MXPA04009336A - Celulas hospederas que tienen propiedades mejoradas de supervivencia celular y metodos para generar estas celulas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a celulas hospederas de mamifero tratadas por ingenieria genetica, que comprenden un nivel aumentado de genes anti-apoptosis activos y a metodos para generar estas celulas hospederas. Mas particularmente, la invencion se refiere a metodos que modulan el nivel de genes activos anti-apoptosis en celulas hospederas y celulas hospederas que muestran una viabilidad celular aumentada retrasando/inhibiendo la muerte celular programada que se produce de forma natural en estas celulas.

Description

CELULAS HOSPEDERAS QUE TIENEN PROPIEDADES MEJORADAS DE SUPERVIVENCIA CELULAR Y METODOS PARA GENERAR ESTAS CELULAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a células hospederas de mamíferos tratadas por ingeniería genética, que comprenden un nivel aumentado de genes anti-apoptosis y métodos para generar estas células hospederas. Más particularmente, la invención se ocupa de métodos que modulan el nivel de genes activos anti-apoptosis en células hospederas y a células hospederas que muestran una viabilidad celular aumentada retrasando/inhibiendo la muerte celular programada que se produce de forma natural en estas células. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las células de mamíferos son el hospedera preferido para la producción de la mayoría de os agentes terapéuticos proteicos complejos, como modificaciones post-traducción funcional y farmacocinéticamente relevantes que son altamente compatibles para seres humanos. Los tipos de células comercialmente relevantes incluyen hibridomas, mielomas, células de ovario de hámster chino (CHO) y células de riñon de cría de hámster (BHK) . Los derivados de CHO están siendo crecientemente usados en la industria debido a su adaptación directa para el crecimiento en medios exentos de REF: 158155 suero/protelnas y su consideración como hospederas de producción seguros por agencias reguladoras claves. Durante los procedimientos de producción biofarmacéuticamente estándar -operaciones en bioreactores-un porcentaje sustancial de la población celular de la producción muere a continuación de un programa genéticamente determinado .conocido como apoptosis (Al-Rubeai et al., 1998; Goswami et al., 1999; Lakenet al., 2001). La apoptosis es conocida como un programa de suicidio celular activo activado como consecuencia de señales extrínsecas o intrínsecas, como privación de suero, limitación de nutrientes, limitación de oxígeno y tensiones mecánicas. La apoptosis se caracteriza por una formación de ampollas de plasma en membranas, pérdida de volumen celular, condensación nuclear y degradación endonucleolítica de DNA a intervalos nucleosomales (Wyllie et al . , 1980) . Los componentes del suero han sido identificados como los principales agentes protectores de apoptosis eficaces. Sin embargo, hay una fuerte tendencia en la industria de la biotecnología, también impulsada por agencias reguladoras claves para el registro de fármacos, hacia el desarrollo de procedimientos de fabricación exentos de suero y exentos de proteínas. Las principales razones son la reducción de costes, una menor interferencia durante la purificación de proteínas y la reducción de la posibilidad potencial de introducción de agentes patógenos, como priones o virus. Sin embargo, la omisión del suero conduce a menudo a una sensibilidad aumentada de la producción de líneas celulares hacia una muerte celular programada, haciendo las células más vulnerables a las agresiones en cultivos (Franek et al . , 1991; Goswani et al., 1999; Moore et al., 1995; Zanghi et al., 1999). La muerte celular prematura, por ejemplo por apoptosis, representa una pérdida elevada de fuentes valiosas, porque la producción de proteínas es principalmente una función de la población celular de producción viable, cuanto más tiempo se pueda mantener una densidad elevada de células viables y productivas en un cultivo, más eficaz y aprovechable es el procedimiento de producción debido a los rendimientos superiores de productos por experimento de producción. En ausencia de suero, las células mueren más rápidamente al alcanzar la fase de crecimiento estacionario a la densidad celular máxima, cortando así la corta fase de producción. Los rendimientos son incluso adicionalmente reducidos por la degradación de productos por proteasas liberadas de las células apoptóticas y por la interferencia durante la recolección causada por números elevados de debris celular . Se ha iniciado una diversidad de estrategias fisiológicas de ingeniería para resolver el dilema de la sensibilidad de apoptosis aumentada de líneas celulares de producción, particularmente de las lineas celulares que están siendo adaptadas y completamente cultivadas bajo condiciones exentas de suero. Algunas de esas estrategias están dirigidas a la reducción/eliminación de la inducción de programas de respuesta a la apoptosis endógena bajo condiciones de cultivo de células que simulan la producción. Una aproximación se dirige a aliviar la privación de nutrientes por la alimentación (deZengotita et al., 2000; Franek et al., 1996; Mercille et al., 1994; Sanfeliu et al., 1999). Otro método se dirige al uso de aditivos químicos supresores de la apoptosis para bloquear efectores claves de mecanismos de respuesta a la apoptosis (Mastrangelo et al., 1999; Sanfeliu et al., 2000; Simpson et al., 1998.; Zanghi et al., 2000). Una estrategia alternativa representa una aproximación genética. Incluye la manipulación de la célula en sí misma usando genes de supervivencia anti-apoptóticos o determinantes anti-apoptosis tratados por ingeniería derivados de redes o virus reguladores del mantenimiento de la supervivencia (Cotter et al., 1995; Chung et al., 1998; Fussenegger et al., 2000; Mastrangelo et al., 1998, 2000a y 2000b; Mercille et al., 1999a y 1999b; Pan et al., 1998; Simpsosn et al., 1999; Terada et al., 1997; Tey et al., 2000a y 2000b) . De esta última estrategia bcl-2 y bcl-xL, dos supresores de apoptosis y los miembros clave de una familia de genes reguladores de respuestas pro- (por ejemplo, bad, bak, bax, bok, bel, xS , bik, bid, hrk, bim, blk, bcl-y) y antiápoptóticas (por ejemplo, bcl-2, bcl-xL, bcl-w-, bfl-1, al, mcl-1, boo, brag-1, nr-13, bhrf-1, ced 9, cdn-1, cdn-2, cdn-3) han sido propuestos como potentes candidatos para una ingeniería anti-apoptosis en la comunidad biotecnológica . El bcl-2 se ha mostrado que modula la trayectoria de apoptosis dependiente de caspasa-9 en la membrana externa mitocondrial en respuesta a un reostato molecular localizado en la membrana mitocondrial externa que consiste en proteínas de tipo BCL-2 homo- y hetero-dimerízadas , pro- y antiápoptóticas . La expresión desviada hacia un miembro de la subfamilia pro-aproptótica mediante restricciones del cultivo y señales endógenas da lugar a la liberación del complejo Apaf-l-caspasa-9 y la autoactivación de esta proteasa específica para aspartato que contiene cisteína, que se correlaciona con un considerable flujo de citocromo c desde las mitocondrias al citosol . El ensamblaje de las partes principales de la maquinaria de control de la apoptosis en la membrana mitocondrial externa desencadena estas estaciones de poder celular, actuando como sensores de tensiones y ejecutores para el mantenimiento del procedimiento de apoptosis, en el foco de una ingeniería anti-apoptosis (Follstad et al., 2000; Green et al., 1998; Tsujimoto, 1998). Hay algunos informes sobre el efecto positivo de la expresión de un gen bcl-2 anti-apoptosis heterólogo sobre la supervivencia/viabilidad y la robustez de las líneas celulares tratadas por ingeniería, adaptadas y cultivadas en presencia de suero de ternera. Esas células incluyen mielomas, hibridomas, células de riñon de cría de hámster (BHK) y célula de ovario de hámster chino (CHO) . El efecto positivo de la expresión de bcl-2 ha sido descrito en relación con diversas agresiones medioambientales como privación de suero y glucosa, retirada del factor de crecimiento o infecciones virales (Fassnacht et al., 1998 ; Figueroa et al., 2001; Fussenegger et al., 2000; Itoh et al., 1995; Mastrangelo et al., 2000a y 2000b; Reynolds et al., 1996; Simpson et al., 1997, 1998 y 1999; Tey et al., 2000a y 2000b) . La ingeniería metabólica basada en BCL-xL ha sido descrita para células T humanas y células hematopoyéticas CD34+, respectivamente (patente de EE.UU. n° 6.143.291 y documento O 00/75291). Fussenegger et al., 1998 y también Mastrangelo et al., 2000a y 2000b han descrito un efecto positivo de la expresión de BCL-xL sobre la supervivencia de células de hámster. Sin embargo, en todos estos informes se usaron líneas celulares no productoras como células T humanas y células shematopoyéeticas CD34+, o si se usaron líneas celulares de producción, por ejemplo, líneas celulares de hámster o ratones, fueron adaptadas y se hicieron crecer rutinariamente en presencia de suero y, en la mayoría de los casos, incluso como células adherentes. Los estudios sobre el efecto de la retirada del suero sobre la supervivencia de células recombinantes que expresan BCL-2 heterólogo o BCL-xL no incluyeron el cultivo para diversas pasadas en un medio exento de suero. En lugar de ello, las células cultivadas en suero fueron sembradas en medio completamente exento de suero o bien medio con un contenido reducido de suero, y se siguió durante varios días el efecto de esta agresión al cultivo sobre la supervivencia celular en un cultivo en tandas. De esta forma, la aparición real de una agresión al cultivo provocada por la retirada del suero debe ser también retrasada debido a reacciones intracelulares todavía en curso provocadas por agentes protectores de apoptosis en el suero. Solamente se han realizado unos pocos experimentos sobre la producción de líneas celulares recombinantes relevantes adaptadas y constantemente en crecimiento en una suspensión en un medio exento de suero. Estas condiciones son las más favorecidas en la industria de la biotecnología en la actualidad, pero al mismo tiempo las células son también más frágiles y menos robustas. En la publicación de Gos ani et al., 1999, se describen experimentos en los que células de CHO que expresan ?-interferón fueron cultivadas bajo esas condiciones. La supervivencia de los cultivos que expresan además BCL-2 heterólogo se mejoró pero limitada a aproximadamente 40% de células viables después del -día 7 en un cultivo en tandas. No se conoce nada sobre el · efecto de la expresión de BCL-xL sobre la viabilidad/supervivencia de células hospederas, adaptadas y permanentemente en crecimiento bajo condiciones exentas de suero. A partir de la descripción anterior, es evidente que hay una necesidad en la comunidad de la biotecnología de aumentar adicionalmente la viabilidad celular, especialmente de líneas celulares adaptadas a un crecimiento en ausencia de suero y cualificadas para una producción exenta de suero de productos biofarmacéuticos para un uso terapéutico y de diagnóstico. La extensión de la supervivencia celular a viabilidades elevadas a medida que las células alcanzan la fase estacionaria en cultivos por tandas ejercería una influencia significativa sobre la productividad y la rentabilidad, con lo que cualquier día adicional que se gane durante la fase de producción constituiría una gran contribución. En la presente invención se proporcionan estrategias para mejorar adicionalmente la supervivencia de líneas celulares de producción hechas crecer constantemente en suspensión en un medio exento de suero. Las estrategias están basadas en células hospederas de ingeniería con el fin de mejorar el nivel intracelular de polipéptidos de actuación anti-apoptótic . Se encontró sorprendentemente que el nivel de genes de actuación anti-apoptótica intracelular puede mejorar sustancialmente la viabilidad celular sin- mostrar ningún efecto negativo sobre la productividad celular. SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se ha demostrado que la expresión de un gen anti-apoptosis introducido, heterólogo y no amplificado, por ejemplo, BCL-2 o BCL-xL solo tiene un efecto menor sobre la viabilidad/supervivencia de células adaptadas y generalmente hechas crecer bajo condiciones exentas de suero y/o proteínas (véase la Figura 5) . Este descubrimiento está apoyado por la publicación de Goswani et al., 1999. La presente invención describe/proporciona ahora . una nueva aproximación para mejorar enormemente la viabilidad/supervivenvia de células hospederas, particularmente cuando son establecidas y cultivadas bajo condiciones exentas de suero. El retraro/inhibición de la apoptosis se consigue mejorando el nivel intracelular de proteínas de actuación anti-apoptótica, por ejemplo, BCL-xL o BCL-2, usando una sobre-expresión mediada por amplificación. Se ha encontrado sorprendentemente por la presente invención que una sobre-expresión enorme de una proteína anti-apoptosis como BCL-xL es una herramienta más que adecuada para mejorar adicionalmente la viabilidad/supervivencia celular, sin afectar negativamente el nivel de expresión de una proteína deseada. Por el contrario, la productividad celular en las células de sobre-expresión de BCL-xL es aumentada (por ejemplo, véanse las Figuras 2 y 3) . Por lo tanto, la presente invención proporciona a un experto en la materia nuevas células hospederas genéticamente modificadas, en particular líneas celulares de producción de hámster o múridos, y también métodos para generar estas líneas celulares de la invención. ESte descubrimiento es altamente ventajoso para la producción de péptidos/proteínas biofarmacéuticos por los que actualmente la viabilidad económica de los procedimientos de producción se puede mejorar de una manera muy suficiente. Una gran ventaja de la presente invención sobre la técnica anterior consiste en que se proporcionan métodos que conectan la mejora de la viabilidad celular, un factor limitante en los procedimientos de producción de proteínas, con la producción de proteínas a rendimiento elevado . Por lo tanto, la presente invención proporciona células hospederas tratadas por ingeniería genética que tienen propiedades de supervivencia mejoradas y que son altamente adecuadas para la producción de proteínas biofarmacéuticas . Las propiedades mejoradas de supervivencia están basadas en un nivel aumentado de genes anti-apoptosis activos en las células. Son preferidas las células hospederas de origen mamífero, y más preferidas los hibridomas/mielomas de múridos o células de hámster, especialmente si están adaptadas y constantemente hechas crecer en medios exentos de suero y/o exentos de proteínas . La presente invención proporciona también un método para generar células hospederas de mamíferos que muestran este nivel de expresión aumentado de un gen anti-apoptosis , que comprende (i) introducir en una población celular de mamífero secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen anti-apoptosis, un gen marcador amplificable y seleccionable y, opcionalmente, al menos un gen de interés, en donde dichos genes están operativamente conectados al menos a una secuencia reguladora que permite la expresión de dichos genes, (ii) cultivas dicha población celular bajo condiciones en las que se expresen al menos dicho gen marcador amplificable y seleccionable y dicho gen anti-apoptosis, y que sean favorables para obtener copias múltiples al menos del gen anti-apoptosis, y (iii) seleccionar células de la población celular que incorporen copias múltiples de al menos el gen anti-apoptosis. Por lo tanto, la presente invención proporciona también métodos para expresar un gen anti-apoptosis, un gen marcador amplificable y seleccionable y al menos un gen de interés en una célula hospedera, que comprende (i) introducir en una población celular hospedera las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen anti-apoptosis, un gen marcador amplificable y seleccionable, y un (os) gen (es) de interés, en donde dichos genes están operativamente conectados a al menos una secuencia reguladora que permita la expresión de dichos genes, y (ii) cultivas dicha población celular hospedera bajo condiciones en las que se expresen dichos genes . La manipulación de las células hospederas por cualquiera dé estos métodos proporciona células hospederas que comprenden al menos un elevado número de copias de un gen anti-apoptosis . La presente invención proporciona también procedimientos para producir una proteína de interés en cualquier célula hospedera según esta invención, que comprenden (i) cultivas células bajo condiciones que sean favorables para la expresión del gen anti-apoptosis y el (o los) gen (es) de interés y (ii) aislar la proteína de interés a partir de las células y/o la materia sobrenadante del cultivo celular. Finalmente, la presente invención proporciona también a una persona experta en la técnica un nuevo gen anti-apoptosis, originalmente aislado de hámster (Cricetulus griseus) , y también de varios mutantes de ese gen. Los dos genes, de tipo salvaje y modificado, se pueden utilizar en cualquiera de los procedimientos de la invención descritos en esta memoria para mejorar la viabilidad de las células y la productividad celular. Además, la presente invención se dirige también a las proteínas que son codificadas por cualquiera de estos nuevos genes anti-apoptóticos .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra esquemáticamente diseños detectores de expresión usados para la transfeccion de células CH0-DG44. P/E significa una unidad compuesta que contiene un elemento mej orador y promotor, P es un elemento promotor y T un sitio de terminación de transcripción requerido para la poliadenilacion de RNA mensajero transcrito. sICAM se refiere al gen de interés y bel -2 o bcl-xl a los genes anti-apoptosis. dhfr se refiere al marcador seleccionable y amplificable dihidrofolato-reductasa . Una flecha indica el sitio de inicio de la transcripción en una unidad de transcripción . Las Figuras 2A - 2C comparan los perfiles de expresión de células CHO-DG44 transitoriamente transfectadas 48 horas después de la transfeccion. En la Figura 2A pBID-sICAM, en la Figura 2B el testigo pSEAP2 (Clontech, Palo Alto, CA) y en la Figura 2C el testigo pGL2 (Promega, Madison, WI) fue co-transfectado con pBID-bcl-2, pBID-bcl-xL o el testigo pBID. La Figura 3 muestra perfiles de expresión de sICAM de poblaciones mixtas estables de células CHO-DG44 cotransfectadas con pBID-sICAM y pBID, pBID-bcl-2 o pBID-bcl-xL, seleccionadas y cultivadas en medio CHO-s-SFMII exento de hipoxantina/timidina (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Cada valor resultó de una producción media de sICAM de seis poblaciones mixtas durante un periodo de cultivo de 3 días sobre 5 pasadas . La Figura 4 valora la viabilidad de líneas celulares clónales HMNI-l/2 (líneas celulares testigos cotransfectadas con pBID-sICAM y pBID) , HMNIBC-l/2 (cotransfectadas con pBID-sICAM y pBID-bcl-2) y HM IBX-l/2 (cotransfectadas con pBID-sICAM y pBID-bcl-xL) durante un período de cultivo por tandas usando exclusión con colorante de azul de trípano . Las células CH0-DG44 recombinantes fueron selccionadas y cultivadas en medio CHO-s-SFMII exento de hipoxantina/timidina (Invitrogen, Carlsbad, CA) . La Figura 5 muestra los . perfiles de viabilidad porcentual, usando exclusión con colorante de azul de trípano, de clones HMNI-3/4 de células amplificadas con metotrexano (líneas celulares testigos cotransfectadas con pBID-sICAM y pBID) , HMNIBC-3/4 (cotransfectadas con pBID-sICAM y pBID-bcl-2) y HMNIBX-3/4 (cotransfectadas con pBID-sICAM y pBID-bcl-xL) durante un cultivo por tandas de 9 días en medio CHO-s-SFMII exento de hipoxantina/timidina (Invitrogen, Carlsbad, CA) y la presencia de MTX 20 nM. La Figura 6 muestra las características de apoptosis de clones de células CHO-DG44 amplificados con metotrexato que expresan BCL-2 o BCL-xL. El porcentaje de células apoptóticas entre cultivos por tandas de HMNI-3/4 (líneas celulares testigos cotransfectadas con pBID-sICAM y pBID) , H NIBC-3/4 (cotransfectadas con pBID-sICAM y pBID-bcl-2) y HMNIBX-3/4 (cotransfectadas con pBID-sICAM y pBID-bcl-xL) en medio CHO-s-SFMII exento de hipoxantina/timidina (Invitrogen, Carlsbad, CA) más MTX 20 nM fueron valorados en los días 2, 4 y 6 usando un ensayo TU LL basado en fluorescencia (BD Biosciences PharMingen, San Diego, CA) . Las Figuras 7A y 7B muestran el análisis de trasnferencia Western de BCL-2 y BCL-xL en clones de células CHO-DG44 recombinantes diferentes. Compara la expresión de BCL-2 (Fig. 7A) y BCL-xL (Fig. 7B) en clones de células sin amplificar (BCL-2 :HMNIBC-l/2 ; BCL-xL: HMNIBX-l/2) o amplificados (BCL-2: HMNIBC-3/4; BCL-xL: HM IBX-3/4) que expresan los genes anti-apoptosis en configuración monocistrónica . La expresión del gen anti-apoptosis se comparó con líneas celulares testigos parentales (CHO-DG44) y productoras solo de sICAM (HMNI-1) . Las proteínas fueron detectadas usando anticuerpos monoclonales de ratón de Santa Cruz Biotechonology (Santa Cruz, CA) específicos para BCL-2 o BCL-xL y un anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa antiratón (Dianova GmbH, Hamburgo, Alemania) . La Figura 8 muestra la cuantificación basada en Mito Tracker (Molecular Probes, Eugene, OR) del contenido de mitocondrias en células CH0-DG44 hechas crecer en presencia y ausencia de suero. Los recuentos de mitocondrias mediadas por FACS se realizaron sobre células CHO-DG44 cultivadas en presencia (línea gris) de 10% de suero y en ausencia (línea negra) de suero. La figura 9 muestra la secuencia de nucleótidos y el marco de lectura abierto predicho del nuevo gen bcl-xL de hámster (SEQ ID NOS: 3 y 4) . La secuencia de nucleótidos representa una secuencia compuesta, en la que las regiones 5' y 3' no traducidas han sido obtenidas a partir de clones genómicos, y la región codificadora ha sido obtenida a partir de un clon de DNAc . La figura 10 muestra esquemáticamente el diseño del vector de expresión eucariótico. P/E significa una unidad compuesta que contiene tanto el elemento mej orador como promotor, P es un elemento promotor y T es un sitio de terminación de la transcripción requerido para la poliadenilación del ARN mensajero transcrito. bcl-xL se refiere al DNAc de bcl-xL anti-apoptosis de hámster, y dhfr al marcador de hidrofolato reductasa amplificable y seleccionable . Una flecha indica el sitio del inicio de la transcripción dentro de una unidad de transcripción. La figura 11 muestra esquemáticamente la estrategia de clonación general utilizada para la generación de los mutantes por deleción de bcl-xL de hámster. El vector de expresión pBID/bcl-xL, que codifica el DNAc de tipo salvaje de bcl-xL de hámster, sirvió como plantilla en las PCRs . Al utilizar una combinación del cebador 1 específico para el vector (VSP1) y del cebador del26, del46 o del66 específico para el gen, se generaron los diversos extremos 5' de los m tantes por deleción. Para subclonar los productos de PCR (flechas en negro) se digerió con Notl, para lo cual se introdujo de nuevo un sitio de enzima de restricción por parte de los cebadores específicos para el gen, y SnaBI, situado dentro de la región de promotor/mejorador (P/E) . Para la generación de los diversos extremos 3 ' de los mutantes por deleción, se utilizó una combinación de cebador 2 específico para el vector (VSP2) y de los cebadores del63 o del83 específicos para el gen, y los productos de PCR resultantes (flechas con líneas discontinuas) se digerieron con Notl, situado dentro de la secuencia del cebador específico para el gen, y EcoRI, situado más arriba de la región del terminador (T) . Para la construcción de los vectores de expresión que contenían los mutantes por deleción del DNAc de bcl-xL de hámster (pBID/bcl-xL del) , se clonaron un fragmento de DNAc 5' y uno 3' direccionalmente en el vector pBID digerido con SnaBI/EcoRI . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona células hospederas que son genéticamente modificadas introduciendo secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen anti-apoptosis, un gen marcador amplificable y seleccionable y al menos un gen de interés. En una realización preferida, el gen anti-apoptosis, el gen marcador amplificable y seleccionable y el (o los) gene (es) de interés están operativamente conectados al menos a una secuencia reguladora que permite la expresión de dichos genes. En una realización más preferida, el gen anti-apoptosis , el gen marcador amplificable y seleccionable y el o los genes de interés se unen operativamente a sólo una secuencia de promotor que permite la co-expresión de dichos genes. En otra realización preferida el gen anti-apoptosis y el gen marcador amplificable y seleccionable están unidos operativamente a únicamente una secuencia de promotor que permite la co-expresión de dichos genes. En una realización adicional, la modificación genética de las células hospederas incluye la introducción de más de un gen anti-apoptosis. Las células hospederas modificadas de esta manea permiten la co-expresión del (o de los) gene (es) anti-apoptosis junto con un marcador amplificable y seleccionable y, opcionalmente, con un gen de interés . El marcador amplificable y seleccionable no solamente hace posible la selección de clones de células hospederas transíectadas estable, sino también la amplificación del (o de los) gen (es) anti-apoptosis. Se muestra por la presente invención que la amplificación de un gen anti-apoptosis proporciona un método más eficaz para conseguir niveles intracelulares de proteínas de actuación anti-apoptótica, que son suficientes para mejorar la supervivencia de las células hospederas en comparación con las células hospederas sin ninguna secuencia que codifique proteínas antiapoptosis amplificadas. Las células hospederas genéticamente modificadas según esta invención se caracterizan por una supervivencia celular mejorada atribuida a una muerte celular programada retrasada o inhibida, por ejemplo, apoptosis, en las células hospederas. Se ha encontrado sorprendentemente que una población de células hospederas modificada por cualquier método de esta invención están siendo cultivables durante al menos 9 días, en los que la viabilidad total de las células es al menos aproximadamente 50% (véase también la Figura 5) . Después de un cultivo por tandas de 8 días, se puede conseguir una viabilidad de al menos aproximadamente 60% por las células hospederas generadas según esta invención. En una realización adicional de esta invención, se puede obtener una viabilidad celular de al menos aproximadamente 75% para un cultivo por tandas de 7 días. En otra realización, después de un período de cultivo de 6 días, se puede conseguir una viabilidad celular de al menos aproximadamente 85%. Unos niveles equivalentes de viabilidad no son conocidos en la técnica, al menos no para un cultivo exento de suero, especialmente para células que se cultivan permanentemente en condiciones exentas de suero, y/o en conexión con la producción exenta de suero de agentes biofarmacéuticos . La viabilidad descrita en la técnica está limitada a un 40% de células después de un cultivos por tandas de 7 días (Goswami et al., 1999) . Por lo tanto, las células hospederas caracterizadas consecuentemente están dentro del significado de la presente invención. La "viabilidad celular" o "supervivencia celular" es la capacidad de una célula diana para continuar permaneciendo viva y funcional, e incluye la protección de la célula respecto a la muerte celular debido a la inhibición o retraso de la apoptosis o muerte celular natural . Las formas de medir la viabilidad o supervivencia celular son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, la viabilidad celular puede ser determinada por microscopía de contraste de fases, microscopía de fluorescencia o citometría de flujo usando colorantes permeables no celulares como azul de trípano, yoduro de propidio o una combinación de yoduro de propidio/naranj de acridina. Esos métodos se describen con ejemplos en la publicación "Current Protocols in Cytometry" , John Wiley & Sons, Inc., actualizada, incorporada como referencia . La expresión "cultivadas permanentemente en condiciones exentas de suero" significa que no sólo el cultivo de las células se efectúa en condiciones exentas de suero, sino también la transformación de las células, la expansión de las células al multiplicar el número de células y también el almacenamiento de las células, por ejemplo en nitrógeno fluido.

Por lo tanto, la presente invención se refiere también a métodos para inhibir o retrasar la muerte celular en una célula hospedera, que comprenden cultivar células hospederas de esta invención, por ejemplo, células hospederas como se describió anteriormente, bajo un estado en el que se exprese al- menos el gen anti-apoptosis de forma que la muerte celular sea inhibida o retrasada en dichas células hospederas. En una realización preferida, la muerte celular de dichas células está provocada por una muerte celular programada, más preferentemente por apoptosis . La presente invención proporciona también métodos para generar células hospederas de mamíferos que muestran un nivel de expresión aumentado de un gen anti-apoptosis que comprende, (i) introducir en una población de células de mamífero secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen un gen anti-apoptosis, un gen marcador amplificable y seleccionable y, opcionalmente, al menos un gen de interés, en donde dichos genes están operativamente conectados al menos a una secuencia reguladora que permite la expresión de dichos genes, (ii) cultivar dicha población celular bajo condiciones en las que se expresen al menos dicho gen marcador amplificable y seleccionable y dicho gen anti-apoptosis, y que sean favorables para obtener múltiples copias de al menos el gen anti-apoptosis, y (iii) seleccionar células de la población celular que incorporen copias múltiples de al menos el gen anti-apoptosis. Se prefiere disponer al menos el gen anti-apoptosis y el gen marcador amplificable y seleccionable en estrecha proximidad espacial para permitir una amplificación más eficaz del gen anti-apoptosis . Por lo tanto, en una realización preferida del método descrito anteriormente, al menos el gen anti-apoptosis y el gen marcador amplificable y seleccionable son codificados por la misma molécula de DNA, por ejemplo, si ambos genes se disponen en el mismo vector de expresión y, por lo tanto, serán introducidos en común en la célula hospedera. En una realización más preferida de este método, la expresión del gen anti-apoptosis y el gen marcador amplificable y seleccionable están operativamente unidos uno con otro, por ejemplo utilizando un promotor común para permitir la coexpresión de dichos genes . En una realización preferida adicional, el gen anti-apoptosis, el gen marcador amplificable y seleccionable y el o los genes de interés son codificados por únicamente una molécula de DNA, por ejemplo si todos estos genes están dispuestos en el mismo vector de expresión, y se introducirán en común en dicha célula hospedera. En una realización más preferida, el gen anti-apoptosis, el gen marcador amplificable y seleccionable y el o los genes de interés no sólo son codificados por una molécula de DNA, sino que están también operativamente unidos a una única secuencia de promotor para permitir la co-expresión de dichos genes. Las células hospederas genéticamente modificadas por cualquier método según esta invención muestran una expresión aumentada de una proteína anti-apoptosis en comparación con células parentales no transfectadas así como no amplificadas . Una "célula parental" significa una célula que no muestra una expresión aumentada del gen anti-apoptosis, y generalmente se hace crecer bajo las mismas o sustancialmente las mismas condiciones que la célula genéticamente modificada según la presente invención, por ejemplo, modificada introduciendo y amplificando las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el (o los) gen (es) anti-apoptosis, un gen marcador amplificable y seleccionable y, opcionalmente, al menos un gen de interés. Una "expresión aumentada" de la proteína anti-apoptosis significa, por ejemplo, una sobre-expresión, que está al menos 30 veces aumentada, preferentemente al menos 50 veces aumentada, incluso más preferentemente al menos 100 veces aumentada en comparación con el nivel de expresión de esa proteína en células hospederas que no están modificadas según cualquier método de esta invención, por ejemplo, modificadas introduciendo y amplificando las secuencias de ácidos nucleicos que codifican el (o los) gen (es) anti-apoptosis, un gen marcador amplificable y seleccionable y, opcionalmente, al menos un gen de interés. Por lo tanto, esta invención proporciona también células hospederas, que están genéticamente modificadas por cualquier método descrito en la presente memoria descriptiva y que muestran una sobre-expresión de un gen anti-apoptosis que está al menos 30 veces aumentado en comparación con el nivel de expresión de dicho gen en células hospederas que no están modificadas según cualquier método de esta invención. En una realización preferida, la presente invención se refiere también a células hospederas que muestran un nivel de sobre-expresión que está al menos 50 veces aumentado en comparación con células no modificadas en el sentido de esta invención. En otra realización se proporcionan células hospederas que muestran un nivel de sobre-expresión que está al menos aproximadamente 100 veces aumentado en comparación con el nivel de expresión de células que no están modificadas de ninguna forma descrita por esta invención. El nivel de expresión que se puede conseguir por las células hospederas generadas mediante un método de la presente invención se describe con ejemplos en la Figura 7. Los niveles de expresión de un gen anti-apoptosis pueden ser adicionalmente aumentados aplicando los principios de esta invención sobre el procedimiento de modificació de células hospederas, por ejemplo, aumentando adicionalmente el número de copias del gen anti-apoptosis. También se puede concebir la introducción de copias múltiples de uno o más genes anti-apoptosis en una célula hospedera. "Células hospederas" o "células diana" en el sentido de la presente invención son células de hámster, preferentemente BHK21, BHK, TK~, CHO, CHO-K1 , CHO-DUKX, CHO-DUK Bl y células CHO-DG44 o los derivados/progenies de cualquiera de estas línes celulares. Son particularmente preferidas las células CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 y BHK21, e incluso más preferidas las células CH0-DG44 y CHO-DUKX. En una realización adicional de la presente invención, "células hospederas" significa también células de mieloma de múridos, preferentemente células NSO y Sp2/0 o los derivados/progenies de cualquiera- de estas líneas celulares. Ejemplos de células de múridos y de hámster que pueden ser usadas en el sentido de esta invención son también las resumidas en la Tabla 1. Sin embargo, los derivados/progenies de esas células, otras células de mamíferos, incluidas pero sin limitación células humanas, de ratón, rata, mono y roedores, o células eucarióticas, incluidas pero sin limitación las células de levadura, insectos y plantas, pueden ser usadas también en el sentido de esta invención, particularmente para la producción de proteínas biofarmacéuticas . TABLA 1: Lineas celulares de producción de hámster y múridos Línea celular Número de orden NSO ECACC No. 85110503 Sp2/0-Ag14 ATCC CRL-1581 BHK21 ATCC CCL-10 BHK TK" ECACC No. 8501 423 HaK ATCC CCL-15 2254-62.2 (derivado de BHK-21) ATCC CRL-8544 CHO ECACC No. 8505302 CHO-K1 ATCC CCL-61 CHO-DUKX ATCC CRL-9096 (= CHO duk", CHO/dhfr) Línea celular Número de orden CHO-DUKX B1 ATCC CRL-9010 CHO-DG44 Uriaub et al., Cell 33[2], 405-412, 1983 CHO Pro-5 ATCC CRL-1781 V79 ATCC CCC-93 B14AF28-G3 ATCC CCL-14 CHL ECACC No. 87 1 906 Las células hospederas son más preferidas cuando están siendo establecidas, adaptadas y completamente cultivadas bajo condiciones exentas de suero y, opcionalmente, en medios que estén exentos de cualquier proteína/péptido de origen animal . Los medios disponibles en el comercio como F12 de Ham (Sigma, Deisemhofen, Alemania) , RPMI-1640 (Sigma) , medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM,- Sigma) , medio esencial mínimo (MEM; sigma) , medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM; Sigma) , CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) , CHO-S-Invitrogen) , medio de CHO exento de suero (Sigma) y medio de CHO exento de proteínas (Sigma) son ejemplos de soluciones nutrientes apropiadas . Cualquiera de los medios puede estar complementado en la medida necesaria con una diversidad de compuestos, de los que son ejemplos las hormonas y/o factores de crecimiento (como insulina, transferrina, factor de crecimiento epidérmico o factor de crecimiento de tipo insulina) , sales (como cloruro de sodio, fosfato de calcio o magnesio) , tampones (como HEPES) , nucleósidos (como adenosina o timidina) , glutamina, glucosa u otras fuentes de energía equivalentes, antibióticos o elementos residuales. -Se puede incluir también cualquiera de otros complementos necesarios a las concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la técnica. En la presente invención se prefiere el uso de un medio exento de suero, pero los medios complementados con una cantidad adecuada de suero pueden ser usados también para el cultivo de células hospederas. Para el crecimiento y selección de células genéticamente modificadas que expresan el gen seleccionable, se añade un agente de selección adecuado al medio de cultivo. La presente invención se refiere también a la expresión a nivel elevado de un gen anti-apoptosis de la superfamilia de bcl-2 con el fin de mejorar la viabilidad de las células hospederas, preferentemente de células de producción como se describió anteriormente . Los genes que codifican la superfamilia de bcl-2 son por lo tanto adecuados para generar células hospederas según esta invención. Por tanto, las células hospederas genéticamente modificadas introduciendo secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen de la superfamilia de bcl-2, un gen marcador amplificable y seleccionable y al menos un gen de interés, están dentro del sentido de la presente invención. En la Tabla 2 se citan ejemplos de miembros pertenecientes a la superfamilia de bcl-2, que inhiben o retrasan la muerte celular programada o apoptosis. La mayoría de las proteínas de esta familia de origen mamífero, C. elegans o viral tienen dos -a cuatro analogías de secuencias de aminoácidos extensivas con BCL-2 (regiones de homología de BCL-2 BH1-BH4) , el inhibidor prototípico de la apoptosis. Todas estas son candidatos adecuados de genes/proteínas anti-apoptosis para llevar a cabo la presente invención. En una realización adicional de esta invención se prefieren células en las que la supervivencia se prolonga introduciendo secuencias de ácidos nucleicos que codifican BCL-xL, BCL-2, BCL-w, BFL-1, Al, MCL-1, B00, BRAG-1, NR-13, CDN-1, CDN-2, CDN-3, BHRF-1 , LMW5-HL o CED-9. En una realización más preferida, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el gen anti-apoptosis de la presente invención es una molécula de DNA de una especie de vertebrado. Un vertebrado preferido es un mamífero. Más preferentemente, un ácido nucleico de la presente invención codifica polipéptidos denominados BCL-xL o BCL-2. El gen que codifica BCL-xL es el más preferido. En una realización adicional preferida, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica BCL-xL se aisla del hámster, preferiblemente de Cricetulus griseus. Es también preferido un ácido nucleico que tiene la secuencia de la SEQ ID n° 1 (idéntico al número de acceso de GenBank Z23115) , SEQ ID n° 2 (idéntica al número de acceso de GenBank M13995) , SEQ ID n° 3, SEQ ID n° 5, SEQ ID n° 7, SEQ ID n° 9 o SEQ ID n° 11, en donde SEQ ID n° 3 se aisla originalmente del hámster y las SEQ ID n° 5, SEQ ID n° 7, SEQ ID n° 9 -y SEQ ID n° 11 son variantes modificadas de la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID n° 3. Lo más preferido es una secuencia de SEQ ID n° l o SEQ ID n° 3. Cualquiera de los homólogos de cualquiera de estos genes codificados a partir de otras especies de vertebrados son también adecuados para llevar a cabo la presente invención. Además de ello, son también preferidas secuencias de nucleótidos que codifican cualquiera de los genes anti -apoptosis de la Tabla 2, particularmente los que tienen la secuencia dada por cualquiera de los números de acceso de GenBank citados en la Tabla 2. Ejemplos de un gen de actuación anti-apoptosis se describen también en las patentes de EE.UU. n° 6.303.331, n° 5.834.309 y n° 5.646.008, así como en el documento WO 95/006342, que se incorporan como referencia a la presente memoria descriptiva. Se hace referencia también al documento de Boise et al . , Cell 74, 597-608, 1993. En el documento WO 95/006342 se describe con ejemplos el aislamiento de la secuencia que codifica BCL-xL. Una secuencia de ácidos nucleicos que codifique una proteína anti-apoptosis está previsto que incluya cualquier secuencia de ácidos nucleicos que sea transcrita y traducida en una proteina anti-apoptosis in vitro otras la introducción de la secuencia codificadora en una célula diana. La proteína anti-apoptosis que codifica secuencias puede ser de genes nativos (tipo salvaje) asi como que se produzcan 'de forma natural (por mutación espontánea) o mutantes tratados por ingeniería recombinante y variantes, versiones y fragmentos truncados, equivalentes funcionales, derivados, homólogos y fusiones de las proteínas que se producen de forma natural o de tipo salvaje, en la medida en que la actividad funcional biológica, en el sentido de la función anti-apoptótica, del polipeptido codificado se mantenga y nos e altere sustancialmente . Un polipeptido codificado preferido tiene al menos 50%, mas preferentemente al menos 80% e incluso más preferentemente al menos 100% o más de actividad biológica funcional en comparación con la correspondiente proteína anti-apoptosis de tipo salvaje. "Proteína de tipo salvaje" significa un alelo que se produce de forma natural, completo, no truncado y no modificado del polipeptido codificador. La "actividad biológica funcional" de un polipeptido anti-apoptosis, por ejemplo de BCL-xL, se puede determinar por ensayos cuantitativos de apoptosis sobre células transfectadas que expresan el polipeptido natural como, por ejemplo, ensayo TUNEL, ensayo de Annexina V, tinción con naranja de acridina/bromuro de etidio o tinción con yoduro de propidio/naranj a de acridina usando microscopía de fluorescencia o análisis de citometría de flujo u otros ensayos. Esos ensayos son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la publicación "Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons, le, actualizada. Las expresiones "polipéptido (s) funcional y biológicamente activo" o "fragmento (s) funcional y biológicamente activo" se refieren a polipéptido (s) o fragmento (s) con la actividad biológica funcional del péptido anti-apoptosis. Esto significa que un polipéptido funcional y biológicamente activo o un fragmento funcional y biológicamente activo tiene al menos el 50%, más preferiblemente al menos el 80% e incluso más preferiblemente al menos el 100% o más de la actividad biológica funcional en comparación con la correspondiente proteína anti-apoptosis de tipo salvaje. Las secuencias de ácidos nucleicos modificados se pueden preparar usando técnicas estándar bien conocidas por un experto en la técnica, por ejemplo, mutagénesis específica para el sitio o mutagénesis mediada por reacción de cadena de polimerasa. En la presente invención, una secuencia de ácidos nucleicos BCL-xL particularmente preferida es el polinucleótido aislado de la SEQ ID n° 1 (idéntico al número de acceso de GenBank Z23115) , SEQ ID n° 3, SEQ ID n° 5, SEQ ID n° 7, SEQ ID n° 9 o SEQ ID n° 11. La invención incluye también secuencias de ácidos nucleicos funcionalmente equivalentes a dichas secuencias o a cualesquiera otras secuencias codificadoras de BCL-xL, incluidos mutantes y variantes tratados por ingeniería recombinante, versiones y fragmentos truncados, equivalentes funcionales, derivados, homólogos y fusiones de esos ácidos nucleicos . En una realización preferida, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína BCL-xL es de origen humano y, en una realización más preferida, es de origen de hámster. En este contexto, se ha identificado por primera vez y se proporciona también por la presente invención un ácido nucleico que codifica un gen homólogo bcl-xL de hámster. El gen bcl-xL de hámster aislado es una materia de ácido nucleico con la SEQ ID NO: 3 que ha sido aislado y clonado a partir de Cricetulus griseus. El uso de una proteína anti-apoptosis codificada por esta secuencia o cualesquiera fragmentos, variantes o mutantes (degenerativos y no degenerativos) funcionales de la misma en un procedimiento que prolonga la supervivencia de las células por la inhibición o la demora de apoptosis es una realización preferida de la presente invención. Sin embargo, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican BCL-xL de otras especies están también abarcadas por el significado de esta invención. La proteína BCL-xL es codificada por un gen bcl-x. Es sabido por el gen bcl-xL humano que se producen dos moléculas diferentes de RNA, una de las cuales codifica BCL-xL (forma larga) y la otra codifica BCL-xS (forma corta) . La BCL-xS carece de una sección de 63 aminoácidos encontrada en la BCL- xL. La BCL-xS ha mostrado que favorece la apoptosis y, por lo tanto, es preferible usar un cDNA para la expresión de la BCL-xL en lugar de un fragmento genómico. En otra realización preferida, un mutante de BCL-xL, o un mutante de BCL-2, con propiedades anti-apoptosis mejoradas, está abarcada, por ejemplo, suprimiendo una región no conservada entre las regiones conservadas BH3 y BH4 y, por tanto, aumentando la estabilidad de las proteínas de las variantes proteicas mutantes (Chang et al., 1997; Figueroa et al., 2001) . En una realización preferida adicional, la presente invención proporciona variantes modificadas del gen bcl-xL de hámster, especialmente del gen bcl-xL de hámster codificado por la SEQ ID NO: 3 como se ha mencionado anteriormente. Variantes modificadas de este tipo incluyen, pero no se limitan a moléculas de ácidos nucleicos con la secuencia de SEQ ID MO:5, SEQ ID ÑO: 7, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11, o cualesquiera variantes o mutantes (degenerativos y no degenerativos) funcionales de la misma. Un "mutante funcional" incluye, pero no se limita a una molécula de DNA con al menos una homología del 95%, de preferencia 96%, más preferentemente 97%, incluso más preferiblemente 98% y lo más preferiblemente 99% con cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos descritas · anteriormente, preferiblemente con cualquiera de los ácidos nucleicos con la secuencia de SEQ ID NO : 3 , SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 9 o SEQ ID NO: 11. La mutación puede ser provocada por inserciones, sustituciones y/o deleciones de uno o más nucleótidos de la secuencia original del ácido nucleico. La expresión "mutante funcional" incluye también cualquier fragmento funcional biológicamente activo mutante por deleción o inserción de cualquiera de las moléculas de ácidos nucleicos antes mencionadas con una homología de al menos el 95%, preferiblemente de al menos el 96%, más , preferiblemente de al menos el 97%, incluso más preferiblemente de al menos el 97%, incluso más preferiblemente de al menos el 98%, y lo más preferiblemente de al menos el 99% con cualquiera de estas moléculas, o al menos con fragmentos funcionales de estas moléculas . La expresión "mutante funcional" incluye también cualquier fragmento funcional biológicamente activo, mutante por deleción o inserción de cualquiera de las moléculas de ácidos nucleicos antes mencionadas, en donde la parte biológicamente activa de estos fragmentos muestra una homología de al menos el 95%, preferiblemente de al menos el 96%, más preferiblemente de al menos el 97%, incluso más preferiblemente de al menos el 98% y lo más preferiblemente de al menos el 99% con la parte biológica activa del gen bcl- xL del hámster. Un "fragmento funcional" significa también una molécula de DNA que codifica una porción funcionalmente activa del gen bcl-xL de hámster, especialmente del ácido nucleico con la secuencia de SEQ ID NO: 3. Ejemplos de fragmentos funcionales preferidos de un gen bcl-xL de hámster son las moléculas de ácido nucleico con la secuencia de SEQ ID N0:5, SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO: 9 O SEQ ID NO: 11. "Variantes funcionales" incluyen moléculas de ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones estrictas a un ácido nucleico con una cualquiera de las secuencias definidas anteriormente, por ejemplo con la secuencia de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 9 o SEQ ID NO: 11, y que codifica un gen bcl-xL de hámster funcional y biológicamente activo. El término "variantes" se refiere, en general, a una forma alternativa de un polinucleótido que puede tener una sustitución, deleción o adición de uno o más nucleótidos que no altera sustancialmente la función del polipéptido codificado . "Mutantes degenerativos" se refiere, en general, a moléculas de DNA con diferentes secuencias de ácidos nucleicos pero que codifican polipéptidos con secuencias de aminoácidos idénticas. Esto significa que cualquier ácido nucleico que codifique un polipéptido con la secuencia de aminoácidos que es codificada por cualquiera de las secuencias de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5 , SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11 es un mutante degenerativo del mismo.

De acuerdo con el aspecto antes descrito, la presente invención proporciona también un DNA que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un gen bcl-xL biológicamente activo, en donde el ácido nucleico se selecciona de: (a) un ácido nucleico con la secuencia de SEQ ID NO: 3, o su cadena complementaria; (b) un fragmento, variante o mutante (degenerativo y no degenerativo) funcional de la secuencia de ácidos nucleicos definida en (a) ; (c) un ácido nucleico con una homología de al menos el 95% con la secuencia del ácido nucleico definida en (a) ; y (d) un ácido nucleico que se híbrida a cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos definidas en (a) , (b) o (c) en condiciones estrictas. La presente invención proporciona, además, un DNA que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un gen bcl-xL biológicamente activo, en donde el ácido nucleico se selecciona de (a) un ácido nucleico con la secuencia de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : 9 , SEQ ID NO: 11 o la cadena complementaria de cualquiera de los anteriores; (b) variantes o mutantes (degenerativos y no degenerativos) funcionales de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos definidas en (a) ; (c) un ácido nucleico con una homología de al menos el 95% con cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos definidas en (a) ; y (d) un ácido nucleico que se híbrida a cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos definidas en (a) , (b) o (c) , en condiciones estrictas. En una realización más preferida, la presente invención se dirige también a un DNA que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un gen bcl-xL biológicamente activo con la secuencia de SEQ ID N0:3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : o SEQ ID NO: 11. Las proteínas codificadas por cualquiera de las secuencias de DNA antes mencionadas dan como resultado una forma más o menos estabilizada de la proteína BCl-xL de hámster. El uso de uno o más de estos mutantes BCL-xL de hámster en cualquier procedimiento de la invención que prolongue la supervivencia de las células al inhibir o demorar la apoptosis, según se describe en esta memoria, es una realización muy preferida de la presente invención. La presente invención se dirige, por lo tanto, también a un polipéptido que es codificado por cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos descritas anteriormente que codifica un gen bcl-xL funcional y biológicamente activo. TABLA 2 : Genes anti-apoptosis de la superfamilia bcl-2 Polinucleótido N° de acceso Polinucleótido N° de acceso GenBank Genbank bcl-xL (humano) Z23115 nr-13 (pollo) AF120211 bcl-xL (ratón) L35049 bcl-xL (rata) U34963 bcl-xL (pollo) Z23110 bcl-2 (humano) M 13995 bhfr-1 (virus de AF120456 bcl-2 (ratón) M 16506 herpes) Polinucleótido N° de acceso Polinucleótido N° de acceso GenBank Genbank bcl-2 (rata ) L14680 bhfr-1 (virus Epstein- A22899 bcl-2 (pollo) Z1 1961 Barr) bcl-2 (hámster) AJ271720 bcl-w (humano) U59747 Imw5-HL (virus de L09548 bcl-w (ratón) U59745 fiebre procina bcl-w (rata) AF096291 africana) bfl-1 (humano) U27467 cdn-1 (humano) AAQ95492 A1 (ratón) U23774 (NAGENESEQ) mcl-1 (humano) AF 147742 cdn-2 (humano) AAQ95493 mcl-1 (ratón) U35623 (NAGENESEQ) mcl-1 (rata) AF 115380 mcl-1 (pollo) AF120210 boo (ratón) AF102501 cdn-3 (humano) AAQ95494 (NAGENESEQ) brag-1 (humano) S82185 ced-9 L26545 (C. elegans) Una "secuencia de ácidos nucleicos", como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a un oligonucleótido, nucleótido o polinucleótido y fragmentos y partes de los mismos y a DNA o R A de origen genómico o sintético, que pueden ser de cadena sencilla o doble y representan la cadena de sentido o antisentido. Los polinucleótidos de la invención incluyen regiones de ácidos nucleicos en las que uno o más codones han sido sustituidos por sus sinónimos. Están adicionalmente incluidos polinucleótidos que tienen una secuencia codificadora que es una variante alélica que se produce de forma natural de ¦ una secuencia codificadora, por ejemplo, una variante de la secuencia codificadora de SEQ ID n° 1, SEQ ID n° 2, SEQ ID n° 3, SEQ ID n° 5, SEQ ID n° 7, SEQ ID n° 9 o SEQ ID n° 11. Como es conocido en la técnica, una variante alélica es una forma alternada de un polinucleótido, que puede tener una sustitución, deleción o adición de uno o más nucleótidos que no alteran sustancialmente la función del polipéptido codificado. La función de un polipéptido está determinada en general por la actividad biológica funcional de dicho polipéptido codificador. Por lo tanto, "no altera sustancialmente la función de los polipéptidos codificados" significa que el nivel de actividad biológica funcional del polipéptido codificado es al menos 50%, más preferentemente al menos 80% e incluso más preferentemente al menos 100% o más en comparación con el correspondiente polipéptido codificado de tipo salvaje. El término "codificar" se refiere a la propiedad inherente de las secuencias específicas de nucleótidos en un ácido nucleico, como un gen en un cromosoma o un mR A, para servir como plantillas para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procedimientos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos (es decir, r NA, t NA y otras moléculas de A) o aminoácidos y las propiedades biológicas que resultan a partir de los mismos. Por tanto, un gen codifica una proteína, si la transcripción y traducción del irtRNA producido por ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena codificadora, cuya secuencia de nucleotidos es idéntica a la secuencia del mRMA y está habitualmente proporcionada en los listados de secuencias, como la cadena no codificadora, usada como la plantilla para la transcripción de un gen o cDNA pueden ser citadas como codificadoras de la proteína u otro producto de ese gen o cDNA. Un ácido nucleico que codifique una proteína incluye cualesquiera ácidos nucleicos que tengan secuencias de nucleotidos diferentes pero que codifiquen la misma secuencia' de aminoácidos de la proteína debido a la degeneración del código genético. Los ácidos nucleicos y secuencias de nucleotidos que codifican proteínas pueden incluir intrones . El término "cDNA" en el contexto de esta invención se refiere a ácidos desoxiribonucleicos producidos por transcripción inversa y normalmente síntesis de una segunda cadena de mRNA u otro R A producido por un gen. Si es de cadena doble, una molécula de cDNA tiene tanto una cadena codificadora o de sentido como una no codificado o de antisentido. En general, como se usan en la presente memoria descriptiva, las letras mayúsculas (por ejemplo, BCL-xL) indican polipéptidos (por ejemplo, productos de expresión génica) y las letras minúsculas (por ejemplo, bcl-xL) indican polinucleótidos (por ejemplo, genes) . Adicionalmente, en toda esta memoria descriptiva, la forma singular de los artículos incluye las referencias en plural, salvo que el - contexto indique claramente otra cosa. El término "polipéptido" se usa de forma intercambiable con secuencias de residuos de aminoácidos o proteínas y se refiere a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. Estos términos incluyen también proteínas que son modificadas post-traducción a través de reacciones que incluyen, aunque sinlimitación, glicosilación, acetilación, fosforilación o tratamiento de proteínas. Se pueden hacer modificaciones y cambios, por ejemplo, fusiones a otras proteínas, sustituciones de secuencias de aminoácidos, deleciones o inserciones, en la estructura de un polipéptido, mientras la molécula mantiene su actividad funcional biológica. Por ejemplo, se pueden hacer ciertas sustituciones de secuencias de aminoácidos en un polipéptido o su secuencia codificadora de ácidos nucleicos subyacente y se puede obtener una proteína con propiedades análogas. Como se mencionó anteriormente, una proteína preferida es la secuencia de proteínas BCL-xL codificada por la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID n° 1, SEQ ID n° 3, SEQ ID n° 5, SEQ ID n° 7, SEQ ID n° 9 o SEQ ID n° 11, o cualquier fragmento, variante o mutante (degenerativa y no degenerativa) funcional de la misma. Se pueden preparar sustituciones de aminoácidos que proporcionen polipéptidos BCL-xL funcionalmente equivalentes mediante el uso del índice hidrofático de aminoácidos (Kyte et al., J. Mol. Biol. 157: 105-132, 1982) realizando mutagenesis específica para el sitio o mutagénesis mediada por reacción de cadena de polimerasa sobre su secuencia de aminoácidos subyacente. Como se mencionó anteriormente, la presente invención se refiere a células hospederas genéticamente modificadas y también a métodos para generar estas células hospederas . En una realización, las células hospederas comprenden secuencias de polinucleótidos heterólogos introducidos que codifican un gel anti-apoptosis, un gen marcador amplificable y seleccionable y, opcionalmente, al menos un gen de interés. El "gen marcador amplificable y seleccionable" tiene las propiedades de un gen marcador seleccionable, pero adicionalmente permite la amplificación (es decir, generación de copias adicionales del gen que sobreviven en forma intra-cromosomal o extra-cromosomal) del propio gen y también de genes adyacentes a ese gen amplificable y seleccionable cuando las células son cultivadas bajo condiciones apro iadas. La presente invención proporciona particularmente células hospederas que comprenden no solamente una copia de un gel anti-apoptosis introducido, sino que comprenden copias múltiples de dicho gen anti-apoptosis, más de 5, 10, 20, 50 ó 100 copias del gen anti-apoptosis introducido. Estas células hospederas se pueden obtener, por ejemplo, mediante el método que comprende (i) introducir en una población celular de mamífero secuencias de ácidos nucleicos que codifiquen un gen anti-apoptosis, un gen marcador amplificable y seleccionable y, opcionalmente, al menos un gen de interés, en donde dichos genes están operativamente conectados al menos a una secuencia reguladora que permite la expresión de dichos genes, (ii) cultivas dicha población celular bajo condiciones en las que se expresen dicho gen marcador amplificable y seleccionable y dicho gen anti-apoptosis, y que sean favorables para obtener copias múltiples de al menos el gen anti-apoptosis y (iii) seleccionar células de la población celular que incorporen copias múltiples de al menos el gen anti-apoptosis. Como se ha mencionado anteriormente, se prefiere disponer al menos el gen anti-apoptosis y el gen marcador amplificable y seleccionable en estrecha proximidad espacial para permitir una amplificación más eficaz del gen anti-apoptosis. Por lo tanto, en una realización preferida del método descrito en esta memoria, al menos el gen anti-apoptosis y el gen marcador amplificable y seleccionable son codificados por la misma molécula de DNA, por ejemplo ambos genes se disponen en el mismo vector de expresión y, por lo tanto, serán introducidos en común en la célula hospedera. r En una realización más preferida de este método, la expresión del gen anti-apoptosis y el gen marcador amplificable y seleccionable están operativamente unidos uno con otro, por ejemplo al utilizar un promotor común que permita la co-expresión de dichos genes. Las células hospederas generadas de esta manera comprenden, por ejemplo, al menos 5 copias del gen anti-apoptosis heterólogo incorporado. En una realización adicional, las células hospederas comprenden, por ejemplo, al menos 10 copias del gen anti-apoptosis heterólogo incorporado. En otra realización, se pueden obtener células hospederas que comprenden al menos 50 copias del gen anti-apoptosis heterólogo introducido. En una realización adicional, las células hospederas comprenden, por ejemplo, al menos 100 copias de un gen anti-apoptosis heterólogo incorporado. Los genes anti-apoptosis apropiados son los anteriormente mencionados, en particular los citados en la Tabla 2, por ejemplo, los que codifican cualesquiera de los polipéptidos BCL-xL descritos en esta memoria. En general, en la invención se prefieren células hospederas que comprendan el gen anti-apoptosis en números de copias que permitan su expresión a niveles que sean suficientemente elevados para aumentar la supervivencia de la población celular inhibiendo o retrasando la muerte celular programada. Las más preferidas son las células hospederas que comprenden no solamente el gen anti-apoptosis en números de copias que permitan mejorar la supervivencia celular, sino que muestren también un nivel elevado de expresión del gen de interés, codificado también por las células hospederas genéticamente modificadas . Los métodos para descubrir- el nivel de expresión más elevado tolerable para un gen anti-apoptosis que tenga el efecto máximo sobre la reducción de la velocidad de apoptosis, sin conducir a velocidades de crecimiento celular grandemente disminuidas o inestabilidades genéticas, y sin tener un impacto negativo sobre la productividad con respecto a la proteína de interés, son bien conocidos por un experto en la técnica. Incluyen, sin limitación, por ejemplo, curvas de crecimiento de generación, verificación de la viabilidad de las células midiendo la exclusión de colorantes no permeables por microscopía o por citometria de flujo, cuantificación de la apoptosis por ensayos TUNEL o de Anexina V, determinación de los títulos de un producto por un ensayo ELISA y evaluación de la estabilidad genética de los genes transfectados a través de pasadas por análisis de transferencia Southern y de puntos o por PCR cuantitativa. En esta invención, por ejemplo, se proporciona una supervivencia celular suficientemente mejorada, si el nivel de expresión del gen anti-apoptosis, por ejemplo, el gen bcl-xL, alcanza concentraciones de supervivencia intracelular eficaces del polipéptido codificador en comparación con la célula parental no amplificada. Una supervivencia celular mejora suficiente es proporcionada, por ejemplo, cuando el nivel para la expresión del gen bcl-xL, o para cualquier otro gen anti-apoptosis, dé lugar a una población celular que tenga al menos un aumento de la supervivencia de al menos aproximadamente 20% después de 6, 7, 8 ó 9 días de cultivo en comparación con la población celular parental . Es más preferido un aumento de la supervivencia de al menos aproximadamente 30%, e incluso más preferido un aumento de la supervivencia de al menos 50% después de un cultivo de 6, 7, 8 ó 9 días en comparación con la población celular parental . Se proporciona también una supervivencia celular suficiente cuando al menos un 50% de las células cultivadas son viables después de un período de cultivo de 9 días. Si el gen anti-apoptosis codifica BCL-xL, se proporciona también una supervivencia celular suficiente cuando al menos un 60% de las células son viables después de un cultivo de 9 días. En otra realización, se alcanza una supervivencia celular aumentada cuando al menos aproximadamente un 60% de la población celular es viable después de 8 días. En una realización adicional, se consigue una supervivencia celular aumentada suficiente cuando al menos aproximadamente un 75% de la población celular es viable después de 7 días, y adicionalmente si al menos aproximadamente un 85% de las células son viables después de 6 días . El "gen marcador amplificable y seleccionable" habitualmente codifica una enzima que es necesaria para el crecimiento de células eucarioticas bajo esas condiciones. Por ejemplo, el gen marcador amplificable y seleccionable codifica DHFR, gen que es amplificado cuando una célula hospedera transfectada con el mismo se hace crecer en presencia de un agente selectivo, metotrexato (MTX) . Los ejemplos no limitados de genes seleccionables de la Tabla 3 son también genes marcadores amplificables , que pueden ser usados para levar a cabo la presente invención. Para un examen de los genes marcadores amplificables y seleccionables citados en la Tabla 3, véase la publicación de Kaufman, "Methods in Enzymology" , 185:537-566 (1990), incorporada como referencia.

Consecuentemente, las células hospederas genéticamente modificadas según cualquier método descrito en la presente memoria descriptiva están abarcadas por esta invención, en la que el gen marcador amplificable y seleccionable codifica un polipéptido que tiene la función de dihidrofolato-reductasa (DHFR) , glutamina-sisntetasa, CAD, adenosina-desaminasa, adenilato-desaminasa, UMP-sintetasa, IMP-51 -deshidrogenasa, xantina-guanina-fosforribosil-transferasa, HGPRTasa, timidina-quinasa, timidilato-sintetasa, P-glicoproteína 170, ribonucleotido-reductasa, aspargina-sintetasa, arginosuccinato-sintetasa, ornitina-descarboxilasa, HMG CoA-reductasa, acetilglucosaminil-transferasa, treonil-tRA-sintetasa o Na+K+-ATPasa . Un gen marcador amplificable y seleccionable preferido es el gen que codifica dihidrofolato-reductasa (DHFR) que es necesario para la biosíntesis de purinas . Las células que carecen del gen DHFR no crecerán en medios que carezcan de purinas. El gen DHFR, por lo tanto, es útil como un marcador seleccionable dominante para seleccionar y amplificar genes en estas células que crecen en un medio que carece de purinas. El agente de selección usado conjuntamente con un gen DHFR es metotrexato (MTX) . Por lo tanto, la presente invención incluye un método para generar una célula hospedera de mamífero que comprende (i) introducir en una población celular hospedera de mamífero un gen anti-apoptosis, un gen que codifica DHFR y (ii) amplificar el gen anti-apoptosis en presencia de metotrexato. En una realización más preferida de la presente invención, el gen anti-apoptosis y el gen que codifica DHFR se disponen en la misma molécula de DNA cuando se introducen en la célula hospedera. En una realización más preferida, ambos genes están operativamente unidos uno con otro y son transcritos únicamente por un promotor común. Consecuentemente, las células transfectadas son cultivables en un medio exento de hipoxantina/timidina en ausencia de suero y cantidades crecientes de MTX, partiendo sin MTX en el medio hasta concentraciones de MTX entre 2 nM y 2.000 nM, más normalmente entre 2 nM y 1.000 nM. La concentración de MTX se aumenta gradualmente en un factor entre 2 y 10. En un procedimiento preferido, el gen anti-apoptosis codifica adicionalmente uno cualquiera de los genes citados en la Tabla 2. En un método más preferido, el gen anti-apoptosis codifica BCL-2 o BCL-xL, en un método incluso más preferido para BCL-xL.

TABLA 3 : Genes marcadores amplificables y seleccionables Gen marcador amplificable Número de acceso Agente de selección y seleccionable Dihidrofolato-reductasa M 19869 (hámster) Meíoírexaío (MTX) E00236 (ratón) Metalotioneína D10551 (hámster) Cadmio 13003 (humano) M11794 (rata) CAD (Carbamoil-fosfato- M23652 (hámster) N-fosfoaceíil-L-aspartaío sintetasa:Aspartato- D78586 (humano) transcarbamilasa:Dihidroorot asa) Adenosino-desaminasa K02567 (humano) Xyl-A- o adenosina-2'- M10319 (ratón) desoxicoformicina AMP (adenilato)desaminasa D12775 (humano) Adenina, azaserina- J02811 (rata) coformicina UMP-sintasa J03626 (humano) 6-Azuridina, pirazofurano IMP-5'-deshidrogenasa J04209 (hámster) Acido micofenólico J04208 (humano) M33934 (ratón) Xantina-guanina-fosfo- X00221 (E. coli) Ácido micofenólico con ribosiltransferasa xantina limitaníe HGPRTasa muíante o J00060 (hámster) Hipoxaníina, aminopíeridina y timidina-quinasa muíante M13542, K02581 (humano) íimidina (HAT) J00423, 68489(ratón) M63983 (rata) Gen marcador amplificable Número de acceso Agente de selección y seleccionable M36160 (herpesvirus) Timidilato-sintetasa D00596 (humano) 5-Fluorodesoxiuridina M 13019 (ratón) L12138 (rata) P-glicoproteína 170 (MDR1 ) AF016535 (humano) Fármacos múltiples, p. ej., J03398 (ratón) adriamicina, vincristina, coichicina Ribonuleótido-reductasa M124223, K02927 (ratón) Afidicolina Glutamina-sintetasa AF150961 (hámster) Metionina-sulfoximina (MSX) U09114, M60803 (ratón) M29579 (rata) Asparagina-sintetasa M27838 (hámster) Hidroximato de ß-Aspartilo, 27396 (humano) Albizziina, 5'-Azacitidina U38940 (ratón) U07202 (rata) Arginosuccinato-sintetasa X01630 (humano) Canavanina M31690 (ratón) M26198 (bovino) Ornitina-descarboxilasa M34158 (humano) -Difluorometil-ornitina J03733 (ratón) M16982 (rata) HMG-CoA-reductasa L00183,' M12705 (hámster) Compactina M11058 (humano) N-acetilglucosam¡nil- 55621 (humano) Tunicamicina transferasa Treonil-tRNA-sintetasa M63180 (humano) Borrellidina Na+K+-ATPasa J05096 (humano) Ouabaina M 14511 (rata) Las células hospederas adecuadas para usar un gen que codifica DHFR como marcador amplificable y seleccionable son células de mamíferos, preferentemente células de mieloma de múridos o de hámster. Son más preferidas las células CHO-DUKX (ATCC CRL-9096) y CH0-DG44 (Urlaub et al., Cell 33 [2] , 405-412, 1983) que son deficientes en actividad de DHFR. Para extender el método de amplificación de DHFR a otros tipos de células, se puede usar un gen DHFR mutante que codifique una proteína con sensibilidad reducida para metotrexato conjuntamente con células hospederas que contengan miembros normales de un gen DHFR de tipo salvaje endógeno (Simonson et al., 1983; igler et al., 1980; Haber et al., 1982). Otra realización de esta invención proporciona también células hospederas que son genéticamente modificadas introduciendo secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen anti-apoptosis, un gen DHFR, y al menos un gen de interés. En una realización adicional, el gen anti-apoptosis de dichas células hospederas codifica cualquiera de los genes anti-apoptosis citados en la Tabla 2, preferentemente el gen BCL-xL, más preferentemente el gen BCL-xL de origen humano o de hámster, incluso más preferiblemente el que tiene la SEQ ID n° 1, SEQ ID n° 3, SEQ ID n° 5, SEQ ID n° 7, SEQ ID n° 9 o SEQ ID n° 11, o cualquier fragmento, variante o mutante (degenerativa y no degenerativa) funcional de la misma. Las células hospederas genéticamente modificadas mediante la introducción de secuencias de ácidos nucleicos que codifican BCL-xL, el gen DHFR y al menos un gen de interés son las más preferidas para esta invención y, por lo tanto, son objeto de la presente invención. Sin embargo, en general, las células hospederas que están dentro del sentido de la presente invención comprenden al menos un gen anti-apoptosis heterólogo, un gen marcador amplificable y seleccionable y un gen de interés, de los que el gen anti-apoptosis es cualquier gen de la Tabla 2 o cualquier otro descrito en esta memoria, y el gen marcador amplificable y seleccionable es cualquiera de los genes citados en la Tabla 3. La expresión "agente de selección" se refiere a una sustancia que interfiere con el crecimiento o supervivencia de una célula hospedera que es deficiente en un gel seleccionable particular. Por ejemplo, para seleccionar la presencia de un gen de resistencia a los antibióticos como APH (aminoglicósido-fosfotransferasa) en una célula transfectada, se usa el antibiótico Geneticina (G418) . El agente de selección puede comprende también un "agente de amplificación" que se define para los fines de la presente invención como un agente para amplificar copias del gen amplificable si el gen marcador seleccionable en que se basa es un marcador seleccionable amplificable. Por ejemplo, MTX es un agente de selección útil para la amplificación del gen DHFR. Ejemplos de agentes de selección y de amplificación, sin limitación, son los citados en la Tabla 3. La presente invención es adecuada para generar células hospederas para la producción de polipéptidos/proteínas biofarmacéuticos . La invención es particularmente adecuada para la expresión con rendimiento elevado de un gran número de genes diferentes de interés por células que muestran una viabilidad y productividad celular mejoradas. "Gen de interés", "Secuencia seleccionada" o "Gen producto" tienen el mismo significado en la presente memoria descriptiva y se refieren a una secuencia de polinucleótidos de cualquier longitud que codifica un producto de interés, también mencionado por la expresión "producto deseado". La secuencia seleccionada puede ser de longitud completa o un gen truncado, un gen de fusión o etiquetado y puede ser un cDNA, un DNA genómico o un fragmento de DNA, preferentemente un cDNA. Puede ser la secuencia nativa, es decir, form (s) que se produce (n) de forma natural o puede ser mutada o modificada de algún otro modo en la medida deseada. Estas modificaciones incluyen optimizaciones de codones para optimizar la utilización de codones en la célula hospedera seleccionada, humanización o etiquetado. La secuencia seleccionada puede codificar un enlace de membrana, nuclear, citoplásmico o segregado o un polipéptido de la superficie celular. El "producto deseado" incluye proteínas, polipéptidos , sus fragmentos, péptidos, RNA antisentido, todos los cuales pueden ser expresados en la- células hospedera seleccionada. Las proteínas deseadas pueden ser, por ejemplo, anticuerpos, enzimas, citoquinas, linfocinas, moléculas de adhesión, receptores y derivados o sus fragmentos, y cualesquiera otros polipéptidos que puedan servir como agonistas o antagonistas y/o que tengan un uso terapéutico o de diagnóstico. Ejemplos para una protelna/polipéptido deseado seproporcionan también a continuación. Por definición, cualesquiera secuencias o genes introducidos en una célula hospedera se denominan "secuencias heterólogas" o "genes heterólogos" con respecto a la célula hospedera, incluso si la secuencia o gen introducido es idéntico a una secuencia o gen endógenos en la célula hospedera. Por ejemplo, un gen bcl-xL de hámster, introducido en una célula hospedera de hámster, es por definición un gen heterólogo . Las secuencias de genes heterólogos pueden ser introducidas en una célula diana, por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos que codifique bcl-xL, usando un "vector de expresión", preferentemente uno eucariótico, e incluso más preferentemente un vector de expresión de mamífero. Los métodos usados para construir vectores son bien conocidos por un experto en la técnica y están descritos en diversas publicaciones. En particular, las técnicas para construir vectores adecuados, incluida una descripción - de los componentes funcionales como promotores, mej oradores , señales de terminación y poliadenilación, marcadores de selección, orígenes de replicación y señales de escisión, son examinados considerablemente en detalle por Sambrook et al., 1989 y las referencias citadas por los mismos. Los vectores pueden incluir, pero sin limitación, vectores de plásmidos, fagémidos, cósmidos, mini-cromosomas artificiales o vectores virales como baculovirus, retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados , virus de herpes simple, retrovirus o bacteriófagos. Los vectores de expresión eucarioticos contendrán normalmente también secuencias procarióticas que facilitan la propagación del vector en bacterias como un origen de replicación y genes de resistencia a los antibióticos para la selección en bacterias. Una diversidad de vectores de expresión eucarioticos, que contienen un sitio de clonación en el que puede estar operativamente unido un polinucleótido, son bien conocidos en la técnica y algunos están disponibles en el comercio en empresas como Stratagene, La Jolla, CA; Invitrogen, Carlsbad, CA Promega, Madison, WI o BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA. En una realización preferida, el vector de expresión comprende al menos una secuencia de ácidos nucleicos que es una secuencia reguladora necesaria para la transcripción y traducción de secuencias de nucleótidos que codifican un péptido/polipéptido . En una realización más específica, el vector de expresión comprende al menos una secuencia reguladora que permite la transcripción y . traducción (expresión) de las secuencias de nucleótidos que codifican el gen anti-apoptosis , el gen marcador amplificable y seleccionable y un gen de interés . Las "secuencias reguladoras" incluyen promotores, mej oradores, señales de terminación y poliadenilacion y otros elementos de control de la expresión. Las secuencias reguladoras tanto inducibles como constitutivas se conoce en la técnica que actúan en diversos tipos de células . Los elementos transcripcionalmente reguladores comprenden normalmente un promotor aguas arriba de la secuencia génica que va a ser expresada, sitios de inicio y terminación transcripcionales y una secuencia de señal de poliadenilacion. La expresión "sitio de inicio transcripcional" se refiere al ácido nucleico en la construcción correspondiente al primer ácido nucleico incorporado en el transcrito primario, es decir, el precursor de mR A y el sitio de inicio transcripcional se puede solapar con las secuencias promotoras. La expresión "sitio de terminación transcripcional" se refiere a una secuencia de nucleótidos normalmente representada en el extremo 31 de un gen de interés o el estiramiento de las secuencias que van a ser transcritas, que provoca que la R A-polimerasa termina la transcripción. La secuencia de señal de poliadenilación o señal de adición de poli-A proporciona la señal para la escisión en un sitio específico en el extremo 3 ' de mRAN eucariótico y la adición post-transcripcional en el núcleo de una secuencia de aproximadamente 100-200 nucleotidos de adenina (cola de poliA) al extremo 3' escindido. La secuencia de señal de poliadenilación incluye la secuencia AATAAA colocada a aproximadamente 10-30 nucleotidos aguas arriba del sitio de escisión, más una secuencia aguas abajo. Son conocidos diversos elementos de poliadenilación, por ejemplo, SV40 tardío y poli A temDrano, o BGH-poliA. Los elementos reguladores de traducción incluyen un sitio de inicio de traducción (AUG) , un codón de terminación y una señal de poliA para cada polipéptido individual que va a ser expresado. Se incluye un sitio de entrada de ribosomas internos (IRES) en algunas construcciones. El IRES se define con posterioridad. Con el fin de optimizar la expresión, puede ser necesario separar, añadir o alterar partes no traducidas en 5' y/o 3' de la secuencia de ácidos nucleicos que va a ser expresada para eliminar potencialmente codones de inicio de traducción alternativa inapropiada u otras secuencias que puedan interferir con la expresión o reducirla, al nivel de la transcripción o la traducción. Alternativamente, se pueden insertar sitios de unión de ribosomas de consenso inmediatamente en 5 ' del codón de comienzo para aumentar la expresión. Para producir un polipéptido segregado, la secuencia seleccionada incluirá generalmente una secuencia de señal que codifica un péptido líder que dirige el polipéptido recién sintetizado hasta y a través de una membrana ER en la que el polipéptido puede ser dirigido para la secreción. El péptido líder está a menudo, pero no universalmente , en la terminación amino de una proteína segregada y es escindido por peptidasas de señales después de que la proteína atraviesa la membrana ER. La secuencia seleccionada incluirá generalmente, pero no necesariamente, su propia secuencia de señal. Cuando la secuencia de señal nativa están ausente, una secuencia de señal heteróloga puede ser fusionada a la secuencia seleccionada . Numerosas secuencias de señal son conocidas en la técnica y están disponibles a partir de bases de datos de secuencias como GenBank y EMBL. El vector de expresión puede contener una única unidad de transcripción para la expresión del gen anti-apoptosis , el gen marcador amplificable y seleccionable y, opcionalmente, el (o los) gen(es) de interés, haciendo uso, por ejemplo, de los elementos de IRES o posicionamiento de intrones de algunos de los genes para unir operativamente todos los elementos al mismo promotor o promotor/mejorador. Alternativamente, el vector de expresión puede tener una o más unidades de transcripción y los elementos anteriormente mencionados pueden ser expresados a partir de unidades de transcripción separadas, conteniendo cada unidad de transcripción las mismas o diferentes secuencias reguladoras. En otra alternativa, más de un vector de expresión que comprende una o más unidades de transcripción, cada una de las cuales puede ser usada para la expresión de un o más de los elementos anteriormente mencionados, pueden ser usadas e introducidas en una célula hospedera por co-transfección o en rondas secuenciales en cualquier orden de las unidades de transcripción introducidas . Se puede escoger cualquier combinación de elementos en cada vector en la medida en que las unidades de transcripción estén suficientemente expresadas. Se pueden colocar elementos adicionales que se estimen necesarios en un vector de expresión, como gen (es) anti-apoptosis adicional (es) , gen(es) de interés o marcadores de selección. El requisito previo para la presente invención es la introducción conjunta del gen anti-apoptosis y el gen marcador amplificable y seleccionable al mismo tiempo, en unidades de transcripción separadas en uno o dos vectores o ambos en una unidad de transcripción en un vector único, para permitir la co-amplificacion del gen anti-apoptosis junto con el gen marcador amplificable y seleccionable. En una realización adicional, el gen anti-apoptosis, el gen marcador amplificable y seleccionable y también el (o los) gen (es) de interés se incorporan al mismo tiempo, en unidades de transcripción separadas en uno o más vectores, o bien en una o más unidades de transcripción en un único vector, para permitir la co-amplificación del gen anti-apoptosis junto con el marcador amplificable y seleccxonable y el (o los) gen (es) de interés. Se prefiere disponer al menos el gen anti-apoptosis y el gen marcador amplificable y seleccionable en estrecha proximidad espacial para permitir una amplificación más eficaz del gen anti-apoptosis. Por lo tanto, se prefiere que al menos el gen anti-apoptosis y el gen marcador amplificable y seleccionable sean codificados por la misma molécula de DNA, por ejemplo si ambos genes se disponen sobre el mismo vector de expresión, y por lo tanto serán introducidos en común en la célula hospedera. Es más preferido, además, disponer ambos genes en una unidad de transcripción, por ejemplo utilizando un elemento promotor común para permitir la co-expresión y la amplificación de dichos genes . Un "promotor" se refiere a una secuencia de polinucleótidos que controla la transcripción de un gen o secuencia al que está operativamente unida. Un promotor incluye señales para unión a R A-polimerasa y el inicio de la transcripción. Un promotor usado será funcional en el tipo de célula de la célula hospedera en la que se está contemplando la expresión de la secuencia seleccionada. Un gran número de promotores, incluidos promotores constitutivos, inducibles y contenibles de una diversidad de fuentes diferentes, son conocidos en la técnica (y están identificados en bases de datos como GenBank) y están disponibles o están en polinucleotidos clonados (por ejemplo, de depositarios como la entidad ATCC así como otras fuentes comerciales o individuales) . Con los promotores inducibles, , la actividad del promotor aumenta o disminuye en respuesta a una señal . Por ejemplo, el promotor de tetraciclina (tet) que contiene la secuencia operadora de tetraciclina (teto) puede ser inducido por una proteína transactivadora regulada por tetraciclina (tTA) . La unión de la tTA a la teto es inhibida en presencia de tet . Para otros promotores inducibles que incluyen jun, fos, metalotioneína y promotores de choque por calor, véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989 y Gossen et al., 1994. Entre los promotores eucarióticos que han sido identificados como promotores fuertes para una expresión a nivel elevado están el promotor de hámster del gen S27a de ubiquitina y fragmentos funcionales del mismo, según se describe en el docuemnto W097/15664, el promotor temprano SV40, promotor tardío principal de adenovirus, promotor de metalaotioneína-I de ratón, repetición terminal larga de virus de sarcoma Rous y promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano (CMV) . Otros promotores de mamíferos heterólogos incluyen, por ejemplo, promotor de actina, promotor de inmunoglobulina y promotores de choque por calor. Los promotores anteriormente mencionados son bien conocidos en la técnica. Cualquiera de los promotores antes mencionados es muy adecuado para controlar e iniciar la expresión de al menos el gen anti-apoptosis en la totalidad de las células hospedera de la invención descritas en esta memoria. Por ejemplo, un vector de expresión adecuado para introducir el gen gen anti-apoptosis y el gen marcador amplificable y seleccionable es una célula hospedera de mamífero que comprende un gen anti-apoptosis, un gen marcador amplificable y seleccionable y el promotor de hámster del gen S27a Ubiquitina o fragmentos funcionales de los mismos, según se describe en el documento W097/15664. Preferiblemente, al menos el gen anti-apoptosis se encuentra bajo el control de dicho promotor de hámster del gen S27a Ubiquitina. Un "mej orador", como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a una secuencia de polinucleótidos que actúa sobre un promotor para aumentar la transcripción de un gen o codificar la secuencia a la que está operativamente conectado. Al contrario que los promotores, los mej oradores son relativamente independientes de la orientación y posición y se han encontrado en 5 ' o 3 ' respecto a la unidad de trancripción, en un intrón, así como en la propia secuencia codificadora. Por lo tanto, los mej oradores pueden ser sustituidos aguas arriba o aguas abajo del sitio de inicio de la transcripción o a distancias considerables del promotor, aunque en la práctica los mej oradores se pueden solapar físicamente y funcionalmente con los promotores. Se conoce en la técnica un gran número de mej oradores de una amplia diversidad de fuentes diferentes (y están identificados en bases de datos como GenBank, por ejemplo, el mej orador SV40, mej orador C V, mejorador de polioma o mej orador de adenovirus) y están disponibles como tales o en secuencias de polinucleótidos clonados (por ejemplo, a partir de entidades de depósito como la ATCC así como otras fuentes comerciales o individuales) . Un cierto número de secuencias promotoras que comprenden polinucleótidos (tales como el promotor MCV comúnmente usado) comprenden también secuencias mej oradoras. Por ejemplo, todos los promotores fuertes citados con anterioridad comprenden también mej oradores fuertes. Una "unidad de transcripción" define una región en una construcción que contiene uno o más genes que van a ser transcritos, en la que los genes contenidos en el segmento están operativamente conectados unos a otros y son transcriptos a partir de un único promotor y, como consecuencia, los diferentes genes están al menos transcripcionalmente conectados . Más de una proteína o producto pueden ser transcritos y expresados a partir de cada unidad de transcripción. Cada unidad de transcripción comprenderá los elementos reguladores necesarios para la transcripción y la traducción de cualquiera de las secuencias seleccionadas que están contenidas en la unidad. "Opera ivamente conectado" significa que dos o más secuencias de ácidos nucleicos o elementos de las secuencias están colocados de una forma que permite que funcionen de la manera prevista. Por ejemplo, un promotor y/o mejorador está operativamente conectado a una secuencia codificadora si actúa en cis para controlar o modular la transcripción de la secuencia conectada. Generalmente, pero no necesariamente, las secuencias de DNA que están operativamente conectadas son contiguas y, cuando sea necesario unir dos regiones codificadoras de proteínas o en el caso de un lider secretor, contiguas y en un marco de lectura. Sin embargo, aunque un promotor operativamente conectado está generalmente colocado aguas arriba de la secuencia codificadora, no es necesariamente contigua a ella. Los mejoradores no tienen que ser contiguos en la medida en que aumenten la transcripción de la secuencia codificadora. Por esto, pueden estar colocados aguas arriba o aguas abajo de a secuencia codificadora e incluso a alguna distancia. Un sitio de poliadenilacion está operativamente conectado a una secuencia codificadora si está colocado en el extremo 31 de la secuencia codificadora en una forma que la transcripción tenga lugar a través de la secuencia codificadora en la señal de poliadenilacion. La conexión se realiza por métodos recombinantes conocidos en la técnica, por- ejemplo, usando una metodología PCR, por ligadura a sitios de restricción adecuados o por reasociación. Se pueden usar conectores o adaptadores de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional si no están presentes sitios de restricción adecuados. El término "expresión", tal como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a la transcripción y/o traducción de una secuencia heteróloga de ácidos nucleicos en una célula hospedera. El nivel de expresión de un producto deseado en una célula hospedera se puede determinar sobre la base de la cantidad de mR A correspondiente que está presente en la célula, o bien la cantidad de polipéptido deseado codificado por la secuencia seleccionada. Por ejemplo, el mRNA transcrito a partir de una secuencia seleccionada puede ser cuantificada por hibridación de transferencia Northern, protección de ribonucleasa-RNA, hibridación in. situ a RNA o por PCR (véase Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1987, actualizado) . Las proteínas codificadas por una secuencia seleccionada pueden ser cuantificadas por diversos métodos, por ejemplo, por un ensayo ELISA, por transferencia Western, por radioinmunuensayos , por inmunoprecipitación o ensayando la actividad biológica de la proteína, o por inmunotinción de la proteína seguida de ana'lisis FACS (véase Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1987, actualizado).

Como se usan en la presente memoria descriptiva, las expresiones y términos "expresión aumentada" o " sobreexpresión" o "expresión a nivel elevado" se refieren a una expresión sostenida y suficientemente elevada de una secuencia seleccionada heteróloga, en la presente invención preferentemente un gen anti-apoptosis , por ejemplo, bcl-xL o bcl-2 y/o un gen de interés, introducido en una célula hospedera. La expresión mejorada se puede conseguir por medios diferentes. En la presente invención, la expresión de un gen anti-apoptosis como bcl-xL o cualquier otro gen citado en la Tabla 2, junto con un gel marcador amplificable y seleccionable, proporciona un método más eficaz para seleccionar e identificar células hospederas que expresan un gen heterólogo a niveles elevados. El marcador amplificable y seleccionable no solo permite la selección de líneas celulares hospederas transfectadas estables, sino que permite a amplificación génica del gen heterólogo de interés . Las copias adicionales de las secuencias de ácidos nucleicos pueden estar integradas en el genoma de la célula o un cromosoma/mini-cromosoma artificial extra o pueden estar colocadas episomalmente . Esta aproximación puede ser combinada con una selección soportada por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para células hospederas recombinantes que tienen co-amplificado el gen anti-apoptosis usando como marcador de selección adicional, por ejemplo, una proteína fluorescente (por ejemplo, GFP) o un marcador de a superficie celular. Otros métodos para conseguir una expresión aumentada (por sí mismos o en combinación con las posibilidades anteriormente mencionadas) pueden incluir, sin limitación, el uso de factores de transcripción (artificiales) o el tratamiento de células con agentes naturales o sintéticos para una regulación ascendente de la expresión génica endógena o heteróloga, una mejora de la estabilidad de la codificación de mRNA para BCL-xL o de la propia proteína (por ejemplo, deleción de regiones susceptibles a proteasas no relevantes para la función biológica de la protelna) , aumento de la traducción del mRNA o aumento de la dosificación génica mediante el uso de plásmidos episomales (basados en secuencias virales para los orígenes de replicación, como SV40, polioma, adenovirus, EBV o BPV) , secuencias de amplificción-promoción (Hernán et al., 1994) o sistemas de amplificación in vitro basados en DNA-concatémeros (Monaco et al., 1996). Un experto en la técnica será capaz de identificar y cuantificar los números de copias aumentados, por ejemplo, del gen anti-apoptosis heterólogo amplificado por métodos de la técnica, por ejemplo, mediante análisis por transferencia Southern o métodos de PCR cuantitativos . Están dentro de los conocimientos de un experto en la técnica el modo de elección de los controles más adecuados para la realización de tales ensayos. Un ejemplo de este método se proporciona en los Ejemplos descritos en la presente memoria descriptiva. Mediante los métodos anteriormente descritos, se pueden generar células hospederas tales que comprendan copias múltiples de al menos el gen anti-apoptosis sintroducido, por ejemplo, al menos 5, 10, 20, 50 ó 100 copias del gen anti-apoptosis introducido. Un "sitio de entrada de ribosoma interno" o "IRES" describe una secuencia que favorece funcionalmente el inicio de la traducción independiente del gen en 5 ' del IRES y permite que dos cistrones (marcos de lectura abiertos) sean traducidos a partir de una transcrito único en una célula animal . El IRES proporciona un sitio de entrada de ribosoma independiente para la traducción del marco de lectura abierto inmediatamente aguas abajo del mismo. Al contrario que el mRNA bacteriano que puede ser policistrónico, es decir, codifica varios polipéptidos diferentes que son traducidos secuencialmente a partir de los mRNAs, la mayoría de los mRNAs de las células animales son monocistrónicos y codifican la síntesis de solamente una proteína. Con un transcrito policistrónico en una célula eucariótica, la traducción se iniciaría a partir del sitio de inicio de la traducción más en 5 ' , terminaría en el primer codón de terminación y la transcripción se liberaría a partir del ribosoma, dando lugar a la traducción de solamente el primer polipeptido codificado en el mRNA. En una célula eucariótica, una transcripción policistrónica que tiene un IRES operativamente conectado al segundo o posterior marco de lectura abierto en la transcripción permitiría la traducción secuencial de ese marco de lectura abierto aguas abajo para producir los dos o más polipéptidos codificados por la mismo transcrito. El IRES puede ser de longitud variable y de diversas fuentes, por ejemplo, virus de encefalomiocarditis (EMCV) o picornavirus . Las diversas secuencias de IRES y su uso en la costrucción de vectores han sido previamente descritos (Pelletier et al., 1988; Jang et al., 1989; Davies et al., 1992; Adam et al., 1991; Morgan et al., 1992; Sugimoto et al., 1994; Ramesh et al., 1996; Mosser et al., 1997). La secuencia codificadora aguas abajo está operativamente conectada al extremo 3' del IRES a cualquier distancia que no afecte negativamente a la expresión del gen aguas abajo. La distancia óptima o permisible entre el IRES y el comienzo del gen aguas abajo puede ser fácilmente determinada variando la distancia y midiendo la expresión como una función de la distancia. El término "intrón", como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos no codificadora de longitud variable, presente normalmente en muchos genes eucarióticos que es separada de un precursor de mRNA recién transcrito mediante el procedimiento de escisión, para el que son necesarios secuencias altamente conservadas en cualquier extremo o sus proximidades del intrón. En general, el procedimiento de escisión requiere ¦ que los extremos 5 ' y 31 del intrón sean correctamente escindidos y los extremos resultantes del mR A sean exactamente unidos, de forma que se produzca un mKNTA maduro que tenga el marco de lectura apropiado para la síntesis de proteína. Han sido caracterizados muchos sitios donantes de empalmes y aceptores de empalmes, queriendo decir las secuencias que rodean inmediatamente los contornos exon-intron e intron-exon, y Ohshima et al., 1987, proporcionan un examen de los mismos. La "transfección" de células hospederas eucarioticas con un polinucleótido o un vector de expresión, que da lugar a células genéticamente modificadas o células transgénicas, se puede realizar por cualquier método bien conocido en la técnica y descrito, por ejemplo, por Sambrook et al., 1989 o por Ausubel et al., 1987 (actualizado). Los métodos de transfección incluyen, pero sin limitación, la transfección mediada por liposomas, co-precipitación con fosfato de calcio, electroporación, transfección mediada por policación (como DEAE-dextrano) , fusión de protoplastos , infecciones virales y microinyección . Preferentemente, la transfección es una transfección estable . Se favorece el método de transfección que proporcione una frecuencia de transfección óptima y la expresión de los genes heterologos en la línea y tipo de célula hospedera particular. Los métodos adecuados pueden ser determinados por procedimientos rutinarios . Para los transfectantes estables, las construcciones están integradas en el genoma de las células o en un cromosoma/mini-cromosoma artificial o colocados episomalmente con el fin de mantenerse establemente en la célula hospedera.

Un "gen marcador seleccionable" es un gen que solo permite que las células poten el gen que va a ser específicamente seleccionado a favor o en contra en presencia de un correspondiente agente de selección. A modo de ilustración, un gen de resistencia a los antibióticos puede ser usado como un gen marcador seleccionable positivo que permite que la célula hospedera transformada con el gen sea positivamente seleccionada a favor en presencia del correspondiente antibiótico; una célula hospedera no transformada o sería capaz de crecer o sobrevivir bajo las condiciones del cultivo de selección. Los marcadores seleccionables pueden ser positivos, negativos, o bifuncionales . Los marcadores seleccionable positivos permiten la selección de células que portan el marcador confiriendo resistencia a un fármaco o compensando un defecto metabólico o catabólico en la célula hospedera. Por el contrario, los marcadores de selección negativos permiten que las células que portan el marcador sean selectivamente eliminadas. Por ejemplo, usando el gen HSV-tk como un marcador se hará que las células sean sensibles a agentes como aciclovir o glancicovir. Los genes marcadores seleccionables usados en la presente invención, que incluyen los genes seleccionables y araplificables, incluirán imitantes y variantes tratados por ingeniería genética, fragmentos, equivalentes funcionales, derivados, homólogos y fusiones del gen marcador seleccionable nativo en la medida en que el producto codificado retenga la propiedad seleccionable. Los derivados útiles tienen generalmente una similaridad de secuencias sustancial (al nivel de aminoácidos) en regiones o dominios del marcador seleccionable asociado con la propiedad seleccionable. Se ha descrito una diversidad de genes marcadores, incluidos marcadores bifuncionales (es decir, positivos/negativos) (véase, por ejemplo, los documentos WO 92/08796 y WO 94/2813) incorporados como referencia a la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, los genes seleccionables comúnmente usados con células eucarióticas incluyen los genes para aminoglicósido-fosfotransferasa (APH) , higromicina-fosforotransferasa (HYG) , dihidrofolato-reductasa (DHFR) , timidina-quinasa (TK) , glutamina-sintetasa, aspargina-sintetasa y genes que codifican resistencia a la neomicina (G418) , puromicina, histidinol D, bleomicina y fleomicina . La selección se puede hacer también por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) usando, por ejemplo, un marcador de la superficie celular, ß-galactosidasa bacteriana o proteínas fluorescentes (por ejemplo, proteínas fluorescentes verdes (GFP) y sus variantes de Aequorea victoria y Renilla reniformis u otras especies; proteínas fluorescentes rojas, proteínas fluorescentes y sus variantes de Discosomas u otras especies) para seleccionar células recombinantes . De acuerdo con lo expuesto en la presente memoria descriptiva, la presente invención proporciona también un método para la expresión de un gen anti-apoptosis , un gen marcador amplificable y seleccionable y al menos un gen de interés en una célula hospedera. Dicho método comprende las etapas: (i) introducir en una población de células hospederas, preferentemente en una población de células hospederas de hámster, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen anti-apoptosis, un gen marcador amplificable y seleccionable y al menos un gen de interés, en donde dichos genes están operativamente conectados al menos a una secuencia reguladora que permite la expresión de dichos genes, y (ii) cultivar dicha población de células hospederas bajo condiciones en las que se expresen dichos genes. Los métodos que exponen a un experto en la técnica el modo de introducir uno o más polinucleótidos en una célula hospedera se ilustran con los ejemplos descritos con anterioridad. Además de ello, se proporcionan también ejemplos por medio de la invención del modo en que uno o más genes pueden ser conectados con al menos una secuencia reguladora que permita la expresión de dichos genes. Además, se describe también que se prefiere disponer al menos el gen an i-apoptosis y el gen marcador amplificable y seleccionable en estrecha proximidad espacial para permitir una amplificación más eficaz del gen anti-apoptosis. Las células hospederas, adecuadas para expresar dichos genes, son las mencionadas por l invención. Las células adecuadas de un gen anti-apoptosis se citan en la Tabla 2. Es preferida la expresión de cualquiera de las secuencias que codifican BCL-xL o BCL-2, más preferida es cualquier - secuencia que codifica BCL-xL, incluso más preferida es cualquier secuencia codificadora de BCL-xL de origen humano o de hámster. En una realización preferida adicional de ese método, las células hospederas que expresan conjuntamente incluyen cualquiera de las secuencias que codifican uno cualquiera de los marcadores amplificables seleccionables citados en la Tabla 3. Es incluso más preferido un método en el que las células hospederas comprenden una secuencia que codifica un BCL-xL heterólogo y también las secuencias que codifican uno cualquiera de los marcadores amplificables seleccionables citados en la Tabla 3. Lo más preferido es un método en el que la células hospedera comprende las secuencias que codifican un BCL-xL heterólogo y DHFR, especialmente si la secuencia codificadora de BCL-xL es de origen humano o de hámster.

Los métodos proporcionados por la presente invención permiten a un experto en la técnica generar nuevas células hospederas, particularmente para fines de producción, que muestran una supervivencia celular aumentada atribuida a una muerte celular programada retrasada o inhibida. Se han encontrad estrategias ventajosas que aumentan enormemente la viabilidad y productividad de las células, hechas crecer constantemente en suspensión y, especialmente, en un medio exento de suero. Las células según esta invención son altamente adecuadas para la producción de diversos polipéptidos deseados. Las células hospederas genéticamente modificadas descritas en la presente memoria descriptiva no solamente codifican los genes que son responsables de una supervivencia celular mejorada, por ejemplo, un gen anti-apoptosis y un gen marcador seleccionable y amplificable, sino opcionalmente de cualquier gen de interés que codifique un péptido deseado. Consecuentemente, la presente invención proporciona también a los expertos en la técnica un procedimiento para producir una proteína de interés en una célula hospedera, que comprende (i) cultivar cualquiera de las células hospederas de esta invención bajo condiciones que sean favorables para la expresión del gen anti-apoptosis y el (o los) gen (es) de interés) y (ii) aislar la proteína de interés de las células y/o la materia sobrenadante del cultivo celular. También se proporciona el uso de dichas células para la producción de al menos una proteína deseada codificada por un gen de interés. Las proteínas deseadas son las anteriormente mencionadas. Especialmente, las proteínas/polipéptidos deseados son, por ejemplo, pero sin limitación, insulina, factor de crecimiento de tipo insulina, hGH, tPA, citoquinas como interleucinas (IL) , por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, interferón (IFN) alfa, IFN beta, IFN gama, IFN omega o IFN tau, factor de necrosis tumoral (TNF) como TNF alfa y TNF beta, TNF gamma, TRAIL; G-CSF, GM-CSF, M-CSF, MCP-1 y VEGF. También está incluida la producción de eritropoyetina o cualquier otro factor de crecimiento hormonal . El método según la invención puede ser también ventajosamente usado para la producción de anticuerpos o sus fragmentos. Estos fragmentos incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab (Fragmento de unión a antígeno = Fab) . Los fragmentos Fab consisten en las regiones variables de las dos cadenas que se mantienen conjuntamente en la región constante adyacente. Estas pueden estar formadas por digestión de proteasas, por ejemplo, con papaína, a partir de anticuerpos convencionales, pero se pueden producir también fragmentos Fab similares mientras tanto por ingeniería genética. Adicionalmente , los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos F(ab')2, que pueden ser preparados por escisión proteolítica con pepsina. Usando métodos de ingeniería genética, es posible producir fragmentos de anticuerpos acortados que consisten solamente en las regiones variables de la cadena pesada (VH) y de a ligera (VL) . Estos se denominan fragmentos Fv (Fragmento variable = fragmento de la parte variable) . Como estos fragmentos Fv carecen del enlace covalente de las dos cadenas por las cisteínas de las cadenas constantes, los fragmentos Fv a menudo están estabilizados. Es ventajoso unir las regiones variables de la cadena pesada y ligera por un fragmento de péptido corto, por ejemplo, de 10 a 30 aminoácidos, preferentemente 15 aminoácidos. De esta forma se obtiene una cadena única de péptido que consiste en VH y VL, unidos por un conector péptido. Una proteína de anticuerpo de este tipo es conocida como Fv de cadena única (scFv) . Ejemplos de proteínas de anticuerpo scFv de este tipo conocido de la técnica anterior se describen por Huston et al. (1988, PNAS 16:5879-5883). En los últimos años, se han desarrollado diversas estrategias para preparar scFv como un derivado multimero. Esto está destinado a conducir, en particular, los anticuerpos recombínantes con propiedades mejoradas farmacocinéticas y de biodistribución, así como con una avidez de unión aumentada. Con el fin de conseguir la multimerización del scFv, se prepararon scFv como proteínas de fusión con dominios de mul imerización. Los dominios de multimerización pueden ser, por ejemplo, la región CH3 de una IgG o una estructura de rizo enrrollado (estructuras helicoidales) como los dominios Leucin-zipper. Sin embargo, hay también estrategias en las que se usa la interacción entre las regiones VH/VL del scFv para la multimerización (por ejemplo, di-, tri- y penta-estructuras) . Por diestructura el experto en la técnica entiende un derivado de scFv homodímero divalente. El acortamiento del Linker de una molécula de scFv hasta 5-10 aminoácidos conduce a la formación de homodimeros en los que tiene lugar una superposición entre cadenas de VH/VL. Las diaestructuras pueden ser adicionalmente estabilizadas mediante la incorporación de puentes de disulfuro. Ejemplos de proteínas de dxaestructura-anticuerpo de la técnica anterior se pueden encontrar en la publicación de Perisic et al. (1994, Structure 2:1217-1226). Por miniestructura el experto en la técnica entiende un derivado de scFv homodímero y divalente. Consiste en una proteína de fusión que contiene la región CH3 de una ínmunoglobulina, preferentemente IgG, lo más preferentemente IgGl como la región de dimerización que está conectada al scFv a través de la región de Hinge (por ejemplo, también a partir de IgGl) y una región Linker. Ejemplos de proteínas de minianticuerpo-anticuerpo de la técnica anterior se pueden encontrar en la publicación de Hu et al. (1996, Cáncer Res. 56 :3055-61) . Por triaestructura el experto en la técnica entiende: un derivado de csFv homotrímero y trivalente (Kortt et al. 1997 Protein Engineering 10:423-433) . Los derivados de scFv en los que los VH-VL están fusionados directamente sin una secuencia conectora, conducen a la formación de trímeros. El experto en al técnica será también conocedor de los denominados minianticuerpos que tienen una estructura bi-, tri o tetra-valente y derivan de scFv. La multimerización se lleva a cabo mediante estructuras de rizos enrollados di-, tri o tetra-meros (Pack et al., 1993 Biotechnology 11:1271-1277; Lovejoy et al. 1993 Science 259:1288-1293; Pack et al., 1995 J. Mol. Biol. 246:28-34). Las células hospederas preferidas de la presente invención son las descritas en la presente memoria descriptiva y que están siendo caracterizadas por una supervivencia celular mejorada. En particular, son preferidas las células hospederas genéticamente modificadas mediante cualquier método según esta invención, que comprendan las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen anti-apoptosis, un gen marcador amplificable y seleccionable y al menos un gen de interés. Son más preferidas las células hospederas que comprenden copias múltiples de esos genes, al menos del gen anti-apoptosis y el gen marcador amplificable y seleccionable . Múltiples copias de esos genes se pueden obtener mediante los métodos también descritos en la- presente memoria descriptiva, por ejemplo, por procedimientos de amplificación génica y/o proporcionando células hospederas con copias múltiples de genes por cualquier otra vía, conocida por un experto en la técnica . (por ejemplo, introduciendo concatémeros del (o de los gen (es) ) . Los genes anti-apoptosis adecuados son, aunque sin limitación, los citados en la Tabla 2. Son preferidas las células hospederas que comprenden copias múltiples de un ge que codifica BCL-xL y copias múltiples de uno cualquiera de los genes marcadores amplificables y seleccionables citados en la Tabla 3. El gen marcador amplificable y seleccionable más preferido es un gen que codifica DHFR. Las células hospederas adecuadas para la producción de proteínas muestran sobreexpresión de la proteína antiápoptosis que está aumentada al menos 30 veces, preferentemente al menos aproximadamente 50 veces, incluso más preferentemente al menos aproximadamente 100 veces aumentada en comparación con el nivel de expresión de dicha proteína en células hospederas que no están modificadas según cualquier método de esta invención. Además de ello, es adecuada una población de células hospederas que muestra una viabilidad de al menos aproximadamente 50% cuando se cultiva durante 9 días. Además de ello, son adecuadas y preferidas las células hospederas de la presente invención que muestran una viabilidad de- al menos aproximadamente 60% después de 8 días de cultivo. Adicionalmente , las células hospederas son adecuadas en el sentido de esta invención cuando al menos un 75% de la población celular es viable durante al menos 7 días. En otra realización, es adecuada y preferida una población de células hospederas que muestra una viabilidad celular de al menos aproximadamente 85% después de un cultivo de 6 días. En el caso de que la anti-apoptosis codifique una viabilidad células de BCL-xL de aproximadamente 60% después de un cultivo de 9 días, 75% después de un cultivo de 8 días y aproximadamente 85% de un cultivo de 7 días, se pueden obtener (por ejemplo, véase la Figura 5. También, son particularmente adecuadas las células hospederas que tienen un aumento de la supervivencia de al menos aproximadamente 20% después de un cultivo de 6, 7, 8 ó 9 días en comparación con la población celular parental , que no es modificada por métodos de amplificación génica. Son más preferidas las poblaciones de células hospederas que tienen un aumento de la supervivencia de al menos aproximadamente 30%, e incluso más preferidas son las poblaciones de células hospederas que tienen un aumento de la supervivencia de aproximadamente al menos 50% después de un cultivo de 6, 7, 8 ó 9 días, en comparación con la población de células parentales.

Las células hospederas adecuadas o la población de células hospederas en el sentido de la presente invención incluyen células de hámster, preferentemente células BHK21, BHK TK", CHO, CH0-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX Bl y CHO-DG44 o los derivados/progenies de cualquiera de estas líneas celulares. Son particularmente preferidas CH0-DG44, CHO-DUKX, CH0-K1 y CHK21, e incluso más particularmente células CH0-DG44 y CHO-DUKX. En una realización adicional de la presente invención, las células hospederas significan también células de mieloma de múridos, preferentemente NSO y SP2/0 o losderivados/progenies de cualquiera de estas lineas celulares. Sin embargo, los derivados/progenies de esas células, y otras células de mamíferos, incluidas pero sin limitación las líneas celulares humanas, de ratones, ratas, monos y roedores, o las células eucarióticas , incluidas pero sin limitación las células de levaduras, insectos y plantas, se pueden usar también en el sentido de esta invención para fines de producción. La selección de las células hospederas recombinantes que muestran altos niveles aumentados de viabilidad y expresión de una proteína deseada, es generalmente un procedimiento de múltiples etapas. La estrategia de selección depende de si las células son co-transfectadas al menos por la totalidad de tress genes relevantes (gen anti-apoptosis, ge (es) marcador(es) amplificable (s) y seleccionable (s) , gen(es) de interés y, opcionalmente , gen (es) marcador (es) de selección adicional) en paralelo, tanto si el (o los) gen (es) de interés se introduce (n) en las células que ya muestran una viabilidad celular aumentada como se describe en la presente memoria descriptiva, como si el (o los) gen (es) anti-apoptosis junto con un marcador amplificable y seleccionable se introducen en células hospederas que ya expresan un (os) ge (es) de interés. En el primer caso, las células transfectadas son apartadas o seleccionadas en cuanto a la expresión de cualquiera de los marcadores de selección co-transfectados con el gen de interés, para identificar las células que han incorporado el (o los) gen (es) de interés. Normalmente, las células hospederas transfectadas son sometidas a selección en cuanto a la expresión del (o de los) marcador (es) seleccionable (s) cultivando en un medio de selección, por ejemplo, durante aproximadamente 2 semanas. A continuación de eso, las células son expuestas por etapas a cantidades sucesivamente crecientes del (o de los) agente (s) de selección para co-amplificar las secuencias de ácidos nucleicos que codifican al menos el (o los) gen (es) anti-apoptosis, el (o los) gen (es) marcador (es) amplificable (s) y seleccionable (s) y el (o los) gen(es) de interés hasta que se obtenga una expresión suficiente del (o de los) producto (s) deseado (s) heterólogo (s) y también el (o los) producto(s) de gen (es) anti-apoptosis . Cada etapa de la selección se puede realizar sobre acumulaciones de células o se puede ¦ combinar con una selección de clones, por ejemplo, por dilución limitada. La selección puede estar apoyada por una clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) si se usa un marcador apropiado como GFP para la selección. En el segundo caso, las células hospederas adecuadas son transfectadas por medio de al menos el (o los) gen (es) de interés y el (o los) gen (es) marcador (es) seleccionable (s) , opcionalmente un gen amplificable y seleccionable, que difiere el gen marcador amplificable y seleccionable usado anteriormente para generar las células hospederas de viabilidad aumentada. Posteriormente las células transfectadas son apartadas o seleccionadas al menos en cuanto al marcador de selección co-transfectado con el gen de interés, para identificar las células que han incorporado el gen de interés. Normalmente, las células hospederas transfectadas son sometidas a selección en cuanto a la expresión del (o de los) marcado (es) seleccionable (s) cultivando en el medio de selección. Opcionalmente, el medio de selección contiene también el agente selectivo que es específico para el marcador amplificable y seleccionable usado con anterioridad para generar una célula hospedera de viabilidad mejorada. La etapa de selección se puede realizar sobre acumulaciones celulares o puede ser combinada con una selección de clones, por ejemplo, por dilución limitada. La selección puede estar apoyada por una clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) si se usa un marcador apropiado como GFP para la selección. Opcionalmente, las células pueden experimentar etapas adicionales de amplificación para aumentar el número de copias al menos del gen de interés, si se usó otro marcador amplificable y seleccionable para la transfeccion. En el tercer caso, las células hospederas recombinantes o las lineas celulares de producción que ya expresan el (o los) gen (es) de interés son co-transfectadas con el (o los) gen (es) anti-apoptosis, el (o los) gen (es) marcador (Es) amplificable (s) y seleccionable (s) y, opcionalmente, con gen (es) marcador (es) de selección adicional (es) y/o gen (es) de interés, con lo que los marcadores diferentes de los usados para establecer la línea celular de producción recombinante son usados para la selección. Las células hospederas transíectadas son sometidas a selección en cuanto a la expresión del (o de los) gen (es) marcador (es) introducido (s) cultivando en medio de selección durante aproximadamente 2 semanas. Opcionalmente, el medio de selección contiene también el agente selectivo que es específico para el (o los) marcador (es) seleccionable (s) usado (s) antes de generar la línea celular deproducción recombinante. A continuación de eso, las células son expuestas por etapas a cantidades sucesivamente crecientes de los agentes de selección de amplificación para amplificar conjuntamente al menos el (o los) gen (es) anti-apoptosis y el gen marcador amplificable y seleccionable y, opcionalmente, el (o los) gen (es) co-transfectado (s) de interés hasta que se obtenga una expresión suficiente de al menos el producto de gen anti-apoptosis. Cada etapa de la selección se puede realizar sobre acumulaciones de células o puede ser combinada con una selección de clones, por ejemplo, por dilución limitada. La selección puede ser soportada por clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) , si se usa un gen marcador apropiado como GFP para la selección. La proteina de interés es recuperada preferentemente del medio de cultivo en forma de un polipéptido segregado, o puede ser recuperada de lisados de células hospederas si es expresada sin una señal secretora. Es necesario purificar la proteina de interés de otras proteínas recombinantes y proteínas de células hospederas de forma que se obtengan preparaciones sustancialmente homogéneas de la proteína de interés. En una primera etapa, las células y/o debris celular en forma de partículas son separados del medio de cultivo o lisado. El producto de interés posteriormente es purificado de proteínas solubles contaminantes, polipéptidos y ácidos nucleicos, por ejemplo, por columnas de fraccionamiento sobre inmunoafinidad o de intercambio iónico, precipitación en etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía Sephadex, cromatografía sobre sílice o en una resina . de intercambio catiónico como DEAE. En general, los métodos que enseñan a un experto en la materia sobre el modo de purificar una proteína heteróloga expresada por células hospederas son bien conocidos en la técnica. Estos métodos se describen, por ejemplo, por Harris y Angal, "Protein Purification Methods" en Rickwood y Hames eds . , The Practical Approach Series, IRL Press (1995) o por Robert Scopes, "Protein Purification", Springer-Verlag (1988) , que se incorporan ambas como referencia a la presente memoria descriptiva. Un objeto general de la presente invención es proporcionar a un experto en la técnica células hospederas que muestren una supervivencia celular aumentada. La supervivencia celular puede ser aumentada inhibiendo o retrasando la muerte celular programada, por ejemplo, la apoptosis, por cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria descriptiva. La forma más suficiente de aumentar la supervivencia celular en el sentido de esta invención es proporcionar una célula hospedera con copias múltiples de al menos un gen anti-apoptosis introducido heterólogo y cultivar las células hospederas bajo condiciones que permitan la expresión de esas copias de genes anti-apoptosis. La presente invención proporciona también células hospederas que comprenden al menos 5 copias de un gen anti-apoptosis heterólogo. También se proporcionan células hospederas que comprenden al menos 10 copias de un gen anti-apoptosis heterólogo. Además de ello, la presente invención proporciona también células hospederas que comprenden al menos 20 copias, en otra realización al menos 50 copias y, en una realización adicional, el menos 100 copias del (o de los) gen (es) anti-apoptosis heterólogo (s) . La presente invención proporciona varios métodos a un experto en la técnica sobre el modo de generar estas células hospederas, que comprenden copias múltiples de un gen anti-apoptosis heterólogo. Esos métodos incluyen, sin limitación, los anteriormente descritos: por ejemplo, (i) la amplificación por etapas de al menos un gen anti-apoptosis introducido heterólogo dirigida por un agente selectivo, (ii) aumentar la dosificación de genes de al menos un gen anti-apoptosis introducido heterólogo mediante el uso y la introducción de plásmidos episomales como se describió anteriormente, (iii) o usar sistemas de amplificación in vitro basados en DNA-concatemeros como se describe, por ejemplo, por Monaco et al., 1996, que se incorpora como referencia a la presente memoria descriptiva. Los genes anti-apoptosis adecuados son los citados en la Tabla 2 o los que se describen en esta memoria en general, particularmente codificados por cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos citadas en la Tabla 2, o por cualquiera de las secuencias codificadas por la SEQ ID n° 1, SEQ ID n° 3, SEQ ID n° 5, SEQ ID n° 7, SEQ ID n° 9 o SEQ ID 'n° 11, o cualquier fragmento, variante o mutante (degenerativa y no degenerativa) funcional de la misma. Es preferido un hospedera que comprenda copias múltiples de un gen que codifique BCL-xL o BCL-2, más preferido el BCL-xL, e incluso más preferido BCL-xL de origen humano o de hámster. Incluso más preferido es una célula hospedera que comprenda múltiples copias de un ácido nucleico que tenga la secuencia de cualquiera de la SEQ ID n° 1, SEQ ID n° 3, SEQ ID n° 5, SEQ ID n° 7, SEQ ID n° 9 o SEQ ID n° 11, o cualquier fragmento, variante o mutante (degenerativa y no degenerativa) funcional de la misma. En una realización adicional, se prefiere el gen anti-apoptosis que codifica BCL-2 o que tiene la SEQ ID n° 2. También se prefieren células hospederas que comprendan genes anti-apoptosis diferentes, por ejemplo, seleccionados entre los citados en la Tabla 2 o cualesquiera de los otros descritos en esta memoria. En una realización más preferida de esta invención, al menos una copia de la mezcla codifica un BCL-xL heterólogo. Las células hospederas adecuadas son cualquiera de las descritas en la presente invención, por ejemplo, las mencionadas en la Tabla 1. Son más preferidas células hospederas de hámster o de origen múrido, por ejemplo, células de mieloma de múridos. Son incluso más preferidas las células CHO o BHK, particularmente CH0-CG44, BHK21, CHK TIC, CHO, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX Bl y células CHO-DG44 de los derivados/progenies de cualquiera de estas líneas celulares. Las más preferidas son las células CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-K1 y BHK21, particularmente CH0-DG44 y CHO-DUKX. Las células hospederas anteriormente descritas pueden ser adicionalmente modificadas introduciendo al menos un gen heterólogo de interés, de forma que la presente invención se refiere también a células hospederas que comprenden copias múltiples de un gen anti-apoptosis como se describió anteriormente, y que comprenden adicionalmente al menos un gen de interés . La práctica de la presente invención empleará, salvo que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología celular, biología molecular, cultivo de células, inmunología y similares, que están dentro de los conocimientos de un experto en la técnica. Estas técnicas se describen más en detalle en la bibliografía actual. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1987, updated) ; Brown ed. , Essential Molecular Biology, IRL Press (1991) ; Goeddel ed. , Gene Expression Technology, Academic Press (1991); Bothwell et al. eds . , Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Bartlett Publ . (1990); u et al . , eds . , Recombinant DNA Methodology, Academic Press (1989) ; Kriegler, Gene - Transfer and Expréssion, Stockton Press (1990) ; McPherson et al . , PCR: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1991); Gait ed. , Oligonucleotide Synthesis (1984); Miller & Calos eds., Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (1987); Butler ed., Mammalian Cell Biotechnology (1991); Pollard et al., eds., Animal Cell Culture, Humana Press (1990); Freshney et al., eds.. Culture of Animal Cells, Alan R. Liss (1987); Studzinski, ed. , Cell Growth and Apoptosis, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Presss (1995) ; Melamed et al., eds., Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss (1990) ; Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons, Inc. (updated) ; Wirth & Hauser, Genetic Engineering of Animáis Cells, in: Biotechnology Vol . 2, Pühler ed. , VCH, Weinheim 663-744; the series Methods of Enzymology (Academic Press, Inc.), and Harlow et al., eds., Antibodies: A Laboratory Manual (1987) . Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en esta memoria descriptiva son indicativas del nivel de conocimientos de los expertos en la técnica al que se refiere esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes citadas en la presente memoria descriptiva se incorporan a la misma como referencia en su totalidad, con el fin de describir más en detalle el estado de la técnica a que se refiere esta invención. La invención generalmente descrita con anterioridad se comprenderá más fácilmente mediante la referencia a los siguientes ejemplos, que se incluye a la presente memoria descriptiva meramente para fines ilustrativos de ciertas realizaciones de la presente invención, y no están destinados a limitar la invención en modo alguno. EJEMPLOS Abreviaturas CHO : ovario de hámster chino DHFR: dihidrofolato-reductasa ELISA: ensayo inmunoabsorbente de unión enzimática FACS : clasificador celular activado por flúores-cencía FITC: isotiocianato de fluoresceíná HRPO: peroxidasa de rabanillo HT: hípoxantina y timidina IRES : sitio de entrada de ribosoma interno MTX: metotrexato PAGE: electroforesis de gel de poliacrilamida PBS : solución salina tamponada con fosfato PCR: reacción en cadena de la polimerasa PI : yoduro de propidio RT-PCR: transcriptasa inversa - reacción en cadena de la polimerasa SEAP: fosfatasa alcalina segregada SDS : dodecil-sulfato de sodio sICAM: molécula de adhesión intracelular soluble Métodos 1. Cultivo celular Se incubó CH0-DG44/dhfr (Urlaub et al., 1983), permanentemente crecidas en suspensión en el medio exento de suero CHO-S-SFMII (Invitrogen, Carlsbad, CA) complementado con hipoxantina y timidina (Invitrogen, Carlsbad, CA) en matraces de cultivo celular a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenia 5% de C02. Las células fueron sembradas a una concentración de 2 x 105 células/ml en medio de reciente aportación cada dos a tres días y las suspensiones celulares (500 µ?) fueron analizadas en cuanto al número y la viabilidad celular usando un contador celular CASY1 (Schaerfe System; Alemania) . La viabilidad se confirmó también por exclusión en colorante de azul de trípano. La clonación celular única se hizo por una tecnología de dilución estándar en cámaras de 96 pocilios. Para la selección basada en DHFR de células CHO-DG44 transíectadas estables, se usó medio de CHO-S-SFMII sin hiposantina ni timidina. La amplificación de genes basada en DHFR se consiguió añadiendo MTX 20 nM (Sigma, Alemania) como agente de selección de amplificación para el medio. Para un cultivo por tandas, los clones fueron sellados por duplicado en matraces de cultivo celular (T25) que contenían 12 mi de medio apropiado y se mantuvieron durante 7 ó 9 días en el incubador sin añadir ningún medio de nueva aportación. Cuando las células CHO-DG44 fueron cultivadas en presencia de suero, el medio CHO-S-SFMII fue complementado con 10% de suero de ternera fetal (Sigma, Alemania) . Para la pasada, las células fueron tripsinizadas (en presencia de suero, las CHO-DG44 se hicieron adherentes) y fueron selladas a una concentración de 2 x 105 células/ml en medio de nueva aportación cada dos a tres días . 2. Vectores de expresión El vector básico pBID, basado en el vector pAD-CMV (Werner et al., 1998) hace de mediador en la expresión constitutiva de los genes heterólogos accionada por el promotor/mej orador C V. Además, el pBID codifica el mini-gen dhfr como marcador seleccionable y amplificable (véase, por ejemplo, el documento EP 0,393,438). El sICAM fue aislado como fragmento de HindIIl/SalI a partir de pAD-sICAM (Werner et al., 1998) y fue clonado en los sitios correspondientes (HindIII y Salí) del pBID, dando lugar a pBID-sICAM. El homólogohumano de bcl-xL (SEQ ID n° 1, número de acceso de GenBank Z23115) y bcl-2 (SEQ ID n° 3, número de acceso de GenBank M13995) fueron clonados en los vectores de expresión como sigue. Para la construcción de pBID-bcl-2, el bcl-2 en primer lugar fue amplificado por PCR a partir de RNA total humano y subclonado en el vector de clonación pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, " CA) A partir de ahí, fue cortado usando EcoRI y ligado en el correspondiente - sitio -EcoRI de pBID. Usando Klenow-DNA-polimerasa, el fragmento IRES-bcl-xL de pDD6 cortado e introducido en Pmel (Fussenegger et al . , 1998) fue clonado en el sitio Xbal introducido de pBID-sICAM dando lugar al vector de expresión bicistrónico pBID-sICAM-bcl-xL. Este vector fue la base para la construcción de pBID-bcl-xL eliminando el elemento sICAM-IRES de pBID-sICAM-bcl-xL por digestión y religadura de Sall/Xhol. El pSEAP2-Control alberga la fosfatasa alcalina segregada humana bajo control del promotor SV40 (Clontech, Palo Alto, CA) . el pGL2-Control contiene la luciferasa de luciérnaga accionada por el promotor SV40 (Promega, Madison, EE.UU.). 3. Transfecciones transitorias y estables Se realizaron transfecciones usando el reactivo Fugene6 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) . Por cada transfección se sembraron células CH0-DG44 de crecimiento exponencial 0,6 x 106 en 2 mi de medio CHO-s.-SFMII complementado con HT, en un pocilio de una cámara de 6 pocilios. Se usaron un total de 4 µg de plásmido-DNA y 10 µ? de reactivo Fugene6 para cada transfección, siguiendo el protocolo del fabricante. Las transfecciones transitorias se realizaron por triplicado y la materia sobrenadante y las células fueron recolectadas 48 horas después de la transfección. Para las transfecciones estables, el medio fue sustituido con medio CHO-s-SFMII exento de HT 72 horas después de la transfección y las poblaciones de- células mixtas se seleccionaron durante dos semanas antes del análisis o clonando con cambios en el medio cada 3 a 4 días. Se hizo una única clonación celular por tecnología de dilución estándar. Para la amplificación de genes heterólogos, integrados en los cromosomas de las células hospederas, se sembraron células únicas derivadas de una población de células hospederas mixtas genéticamente modificadas en cámaras de 96 pocilios que contenían 200 µ? de medio CHO-S-SFMII exento de HT complementado con MTX 20 nM. Se seleccionaron clones únicos amplificados durante 3 semanas y se expandieron en matraces de cultivo de células . 4. sICAM ELISA Los títulos de sICAM en las materias sobrenadantes fueron cuantificados mediante ensayo ELISA con protocolos estándar (Ausubel et al., 1994, actualizado) usando dos anticuerpos monoclonales específicos para sICAM desarrollados en el propio laboratorio (como se describe, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. n° 5.284.931 y 5.475.091) con lo que uno de los anticuerpos es un anticuerpo conjugado a HRPO. La proteína sICAM purificada se usó como un patrón. Las muestras fueron analizadas usando un lector Spectra Fluor Plus (TECA , Crailsheim, Alemania) .

.. Ensayos de enzimas reporteros La actividad enzimática reportera de luciferasa de luciérnaga se determinó con el sistema de ensayo de luciferasa de Promega (Madison, WI) según el protocolo. La actividad de SEAP se midió con el estuche de ensayo Great EscAPe SEAP de la empresa Clontech (Palo Alto, CA) según el protocolo. Las muestras fueron analizadas usando un lector Spectra Fluor Plus (TECA , Crailsheim,Alemania) . 6. Análisis de transferencia Western La expresión de BCL-2 y BCL-xL de las células hospederas parentales CHO-DG44 y las células hospederas genéticamente modificadas se confirmó por análisis de transferencia Western. Se extrajeron aproximadamente 1 x 10s células en 500 µ? dee tampón de lisis (1% de Tritón X-100, NaCl 15 mM, Tris-DC1 10 mM, pH 7,5, con 50 g/ml de fluoruro de fenil-metanosulfonilo y 200 µ? de la combinación inhibidora de proteasa Complete de la empresa Roche Diagnostics) . Los Usados fueron clarificados por centrifugación a 13.000 x g durante 10 minutos. Las concentraciones de proteínas se determinaron mediante un ensayo Bradford según el protocolo del fabricante (Bio-Rad Laboratories GmH, Munich, Alemania) . Los extractos fueron seguidamente almacenados a -80 °C hasta que fuera necesario. Cantidades iguales de proteína (20 ^g) fueron sometidas a 10% de SDS-PAGE (Novex; Invitrogen, Calsbad, CA) y postriormente fueron sometidas a electrotransferencia sobre membranas de nitrocelulosa (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Después de bloquear con leche desnatada al 5%, las proteínas fueron detectadas usando anticuerpos monoclonales de ratón de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) específicos para BCL-2 o BCL-xL. Las proteínas fueron visualizadas con un anticuerpo secundario acoplada a peroxidasa anti-ratón (Dianova GmbH, Hamburgo, Alemania) usando el sistema de detección ECL (Amersham Biosciences, Freiburg, Alemania) . 7. Cuantiflcación de la apoptosis Los niveles de DNA fragmentados fueron cuantificados usando un ensayo TUNEL basado en fluorescencia (BD Biosciences PharMaingen, San Diego, CA) . Se recolectaron 1 x 10s células, se lavaron con PBS y fueron tratadas con solución de paraformaldehído al 1% en PBS durante 15 minutos a 4°C. A continuación de una etapa de lavado adicional usando PBS, las células fueron fijadas en etanol al 70% y analizadas según el protocolo del fabricante. Los perfiles de emisión de FITC y PI de 10.000 células por muestra fueron analizados usando un dispositivo FACSCalibur (Becton-Dickinson) . 8. Citometría de flujo de mitocondrias marcadas Se recolectaron 500.000 células por muestra, se lavaron con PBS y se trataron con paraformaldehído al 1% en PBS durante 15 minutos a 4°C. Después de una segunda etapa de lavado con PBS, las células estaban preparadas para la tinción basada en fluorescencia de sus mitocondrias . Se preparó una solución en PBS que contenía 500 pM de colorante MitoTracker Green FM selectivo para mitocondrias (Molecular Probes, Eugene, OR) a partir de una solución madre 1 mM. Las células fueron incubadas en 200 µ? de solución de tinción durante 15 minutos a 37 °C. Posteriormente, las células fueron lavadas dos veces con PBS, se volvieron a poner en suspensión en 400 µ? de PBS y se sometieron a análisis citométrico de flujo. Se determinó la emisión de fluorescencia verde de 10.000 células por muestra. 9. Ensayo de hibridización El análisis de hibridación de borrones de DNA o ARN utilizando sondas de DNA o ARN (>100 pb) se lleva a cabo de acuerdo con los protocolos convencionales descritos en Ausubel et al., 1994, actualizado. La especificidad de la hibridación se consigue en los lavados post-hibridación, en donde los parámetros críticos son la resistencia iónica de la solución de lavado final y la temperatura a la que se lleva a cabo el lavado. Las condiciones estrictas se consiguen llevando a cabo el lavado en 0,2xSSC/0,l% SDS a 65 °C. Para condiciones muy estrictas, el lavado se efectúa en 0,lxSSC/0,l% SDS a 65°C. Ejemplo 1: Sobre-expresión de supervivencia y genes de producto en modo transitorio y estable La sICAM (molécula de adhesión intercelular soluble 1) terapéutica del resfriado común compite con el receptor de ICAM en cuanto a la unión .a rinovirus y evita a interacción de este agente etiológico del resfriado común con el receptor de ICAM que es necesario para la entrada de células y la posterior infección (Bella et al., 1999; Marlin et al., 1990) . La valoración detallada de la expresión transitoria de los genes anti-ápoptosis bcl-2 o bcl-xL sobre la producción de cantidades iguales de sICAM pBID-sICAM fueron co-transfectos por triplicado con el pBID-bcl-2, pBID-bcl-xL o el testigo isogénico pBID (Figura 1) en el CHO-DG44 deficiente en dhfr. Las células se hicieron crecer permanentemente en suspensión en el medio exento de suero CHO-S-SFMII (Invitrogen, Carlsbad, CA) complementado con hipoxantina y timidina. Los títulos de sICAM en las materias sobrenadantes se cuantificaron 48 horas después de la transfección por ensayo ELISA usando anticuerpos específicos sICAM producidos en el laboratorio propio. Mientras que la expresión de BCL-2 redujo considerablemente la producción de sICAM a 10% del pBID testigo, la expresión de BCL-xL ectópico aumentó el rendimiento de sICAM en 60% (Figura 2A) . Estos datos fueron confirmados por los perfiles de expresión SEAP (intercambiando pBID-sICAM con testigo pSEAP2) demostrando que las características de producción observadas de BCL-2 y BCL-xL eran de un efecto general en lugar de uno combinado de expresión de sICAM/BCL-2 o sICAM/BCL-xL (Figura 2B) . También, con el fin de valorar si el impacto de la expresión de BCL-2 y BCL-xL sobre los parámetros de la producción celular est asociada o limitada con respecto a las proteínas de producto segregadas, se realizó un perfil de producción idéntico usando el reportero de luciferasa intracelular (intercambiando pBID-sICAM por testigo pGL2. Las características de producción de luciferasa se correlacionaron con los perfiles de expresión de SEAP y sICAM anteriormente mencionados, confirmando el impacto positivo (bcl-xL) y negativo (bel-2) de estos genes de supresión de la apoptosis sobre la productividad global de células CHO-DG44 (Figura 2C) . La producción reducida de proteínas deseadas a continuación de la expresión de BCL-2 ha sido observada también en células COS-7 (ATCC CRL-1651) , células CHO-K1 dependientes del anclaje (ATCC CCL-61) y CHO-DU X (ATCC CRL-9096) adaptadas para el crecimiento en suspensión. Aunque los experimentos de transfección transitoria hacen posible una información altamente fiable sobre la capacidad de ingeniería metabólica de los genes heterólogos sobre una amplia gama de tipos de células y números de copias, solamente las poblaciones mixtas estables pueden confirmar fuera de cualquier duda el fenotipo observado. Por lo tanto, se generaron los perfiles de los ciclos de sICAM de 6 poblaciones mixtas para cada configuración de pBID-sICAM/pBID-bcl-2, pBID-sICAM/pBID-bcl-xL y pBID-sICAM/pBID.

Las poblaciones celulares transfectadas fueron seleccionadas en cuanto a la expresión de los genes heterólogos por selección basada en DHFR en medio CHO-S-SFMII exento de HT. La Figura 3 muestra el rendimiento absoluto de sICAM producido por las poblaciones mixtas transfectadas estables durante un período de cultivo de 3 días . Cada valor representa una producción media de sICAM de todas las poblaciones sobre cinco pasadas, con lo que se tomó una muestra a cada pasada. Como se observa con las transfecciones transitorias, la expresión de BCL-2 tiene un impacto negativo sobre la producción de sICAM con títulos reducidos en 50%, mientras que la expresión de BCL-xL aumenta el rendimiento global de este agente terapéutico para el resfriado común en 30% en comparación con las poblaciones testigos tratadas por ingeniería para la expresión de solamente sICAM. Estos resultados que se correlacionan obtenidos en configuraciones de expresión transitorias y estables sugieren que el diseño de las estrategias de ingeniería anti-apoptosis solo deben considerarse a continuación de un cuidadoso análisis de los determinantes de supervivencia disponibles. Ejemplo 2: Efecto de la expresión génica amplificada por dhfr de bel -2 y bcl-xL sobre la viabilidad y la apoptosis de clones de células productoras de sICAM estables. Para la evaluación del efecto de la ingeniería anti-apoptosis sobre la viabilidad de líneas celulares CH0-DG44 transgérticas en un cultivo por tandas exento de suero, se seleccionaron para un análisis adicional las poblaciones celulares más productoras de sICAM de 6 poblaciones celulares mixtas cada una, generadas por co-transfección estable de CHO-DG44 con combinaciones de vectores p3ID-sICAM/pBID-bcl-2 , pBID-sICAM/pBID-bclxL o pBID-sICAM/pBID . Se realizaron dos procedimientos paralelos de clonación de células únicas por dilución celular limitada en cámaras de 96 pocilios, una en medio CHO-S-SFMII exento de HT (clones de células no amplificadas) y uno que incluía una única ronda de amplificación basada en DHFR inducida por MTX complementando el medio CHO-S-SFMII exento de HT con MTX 20 nM (clones de células amplificadas) . Los clones de células fueron seleccionados en cuanto a productores más elevados de sICAM por un ensayo ELISA y para cada configuración génica, se seleccionaron los dos clones celulares mejores para un análisis adicional. Además de pBID-sICAM, estos clones celulares contienen también una de las siguientes construcciones: (i) pBID (testigo de vector solamente) en HM I-1, HM I-2 (no amplificado) y HMNI-3, HMNI-4 (amplificado), (ii) pBID-bcl-2 en HM IBC-1, HM IBC-2 (no amplificado) y HMNIBC-3, HM IBC-4 (amplificado), (iii) pBID-bcl-xL en HM IBX-1, HMNIBX-2 (no amplificado) y HMNIBX-3, HM IBX-4 (amplificado) . La viabilidad de los clones celulares en un cultivo por tandas en matraces de cultivos celulares se verificó diariamente durante un período de. una semana. Como se observa en la Figura 4, todos los clones celulares no amplificados, incluido el testigo de vector solamente, exhibían perfiles de viabilidad similares que mostraban claramente el efecto despreciable de BCL-2 y BCL-xL sobre la viabilidad. A los 7 días la viabilidad cayó hasta aproximadamente 30-40% en todos los casos. Sin embargo, se observaron aumentos significativos de la viabilidad celular durante la fase de disminución de los clones que contenían genes heterólogos amplificados. El BCL-xL claramente rindió mejor que BCL-2 con respecto a la protección de la muerte celular (Figura 5) . En las líneas celulares que expresan BCL-xL (HMNIBX-3/4) había todavía un 70% de células viables en el cultivo en el día 9, en comparación con aproximadamente 60% en las líneas celulares que expresan BCL-2 (HMNIBC-3/4) y no había células viables en las líneas celulares testigos transgénicas (HM I-3/4) . Correlacionándose con un aumento en la viabilidad, los clones de las células amplificadas mostraron también una considerable reducción del porcentaje de células que iniciaron los programas de apoptosis, valorados en los días 2, 4 y 6 usando un ensayo TUNEL basado en fluorescencia (Figura 6) . Mientras que en el día 2 casi no se encontraron células apoptóticas en todas las configuraciones transgénicas, se observó un aumento significativo de los números de células apoptóticas en el día 4. El menor aumento hasta 5% se encontró en células que expresan BCL-xL, - seguidas de células que expresan BCL-2 con 10% y las células testigos transgénicas ya con 30% de células apoptóticas. En el día 6, la diferencia entre las diversas líneas celulares transfectadas fue incluso más pronunciada. El potencial supresor de apoptosis de BCL-xL es al menos 3 veces mayor en comparación con BCL-2, en el que un 30% de las células apoptóticas, en comparación con un 10% en las células que expresan BCL-xL, fueron encontradas en esta etapa. En las células testigos transgénicas, que no expresaban ningún gen anti-apoptosis heterólogo, el número de células apoptóticas ascendió ya a 60%. Con el fin de confirmar el estado de amplificación de los genes anti-apoptosis se realizaron análisis de transferencia Western dirigidos a BCL-2 y BCL-xL. Las Figuras 7A - 7B demuestran solamente expresión basal de BCL-2 (Figura 7A) y BCL-xL (Figura 7B) en la línea celular testigo transgénica HMNI-1 a niveles cercanos al límite de detección y comparables a las células parentales CH0-DG 4. Esto indica que la expresión génica de supervivencia no está regulada en sentido ascendente por una selección basada en DHFR, como se mostró que ocurría en un informe anterior a continuación de una selección mediada por G418, que desvió los resultados hacia una supervivencia aumentada (Tey et al., 2000a). Los perfiles de expresión de BCL-2 y BCL-xL se pudieron aumentar en al menos 80 a 100 veces y 30 a 40 veces, respectivamente, por la amplificación basada en DHFR en comparación con el testigo transgenico HMNI-1 y el CH0-DG44 parental (HMNIBC-3/4 y HMNIBX-3/4; Figura 12A y 12B) . En las lineas celulares transgénicas o amplificadas BCL-2 y BCL-xL, los niveles de expresión fueron aumentados menos de 10 veces. ESte nivel de proteína era evidentemente demasiado bajo para un suficiente efecto protector anti-apoptosis (Figura 5) . Se obtuvieron resultados comparables con células transíectadas con pBID-sICAM-bcl-xL, un vector de expresión con una configuración dicistrónica. En este ajuste, se inició la traducción de sICAM en el primer castrón de la unidad de transcripción, de una manera clásica dependiente de cap y de bcl-xL en el segundo cistrón de una manera independiente de cap, accionada por un elemento IRES derivado del virus de encefalomiocarditis . El marcador amplificable y seleccionable dhfr estaba contenido en una unidad de transcripción separa en el mismo vector. El análisis detallado de la ingeniería anti-apoptosis mediada por BCL-2 y BCL-xL ilustra que la expresión a nivel elevado de estos determinantes de supervivencia es necesaria con el fin de exhibir cualquiera de los efectos protectores significativos en células CHO-DG44 cultivadas permanentemente bajo condiciones de medio exento de suero.

Ejemplo 3: Determinación de los números de copias de genes por análisis de transferencia de puntos Los números de copias de los genes anti-apoptosis eterólogos bel -2 o bcl-xL integrados en el genoma de las células hospederas transfectadas CH0-DG44 se determinan por análisis de transferencia de puntos. Para estos fines, el DNA genómico es aislado de las líneas celulares transgénicas y CHO-DG44 parental usando el estuche de ensayo disponible en el comercio Blod & Tissue Kit de la empresa Qiagen (Hilden, Alemania) según el protocolo del fabricante. Diversas cantidades del DNA genómico, habitualmente entre 0,5 //g y 15 /xg, son aplicadas por duplicado en tampón alcalino a una membrana de Hybond N + nilón con carga positiva (Amersham Biosciences, Freiburg, Alemania) usando un colector unido a un dispositivo de succión (para un protocolo detallado, véase la publicación de Ausubel et al., 1994, actualizado) . La cantidad de DNA genómico que debe ser sometido a transferencia dependerá de la abundancia relativa de la secuencia diana que será posteriormente buscada por medio de una sonda de hibridación. Seguidamente . se lleva a cabo un análisis de hibridación para determinar la abundancia de las secuencias bcl-2 o bcl-xL en las preparaciones de DNA sometidas a transferencia. Siguiendo el protocolo del módulo de marcado de cebadores al azar de Gene Images (Amersham Biosciences, Freiburg, Alemania) , se generan sondas marcadas FITC-dUTP cebadas al azar y específicas para BCL-xL, usando el fragmento de 640 bp específico para bel-2 - obtenido mediante digestión con EcoRI de pBID-bcl-2 o el fragmento Pvull/Bcll de 730 bp específico para bcl-xL generado a partir de la digestión de pBID-bcl-xL en forma de una plantilla en la reacción de marcado. La hibridación se realiza durante una noche a 65 °C en una estufa de hibridación según el protocolo del módulo de marcado de cebadores al azar de Gene Images . Después de la hibridación, el filtro se lava dos veces con 2 x SSC/0,1% de SDS a 65°C durante 20 minutos antes de proceder al desarrollo del anticuerpo y la detección según el módulo de detección de Gene Images CDP-Star (Amersham Biosciences) . La cuantificación de las señales se realiza usando el sistema de formación de imágenes VDS-CL Imager System (Amersham Biosciences) . Las intensidades de las señales correspondientes a las señales específicas de bel-2 o bcl-xL del DNA genómico, aisladas a partir de las células transgénicas , son comparadas con una curva estándar de números de moléculas definidos del pBID-bcl-2 o el plásmido de expresión pBID-bcl-xL (números calculados sobre la base del peso molecular de los plásmidos) , respectivamente, y se usan para estimar la cantidad absoluta de DNA diana en las muestras de DNA genómico. Las señales de hibridación del DNA genómico de la línea celular parental CHO-DG4 , debidas a los genes bel-2 y bcl-xL endógenos, son sustraídas de las señales transgénicas . Los números de copias de las muestras transgénicas se dividen seguidamente por el contenido de DNA de cada muestra para obtener el número de copias de genes por célula y multiplicado por 5 pg, basado en un contenido de 5 pg de DNA por célula. Para la normalización de los contenidos de DNA entre las muestras que están siendo comparadas, parte del gen mbh-1 de hámster (homólogo 1 del motivo básico myc) es usado como una sonda génica testigo interna en una segunda reacción de hibridación sobre el mismo filtro después de retirar el filtro de las primeras sondas. Mediante este método, se pueden determinar las células hospederas genéticamente modificadas generadas introduciendo y amplificando el gen bel-2 o bcl-xL (por ejemplo, como se describe en la presente memoria descriptiva) que comprenden al menos 5, 10, 20 50 ó 100 copias del gen bel-2 o bcl-xL heterólogo . Ejemplo 4: Modulación del número de mitocondrias por aditivos de suero El requisito obvio para una dosificación elevada de BCL-2 o BCL-xL con el fin de conseguir un impacto significativo de la supervivencia sobre CHO-DG44 crecidas bajo condiciones exentas de suero dio lugar a especulaciones sobre si el contenido de mitocondrias y, por lo tanto, la sensibilidad respecto a la muestra celular programada es dependiente del suero. Esta hipótesis es incluso más convincente cuando se encontró que el suero era un factor clave para la ¦ rotección de la apoptosis y porque las mitocondrias son una plataforma principal de los moduladores de la muerte celular (como BCL-2 y BCL-xL) . Con el objetivo de determinar la dependencia del suero del contenido de mitocondrias específicas, se cultivaron células CHO-DG44 en suspensión en un medio CHO-S-SFMII exento de suero o en forma de células adherentes en medio CHO-S-SFMII complementado con 10% de FCS . A continuación del cultivo durante dos semanas bajo condiciones establecidas, se hizo un perfil de las células de ambos cultivos en cuanto a su contenido de mitocondrias específicas usando MitoTracker Green FM, un colorante fluorescente específico para mitrocondrias . Como el colorante MitoTracker Green Fm se acumula en las mitocondrias de una manera independiente del potencial de la membrana, es una herramienta bien establecida para la cuantificación de estos orgánulos (Metivir et al., 1998) . La tinción específica para mitocondrias aumentó significativamente en células cultivadas en ausencia de suero, en comparación con las células cultivadas en presencia de suero. Un análisis mediado por FACS cuantificó una subida de hasta 3 veces en el contenido de mitocondrias específicas (Figura 8) . Dada la clara amplificación de mitocondrias bajo condiciones exentas de suero, se puede sugerir directamente que una ingeniería anti-apoptosis satisfactoria de líneas celulares independientes · de suero requiere niveles de expresión aumentados de BCL-2 o BCL-xL para compensar los aumentos específicos en las maquinarias de la apoptosis asociados con estos orgánulos. Ejemplo 5: Clonación del DNAc de bcl-xL de hámster Se diseñaron el siguiente cebador del extremo 5' (Bel forl: 5 ' -GCCACCATGTCTCAGAGCAAACCGGGAG-3 ' ; SEQ ID NO : 13) y el cebador del extremo 3' (Bel revi: 5'- TCAYTTCCGACTGAAGAGYGARCC-3 ' ; SEQ ID NO: 14) . Estos cebadores se utilizaron en una RT-PCR de una etapa de acuerdo con el protocolo (Invitrogen, Carlsbad, CA) en 1 µg de ARN total aislado de la línea de células CH0-DG44 de hámster (Urlaub et al., 1983) para obtener el homólogo de DNAc de bcl-xL de hámster. El producto de DNAc 700 pb resultante se subclonó en un vector de clonación de tipo TA (Invitrogen) y la secuencia de nucleótidos de ambas cadenas del DNAc se determinó en un secuenciador automático ABI 373A (Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemania) , utilizando cebadores específicos para el vector (M13 inverso, T7) , y específicos para el gen (Bel forl y Bel revi) para iniciar la reacción de extensión en la reacción Big Dye Terminator Cycle Sequencing de acuerdo con el protocolo del fabricante (Applied Biosystems) . La investigación de la homología frente a bancos de datos GenBank y EMBL confirmó la identidad del DNAc aislado y que éste comprendía la región codificadora completa del gen bcl-xL de hámster. Con el fin de determinar la secuencia verdadera del extremo 5' y del extremo 3' de la región codificadora de bel- r xL de hámster, se utilizó un enfoque de marcha genómico. Para el aislamiento de la región genómica que cubre el extremo 5' y el extremo 3' de la región codificadora, respectivamente, se diseñaron los siguientes cebadores, basados en la secuencia bcl-xL de hámster: (i) cebadoras solapantes Bel rev5 (5'- CATCACTAAACTGACTCCAGCTG-3 ' ; SEQ ID NO : 15) y Bel rev6 (5'-TGACTCCAGCTGTATCCTTTCTG-3 ' ; SEQ ID NO: 16) situados más abajo del extremo 5' de la región codificadora y con complementariedad a la cadena codificadora para el aislamiento del extremo 5', cebadoras solapantes Bel for2 (5 ' -GACGGGCAT- GACTGTGGCTG-3 ' SEQ ID NO: 17) y Bel for3 (5'-TGACTGTGGCTGGTGTGGTTCT-3 ' ; SEQ ID NO : 18) situados más arriba del extremo 3' de la región codificadora con complementariedad a la cadena no codificadora para el aislamiento del extremo 3' . El DNA genómico de CHO-DG44 ligado al adaptador sirvió como plantilla en una PCR imbricada. La PCR primaria se realizó con una combinación de los cebadores complementarios al adaptador y un cebador específico para bcl-xL (Bel rev5 o Bel for2 , respectivamente) . Se llevó a cabo una PCR secundaria en los productos de PCR primarios con una combinación de un cebador para el adaptador interior y un cebador especifico para bcl-xL imbricado (Bel revS o Bel for3, respectivamente). Los fragmentos de DMA resultantes con tamaños entre 0,5 kb y 1,8 kb, partiendo de una secuencia conocida en el extremo del cebador bcl-xL y que se extendían en DNA genómico adyacente desconocido de diversas longitudes , se clonaron en un vector de clonación de tipo TA (Invitrogen) y se analizaron adicionalmente mediante el análisis de la secuencia. Todos los fragmentos de DNA solapantes contenían el extremo 5' o el extremo 3' de la región codificadora bcl-xL de hámster y, además, secuencias de la región 5' o 3' no traducida. En base a esta información de la secuencia, se repitió la RT-PCR de una etapa, esta vez utilizando en las reacciones el cebador del extremo 5' específico para el hámster Eco-Bel for (5 ' -TCCGGAATTCGCCACCATGTCTCAGAGCAACC GGGAG-3 ' ; SEQ ID NO: 19) y el cebador del extremo 3' Xho-Bcl rev (5 ' -TCCGCTCGAGTCACTTCCGACTGAA GAGAGAGCC-3 ' ; SEQ ID NO: 20) . De este modo, se obtuvo una región codificadora de bcl-xL completa de origen de hámster (figura 9) . Los cebadores Eco-Bel for y Xho.Bcl rev incluyen, además de la secuencia bcl-xL, un sitio de enzima de restricción para EcoRI o Xhol, respec ivamente, con fines de subclonar en el vector de expresión eucariótico pBID, dando como resultado pBID/bcl-xL (figura 10) . Este vector, basado en el vector pAD-CMV (Werner et al., 1998), media en la expresión constitutiva de los genes heterólogos impulsados por el promotor/me orador de CMV. Además, pBID codifica el minigen dhfr como marcador amplificable y seleccionable (véase, por ejemplo, el documento EP 0 393 438) . Ejemplo 6: Generación de mutantes por deleción de bcl-xL de hámster Varios mutantes de bcl-xL de hámster con diferentes deleciones de la región de bucle no estructurada y no conservada se clonaron como sigue. En síntesis, el extremo 5' y el extremo 3 ' de cada imitante por deleción se generó por separado mediante PCR, se unieron juntos a través de un sitio de restricción Notl recientemente introducido, se clonaron directamente en el vector de expresión eucariótico pBID y se confirmaron mediante análisis de la secuencia. Los residuos de aminoácidos suprimidos se reemplazaron con ello uniformemente por una secuencia de 4 alaninas que servía como una enlazador para puentear los dominios adyacentes. El vector de expresión pBID/bcl-xL, que contenía el DNAc de tipo salvaje de bcl-xL de hámster, se utilizó como plantilla en las PCRs con diversas combinaciones del cebador para generar los componentes requeridos para la parte 5' ó 3' de la región codificadora situada más arriba o más abajo de la secuencia de DNA suprimida (figura 11) : Parte 5' : cebador situado más arriba, especifico para el vector, combinado con del26 (5 ' -ATAGTTATGCTGCG GCCCGC ACTCCAGCTGTATCCTTTCTGG-3 ' ) (SEQ ID NO : 19) cebador situado más arriba, específico para el vector, combinado con del46 (5 ' -ATAGTTATGCTGCG GCCGCCCTCTCTGATTCAGTTCCTTCTG-3 ' ) (SEQ ID NO: 20) cebador situado más arriba, específico para el vector, combinado con del66 (5 ' -ATAGTTATGCTGCG GCCCGCTACCGCGGGGCTGTCCGCC-3' ) (SEQ ID NO: 21) Parte 3 ' : cebador situado más abajo, específico para el vector, combinado con del63 (5 ' -AAGTAAGAAGCG GCCGCAGCAGCGGTAAATGGAGCCACTGGC-3 ' ) (SEQ ID NO : 22) cebador situado más abajo, específico para el vector, combinado con del83 (5'- AAGTAAGAAGCGGCCGCAGCAGCAGCGTAAAGCAAGCGCTG-3 ' ) (SEQ ID NO: 23) . Para la generación de los mutantes por deleción pBID/bcl-xLdel26-83 con las secuencias de nt y de aa de SEQ ID Nos: 5 y 6, respectivamente, pBID/bcl-xLdel46-83 con las secuencias de nt y de aa de SEQ ID Nos: 7 y 8, respectivamente, pBID/bcl-xLdel66-83 con las secuencias de nt y de aa de SEQ ID Nos: 9 y 10, respectivamente, y pBID/bcl-xLdel 6-63 con las secuencias de nt y de aa de SEQ ID Nos: 11 y 12, respectivamente, los fragmentos por PCR del26 y del83, del66 y del83 o del46 y del63, respectivamente, se unieron a través del sitio de restricción Notl introducido y se clonaron en el vector de expresión pBID como fragmento de restricción EcoRI/SnaBI. Los números son indicativos de los aminoácidos suprimidos, por ejemplo del26-83 significa que en este mutante se suprimieron los aminoácidos 26 a 83 de la secuencia BCL-xL de tipo salvaje de hámster . 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A. et al . , Biotechnol Prog 2000, 16, 319-325 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripció de la invención.

Claims (64)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Célula hospedera de hámster caracterizada porque está genéticamente modificada mediante la introducción de secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen anti-apoptosis, un gen marcador amplificable y seleccionable y al menos un gen de interés. 2. Célula hospedera de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la células hospedera es una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula de riñon de cría de hámster (BH ) .
3. 3. Célula hospedera de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque la célula hospedera es una célula CHO-DG44, CHO-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX Bl, CHO Pro-5, V79, B14AF28-G3, BHK-21, BHK TK~ , HaK, o BHK-21 (2254-62.2 ) , o la progenie de cualquiera de estas líneas celulares.
4. 4. Célula de mieloma de múridos, caracterizada porque está genéticamente modificada mediante la introducción de secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen anti-apoptosis, un gen marcador amplificable y seleccionable y al menos un gen de interés .
5. 5. Célula hospedera de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porgue la célula hospedera es una célula NSO o SP2/0-Agl4, o la progenie de cualquiera de estas lineas celulares .
6. 6. Célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque el gen anti-apoptosis codifica un miembro de la superfamilia Bel-2 que puede actuar como un represor de la muerte celular.
7. 7. Célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el gen anti-apoptosis codifica BCL-xL, BCL-2, BCL-w, BFL-1, Al, CL-1, BOO, BRAG-1, NR-13, CDN-1, CDN-2, CDN-3, BHRF-1, LMW5-HL o CED-9.
8. 8. Célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el gen anti-apoptosis codifica BCL-xL o BCL-2.
9. 9. Célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el gen anti-apoptosis tiene la secuencia de la SEQ ID n° 1, SEQ ID n° 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 0 SEQ ID NO: 11, o cualquier fragmento, variante o derivado del mismo biológicamente activo.
10. 10. Célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque codifica BCL-xL.
11. 11. Célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el gen anti-apoptosis tiene la secuencia de la SEQ ID n° 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9 0 SEQ ID NO : 11, o cualquier fragmento, variante o derivado del mismo biológicamente activo.
12. 12. Célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque el gen marcador amplificable y seleccionable codifica dihidrofolato-reductasa (DHFR) , glutamina-sintetasa, C7AD, adenosina-desaminasa, adenilato-desaminasa, UMP-sintetasa, IMP-51-dihidrogenasa, santina-guanina-fosforribosil-transferasa, HGPRTasa, timidina-quinasa, timidilato-sintetasa, P-glicoproteína 170, ribonucleótido-reductasa, aspargina-sintetasa, arginosuccinato-sintetasa, o nitina-descarboxilasa, H G-CoA-reductasa, acetilglucosaminil-transferasa, treonil-tRNA-sintetasa o Na+K+-ATPasa .
13. 13. Célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque el gen anti-apoptosis codifica BCL-xL y el gen marcador amplificable y seleccionable codifica DHFR, glutamina-sintetasa, CAD, adenosina-desaminasa, adenilato-desaminasa, UMP-sintetasa, IMP-5 ' -dihidrogenasa, xantina-guanina-fosforribosil-transaferasa, HGPRTasa, timidina-quinasa, timidilato-sintetasa, P-glicoproteína 170, ribonucleótido-reductasa, aspargina-sintetasa, arginosuccinato-sintetasa, ornitina-descarboxilasa, HMG-CoA-reductasa, acetilglucosaminil-transferasa, treonil-tRNA-sinte asa o Na+K+-ATPasa .
14. 14. Célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque el gen anti-apoptosis codifica BCL-xL y el gen marcador amplificable y seleccionable codifica DHFR.
15. 15. Célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizada porque el gen anti-apoptosis, el gen marcador amplificable y seleccionable y el (o los) gen (es) de interés están operativamente conectados al menos a una secuencia reguladora que permite la expresión de dichos genes.
16. 16. Un método para expresar un gen anti-apoptosis, un gen marcador amplificable y seleccionable y al menos un gen de interés en una célula hospedera de mamífero, caracterizado porque comprende : (a) introducir en una población de células hospederas de hámster las secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen anti-apoptosis, un gen marcador amplificable y seleccionable y un(os) gen(es) de interés, en que dichos genes están operativamente conectados al menos a una secuencia reguladora que permite la expresión de dichos genes ; (b) cultivar dicha población de células hospederas bajo condiciones en la que se expresen dichos genes.
17. 17. Método para generar células hospederas de mamífero que muestran un nivel de expresión aumentado de un gen anti-apoptosis, caracterizado porgue comprende: (a) introducir en una población de células hospederas de mamífero secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen anti-apoptosis , un gen marcador amplificable y seleccionable y, opcionalmente, al menos un gen de interés, en que dichos genes están operativamente conectados al menos a una secuencia reguladora que permite la expresión de dichos genes; (b) cultivar dicha población de células bajo condiciones en las que se expresen dicho gen marcador amplificable y seleccionable y dicho gen anti-apoptosis, y que sean favorables para obtener copias múltiples de al menos el gen anti-apoptosis; (c) seleccionar células de la población celular que incorporen copias múltiples de al menos el gen anti-apoptosis .
18. 18. Método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el (o los) ge (es) de interés es (o son) introducido (s) en la población de células hospederas de mamífero .
19. 19. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizado porque las células hospederas de mamífero son células de mieloma de múridos o de hámster .
20. 20. Método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque las células de hámster son células de ovario de hámster chino (CHO) o células de riñon de cría de hámster (BHK) .
21. 21. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizado porque la célula hospedera de mamífero es una célula NSO o SP2/0-Agl4.
22. 22. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, caracterizado porque el gen anti-apoptosis codifica BCL-xL, BCL-2, BCL- , BFL-1 , Al, MCL-1, BOO, BRAG-1, NR-13, CDN-1, CDN-2, CDN-3, BHRF-1, LMW5-HL o CED-9.
23. 23. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, caracterizado porque el gen anti-apoptosis codifica BCL-xL o BCL-2.
24. 24. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, caracterizado porque el gen anti-apoptosis tiene la secuencia de la SEQ ID n° 1, SEQ ID n° 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 O SEQ ID NO: 11, o cualquier fragmento, variante o derivado del mismo biológicamente activo.
25. 25. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, caracterizado porque el gen anti-apoptosis codifica BCL-xL.
26. 26. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, caracterizado porque el gen anti-apoptosis tiene la secuencia de la SEQ ID n° 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9 0 SEQ ID NO : 11, O cualquier fragmento, variante o derivado del mismo biológicamente activo .
27. 27. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 26, caracterizado porque el gen marcador amplificable y seleccionable codifica la dihidrofolato-reductasa (DHFR) , glutamina-sintetasa, CAD, adenosina-desaminasa, adenilato-desaminasa, UMP-sintetasa, IMP-51 -deshidrogenasa, xantina-guanina-fosforribosil-transferasa, HGPRTasa, timidna-quinasa, timidilato-sintetasa, P-glicoproteína 170, ribonucleótido-reductasa, aspargina-sintetasa, arginosuccinato-sintetasa, ornitina-descarboxilasa, HMG-CoA-reductasa, acetilglucosaminil-transferasa, treonil-tRNA-sintetasa o Na+K+ATPasa.
28. 28. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, caracterizado porque el gen anti-apoptosis codifica BCL-xL y el gen marcador amplificable y seleccionable codifica DHFR.
29. 29. Método para generar una célula hospedera de mamífero, caracterizado porque comprende: (a) introducir en una población de células hospederas de mamífero un gen anti-apoptosis y el gen DHFR; (b) amplificar el gen anti-apoptosis en presencia de metotrexato .
30. 30. Método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el gen anti-apoptosis codifica BCL-2 o BCL-xL.
31. 31. Método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el gen anti-apoptosis codifica BCL-xL.
32. 32. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, caracteriado porque las células hospederas son células de mieloma de múrido o de hámster.
33. 33. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 31, caracterizado porque las células de hámster son células de ovario de hámster chino (CEO) o células de riñon de cría de hámster (BHK) .
34. 34. Células hospederas, caracterizadas porque se pueden obtener mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 33.
35. 35. Método para inhibir o retrasar la muerte celular en una célula hospedera, caracterizado porque comprende cultivar células hospederas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 ó 34, bajo condiciones en las que al menos el gen anti-apoptosis es expresado de forma que la muerte celular es inhibida o retrasa en dichas células hospederas .
36. 36. Método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la muerte celular está provocada por una muerte celular programada.
37. 37. Método de de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porgue la muerte celular está provocada por apoptosis.
38. 38. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 33 ó 35 a 37, caracterizado porque las células son cultivadas en un medio de cultivo exento de suero y/o proteínas.
39. 39. Procedimiento para producir una proteina de interés en una célula hospedera, caracterizado porque comprende: (a) cultivar células según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 ó 34 bajo condiciones que sean favorables para la expresión del gen anti-apoptosis y el (o los) gen (es) de interés; (b) aislar la proteína de interés a partir de las células y/o la materia sobrenadante del cultivo celular.
40. 40. Uso de una célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 ó 34, para la producción de al menos una proteína codificada por un gen de interés.
41. 41. Célula hospedera, caracterizada porque comprende al menos 5 copias de un gen anti-apoptosis heterologo.
42. 42. Célula hospedera, caracterizada porque comprende al menos 10 copias de un gen anti-apoptosis heterologo.
43. 43. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende al menos 20 copias de un gen anti-apoptosis heterologo.
44. 44. Célula hospedera, caracterizada porque comprende al menos 50 copias de un gen anti-apoptosis heterologo.
45. 45. Célula hospedera, caracterizada porque comprende al menos 100 copias de un gen anti-apoptosis heterologo.
46. 46. Célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37 a 41, caracterizada porque el gen anti-apoptosis codifica BCL-xL, BCL-2, BCL-w, BFL-1, Al, MCL-1, BOO, BRAG-1, NR-13 , CDN-1, CDN-2, CDN-3 , BHRF-1, LM 5-HL o CED-9.
47. 47. Célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 45, caracterizada porque el gen anti-apoptosis es BCL-xL o BCL-2.
48. 48. Célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 45, caracterizada porque el gen anti-apoptosis tiene la secuencia de la SEQ ID n° 1, SEQ ID n° 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 O SEQ ID NO: 11, o cualquier fragmento, variante o derivado del mismo biológicamente activo.
49. 49. Célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 45, carcterizada porque el gen anti-apoptosis es BCL-xL.
50. 50. Célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 49, caracterizada porque la célula hospedera es una célula de hibridoma de múrido o de hámster.
51. 51. Célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 49, caracterizada porque la célula hospedera es una célula de ovario de hámster chino (CHO) o una célula de riñon de cría de hámster (BHK) .
52. 52. Célula de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada porque la célula de mieloma de múrido es una célula NSO o SP2/0Agl4, o la progenie de cualquiera de estas líneas celulares.
53. 53. Célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 49, caracterizada porque la célula hospedera es una CHO-DG44, CH0-K1, CHO-DUKX, CHO-DUKX Bl, CHO Pro-5, V79, B14AF28-G3, BHK-21, BHK TIC, HaK, BHK-21 (2254-62.2), o una progenie de cualquiera de estas líneas celulares .
54. 54. Célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41 a 53, caracterizada porque comprende opcionalmente al menos un gen heterólogo de interés .
55. 55. Célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 ó 34, caracterizada porque comprende al menos 5 copias del gen anti-apoptosis heterólogo .
56. 56. Célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 ó 34, caracterizada porque comprende al menos 10 copias del gen anti-apoptosis heterólogo.
57. 57. Célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 ó 34, caracterizada porque comprende al menos 20 copias del gen anti-apoptosis heterólogo .
58. 58. Célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 6 33, caracterizada porque comprende al menos 50 copias del gen anti-apoptosis heterólogo .
59. 59. Célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 ó 34, caracterizada porque comprende al menos 100 copias del gen anti-apoptosis heterólogo .
60. 60. Un DNA caracterizado porque comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un gen bcl-xL biológicamente activo, en donde el ácido nucleico es: (a) un ácido nucleico con la secuencia de SEQ ID NO:3, o su cadena complementaria; (b) fragmentos, variantes o mutantes (degenerativos y no degenerativos) funcionales de la secuencia de ácidos nucleicos definida en (a) ; (c) un ácido nucleico con una homología de al menos el 95% con respecto a la secuencia de ácidos nucleicos definida en (a) ,- o (d) un ácido nucleico que se híbrida a cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos definidas en (a), (b) o (c) en condiciones estrictas.
61. 61. Un DNA caracterizado porque comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un gen bcl-xL biológicamente activo, en donde el ácido nucleico es: (a) un ácido nucleico con la secuencia de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 11 o su cadena complementaria de cualquiera de éstas; (b) variantes o mutantes (degenerativos y no degenerativos) funcionales de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos definida en (a) ; (c) un ácido nucleico con una homología de al menos el 95% con respecto a cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos definida en (a) ; o (d) un ácido nucleico que se híbrida a cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos definidas en (a), (b) o (c) en condiciones estrictas.
62. 62. Un DNA caracterizado porque comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un gen bcl-xL biológicamente activo que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO : o SEQ ID NO: 11.
63. 63. Un polipéptido caracterizado porque está codificado por un DNA de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 60 a 62.
64. 64. Célula hospedera caracterizada porqueque comprende un DNA de conformidad con las reivindicaciones 60 a 62.