JP2000503391A

JP2000503391A - アルツハイマー疾患の検知方法

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Publication number: JP2000503391A
Application number: JP9526001A
Authority: JP
Inventors: ケイ，マーガレット・エム・ビー
Original assignee: リサーチ・コーポレイション・テクノロジーズ・インコーポレイテッド
Priority date: 1996-01-19
Filing date: 1996-12-13
Publication date: 2000-03-21
Also published as: EP0877939A1; ES2176523T3; EP0877939B1; CA2242343A1; ATE219247T1; WO1997026537A1; DE69621837D1; DE69621837T2

Abstract

(57)【要約】アルツハイマー疾患の検知方法。特に、アルツハイマー疾患組織を正常組織と識別できる、バンド３蛋白質に対する抗体を提供する。更に、バンド３リン酸化の差を測定することを含むアルツハイマー疾患の検知方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】アルツハイマー疾患の検知方法発明の分野本発明はアルツハイマー疾患の検知方法に関する。特に、本発明はアルツハイマー疾患組織を正常組織から区別することができるバンド３蛋白質に対する抗体を提供する。更に、本発明は、バンド３のリン酸化の差を測定することを含むアルツハイマー疾患の検知方法を提供する。発明の背景バンド３は遍在するアニオン交換蛋白質である。これは細胞核、ゴルジ体、ミトコンドリアおよび細胞膜中に、およびこれまで試験されたすべての組織中に存在する。有核細胞中のバンド３蛋白質はバンド３抗体により誘発された細胞表面のパッチングおよびキャッピング中に存在している。バンド３はアニオンの交換を媒介することによって酸−塩基のバランスを維持し、解糖酵素のための結合部位であり、原形質膜を細胞骨格に結合する大きい構造蛋白質である。バンド３は、そのＣＯ₂呼吸における中心的役割をなすために、脊椎動物のイオン輸送システム中で最も重要なものとして使用される。ヒトの赤血球バンド３蛋白質はすべてのバンド３蛋白質のプロトタイプである。ｃＤＮＡの翻訳された連鎖に基づけば、ヒトの赤血球のバンド３蛋白質は９１１個のアミノ酸からなっている〔タンナー他著、バイオケミカル・ジャーナル、第256巻、第703頁（1988）〕。Ｎ末端から３９７個のアミノ酸は細胞の細胞質の中に位置している。バンド３中の種および組織特定の変性体およびいくつかの既知のバンド３多形物は、主としてこの細胞質セグメント中に位置しており、これは酵素分解研究に基づけば１から４００番目までのアミノ酸であるといわれる。バンド３分子の二つの重要な性質、即ちアニオン輸送および老化細胞抗原（ＳＣＡ）の抗原性は膜関連“領域”に位置しており、この領域はＣ末端から５００個目までのアミノ酸からなる〔ケイ（Kay）他著、トランザクションズ・オブ・メディカル・レビュー、第5巻、第173-195頁(1991)〕。老化および神経学的疾患のバイオ指標であるＳＣＡは、バンド３の酸化および破壊によって引き起こされる。ＳＣＡは古い細胞上に現れ、ＩｇＧ自己抗体の結合、および続いて起こる食細胞によるその細胞の除去としてその細胞の終結を示す特定のシグナルとして働く〔ケイ著、ジャーナル・オブ・スーパーモレキュラー・ストラクチャー、第9巻、第555-567頁(1978)〕。これは哺乳類や他の脊椎動物における老化および損傷した細胞を除去するための一般的な生理学過程であるように見える。ＳＣＡは、神経細胞を含めて試験されたすべての細胞上で見い出されてきた。老化および損傷細胞の除去における中心的な役割に加えて、ＳＣＡはアルツハイマー疾患の神経原繊維タングル（tangle）および老年性溶血斑中にも存在し、神経細胞および血小板の除去および臨床的溶血性貧血、鎌型赤血球貧血症およびマラリアにおける赤血球の除去にもからんでくる。バンド３は赤血球および白血球中におけると同様成人の脳の中でも同じ構造的および機能的活動を行う〔ケイ他著、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス、ユーエスエー、第80巻、第6882-6886頁(1983)〕。このように、脳中のバンド３は赤血球および白血球中で見いだされたバンド３のものと同じ特性を示す〔カバー他著、ライフサイエンス、第58巻、第655-644頁(19 96)；ケイおよびグッドマン著、ジェロントロジー、第11巻、印刷中〕。バンド３は細胞および組織が老化するとともに老化する。最初、バンド３は、これまでのところでは、非特徴的な構造変化を引き起こす。この構造変化に続いて、バンド３は膜内外のアニオン輸送領域において崩壊を引き起こし、その結果ＳＣＡを生じる。本発明者は老化した細胞中で（ただし、中年または若い細胞ではそうではない）バンド３のはっきりした領域に結合するこの「老化したバンド３」に対する抗体を開発した。バンド３上の「老化抗原部位」と呼ばれるこれらの領域は、バンド３分子の５３８−５５４および８１２−８３０の残基に位置している。バンド３の老化は、アニオン輸送効率の減少、グルコース輸送の減少、より小さいフラグメントへの崩壊の増加、および生理学的ＩｇＧ自己抗体のその場での結合の増加を含む機能的変化と関係している。サイトー他、アナリティカル・ニューヨーク・アカデミック・サイエンス、第 674巻、第180頁(1992)およびケイ他著、アナリティカル・ニューヨーク・アカデミック・サイエンス、第719巻、第419頁(1994)には、バンド３の崩壊はアルツハイマー疾患をもった患者からの脳膜中で生じることが提案された。免疫組織化学によれば、バンド３合成ペプチド（ｐｅｐ‐ＣＯＯＨ）ターナー等によりナンバリングされた８１２-８２７番目の残基）に対する抗体は正常なコントロールからの前頭皮質よりもアルツハイマー患者からの前頭皮質の神経細胞をより傷つける。バンド３の５８８-６０２および８２２-８３９ペプチドに対する血清の自己抗体はコントロールに比べて、アルツハイマー疾患患者において増加した。ケイ著、アナリティカル・ニューヨーク・アカデミック・サイエンス、第621巻、第1 79頁(1991)は、脳のバンド３はアルツハイマー疾患中では変化するかもしれないことを暗示している。本発明によれば、実に抗バンド３抗体は正常の赤血球細胞とアルツハイマー患者の赤血球細胞を識別することができ、それによりこの病気の便利で信頼性のあるアッセイを提供し得ることを見いだした。更に、アルツハイマー患者のバンド３のリン酸化の予期しない変質はこの病気に対する他のアッセイを提供する。更に、翻訳後の変化がＲＢＣバンド３において起こり、同様の変化は脳バンド３においても起こることを発見した。これらの変化には、脳およびイン・ビトロでのＲＢＣにおけるバンド３ポリペプチドの³²Ｐリン酸塩ラベリングの減少、バンド３の崩壊の増加、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体によって認識されるバンド３における変質、赤血球細胞によるアニオンおよびグルコース輸送の減少およびバンド３のより小さいフラグメントへの崩壊の増加が含まれる。発明の要旨本発明はアルツハイマー疾患の検知方法を提供するものであり、以下のものを含む：アルツハイマーのバンド３を正常のバンド３から識別する抗体を、抗体‐ 抗原複合体が形成される条件下で、アルツハイマー疾患があると見られる患者の組織試料と接触すること；上記複合体を検出すること；上記複合体の量を健康な個体からのコントロール試料について同じ条件下で形成した複合体の量と比較すること。好ましい態様においては、組織試料は大脳皮質、血液またはそのフラクション、赤血球細胞、白血球細胞または赤血球細胞膜である。更に、本発明は以下のものを含むアルツハイマー疾患の検知方法を提供する：アルツハイマーバンド３を正常バンド３と識別する抗体を、抗体-抗原複合体が形成される条件下でアルツハイマー疾患を有すると見なされる患者からの組織サンプルと接触させること、および上記複合体を検知すること。本発明は更にアルツハイマー疾患を有すると見なされる患者の第１の組織試料中のバンド３蛋白質のリン酸化またはその崩壊生成物の量を測定すること、および上記バンド３蛋白質のリン酸化の量またはその崩壊生成物の量を、健康なコントロール個体の第２の組織試料中のバンド３蛋白質のリン酸化またはその崩壊生成物の量と比較することを含むアルツハイマー疾患の検知方法を提供するものであり、上記第１の試料中のリン酸化の減少はアルツハイマー疾患を示すものである。好ましい態様では、組織試料は大脳皮質、血液またはその部分、赤血球細胞、白血球細胞または赤血球細胞膜である。図面の簡単な説明図１Ａ−１Ｄは、バンド３抗体を用いて評価した血液試料のイムノブロットの結果を示す棒グラフである。図２は、中年令のハツカネズミと比較した老年のハツカネズミのバンド３のリン酸化の減少を示す。図３は、コントロールの側頭皮質試料と比較したアルツハイマー患者におけるバンド３リン酸化の減少を示す。図４は、アルツハイマー疾患（ＡＤ）のＲＢＣバンド３とコントロールのＲＢＣバンド３への³²リン酸塩の結合を示す。バンド３蛋白質バンドはアルカリホスファターゼによって検出されるように、抗体結合によって同定される。リン酸化は³²Ｐの結合により測定される。図４Ａは、アルツハイマー疾患およびコントロールからの前頭ジャイラス（gy rus）脳膜または中年令のＲＢＣ膜中のバンド３への抗-ホスホチロシン抗体の結合を示す。Ａ：コントロールの前頭ジャイラス、Ｂ：アルツハイマー疾患の前頭ジャイラス、Ｃ：アルツハイマー疾患の中年令のＲＢＣ膜、Ｄ：コントロールの中年令のＲＢＣ膜。図５は、コントロールではなくアルツハイマー疾患の脳膜への９８０抗体の結合を示す。レーンＡ、Ｅ、Ｇ、Ｈはコントロール膜、レーンＢ、Ｃ、Ｄ、Ｆはアルツハイマー疾患のコントロール膜、ＡＢは蛋白質のアミド黒汚れ（black stain）、ＡＲはオートラジオグラフである。図６は、抗体９８０が、内部バンド３アニオン輸送セグメント、ＡＮＩＯＮ２、バンド３に対する損傷のために老化しやすい部位である残基５８８-６０２（ＬＲＫＦＫＮＳＳＹＦＰＧＫＬＲ）を認識することを示す。ＡＮＩＯＮ２（ＡＮ２）、残基５８８-６０２（ＬＲＫＦＫＮＳＳＹＦＰＧＫＬＲ）はＣＯＯＨに微量結合している。ＡＮＩＯＮ２は、ＡＳＮ-５９３のところの潜在的Ｎ-糖化部位が糖化されないので分子内であるように見える。ＲＢＣ：赤血球細胞膜、ＡＮＩＯＮ１（ＡＮ１）：位置５３８-５５４（ＳＫＬＩＫＩＦＱＤＨＰＬＱＫＴＹＮ）、ＣＯＯＨ：８１２-８２７（ＬＦＫＰＰＫＹＨＰＤＶＰＹＶＫＲ）、ＣＯＯＨ-６、８１３-８１８（ＦＫＰＰＫＹ）、Ｇ１ｙｃｏｓ、６３０-６４８（ＱＫＬＳＶＰＤＧＦＫＶＳＮＳＳＡＲＧＷ）、ＢＲ：脳。オートラジオクラフによれば、バンド３への抗体の結合は左側で行われおよび老化バンド３への抗体の結合は右側で行われることを示している。ＡＢ：蛋白質に対するアミド黒色汚れ、ＡＲ：オートラジオクラフ。図７Ａは、抗体ＡＤ-ＢＤ３とペプチドＣＯＯＨがアルツハイマー疾患とコントロールの前頭皮質を識別することを示している。抗体はイムノドットにおいてアルツハイマー疾患とコントロールとの側頭皮質に対して試験した。他の抗-バンド３ペプチド抗体もアルツハイマー疾患を正常組織と識別する。図７Ｂおよび７Ｃとは、バンド３ペプチドに対する抗体（ＡＤ-ＢＤ３とｐｅｐ-ＣＹＴＯ）がイムノドットにおいて、アルツハイマー疾患とコントロールとの前頭皮質および中年令（ＭＡ）のＲＢＣを識別することを示している。図８は、赤血球合成ＳＣＡに対する、アルツハイマー疾患組織とよりよく反応するヘテロハイブリドーマ抗体の例を示している。継代（passage）１−３由来のモノクローナル類をイムノドットにおいて試験した。抗体のインキュベーションは５時間であった。図９は、赤血球合成ＳＣＡに対する、コントロール組織とよりよく反応するヘテロハイブリドーマ抗体の例を示している。継代（passage）６由来のモノクローナル類をイムノドットにおいて試験した。図１０は、バンド３およびバンド３の合成ペプチドに対する抗体がアルツハイマー疾患を、組織断面において正常コントロール脳と識別することを示している。抗ペプチド抗体と反応したアルツハイマー疾患およびコントロール脳組織のエッチング断面について電子顕微鏡観察が行われた。抗体の結合が金コロイドに結合した蛋白質Ａによって可視化された。バンド３の崩壊生成物（１０Ａ）およびグルコース輸送体であるチャンネル蛋白質（１０Ｂ）とを認識するｐｅｐ-ＣＯＯＨに対する抗体はアルツハイマー疾患とは反応するが、コントロール脳組織とは反応しない。抗体はコントロール組織（１０Ｃ）とは反応しなかった。図１１は、アルツハイマー疾患とコントロールのＲＢＣを識別する赤血球ＳＣＡに対するヘテロハイブリドーマ抗体を示している。図１２は、バンド３の合成ペプチドおよびＳＣＡに対するアルツハイマー疾患とコントロールの血清の抗体が、ＥＬＩＳＡによって定量化されるのを示している。示されている値は平均値±ＳＥＭである。発明の詳細な記述本発明は、アルツハイマー疾患を検知する方法を提供する。特に、本発明によれば、バンド３またはそのフラグメントに対するある種の抗体はアルツハイマーの組織試料と正常な組織試料を区別することができる。抗体は血液試料および脳試料のいずれでも区別することができる。好ましい実施態様では、本発明の方法に有用な好ましい抗体は、「老化バンド３」として知られている種のバンド３に対する抗体である。輸送膜分子バンド３は、バンド３のＳＣＡへの崩壊に先立って起こる老化に伴う非特定的変化を引き起こすことは当業者には公知であり、例えば「ケイ他著、アナリティカル・ニューヨーク・アカデミック・サイエンス、第719巻、第419頁(1994)」に記載されている。この無傷ではあるが変性したバンド３は「老化バンド３」として知られている。老化バンド３に対する抗体は、老化した細胞においてはバンド３には結合するが、中年令または若い細胞においては結合しないというその能力によって確認される。赤血球細胞は、公知の方法〔ベネット他著、エクスペリメンタル・ヘマトール、第9巻、第297頁(1981)〕によって異なる年令の集団に容易に分離され、老化バンド３に対する抗体を確認するための細胞源を提供することができる。老化バンド３に対する好ましい抗体である、抗体９８０は、ケイ他著、「プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス・ユーエスエー、第 86巻、第5834頁(1989)」に記載されており、本発明の一部として組み込まれる。抗体９８０はＳＣＡの形成に先立って起こるバンド３における老化の変化を確認する〔ケイ著、アナリティカル・ニューヨーク・アカデミック・サイエンス、第 621巻、第179-205頁(1991)〕。老化バンド３に対するもう一つの好ましい抗体、抗体ＡＤ-ＢＤ３は、「ケイ他著、クリニカル・エクスペリメント・オブ・イムノゲネティックス、第7巻、第181-199頁(1990)」に記載されている。ＡＤ-ＢＤ３は老化ＩｇＧ（ＳＣＩｇＧ）に対する抗イディオタイプとして作られ、老化赤血球から溶離された自己抗体である。抗イディオタイプ抗体は、「ケイ著、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミック・サイエンス・ユーエスエー、第82巻、第1731-1735頁(1985)」の方法により従来通りに調製することができ、これは本発明の一部とする。Ｐｅｐ-ＣＹＴＯはバンド３の細胞質ペプチド、残基１２２-１４４、に対する抗体である。老化バンド３に対する他の抗体はヒト血清からＩｇＧ自己抗体として単離することができるし、または当業者にとって公知の標準法によって調製することもできる。ポリクローナル抗体もモノクローナル抗体もどちらも本発明の方法において有用である。ゲッ歯類、うさぎ、ヒト、ヒト様（humanized）、ＣＤＲ移植された、およびキメラのものを含むモノクローナル抗体が好ましい。老化バンド３に対するヒトおよびヒト様モノクローナル抗体が特に好ましい。安定なヒト抗体‐分泌ヘテロハイブリドーマはヒトＢ細胞を「トンプソン他著、ジャーナル・オブ・イミュノロジー、第94巻、第7-12頁(198 6)」のハツカネズミ骨髄腫細胞株と融合することによって調製される。抗体９８０がバンド３ペプチド残基５８８−６０２を認識することが本発明者によって発見された。残基５８８−６０２はまたＡＮＩＯＮ２としても知られている。ＡＮＩＯＮ２は「老化を受け易い部位」である。本発明で定義する「老化を受け易い部位」は、老化損傷を受け易く、バンド３崩壊を開始する多数のアミノ酸を含むバンド３領域である。例えば、位置５９３のアスパラギンは、脱アミノ化し、バンド３のコンフィグレーションに付随した変化を引き起こす。ＡＮＩＯＮ２もまたセリンプロテアーゼに対して弱いものである。したがって、ペプチド残基５８８−６０２に対する抗体もまた本発明のものとされる。残基５８８−６０２は連鎖ＬＲＫＦＫＮＳＳＹＦＰＧＫＬＲを持つ。もうひとつの好ましい態様では、本発明の方法に有用な抗体は、タンナー（Ta nner）等によって番号付けされたバンド３の残基８１２−８３０を有するペプチドに対する抗体である。残基８１２−８３０は連鎖ＬＦＫＰＰＫＹＨＰＤＶＰＹＶＫＲＶＫＴを持つ。もうひとつの好ましい態様では、本発明の方法において有用な抗体は、バンド３の残基８２２−８３９（ＶＰＹＶＫＲＶＫＴＷＲＭＨＬＦＴＧＩ）を有するペプチドに対する抗体である。もうひとつの好ましい態様では、本発明の方法において有用な抗体は、バンド３の残基５３８−５５４（ＳＫＬＩＫＩＦＱＤＨＰＬＱＫＴＹＮ）を有するペプチドに対する抗体である。もうひとつの好ましい態様では、本発明の方法において有用な抗体は、バンド３の残基８５３−８７０を有するペプチドに対する抗体である。更にもうひとつの好ましい態様では、本発明の方法において有用な抗体は、バンド３の残基１２２−１４４（ＤＬＱＥＴＳＬＡＧＶＡＮＱＬＬＤＲＦＩＦＥＤＱ）を有するペプチドに対する抗体である。更にもうひとつの好ましい態様では、本発明の方法において有用な抗体は、バンド３の残基８１２−８２７（ＬＦＫＰＰＫＹＨＰＤＶＰＹＶＫＲ）を有するペプチドに対する抗体である。更にもうひとつの好ましい態様では、本発明の方法において有用な抗体は、バンド３の残基５２６−５４１（ＦＬＩＳＬＩＦＩＹＥＴＦＳＫＬＩ）を有するペプチドに対する抗体である。更にもうひとつの好ましい態様では、本発明の方法において有用な抗体は、バンド３の残基５４９−５６６（ＬＱＫＴＹＮＹＮＶＬＭＶＰＫＰＱＧＰ）を有するペプチドに対する抗体である。更にもうひとつの好ましい態様では、本発明の方法において有用な抗体は、バンド３の残基５６１−５７８（ＰＫＰＱＧＰＬＰＮＴＡＬＬＳＬＶＬＭ）を有するペプチドに対する抗体である。更にもうひとつの好ましい態様では、本発明の方法において有用な抗体は、バンド３の残基５７３−５９１（ＬＳＬＶＬＭＡＧＴＦＦＦＡＭＭＬＲＫＦ）を有するペプチドに対する抗体である。更にもうひとつの好ましい態様では、本発明の方法において有用な抗体は、バンド３の残基５９７−６１４（ＦＰＧＫＬＲＲＶＩＧＤＦＧＶＰＩＳＩ）を有するペプチドに対する抗体である。更にもうひとつの好ましい態様では、本発明の方法において有用な抗体は、バンド３の残基８１８−８２７（ＹＨＰＤＶＰＹＶＫＲ）を有するペプチドに対する抗体である。更にもうひとつの好ましい態様では、本発明の方法において有用な抗体は、バンド３の残基８１８−８２３（ＹＨＰＤＶＰ）を有するペプチドに対する抗体である。更にもうひとつの好ましい態様では、本発明の方法において有用な抗体は、バンド３の残基８２２−８２７（ＶＰＹＶＫＲ）を有するペプチドに対する抗体である。更にもうひとつの好ましい態様では、本発明の方法において有用な抗体は、バンド３の残基８０４−８１１（ＱＬＦＤＲＩＬＬ）を有するペプチドに対する抗体である。更にもうひとつの好ましい態様では、本発明の方法において有用な抗体は、バンド３の残基８２８−８３４（ＶＫＴＷＲＭＨ）を有するペプチドに対する抗体である。更にもうひとつの好ましい態様では、本発明の方法において有用な抗体は、バンド３の残基５３４−５４０（ＹＥＴＦＳＫＬ）を有するペプチドに対する抗体である。更にもうひとつの好ましい態様では、本発明の方法において有用な抗体は、バンド３の残基５３８−５４４（ＳＫＬＩＫＩＦ）を有するペプチドに対する抗体である。更にもうひとつの好ましい態様では、本発明の方法において有用な抗体は、バンド３の残基５４３−５４９（ＩＦＱＤＨＰＬ）を有するペプチドに対する抗体である。更にもうひとつの好ましい態様では、本発明の方法において有用な抗体は、バンド３の残基５４７−５５３（ＰＬＱＫＴＹＮ）を有するペプチドに対する抗体である。例えばペプチド１２２−１４４、８１２−８３０、８１２−８２７、５８８― ６０２、８２２−８３９、５３８−５５４および８５３−８７０に対する抗体はペプチド合成の標準法によって作られたペプチドを用いて業界で公知の標準法によって調製することができる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は本発明の方法において有用である。ゲッ歯類、うさぎ、ヒト、ヒト様、ＣＤＲ移植された、およびキメラの抗体を含むモノクローナル抗体が好ましく、業界で公知の方法によって作ることができる。抗体の産生は、例えば、バートン（Burton ）他著、アドバンスト・イン・イムノロジー（Adv,Immunol.）、第57巻、第191 頁(1 994)、キャネラリ（Canerari）他著、インターナショナル・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・マーカーズ、第8巻、第147頁(1993)、ザッコロ（Zaccolo）他著、インターナショナル・ジャーナル・オブ・クリニカル・ラボラトリアル・リサーチ、第23巻、第192頁(1993)、ポッター他著、インターナショナル・レビュー・オブ・イミュノロジー、第10巻、第103頁(1993)、カルシ（Kalsi）他著、オートイミュニティー、第13巻、第249頁(1992)、およびハーロー（Harlow）他著、編集、アンチボディーズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（1988）、に記載されている。上記抗体類はアルツハイマー患者からの組織試料中のバンド３を、正常の年令相応の対象物の組織試料中のバンド３と識別することができる。好適な組織試料源としては大脳皮質、血液、血液フラクション、赤血球細胞、赤血球細胞膜、および白血球細胞が含まれる。血液試料が特に好ましい。本発明では、アルツハイマーのバンド３を正常バンド３から識別することのできる抗体を、抗体-抗原複合体が形成される条件下で、アルツハイマー疾患を持つと疑われる患者からの組織試料と接触させる。これに相当するコントロール試料中では、同じ抗体を、同じ条件下で年令相応のコントロール組織試料と接触させる。次いで、得られた抗体-抗原複合体を比較する。アルツハイマー疾患を有すると予想される患者の試料中の抗体反応性のコントロール試料に対する統計的有意差のある増加は疾患の存在を示している。更に、もしコントロール試料において抗体反応性が全く観察されないなら、アルツハイマー疾患を有すると予想される患者の試料中の正の反応性は疾患の存在を暗示している。「統計的に有意」とは、アルツハイマー疾患があると疑われる患者の試料の抗体反応とコントロール試料の抗体反応の差が１０−６０％であるか、および／またはアルツハイマー疾患の患者の試料の反応が正であってコントロール試料に抗体反応がないことを意味する。本発明では、抗体-抗原複合体が形成される条件下で、アルツハイマーバンド３を正常バンド３と識別することのできる抗体をアルツハイマー疾患を有すると疑われる患者の試料と接触させる。その場合、抗体-抗体複合体の形成を検知するために当業者にとって公知の従来の方法が使用される。本方法では、抗体の結合、検知および定量のために、当業者にとって公知の標準的なイムノアッセイ法が用いられる。好適なイムノアッセイとしては、固相および溶液アッセイ、放射性イムノアッセイ、ウェスターンブロット、酵素結合イムノソルベントアッセイ、イムノ蛍光アッセイ、ケミルミネッセントアッセイ、およびバイオルミネッセントアッセイが含まれる。アッセイ、条件および検知方法は当業者にとって公知である。本発明は、更に、アルツハイマー疾患を有すると疑われる患者の第１の組織試料中のバンド３蛋白質またはその崩壊生成物のリン酸化の量の決定、上記バンド３蛋白質またはその崩壊生成物の上記リン酸化の量を、健康なコントロール個体の第２の組織試料中のバンド３蛋白質またはその崩壊生成物のリン酸化の量と比較することを含むアルツハイマー疾患の検知方法を提供する。ここではコントロール試料に対する上記第１の試料の中のリン酸化の統計的に有意な低下はアルツハイマー疾患を示している。更に、コントロール試料中にリン酸化が観察されなければ、アルツハイマー疾患を有すると疑われる患者の試料中の正の反応性は疾患の存在を示唆している。好ましい態様では組織試料は大脳皮質、血液またはそのフラクション、赤血球細胞または赤血球細胞膜である。本発明では、バンド３またはそのフラグメントはアルツハイマー疾患においてはリン酸化が少ないことを示すことが発見された。バンド３およびそのフラグメントのリン酸化の検知および定量は当業者にとって公知の方法によって評価することができる。例えば、リン酸化はＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上の分子量のシフトを観察することによって、または抗ホスホチロシン抗体との反応性を評価することによって検知することができる。好ましい態様では、リン酸化は、バンド３中のリン酸塩が³²Ｐによって交換され、バンド３蛋白質中へ組み込まれる³²Ｐを検知し定量する条件下で、均一化した組織試料を標識したリン酸塩とともにインキュベートすることにより、好ましくはγ³²Ｐ-ＡＴＰの形で検知される。³²Ｐ標識したバンド３は上記した抗バンド３抗体を用いたイムノアッセイにより検知することができる。リン酸化を検知するための詳細な方法は下記の実施例２に記載されている。本発明の方法では、年令相応のコントロール試料に比べてアルツハイマー疾患があると疑われる患者の組織試料中のバンド３またはその崩壊生成物のリン酸化の統計的に有意な減少はアルツハイマー疾患を示唆している。本発明によれば、脳バンド３はグルコースおよびアニオンの輸送に於ける差異のようなアルツハイマー疾患における顕著な変化を引き起こすこと、およびこれらの変化は下記の実施例７で示すように末端血液の変化を伴うことが発見された。バンド３蛋白質に加えて、老化し、アルツハイマー疾患組織と正常組織とを識別するために用いることのできる他の蛋白質が存在することも発見された。このような蛋白質の例としてグルコール輸送蛋白質が挙げられる。例えば、肝グルコール輸送蛋白質（ＨＥＰＧ２）およびインスリン規制グルコール輸送蛋白質（ＩＲＧＴ）およびその他。加えて、アルツハイマー組織を正常組織と識別する抗体と複合体を形成する上記のグルコール輸送蛋白質のフラグメントまたは抗原決定基、例えばＨＥＰＧ２残基（ＱＧＧＡＳＱＳＤＫＴＰＥＥＬＦＨＰ）およびＩＲＧＴ残基（ＭＰＳＧＦＱＱＩＧＳＥＤＧ）が存在することも発見された。もう一つの例として、ＩＲＧＴ抗原決定基は、連鎖ＳＱＱＬＳＧＩＮＡＶＦＹＹＳＴによって表される。このように、これらの蛋白質はいずれも、本発明の、アルツハイマー組織と正常組織を識別する上記方法においてバンド３蛋白質またはフラグメントの代わりに用いることができる。以下の実施例により詳細に本発明を説明する。実施例１老化している脳試料およびアルツハイマー疾患の脳試料中の抗原性変化はバンド３、そのペプチドおよび崩壊生成物に対する抗体によって検知される。次の蛋白質またはペプチドに対するポリクローナル抗体は標準方法により得られまたはうさぎの中で産生される：バンド３および崩壊生成物（ｂａｎｄ３Ｂｒｋ）；バンド３の細胞質ペプチド（Ｃｙｔｏ）；バンド３のＣＯＯＨ末端から８１２−８２７残基（Ｒ８１２−８２７）ＳＣＡの生成に先立って生じる老化バンド３（９８０）グルコース輸送蛋白質（Ｇｌｕｃ）の４６９−４８５（ＱＧＧＡＳＱＳＤＫＴＰＥＥＬＦＨＰ）残基のチャンネルペプチド、およびバンド３のＣＯＯＨ末端から８１２−８３０の残基（Ｒ８１２−８２７）中年令（７カ月令）と老年令（１２−１３カ月令）のハツカネズミを頸部脱臼（cervical dislocation）により屠殺した。無菌状態で脳を取り出し、氷冷した均質化緩衝液〔５ｍＭのヘペス（Ｈｅｐｅｓ）、０.３２Ｍの蔗糖、５.０ｍＭのイミダゾール、５.０ｍＭのベンツアミジン、０.３ｍＭのＥＤＴＡ、０.５ｍＭのＭｇＳＯ₄、０.５ｍＭのＺｎＳＯ₄、５.０ｍＭのグリセロホスフェート、２. ０ｍＭのメルカプトエタノール、０.１ｍｇ／ｍｌのアプロティニン（シグマ社製）、０.１ｍｇ／ｍｌのロイペプチン（シグマ社）、０.０５ｍｇ／ｍｌのペプトスタチンＡ（シグマ社）、ｐＨ０.８〕中に入れた。脳を「ティシュテアロール（Tissue Tearor）」（ブリンクマン社製）により５分間均質化し、ソーバル（Ｓｏｒｂａｌｌ）ＲＣ-５Ｂ超遠心分離機中で４℃で８分間回転数５,０００ｒｐｍで分画型遠心分離機した。上澄みを傾斜法で取り出して氷上に置き、一方残りのペレットは均質化緩衝液中で均質化して同じ設定条件で遠心分離にかけた。これを３回繰り返した後、上澄みを４℃で３０分間、２０,０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄みを捨て、ペレットを均質化緩衝液（１０ｍＭのＡＴＰおよび２０％の超純粋グリセロール）に再懸濁し、イムノドットおよびリン酸化アッセイに備えて−７０℃で保存した。イムノドットアッセイは、若いハツカネズミ、老年のハツカネズミ、コントロールおよびアルツハイマー疾患患者のバンド３、変性バンド３およびバンド３崩壊生成物を比較するために用いた。膜またはバンド３抗体のいずれかが除かれているコントロールを測定したが、いずれも同じであった。実験された値からコントロールの値を差し引いた。比較しようとする試料をすべて同時に測定にかけた。ニトロセルロース膜上に、ウエル当たり２ｎｇから１８μｇの範囲の濃度で脳の均質化した蛋白質をスポットとして載せた。次いで膜を室温で４５分間乾燥し、５０ｍＭのトリスマ（Ｔｒｉｓｍａ）（ｐＨ７.４）、０.１％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）および６.０％の脱脂乾燥ミルク（ＮＦＤＭ）を含むトリス（Ｔｒｉｓ）緩衝塩溶液（ＴＢＳ）-ツイーン緩衝液中で６０分間遮断（block）した。それから膜をＴＢＳ−ツイーン（バイオラッド社製）緩衝液中で各１分間、合計３回洗浄し、ポリクローナル抗体中で６時間インキュベートした。それから各々の膜をＴＢＳにより各４分間、合計４回洗浄した。ＴＢＳ−ツイーンで１０分間最終水洗したのち、皿を取り換えて、各膜を６.０％ＮＦＤＭの入ったＴＢＳ−ツイーン中でインキュベートした。１時間後、膜を１４０μｌの¹²⁵Ｉ-蛋白質Ａ（アメルシャム社製）および１００ｍｌのＴＢＳ−ツイーン中で２時間インキュベートした。膜をＴＢＳ−ツイーン中で各５分間、合計４回、次いで３０分間ずつ２回洗浄した。湿潤膜を、ガンマカウンター（ベックマン社製）でｃｐｍを測定するため格子マークに沿って裁断した。測定はすべて３回行った。イムノブロットアッセイの結果を表１に表した。表１バンド３およびその崩壊生成物、老化バンド３、バンド３の合成ペプチド、合成ＳＣＡペプチド、またはグルコース輸送チャンネルペプチド（ＧＬＵＣ）に対する抗体によって検知された老化およびアルツハイマー疾患脳中の抗原性変化コントロール：年令相応のコントロール、結果はｃｐｍで表されている。＊：Ｐ≦０.０００１、＋：Ｐ≦０.０１、ＮＤ：未測定。バンド３の合成ペプチドに対する抗体は、若い処理および未処理ハツカネズミの脳組織と反応していた。ＣＹＴＯ：バンド３の細胞質ペプチド、残基１２２−１４４に対する抗体、ＢＤ３-ＢＲＫ：バンド３およびその崩壊生成物を認識する抗体、９８０：ＳＣＡ（ＳＣＡ）を生じる前の老化バンド３に対する抗体、８１２−８２７および８１２−８３０：バンド３の輸送領域のカルボキシル末端からのこれらペプチド残基に対する抗体、ＧＬＵＣ：グルコース輸送蛋白質のチャンネルペプチドに対する抗体。表１のデータは、バンド３の崩壊生成物での増加は年齢と関係があることを立証している。更に、データは、アルツハイマー疾患膜への抗体９８０および８１２−８３０の結合は正常な脳の膜への結合に比べて有意に増加していることを示している。このように抗体９８０および８１２−８３０はアルツハイマー疾患と正常な脳組織とを識別する。Ｃｙｔｏ、バンド３Ｂｒｋ、９８０およびＧｌｕｃ抗体を用いるイムノドットもアルツハイマー患者および正常な年齢相応なコントロールの血液試料から得られた赤血球細胞に関して行った。結果を図１Ａ-１Ｄにグラフにして表した。図１Ｃから分かるように、抗体９８０もまた正常な対象およびアルツハイマー患者とから得られた血液試料を識別することができる。実施例２次の実施例は、アルツハイマー疾患と正常な年齢相応コントロールとのバンド３のリン酸化の違いを示している。リン酸化は溶解した（lysed）細胞の膜中のバンド３に結合している³²Ｐの量をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて定量することにより比較した。リン酸化反応は、最終濃度が１００μｇ／ｍｌの蛋白質キナーゼＡインヒビター（シグマ社）、２００ｍＭのＭｇＳＯ₄、２ｍＭのエチレンジニトリロ-テトラ酢酸二ナトリウム塩（ＥＤＴＡ）、０.１３８ｍＭの２-メルカプトエタノール、および０.１５ｍＭ（３７ＧＢｑ／ｍｍｏｌ）（ＩＣＮ）のγ³²ＰＡＴＰを含む２００ｍＭのトリス‐塩酸（Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ）の７０μｌの入った均質化緩衝液（ｐＨ７.６）５０μｌの中に、脳均質化物１００μｇを混合し、３７℃で１２分間インキュベートした。リン酸化反応の終了時点で、試料を、４０％のグリセロールと２５ｍＭのＥＤＴＡを含む１Ｍのトリス-塩酸緩衝液（ｐＨ６.８）で希釈した。それぞれの試料（７５μｌ）の５０μｇを６-２３％のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルに載せ、ゲルの底から２ｃｍ以内のところまで走らせた。バンド３は、イムノブロット（ウエスターンブロット）の抗体／アルカリホスホターゼを載せた物（staining ）によって同定した。ウエスターンブロットは、ポリビニリデンジフルオライド微多孔膜（ＰＶＤＦ：ミリポア社製）上で２８アンペアで２２時間行った。トランスファーが完了した時点で、膜を５０ｍＭのトリツマ塩基（Ｔｒｉｚｍａｂａｓｅ）、３％の魚ゼラチン、０.１％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含むトリス緩衝塩溶液（ＴｒｉｓＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ：ＴＢＳ）中で、各回１５分間、合計３回洗浄し、次いでバンド３ペプチド残基８１２-８２７に対するポリクローナル抗体をＴＢＳに希釈した中で１時間インキュベートした。それからＰＶＤＦ膜をＴＢＳ中で３×５分間洗浄し、５０μｌのヒツジの抗-ウサギアルカリホスファターゼ（ザイミッド（Ｚｙｍｅｄ）社）、０.１％のマグネシウムおよび亜鉛クロライド中でＴＢＳで希釈してインキュベートした。膜を、再度、０.１％のツイーン２０を含む５０ｍＭのトリス（ｐＨ７.４）中で、各５分間合計３回洗浄した。バンド３標識した抗体は、膜を、色が正に付き始めるまで、２.５％のジエタノールアミン、０.３％の５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル- β-Ｄ-ガラクトシド、０.７％のｐ-ニトロブルーテトラゾリウムクロライド中でインキュベートすることにより同定した。放射能を持ったリン酸化した蛋白質は、膜を光照射付き容器（lightning plus cassette）中に−７０℃で２４時間暴露することにより同定した。この実験の結果は、中年令の脳および若年の脳に比べて老齢のハツカネズミの脳では、リン酸化は減少することを示している（図２）。更に、バンド３およびそのフラグメントのリン酸化は、年令相応のコントロールに対比してアルツハイマー疾患では減少している（図３）。アルツハイマー疾患の場合に観察されたバンド３のリン酸化のちがい（differencial）はトリプシン残基で観察される。バンド３のリン酸化は、脳組織の場合に記載したように、溶解した赤血球細胞の膜中のバンド３に結合している³²Ｐの量をＳＤＳ-ＰＡＧＥを用いて定量することによっても比較した。この実験の結果は、アルツハイマー疾患赤血球細胞では、リン酸化は、年令相応コントロールでのリン酸化に比較して減少していることを示している（図４）。脳の結果に関しては、バンド３のリン酸化の減少／赤血球細胞への³²Ｐの結合の減少はイン・ビボ（即ち、分子内）でのリン酸化の増加によるものであり、したがって³²Ｐで標識するには少しの部位しか残されていないことによる。図４Ａは、アルツハイマー疾患およびコントロールの、前頭ジャイラス（gyrus）脳の膜または中年令のＲＢＣ膜中のバンド３に対する抗ホスホチロシン抗体の結合を示している。実施例３次の実施例は、アルツハイマー疾患とコントロール脳組織とを識別する抗体に関するイン・ビトロでの研究を示している。脳組織はジェイ・ロジャーズ博士（Ｄｒ.Ｊ.Ｒｏｇｅｒｓ）（アリゾナ州、フェニックスのサン・シティー・リサーチ）およびボスマン博士（Ｂｏｓｍａｎ）〔ネザーランド州、ニジュメガン（Ｎｉｊｍｅｇａｎ）大学、医学部、生物化学科〕から入手した。バンド３に対する上記の抗体に関するイムノドットアッセイは上記の実施例に示したようにして、およびカバー（Ｃｏｖｅｒ）他著、ライフ・サイエンス、第 58巻、第655-664頁(1996)（これは本発明の一部とする）に記載されたようにして行った。同様にニトロセルロース膜に、脳の均質化蛋白質を２ｎｇから１８μ ｇの範囲の濃度でスポットとして載せた。膜を乾燥し、遮断し、ポリクローナルバンド３抗体と一緒に６時間インキュベートした。膜は洗浄して１００ｍｌのＴＧＳ-ツイーン中に入れた１４０μｌ（０.１４μＣｉ／ｍｌ）の¹²⁵Ｉ-蛋白質Ａ〔比活性３７ＭＢｑ；０.１００ｍＣｉ／ｍｌ；アメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製〕中で２時間インキュベートした。洗浄した膜を、ガンマ・カウンター（ベックマン社製）を用いてｃｐｍを測定するために格子ラインに沿って裁断した。イムノドットアッセイの結果を図５および図６に表した。図５は、抗体９８０がアルツハイマー疾患と正常な脳の膜を識別することを示している。図６は、バンド３および老化したバンド３への抗体の結合を示している。抗体９８０はバンド３の大きなアニオン輸送セグメント〔ＡＮＩＯＮ２；ケイ著、ＦＡＳＥＢＪ、第5巻、第109-115頁(1990)〕を認識する。ＡＮＩＯＮ 2、残基５８８-６０２は抗体９８０が強く結合するバンド３の内部セグメントである。図６も、ＡＮＩＯＮ１へではなく、ＣＯＯＨへの抗体９８０の微量の結合を示している。抗体９８０によるＡＮＩＯＮ２の認識は、ＳＣＡの生成に先立つバンド３の変化がＡＮＩＯＮ２、残基５８８-６０２の内部またはその近くで起こることを暗示している。実施例４次の実施例は、バンド３に対する抗体がアルツハイマー疾患とコントロールとの側頭皮質、およびアルツハイマー疾患とコントロールとの赤血球細胞を識別することを示している。バンド３の合成ペプチドに対する抗体は、正常な個体由来の脳の膜のバンド３蛋白質をアルツハイマー疾患を持つ患者由来のものと識別する。これらのひとつである、バンド３合成ペプチドｐｅｐ-ＣＯＯＨに対する抗体はアルツハイマー疾患の患者由来の脳中の６０,０００−７０,０００ダルトンの範囲の３種類のものを検出するが、年令相応のコントロール由来の脳中のものは検出しない（参照：サイトウ他著、アナリティカル・ニューヨーク・アカデミック・サイエンス、第674巻、第180-192頁(1992)）。ｐｅｐ-ＣＯＯＨに対する抗体はアルツハイマー疾患および正常な前頭皮質の免疫組織化学的解析用に使用される。ｐｅｐ-ＣＯＯＨに対する抗体はＣＯＯＨが老化した細胞抗原の一成分であるために用いられる。ｐｅｐ-ＣＯＯＨ抗体は正常な皮質中で神経細胞をほんの弱く汚染しただけである。ほんの少しの大きい神経細胞だけが強く反応性があった。アルツハイマー疾患の場合は、ｐｅｐ-ＣＯＯＨに対する抗体を標識している神経細胞の数は２６０％増加した（ｐ≦０.０１）。コントロールに較べてアルツハイマー疾患中の神経細胞の損失は５０％になる（ｐ≦０.００２）ので、ｐｅｐ-ＣＯＯＨに陽性である残留神経細胞の割合は５４０％増加した。アルツハイマー疾患においては、ｐｅｐ-ＣＯＯＨに対する抗体は血小板の周辺で見いだされるグリア細胞を標識した。このことはバンド３が、崩壊していない状態にあるものが支配的である正常な神経細胞中に存在すること、およびバンド３の崩壊はｐｅｐ-ＣＯＯＨへ抗体が結合しているアルツハイマー疾患において発生するを示唆している。図７は、バンド３のペプチド崩壊生成物および老化したバンド３を認識する、ＡＤ-ＢＤ３およびＣＯＯＨに対する抗体を含む多数のバンド３抗体による、アルツハイマー疾患の脳への結合とコントロールの脳とへの結合との間には有意差がある（ｐ≦０.００１）ことを示している。いくつかの抗-ペプチド抗体は、アルツハイマー疾患の脳と正常な脳とを識別することに加えて、アルツハイマー疾患のＲＢＣと正常なＲＢＣとを識別する。血清（sera）をバンド３の残基である、５３８-５５４、５８８-６０２、８１２ ‐８２７に対する抗体に関してＥＬＩＳＡを用いて選別した。これらの合成ペプチドはバンド３分子の関連する部分の主要な連鎖を複製する〔クドゥリスキー（Ｋｕｄｒｙｃｋｉ）およびシャル（Ｓｈｕｌｌ）著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ、第264巻、第8185-8194頁(1989)〕。これは本発明の一部とする。ＥＬＩＳＡは、ベネット（Ｂｅｎｅｔｔ）およびケイ（Ｋａｙ）著、エクスペリメンタル・ヘマトロジー、第9巻、第297-307頁(1981)に記載されたようにして行った。これは本発明の一部とする。パーオキシダーゼを結合したヒツジ抗ハツカネズミイムノグログリンを第２の抗体として用いた。ペプチド抗原を０ .２ｍの炭酸塩緩衝液に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、プレートを被覆するためにウェル当たり１００μｇを使用した。３７℃で終夜乾燥したのち、プレートを０.５％のツイーン２０を含むリン酸塩緩衝塩溶液で３回洗浄し、それから遮断緩衝液（blocking buffer）であるＰＢＳＴ中の０.０１％ゼラチン（ブタの皮膚）によって室温で振盪台（rocker）上で１時間クエンチ（quench）した。それからプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、最初は希釈率１：４０、最後は希釈率１：５で順次、遮断緩衝液（blocking buffer）中で希釈されたハツカネズミの血清とともに１時間インクベートした。プレートを洗浄し、これをホースラディッシュパーオキシダーゼを結合したヒツジ抗ハツカネズミＩｇＧおよびＩｇＭ（重い連鎖および軽い連鎖）（カルターク（Ｃａｌｔａｇ）社製）を遮断緩衝液中で１：６４００の希釈率にした中でインクベートした。ＰＢＳＴで洗浄した後、０. １Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ４.０）中の０.０３％の２-２'ＡＮＺＯビス（３- エチルバンツチアゾリン-６-スルホン酸）ジアンモニア塩を０.０１％のＨ₂Ｏ₂ とともにウエルに加えた。３０分後、プレートをバイオラド（BioRad）3559ミクロプレートリーダー（バイオラド・ラボラトリーズ社製、カリフォルニア州リッチモンド）で、４０５ｎｍのところで読みとった。アルツハイマー疾患のある個体および年令相応のコントロール個体に由来する赤血球細胞中の、バンド３、変性バンド３、抗ペプチド抗体およびバンド３崩壊生成物を比較するために“ドット-ブロット”／イムノドットアッセイを用いた。アルツハイマー疾患のある患者由来の赤血球細胞膜と、コントロールとして用いられる配偶者由来する赤血球細胞膜の間には、次の抗体：ＡＤ-ＢＤ３（ｐ≦０.０４）（図７Ａ）と反応させたとき有意差が存在した。また、次の抗体：ＢＤ３-ＢＲＫ（ｐ≦０.０１）、グルコースチャンネル蛋白質（ｐ≦０.０５）、およびｐｅｐ-ＣＹＴＯと反応させたとき、アルツハイマー疾患を持つ患者由来の赤血球細胞膜とコントロールとして用いた配偶者由来の赤血球細胞膜の間にも有意差があった。このように、赤血球と脳の中においては同じバンド３の変化が起こる（図７Ｂ−７Ｃ）。実施例５次の実施例は抗-ＳＣＡモノクローナル抗体はアルツハイマー疾患とコントロールとの脳組織を識別することができることを示している。ＳＣＡペプチドＡＮＩＯＮ１およびＣＯＯＨに対する抗体を産生する正常なドナーの抹消血液中で自然に発生するＢ細胞を、ヘテロハイブリドーマを産生するようにハツカネズミのＰ３Ｘ６３-ＡＧ８.６５３骨髄腫細胞株へ融合した。赤血球ＳＣＡを選別する多数のヘテロハイブリドーマはアルツハイマー疾患の脳とコントロールの脳とを識別し（図８および９）、アルツハイマー疾患の赤血球をコントロールの赤血球と識別した（下記参照）。ある種のモノクローナル抗体はアルツハイマー疾患組織への結合を増し、一方他の種類のモノクローナル抗体はコントロールに組織への結合を増加した。これは、（ａ）アルツハイマー疾患組織は正常組織が含むある種の抗原性決定基（determinant）またはその組み合わせを欠いており、また（ｂ）アルツハイマー疾患組織は正常組織がもっていない後天性のある種の抗原性決定基またはその組み合わせを持っていることを示唆している。これは、正常なヒトＢ細胞がＳＣＡに対する抗体を産生することを示している。これらの抗体は、老化に関係した免疫機能の低下がアルツハイマー疾患に有効であるかもしれないことを示唆しておりＴ-細胞の助けを必要とする。加えて、正常なヒト由来のＢ細胞がアルツハイマー疾患バンド３をコントロールのバンド３と識別する抗体を産生する事実は、健康な個体の免疫系による認識を開始することができるアルツハイマー疾患中の変質（alteration）および遮断することができる別のものが存在することを示唆している。これはアルツハイマー疾患に対する免疫学的および／または自己免疫成分を支持している。実施例６この実施例はバンド３およびバンド３合成ペプチドに対する抗体が組織切片中でアルツアイマー疾患の脳を正常なコントロールの脳と区別することを示している。抗ペプチド抗体または免疫付与前のうさぎ血清と反応したアルツハイマー疾患の脳組織およびコントロールの脳組織のエッチング切片について免疫電子顕微鏡観察を行った。抗体の結合を、金コロイドと結合した蛋白質Ａによって可視化した（図１０）。ｐｅｐ-ＣＯＯＨおよびグルコース輸送体であるチャンネル蛋白質に対する抗体はアルツハイマー疾患脳組織とは反応したがコントロール脳組織とは反応しなかった。正常なうさぎ血清はアルツハイマー疾患組織とは反応せず、コントロール組織と反応した。実施例７この実施例は、アルツハイマー疾患のある１０の個体のグルコースおよびアニオン輸送と年齢相応のコントロールの１０の個体のそれとの間で観察された差異を示している。アニオンおよびグルコース輸送の差異は当業者にとって周知の方法により末端血液中で観察できる。例えば、硫酸塩取り込みの測定は、カバー他著、ライフサイエンス、第58巻、第655-664頁(1996)に記載されているように、パーコル（Per c oll）勾配上での分離後の中年令者の赤血球に関して行った。赤血球を流入（inf lux）緩衝液（３００ｍＭの蔗糖、１０ｍＭのトリスマ（Trisma）、ｐＨ７.０）中で十分洗浄して、外部および細胞内部の塩化物を除いた。細胞を流入（influx ）緩衝液中に再懸濁させた後、５種類の硫酸塩（基質）濃度で３回アッセイを行うためのホウケイ酸塩培養管へ２×１０⁸個の細胞を導入（aliquate）した。基質濃度の適当なものを添加するに先立って、細胞を３７℃で１０分間インキュベートした。最終基質濃度がそれぞれ４０、２０、１０、５および２.５ｍＭとなるように、１００μｌの基質カクテル（４００ｍＭのＫ₂ＳＯ₄、０.２５ｍＣｉのＮａ₂ ³⁵ＳＯ₄）またはそれを連続的に希釈した一連の４種類の濃度のもの（２００、１００、５０および２５ｍＭのＫ₂ＳＯ₄）のひとつを、適当な時間間隔で適当な細胞懸濁液の入った管に加えた。３７℃で正確に５分間インキュベートしたのち、細胞懸濁液の０.５ｍｌを抽出し、９.０ｍｌの氷冷した洗浄用緩衝液（１.１５ＫＣｌ、１０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７.４）に加えた。それから細胞を洗浄緩衝液で３回洗浄し、遠心分離して、上澄み液をすべて捨てた。細胞のペレット状物を１０％のトリクロロ酢酸０.８ｍｌで脱蛋白し、遠心分離にかけて、それぞれの管からの６００μｌの上澄み液を、β-線放射を測定するための５.０ｍｌのオプティ‐フルオル（Ｏｐｔｉ-Ｆｌｕｏｒ）シンチレーションカクテルに加えた。硫酸塩吸収速度はｎｍｏｌ／１０⁸ｃｅｌｌｓ／ｍｉｎとして表現した。Ｄ-グルコース取り込み測定はパーコル（Percoll）勾配上で分離した中年令者の末梢赤血球に関して行った。外部および細胞内部のグルコースを除くために、赤血球を２０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）中で十分洗浄した。細胞をリン酸緩衝液中に再懸濁したのち、２×１０⁸個の細胞をホウケイ酸塩培養管中へ導入（aliquote）し、アッセイを５種類のＤ-グルコース（基質）濃度で３回行うために氷上に置いた。最終基質濃度がそれぞれ２、１、０.５、０.２５および０. １２５ｍＭとなるように、１００μｌの基質カクテル（２０ｍＭのＤ‐グルコース、０.３ｍＣｉのＤ-³Ｈ-グルコース）またはそれを連続的に希釈した一連の４種類の濃度のもの（１０、５、２.５および１.２５ｍＭＤ‐グルコース）のひとつを、適当な時間間隔で適当な細胞懸濁液の入ったチューブに加えた。０℃で正確に５分間インキュベートしたのち、細胞懸濁液の０.５ｍｌを抽出し、９.０ｍｌの氷冷した停止用緩衝液（２０ｍＭのリン酸塩緩衝液、０.１ｍＭのフロレチン（phl oretin）、ｐＨ７.４）に加えた。それから細胞を停止用緩衝液で３回洗浄し、遠心分離して、上澄み液をすべて捨てた。細胞のペレット状物を１０％のトリクロロ酢酸０.８ｍｌで脱蛋白し、遠心分離にかけて、それぞれの管からの６００ μｌの上澄み液を、β‐線放射を測定するための５.０ｍｌのオプティ-フルオル（Ｏｐｔｉ-Ｆｌｕｏｒ）シンチレーションカクテルに加えた。Ｄ-グルコース取り込み速度はｐｍｏｌ／１０⁸ｃｅｌｌｓ／ｍｉｎとして表現した。アルツハイマー疾患患者の赤血球によるアニオンおよびグルコース輸送は、同じ実験で平行して行ったコントロールでの試験よりも確実に低かった。試料の量が少ないことと個体間のばらつきのために、データはコントロールの輸送に対する患者の相対的輸送として解析した。コントロールは常に配偶者とした。グルコース輸送のＶ^maxとＫ_mの差は統計的に有意（それぞれ、ｐ≦０.０４および０.０３；表II）であった。また、アニオン輸送の差もＶ^max（ｐ≦０.００１）およびＫ_m（ｐ≦０.０４；表II）について統計的に有意であった。硫酸塩取り込み速度は、赤血球、脳および白血球において年令とともに減少した（即ち、アニオン輸送の減少）。特に脾臓白血球によるアニオン輸送は年令とともに２４％減少した（老齢のハツカネズミと中年令のハツカネズミとでｐ≦０ .００５；老齢ハツカネズミと若いハツカネズミとでは３０％；ｐ＜０.００１）。実施例１０参照。このように、アルツハイマー疾患のある個体由来のＲＢＣはアニオンおよびグルコース輸送の効率を低下し、その配偶者および年令相応のコントロールに比べて、アニオンおよびグルコース結合部位（Ｋ_m）の数の減少を示した。アニオン輸送もまた白血球において年令とともに減少した。１）Ｖ^max:ｍｍｏｌ／１０⁸ｃｅｌｌｓ／ｍｉｎ.、Ｋ_m：ｍＭ。２）Ｖ^max:ｐｍｏｌ／１０⁸ｃｅｌｌｓ／ｍｉｎ.、Ｋ_m：ｍＭ。３）統計的解析（ｐ値）は各実験について、コントロールの輸送に対し患者の輸送を比較したものである。コントロールは通常環境効果を保証するための配偶者を用いた。実施例８この実施例は抗ＳＣＡモノクローナル抗体がアルツハイマー疾患とコントロールの赤血球細胞を識別することができることを示している。実施例５で記載した多数のヘテロハイブリドーマはアルツハイマー疾患とコントロールとの赤血球を識別した（図１１）。ある種のモノクローナル抗体はアルツハイマー疾患の赤血球細胞と反応し、一方、他のモノクローナル抗体はコントロールの赤血球細胞と反応した。実施例９この実施例は、バンド３ペプチド５８８-６０２および８２２-８３９に対する血清の自己抗体がコントロールに比べてアルツハイマー疾患患者中で増加することを示した。自然に産生する自己抗体を、これらの抗体がアルツハイマー疾患とともに増加するかどうかを測定するために熟成中ＥＬＩＳＡによってヒト血清中の老化細胞抗原に対して定量測定した。また自然に産生する自己抗体は、それらを既知のアルツハイマー疾患組織、例えば脳、と反応させることによっても検知し、、または定量することができる。血清の自己抗体はバンド３ペプチド５８８-６０２および８２２-８３９に対して、コントロールよりもアルツハイマー疾患患者中で増加した（両側ｔ検定ｐ≦ ０.０６；図１２）。有意性は試料の大きさが増加するに連れて増加することが期待される。これらのバンド３残基はアニオン輸送／結合領域に存在する。このことは、変性は患者の免疫系によって抗原的に異なるものと認識されるから、アルツハイマー疾患のこの領域の変性と一致する。これはアニオン輸送において観察された減少と一致する（実施例７）。５８８-６０２領域に対する自己抗体の発生は、これが「老化を受け易い部位」であることを示すデータと一致している。

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）アルツハイマー疾患を持つと疑われる患者由来のバンド３を含む組織試料を、アルツハイマーのバンド３を正常なバンド３と識別する抗体と、上記抗体とバンド３との間で複合体を形成するに効果的な条件下で接触させること；（ｂ）上記複合体を検知すること；（ｃ）健康な個体由来のバンド３を含む組織試料を、アルツハイマー疾患を正常バンド３から識別する抗体と接触させ、十分な時間およびもし複合体を形成するのであれば上記抗体とバンド３との間で複合体が形成されるに効果的な条件下でインキュベートさせること；および（ｄ）ステップ（ｂ）で形成された複合体の量をステップ（ｃ）で形成された複合体の量と比較すること、即ち、アルツハイマー疾患の存在を示す、ステップ（ｃ）に比べてのステップ（ｂ）で形成された複合体の統計的な増加量を比較することを含むアルツハイマー疾患の検知方法。２．（ａ）アルツハイマー疾患を持つと疑われる患者由来のバンド３を含む組織試料を、アルツハイマーのバンド３を正常なバンド３と識別する抗体と、上記抗体とバンド３との間で複合体を形成するに効果的な条件下で接触させること；および（ｂ）上記複合体を検知すること、を含むアルツハイマー疾患の検知方法。３．上記組織試料が大脳皮質、血液またはそのフラクション、赤血球細胞、赤血球細胞膜または白血球細胞である請求項１または２に記載の方法。４．上記抗体が抗体９８０である請求項１または２に記載の方法。５．上記抗体がＡＤ-ＢＤ３である請求項１または２に記載の方法。６．上記抗体がバンド３のペプチド８１２-８２７と複合体を形成する請求項１または２に記載の方法。７．上記抗体がバンド３のペプチド８１２-８３０と複合体を形成する請求項１または２に記載の方法。８．上記抗体がバンド３のペプチド８２２-８３９と複合体を形成する請求項１または２に記載の方法。９．上記抗体がバンド３のペプチド８５３-８７０と複合体を形成する請求項１または２に記載の方法。１０．上記抗体がバンド３のペプチド５３８-５５４と複合体を形成する請求項１または２に記載の方法。１１．上記抗体がバンド３のペプチド５８８-６０２と複合体を形成する請求項１または２に記載の方法。１２．上記抗体がバンド３のペプチド４６９-４８５と複合体を形成する請求項１または２に記載の方法。１３．上記抗体がバンド３のペプチド５３８-５５４および８１２-８２７の混合物と複合体を形成する請求項１または２に記載の方法。１４．上記抗体がバンド３のペプチド５８８-６０２および８１２-８２７の混合物と複合体を形成する請求項１または２に記載の方法。１５．（ａ）アルツハイマー疾患を有する疑いのある患者の第１の組織試料中の、バンド３蛋白質またはその崩壊生成物のリン酸化の量を測定すること；および（ｂ）バンド３蛋白質またはその崩壊生成物の上記リン酸化の量を、健康なコントロール個体中の第２の組織試料中のバンド３蛋白質またはその崩壊生成物のリン酸化の量と比較すること；を含み、上記第１の試料中の統計的なリン酸化量の減少がアルツハイマー疾患を示唆しているアルツハイマー疾患の検知方法。１６．上記組織試料が大脳皮質、血液またはそのフラクション、赤血球細胞、赤血球細胞膜または白血球細胞である請求項１５記載の方法。