JPH11504317A

JPH11504317A - プリオンタンパク質に結合する単離５５〜７５ｋｄａタンパク質

Info

Publication number: JPH11504317A
Application number: JP8531191A
Authority: JP
Inventors: ブレンタニ，リカルド，アール; デ・ソウザ，サンドロ，ジェイ; マルティンス，ヴィルマ，アール
Original assignee: ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ
Priority date: 1995-04-12
Filing date: 1996-04-11
Publication date: 1999-04-20
Also published as: DE69623272T2; EP0822828A4; EP0822828A1; CA2217947A1; US6350854B1; AU5541896A; ATE222767T1; EP0822828B1; US5679530A; WO1996032128A1; US6066320A; DE69623272D1; AU703571B2; ES2183944T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約５５ｋＤないし約７２ｋＤの分子量を有する単離アンチプリオンタンパク質結合タンパク質に関する。単離されたアンチプリオンタンパク質結合タンパク質由来のペプチドも記載される。これら分子それぞれの診断的利用法が説明される。

Description

【発明の詳細な説明】プリオンタンパク質に結合する単離５５〜７５ＫＤＡタンパク質関連出願本出願は、参考文献として引用する１９９５年４月１２日に出願の係属中出願第０８／４２１，０５９号の一部継続出願である。発明の分野本発明は、以下、ＰｒＰと称するプリオンタンパク質に結合するタンパク質の同定と単離に関する。詳しくは、本発明の単離タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約５５ｋＤないし約７２ｋＤの分子量を有し、以下、アンチ−ＰｒＰタンパク質又はＰｒＰ結合タンパク質、と称する。前記結合タンパク質／アンチ−ＰｒＰタンパク質からのアミノ酸配列から成る単離ペプチドも記載される。これらペプチドとタンパク質とは共に、様々な診断上の効力を有する。ペプチドの場合、これは、たとえば、アンチ−ＰｒＰタンパク質の同定に使用される抗体を作り出すのに利用することができる。又、ペプチドは、それ自身、ＰｒＰに結合することができる。同様に、全長タンパク質も、同じように使用可能である。従って、これらの物質を使用して、プリオンに関連する様々な疾患を、診断し、スクリーニングすることができる。更に、本発明のタンパク質を使用して、サンプル中のＰｒＰの存在をスクリーニングすることができる。背景及び従来技術「プリオン」又は「タンパク質性感染粒子」は、数多くの病理的状態と関連付けられてきた。公知のプリオン関連疾患は、それら疾患に共通の特徴、即ち、脳組織中の「空胞」の形成に依り、一般に海綿状脳症と称されている。最も一般的にみられるプリオン関連疾患は、羊及び山羊に見られる「スクレイピー」である。病気にかかった動物は、筋肉運動の協調を失い、最終的には立つことができなくなる。プリオンに関連するその他の動物疾患として、伝染性ミンク脳障害、ラバ、シカ及びヘラジカの慢性消耗病、猫海綿状脳症、そしてウシ海綿状脳症（「狂牛病」）がある。ヒトにおいては、クールー病、又は「笑い死（ｌａｕｇｈｉｎｇｄｅａｔｈ）」が、食人風習と関連付けられてきた。しかし、プリオンに関連する最も深刻なヒトの疾患は、クロイツフェルト−ヤコブ病である。この病状は、一般に、患者に於ける痴呆の進行によって明らかとなる。これは、角膜移植、汚染された外科器具の使用、精製成長ホルモン又はその他の下垂体ベースの物質の注射、更に、脳への硬膜移植又は電極の埋め込み等によって、医療によって伝染しうるために、大きな不安の原因となっている。プリオンに関（lataxia と小脳の障害）及び不治の家族性不眠症がある。これらの病状は、共に、遺伝性であり、通常、中年期に現われる。最初は、前述した諸症状は、小脳組織に見られるスローアクティングウィルスによって引き起こされるものと考えられていた。この仮説は、これらの病気が、病気の動物の脳抽出物を健康な動物に注入することによって伝染させることができたという観察に基づくものであった。しかし、この仮説は、現在ではもはや一般に受け入れられていない。というのは、単離のための大変な努力にも拘わらずウィルスは単離されなかったからである。これらの病状に関して判っていることは、これらは遺伝性ではあるが、核酸によってではなく、タンパク質性物質によって引き起こされるものである、ということである。このタンパク質性物質は、プリオンと称されている。タンパク質物質が関連しているという仮説に導いた実験の一つは、核酸ではなく、タンパク質を不活性化する、感染した動物からの物質で処置するというものであった。これらの条件下において、疾病は伝染しなかった。この仮説を詳細に研究することによって、スクレイピー・プリオンの中に一つのタンパク質が同定された。このタンパク質、「プリオンタンパク質」を、以後、“ＰｒＰ”と称する。これは、総称的に、プリオンを形成するタンパク質を指すのに用いられる。例えば、Prusener，Science 252:1512-1522(1991 年６月１４日)（"Molecular Biology of Prion Diseases" ），プルシナー（Prusiner）他，ed.，Prion Diseases of Humans And Animals( Ellis Horwood,1992)参照。すべてのタンパク質と同様、ＰｒＰは遺伝子によってコードされる。しかし、ＰｒＰの発現は、プリオン関連病状を引き起こすには十分ではない。ＰｒＰはその三次元構造において変化を受け、これによってそのプリオン形状となる可能性があると判定されている。詳述すると、良性形状のＰｒＰは、複数のαヘリックス構造を示す。しかし、感染性プリオン形状においては、三次元構造が「伸長され」β・シートを形成する。要するに、正常な、無害な形状のＰｒＰとたとえば疾患に関連する形状との違いは、完全に立体配座的なものであるようである。ここに記載する本発明の理解にとって必須である概念、「相補性ヒドロパシー（complementary hydropathy）」は、最初に、Ｂｉｒｏ，ＭｅｄｉｃａｌＨｙｐｏｔｈｅｓｉｓ７：９８１（１９８１）によって示唆された。Ｂｉｒｏが提示するその概念は、タンパク質／タンパク質相互作用が特異的であることが観察されたという観察に基づくものであった。彼は、相補性コーディング、即ち、核酸分子のセンス・ストランドと「アンチ−センス」ストランドとの両方によるコーディングによって、必要な特異性が導かれる、と主張した。ＡＣＴＨ，γ−エンドルフィン、アンギオテンシンＩＩ、黄体形成ホルモン放出ホルモン、及びフィブロネクチンとそれらのレセプターの間の相互作用に関する研究はこの仮説を支持している。ボスト（Bost）他，Mol．Cell Endocrin 44:1(1986)(ACTH); カー（Carr）他，J．Neuroimmunol 12: 329(1986)(γ−エンドルフィン)，エルトン（Elton）他，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:2518(1988);(アンギオテンシンＩＩ); マルカヒー（Mulchahey）他，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83: 9714 （1986）(黄体形成ホルモン放出ホルモン); 及びブレンタニ（Brentani）他，Pr oc．Natl．Acad．Sci．USA 85: 364(1988)(フィブロネクチン)参照。これら研究の全部が、ブラロック（Blalock）他，Biochem．Biophys．Res． Commun．121: 203(1984)によって仮説化された概念を支持していた。これらの観察は、疎水性アミノ酸のためのコドンをそれらの相補性コドンと比較したところ、これらの相補性コドンは、一般に、親水性アミノ酸をコードするコドンであった、というものであった。ブラロック（Blalock）他は、対向するＤＮＡストランドによってコードされるアミノ酸のヒドロパシー係数の間に大きな相関性（ｒ＝０．７４）を観察し、従って、相補性ＤＮＡストランドによってコードされるペプチドは、互いに結合するであろうと推定した。既に示したように、この仮説は数多くのペプチドによって支持されている。１９９１年、ゴールドゲイバー（Goldgaber），Nature351: 106(5/9/91)は、ＰｒＰに対する相補性の適応の可能性について報告した。ゴールドゲイバー（Go ldgaber）は、ＰｒＰと相補的なＤＮＡ配列を解析し、ＰｒＰ遺伝子のＤＮＡの「アンチセンス」ストランド中に於ける大きな、部分的に重複するオープンリーディングフレームの同定を報告した。ゴールドゲイバー（Goldgaber）がこの相補的なコード領域の推定アミノ酸配列を分析したところ、彼は、それがほぼＰｒＰのミラー・イメージであることを見出した。ゴールドゲイバー（Goldaber）は、その全体を参考文献として引用する。マンソン（Manson）他，Nature 352: 29 1(7/25/91)は、この研究に異議を唱えたが、ヘウィンソン（Hewinson）他，Natu re 352: 291(7/25/91)は、それが彼ら自身の研究を確認するものであったと報告した。プルシナー（Prusiner）他，Nature 362: 213(3/18/93)は、彼らはＰｒＰセンス・ストランドにハイブリダイズする適当なサイズ（４．５ｋｂ）のＲＮＡユニットを発見したが、それはアンチセンスＰｒＰストランドに由来するものではない、と報告し、この研究に興味深い「新機軸（ｗｒｉｎｋｌｅ）」を提供した。上述した様々な報告、更に、モーザー（Moser）他，Nature 362: 213(3/18/93 )による報告は、プリオン関連疾患に於ける以下のアンチ−ＰｒＰタンパク質と称するタンパク質の可能性を記載している。ヘウィンソン（Hewinson）他は、相補的タンパク質が、ＰｒＰレセプターであるかもしれないと示唆した。以下の研究は、初めて、アンチ−ＰｒＰ結合タンパク質の同定とキャラクタライゼーションとを提供するものである。この物質は、サンプル中に於けるＰｒＰの存在を同定するのに利用可能であり、従って、特にプリオン関連疾患に特徴的なその他症状が観察される場合において、スクリーニングおよび／又は診断の方法を提供するものである。家畜においてプリオン関連障害が蔓延していることから、本発明は、たとえば、ヒトと家畜との両方のための利用方法がある。図面の簡単な説明図１は、本発明のペプチドを用いて作られた抗体を使用した、免疫蛍光アッセイの結果を示す。図２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分析を示す。レーンＡには、免疫蛍光アッセイにおいて陰性であった細胞からの溶出液が示されている。レーンＢは、陽性の細胞からの溶出液を使用して得られた。レーンＣは、正常なマウス血清を使用した、レーンＢの溶出液のウェスタン・ブロットであり、これに対して、レーンＤは、本発明のペプチドを使用して得られた抗血清でのその溶出液のテストから得られた結果である。図３Ａ及び３Ｂは、マウス中脳神経細胞における免疫蛍光アッセイのデータを提示している。図３Ａにおいて、細胞に対する標識化抗体の結合が示されている。図３Ｂは、その結合の局在を示している。図４Ａ及び４Ｂは、プリオン結合タンパク質の免疫電子−光化学的特性に関するデータを示している。図５は、相補的タンパク質へのプリオンの結合を確定する実験の結果を示している。好適実施例の詳細説明例１アンチ−プリオンタンパク質が存在するか否かという問題にアプローチするために、ここにその開示の全部を参考文献として引用するフォルローニ（Fo rloni）他，Nature 362: 543-546(1993)の研究に基づいて、ペプチドを合成した。フォルローニ（Forloni）他は、一次ラット海馬培養物中において細胞死を誘発したプリオンペプチド”ＰｒＰ１０６−１２６“を開示している。ここに使用されたペプチド、即ち、 Tyr His Val Ala Thr Lys Ala Pro His His Gly Pro Cys Arg Ser Ser Ala （配列認識番号１）は、ＰｒＰ由来のペプチドに対して相補的であり、それ自身、前述の推定アンチ −プリオンＯＲＦの相補的アミノ酸１１３−１２９に由来する。この合成ペプチドを、キーホールリムペットヘモシアニン（Keyholelimpet hemocyanin:ＫＬＨ）に結合させて免疫原を作った。次に、この免疫原を、２週間間隔で、全部で１００ｕｇの全タンパク質となるように、マウスに腹膜内注射した。４回目の注射の後、これらの動物から採血し、標準式固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）によって、非結合ペプチドに対してタイターを測定した。例２抗血清が作られたところで、これを免疫蛍光研究に利用した。マウス神経芽細胞腫細胞系”ｎｅｕｒｏ２Ａ“を使用した。この細胞系のサンプルを、８枚のウェル組織培養チャンバースライドにプレーティングした（２ｘ１０⁶細胞／ウェル）。これらの細胞を一晩インキュベートし、その後、スライドを洗浄し、細胞を１％グルタルアルデヒドで固定した。固定後、１：２０ウマ血清溶液を、３７ ℃で１時間添加した。その後、燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次に、抗血清を、２時間添加した。この後、細胞を穏やかに（extensively）洗浄し、その後、二次抗体、即ち、フルオレセインイソチオシアネートに結合し、エバンスブルー中で１：８０に希釈されたアンチ−ＩｇＧを、１時間添加した。その後、穏やかな洗浄を行い、更に、スライドを顕微鏡の検鏡板に固定して観察した。図１は、これらの結果を示しているが、白黒の複写ではＦＩＴＣ標識化が実際に起こったという事実（緑色が標識化が起こったことを示す）ははっきりとは示されていない。しかし、これらの結果は、抗血清がｎｅｕｒｏ２Ａ細胞の表面を認識したということを示している。総反応は、全集団の約１５％であった。この結果は、ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞中でのＰｒＰ^scの感染能力は集団のある種の細胞のみに限定されることを示した、バトラー（Butler）他，J．Virol 62: 155 8-1564(1988)によって得られた結果と類似している。ここに報告されている観察は、陰性細胞と陽性細胞との間のあらゆる可能な相違を分析するように計画された次の一連の実験を示唆した。例３これらの実験において、陽性と陰性の細胞を、最初に、制限希釈によってクローニングした。陽性細胞はクローン“ＩＥＩ２”から、そして、陰性細胞はクローン“ＩＣ４”から導かれた。各クローンの生きた細胞を、周知のラクトペルオキシダーゼ法を使用して、¹² ⁵ Ｉで表面標識化した。標識化の後、細胞を溶解して、その結果得られた抽出物を、ＣＮＢｒ４Ｂセファロースビーズに結合したプリオンペプチドＰｒＰ^106-12 ⁶ と共に一晩、攪拌しながら、インキュベートした。インキュベーション後、すべての結合した物質（即ち、ＰｒＰ^106-126ペプチドに結合したものすべて）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。これを行うために、結合した物質を、４０％濃縮ゲルと、７．５％分離ゲルとを用いて分離した。次に、タンパク質をニトロセルロース・フィルター（孔径０．４５ｕｍ）にトランスファーし、その後、トランスファーの程度を確認するために、０．５％ＰｏｎｃｅａｕＳで染色した。図２はこれらの結果を示している。レーンＡは、陰性クローンからのものであり、レーンＢは陽性クローンからのものである。溶出液を比較した時、陽性クローンからの約５５−６５ｋＤのタンパク質のバンドは、陰性クローンにおいては高いレベルで見られないことが示された。この結果を確認するために、次に、以下に示すように、ウェスタン・ブロットを行った。例４陽性クローンからの細胞を例１と同様に処理したが、標識化は行わなかった。又、例３と同様に、未標識化タンパク質抽出物を、ＰｒＰ^106-126セファロースビーズと共にインキュベートし、結合したタンパク質を次に、溶出し、前述したようにフィルターにトランスファーした。ウェスタン・ブロットのために、フィルターを、ＰＢＳ中で５％脂肪乾燥ミルクを用いてブロッキングし、次に、正常なマウス血清又は前述した抗血清のいずれかとインベキュートし、その後、ヤギ抗−マウスビオチン結合抗体と、インキュベートした。この標識化抗体を、一時間室温で添加した。穏やかな洗浄後、抗体を、周知のＥＣＬ化学発光システムを使用して、現像した。その結果は図２のレーンＣ−Ｄに示され、レーンＣは、正常血清を用いて得られる結果を、そして、レーンＤは上述したアンチ−プリオンペプチドに対する抗血清用いて得られる結果を示している。これらの知見は、アンチ−プリオンペプチドに対する抗血清が、ＰｒＰ^106-126結合バンドを認識することを示唆している。例５前記諸例は、神経細胞とグリア細胞との共同培養物の分析を含む。グリア細胞の標識化の可能性を度外視することができなかったので、この可能性をテストするためのプロトコールを開発した。標準的方法を使用して、培養基中でグリア細胞を培養した。次に、培養された細胞を、溶解し、抽出物を、上述した抗血清を使用して、ウェスタン・ブロット分析に使用した。これらグリア細胞は、図１に示した結果と比較して、完全に陰性であった。このことから、抗血清の標的は、神経細胞上の分子、即ち、それは神経細胞抗原であると推論できる。例６１４日齢のスイス・マウス胚の中脳からの神経細胞を、ここに参考文献として引用する、モーロネト（Mouro Neto）他，EMBOＪ2:1243-1248(1983)に従って、調製した。これらの細胞を、グルコース、グルタミン、重炭酸ナトリウム、及び１０％胎児ウシ血清とを添加したＤＭＥＭとＦ１２培地の混合物中で、ポリオルニチン（ＭＷ：４１ｋＤ；１．５ｕｇ／ｕｌ）で予めコーティングしておいた直径１０ｍｍのガラスカバーグラス上に載置した。この点に関しては、ガルシア −アブル（Garcia-Abreu），Neuros．Res．40:471-477(1995)参照。２４時間後、広範囲に渡る神経腫の発達が見られた。配列番号１からＮ末端Ｔｙｒを除いたものからなるアミノ酸配列に対して作成し、前述したように調製したマウス抗血清を、ハーフトラー（Halftler）他，Eu r．J．Neurosci 1: 297-308(1989)に従って、生きた細胞に結合させるべく、１：１００ｖ／ｖで添加した。１時間のインキュベーション後、すべての過剰の抗血清を除去し、細胞を、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．６中の４％パラホルムアルデヒドによって、３０分間で固定した。細胞を、ＰＢＳ中の０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で、すばやく洗浄し、１：１００に希釈されたβ−チューブリンIIIに対するモノクローナル抗体と共に一晩インキュベートした。次に、ＦＩＴＣとＲＩＴＣで標識化された抗体と共に２時間のインキュベーションを行った。次に、カバーグラスを、グリセロール−没食子酸プロピル／ＰＢＳ（９：１，ｖ／ｖ）中でセットした。次に、スライドを、ツアイス社エピ蛍光アタッチメント付きａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡上で観察した。図３Ａは、抗体がすべてのマウス神経細胞と反応したことを示し、これは、神経細胞によって発現される、プリオン・レセプター／結合タンパク質の認識と一致する。細胞が神経細胞であるという同定を、β−チューブリンＩＩＩに対するｍＡｂでの染色によって確認した。次に、カバーグラスを、ツアイス社レーザ顕微鏡を使用して調べたが、その共焦断面が図３Ｂに示されている。これによると、結合分子は神経細胞膜に局在していることが判った。例７次に、結合分子を同定し、その細胞内における位置を確認するために追加の研究を行った。マウス脳全抽出物を、マウス脳を、５０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ７．４，０．２％デオキシコール酸ナトリウム、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１ｍＭアプロチニン、１ｍＭロイペプチン、１ｍＭＰＭＳＦ、及び１ｍＭベンズアミジン中でホモゲナイズすることによって調製し、これを、次に、１２，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。膜抽出物を、脳を１０ｍＭＨｅｐｅｓ，ｐＨ７．４，０．５ｍＭＭｇＣｌ₂ ，１ｍＭアプロチニン、１ｍＭロイペプチン、１ｍＭＰＭＳＦ、及び１ｍＭベンズアミジン中でホモゲナイズすることによって調製し、これを、次に、６００ｘｇで１５分間遠心分離した。次に、上清を、同じ緩衝液に０．７ｍＭＥＤＴＡを添加したもので５倍に希釈し、その後、０．３Ｍスクロースを緩衝剤として、８２５ｘｇで１５分間遠心分離した。ペレットを、１．３８Ｍスクロース中に再懸濁し、０．３Ｍスクロース溶液下で１０５，０００ｘｇで１時間遠心分離した。界面を収集し、２０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１２０ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭロイペプチン、１ｍＭＰＭＳＦ，１ｍＭアプロチニン、及び１ｍＭベンジアミジン中に懸濁した。細胞質画分を、脳を、５０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１．５ｍＭＭｇＣｌ₂，１０ｍＭＫＣｌ，１ｍＭロイペプチン、１ｍＭＰＭＳＦ，１ｍＭアプロチニン、及び１ｍＭベンズアミジン中でホモゲナイズし、１０５，０００ｘｇで１時間遠心分離することによって調製した。上清を細胞質画分とした。各処理プロトコールからのサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースメンブレンにトランスファーした。ブロットを、前述したように作成した血清（後述するように、図中の奇数番号のレーン）又は、マウス非−免疫血清（後述するように、図中の偶数番号のレーン）に晒した。図４Ａにおいて、レーン１及び２は、全抽出物のウェスタン・ブロットを示し、レーン３及び４は、膜抽出物のウェスタンを示し、レーン５及び６は、細胞質抽出物を示している。ここに示されるように、６０ｋＤａのシグナルが脳全抽出物中に見られ、膜抽出物にもシグナルが見られたがこれは６３−６６ｋＤａにおいてであった。細胞質画分にも６０ｋＤａにおいて検出可能な種があった。レーン１，３及び５参照。これは、２つの形態のタンパク質が脳細胞中に存在し、膜結合形態はいくらか少なく、したがって、精製画分においてのみ検出可能であることを示唆している。非−免疫血清を使用した場合は、シグナルは検出されなかった。図４Ｂにおいて、２次元電気泳動後のウェスタン・ブロッティングに依る分析が示されている。上述したようにして抽出物を調製し、次に、オ・ファレル（O' Farrell）他，Cell 12: 1133-1142(1977)に従い、第１次元におけるｐＨ５．０ −８．０のライト・パーツの両性電解質勾配と、ｐＨ３．０−１０．０の２パーツの両性電解質勾配と、その後の第２次元に於ける還元条件下での１０％ＳＤＳＰＡＧＥを使用して分離し、その後、ニトロセルロースメンブレンヘトランスファーした。脳全抽出物はパネル１であり、膜抽出物はパネル２である。ここでも、前述したように作成した血清を使用し、その後、アルカリホスファターゼで標識化した抗−マウスＩｇＧを使用した。酵素の基質は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートと、ニトロブルーテトラゾリウムクロリドであった。図４Ｂは、全抽出物において６０と６３−６６ｋＤａの分子量で、ｐＩが６．９と６．８であるものを確認している。膜画分は、一つの成分（６３−６６ｋＤａ，ｐＩ６．８）を示した。例８プリオンが上述した同定された分子に結合するか否かを判定することが重要な実験であった。これを判断するために、上述した脳全抽出物を、３０％，４５％及び５５％硫酸アンモニウムで順番に沈殿させた。ペレットを溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、次に、ニトロセルロースメンブレンにトランスファーした。次に、抗−プリオンウサギ血清、又は、前述したペプチドに対する血清のいずれかを使用してウェスタン・ブロットを行った。メンブレンを、増強化学発光を使用して現像し、Ｘ線フィルムに露光した（図５の奇数番号のレーンは抗− プリオンウサギ血清の効果を示し、これに対して、偶数番号のレーンは抗−相補的ペプチド抗血清の効果を示している）。プリオンタンパク質は、３０％フラクション（レーン５）に存在し、そして相補的タンパク質は５５％フラクション（レーン２）に存在したことが理解されるであろう。レーン２は、又、４５と５５％飽和硫酸アンモニウムの間で沈殿したフラクションが、相補的プリオンペプチドに対する抗血清と反応するタンパク質の両方の形態のものを含んでいたことも示している。レーン１と同様、４５−５５％フラクションにはプリオンタンパク質は見つからなかった。レーン５に示されるフラクションは、抗−相補的ペプチド抗血清と反応する物質を含んでいなかった。３０％フラクションを、電気泳動によって分離された５５％フラクションからのタンパク質とインキュベートしたところ、６３−６６ｋＤａの分子量で、ウサギ抗−プリオン抗血清との検出可能な反応があった。レーン３を参照。これは、正常プリオンタンパク質、即ち、ＰｒＰ^cが前述の分子のより重い形状のもの、即ち、膜において見つかったもの、に結合することを示している。反対に、５５％フラクションを電気泳動によって分離された３０％フラクションのタンパク質とインキュベートした時には（レーン６）、抗−相補的ペプチド抗体の結合が見られ、この結合は、３０−３３ｋＤａに於ける、三つの公知のプリオンアイソフォームに対するものであった。従って、レセプタータンパク質は、これらのアッセイにおいてプリオンと結合することができた。これらのアッセイを、オーバーレイ・アッセイと称する。具体的には、最初のものにおいて、可溶化した３０％フラクション（２０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌｐＨ７．４，１２０ｍＭＮａＣｌ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた５５％フラクションのブロットと共にインキュベートした。次に、同じ溶液、但し、５５％フラクションを使用したもの、を３０％フラクションのブロットに適用した。上記諸例は、ＰｒＰに見られるペプチドに対して相補的なペプチドを示すものである。ＰｒＰペプチドは、公知であり、神経毒性であることが知られている。配列番号１に示す本発明のペプチドを、神経細胞を同定するのに使用可能な抗体を開発するのに使用した。というのは、この抗血清の標的は特異的に神経細胞であるからである。そのアミノ酸配列の一部として配列番号１を有することが可能で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約５５キロダルトンないし約７２キロダルトンの分子量を有する、単離、ＰｒＰ結合タンパク質とも称される、単離アンチ−ＰｒＰタンパク質も本発明の一部を構成するものである。これらのタンパク質は、そのＰｒＰに結合する能力により、診断用として有用である。既に示したように、単離５５−７２ｋＤタンパク質は、サンプル中のＰｒＰを判定するのに使用することができる。この方法は、サンプルを５５−７２ｋＤタンパク質と接触させてこれらの間の複合体を形成させ、その後この形成された複合体を検出するものである。５５−７２ｋＤタンパク質は、ビーズ、カラムガラス管壁、等に固定化することが可能であるが、必ずしもそうする必要はない。固定化しない場合は、溶液中に複合体が形成した際、これらは、ゲル上での移動パターンの観察、あるいは、当該技術において公知の標準的方法のいずれかによって判定することができる。又、すべての単離タンパク質は、発色団、¹²⁵Ｉ等の放射性標識、酵素、あるいは結合の判定に使用されるその他のいずれかの標準式標識等によって標識化することできる。サンプル中に於けるＰｒＰの存在は、前述したもののようなプリオン関連疾患の存在又はそのような疾患への疾病素質を示すことができる。これらの診断アッセイ及びシステムは、動物の管理、獣医療、そして、もちろん、ヒトの疾病および／又は一般的診断アッセイにおいて利用することができる。前述したように、本発明のペプチドは、それ自身診断方法において、又は免疫原として利用可能である。後者の場合、キーホールリムペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、あるいは、小さなペプチドを「ハプテン化」するのに使用されるすべての標準的物質等の担体に結合させることができる。その結果得られる、配列番号１を有する複合体、又は、そのペプチド自身は、アジュバント等と共に、免疫原性組成物の中に調剤することができる。前述したように、本発明のペプチドによる免疫化後作成された抗体は、例えば、抗血清の形態中において、ポリクローナルのものであってもよく、又は標準的技術を用いて調製したモノクローナルのものであってもよく、アンチ−ＰｒＰタンパク質を有する神経細胞を検出するのに使用することができる。更に、“ＧＳＴ−プリオン”等の、第１のタンパク質とプリオンタンパク質との融合タンパク質を作ることが可能であることも分かっている。これらの融合タンパク質は、アンチ−プリオンペプチド及びタンパク質、レセプター、等に対するアッセイを行うのにも利用できる。本発明のその他の側面は、当業者にとって明らかであろう。従って、ここでは繰り返す必要はない。ここに使用した用語及び表現は、限定の用語としてではなく記載の用語として使用されたものであり、これらの用語及び表現を使用するに当たって、ここに図示及び記載した特徴構成のいかなる均等物又はそれらの一部を除外する意図は無く、様々な改変も本発明の範囲内において可能であると認識される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｑ 1/00 Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者デ・ソウザ，サンドロ，ジェイブラジル国エスピー 01509−010 サン・パウロルア・プロフ・アントニオ・プルデンテ 109／４エイ (72)発明者マルティンス，ヴィルマ，アールブラジル国エスピー 01509−010 サン・パウロルア・プロフ・アントニオ・プルデンテ 109／４エイ

Claims

【特許請求の範囲】１．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約５５キロダルトンないし約７２キロダルトンの分子量を有する、プリオンタンパク質に結合する単離タンパク質。２．配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１の単離タンパク質。３．配列番号１のアミノ酸配列から成る単離ペプチド。４．担体に複合体化された請求項３の単離ペプチドからなる免疫原性複合体。５．前記担体はキーホールリムペットヘモシアニンである、請求項４の免疫原性複合体。６．請求項３の単離ペプチドとアジュバントとを有する免疫原性組成物。７．請求項４の複合体とアジュバントとを有する免疫原性組成物。８．宿主動物を請求項３の単離ペプチドによって免疫化し、そこから抗血清を分離することによって作られる、その表面上にアンチＰｒＰタンパク質を提示する神経細胞を同定するのに有用な抗血清。９．宿主動物を請求項４の免疫原性複合体によって免疫化し、そこから抗血清を分離することによって作られる、その表面上にアンチＰｒＰタンパク質を提示する神経細胞を同定するのに有用な抗血清。１０．請求項１の単離タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体。１１．サンプル中におけるプリオンタンパク質の判定として、サンプルを請求項１の単離タンパク質と接触させ、前記単離タンパク質と前記プリオンタンパク質との複合体の形成を判定することからなる、サンプル中に於けるプリオンタンパク質を判定する方法。１２．サンプル中におけるプリオンタンパク質の判定として、サンプルを請求項３の単離ペプチドと接触させ、前記単離ペプチドと前記プリオンタンパク質との複合体の形成を判定することからなる、サンプル中に於けるプリオンタンパク質を判定する方法。１３．サンプル中におけるアンチプリオンタンパク質の判定として、サンプルと請求項３の抗血清を接触させ、複合体の形成を判定することからなる、サンプル中に於けるアンチプリオンタンパク質を判定する方法。１４．サンプル中におけるアンチプリオンタンパク質の測定として、サンプルと請求項４の抗血清を接触させ、複合体の形成を判定することからなる、サンプル中に於けるアンチプリオンタンパク質を判定する方法。