CN1646683A - 具有改良的存活性质的宿主细胞及该细胞的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是有关包括增加量的活性抗－细胞凋亡基因的遗传工程处理的哺乳动物宿主细胞与产生此类细胞的方法。更特别地，本发明是关于调节宿主细胞内抗－细胞凋亡活性基因的量的方法；以及关于利用延迟/抑制此类细胞的自然发生的程序性细胞死亡而显示增加的细胞存活力的宿主细胞。本发明还提供了新的抗凋亡基因，该基因适合制备利用延迟/抑制此类细胞的自然发生的程序性细胞死亡而显示增加的细胞存活力的宿主细胞。

Description

具有改良的存活性质的宿主细胞 及该细胞的生产方法
技术领域
本发明是有关包括增加量的活性抗-细胞凋亡基因的遗传工程处理的哺乳动物宿主细胞与产生此类细胞的方法。更特别地，本发明是关于调节宿主细胞内抗-细胞凋亡活性基因的量的方法；以及关于利用延迟/抑制此类细胞的自然发生的程序性细胞死亡而显示增加的细胞存活力的宿主细胞。
背景技术
因为功能上与药物动力学上相关的后翻译修饰是与人类高度相容，故哺乳类细胞是生产大部分的复杂的蛋白质治疗药物的优选宿主。商业上相关的细胞型态包括杂交瘤、骨髓瘤、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞与幼仓鼠肾脏(BHK)细胞。因为CHO的生长直接地适应无血清/无蛋白质的培养液，且考虑其为重要管制机构的安全的生产宿主，故产业上使用愈来愈多的CHO衍生物。
在标准的生物医药生产方法-生物反应器操作中，有相当百分比的生产细胞群会在称为细胞凋亡的遗传决定的程序中死亡(Al-Rubeai等人，1998；Goswami等人，1999；Laken等人，2001)。已知细胞凋亡是因诸如血清缺乏、营养限制、氧气限制与机械应激的外源或内生性信号的结果而活化的主动细胞自杀程序。细胞凋亡的特征为浆膜起泡、细胞体积丧失、细胞核回缩与在核体间隔的核酸内切酶降解DNA(Wyllie等人，1980)。
经辨识血清成分是主要有效的细胞凋亡保护剂。然而，不仅在生物技术产业内，甚至，亦因药物注册的重要的管制机构的推动，一直有强烈驱力来发展无血清与无蛋白质的制造过程。主要原因在节省成本、蛋白纯化时较少的干扰、并减少导入诸如感染性蛋白质或病毒等病原的潜在性。然而，省略血清通常造成生产的细胞株对程序性细胞死亡敏感度增加，使细胞更易受培养的侵犯的伤害(Franek等人，1991；Goswami等人，1999；Moore等人，1995；Zanghi等人，1999)。因为蛋白产量主要为活的生产细胞群的函数，故成熟前的细胞死亡，例如藉细胞凋亡所致的细胞死亡，即表示有价值的来源的大量损失。愈能长久维持培养物中高密度的活的生产性细胞，因为每个生产过程的产率亦较高，其生产过程愈有效亦愈能获利。在无血清时，细胞在到达最高细胞密度的固定生长期时会更快死，因此缩短生产期。因产物受凋亡细胞释出的蛋白酶降解与收取时受多量的细胞碎片干扰，产率会进一步减低。
为解决生产细胞株增加的细胞凋亡敏感度的困境，目前已开始多种生理的工程处理策略，特别是那些经改变并完全培养于无血清条件的细胞株。其中的某些策略的焦点为，在模拟生产的细胞培养条件下，减少/消减诱发内生性的细胞凋亡-反应程序。有一种方法是通过给食减轻营养物的损失(deZengotita等人，2000；Franek等人，1996；Mercille等人，1994；Sanfeliu等人，1999)。另一种方法的焦点为，使用细胞凋亡的抑制化合物添加剂以阻断细胞凋亡反应机制的主要效应物(Mastrangelo等人，1999；Sanfeliu等人，2000；Simpson等人，1998；Zangli等人，2000)。一种替代策略代表遗传方法。包括利用抗-细胞凋亡存活基因或遗传工程处理的抗细胞凋亡决定物来处理细胞本身，所述决定物衍生自存活维持调控网络或病毒(Cotter等人，1995；Chung等人，1998；Fussenegger等人，2000；Mastrangelo等人，1998，2000a与2000b；Mercille等人，1999a与1999b；Pan等人，1998；Simpson等人，1999；Terada等人，1997；Tey等人，2000a与2000b)。
关于后者的策略，经假设bcl-2与bcl-xL这两种细胞凋亡抑制物，且是高度保守的促(pro-)-细胞凋亡(例如bad、bak、bax、bok、bcl-xS、bik、bid、hrk、bim、blk、bcl-y)与抗-细胞凋亡(例如bcl-2、bcl-xL、blc-w、bfl-1、al、mcl-1、boo、brag-1、nr-13、bhrf-1、ced 9、cdn-1、cdn-2、cdn-3)应答调控基因的主要成员，是生物技术机构中抗-细胞凋亡的工程操作的强力候选者。
经显示，Bcl-2可在回应由同源-与异源-二聚化的促-与抗-细胞凋亡BCL-2型蛋白质所组成的位于线粒体外膜的分子变阻器情形下，调节位于线粒体外膜的胱冬酶(caspase)-9-依赖型的细胞凋亡路径的诱发。利用培养限制的对促-调亡(pro-apoptotic)亚家庭成员的偏向表达与内生信号，造成Apaf-1-胱冬酶-9复合物的释出与此含半胱氨酸的天冬氨酸特异性蛋白酶自动活化的情形，与细胞色素c由线粒体剧烈流至细胞质相关。细胞凋亡控制机制在线粒体外膜组合其主要的部分，在抗细胞凋亡的工程操作的焦点上，可使这些细胞发电厂成为压力感应器，并且作为维持细胞凋亡过程的执行者(Follstad等人，2000；Green等人，1998；Tsujimoto，1998)。
有些报告指出导源抗-细胞凋亡bcl-2基因的表达对适应并培养于含胎牛血清的遗传工程细胞株的存活/存活力与强健具正向效果。那些细胞包括骨髓瘤、杂交瘤、幼仓鼠肾脏细胞(BHK)与中华仓鼠卵巢细胞(CHO)。有人说明BCL-2表达的正效果与诸如血清与葡萄糖缺乏、生长因子抽离或病毒感染的不同环境应激相关(Fassnacht等人，1998；Figueroa等人，2001；Fussenegger等人，2000；Itoh等人，1995；Mastrangelo等人，2000a与2000b；Reynolds等人，1996；Simpson等人，1997，1998与1999；Tey等人，2000a与2000b)。
分别已有人说明以BCL-xL为基础的代谢遗传工程处理人T细胞与CD34+血球生成细胞(美国专利号码6,143,291，WO 00/75291)。Fussenegger等人，1998还有Mastrangelo等人，2000a与2000b皆说明BCL-xL表达对仓鼠细胞存活的正效果。
然而，全部这些报告若非使用诸如人类T细胞与CD34+造血细胞的非生产性细胞株，即是使用已调适过并例行地培养在含血清条件的例如，仓鼠或小鼠细胞株的生产性细胞株；而且，甚至多数是附着细胞。研究血清抽离效果对表达异源BCL-2或BCL-xL的重组细胞的存活，并不包括数次传代培养于无血清的培养液。反而，血清培养的细胞若非接种于完全无血清的培养液，即是血清含量减低的培养液；而且，还追踪数天有关这些培养侵犯对批式培养的细胞存活效果。因为由血清内的细胞凋亡保护剂制约的胞内反应仍持续，这种因血清抽离造成的培养侵犯的真正开始亦可能延迟。
只有少量实验进行相关的已适应并恒定生长于无血清培养液的悬浮液的重组细胞株的生产。目前，这些条件是生物技术产业最喜爱者，但是同时细胞株更脆弱且更不强健。在Goswami等人1999的报告中，说明了表达γ-干扰素的CHO细胞培养在那些条件下的实验。表达额外的异源BCL-2的培养物的存活有改善，但局限于批式培养7天后仅约40％的活细胞而已。没有人知道BCL-xL表达对适应并永久生长于无血清条件下的缩主细胞存活力/存活的效果。
由上述讨论，很清楚地在生物技术机构需要进一步增加细胞存活力，尤其是已适应无血清生长并够格于无血清生产治疗与诊断用的生物药物的细胞株。于批式培养中，若能以高存活力延长细胞于固定期的存活，会明显影响产率与成本效益，藉此生产期每额外增加一天都会带来大贡献。
在本发明中，我们提供策略以进一步改善在无血清的培养液的悬浮液中恒定成长的生产细胞株的存活。该策略是根据遗传工程处理的宿主细胞，以改善抗-细胞凋亡的作用性多肽的细胞内含量。很惊讶地发现，抗-细胞凋亡的作用性基因的细胞内含量可实质改善细胞存活力，且对细胞生产力亦无任何负面效果。
发明概述
经显示，非扩增的异源导入的抗-细胞凋亡基因，例如BCL-2或BCL-xL，对适应且通常生长于无血清和/或无蛋白质条件的细胞的存活力/存活，仅有很小效果(参照图5)。此发现已由Goswami等人1999的报告所支持。现在，本发明说明/提供一个显著改善宿主细胞存活力/存活的新方法，特别是对建立与培养于无血清条件下的宿主细胞。利用扩增促成的过度表达来改善抗细胞凋亡作用性蛋白，例如BCL-xL或BCL-2的胞内含量，可延迟/抑制细胞凋亡。本发明很惊讶发现，藉大量的过度表达诸如BCL-xL的抗细胞凋亡蛋白，不仅仅是未负面影响所需蛋白表达量的能进一步改善存活力/存活的适当工具而已。相反地，在BCL-xL过度表达的细胞，细胞生产力还增加(例如参照图2与图3)。因而，本发明提供新的遗传修饰宿主细胞，特别是仓鼠或小鼠生产细胞株，而且还有生成这种创造性的生产细胞株的方法。只要能以非常充分方式改善目前的生产方法的经济活力，此发现对生产生物医药肽/蛋白将非常有利。与现有技术比较，本发明的大优点在于其提供了将细胞存活力改善，蛋白生产过程的限制因子和蛋白的高产量相互联系起来的方法。
因而，本发明提供具改善的存活性质且非常适于生产生物医药蛋白质的遗传工程处理的宿主细胞。该改善的存活性质是基于细胞内增加的抗细胞凋亡基因的量。优选者为哺乳动物来源的宿主细胞、更优选为小鼠杂交瘤/骨髓瘤或仓鼠细胞，尤其是已适应且恒定培养于无血清和/或无蛋白质的培养液的宿主细胞。
本发明亦提供显示增加的抗-细胞凋亡基因表达量的哺乳动物宿主细胞的产生方法，包括(i)将编码抗-细胞凋亡基因、选择用的可扩增的标记基因与视情形的至少一种目的基因的核酸序列导入哺乳动物宿主细胞群，其中该基因是可操作地连接于至少一种允许该基因表达的凋控序列，(ii)将该细胞群于至少可表达该选择用的可扩增的标记基因和该细胞凋亡基因，且是有利于取得至少该抗-细胞凋亡基因的多拷贝数的条件下培养，以及(iii)由该细胞群选取至少掺入多拷贝数的抗-细胞凋亡基因的细胞。
因而，本发明亦提供在宿主细胞表达抗-细胞凋亡基因、选择用的可扩增的标记基因与至少一种目的基因的方法，包括(i)将编码抗-细胞凋亡基因、选择用的可扩增的标记基因与目的基因的核酸序列导入宿主细胞群，其中该基因是可操作地连接于至少一种允许该基因表达的调控序列，和(ii)将该细胞群于可表达该基因的条件下培养。
利用任何这些方法之一处理宿主细胞，可提供包括至少一种高拷贝数的抗-细胞凋亡基因的宿主细胞。
本发明亦提供在任何根据本发明的宿主细胞生产目的蛋白的方法，包括(i)在有利于抗-细胞凋亡基因与目的基因表达的条件下培养细胞，和(ii)从细胞和/或细胞培养上清液中分离目的蛋白。
最后，本发明还为本领域熟练技术人员提供了最早从仓鼠(黝仓鼠(Cricetulus griseus))分离的新的抗凋亡基因，以及该基因的几种突变体。野生型和修饰后基因均可用于本文的任何创造性方法中，用来改善细胞生存力和细胞繁殖力。此外，本发明还涉及蛋白质，该蛋白由这些新的抗凋亡基因中的任何一种编码。
附图简述
图1图示供转染CHO-DG44细胞的表达载体设计。P/E意指含增强子与启动子元件的组合单位，P为启动子元件而T为被转录的信使RNA聚腺苷酸化所需的转录终止位置。sICAM意指目的基因，而bcl-2与bcl-xl指抗细胞凋亡基因。dhfr意指可扩增的选择用标记二氢叶酸还原酶。箭头指示转录单位内的转录起始位置。
图2比较短暂转染的CHO-DG44细胞于转染后48小时的表达情形。图2A的pBID-sICAM、图2B的pSEAP2-对照组(Clontech，Palo Alto，CA)与图2C的pGL2-对照组(Promega，Madison，WI)是经pBID-bcl-2、pBID-bcl-xL或对照组pBID转染。
图3显示经pBID-sICAM与pBID、pBID-bcl-2或pBID-blc-xL共转染、选取与培养于无黄嘌呤/胸苷的CHO-S-SFMII培养液(Invitrogen，Carlsbad，CA)的CHO-DG44的稳定混合群sICAM的表达情形。每个值都是经过3天培养期间的5次传代的6个混合群的平均sICAM产量。
图4评估克隆的细胞株HMNI-1/2(经pBID-sICAM与pBID共转染的对照组细胞)、HMNIBC-1/2(经pBID-sICAM与pBID-bcl-2共转染)与HMNIBX-1/2(经pBID-sICAM与pBID-bcl-xL共转染)于7天批式培养期使用台盼蓝染料排除的存活力。选取重组的CHO-DG44细胞并培养于无黄嘌呤/胸苷的CHO-S-SFMII培养液(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
图5显示使用台盼蓝染料排除的存活力百分比情形，氨甲喋呤扩增的细胞克隆HMNI-3/4(经pBID-sICAM与pBID共转染的对照组细胞株)、HMNIBC-3/4(经pBID-sICAM与pBID-bcl-2共转染)与HMNIBX-3/4(经pBID-sICAM与pBID-bcl-xL共转染)于9天批式培养于无黄嘌呤/胸苷，但含20毫微摩尔浓度的MTX的CHO-S-SFMII培养液(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
图6显示表达BCL-2或BCL-xL的氨甲喋呤扩增的CHO-DG44细胞克隆的细胞凋亡特征。使用荧光为基础的TUNEL分析(BD BiosciencesPharMingen，San Diego，CA)，于第2、4与6天时评估HMNI-3/4(经pBID-sICAM与pBID共转染的对照组细胞株)、HMNIBC-3/4(经pBID-sICAM与pBID-bcl-2共转染)与HMNIBX-3/4(经pBID-sICAM与pBID-bcl-xL共转染)的批式培养于无黄嘌呤/胸苷，但含20毫微摩尔浓度的MTX的CHO-S-SFMII培养液(Invitrogen，Carlsbad，CA)的凋零细胞百分比。
图7显示BCL-2与BCL-xL在不同重组的CHO-DG44细胞克隆的Western印迹分析结果。其比较BCL-2(图7A)与BCL-xL(图7B)在未扩增(BCL-2：HMNIBC-1/2；BCL-xL：HMNIBX-1/2)或扩增(BCL-2：HMNIBC-3/4；BCL-xL：HMNIBX-3/4)的表达单顺反子构型的抗-细胞凋亡基因的细胞品系的表达。抗-细胞凋亡基因的表达是与亲代(CHO-DG44)且仅生产-sICAM(HMNI-1)的对照组的细胞株做比较。蛋白质是利用购自SantaCruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)的具BCL-2或BCL-xL特异性的小鼠单株抗体与抗-小鼠过氧化酶偶合的第二抗体(Dianova GmbH，Hamburg，Germany)来检测。
图8显示以Mito Tracker为基础的培养于有或无血清的CHO-DG44的线粒体含量的定量(Molecular Probes，Eugene，OR)。FACS介导的线粒体计数是对培养于含10％血清(灰线)与不含血清(黑线)的CHO-DG44细胞进行的。
图9显示了新仓鼠bcl-Xl基因(SEQ ID NOS：3和4)的核苷酸序列以及预期的开放阅读框架。所述核苷酸序列代表一种合成序列，其中5’和3’未翻译区自基因组克隆和cDNA克隆的编码区获得。
图10图示了真核表达载体设计。P/E表示含有增强子和启动子元件的合成单位，P是启动子元件，T是转录的信使RNA多核苷酸化所需的转录终止位点。bcl-xL指仓鼠抗凋亡bcl-xL cDNA，而dhfr指可扩增的选择性标记二氢叶酸还原酶。箭头表明了转录单位内的转录起始位点。
图11图示了产生仓鼠Bcl-xL缺失突变体的总体克隆策略。表达载体pBID/Bcl-xL编码仓鼠Bcl-xL野生型cDNA，在PCRs中作为模板。使用载体特异的引物1(VSP1)和基因特异性引物del26，del46或del66的组合物产生缺失突变体的各种5’末端。为进行亚克隆，使用Not I和位于启动子/增强子(P/E)区内的SnaB I消化PCR产物(黑色箭头)，Not I中通过基因特异的引物新引入了限制性酶切位点。使用载体特异的引物2(VSP2)和基因特异性引物del63或del83的组合物产生缺失突变体的各种3’末端。使用位于基因特异引物序列内的Not I和终止子区(T)上游的EcoR I消化得到的PCR产物(黑色箭头)。为构建含有仓鼠bcl-xL cDNA缺失突变体(pBID/bcl-xL del)的表达载体，将5’和3’cDNA片段直接克隆到SnaB I/EcoR I消化的载体pBID中。
发明详述
本发明提供经导入编码抗-细胞凋亡基因、选择性的扩增用的标记基因与至少一种目的基因的核酸序列而遗传修饰的宿主细胞。在一优选具体实施方案中，该抗-细胞凋亡基因、选择性的扩增用的标记基因与目的基因，可操作地连接于至少一个允许这些基因表达的调控序列。在一个更优选的实施方式中，所述抗凋亡基因，选择性标记基因和目的基因可操作地连接于仅一个启动子序列，使得所述基因共表达。在本发明的另一实施方案中，该抗凋亡基因，选择性可扩增标记基因可操作地连接于仅一个启动子序列，使得所述基因共表达。在另一具体实施方案中，该宿主细胞的遗传修饰包括导入一种以上的抗-细胞凋亡基因。
以此方式修饰的宿主细胞，允许抗-细胞凋亡基因与选择性扩增用的标记以及视情形的目的基因共表达。选择性扩增用的标记，不仅使我们可稳定选取转染的宿主细胞克隆，亦可扩增抗-细胞凋亡基因。本发明显示，扩增抗-细胞凋亡基因，提供达成抗-细胞凋亡作用性蛋白的细胞内含量更有效的方法；与未扩增任何抗-细胞凋亡蛋白编码序列者比较，可有效改善宿主细胞的存活。因为延迟或抑制宿主细胞内的程序性的细胞死亡，例如细胞凋亡所强化的细胞存活，为根据本发明的遗传修饰的宿主细胞的特征。很惊讶地发现，经任何的本发明方法修饰的宿主细胞群，是经培养至少9天，其中细胞的总存活率至少为约50％(亦参照图5)。8天批式培养后，根据本发明生成的宿主细胞的存活力至少可达60％。在本发明的进一步具体实施方案中，7天的批式培养后细胞的存活力至少可达约75％。在另一个具体实施方案中，6天的批式培养后细胞的存活力至少可达约85％。本领域无法得知存活力的相等水平，至少对无血清的培养，尤其是一直培养在无血清条件下的细胞，和/或与生物医药的无血清生产相关联者是如此。本领域所述的存活力经7天批式培养后，限制于40％(Goswami等人，1999)。因而，据此所确定特征的宿主细胞是本发明范围所涵盖。
“细胞存活力”或“细胞存活”是目标细胞持续活着并表达功能的能力，且包括因抑制或延迟细胞凋亡或自然细胞死亡而保护细胞免于细胞死亡。细胞存活力或细胞存活的测定方法是本领域所熟知。例如，细胞存活力可利用相差显微镜、荧光显微镜或使用诸如台盼蓝、碘化丙锭或碘化丙锭/吖啶橙的组合等非细胞渗透性染料的流式细胞计数仪来测定。这些方法在Current Protocols in Cytometry，John Wiley&Sons，Inc.，更新版，都以实例说明，其全文纳入此文供参考。
术语“一直培养在无血清条件下”不仅指在无血清条件下进行的细胞培养，还包括细胞转化，通过增加细胞数目的细胞扩增以及细胞储存，例如储存于液氮中。
因而，本发明亦是有关抑制或延迟宿主细胞死亡的方法，包括将本发明的宿主细胞，例如上述的宿主细胞培养于至少有一种抗-细胞凋亡基因表达的条件，并可抑制或延迟该宿主细胞的死亡。在一优选具体实施方案中，该细胞的细胞死亡是由程序化的细胞死亡，更优选是因细胞凋亡所造成。
本发明亦提供显示增加的表达量的抗细胞凋亡基因的哺乳动物宿主细胞的产生方法，包括(i)将编码抗-细胞凋亡基因、选择用的可扩增的标记基因与视情形的至少一种目的基因的核酸序列导入哺乳动物宿主细胞群，其中该基因是可操作地连接于至少一种允许该基因表达的调控序列，(ii)将该细胞群于至少可表达该选择用的可扩增的标记基因和该抗-细胞凋亡基因，且是有利于取得至少该抗-细胞凋亡基因的多拷贝数的条件下培养，以及(iii)由该细胞群选取至少掺入多拷贝数的抗-细胞凋亡基因的细胞。优选将至少抗凋亡和选择性可扩增的标记基因置于空间紧邻位置，使得抗凋亡基因的扩增更有效。因此在上述优选的实施方案的方法中，至少抗凋亡和选择性可扩增基因由相同的DNA分子编码，例如如果两个基因均位于相同的表达载体上，并因此共同引入宿主细胞中。在该方法更优选的实施方案中，该抗凋亡基因和选择性可扩增标记基因的表达例如通过使用共同的启动子可操作地相互连接，使得所述基因共表达。
在更有选地实施方案中，该抗凋亡基因，选择性可扩增标记基因和目的基因由仅一个DNA分子编码，例如如果所有这些基因被置于相同的表达载体上，并将共同被引入所述的宿主细胞中。在更有选地实施方案中，该抗凋亡基因，选择性可扩增基因和目的基因不仅只由一种DNA分子编码，还可操作地连接于仅一个启动子序列以使所述基因共表达。
根据本发明的任何方法基因修饰的宿主细胞与非转染以及非扩增的亲代细胞比较，显示增加的抗-细胞凋亡蛋白的表达。“亲代细胞”意指未显示增加的抗-细胞凋亡基因表达的细胞；而且，通常与根据本发明的例如，导入与扩增编码抗-细胞凋亡基因、选择用的可扩增的标记基因与视情形的至少一种目的基因的核酸序列的基因修饰细胞，生长在相同或实质上相同的条件。“抗-细胞凋亡蛋白的增加的表达”意指例如，过度表达，亦即，与未根据本发明的任何修饰的方法比较，例如，藉由导入和扩增编码抗-细胞凋亡基因、选择用的可扩增的标记基因与视情形的至少一种目的基因的核酸序列加以修饰的宿主细胞，该蛋白在宿主细胞中的表达量至少增加30倍，以至少增加50倍优选，以增加至少100倍更佳。
因而，本发明亦提供经本文所述的任何方法基因修饰，并显示过度表达的抗-细胞凋亡基因的宿主细胞；亦即，与未根据本发明的任何修饰的方法比较，该基因在宿主细胞的表达量至少增加约30倍。在进一步的具体实施方案中，本发明亦关于与未经本发明修饰的细胞比较，其过度表达量至少显示增加50倍的宿主细胞。在另一具体实施方案中，本发明提供与未经本发明揭示方式所修饰的细胞比较，其过度表达量至少显示增加约100倍的宿主细胞。图7以实例说明由本发明方法产生的宿主细胞可达到的表达量。将本发明方法应用于宿主细胞的修饰过程，例如，进一步增加抗-细胞凋亡基因的拷贝数，可进一步增加抗-细胞凋亡基因的表达量。将一或多种抗-细胞凋亡基因的多拷贝导入宿主细胞亦是可了解的。
在本发明意义的“宿主细胞”或“目标细胞”为仓鼠细胞，优选者为BHK21、BHK TK-、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1与CHO-DG44细胞或任何此类细胞株的衍生物/子代。尤其优选者为CHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-K1与BHK21，甚至更优选者为CHO-DG44与CHO-DUKX细胞。在进一步的具体实施方案中，本发明的宿主细胞亦指小鼠骨髓瘤细胞，优选者为NS0与Sp2/0细胞或任何此类细胞株的衍生物/子代。在本发明意义可使用的小鼠与仓鼠细胞的实例总结于表1中。然而，这些细胞，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、猴子与啮齿类细胞株的其它哺乳类细胞，或包括但不限于酵母菌、昆虫与植物细胞的真核细胞的衍生物/子代，亦可做为本发明的意义上的宿主细胞使用，特别是用于生产生物医药蛋白质。
表1：仓鼠与小鼠生产细胞株
细胞株 次序号码
NS0 ECACC No.85110503
Sp2/0-Ag14 ATCC CRL-1581
BHK21 ATCC-CCL-10
BHKTK- ECACC No.85011423
HaK ATCC CCL-15
2254-62.2(BHK-21衍生物) ATCC CRL-8544
CHO ECACC No.8505302
CHO-K1 ATCC CCL-61
CHO-DUKX(＝CHO duk-，CHO/dhfr-) ATCC CRL-9096
CHO-DUKX B1 ATCC CRL-9010
CHO-DG44 Urlaub et al.，Cell 33[2]，405-412，1983
CHO Pro-5 ATCC CRL-1781
V79 ATCC CCC-93
B14AF28-G3 ATCC CCL-14
CHL ECACC No.87111906
建立、适应后，宿主细胞最好能完全培养于无血清条件，且视情形是在无任何动物来源的蛋白质/肽的培养液中。市售培养液诸如Ham′sF12(Sigma，Deisenhofen，Germany、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco′s ModifiedEagle′s Medium(DMEM；Sigma)、Minimal Essential Medium(MEM；Sigma)、Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium(IMDM；Sigma)、CD-CHO(Invitrogen，Carlsbad，CA)、CHO-S-Invtirogen、无血清的CHO Medium(Sigma)与无蛋白的CHO Medium(Sigma)俱为适当营养溶液的范例。任何的这些培养液，必要时皆需补充一些化合物，例如激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白、表皮细胞生长因子、类胰岛素生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁、磷酸盐)、缓冲液(诸如HEPES)、核苷(诸如腺苷、胸苷)、谷氨酰胺、葡萄糖或其它相当的能量来源、抗生素、微量元素等。亦得包括任何本领域技术人员熟知的其它适当浓度的必要补充物。在本发明使用无血清的培养液优选，但补充适当量血清的培养液亦可做为培养宿主细胞之用。为培养与选取表达选择用的基因的遗传修饰细胞，我们在培养液中添加适当的选择药剂。
为改善宿主细胞存活力，最好是如上述的生产细胞的存活力，本发明亦涉及高水平表达的bcl-2超家族抗-细胞凋亡基因。因而，编码bcl-2超家族的基因适于生产根据本发明的宿主细胞。因此，利用导入编码bcl-2超家庭基因、选择用的可扩增的标记基因与至少一种目的基因的核酸序列的遗传修饰的宿主细胞，亦为本发明意义所涵盖。表2中列出抑制或延迟程序性的细胞死亡或细胞凋亡的属于bcl-2超家庭成员的实例。哺乳动物、线虫(C.elegans)或病毒来源的此家族的多数蛋白，具有与细胞凋亡抑制剂，BCL-2(BCL-2类似物区域BH1-BH4)相似的2-4个区域的延长的氨基酸序列。这些均为进行本发明的抗细胞凋亡基因/蛋白质的适当候选物。
本发明的进一步具体实施方案以细胞为优选，其存活是藉导入编码BCL-xL、BCL-2、BCL-w、BFL-1、A1、MCL-1、BOO、BRAG-1、NR-13、CDN-1、CDN-2、CDN-3、BHRF-1、LMW5-HL或CED-9的核酸序列而延长。在一更佳的具体实施方案中，该编码本发明的抗-细胞凋亡基因的核酸序列为脊椎动物的DNA分子。优选的脊椎动物为哺乳动物。更优选，本发明的核酸序列编码名为BCL-xL或BCL-2的多肽。以BCL-xL编码基因最佳。在更优选的实施方案中，编码BCL-Xl的核酸序列从仓鼠，优选黝仓鼠中分离。亦佳者为具有SEQ ID NO：1(与GenBank AccessionNumber Z23115一致)或SEQ ID NO：2(与GenBank Accession Number M13995一致)，SEQ IDNO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，或SEQ ID NO：11序列的核酸，其中SEQ ID NO：3最早从仓鼠分离，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ IDNO：9，和SEQ ID NO：11是SEQ ID NO：3的核酸序列的修饰变体。最佳者为SEQ ID NO：1。由其它脊椎动物编码的任何这些基因的同系物，亦适于进行本发明。而且，亦佳者为编码任何表2的抗-细胞凋亡基因的核苷酸序列，特别是具有表2所引的任何GenBank Accession Number的序列。抗-细胞凋亡作用基因的实例亦可参照美国专利6,303,331、5,834,309和6,646,008以及WO 95/006342，其并列入本文供参考。亦可参考Boise等人，Cell 74，597-608，1993。WO 95/006342以实例说明如何分离BCL-xL编码序列。
编码抗-细胞凋亡蛋白的核酸序列意欲包括任何不论在体外或将编码序列导入目标细胞后会转录与翻译成-细胞凋亡蛋白的核酸序列。该抗-细胞凋亡蛋白编码序列可为天然(野生型)基因和自然产生(经自发突变)的基因，或重组的遗传工程的突变体与变体、截短物与片段、功能性等效物、衍生物、同系物与自然产生或野生型蛋白的融合物；只要编码的多肽的生物功能活性，即抗细胞凋亡功能维持，且未实质改变即可。优选的编码多肽与相应的野生型抗-细胞凋亡蛋白质比较，至少具有50％，更优选为至少具有80％，益佳者为至少具有100％或更多的功能性生物活性。“野生型蛋白”意指完整、未切短、未修饰、自然产生的编码多肽的等位基因。
抗-细胞凋亡多肽的“功能性生物活性”可经由对表达该特定多肽的转染细胞的定量细胞凋亡分析来确定，其例诸如TUNEL分析、Annexin V分析、利用荧光显微镜的吖啶橙/溴化乙锭染色或碘化丙锭/吖啶橙染色、或流式细胞计数分析或其它分析。这些分析为本领域所熟知且其说明可参照例如Current Protocols in Cytometry，John Wiley&Sons，Inc.，更新版。
术语“功能性生物活性”或“功能性生物活性片段”指具有抗凋亡肽的功能性生物活性的多肽或片段。意思是与相应的野生型抗凋亡蛋白相比，功能性生物活性多肽或功能性生物活性片段具有至少50％，更优选至少80％，更优选至少100％或者更多功能性生物活性。
利用本领域所熟知的标准技术，例如定点突变或聚合酶链反应介导的突变，可制备该修饰的核酸序列。在本发明中，特佳的bcl-xL核酸序列为分离的SEQ ID NO：1(与GenBank Accession Number Z23115一致)，SEQ IDNO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11的多聚核苷酸。本发明还包括与那些序列以及任何其它BCL-xL编码序列功能上相当的核酸序列，包括那些核酸的重组改造的突变体和变体，截短的序列和片段，功能对等物，衍生物，同源物和融合物。。在一优选具体实施方案中，该编码BCL-xL的蛋白质为人类来源的；在一更佳的具体实施方案其是起源于仓鼠。
在本文中，编码仓鼠Bcl-xL同源基因的核酸第一次被鉴定并也由本发明提供。分离的仓鼠bcl-xl基因是一种核酸物质，具有SEQ ID NO：3，该基因从黝仓鼠中分离并从中克隆。将使用该序列或其任何功能片段，变体或突变体(简并性或非简并性)编码的抗凋亡蛋白，通过抑制或延缓凋亡来延长细胞生存的方法是本发明的一个优选的实施方案。然而，编码其它物种的BCL-xL的核酸序列亦为本发明的意义所涵盖。
BCL-xL蛋白质是bcl-x基因所编码。已知人bcl-xl基因产生两种不同的RNA分子，其一编码BCL-xL(长型)另一个编码BCL-xS(短型)。BCL-xS缺少BCL-xL的一段63个氨基酸。经显示BCL-xS有助于细胞凋亡。因而使用cDNA，而非基因组片段表达BCL-xL优选。在另一优选具体实施方案中，其涵盖改善的抗-细胞凋亡性质的BCL-xL突变体或BCL-2突变体，例如删除BH3与BH4保守区间的非保守区域，因此增加突变的蛋白质变体的蛋白质稳定性(Chang等人，1997；Figueroa等人，2001)。
本发明提供的另一优选实施方案中，修饰的仓鼠bcl-xL基因的变体，尤其是上述SEQ ID NO：3编码的仓鼠bcl-xL基因。这种修饰的变体包括但不限于具有以下序列的核酸分子：SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11或其任何功能性变体或突变体(简并性或非简并性)。
“功能突变体”包括但不限于具有与上述任何一种核酸序列至少95％，优选96％，更优选97％，更加优选98％和最优选99％的同源性的DNA分子。突变可由插入，替代和/或缺失原始核酸序列的一个或多个核苷酸造成。术语“功能突变体”也包括上述核酸分子的任何功能性生物活性片段，缺失或插入突变体，其与这些分子的任一种或者至少与这些分子的功能片段具有至少95％，优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的同源性。术语“功能突变体”还包括上述核酸分子的任何功能性生物活性片段，缺失或插入突变体，其中这些片段的生物活性部分显示与仓鼠bcl-xL基因的生物活性部分至少95％，优选至少96％，更优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的同源性。
“功能片段”也指DNA分子，其编码仓鼠bcl-xL基因的功能活性部分，尤其是具有SEQ ID NO：3的序列的核酸的片段。优选仓鼠bcl-xL基因的功能片段的实例是具有SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9或SEQ IDNO：11的序列的核酸分子。
“功能变体”包括在严格的条件下与具有上述任何序列的核酸杂交的核酸分子，例如具有SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：11的序列，并编码功能性生物活性的仓鼠bcl-xL基因的核酸。术语“变体”通常指多核苷酸的另一种形式，它具有一个或多个核苷酸取代，缺失或插入，而基本不改变编码的多肽的功能。
“简并突变体”通常指具有不同的核酸序列但编码具有相同氨基酸序列的多肽的DNA分子。意思是，任何编码特定多肽的核酸是其简并突变体，该多肽具有SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11的任一序列编码的氨基酸序列。
根据上文所述，本发明还提供了包含编码生物活性bcl-xL基因的核酸序列的DNA，其中的核酸选自：(a)具有SEQ ID NO：3的序列的核酸或其互补序列；(b)(a)中定义的核酸序列的功能片段，变体或突变体(简并或非简并性)；(c)与(a)中定义的核酸序列具有至少95％的同源性的核酸和；(d)与(a)，(b)或(c)中定义的任一核酸序列在严格条件下杂交的核酸。本发明还提供了包含编码生物活性bcl-xL基因的核酸序列的DNA，其中的核酸选自：(a)具有SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11的序列的核酸或其互补序列；(b)(a)中定义的核酸序列的功能片段，变体或突变体(简并或非简并性)；(c)与(a)中定义的核酸序列具有至少95％的同源性的核酸和；(d)与(a)，(b)或(c)中定义的任一核酸序列在严格条件下杂交的核酸。在更优选的实施方案中，本发明还涉及包含编码生物活性bcl-xL基因的核酸序列的DNA，所述核酸具有SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：11的序列。
上述那些DNA序列中的任一种编码的蛋白导致仓鼠BCl-xL蛋白的稳定形式增强或降低。本文所述在任何创造方法中使用一种或多种这些仓鼠BCl-xL突变体，通过抑制或延缓凋亡来延长细胞生存是本发明一个高度优选的实施方案。本发明因此还涉及一种多肽，所述多肽由上述编码功能性生物活性bcl-xL基因的核酸序列的任何一种编码。
表2：bcl-2超家族的抗-细胞凋亡基因
多聚核苷酸 GenBank的登录号   多聚核苷酸 GenBank的登录号
bcl-xL(人)bcl-xL(小鼠)bcl-xL(大鼠)bcl-xL(鸡)     Z23115L35049U34963Z23110   nr-13(鸡)     AF120211
bcl-2(人)bcl-2(小鼠)bcl-2(大鼠)bcl-2(鸡)bcl-2(仓鼠)     M13995M16506L14680Z11961AJ271720   bhfr-1(疱疹病毒)bhfr-1(E-B病毒)     AF120456A22899
bcl-w(人)bcl-w(小鼠)bcl-w(大鼠)     U59747U59746AF09291   1mw5-HL(非洲猪热病毒)     L09548
bfl-1(人)Al(小鼠)     U27467U23774   cdn-1(人)     AAQ95492(NAGENESEQ)
mcl-1(人)mcl-1(小鼠)mcl-1(大鼠)mcl-1(鸡)     AF147742U35623AF115380AF120210   cdn-2(人)     AAQ95493(NAGENESEQ)
boo(小鼠)     AF102501   cdn-3(人)     AAQ95494(NAGENESEQ)
brag-1(人)     S82185   ced-9(线虫)     L26545
本文所用的“核酸序列”意指寡核苷酸、核苷酸或多聚核苷酸或其片段或部分，且涵盖基因组来源或合成的DNA或RNA，其可为单链或双链并可代表有意义链与反义链。本发明的多聚核苷酸包括其中一个或多个密码子已经由其同义物所取代的核酸区域。另外包括具有编码序列的多聚核苷酸，其为编码序列的自然发生的等位基因变体，例如SEQ ID NO：1，SEQID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9或SEQID NO：11的编码序列变体。如本领域所知，等位基因变体为多聚核苷酸的替代型，其可能有实质上不改变编码的多肽的功能的一个或多个核苷酸的取代、删除或插入。多肽的功能通常由该编码多肽的功能性生物活性所决定。因而，实质上不改变编码的多肽的功能，意指与对应的野生型编码的多肽比较，该编码的多肽的功能性生物活性水平至少是50％，更优选为至少是80％，益佳者为至少是100％或更多。
“编码”的用语意指核酸中核苷酸的特定序列，诸如在染色体中的基因或mRNA的固有性质，其是做为合成在生物过程中的其它聚合物与巨分子的模版。所述聚合物或巨分子具有确定的核苷酸(亦即rRNA、tRNA、其它RNA分子)或氨基酸序列及所述基因或mRNA所带来的生物特性。因此，若一个基因生成的mRNA的转录与翻译生成细胞中或其它系统的蛋白，则该基因即编码该蛋白质。无论是其核苷酸序列与mRNA序列一致，且通常在序列表中提供的编码链，还是做为基因或cDNA翻译的模版的非编码链，皆可认为能编码该基因或cDNA的蛋白质或其它产物。因为遗传密码的简并性，编码蛋白质的核酸包括任何具有不同核苷酸序列，但是编码该蛋白质的相同氨基酸序列的核酸。编码蛋白质的核酸与核苷酸序列可包括内含子。
在本文中“cDNA”的用语意指由逆转录所产生的脱氧核糖核苷酸，而且通常是mRNA或基因生成的其它RNA的第二链所合成。若为双链，则cDNA分子具有编码或意义链或非编码或反义链。
通常如本文所用者，大写字母(例如BCL-xL)意指多肽(例如基因表达的产物)；而小写字母(例如bcl-xL)意指聚核苷酸(例如基因)。此外，在此专利说明书通篇中，除非有其它说明，单数型“一个”与“该”皆包括复数型。
“多肽”的用语与氨基酸残基序列或蛋白质交互使用，并意指任何长度的氨基酸聚合物。这些用语亦包括经由反应的翻译后修饰的蛋白质，这些反应包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化或蛋白质加工。可在多肽结构中进行修饰与改变，例如与其它蛋白质融合、氨基酸序列取代、删除或插入，同时维持分子的生物性功能活性。例如，可在多肽或其对应的核酸编码序列，做某些氨基酸序列的取代，而且可得具类似性质的蛋白质。如上述，优选的蛋白质为由SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQID NO：7，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11，或其任何功能片段，变体或突变体(简并和非简并性)的核酸序列编码的BCL-xL蛋白质序列。藉由对其对应的核酸序列进行定点突变或聚合酶链反应介导的突变而生成，可制备利用氨基酸的亲水/疏水(hydropathic)指数(Kyte等人，J.Mol.Biol.157：105-132，1982)提供功能性相当的BCL-xL多肽的氨基酸取代。
如上述，本发明涉及有关遗传修饰的宿主细胞，以及产生此种宿主细胞的方法。在一个具体实施方案中，该宿主细胞包括异源引入的编码抗-细胞凋亡基因、选择用的可扩增的标记基因与视情形的至少一种目的基因的聚核苷酸序列。“选择用的可扩增的标记基因”具有选择用标记基因的性质，但当细胞培养于适当条件时，另外允许扩增(亦即，生成该基因的另外拷贝，该基因可以以染色体内(intra-chromosomal)或染色体外(extra-chromosomal)的型式存活)基因本身与邻近该选择用的可扩增的基因的基因。本发明特别提供宿主细胞，不仅包括一个拷贝数的导入的抗-细胞凋亡基因，亦包括多拷贝数的该抗-细胞凋亡基因，例如超过5，10，20，50或100个拷贝数的导入的抗-细胞凋亡基因。
这种宿主细胞，例如可经由包括下列的方法取得：(i)将编码抗-细胞凋亡基因、选择用的可扩增的标记基因与视情形的至少一种目的基因的核酸序列导入哺乳动物宿主细胞群，其中该基因是可操作地连接于至少一种允许该基因表达的凋控序列，(ii)将该细胞群培养于至少可表达该选择用的可扩增的标记基因与该抗-细胞凋亡基因，且是有利于取得至少该抗-细胞凋亡基因的多拷贝数的条件，以及(iii)由该细胞群选取至少掺入多拷贝数的抗-细胞凋亡基因的细胞。如上所述，优选至少将抗凋亡和选择性可扩增标记基因放置在空间邻近的位置上使得该抗凋亡基因的扩增更有效。因此，本文方法优选的实施方案中，至少抗凋亡基因和选择性可扩增标记基因是相同的DNA分子编码的，例如两个基因均位于相同的表达载体上，并因此被共同引入宿主细胞。在该方法更优选的实施方案中，例如通过使用共同的启动子将该抗凋亡基因和选择性扩增标记基因的表达可操作地相互连接，使得所述基因共表达。
以此方式生成的宿主细胞包括，例如至少5个拷贝数的掺入的异源性抗-细胞凋亡基因。在进一步的具体实施方案中，该宿主细胞包括，例如至少10个拷贝数的掺入的异源性抗-细胞凋亡基因。在另一个具体实施方案中，可得包括至少50个导入的拷贝数的异源性抗-细胞凋亡基因的宿主细胞。在进一步的具体实施方案中，该宿主细胞包括，例如至少100个拷贝数的掺入的异源性抗-细胞凋亡基因。适当的抗-细胞凋亡基因是那些以上所述的凋亡基因，特别是那些表2所列者，例如编码本文所述BCL-xL多肽的任何基因。
通常本发明的宿主细胞优选者是包括，其拷贝数允许其表达量足够高至能经由抑制或延迟程序性的细胞死亡，而增强细胞群存活的抗-细胞凋亡基因。更优选为，宿主细胞不仅包括允许改善细胞存活的拷贝数的抗-细胞凋亡基因，亦显示同样由遗传修饰的宿主细胞编码的高量表达的目的基因。对熟谙本领域者而言，发现具有减少细胞凋亡率的最高效果，而不剧烈造成细胞生长率减少或遗传不稳定性，并且对目的蛋白质的生产率亦无负面影响的抗-细胞凋亡基因的最高可容许表达量的方法，是已知的。其包括但不限于，例如产生生长曲线、利用测定非渗透性染料的排除而经显微镜或流式细胞计数法检测细胞存活力、藉TUNEL或Annexin V分析定量细胞凋亡、由ELISA决定产品滴定度并经数次传代由Southern杂交或斑点印迹杂交或定量PCR评估转染基因的遗传稳定性。
在本发明中，若抗-细胞凋亡基因，例如bcl-xL基因的表达量与亲代、非扩增细胞比较，达到编码多肽的胞内存活的有效浓度，例如即达到充分增加的细胞存活。充分增加的细胞存活的提供是例如，当该bcl-xL基因或任何其它抗-细胞凋亡基因的表达量与亲代细胞群比较，致使细胞群于培养6、7、8或9天后至少增加约20％的存活。更优选为与亲代细胞群比较，于培养6、7、8或9天后细胞存活至少增加约30％，益佳者为至少增加约50％。培养期9天后，当至少约50％的培养细胞存活时，亦达到了足够的细胞存活。若抗-细胞凋亡基因编码BCL-xL，于培养9天后，当至少约60％的细胞存活时，亦达到了足够的细胞存活。在一个具体实施方案中，当培养9天后至少约60％的细胞群存活时，其亦达到了充分增加的细胞存活。在进一步的具体实施方案中，当培养7天后至少约75％的细胞群存活；甚至，若培养6天后至少约85％的细胞存活时，其即达到了充分增加的细胞存活。
“选择用可扩增的标记基因”通常是编码真核细胞在那些条件下生长所需的酶。例如，该选择用可扩增的标记基因可编码DHFR，该基因是在转染的宿主细胞生长于选择性药剂，氨甲喋呤(MTX)条件下所扩增。表3的非限制性实例选择用基因亦为可扩增的标记基因，其可用以实现本发明。为回顾表3所列的选择用可扩增的标记基因，请参照Kaufman，Methods inEnzymology，185：537-566(1990)，其纳入本文供参考。据此，根据本文所述任何方法的遗传修饰宿主细胞皆为本发明所涵盖，其中该选择用可扩增的标记基因编码具有二氢叶酸还原酶(DHFR)、谷氨酰胺合成酶、CAD、腺苷脱氨酶、腺苷酸脱氨酶、UMP合成酶、IMP 5′-脱氢酶、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、HGPRT酶、胸苷激酶、胸苷酸合成酶、P糖蛋白170、核糖核苷酸还原酶、天冬酰胺合成酶、精氨基琥珀酸合成酶、鸟氨酸脱羧酶、HMG CoA还原酶、乙酰葡糖胺转移酶、苏氨酸-tRNA合成酶或Na+K+-ATP酶的功能的多肽。
优选的选择用可扩增的标记基因为编码嘌呤合成所必须的二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因。缺少DHFR基因的细胞在无嘌呤的培养基无法生长。因而，DHFR具有选取并扩增在缺少嘌呤的培养基中生长的基因的显性选择用标记的用途。与DHFR基因联合所用的药剂为氨甲喋呤(MTX)。因而，本发明包括生成哺乳动物宿主细胞的方法，包括(i)将抗-细胞凋亡基因、编码DHFR的基因导入哺乳动物细胞群，与(ii)在含氨甲喋呤条件下扩增该抗-细胞凋亡基因。在本发明更优选的实施方案中，该抗凋亡基因和DHFR编码基因引入宿主细胞中时位于相同的DNA分子上。本发明更优选的实施方案中，两个基因可操作地相互连接，并通过仅一个共同的启动子转录。据此，将转染基因培养于不含血清、无次黄嘌呤/胸苷的培养基并逐渐增加MTX的量，由培养基中无MTX开始，至MTX浓度介于2毫微摩尔浓度至2000毫微摩尔浓度，更典型地介于2毫微摩尔浓度至1000毫微摩尔浓度。逐渐增加MTX浓度，其倍数因子为2-10。在一优选方法，该抗-细胞凋亡基因另外编码表2所列的任何一个基因。在一更佳方法中，该抗-细胞凋亡基因编码BCL-2或BCL-xL；而且在一益佳方法中，其编码BCL-xL。
表3：选择用可扩增标记基因
选择用可扩增标记基因 保藏号 选择用药剂
二氢叶酸还原酶 M19869(仓鼠)E00236(小鼠) 氨甲喋呤(MTX)
金属硫蛋白 D10551(仓鼠)M13003(人)M11794(大鼠) 镉
CAD(氨甲酰-磷酸合成酶∶天冬酰胺转氨甲酰酶∶二氢乳清酸酶) M23652(仓鼠)D78586(人) N-磷酸乙酰-L-天冬氨酸
腺苷脱氨酶 K02567(人)M10319(小鼠) Xyl-A-或腺苷，2′-脱氧助间型霉素
AMP(腺苷酸)脱氨酶 D12775(人)J02811(大鼠) 腺嘌呤、重氮丝氨酸、助间型霉素
UMP合成酶 J03626(人) 6-氮尿苷，吡唑呋喃
IMP5′脱氢酶 J04209(仓鼠)J04208(人)M33934(小鼠) 霉酚酸
黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 X00221(大肠杆菌) 带有限的黄嘌呤的霉酚酸
突变HGPRTase或突变胸苷激酶 J00060(仓鼠)M13542，K02581(人)J00423，M68489(小鼠)M63983(大鼠)M36160(疱疹病毒) 次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT)
胸苷酸合成酶 D00596(人)M13019(小鼠)L12138(大鼠) 5-氟去氧尿苷
P-糖蛋白170(MDR1) AF016535(人)J03398(小鼠) 多重药物(multiple drug)，例如亚德里亚霉素(adriamycin)、长春新碱、秋水仙素
核糖核苷酸还原酶 M124223，K02927(小鼠) Aphidicolin
谷氨酰胺合成酶 AF150961(仓鼠)U09114，M60803(小鼠)M29579(大鼠) 甲硫氨酸砜亚胺(MSX)
天冬酰胺合成酶 M27838(仓鼠)M27396(人)U38940(小鼠)U07202(大鼠) β-天冬氨酰氧肟酸酯，合欢氨酸，5′-氮胞苷
精氨基琥珀酸合成酶 X01630(人)M31690(小鼠)M26198(牛) 刀豆氨酸
鸟氨酸脱羧酶 M34158(人)J03733(小鼠)M16982(大鼠) α-二氟甲基鸟氨酸
HMG-CoA还原酶 L00183，M12705(仓鼠)M11058(人) Compactin
N-乙酰葡萄糖胺酰转移酶 M55621(人) 突尼卡霉素(tunicamycin)
苏氨酸t-RNA合成酶 M63180(人) 疏螺体素(Borrelidin)
Na+K+-ATP酶 J05096(人)M14511(大鼠) 鸟本苷(Ouabain)
利用DHFR编码基因做为选择用可扩增的标记的适当宿主细胞为哺乳动物细胞，优选者为小鼠骨髓瘤或仓鼠细胞。更优选为缺少DHFR活性的CHO-DUKX(ATCC CRL-9096)及CHO-DG44(Urlaub等人，Cell 33[2]，405-412，1983)细胞。为延展DHFR扩增方法至其它细胞类型，可能使用编码对氨甲喋呤敏感性降低的蛋白质的突变体DHFR基因，联合含正常数目的内源性野生型DHFR基因的宿主细胞(Simonson等人，1983；Wigler等人，1980；Haber等人，1982)。
本发明的另一个具体实施方案亦提供经导入的编码抗-细胞凋亡基因、DHFR基因与至少一种目的基因的核酸序列而遗传修饰的宿主细胞。在进一步的具体实施方案中，该宿主细胞的抗-细胞凋亡基因，编码任何表2所列的抗-细胞凋亡基因，优选者是bcl-xL基因，更优选是人或仓鼠源的bcl-xL基因，更优选具有SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11，或其任何功能片段，变体或突变体(简并和非简并性)的序列的bcl-xL基因。
经由导入编码bcl-xL、DHFR基因与至少一种目的基因的核酸序列而遗传修饰的宿主细胞是本发明最优选的，因而，亦是本发明的主题。然而，通常宿主细胞是在本发明意义之内，至少包括异源的抗-细胞凋亡基因、选择用可扩增标记基因与一种目的基因，其中该抗-细胞凋亡基因是表2的任何基因，或本文所述的其它任何基因，而该选择用可扩增标记基因是表3所列的任何基因。
“选择用药剂”的用语意指干扰缺少特定选择用的基因的宿主细胞生长或存活的物质。例如，为选取转染细胞的例如APH(氨基糖苷磷酸转移酶)的抗生素抗性基因的存在，使用抗生素，遗传霉素(G418)。选择用药剂亦可包括“扩增药剂”，若该选择用标记基因依赖其可扩增的选择用标记，其定义为供本文的目的做为扩增该可扩增基因的拷贝数的药剂。例如，MTX为选择用药剂对DHFR基因的扩增有用途。扩增选择用药剂的实例为，但不限于表3所述药剂。
本发明适于产生生产生物医药多肽/蛋白质的宿主细胞。本发明特别适于显示增强的细胞存活力与生产力的细胞来表达高产率的大量不同的目的基因。“目的基因”、“选取序列”或“产物基因”在本文具有相同意义，并意指任何长度的编码目的产物的多聚核苷酸序列，亦可指称为“所需产物”的用语。选取序列可为全长度或切短的基因、融合或标记的基因，而且可为cDNA、基因组NDA或DNA片段，又以cDNA优选。其可为天然序列，亦即自然产生型式或可为突变型，或者还可以是视需要加以修饰者。这些修饰包括将密码子最佳化，可使密码子在选取的细胞中使用最优化、人源化(humanization)或贴上标签。选取的序列可编码分泌的、细胞质的、细胞核、膜结合或细胞表面的多肽。“所需产物”包括蛋白质、多肽、其片段、肽、反义RNA等的全部能在选取的宿主细胞表达者。所需的蛋白质可为例如抗体、酶、细胞因子、淋巴因子、粘附分子、受体、衍生物或其片段，及任何其它做为激动剂或拮抗剂的多肽，和/或具有治疗或诊断用途的多肽。所需蛋白质多肽的实例亦可见下文。
就定义而言，任何导入宿主细胞的序列或基因，相对于宿主细胞皆称为“异源序列”或“异源基因”，即使该导入序列或基因与宿主的内生序列或基因一致。例如，导入仓鼠宿主细胞的仓鼠bcl-xL基因在定义上即是异源基因。
利用“表达载体”，可将例如编码BCL-xL的核酸序列的异源基因序列导入目标细胞，以真核细胞优选，又以哺乳动物表达载体更佳。建构载体的方法是熟谙本领域者所熟知，且大不同的发表文章中皆有说明。特别的建构适当载体的技术，包括诸如启动子、增强子、终止与聚腺苷酸化信号、选择标记、复制起点与剪切信号等功能成分的说明，在Sambrook等人，1989，及其所引的参考资料皆有相当详细的回顾。载体可能包括，但不限于质粒载体、噬菌粒、粘粒、人工/微小-染色体，或诸如杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、噬菌体的病毒载体。真核表达载体典型地亦包含促成载体在细菌增殖的原核序列，诸如复制起点与在细菌中选取用的抗生素基因。多种真核表达载体是本领域所熟知的，该载体包含克隆位点，其内可操作地连接多聚核苷酸，某些表达载体可购自诸如Stratagene，La Jolla，CA；Invitrogen，Carlsbad，CA；Promega，Madison，WI或BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA。
在一优选具体实施方案中，该表达载体至少包括编码肽/多肽的核苷酸序列转录与翻译所需的调控序列的核酸序列。在一更特定具体实施方案中，该表达载体至少包括允许编码抗-细胞凋亡基因、选择用可扩增的标记基因与目的基因的核苷酸序列转录与翻译(表达)的调控序列。
“调控序列”包括启动子、增强子、终止与聚腺苷酸化信号及其它表达控制元件。可于不同细胞型态表达功能的不论诱导性或构造性调控序列，皆为本领域所知。转录调控单位通常包括欲表达的基因序列的上游启动子、转录起始与终止位置与聚腺苷化信号序列。转录起始位点的用语，意指构建体中的核酸，该核酸相当于掺入初级转录本亦即mRNA前体的第一个核酸；转录起始位点可与启动子序列重叠。转录终止位点的用语意指通常出现在目的基因的3′端或欲转录序列的延伸的核苷酸序列，其会造成RNA聚合酶终止转录。聚腺苷化信号或聚-A添加信号提供在真核RNA 3′端的特定位置的切断与至3′端约100-200腺嘌呤核苷酸(聚A尾)序列核心的转录后添加的信号。聚腺苷化信号序列包括位于切断位置上游约10-30核苷酸的AATAAA序列，加上下游序列。已知有不同的聚腺苷酸元件，例如SV40晚期与早期polyA或BGH polyA。转录调控元件包括每个欲表达的个别多肽的转录起始位置(AUG)、终止密码子与聚A信号。在某些构建体中还包括内部的核糖体进入位置(IRES)。IRES定义如下。为将表达最佳化，不论在转录或翻译层面，对欲表达的核酸序列可能需去除、添加或改变5′和/或3′未翻译部分，以消减潜在的额外的不适当替代翻译起始密码子或其它可能干扰或减少表达的序列。另外的共有核糖体结合位置可即插入开始密码子的5′端以增强表达。为产生分泌性多肽，该选取序列通常会包括编码前导肽的信号序列，所述肽可指引新合成多肽到达并穿过多肽的分泌性路径的ER膜。前导肽通常，但非无一例外地位于分泌蛋白质的氨基端，且在蛋白质通过ER膜后即会被信号肽酶切断。分泌用的序列通常，但非必需包括其自己的信号序列。在无原生信号序列时，可将异源信号序列融合于选取的序列。无数的信号序列是本领域已知，且可得自诸如GenBank与EMBL的序列资料库。
表达载体可包含表达抗-细胞凋亡基因、选择用的可扩增的标记基因与视情形的目的基因的单一转录单位，例如利用IRES元件或某些基因的插入序列指引，以在操作上将全部元件连接于相同启动子或启动子/增强子。替代性地，表达载体可具有一或多种转录单位，而前述元件可由分开的转录单位表达，而每个转录单位含相同或不同调控序列。在另一替代方式，超过一种表达载体包括一或多种转录单位，每个转录单元皆可用以表达一个或多个前述元件，可经共转染使用并导入宿主细胞，或可依次序的不同回合或任何次序的导入转录单位使用并导入宿主细胞。只要转录单位能充分表达，可选用每个载体的任何组合。进一步的经认定为必要的元件，可能位于表达载体上，所述元件诸如另外的抗-细胞凋亡基因、目的基因或选择用标记。本发明的先决条件为，若非在一或两个载体的分开的转录单位即是在单一载体的同一转录单位，将抗-细胞凋亡基因与选择用可扩增的标记基因共导入，以允许抗-细胞凋亡基因与选择用可扩增的标记基因共扩增。在进一步的具体实施方案中，该抗-细胞凋亡基因、选择用可扩增的标记基因还有目的基因是同时导入，若非在一或两个载体的分开的转录单位即是在单一载体之一或多个转录单位，以允许抗-细胞凋亡基因与选择用可扩增的标记基因与目的基因的共扩增。优选至少将抗凋亡基因和选择性可扩增标记基因置于空间上紧邻的位置，使得该抗凋亡基因的扩增更有效。因此优选至少抗凋亡基因和选择性可扩增标记基因是相同的DNA分子编码的，例如两个基因均位于相同的表达载体上，并因此被共同引入宿主细胞。更优选例如通过使用共同的启动子将该抗凋亡基因和选择性扩增标记基因可操作地相互连接，使得所述基因共表达和扩增。
“启动子”意指控制其可操作地连接的基因或序列转录的聚核苷酸序列。启动子包括RNA聚合酶结合与转录起始的信号。所用启动子会在表达涵盖所选序列的宿主细胞的细胞型态表达功能。不同来源的包括构成性、诱导性与阻遏性启动子的大量启动子是本领域所熟知(并在诸如GenBank的资料库中已经辨识)，而且可作为克隆的多聚核苷酸获得或可从克隆的多聚核苷酸中获得(例如来自诸如ATCC以及其它市售或个别来源的贮存库)。就诱导性启动子而言，启动子是对应信号而增加或减少活性。例如，含四环素操纵子序列(tetO)的四环素(tet)启动子可利用四环素-调控转化蛋白(tTA)来诱导。在有tet时，tTA与tetO的结合受抑制。其它诱导性启动子包括jun、fox、金属硫蛋白与热休克启动子，请参照例如Sambrook等人，1989与Gossen等人，1994。经辨识为高表达的强启动子的真核启动子为WO97/15664描述的Ubiquitin S27a基因的仓鼠启动子及其功能片段，SV40早期启动子、腺病毒的主要晚期启动子、小鼠金属硫蛋白-I启动子、Rous肉瘤病毒长末端重复序列与人类巨细胞病毒即早期启动子(CMV)。其它异源哺乳动物启动子包括，例如肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休克启动子。前述启动子是本领域所熟知者。任何上述的启动子都高度适合控制和启动本文所述的所有创造性宿主细胞中的至少抗凋亡基因的表达。例如，引入哺乳动物细胞的抗凋亡基因和选择性可扩增标记基因的适宜表达载体包含一个抗凋亡基因，一个选择性可扩增标记基因，和WO97/15664描述的UbiquitinS27a基因的仓鼠启动子或其功能片段。优选至少该抗凋亡基因在所述Ubiquitin S27a基因的仓鼠启动子的控制之下。本文所用“增强子”意指作用于启动子以增强与其操作连接的基因或编码序列的转录的多聚核苷酸序列。不像启动子，增强子相对不依赖于方向与位置，且发现是在转录单位的5′或3′，位于内含子内以及就在编码序列内。因而，尽管实例上增强子得与启动子在物理与功能上重叠，然而，增强子可放在转录起始位置的上游或下游或与启动子有相当距离。大量的不同来源的启动子是本领域所熟知的(并在诸如GenBank的资料库中已辨识，例如SV40增强子、CMV增强子、多瘤病毒增强子、腺病毒增强子)，而且可作为克隆的多聚核苷酸序列获得或从克隆的聚核苷酸中获得(例如来自诸如ATCC以及其它市售或个别来源的贮存库)。有些包括启动子的多聚核苷酸(诸如一般用的CMV启动子)亦包括增强子。例如上述所有的强启动子亦包括强的增强子。
“转录单位”是定义构建体内的含一或多个待转录基因的区域，其中，该基因内含的片段操作上彼此连接，并由单一启动子转录；其结果，使不同的基因至少在转录上相连接。每个转录单位可转录并表达超过一个蛋白质或产物。每个转录单位将包含该单位所含的任何选取序列转录与翻译所需的调控单位。
“可操作地连接”意指其所处位置允许其以目的方式表达功能的两个或更多的核酸序列或序列元件。例如，若其作用为顺式控制或调节连接序列的转录，启动子和/或增强子即可操作地连接于编码序列。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，但亦不尽然；然而，在需要连接两个蛋白质编码区域，或为分泌性前导序列情形时，将为连续且在读框中。然而，尽管操作连接的启动子通常位于编码序列上游，却未必与其连续。增强子只要能增加编码序列的转录，不需要是连续者。为此，其可位于编码序列的上游或下游，甚至是有一段距离。聚腺苷酸化位置若位于编码序列3′端，且能使转录继续由编码序列至聚腺苷酸化信号时，其即操作上与编码序列连接。经本领域已知的重组方法即可完成连接，例如使用PCR方法、接合于适当的限制位置或经由粘接过程。若无适当的限制位置，亦得使用根据传统方式的合成寡核苷酸连接子或衔接子来进行。
本文所用“表达”的用语意指宿主细胞内的异源核酸序列的转录和/或翻译。宿主细胞中所需产物的表达量，得根据细胞中对应的mRNA的量或选取序列编码所需多肽的量来决定。例如，由选取序列转录的mRNA得经Northern杂交、核糖核酸酶RNA保护、与细胞RNA的原位杂合或经PCR定量(参照Sambrook等人，1989，Ausubel等人，1987更新版)。可利用多种方法定量选取序列编码的蛋白，例如藉ELISA、藉Western印迹、藉放射免疫分析、藉免疫沉淀、藉分析蛋白的生物活性或藉蛋白的免疫染色并随后FACS分析(参照Sambrook等人，1989；Ausubel等人，1987更新版)。
本文所用“增强表达”、“过度表达”或“高量表达”的用语意指持续与充分高量的异源选取序列的表达，在本发明中以导入宿主细胞的抗-细胞凋亡基因，例如bcl-xL或bcl-2和/或目的基因优选。增强表达可利用多种方式达成。在本发明中，诸如bcl-xL的抗-细胞凋亡基因，或任何其它表2所列基因加上选择用可扩增的标记基因的表达，提供更有效的选取与辨识高量表达异源基因的宿主细胞。选择用可扩增的标记基因不仅允许我们选取稳定的转染细胞株，也允许目的异源基因的基因扩增。该核酸序列的另外的拷贝得整合入细胞的基因组或额外的人工染色体/微小染色体，或以附加体形式被放入。此方法得结合荧光激活细胞分选(FACS)-使用例如荧光蛋白质(例如GFP)或细胞表面标示物等另外的选择标记，以支持选取共扩增抗-细胞凋亡基因的重组宿主细胞。可达到增强表达(不论就其本身或组合上述可能的情形时)的其它方法包括但不限于，使用(人工)转录因子或以天然或合成药剂处理细胞，以向上调控内生或异源基因表达、改善编码BCL-xL的mRNA或蛋白质本身的稳定性(例如删除与蛋白质生物功能无关的蛋白酶易感性区域)、增加mRNA翻译或使用附加体质粒(根据做为复制起点的病毒序列，诸如SV40、多瘤病毒、腺病毒、EBV或BPV)来增加基因量、扩增启动序列(Hemann等人，1994)或根据DNA连环的体内扩增系统(Monaco等人，1996)。熟谙本领域者以本领域的方法，可辨识与定量已增加的拷贝数，例如，扩增的异源抗-细胞凋亡基因的拷贝数，所利用的方法例如Southern印迹分析或定量PCR。如何选取最适控制并进行此分析，是熟谙本领域者的知识范围。这种方法的实例之一是本文所述的实例。
藉上述方法可依此产生宿主细胞，故其包括至少多拷贝数的导入的抗-细胞凋亡基因，例如至少5、10、20、50或100拷贝数的导入的抗-细胞凋亡基因。
“内部核糖体进入位置”或“IRES”说明功能上促进独立于IRES的5′的基因翻译起始的序列，并允许动物细胞中的两个顺反子(开放读框)翻译自单一转录本。IRES提供独立的核糖体进入位置以供正在其下游的开放读框的翻译。不像细菌mRNA的多顺反子一样，即编码由该mRNA依序翻译的多种不同多肽，动物的多数mRNA为单顺反子，并仅编码一个蛋白质的合成。在真核细胞的多顺反子转录本，翻译会由最5′端的翻译起始位置起始，于第一个停止密码子终止，且该翻译本会由核糖体释出，造成仅mRNA的第一个编码多肽的翻译。在真核细胞，具IRES可操作地连接于第二个或后续的开放读框的多顺反子的转录本，其允许下游的开放读框的依序翻译，以产生由该相同转录本编码的两种或多种多肽。该IRES可为不同长度且得自不同来源，例如脑心肌炎病毒(EMCV)或细小核糖核酸病毒。先前已有人说明不同的IRES序列及其在载体建构中的用途(Pelletier等人，1988；Jang等人，1989；Davies等人，1992；Adam等人，1991；Morgan等人，1992；Sugimoto等人，1994；Ramesh等人，1996；Mosser等人，1997)。同样可操作地(isoperatively)连接于IRES 3′端的下游编码序列，不论以任何距离，都不会负面影响下游基因的表达。藉改变距离并测量做为距离函数的表达情形，可很方便决定IRES与下游基因开始处之间的最佳或许可的距离。
本文所用“内含子”的用语意指通常出现在很多真核基因中的不同长度的非编码核酸序列，其是经由必须依赖插入序列两端的高度保存或靠近的序列的剪切方法，由新转录的mRNA前体去除。通常，剪切过程需要内含子的5′端与3′端正确切除，而且生成的mRNA的端正确接合，使得产生成熟的具蛋白质合成的适当读框的mRNA。很多剪切提供者与剪切接受者的位置，亦即在外显子-内含子与内含子-外显子边界紧密围绕的序列的特征已被确定，对此可参见Ohshima等人，1987的综述。
得利用任何本领域熟谙的技术进行真核宿主细胞经聚核苷酸或表达载体的“转染”，以生成遗传修饰细胞或转基因细胞，其说明请见Sambrook等人，1989或Ausubel等人，1987(更新版)。转染方法包括，但不限于脂粒-介导的转染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、聚阳离子(诸如DEAE-葡聚糖)-介导的转染、原生质融合、病毒感染与微注射。该转染以稳定的转染优选。这样的转染方法是有利的，其能在特定的宿主细胞株与类型中，提供最佳的转染频率与异源基因的表达。适当方法得由例行过程确定。对于稳定的转染子而言，构建体或者整合入宿主细胞基因组或人工染色体/微小染色体，或者以附加体形式存在，以便于其在宿主细胞内稳定地维持。
“选择用标记基因”是仅允许带该基因的细胞在相应的选取药剂下，受具体的顺或反向选取的基因。藉由说明，抗生素抗性基因可做为正的选择用标记基因，其允许以相应的抗生素条件，做为正向选择经该基因转化的宿主细胞的标记；至于，非转化宿主细胞在选择的培养条件则无法生长或存活。选择用标记可为正、负或双功能的。正向选择用标记，藉赋予药物抗性或补偿宿主细胞的代谢或合成缺陷而允许选取带标记的基因。相形之下，负向选取标记允许带标记细胞受选择性消减。例如，利用HSV-tk基因做为标记，可使细胞对诸如无环鸟苷与丙氧鸟苷(gancyclovir)的药剂敏感。只要其编码产物维持选择用性质，本文所用的选择用标记基因，可包括扩增的选择用基因，包括重组的遗传工程处理的突变体与变体、片段、功能性等效物、衍生物、同系物与原生的选择用标记基因的融合物。有用的衍生物，通常在与选择用性质相关的选择用标记的区域或功能部位具有实质的序列相似性(在氨基酸水平)。目前已有多种包括双功能(亦即正/负)标记的标记基因的说明，(参照例如WO 92/08796与WO 94/28143)其列入本文供参考。例如，通常用于真核细胞的选择用基因包括，编码氨基糖苷磷酸转移酶基因(APH)，潮霉素磷酸转移酶(HYG)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶、天冬酰胺合成酶的基因，与编码新霉素(G418)、嘌呤霉素、组胺醇D、博菜霉素与腐草霉素的抗性基因。
选择亦可利用例如细胞表面标示物、细菌β-半乳糖苷酶或荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(GFP)及其来自水母(Aequorea victoria)与另一种水母(Renilla reniformis)或其它物种的变体、红色荧光蛋白、荧光蛋白及其来自Discosoma或其它物种的变体)藉荧光激活细胞分选仪(FACS)选取细胞。
根据本文的教诲，本发明亦提供在宿主细胞表达抗-细胞凋亡基因、选择用的可扩增的标记基因与至少一种目的基因的方法。该方法包括下列步骤：(i)将编码抗-细胞凋亡基因、选择用的可扩增的标记基因与至少一种目的基因的核酸序列导入宿主细胞群，优选者为仓鼠宿主细胞群，其中该基因是可操作地连接于至少一种允许该基因表达的调控序列，(ii)将该细胞群培养于可表达该基因的条件。对熟谙本领域者而言，如何将一或多种聚核苷酸导入宿主细胞的方法、教诲是如上述所例示者。甚至，本发明亦给予实例，说明一或多种基因如何与至少一种调控序列连接，以表达该基因。此外，还描述了优选将至少该抗凋亡基因和选择性可扩增标记基因置于空间上紧邻的位置上使得该抗凋亡基因的扩增更为有效。适于表达该基因的宿主细胞是本发明所提及者。抗-细胞凋亡基因的适当中选物列于表2。优选者是编码BCL-xL或BCL-2的任何序列，更优选是编码BCL-xL的任何序列，更优选人或仓鼠源的编码的任何BCL-xL序列。在该方法的进一步更佳具体实施方案中，共表达的宿主细胞包括任何编码表3所列的任何一种选择用可扩增的标记的序列。益佳的方法为，其中该宿主细胞包括编码异源BCL-xL的序列且包括编码表3所列的任何一种选择用可扩增的标记的序列。最佳的方法为，其中该宿主细胞包括编码异源BCL-xL与DHFR的序列，尤其是当BCL-xL编码序列是人或仓鼠源的时候。
本发明提供的方法，允许熟谙本领域者产生归因于延迟或抑制程序性的细胞死亡，而显示增强的细胞存活的特别是为生产目的的新宿主细胞。目前已发现将细胞长期培养于悬浮液，尤其是无血清培养液的剧烈增加细胞存活力与产量的有利策略。根据本发明的细胞非常适于生产多种所需的多肽。本发明所述的遗传修饰宿主细胞，不仅编码负责增强细胞存活的基因，例如抗-凋亡基因和可扩增的标记基因，而且还视情形编码所需肽的任何目的基因。据此，本发明亦提供熟谙本领域者在宿主细胞生产目的蛋白质的方法，包括i)将本发明的任何宿主细胞在有利于表达抗-细胞凋亡基因与目的基因的条件下培养，与ii)由细胞和/或细胞培养上清液分离目的蛋白。本发明亦提供以该细胞生产由目的基因所编码的至少一种所需蛋白的用途。
所需蛋白质是那些上述者。尤其是，所需蛋白质/多肽是例如，但不限于胰岛素、类胰岛素生长因子、hGH、tPA；诸如白细胞介素(IL)的细胞因子，例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18，干扰素(IFN)α、IFNβ、IFNγ、IFNω或IFNτ，肿瘤坏死因子(IFN)(诸如)IFNα与IFNβ、IFNγ、TRAIL、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1与VEGF。亦包括促红细胞生成素或任何其它激素生长因子的生产。根据本发明的方法，可很有利地用来生产抗体及其片段。这种片段包括，例如Fab片段(抗原结合片段＝Fab)。Fab片段是由邻近恒定区聚在一起的两种链的可变区组成。这些可利用蛋白酶例如，以木瓜酵素由传统抗体消化形成；但是类似的Fab片段亦可同时经由遗传工程生产。进一步的抗体片段包括F(ab′)2片段，可利用胃蛋白酶的蛋白质剪切制备。
利用遗传工程方法可能生产仅由重键(VH)与轻链(VL)可变区组成的缩短的抗体片段。其命名为Fv片段(可变区片段＝可变区部分的片段)。因为这些Fv片段缺少经由恒定链的半胱氨酸的两个链的共架结合，Fv片段通常已经过稳定化。利用短的肽片段连接重链与轻链的可变区是有利的，例如10-30个氨基酸，以15个氨基酸优选。以此方式取得由肽连接子连接的包括VH与VL的单一肽链。这种抗体蛋白质命名为单链-Fv(scFv)。由现有技术所知的此类Fv-抗体蛋白的实例说明详见Huston等人，(1988，PNAS 16：5879-5883)。
近年来，已发展出制备scFv做为多聚衍生物的不同策略。此是欲造成特别是具改善的药物动力学与生物分布性质以及增强的结合亲合性的重组抗体。为实现scFv的多聚化，故将scFv制成具有多聚化功能区的融合蛋白。该多聚化功能区可为例如IgG的CH3区域或诸如亮氨酸-拉链功能部位的卷绕的卷绕结构(螺旋结构)。然而，亦有使用scFv的VH/VL区域间的作用来多聚化的策略(例如双、三与五体(pentabodies))。所谓双体(biabody)，熟谙本领域者亦指二价同源二聚体scFv衍生物。scFv分子中缩短的连接子至5-10个氨基酸会形成其中有一链内VH/VL-重叠(superimposition)的同源二聚体。藉掺入双硫键桥可将双体另外稳定化。来自现有技术的双体抗体蛋白的实例可见Perisic等人(1994，Structure2：1217-1226)。
所谓微抗体，熟谙本领域者亦指双价、同源二聚体scFv衍生物。其由包含免疫球蛋白，优选者为IgG的CH3区域融合蛋白组成；最佳者做为二聚化区域的IgG1是经由绞链区(例如，亦源于IgG1)与连接子区域连接于scFv。来自现有技术的微抗体蛋白的实例可见Hu等人(1996，Cancer Res.56：3055-61)。
所谓三体(tribody)，熟谙本领域者亦指三价同源三聚体scFv衍生物(Kortt等人，1997 Protein Enginnering 10：423-433)。不用连接子序列而经VH-VL直接融合的scFv衍生物会形成三聚体。
熟谙本领域者亦熟悉具双-、三-或四价结构并衍生自scFv的所谓的微抗体。该多聚化是由双-、三-或四聚体的卷绕的卷绕结构实现(Pack等人，1993 Biotechnology 11：1271-1277；Lovejoy等人，1993 Science 259：1288-1293；Pack等人，1995 J.Mol.Biol.246：28-34)。
本发明的优选宿主细胞是本文所说明且以增强的细胞存活为其特征者。特别是优选者为根据本发明的遗传修饰的宿主细胞，包括编码抗-细胞凋亡基因、选择用的可扩增的标记基因与至少一种目的基因的核酸序列。更优选为包括多拷贝数的这些基因的宿主细胞，至少有抗-细胞凋亡基因与选择用可扩增的标记基因。多拷贝数的这些基因亦是利用本文所述方法取得，例如藉基因扩增方法和/或以熟谙本领域者已知的任何其它方式(例如，导入基因的多联体)提供宿主细胞多基因拷贝数。
适当的抗-细胞凋亡基因为，但不限于表2所列者。优选者是包括多拷贝数的BCL-xL编码基因与多拷贝数的任何表3所列的选择用可扩增的标记基因的宿主细胞。最佳的选择用可扩增的标记基因为DHFR编码基因。
适于生产蛋白的宿主细胞是显示过度表达抗-细胞凋亡基因者，与未根据本发明方法修饰的宿主细胞的该蛋白的表达量比较，其至少增加约30倍，以至少约50倍优选，又以至少约100倍更佳。
甚至，适当的是于培养9天后，显示至少约50％存活力的宿主细胞群。甚至，本发明的适当的与优选的宿主细胞是培养8天后，显示至少约60％存活力者。甚至，适于本发明意义的宿主细胞为，于至少7天后，显示至少约75％的细胞存活力者。在另一具体实施方案中，宿主细胞群于培养6天后，以显示至少约85％存活力为适当的且优选的。在抗-细胞凋亡基因编码BCL-xL的情形下，可取得于培养9天后，至少约60％；培养8天后，至少75％；培养7天后，至少约85％的存活力的细胞(例如参照图5)。而且，与未经基因扩增方法修饰的亲代细胞群比较，以经过6、7、8或9天培养后，其存活至少增加约20％的宿主细胞特别适当。更优选是，与亲代细胞群比较，经6、7、8或9天培养后，其存活至少增加约30％的宿主细胞群，益佳者为其存活至少增加约50％的宿主细胞群。
在本发明意义的适当的宿主细胞或宿主细胞群，包括仓鼠细胞，以BHK21、BHK TK-、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1与CHO-DG44细胞优选，或可为任何此类细胞株的衍生物/子代。特佳者为CHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-K1与BHK21；更特别者为CHO-DG44与CHO-DUKX细胞。在本发明进一步的具体实施方案中，宿主细胞亦意指小鼠骨髓瘤细胞，优选者为NS0与Sp2/0或任何此类细胞株的衍生物/子代。然而，那些细胞、其它哺乳类细胞的衍生物/子代，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、猴子与啮齿类细胞株；或真核细胞，包括但不限于酵母菌、昆虫与植物细胞，亦可做为生产目的的本发明意义的用途。
通常是经多步骤方法，才能选取已显示增加的存活力并表达高水平所需蛋白的重组宿主细胞。选取策略有赖细胞是否由至少三个相关基因(抗-细胞凋亡基因、选择用的可扩增的标记基因、目的基因、与视情形的额外的选择用标记基因)平行共转染、是否将该目的基因导入已经显示如本文所述的增加的细胞存活力的细胞，或是否将该抗-细胞凋亡基因加上选择用可扩增的标记基因导入已表达目的基因的宿主细胞。
在第一种情形，其筛选或选取与目的基因共转染的任何表达选择用标记的转染细胞，以辨识掺入目的基因的细胞。通常，将转染宿主细胞培养于选择用培养液，例如约2周，以选择表达有选择用标记的宿主细胞。其后，逐步将细胞暴露于连续增量的扩增选取药剂，共扩增编码至少抗-细胞凋亡基因、选择用的可扩增的标记基因与目的基因的核酸序列，直到取得充分表达的异源的所需产物以及抗-细胞凋亡基因产物。每个选取步骤皆可以细胞集中物(cell pools)，或结合克隆选择方法，例如通过有限稀释来进行。若使用诸如GFP的适当标记，可利用荧光激活细胞分选仪(FACS)进行选取。
在第二种情形，适当的宿主细胞是至少经目的基因与选择用标记基因转染；并视情形加上与先前所用的选择用可扩增的标记基因不同的选取用可扩增的基因，以产生具增强的存活力的宿主细胞。之后，筛选或选取至少表达有与目的基因共转染的选取用标记的转染细胞，以辨识掺入目的基因的细胞。典型地，将转染宿主细胞培养于选择用培养液，以选择被表达选择用标示物者。视情形，为产生具增强的存活力的宿主细胞，选取用培养液亦可包含对先前所用的选择用可扩增的标记基因具有特异性的选取用药剂。选取步骤可以细胞集中物(cell pools)或可与克隆选择方法组合进行，所述克隆选择可通过例如，有限稀释来实现。若使用诸如GFP的适当标记，可利用荧光激活细胞分选(FACS)来进行选取。若使用另一种选择用可扩增的标记基因进行转染时，视情形，亦可进行进一步的细胞扩增步骤，以至少增加目的基因的拷贝数。
在第三种情形，以抗-细胞凋亡基因、选择用的可扩增的标记基因与视情形的另外一种选择用标记基因和/或目的基因，将重组的宿主细胞或已表达目的基因的生产细胞株共转染；藉此，其使用与建立重组的生产细胞株不同的标记以进行选取。将转染的宿主细胞株培养于选取用培养基约2周，进行选取，以表达新导入的标记基因。视情形，该选取用培养基亦含具有先前使用的选取用标记特异性的选取用药剂，以生成重组的生产细胞株。其后，逐步将细胞暴露于连续增加量的扩增的选取药剂，至少共扩增抗-细胞凋亡基因、选择用的可扩增的标记基因与视情形共转染的目的基因，直到至少取得充分表达的抗-细胞凋亡基因产物为止。每个选取步骤皆可以细胞集中物或可结合，例如有限稀释的克隆选择来进行。若使用诸如GFP的适当标记，得利用荧光激活细胞分选(FACS)来进行选取。
目的蛋白以培养液中的分泌性多肽的形式回收优选，或若其表达时无分泌性信号，可由宿主细胞裂解物回收。需要从其它重组蛋白和宿主细胞蛋白中纯化目的蛋白，以取得目的蛋白的实质上均质的制备物。第一步，细胞和/或颗粒性细胞碎片从培养液或裂解物中去除。其后，将目的产物从污染的可溶蛋白、多肽与核酸中纯化，例如藉免疫亲合力或离子交换层析柱分级分离、乙醇沉淀、反相HPLC、Sephadex色谱层析、硅胶或诸如DEAE的阳离子交换树脂的色谱层析法。通常，教导熟谙本领域者如何纯化宿主细胞表达的异源蛋白的方法是本领域所熟知的。这种方法的说明请见例如Harris与Angal，Protein Purification Methods，Rickwood与Hames编辑，ThePractical Approach Series，IRL Press(1995)或Robert Scopes，ProteinPurification，Springer-Verlag(1998)，二者皆列入本文供参考。
本发明的通常主题之一，是提供熟谙本领域者显示已增加细胞存活的宿主细胞。藉任何本文所述方法，抑制或延迟程序性的细胞死亡，例如细胞凋亡，皆可增加细胞存活。增强本文意义的细胞存活的最充分方式为，提供宿主细胞多拷贝数的至少一种异源导入的抗-细胞凋亡基因，并培养该宿主细胞于允许抗-细胞凋亡基因拷贝数高度表达的条件。本发明亦提供至少包括5个拷贝数的异源抗-细胞凋亡基因的宿主细胞。本发明亦提供至少包括10个拷贝数的异源抗-细胞凋亡基因的宿主细胞。甚且，本发明亦提供宿主细胞，至少包括20个拷贝数；在另一个具体实施方案中，至少50个拷贝数；在进一步的具体实施方案中，至少100个拷贝数的异源抗-细胞凋亡基因。本发明，提供熟谙本领域者数种如何生成此类包括多拷贝数的异源抗细胞凋亡基因的宿主细胞的方法。那些方法包括但不限于上述者：例如(i)于选择性药剂驱使下，逐步扩增至少一种异源导入的抗-细胞凋亡基因，(ii)利用并导入上述的附加体质粒，增加至少一种异源导入的抗-细胞凋亡基因的基因量，(iii)或使用根据例如Monaco等人，1996所述的DNA多联体体外扩增系统，其列入本文供参考。
适当的抗-细胞凋亡基因是任何表2所列者或者本发明通常描述的那些，特别是由任何指向表2的核酸序列所编码者或者任何由SEQ ID：1，SEQID：3，SEQ ID：5，SEQ ID：7，SEQ ID：9或SEQ ID：11或其任何功能变体或突变体(简并和非简并性)编码的基因。优选者为包括多拷贝数的编码BCL-xL或BCL-2的基因的宿主细胞，更优选为编码BCL-xL，更优选为编码人或仓鼠源的BCL-xL。而益佳者为包含多拷贝的具SEQ ID NO：1，SEQ ID：3，SEQID：5，SEQ ID：7，SEQ ID：9或SEQ ID：11或其任何功能变体或突变体(简并和非简并的)的序列的核酸的宿主细胞。在进一步的具体实施方案中，以编码BCL-2或具SEQ ID NO：2的序列的抗-细胞凋亡基因优选。亦佳者为包括不同的抗-细胞凋亡基因，例如选自表2所列者或本发明所述的其它任何基因的宿主细胞。在本发明一更佳具体实施方案中，混合物至少有一个拷贝数编码异源的BCL-xL。
适当的宿主细胞是任何本发明所述者，例如表1所提及者。更优选为仓鼠或小鼠类来源，例如小鼠骨髓瘤细胞的宿主细胞。益佳者为CHO或BHK细胞，特别是CHO-DG44、BHK21、BHK TK-、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1与CHO-DG44细胞，或可为任何此类细胞株的衍生物/子代。最佳者为CHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-K1与BHK21；特别是CHO-DG44与CHO-DUKX细胞。
上述的宿主细胞可另外藉导入至少一种目的异源基因加以修饰；因此，本发明亦关于包括如上述的多拷贝数的抗-细胞凋亡基因，并进一步包括至少一种目的基因的宿主细胞。
本发明的实施除非另有说明，将使用传统细胞生物、分子生物、细胞培养、免疫学等常规技术，而这些皆属于本领域的技术。这些技术在目前的文献皆完全揭示。例如参照Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(1987更新版)；Brown编辑，Essential Molecular Biology，IRL Press(1991)；Goeddel编辑，Gene Expression Technology，Academic Press(1991)；Bothwell等人编辑，Methods fo Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes，Bartlett Publ.(1990)；Wu等人，编辑，Recombinant DNA Methodology，AcademicPress(1989)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，Stockton Press(1990)；McPherson等人，PCR：A Practical Approach，IRL Press at Oxford UniversityPress(1991)；Gait编辑，Oligonucleotide Synthesis(1984)；Miller&Calos编辑，Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(1987)；Butler编辑，MammalianCell Biotechnology(1991)；Pollard等人，编辑，Animal Cell Culture，HumanaPress(1990)；Freshney等人，编辑，Culture of Animal Cells，Alan R.Liss(1987)；Studzinski，编辑，Cell Growth and Apoptosis，A Practical Approach，IRL Press atOxford University Press(1995)；Melamed等人，编辑，Flow Cytometry andSorting，Wiley-Liss(1990)；Current Protocols in Cytometry，John Wiley&Sons，Inc.(更新版)；Wirth&Hauser，Genetic Engineering of Animals Cells，in：Biotechnology第2册，Puhler编辑，VCH，Weinheim 663-744；Methods ofEnzymology(Academic Press，Inc.)系列丛书与Harlow等人，编辑，Antibodies：A Laboratory Manusal(1987)。
本专利说明书所提及的全部出版品与专利申请，是本发明所涉及领域的技术人员技术水平的指示。本文所引用的全部出版品与专利申请，藉此全文引入本文供参考，以更完整说明有关本发明的技术状态。参考下列实施例，将更易了解上文的本发明的一般描述，然而其仅用以说明本发明的某些具体实施方案，无论如何皆非用以限制本发明。
实施例
缩写
CHO：中华仓鼠卵巢
DHFR：二氢叶酸还原酶
ELISA：酶联免疫吸附试验
FACS：荧光激活细胞分选仪
FITC：异硫氰酸荧光素
HRPO：辣根过氧化酶
HT：次黄嘌呤与胸苷
IRES：内部核糖体进入位置
MIX：氨甲喋呤
PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳
PBS：磷酸盐缓冲的盐溶液
PCR：聚合酶链反应
PI：碘化丙锭
RT-PCR：逆转录酶-聚合酶链反应
SEAP：分泌性的碱性磷酸酶
SDS：十二烷基硫酸钠
sICAM：可溶性细胞间粘附分子
方法
1.细胞培养
将永久培养于补充以次黄嘌呤与胸苷(Invitrogen，Carlsbad，CA)的无血清培养液的悬浮液CHO-S-SFMII(Invitrogen，Carlsbad，CA)中的CHO-DG44/dhfr-/-(Urlaub等人，1983)，保温于37℃、含5％CO2的湿度调整的恒温箱的细胞培养烧瓶中。每2-3天，接种浓度为2×105细胞/毫升的细胞，并利用CASY1细胞计数器(Schaerfe System；Germany)分析细胞悬浮液(500微升)的细胞数及存活力。存活力亦可利用台盼蓝染色排除来确认。单细胞克隆是利用标准稀释技术，以96孔板进行。为了以DHFR为基础的选取稳定转染的CHO-DG44细胞之用，我们使用无次黄嘌呤与胸苷的CHO-S-SFMII培养液。将20毫摩尔浓度MTX(Sigma，Germany)加入培养液，做为扩增选取用药剂来完成以DHFR为基础的基因扩增。做为批式培养用，将纯种系以二重复接种入含12毫升适当培养液的细胞培养烧瓶(T25)，并保温于恒温箱中7-9天而不加任何新鲜培养液。当将CHO-DG44细胞培养于CHO-S-SFMII培养液时，补充以10％胎牛血清(Sigma，Germany)。为了传代，每2-3天将细胞以胰蛋白酶处理(在含血清时CHO-DG44便会附着)并以2×105细胞/毫升的浓度接种于新鲜培养液中。
2.表达载体
根据pAD-CMV载体(Werner等人，1998)的基础载体pBID，会介导由CMV启动子/增强子驱使的异源基因的构成性表达。此外，pBID编码dhfr的微小基因做为可扩增的选择用标记(例如参照EP 0 393 438)。由pAD-sICAM(Werner等人，1998)分离出含sIACM的HindIII/SalI片段，并克隆入pBID的相当位置(HindIII与SalI)，以生成pBID-sICAM。以如下方式将人类bcl-xL(SEQ ID NO：1，GenBank Accession Number Z23115)与bcl-2(SEQ ID NO：3，GenBank登录号为M13995)同系物克隆入表达载体。为建构pBID-bcl-2，首先将bcl-2以PCR由人类总RNA扩增，并再克隆入pCR2.1-TOPO克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。利用EcoRI，将其从那里切出并接合入pBID的相当的EcoRI位置。利用Klenow-DNA聚合酶，将填满的PmeI-切出的pDD6(Fussenegger等人，1998)的IRES-bcl-xL片段，克隆入pBID-sICAM的Xbal位置生成双顺反子的pBID-sICASM-bcl-xL表达载体。利用SalI/XhoI消化与再接合，将sICAM-IRES成分从pBID-sICAM-bcl-xL中消除，此载体为建构pBID-bcl-xL的基础。PSEAP2-对照包含受SV40启动子控制的人类的分泌性碱性磷酸酶(Clontech，PaloAlto，CA)。pGL2-对照包含受SV40启动子驱使的萤火虫的虫荧光素酶(Promega，Madison，USA)。
3.瞬时与稳定的转染
利用Fugene6试剂(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)进行转染。每次转染，将2毫升的含0.6×106指数生长的CHO-DG44细胞的补充以HT的CHO-S-SFMII培养液接种入6孔板的孔中。每次转染，依照制造商的方法，使用总共4微克的质粒-DNA与10微升的Fugene6试剂。瞬时的转染平行三份重复进行，并于转染48小时后收集上清液与细胞。为了稳定的转染，于转染后72小时以无HT的CHO-S-SFMII培养液取代培养液，并于分析或克隆前选取混合的细胞群2周，而且每3-4天换培养液。单细胞的克隆是利用标准稀释技术。为扩增整合入宿主细胞染色体的异源基因，将衍生自混合的遗传修饰的宿主细胞群接种入含200微升的补充以20毫微摩尔浓度MTX的无HT的CHO-S-SFMII培养液至96孔板。以3周选取扩增的单细胞克隆，并扩展入细胞培养烧瓶。
4.sICAM ELISA
以标准方法(Ausubel等人，1994更新版)，利用两个自行生产的sICAM特异性单克隆抗体(例如美国专利号码5,284,931与5,475,091所述)，其中之一抗体为HRPO-偶联抗体，经ELISA定量上清液的sICAM滴度。以纯化的sICAM蛋白用做标准物。由Spectra Fluor Plus读数机(TECAN，Crailsheim，Germany)分析样本。
5.报导酶分析
根据标准方法，以Promega的Luciferase Assay System(Madison，WI)决定萤火虫的虫荧光素酶报导酶活性。根据标准方法，以Clontech的GreatEscAPe SEAP试剂盒(Palo Alto，CA)测定SEAP活性。利用Spectra Fluor Plus读数仪(TECAN，Crailsheim，Germany)分析样本。
6.Western印迹分析
利用Western印迹分析确认亲代宿主细胞CHO-DG44与遗传修饰的宿主细胞的BCL-2与BCL-xL的表达。以500微升裂解缓冲液(1％TritonX-100、15毫摩尔浓度NaCl、10毫摩尔浓度Tris-HCl pH 7.5加上50微克/毫升苯基甲烷磺酰氟化物与200微升的来自Roche Diagnostics的蛋白酶抑制剂混合物)抽提约1×106的细胞。裂解物以13000xg离心10分钟，使之澄清。根据制造商的方法(Bio-Rad Laboratories GmbH，Munich，Germany)，以Bradford分析确定蛋白质浓度。然后，将抽提物贮存于-80℃备用。取等量蛋白(20微克)进行10％SDS-PAGE(Novex；Invitrogen，Carlsbad，CA)并于其后电印迹于硝酸纤维素膜(Invitrogen，Carlsbad，CA)。以5％脱脂奶粉封闭后，利用来自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)的BCL-2或BCL-xL特异性的小鼠单克隆抗体检测蛋白。观测蛋白是以抗-小鼠过氧化酶-偶合的第二抗体(Dianova GmbH，Hamburg，Germany)利用ECL检测系统(AmershamBiosciences，Freiburg，Germany)进行。
7.细胞凋亡的定量
利用以荧光为基础的TUNEL-分析(BD Biosciences PharMingen，SanDiego，CA)定量片段化的DNA量。收取1×106细胞，以PBS洗过，并以1％聚甲醛的PBS溶液于4℃处理15分钟。经另外的PBS清洗步骤后，将细胞混以70％乙醇并根据制造商方法进行分析。以FACSCalibur(Becton-Dickinson)进行每个样本的10000个细胞的FITC与PI发射情形分析。
8.标记的线粒体的流式细胞计数法
每个样本收取500000个细胞，以PBS洗，并以1％聚甲醛的PBS溶液于4℃处理15分钟。于第二次PBS清洗后，已可进行以荧光为基础的细胞线粒体的染色。由1毫摩尔浓度贮存液制备含500pM浓度的线粒体选取用的Mito Tracker Green FM染料(Molecular Probes，Eugene，OR)的PBS溶液。将细胞保温于200微升，37℃的染色溶液15分钟。其后，以PBS洗细胞两次，悬浮于400微升PBS，并进行流式细胞计数分析。测定每个样本10000个细胞的绿色荧光发射。
9.杂交试验
根据Ausubel等，1994，更新版所述的标准方案使用DNA或RNA探针＞100bp)进行DNA或RNA蛋白印迹的杂交分析。在后杂交洗涤中实现杂交的特异性，其中关键的参数是终洗涤溶液的离子强度和洗涤进行时的温度。通过在65℃下0.2XSSC/0.1％SDS中进行洗涤实现严格条件。对于高度严格的条件洗涤在65℃下0.1XSSC/0.1％SDS中进行。
实例1：瞬时与稳定模式的存活与产物基因的过度表达
一般伤风治疗药sICAM(可溶性的细胞间粘附分子1)会与ICAM受体竞争鼻病毒的结合并防止此一般伤风的病原与进入细胞及后续感染所需的ICAM受体作用(Bella等人，1999；Marlin等人，1990)。为详细评估抗-细胞凋亡基因bcl-2与bcl-xL的暂时表达对sICAM产生的影响，将等量的sICAM编码质粒pBID-sICAM以平行三份与pBID-bcl-2、pBID-bcl-xL或同基因型对照pBID其转染(图1)入缺乏dhfr的CHO-DG44。让细胞永久生长于无血清的补充以次黄嘌呤与胸苷的CHO-S-SFMII(Invitrogen，Carlsbad，CA)的悬浮液。转染后48小时，利用自行生产的sICAM特异抗体、经ELISA定量悬浮液的sICAM滴定度。在BCL-2的表达剧烈减低对照组pBID的sICAM生产至10％的情形时，异位的BCL-xL的表达却增加sICAM产率达60％(图2A)。这些资料经SEAP表达情形(以pSEAP2-对照交换pBID-sICAM)证实，其显示所观察的BCL-2与BCL-xL的生产特征是一般性的，而非sICAM/BCL-2或sICAM/BCL-xL表达的组合效果(图2B)，而且，为评估BCL-2与BCL-xL的表达对细胞生产参数的影响是否与分泌性产物蛋白相联系、甚或受其限制，还利用胞内荧光素酶报导分子进行一致性的产物分析(以pGL2-对照取代pBID-sICAM)。荧光素酶生产特征与前述SEAP及sICAM表达情形相关，证实这些细胞凋亡-抑制基因对CHO-DG44细胞的总体产量的正面(bcl-xL)与负面(bcl-2)影响(图2C)。所需蛋白在BCL-2表达后的减量生产情形，在适应悬浮液生长的COS-7细胞(ATCC CRL-1651)、附着依赖性的CHO-K1(ATCC CCL-61)与CHO-DUKX细胞(ATCC CRL-9096)亦发现。
尽管瞬时转染实验对异源基因在广范围的细胞型态与拷贝数的代谢的工程改造能力给我们高度可依赖的资料，却仅有稳定的混合群体得无疑地证实所观察的表达型。因而，生成每个pBID-sICAM/pBID-bcl-2、pBID-sICAM/pBID-bcl-xL、pBID-sICAM/pBID-构型的6个混合群的sICAM滴定度情形。于无HT的CHO-S-SFMII培养液利用以DHFR为基础的筛选来选取表达异源基因的转染细胞群。图3显示在3天培养期中由那些稳定转染的混合群所生产的sICAM的绝对产量。每个值表示经5次传代后所有群的平均sICAM产量，而每次传代皆取一些样本。如瞬时转染可见到的，BCL-2的表达对sICAM产量有负面影响，滴定度减低达50％；至于与工程处理仅sICAM表达的对照组群比较，BCL-xL的表达增加此一般伤风治疗剂的总体产率达30％。这些在瞬时与稳定表达构型中所得的相关性结果提示，抗-细胞凋亡的工程策略的设计应在仔细考虑了可利用的存活决定因素后再予以考虑。
实施例2：bcl-2与bcl-xL的dhfr-扩增的基因表达对稳定的
生产sICAM的细胞纯种系的存活力与抗-细胞凋亡的效果。
为评估抗-细胞凋亡工程处理对无血清的批式培养的转基因CHO-DG44细胞株的效果，选取由CHO-DG44与pBID-sICAM/pBID-bcl-2、pBID-sICAM/pBID-bcl-xL或pBID-sICAM/pBID载体组合稳定共转染、且来自6种混合的细胞群的个别最高生产sICAM的细胞群做进一步分析。利用于96孔板的限制性细胞稀释，进行两个单细胞的克隆步骤，一个是在无HT的CHO-S-SFMII培养液(非扩增的细胞纯种系)；另一个包括单回合的MTX-诱发的DHFR-为基础的扩增，且以20毫微摩尔浓度的MTX补充无HT的CHO-S-SFMII培养液(扩增的细胞纯种系)。利用ELISA筛选最高的sICAM生产者的细胞纯种系，每个基因组态选取两个最好的纯种系做进一步分析。除了pBID-sICAM外，这些细胞纯种系亦含下列之一的构建体：(i)位于HMNI-1、HMNI-2(未扩增)及HMNI-3、HMNI-4(已扩增)中的pBID(仅有载体的对照组)，(ii)位于HMNIBC-1、HMNIBC-2(未扩增)及HMNIBC-3、HMNIBC-4(已扩增)中的pBID-bcl-2，(iii)位于HMNIBX-1、HMNIBX-2(未扩增)及HMNIBX-3、HMNIBX-4(已扩增)中的pBID-bcl-xL。
每天检测批式培养的细胞培养瓶中全部的细胞纯种系，持续一周。如图4可见，所有非扩增的细胞纯种系，包括仅有载体的对照组，展现类似的存活力情形，此清楚显示BCL-2与BCL-xL对存活力的效果可忽视。于第7天，存活力在所有情形皆降至约30-40％。然而，在含扩增的异源基因的纯种系的下降期，可发现细胞存活力明显较高。在有关细胞死亡的保护方面，BCL-xL明显比BCL-2表达好(图5)。在表达BCL-xL的细胞株(HMNIBX-3/4)，于第9天仍有70％的活细胞，这与表达BCL-2的细胞株(HMNIBC-3/4)的约60％的活细胞和转基因对照细胞株(HMNI-3/4)的无活细胞形成对照。与存活力增加相关，使用荧光为基础的TUNEL分析，于2、4及6天时评估扩增的细胞纯种系，亦显示起始细胞死亡程序的细胞百分比剧烈减少(图6)。然而，在第2天时全部的转基因组态几乎皆未发现凋亡的细胞，而第4天时则可见凋亡的细胞明显增加。增加最少达5％者，为表达BCL-xL的细胞；随之为表达BCL-2的细胞为10％；至于转基因的对照组细胞中的凋亡细胞几乎达30％。于第6天时，不同的转染细胞株间的差异更明显。BCL-xL的细胞凋亡抑制潜力与BCL-2比较至少高3倍；因为在此阶段后者BCL-xL的凋亡细胞达30％，而前者仅10％。在未表达任何异源抗-细胞凋亡基因的转基因对照组细胞中，凋亡细胞的数目则已达60％。
为证实抗-细胞凋亡基因的扩增状态，遂进行BCL-2与BCL-xL指向的Western印迹分析。图7显示仅转基因对照组细胞株HMNI-1的基础BCL-2(图7A)与BCL-xL(图7B)表达量接近检测极限，并与亲代CHO-DG44细胞的表达量相当。此显示存活的基因表达并未受以DHFR为基础的选取向上调控，这与较早的G418介导的选取报告偏向增强的存活结果有所不同(Tey等人，2000a)。与基因转基因对照组HMNI-1和亲代CHO-DG44(图12A与12B，HMNIBC-3/4与HMNIBX-3/4)比较，利用以DHFR为基础的扩增，BCL-2与BCL-xL的表达情形可分别增加至少80-100倍与30-40倍。在非扩增的转基因细胞株，BCL-2与BCL-xL的表达量增加不到10倍。此蛋白量明显低是因为充分的抗-细胞凋亡保护效果(图5)。以具双顺反子组态的表达载体-pBID-sICAM-bcl-xL转染的细胞可得相当结果。在此转录单位的第一个顺反子的sICAM的开始(set up)翻译中，其起始是传统的cap-依赖模式；而第二个顺反子的bcl-xL的cap-依赖模式，是由衍生自脑心肌炎病毒的IRES元件所驱使。选择用可扩增的标记dhfr是包含在相同载体的分开的转录单位。
BCL-2与BCL-xL介导的抗-细胞凋亡工程的详细分析例示这些存活决定因子的高水平表达是必须的，以便在永久培养于无血清条件的CHO-DG44细胞中展现任何明显的保护效果。
实施例3：利用斑点印迹分析确定基因的拷贝数
整合入转染宿主细胞CHO-DG44的异源抗-细胞凋亡基因bcl-2与bcl-xL的拷贝数是利用斑点印迹分析来决定。为此目的，利用市售Qiagen的Genomic Blood&Tissue Kit(Hilden，Germany)，根据制造商所述方法，由转基因与亲代CHO-DG44细胞株分离基因组DNA。将通常介于0.5-15微克的不同量基因组DNA的溶于碱性缓冲液者，使用附着于抽气装置(suctiondevice)的歧管(其细节请见Ausubel等人，1994，更新版)二重复施用于带正电的Hybond N+尼龙膜(Amersham Biosciences，Freiburg，Germany)。被印迹的基因组DNA的量，视其后将由杂合的探针搜寻的目标序列的相对量而定。然后进行杂合分析以决定印迹的DNA制备物的bcl-2与bcl-xL序列的量。遵照基因图像随机引物标识模式(Gene Images random prime labelling module)(Amersham Biosciences，Freiburg，Germany)的方法，产生随机引物引导(random-primed)的FITC-dUTP标记的bcl-2与bcl-xL特异性探针；若非利用由EcoRI消化pBID-bcl-2所得bcl-2特异性的640碱基对片段，即是利用PvuII/BcII消化pBID-bcl-xL的bcl-xL特异性730碱基对片段做为标识反应的模板。根据基因图像随机引物标识模式的方法，杂交是于杂交箱中以65℃杂交过夜。杂交后滤膜以0.2xSSC/0.1％SDS，65℃洗两次、各20分钟，然后根据Gene Images CDP-Star检测模式(Amersham Biosciences)，继续抗体显色与检测。信号定量是利用VDS-CL Imager System(Amersham Biosciences)进行的。分离自转基因细胞的基因组DNA的bcl-2或bcl-xL特异性信号的信号强度是与固定分子数的pBID-bcl-2或pBID-bcl-xL表达质粒(根据质粒分子量为基础计算的数目)的标准曲线比较，且用来估计基因组DNA样本内的目标DNA的绝对量。因为内源性bcl-2与bcl-xL基因，亲代细胞株CHO-DG44的基因组DNA的杂交信号将从转基因信号减去。然后将转基因样本的拷贝数除以每个样本的DNA量，以取得每个细胞的基因拷贝数并根据每个细胞5pg的DNA量，乘以5pg。为校正所比较的样本间DNA的量，于脱去滤膜(filter)上的第一种探针后，在相同滤膜的第二次杂合反应中以仓鼠的mbh-1基因的一部分(myc-为基础的基序的同系物1)用做内部控制基因探针。
藉此方法，可确定经由导入与扩增bcl-2或bcl-xL基因(例如，如本文所述者)的遗传修饰的宿主细胞，其包含至少5、10、20、50或100拷贝数的异源bcl-2与bcl-xL基因。
实施例4：藉添加血清调节线粒体数目
为明显影响生长于无血清条件的CHO-DG44的存活，很清楚的需要高BCL-2或BCL-xL剂量，起始我们思考是否线粒体的量与因而对程序性细胞死亡的敏感性是视血清而定。因为发现血清是细胞凋亡的重要保护因素，而且线粒体是细胞死亡调节者(类似BCL-2与BCL-xL)的主要平台，此假设更令人信服。
以决定血清依赖型的特定线粒体量为焦点，CHO-DG44细胞，若非培养于无血清的CHO-S-SFMII培养液的悬浮液，即是培养于补充以10％FCS的CHO-S-SFMII中成附着细胞。于所述条件培养2周后，两种培养的细胞皆利用MitoTracker Green FM-线粒体特异性的荧光染料描述其特定线粒体含量。因MitoTracker Green FM会以膜电位依赖方式在线粒体累积，故其是定量这些细胞器的良好工具(Metivier等人，1998)。与培养在含血清的细胞比较，线粒体特异性染色在无血清的细胞培养中明显增加。FACS-介导的分析定量特定线粒体含量增高达3倍(图8)。因无血清条件下线粒体清楚扩增，故直接提示血清依赖型细胞株的成功抗-细胞凋亡工程处理需增加BCL-2或BCL-xL表达量以补足与这些细胞器相关的细胞凋亡机制的特定增加。
实施例5：克隆仓鼠bcl-xL cDNA
设计了以下5’末端引物(Bcl for1：5’-GCCACCATGTCTCAGAGCAAACCGGGAG-3’；SEQ ID NO：13)和3’末端引物(Bcl rev1：5’-TCAYTTCCGACTGAAGAGYGARCC-3’；SEQ ID NO：14)。这些引物根据方案(Invitrogen，Carlsbad，CA)用于一步RT-PCR，对从仓鼠细胞系CHO-DG44(Urlaub et al.，1983)中分离的1μg总RNA进行所述RT-PCR以获得bcl-xL cDNA的仓鼠同源物。产生的700bp cDNA产物亚克隆入TA-型克隆载体(Invitrogen)中，并在ABI 373A自动测序仪(Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)上测定两条cDNA链的核苷酸序列，其中使用载体特异的(M13反向，T7)和基因特异的引物(Bcl for1和Bcl rev1)根据产品说明(Applied Biosystems)启动Big Dye Terminator Cycle Sequencing reaction试剂盒中的延伸反应。对GenBank和EMBL数据库进行同源搜索已确定分离的cDNA以及其包含仓鼠bcl-xL基因的整个编码区。
为测定仓鼠bcl-xL基因编码区的真实5’和3’末端序列，使用了基因组步移法(genomic walking approach)。为分别分离含有编码区5’末端和3’末端的基因组区，根据仓鼠bcl-xL序列设计了以下引物：
(i)重叠引物Bcl rev5(5’-CATCACTAAACTGACTCCAGCTG-3’；SEQID NO：15)和Bcl rev6(5’-TGACTCCAGCTGTATCCTTTCTG-3’；SEQ ID NO：16)，位于编码区的5’末端的下游，并与分离5’末端的编码链互补，
(ii)重叠引物Bcl for2(5’-GACGGGCATGACTGTGGCTG-3’；SEQ IDNO：17)和Bcl for3(5’-TGACTGTGGCTGGTGTGGTTCT-3’；SEQ ID NO：18)，位于编码区的3’末端的上游，并与分离3’末端的非编码链互补，
衔接子接连的基因组CHO-DG44 DNA作为嵌套式PCR中的模板。初级PCR用与衔接子互补的引物以及bcl-xL特异的引物(分别为Bcl rev5或Bcl for2)的组合物进行。次级PCR利用初级PCR产物以及内部衔接子引物和嵌套式bcl-xL特异引物(分别为Bcl rev6或Bcl for3)的组合物。产生的DNA片段的大小在0.5kb和1.8kb之间，其起点是bcl-xl引物末端已知序列，并延伸到各种长度的未知邻近基因组DNA，将该片段克隆到TA-型克隆载体(Invitrogen)中，并进一步利用序列分析进行分析。所有重叠DNA片段含有仓鼠bcl-xL编码区的5’或3’末端，以及未翻译区的5’或3’末端的序列。根据该序列信息，在反应中使用以下引物重复一步式RT-PCR：仓鼠特异的5’末端引物(5’-TCCGGAATTCGCCACCATGTCTCAGAGCAACC GGGAG-3’；SEQ ID NO：19)和3末端引物Xho-Bcl rev(5’-TCCGCTCGAGTCACTTCCGACTGAA GAGAGAGCC-3’；SEQ ID NO：20)。通过这种方法获得完整的仓鼠源bcl-xL编码区(图9)。引物Eco-Bcl for和Xho-Bcl rev包括bcl-xL序列和EcoRI或XhoI的限制性酶切位点，用于亚克隆到真核表达载体pBID中，产生pBID/bcl-xL(图10)。该载体基于pAD-CMV载体(Werner等，1998)，介导CMV启动子/增强子驱动的异源基因的构成性表达。此外，pBID编码dhfr微小基因，该基因是可扩增的选择性标记(见例如EP 0 393 438)。
实施例6：仓鼠bcl-xL缺失突变体的产生
多种具有不同的非保守非结构环区缺失的仓鼠bcl-xL突变体如下克隆。简言之，每种缺失突变体的5’和3’末段分别通过PCR产生，通过新引入的Not I限制性位点连接，直接克隆到真核表达载体pBID中并通过序列分析确定。缺失的氨基酸残基被4个丙氨酸的序列一致地取代，该序列作为桥接相邻结构域的接头。表达载体pBID/bcl-xL含有仓鼠bcl-xL野生型cDNA，并在PCR中用作模板，与各种引物组合产生编码区5’或3’部分的所需部分，所述编码区位于缺失的DNA序列的上游或下游(图11)：
(i)5’部分：
a)载体特异的上游引物与del26组合(5’-ATAGTTATGCTGCG GCCGCACTCCAGCTGTATCCTTTCTGG-3’)(SEQ ID NO：19)
b)载体特异的上游引物与del46组合(5’-ATAGTTATGCTGCGGCCGCCCTCTCTGATTCAGTTCCTTCTG-3’)(SEQ ID NO：20)
c)载体特异的上游引物与del66组合(5’-ATAGTTATGCTGCGGCCGCTACCGCGGGGCTGTCCGCC-3’)(SEQ ID NO：21)
(ii)3’部分：
a)载体特异的下游引物与del63组合(5’-AAGTAAGAAGCGGCCGCAGCAGCGGTAAATGGAGCCACTGGC-3’)(SEQ ID NO：22)
载体特异的下游引物与del83结合(5’-AAGTAAGAAGCGGCCGCAGCAGCAGCCGTAAAGCAAGCGCTG-3`)(SEQ ID NO：23)
为使产生缺失突变体pBID/bcl-xLdel26-83分别具有SEQ ID NOs：5和6的nt和aa序列，pBID/bcl-xLdel46-83分别具有SEQ ID NOs：7和8的nt和aa序列，pBID/bcl-xLdel66-83分别具有SEQ ID Nos：9和10的nt和aa序列，以及pBID/bcl-xLdel46-63分别具有SEQ ID NOs：11和12的nt和aa序列，PCR片段del26和del83，del46和del83，del66和del83或del46和del63分别通过引入的NotI限制性位点连接并作为EcoRI/SnaBI限制性片段克隆入表达载体pBID中。数字表明缺失的氨基酸，例如del26-83表示，在突变体中仓鼠野生型BCL-xL序列的氨基酸26-83缺失。
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Wu et al.，eds.，Recombinant DNA Methodology，Academic Press(1989)
Wyllie，A.H.et al.，Int Rev Cytol 1980，68，251-306
Zanghi，J.A.et al.，Biotechnol Bioeng 1999，64，108-199
Zanghi，J.A.et al.，Biotechnol Prog 2000，16，319-325
                                 序列表
<110>贝林格尔英格海姆法玛两合公司(Boehringer Ingelheim Pharma GmbH&Co.KG)
<120>具有改良的存活性质的宿主细胞及该细胞的生产方法
<130>Case 1-1314
<160>25
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>926
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
gaatctcttt ctctcccttc agaatcttat cttggctttg gatcttagaa gagaatcact     60
aaccagagac gagactcagt gagtgagcag gtgttttgga caatggactg gttgagccca    120
tccctattat aaaaatgtct cagagcaacc gggagctggt ggttgacttt ctctcctaca    180
agctttccca gaaaggatac agctggagtc agtttagtga tgtggaagag aacaggactg    240
aggccccaga agggactgaa tcggagatgg agacccccag tgccatcaat ggcaacccat    300
cctggcacct ggcagacagc cccgcggtga atggagccac tgcgcacagc agcagtttgg    360
atgcccggga ggtgatcccc atggcagcag taaagcaagc gctgagggag gcaggcgacg    420
agtttgaact gcggtaccgg cgggcattca gtgacctgac atcccagctc cacatcaccc    480
cagggacagc atatcagagc tttgaacagg tagtgaatga actcttccgg gatggggtaa    540
actggggtcg cattgtggcc tttttctcct tcggcggggc actgtgcgtg gaaagcgtag    600
acaaggagat gcaggtattg gtgagtcgga tcgcagcttg gatggccact tacctgaatg    660
accacctaga gccttggatc caggagaacg gcggctggga tacttttgtg gaactctatg    720
ggaacaatgc agcagccgag agccgaaagg gccaggaacg cttcaaccgc tggttcctga    780
cgggcatgac tgtggccggc gtggttctgc tgggctcact cttcagtcgg aaatgaccag    840
acactgacca tccactctac cctcccaccc ccttctctgc tccaccacat cctccgtcca    900
gccgccattg ccaccaggag aacccg                                         926
<210>2
<211>911
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
tgattgaaga caccccctcg tccaagaatg caaagcacat ccaataaaat agctggatta     60
taactcctct tctttctctg ggggccgtgg ggtgggagct ggggcgagag gtgccgttgg    120
cccccgttgc ttttcctctg ggaaggatgg cgcacgctgg gagaacgggg tacgacaacc    180
gggagatagt gatgaagtac atccattata agctgtcgca gaggggctac gagtgggatg    240
cgggagatgt gggcgccgcg cccccggggg ccgcccccgc accgggcatc ttctcctccc    300
agcccgggca cacgccccat ccagccgcat cccgcgaccc ggtcgccagg acctcgccgc    360
tgcagacccc ggctgccccc ggcgccgccg cggggcctgc gctcagcccg gtgccacctg    420
tggtccacct ggccctccgc caagccggcg acgacttctc ccgccgctac cgcggcgact    480
tcgccgagat gtccagccag ctgcacctga cgcccttcac cgcgcgggga cgctttgcca    540
cggtggtgga ggagctcttc agggacgggg tgaactgggg gaggattgtg gccttctttg    600
agttcggtgg ggtcatgtgt gtggagagcg tcaaccggga gatgtcgccc ctggtggaca    660
acatcgccct gtggatgact gagtacctga accggcacct gcacacctgg atccaggata    720
acggaggctg ggtaggtgca tctggtgatg tgagtctggg ctgaggccac aggtccgaga    780
tcgggggttg gagtgcgggt gggctcctgg gcaatgggag gctgtggagc cggcgaaata    840
aaatcagagt tgttgcttcc cggcgtgtcc ctacctcctc ctctggacaa agcgttcact    900
cccaacctga c                                                         911
<210>3
<211>863
<212>DNA
<213>黝仓鼠(Cricetulus griseus)
<400>3
cagagcagac ccagtgagtg agcaggtgtt ttggacaatg gactggttga gcccatctgt     60
attataaaaa tgtctcagag caaccgggag ctagtggttg actttctctc ctacaagctc    120
tcccagaaag gatacagctg gagtcagttt agtgatgtcg aagagaacag gactgaggcc    180
ccagaaggaa ctgaatcaga gagggagacc cccagtgcca tcaatggcaa cccatcctgg    240
cacctggcgg acagccccgc ggtaaatgga gccactggcc acagcagcag tttggatgca    300
cgggaggtga tccccatggc agccgtaaag caagcgctga gagaggccgg cgatgagttt    360
gagctgcggt accggcgggc gttcagtgat ctaacatccc agcttcatat aaccccaggg    420
actgcatatc aaagctttga acaggtagtg aatgaactct tccgggatgg ggtaaactgg    480
ggtcgcattg tggccttttt ctccttcggt ggagccctct gtgtggaaag cgtagacaag    540
gagatgcagg tattggtgag tcggatcgca agttggatgg ccacctacct gaatgaccac    600
ctagagcctt ggatccagga caacggcggc tgggacactt tcgtggaact ctacggaaac    660
aatgcagcag ctgagagccg gaaaggccag gagcgcttca accgctggtt cctgacgggc    720
atgactgtgg ctggtgtggt tctgctgggc tctctcttca gtcggaagtg acaagacagt    780
gaccacctac tcacatctcg cctcccaccc tatccccacc acaactctct cttcagccac    840
cattgctacc aggagaacca cta                                            863
<210>4
<211>233
<212>PRT
<213>黝仓鼠(Cricetulus griseus)
<400>4
Met Ser Gln Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys
1               5                   10                  15
Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Gln Phe Ser Asp Val Glu Glu
            20                  25                  30
Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser Glu Arg Glu Thr Pro
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Asn Gly Asn Pro Ser Trp His Leu Ala Asp Ser Pro Ala
    50                  55                  60
Val Asn Gly Ala Thr Gly His Ser Ser Ser Leu Asp Ala Arg Glu Val
65                  70                  75                  80
Ile Pro Met Ala Ala Val Lys Gln Ala Leu Arg Glu Ala Gly Asp Glu
                85                  90                  95
Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Phe Ser Asp Leu Thr Ser Gln Leu
            100                 105                 110
His Ile Thr Pro Gly Thr Ala Tyr Gln Ser Phe Glu Gln Val Val Asn
        115                 120                 125
Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe
    130                 135                 140
Ser Phe Gly Gly Ala Leu Cys Val Glu Ser Val Asp Lys Glu Met Gln
145                 150                 155                 160
Val Leu Val Ser Arg Ile Ala Ser Trp Met Ala Thr Tyr Leu Asn Asp
                165                 170                 175
His Leu Glu Pro Trp Ile Gln Asp Asn Gly Gly Trp Asp Thr Phe Val
            180                 185                 190
Glu Leu Tyr Gly Asn Asn Ala Ala Ala Glu Ser Arg Lys Gly Gln Glu
        195                 200                 205
Arg Phe Asn Arg Trp Phe Leu Thr Gly Met Thr Val Ala Gly Val Val
    210                 215                 220
Leu Leu Gly Ser Leu Phe Ser Arg Lys
225                 230
<210>5
<211>540
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SEQ ID NO：3的缺失突变体(de126-83)
<400>5
atgtctcaga gcaaccggga gctagtggtt gactttctct cctacaagct ctcccagaaa     60
ggatacagct ggagtgcggc cgcagcagca gccgtaaagc aagcgctgag agaggccggc    120
gatgagtttg agctgcggta ccggcgggcg ttcagtgatc taacatccca gcttcatata    180
accccaggga ctgcatatca aagctttgaa caggtagtga atgaactctt ccgggatggg    240
gtaaactggg gtcgcattgt ggcctttttc tccttcggtg gagccctctg tgtggaaagc    300
gtagacaagg agatgcaggt attggtgagt cggatcgcaa gttggatggc cacctacctg    360
aatgaccacc tagagccttg gatccaggac aacggcggct gggacacttt cgtggaactc    420
tacggaaaca atgcagcagc tgagagccgg aaaggccagg agcgcttcaa ccgctggttc    480
ctgacgggca tgactgtggc tggtgtggtt ctgctgggct ctctcttcag tcggaagtga    540
<210>6
<211>179
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>SEQ ID NO：4的缺失突变体(de126-83)
<400>6
Met Ser Gln Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys
1               5                   10                  15
Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val
            20                  25                  30
Lys Gln Ala Leu Arg Glu Ala Gly Asp Glu Phe Glu Leu Arg Tyr Arg
        35                  40                  45
Arg Ala Phe Ser Asp Leu Thr Ser Gln Leu His Ile Thr Pro Gly Thr
    50                  55                  60
Ala Tyr Gln Ser Phe Glu Gln Val Val Asn Glu Leu Phe Arg Asp Gly
65                  70                  75                  80
Val Asn Trp Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Ser Phe Gly Gly Ala Leu
                85                  90                  95
Cys Val Glu Ser Val Asp Lys Glu Met Gln Val Leu Val Ser Arg Ile
            100                 105                 110
Ala Ser Trp Met Ala Thr Tyr Leu Asn Asp His Leu Glu Pro Trp Ile
        115                 120                 125
Gln Asp Asn Gly Gly Trp Asp Thr Phe Val Glu Leu Tyr Gly Asn Asn
    130                 135                 140
Ala Ala Ala Glu Ser Arg Lys Gly Gln Glu Arg Phe Asn Arg Trp Phe
145                 150                 155                 160
Leu Thr Gly Met Thr Val Ala Gly Val Val Leu Leu Gly Ser Leu Phe
                165                 170                 175
Ser Arg Lys
<210>7
<211>600
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SEQ ID NO：3的缺失突变体(de146-83)
<400>7
atgtctcaga gcaaccggga gctagtggtt gactttctct cctacaagct ctcccagaaa     60
ggatacagct ggagtcagtt tagtgatgtc gaagagaaca ggactgaggc cccagaagga    120
actgaatcag agagggcggc cgcagcagca gccgtaaagc aagcgctgag agaggccggc    180
gatgagtttg agctgcggta ccggcgggcg ttcagtgatc taacatccca gcttcatata    240
accccaggga ctgcatatca aagctttgaa caggtagtga atgaactctt ccgggatggg    300
gtaaactggg gtcgcattgt ggcctttttc tccttcggtg gagccctctg tgtggaaagc    360
gtagacaagg agatgcaggt attggtgagt cggatcgcaa gttggatggc cacctacctg    420
aatgaccacc tagagccttg gatccaggac aacggcggct gggacacttt cgtggaactc    480
tacggaaaca atgcagcagc tgagagccgg aaaggccagg agcgcttcaa ccgctggttc    540
ctgacgggca tgactgtggc tggtgtggtt ctgctgggct ctctcttcag tcggaagtga    600
<210>8
<211>199
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>SEQ ID NO：4的缺失突变体(de146-83)
<400>8
Met Ser Gln Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys
1               5                   10                  15
Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Gln Phe Ser Asp Val Glu Glu
            20                  25                  30
Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser Glu Arg Ala Ala Ala
        35                  40                  45
Ala Ala Ala Val Lys Gln Ala Leu Arg Glu Ala Gly Asp Glu Phe Glu
    50                  55                  60
Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Phe Ser Asp Leu Thr Ser Gln Leu His Ile
65                  70                  75                  80
Thr Pro Gly Thr Ala Tyr Gln Ser Phe Glu Gln Val Val Asn Glu Leu
                85                  90                  95
Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Ser Phe
            100                 105                 110
Gly Gly Ala Leu Cys Val Glu Ser Val Asp Lys Glu Met Gln Val Leu
        115                 120                 125
Val Ser Arg Ile Ala Ser Trp Met Ala Thr Tyr Leu Asn Asp His Leu
    130                 135                 140
Glu Pro Trp Ile Gln Asp Asn Gly Gly Trp Asp Thr Phe Val Glu Leu
145                 150                 155                 160
Tyr Gly Asn Asn Ala Ala Ala Glu Ser Arg Lys Gly Gln Glu Arg Phe
                165                 170                 175
Asn Arg Trp Phe Leu Thr Gly Met Thr Val Ala Gly Val Val Leu Leu
            180                 185                 190
Gly Ser Leu Phe Ser Arg Lys
        195
<210>9
<211>660
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SEQ ID NO：3的缺失突变体(de166-83)
<400>9
atgtctcaga gcaaccggga gctagtggtt gactttctct cctacaagct ctcccagaaa     60
ggatacagct ggagtcagtt tagtgatgtc gaagagaaca ggactgaggc cccagaagga    120
actgaatcag agagggagac ccccagtgcc atcaatggca acccatcctg gcacctggcg    180
gacagccccg cggtagcggc cgcagcagca gccgtaaagc aagcgctgag agaggccggc    240
gatgagtttg agctgcggta ccggcgggcg ttcagtgatc taacatccca gcttcatata    300
accccaggga ctgcatatca aagctttgaa caggtagtga atgaactctt ccgggatggg    360
gtaaactggg gtcgcattgt ggcctttttc tccttcggtg gagccctctg tgtggaaagc    420
gtagacaagg agatgcaggt attggtgagt cggatcgcaa gttggatggc cacctacctg    480
aatgaccacc tagagccttg gatccaggac aacggcggct gggacacttt cgtggaactc    540
tacggaaaca atgcagcagc tgagagccgg aaaggccagg agcgcttcaa ccgctggttc    600
ctgacgggca tgactgtggc tggtgtggtt ctgctgggct ctctcttcag tcggaagtga    660
<210>10
<211>219
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>SEQ ID NO：4的缺失突变体(de166-83)
<400>10
Met Ser Gln Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys
1               5                   10                  15
Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Gln Phe Ser Asp Val Glu Glu
            20                  25                  30
Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser Glu Arg Glu Thr Pro
        35                  40                  45
Ser Ala Ile Asn Gly Asn Pro Ser Trp His Leu Ala Asp Ser Pro Ala
    50                  55                  60
Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Lys Gln Ala Leu Arg Glu Ala Gly
65                  70                  75                  80
Asp Glu Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Phe Ser Asp Leu Thr Ser
                85                  90                  95
Gln Leu His Ile Thr Pro Gly Thr Ala Tyr Gln Ser Phe Glu Gln Val
            100                 105                 110
Val Asn Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp Gly Arg Ile Val Ala
        115                 120                 125
Phe Phe Ser Phe Gly Gly Ala Leu Cys Val Glu Ser Val Asp Lys Glu
    130                 135                140
Met Gln Val Leu Val Ser Arg Ile Ala Ser Trp Met Ala Thr Tyr Leu
145                 150                 155                 160
Asn Asp His Leu Glu Pro Trp Ile Gln Asp Asn Gly Gly Trp Asp Thr
                165                 170                 175
Phe Val Glu Leu Tyr Gly Asn Asn Ala Ala Ala Glu Ser Arg Lys Gly
            180                 185                 190
Gln Glu Arg Phe Asn Arg Trp Phe Leu Thr Gly Met Thr Val Ala Gly
        195                 200                 205
Val Val Leu Leu Gly Ser Leu Phe Ser Arg Lys
    210                 215
<210>11
<211>660
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SEQ ID NO：3的缺失突变体(de146-63)
<400>11
atgtctcaga gcaaccggga gctagtggtt gactttctct cctacaagct ctcccagaaa     60
ggatacagct ggagtcagtt tagtgatgtc gaagagaaca ggactgaggc cccagaagga    120
actgaatcag agagggcggc cgcagcagcg gtaaatggag ccactggcca cagcagcagt    180
ttggatgcac gggaggtgat ccccatggca gccgtaaagc aagcgctgag agaggccggc    240
gatgagtttg agctgcggta ccggcgggcg ttcagtgatc taacatccca gcttcatata    300
accccaggga ctgcatatca aagctttgaa caggtagtga atgaactctt ccgggatggg    360
gtaaactggg gtcgcattgt ggcctttttc tccttcggtg gagccctctg tgtggaaagc    420
gtagacaagg agatgcaggt attggtgagt cggatcgcaa gttggatggc cacctacctg    480
aatgaccacc tagagccttg gatccaggac aacggcggct gggacacttt cgtggaactc    540
tacggaaaca atgcagcagc tgagagccgg aaaggccagg agcgcttcaa ccgctggttc    600
ctgacgggca tgactgtggc tggtgtggtt ctgctgggct ctctcttcag tcggaagtga    660
<210>12
<211>219
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>SEQ ID NO：4的缺失突变体(de126-83)
<400>12
Met Ser Gln Ser Asn Arg Glu Leu Val Val Asp Phe Leu Ser Tyr Lys
1               5                   10                  15
Leu Ser Gln Lys Gly Tyr Ser Trp Ser Gln Phe Ser Asp Val Glu Glu
            20                  25                  30
Asn Arg Thr Glu Ala Pro Glu Gly Thr Glu Ser Glu Arg Ala Ala Ala
        35                  40                  45
Ala Ala Val Asn Gly Ala Thr Gly His Ser Ser Ser Leu Asp Ala Arg
    50                  55                  60
Glu Val Ile Pro Met Ala Ala Val Lys Gln Ala Leu Arg Glu Ala Gly
65                  70                  75                  80
Asp Glu Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Phe Ser Asp Leu Thr Ser
                85                  90                  95
Gln Leu His Ile Thr Pro Gly Thr Ala Tyr Gln Ser Phe Glu Gln Val
            100                 105                 110
Val Asn Glu Leu Phe Arg Asp Gly Val Asn Trp Gly Arg Ile Val Ala
        115                 120                 125
Phe Phe Ser Phe Gly Gly Ala Leu Cys Val Glu Ser Val Asp Lys Glu
    130                 135                 140
Met Gln Val Leu Val Ser Arg Ile Ala Ser Trp Met Ala Thr Tyr Leu
145                 150                 155                 160
Asn Asp His Leu Glu Pro Trp Ile Gln Asp Asn Gly Gly Trp Asp Thr
                165                 170                 175
Phe Val Glu Leu Tyr Gly Asn Asn Ala Ala Ala Glu Ser Arg Lys Gly
            180                 185                 190
Gln Glu Arg Phe Asn Arg Trp Phe Leu Thr Gly Met Thr Val Ala Gly
        195                 200                 205
Val Val Leu Leu Gly Ser Leu Phe Ser Arg Lys
    210                 215
<210>13
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸(Bcl rev1)
<400>13
gccaccatgt ctcagagcaa accgggag                                         28
<210>14
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸(Bcl rev1)
<220>
<221>Y
<222>(4)..(4)
<223>Y指T或C
<220>
<221>Y
<222>(19)..(19)
<223>Y指T或C
<220>
<221>R
<222>(22)..(22)
<223>R指G或A
<400>14
tcayttccga ctgaagagyg arcc                                             24
<210>15
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸(Bcl rev5)
<400>15
catcactaaa ctgactccag ctg                                              23
<210>16
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸(Bcl rev6)
<400>16
tgactccagc tgtatccttt ctg                                              23
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸(Bcl for2)
<400>17
gacgggcatg actgtggctg                                                  20
<210>18
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸(Bcl for3)
<400>18
tgactgtggc tggtgtggtt ct                                               22
<210>19
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸(Eco-Bcl for)
<400>19
tccggaattc gccaccatgt ctcagagcaa ccgggag                               37
<210>20
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸(Xho-Bcl rev)
<400>20
tccgctcgag tcacttccga ctgaagagag agcc                                  34
<210>21
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸(de126)
<400>21
atagttatgc tgcggccgca ctccagctgt atcctttctg g                          41
<210>22
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸(de146)
<400>22
atagttatgc tgcggccgcc ctctctgatt cagttccttc tg                         42
<210>23
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸(de166)
<400>23
atagttatgc tgcggccgct accgcggggc tgtccgcc                              38
<210>24
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸(de163)
<400>24
aagtaagaag cggccgcagc agcggtaaat ggagccactg gc                         42
<210>25
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸(de183)
<400>25
aagtaagaag cggccgcagc agcagccgta aagcaagcgc tg                         42

Claims (64)

1.一种藉导入编码抗-细胞凋亡基因、选择用的可扩增的标记基因与至少一种目的基因的核酸序列以遗传修饰的仓鼠宿主细胞。
2.根据权利要求1的宿主细胞，其中所述宿主细胞为中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或幼仓鼠肾脏(BHK)细胞。
3.根据权利要求1或2的宿主细胞，其中所述宿主细胞为CHO-DG44、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1、CHO Pro-5、V79、B14AF28-G3、BHK-21、BHK TK-、HaK或BHK-21(2254-62.2)细胞，或任何此类细胞株的子代。
4.一种藉导入编码抗-细胞凋亡基因、选择用的可扩增的标记基因与至少一种目的基因的核酸序列以遗传修饰的小鼠骨髓瘤细胞。
5.根据权利要求4的宿主细胞，其中所述宿主细胞为NS0或SP2/0-Ag14细胞，或任何此类细胞株的子代。
6.根据权利要求1至5中任一项的宿主细胞，其中所述抗-细胞凋亡基因编码可起细胞死亡抑制物作用的Bcl-2超家庭的成员。
7.根据权利要求1至6中任一项的宿主细胞，其中所述抗-细胞凋亡基因编码BCL-xL、BCL-2、BCL-w、BFL-1、Al、MCL-1、BOO、BRAG-1、NR-13、CDN-1、CDN-2、CDN-3、BHRF-1、LMW5-HL或CED-9。
8.根据权利要求1至6中任一项的宿主细胞，其中所述抗-细胞凋亡基因编码BCL-xL或BCL-2。
9.根据权利要求1至7中任一项的宿主细胞，其中所述抗-细胞凋亡基因具有SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：7，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11，或其任何生物活性片段，变体或衍生物的序列。
10.根据权利要求1至7中任一项的宿主细胞，其编码BCL-xL。
11.根据权利要求1至7中任一项的宿主细胞，其中所述抗-细胞凋亡基因具有SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：11，或其任何生物活性片段，变体或衍生物的序列。
12.根据权利要求1至9中任一项的宿主细胞，其中所述选择用的可扩增的标记基因编码二氢叶酸还原酶(DHFR)、谷氨酰胺合成酶、CAD、腺苷脱氨酶、腺苷酸脱氨酶、UMP合成酶、IMP 5′-脱氢酶、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、HGPRT酶、胸苷激酶、胸苷酸合成酶、P糖蛋白170、核糖核苷酸还原酶、天冬酰胺合成酶、精氨基琥珀酸合成酶、鸟氨酸脱羧酶、HMG CoA还原酶、乙酰葡萄糖胺转移酶、苏氨酸-tRNA合成酶或Na+K+-ATP酶。
13.根据权利要求1至12中任一项的宿主细胞，其中所述抗-细胞凋亡基因编码BCL-xL，而该选择用的可扩增的标记基因编码DHFR、谷氨酰胺合成酶、CAD、腺苷脱氨酶、腺苷酸脱氨酶、UMP合成酶、IMP 5′-脱氢酶、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、HGPRT酶、胸苷激酶、胸苷酸合成酶、P糖蛋白170、核糖核苷酸还原酶、天冬酰胺合成酶、精氨基琥珀酸合成酶、鸟氨酸脱羧酶、HMG CoA还原酶、乙酰葡萄糖胺转移酶、苏氨酸-tRNA合成酶或Na+K+-ATPP酶。
14.根据权利要求1至12中任一项的宿主细胞，其中所述抗-细胞凋亡基因编码BCL-xL而该选择用的可扩增的标记基因编码DHFR。
15.根据权利要求1至14中任一项的宿主细胞，其中所述抗-细胞凋亡基因、该选择用的可扩增的标记基因与目的基因在可操作地连接于至少一种允许所述基因表达的调控序列。
16.一种在哺乳动物宿主细胞表达编码抗-细胞凋亡基因、选择用的可扩增的标记基因与至少一种目的基因的方法，其包括：
(a)将编码抗-细胞凋亡基因、选择用的可扩增的标记基因与目的基因的核酸序列导入仓鼠宿主细胞群，其中所述基因可操作地连接于至少一种允许该基因表达的调控序列，
(b)将该宿主细胞群于可表达该基因的条件下培养。
17.一种产生显示增强表达量的抗-细胞凋亡基因的哺乳动物宿主细胞的方法，其包括：
(a)将编码抗-细胞凋亡基因、选择用的可扩增的标记基因与视情形的至少一种目的基因的核酸序列导入哺乳动物宿主细胞群，其中所述基因可操作地连接于至少一种允许该基因表达的调控序列，
(b)将该细胞群于至少可表达该选择用的可扩增的标记基因和该抗-细胞凋亡基因，且是有利于获得至少该抗-细胞凋亡基因的多拷贝数的条件下培养，
(c)从所述细胞群中选取至少掺入了多拷贝数的抗-细胞凋亡基因的细胞。
18.根据权利要求17的方法，其中所述目的基因被导入哺乳动物宿主细胞群中。
19.根据权利要求16至18中任一项的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞是小鼠骨髓瘤细胞或仓鼠细胞。
20.根据权利要求19的方法，其中所述仓鼠细胞为中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或幼仓鼠肾脏(BHK)细胞。
21.根据权利要求16至18中任一项的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞为NS0或SP2/0-Ag14细胞。
22.根据权利要求15至19中任一项的方法，其中所述抗-细胞凋亡基因编码BCL-xL、BCL-2、BCL-w、BFL-1、Al、MCL-1、BOO、BRAG-1、NR-13、CDN-1、CDN-2、CDN-3、BHRF-1、LMW5-HL或CED-9。
23.根据权利要求16至22中任一项的方法，其中所述抗-细胞凋亡基因编码BCL-xL或BCL-2。
24.根据权利要求16至22中任一项的方法，其中所述抗-细胞凋亡基因具有SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：7.SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11，或其任何生物活性片段，变体或突变体(简并和非简并性)的序列。
25.根据权利要求16至22中任一项的方法，其中所述抗-细胞凋亡基因编码BCL-xL。
26.根据权利要求16至22中任一项的方法，其中该抗-细胞凋亡基因具有SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11，或其任何生物活性片断，变体或突变体(简并和非简并性)的序列。
27.根据权利要求16至26中任一项的方法，其中所述选择用的可扩增的标记基因编码二氢叶酸还原酶(DHFR)、谷氨酰胺合成酶、CAD、腺苷脱氨酶、腺苷酸脱氨酶、UMP合成酶、IMP 5′-脱氢酶、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、HGPRT酶、胸苷激酶、胸苷酸合成酶、P糖蛋白170、核糖核苷酸还原酶、天冬酰胺合成酶、精氨基琥珀酸合成酶、鸟氨酸脱羧酶、HMGCoA还原酶、乙酰葡萄糖胺转移酶、苏氨酸-tRNA合成酶或Na+K+-ATP酶。
28.根据权利要求16至21中任一项的方法，其中所述抗-细胞凋亡基因编码BCL-xL而该选择用的可扩增的标记基因编码DHFR。
29.一种产生哺乳动物宿主细胞的方法，其包括：
(a)将抗-细胞凋亡基因与DHFR基因导入哺乳动物细胞群，
(b)在氨甲喋呤存在的条件下扩增该抗-细胞凋亡基因。
30.根据权利要求29的方法，其中所述抗-细胞凋亡基因编码BCL-2或BCL-xL。
31.根据权利要求29的方法，其中所述抗-细胞凋亡基因编码BCL-xL。
32.根据权利要求29-31的方法，其中所述宿主细胞为小鼠骨髓瘤细胞或仓鼠细胞。
33.根据权利要求29-31的方法，其中所述仓鼠细胞为中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或幼仓鼠肾脏(BHK)细胞。
34.一种根据权利要求16-33中任一项的方法获得的宿主细胞。
35.一种抑制或延迟宿主细胞的细胞死亡的方法，其包括将根据权利要求1-15或34中任一项的宿主细胞于至少表达抗-细胞凋亡基因，因而抑制或延迟该宿主细胞的细胞死亡的条件下培养。
36.根据权利要求35的方法，其中所述细胞死亡是由程序性细胞死亡所造成的。
37.根据权利要求35的方法，其中所述细胞死亡是由细胞凋亡所造成的。
38.根据权利要求16-33或35-37中任一项的方法，其中所述细胞被培养在无血清和/或无蛋白质的培养液中。
39.一种在宿主细胞中生产目的蛋白质的方法，其包括：
(a)将根据权利要求1-15或34中任一项的细胞在有利表达抗-细胞凋亡基因与目的基因的条件下培养，
(b)从细胞和/或细胞培养上清液中分离目的蛋白。
40.一种根据权利要求1-15或34中任一项的细胞生产至少一种由目的基因所编码的蛋白质的用途。
41.一种至少包含5个拷贝数的异源抗-细胞凋亡基因的宿主细胞。
42.一种至少包含10个拷贝数的异源抗-细胞凋亡基因的宿主细胞。
43.一种至少包含20个拷贝数的异源抗-细胞凋亡基因的宿主细胞。
44.一种至少包含50个拷贝数的异源抗-细胞凋亡基因的宿主细胞。
45.一种至少包含100个拷贝数的异源抗-细胞凋亡基因的宿主细胞。
46.根据权利要求37-41中任一项的宿主细胞，其中所述抗-细胞凋亡基因编码BCL-xL、BCL-2、BCL-w、BFL-1、Al、MCL-1、BOO、BRAG-1、NR-13、CDN-1、CDN-2、CDN-3、BHRF-1、LMW5-HL或CED-9。
47.根据权利要求41-45中任一项的宿主细胞，其中所述抗-细胞凋亡基因为BCL-xL或BCL-2。
48.根据权利要求41-45中任一项的宿主细胞，其中所述抗-细胞凋亡基因具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：7，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11，或其任何生物活性片段，变体或突变体(简并和非简并性)的序列。
49.根据权利要求41-45中任一项的宿主细胞，其中所述抗-细胞凋亡基因为BCL-xL。
50.根据权利要求41-49中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞为小鼠骨髓瘤细胞或仓鼠细胞。
51.根据权利要求41-49中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞为中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或幼仓鼠肾脏(BHK)细胞。
52.根据权利要求50的宿主细胞，其中所述小鼠骨髓瘤细胞为NS0或SP2/0-Ag14细胞，或任何此类细胞株的子代。
53.根据权利要求41-49中任一项的宿主细胞，其中该宿主细胞为CHO-DG44、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1、CHO Pro-5、V79、B14AF28-G3、BHK-21、BHK TK-、HaK、BHK-21(2254-62.2)，或任何此类细胞株的子代。
54.根据权利要求41-53中任一项的宿主细胞，其进一步包含至少一种异源的目的基因。
55.根据权利要求1-15或34中任一项的宿主细胞，其至少包含5个拷贝数的异源的抗-细胞凋亡基因。
56.根据权利要求1-15或34中任一项的宿主细胞，其至少包含10个拷贝数的异源的抗-细胞凋亡基因。
57.根据权利要求1-15或34中任一项的宿主细胞，其至少包含20个拷贝数的异源的抗-细胞凋亡基因。
58.根据权利要求1-15或34中任一项的宿主细胞，其至少包含50个拷贝数的异源的抗-细胞凋亡基因。
59.根据权利要求1-15或34中任一项的宿主细胞，其至少包含100个拷贝数的异源的抗-细胞凋亡基因。
60.一种DNA，包含编码生物活性bcl-xL基因的核酸序列，其中该核酸是：
(a)具有SEQ ID NO：3或其互补链的序列的核酸；
(b)(a)中定义的核酸序列的功能片段，(简并和非简并性的)变体或突变体；
(c)与(a)中定义的核酸序列具有至少95％的同源性的核酸；或
(d)与(a)，(b)，或(c)中定义的任何核酸序列在严格条件下杂交的核酸。
61.一种DNA，包含编码生物活性bcl-xL基因的核酸序列，其中所述核酸是：
(a)具有SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11或其中任一互补链的序列的核酸；
(b)(a)中定义的任何核酸序列的(简并和非简并性)功能变体或突变体；
(c)与(a)中定义的任何核酸序列具有至少95％的同源性的核酸；或
(d)与(a)，(b)，或(c)中定义的任何核酸序列在严格条件下杂交的核酸。
62.一种DNA，包含编码生物活性bcl-xL基因的核酸序列，所述bcl-xL基因具有SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9或SEQ IDNO：11的序列。
63.根据权利要求60-62中任一项的DNA编码的多肽。
64.包含根据权利要求60-62中任一项的DNA的宿主细胞。
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