CN1432411A - 人端粒酶反转录酶样组分的基因突变体的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人端粒酶反转录酶样组分的基因突变体的新用途，即其在制备治疗肝癌的药物中的应用。该基因突变体的基因顺序包括在端粒酶反转录酶样组分各保守结构域的各种可能的突变顺序，该基因突变体的载体为真核表达质粒或核酸病毒，其作为药物的给药方式为静脉注射或肌肉注射。

Description

人端粒酶反转录酶样组分的基因突变体的新用途

技术领域

本发明涉及一种人端粒酶反转录酶样组分的基因突变体的新用途，特别涉及其在制备治疗肝癌的药物中的应用。

背景技术

端粒(telomere)是存在于真核生物线性染色体末端的由串联重复的DNA序列及其相关蛋白所组成的结构，由于能防止染色体的端-端融合、重组和降解，故具有稳定染色体的作用。如所周知，参与真核生物线性DNA复制的DNA聚合酶并不能使染色体DNA完全复制，因而染色体末端的端粒序列在不断分裂的过程中逐渐缩短。当人染色体的末端，又称末端限制片断TRF(terminal restriction fragments)，缩短到5-7Kbp时，细胞就会发生衰老(Harley CB et al.Cancer Surveys 1997 29：263-84)，因此，端粒的长度和细胞寿命的控制相关。

端粒酶是一种由蛋白质和RNA构成的核糖核蛋白体。在绝大多数的真核生物中，端粒的长度都是通过端粒酶(telomerase)维持的。正常体细胞中，除生殖细胞、骨髓造血干细胞及外周淋巴细胞等少数细胞外，一般没有端粒酶的活性，染色体末端的端粒序列便会不断缩短。由于肿瘤细胞是永生性的细胞，不会衰老，而85％的肿瘤细胞都具有端粒酶的表达(Shay JW et al.Eur J Cancer 1997 33：787-91)，因此，端粒酶的活性与表达程度和肿瘤的发生、恶性及转归间的关系便成为近年来生物学和基础医学共同关注的热点。端粒酶的激活可能是肿瘤发生的早期事件(Cheng RYS et al.Br J Cancer1998 77：456-60)。

端粒酶的有关蛋白组分中，有一部分被称之为端粒酶反转录酶样结构(hTERT)的组分，目前引起了学界的关注，hTERT的编码基因具有七个反转录酶保守结构域和一个端粒酶特异的保守结构域，其表达调控是多水平的，涉及转录、转录后mRNA剪切和蛋白磷酸化等，其中主要的调控方式是转录水平调控(Liu JP.FASEB J 1999 13：2091-104)。对hTERT基因启动子区的分析表明，其启动区存在转录因子MYC和Sp1的结合位点，核心调控区由59bp组成，位于-280到-150(Horikawa I，et al.Cancer Res 199959：826-30、Kyo S，et al.Nucleic Acids Res 2000 28：669-77)。

人类端粒酶催化亚单位或端粒酶反转录酶样组分(hTERT，humantelomerase reverse transcriptase subunit)是人类端粒酶的重要组分，有活性的端粒酶反转录酶样组分可以说是绝大部分恶性肿瘤共同的“标志蛋白”，这种蛋白只在恶性肿瘤细胞中表达，在正常细胞中则没有表达，其表达水平与肿瘤细胞的端粒酶活性水平呈正相关。如果研制成一种人类端粒酶催化亚单位或端粒酶反转录酶样组分的基因突变体，就有可能通过竞争抑制去抑制端粒酶的活性，阻断肿瘤细胞的有丝分裂，从而达到控制肿瘤生长的目的。

考虑到hTERT蛋白相对于肿瘤细胞的特异性，启发我们打算用hTERT基因的点突变体(DN-hTERT)去抑制人肝癌细胞的异常分裂，从而有可能将这种点突变的基因通过载体注入患者体内进行基因治疗，达到控制肝癌的目的。根据文献报道，应用PCR定点突变的方法，将端粒酶反转录酶样组分的第三个保守的反转录结构域中710和711位的编码天冬氨酸和缬氨酸残基的序列替换为编码丙氨酸和异亮氨酸的序列，从而构建了端粒酶反转录酶组分的功能域突变体(dominant negative form of hTERT，DN-hTERT)，其基因序列见序列表中的<210>1(Counter CM，et al.Proc Natl Acad Sci USA 199895：14723-8、Hahn WC，et al.Nat Med 1999 5：1164-70)，已有文献报道该功能域突变体在卵巢癌细胞(36M)、乳腺癌细胞(SW613和SKBR3)和结肠癌细胞LoVo中可以有效抑制上述各种癌细胞的端粒酶活性进而使之发生凋亡(Hahn WC，et al.Nat Med 1999 5：1164-70)，但该功能域突变体对有“癌中之王”之称的肝癌的端粒酶活性及其恶性行为的影响在国际上却无报道。

根据Medline的检索，目前并无任何有关采用人端粒酶反转录酶样组分的基因突变体进行临床治疗肝癌的研究的报道。查到有关telomerase和catalytic and mutant的文献18篇，其中涉及肝癌的研究为0篇。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人端粒酶反转录酶样组分的基因突变体的新用途，特别是其在制备治疗肝癌的药物中的应用。该基因突变体的基因顺序包括在端粒酶反转录酶样组分各保守结构域的各种可能的突变顺序；该基因突变体的突变方式是点突变；该基因突变体的基因序列为<210>1中所述序列；该基因突变体的载体为真核表达质粒或核酸病毒；该核酸病毒为反转录病毒或腺病毒；所述药物的给药方式为静脉注射或肌肉注射。

在BEL-7404人肝癌细胞中表达端粒酶反转录酶组分的功能域突变体后，由于该突变体可以与野生型的端粒酶反转录样组分发生竞争，因而可以有效抑制其端粒酶活性，表达DN-hTERT的BEL-7404人肝癌细胞的端粒长度随着细胞分裂的进行逐渐缩短，而表达野生型的反转录酶组分(wild typehTERT，WT-hTERT)和空白载体对照的细胞则没有这样的变化；DN-hTERT表达细胞的生长受到抑制，抑制程度与端粒酶活性的抑制水平相关，但WT-hTERT表达细胞的生长与对照细胞相比则几乎没有变化；DN-hTERT表达细胞在细胞传代培养的后期，细胞膨胀变大；当DN-hTERT表达细胞的端粒长度达到极限短时(大约1.7Kb)，细胞发生凋亡；裸鼠成瘤性实验结果显示，DN-hTERT表达细胞的裸鼠成瘤性消失。上述结果表明，端粒酶的反转录酶组分对肝癌细胞的生长是必需的，是肝癌基因治疗和抗肝癌药物筛选的理想靶点。

我们又将端粒酶的反转录酶组分的基因点突变体对载人肝癌的裸鼠模型进行了实验治疗，结果令人满意。并在实验动物中证明了端粒酶反转录酶组分的功能域突变体能够使人肝癌细胞的成瘤性消失。上述结果表明通过基因点突变构建的端粒酶的反转录酶组分的功能域突变体作为一种治疗人类肝细胞肝癌的新药是完全值得的。

附图说明

图1表示出外源的hTERT基因(DN-hTERT或WT-hTERT)对BEL-7404人肝癌细胞端粒酶活性的影响。

其中：

1—裂解液阴性对照       2—BEL-7404母细胞对照

3—Vector对照           4—WT-hTERT表达克隆2

5—WT-hTERT表达克隆3    6—WT-hTERT表达克隆8

7—DN-hTERT表达克隆1    8—DN-hTERT表达克隆3

9 DN-hTERT表达克隆4     10—DN-hTERT表达克隆8

图2表示出外源的hTERT基因(DN-hTERT或WT-hTERT)对BEL-7404人肝癌细胞端粒长度的影响。

其中：

1，7—Marker                   2，8—Bel-7404母细胞

3—Vector对照                  4—WT-hTERT表达克隆3，PD 10

5—DN-hTERT表达克隆3，PD 7     6—DN-hTERT表达克隆1，PD 10

9—WT-hTERT表达克隆2，PD 5     10—WT-hTERT表达克隆2，PD 10

11—WT-hTERT表达克隆2，PD 15   12—DN-hTERT表达克隆4，PD 1

13—DN-hTERT表达克隆4，PD 8    14—DN-hTERT表达克隆4，PD 15

图3表示出外源的hTERT(DN-hTERT或WT-hTERT)基因表达对BEL-7404人肝癌细胞生长的影响。

其中：除了DN-hTERT表达克隆3，在PD 5外，所有实验细胞均处于PD6。实验结果显示为：平均值±标准误，每组实验数值均来自3个复孔。

图4表示出外源DN-hTERT基因表达诱导的BEL-7404人肝癌细胞的形态变化。

其中：

A—表达DN-hTERT基因的BEL-7404人肝癌细胞；

B—表达WT-hTERT基因的BEL-7404人肝癌细胞；

C—BEL-7404人肝癌细胞；

D—表达空白载体对照的BEL-7404人肝癌细胞。

图5表示出外源DN-hTERT基因表达诱导的BEL-7404人肝癌细胞超微形态的变化。

其中：

A—表达WT-hTERT基因的BEL-7404人肝癌细胞；

B—表达空白载体对照的BEL-7404人肝癌细胞；

C—表达DN-hTERT基因的BEL-7404人肝癌细胞。

图6A、6B、6C表示出流式细胞仪检测DN-hTERT表达克隆3，PD 7；WT-hTERT表达克隆3，PD 10和空白载体表达克隆，PD 10的细胞凋亡结果。

图7表示出TUNEL检测细胞凋亡的结果。

其中：

A—DN-hTERT表达克隆细胞    B—WT-hTERT表达克隆细胞

C—表达空白载体对照的细胞  D—阴性对照

E—阳性对照

图8表示出外源的hTERT(DN-hTERT或WT-hTERT)基因表达对BEL-7404人肝癌细胞裸鼠成瘤性的影响。

其中：

A—BEL-7404人肝癌母细胞

B—表达空白载体对照克隆细胞

C—表达WT-hTERT外源基因克隆3

D—表达WT-hTERT外源基因克隆8

E—表达DN-hTERT外源基因克隆1

F—表达DN-hTERT外源基因克隆3

具体实施方式

实施例1

在BEL-7404人肝癌细胞中表达端粒酶反转录酶组分的功能域突变体(dominant negative form of hTERT，DN-hTERT)可以有效抑制其端粒酶活性。

经过脂质体转染，筛选和鉴定后，以非放射性端粒酶活性定量测定方法检测端粒酶活性，该方法包括含端粒酶的细胞抽提液的制备、端粒酶介导的延伸反应、PCR扩增和染色拍照等步骤(Zhang RG，et al.Cell Res，200010：71-7)。我们观察了外源的hTERT基因(DN-hTERT或WT-hTERT)对BEL-7404人肝癌细胞端粒酶活性的影响，以裂解液为阴性对照，以BEL-7404细胞为母细胞对照，以pCMV-script质粒为Vector对照，发现所有的WT-hTERT表达克隆的端粒酶活性均有所活跃，所有的DN-hTERT表达克隆的端粒酶均有所抑制，其抑制程度同DN-hTERT的表达强度相平行(见图1)。

实施例2

表达DN-hTERT的BEL-7404人肝癌细胞的端粒长度随着细胞分裂的进行逐渐缩短，而表达野生型的反转录酶组分(wild type hTERT，WT-hTERT)和空白载体对照的细胞则没有这样的变化；

以Southerblot方法应用Roche公司试剂盒，该方法有以下一些步骤：细胞基因组DNA的抽提、Rsa I/HinfI酶切、与标记的端粒特异探针杂交和端粒长度计算(Ulaner GA，et al.Int J Cancer 2001 91：644-9)。我们观察了外源的hTERT基因(DN-hTERT或WT-hTERT)对BEL-7404人肝癌细胞端粒长度的影响，以Roche公司的DNA Marker(以Kilo base pair为单位)为标志值，以Bel-7404细胞为母细胞对照，以pCMV-script质粒为Vector对照，发现所有WT-hTERT的、包括连续传代后的表达克隆，其端粒DNA长度与对照细胞均相似，而DN-hTERT表达克隆则随着细胞的传代，其端粒DNA长度逐渐缩短(见图2)。

实施例3

DN-hTERT表达细胞的生长受到抑制，抑制程度与端粒酶活性的抑制水平相关，但WT-hTERT表达细胞的生长与对照细胞相比则几乎没有变化。

以台盼蓝拒染法测定端粒酶反转录样组分的功能域突变体对细胞生长的影响，将细胞按3×10⁴个细胞/孔，接种到96孔板中培养。每12小时收集细胞进行计数，连续观察96小时。计数时，将细胞悬液与等体积的0.4％台盼蓝混合。活细胞的细胞膜完整，透明不着色，而着色的细胞均为死细胞计数时不予计算。实验中，以转染有pCMV-script Vector和表达WT-hTERT的BEL-7404人肝癌细胞为对照，我们观察了表达DN-hTERT的BEL-7404细胞的生长情况同端粒酶活性间的相关性，发现表达WT-hTERT细胞的生长情况与转染有pCMV-script Vector的对照细胞相似，但表达DN-hTERT的BEL-7404细胞的生长明显受到抑制(见图3)。

实施例4

DN-hTERT表达细胞在细胞传代培养的后期，细胞膨胀变大；当DN-hTERT表达细胞的端粒长度达到极限短时，细胞发生凋亡。

我们以BEL-7404人肝癌母细胞、转染有pCMV-script Vector和表达WT-hTERT的BEL-7404人肝癌细胞为对照，发现当DN-hTERT表达细胞在细胞传代培养的后期，细胞膨胀变大。以电子显微镜观察细胞核形态、TUNEL原位细胞凋亡检测和流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。其中TUNEL原位细胞凋亡检测方法为，在盖玻片上培养的细胞空气干燥，4％多聚甲醛室温固定1h，PBS洗片并用含3％H₂O₂的甲醛作用10min终止固定，PBS洗片并用含0.1％ Triton X-100的0.1％柠檬酸钠冰上浸浴渗透2min，PBS洗片两次并加TUNEL反应混合物50μl，37℃孵育1h，PBS洗片三次并加Conver-POD试剂50μl，37℃孵育30min，荧光显微镜下观察拍照。以不含末端转移酶的标记试剂代替TUNEL反应混合物孵育渗透后的细胞作为阴性对照。以50μg/ml的DNase I室温作用渗透后的细胞10min诱导DNA断裂作为阳性对照；流式细胞仪检测细胞凋亡的方法为细胞收集后用D-Hanks洗涤一次，柠檬酸固定液(40mmol/L sodium citrate，250mmol/L sucrose，5％ DMSO)固定后置4℃保存，测定时PI染色(50mg/L RNase A，20mg/L PI)，流式细胞仪(Becton-Dickson公司产品)检测细胞凋亡率(Kang JX，et al.Cell Growth& Differ 1999 10：591-600、Andreassen PR，et al.J Cell Biol 1994 127：789-802)。结果发现，当端粒长度达到1.7Kb时，细胞发生凋亡(见图4-7)。

实施例5

裸鼠成瘤性实验结果显示，DN-hTERT表达细胞的裸鼠成瘤性消失(HahnWC，et al.Nature 1999 400：464-8)。

将雌性Balb/c裸鼠随机分为6组，每组5鼠，按2×10⁶个细胞/鼠将不同处理方式的BEL-7404人肝癌细胞接种于裸鼠的右侧腋下，在无病原体的条件下饲养，接种五周后处死裸鼠观察接种细胞的成瘤情况。我们发现母细胞组(Parental cells)、空载体对照组(Vector control)、表达端粒酶反转录酶样组分的2个观察组(WT-hTERT)均100％成瘤，而表达端粒酶反转录酶样组分突变体(DN-hTERT)的2个观察组则100％不形成肿瘤(见表1和图8)

表1    外源的hTERT(DN-hTERT或WT-hTERT)基因表达对BEL-7404人肝癌细胞裸鼠成瘤性的影响

                倍增代数  成瘤鼠数/注射鼠数    端粒长度母细胞                 /             5/5             4.1载体对照              10             5/5             4.1WT-hTERT表达克隆3     10             5/5             4.1WT-hTERT表达克隆8     10             5/5             未检测DN-hTERT表达克隆1     10             0/5             3.2DN-hTERT表达克隆3     7              0/5             1.7

                 SEQUENCE LISTING<110>  中国科学院上海细胞生物学研究所<120>  人端粒酶反转录酶样组分的基因突变体的新用途<130>  1<160>  2<170>  PatentIn version 3.1<210>  1<211>  3399<212>  DNA<213>  human<220><221>  CDS<222>  (1)..(3399)<223><400>  1atg ccg cgc gct ccc cgc tgc cga gcc gtg cgc tcc ctg ctg cgc agc48Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser1               5                   10                  15cac tac cgc gag gtg ctg ccg ctg gcc acg ttc gtg cgg cgc ctg ggg96His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly

        20                  25                  30ccc cag ggc tgg cgg ctg gtg cag cgc ggg gac ccg gcg gct ttc cgc144Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg

    35                  40                  45gcg ctg gtg gcc cag tgc ctg gtg tgc gtg ccc tgg gac gca cgg ccg192Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro

50                  55                  60ccc ccc gcc gcc ccc tcc ttc cgc cag gtg tcc tgc ctg aag gag ctg240Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu65                  70                  75                  80gtg gcc cga gtg ctg cag agg ctg tgc gag cgc ggc gcg aag aac gtg288Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val

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    115                 120                 125gac gca ctg cgg ggg agc ggg gcg tgg ggg ctg ctg ttg cgc cgc gtg432Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val

130                 135                 140ggc gac gac gtg ctg gtt cac ctg ctg gca cgc tgc gcg ctc ttt gtg480Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val145                 150                 155                 160ctg gtg gct ccc agc tgc gcc tac cag gtg tgc ggg ccg ccg ctg tac528Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr

            165                 170                 175cag ctc ggc gct gcc act cag gcc cgg ccc ccg cca cac gct agt gga576Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly

        180                 185                 190ccc cga agg cgt ctg gga tgc gaa cgg gcc tgg aac cat agc gtc agg624Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg

    195                 200                 205gag gcc ggg gtc ccc ctg ggc ctg cca gcc ccg ggt gcg agg agg cgc672Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg

210                 215                 220ggg ggc agt gcc agc cga agt ctg ccg ttg ccc aag agg ccc agg cgt720Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg225                 230                 235                 240ggc gct gcc cct gag ccg gag cgg acg ccc gtt ggg cag ggg tcc tgg768Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp

            245                 250                 255gcc cac ccg ggc agg acg cgt gga ccg agt gac cgt ggt ttc tgt gtg816Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val

        260                 265                 270gtg tca cct gcc aga ccc gcc gaa gaa gcc acc tct ttg gag ggt gcg864Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala

    275                 280                 285ctc tct ggc acg cgc cac tcc cac cca tcc gtg ggc cgc cag cac cac912Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His

290                 295                 300gcg ggc ccc cca tcc aca tcg cgg cca cca cgt ccc tgg gac acg cct960Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro305                 310                 315                 320tgt ccc ccg gtg tac gcc gag acc aag cac ttc ctc tac tcc tca ggc1008Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly

            325                 330                 335gac aag gag cag ctg cgg ccc tcc ttc cta ctc agc tct ctg agg ccc1056Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro

        340                 345                 350agc ctg act ggc gct cgg agg ctc gtg gag acc atc ttt ctg ggt tcc1104Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser

    355                 360                 365agg ccc tgg atg cca ggg act ccc cgc agg ttg ccc cgc ctg ccc cag1152Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln

370                 375                 380cgc tac tgg caa atg cgg ccc ctg ttt ctg gag ctg ctt ggg aac cac1200Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His385                 390                 395                 400gcg cag tgc ccc tac ggg gtg ctc ctc aag acg cac tgc ccg ctg cga1248Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg

            405                 410                 415gct gcg gtc acc cca gca gcc ggt gtc tgt gcc cgg gag aag ccc cag1296Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln

        420                 425                 430ggc tct gtg gcg gcc ccc gag gag gag gac aca gac ccc cgt cgc ctg1344Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu

    435                 440                 445gtg cag ctg ctc cgc cag cac agc agc ccc tgg cag gtg tac ggc ttc1392Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe

450                 455                 460gtg cgg gcc tgc ctg cgc cgg ctg gtg ccc cca ggc ctc tgg ggc tcc1440Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser465                 470                 475                 480agg cac aac gaa cgc cgc ttc ctc agg aac acc aag aag ttc atc tcc1488Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser

            485                 490                 495ctg ggg aag cat gcc aag ctc tcg ctg cag gag ctg acg tgg aag atg1536Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met

        500                 505                 510agc gtg cgg ggc tgc gct tgg ctg cgc agg agc cca ggg gtt ggc tgt1584Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys

    515                 520                 525gtt ccg gcc gca gag cac cgt ctg cgt gag gag atc ctg gcc aag ttc1632Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe

530                 535                 540ctg cac tgg ctg atg agt gtg tac gtc gtc gag ctg ctc agg tct ttc1680Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe545                 550                 555                 560ttt tat gtc acg gag acc acg ttt caa aag aac agg ctc ttt ttc tac1728Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr

            565                 570                 575cgg aag agt gtc tgg agc aag ttg caa agc att gga atc aga cag cac1776Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His

        580                 585                 590ttg aag agg gtg cag ctg cgg gag ctg tcg gaa gca gag gtc agg cag1824Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln

    595                 600                 605cat cgg gaa gcc agg ccc gcc ctg ctg acg tcc aga ctc cgc ttc atc1872His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile

610                 615                 620ccc aag cct gac ggg ctg cgg ccg att gtg aac atg gac tac gtc gtg1920Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val625                 630                 635                 640gga gcc aga acg ttc cgc aga gaa aag agg gcc gag cgt ctc acc tcg1968Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser

            645                 650                 655agg gtg aag gca ctg ttc agc gtg ctc aac tac gag cgg gcg cgg cgc2016Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg

        660                 665                 670ccc ggc ctc ctg ggc gcc tct gtg ctg ggc ctg gac gat atc cac agg2064Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg

    675                 680                 685gcc tgg cgc acc ttc gtg ctg cgt gtg cgg gcc cag gac ccg ccg cct2112Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro

690                 695                 700gag ctg tac ttt gtc aag gtg gct atc acg ggc gcg tac gac acc atc2160Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Ala Ile Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile705                 710                 715                 720ccc cag gac agg ctc acg gag gtc atc gcc agc atc atc aaa ccc cag2208Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln

            725                 730                 735aac acg tac tgc gtg cgt cgg tat gcc gtg gtc cag aag gcc gcc cat2256Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His

        740                 745                 750ggg cac gtc cgc aag gcc ttc aag agc cac gtc tct acc ttg aca gac2304Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp

    755                 760                 765ctc cag ccg tac atg cga cag ttc gtg gct cac ctg cag gag acc agc2352Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser

770                 775                 780ccg ctg agg gat gcc gtc gtc atc gag cag agc tcc tcc ctg aat gag2400Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu785                 790                 795                 800gcc agc agt ggc ctc ttc gac gtc ttc cta cgc ttc atg tgc cac cac2448Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His

            805                 810                 815gcc gtg cgc atc agg ggc aag tcc tac gtc cag tgc cag ggg atc ccg2496Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro

        820                 825                 830cag ggc tcc atc ctc tcc acg ctg ctc tgc agc ctg tgc tac ggc gac2544Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp

    835                 840                 845atg gag aac aag ctg ttt gcg ggg att cgg cgg gac ggg ctg ctc ctg2592Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu

850                 855                 860cgt ttg gtg gat gat ttc ttg ttg gtg aca cct cac ctc acc cac gcg2640Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala865                 870                 875                 880aaa acc ttc ctc agg acc ctg gtc cga ggt gtc cct gag tat ggc tgc2688Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys

            885                 890                 895gtg gtg aac ttg cgg aag aca gtg gtg aac ttc cct gta gaa gac gag2736Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu

        900                 905                 910gcc ctg ggt ggc acg gct ttt gtt cag atg ccg gcc cac ggc cta ttc2784Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe

    915                 920                 925ccc tgg tgc ggc ctg ctg ctg gat acc cgg acc ctg gag gtg cag agc2832Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser

930                 935                 940gac tac tcc agc tat gcc cgg acc tcc atc aga gcc agt ctc acc ttc2880Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe945                 950                 955                 960aac cgc ggc ttc aag gct ggg agg aac atg cgt cgc aaa ctc ttt ggg2928Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly

            965                 970                 975gtc ttg cgg ctg aag tgt cac agc ctg ttt ctg gat ttg cag gtg aac2976Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn

        980                 985                 990agc ctc cag acg gtg tgc acc aac atc tac aag atc ctc ctg ctg cag3024Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln

    995                 1000                1005gcg tac  agg ttt cac gca tgt  gtg ctg cag ctc cca  ttt cat cag3069Ala Tyr  Arg Phe His Ala Cys  Val Leu Gln Leu Pro  Phe His Gln

1010                 1015                 1020caa gtt  tgg aag aac ccc aca  ttt ttc ctg cgc gtc  atc tct gac3114Gln Val  Trp Lys Asn Pro Thr  Phe Phe Leu Arg Val  Ile Ser Asp

1025                 1030                 1035acg gcc  tcc ctc tgc tac tcc  atc ctg aaa gcc aag  aac gca ggg3159Thr Ala  Ser Leu Cys Tyr Ser  Ile Leu Lys Ala Lys  Asn Ala Gly

1040                 1045                 1050atg tcg  ctg ggg gcc aag ggc  gcc gcc ggc cct ctg  ccc tcc gag3204Met Ser  Leu Gly Ala Lys Gly  Ala Ala Gly Pro Leu  Pro Ser Glu

1055                 1060                 1065gcc gtg  cag tgg ctg tgc cac  caa gca ttc ctg ctc  aag ctg act3249Ala Val  Gln Trp Leu Cys His  Gln Ala Phe Leu Leu  Lys Leu Thr

1070                 1075                 1080cga cac  cgt gtc acc tac gtg  cca ctc ctg ggg tca  ctc agg aca3294Arg His  Arg Val Thr Tyr Val  Pro Leu Leu Gly Ser  Leu Arg Thr

1085                 1090                 1095gcc cag  acg cag ctg agt cgg  aag ctc ccg ggg acg  acg ctg act3339Ala Gln  Thr Gln Leu Ser Arg  Lys Leu Pro Gly Thr  Thr Leu Thr

1100                 1105                 1110gcc ctg  gag gcc gca gcc aac  ccg gca ctg ccc tca  gac ttc aag3384Ala Leu  Glu Ala Ala Ala Asn  Pro Ala Leu Pro Ser  Asp Phe Lys

1115                 1120                 1125acc atc  ctg  gac tga3399Thr Ile  Leu Asp

1130<210>  2<211>  1132<212>  PRT<213>  human<400>  2Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser1               5                   10                  15His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly

        20                  25                  30Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg

    35                  40                  45Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro

50                  55                  60Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu65                  70                  75                  80Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val

            85                  90                  95Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro

        100                 105                 110Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr

    115                 120                 125Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val

130                 135                 140Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val145                 150                 155                 160Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr

            165                 170                 175Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly

        180                 185                 190Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg

    195                 200                 205Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg

210                 215                 220Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg225                 230                 235                 240Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp

            245                 250                 255Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val

        260                 265                 270Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala

    275                 280                 285Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His

290                 295                 300Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro305                 310                 315                 320Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly

            325                 330                 335Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro

        340                 345                 350Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser

    355                 360                 365Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln

370                 375                 380Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His385                 390                 395                 400Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg

            405                 410                 415Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln

        420                 425                 430Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu

    435                 440                 445Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe

450                 455                 460Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser465                 470                 475                 480Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser

            485                 490                 495Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met

        500                 505                 510Ser Val Arg Gly Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val G1y Cys

    515                 520                 525Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe

530                 535                 540Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe545                 550                 555                 560Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr

            565                 570                 575Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His

        580                 585                 590Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln

    595                 600                 605His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile

610                 615                 620Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val625                 630                 635                 640Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser

            645                 650                 655Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg

        660                 665                 670Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg

    675                 680                 685Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro

690                 695                 700Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Ala Ile Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile705                 710                 715                 720Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln

            725                 730                 735Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His

        740                 745                 750Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp

    755                 760                 765Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser

770                 775                 780Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu785                 790                 795                 800Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His

            805                 810                 815Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro

        820                 825                 830Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp

    835                 840                 845Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu

850                 855                 860Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala865                 870                 875                 880Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys

            885                 890                 895Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu

        900                 905                 910Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe

    915                 920                 925Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser

930                 935                 940Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe945                 950                 955                 960Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly

            965                 970                 975Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn

        980                 985                 990Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln

    995                 1000                1005Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln

1010                1015                1020Gln Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp

1025                1030                1035Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly

1040                1045                1050Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu

1055                1060                1065Ala Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr

1070                1075                1080Arg His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr

1085                1090                1095Ala Gln Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr

1100                1105                1110Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys

1115                1120                1125Thr Ile Leu Asp

1130

Claims (7)

1.人端粒酶反转录酶样组分的基因突变体在制备治疗肝癌的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于该基因突变体的基因顺序包括在端粒酶反转录酶样组分各保守结构域的各种可能的突变顺序。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于该基因突变体的突变方式是点突变。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于该基因突变体的基因序列为<210>1中所述序列。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于该基因突变体的载体为真核表达质粒或核酸病毒。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于该核酸病毒为反转录病毒或腺病毒。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物的给药方式为静脉注射或肌肉注射。

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