CN1685039A

CN1685039A - 只存在于病原性分枝杆菌并选择表达于吞噬体pH值下的分泌型酸性磷酸酶(SAPM)

Info

Publication number: CN1685039A
Application number: CNA2003801001302A
Authority: CN
Inventors: 刘军; 马赞·T·萨利赫; 大卫·亚历山大
Original assignee: CHENGDU YONG'AN PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: Chengdu Cypco Biotechnology Co ltd
Priority date: 2002-10-09
Filing date: 2003-10-09
Publication date: 2005-10-19
Anticipated expiration: 2023-10-09
Also published as: AU2003273699A8; JP2006501830A; GB2408982A; WO2004033677A3; ZA200503423B; WO2004033677A2; AU2003273699A1; CN1685039B; GB0507401D0; GB2408982B; US20060172301A1; RU2005114507A; CA2501941A1

Abstract

本发明涉及一种分离的DNA构建体，其中包含一个低pH可诱导的分支杆菌分泌型酸性磷酸酶启动子或启动子片段。本发明进一步还涉及用于治疗或预防病原性分枝杆菌疾病或感染的诊断方法及疫苗。本发明还提供筛选化合物的方法，该化合物能够调控分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶的活性、生成或分泌。

Description

只存在于病原性分枝杆菌并选择表达于吞噬体pH值下的分泌型酸性磷酸酶(SAPM)

技术领域

本发明涉及病原性分枝杆菌或病原性真菌疾病或感染的诊断方法及疫苗。

背景技术

病原性分枝杆菌包括结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)定居于宿主巨噬细胞的吞噬体中，吞噬体对于大多数微生物来说是一种恶劣的环境。显然结核杆菌改变了这种吞噬体腔室(compartment)从而提高了它本身的细胞内存活能力(Clemens and Horwitz，1995)。其中包括改变Rab GTPase组成(Via et al.，1997；Clemens et al.，2000)以及空泡型质子ATPase(vacuolarproton ATPase)的排出(Sturgill et al.，1994)。因此，分枝杆菌吞噬体在成熟的早期被俘获并且仅轻微酸化至pH6.1～6.5(Xu et al.，1994；Sturgillet etal.，1994；Clemens and Horwitz，1995)。病原性分枝杆菌在巨噬细胞中的耐久力在疾病的发生及发展中发挥着关键作用。但是弱化宿主过程(hostprocesses)的特异的细菌因子还基本上是未知的。基于对细菌致病性起作用的基因在感染过程中可差异性地表达这种假设，已经使用了各种方法鉴定在下述条件下表达优先上调的结核杆菌基因：即那些在体内(即，在巨噬细胞内)(综述见(Triccas and Gicquel，2000))或者在模拟细菌遭遇的宿主环境的体外条件下(例如，例如低氧压、酸性pH，以及营养缺乏)(Betts et al.，2002；Fisher et al.，2002)。尽管已有众多候选的病原性基因被描述，但是其中大多数基因的生物学功能仍然未知，它们对细菌在细胞内存活的直接作用也还不清楚。对细菌复制及存活起作用的分枝杆菌蛋白的鉴定对于理解疾病的致病及保护机理至关重要。

细胞内细菌病原体包括结核杆菌和肠沙门氏菌鼠伤寒血清变种(Salmonella enteric serovar Typhimurium)会遭遇共生物种很难遇到的千差万别的宿主体内环境。对环境压力的响应及对恶劣的细胞内条件的适应能力使得这些病原体能够生存。环境压力包括：温度、摩尔渗透压浓度(osmolarity)、pH、氧压以及养分获取。已经发现环境压力是细菌基因特定亚组(subset)的诱导信号，该基因亚组有助于提高存活或增殖能力。这些基因中的大多数已在沙门氏菌中被鉴定，并且其中一些在感染和/或致病性中显示发挥着重要作用(综述见(Lucas and Lee，2000))。使用多种策略，还鉴定出了大量的结核杆菌候选毒性基因(Triccas and Gicquel，2000)。但是其中仅有少数基因有直接证据证明它们在毒性中的必不可少的作用，这些基因例如：异柠檬酸裂合酶(isocitrate lyase，aceA)(McKinney et al.，2000))、α-晶状体蛋白(α-crystallin，acr)(Yuan et al.，1998)和外运重复蛋白(exported repetitive protein，erp)(Berthet etal.，1998)。

众所周知，病原性分枝杆菌活跃地调节着吞噬体的pH值。含有有活力的病原性结核杆菌和鸟结核分枝杆菌(M.avium)的吞噬体仅仅被轻微酸化(pH6～6.5)，这是由于，至少部分由于质子ATPase缺乏的缘故(Sturgill etal.，1994)。相反，非致病性分枝杆菌，例如：包皮垢分枝杆菌(M.smegmatis)和戈登分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)，或者致死性病原性分枝杆菌则不能阻止吞噬体的酸化，含有这些细菌的吞噬体的pH被酸化到近似于晚期核内体(late endosome)和溶酶体的pH值(pH≈5)(Kuehnel et al.，2001)。这些数据表明：仅发现于病原性菌株的因子的生成对于抑制吞噬体酸化及细胞内存活有着重要的意义。酸化可以作为信号诱导改变吞噬体成熟所需基因的表达。结核杆菌H37Rv的分泌型酸性磷酸酶(the secreted acid phosphataseof M.)，SapM最近被鉴定(Saleh and Belisle，2000)。

发明内容

本发明提供了一种分离的DNA序列，其中包含一种启动子或启动子片段，位于分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶基因编码区域[SEQ ID NO：9]、[SEQ IDNO：11]、[SEQ ID NO：13]、[SEQ ID NO：15]起始位点的上游5’端侧翼区域，其中所述启动子或启动子片段足以调控目的核苷酸序列的表达，并且在低pH条件下是可诱导的。本发明还提供了一种分离的DNA序列，其中包含一种启动子或启动子片段，位于分泌型酸性磷酸酶基因编码区域起始位点上游5’端侧翼区域，该分泌型酸性磷酸酶基因的编码区域是选自结核杆菌[SEQID NO：9]、牛型结核杆菌(Mycobacterium bovis)[SEQ ID NO：11]、鸟结核分枝杆菌[SEQ ID NO：13]或海鱼分枝杆菌(Mycobacterium marinum)[SEQID NO：15]。

本发明涉及一种分离的DNA序列，其中包含一种启动子或启动子片段，该启动子或启动子片段在高严谨的杂交条件下与[SEQ ID NO：1]、[SEQ IDNO：2]、[SEQ ID NO：3]、[SEQ ID NO：4]杂交，并且足以控制目的核苷酸序列的表达，并且在低pH条件下是可诱导的。

本发明还涉及一种表达载体，其中包括一种分离的DNA序列，该序列包含一种启动子或启动子片段，位于分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶基因编码区域[SEQ ID NO：9]、[SEQ ID NO：11]、[SEQ ID NO：13]、[SEQ ID NO：15]起始位点上游5’端侧翼区域，其中所述启动子或启动子片段足以控制目的核苷酸序列的表达，并且在低pH条件下是可诱导的。

本发明还涉及一种表达载体，其中包括一种分离的DNA序列，该序列包含一种启动子或启动子片段，位于分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶基因编码区域起始位点上游的5’端侧翼区域，该分泌型酸性磷酸酶基因编码区域选自结核杆菌[SEQ ID NO：9]、牛型结核杆菌[SEQ ID NO：11]、鸟结核分枝杆菌[SEQ ID NO：13]或海鱼分枝杆菌[SEQ ID NO：15]，其中所述启动子或启动子片段足以控制目的核苷酸序列的表达，并且在低pH条件下是可诱导的。

本发明涉及还涉及一种表达载体，其中包括一种分离的DNA序列，该序列包含一种启动子或启动子片段，该启动子或启动子片段能够在高严谨的杂交条件下与[SEQ ID NO：1]、[SEQ ID NO：2]、[SEQ ID NO：3]、[SEQ ID NO：4]杂交，并且足以控制目的核苷酸序列的表达，并且在低pH条件下是可诱导的。

本发明进一步涉及一种被表达载体转化了的宿主细胞，该载体包括一种分离的DNA序列，该序列包含一种启动子或启动子片段，该启动子或启动子片段位于分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶基因编码区域[SEQ ID NO：9]、[SEQID NO：11]、[SEQ ID NO：13]、[SEQ ID NO：15]起始位点上游的5’端侧翼区域，其中所述启动子或启动子片段足以控制目的核苷酸序列的表达，并且在低pH条件下是可诱导的。

本发明进一步涉及一种被表达载体转化了的宿主细胞，该载体包括一种分离的DNA序列，该序列包含一种启动子或启动子片段，该启动子或启动子片段位于分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶基因编码区域起始位点上游的5’端侧翼区域，该编码区域选自结核分枝杆菌[SEQ ID NO：9]、牛型结核杆菌[SEQ ID NO：11]、鸟结核杆菌[SEQ ID NO：13]、或海鱼分枝杆菌[SEQ ID NO：15]。

本发明进一步涉及一种被表达载体转化了的宿主细胞，该载体包括一种分离的DNA序列，该序列包含一种启动子或启动子片段，该启动子或启动子片段能够在高严谨的杂交条件下与[SEQ ID NO：1]、[SEQ ID NO：2]、[SEQID NO：3]、[SEQ ID NO：4]杂交，足以控制目的核苷酸序列的表达，并且在低pH条件下是可诱导的。

本发明的另一个方面是一种转录盒，其中包含一种SapM启动子或启动子片段[SEQ ID NO：1]、[SEQ ID NO：2]、[SEQ ID NO：3]、[SEQ ID NO：4]，一段与SapM启动子或启动子片段[SEQ ID NO：1]、[SEQ ID NO：2]、[SEQ IDNO：3]、[SEQ ID NO：4]可操作连接的目的核苷酸序列，以及转录终止区域。

在另一个实施方案中，所述的转录盒进一步包括所述分泌型酸性磷酸酶N-端信号序列[SEQ ID NO：5]、[SEQ ID NO：6]、[SEQ ID NO：7]、[SEQ ID NO：8]或其功能部分。在另一个实施方案中，所述的转录盒进一步包括所述分泌型酸性磷酸酶N-端信号序列，该信号序列选自结核杆菌[SEQ ID NO：5]、牛型结核杆菌[SEQ ID NO：6]、鸟结核杆菌[SEQ ID NO：7]、或海鱼分枝杆菌[SEQ ID NO：8]。

本发明的另一方面提供了一种诊断受试者病原性分枝杆菌感染或病原性真菌感染的方法，该方法包括从受试者获得生物学样本，然后分析样本中针对SapM[SEQ ID NO：10]、[SEQ ID NO：12]、[SEQ ID NO：14]、[SEQ IDNO：16]的特异性抗体的存在，其中检测到针对SapM[SEQ ID NO：10]、[SEQID NO：12]、[SEQ ID NO：14]、[SEQ ID NO：16]的特异性抗体就表示存在病原性分枝杆菌感染或病原性真菌感染。

本发明的一个方面提供了一种诊断受试者病原性分枝杆菌感染或病原性真菌感染的方法，该方法包括从受试者获得核酸样本，然后分析该样本中编码sapM[SEQ ID NO：9]、[SEQ ID NO：11]、[SEQ ID NO：13]、[SEQ ID NO：15]的核酸的存在，其中检测到sapM[SEQ ID NO：9]、[SEQ ID NO：11]、[SEQID NO：13]、[SEQ ID NO：15]就表示存在病原性分枝杆菌感染或病原性真菌感染。在一个实施方案中所述的诊断病原性分枝杆菌感染或病原性真菌感染的方法进一步包括对所检测sapM[SEQ ID NO：9]、[SEQ ID NO：11]、[SEQID NO：13]、[SEQ ID NO：15]进行定量的步骤。

本发明的另一方面是一种诊断受试者病原性分枝杆菌感染或病原性真菌感染的方法，该方法包括从受试者获得生物学样本，然后分析样本中SapM磷酸酶活性的存在，其中检测到SapM磷酸酶活性就表示存在病原性分枝杆菌感染或病原性真菌感染。

本发明还涉及一种筛选化合物的方法，所述化合物能够调节或调控SapM[SEQ ID NO：10]、[SEQ ID NO：12]、[SEQ ID NO：14]、[SEQ ID NO：16]的生成，该方法包括提供或使用一种含有sapM启动子[SEQ ID NO：1]、[SEQ ID NO：2]、[SEQ ID NO：3]、[SEQ ID NO：4]或其功能部分的核酸构建体，所述启动子或其功能部分可操作地连接于一个能产生可检测或可测量信号的报道基因，将该构建体暴露于候选或待测化合物，然后检测或测量上述报道基因产生的信号，存在候选或待测化合物时产生的信号与没有该待测化合物时产生信号相比发生了变化，则说明所述待测化合物能够调节分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶的生成。在一个实施方案中测试了大量的化合物。

本发明还涉及一种筛选化合物的方法，所述化合物能够调节或调控SapM磷酸酶活性，该方法包括将含有SapM[SEQ ID NO：10]、[SEQ ID NO：12]、[SEQ ID NO：14]、[SEQ ID NO：16]一种SapM底物以及待测化合物的混合物进行孵育，然后测试所述磷酸酶活性。当存在待测化合物时的活性与没有该待测化合物时的活性相比发生了变化，则说明所述待测化合物能够调节分泌型酸性磷酸酶的活性。在一个实施方案中测试了大量的化合物。

本发明进一步涉及一种筛选化合物的方法，所述化合物能够调节或调控SapM[SEQ ID NO：10]、[SEQ ID NO：12]、[SEQ ID NO：14]、[SEQ ID NO：16]的分泌，该方法包括将分枝杆菌细胞暴露于待测化合物，其中所述分枝杆菌细胞分泌SapM[SEQ ID NO：10]、[SEQ ID NO：12]、[SEQ ID NO：14]、[SEQID NO：16]，然后检测分枝杆菌细胞分泌的SapM[SEQ ID NO：10]、[SEQ IDNO：12]、[SEQ ID NO：14]、[SEQ ID NO：16]的存在或活性，测定分枝杆菌细胞分泌的分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶的量。当存在待测化合物时分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶的分泌与没有该待测化合物时的分泌相比发生变了化，则说明所述待测化合物能够调节分枝杆菌分泌型磷酸酶的分泌。在一个实施方案中测试了大量的化合物。

本发明还涉及一种检测病原性分枝杆菌疾病或感染的试剂盒，其中包括一种SapM蛋白[SEQ ID NO：10]、[SEQ ID NO：12]、[SEQ ID NO：14]、[SEQID NO：16]或其多肽，至少一种SapM抗体，以及检测SapM特异性抗体所需的一种或多种试剂。

本发明还涉及一种检测病原性分枝杆菌疾病或感染的试剂盒，该试剂盒包括一种寡核苷酸，包括与下述核酸序列互补的核酸序列相邻接的核苷酸：[SEQ ID NO：1]、[SEQ ID NO：2]、[SEQ ID NO：3]、[SEQ ID NO：4]、[SEQ IDNO：9]、[SEQ ID NO：11]、[SEQ ID NO：13]、[SEQ ID NO：15]，并且该核酸序列能与互补核苷酸序列特异性杂交，以及所述寡核苷酸与互补核酸序列杂交所需的试剂。

本发明的另一方面提供了一种抗体，该抗体能特异性结合SapM蛋白[SEQ ID NO：10]、[SEQ ID NO：12]、[SEQ ID NO：14]、[SEQ ID NO：16]或其多肽片段[SEQ ID NO：22]的抗体。

本发明的另一方面提供了一种用于治疗或预防哺乳动物免受分枝杆菌侵害的疫苗或致免疫的组合物，其中包括一种能特异性结合SapM蛋白[SEQ ID NO：10]、[SEQ ID NO：12]、[SEQ ID NO：14]、[SEQ ID NO：16]或其多肽片段[SEQ ID NO：22]的抗体。

本发明的另一方面提供了一种用于治疗或预防哺乳动物免受分枝杆菌侵害的疫苗或致免疫的组合物，其中包括一种分离的DNA序列，该序列包含一种启动子或启动子片段，位于分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶基因编码区域[SEQ ID NO：1]、[SEQ ID NO：2]、[SEQ ID NO：3]、[SEQ ID NO：4]的起始位点的上游5’端侧翼区域，其中所述启动子或启动子片段足以控制目的核苷酸序列的表达，并且在低pH条件下是可诱导的。

本发明的另一方面提供了一种用于治疗或预防哺乳动物免受分枝杆菌侵害的疫苗或致免疫的组合物，其中包括一种分离的DNA序列，该序列包含一种在高严谨的杂交条件下与[SEQ ID NO：1]、[SEQ ID NO：2]、[SEQ IDNO：3]、[SEQ ID NO：4]杂交的启动子或启动子片段，所述启动子或启动子片段足以控制目的核苷酸序列的表达，并且在低pH条件下是可诱导的。

本发明还涉及一种用于治疗或预防哺乳动物免受分枝杆菌侵害的疫苗或致免疫的组合物，其中包括一种SapM蛋白[SEQ ID NO：10]、[SEQ ID NO：12]、[SEQ ID NO：14]、[SEQ ID NO：16]或其多肽片段[SEQ ID NO：22]。

本发明的另一方面提供了一种用于治疗或预防哺乳动物免受分枝杆菌侵害的疫苗或致免疫的组合物，其中包括一种分离的DNA序列或序列片段，该序列或序列片段能够在高严谨的杂交条件下与[SEQ ID NO：9]、[SEQ IDNO：11]、[SEQ ID NO：13]、[SEQ ID NO：15]杂交，并可使SapM蛋白[SEQID NO：10]、[SEQ ID NO：12]、[SEQ ID NO：14]、[SEQ ID NO：16]或其多肽片段[SEQ ID NO：22]得以表达。

本发明进一步涉及用于检测受试者病原性分枝杆菌疾病或感染的抗原组合物，其中包括一种SapM多肽，并且实质上不含固有的混合存在于病原性分枝杆菌培养物中的其他蛋白质或糖蛋白。

附图说明

本发明的优选实施方案结合附图进行描述，其中：

图1、(A)响应养分胁迫时，牛型结核杆菌卡介苗(BCG)培养物上清中的酸性磷酸酶活性。在标准的含天冬酰胺的Sauton培养基、低-磷酸盐Sauton、低甘油Sauton或者含铵的Sauton中培养BCG菌株至平台期早期，作3份平行试验，按照“实验规程(Experimental Procedures)”中的描述，测定培养物上清中的酸性磷酸酶活性。(B)在Sauton培养基中生长的牛型结核杆菌BCG的SapM表达。每一泳道加样等量蛋白(6μg)，通过银染(上面的部分)或通过使用SapM抗血清的Western印迹(下面的部分)显色。泳道2、4、6和8分别为来自于培养于常规Sauton培养基的BCG-Frappier、-Pasteur、-Birkhaug、和-Japan的培养物上清。泳道3、5、7、和9是培养于含铵的Sauton培养基中的相应菌株。泳道10是从mc²-155/pSAP部分纯化的SapM，泳道1是标准分子量标记物。

图2、SapM在牛型结核杆菌BCG-Birkhaug中的pH-依赖性表达。

(A)生长于Sauton培养基的BCG-Birkhaug培养物的CFP级分中测得的酸性磷酸酶活性，其中上述培养基的pH用合适的缓冲液调至指定水平。结果出自3份平行培养物。(B)将与(A)中相同的CFP级分进行SDS-PAGE分析。每一泳道加样等量蛋白(7μg)，通过银染(上面的部分)或通过使用SapM抗血清的Western印迹(下面的部分)显色。箭头所指的是部分纯化SapM包括在内作为对照。(C)来自BCG-Birkhaug的细胞表面-相关酸性磷酸酶(空心柱)及碱性磷酸酶(实心柱)活性。活性的检测是从相等数目的细胞中按照“实验规程”中的描述进行的。

图3、结核杆菌sapM在包皮垢分枝杆菌中的克隆和表达。

(A)构建pSAP：将结核杆菌基因组(BAC403)的一个3kb Nhel片段与线性化的Xbal pMD31连接。得到的质粒pSAP中含有upp、sapM(Rv33 10)和sapC(Rv33 11)。限制酶切位点：B代表BglII、H代表HindIII、K代表KpnI、V代表EcoRV、以及X代表XbaI。

(B)sapM在包皮垢分枝杆菌中的表达。将包皮垢分枝杆菌细胞培养于常规含天冬酰胺的Sauton培养基(泳道1和3)或含铵的Sauton培养基(泳道2和4)中，将CFP级分用SDS-PAGE分析，通过银染(上面的部分)或通过使用SapM抗血清的Western印迹(下面的部分)显色。泳道1、2：mc²-155/pSAP，泳道3、4：mc²-155/pMD31。箭头所指为SapM。

图4、结核杆菌sapM的pH-诱导表达。

(A)将包皮垢分枝杆菌重组菌株mc²-155/pSAP(实心柱)和对照菌株mc²-155/pMD31(空心柱)培养于调至指定pH的Sauton培养基中，测定CFP级分中的酸性磷酸酶活性。(B&C)将与(A)中相同的CFP级分进行SDS-PAGE分析，通过(B)银染色或(C)通过Western印迹显色。上面的部分来自mc²-155/pMD31，下面部分来自mc²-155/pSAP。箭头所指的是部分纯化的SapM包括在内作为对照。

图5、(A)GFP-融合载体的构建。将pSAP的2.5kb EcoRV片段与线性化的EcoRV的GFP-融合载体pFPV27连接。得到的pSAPC-GFP中含有完整的sapM基因和转录融合于gfp的截短的sapC基因。然后用BglII切割载体pSAPC-GFP。将含有sapM、gfp和载体骨架的3.8kb和2.5kb片段重连接。得到的pSAPM-GFP中含有转录融合于gfp的截短的sapM基因。(B)用带有pSAPM-GFP(A～C)、pSAPC-GFP(D～F)或克隆载体pFPV27(G～H)的海鱼分枝杆菌感染J774细胞，然后用显微镜检测。将海鱼分枝杆菌细胞培养于Sauton培养基(pH7.4)，用细菌感染J774细胞24小时后进行分析。在DIC模式(A、D和G)、针对德克萨斯-红鬼笔环肽(phalloidin)的红色荧光通道(B、E和H)以及绿色荧光通道(C、F和I)中每一视野的图像均被收集。细胞内细菌用箭头指示，细胞外的细菌用箭头尖指示。

图6、(A)基因组数据库中的结核杆菌、牛型结核杆菌、鸟结核分枝杆菌和海鱼分枝杆菌SapM同系物的对比。箭头指示的是推断的信号序列的断裂位点。(B)Southern印迹分析。用EcoRI或EcoRV消化质粒pSAP和分离自牛型结核杆菌BCG、包皮垢分枝杆菌(M.sm)和龟分枝杆菌(M.chelonae，M.ch)的染色体DNA，在琼脂糖凝胶上分离，然后转移至尼龙膜上，用放射性标记的sapM探针杂交。

图7、人血清与来自mc²-155/pSAP的部分纯化SapM的反应活性。将部分纯化的SapM在SDS-PAGE上进行电泳，然后转移至硝酸纤维素膜。分别切下每单个泳道，用1∶150稀释的人血清检测。泳道1：按照“实验规程”中的描述制备的抗合成肽的兔SapM抗血清；2：来自PPD测试阳性的健康个体的血清；3和6：PPD反应性未知的健康个体；4：已经接受了4个月化疗的淋巴结结核患者；5：痰液中有明显鸟结核分枝杆菌的患者；7：在1977年接种了BCG的健康个体；8：取自1953年接种BCG的健康个体的血清。

具体实施方式

现在结合附图对本发明进行更全面描述，并且给出了优选的实施方案。但是，本发明还可以不同方案实施，不应该被理解为限于本申请中列出的实施方案。相反，提供这些实施方案是为了使本说明书全面完整，是向本领域技术人员充分传达本发明的范围。

本申请中使用的术语“抗体”不仅包括抗体本身，还包括抗体的生物活性衍生物，例如Fab’，F(ab’).sub.2或Fv，以及单-结构域和单链抗体。抗体的生物活性衍生物保留着结合抗原的能力。

本申请所述的术语“分离的DNA序列”包括DNA单链或双链。所述序列是分离和/或纯化的(即从天然环境)，基本上为纯化或同源形式，不含或基本不含除所述启动子或启动子片段序列之外的目的物种或来源物种的核酸或基因。本发明所述的DNA序列可以是全部或部分合成的。术语“分离的”包括了所有这些可能。

本申请中使用的术语“低pH条件”是指略微酸化的条件，pH值为5.0～7.0，更优选5.8～6.6，最优选为6.2。

本申请中使用的术语“寡核苷酸”是指探针或引物，该探针或引物是单链DNA或RNA或其类似物，其包括一个核苷酸序列，该序列包括至少14个、优选至少20、更优选至少50个邻接的碱基，这些碱基与SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：4、[SEQ ID NO：9]、[SEQ ID NO：11]、[SEQ ID NO：13]、[SEQID NO：15]中任一序列中的任一段14个或更多邻接的碱基相同(或互补)。构建探针的优选区域包括[SEQ ID NO：9]、[SEQ ID NO：11]、[SEQ ID NO：13]、[SEQ ID NO：15]的5’和/或3’端编码区域。此外，[SEQ ID NO：18]的完整cDNA编码区域，或[SEQ ID NO：20]的完整序列，可用作探针。探针可以使用如下文所述的本领域熟知的方法标记，并可用于各种诊断试剂盒。

本申请所述的术语“可操作地连接(operably linked)”是指作为同一核酸分子的一部分连接，恰当地设置并延伸以从同一启动子启动转录。

本申请中使用的术语“启动子”是指一段核苷酸序列，由该序列转录可被启动在DNA上向下游可操作地连接(即双链DNA中正义链的3’端方向)。

本申请中所述的术语“启动子活性”是指启动转录的能力。

本申请中所述的术语“转录盒”是指编码要转录的核酸的核酸序列。为了使转录容易的进行，通常将核酸元件例如启动子、增强子和转录终止序列典型的包括于转录盒中。

我们已经发现SapM是分枝杆菌的致病性的重要决定因素。

与大多数细菌酸性磷酸酶不同，SapM的表达不受环境无机磷酸盐浓度的调控。取而代之，其受pH的调控。在弱酸性pH值下病原性分枝杆菌产生高水平的SapM，并且在pH6.2时表达量最大。sapM基因只存在于病原性分枝杆菌中。在宿主巨噬细胞中sapM基因选择性表达，对分枝杆菌包括结核杆菌的毒性和致病性有重要作用。结核杆菌sapM的表达由细胞内pH诱导，该基因是病原性分枝杆菌特有的。SapM具有独特的酶活性，是分枝杆菌的致病性的重要决定因素。与其它的细菌磷酸酶不同，SapM通常表现出很高的抗GTP活性，它能影响细胞GTP含量并随后影响Rab蛋白由活性形式到非活性形式的平衡。这可能部分是因为SapM是一种分泌于细胞外的小蛋白(28kD)，能够进入巨噬细胞的胞质溶胶。SapM存在于病原性分枝杆菌中而不存在于非病原性分枝杆菌中，这一重要的发现进一步说明SapM在分枝杆菌致病性中发挥着重要作用。SapM同系物发现于结核杆菌、牛型结核杆菌、牛型结核杆菌BCG、鸟结核分枝杆菌和海鱼分枝杆菌，所有这些都是致病性的。相反在非病原性的、环境的分枝杆菌，例如包皮垢分枝杆菌和龟分枝杆菌中既没有检测到SapM蛋白，也没有检测到sapM基因。

启动子片段

本发明提供了一种分离的DNA序列，其中包含一种启动子或启动子片段，该启动子或启动子片段包含[SEQ ID NO：1]、[SEQ ID NO：2]、[SEQ IDNO：3]、[SEQ ID NO：4]所示的核苷酸序列。所述启动子或启动子片段可以包含[SEQ ID NO：1]、[SEQ ID NO：2]、[SEQ ID NO：3]、[SEQ ID NO：4]提供的一个或多个核苷酸序列片段，该核苷酸序列片段足以控制目的核苷酸序列的表达并且在低pH条件下是可诱导的。所述的启动子或启动子片段可以包含结核杆菌中的[SEQ ID NO：1]中从5’端至第498位的核苷酸序列或者其它病原性分枝杆菌或病原性真菌的等价序列。

可以使用限制性酶或核酸酶消化核酸，然后通过合适的测定方法测定启动子活性所需的最小核苷酸序列。

所述的启动子或启动子片段可以包含一个或多个序列基序或元件，赋予表达发育和/或组织特异性调控或者受外源性底物或环境条件的调控。例如所述的启动子或启动子片段可以包含一个肺-特异性调控元件或受外加糖调控的元件，例如异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(thiogalactopyranoside)。

本发明还涉及具有这样核苷酸序列的启动子或启动子片段，即该核苷酸序列是通过核苷酸的添加、插入、取代或缺失得到的等位体、突变体、变异体或衍生物。核苷酸序列的改变可以通过本领域技术人员已知的技术来实现。对启动子或启动子片段或本发明所述片段作一处或多处改变可以增强或减弱启动子活性，或者降低可调节启动子或启动子片段活性的化合物或蛋白质的作用的程度。

表达载体

本发明还提供了一种含有本申请公开的启动子或启动子片段的表达载体。可以采用本领域熟知的方法将启动子或启动子片段克隆入多种载体。这类载体含有位置适当的限制性位点或者将目的核酸序列插入载体的其它方式，该目的核酸序列可操作地连接于本发明的启动子或启动子片段。这类载体含有位置适当的限制性位点或者将目的核苷酸序列插入载体的其它方式，该目的核苷酸序列可操作地连接于本发明的启动子或启动子片段。

可选择合适的载体或构建为包含适当的调控序列，包括启动子序列或其片段、终止子片段、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因以及其它的合适序列。

用于测定或实验，可以采用商业上提供的载体如pET-系列(Stratagene)、pPRO-系列(Clontech)、pTet-系列(Clontech)、BacPAK系统(Clontech)。为了用于基因治疗，可以使用pT-Rex、plND、pcDNA、pVAX1和pEF等载体。表达载体可用于提供高水平的多肽表达。用本发明DNA序列转化的细胞培养物可用作研究工具，特别用于研究SapM对吞噬体运输及成熟中的作用的工具。细胞培养物可用于过表达以及根据本领域已知的多种技术的研究。例如，可以用含有本发明转录盒的载体转染细胞系(无限传代的细胞培养物或原代细胞培养物)，这样可以对产生的目的核酸的水平、多肽、功能及该细胞的表型进行评定。

详细描述参见，例如，分子克隆：实验手册(Molecular Cloning：aLaboratory Manual)，第二版Sambrook et al.，1989 Cold Spring HarborLaboratory Press。将DNA导入细胞的方法取决于所用的宿主，但这些方法是众所周知的，例如电穿孔和磷酸钙转化法。

宿主细胞

本发明的另一方面提供了一种含有本发明转录盒的宿主细胞。特别理想的宿主细胞包括结核杆菌、海鱼分枝杆菌、牛型结核杆菌、牛型结核杆菌BCG、包皮垢分枝杆菌、鸟结核分枝杆菌复合体的成员、大肠杆菌(及衍生物如大肠杆菌BL21(DE3))、昆虫细胞系如Sf21，用于蛋白质过表达，和哺乳动物细胞系，例如RAW和J774。适于在sapM启动子调控下表达的合适的基因的实例有：抗原85基因(fbpA、fbpB、fbpC)、19-Kd脂蛋白基因(lppo)和α-晶状体蛋白基因(acr)。

本领域已知的转化方法包括但不限于，电穿孔，氯化铷、氯化钙、磷酸钙或氯喹转染，病毒转染，噬菌体转导及微注射，以及使用阳离子脂类和脂类/氨基酸复合物、或脂质体、或多种商业上可获得的物质，以及易于合成的转染佐剂，这些都能用于将SapM核酸分子转入宿主细胞。

宿主细胞培养于常规养分的培养基中。可对培养基进行修饰从而利于诱导启动子、扩增目的核酸序列或筛选转化体。培养条件，例如温度、组成及pH是显而易见的。转化后可根据可选择的表型鉴定转化体。

诊断方法

sapM核酸、SapM蛋白或SapM磷酸酶活性的检测可作为一种工具，筛查病原性分枝杆菌或病原性真菌感染的存在，或者监测病原性分枝杆菌或病原性真菌感染病程。

本发明涉及一种诊断受试者病原性分枝杆菌感染或病原性真菌感染的方法，该方法包括：

a)从受试者获得生物学样本；和

b)分析样本中有无针对SapM[SEQ ID NO：10]、[SEQ ID NO：12]、[SEQID NO：14]、[SEQ ID NO：16]的特异性抗体存在，其中检测到针对SapM[SEQID NO：10]、[SEQ ID NO：12]、[SEQ ID NO：14]、[SEQ ID NO：16]的特异性抗体就表示存在病原性分枝杆菌感染或病原性真菌感染。

通过在免疫测定中使用SapM分析样本中特异性抗SapM的抗体的存在，其中可将SapM在液相或结合于固相载体来使用。此外，用各种可检测的方式标记SapM，用于使用抗SapM抗体的免疫测定。用于本发明的检测抗SapM抗体的优选免疫测定方法包括放射免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)，或其它本领域已知的测定，例如免疫荧光测定、化学发光测定或生物发光测定。

a)从受试者获得核酸样本；和

b)分析样本中编码SapM的核酸的存在，其中检测到sapM就表示存在病原性分枝杆菌感染或病原性真菌感染。

可以通过例如PCR分析、DNA测序、SSCP分析或RFLP分析，测定样本中编码SapM的核酸的存在。

另一个实施方案中，本发明涉及一种诊断受试者病原性分枝杆菌感染或病原性真菌感染的方法，该方法包括：

a)从受试者获得生物学样本；和

b)分析样本中SapM磷酸酶活性的存在，其中检测到SapM磷酸酶活性就表示存在病原性分枝杆菌感染或病原性真菌感染。

分析样本中SapM磷酸酶活性的存在，可以通过使用以GTP和/或NADPH为辅助因子，以对-硝基苯基磷酸盐为底物进行酸性磷酸酶测试来实现。

对sapM核酸、SapM蛋白或SapM磷酸酶活性的检测不仅可用于诊断受试者病原性分枝杆菌感染或病原性真菌感染，而且也可用于监测治疗应答、预后测评、患者疾病风险测评，以及监测对危险患者施行的疾病防止干预措施的成功。

其它测定(以及上述测定的变化方式)都可从本发明说明书及技术中清楚地看出。

筛选方法

本发明还涉及一种筛选合成化合物或蛋白质的方法，所述化合物或蛋白质能够调节或调控本发明启动子或启动子片段DNA的启动子活性。一种鉴定可调节或调控SapM启动子或启动子片段的启动子活性的合成化合物或蛋白质的方法包括：

a)使用或提供一种含有SapM启动子[SEQ ID NO：1]、[SEQ ID NO：2]、[SEQ ID NO：3]、[SEQ ID NO：4]功能部分的核酸构建体，所述的启动子功能部分可操作地连接于一个能产生可检测信号的报道基因；

b)将该核酸构建体暴露于候选化合物或蛋白质中；和

c)与没有待测化合物或蛋白质存在时产生的信号进行对比。

优选，报道基因编码一种催化能产生可检测信号的反应的酶。已知许多实例，例如，编码绿色荧光蛋白的gfp(以及编码增强绿、蓝/蓝绿色及黄色荧光蛋白的gfp变异体)、编码红色荧光蛋白的DsRed、编码β-半乳糖苷酶的lacZ、编码β-葡糖透明质酸酶(Beta-glucoronidase)的gus、编码细菌荧光素酶的luxAB(或lucCDABE)、编码萤火虫荧光素酶的luc以及编码碱性磷酸酶的phoA。

本领域技术人员都熟知许多可用的报道基因以及可用于测定基因活性的测试技术。任何一种合适的报道基因/测试技术都可使用，应当理解本发明不局限于任何具体选择。

报道基因可用于体外或体内表达系统。除启动子或启动子片段外，表达通常还需要有翻译起始区域以及转录和翻译终止区域的存在。

本发明的另一实施方案涉及一种筛选可调节或调控SapM磷酸酶活性的合成化合物或蛋白质的方法，该方法包括：

a)将含有SapM[SEQ ID NO：10]、[SEQ ID NO：12]、[SEQ ID NO：14]、[SEQ ID NO：16]、一种SapM底物以及待测化合物的混合物进行孵育；

b)测定磷酸酶活性；和

c)与没有待测化合物或蛋白存在时测定的磷酸酶活性进行对比。

所述底物包括pNPP、GTP或NADPH。

本发明的另一实施方案涉及一种筛选可调节或调控SapM分泌的合成化合物或蛋白质的方法，该方法包括：

a)将分枝杆菌细胞暴露于待测化合物或蛋白质中，其中所述分枝杆菌细胞分泌SapM[SEQ ID NO：10]、[SEQ ID NO：12]、[SEQ ID NO：14]、[SEQID NO：16]；

b)检测该分枝杆菌细胞分泌的SapM[SEQ ID NO：10]、[SEQ ID NO：12]、[SEQ ID NO：14]、[SEQ ID NO：16]的存在或活性；和

c)与没有待测化合物或蛋白存在时SapM[SEQ ID NO：10]、[SEQ ID NO：12]、[SEQ ID NO：14]、[SEQ ID NO：16]的分泌情况进行对比。

术语“调控”(moduation，modulates和modulating)是指表达或活性的增强、表达或活性的减弱、存在表达或活性的类别或类型的改变、表达或活性完全停止(即，无表达或活性)、或者刺激表达或活性。可以使用的合适的化合物包括但不限于蛋白质、核酸、小分子、激素、抗体、肽、抗原、细胞因子、生长因子、药剂包括化疗剂、致癌物、或其它细胞(即细胞-细胞接触)。还可使用细胞筛查环境或物理因素如辐射、作用力等对正常基因表达的影响。

其它测试(以及上述测试的变化形式)可从本发明的说明书以及美国专利US5,851,788、5,736,337及5,767,075中公开的技术清楚地看出，这些文献在此全文引入作为参考。例如可以将待测化合物含量固定或提高，将一系列化合物同时测定。

试剂盒

本发明包括一种用于检测SapM核酸分子存在的试剂盒，该试剂盒包括至少一种本发明所述探针。试剂盒可用已知技术制备，例如，参见专利US5,851,788和5,750,653。所述试剂盒优选包括适于探针与互补核酸序列杂交的试剂。本发明还包括一种用于检测SapM蛋白存在的试剂盒，该试剂盒包括至少一种本发明所述抗-SapM的抗体。试剂盒可用已知技术制备，例如，参见专利US5,851,788和5,750,653。

所述试剂盒优选包括一种抗体、一种适于该抗体与抗体识别的多肽之间形成免疫复合物的介质以及一种能用于检测免疫复合物从而验证生物样本中存在有SapM或类似多肽的试剂。另有文献提供了使用抗体的背景，例如美国专利US5,695,931和US5,837,472，在此引入作为参考。

抗体制备

本发明包括一种能够与本发明所述多肽发生免疫反应的分离的抗体。优选地制备抗天然SapM[SEQ ID NO：10]、[SEQ ID NO：12]、[SEQ ID NO：14]、[SEQ ID NO：16]的抗原决定部位或者抗SapM[SEQ ID NO：10]、[SEQ ID NO：12]、[SEQ ID NO：14]、[SEQ ID NO：16]的合成多肽的抗原决定部位。抗体可以用可检测标记物标记，也可不作标记。所述抗体优选为单克隆抗体或多克隆抗体。可以用抗SapM的抗体筛选含有SapM多肽的微生物。所述抗体也可用于从粗制提取物中免疫纯化多肽。例如可以在允许该抗体与该抗体所识别多肽间形成免疫复合物的条件下，让生物样本与所述抗体接触；然后检测有无出现上述免疫复合物从而检测该样本中是否存在SapM或类似多肽。本发明还包括组合物，优选地包含所述抗体、一种利于在该抗体与该抗体识别的多肽之间形成免疫复合物的介质、以及一种能用于检测免疫复合物从而确定生物样本中存在有SapM或类似多肽的试剂。

为了识别SapM，可以制备多种抗体，能在整个分子中抗一系列独特的抗原决定部位，例如[SEQ ID NO：22](NDMHDGSI)。可以制备以N-末端信号序列为靶的多个抗体，阻断SapM的分泌。此外，这些抗体，或者抗其他SapM抗原决定部位的抗体，能够通过加强SapM清除/降解来阻断SapM的活性，同时SapM磷酸酶活性随之减弱。

单克隆及多克隆抗体可以用本申请说明书的描述和本领域已知的技术来制备。单克隆抗体制备和使用方法的实例，参见美国专利5,688,681、5,688,657、5,683,693、5,667,781、5,665,356、5,591,628、5,510,241、5,503,987，5,501,988、5,500,345和5,496,705，其全部内容在此引入作为参考。多克隆抗体制备和使用的实例公开于美国专利5,512,282、4,828,985、5,225,331和5,124,147，其全部内容在此引入作为参考。

本发明还包括使用所述抗体的方法。例如，本发明包括一种用于检测SapM多肽如[SEQ ID NO：10]、[SEQ ID NO：12]、[SEQ ID NO：14]、[SEQ IDNO：16]或[SEQ ID NO：22]的方法，通过：a)让含有一种或多种多肽的样本与本发明的抗体在适于该抗体能与其进行特异性反应的多肽相结合的条件下接触；b)将未结合的多肽与抗体分离；以及c)检测与样本中一种或多种多肽保持结合的抗体。

致免疫的组合物

本领域技术人员应该能够认识到施用本发明所述致免疫的组合物的合适方法已经存在。优选地，该组合物通过非胃肠道途径施用，例如静脉内、动脉内、鞘内(intrathecally)、皮下、皮内或肌内。对于非胃肠道组合物有效的药物载体的要求已为本领域普通技术人员所熟知(参见，例如，Bankerand Chalmers(eds.)，Pharmaceutics and Pharmacy Practice，J.B.LippincottCompany，Philadelphia，PA，(1982)and Toissel，ASHIP Handbookon InjectableDrugs(4^th ed.))。所述溶液可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、以及能使所述制剂与待接受者血液等渗的溶质，以及能包括悬浮剂的含水及无水的无菌悬液、增溶剂、增稠剂、稳定剂以及防腐剂。可以将化合物置于生理学可接受的药物载体的溶剂中施用，例如无菌液体或液体混合物，包括水、盐水，右旋糖水溶液及相关糖溶液，醇例如乙醇、异丙醇或十六烷基醇，二元醇例如丙二醇或聚乙二醇，二甲亚砜，甘油缩酮(glycerol ketals)例如2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-甲醇，醚例如聚乙二醇400，油，脂肪酸，脂肪酸酯或甘油酯或乙酰化脂肪酸甘油酯，并添加或不添加药物上可接受的表面活性剂的，例如脂肪酸盐(soap)或去污剂，悬浮剂例如果胶、卡波姆(carbomers)、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素，或者乳化剂以及其他药用佐剂。

可用于非胃肠道制剂的油包括石油、动物油、植物油或合成油。可用于这类制剂的油的实例的包括花生油、大豆油、棉籽油、玉米油、橄榄油、矿脂以及矿物油。用于非胃肠道制剂的合适脂肪酸包括油酸、硬脂酸以及异硬脂酸。油酸乙酯和异丙基豆蔻酸酯是合适脂肪酸酯的实例。

可用于非胃肠道制剂的脂肪酸盐包括脂肪族碱金属(fatty alkali metal)、铵和三乙醇胺盐(triethanolamine salt)，以及合适的去污剂包括阳离子去污剂、阴离子去污剂、非离子型去污剂、两性去污剂及其混合物。

非胃肠道制剂通常在溶液中含有约0.5％～约25％重量百分比的活性成分。可以使用防腐剂和缓冲液。可以将非胃肠道制剂存放于单剂或多剂的密封盛器中，并可以是冻干的。可以将无菌粉末、颗粒及片剂配制为即用型注射液及悬液。局部用剂，包括那些用于经皮(transdermal)药物释放的剂型，为本领域技术人员所熟知，适合于本发明皮肤给药的范畴。

适于口服给药的剂型可以由溶液、胶囊、粉末、悬液和合适乳剂组成。液态制剂可以包括稀释液，例如水和醇。胶囊形式可以是常见的硬壳或软壳凝胶形式，其中含有，例如，表面活性剂、滑润剂以及惰性填充物如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉。片剂形式可以包括赋形剂、着色剂、稀释液、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐剂、调味剂以及药物上相容的赋形剂。

本发明所述的致免疫的组合物可以制备为通过吸入给药的气雾剂。适于气雾给药的剂型包括表面活性剂和抛射剂。也可以包括一种鼻内输送的载体。

本发明的组合物可通过与一系列基质，例如乳化基质或水溶基质，混合以栓剂的方式施用。适于阴道给药的剂型可以为阴道栓剂、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、发泡剂(foams)或喷雾剂。

用于致免疫的组合物的SapM蛋白或其多肽片段的浓度可以有很大变化，即，从通常的低于约1％或至少约10％至高达20％～50％或更高的重量百分比，并根据所选用的特定施用模式，来主要选择流体体积、粘度等。制备可非胃肠道施用组合物的实际的方法已为本领域技术人员所知或是显而易见的，更详细的描述，例如，Remington′s Pharmaceutical Science(17th ed.，Mack Publishing company，Easton，PA，(1985))。

本发明的化合物也可配制为包合络合物(inclusion complexes)或脂质体。脂质体的作用为将SapM蛋白或其多肽片段多肽靶向特定组织。脂质体能够延长组合物的半衰期。

疫苗制备及用途

适合用作疫苗的致免疫的组合物可以由SapM蛋白及其多肽片段以及编码SapM蛋白及其多肽片段的核酸分子制备而成。疫苗制备及使用方法的实例，参见美国专利4,601,903、4,599,231、4,599,230和4,596,792，在此引入作为参考。

致免疫的组合物包括疫苗可以制备为可注射的溶液或悬液；也可以制备为适合在注射前配制为溶液、悬液的固体形式。也可以将制剂乳化，或者将蛋白包裹于脂质体内。活的(live)致免疫的成分往往与药物学可接受且与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂为，例如，水、盐水、右旋糖(dextrose)、甘油、乙醇等及他们的组合。此外，如果需要，所述疫苗还可以包括少量的辅助物质例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、和/或能增强疫苗效果的佐剂。有效佐剂的实例包括但不限于：氢氧化铝、N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称为正-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-锡-丙三基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2(1’-2’-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamine，CGP 19835A，称为MTP-PE)、以及RIBI，RIBI中包含的3种提取自细菌的三种成分：单磷酰脂A、海藻糖二梅菌酸酯(trehalose dimycolate)和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)，存在于2％角鲨烯/Tween80^TM乳液中。

佐剂的效果可以通过测量抗致免疫的多肽的抗体的量来测定，该致免疫的多肽是通过施用也含有各种佐剂的SapM疫苗得到的含SapM抗原序列的致免疫的多肽。

疫苗通常通过非胃肠道途径施用，通过注射，例如通过皮下注射或肌内注射。适于其它给药方式的其它剂型包括栓剂以及，在某些情况下，口服剂型。就栓剂而言，可以包括常用的粘合剂和载体，例如，聚(亚烷基)二醇或甘油三酯；这类栓剂可由含0.5％～10％，优选含1％～2％的活性成分的混合物制成。口服剂型包括常用的赋形剂，如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸钠等。这些组合物采用溶液、悬液、片剂、丸剂、胶囊、缓释剂或粉末，其中含10％～95％的活性成分，优选25％～70％。该疫苗可以与剂量剂型相适配的方式施用，其用量为预防有效量和/或治疗有效量。

所述疫苗可以单剂疗程施用或者优选以多剂疗程施用。多剂疗程的首次接种过程可以分别给予1～10剂，随后的其他剂量可间隔一段时间施用，如1～4个月给予第二剂，以保持和/或加强免疫反应。如果需要，几个月后可以再次给予一剂或多剂。此外，给药方案，至少部分的，由个体需要决定，且根据临床医师的判断而定。

此外，所述疫苗可与其它免疫调节剂结合使用，例如免疫球蛋白。

核酸分子

功能等价的核酸分子或多肽序列

术语“分离的DNA序列”是指结构与任何天然生成的DNA序列或者与跨越三个以上独立基因的天然生成的DNA序列的任何片段不同的DNA序列。因此，该术语包括，例如，(a)具有天然生成基因组DNA分子部分序列的DNA；(b)以下述方式分别将一个DNA序列引入一个载体或引入原核或真核生物的基因组DNA，在某种意义上，所得到的分子即不同于任何天然生成的载体，也不同于基因组DNA；(c)一个独立的分子例如cDNA，一个基因组片段，一个通过反转录polyA RNA得到的片段，polyA RNA可以通过PCR扩增得到，或者一个限制酶切片段；以及(c)作为杂合基因的一部分的一个重组DNA序列，即编码一个融合蛋白的基因。该定义特别排除的为存在于(i)DNA分子、(ii)转染细胞以及(iii)细胞克隆的混合物中的核酸，例如，存在于DNA文库如cDNA文库或基因组DNA文库中的DNA。

能够得到化学等价或化学类似的氨基酸序列而对DNA序列的修饰，包括在本发明的范围之内。修饰包括核苷酸的取代、插入或缺失或者改变核苷酸的相对位置或顺序。

本发明多肽的变体可以天然生成如通过突变，或者用多肽工程技术制备例如本领域熟知的用于氨基酸取代的定点诱变。例如，可以将疏水残基如丙氨酸用更疏水的残基如亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸取代。可以将带负电的氨基酸如天冬氨酸用谷氨酸取代。可以将带正电氨基酸如赖氨酸取代为另一带正电的氨基酸如精氨酸。

因此，本发明包括具有氨基酸序列保守变化或取代的多肽。保守取代插入一个或多个与所取代氨基酸具有类似化学特性的氨基酸。本发明包括那些具有不破坏SapM活性的保守取代的序列。

本发明还包括用于给予SapM活性的本发明的多肽的多肽片段，如果该片段保持有活性的化。本发明还包括可作为表征多肽或其活性的研究工具的本发明的多肽的多肽片段。所述多肽优选含有至少5个氨基酸。在优选的实施方式中，他们可含有本发明的多肽的6～10、11～15、16～25、26～50、51～75、76～100或101～250个氨基酸(或更长的氨基酸序列)。所述片段优选具有SapM活性。片段还可包括具有一个或多个氨基酸缺失的序列，例如一个SapM序列中的C-末端的氨基酸。

本发明还包括那些具有为增强或减弱SapM活性而进行保守取代的序列。

含有一个或多个d-氨基酸的多肽也在本发明的范围之内。本发明还包括那些N-末端上有一个或多个乙酰化的氨基酸的多肽。本领域技术人员应该认识到现有的很多技术能够构建具有相同或近似期望SapM活性的多肽模拟物作为相应的本发明多肽化合物，而较原多肽在溶解度、稳定性和/或对水解及蛋白酶解敏感度方面具有更为有利的活性。参见，例如，Morgan andGainor，(1989)Ann.Rep.Med.Chem.，24：243-252。多肽模拟物的实例的描述见美国专利No.5,643,873。其他描述如何制备和使用模拟物的专利包括，5,786,322、5,767,075、5,763,571、5,753,226、5,683,983、5,677,280、5,672,584、5,668,110、5,654,276、5,643,873。本发明多肽模拟物还可根据本领域已知的其他技术制备，例如，用能够通过将氢原子转化为其他基团如羟基或氨基的化学手段改变侧基的试剂处理本发明多肽。

模拟物优选包括完全由氨基酸组成的序列，或者包含氨基酸及修饰氨基酸或其他有机分子的杂合序列。

本发明还包括杂合的核酸分子及多肽，例如，来自某一物种的sapMDNA序列与来自植物、哺乳动物、细菌或酵母的序列的核苷酸序列结合，编码一种融合蛋白。本发明包括一种具有至少两种组分的融合蛋白，其中该融合蛋白的第一组分包括本发明的一个多肽，优选为全长SapM多肽(或其部分，见下文)。该融合蛋白的第二组分包括一个标记物，例如GST，附加表位或酶。所述融合蛋白还可包含组织化学或细胞化学标记物，例如lacZ、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，或者荧光标记物，例如GFP或其衍生物中的一种。

本发明还包括一种组合物，其中含有全长或部分的本发明的分离DNA分子(优选sapM[SEQ ID NO：9]、[SEQID NO：11]、[SEQID NO：13]、[SEQIDNO：15])，可以含有或不含有载体，优选为用于细胞转化的组合物。本发明还包括一种组合物，其中包括含有或不含有载体的SapM多肽(优选为SapM[SEQID NO：10]、[SEQ ID NO：12)、[SEQID NO：14]、[SEQID NO：16]or[SEQ ID NO：22])，优选用于研究或调节多肽活性。

序列同一性

本发明包括修饰的核酸分子，该分子与[SEQ ID NO：1]～[SEQ ID NO：4]或者[SEQ ID NO：9]、[SEQID NO：11]、[SEQID NO：13]、[SEQID NO：15](或其部分序列或者其互补序列)提供的DNA序列具有至少约：＞17％，＞20％，＞30％，＞40％，＞50％，＞60％，＞70％，＞80％或＞90％，更优选至少约＞95％，＞99.5％的序列同一性。优选地，约1、2、3、4、5、6～10、10～25、26～50、51～100或101～250个核苷酸被修饰。序列同一性最优选用BLAST 2.1版程序高级搜索(BLAST version 2.1 program advanced search)的算法进行测算(参数如上)。BLAST是由下列网址在线提供的一系列程序：http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST。

BLAST搜索的参考文献有：

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Madden，T.L.，Tatusov，R.L.& Zhang，J.(1996)″Applications of networkBLAST server″Meth.Enzymol.266：131-141.

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Zhang，J.& Madden，T.L.(1997)″PowerBLAST：A new network BLASTapplication for interactive or automated sequence analysis and annotation.″Genome Res.7649-656

其他物种的同源sapM核酸分子编码的多肽与[SEQ ID NO：10]、[SEQIDNO：12]、[SEQ ID NO：14]、[SEQ ID NO：16](或其部分序列)提供的氨基酸序列具有至少约：＞20％，＞25％，＞28％，＞30％，＞40％或＞50％的氨基酸序列同一性。一些物种的多肽与[SEQ ID NO：10]、[SEQID NO：12]、[SEQ ID NO：14]、[SEQ ID NO：16](或其部分序列)所示的全长或部分氨基酸序列具有至少约：＞60％，＞70％，＞80％或＞90％的序列同一性，更优选至少约：＞95％，＞99％或＞99.5％。同一性可以用本领域已知方法计算。序列同一性最优选用BLAST 2.1版程序高级搜索进行测算(参数如上)。优选地，约1、2、3、4、5、6～10、10～25、26～50、51～100或101～250个核苷酸或氨基酸被修饰。

本发明包括突变的核酸分子，这些突变导致不涉及提供SapM活性的多肽部分内的氨基酸的变化，或者导致涉及提供SapM活性的多肽部分内的氨基酸的变化，从而增强或减弱多肽的活性。

本发明的序列可以用多种技术制备。本发明不限于任一具体的制备方法。例如，本发明核酸分子可以通过下列方法制备：cDNA克隆、基因组克隆、cDNA合成、聚合酶链反应(PCR)或这些方法的结合(Current Protocols inMolecular Biology，F.M.Ausbel etal.，1989)。序列可以用熟知的方法和设备例如自动合成仪，来合成。

杂交

可以用DNA-DNA或DNA-RNA杂交技术分离出SapM DNA分子的其他功能等价形式。在不明显影响其活性的前提下可以对这些核酸分子及SapM序列进行修饰。

本发明还包括这样的核酸分子，它们能够与[SEQ ID NO：1]～[SEQ IDNO：4]和[SEQ ID NO：9]、[SEQID NO：11]、[SEQID NO：13]、[SEQID NO：15](或其部分序列或者其互补序列)所示DNA序列中的一个或多个进行杂交，而且编码的肽或多肽表现出与[SEQ ID NO：10]、[SEQID NO：12]、[SEQ IDNO：14]、[SEQ ID NO：16]中的DNA产生的SapM多肽具有基本相等的活性。这些核酸分子优选能够在本申请定义的低度、中度(介于高度和低度之间)或高度严谨的条件下(参见Sambrook et al.(最新版)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；Ausubel et al.(eds.)，1995，Current Protocols in Molecular Biology，(John Wiley & Sons，NY))与SapM或其互补体的全长或部分进行杂交。核酸分子发生杂交的部分通常长度为至少15(例如20、25、30或50)个核苷酸。杂交核酸分子发生杂交的部分与编码SapM多肽的核酸分子或其互补体具有至少80％，例如至少95％或至少98％的同一性。本申请中典型描述的杂交核酸分子可以用作，例如克隆探针、引物(例如，PCR引物)或诊断探针。寡核苷酸探针与核酸样本的杂交通常在严谨条件下进行。核酸双链体或杂合体的稳定度用解链温度或Tm来表示，也就是能够将探针从靶DNA分离开来的温度。该解链温度可用于定义严谨条件。如果序列被定义为与探针相关且基本相同，而不是相同，那么可用于首先建立最低温度，该温度在特定盐浓度下只发生同源杂交(例如，SSC或SSPE)。假定从Tm开始降低1℃有1％的错配发生，那么杂交反应的最终洗涤温度随之降低(例如，如果搜索与探针具有大于95％同一性的序列，那么最终的洗涤温度降低5℃)。实际上，每1％错配，Tm的变化为0.5～1.5℃。涉及杂化的低度严谨条件为约：1×SSC，0.1％SDS，50℃。高度严谨条件为：0.1×SSC，0.1％SDS，65℃。中度严谨条件为约：1×SSC，0.1％SDS，60℃。可以调节盐浓度和温度的参数以使探针和靶核酸之间达到最佳水平的同一性。

本发明还包括经过修饰或者没有经过修饰的任一来源的核酸分子，这些分子能够在与本申请所述相同的盐及温度条件下与编码SapM多肽氨基酸序列的基因组DNA、cDNA或合成DNA分子或基因降解形式(geneticallydegenerate forms)杂交，而且其编码的肽或多肽具有SapM活性。优选地，所述多肽具有与SapM多肽相同或近似的活性。如果上述核酸分子编码的多肽能够被SapM-特异性抗体以特定方式识别，包括但不限于本申请所列抗体，那么就可以认为该核酸分子与本发明所述sapM核酸分子功能等价。

在生长于氯化铵上的牛型结核杆菌BCG中的诱导表达sapM

细菌的酸性及碱性磷酸酶通常受环境无机磷酸盐浓度调控(综述见(Rossolini et al.，1998))。这些酶能够使外源磷酸化的成分催化水解为无机磷酸盐，它们通常在磷酸盐缺乏的条件下诱导表达。然后通过膜通透酶将这些基本有限养分运输到细胞内。最近研究表明：结核杆菌的SapM是一种分泌至培养基中的酸性磷酸酶(Saleh and Belisle，2000)。为了测定SapM是否参与磷酸盐同化作用，我们测定了环境磷酸盐浓度对SapM表达及活性的影响。将4株牛型结核杆菌BCG，它们是与结核杆菌紧密相关的微生物，培养于含3种不同无机磷酸盐浓度的Sauton培养基中，磷酸盐浓度分别为0.05、0.5和5.0g/L，然后测定培养基过滤蛋白(culture filtrate protein，CFP)级分中的酸性磷酸酶活性。在这些条件下，酸性磷酸酶活性很低，为40-到130-nmol·hr^-1·mg^-1(总蛋白)。与大多数细菌酸性磷酸酶不同，BCG培养物的CFP级分中的酸性磷酸酶活性不受磷酸盐浓度的调控，磷酸盐的缺乏不能增加其活性(图1A)。培养基中碳源的短缺也不能影响该酶活性(图1A)。

值得关注的是，在生长于以氯化铵(NH₄Cl)作氮源的培养基中的BCG中检测到了高水平的酸性磷酸酶活性(图1A)。原始Sauton培养基含有27mM天冬酰胺作为基本氮源。用等摩尔浓度的NH₄Cl取代天冬酰胺，将新鲜培养基调至pH7.4。所测试的BCG菌株，BCG-Birkhaug、-Japan、-Frappier和-Pasteur，都在含铵的Sauton培养基中正常生长。在这些条件下制备的CFP级分表现出比生长于原始Sauton中的高得多的酸性磷酸酶活性(图1A)。BCG-Birkhaug表现惊人，活性升高了25倍，从136-升至3,459-nmol·hr^-1·mg^-1。其他BCG菌株的酸性磷酸酶活性提高了5至10倍。调整含铵Sauton培养基中磷酸盐或甘油浓度不会改变酶活性的水平(数据未显示)。

此前表明SapM是结核杆菌培养物胞外级分中检测到的唯一的酸性磷酸酶(Saleh and Belisle，2000)。为了测定SapM是否对观察到的酸性磷酸酶活性升高有贡献，用SDS-PAGE分析CFP级分。如图1B所示，培养于含铵Sauton中的BCG-Birkhaug出现了一条银染可见的蛋白条带，而生长于常规Sauton培养基中的培养物未显现该蛋白条带。该蛋白条带的迁移率对应于成熟SapM蛋白的分子量(～28kD)，并且对应于部分纯化SapM蛋白的分子量。为了证实该蛋白的同一性，用对应于SapM蛋白第201-208位氨基酸残基的合成肽制备抗体，进行Western印迹试验。确实，上述28-kD蛋白与抗-SapM抗血清反应，这表明该蛋白就是SapM(图1B)。就其他BCG菌株而言，几乎观察不到SapM蛋白，这与这些菌株中检测到较低水平酶活性相关(图1A)。

牛型结核杆菌BCG的SapM选择性表达于弱酸性pH

为什么SapM能够在含NH₄Cl的培养基中诱导表达的问题不是立即就弄清楚了的。尽管我们最初的假设是sapM受氮源的可用性调控，但是氮缺乏并没有改变SapM的表达或活性(数据未显示)。但是，铵(NH₄ ⁺)的摄入是由膜转运蛋白完成的，其将铵的摄入与H⁺的输出相偶联(Westhoff et al.，2002)。这会导致培养基逐渐酸化。实际上，测量使用过的BCG培养基的pH值表明：细胞生长导致含NH₄Cl的Sauton培养基酸化(即，pH从7.4变为5.8～6.2)，而含天冬酰胺的Sauton培养基的pH仍为7.4-7.8。

因此，我们假设培养基的酸化是诱导SapM表达的原因。为了测试这一点，将BCG-Birkhaug培养于含天冬酰胺的Sauton培养基(pH7.4)，然后洗涤细胞部分，并将其培养于相同培养基上，但用合适的缓冲液将pH分别调至7.0、6.6、6.2和5.8。测定这些培养物CFP级分的酸性磷酸酶活性，表明酸性磷酸酶活性水平与培养基pH之间相关(图2A)。在pH7.0～7.4下，酸性磷酸酶活性水平很低。在弱酸性条件下(即，pH5.8～6.6)，检测到了高水平的酸性磷酸酶活性，并且在pH6.2时为最大值(图2A)。SDS-PAGE和Western印迹分析证实SapM在pH5.8～6.6被诱导表达(图2B)，这与相同pH下高水平酶活性非常相关。这些结果表明sapM选择表达于弱酸性pH。生长于pH5.8～6.2的BCG-Birkhaug中检测到的SapM活性近似于生长于含铵Sauton培养基中的活性(对比图1A & 2A)，这表明上述的铵诱导SapM表达实际上反映的是pH的作用。

在pH7.0～7.4下，银染或Western印迹都没有检测到SapM(图2B)，这表明SapM水平很低或低于检测下限，这一点与这些pH值下检测到的残留酸性磷酸酶活性相一致(图2A)。或者，所述的残留磷酸酶活性源自小部分的细胞表面-相关的酸性磷酸酶，这些酸性磷酸酶在培养过程中渗漏到外部培养基中。除SapM外，结合杆菌只有一个基因产物，Rv2577，被认为是酸性磷酸酶(Cole et al.，1998)。但是，Rv2577不具有输出信号序列，而显示出是细胞表面相关的(Braibant and Content，2001)。BCG的细胞表面-相关的酸性磷酸酶及碱性磷酸酶的活性不受培养基pH变化的影响(图2C)，表明该pH-依赖性表达是SapM的特性。

结核杆菌sapM在包皮垢分枝杆菌中的克隆和表达

SapM最初是通过生化方法从生长于甘油-丙氨酸-盐(GAS)培养基中的结核杆菌H37Rv的胞外培养基鉴定得到的(Saleh and Belisle，2000)。和我们的含铵Sauton培养基一样，GAS含有NH₄Cl作为氮源，并且使用过的GAS培养基呈现弱酸性(数据未显示)。为了证实结核杆菌的SapM与牛型结核杆菌BCG具有相同的特性，将含sapM基因的DNA片段(Rv3310)克隆到穿梭载体pMD31以制备pSAP(图3A)，然后将pSAP转化入包皮垢分枝杆菌mc²-155。包皮垢分枝杆菌染色体缺失sapM基因，胞外CFP级分中没有检测到SapM活性(见下文)。但是，将含sapM的重组包皮垢分枝杆菌培养于含NH₄Cl的Sauton培养基中，在对CFP级分进行SDS-PAGE和Western印迹分析时检测到了SapM蛋白(图3B)。生长于含天冬酰胺的Sauton中的pSAP菌株和含克隆载体pMD31的对照菌株没有SapM。这些结果表明包皮垢分枝杆菌够表达和分泌结核杆菌的sapM基因。

为了测定结核杆菌sapM是否受pH调控，将mc²-155/pSAP培养于调至上述不同pH水平的Sauton培养基(含有天冬酰胺)中。SapM的酶活性和蛋白浓度相互关联，二者都依赖于培养基的pH(图4A～C)。在pH5.8～6.6下检测到高水平的SapM表达和活性，这与牛型结核杆菌BCG中得到的结果一致。只含有克隆载体的对照菌株表现残留的酸性磷酸酶活性，这可能是由于细胞表面-相关酸性磷酸酶的渗漏，这种酶活性不受pH诱导。

结核杆菌sapM基因在巨噬细胞中选择性表达

我们的体外研究表明sapM选择性表达于pH5.8～6.6，这一pH水平与含分枝杆菌的弱酸性吞噬体相一致(pH6.1～6.5)(Sturgill et al.，1994)，这表明sapM表达诱导于巨噬细胞内。为了说明sapM的体内表达，构建了两种转录融合体。pSAPM-GFP包含sapM编码区域上游的560bp和3′末端截短了67bp的sapM基因。pSAPC-GFP含有相同的560bp sapM启动子片段、完整的sapM基因和3′末端截短了183bp的sapC基因(Rv3311)(图5A)。sapM和sapC表现为共转录。这两种载体中，所述截短基因在转录水平上融合(transcriptionally fused)于无启动子突变绿色荧光蛋白(mGFP)(Barker etal.，1998)。将这些构建体与克隆载体pFPV27一起转化入一种鱼类病原体，海鱼分枝杆菌中，也从染色体基因座位(loci)产生SapM(见下文)。将重组海鱼分枝杆菌菌株培养于含天冬酰胺的Sauton培养基(pH7.4)中，其中sapM的表达未被诱导或以极低的水平诱导，可用其感染鼠的巨噬细胞-样细胞系J774A.1。正如所料，在巨噬细胞中，含pSAPM-GFP或pSAPC-GFP的海鱼分枝杆菌显现明亮的荧光，而细胞外的细菌荧光极弱(图5B)。含克隆载体pFPV27(图5B)或其中sapM启动子反方向插入的构建体(数据未显示)的海鱼分枝杆菌菌株不显现荧光。这一结果与我们的上述体外实验数据一起说明：sapM是被所培养巨噬细胞的分枝杆菌吞噬体的弱酸性环境诱导的。

sapM基因只存在于病原性分枝杆菌

如上所述，在包皮垢分枝杆菌一种非病原性分枝杆菌中未检测到SapM蛋白和酶活性。为了验证SapM是病原性分枝杆菌所特有的，我们对其他两种分枝杆菌，非病原性的龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonae)和鱼类病原性的海鱼分枝杆菌进行了分析。与牛型结核杆菌BCG一样，培养于含铵Sauton培养基的海鱼分枝杆菌培养物的CFP表现出高水平的酸性磷酸酶活性(数据未显示)，这种活性依赖于培养基的pH(数据未显示)。相反，龟分枝杆菌与包皮垢分枝杆菌类似，表现出残留水平的酸性磷酸酶活性，该活性不受培养基pH的调控(数据未显示)。这些结果表明，海鱼分枝杆菌含有SapM同系物，而龟分枝杆菌和包皮垢分枝杆菌则不含。检索TIGR和Sanger中心的未公开的基因组序列，结果表明SapM同系物出现于海鱼分枝杆菌和鸟结核分枝杆菌(一种鸟类病原)，而不出现于包皮垢分枝杆菌(图6A)。

为了验证上述结果，使用放射性标记的结核杆菌特异性探针与包皮垢分枝杆菌和龟分枝杆菌的染色体DNA进行DNA杂交。将牛型结核杆菌BCG的染色体DNA和含sapM的质粒pSAP作为阳性对照。结果表明在包皮垢分枝杆菌和龟分枝杆菌染色体中未检测到sapM等位基因(图6B)。

SapM的免疫原性

用部分纯化的结核杆菌SapM和收集自7个个体的血清，通过Western印迹测定人感染中SapM的抗原性。这些个体中包括一个诊断为淋巴结结核(TB)的患者，该患者在收集血清前已进行了4个月的化疗；一个唾液涂片为鸟分枝杆菌阳性的患者；两个已经接种了牛型结核杆菌BCG；三个外观健康的个体，其中一个接受病人护理，一个测试为PPD阳性。值得注意的是，取自两个患者(TB患者和被鸟分枝杆菌感染的患者)的血清与SapM反应(泳道4和5，图7)。而取自两个健康个体其中一个测试为PPD-阳性的血清不与SapM反应(泳道2和6)。但是，取自两个已接种了BCG的个体(泳道7和8)的血清和取自接受TB病人护理的个体(泳道3)的血清也与SapM反应。这些结果表明SapM被来自TB患者的抗体或者来自已接种BCG个体的抗体所识别，而不被来自未暴露于结核杆菌的健康个体的抗体所识别。

结核杆菌产生了一种分泌型的酸性磷酸酶，SapM，它表现出针对GTP和NADPH非常高的的活性。SapM的生物学功能还是未知的。该研究中，我们发现sapM受pH调控。当培养基pH从7.0～7.4降至5.8～6.6时，SapM的表达水平和酶活性显著升高(最高达～30倍)。截短的sapM与无启动子gfp的转录融合表明：sapM诱导表达于感染的巨噬细胞。DNA杂交和序列分析表明：sapM基因存在于病原性分枝杆菌，包括牛型结核杆菌BCG、鸟分枝杆菌和海鱼分枝杆菌，但是不出现于非病原性分枝杆菌如包皮垢分枝杆菌和龟分枝杆菌中。而且，来自TB患者或BCG接种的个体的抗体能够识别SapM，而来自健康个体的抗体不能识别SapM。总之，这些结果表明SapM对于分枝杆菌致病性至关重要，该分子可能通过干扰效应物分子而参与吞噬体成熟，从而对细胞内存活做出贡献。

材料和方法

菌株和培养条件

牛型结核杆菌BCG菌株、BCG-Japan、-Pasteur、-Frappier和-Birkhaug由Marcel Behr提供(McGill大学)。海鱼分枝杆菌1218R菌株由Lucia Barker提供(Rocky Mountain Laboratories，NIAID)。包皮垢分枝杆菌mc²-155和龟分枝杆菌PS4770此前已有描述(Liu et al.，1995；Liu et al.，1996)。

将分枝杆菌细胞以常规方法培养于含下列成分的常规Sauton培养基(每升)：0.5g KH₂PO₄、0.14g MgSO₄、2.0g柠檬酸、0.05g柠檬酸铵铁、5.0g天冬酰胺和60ml甘油。将pH调至7.4。为了研究磷酸盐浓度对酸性磷酸酶活性的影响，将生长于Sauton培养基中的细菌培养至指数期，用不含KH₂PO₄的相同介质洗涤，然后接种于100ml Sauton培养基，该培养基中磷酸盐浓度进行了下述调整(每升)：KH₂PO₄升高10倍至5.0g(高Pi培养基)，或降低10倍至0.05g(低Pi培养基)。为了研究氮源对酸性磷酸酶的影响，将原始Sauton中的天冬酰胺(5g/l)替换为NH₄Cl(1.42g/l)。为使碳源缺乏，略去Sauton培养基中的甘油。为了研究pH对酸性磷酸酶活性的影响，将原始Sauton培养基的pH用缓冲液20mM MOPS(对于pH7.0和6.6)或20mMMES(对于pH6.2和5.8)进行调节。除海鱼分枝杆菌和龟分枝杆菌在30℃下培养外，所有培养物都37℃下连续振荡培养。

分子克隆

用结核杆菌H37Rv基因组的一种有序BAC文库作为克隆用的DNA模板。使用标准规程进行DNA的操作。通过下述操作完成sapM的克隆：将含有Rv3309(upp)、Rv3310(sapM)和Rv3311(sapC)得BAC403的一个3kb Nhel片段连接到质粒pMD31中的独特的Xbal位点，而得到pSAP。通过将pSAP的片段克隆入pFPV27构建转录融合到无启动子突变的gfp中。为了构建pSAPC-GFP，将pSAPM的一个2.56kb EcoRV片段插入pFPV27中的独特的EcoRV位点，所述片段中含有sapM上游的560bp、完整的sapM基因以及3′末端截短了183bp的sapC(Rv3311)(Barker et al.，1998)。为了制备pSAPM-GFP，用BglII酶切载体pSAPC-GFP，然后将含有pFPV27、sapM起始密码子上游的560bp以及除67bp以外的sapM编码区域的3.8kb和2.5kb的两个片段重-连接。通过电穿孔将质粒导入海鱼分枝杆菌和包皮垢分枝杆菌mc²-155，然后在添加了10％OADC和25μg/mI卡那霉素的Middlebrook7H9琼脂(Difco)上筛选重组子。

Southern印迹

按照标准方法进行Southern印迹试验。简而言之，从牛型结核杆菌BCG、包皮垢分枝杆菌mc²-155和龟分枝杆菌中分离染色体DNA，用EcoRI或EcoRV消化，琼脂糖凝胶电泳分离，然后转移至尼龙膜上(Hybond N+，Amersham Pharmacia)。然后，将该膜用α³²P-CTP放射性标记的sapM探针(pSAP的一个660bp Hphl-Ndel片段)杂交，置于磷成像暗盒(phosphoimagercassette)上曝光。

酶测定

为了测定分泌型酸性磷酸酶活性，从生长至指数期(A₆₀₀～0.8)的培养物收集培养物过滤蛋白(CFP)级分，用离心过滤器(Millipore)浓缩，然后用蒸馏水4℃下透析(150～200×体积)过夜。用BCA测定仪(Pierce)测定蛋白浓度。如前所述(Saleh and Belisle，2000)在pH6.8下使用对-硝基苯基磷酸酯(pNPP)以微量滴定(microtitre)方式进行酸性磷酸酶测定。用硝基酚的消光系数18,380mMhr^-1cm^-1计算特异性活性，磷酸酶活性以nmol hr^-1mg^-1(总CFP蛋白)表示。

为了测定细胞表面-相关酸性磷酸酶及碱性磷酸酶，收集菌体细胞，超声波稍作处理破碎细胞团块。然后，将细胞置于Tris-缓冲的盐溶液中洗涤3次，最后用蒸馏水洗涤，将细胞密度调至0.42的最终OD₅₉₅值。按照上述方法通过测量对-硝基酚的释放测定相对pNPP的全细胞磷酸酶活性。通常，将50μl菌体细胞与150μl的25mM醋酸盐缓冲液pH6.0(用于酸性磷酸酶测定)或25mM Tris、pH10.0(用于碱性磷酸酶测定)混合。反应缓冲液还含有MgCl₂和ZnCl₂各1mM。加入终浓度为1mg/ml的pNPP启动反应。随后在37℃孵育30分钟后，离心沉淀细胞，取150μl反应液上清转移至盛有50μl，1.0MNaOH的ELISA板的孔中，使反应终止，用ELISA阅读仪测量OD_405nm。

抗-SapM抗血清的制备

用固相肽合成仪合成对应于SapM氨基酸序列中第201～208位残基的肽。通过乙酰化羧基端和在氨基端添加半胱氨酸对该肽进行了修饰。通过下述操作将约10mg具有序列CNDGHDGSI-Ac的纯化的肽还原：将该肽溶于4.0ml含20mM DTT的10mM重碳酸铵缓冲液，pH8.0(缓冲液A)中，然后在室温下孵育2小时。将还原后的肽上样于用缓冲液A预-平衡过的1.5cm×4.0cm的阴离子-交换柱(DEAE-Sephadex A50，Pharmacia)，然后用不含DTT的相同缓冲液25ml洗涤。结合后的肽用10ml pH3.0的10mM醋酸盐缓冲液洗脱。将总体积2.0ml的肽立即加入装有2mg mcKLH(Pierce Sciences)的试管中，然后加入200μl pH7.4的1.0M磷酸盐缓冲液，室温下连续混合2小时。随后将结合的KLH置于G-10柱(1.5cm×25cm)PBS脱盐。两只新西兰兔用250μg KLH结合物首次免疫，然后在第28天第一次加强免疫，第56天第二次加强免疫(每次100μg)。第二次加强免疫9天后筛查血清，并于次日收集抗血清。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹

为了检测SapM蛋白，将CFP样本(通常8～10μg蛋白)用十二烷基磺酸钠(SDS)-14％聚丙烯酰胺凝胶分离，银染显色，或用于Western印迹分析，转移到硝酸纤维素膜。然后，将膜用1∶400稀释的抗-SapM抗血清探查，用抗-兔IgG-碱性磷酸酶结合物和BCIP/NBT显影。为了分析SapM抗原性，用前述的方法(Saleh and Belisle，2000)从带有质粒pSAP的重组包皮垢分枝杆菌菌株中部分纯化SapM蛋白。将该蛋白展开于14％SDS-PAGE，然后转移至硝酸纤维素膜。切下单个泳道，用1∶150稀释的个体人血清探查，用上述方法显影。人血清样本由Tony Mazzulli(Mount Sinai Hospital，Toronto，ON)提供。

荧光显微镜方法

将小鼠巨噬细胞系J774培养于含有胎牛血清(5％)、100μg/ml链霉素和100单位/ml青霉素的RPMI 1640培养基中。为使其感染海鱼分枝杆菌，让细胞附着在盖玻片(22×22mm)上，在37℃、5％CO₂的孵育箱中过夜。然后把使用过的培养基用新鲜培养基(不加抗生素)替换，以10∶1的MOI加入海鱼分枝杆菌，37℃孵育1小时。用无菌PBS洗涤数次除去过量的细菌，最后将感染的细胞用新鲜培养基覆盖，送回孵育箱。在感染后的给定时刻，用PBS数次洗涤盖玻片，然后用3.7％多聚甲醛固定15分钟，用0.1％的Triton X-100渗透(permeabilize)10分钟，用德克萨斯-红鬼笔环肽染色1小时。所有处理都在室温下进行。用安装有Hamamatsu数码照相机的LeicaDM IRBE显微镜收集图像。用微分干涉相衬(differential interferencecontrast，DIC)收集图像，DIC上装有观察GFP用的FITC过滤器，或者用德克萨斯-红过滤器观察结合了德克萨斯-红的用细胞骨架特异性染料鬼笔环肽处理过的巨噬细胞。

上文特别结合优选的实施方案已经对本发明做了详细的描述；但是，本领域普通技术人员应该理解的是在不脱离本发明实质和范围的前提下可以对本发明进行改动。例如，当本申请中提及蛋白时，显然往往也可以使用肽和多肽。类似地，在本申请中描述基因时，显然往往也可以使用核酸或基因片段。

所有出版物(包括Genbank条目)、专利及专利申请其全部内容在此引入作为参考，如同每个出版物、专利及专利申请均特别并分别地被指明其全部内容引入作为参考。

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序列表

<110>成都永安制药有限公司

刘军

<120>Secreted Acid Phosphatase(sapM)is Present Only in Pathogenic Mycobacteria and Expressed

Selectively at Phagosomal pH

<130>4146 0005

<140>

<141>

<150>US 60/416,957

<151>2002-10-09

<160>22

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>500

<212>DNA

<213>结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400>1

catcgggtca agcaccatga ccggtacatc cgtcaggtcg tcgggcagcg agtccagata 60

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caggggtggc ttggttagcc gcgacccgac cgtctcggcc agcggcgtac ggatcgggac 240

tggctcgcag ggcgcatcgc gggtggcctc atagatcaac agcagcgtga gctcgcgcag 300

cgctgcccgg aagccggcgt tgtcggtgcg ttcgtcacgc agcgtggtca gtcgggccgc 360

ggccagtggg tggtcaacga catggacctg cacggcgttg aaccctatat aacaatcgtg 420

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<210>2

<211>500

<212>DNA

<213>牛型结核杆菌(Mycobacterium bovis)

<400>2

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ggccagtggg tggtcaacga catggacctg cacggcgttg aaccctatat aacaatcgtg 420

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<400>3

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<210>4

<211>500

<212>DNA

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<400>4

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ataacaatcg gattcaagcc gctgacacgc tccccctcct cgcggcgccg aggccgagcc 480

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<210>5

<211>43

<212>PRT

<213>结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400>5

Met Leu Arg Gly Ile Gln Ala Leu Ser Arg Pro Leu Thr Arg Val Tyr

1 5 10 15

Arg Ala Leu Ala Val Ile Gly Val Leu Ala Ala Ser Leu Leu Ala Ser

20 25 30

Trp Val Gly Ala Val Pro Gln Val Gly Leu Ala

35 40

<210>6

<211>43

<212>PRT

<213>牛型结核杆菌(Mycobacterium bovis)

<400>6

Met Leu Arg Gly Ile Gln Ala Leu Ser Arg Pro Leu Thr Arg Val Tyr

1 5 10 15

Arg Ala Leu Ala Val Ile Gly Val Leu Ala Ala Ser Leu Leu Ala Ser

20 25 30

Trp Val Gly Ala Val Pro Gln Val Gly Leu Ala

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<210>7

<211>42

<212>PRT

<213>鸟结核分枝杆菌(Mycobacterium avium)

<400>7

Met Ser Arg Glu Asn Arg Ser Arg Arg Arg Leu Ile Gly Gly Ala Tyr

1 5 10 15

Arg Ser Leu Arg Leu Leu Gly Ala Val Ala Ala Val Ala Leu Ala Ala

20 25 30

Ser Pro Leu Thr Pro Arg Thr Ser Leu Ala

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<210>8

<211>40

<212>PRT

<213>海鱼分枝杆菌(Mycobacterium marinum)

<400>8

Met Cys Gly Leu Lys Gln Arg Phe Thr Ser Thr Phe Arg Ala Leu Ala

1 5 10 15

Val Leu Gly Ala Val Ala Val Ser Leu Pro Ala His Gly Ser Asp Ala

20 25 30

Pro Pro Arg Ile Asp Leu Thr Ala

35 40

<210>9

<211>900

<212>DNA

<213>结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(900)

<400>9

atg ctc cgc gga atc cag gct ctc agc cgg ccc ctg acc agg gta tac 48

Met Leu Arg Gly Ile Gln Ala Leu Ser Arg Pro Leu Thr Arg Val Tyr

1 5 10 15

cgt gcc ttg gcg gtg atc ggt gtc ctg gca gca tcg ttg ctg gcc tca 96

Arg Ala Leu Ala Val Ile Gly Val Leu Ala Ala Ser Leu Leu Ala Ser

20 25 30

tgg gtc ggc gct gtc cca caa gtg ggt ctg gca gcg agt gcc ctg ccg 144

Trp Val Gly Ala Val Pro Gln Val Gly Leu Ala Ala Ser Ala Leu Pro

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acc ttc gcg cac gtg gtc atc gtg gtg gag gag aac cgc tcg cag gcc 192

Thr Phe Ala His Val Val Ile Val Val Glu Glu Asn Arg Ser Gln Ala

50 55 60

gcc atc atc ggt aac aag tcg gct ccc ttc atc aat tcg ctg gcc gcc 240

Ala Ile Ile Gly Asn Lys Ser Ala Pro Phe Ile Asn Ser Leu Ala Ala

65 70 75 80

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Asn Gly Ala Met Met Ala Gln Ala Phe Ala Glu Thr His Pro Ser Glu

85 90 95

ccg aac tac ctg gca ctg ttc gct ggc aac aca ttc ggg ttg acg aag 336

Pro Asn Tyr Leu Ala Leu Phe Ala Gly Asn Thr Phe Gly Leu Thr Lys

100 105 110

aac acc tgc ccc gtc aac ggc ggc gcg ctg ccc aac ctg ggt tct gag 384

Asn Thr Cys Pro Val Asn Gly Gly Ala Leu Pro Asn Leu Gly Ser Glu

115 120 125

ttg ctc agc gcc ggt tac aca ttc atg ggg ttc gcc gaa gac ttg cct 432

Leu Leu Ser Ala Gly Tyr Thr Phe Met Gly Phe Ala Glu Asp Leu Pro

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Ala Val Gly Ser Thr Val Cys Ser Ala Gly Lys Tyr Ala Arg Lys His

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gtg ccg tgg gtc aac ttc agt aac gtg ccg acg aca ctg tcg gtg ccg 528

Val Pro Trp Val Asn Phe Ser Asn Val Pro Thr Thr Leu Ser Val Pro

165 170 175

ttt tcg gca ttt ccg aag ccg cag aat tac ccc ggc ctg ccg acg gtg 576

Phe Ser Ala Phe Pro Lys Pro Gln Asn Tyr Pro Gly Leu Pro Thr Val

180 185 190

tcg ttt gtc atc cct aac gcc gac aac gac atg cac gac ggc tcg atc 624

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195 200 205

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Ala Gln Gly Asp Ala Trp Leu Asn Arg His Leu Ser Ala Tyr Ala Asn

210 215 220

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Trp Ala Lys Thr Asn Asn Ser Leu Leu Val Val Thr Trp Asp Glu Asp

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gac ggc agc agc cgc aat cag atc ccg acg gtg ttc tac ggc gcg cac 768

Asp Gly Ser Ser Arg Asn Gln Ile Pro Thr Val Phe Tyr Gly Ala His

245 250 255

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Val Arg Pro Gly Thr Tyr Asn Glu Thr Ile Ser His Tyr Asn Val Leu

260 265 270

tcc aca ttg gag cag atc tac gga ctg ccc aag acg ggt tat gcg acc 864

Ser Thr Leu Glu Gln Ile Tyr Gly Leu Pro Lys Thr Gly Tyr Ala Thr

275 280 285

aat gct ccg cca ata acc gat att tgg ggc gac tag 900

Asn Ala Pro Pro Ile Thr Asp Ile Trp Gly Asp

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<210>10

<211>299

<212>PRT

<213>结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400>10

Met Leu Arg Gly Ile Gln Ala Leu Ser Arg Pro Leu Thr Arg Val Tyr

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Arg Ala Leu Ala Val Ile Gly Val Leu Ala Ala Ser Leu Leu Ala Ser

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Trp Val Gly Ala Val Pro Gln Val Gly Leu Ala Ala Ser Ala Leu Pro

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Thr Phe Ala His Val Val Ile Val Val Glu Glu Asn Arg Ser Gln Ala

50 55 60

Ala Ile Ile Gly Asn Lys Ser Ala Pro Phe Ile Asn Ser Leu Ala Ala

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Pro Asn Tyr Leu Ala Leu Phe Ala Gly Asn Thr Phe Gly Leu Thr Lys

100 105 110

Asn Thr Cys Pro Val Asn Gly Gly Ala Leu Pro Asn Leu Gly Ser Glu

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Ala Val Gly Ser Thr Val Cys Ser Ala Gly Lys Tyr Ala Arg Lys His

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Val Pro Trp Val Asn Phe Ser Asn Val Pro Thr Thr Leu Ser Val Pro

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Phe Ser Ala Phe Pro Lys Pro Gln Asn Tyr Pro Gly Leu Pro Thr Val

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Trp Ala Lys Thr Asn Asn Ser Leu Leu Val Val Thr Trp Asp Glu Asp

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<211>900

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<220>

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<213>牛型结核杆菌(Mycobacterium bovis)

<400>12

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Leu Leu Ser Ala Gly Tyr Thr Phe Met Gly Phe Ala Glu Asp Leu Pro

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Val Pro Trp Val Asn Phe Ser Asn Val Pro Ala Thr Leu Ser Val Pro

165 170 175

Phe Ser Ala Phe Pro Lys Pro Gln Asn Tyr Pro Gly Leu Pro Thr Val

180 185 190

Ser Phe Val Ile Pro Asn Ala Asp Asn Asp Met His Asp Gly Ser Ile

195 200 205

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210 215 220

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Asp Gly Ser Ser Arg Asn Gln Ile Pro Thr Val Phe Tyr Gly Ala His

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115 120 125

ctc gcc gcc ggt tac aca ttc gcc ggc tac gcc gag ggc ctg ccg tcc 432

Leu Ala Ala Gly Tyr Thr Phe Ala Gly Tyr Ala Glu Gly Leu Pro Ser

130 135 140

ccg ggc tca ccg gtg tgc agt gcg ggc aag tac gcg cga aaa cat gtg 480

Pro Gly Ser Pro Val Cys Ser Ala Gly Lys Tyr Ala Arg Lys His Val

145 150 155 160

ccg tgg gcc aac ttc acc aac gtg ccg gcg gcg agc tcg ctg ccg ttc 528

Pro Trp Ala Asn Phe Thr Asn Val Pro Ala Ala Ser Ser Leu Pro Phe

165 170 175

tcg gcg ttc ccg atg ggc aac tac gcc agc ctg ccg acg gtg tcg ttc 576

Ser Ala Phe Pro Met Gly Asn Tyr Ala Ser Leu Pro Thr Val Ser Phe

180 185 190

gtc atc ccg aac aac gac aac aac atg cac gac ggc tcg atc gcg cag 624

Val Ile Pro Asn Asn Asp Asn Asn Met His Asp Gly Ser Ile Ala Gln

195 200 205

gcc gac gcc tgg ctg aac cgg cag ctg tcc ggc tac gcc aat tgg gcg 672

Ala Asp Ala Trp Leu Asn Arg Gln Leu Ser Gly Tyr Ala Asn Trp Ala

210 215 220

ctg gcc aac aac agc ctg ctg atc gtc acc ttc gac gag gac gac aac 720

Leu Ala Asn Asn Ser Leu Leu Ile Val Thr Phe Asp Glu Asp Asp Asn

225 230 235 240

tcc aac gtc gga gcc agc cgc aac cag atc ccc acg gtg ttc tac ggc 768

Ser Asn Val Gly Ala Ser Arg Asn Gln Ile Pro Thr Val Phe Tyr Gly

245 250 255

gcc cac gtc cgc ccc ggc aac tac gcc gag cag atc aac cac tac aac 816

Ala His Val Arg Pro Gly Asn Tyr Ala Glu Gln Ile Asn His Tyr Asn

260 265 270

gtg ctt gcc acc ctc gag cag atg tac ggg ctg ccc aag acg ggc tat 864

Val Leu Ala Thr Leu Glu Gln Met Tyr Gly Leu Pro Lys Thr Gly Tyr

275 280 285

gcc gcc ggc gcc gcc ccc atc acc gac atc tgg ggc tga 903

Ala Ala Gly Ala Ala Pro Ile Thr Asp Ile Trp Gly

290 295 300

<210>14

<211>300

<212>PRT

<213>鸟结核分枝杆菌(Mycobacterium avium)

<400>14

Met Ser Arg Glu Asn Arg Ser Arg Arg Arg Leu Ile Gly Gly Ala Tyr

1 5 10 15

Arg Ser Leu Arg Leu Leu Gly Ala Val Ala Ala Val Ala Leu Ala Ala

20 25 30

Ser Pro Leu Thr Pro Arg Thr Ser Leu Ala Ala Ala Ala Ile Pro Gln

35 40 45

Pro Ser His Ile Val Ile Val Val Glu Glu Asn Arg Ser Glu Ser Gly

50 55 60

Ile Ile Gly Asn Lys Ser Ala Pro Phe Ile Thr Ala Leu Ala Ala Ser

65 70 75 80

Gly Ala Asn Met Thr Gln Ser Phe Ala Glu Thr His Pro Ser Glu Pro

85 90 95

Asn Tyr Leu Ala Leu Phe Ala Gly Asn Thr Phe Gly Val Thr Lys Asp

100 105 110

Leu Cys Pro Val Asn Ala Gly Ala Ala Pro Asn Leu Gly Ser Glu Leu

115 120 125

Leu Ala Ala Gly Tyr Thr Phe Ala Gly Tyr Ala Glu Gly Leu Pro Ser

130 135 140

Pro Gly Ser Pro Val Cys Ser Ala Gly Lys Tyr Ala Arg Lys His Val

145 150 155 160

Pro Trp Ala Asn Phe Thr Asn Val Pro Ala Ala Ser Ser Leu Pro Phe

165 170 175

Ser Ala Phe Pro Met Gly Asn Tyr Ala Ser Leu Pro Thr Val Ser Phe

180 185 190

Val Ile Pro Asn Asn Asp Asn Asn Met His Asp Gly Ser Ile Ala Gln

195 200 205

Ala Asp Ala Trp Leu Asn Arg Gln Leu Ser Gly Tyr Ala Asn Trp Ala

210 215 220

Leu Ala Asn Asn Ser Leu Leu Ile Val Thr Phe Asp Glu Asp Asp Asn

225 230 235 240

Ser Asn Val Gly Ala Ser Arg Asn Gln Ile Pro Thr Val Phe Tyr Gly

245 250 255

Ala His Val Arg Pro Gly Asn Tyr Ala Glu Gln Ile Asn His Tyr Asn

260 265 270

Val Leu Ala Thr Leu Glu Gln Met Tyr Gly Leu Pro Lys Thr Gly Tyr

275 280 285

Ala Ala Gly Ala Ala Pro Ile Thr Asp Ile Trp Gly

290 295 300

<210>15

<211>888

<212>DNA

<213>海鱼分枝杆菌(Mycobacterium marinum)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(888)

<400>15

gtg tgt ggc ctg aaa cag cgt ttt acc agt aca ttt cga gct ctg gcg 48

Met Cys Gly Leu Lys Gln Arg Phe Thr Ser Thr Phe Arg Ala Leu Ala

1 5 10 15

gta ctc ggc gcg gtg gcg gta tcc cta ccg gcc cac ggt agc gac gct 96

Val Leu Gly Ala Val Ala Val Ser Leu Pro Ala His Gly Ser Asp Ala

20 25 30

ccc ccg cgt atc gac ctg acc gcc act gcg ttg ccg gcg ttc tca cat 144

Pro Pro Arg Ile Asp Leu Thr Ala Thr Ala Leu Pro Ala Phe Ser His

35 40 45

gtg gtg gtc gtg gtg gag gag aac cat tcg cag gcc aac atc att ggc 192

Val Val Val Val Val Glu Glu Asn His Ser Gln Ala Asn Ile Ile Gly

50 55 60

aac aag gcg gcc ccg ttc atc aat gcg ctg gcc gcc aat ggc gcg atg 240

Asn Lys Ala Ala Pro Phe Ile Asn Ala Leu Ala Ala Asn Gly Ala Met

65 70 75 80

atg tcg cag tcg ttc gcc gaa acg cac ccc agc gaa ccc aac tac ctg 288

Met Ser Gln Ser Phe Ala Glu Thr His Pro Ser Glu Pro Asn Tyr Leu

85 90 95

gcc ttg ttc gcc ggt acc acc ttc ggc ttg aag aag aac acg tgt ccg 336

Ala Leu Phe Ala Gly Thr Thr Phe Gly Leu Lys Lys Asn Thr Cys Pro

100 105 110

gtc aat gcg ggc agc acg ccc aac ctg gct tcg gag ttg ctc gcc gcg 384

Val Asn Ala Gly Ser Thr Pro Asn Leu Ala Ser Glu Leu Leu Ala Ala

115 120 125

ggc cac acg ttc gta ggt ttc gcc gag agc ctg ccc gaa gtc ggt tcg 432

Gly His Thr Phe Val Gly Phe Ala Glu Ser Leu Pro Glu Val Gly Ser

130 135 140

acg gtc tgc agc gcc gga aag tac ggg cgc aag cat gcg cct tgg gtg 480

Thr Val Cys Ser Ala Gly Lys Tyr Gly Arg Lys His Ala Pro Trp Val

145 150 155 160

aac ttc agc aat gtt ccg gcc acg ctg tcg atg ccc ttc tcc gcg ttt 528

Asn Phe Ser Asn Val Pro Ala Thr Leu Ser Met Pro Phe Ser Ala Phe

165 170 175

ccg acg ccg gcg gac tac gcc agg ctg ccc acg gtg tcc ttc gtc atc 576

Pro Thr Pro Ala Asp Tyr Ala Arg Leu Pro Thr Val Ser Phe Val Ile

180 185 190

ccc aac ggg gat aac aac atg cac gac ggc acc atc gcg gca gct gac 624

Pro Asn Gly Asp Asn Asn Met His Asp Gly Thr Ile Ala Ala Ala Asp

195 200 205

gag tgg ttg aac cgt caa ctg tcg ccg tac gcc aac tgg gcc cga tcc 672

Glu Trp Leu Asn Arg Gln Leu Ser Pro Tyr Ala Asn Trp Ala Arg Ser

210 215 220

aac aac agc ctg ctg atc gtg acg tgg gat gag gac gac ggc ggc agc 720

Asn Asn Ser Leu Leu Ile Val Thr Trp Asp Glu Asp Asp Gly Gly Ser

225 230 235 240

cgc aac cag att ccc acg gtg ttc tac ggc gca cac gta cgg ccg ggc 768

Arg Asn Gln Ile Pro Thr Val Phe Tyr Gly Ala His Val Arg Pro Gly

245 250 255

act tac aac cag acc atc agc cac tac aac gtg ctt tcc acg ctg gag 816

Thr Tyr Asn Gln Thr Ile Ser His Tyr Asn Val Leu Ser Thr Leu Glu

260 265 270

cag atg tac ggc ttg ccc aag acg ggt ttc gcg gcg aac gcc ccg gtc 864

Gln Met Tyr Gly Leu Pro Lys Thr Gly Phe Ala Ala Asn Ala Pro Val

275 280 285

atc gct gat atc tgg ggc ggc taa 888

Ile Ala Asp Ile Trp Gly Gly

290 295

<210>16

<211>295

<212>PRT

<213>海鱼分枝杆菌(Mycobacterium marinum)

<400>16

Met Cys Gly Leu Lys Gln Arg Phe Thr Ser Thr Phe Arg Ala Leu Ala

1 5 10 15

Val Leu Gly Ala Val Ala Val Ser Leu Pro Ala His Gly Ser Asp Ala

20 25 30

Pro Pro Arg Ile Asp Leu Thr Ala Thr Ala Leu Pro Ala Phe Ser His

35 40 45

Val Val Val Val Val Glu Glu Asn His Ser Gln Ala Asn Ile Ile Gly

50 55 60

Asn Lys Ala Ala Pro Phe Ile Asn Ala Leu Ala Ala Asn Gly Ala Met

65 70 75 80

Met Ser Gln Ser Phe Ala Glu Thr His Pro Ser Glu Pro Asn Tyr Leu

85 90 95

Ala Leu Phe Ala Gly Thr Thr Phe Gly Leu Lys Lys Asn Thr Cys Pro

100 105 110

Val Asn Ala Gly Ser Thr Pro Asn Leu Ala Ser Glu Leu Leu Ala Ala

115 120 125

Gly His Thr Phe Val Gly Phe Ala Glu Ser Leu Pro Glu Val Gly Ser

130 135 140

Thr Val Cys Ser Ala Gly Lys Tyr Gly Arg Lys His Ala Pro Trp Val

145 150 155 160

Asn Phe Ser Asn Val Pro Ala Thr Leu Ser Met Pro Phe Ser Ala Phe

165 170 175

Pro Thr Pro Ala Asp Tyr Ala Arg Leu Pro Thr Val Ser Phe Val Ile

180 185 190

Pro Asn Gly Asp Asn Asn Met His Asp Gly Thr Ile Ala Ala Ala Asp

195 200 205

Glu Trp Leu Asn Arg Gln Leu Ser Pro Tyr Ala Asn Trp Ala Arg Ser

210 215 220

Asn Asn Ser Leu Leu Ile Val Thr Trp Asp Glu Asp Asp Gly Gly Ser

225 230 235 240

Arg Asn Gln Ile Pro Thr Val Phe Tyr Gly Ala His Val Arg Pro Gly

245 250 255

Thr Tyr Asn Gln Thr Ile Ser His Tyr Asn Val Leu Ser Thr Leu Glu

260 265 270

Gln Met Tyr Gly Leu Pro Lys Thr Gly Phe Ala Ala Asn Ala Pro Val

275 280 285

Ile Ala Asp Ile Trp Gly Gly

290 295

<210>17

<211>1291

<212>DNA

<213>产毒青霉(Penicillium chrysogenum)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(213)

<220>

<221>intro

<222>(217)..(244)

<220>

<221>CDS

<222>(245)..(1288)

<400>17

atg ctc acc aaa caa acc ctt ctc gcg ttc gtc ggg gcc ctc gcc ctc 48

Met Leu Thr Lys Gln Thr Leu Leu Ala Phe Val Gly Ala Leu Ala Leu

1 5 10 15

Gcc acg ggt aca act acc act gaa gag acc cca act cag gct gag att 96

Ala Thr Gly Thr Thr Thr Thr Glu Glu Thr Pro Thr Gln Ala Glu Ile

20 25 30

gat gca gca cgt gct acg gcc ctg cct tac tct cct gtg tca aac gta 144

Asp Ala Ala Arg Ala Thr Ala Leu Pro Tyr Ser Pro Val Ser Asn Val

35 40 45

aag ggt ttg gcc ttt gat cgt ttc gtg aac atc tgg ctc gag aac aca 192

Lys Gly Leu Ala Phe Asp Arg Phe Val Asn Ile Trp Leu Glu Asn Thr

50 55 60

gta ggt ttc ccg ttg aat ata taacaatgac cacgcgctca cccctttgta g 244

Val Gly Phe Pro Leu Asn Ile

65 70

gac ttt gaa ccc gct gct tta gac gag aac ctg tcc aag ctg gcc aag 292

Asp Phe Glu Pro Ala Ala Leu Asp Glu Asn Leu Ser Lys Leu Ala Lys

75 80 85

gag ggt atc ctc ctg acc aac tac ttt gcc atc tct cac ccc tcg cag 340

Glu Gly Ile Leu Leu Thr Asn Tyr Phe Ala Ile Ser His Pro Ser Gln

90 95 100

ccc aac tac tgt gct tcc gcc ggg ggt gac aca ttc ggc atg gat aat 388

Pro Asn Tyr Cys Ala Ser Ala Gly Gly Asp Thr Phe Gly Met Asp Asn

105 110 115

gac gac ttc cta caa atc cct tcg aat gtc tca act att gcc gat ctc 436

Asp Asp Phe Leu Gln Ile Pro Ser Asn Val Ser Thr Ile Ala Asp Leu

120 125 130 135

ttt gat act aag cac atc tct tgg ggt gaa tac caa gaa gac atg ccc 484

Phe Asp Thr Lys His Ile Ser Trp Gly Glu Tyr Gln Glu Asp Met Pro

140 145 150

tat gct ggc tac caa ggc aaa cgg tat ccc ctc agc ggt ccg aac cag 532

Tyr Ala Gly Tyr Gln Gly Lys Arg Tyr Pro Leu Ser Gly Pro Asn Gln

155 160 165

tac gtg cgc aag cac aac ccg ctg gtt ttg ttt aac tcg gtt acc gac 580

Tyr Val Arg Lys His Asn Pro Leu Val Leu Phe Asn Ser Val Thr Asp

170 175 180

gac gcc gtg cgc ccg cgc caa atc aag aat ttc acc act ttc tac gac 628

Asp Ala Val Arg Pro Arg Gln Ile Lys Asn Phe Thr Thr Phe Tyr Asp

185 190 195

gat ctg aag cac cac agc ctt ccc caa cac atg ttc atc aca ccg aac 676

Asp Leu Lys His His Ser Leu Pro Gln His Met Phe Ile Thr Pro Asn

200 205 210 215

atg acc aat gac gcc cac gac acg aac atc act gtg gcc ggt aac tgg 724

Met Thr Asn Asp Ala His Asp Thr Asn Ile Thr Val Ala Gly Asn Trp

220 225 230

gtc gat cgc ttc ctg tct cct cta ctg aag aac gag tac ttc acc aag 772

Val Asp Arg Phe Leu Ser Pro Leu Leu Lys Asn Glu Tyr Phe Thr Lys

235 240 245

gac agc cta gtg cta ctc acc ttt gac gag gga gac acc tac tcc tac 820

Asp Ser Leu Val Leu Leu Thr Phe Asp Glu Gly Asp Thr Tyr Ser Tyr

250 255 260

ccc aac cgg gtc ttc agc ttc ctt gtt gga ggt gct atc cca gag cac 868

Pro Asn Arg Val Phe Ser Phe Leu Val Gly Gly Ala Ile Pro Glu His

265 270 275

ctg aag ggg acc act gac gac act ttc tac acc cac tac tca att gtc 916

Leu Lys Gly Thr Thr Asp Asp Thr Phe Tyr Thr His Tyr Ser Ile Val

280 285 290 295

gct tcc ctg tct gct aac tgg ggt tta ccc tcg ctt ggt cgc tgg gat 964

Ala Ser Leu Ser Ala Asn Trp Gly Leu Pro Ser Leu Gly Arg Trp Asp

300 305 310

tgt ggc gcc aac ctg ctg aag atg gtc gct gac aag acc ggc tat gtc 1012

Cys Gly Ala Asn Leu Leu Lys Met Val Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Val

315 320 325

aac tgg gaa gtt gat acc agc aat gtc tac ctc aac gag act tac cct 1060

Asn Trp Glu Val Asp Thr Ser Asn Val Tyr Leu Asn Glu Thr Tyr Pro

330 335 340

gga cct atg tct acc gac aac tat tcc tct aag tgg gcc gtt cct gcc 1108

Gly Pro Met Ser Thr Asp Asn Tyr Ser Ser Lys Trp Ala Val Pro Ala

345 350 355

acc aag ggc aaa tgc tct gct ggc cat ggc att gct gag gtc gtg aag 1156

Thr Lys Gly Lys Cys Ser Ala Gly His Gly Ile Ala Glu Val Val Lys

360 365 370 375

aat acc tac cac ggg ctt caa ccc acc tac gac tat gcc agc cct gta 1204

Asn Thr Tyr His Gly Leu Gln Pro Thr Tyr Asp Tyr Ala Ser Pro Val

380 385 390

ccg tat gac gtg acc agt gga aac aac gtc ggc atc aag tac cac cgc 1252

Pro Tyr Asp Val Thr Ser Gly Asn Asn Val Gly Ile Lys Tyr His Arg

395 400 405

act ctg gta tgt atc ctt tca tgt tct tcc ctt tca tga 1291

Thr Leu Val Cys Ile Leu Ser Cys Ser Ser Leu Ser

410 415

<210>18

<211>71

<212>PRT

<213>产毒青霉(Penicillium chrysogenum)

<400>18

Met Leu Thr Lys Gln Thr Leu Leu Ala Phe Val Gly Ala Leu Ala Leu

1 5 10 15

Ala Thr Gly Thr Thr Thr Thr Glu Glu Thr Pro Thr Gln Ala Glu Ile

20 25 30

Asp Ala Ala Arg Ala Thr Ala Leu Pro Tyr Ser Pro Val Ser Asn Val

35 40 45

Lys Gly Leu Ala Phe Asp Arg Phe Val Asn Ile Trp Leu Glu Asn Thr

50 55 60

Val Gly Phe Pro Leu Asn Ile

65 70

<210>19

<211>348

<212>PRT

<213>产毒青霉(Penicillium chrysogenum)

<400>19

Asp Phe Glu Pro Ala Ala Leu Asp Glu Asn Leu Ser Lys Leu Ala Lys

1 5 10 15

Glu Gly Ile Leu Leu Thr Asn Tyr Phe Ala Ile Ser His Pro Ser Gln

20 25 30

Pro Asn Tyr Cys Ala Ser Ala Gly Gly Asp Thr Phe Gly Met Asp Asn

35 40 45

Asp Asp Phe Leu Gln Ile Pro Ser Asn Val Ser Thr Ile Ala Asp Leu

50 55 60

Phe Asp Thr Lys His Ile Ser Trp Gly Glu Tyr Gln GIu Asp Met Pro

65 70 75 80

Tyr Ala Gly Tyr Gln Gly Lys Arg Tyr Pro Leu Ser Gly Pro Asn Gln

85 90 95

Tyr Val Arg Lys His Asn Pro Leu Val Leu Phe Asn Ser Val Thr Asp

100 105 110

Asp Ala Val Arg Pro Arg Gln Ile Lys Asn Phe Thr Thr Phe Tyr Asp

115 120 125

Asp Leu Lys His His Ser Leu Pro Gln His Met Phe Ile Thr Pro Asn

130 135 140

Met Thr Asn Asp Ala His Asp Thr Asn Ile Thr Val Ala Gly Asn Trp

145 150 155 160

Val Asp Arg Phe Leu Ser Pro Leu Leu Lys Asn Glu Tyr Phe Thr Lys

165 170 175

Asp Ser Leu Val Leu Leu Thr Phe Asp Glu Gly Asp Thr Tyr Ser Tyr

180 185 190

Pro Asn Arg Val Phe Ser Phe Leu Val Gly Gly Ala Ile Pro Glu His

195 200 205

Leu Lys Gly Thr Thr Asp Asp Thr Phe Tyr Thr His Tyr Ser Ile Val

210 215 220

Ala Ser Leu Ser Ala Asn Trp Gly Leu Pro Ser Leu Gly Arg Trp Asp

225 230 235 240

Cys Gly Ala Asn Leu Leu Lys Met Val Ala Asp Lys Thr Gly Tyr Val

245 250 255

Asn Trp Glu Val Asp Thr Ser Asn Val Tyr Leu Asn Glu Thr Tyr Pro

260 265 270

Gly Pro Met Ser Thr Asp Asn Tyr Ser Ser Lys Trp Ala Val Pro Ala

275 280 285

Thr Lys Gly Lys Cys Ser Ala Gly His Gly Ile Ala Glu Val Val Lys

290 295 300

Asn Thr Tyr His Gly Leu Gln Pro Thr Tyr Asp Tyr Ala Ser Pro Val

305 310 315 320

Pro Tyr Asp Val Thr Ser Gly Asn Asn Val Gly Ile Lys Tyr His Arg

325 330 335

Thr Leu Val Cys Ile Leu Ser Cys Ser Ser Leu Ser

340 345

<210>20

<211>1457

<212>DNA

<213>烟曲霉(Aspergillus fumigatus)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(186)

<220>

<221>Intron

<222>(187)..(239)

<220>

<221>CDS

<222>(240)..(301)

<220>

<221>Intron

<222>(302)..(361)

<220>

<221>CDS

<222>(362)..(1454)

<400>20

atg aag cct tcc gtc gcg act ttg ctt gcc act gtc tct ctg gtc tat 48

Met Lys Pro Ser Val Ala Thr Leu Leu Ala Thr Val Ser Leu Val Tyr

1 5 10 15

gct cag act gct act gag aag gag cct tcg ctg tct gcg ata gaa tct 96

Ala Gln Thr Ala Thr Glu Lys Glu Pro Ser Leu Ser Ala Ile Glu Ser

20 25 30

gca gca gcc tcc atc cag cct tac tct ccc gtt tcg aac gtt gag ggt 144

Ala Ala Ala Ser Ile Gln Pro Tyr Ser Pro Val Ser Asn Val Glu Gly

35 40 45

gtt gca ttt aat cgc ttc ttc caa gtg tgg ctt gag aat att 186

Val Ala Phe Asn Arg Phe Phe Gln Val Trp Leu Glu Asn Ile

50 55 60

gtatgtgatc accttaccaa tcagagaatc ttgttcaaag ctgacctcag aag gat 242

Asp

tac gag gat gct gcg gcg gat gag aac atg aaa tgg ctg gcc tcg caa 290

Tyr Glu Asp Ala Ala Ala Asp Glu Asn Met Lys Trp Leu Ala Ser Gln

65 70 75

ggg atc ctg ct gtaagacctc atatcggcca tctgctcacg atttgaactt 341

Gly Ile Leu Leu

80

cgaactaatt tactccacag c acc aat ttc tat gca gtc acg cat cct tca 392

Thr Asn Phe Tyr Ala Val Thr His Pro Ser

85 90

gag cca aac tac tgc gct gct gtt gga ggc gac aca ttt ggc atg gac 440

Glu Pro Asn Tyr Cys Ala Ala Val Gly Gly Asp Thr Phe Gly Met Asp

95 100 105

aat gac aac ttt aac cag att cct gcc aat gtt tct act gtc gct gat 488

Asn Asp Asn Phe Asn Gln Ile Pro Ala Asn Val Ser Thr Val Ala Asp

110 115 120 125

ctc ctg gac acc aaa aac att gct tgg gga gag tat cag gag cac tta 536

Leu Leu Asp Thr Lys Asn Ile Ala Trp Gly Glu Tyr Gln Glu His Leu

130 135 140

cct tat ccc gga ttc caa ggt ttc aac tat tcc aac cag gag act tat 584

Pro Tyr Pro Gly Phe Gln Gly Phe Asn Tyr Ser Asn Gln Glu Thr Tyr

145 150 155

gtc aat gac tat gtg cgc aag cat aac cca ctg gtc ttg tat gac tct 632

Val Asn Asp Tyr Val Arg Lys His Asn Pro Leu Val Leu Tyr Asp Ser

160 165 170

gtc acc aag aac agc act cgt ttg cgc cag atc aag aac ttt acc agc 680

Val Thr Lys Asn Ser Thr Arg Leu Arg Gln Ile Lys Asn Phe Thr Ser

175 180 185

ttc gag gac gac ctg gcc aac aag aaa ctt cct caa tgg gca ttt atc 728

Phe Glu Asp Asp Leu Ala Asn Lys Lys Leu Pro Gln Trp Ala Phe Ile

190 195 200 205

act cca aac atg acc aac gac gct cat gac acc aac att act ttc gga 776

Thr Pro Asn Met Thr Asn Asp Ala His Asp Thr Asn Ile Thr Phe Gly

210 215 220

gcc aaa tgg gag cga agc tgg att gcg ccc ttg ctc aac aac tca tac 824

Ala Lys Trp Glu Arg Ser Trp Ile Ala Pro Leu Leu Asn Asn Ser Tyr

225 230 235

ttc atg aat gat acc cta atc cta ctt acc ttt gat gag gat ggc act 872

Phe Met Asn Asp Thr Leu Ile Leu Leu Thr Phe Asp Glu Asp Gly Thr

240 245 250

tat tcc aag agc aac aag atc ttc agt gtt ctt ctc ggt ggt gcc att 920

Tyr Ser Lys Ser Asn Lys Ile Phe Ser Val Leu Leu Gly Gly Ala Ile

255 260 265

ccc gat gag ctg aag ggt act cag gac gat acg ttc tat acc cac tac 968

Pro Asp Glu Leu Lys Gly Thr Gln Asp Asp Thr Phe Tyr Thr His Tyr

270 275 280 285

tca gtg att gcg tcc gtg tcc gcg aac tgg ggc ctt cct tcg ttg gga 1016

Ser Val Ile Ala Ser Val Ser Ala Asn Trp Gly Leu Pro Ser Leu Gly

290 295 300

agg tgg gat tgt ggt gcg aac att ctt gag att gtg gca aac aag acg 1064

Arg Trp Asp Cys Gly Ala Asn Ile Leu Glu Ile Val Ala Asn Lys Thr

305 310 315

gga tat gtc aac tac gac gtt gac aca acc aatctc cgc ctc aac gag 1112

Gly Tyr Val Asn Tyr Asp Val Asp Thr Thr Asn Leu Arg Leu Asn Glu

320 325 330

acc tac ccc ggt ccc atg tca gcg ggc gaa tac tcg aaa tac tcc cct 1160

Thr Tyr Pro Gly Pro Met Ser Ala Gly Glu Tyr Ser Lys Tyr Ser Pro

335 340 345

gtc tgg ccg aat gcc ttg acc cgt ggt gac tgc tct gct ggc cat ggc 1208

Val Trp Pro Asn Ala Leu Thr Arg Gly Asp Cys Ser Ala Gly His Gly

350 355 360 365

att ttg gac att gtc aag gag acc tac gcc aac acg gag cca aca tac 1256

Ile Leu Asp Ile Val Lys Glu Thr Tyr Ala Asn Thr Glu Pro Thr Tyr

370 375 380

aac tat tcg agc ccc ttc cca tat gac act gcg agc aac tac aac acc 1304

Asn Tyr Ser Ser Pro Phe Pro Tyr Asp Thr Ala Ser Asn Tyr Asn Thr

385 390 395

aag gtg act gcc acc aaa aag aat gtc acc ggt aca cat aga agt tct 1352

Lys Val Thr Ala Thr Lys Lys Asn Val Thr Gly Thr His Arg Ser Ser

400 405 410

tct tcc tcc tct ccg tca gct agc tcc aac gcc gct gtt tct gct gtc 1400

Ser Ser Ser Ser Pro Ser Ala Ser Ser Asn Ala Ala Val Ser Ala Val

415 420 425

gct cct gca gcc ggt gtc tct ggt ctc ctc ttg gga ctc gct cta aac 1448

Ala Pro Ala Ala Gly Val Ser Gly Leu Leu Leu Gly Leu Ala Leu Asn

430 435 440 445

ctg ctt taa 1457

Leu Leu

<210>21

<211>447

<212>PRT

<213>烟曲霉(Aspergillus fumigatus)

<400>21

Met Lys Pro Ser Val Ala Thr Leu Leu Ala Thr Val Ser Leu Val Tyr

1 5 10 15

Ala Gln Thr Ala Thr Glu Lys Glu Pro Ser Leu Ser Ala Ile Glu Ser

20 25 30

Ala Ala Ala Ser Ile Gln Pro Tyr Ser Pro Val Ser Asn Val Glu Gly

35 40 45

Val Ala Phe Asn Arg Phe Phe Gln Val Trp Leu Glu Asn Ile Asp Tyr

50 55 60

Glu Asp Ala Ala Ala Asp Glu Asn Met Lys Trp Leu Ala Ser Gln Gly

65 70 75 80

Ile Leu Leu Thr Asn Phe Tyr Ala Val Thr His Pro Ser Glu Pro Asn

85 90 95

Tyr Cys Ala Ala Val Gly Gly Asp Thr Phe Gly Met Asp Asn Asp Asn

100 105 110

Phe Asn Gln Ile Pro Ala Asn Val Ser Thr Val Ala Asp Leu Leu Asp

115 120 125

Thr Lys Asn Ile Ala Trp Gly Glu Tyr Gln Glu His Leu Pro Tyr Pro

130 135 140

Gly Phe Gln Gly Phe Asn Tyr Ser Asn Gln Glu Thr Tyr Val Asn Asp

145 150 155 160

Tyr Val Arg Lys His Asn Pro Leu Val Leu Tyr Asp Ser Val Thr Lys

165 170 175

Asn Ser Thr Arg Leu Arg Gln Ile Lys Asn Phe Thr Ser Phe Glu Asp

180 185 190

Asp Leu Ala Asn Lys Lys Leu Pro Gln Trp Ala Phe Ile Thr Pro Asn

195 200 205

Met Thr Asn Asp Ala His Asp Thr Asn Ile Thr Phe Gly Ala Lys Trp

210 215 220

Glu Arg Ser Trp Ile Ala Pro Leu Leu Asn Asn Ser Tyr Phe Met Asn

225 230 235 240

Asp Thr Leu Ile Leu Leu Thr Phe Asp Glu Asp Gly Thr Tyr Ser Lys

245 250 255

Ser Asn Lys Ile Phe Ser Val Leu Leu Gly Gly Ala Ile Pro Asp Glu

260 265 270

Leu Lys Gly Thr Gln Asp Asp Thr Phe Tyr Thr His Tyr Ser Val Ile

275 280 285

Ala Ser Val Ser Ala Asn Trp Gly Leu Pro Ser Leu Gly Arg Trp Asp

290 295 300

Cys Gly Ala Asn Ile Leu Glu Ile Val Ala Asn Lys Thr Gly Tyr Val

305 310 315 320

Asn Tyr Asp Val Asp Thr Thr Asn Leu Arg Leu Asn Glu Thr Tyr Pro

325 330 335

Gly Pro Met Ser Ala Gly Glu Tyr Ser Lys Tyr Ser Pro Val Trp Pro

340 345 350

Asn Ala Leu Thr Arg Gly Asp Cys Ser Ala Gly His Gly Ile Leu Asp

355 360 365

Ile Val Lys Glu Thr Tyr Ala Asn Thr Glu Pro Thr Tyr Asn Tyr Ser

370 375 380

Ser Pro Phe Pro Tyr Asp Thr Ala Ser Asn Tyr Asn Thr Lys Val Thr

385 390 395 400

Ala Thr Lys Lys Asn Val Thr Gly Thr His Arg Ser Ser Ser Ser Ser

405 410 415

Ser Pro Ser Ala Ser Ser Asn Ala Ala Val Ser Ala Val Ala Pro Ala

420 425 430

Ala Gly Val Ser Gly Leu Leu Leu Gly Leu Ala Leu Asn Leu Leu

435 440 445

<210>22

<211>8

<212>PRT

<213>结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<400>22

Asn Asp Met His Asp Gly Ser Ile

1 5

Claims

1、一种分离的DNA序列，包括分枝杆菌的分泌型酸性磷酸酶基因的启动子或启动子片段，其中所述启动子或启动子片段足以调控目的核苷酸序列的表达，并且在低pH条件下是可诱导的。

2、权利要求1中的分离的DNA序列，其中所述的启动子或启动子片段选自：结核杆菌sapM启动子或启动子片段、牛型结核杆菌sapM启动子或启动子片段、鸟结核分枝杆菌sapM启动子或启动子片段和海鱼分枝杆菌sapM启动子或启动子片段。

3、一种分离的DNA序列，包括足以调控目的核苷酸序列的表达并且在低pH条件下是可诱导的启动子或启动子片段，其中所述启动子或启动子片段能够在高严谨的条件下与选自下列的sapM启动子杂交：结核杆菌sapM启动子[SEQID NO：1]、牛型结核杆菌sapM启动子[SEQ ID NO：2]、鸟结核分枝杆菌sapM启动于[SEQ ID NO：3]和海鱼分枝杆菌sapM启动子[SEQ ID NO：4]。

4、一种表达载体，包括权利要求1、2或3所述的分离的DNA序列。

5、一种经权利要求4所述载体转化的宿主细胞。

6、一种转录盒，其中包括：

(a)分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶启动子或启动子片段，其中所述启动子或启动子片段足以调控目的核苷酸序列的表达；

(b)可操作连接于所述启动子或启动子片段的目的核苷酸序列；和

(c)转录终止区域。

7、权利要求6中的转录盒，其中所述的分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶启动子或启动子片段选自：结核杆菌sapM启动子[SEQ ID NO：1]、牛型结核杆菌sapM启动子[SEQ ID NO：2]、鸟结核分枝杆菌sapM启动子[SEQ ID NO：3]和海鱼分枝杆菌sapM启动子[SEQ ID NO：4]。

8、权利要求6或7中的转录盒，其中进一步包括分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶N-末端信号序列。

9、权利要求8中的转录盒，其中所述的分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶N-末端信号序列选自：结核杆菌sapM N-末端信号序列[SEQ ID NO：5]、牛型结核杆菌sapM N-末端信号序列[SEQ ID NO：6]、鸟结核分枝杆菌sapM N-末端信号序列[SEQ ID NO：7]和海鱼分枝杆菌sapM N-末端信号序列[SEQ ID NO：8]。

10、一种诊断受试者病原性分枝杆菌感染或病原性真菌感染的方法，包括：

(a)从受试者获得生物学样本；和

(b)分析该样本中针对分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶的特异性抗体的存在，其中检测到针对分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶的特异性抗体就表示存在病原性分枝杆菌感染或病原性真菌感染。

11、权利要求10中的方法，其中所述的分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶选自：结核杆菌SapM[SEQ ID NO：10]、牛型结核杆菌SapM[SEQ ID NO：12]、鸟结核分枝杆菌SapM[SEQ ID NO：14]和海鱼分枝杆菌SapM[SEQ ID NO：16]。

12、一种诊断受试者病原性分枝杆菌感染或病原性真菌感染的方法，包括：

(a)从受试者获得核酸样本；和

(b)分析样本中编码分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶的核酸的存在，其中检测到编码分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶的核酸就表示存在病原性分枝杆菌感染或病原性真菌感染。

13、权利要求12中的方法，其中所述的编码分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶的核酸选自：结核杆菌sapM、牛型结核杆菌sapM、鸟结核分枝杆菌sapM和海鱼分枝杆菌sapM。

14、一种诊断受试者病原性分枝杆菌感染或病原性真菌感染的方法，包括：

(a)从受试者获得生物学样本；和

(b)分析样本中分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶活性的存在，其中检测到分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶活性就表示存在病原性分枝杆菌感染或病原性真菌感染。

15、权利要求14中的方法，其中所述的分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶活性选自：结核杆菌SapM活性、牛型结核杆菌SapM活性、鸟结核分枝杆菌SapM活性和海鱼分枝杆菌SapM活性。

16、一种筛选能够调控分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶生成的化合物的方法，包括：

(a)提供一种含有分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶启动子或启动子片段的核酸构建体，其中所述启动子或启动子片段可操作地连接于一个能产生可测量信号的报道基因；

(b)提供一种待测化合物；

(c)将所述核酸构建体暴露于上述待测化合物中；和

(d)测量报道基因产生的信号，其中当存在待测化合物时产生的信号与没有该待测化合物时产生信号相比发生了变化，则说明所述待测化合物能够调控分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶的生成。

17、权利要求16中的方法，其中所述的分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶启动子或启动子片段选自：结核杆菌sapM启动子或启动子片段、牛型结核杆菌sapM启动子或启动子片段、鸟结核分枝杆菌sapM启动子或启动子片段和海鱼分枝杆菌sapM启动子或启动子片段。

18、一种筛选能够调控分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶活性的化合物的方法，包括：

(a)将含有分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶、分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶底物以及待测化合物的混合物进行孵育；和

(b)测量分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶活性，其中当存在待测化合物时的活性与没有该待测化合物时的活性相比发生了变化，则说明所述待测化合物能够调节分泌型酸性磷酸酶的活性。

19、权利要求18中的方法，其中所述的分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶选自：结核杆菌SapM、牛型结核杆菌SapM、鸟结核分枝杆菌SapM和海鱼分枝杆菌。

20、一种筛选能够调控分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶分泌的化合物的方法，包括：

(a)将分枝杆菌细胞暴露于待测化合物中，其中所述分枝杆菌细胞分泌分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶；和

(b)测定分枝杆菌细胞分泌的分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶的量，其中当存在待测化合物时分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶的分泌与没有该待测化合物时相比发生了变化，则说明所述待测化合物能够调节分泌型酸性磷酸酶的分泌。

21、权利要求20中的方法，其中所述的分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶选自：结核杆菌SapM、牛型结核杆菌SapM、鸟结核分枝杆菌SapM和海鱼分枝杆菌SapM。

22、一种检测病原性分枝杆菌疾病或感染的试剂盒，包括：

(a)分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶；

(b)至少一种针对分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶的特异性抗体；和

(c)一种或多种检测上述抗体所需的试剂。

23、权利要求22中的试剂盒，其中所述的分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶选自：结核杆菌SapM、牛型结核杆菌SapM、鸟结核分枝杆菌SapM和海鱼分枝杆菌SapM。

24、一种检测病原性分枝杆菌疾病或感染的试剂盒，包括：

(a)一种寡核苷酸，包括与下述核酸序列互补的核酸序列相邻接的核苷酸：[SEQ ID NO：1]～[SEQ ID NO：4]、或[SEQ ID NO：9]、[SEQ ID NO：11]、[SEQID NO：13]、[SEQ ID NO：15]，并且能与互补的核苷酸序列特异性杂交；和

(b)所述寡核苷酸与互补核酸序列杂交所需的试剂。

25、一种抗体，该抗体能与分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶或其多肽片段特异性结合。

26、权利要求25中的抗体，其中所述的分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶选自：结核杆菌SapM、牛型结核杆菌SapM、鸟结核分枝杆菌SapM和海鱼分枝杆菌SapM。

27、一种用于治疗或预防哺乳动物免受分枝杆菌侵害的疫苗或致免疫的组合物，其中包括权利要求26所述的抗体。

28、一种用于治疗或预防哺乳动物免受分枝杆菌侵害的疫苗或致免疫的组合物，其中包括权利要求1、2或3所述的分离的DNA序列。

29、一种用于治疗或预防哺乳动物免受分枝杆菌侵害的疫苗或致免疫的组合物，其中包括分枝杆菌分泌型酸性磷酸酶，该酶选自：结核杆菌SapM、牛型结核杆菌SapM、鸟结核分枝杆菌SapM和海鱼分枝杆菌SapM或其多肽片段。

30、一种用于检测受试者病原性分枝杆菌疾病或感染的抗原组合物，包括一种SapM多肽，并且实质上不含固有的混合存在于病原性分枝杆菌培养物中的其他蛋白质或糖蛋白。