TWI332991B - Host cells having improved cell survival properties and methods to generate such cells - Google Patents

Description

1332991 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關包括增加量之活性抗-細胞凋零基因之遺 傳工程處理的哺乳類宿主細胞與產生此類細胞之方法。更 特別地，本發明係關於調節宿主細胞内抗·細胞凋零活性 基因的量之方法；以及關於利用延遲/抑制此類細胞之自 然發生的計畫性細胞死亡而顯示增加之細胞存活力的宿主 細胞。 【先前技術】 因為功能上與藥物動力學上相關之後轉譯修飾係與人類 高度相容’故哺乳類細胞係生產大部分之複雜的蛋白質治 療藥物之較佳宿主。商業上相關之細胞型態包括融合瘤、 骨髓瘤、中華倉鼠卵巢（CH0)細胞與幼倉鼠腎臟（ΒΗκ)細 胞。因為CHO之生長直接地適應無血清/無蛋白質之培養 液’且考慮其為重要管制機構之安全之生產宿主，故產業 上使用愈來愈多之CHO衍生物。 在標準之生物醫藥生產方法中·生物反應器操作，有相 當百分比之生產細胞族群會在稱為細胞凋零之遺傳決定的 程式中死亡（Al-Rubeai 專人，1998 ; Goswami等人，1999 ，Laken等人，2001)。已知細胞凋零係因諸如血清缺乏、 營養限制、氧氣限制與機械應力之外源或内生性信號之結 果而活化的主動細胞自殺程式。細胞〉周零之特徵為聚膜起 泡、細胞體積喪失、細胞核縮合與在核體間隔之核酸内切 酶降解 DNA(Wyllie等人，198〇)。 140810.doc 1332991 經辨識血清成分係主㈣效之細胞㈣保護劑。然而， 不僅在生技產業内’甚且，亦因藥物註冊之重要之管制機 構之推動，-直有強烈驅力來發展無血清與無蛋白質之製 造過程。主要原因在解省成本、蛋白純化時較少之干擾、 並減少導入諸如蛋白感染素或病毒等病原之潛在性。然而 ’省略血清通常造成生產的細胞株對計畫性細胞死亡:感 度增加，使細胞更易受培養之侵犯的傷害（以⑽吆等人’， 1州；G〇Swami等人’ 1999;編⑽等人，1995 ;以咖 等人’叫因為蛋白產量主要為活的生產細胞族群之 函數，故早熟之細胞死亡，例如藉細胞凋零者，即表示有 價值的來源之高度損失。愈能長久維持高密度之活的與生 產性細胞之培養時，因為每個生產過程之產率亦較高，其 生產過程愈有效亦愈能獲利。纟無血清時，細胞在到達最 高細胞密度之固定生長期時會更快死，因此縮短生產期。 因產物受凋零細胞釋出之蛋白酶降解與收取時受多量之細 胞碎片干擾’產率會進一步減低。 為解決生產細胞株增加之細胞凋零敏感度的困境，目前 已開始多種生理之工程處理策略’特別是那些經改變並完 全培養於無血清條件之細胞株。其令的某些策略之焦 ，在擬似產生的細胞培養條件下，減少/消減誘發内生性 ，細胞凋零·反應程式。有一種方法係減輕經由餵食之抽 離營養（deZengotiu等人，2〇〇〇 ;卜如仏等人，Μ% ; Mercille 等人，1994 ; Sanfeliu 等人’ 1999)。另一種方法 之焦點為’使用細胞洞零之壓制化合物添加劑以阻斷細胞 IS ] H0810.doc 屑零反應機制之主要效應物（Ma.strangelo等人，1999 ; Sanfeliu等人 ’ 2000 ; Simpson等人，1998 ; Zanghi等人， 2000)。替代的策略之一代表遺傳方法。包括利用抗_細胞 凋零存活基因，或遺傳工程處理之衍生自存活維持的調控 網路或病毒之抗細胞凋零決定者，以處理細胞本身（c〇Uer 荨人 ’ 1995 ’ Chung等人 ’ 1998 ; Fussenegger等人，2000 ;Mastrangelo 等人，1998，2000a與 2000b ; Mercille 等人 ，1999a與 1999b，Pan等人，1998 ; Simpson等人，1999 ; Terada等人，1997; Tey等人，2000a與2000b)。 關於後者之策略’經假設bcl-2與bcl-xL這兩種細胞)周零 壓制者’且是高度保存之親-(例如bad、bak、bax、bok、 bcl-xS、bik、bid、hrk、bim、blk、bcl-y)與抗-細胞凋零（ 例如1^1-2、1^1-认、131£^、匕€1-1、31、„1〇1-1、15〇〇、1^§- 1 ' nr-13、bhrf-1、ced 9、cdn-1、cdn-2、cdn-3)反應調控 基因之主要成員’係生技社群中抗-細胞凋零的工程操作 之強力中選者。 經顯示，Bcl-2可在回應由同源·與異源-雙體化之親-與 抗-細胞凋零BCL-2型蛋白質所組成之位於粒線體外膜之 分子變阻器情形下’調節位於粒線體外膜之硫胱胺酸蛋白 酶-9-依賴型的細胞凋零路徑之誘發。利用培養限制之對 親-細胞凋零亞家族成員之偏見表現與内生信號，造成 Apaf-1·硫胱胺酸蛋白酶-9複合物之釋出與此含半光胺酸 之天冬胺酸專一性蛋白酶自動活化之情形，與細胞色素c 由粒線體劇烈流至細胞質相關。細胞凋零控制機制在粒線 140810.doc 1332991 體外膜組合其主要的部分’在抗細胞〉周零之工程操作的焦 點上’可使這些細胞發電廠成為壓力感應器，並且是維持 細胞凋零過程之執行者（Follstad等人，2000 ; Green等人 ，1998 ; Tsujimoto，1998)。 有些報告指出異源抗-細胞调零be 1-2基因之表現對適應 並培養於含胎牛血清之遺傳工程細胞株之存活/存活力與 強健具正向效果。那些細胞包括骨髓瘤、融合瘤、幼倉鼠 腎臟細胞（BHK)與中華倉鼠卵巢細胞（ch〇)。有人說明 BCL-2表現之正效果與諸如血清與葡萄糖缺乏、生長因子 抽離或病毒感染之不同環境壓迫相關（Fassnacht等人， 1998，Figueroa 等人，2001 ; Fussenegger 等人，2000 ; Itoh 等人 ’ 1995 ; Mastrangelo 等人，2000a 與 2000b ; Reynolds 等人 ’ 1996 ; Simpson 等人，1997，1998 與 1999 ;Tey等人，2000a與2000b)。 分別已有人說明以BCL-xL為基礎之代謝遺傳工程處理τ 細胞與CD34+血球生成細胞（美國專利號碼6，143,291，W0 00/75291)。Fussenegger 等人，1998 還有 Mastrangelo 等人 ’ 2000a與2000b皆說明BCL-xL表現對倉鼠細胞存活之正 效果。 然而’全部這些報告若非使用諸如人類T細胞與CD34 + 灰球生成細胞之非生產性細胞株，即是使用已調適過並例 行地培養在含血清條件之例如，倉鼠或小鼠細胞株之生產 性細胞株；而且，甚至多數是附著細胞。研究血清抽離效 果對表現異源BCL-2或BCL-xL的重組細胞之存活’並不包 I40810.doc 1332991 括數次繼代培養於無血清之培養液。反而，血清培養之細 胞若非接種於完全無血清之培養液，即是血清含量減低之 養液，而i ’還追縱I天有關這些培養侵犯對批式培養 之細胞存活效果。13為由血清内之細胞料保護劑制約的 胞内反應料續，這㈣血清㈣造紅料侵犯的真正 開始亦可能延遲。

只有少量實驗進行相關之已適應錄定生長於無血清培 養液之懸浮液的重組細胞株的生產。目前，這些條件是生 技產業最喜愛者，但是同時細胞株更脆弱且更不強健。在 G〇SWami等人1999之報告，其說明表現干擾素之CH0 細胞培養在那些條件下之實驗。表現額外之異源町_2之 培養的存活有改善，㈣限錄切養7天後僅約鄉的 活細胞而已。&有人知道BCL_xL表現對適應並永久生長 於無血清條件下之宿主細胞存活力/存活之效果。 由上述討論，很清楚地在生技社群需要進—步增加細胞 存活力，尤其是已適應無血清生長並夠格於無血清生產治 療與診斷用之生藥的細胞株。妹式培養巾，若能以高存 活力延長細胞於固定期之存活’會明顯影響產率與成本效 益，藉此生產期每額外增加一天都會造成大貢獻。 【發明内容】 在本發明中，我們提供策略以進—步改善在無血清之培 養液的懸浮液中怪定成長之生產細胞株之存活。該策略係 根據遺傳工程處理之宿主細胞’以改善抗細胞凋零之作 用性多肽的細胞内含量。很驚料發現，抗細胞调零之 140810.doc 1332991 作用性基因的細胞内含量可實質改善細胞存活力，且對細 胞生產力亦無任何負面效果。 因’例如 經顯示’非放大之異源導入的抗-細胞凋零基 BCL-2或BCL-xL，對適應且通常生長於無血清與/或無蛋 白質條件之細胞的存活力/存活，僅有很小效果（參照圖5) 。此發現已由Goswami等人1999之報告所支持。現在，本 發明說明/提供一個劇烈改善宿主細胞存活力/存活之新方 法，特別是對建立與培養於無血清條件下者。利用放大促 成之過度表現來改善抗細胞凋零作用性蛋白，例如bcl_ xL或BCL-2之胞内含量，可延遲/抑制細胞凋零。本發明 很驚訝發現，藉大量之過度表現諸如BCL_xL之抗細胞凋 零蛋白，不僅是未負面影響所需蛋白表現量之能進一步改 善存活力/存活之適當工具而已。相反地，在BCL_xL^度 表現之細胞，細胞生產力還增加（例如參照圖2與。因而 ，本發明提供熟諳此藝者新的遺傳修飾宿主細胞，特別是 倉鼠或鼠類生產細胞株，而且還有生成這種發明性生產細 胞株之方法。只要能以非常充分方式改善目前的生產方法 之經濟活力，此發現對生產生物醫藥肽/蛋白將非常有利 。與目前技藝比較，本發明之大優點在於其不僅提供改呈 蛋白生產過程之限制因子-細胞存活力，之方法，同時提 供高蛋白質生產率。 因而’本發明提供具改善的存活性質且非常適於生產生 物醫藥蛋白質之遺傳工程處理的宿主細胞。該改善之存活 性質係根據細胞内增加之抗細胞凋零基因的量。較佳者為

[S I40810.doc 〇 i礼類來源之宿主細胞、更加者為鼠類融合瘤/骨髓瘤或 倉鼠細胞，尤其是已適應且恆定培養於無血清與/或益蛋 白質之培養液者。 ’ 本毛月亦提供顯示比方增加的抗細胞凋零基因表現量 之哺乳類宿主細胞的產生方法，包括⑴將編媽抗'細胞〉周 零基因、選擇用之可放大的標示者基因與視情形之至少一 種所奴的基因之核酸序列導入哺乳類宿主細胞族群，其中 絲因係_作上連接於至少—種允許該基因表現之調控序 列，=)將該細胞族群培養於至少可表現該選擇用之可放 大的標示者基因與該細胞洞零基因，且係有利於取得至少 該抗:細胞调零基因之多複製數的條件，以及㈣由該細胞 族群選取至少併人多複製數之抗_細胞料基因的細胞。 因而’本發明亦提供在宿主細胞表現抗·細胞料基因 、選擇用之可放大的標示者基因與至少一種所欲的基因之 方法’包括⑴將編碼抗·細胞祠零基因、選擇用之可放大 的標示者基因與所欲的基因之核酸序列導入宿主細胞族群 ’其中《因係㈣上連接於至少—種允許該基因表現之 调控序列，與(π)將該細胞族群培養於可表現該基因之條 件0 利用任何這歧方法夕 一、 —万沄之一處理宿主細胞，可提供包括至少 -，尚複製數之抗·細胞凋零基因之宿主細胞。 取後本發明亦提供在任何根據本發明之宿主細胞生產 所欲蛋白之方法，包括⑴培養細胞於有利抗細胞〉周零基 因與所欲基因表現之條件，與（u)由細胞與/或細胞培養上 140810.doc 1332991 澄液分離所欲之蛋白。. 【實施方式】 本發明提供經導入編碼抗_細胞 一 L用苓基因、選擇性之放 大用的標示者基因與至少一箱所於从甘 檀所欲的基因之核酸序列而遺 傳修飾之伯主細胞。在一較佳呈每. 衩佳具體貫施例，該抗-細胞凋 零基因、選擇性之放大用的標示者基因與所欲的基因操 作上連接於至少-個允料些基因表現之調控㈣。在更

-具體實施例’該宿主細胞之遺傳㈣包括導人—種以上 之抗-細胞凋零基因。 以此方式修飾之宿主細胞，允許抗·細胞料基因與選 擇性放大用之標示者以及視情形之所欲基因共表現。選擇 性放大用之標示者’不僅使我們可安定選取轉感染之宿主 細胞選殖系，亦可放大抗·細胞洞零基因。本發明顯示， 放大抗-細胞凋零基因，提供達成抗_細胞凋零作用性蛋白 之細胞内3量更有效之方法；與未放大任何抗細胞洞零 蛋白編碼序列者比較，可有效改善宿主細胞之存活。

因為延遲或抑制宿主細胞内之計晝性的細胞死亡，例如 細胞凋零所強化之細胞存活，為根據本發明之遺傳修飾的 宿主細胞之特徵。很驚訝地發現，經任何之本發明方法修 飾的宿主細胞族群，係經培養至少9天，其中細胞之總存 活率至少為約50%(亦參照圖5)β 8天批式培養後，根據本 發明生成的宿主細胞之存活力至少可達6〇%。在本發明之 進一步具體貫施例，7天之批式培養後細胞之存活力至少 可達約75°/。°在另一個具體實施例，6天之批式培養後細 140810.doc IS 1 -10- 1332991 胞之存活力至少可達約85%。此藝無法得知存活力當量， 至少對無血清之培養’與/或和生物醫藥之無血清生產相 關聯者係如此。此藝所述之存活力經7天批式培養後，限 制於4〇% (Goswami等人’ 1999)。因而，據此定特徵之宿 主細胞係本發明範圍所涵蓋。 「細胞存活力」或「細胞存活力」係目標細胞持續活著 並表現功能之能力’且包括因抑制或延遲細胞凋零或自然 細胞死亡而保護細胞免於細胞死亡。細胞存活力或細胞存 活之測定方法係此藝所熟知。例如，細胞存活力可利用相 位差顯微鏡、螢光顯微鏡或使用諸如錐藍、磁化丙錠或礙 化丙叙/叶啶橙之組合等非細胞滲透性染料之流動細胞計 數來決定。這些方法在Current Pr〇t〇⑶丨s in Cyt〇metlT，

John Wiley & Sons，Inc.，更新版，都以實例說明，其全文 並列於此供參考。 因而’本發明亦係有關抑制或延遲宿主細胞死亡之方法 ，包括將本發明之宿主細胞，例如上述之宿主細胞培養於 至少有一種抗_細胞凋零基因表現之條件，並可抑制或延 遲宿該主細胞之死亡。在一較佳具體實施例，該細胞之細 胞死亡係由已計畫性之細胞死亡，更佳者係因細胞凋零所 造成。 本發明亦提供顯示增加的表現量之抗細胞凋零基因的哺 乳類宿主細胞之產生方法，包括⑴將編碼抗·細胞凋零基 因、選擇用之可放大的標示者基因與視情形之至少一種所 欲的基因之核酸序列導入哺乳類宿主細胞族群，其中該基 140810.doc ^1332991 因係％作上連接於至少一種允許該基因表現之調控序列， (π)將該細胞族群培養於至少可表現該選擇用之可放大的 標示者基因與該抗·細胞凋零基因，且係有利於取得至少 該抗-細胞凋零基因之多複製數的條件，以及（in)由該細胞 私群選取至少併入多複製數之抗_細胞凋零基因的細胞。 根據本發明之任何方法遺傳修飾的宿主細胞與非轉感染 以及非放大之親代細胞比較，顯示增加之抗_細胞凋零蛋 的表現親代細胞」思指未顯示增加之抗-細胞凋零基 因表現的細胞，·而且，通常與根據本發明之例如，導入與 放大編碼抗-細胞凋零基因、選擇用之可放大的標示者基 因與視情形之至少-種所欲的基因之核酸序列的遺傳修飾 細胞’生長在相同或實質上相同之條件。抗_細胞洞零蛋 白之增加的表現”意指例如，過度表現，亦即，與未根據 本發明之任何修飾的方法比較，例如，藉由導人與放大編 碼抗-細胞调零基因、選擇用之可放大的標示者基因與視 情形之至少一種所欲的基因之核酸序列加以修飾者，該蛋 白在宿主細胞之表現量至少增加3〇倍，以至少增加5〇倍較 佳，以增加至少100倍更佳。 因而’本發明亦提供經本文所述之任何方法遺傳修飾， 並顯不過度表現之抗-細胞凋零基因的宿主細胞；亦即， 與未根據本發明之任何修飾的方法比較，該基因在宿主細 胞之表現量至少增加約30倍。在進一步之具體實施例本 發明亦關於與未經本發明意義修飾之細胞比較，其過度表 現量至少顯示增加50倍的宿主細胞。在另一具體實施：，

IS 140810.doc 本發明提供與未經本發明揭示方式所修飾之細胞比較，其 過度表現量至少顯示增加約1 〇〇倍的宿主細胞。圖7以實例 說明由本發明方法產生之宿主細胞可達到之表現量。將本 發明方法應用於宿主細胞之修飾過程，例如，進一步增加 抗-細胞凋零基因之複製數，可進一步增加抗-細胞凋零基 因之表現量。將一或多種抗-細胞凋零基因之多複製數導 入宿主細胞亦是可了解的。 在本發明意義之「宿主細胞」或「目標細胞」為倉鼠細 胞，較佳者為 BHK21、BHK TK_、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1與CHO-DG44細胞或任何此類細胞 株之衍生物/子代。特佳者為CHO-DG44、CHO-DUKX、 CHO-K1 與 BHK21，益佳者為 CHO-DG44 與 CHO-DUKX 細 胞。在進一步之具體實施例，本發明之宿主細胞亦意指鼠 類骨髓瘤細胞，較佳者為NS0與Sp2/0細胞或任何此類細 胞株之衍生物/子代。在本發明意義可使用之鼠類與倉鼠 細胞之實例表1亦有摘要。然而，這些細胞，包括但不限 於人類、小鼠、大鼠、猴子與嚙齒類細胞株之其他哺乳類 細胞，或包括但不限於酵母菌、昆蟲與植物細胞之真核細 胞的衍生物/子代，亦可做為本發明之意義使用，特別係 生產生物醫藥蛋白質。 表1 :倉鼠與鼠類生產細胞株 細胞株 次序號碼 NS0 ECACC No. 85110503 Sp2/0-Agl4 ATCC CRL-1581 BHK21 ATCC-CCL-10 ΒΗΚ TK* ECACC No. 85011423 140810.doc -13-

HaK ATCC CCL-15 2254-62.2 (BHK-21 derivative). ATCC CRL-8544 CHO ECACC No. 8505302 CHO-K1 ATCC CCL-61 CHO-DUKX (=CHO duk', CHO/dhff) ATCC CRL-9096 CHO-DUKX B1 ATCC CRL-9010 CHO-DG44 Urlaub et al.，Cell 33[21，405-412, 1983 CHO Pro-5 ATCC CRL-1781 V79 ATCC CCC-93 B14AF28-G3 ATCC CCL-14 CHL ECACC No. 87111906 1332991 建立、適應後，宿主細胞最好能完全培養於無血清條件 ，且視情形係在無任何動物來源之蛋白質/肽的培養液中 。市售培養液諸如 Ham's F12(Sigma, Deisenhofen,

Germany)、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco's Modified

Eagle's Medium (DMEM ； Sigma) ' Minimal Essential

Medium(MEM ; Sigma)、Iscove’s Modified Dulbecco's

Medium(IMDM ; Sigma)、CD-CHO(Invitrogen, Carlsbad CA)、CHO-S-Invtirogen、無金清之 CHO Medium (Sigma) 與無蛋白之CHO Medium (Sigma)俱為適當營養溶液之範 例。任何之這些培養液，必要時皆得補充一些化合物，例 如激素與/或其他生長因子 （諸如胰島素、轉鐵蛋白、 表皮細胞生長因子、類姨島素生長因子）、鹽（諸如氣化納 、鈣、鎂、磷酸鹽）、緩衝液（諸如hepes)、核：y：(諸如腺 苷、胸苷）、麩胺醯胺、葡萄糖或其他相當之能量來源、 抗生素、微量元素等。亦得包括任何熟諸此藝者熟知之 他適當濃度之必要補充。在本發明使用無血清之培養液較 佳，但補充適當量血清之培養液亦可做為培養宿主細胞之 m 140810.doc -14- 用。為培養與選取表現選擇用之基因的遺傳修飾細胞，我 們在培養液中添加適當之選擇藥劑。 為改善宿主細胞存活力，最好是如上述之生產細胞，本 發明亦關於高量表現的bcl-2超家族之抗-細胞凋零基因。 因而’編碼bcl-2超家族之基因適於生產根據本發明之宿 主細胞。因此，利用導入編碼bci_2超家族基因、選擇用 之可放大的標示者基因與至少一種所欲的基因之核酸序列 之遺傳修飾的宿主細胞，亦為本發明意義所涵蓋。表2中 列出抑制或延遲計畫性之細胞死亡或細胞凋零之屬於bc卜 2超家族成員之實例。哺乳類、線虫（c eiegans)或病毒來 源之此家族的多數蛋白，具有與細胞凋零抑制劑，BCL-2(BCL-2類似物區域BH1-BH4)相似之2·4個區域之延長的 胺基酸序列。此些均為進行本發明之抗細胞凋零基因/蛋 白質之適當侯選物。 本發明之進一步具體實施例以細胞較佳，其存活係藉導 入編碼 BCL-xL、BCL-2、BCL-w、BFL-1、Al、MCL-1、 BOO ' BRAG-1、NR-13、CDN-1、CDN-2、CDN-3、 BHRF-1、LMW5-HL或CED-9之核酸序列而延長。在一更 佳之具體貫施例，該編碼本發明之抗-細胞凋零基因之核 酸序列為脊椎動物之DNA分子。較佳之脊椎動物為哺乳類 。更佳者，本發明之核酸序列編碼名為Bcl-xL或BCL-2之 多肽。以BCL-xL編碼基因最佳。亦佳者為具有序列辨識 號碼.1 (與 GenBank Accession Number Z23115—致）咬序 列辨識號碼·· 2 (與GenBank Accession Number M13995 — I40810.doc 1332991 致）之序列的核酸。最佳者為序列辨識號瑪：1。由其他脊 椎物種編碼之任何這些基因的同系物，亦適於進行本發明 。甚且’亦佳者為編碼任何表2之抗_細胞凋零基因的核贫 酸序列’特別是具有表2所引之任何GenBank Accession Number的序列。抗-細胞凋零作用基因之實例亦可參照美

國專利號碼 6,303,33 1、5,834,309 與 5,646,008 與 WO 95/006342 ’其並列於本文供參考。亦可參考Boise等人，

Cell 74, 597-608, 1993。WO 95/006342以實例說明如何分 離BCL-xL編碼序列。 編碼抗-細胞凋零蛋白之核酸序列意欲包括任何不論在 體外或將編碼序列導入目標細胞後會轉錄與轉譯成抗·細 胞凋零蛋白之核酸序列。該抗-細胞凋零蛋白編碼序列得 為原生（野生型）基因以及自然產生（經自發突變），或重組 之遺傳工程的突變體與變體、切短版與片段、功能性相當 物、衍生物、同系物與自然產生或野生形之融合物；只要 編碼之多肽的生物功能活性’即抗細胞凋零功能維持，且 未實質改變即可。較佳之編碼多肽與相當之野生型抗-細 胞凋零蛋白質比較，至少具有50%，更佳者為至少具有 ’益佳者為至少具有100%或更多之功能性生物活性。 「野生型蛋白」意指完全、未切短、未修飾、自然產生之 編碼多肽的對偶基因。 抗-細胞凋零多肽之「功能性生物活性」可經由對表現 該特別多肽之轉感染細胞的定量細胞凋零分析來決定其 例諸如TUNEL分析、Annexin V分析、利用螢光顯微鏡之 I40810.doc 16 咬橙/漠化乙鍵染色或蛾化丙紗丫.錢染色、或流動細胞 計數分析或其他分析。這些分析為此藝所熟知且其說明可 參照例如Current Protocols in加贈巧，& Sons, Inc.，更新版。 利用此藝所熟知之標準技術，例如位置特定突變形成或 聚合酶鏈反應媒介之突變形成，得製備該修飾之核酸序列 在本發月中，特佳之bcl-xL核酸序列為分離的序列辨識 唬碼：1(與 GenBank Accession Number Z23115-致）之聚 核甞酸。本發明進一步包括與GenBank Accessi〇n n。 Z23 11 5序列或其他BCL-xL編碼序列功能上相當之核酸序 列。在一較佳具體實施例，該編碼BCL_xL之蛋白質為人 類者；在一更佳之具體實施例其係起源於倉鼠。然而，編 碼其他物種之BCL-xL之核酸序列亦為本發明之意義所涵 蓋。BCL-xL蛋白質係bcl-x基因所編碼。該基因產生兩種 不同的RNA分子，其一編碼BCL_xL(長型式）另一個編碼 BCL-xS (短型式）。BCL_xS缺少BCL_xL之一段63個胺基酸 。經顯示BCL-xS有助細胞凋零，因而使用cDNA，而非基 因體片段表現BCL-xL較佳。在另一較佳具體實施例’其 涵蓋改善之抗-細胞凋零性質之BCL_xL突變體或BCL_2突 變體，例如刪除BH3與BH4保存區間之非保存區域，因此 增加突變之蛋白質變體的蛋白質安定性（Chang等人，1997 ;Figueroa等人，2001) ° H08l0.doc 17 1332991 表2 : bcl-2超家族之抗-細胞凋零基因 聚核甞酸 GenBank Accession No. "^核苷酸~~" GenBank Accession No. bd-xL(人） Z23115 nr-13(雞） AF120211 bcl-xL(小鼠） L35049 bcl-xL(大鼠） U34963 bcl-xL(雞） Z23110 bcl-2(A) M13995 bhfr-1 AF120456 bcl-2(小鼠） M16506 (癌療病毒） bcl-2(大鼠） L14680 bhfr-l(E-B 病毒） A22899 bcl-2(雞） Z11961 bcl-2(倉鼠） AJ271720 bcl-w(人） U59747 Imw5-HL L09548 bcl-w(小鼠） U59746 (非洲豬熱病毒） bcl-w(大鼠） AF096291 bfl-l(人） U27467 cdn-Ι (人） AAQ95492 A1(小鼠） U23774 (NAGENESEQ) mcl-1 (人） AF147742 cdn-2(人） AAQ95493 mcl-1(小鼠） U35623 (NAGENESEQ) mcl-1 (大鼠） AF115380 mcl-1 (雞） AF120210 boo(小鼠） AF102501 cdn-3(人） AAQ95494 (NAGENESEQ) brag-1 (人） S82185 ced-9 L26545 (線蟲） 本文所用之「核酸序列」意指寡核甞酸、核甞酸或聚核 甞酸及其片段或部分，且涵蓋基因體來源或合成之DNA或 RNA，其可為單或雙股並可代表意義與反義股。本發明之 聚核站酸包括其中一或多種密碼子已經由其同義物所取代 之核酸區域。另外包括具有編碼序列之聚核：y：酸，其為編 碼序列之自然發生的對偶基因變體，例如序列辨識號碼： 1或序列辨識號碼：2之編碼序列變體。如此藝所知者，對 140810.doc -18- 偶基因變體為聚核：y：酸之替代型，其可能有實質上不改變 編碼的多肽之功能的一或多種核苷酸之取代、刪除或加成 。多肽之功能通常由該編碼多肽之功能性生物活性所決定 因而貝貝上不改變編碼的多肽之功能，意指與對應之 野生型編碼的多肽比較，該編碼的多肽之功能性生物活性 至少具有50%，更佳者為至少具有8〇%，益佳者為至少具 有100%或更多。 「編碼」之用語意指核酸中核苷酸之特定序列，諸如在 染色體中之基因或mRNA的固有性質，其係做為合成在生 物過程中具有定義之核：y：酸（亦即rRNA、tRNA、其他rNA 分子）或胺基酸序列之其他聚合物與巨分子之模版，及其 所生成之生物性質。因此，若一個基因生成之mRNA之轉 錄與轉譯生成細胞中或其他系統之蛋白，則該基因即編碼 蛋白質。不論是其核誓酸序列與mRNA序列一致，且通常 在序列表中提供之編碼股；或是做為基因或cDNA轉譯之 板版的非編碼股’皆付指為編碼該基因或cDNA之蛋白質 或其他產物者。因為遺傳密碼之退化，編碼蛋白質之核酸 包括任何具有不同核铝酸序列，但是而編碼該蛋白質之相 同胺基酸序列之核酸。編碼蛋白質之核酸與核苷酸序列得 包括插入序列。 在本文中「Cdna」之用語意指由逆轉錄所生產之去氧核 糖核菩酸，而且典型地係mRNA或基因生成之其他rn A之 第二股所合成。若為雙股’則cDNA分子具有編碼或意義 股與非編碼或反義股。 140810.doc 19 1332991 通常如本文所用者，大寫字母（例如BCL-xL)意指多肽 (例如基因表現之產物）；而小寫字母（例如bel_XL)意指聚 核苷酸（例如基因）。此外，在此專利說明書通篇中，除非 有其他說明，單數型「一個（a)J「一個（an)」與「該」皆 包括複數型。 「多狀」之用語與胺基酸殘基序列或蛋白質交互使用， 並意指任何長度之胺基酸聚合物。這些用語亦包括經由反 應的後轉譯修倚之蛋白質，這些反應包括但不限於糖化、 乙醯化、磷酸化或蛋白質加工。可在多肽結構中進行修飾 與改變，例如與其他蛋白質融合、胺基酸序列取代、刪除 或插入’同時維持分子之生物性功能活性。例如，可在多 肤或其背後之核酸編碼序列，做某些胺基酸序列之取代， 而且可得具類似性質之蛋白質。如上述，較佳之蛋白質為 由序列辨識號碼：1之核酸序列編碼之BCL-xL蛋白質序列 。藉由對其背後之核酸序列進行位置特定突變生成或聚合 酶鏈反應媒介之突變生成，可製備利用胺基酸之水療法指 數（Kyte等人，j. M〇i Bi〇1 157 : 1〇5_132, 1982)提供功能 性相當之BCL-xL多肽的胺基酸取代。 如上述’本發明係有關遺傳修飾之宿主細胞，以及產生 此種宿主細胞之方法。在一個具體實施例，該宿主細胞包 括異源引入之編碼抗·細胞凋零基因、選擇用之可放大的 標不者基因與視情形之至少一種所欲的基因之聚核钻酸序 列 選擇用之可放大的標示者基因」具有選擇用標示者 基因之性質，但當細胞培養於適當條件時，另外允許放大

IS I408l0.doc -20- (亦即’生成該基因之活成内染色，體或外染色體型式的另 外複製數）基因本身與鄰近該選擇用之可放大的基因之基 因。本發明特別提供宿主細胞，不僅包括一個複製數之導 入的抗-細胞凋零基因，亦包括多複製數之該抗-細胞凋零 基因’例如超過5，10，20，5〇或1〇〇個複製數之導入的 抗-細胞凋零基因。 這種宿主細胞，例如可經由包括下列之方法取得：（i)將 編碼抗-細胞凋零基因、選擇用之可放大的標示者基因與 視情形之至少一種所欲的基因之核酸序列導入哺乳類宿主 細胞族群’其中該基因係操作上連接於至少一種允許該基 因表現之調控序列’（ii)將該細胞族群培養於至少可表現 遠選擇用之可放大的標示者基因與該抗-細胞凋零基因， 且係有利於取得至少該抗-細胞凋零基因之多複製數的條 件’以及（iii)由該細胞族群選取至少併入多複製數之抗_細 胞祠零基因的細胞。以此方式生成之宿主細胞包括，例如 至少5個複製數之併入的異源性抗_細胞凋零基因。在進一 步之具體實施例’該宿主細胞包括，例如至少丨〇個複製數 之併入的異源性抗-細胞凋零基因。在另一個具體實施例 ’可得包括至少50個導入之複製數的異源性抗-細胞凋零 基因之宿主細胞。在進一步之具體實施例，該宿主細胞包 括’例如至少1 〇〇個複製數之併入的異源性抗_細胞凋零基 因適當之抗-細胞调零基因係那些上述者，特別係那此 表2所列者，例如編碼BCL-xL者。 通常本發明之宿主細胞較佳者係包括，其複製數允許其 140810.doc 1332991 表現量夠高到能經由抑制或延遲計晝性之細胞死亡，而增 強細胞族群存活之抗·細胞凋零基因。更佳者為，宿主細 胞不僅包括允許改善細胞存活之複製數的抗·細胞凋零基 因’亦顯示同樣由遺傳修飾之宿主細胞編碼之高量表現的 所欲基因。對熟諳此藝者而言，發現具有減少細胞凋零率 之隶1¾政果，而不劇烈造成細胞生長率減少或遺傳不安定 性’並且對所欲之蛋白質的生產率亦無負面影響之抗-細 胞〉周零基因的最高可容許表現量之方法，係已知的。其包 括但不限於，例如產生生長曲線、利用測定非滲透性染料 毫 之排除而經顯微鏡或流動細胞計數法偵測細胞存活力、藉 TUNEL或Annexin V分析定量細胞凋零、由EUSA決定產 〇〇滴疋度並經數次繼代由南方或斑點污潰雜合或定量p C R 評估轉感染基因之遺傳安定性。 在本發明中，若抗_細胞凋零基因，例如bc丨·认基因之表 現里與親代、非放大細胞比較，達到編碼多肽之胞内存活 的有效濃度，例如即達到充分增加之細胞存活。充分增加 之細胞存活之提供係例如，當該bd_XL基因或任何其他籲 抗-細胞凋零基因之表現量與親代細胞族群比較，致使細 胞族群於培養6、7、8或9天後至少增加約2〇%之存活。更 佳者為與親代細胞族群比較，於培養6、7、8或9天後細胞 存活至少增加約30%，益佳者為至少增加約5〇%。培養期9 天後，當至少約50%之培養細胞存活時，亦達足夠之細胞 存活。右抗·細胞凋零基因編碼BCL-xL，於培養9天後， 當至少約6G%之細胞存活時，亦収夠之細胞存活。在一 iS ] 140810.doc •22- 個具體實施例，當培養9天後至少約60%之細胞族群存活 時，其亦達充分增加之細胞存活。在進一步之具體實施例 ，當培養7天後至少約75%之細胞族群存活；甚且，若培 養6天後至少約85%之細胞存活時，其即達充分增加之細 胞存活。 「選擇用可放大之標示者基因」通常係編碼真核細胞在 那些條件下生長所需之酶。例如，該選擇用可放大之標示 者基因得編碼DHFR，該基因係在轉感染之宿主細胞生長 於選擇性藥劑，胺曱碟呤（MTX)條件下所放大。表3之非 限制性實例選擇用基因亦為可放大之標示者基因，其可用 以實現本發明。為回顧表3所列之選擇用可放大之標示者 基因，請參照 Kaufman, Methods in Enzymology, 185 : 53 7-5 66(1990)，其並列本文供參考。據此，根據本文所 述任何方法之遺傳修飾宿主細胞皆為本發明所涵蓋，其中 該選擇用可放大之標示者基因編碼具有二氫葉酸還原酶 (DHFR)、麵胺酿胺合成酶、CAD、腺#去胺酶、腺：y：酸 去胺酶、UMP合成酶、IMP 5'-去氫酶、黃。票吟鳥11票呤構 酸核糖轉移酶、HGPRT酶、胸苷激酶、胸甞酸合成酶、P 糖蛋白1 70、核糖核苷酸還原酶、天冬醯胺合成酶、精胺 酸琥珀醯酸合成酶、鳥胺酸去羧酶、HMG CoA還原酶、 乙醯葡糖胺轉移酶、蘇胺酸-tRNA合成酶或Na+K+-ATP酶 的功能之多肽。 較佳之選擇用可放大之標示者基因為編碼嘌呤合成所必 須之二氫葉酸還原酶（DHFR)之基因。缺少DHFR基因之細 140810.doc -23- 1332991 胞在無嘌呤之培養基無法生長。因而，DHFR具有選取並 放大在缺少嘌呤之培養基中生長的基因之顯性選擇用標示 者之用途。與DHFR基因聯合所用之藥劑為胺曱碟呤（MTX) 。因而，本發明包括生成哺乳類宿主細胞之方法，包括（i) 將抗-細胞凋零基因、編碼DHFR的基因導入哺乳類細胞族 群，與（ii)在含胺曱碟呤條件放大該抗-細胞凋零基因。據 此，將轉感染基因培養於不含血清、無次黃°票吟/胸替之 培養基並逐漸增加MTX的量，由培養基中無MTX開始， 至MTX濃度介於2毫微莫耳濃度至2000毫微莫耳濃度，更 典型地介於2毫微莫耳濃度至1000毫微莫耳濃度。逐漸增 加MTX濃度，其倍數因子為2-1 0。在一較佳方法，該抗-細胞凋零基因另外編碼表2所列之任何一個基因。在一更 佳方法，該抗-細胞凋零基因編碼BCL-2或BCL-xL ;而且 在一益佳方法為編碼B C L - X L。 表3:選擇用可放大標示者基因

Selectable Amplifiable Marker Gene Accession Number 選擇用藥劑 Dihydrofolate reductase M19869(倉鼠） E00236(小鼠） 胺曱碟呤(MTX) 金屬硫蛋白 D10551(倉鼠） M13003(人） Ml 1794(大鼠） CAD(氨曱醯-磷酸合成酶 :天冬醯胺轉氨甲醢酶 :二氫乳醋酸酶） M23652(倉鼠） D78586(人） N-磷酸乙醯-L-天冬胺酸 腺苷去胺酶 K02567(人） Μ10319(小鼠） Xyl-A-或腺：y：，2’去氧共 間型黴素 AMP(腺站酸)去胺酶 D12775(人） J02811(大鼠） 腺嘌呤、氮絲胺酸、共間 型黴素 UMP合成酶 J03626(人） 6-氮尿芬* p比α坐咬喃 IMP 5’去氫酶 •J04209(倉鼠） 黴酚酸 tS ] 1408l0.doc -24- 1332991

J04208(人） M33934(小鼠） · 黃嘌呤鳥嘌呤磷酸 核糖轉移酶 X00221(大腸桿_) 黴酚酸與有限的黃嘌呤 突變HGPRTase或 突變胸苷激酶 J00060(倉鼠） M13542，K02581(人） J00423, M68489(小鼠） M63983(大鼠） M36160(疱疹） 次黃嘌呤、胺基蝶呤與胸 苷(HAT) 胸^酸激酶 D00596(人） M13019(小鼠） L12138(大鼠） 5-氟去氧尿嘗 P_ 糖蛋白 170(MDR1) AF016535(人） J03398(小鼠） 多重藥物，例如亞德里亞 黴素、長春新驗、秋水仙 素 核糖核苷酸還原酶 Ml24223，K02927(小鼠） Aphidicolin 麵胺酿胺合成酶 AF 150961(倉鼠） U09114，M60803(小鼠） M29579(大鼠） 曱硫胺酸砜亞胺(MSX) 天冬醯胺合成酶 M27838(倉鼠） M27396(人） U38940(小鼠） U07202(大鼠） β-天冬胺醯氧肪酸酯合歡 胺酸，5·-氮胞苷 精胺酸琥珀醯酸合成酶 X01630(人） M31690(小鼠） M26198(牛） 刀豆胺酸 鳥胺酸去羧酶 M34158(人） J03733(小鼠） M16982(大鼠） α-二氟曱基鳥胺酸 HMG-CoA還原酶 L00183，M12705(倉鼠） Ml 1058(人） Compactin N-乙醯葡萄糖胺轉移酶 M55621(人） 突尼卡黴素 蘇胺酸t-RNA合成酶 M63180(A) 疏螺體素 Na+K+-ATP 酶 105096(A) M14511(大鼠） 鳥本嘗 利用DHFR編碼基因做為選擇用可放大之標示者的適當 宿主細胞為哺乳類細胞，較佳者為鼠類骨髓瘤或倉鼠細胞 。更佳者為缺少DHFR活性之CHO-DUKX(ATCC CRL-9096) 及 CHO-DG44(Urlaub等人，Cell 33 [2]，405-412, 1983)細 胞。為延展DHFR放大方法至其他細胞型態，可能使用編 I40810.doc • 25· 1332991 碼對胺甲碟呤敏感性降低之蛋白質的突變體DHFR基因， 聯合含正常數目之内生性野生型DHFR基因之宿主細胞 (Simonson等人，1983 ; Wigler等人，198〇 ; Haber等人， 1982)〇 本發明之另一個具體實施例亦提供經導入之編碼抗·細 胞屑零基因、DHFR基因與至少一種所欲的基因之核酸序 列而遺傳修飾之宿主細胞。在進一步之具體實施例，該宿 主細胞之抗-細胞凋零基因，編碼任何表2所列之抗細胞 凋零基因，較佳者係bcl-xL基因，更佳者係編碼具有序列 辨識號碼：1序列之bcl-xL基因。經由導入編碼bcl_xL、 DHFR基因與至少一種所欲的基因之核酸序列而遺傳修飾 之宿主細胞係本發明最喜歡者，因而，亦係本發明之主題 。然而，通常宿主細胞係在本發明意義之内，包括至少異 源之抗-細胞凋零基因、選擇用可放大標示者基因與一種 所欲的基因，其中該抗-細胞凋零基因係表2之任何基因， 而該選擇用可放大標示者基因係表3所列之任何基因。 「選擇用藥劑」之用語意指干擾缺少特定選擇用之基因 的宿主細胞生長或存活之物質。例如，為選取轉感染細胞 之例如A P Η (胺基配糖體磷酸轉移酶）之抗生素抗性基因之 存在’使用抗生素，Geneticin(G418)。選擇用藥劑亦得包 括放大藥劑」，若該選擇用標示者基因依賴其可放大之 選擇用標示者，其定義為供本文之目的做為放大該可放大 基因之複製數之藥劑。例如，MTX為選擇用藥劑對DHFR 基因之放大有用途。放大選擇用藥劑之實例為，但不限於 H0810.doc -26 - 1332991 表3者。 本發明適於產生生產生物醫藥多肽/蛋白質之宿主細胞 。本發明特別適於顯示增強之細胞存活力與生產力的細胞 來表現向產率之大量不同的所欲基因。「所欲基因」、「選 取序列」或「產物基因」在本文具相同意義，並意指任何 長度之編碼所欲產物之聚核苷酸序列，亦會被指稱為「所 需產物」之用語。選取序列得為全長度或切短的基因、融 5或‘示的基因，而且得為cDNA、基因體DNA或片 段’又以cDNA較佳。其得為原生序列，亦即自然產生型 式或得為突變型，否則即是視需要加以修飾者。這些修飾 包括將密碼子最佳化，使密碼子在選取之細胞表現最佳功 能、人性化或貼標籤。選取之序列得編碼分泌的、細胞質 的、細胞核、膜結合或細胞表面之多肽。「所需產物」包 括蛋白貝、多肽、其片段、肽、反義RNA等之全部能在選 取的宿主細胞表現者。所需之蛋白質得為例如抗體、酶、 胞動素、淋巴動素、附著分子、受體、衍生物或其片段， 及任何其他做為激動劑或拮抗劑之多肽，與/或具有治療 或診斷用途。所需蛋白質多肽之實例亦可見下文。 就定義而言，任何導入宿主細胞之序列或基因，相對於 宿主細胞皆稱為「異源序列」或「異源基因」，即使該導 入序列或基因與宿主之内生序列或基因一致亦同。例如， 導入倉鼠宿主細胞之倉鼠bcl_xL基因在定義上即是異源基 因。 利用「表現載體」，得將例如編碼BCL-xL之核酸序列之 I40810.doc •27- 1332991 異源基因序列導入目標細胞，以真核細胞較佳又以哺乳 類表現載體更佳。建構載體之方法係熟諳此藝者所孰知， 且在不同之發表文章中皆有說明。特別之建構適當載體之 技術，包括諸如啟動子、增料、終結與聚腺嗓吟信號、 選取標示物、複製起源與剪切信號等功能成分之說明：在

Sambr〇〇k等人，1989，及其所引之參考資料皆有相當詳 細之回顧。載體可能包括，但不限於質體載體、噬菌質體 、粘接質體、人工/迷你-染色體，或諸如桿狀病毒、逆轉 錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病#、泡疹單純病毒、噬菌 體之病毒載體。真核表現載體典型地亦包含促成載體在細 菌傳布之原核序列，諸如複製起源與在細菌中選取用之抗 生素基因。多種含聚核奸得操作上連接於其内之選殖位 置的真核表現載體係此藝所熟知，某些並得市購諸如 Stratagene, La Jolla, CA ； Invitrogen, Carlsbad, CA ； Promega，Madison, WI 或 BD Biosciences cl〇ntech，pal〇 Alto, CA。 在一較佳具體實施例，該表現載體至少包括編碼肽/多 狀的核芬酸序列轉錄與轉譯所需之調控序列的核酸序列。 在一更特定具體實施例，該表現載體至少包括允許編碼 抗-細胞凋零基因、選擇用可放大之標示者基因與所欲基 因的核菩酸序列轉錄與轉譯（表現）之調控序列。 「調控序列」包括啟動子、增強子、終結與聚腺嘌呤信 號及其他表現控制單元。得於不同細胞型態表現功能之不 論誘導性或構造性調控序列，皆為此藝所知。轉錄調控單

iS I408l0*doc 1332991 位通常包括欲表現之基因序列的上游啟動子'轉錄起始與 終結位置與聚腺嘌呤信號序列。轉錄起始位置之用語，意 指相當於併入初級轉錄體亦即mRNA前驅物之第一個核酸 建構物中之核酸，轉錄起始位置得與啟動子序列重疊。轉 彔、位置之用sf·思指通常出現在所欲基因之3 ,端或欲轉 錄序列之延伸的核:y：酸序列，其會造成RNA聚核酶終結轉 錄。聚腺嘌呤信號或聚_A加成信號提供在真核RNA 3,端之 特定位置的切斷與至3,端約i00_200腺嘌呤核菩酸（聚八尾 巴）序列核心之後轉錄加成之信號。聚腺嘌呤信號序列包 括位於切斷位置上游約10_30核甞酸之AATAAA序列，加 上下游序列。已知有不同之聚腺嘌呤單元，例如Sv4〇晚 與早期聚A或BGH聚A。轉錄調控單元包括每個欲表現之 個別多肽的轉錄起始位置（AUG)、停止密碼子與聚A信號 。在某些建構物中還包括内部之核糖體進入位置（IRES)。 IRES疋義如下。為將表現最佳化’不論在轉錄或轉譯層 面，對欲表現之核酸序列可能需去除、加成或改變5，與/或 3·未轉譯部分’以消減潛在之額外的不適當替代轉錄起使 密碼子或其他可能干擾或減少表現之序列。另外之共識核 糖體結合位置可即插入開始密碼子之5,端以增強表現。為 產生分泌性多肽’該選取序列通常會包括編碼可指引新合 成多肽到達與穿過多肽之分泌性路徑的ER膜之引導子肽 信號序列。引導子肽通常，但非全面性位於分泌蛋白質之 胺基端’且在蛋白質通過ER膜後即會被信號肽酶切斷。 分泌用之序列通常，但非必要包括其信號序列。在無原生 1408l0.doc -29- 1332991 信號序列時，可將異源信號序列融合於選取之序列。無數 之信號序列係此藝已知，且可得自諸如GenBank與eMbl 之序列資料庫。 表現載體得包含表現抗-細胞凋零基因 大的標示者基因與視情形之所欲的基因之單一轉錄單位， 例如利用IRES單元或某些基因之插入序列指引，以在操 作上將全部單元連接於相同啟動子或啟動子/增強子。替 代性地，表現載體得具有一或多種轉錄單位，而前述單元 侍由分開之轉錄單位表現，而每個轉錄單位含相同或不同 調控序列。在另-替代方式，超過一種表現載體包括一或 多種轉錄單位，每個皆得用以表現前述單元，得經共轉感 染使用並導入宿主細胞，或為依次序之不同回合或任何次 2之轉錄的導人單位。只要轉料位能充分表1，得選用 每個載體之任何組合◊進一步之經認定為必要之單元，可 能位於表現載體上諸如另外之抗'細胞祠零基因、所欲基 因或選擇用標示者。本發明之先決條件為，若非在一或兩 個載體之分開的轉錄單位即是在單一載體之同—轉錄單位 ’將抗-細胞獨零基因與選擇用可放大之標示者基因共導 入，以允許抗-細胞凋零基因與選擇用可放大之標示^基 因共放大。在進—步之具體實施例，該抗·細胞:零基^ 、選擇用可放大之標示者基因還有所欲基因係同時併入， 右非在一或兩個載體之分開的轉錄單位即是在單 一或多個轉錄單位’以允許抗·細㈣零基因與選^用牙 放大之標示者基因與所欲基因之共放大。 、 m 1408I0.doc -30- 1332991 「啟動子」意指控制其操作上連接之基 聚核甞酸序列。啟動子F勺衽球的 動子包括RNA聚核酶結合與轉錄起始之 <吕號。所用啟動子舍名矣？目，7 & & 會在表現心所選序列之宿主細胞的細 胞型態表現功能。不同來源之包括構造性、誘導性與阻遏 性啟動子之大量啟動子係此藝所熟知(並在諸如GenBank 之資料庫中已經辨識)，而且可得即是或包含於選殖之聚 料酸者（例如來自諸如A取以及其他市售或個別來源之 貯存庫）。就誘導性啟動早而

啟動子而έ，啟動子係對應信號而增 t,或減少活性。例如，含四環黴素操作者序列（⑽）之四 環黴素㈣啟動子得利用四環黴素_調控轉活化蛋白㈣） 來誘導。在有tet時，tTA與⑽之結合受抑制。其他誘導 性啟動子包括jUn、fos、金屬硫蛋白與熱休克啟動子，請 參照例如Sambrook等人，1989與G〇ssen等人，1994。經辨 識為高表現之強啟動子的真核啟動子為sv4〇早期啟動子 、腺病毒之主要晚期啟動子、小鼠金屬硫蛋白·说動子、 R㈣肉瘤病毒長終端重複與人類巨細胞病毒即早期啟動子 (MV) #他異源哺乳類啟動子包括，例如肌動蛋白絲啟 動子、免疫球蛋白啟動子、熱休克啟動子。前述啟動子係 此藝所熟知者。 本文所用增強子」意指作用於啟動子以增強其操作連 接之基因或編碼序狀轉譯的聚核#酸序列。不像啟動子 ，增強子具相當方向性與位置獨立，且發現係在轉錄單位 或 在插入序列以及在編碼序列本身。因而，儘管 實例上增強子得與啟動子在物理與功能上重疊，然而，增 140810.doc 1332991 強子侍放在轉錄起始位置之上游或下游或與啟動子有相當 離大畺的不同來源啟動子係此藝所熟知（並在諸如 GenBank之資料庫中已辨識，例如SV4〇增強子、cmv增強 子、多瘤病毒增強子、腺病毒增強子），而且可得即是或 匕3於選殖之聚核甞酸者（例如來自諸如atcc以及其他市 售或個別來源之貯存庫）。有些包括啟動子之聚核芬酸（諸 如一般用之CMV啟動子）亦包括增強子。❹上述之所有 的強啟動子亦包括強的增強子。 「轉錄單位」係定義建構物内之含—或多個待轉錄⑴ 因之區域’其中’該基因内含之片段操作上彼此連接」 啟動子轉錄：其結果’使不同之基因至少在轉錄」 物1 I個轉錄早位得轉錄並表現超過一個蛋白質或』 :。母個轉錄單位將包括該單位所 與轉譯所需之調控單位。 巧取㈣轉矣 、作上連接」意指其所處位置允許其以所欲方式表 兩個或更多之核酸序列或序列單元。例如，若盆 ==調節連接序列之轉錄，啟動子與/或增 子即刼作上連接於編碼序 列係連續的，但亦不盡乂作上連接之隱 編碼區域，或為分泌性5|導;:在:要連接兩個蛋白 取骨架上。熬而，儘J導子之情形時，將為連續且在1 列上游，卻未必與其通常位於編碼， 轉譯，不需要是連續者。為： =加編碼序列: 或下游，甚至是有g/l "寸位於編碼序列之上总 有一段距離。聚腺嗓吟位置若位於編… I40810.doc is ]

-32- 1332991 列3端，且能使轉錄繼續由編碼序列至聚腺嘌呤信號時， 其即操作上與編碼序列連接。經此藝已知之重組方法即可 完成連接，例如使用PCR方法、接合於適當之限制位置或 經由黏接。若無適當之限制位置，亦得使用根據傳統方式 之合成寡核甞酸連接子或適應子來進行。 本文所用表現」之用語意指宿主細胞内之異源核酸序 列之轉錄與/或轉譯。宿主細胞中所需產物之表現量，得 根據細胞中對應2mRNA的量或選取序列編碼所需多肽的 里來決定。例如，由選取序列轉錄之mRNA得經北方污潰 雜合、核糖核酸梅RNA保護、與細胞RNA之原位雜合或經 PCR定量（參照 Sambrook等人，1989 ; Ausubel等人，1987 更新版）。得利用多種方法定量選取序列編碼之蛋白，例 如藉ELISA'藉西方污潰、藉放射免疫分析、藉免疫沉澱 、藉分析蛋白之生物活性或藉蛋白之免疫染色並附隨 FACS 分析（參照 Sambrook 等人，1989 ; Ausubel 等人， 1987更新版）。 本文所用「增強表現」、「過度表現」或「高量表現」之 用語意指永續與高量之異源選取序列之表現，在本發明中 以導入宿主細胞之抗·細胞凋零基因，例如bcl_xL或bcl2 與/或所欲基因較佳。增強表現得利用多種方式達成。在 本發明中，諸如bcl-xL之抗-細胞凋零基因，或任何其他 表2所列基因加上選擇用可放大之標示者基因之表現，提 供更有效之選取與辨識高量表現異源基因之宿主細胞。選 擇用可放大之標示者基因不僅允許我們選取安定之轉感染 140810.doc •33· 1332991 細胞株’也允許所欲之異源基因之基因放大。該核酸序列 之另外複製數得整合入細胞之基因體或額外之人工染色 體/迷你染色體’或得放入基因副體。此方法得結合螢光 活化細胞分類（FACS)-使用例如螢光蛋白質（例如GFp)或細 胞表面標示物等另外的選取標示物，以支持選取共放大 抗-細胞凋零基因之重組宿主細胞。得達成增強表現（不論 就其本身或組合上述可能之情形時）之其他方法包括但不 限於’使用（人工）轉錄因子或以天然或合成藥劑處理細胞 ’以向上調控内生或異源基因表現、改善編碼Bcl-xl之 mRNA或蛋白質本身的安定性（例如刪除無關蛋白質生物功 能之蛋白酶易感性區域）、增加mRNA轉譯或使用基因副體 質體（根據做為複製起源之病毒序列，諸如SV40、多瘤病 毒、腺病毒、EBV或BPV)來增加基因劑量、放大啟動子 序列（Hemann等人，1994)或根據DNA連環之體内放大系統 (Monaco等人’ 1996)。熟諳此藝者以此藝之方法，可辨識 與定量已增加複製數之例如，放大的異源抗-細胞凋零基 因’例如利用南方污潰分析或定量PCR方法。如何選取最 適控制並進行此分析，係熟諳此藝者之知識範圍。這種方 法之實例之一係本文所述之實例。 藉上述方法可依此產生宿主細胞，故其包括至少多複製 數之導入的抗-細胞凋零基因’例如至少5、1 〇、2 0、5 0或 1 00複製數之導入的抗_細胞凋零基因。 「内部核糖體進入位置」或「IRE S」說明功能上促成 無關IRES之5’的基因轉譯起始之序列，並允許動物細胞中 [S 3 140810.doc •34· 1332991

之兩個順反子（開放讀取骨架）轉譯.自單一轉錄本。111£8提 供獨立之核糖體進入位置以供正在其下游之開放讀取骨架 之轉譯。不像細菌mRNA之聚順反子般，亦即編碼多種不 同由该mRNA依序轉譯者之多肽，動物之多數mRNA為單 順反子者，並僅編碼一個蛋白質之合成。在真核細胞之聚 順反子轉錄本，轉譯會由最5,端之轉譯起始位置起始，於 第一個停止密碼子終止，且該轉譯本會由核糖體釋出，造 成僅mRNA之第一個編碼多肽之轉譯。在真核細胞，具 IRES操作上連接於第二個或後續之開放讀取骨架之聚順 反子的轉錄本，其允許下游之開放讀取骨架之依序轉譯， 以產生由該相同轉錄本編碼之兩種或多種多肽。該 得為不同長度且得自不同來源，例如腦心肌炎病毒（emcv) 或細小核糖核酸病毒。先前已有人說明不同之ires序列 及其在載體建構之用途（pelletier等人，198 8 ; 等人， 1989 ; Davies等人，1992 ; Adam等人，i99i ; ㈣等 人，1992 ; Sugimot。等人，1994 ; Ramesh等人，Μ%

Mosser等人，1997)。同操作上連接於mES 3·端之下游編 碼序列，不論以任何距離，都不會負面影響下游基因之表 現。藉改變距離並測量做為距離函數之表現情形，可； 方便決定mES與下游基㈣始處之間的最佳或許可之距 本文所用「插入序列」之用語意指通常出現在很多真 基因中之不同長度的非編碼核酸序列，其係經由必須仿 插入序列兩端之高度保存或靠近的序列之剪切方法，、由 140810.doc •35- 1332991 轉錄之mRNA前驅物去除。通常，剪切過程需要插入序列 之5,端與3,端正確切除，而且生成之mRNA的端正痛接合 ，使得產生成熟之具蛋白質合成的適當讀取骨架之心财 。很多剪切捐助者與煎切接受者位置，亦即在表現序列_ 插入序列與插入序列-表現序列邊界密接周圍之序列的特 徵已決定，而且Ohshima等人，1987也提供回顧 得利用任何此藝熟狀技藝進行真核宿主細胞經聚核芬 酸或表現載體之「轉感染」’以生成遺傳修飾細胞或基因 轉殖細月包，其說明請見Sambrook等人，19musubei等 人，1987(更新版)。轉感染方法包括…限於脂質體_ 媒介之轉感染、弼-鄰酸鹽共沉殿、電孔動化、聚陽離子( 諸如舰E·葡聚糖）_媒介之轉感染、原子f體融合、病毒 感染與微注射。該轉錢以安定之轉感染較佳。轉感毕方 法在特別之宿主細胞株與型態有利時，提供最佳之轉感染 頻率與異源基因之表現。適當方法得由例行過程決定。為 了安定轉感染，建構物若非整合入宿主細胞基因體即是人 工杂色體/迷你染色體或位於基因副體，以便於宿主細 内安定維持。 ^擇用標示者基因」係僅允許帶該基因之細胞在相當 ΒΗ 4 專r之順或反向選取之基因。藉由說 月’抗生素抗性基因得做為正的選擇用標示者基因〜 :以相當之抗生素條件’做為正向選擇經該基因轉型之宿 田胞的標示者；至於，非轉型宿主細 件則無法生長或存活。選擇用標示者得為正、負或雙= IS ]

140810.doc -36 · 1332991

者：正向選擇用標示者’藉賦予藥物抗性或補償宿 之代謝或異化缺陷而允許選取帶標示者之基因。相形之^ ，負向選取標示者允許帶標示者細胞受選擇性消減。例如 ，利用HSV-tk基因做為標示者’可使細胞對諸如無環" 與丙氧鳥嘗之藥劑敏感。只要其編碼產物維持選擇用性= 本文所用之選擇用標示者基因，可包括放大之選擇用基 2，包括重組之遺傳工程處理之突變體與變體、片段、二 能性相當物、衍生物、同系物與原生之選擇用標示者基因 之融:物。有用之衍生物，通常在與選擇用性質相關之選 擇用標示者的區域或功能部位具實質序列相似性（於胺美 酸層次）。目前已有多種包括雙功能（亦即正/負）標示者2 標示者基因的說明，（參照例如w〇 92/〇8796與w〇 94/28U3)其並列於本文供參考。例如，通常用於真核細 胞之選擇用基因包括’胺基配糖體碟酸轉移酶基因（ΑΡΗ) 、南黴素磷酸轉移酶（HYG)、二氫葉酸還原酶（DHFR)、胸 苷激酶（TK)、麩胺醯胺合成酶、天冬醯胺合成酶與編碼對 新黴素（G418)、>呤黴素、組胺醇D、博菜黴素與變體鏈 絲黴素（phleomycin)等之基因。 選擇亦得利用例如細胞表面標示物、細菌β_半乳糖酶或 螢光蛋白（例如綠色螢光蛋白（GFp)及其來自水母 (Aequorea victoria)與另一種水母（Ren⑴a renif〇rmis)或其 他物種之變體、紅色螢光蛋白、螢光蛋白及其來自 Discosoma或其他物種之變體）藉螢光活化細胞分類（FACS) 選取細胞。 140810.doc -37- 根據本文之勃i 又之教誨，本發明亦提供在宿主細 胞凋零基因、選摆 L表現杬-細 選擇用之可放大的標示者基 欲的基因之方法。u興至J一種所 念该方法包括下列步驟：⑴將@ > 胞凋零基因、選摆田 ⑴將編碼抗-細 欲的基因之的標示者基因與至少—種所 主細胞族群’其中該基因係操作上連接於至少4= =表現之調控序列，⑼將該細胞族群培養於

熟諳此藝者而言，如何將-或多種= ，田I之方法、教誨係如上述所例示者。甚且， 本發明亦給予實例’說明一或多種基因如何與至 控者序列連接，以表現該基因。適於表現該基因之宿主細 胞係本發明所提及者。抗'細胞料基因之適當中選物列 於表2。較佳者係任何編碼BCL xI^^bcl_2序列之表現， 更佳者係任何編碼BCL_xL序列之表現。在該方法之進一 步更佳具體實施例’共表現之宿主細胞包括任何編碼表3 所列之任何一種選擇用可放大之標示者的序列。益佳之方

法為，其中該宿主細胞包括編碼異源BCL_xL之序列且包 括、扁馬表3所列之任何一種選擇用可放大之標示者的序列 最佳之方法為，其辛5亥宿主細胞包括編碼異源bcl_xL 與DHFR之序列。 本發明提供之方法，允許熟諳此藝者產生歸因於延遲或 抑制计畫性之細胞死亡，而顯示增強之細胞存活之特別是 為生產目的之新宿主細胞。目前已發現將細胞恆久培養於 懸浮液，尤其是無血清培養液之劇烈增加細胞存活力與產 140810.doc [S 3 -38- 1332991 $的有利策略。根據本發明之細胞非常適於生產多種所需 • 之多肽。本發明所述之遺傳修飾宿主細胞，不僅編碼負二 增強細胞存活之基因，並視情形編碼任何編碼所需肽之任 何所欲基因。據此，本發明亦提供熟請此藝者在宿主細胞 生產所欲蛋白質之方法，包括i)將本發明之任何宿主細胞 培養於有利表現抗-細胞凋零基因與所欲基因之條件與 (11)由細胞與/或細胞培養上澄液分離所欲之蛋白。本發明 亦提供以該細胞生產由所欲基因所編碼之至少一種所需蛋 白的用途。 所需蛋白質係那些上述者。尤其是，所需蛋白質/多肽 係例如，但不限於胰島素、類胰島素生長因子、hGH、 tPA;諸如間白素（IL)之胞動素，例如、江_3、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9 ' IL-10、IL-U、IL_ 12、IL-13、IL-14、IL_15、IL-16、IL-17、IL-18，干擾素 σΡΝ)α、IFN(3、IFNY、IFN(〇或㈣丁，腫瘤壞死因子 • (™F)(諸如）™Fa CSF、M_CSF、MCp_mvEGF。亦包括促紅血球生成素或 任何其他激素生長因子之生產。根據本發明之方法，可很 有利地用來生產抗體及其片段。這種片段包括，例如 片段（抗原結合片段=Fab)。Fab片段係由鄰近之怪定區抓 在一起之兩種鏈的可變區組成。這些可利用蛋白酶例如， 以木瓜酵素由傳統抗體消化形成；但是類似之Fab片段亦 可同時經由遺傳工程生產。進一步之抗體片段包括ρ(^，）2 片段，得利用胃蛋白酶之蛋白質切斷製備。 1408I0.doc -39- 1332991 利用遺傳工程方法可能生產僅由重鏈（vh)與輕鏈（礼）可 變區組成之縮短的抗體片段。其經指名為Fv片段（可變區 片段=可變區部分之片段)。因為這㈣片段缺少經由恆定 鏈之半光胺酸之兩個鏈的共架結合，Fv片段通常經過安定 化。利用短的肽片段連接重鏈與輕鏈之可變區是有利的， 例如1〇_30個胺基酸，以15個胺基酸較佳。以此方式取得 由肽連接子連接之包括V_VL之單一肽股。這種抗體蛋 白質名為單鏈-Fv(scFv)。由前藝所知之此類Fv_抗體蛋白 之實例說明請見HUston等人，（1 988, pNAS 16 : 5879_ 5883) ° 近年來，已發展出製備scFv做為多體衍生物之不同策略 。此係欲造成特別是具改善之藥理與生物分布性質以及增 強之結合抗體親抗原性的重組抗體。為達成多體化之scFv ，故將scFv製成具多體化功能部位之融合蛋白。該多體化 功能部位得為例如IgG之CH3區域或諸如白胺酸_拉鍊功能 部位之捲繞的捲繞結構（螺旋結構）。然而，亦有使用scFv 之VH/VL區域間之作用來多體化之策略（例如雙、三與五 體）。所謂雙體，熟諳此藝者亦指二價同雙體scFv衍生物 。縮短scFv分子之連接子至5-10個胺基酸會形成其中有一 交鏈VH/VL-重疊之同雙體。藉併入雙硫鍵架橋得將雙體 抗體另外安定化。來自前藝之雙體抗體蛋白之實例可見

Perisic 等人（1994, Structure 2 : 1217-1226)。 所謂微抗體’熟諳此藝者亦指雙價、同雙體SCFV衍生物 。其由包含免疫球蛋白CH3區域’較佳者為igG之融合蛋 140810.doc -40- 1332991 « 白組成，最佳者做為雙體化區域之IgGl係經由支點區域（ 例如’亦源於igG1)與連接子區域連接於scFv。來自前藝 之微抗體抗體蛋白之實例可見HU等人（1996，cancei· Res. 56 : 3055-61)。 斤月一抗體熟諳此藝者亦指三價、同雙體scfv衍生物 (ortt專人 1997 Protein Engineering 10 : 423-433)。不 用連接子序列而經VH-VL直接融合之scfv衍生物會形成三 體。 熟諳此藝者亦熟悉具雙-、三-或四價結構並衍生自scFv 之所謂的微抗體。該多體化係由雙_、三_或四體之捲繞的 捲繞結構進行（Pack 等人，1993 Bi〇techn〇l〇gy u : 1271· 1277 ; L〇vejoy等人，1993 Science 259 : i288 i293 ; pa 等人，1995 J. Mol. Biol. 246 : 28-34)。 本發明之較佳宿主細胞係本文所說明且以增強之細胞存 活為其特徵者。特別是較佳者為根據本發明之遺傳修飾的 宿主細胞，包括編碼抗_細胞凋零基因、選擇用之可放大 的標示者基因與至少-種所欲的基因之核酸序列。更佳者 為包括多複製數之這些基因的宿主細胞’至少有抗·細胞 阔零基因與選擇用可放大之標示者基因。多複製數之這也 基因亦係利用本文所述方法取得，例如藉基因放大方法 與/或以熟諳此藝者已知之任何其他方式（例如，導入基因 之連環）提供宿主細胞多基因複製數。 適當之抗_細胞调零基因為，但不限於表2所列者。較於 者係包括多複製數之BCL-XL編碼基因與多複製數之任二 140810.doc 1332991 表3所列之選擇用可放大之標示者基因的宿主細胞。最佳 之選擇用可放大之標示者基因為DHFR編碼基因。 適於生產蛋白之宿主細胞係顯示過度表現抗-細胞凋零 基因者，與未根據本發明方法修飾的宿主細胞之該蛋白的 表現量比較，其至少增加約3〇倍，以至少約5〇倍較佳又 以至少約100倍更佳。 甚且，適當的是於培養9天後，顯示至少約5〇%存活力 之宿主細胞族群。甚且，本發明之適當與較佳之宿主細胞 是培養8天後，顯示至少約60%存活力者。甚且，適於本 發明意義之宿主細胞為，於至少7天後，顯示至少約75% 之細胞存活力者。在另一具體實施例，宿主細胞族群於培 養6天後，以顯示至少約85%存活力為適當且較佳。在抗_ 細胞凋零基因編碼BCL-xL之情形，可取得於培養9天後， 至少約60% ;培養8天後，至少75% ;培養7天後，至少約 85%的存活力之細胞（例如參照圖5)。而且，與未經基因放 大方法修飾之親代細胞族群比較，以經過6、7、8或9天培 養後，其存活至少增加約20。/。之宿主細胞特別適當。更佳 者係’與親代細胞族群比較，經6、7、8或9天培養後，其 存活至少增加約30%之宿主細胞族群，益佳者為其存活至 少增加約50%之宿主細胞族群。 在本發明思義之適當的宿主細胞或宿主細胞族群，包括 倉鼠細胞，以 BHK21、BHK TK-、CHO、CHO_K1、CH〇_ DUKX、CHO-DUKX B1與CHO-DG44細胞較佳，或得為任 何此類細胞株之衍生物/子代。特佳者為ch〇_dg44、 【S3 140810.doc -42- 1332991 CHO-DUKX 、CHO-K1 與 BHK21 ；·更特別者為 ch〇-DG44 與CHO-DUKX細胞。在本發明進一步之具體實施例，宿主 細胞亦思指鼠類骨髓硫細胞’較佳者為NS0盘Sp2/0咬任 何此類細胞株之衍生物/子代。然而，那些細胞、其他哺 乳類細胞之衍生物/子代’包括但不限於人類、小鼠、大 鼠、猴子與嚙齒類細胞株；或真核細胞，包括但不限於酵 母菌、昆蟲與植物細胞，亦可做為生產目的之本發明意義 的用途。

通常係經多步驟方法，才能選取已顯示增加之存活力並 表現高量所需蛋白的重組宿主細胞。選取策略有賴細胞是 否由至少三個相關基因（抗-細胞凋零基因、選擇用之可放 大的標示者基因、所欲的基因、與視情形之額外的選擇用 標示者基因）平行共轉感染、是否將該所欲基因導入已經 顯示如本文所述之增加的細胞存活力之細胞，或是否將該

抗-細胞凋零基因加上選擇用可放大之標示者基因導入‘ 表現所欲基因之宿主細胞。 在第-種情形，其篩選或選取與所欲基因共轉感染之^

何表現選擇用標示者的轉感染細胞，以辨識併人所欲基E 之細胞。典型地’將轉感染宿主細胞培養於選擇用培養$ ’例如約2週，以選擇彼表現選擇用標示者。其後，逐』 將細胞暴露於連續增量之放大的選取藥劑，至少共放大: 碼抗-細胞凋零基因、撰摆 ^社 選擇用之可放大的標示者基因盥戶 仅的基因之核酸序列，直 &、 取仔充分表現之異源的所需g 物以及抗-細胞凋零基因甚 令暴口產物。母個選取步料得以 140810.doc •43- 1332991 集中物或結合’例如有限稀釋之純種系選取來進行。若使 用諸如GFP之適當標示者，得利用螢光活化細胞分類 - (FACS)進行選取。 - 在第一種情形，適當之宿主細胞係至少經所欲的基因與 選擇用“示者基因轉感染；並視情形加上與先前所用的選 擇用可放大之標示者基因不同之選取用可放大的基因以 產生具增強之存活力的宿主細胞。之後，至少篩選或選取 那些表現與所欲基因共轉感染之選取用標示者的轉感染細 胞，以辨識併入所欲基因之細胞。典型地，將轉感染宿主 _ 細胞培養於選擇用培養液，以選擇彼表現選擇用標示物者 。視情形，為產生具增強之存活力的宿主細胞，選取用抹 養液亦得包含具先前所用之選擇用可放大之標示者基因專 一性的選取用藥劑。選取步驟得以細胞集中物或結合例如 ，有限稀釋之純種系選取來進行。若使用諸如GFp之適當 標不者，得利用螢光活化細胞分類（FACS)來進行選取。若 使用另-種選擇用可放大之標示者基因進行轉感染時，視 情形，亦得續行細胞之進一步的放大步驟，以至少增加所 魯 欲基因之複製數。 在第三種情形，以抗·細胞凋零基因、選擇用之可放大 的標示者基因與視情形之另外一種選擇用標示者基因與/ 或所欲的基因’將重組之宿主細胞或已表現所欲基因之生 產細胞株共轉感染；藉此，其使用與建立重組之生產細胞 株不同的標示者以進行選取。將轉感染之宿主細胞株培養 於選取用培養基約2週，進行選取，以輯導人之標示 【S3 I408l0.doc • 44 - 1332991 者基因。視情形，該選取用培養基亦含具先前使用之選取 用標示者專一性之選取用藥劑，以生成重組之生產細胞株 。其後’逐步將細胞暴露於連續增加量之放大的選取藥劑 ，至少共放大抗-細胞凋零基因、選擇用之可放大的標示 者基因與視情形共轉感染之所欲的基因，直到至少取得充 分表現之抗-細胞凋零基因產物為止。每個選取步驟皆得 以細胞集中物或可結合，例如有限稀釋之純種系選取來進 行。若使用諸如GFP之適當標示者，得利用螢光活化細胞 分類（FACS)來進行選取。 所欲之蛋白以培養液中之分泌性多肽的形式回收較佳， 或若其表現時無分泌性信號，得由宿主細胞溶胞物回收。 必須由其他重組蛋白與宿主細胞蛋白純化所欲之蛋白，以 取得所欲蛋白之實質均質的製備物。第一步，先將細胞 與/或顆粒性細胞碎片由培養液或溶胞物去除。其後將 所欲產物由污染之可溶蛋白、多肽與核酸中純化，例如藉 免疫親合力或離子交換管柱區分、乙醇沉澱、反相HpLC 、Sephadex色析、矽膠或諸如DEAE之陽離子交換樹脂之 色析法。通常，教導熟諳此藝者如何純化宿主細胞表現之 異源蛋白的方法係此藝所熟知的。這種方法之說明請見例 如 Harris與 Angal，Protein Purification Methods，Rickwood 與 Hames編輯 ’ The Practical Approach Series, IRL Press (1995)或 Robert Scopes，ρ_ίη purificad〇n，响― Verlag (l%8)，二者皆並列於本文供參考。 本發明的通常主題之_，係提供熟諳此藝者顯示已增加 140810.doc •45- 1332991 細胞存活的宿主細胞β藉任何本文所述方法，抑制或延遲 計畫性之細胞死亡’例如細胞凋零，皆得增加細胞存活。 增強本文意義之細胞存活的最充分方式為，提供宿主細胞 多複製數之至少一種異源導入之抗-細胞凋零基因，並培 養該宿主細胞於允許抗·細胞凋零基因複製數高度表現之 條件。本發明亦提供至少包括5個複製數之異源抗_細胞凋 零基因的宿主細胞。本發明亦提供至少包括〗〇個複製數之 異源抗-細胞凋零基因的宿主細胞。甚且，本發明亦提供 宿主細胞，至少包括20個複製數；在另一個具體實施例， 至少50個複製數；在進一步之具體實施例，至少1〇〇個複 製數之異源抗·細胞凋零基因。本發明，提供熟諳此藝者 數種如何生成此類包括多複製數之異源抗細胞凋零基因的 宿主細胞之方法。那些方法包括但不限於上述者：例如⑴ 於選擇性藥劑驅使下，逐步放大至少—種異源導入之抗_ 細胞凋零基因，（ii)利用並導入上述之基因副體質體增 加至少一種異源導入之抗-細胞凋零基因之基因劑量，（Hi) 或使用根據例如Monaco等人，1996所述之DNA連環體外 放大系統，其並列於本文供參考。 適當之抗-細胞凋零基因係任何表2所列者，特別係由任 何扎向表2之核酸序列所編碼者。較佳者為包括多複製數 之編碼BCL-xL或BCL-2的基因之宿主細胞，更佳者為編碼 BCL-XL ’而益佳者為具序列辨識號碼：丨之序列的核酸所 編碼之BCL-xL。在進一步之具體實施例，以編碼bcl_2或 具序列辨識號碼：2之序列的抗_細胞〉周零基因較佳。亦佳 1408l0.doc -46 - 1332991 者為包括不同之抗-細胞凋零基因.，例如選自表2所列者， 的宿主細胞。在本發明一更佳具體實施例，混合物至少有 一個複製數編碼異源之BCL-xL。 適^之伯主細胞係任何本發明所述者，例如表1所提者 。更佳者為倉鼠或鼠類來源，例如鼠類骨髓瘤細胞之宿主 細胞。益佳者為CHO或BHK細胞’特別係ch〇-DG44、 BHK21、BHK TK-、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO- DUKX B1與CHO-DG44細胞，或得為任何此類細胞株之衍 生物 /子代。农佳者為 CHO-DG44、CIHO-DUICX、（ΖΉ0-Κ1 與ΒΗΚ21 ;特別是CHO-DG44與CHO-DUKX細胞。 上述之宿主細胞得另外藉導入至少一種所欲之異源基因 加以修飾；因此，本發明亦關於包括如上述之多複製數的 抗-細胞凋零基因’並進一步包括至少一種所欲基因之宿 主細胞。 本發明之實施除非另有說明，將使用傳統細胞生物、分 子生物、細胞培養、免疫學及其類似者，且皆屬於此藝之 技藝。這些技術在目前之文獻皆完全揭示。例如參照 Sambrook等人 ’ Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 第 2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ν·Υ. (1989); Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology (1987 更新版）；Brown編輯，Essential Molecular Biology，IRL Press (1991) ; Goeddel編輯，Gene Expression Technology, Academic Press (1991) ; Bothwell 等人編輯 ’ Methods for Cloning and Analysis of 140810.doc -47· 1332991

Eukaryotic Genes，Bartlett Publ. (1990) ; Wu等人，編輯， Recombinant DNA Methodology, Academic Press (1989);

Kriegler, Gene Transfer and Expression, Stockton Press (1990) ; McPherson 等人，PCR : A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1991) ; Gait編輯， Oligonucleotide Synthesis (1984); Miller & Calos編輯， Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (1987) ； Butler 編輯，Mammalian Cell Biotechnology (1991) ; Pollard 等 人，編輯，Animal Cell Culture，Humana Press (1990); Freshney 等人，編輯，Culture of Animal Cells, Alan R. Liss (1987) ； Studzinski,編輯，Cell Growth and

Apoptosis, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1995) ; Melamed 等人，編輯，Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss (1990) ； Current

Protocols in Cytometry，John Wiley & Sons, Inc.(更新版） ! Wirth & Hauser, Genetic Engineering of Animals Cells,

in : Biotechnology 第 2 冊，PUhler 編輯，VCH，Weinheim 663-744 ; — 系列之 Methods of Enzymology (Academic Press，Inc.)與 Harlow 等人，編輯，Antibodies : A Laboratory Manual (1987)。 本專利說明書所提之全部出版品與專利申請，係熟諳此 藝者有關本發明之技術水準的指標。本文所引用之全部出 版品與專利申請，藉此全文並列供參考，以更完整說明有 關本發明之技藝狀態。參考下列實例，將更易了解上文之 IS 1 1408l0.doc -48 - 1332991 本發明的一般描述，然而其僅用以說明本發明之某些具體 實施例，無論如何皆非用以限制本發明。 實例 縮寫 CHO :中華倉鼠卵巢 DHFR :二氫葉酸還原酶 ELISA :酶連接免疫吸附分析 FACS :螢光活化細胞分離器 FITC :異硫氰酸鹽螢光素 HRPO :辣根過氧化酶 HT :次黃嘌呤與胸甞 IRES :内部核糖體進入位置 MTX :胺甲碟呤 PAGE :具炳烯醯胺膠電泳 PBS :磷酸緩衝鹽液 PI :碘化丙錠 SΕΑΡ :分泌性之驗性填酸酶 SDS :十二酯硫酸鈉 sIC AM :可溶性細胞内附著分子 方法 1.細胞培養 將永久培養於補充以次黃°票吟與胸访（Invitrogen, Carlsbad, CA)之無血清培養液之懸浮液CHO-S-SFMII (Invitrogen, Carlsbad, CA)的 CHO-DG44/dhfr-/_(Urlaub 等 140810.doc -49- 1332991 人，1983)，保溫於37°C、含5%C02之溼度調整的恆溫箱 之細胞培養燒瓶中。每2-3天，接種細胞濃度為2 X 1 05細 胞/毫升，並利用CASY1細胞計數器（Schaerfe System ； Germany)分析細胞懸浮液（500微升）之細胞數及存活力。 存活力亦可利用錐藍染色排除來確認。單細胞選殖係利用 標準稀釋技術，以96井箱子進行。為了以DHFR為基礎之 選取穩定轉感染的CHO-DG44細胞之用，我們使用無次黃 嘌呤與胸甞之CHO-S-SFMII培養液。將20毫微莫耳濃度 MTX(Sigma，Germany)加入培養液，做為放大選取用藥劑 來完成以DHFR為基礎之基因放大。做為批式培養用，將 純種系以二重複接種入含12毫升適當培養液之細胞培養燒 瓶（T25)，並保溫於恆溫箱中7-9天而不加任何新鮮培養液 。當將CHO-DG44細胞培養於CHO-S-SFMII培養液時，補 充以1 0%胎牛血清（Sigma, Germany)。為了繼代，每2-3天 將細胞以胰蛋白酶處理（在含血清時CHO-DG44便會附著） 並以2χ105細胞/毫升之濃度接種於新鮮培養液中。 2.表現載體 根據pAD-CMV載體（Werner等人，1998)之基礎載體 pBID，會媒介由CMV啟動子/增強子驅使之異源基因的構 造性表現。此外，pBID編碼dhfr之迷你基因做為可放大之 選擇用標示者（例如參照EP 0 393 438)。由pAD-sICAM (Werner 等人，1998)分離出含 sIACM之 Hindlll/Sall 片段， 並選殖入pBID之相當位置（Hindlll與Sail)，以生成pBID-sICAM。以如下方式將人類bcl-xL (序列辨識號碼：1, 1408l0.doc -50- 1332991

GenBank Accession Number Z231.1 5)與bcl-2 (序列辨識號 碼：2，GenBank Accession Number M13995)同系物選殖入 表現載體。為建構pBID-bcl-2，首先將bcl-2以PCR由人類 總RNA放大，並再選殖入pCR2.1-TOPO選殖載體 (Invitrogen，Carlsbad，CA)。利用 EcoRI，將其從那裡切出 並接合入pBID之相當的EcoRI位置。利用Klenow-DNA聚 合酉每，將填滿之Pmel-切出的pDD6 (Fussenegger等人， 1998)之 IRES-bcl-xL片段，選殖入 pBID-sICAM 之 Xbal 位置 生成雙順反子之pBID-sICAM-bcl-xL表現載體。利用 Sall/Xhol消化與再接合，將sICAM-IRES單元由pBID-sICAM-bcl-xL削減，此載體為建構pBID-bcl-xL之基礎。 PSEAP2-對照組懷藏受SV40啟動子控制之人類的分泌性鹼 性碗酸酶（Clontech，Palo Alto, CA)。pGL2-對照組包含受 SV40啟動子驅使之螢火蟲的蟲螢光素酶（Promega, Madison, USA) 〇 3.暫時與穩定之轉感染 利用 Fugene6試劑（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim， Germany)進行轉感染。每次轉感染，將2毫升之含0.6χ106 指數生長之CHO-DG44細胞之補充以ΗΤ的CHO-S-SFMII培 養液接種入6井小室之井中。每次轉感染，依照製造商之 方法，使用總共4微克之質體-DNA與10微升之Fugene6試 劑。暫時之轉感染進行三重複，並於轉感染48小時後收集 上澄液與細胞。為了穩定之轉感染，於轉感染後7 2小時以 無HT之CHO-S-SFMII培養液取代培養液，並於分析或選 I40810.doc 51 1332991 殖前選取混合之細胞族群2週，而且每3-4天換培養液。單 細胞之選殖係利用標準稀釋技術。為放大整合入宿主細胞 染色體之異源基因，將衍生自混合之遺傳修飾的宿主細胞 族群接種入含200微升之補充以20毫微莫耳濃度MTX的無 HT之CHO-S-SFMII培養液至96井小室。以3週選取放大之 單細胞純種系，並擴展入細胞培養燒瓶。

4.SICAM ELISA 以標準方法（Ausubel等人，1994更新版），利用兩個自行 生產發展之sICAM專一性單株抗體（例如美國專利號碼 5,2 84,931與5,475,091所述），其中之一抗體為1111?〇-共軛 者，經ELISA定量上澄液之sICAM滴定度。以純化sIC AM 蛋白為標準。由Spectra Fluor Plus讀取機（TECAN， Crailsheim，Germany)分析樣本。 5. 報導者酶分析 才艮據方法，以 Promega 之 Luciferase Assay System (Madison, WI)決定螢火蟲的蟲營光素酶報導者酶活性。根 據方法，以Clontech 之 Great EscAPe SEAP 套件（Palo Alto, CA)測定SEAP活性。利用Spectra Fluor Plus讀取機 (TECAN, Crailsheim, Germany)分析樣本。 6. 西方式污潰分析 利用西方污潰分析確認親代宿主細胞CHO-DG44與遺傳 修飾的宿主細胞之BCL-2與BCL-xL之表現。以500微升溶 解緩衝液（1% Triton X-100、15毫莫耳濃度NaCM、10毫莫 耳濃度Tris-HCl pH 7.5加上50微克/毫升苯基曱烷磺醯氟化 m 140810.doc -52- 1332991 物與200微升之全來自Roche Diagnostics的蛋白酶抑制劑 混合物）萃取約1 X 1 〇6之細胞。溶胞物以13OOOxg離心1 0分 鐘，使之澄清。根據製造商方法（Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany)，以 Bradford分析定蛋白質濃度 。然後，將萃取物貯存於一80°C備用。取等量蛋白（20微 克）進行 10% SDS-PAGE (Novex ; Invitrogen, Carlsbad, CA) 並於其後電污潰於硕基纖維素膜（Invitrogen, Carlsbad, CA) 。以5%脫脂奶粉阻斷後，利用來自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)之 BCL-2 或 BCL-xL 專一性 的小鼠單株抗體偵測蛋白。觀測蛋白係以抗-小鼠過氧化 酶-偶合之二級抗體（Dianova GmbH, Hamburg, Germany)利 用 ECL 偵測系統（Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)進行。 7. 細胞凋零之定量 利用以螢光為基礎之TUNEL-分析（BD Biosciences PharMingen, San Diego, C A)定量片段化之DNA量。收取 ΙχΙΟ6細胞，以PBS洗過，並以1%聚曱醛之PBS溶液於4°C 處理1 5分鐘。經另外之PBS清洗步驟後，將細胞混以70% 乙醇並根據製造商方法進行分析。以FACSCalibur(Becton-Dickinson)進行每個樣本之1 0000個細胞的FITC與PI發射 情形分析。 8. 標示之粒線體的流動細胞計數法 每個樣本收取500000個細胞，以PBS洗，並以1〇/〇聚曱醛 之PBS溶液於4°C處理15分鐘。於第二次PBS清洗後，已可 140810.doc •53· 1332991 進行以螢光為基礎的細胞粒線體之染色。由1宅莫耳浪度 貯存液製備含500微微莫耳濃度之粒線體選取用的Mit0

Tracker Green FM 染料（Molecular Probes，Eugene, OR)之 PBS溶液。將細胞保溫於200微升，37 °C之染色溶液15分 鐘。其後，以PBS洗細胞兩次，懸浮於400微升PBS ’並進 行流動細胞計數分析。定每個樣本1 〇〇〇〇個細胞之綠色螢 光發射。 實例1 :暫時與安定模式之存活與產物基因之過度表現 一般傷風治療藥sicAM(可溶性胞内附著分子丨）會與 ICAM受體競爭鼻病毒之結合並防止此一般傷風之起源劑 與進入細胞及後續感染所需之ICAM受體作用（BeUa等人， 1999 ; Marlin等人，1990)。為詳細評估抗-細胞凋零基因 bcl-2與bcl-xL之暫時表現對siCAM產生之影響’將等量之 sICAM編碼質體pBID-sICAM以三重複與pBID-bcl-2、 pBID-bcl-xL或同基因型對照組PBID共轉感染（圖U入缺乏 dhfr之CHO-DG44。讓細胞永久生長於無血清之補充以次 黃嘌呤與胸站的 CHO-S-SFMII(Invitrogen，Carlsbad, CA) 之懸浮液。轉感染後48小時，利用自行生產之sICAM專一 性抗體、經ELISA定量懸浮液之siCAM滴定度。在BCL-2 之表現劇烈減低對照組pBID之siCAM生產至1 〇%之情形， 異位的BCL-xL之表現卻增加sIC AM產率達60°/〇(圖2 A)。這 些資料經SEAP表現情形（以pSEAP2-對照組交換pBID-sICAM)證實，其顯示所觀察之BCL-2與BCL-xL的生產特 徵係一般性而非sICAM/BCL-2或sICAM/BCL-xL表現之組 I408l0.doc •54· 1332991 合效果（圖2B)»而且，為評估BCL-2與BCL-xL之表現對細 胞生產參數之影響是否與分泌性產物蛋白連結、甚或受其 限至，還利用胞内螢光素酶報導者進行一致性之產物分析 說明（以pGL2-對照組取代pBID-sICAM)。螢光素酶生產特 徵與前述SEAP及sICAM表現情形相關，證實這些細胞凋 零-壓制基因對CHO-DG44細胞之總體產量之正面（bcl-xL) 與負面（bcl-2)影響（圖2C)。所需蛋白在BCL-2表現後之減 量生產情形，在適應懸浮液生長之COS-7細胞（ATCC CRL-1651)、定錨依賴之CHO-K1 (ATCC CCL-61)與CHO-DUKX 細胞（ATCC CRL-9096)亦發現。 儘管暫時轉感染實驗對異源基因在廣泛圍之細胞型態與 複製數之代謝工程能力給我們高度可信賴之資料，卻僅有 穩定之混合族群得無疑地證實所觀察之表現型。因而，生 成每個 pBID-sICAM/pBID-bc卜2、pBID-sICAM/pBID-bcl-xL、pBID-sICAM/pBID-組態之6個混合族群之sICAM滴定 度情形。於無HT之CHO-S-SFMII培養液利用以DHFR為基 礎之選取來選取表現異源基因之轉感染的細胞族群。圖3 顯示在3天培養期中由那些穩定轉感染之混合族群所生產 之sIC AM的絕對產量。每個值表示經5次繼代後所有族群 之平均sICAM產量，而每次繼代皆取一些樣本。如暫時轉 感染可見者，BCL-2之表現對sICAM產量有負面影響，滴 定度減低達50% ;至於與工程處理僅供sICAM表現之對照 組族群比較，BCL-xL之表現增加此一般傷風治療劑的總 體產率達30%。這些在暫時與穩定表現組態所得之相關性 140810.doc -55- 1332991 結果，建議我們欲設計抗-細胞凋零之工程策略，應僅考 慮追隨所得之存活決定者的小心分析。 實例2 : bcl-2與bcl-xL之dhfr-放大的基因表現對穩定之生 產sICAM的細胞純種系之存活力與抗-細胞凋零之效果 為評估抗-細胞凋零工程處理對無血清之批式培養的基 因轉殖CHO-DG44細胞株之效果，選取由CHO-DG44與 pBID-sICAM/pBID-bcl-2 、 pBID-sICAM/pBID-bcl-xL 或 pBID-sICAM/pBID載體組合穩定共轉感染、且來自6種混 合之細胞族群的個別最高生產sICAM之細胞族群做進一步 分析。利用於96井小室之限制的細胞稀釋，進行兩個單細 胞之無性繁殖步驟，一個係在無HT之CHO-S-SFMII培養 液（非放大之細胞純種系）；另一個包括單回合之MTX-誘 發之DHFR·為.基礎之放大，且以20毫微莫耳濃度之MTX補 充無HT之CHO-S-SFMII培養液（放大之細胞純種系）。利用 ELISA篩選最高之sICAM生產者之細胞純種系，每個基因 組態選取兩個最好之純種系做進一步分析。除了 pBID-sICAM外，這些細胞純種系亦含下列之一的建構物：（i)位 於 HMNI-1、HMNI-2(未放大）及 HMNI-3、HMNI-4(已放大） 之pBID (镡有載體之對照組），（ii)位於HMNIBC-1、 HMNIBC-2(未放大）及 HMNIBC-3、HMNIBC-4(已放大）之 pBID-bcl-2，（iii)位於 HMNIBX-1、HMNIBX-2(未放大）及 HMNIBX-3、HMNIBX-4(已放大）之 pBID-bcl-xL。 每天偵測批式培養之細胞培養瓶中全部的細胞純種系， 持續一週。如圖4可見，所有非放大之細胞純種系，包括 [S ] 1408l0.doc •56- 僅有載體之對照組，展現類似之存活力情形，此清楚顯示 BCL-2與BCL-xL對存活力之效果可忽視。於第7天，存活 力在所有情形皆降至約30-40%。然而，在含放大之異源 基因的純種系之下降期，可發現細胞存活力明顯較高。在 有關細胞死亡之保護，BCL-xL明顯比BCL-2表現好（圖5) 。在表現BCL-xL之細胞株（HMNIBX-3/4)，於第9天仍有 70%之活細胞，比較表現BCL-2之細胞株（HMNIBC-3/4)之 約60%與基因轉殖對照組細胞株（HMNI-3/4)之無活細胞。 與存活力增加相關，使用螢光為基礎之TUNEL分析，於2 、4及6天時評估放大之細胞純種系，亦顯示起始細胞死亡 程序之細胞百分比劇烈減少（圖6)。至於，在第2天時全部 之基因轉殖組態幾乎皆未發現凋零之細胞，而第4天時則 可見凋零之細胞明顯增加。增加最少者達5%，為表現 BCL-xL之細胞；隨之為表現BCL-2之細胞為10% ;至於基 因轉殖之對照組細胞的凋零細胞幾乎達30%。於第6天時 ，不同的轉感染細胞株間之差異更明顯。BCL-xL之細胞 凋零抑制潛力與BCL-2比較至少高3倍；因為在此階段後 者BCL-xL之細胞凋零細胞達30%，而前者僅10%。在未表 現任何異源抗-細胞凋零基因之基因轉殖對照組細胞，細 胞凋零細胞之數目則已達60%。 為證實抗-細胞凋零基因之放大狀態，遂進行BCL-2與 BCL-xL指向之西方污潰分析。圖7顯示僅基因轉殖對照組 細胞株HMNI-1之基準BCL-2(圖7A)與BCL-xL(圖7B)表現 量接近偵測極限，並與親代CHO-DG44細胞者相當。此顯 I40810.doc -57- 1332991 示存活之基因表現並未受以DHFR為基礎之選取向上調控 ，與較早之追隨G4 18媒介的選取報告之偏向增強的存活 之偏見結果有所不同（Tey等人，2000a)。與基因轉殖對照 組 HMNI-1 和親代 CHO-DG44(圖 12A 與 12B，HMNIBC-3/4 與HMNIBX-3/4)比較，利用以DHFR為基礎之放大，BCL-2與BCL-xL之表現情形得分別增加至少80-100倍與3 0-40倍 。在非放大之基因轉殖細胞株，BCL-2與BCL-xL之表現量 增加不到1 0倍。此蛋白量明顯很低係為充分之抗-細胞凋 零保護效果（圖5)。以具雙順反子組態之表現載體--pBID-sICAM-bcl-xL轉感染之細胞可得相當結果。在此轉譯單位 之第一個順反子的sICAM之遞增轉譯，其起始係古典之 cap-依賴型；而第二個順反子之be 1-xL的cap-依賴型，係 由衍生自腦心肌炎病毒之IRES單元所驅使。選擇用可放 大之標示者dhfr係包含在相同載體之分開的轉譯單位。 BCL-2與BCL-xL媒介之抗-細胞凋零工程之詳細分析例 示這些存活決定者之高量表現係必須的，以便在永久培養 於無血清條件之CHO-DG44細胞展現任何明顯之保護效果 〇 實例3 :利用斑點污潰分析定基因之複製數 整合入轉感染宿主細胞CHO-DG44之異源抗-細胞凋零基 因bcl-2與bcl-xL之複製數係利用斑點污潰分析來決定。為 此目的，利用市售 Qiagen之 Genomic Blood & Tissue Kit (Hi 1 den, Germany)，根據製造商所述方法，由基因轉殖與 親代CHO-DG44細胞株分離基因體DNA。將通常介於0.5- [S 1 1408I0.doc -58- 1332991 15微克之不同量基因體DNA之溶於鹼性緩衝液者，使用附 著於抽器裝置之歧管（其細節請見Ausubel等人，Μ%，更 新版）二重複施用於帶正電之Hybond N +尼龍膜 (Amersham Biosciences，Freiburg, Germany)。應點斑點之 基因體DNA的量’視其後將由雜合之探針搜尋之目標序列 的相對量而定。然後進行雜合分析以決定污潰2DNA製備 物之bcl-2與bcl-xL序列的量。遵照Gene Images任意主導 prime標識模式（Amersham Bi〇sciences, Freiburg，以⑽抓乂) 之方法產生任思主導之FITC-dUTP標示之bcl-2與bcl-xL 專一性探針’若非利用由EcoRI消化pBID-bcl-2所得bcl-2 專一性之640鹼對片段’即是利用PvuII/BclI消化pBID_bcl_ xL之bcl-xL專一性730鹼對片段做為標識反應之模板。根 據Gene lmages任意主導prim4f識模式之方法，雜合係於 雜合烤箱中以65°C進行隔夜。雜合後濾膜以〇.2xSSC/0.1% SDS ’ 65 °C洗兩次、各20分鐘，然後根據Gene Images CDP-Star铺測模組（Amersham Biosciences)，繼續抗體發 展與偵測。信號定量係利用VDS_CL imager system (Amersham Biosciences)。分離自基因轉殖細胞之基因體 DNA的bcl-2或bcl-xL專一性信號之信號強度係與固定分子 數之分別為pBID-bcl-2或pBID-bcl-xL表現質體（根據質體 分子量為基礎計算之數目）之標準曲線比較，且用來估計 基因體DNA樣本内的目標DNA之絕對量。因為内生性bci_ 2與bcl-xL基因，親代細胞株CHO-DG44之基因體DNA的雜 合信號將由轉殖基因信號減去。然後將基因轉殖樣本之複 140810.doc -59· 1332991 製數除以每個樣本之DNA量，以取得每個細胞之基因複製 數並根據每個細胞5 pg之DNA量，乘以5 pg。為正常化所 比較之樣本間DNA的量，於脫去濾器上之第一種探針後， 在相同濾器之第二次雜合反應中以部分倉鼠的mbh-1基因 (myc-為基礎之排列的同系物1)為内部控制基因探針。 藉此方式，可決定經由導入與放大bcl-2或bcl-xL基因（ 例如，如本文所述者）之遺傳修飾的宿主細胞，包括至少5 、10、20、50或100複製數之異源bcl-2與bcl-xL基因者。 實例4 :藉添加血清調節粒線體數目 為明顯影響生長於無血清條件之CHO-DG44的存活，很 清楚的需要高BCL-2或BCL-xL劑量，起始我們思考是否粒 線體之量與因而對計畫性細胞死亡之敏感性係視血清而定 。因為發現血清係細胞凋零之重要保護因素，而且粒線體 係細胞死亡調節者（類似BCL-2與BCL-xL)之主要平台，此 假設更令人信服。 以決定血清依賴型之特定粒線體量為焦點，CHO-DG44 細胞，若非培養於無血清之CHO-S-SFMII培養液的懸浮液 ，即是培養於補充以10% FCS之CHO-S-SFMII中成附著細 胞。於所述條件培養2週後，兩種培養之細胞皆利用 MitoTracker Green FM-粒線體專一性之榮光染料描述其特 定粒線體含量。因MitoTracker Green FM會以膜電位依賴 方式在粒線體累積，故其係定量這些胞器之良好工具 (Metivier等人，1998)。與培養在含血清之細胞比較，粒 線體專一性染色在無血清之細胞培養中明顯增加。FACS- m 140810.doc -60- 1332991 媒介之分析定量特定粒線體含量激發達3倍（圖8)。因無血 清條件下粒線體清楚放大，故簡明建議血清依賴型細胞株 之成功抗-細胞凋零工程處理需增加BCL-2或BCL-xL表現 量以補足與這些胞器相關之細胞凋零機制的特定增加。 引用參考資料

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Wyllie, A.H. et al„ Int Rev Cytol 1980, 68,251 - 306 Zanghi, J. A. et al., Biotechnol Bioeng 1999, 64, 108-119 Zanghi, J. A. et al., Biotechnol Prog 2000,16, 319-325 【圖式簡單說明】 圖1圖示供轉感染CHO — DG44細胞之表現載體設計。 P/E意指含增強子與啟動子單元之組合單位’ p為啟動子單 位而T為轉譯之傳信者RNA聚腺嘌呤化所需之轉譯終止位 置。sICAM意指所欲基因，而bcl-2與bcl-xl指抗細胞/周零 基因。dhfr意指可放大之選擇用標示者二氫葉酸還原酶° 箭頭指示轉錄單位内之轉錄起始位置。 圖2比較短暫轉感染之CHO-DG44細胞於轉感染後48小 時之表現情形。圖2A之pBID-sICAM、圖2B之pSEAP2-對 照組（Clontech，Palo Alto，CA)與圖 2C 之 pGL2-對”、、’’且 (Promega，Madison, WI)係經 pBID-bcl-2、pBID-bcl-xL 或 •63- 140810.doc 1332991 對照組pBID轉感染。. 圖 3 顯示經 pBID-sICAM與 pBID、pBID-bcl-2 或 pBID_bcl_ xL共轉感染、選取與培養於無黃嘌呤/胸甞的CHO-S-SFMII 培養液（Invitrogen，Carlsbad, CA)之 CHO-DG44 之安 定混合族群sICAM之表現情形。每個值都是在3天培養期 、5次繼代期之6個混合族群之平均sICAM產量。 圖4評估選殖之細胞株ΗΜΝΙ-1/2(經pBID-sICAM與pBID 共轉感染之對照組細胞株）、HMNIBC-l/2(經pBID-sICAM 與 pBID-bcl-2 共轉感染）與 ΗΜΝΙΒΧ-1/2(經 pBID-sICAM 與 pBID-bcl-xL共轉感染）於7天批式培養期使用錐藍染料排 除之存活力。選取重組之CHO-DG44細胞並培養於無黃嘌 吟 /胸嘗的 CHO-S-SFMII培養液（Invitrogen, Carlsbad, CA) ο 圖5顯示使用錐藍染料排除之存活力百分比情形，胺曱 碟呤放大之細胞選殖系ΗΜΝΙ-3/4(經pBID-sICAM與pBID 共轉感染之對照組細胞株）、HMNIBC-3/4(經pBID-sICAM 與 pBID-bcl-2 共轉感染）與 HMNIBX-3/4(經 pBID-sICAM 與 pBID-bcl-xL共轉感染）於9天批式培養於無黃嘌呤/胸苷， 但含20毫微莫耳濃度之MTX的CHO-S-SFMII培養液 (Invitrogen，Carlsbad，CA) 〇

圖6顯示表現BCL-2或BCL-xL之胺甲碟呤放大的CHO-DG44細胞選殖系之細胞凋零特徵。使用螢光為基礎之 TUNEL分析（BD Biosciences PharMingen，San Diego，CA) ，於第 2、4與6天時評估 HMNI-3/4(經pBID-sICAM與pBID iS ] 140810.doc •64- 1332991 * « 共轉感染之對照組細胞株）、HMN.IBC-3/4(經pBID-sICAM 與 pBID-bcl-2 共轉感染）與 HMNIBX-3/4(經 pBID-sICAM與 pBID-bcl-xL共轉感染）之批式培養於無黃嘌呤/胸:y：，但含 20毫微莫耳濃度之MTX的CHO-S-SFMII培養液（Invitrogen， Carlsbad, CA)之凋零細胞百分比。 圖7顯示BCL-2與BCL-xL在不同重組之CHO-DG44細胞 選殖系之西方污潰分析結果。其比較BCL-2(圖7A)與BCL-xL(圖 7B)在未放大（BCL-2 : HMNIBC-1/2 ； BCL-xL : HMNIBX-1/2)或放大（BCL-2 : HMNIBC-3/4 ; BCL-xL : HMNIBX-3/4)之表現單順反子組態之抗-細胞凋零基因之 細胞品系的表現。抗-細胞凋零基因之表現係與親代 (CHO-DG44)與僅生產-siCAM(HMNI-l)對照組的細胞株做 比較。蛋白質係利用購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)之具BCL-2或BCL-xL專一性之小鼠單株抗體與 抗-小鼠過氧化酶偶合之二級抗體（Dianova GmbH, Hamburg, Germany)來偵測 〇 圖8顯示以MitoTracker為基礎之培養於有或無血清之 CHO-DG44 的粒線體量之定量（Molecular Probes, Eugene, OR)。FACS媒介之粒線體計數係在培養於含i〇%血清（灰 線）與不含血清（黑線）之CHO-DG44細胞進行。 1408l0.doc •65· 1332991 序列表

<110> Boehringer Ingelheim Pharma KG <l2〇>具有改良存活性質之宿主細胞及該細胞之產生方法。 <130>相閼案申請案號(岸列方法案件卜1314) <140> 092106773 <141> 2003·03-26 <150> 02007144-5 <151> 2002-03-28 <160> 2 <17〇> Patentln 2.1 版軟體

<210> 1 <211> 926 <212> DNA <213>人類的 <300> <400>序列辨識號碼：1 gaatctcttt ctctcccttc agaatcttat cttggctttg gatcttagaa gagaatcact 60 aaccagagac gagactcagt gagtgagcag gtgttttgga caatggactggttgagccca 120 tccctattat aaaaatgtct cagagcaacc gggagctggt ggttgacttt ctctcctaca 180 agctttccca gaaaggatac agctggagtc agtttagtga tgtggaagag aacaggactg 240 aggccccaga agggactgaa tcggagatgg agacccccag tgccatcaat ggcaacccat 300 cctggcacct ggcagacagc cccgcggtga atggagccac tgcgcacagc agcagtttgg 360 atgcccggga ggtgatcccc atggcagcag taaagcaagc gctgagggag gcaggcgacg 420 agtttgaact gcggtaccgg cgggcattca gtgacctgac atcccagctc cacatcaccc 480 ca99gacagc atatcagagc tttgaacagg tagtgaatga actcttccgg gatggggtaa 540 actggggtcg cattgtggcc tttttctcct tcggcggggc actgtgcgtg gaaagcgtag 600 acaaggagat gcaggtattg gtgagtcgga tcgcagcttg gatggccact tacctgaatg 660 accacctaga gccttggatc caggagaacg gcggctggga tacttttgtg gaactctatg 720

ggaacaatgc agcagccgag agccgaaagg gccaggaacg cttcaaccgc tggttcctga 780 cgggcatgac tgtggqcggc gtggttctgc tgggctcact: cttcagtcgg aaatgaccag 840 acactgacca tccactctac cctcccaccc ccttctctgc tccaccacat cctccgtcca 900 gccgccattg ccaccaggag aacccg 926 <210> 2 <211> 911 <212> DNA <213>人類的 140810.doc 1332991 <400> SEQ ID N0:2 tgattgaaga caccccctcg tccaagaatg caaagcacat ccaataaaat agctggatta 60 taactcctct tctttctctg ggggccgtgg ggtgggagct ggggcgagag gtgccgttgg 120 cccccgttgc ttttcctctg ggaaggatgg cgcacgctgg gagaacgggg tacgacaacc 180 gggagatagt gatgaagt这c atccattata agctgtcgca gaggggctac gagtgggatg 240 cgggagatgt gggcgccgcg cccccggggg ccgcccccgc accgggcatc ttctcctccc 300 agcccgggca cacgccccat ccagccgcat cccgcgaccc ggtcgccagg acctcgccgc 360 tgcagacccc ggctgccccc ggcgccgccg cggggcctgc gctcagcccg gtgccacctg 420 tggtccacct ggccctccgc caagccggcg acgacttctc ccgccgctac cgcggcgact 480 tcgccgagat gtccagccag ctgcacctga cgcccttcac cgcgcgggga cgctttgcca 540 cggtggtgga ggagctcttc agggacgggg tgaactgggg gaggattgtg gccttctttg 600 agttcggtgg ggtcatgtgt gtggagagcg tcaaccggga gatgtcgccc ctggfcggaca 660 acatcgccct gtggatgact gagtacctga accggcacct gcacacctgg atccaggata 720 acggaggctg ggtaggtgca tctggtgatg tgagtctggg ctgaggccac aggtccgaga 780 tcgggggttg gagtgcgggt gggctcctgg gcaatgggag gctgtggagc cggcgaaata 840 aaatcagagt tgttgcttcc cggcgtgtcc ctacctcctc ctctggacaa agcgttcact 900 cccaacctga c 911 1408l0.doc •2- m

Claims (1)

1. ^ 098132019號專利申請宰〜 中文申請專利範圍替換本(9、9年 七、申請專利範圍：.〜一. 種在倉鼠宿主細胞表現編碼抗細胞调零基因、選擇用 可放大的才示不者基因與至少一種所欲的基因之方法， 其包括： β⑷將編碼抗'細胞〉周零基因BCL-2、選擇用之可放大的 :不者基因與所欲的基因之核酸序列導入倉鼠宿主細胞 知群’其巾該基gj操作上連接於至少—種允許該基因表 現之調控序列； (b)將該宿主細胞族群培養於表現該基因之條件， 藉此，該細胞係於懸浮下生長並培養於無血清與/或無 蛋白質之培養基。 2· 一種產生顯示增強表現量之抗-細胞凋零基因之倉鼠宿主 細胞之方法，其包括： (a)將編碼抗-細胞凋零基因BCL-2、選擇用之可放大的 標示者基因與視情形之至少一種所欲的基因之核酸序列導 入倉鼠宿主細胞族群，其中該基因操作上連接於至少一種 允許該基因表現之調控序列； (b) 將該細胞族群培養於至少可表現該選擇用之可放大 的標示者基因與該抗-細胞凋零基因BCL-2，且係有利於 取得至少該抗-細胞凋零基因BCL-2之多複製數的條件， (c) 由該細胞族群選取至少併入多複製數之抗_細胞〉周 零基因BCL-2的細胞， 藉此，該細胞係於懸浮下生長並培養於無血清與/或無 蛋白質之培養基。 140810-990902.doc 1332991 3. 根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中該倉鼠宿主細 胞為中華倉鼠卵巢（CHO)細胞或幼倉鼠腎臟（BHK)細胞 〇 4. 根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中該抗-細胞凋零 基因具序列辨識號碼：2之序列。 5. 根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中該選擇用之可 放大的標示者基因編碼二氫葉酸還原酶（DHFR)、麩胺醯 胺合成酶、CAD、腺苷去胺酶、腺甞酸去胺酶、UMP合 成酶、IMP 5'-去氫酶、黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶、 HGPRT酶、胸苷激酶、胸甞g吏合成酶、P糖蛋白1 70、核 糖核站酸還原酶、天冬醯胺合成酶、精胺酸琥珀醯酸合 成酶、鳥胺酸去缓酶、HMG CoA還原酶、乙隨葡萄糖胺 轉移酶、蘇胺酸-tRNA合成酶或Na+K+-ATP酶。 6. 根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中該選擇用之可 放大的標示者基因編碼DHFR。 7. 一種產生倉鼠宿主細胞之方法，其包括： (a) 將抗-細胞凋零基因BCL-2與DHFR基因導入倉鼠細 胞族群； (b) 在含胺甲碟呤條件放大該抗-細胞凋零基因BCL-2， 藉此，該細胞係於懸浮下生長並培養於無血清與/或無 蛋白質之培養基。 8. 根據申請專利範圍第7項之方法，其中該倉鼠宿主細胞 為中華倉鼠卵巢（CHO)細胞或幼倉鼠腎臟（BHK)細胞。 9. 一種抑制或延遲宿主細胞之細胞死亡之方法，其包括將 140810-990902.doc 1332991 根據申請專利範圍第1至8項中任一項之方法製備之宿主 細胞培養於至少表現抗-細胞凋零基因BCL-2，因而抑制 或延遲該宿主細胞的細胞死亡之條件。 10. 根據申請專利範圍第9項之方法，其中該細胞死亡係由 計畫性細胞死亡所造成。 11. 根據申請專利範圍第9項之方法，其中該細胞死亡係由 細胞凋零所造成。 φ 丨2.根據申請專利範圍第9至11項中任一項之方法，其中Λ 細胞係培養在無血清與/或無蛋白質之培養液。 Λ 13. —種在宿主細胞生產所欲蛋白質之方法，其包括： ⑷將根據申請專利範圍第⑴項中任—項之方法 之宿主細胞培養於有利表現抗·細胞洞零基因與所欲基因 之條件， 白 (b)由細胞與/或細胞培養上澄液分離所欲之蛋— 14. 一種根據申請專利範圍第丨 1 喟丫仕項之方法製備之 宿主細胞生產至少一種由所 白質之用 裡田所欲基因所編碼之蛋 途。 140810-990902.doc