CN1255186C - 人端粒酶反转录酶样组分的基因突变体的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人端粒酶反转录酶样组分的基因突变体的新用途，即其在制备治疗肝癌的药物中的应用。该基因突变体的基因顺序包括在端粒酶反转录酶样组分各保守结构域的各种可能的突变顺序，该基因突变体的载体为真核表达质粒或核酸病毒，其作为药物的给药方式为静脉注射或肌肉注射。
Description
技术领域
本发明涉及一种人端粒酶反转录酶样组分的基因突变体的新用途，特别涉及其在制备治疗肝癌的药物中的应用。
背景技术
端粒(telomere)是存在于真核生物线性染色体末端的由串联重复的DNA序列及其相关蛋白所组成的结构，由于能防止染色体的端-端融合、重组和降解，故具有稳定染色体的作用。如所周知，参与真核生物线性DNA复制的DNA聚合酶并不能使染色体DNA完全复制，因而染色体末端的端粒序列在不断分裂的过程中逐渐缩短。当人染色体的末端，又称末端限制片断TRF(terminal restriction fragments)，缩短到5-7Kbp时，细胞就会发生衰老(Harley CB et al.Cancer Surveys 1997 29：263-84)，因此，端粒的长度和细胞寿命的控制相关。
端粒酶是一种由蛋白质和RNA构成的核糖核蛋白体。在绝大多数的真核生物中，端粒的长度都是通过端粒酶(telomerase)维持的。正常体细胞中，除生殖细胞、骨髓造血干细胞及外周淋巴细胞等少数细胞外，一般没有端粒酶的活性，染色体末端的端粒序列便会不断缩短。由于肿瘤细胞是永生性的细胞，不会衰老，而85％的肿瘤细胞都具有端粒酶的表达(Shay JW et al.Eur J Cancer 1997 33：787-91)，因此，端粒酶的活性与表达程度和肿瘤的发生、恶性及转归间的关系便成为近年来生物学和基础医学共同关注的热点。端粒酶的激活可能是肿瘤发生的早期事件(Cheng RYS et al.Br J Cancer1998 77：456-60)。
端粒酶的有关蛋白组分中，有一部分被称之为端粒酶反转录酶样结构(hTERT)的组分，目前引起了学界的关注，hTERT的编码基因具有七个反转录酶保守结构域和一个端粒酶特异的保守结构域，其表达调控是多水平的，涉及转录、转录后mRNA剪切和蛋白磷酸化等，其中主要的调控方式是转录水平调控(Liu JP.FASEB J 1999 13：2091-104)。对hTERT基因启动子区的分析表明，其启动区存在转录因子MYC和Sp1的结合位点，核心调控区由59bp组成，位于-280到-150(Horikawa I，et al.Cancer Res 199959：826-30、Kyo S，et al.Nucleic Acids Res 2000 28：669-77)。
人类端粒酶催化亚单位或端粒酶反转录酶样组分(hTERT，humantelomerase reverse transcriptase subunit)是人类端粒酶的重要组分，有活性的端粒酶反转录酶样组分可以说是绝大部分恶性肿瘤共同的“标志蛋白”，这种蛋白只在恶性肿瘤细胞中表达，在正常细胞中则没有表达，其表达水平与肿瘤细胞的端粒酶活性水平呈正相关。如果研制成一种人类端粒酶催化亚单位或端粒酶反转录酶样组分的基因突变体，就有可能通过竞争抑制去抑制端粒酶的活性，阻断肿瘤细胞的有丝分裂，从而达到控制肿瘤生长的目的。
考虑到hTERT蛋白相对于肿瘤细胞的特异性，启发我们打算用hTERT基因的点突变体(DN-hTERT)去抑制人肝癌细胞的异常分裂，从而有可能将这种点突变的基因通过载体注入患者体内进行基因治疗，达到控制肝癌的目的。根据文献报道，应用PCR定点突变的方法，将端粒酶反转录酶样组分的第三个保守的反转录结构域中710和711位的编码天冬氨酸和缬氨酸残基的序列替换为编码丙氨酸和异亮氨酸的序列，从而构建了端粒酶反转录酶组分的功能域突变体(dominant negative form of hTERT，DN-hTERT)，其基因序列见序列表中的<210>1(Counter CM，et al.Proc Natl Acad Sci USA 199895：14723-8、Hahn WC，et al.Nat Med 1999 5：1164-70)，已有文献报道该功能域突变体在卵巢癌细胞(36M)、乳腺癌细胞(SW613和SKBR3)和结肠癌细胞LoVo中可以有效抑制上述各种癌细胞的端粒酶活性进而使之发生凋亡(Hahn WC，et al.Nat Med 19995：1164-70)，但该功能域突变体对有“癌中之王”之称的肝癌的端粒酶活性及其恶性行为的影响在国际上却无报道。
根据Medline的检索，目前并无任何有关采用人端粒酶反转录酶样组分的基因突变体进行临床治疗肝癌的研究的报道。查到有关telomerase和catalytic and mutant的文献18篇，其中涉及肝癌的研究为0篇。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人端粒酶反转录酶样组分的基因突变体的新用途，特别是其在制备治疗肝癌的药物中的应用。该基因突变体的基因顺序包括在端粒酶反转录酶样组分各保守结构域的各种可能的突变顺序；该基因突变体的突变方式是点突变；该基因突变体的基因序列为<210>1中所述序列；该基因突变体的载体为真核表达质粒或核酸病毒；该核酸病毒为反转录病毒或腺病毒；所述药物的给药方式为静脉注射或肌肉注射。
在BEL-7404人肝癌细胞中表达端粒酶反转录酶组分的功能域突变体后，由于该突变体可以与野生型的端粒酶反转录样组分发生竞争，因而可以有效抑制其端粒酶活性，表达DN-hTERT的BEL-7404人肝癌细胞的端粒长度随着细胞分裂的进行逐渐缩短，而表达野生型的反转录酶组分(wild typehTERT，WT-hTERT)和空白载体对照的细胞则没有这样的变化；DN-hTERT表达细胞的生长受到抑制，抑制程度与端粒酶活性的抑制水平相关，但WT-hTERT表达细胞的生长与对照细胞相比则几乎没有变化；DN-hTERT表达细胞在细胞传代培养的后期，细胞膨胀变大；当DN-hTERT表达细胞的端粒长度达到极限短时(大约1.7Kb)，细胞发生凋亡；裸鼠成瘤性实验结果显示，DN-hTERT表达细胞的裸鼠成瘤性消失。上述结果表明，端粒酶的反转录酶组分对肝癌细胞的生长是必需的，是肝癌基因治疗和抗肝癌药物筛选的理想靶点。
我们又将端粒酶的反转录酶组分的基因点突变体对载人肝癌的裸鼠模型进行了实验治疗，结果令人满意。并在实验动物中证明了端粒酶反转录酶组分的功能域突变体能够使人肝癌细胞的成瘤性消失。上述结果表明通过基因点突变构建的端粒酶的反转录酶组分的功能域突变体作为一种治疗人类肝细胞肝癌的新药是完全值得的。
附图说明
图1表示出外源的hTERT基因(DN-hTERT或WT-hTERT)对BEL-7404人肝癌细胞端粒酶活性的影响。
其中：
1-裂解液阴性对照 2-BEL-7404母细胞对照
3-Vector对照 4-WT-hTERT表达克隆2
5-WT-hTERT表达克隆3 6-WT-hTERT表达克隆8
7-DN-hTERT表达克隆1 8-DN-hTERT表达克隆3
9-DN-hTERT表达克隆4 10-DN-hTERT表达克隆8
图2表示出外源的hTERT基因(DN-hTERT或WT-hTERT)对BEL-7404人肝癌细胞端粒长度的影响。
其中：
1，7-Marker 2，8-Bel-7404母细胞
3-Vector对照 4-WT-hTERT表达克隆3，PD 10
5-DN-hTERT表达克隆3，PD 7 6-DN-hTERT表达克隆1，PD 10
9-WT-hTERT表达克隆2，PD 5 10-WT-hTERT表达克隆2，PD 10
11-WT-hTERT表达克隆2，PD 15 12-DN-hTERT表达克隆4，PD 1
13-DN-hTERT表达克隆4，PD 8 14-DN-hTERT表达克隆4，PD 15
图3表示出外源的hTERT(DN-hTERT或WT-hTERT)基因表达对BEL-7404人肝癌细胞生长的影响。
其中：除了DN-hTERT表达克隆3，在PD 5外，所有实验细胞均处于PD6。实验结果显示为：平均值±标准误，每组实验数值均来自3个复孔。
图4表示出外源DN-hTERT基因表达诱导的BEL-7404人肝癌细胞的形态变化。
其中：
A-表达DN-hTERT基因的BEL-7404人肝癌细胞；
B-表达WT-hTERT基因的BEL-7404人肝癌细胞；
C-BEL-7404人肝癌细胞；
D-表达空白载体对照的BEL-7404人肝癌细胞。
图5表示出外源DN-hTERT基因表达诱导的BEL-7404人肝癌细胞超微形态的变化。
其中：
A-表达WT-hTERT基因的BEL-7404人肝癌细胞；
B-表达空白载体对照的BEL-7404人肝癌细胞；
C-达DN-hTERT基因的BEL-7404人肝癌细胞。
图6A、6B、6C表示出流式细胞仪检测DN-hTERT表达克隆3，PD 7；WT-hTERT表达克隆3，PD 10和空白载体表达克隆，PD 10的细胞凋亡结果。
图7表示出TUNEL检测细胞凋亡的结果。
其中：
A-DN-hTERT表达克隆细胞 B-WT-hTERT表达克隆细胞
C-表达空白载体对照的细胞 D-阴性对照
E-阳性对照
图8表示出外源的hTERT(DN-hTERT或WT-hTERT)基因表达对BEL-7404人肝癌细胞裸鼠成瘤性的影响。
其中：
A-BEL-7404人肝癌母细胞
B-表达空白载体对照克隆细胞
C-表达WT-hTERT外源基因克隆3
D-表达WT-hTERT外源基因克隆8
E-表达DN-hTERT外源基因克隆1
F-表达DN-hTERT外源基因克隆3
具体实施方式
实施例1
在BEL-7404人肝癌细胞中表达端粒酶反转录酶组分的功能域突变体(dominant negative form of hTERT，DN-hTERT)可以有效抑制其端粒酶活性。
经过脂质体转染，筛选和鉴定后，以非放射性端粒酶活性定量测定方法检测端粒酶活性，该方法包括含端粒酶的细胞抽提液的制备、端粒酶介导的延伸反应、PCR扩增和染色拍照等步骤(Zhang RG，et al.Cell Res，200010：71-7)。我们观察了外源的hTERT基因(DN-hTERT或WT-hTERT)对BEL-7404人肝癌细胞端粒酶活性的影响，以裂解液为阴性对照，以BEL-7404细胞为母细胞对照，以pCMV-script质粒为Vector对照，发现所有的WT-hTERT表达克隆的端粒酶活性均有所活跃，所有的DN-hTERT表达克隆的端粒酶均有所抑制，其抑制程度同DN-hTERT的表达强度相平行(见图1)。
实施例2
表达DN-hTERT的BEL-7404人肝癌细胞的端粒长度随着细胞分裂的进行逐渐缩短，而表达野生型的反转录酶组分(wild type hTERT，WT-hTERT)和空白载体对照的细胞则没有这样的变化；
以Southerblot方法应用Roche公司试剂盒，该方法有以下一些步骤：细胞基因组DNA的抽提、Rsa I/HinfI酶切、与标记的端粒特异探针杂交和端粒长度计算(Ulaner GA，et al.Int J Cancer 2001 91：644-9)。我们观察了外源的hTERT基因(DN-hTERT或WT-hTERT)对BEL-7404人肝癌细胞端粒长度的影响，以Roche公司的DNA Marker(以Kilo base pair为单位)为标志值，以Bel-7404细胞为母细胞对照，以pCMV-script质粒为Vector对照，发现所有WT-hTERT的、包括连续传代后的表达克隆，其端粒DNA长度与对照细胞均相似，而DN-hTERT表达克隆则随着细胞的传代，其端粒DNA长度逐渐缩短(见图2)。
实施例3
DN-hTERT表达细胞的生长受到抑制，抑制程度与端粒酶活性的抑制水平相关，但WT-hTERT表达细胞的生长与对照细胞相比则几乎没有变化。
以台盼蓝拒染法测定端粒酶反转录样组分的功能域突变体对细胞生长的影响，将细胞按3×104个细胞/孔，接种到96孔板中培养。每12小时收集细胞进行计数，连续观察96小时。计数时，将细胞悬液与等体积的0.4％台盼蓝混合。活细胞的细胞膜完整，透明不着色，而着色的细胞均为死细胞计数时不予计算。实验中，以转染有pCMV-script Vector和表达WT-hTERT的BEL-7404人肝癌细胞为对照，我们观察了表达DN-hTERT的BEL-7404细胞的生长情况同端粒酶活性间的相关性，发现表达WT-hTERT细胞的生长情况与转染有pCMV-script Vector的对照细胞相似，但表达DN-hTERT的BEL-7404细胞的生长明显受到抑制(见图3)。
实施例4
DN-hTERT表达细胞在细胞传代培养的后期，细胞膨胀变大；当DN-hTERT表达细胞的端粒长度达到极限短时，细胞发生凋亡。
我们以BEL-7404人肝癌母细胞、转染有pCMV-script Vector和表达WT-hTERT的BEL-7404人肝癌细胞为对照，发现当DN-hTERT表达细胞在细胞传代培养的后期，细胞膨胀变大。以电子显微镜观察细胞核形态、TUNEL原位细胞凋亡检测和流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。其中TUNEL原位细胞凋亡检测方法为，在盖玻片上培养的细胞空气干燥，4％多聚甲醛室温固定1h，PBS洗片并用含3％H2O2的甲醛作用10min终止固定，PBS洗片并用含0.1％ Triton X-100的0.1％柠檬酸钠冰上浸浴渗透2min，PBS洗片两次并加TUNEL反应混合物50μl，37℃孵育1h，PBS洗片三次并加Conver-POD试剂50μl，37℃孵育30min，荧光显微镜下观察拍照。以不含末端转移酶的标记试剂代替TUNEL反应混合物孵育渗透后的细胞作为阴性对照。以50μg/ml的DNase I室温作用渗透后的细胞10min诱导DNA断裂作为阳性对照；流式细胞仪检测细胞凋亡的方法为细胞收集后用D-Hanks洗涤一次，柠檬酸固定液(40mmol/L sodium citrate，250mmol/L sucrose，5％DMSO)固定后置4℃保存，测定时PI染色(50mg/L RNase A，20mg/L PI)，流式细胞仪(Becton-Dickson公司产品)检测细胞凋亡率(Kang JX，et al.Cell Growth& Differ 1999 10：591-600、Andreassen PR，et al.J Cell Biol 1994 127：789-802)。结果发现，当端粒长度达到1.7Kb时，细胞发生凋亡(见图4-7)。
实施例5
裸鼠成瘤性实验结果显示，DN-hTERT表达细胞的裸鼠成瘤性消失(HahnWC，et al.Nature 1999 400：464-8)。
将雌性Balb/c裸鼠随机分为6组，每组5鼠，按2×106个细胞/鼠将不同处理方式的BEL-7404人肝癌细胞接种于裸鼠的右侧腋下，在无病原体的条件下饲养，接种五周后处死裸鼠观察接种细胞的成瘤情况。我们发现母细胞组(Parental cells)、空载体对照组(Vector control)、表达端粒酶反转录酶样组分的2个观察组(WT-hTERT)均100％成瘤，而表达端粒酶反转录酶样组分突变体(DN-hTERT)的2个观察组则100％不形成肿瘤(见表1和图8)
表1 外源的hTERT(DN-hTERT或WT-hTERT)基因表达对BEL-7404人肝癌细胞裸鼠成瘤性的影响
| 倍增代数 | 成瘤鼠数/注射鼠数 | 端粒长度 | |
| 母细胞载体对照WT-hTERT表达克隆3WT-hTERT表达克隆8DN-hTERT表达克隆1DN-hTERT表达克隆3 | /101010107 | 5/55/55/55/50/50/5 | 4.14.14.1未检测3.21.7 |
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院上海细胞生物学研究所
<120>人端粒酶反转录酶样组分的基因突变体的新用途
<130>1
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>3399
<212>DNA
<213>human
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(3399)
<223>
<400>1
atg ccg cgc gct ccc cgc tgc cga gcc gtg cgc tcc ctg ctg cgc agc
48
Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser
1 5 10 15
cac tac cgc gag gtg ctg ccg ctg gcc acg ttc gtg cgg cgc ctg ggg
96
His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly
20 25 30
ccc cag ggc tgg cgg ctg gtg cag cgc ggg gac ccg gcg gct ttc cgc
144
Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg
35 40 45
gcg ctg gtg gcc cag tgc ctg gtg tgc gtg ccc tgg gac gca cgg ccg
192
Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro
50 55 60
ccc ccc gcc gcc ccc tcc ttc cgc cag gtg tcc tgc ctg aag gag ctg
240
Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu
65 70 75 80
gtg gcc cga gtg ctg cag agg ctg tgc gag cgc ggc gcg aag aac gtg
288
Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val
85 90 95
ctg gcc ttc ggc ttc gcg ctg ctg gac ggg gcc cgc ggg ggc ccc ccc
336
Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro
100 105 110
gag gcc ttc acc acc agc gtg cgc agc tac ctg ccc aac acg gtg acc
384
Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr
115 120 125
gac gca ctg cgg ggg agc ggg gcg tgg ggg ctg ctg ttg cgc cgc gtg
432
Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val
130 135 140
ggc gac gac gtg ctg gtt cac ctg ctg gca cgc tgc gcg ctc ttt gtg
480
Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val
145 150 155 160
ctg gtg gct ccc agc tgc gcc tac cag gtg tgc ggg ccg ccg ctg tac
528
Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr
165 170 175
cag ctc ggc gct gcc act cag gcc cgg ccc ccg cca cac gct agt gga
576
Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly
180 185 190
ccc cga agg cgt ctg gga tgc gaa cgg gcc tgg aac cat agc gtc agg
624
Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg
195 200 205
gag gcc ggg gtc ccc ctg ggc ctg cca gcc ccg ggt gcg agg agg cgc
672
Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg
210 215 220
ggg ggc agt gcc agc cga agt ctg ccg ttg ccc aag agg ccc agg cgt
720
Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg
225 230 235 240
ggc gct gcc cct gag ccg gag cgg acg ccc gtt ggg cag ggg tcc tgg
768
Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp
245 250 255
gcc cac ccg ggc agg acg cgt gga ccg agt gac cgt ggt ttc tgt gtg
816
Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val
260 265 270
gtg tca cct gcc aga ccc gcc gaa gaa gcc acc tct ttg gag ggt gcg
864
Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala
275 280 285
ctc tct ggc acg cgc cac tcc cac cca tcc gtg ggc cgc cag cac cac
912
Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His
290 295 300
gcg ggc ccc cca tcc aca tcg cgg cca cca cgt ccc tgg gac acg cct
960
Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro
305 310 315 320
tgt ccc ccg gtg tac gcc gag acc aag cac ttc ctc tac tcc tca ggc
1008
Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly
325 330 335
gac aag gag cag ctg cgg ccc tcc ttc cta ctc agc tct ctg agg ccc
1056
Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro
340 345 350
agc ctg act ggc gct cgg agg ctc gtg gag acc atc ttt ctg ggt tcc
1104
Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser
355 360 365
agg ccc tgg atg cca ggg act ccc cgc agg ttg ccc cgc ctg ccc cag
1152
Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln
370 375 380
cgc tac tgg caa atg cgg ccc ctg ttt ctg gag ctg ctt ggg aac cac
1200
Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His
385 390 395 400
gcg cag tgc ccc tac ggg gtg ctc ctc aag acg cac tgc ccg ctg cga
1248
Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg
405 410 415
gct gcg gtc acc cca gca gcc ggt gtc tgt gcc cgg gag aag ccc cag
1296
Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Giy Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln
420 425 430
ggc tct gtg gcg gcc ccc gag gag gag gac aca gac ccc cgt cgc ctg
1344
Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu
435 440 445
gtg cag ctg ctc cgc cag cac agc agc ccc tgg cag gtg tac ggc ttc
1392
Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe
450 455 460
gtg cgg gcc tgc ctg cgc cgg ctg gtg ccc cca ggc ctc tgg ggc tcc
1440
Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser
465 470 475 480
agg cac aac gaa cgc cgc ttc ctc agg aac acc aag aag ttc atc tcc
1488
Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser
485 490 495
ctg ggg aag cat gcc aag ctc tcg ctg cag gag ctg acg tgg aag atg
1536
Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met
500 505 510
agc gtg cgg ggc tgc gct tgg ctg cgc agg agc cca ggg gtt ggc tgt
1584
Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys
515 520 525
gtt ccg gcc gca gag cac cgt ctg cgt gag gag atc ctg gcc aag ttc
1632
Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe
530 535 540
ctg cac tgg ctg atg agt gtg tac gtc gtc gag ctg ctc agg tct ttc
1680
Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe
545 550 555 560
ttt tat gtc acg gag acc acg ttt caa aag aac agg ctc ttt ttc tac
1728
Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr
565 570 575
cgg aag agt gtc tgg agc aag ttg caa agc att gga atc aga cag cac
1776
Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His
580 585 590
ttg aag agg gtg cag ctg cgg gag ctg tcg gaa gca gag gtc agg cag
1824
Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln
595 600 605
cat cgg gaa gcc agg ccc gcc ctg ctg acg tcc aga ctc cgc ttc atc
1872
His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile
610 615 620
ccc aag cct gac ggg ctg cgg ccg att gtg aac atg gac tac gtc gtg
1920
Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val
625 630 635 640
gga gcc aga acg ttc cgc aga gaa aag agg gcc gag cgt ctc acc tcg
1968
Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser
645 650 655
agg gtg aag gca ctg ttc agc gtg ctc aac tac gag cgg gcg cgg cgc
2016
Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg
660 665 670
ccc ggc ctc ctg ggc gcc tct gtg ctg ggc ctg gac gat atc cac agg
2064
Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg
675 680 685
gcc tgg cgc acc ttc gtg ctg cgt gtg cgg gcc cag gac ccg ccg cct
2112
Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro
690 695 700
gag ctg tac ttt gtc aag gtg gct atc acg ggc gcg tac gac acc atc
2160
Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Ala Ile Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile
705 710 715
ccc cag gac agg ctc acg gag gtc atc gcc agc atc atc aaa ccc cag
2208
Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln
725 730 735
aac acg tac tgc gtg cgt cgg tat gcc gtg gtc cag aag gcc gcc cat
2256
Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His
740 745 750
ggg cac gtc cgc aag gcc ttc aag agc cac gtc tct acc ttg aca gac
2304
Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp
755 760 765
ctc cag ccg tac atg cga cag ttc gtg gct cac ctg cag gag acc agc
2352
Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser
770 775 780
ccg ctg agg gat gcc gtc gtc atc gag cag agc tcc tcc ctg aat gag
2400
Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu
785 790 795 800
gcc agc agt ggc ctc ttc gac gtc ttc cta cgc ttc atg tgc cac cac
2448
Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His
805 810 815
gcc gtg cgc atc agg ggc aag tcc tac gtc cag tgc cag ggg atc ccg
2496
Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro
820 825 830
cag ggc tcc atc ctc tcc acg ctg ctc tgc agc ctg tgc tac ggc gac
2544
Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp
835 840 845
atg gag aac aag ctg ttt gcg ggg att cgg cgg gac ggg ctg ctc ctg
2592
Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu
850 855 860
cgt ttg gtg gat gat ttc ttg ttg gtg aca cct cac ctc acc cac gcg
2640
Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala
865 870 875 880
aaa acc ttc ctc agg acc ctg gtc cga ggt gtc cct gag tat ggc tgc
2688
Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys
885 890 895
gtg gtg aac ttg cgg aag aca gtg gtg aac ttc cct gta gaa gac gag
2736
Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu
900 905 910
gcc ctg ggt ggc acg gct ttt gtt cag atg ccg gcc cac ggc cta ttc
2784
Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe
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ccc tgg tgc ggc ctg ctg ctg gat acc cgg acc ctg gag gtg cag agc
2832
Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser
930 935 940
gac tac tcc agc tat gcc cgg acc tcc atc aga gcc agt ctc acc ttc
2880
Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe
945 950 955 960
aac cgc ggc ttc aag gct ggg agg aac atg cgt cgc aaa ctc ttt ggg
2928
Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly
965 970 975
gtc ttg cgg ctg aag tgt cac agc ctg ttt ctg gat ttg cag gtg aac
2976
Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn
980 985 990
agc ctc cag acg gtg tgc acc aac atc tac aag atc ctc ctg ctg cag
3024
Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln
995 1000 1005
gcg tac agg ttt cac gca tgt gtg ctg cag ctc cca ttt cat cag
3069
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1010 1015 1020
caa gtt tgg aag aac ccc aca ttt ttc ctg cgc gtc atc tct gac
3114
Gln Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp
1025 1030 1035
acg gcc tcc ctc tgc tac tcc atc ctg aaa gcc aag aac gca ggg
3159
Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly
1040 1045 1050
atg tcg ctg ggg gcc aag ggc gcc gcc ggc cct ctg ccc tcc gag
3204
Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu
1055 1060 1065
gcc gtg cag tgg ctg tgc cac caa gca ttc ctg ctc aag ctg act
3249
Ala Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr
1070 1075 1080
cga cac cgt gtc acc tac gtg cca ctc ctg ggg tca ctc agg aca
3294
Arg His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr
1085 1090 1095
gcc cag acg cag ctg agt cgg aag ctc ccg ggg acg acg ctg act
3339
Ala Gln Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr
1100 1105 1110
gcc ctg gag gcc gca gcc aac ccg gca ctg ccc tca gac ttc aag
3384
Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys
1115 1120 1125
acc atc ctg gac tga
3399
Thr Ile Leu Asp
1130
<210>2
<211>1132
<212>PRT
<213>human
<400>2
Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser
1 5 10 15
His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly
20 25 30
Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg
35 40 45
Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro
50 55 60
Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu
65 70 75 80
Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val
85 90 95
Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro
100 105 110
Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr
115 120 125
Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val
130 135 140
Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val
145 150 155 160
Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr
165 170 175
Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly
180 185 190
Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg
195 200 205
Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg
210 215 220
Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg
225 230 235 240
Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Trp
245 250 255
Ala His Pro Gly Arg Thr Arg y Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val
260 265 270
Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala
275 280 285
Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His
290 295 300
Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro
305 310 315 320
Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly
325 330 335
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340 345 350
Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser
355 360 365
Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His
385 390 395 400
Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg
405 410 415
Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln
420 425 430
Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu
435 440 445
Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe
450 455 460
Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser
465 470 475 480
Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser
485 490 495
Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met
500 505 510
Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys
515 520 525
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530 535 540
Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe
545 550 555 560
Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr
565 570 575
Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His
580 585 590
Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln
595 600 605
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Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val
625 630 635 640
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645 650 655
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675 680 685
Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro
690 695 700
Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Ala Ile Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile
705 710 715 720
Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln
725 730 735
Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His
740 745 750
Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp
755 760 765
Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser
770 775 780
Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu
785 790 795 800
Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His
805 810 815
Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro
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Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp
835 840 845
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Thr Ile Leu Asp
1130
Claims (4)
1、人端粒酶反转录酶样组分的基因突变体的应用，其特征在于，用于制备治疗肝癌的药物，且该基因突变体的突变方式为点突变，具有SEQ ID NO：1所示的基因序列。
2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于，该基因突变体的表达载体为真核表达质粒或核酸病毒。
3、根据权利要求2所述的应用，其特征在于，该核酸病毒为反转录病毒或腺病毒。
4、根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的给药方式为静脉注射或肌肉注射。
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
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