam" ("Immunocytochemical characterization of neurofibrillary tangles in amyotrophic lateral sclerosis and parkinsonism-dementia of Guam"). Ann Neurol 25: 146-151.

Spillantini MG, Bird TD, Ghetti B (1998) "Demencia frontotemporal y Parkinsonismo ligado al cromosoma 17: Un nuevo grupo de tauopatías" ("Frontotemporal dementia and Parkinsonism linked to chromosome 17: new group of tauopathies"). Brain Path 8: 387-402.

Studier FW, Moffatt BA (1986) "Utilización de la ARN polimerasa del bacteriófago T7 para dirigir la expresión de alto nivel selectiva de genes clonados" ("Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes"). J Mol Biol 189:113-130.

Thorpe SJ, Kerr MA (1994) "Técnicas inmunológicas habituales: ELISA, transferencia, inmunohistoquímica e inmunocitoquímica" ("Common immunological techniques: ELISA, blotting, immunohistochemistry and immunocytochemistry"). Immunochemistry BIOS Scientific publisher limited Oxford: 185-209.

Vallee RB (1986) "Punticación de ensamblaje reversible de microtúbulos sin agentes promotores del ensamblaje y purificación posterior de la tubulina, proteínas asociadas a microtúbulos y fragmentos MAP" ("Reversible assembly punTication of microtubules without assembly-promoting agents and further purifioation of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments"). Methods Enzymol, 134: 89-104.

Walls K, Azhar 5, Rho M, Lewis 5, Cowan N, Murphy D (1993) "El mecanismo de la unión en equilibrio de la proteína 2 asociada a microtúbulos a los microtúbulos. La unión es un proceso multifásico y presenta una cooperatividad positiva" ("The mechanism of equilibrium binding of microtubule-associated protein 2 to microtubule. Binding is a multi-phasic process and exhibits positive coopeantivity"). J Biol Chem 20: 15158-15167.

Wang J-Z; Grundke-Iqbal I; Iqbal K (1996) "Glicosilación de la proteína tau asociada a microtúbulos: una modificación postraduccional anormal en la enfermedad de Alzheimer" ("Glycosylation of microtubule-associated protein tau: An abnormal post-translational modification in Alzheimer disease"). Nature Med 2; 8 71-875.

Wilson DM, Binder LI (1997) "Los ácidos grasos libres estimulan la polimerización de tau y de péptidos de amiloide b. Prueba in vitro para un efector común de patogénesis en la enfermedad de Alzheimer" ("Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid b peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer's disease") Am J Pathol 150: 2181-2195.

Wischik CM, Novak M, Edwards PC, Klug A, Tichelaar W, Crowther RA (1988a) "Caracterización estructural del núcleo de los filamentos helicoidales emparejados de la enfermedad de Alzheimer" ("Structural characterization of the core of the paired helical filament of Alzheimer disease"). Proc Natl Acad Sci USA 85: 4884-4888.

Wischik CM, Novak M, Trogersen HC, Edwards PC, Runswick MJ, Jake R, Walker JE, Milstein C, Roth M, Klug A (1988b) "Aislamiento de un fragmento de tau obtenido del núcleo de los filamentos helicoidales emparejados de la enfermedad de Alzheimer" ("Isolation of a fragment of tau derived from the core of the paired helical filament of Alzheimer disease"), Proc Natl Acad USA 85: 4506-4510.

Yan S-D, Chen X, Schmid A-M, Brett J, Godman G, Zou Y-S, Scott CW, Caputo C, Frappier T, Smith MA, Perry G, Yen SH, Stern D (1994) "Proteína tau glicada en la enfermedad de Alzheimer: Mecanismo para la introducción de tensión oxidante" ("Glycated tau protein in Alzheimer disease: A mechanism for induction of oxidant stress"). Proc Natl Acad Sci USA 91: 7787-7791.

<101> AXON Neuroscience Forschungs- y Entwicklungs Gmb

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<120> Proteínas tau

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<130> R 36957

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<160> 10

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<211> 101

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<212> PRT

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<211> 383

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

\hskip1cm

13

\hskip1cm

14

\hskip1cm

15

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<210> 8

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<211> 352

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm

16

\hskip1cm

17

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<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 412

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 9

\hskip1cm

18

\hskip1cm

19

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<210> 10

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<211> 686

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<212> PRT

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<213> rata

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<400> 10

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20

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21

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22

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23

Claims (13)

1. Anticuerpo con una especificidad por las formas truncadas de la proteína tau humana, que está truncada en el extremo N-terminal o bien tanto en el extremo N-terminal como en el extremo C-terminal, tal como se determina en ELISA, empleándose dichas formas truncadas de la proteína tau humana purificadas mediante electroforesis, en muestras de tejido de cerebro con enfermedad de Alzheimer fijadas con paraformaldehido tamponado al 4% a 4ºC utilizando inmunohistoquímica, o tal como se determina mediante transferencia Western, utilizando dichas formas truncadas de las proteínas tau humanas purificadas sobre geles de SDS-poliacrilamida y transferidas a membranas PVDF, siendo dichas formas truncadas diferentes conformacionalmente de la tau humana normal, dicha forma diferente conformacionalmente de la proteína tau es específicamente reconocible por un anticuerpo producido por la linea celular de hibridoma depositada DC-11 o DC-11/I con los números de depósito 00082215 y 00082216 de la ECACC y dichas formas truncadas comprenden, como mínimo, del residuo de aminoácido 300 al residuo 400 de la isoforma de tau humana más larga que comprende 441 aminoácidos, no uniéndose dicho anticuerpo a la proteína tau normal y siendo dicho anticuerpo especifico de dichas formas truncadas de la proteína tau humana.

2. Anticuerpo, según la reivindicación 1, caracterizado porque la especificidad del anticuerpo por la forma truncada de la proteína tau humana es independiente del nivel de fosforilación de la proteína tau humana.

3. Anticuerpo, según la reivindicación 1, que es producido por la línea celular de hibridoma depositada DC-11 o DC-11/I con los números de depósito 00082215 y 00082216 de la ECACC.

4. Linea celular de hibridoma que produce un anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Kit para la detección o aislamiento de formas truncadas de la proteína tau humana que está truncada en el extremo N-terminal o bien tanto en el extremo N-terminal como en el extremo C-terminal, siendo dichas formas truncadas diferentes conformacionalmente de la tau humana normal, dicha forma diferente conformacionalmente de la proteína tau es específicamente reconocible por un anticuerpo producido por la línea celular de hibridoma depositada DC-11 o DC-11/I con los números de depósito 00082215 y 00082216 de la ECACC, en una muestra de tejido de cerebro o fluido corporal en el que el kit comprende un anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un recipiente adecuado para proporcionar la muestra.

6. Kit, según la reivindicación 5, caracterizado porque contiene adicionalmente medios para la detección de un fenómeno de unión de dicho anticuerpo que se une a dichas formas truncadas de la proteína tau humana, preferentemente anticuerpos secundarios, especialmente anticuerpos secundarios que están marcados específicamente.

7. Kit, según la reivindicación 5 ó 6, caracterizado porque contiene adicionalmente medios para la cuantificación de dichas formas truncadas de la proteína tau humana, especialmente una preparación patrón de dichas formas truncadas de la proteína tau humana.

8. Método in vitro para la detección de formas truncadas de la proteína tau humana que están truncadas en el extremo N-terminal o bien tanto en el extremo N-terminal como en el extremo C-terminal, siendo dichas formas truncadas diferentes conformacionalmente de la tau humana normal, dicha forma diferente conformacionalmente de la proteína tau es específicamente reconocible por un anticuerpo producido por la linea celular de hibridoma depositada DC-11 o DC-11/I con los números de depósito 00082215 y 00082216 de la ECACC, en una muestra de tejido de cerebro o de un fluido corporal de un paciente que comprende la mezcla de dicha muestra con un anticuerpo, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, la detección de la presencia de un fenómeno de unión entre dicho anticuerpo y dicha forma truncada de la proteína tau humana y, opcionalmente, la medición de la cantidad de dicha forma truncada de la proteína tau humana que está unida a dicho anticuerpo.

9. Método, según la reivindicación 8, caracterizado porque las formas truncadas de la proteína tau humana son también distinguibles de la tau humana normal por su capacidad para actuar como centro de nucleación para la iniciación de la agregación de tau.

10. Método, según la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque las formas truncadas de la proteína tau humana son también distinguibles de la tau humana normal por su capacidad de desensamblaje de los microtúbulos de la tau humana normal.

11. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque dichas formas truncadas comprenden, como mínimo, del residuo de aminoácido 300 al residuo de aminoácido 400 de la isoforma de tau más larga que comprende 441 aminoácidos.

12. Método, según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque dichas formas de la proteína tau comprenden, como mínimo, de 100 aminoácidos hasta 400 aminoácidos de la secuencia de la proteína tau normal.

13. Utilización de un anticuerpo, según las reivindicaciones 1 a 3, para la precipitación de un fármaco para el tratamiento de pacientes con la enfermedad de Alzheimer.