KR20040044433A - 세포자멸사 과정의 저해 및 세포 기능의 개선 - Google Patents

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KR20040044433A
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피규에로아브루노쥬니어
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아이덱 파마슈티칼즈 코포레이션
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Abstract

본 발명은 세포 내에서 하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현시켜 세포에서 예정된 세포사멸을 예방하거나 지연시킴으로써 예정된 세포사멸을 예방하거나 지연시키는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 세포 내에서 하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현시켜 세포에 의한 세포-관련 산물의 생산을 증가시킴으로써 세포-관련 산물의 생산을 증가시키는 것에 관한 것이다. 또한 세포-관련 산물의 생산 또는 세포 치료법에 유용한 재조합 세포가 제공된다.

Description

세포자멸사 과정의 저해 및 세포 기능의 개선{INHIBITION OF APOPTOSIS PROCESS AND IMPROVEMENT OF CELL PERFORMANCE}
약제학적 또는 상업적 제조 환경에서 진핵 세포에 의한 매우 유용한 치료용 또는 진단용 단백질의 생산은 이용가능한 발효 용기 부피 및 발효 과정 시간에 대해 엄격히 제한된다. 일정 기간 동안 제조하는 발효 스위트(suite)의 견지에서, 작업하는 동안 단위 시간 당 단백질 생산율을 최대화하고 작업 저하 시간을 최소화하고, 생산율이 낮은 작업 시간의 분화를 최소화함으로써 생산 효율이 달성된다.
상기 제조 환경에서 단백질 생산성을 증가시키기 위한 하나의 광범위한 접근법은 용기 내의 세포 밀도를 증가시키는 것이다. 적절히 균형을 맞춘 배양액 조성물의 개발을 통해, 영양소 공급 접근법(nutrient feeding approach)에 의해, 및 세포를 보유하는 시스템을 통한 배양액의 관류에 의해 세포 밀도를 상당히 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법들은 세포 밀도를 증가시킬 뿐만 아니라 배치(batch) 배양의 전체 수명을 증가시키는 데 효과적일 수도 있다.
제조 생산성을 증가시키기 위한 다른 기본 접근법은 세포 자신에 의한 단백질 생산율을 증가시키는 것, 즉 특이적 세포 생산성(생산된 단백질의 양/세포/일)을 증가시키는 것이다. 전통적으로, 높은 비율의 생산성을 갖는 세포를 얻는 방법은, 세포의 대집단을 관심의 대상이 되는 단백질에 대한 유전자로 트랜스펙션시키는 제 1단계, 및 대집단의 단일세포 클론을 성장시키고 더 높은 생산성 세포주를 확인하고 추가 세포주 개발을 위해 선택하는 제 2단계의 다단계 과정으로 일어난다. 트랜스펙션된 세포 집단에서 뚜렷한 단백질 생산율에 대한 불균일은 일반적으로 첫째로 새로운 유전 물질을 숙주 세포의 게놈 내로 통합시키는 위치의 차이에서 비롯되며 둘째로 통합된 DNA 서열의 총수(복제수)의 차이에서 비롯된다. 따라서, 이종 DNA 통합 부위를 숙주 게놈 내로 표적화하는 방법도 개발되어, 높은 수준의 RNA로의 전사와 관련된 부위 속에 DNA 서열을 통합시킬 수 있다. 이러한 접근법의 예는, NEOSPLA 벡터에 관한 미국 특허 제 5,648,267호, 제 5,733,779호, 제6,017,733호, 및 제 6,159,730호 및 동종 재조합에 관한 미국 특허 제 5,830,698호 및 제 5,998,144호에 의해 제공된다.
또한, 독성제에 대한 내성을 부여하는 단백질에 대한 다른 유전자와 관심의 대상이 되는 단백질에 대한 유전자의 공동-트랜스펙션(co-transfection)은 고생산성 세포를 선택하는 방법을 제공한다. 이러한 성장하는 세포를 증가된 농도의 독성제에 노출시키면, 더 높은 복제수의 내성 유전자를 갖는 세포가 선택된다. 이러한 세포는 종종 내성 유전자의 게놈 증폭 과정을 겪는 것으로 확인된다. 관심의 대상이 되는 단백질을 코딩하는 인접 유전자의 공동-증폭(co-amplication)은 종종 원하는 단백질의 세포 특이적 생산 수준을 증가시킨다(Ringold, J. Mol. Appl. Genetic 1(3): 165-75 (1981); Kaufman, J. Mol. Biol. 159(4): 601-21 1982).
세포 배양물 제조 과정의 생화학공학으로부터 완전히 분리된 기원을 갖는 생물학적 연구 분야에서, 과거 10년 동안 세포자멸사, 예정된 세포사멸의 과정에 관해 많이 알게되었다. 이러한 발전에 따른 개념의 약진은, 세포 사멸을 야기하는 자연적인 생리학적 과정이 존재한다는 것이다. 세포 사멸은 물론, 세포 또는 이의 잔여물의 괴사가 진행되면서 세포 완전성을 파괴하는 외상의 직접적이고 즉각적인 결과로서 발생할 수도 있다. 세포자멸사는 질병 과정의 부분으로서 또는 생리학적 스트레스에 대한 반응으로, 자연적 또는 자연에서 발생된 매우 다양한 환경 또는 자극에 의해 개시될 수 있다. 장기가 성숙하거나 재구성되는 발생 과정은 예를 들어, 특정 종류의 세포의 사멸에 관여하여 다른 신종 세포를 출현시킬 수 있다. 따라서, 유전학적 및 생화학적 수준에서의 세포자멸사의 이해, 및 이를 촉진시키거나 이를정지시키기 위해 개입하는 방법에 대한 연구는 의과학에서 상당한 관심 분야로 떠올랐다.
그러나, 세포자멸사는 포유류 세포를 생체 외에서 배양하는 동안의 과정 상의 문제로 발생하는 세포 사멸에 대한 주요 경로로 생각되어 왔다. 실험실 및 대규모의 제조 환경 모두에서 모두 행해지는 세포 배양의 기본 형식은 배치 배양이라 한다. 배치 배양은 건강하고 활발하게 성장하는 세포 접종물을 사용하여 개시하여; 배양물이 최대 세포 밀도까지 성장하고, 쇠퇴기로 들어가고, 세포 집단이 사멸할 때까지 과정을 지속한다. 후자의 세포 배양의 쇠퇴기는, 영양소가 고갈되고 독성 대사산물의 농도가 증가함에 따라 환경이 세포에 스트레스를 주게 되는 시간이다. 또한, 발효 환경 자체가 하드웨어에 의해 생성된 전단응력, 혼합과 관련된 유체 및 기체 난류, 및 파이프와 라인을 통한 배양물의 이동과 같은 다른 스트레스 인자들을 제공할 수 있다. 이러한 모든 인자들(영양소 제한, 배양액 중의 독성제, 및 물리적 스트레스)은 배양물 내의 세포에서 세포자멸사를 개시하여 전체로서의 배양물의 기대수명(life expectancy)을 제한하는 역할을 하는 것으로 확인되었다.
최근 세포자멸사 과정에 중요한 역할을 하는 몇 가지 단백질이 발견되었으며, 이들의 유전자를 분리 및 클로닝하였다. E1B-19K는 Bcl-2 단백질족의 항-세포자멸사 성분인 아데노바이러스 단백질이다. 감염에 대한 세포의 반응은 세포자멸사 캐스케이드를 개시하는 것이다. 이러한 방어 메카니즘은 감염된 세포를 조직으로부터 결핍하는 데 사용된다. 그러나, 특정 바이러스는 세포자멸사를 억제하는 감염 과정 초기에 발현된 단백질을 암호화함으로써 세포자멸사 반응에 대항하는 방법을개발해 왔다. 아데노바이러스 감염 동안에는, 세포에서의 바이러스 유전자 발현이 아데노바이러스 게놈의 E1 영역에 의해 조절된다. E1 영역은 두 개 전사 유닛인 E1A 및 E1B로 구성된다. E1B 유닛은 아데노바이러스의 두 개의 구별된 종양 항원인 19kDa 및 55 kDa 단백질을 암호화한다. 세포자멸사의 저해제인 E1B-19K의 작용은 세포 사멸 경로 내의 다단계에서 세포자멸사를 저해하는 항-세포자멸사 단백질 Bcl-2의 작용과 유사한 것으로 이해된다. 세포자멸사 억제의 한 메카니즘은 미토콘드리아막의 안정화를 통해 사이토크롬 C 및 사이토졸 내의 다른 전-세포자멸사(pro-apoptotic) 인자의 방출을 예방하는 것으로 생각된다(Vander Heiden Cell 91 (5): 627-37 (1997)). 사이토크롬 C는 카스파제 캐스케이드의 저해에 관여된 복합체 내의 Apaf-1에 결합하는 것에 관여한다(Zou J. Biol. Chem. 274 (17): 11549-56 (1999)). Bcl-2족 성분(Bcl-XL)은 또한 Apaf-1에 직접 결합함으로써 Apaf-1의 활성화를 차단한다(Hu et al., J. Biol. Chem 273 (10): 5481-5 (1998); PNAS 95 (8): 4386-91 (1998)).
다른 항-세포자멸사 단백질은 편재하는 막 단백질인 Aven이다. Aven의 항-세포자멸사 활성은 카스파제 활성화인자 Apaf-1의 자가-결합(self-association)을 방해함으로써 카스파제 9 활성화를 저해하는 이의 능력에 기인한다(Chau Mol. Cell. 6: 31-40 (2000)). Aven은 BHK(새끼 햄스터 신장; baby hamster kidney) 세포 내의 Bcl-XL의 항-세포자멸사 활성을 증진시키는 것으로 나타났으며, 이는 Aven과 Bcl-XL간의 상호작용을 제시한다(Chau (2000)).
단백질 생산성을 증가시키기 위한 상기한 모든 다양한 접근법은 실제에서 다양한 정도로 성공하였다. 그럼에도 불구하고 대규모의 상업적 생산에서 예를 들어, 재조합 단백질과 같은 세포-관련 산물의 생산을 증가시키는 방법의 개발이 여전히 요구된다. 또한, 예정된 세포사멸을 예방하거나 지연시키는 방법의 개발도 요구된다.
본 출원은 전체 개시내용이 본 명세서에 참조 병합되는 2001년 7월 10일에 출원된 미국 가특허출원 제 60/303,813호에 대해 우선권을 주장한다.
본 발명은 재조합 세포에서 예정된 세포사멸(programmed cell death)을 예방하거나 지연시키는 것에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 세포 내에 하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현함으로써 재조합 세포 내에 예정된 세포사멸을 저해하는 것에 관한 것이다.
본 발명은 또한 세포 내에 하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현함으로써 재조합 세포의 세포-관련 산물 생산, 예를 들어 항체와 같은 재조합 단백질의 생산을 증가시키는 것에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현하는 재조합 세포를 제공한다. 이러한 세포는 세포 치료법 또는 특히, 상업적 생산용 대규모 생물반응기에서의 세포-관련 산물의 생산에 유용하다.
도 1은 항체 IDEC 131을 발현하는 데 사용된 NEOSPLA 발현 벡터를 도시한다.
도 2는 유도가능한 발현 벡터, 플라스미드 PX + E1B-19K를 도시한다.
도 3은 유도가능한 발현 벡터, 플라스미드 PX + Aven + E1B-19K를 도시한다.
도 4는 Aven cDNA 폴리뉴클레오타이드 및 Aven 폴리펩타이드 아미노산 서열을 도시한다.
도 5는 E1B-19K cDNA 폴리뉴클레오타이드 및 E1B-19K 폴리펩타이드 아미노산 서열을 도시한다.
도 6은 (1) GFP 단독으로 트랜스펙션된 세포, (2) GFP + Aven으로 트랜스펙션된 세포, (3) GFP + E1B-19K로 트랜스펙션된 세포, (4) GFP + Aven + E1B-19K로 트랜스펙션된 세포, 및 (5) 트랜스펙션되지 않은 모세포의 글루코스 결핍 배양물의 3일 생존을 비교한 세포 생존율에 관한 데이터를 도시한다.
도 7은 세포의 글루코스-결핍 배양물이 3일 생존한 것과 비교하여, 스테로이드 유도가 존재 및 부재하는 각 배양물에서, (1) GFP 단독으로 트랜스펙션된 세포, (2) GFP + Aven으로 트랜스펙션된 세포, (3) GFP + E1B-19K로 트랜스펙션된 세포, (4) GFP + Aven + E1B-19K로 트랜스펙션된 세포의 글루코스 결핍 배양물의 3일 생존을, 스테로이드 유도 존재 또는 부재 하에서 비교한 세포 생존율에 관한 데이터를 도시한다.
도 8은 생존율 및 항체 생산 수준에 관해 E1B-19K 및 Aven을 발현하는 스테로이드 유도된 세포의 배치 배양물 기능을 CHO 세포주와 비교한, 항-세포자멸사 폴리펩타이드의 유도가능한 발현에 관한 데이터를 나타낸다.
도 9는 생존율 및 항체 생산 수준에 관해 이러한 트랜스펙션된 유전자의 발현에 대한 스테로이드 유도가 있거나 없이 E1B-19K 및 Aven으로 트랜스펙션된 세포의 배치 배양물 기능을 비교한, 항-세포자멸사 폴리펩타이드의 유도가능한 발현에 관한 데이터를 나타낸다.
도 10은 혈청 결핍 및 배양액 소비 후에 CH0 세포주(CHO-K1)가 세포자멸사를 겪음을 나타내는 결과를 포함한다.
도 11a 및 11b는 Aven, Bcl-xL, 및 Bcl-xL+ Aven을 발현하는 10% FBS 중에서 배양하고 이어서 배양물은 무혈청 배양액에 노출시킨 CHO 세포에 관한 세포 생존율 데이터를 포함한다.
도 12a, b 및 c는 또한 Aven, Bcl-xL, 및 Bcl-xL+ Aven을 발현하는 CHO 세포를 무혈청 배양액으로 배양하고 이러한 배양 후 세포 생존율을 측정한 생존율 데이터를 포함한다.
도 13a, b 및 c는 실시예에 사용된 유도가능한 발현 시스템을 도시한다.
도 14는 CHO 세포에서의 항-세포자멸사 유전자 α-Aven 및 α-E1B-19K의 유도가능한 발현을 나타낸다.
도 15는 6-웰 배양을 사용한 글루코스 결핍 실험 결과를 포함한다.
도 16 내지 21은 스피너 플라스크 배양으로 수행된 글루코스 결핍 실험 결과를 포함한다.
도 22는 IDEC-131을 발현하는 CHO 세포주 및 항-세포자멸사 유전자를 포함한 유도가능한 발현 벡터의 생산을 개략적으로 도시한다.
도 23 내지 26은 다른 스피너 플라스크 결과를 포함한다.
도 27은 유도 또는 비유도 조건 하에 서로 다른 세포주에서의 IDEC131의 상대적 발현을 비교한다.
도 28 내지 31은 생물반응기 연구 #1의 결과를 포함한다.
도 32 내지 34는 생물반응기 연구 #2의 결과를 포함한다.
도 35 내지 37은 생물반응기 연구 #3의 결과를 포함한다.
본 발명의 목적은, 마우스 골수종 세포가 아닌 재조합 세포에서 예정된 세포사멸을 예방하거나 지연시키는 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은, 예를 들어, 세포성 Bcl-xL, Bcl-2, Aven, 또는 바이러스 단백질 E1B-19K, 및 p35와 같은 하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 세포 내에서 발현시키거나 이의 발현을 유도하여 세포에서 예정된 세포사멸을 예방하거나 지연시키는 것을 포함하며, 세포 내에 하나의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현할 경우 항-세포자멸사 폴리펩타이드가 예를 들어, Aven과 같은 Bcl-xL상호작용 인자가 아닌 것을 특징으로 한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 목적은 하나 이상의 원하는 폴리펩타이드, 예를 들어, 항-CD154(IDEC-131), 항-CD20 항체(예를 들어, ATCC 제 69119호, ZevalinTM으로 생산되는, 비호지킨 림프종의 치료에 대해 FDA 승인을 받은 키메라 항-CD20인 RITUXAN,), 항-CD80(IDEC 114) 항체, 항-CD23 항체(IDEC 152), 항-CD4 항체(IDEC 151), 및 항-종양 항원 항체, 효소, 수용체, 사이토카인, 세포-표면 인자, 세포 대사산물, 세포-분비 인자, 바이러스 인자, 및 막-결합 인자와 같은 하나 이상의 원하는 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 이종 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 세포에서 예정된 세포사멸을 예방하거나 지연시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 재조합 세포에 의한 세포-관련 산물의 생산을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은, 세포 내에서 하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현시키거나 이의 발현을 유도하여 세포에 의한 세포-관련 산물의 생산을 증가시키는 것을 포함하고, 세포 내에서 하나의 항-세포자멸사 폴리펩타이드가 발현될 경우 항-세포자멸사 폴리펩타이드가 예를 들어, Aven과 같은 Bcl-xL상호작용 인자가 아닌 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 재조합 세포의 생산을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은, 세포에 하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현시키거나 이의 발현을 유도하여 재조합 세포의 생산을 증가시키는 것을 포함하고, 세포 내에서 하나의 항-세포자멸사 폴리펩타이드가 발현될 경우 항-세포자멸사 폴리펩타이드가 예를 들어, Aven과 같은 Bcl-xL상호작용 인자가 아닌 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 세포-관련 산물의 생산에 유용한 재조합 세포를 제공하는 것이다. 재조합 세포는 두 개 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현시키거나 이의 발현을 유도할 수 있다.
본 발명의 또다른 목적은 세포의 하나 이상의 생물학적 기능을 생산하는 데 유용한 세포의 집단을 제공하는 것이다. 세포의 집단은 두 개 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현시키거나 이의 발현을 유도할 수 있다.
본 발명의 또다른 목적은 세포 치료에 유용한 세포의 집단을 제공하는 것이다. 세포의 집단은 하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현시키거나 이의 발현을 유도할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명은 재조합 세포, 특히 재조합 세포, 바람직하게는 세포-관련 산물을 생산하는 포유류 세포에서 예정된 세포사멸을 예방하거나 지연시키는 것에 관한 것이다. 본 발명에 의해 세포에서 세포자멸사를 저해하면 세포 생존율 및 세포 기능이 증가되는 것으로 발견되었다. 따라서, 본 발명은 세포 내에서 하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현시킴으로써 재조합 세포에서 예정된 세포사멸을 예방하거나 지연시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 세포 내에서 하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현시킴으로써 재조합 세포 내에서 세포-관련 산물의 생산을 증가시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 세포-관련 산물의 생산 또는 세포 치료에 유용한 재조합 세포를 제공한다.
배양물 내의 포유류 및 다른 진핵 세포에서 잠재적으로 세포 사멸을 저해하기 위한 이러한 접근법의 능력(capacity)은 관심의 대상이 되는 세포에 의해 생산된 임의의 천연 또는 이종 단백질 또는 바이러스의 생산을 개선시키는 데 사용될 수 있다. 관심의 대상이 되는 천연 및 이종 산물 표적에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 항체, 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 혈청 단백질, 수용체, 효소, 리간드, 세포 분비 인자, 세포 대사산물, 및 자연적으로 또는 유전자 조작 후 포유류 및 다른 진핵 세포 동물에 의해 생산되는 바이러스 벡터가 포함될 것이다. 유전자 조작기술에는, 이종 단백질과 같은 통합된 유전자를 발현시키기 위해 관심의 대상이 되는 표적 유전자를 포유류의 게놈 또는 염색체외(extra-chromosomal) 성분 속에 통합시키는 표준 재조합 DNA 기술이 포함될 것이다. 본 명세서에 기재된 기술은 세포 배양 과정 동안 세포자멸사가 일어나는 모든 포유류 및 다른 진핵 세포주에 적절할 것이다. 적절한 세포주에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 중국 햄스터 난소(CHO), 새끼 햄스터 신장(BHK), 인간의 태아 신장(HEK) 293, NS0 섬유종, COS, NFO 포유류 세포 및 Sf-9, Sf-21와 같은 다른 진핵 세포, 및 양배추은무늬밤나방(Trichoplusia ni) 곤충 세포가 포함된다. 이러한 세포주들은 ATCC(American Type Culture Collection)와 같은 공급원으로부터 입수할 수 있다. 이러한 기술은 예정된 세포사멸을 겪는 임의의 진핵 세포에 적절할 것이며 상기에 나열된 것과 같은 관심의 대상이 되는 이종 단백질을 생성하기 위해 유전적으로 조작될 수 있다.
표적 단백질 및 바이러스에는 생물공학 또는 약제학적 적용을 위해 포유류 또는 다른 진핵 세포에서 생산될 수 있는 것들이 포함된다. 이 기술을 적용하기 위한 몇 가지 관심의 대상이 되는 단백질에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 인간의 성장 호르몬, 과립구-콜로니 자극 인자(성장 인자), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자, 에리스로포이에틴, 인터류킨 1 알파 및 베타, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 17, 및 18, 인터페론 알파 및 감마, 내피 성장 인자, 상피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 인슐린, 렙틴, 신경 성장 인자, 종양 괴사 인자-알파, 혈소판 유래 성장 인자, 변형 성장 인자, 골 형태형성(morphogenic) 단백질, 및 근세포 인자와 같은 성장 인자 및 사이토카인; 뉴클레아제, 트립신, 아프로티닌, 및 키나제와같은 효소; 라미닌, 콜라겐, 및 피브로넥틴과 같은 세포 배양 시약; 트랜스페린 조직 플라스미노젠 활성화인자, 플라스미노겐, 플라스민, 및 트롬빈 및 인자 Ⅷ, Ⅸ, 및 X와 같은 혈장 및 혈청 단백질; 사이토카인에 대한 모노클로날 항체, 사이토카인 수용체, 성장 인자, 및 다른 수용체, 리간드, 및 세포-결합 인자; 종양 괴사 인자 수용체 1 및 2, 에리스로포리에틴 수용체, 트랜스페린 수용체, 인터류킨 수용체, 렙틴 수용체, P 및 L 셀렉틴, ICAM, VCAM와 같은 수용체; FAS 리간드 및 CD 리간드와 같은 리간드; 지질, 지방, 뉴클레오타이드, 및 탄수화물과 같은 대사산물; 아데노바이러스, 레트로바이러스, 및 아데노-관련 바이러스와 같은 바이러스 벡터가 포함된다. 다수의 현재 생산되는 이종 단백질 및 다른 산물이 이 목록에 포함되어 있을지라도, 상기 기술은 생산 과정 동안 배양물 내의 생산하는 진핵세포가 세포자멸사를 겪는 다른 현재 및 미래의 단백질 및 산물에 똑같이 적절할 것이다.
본 발명에 따르면, 당업자에게 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 세포에 하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 폴리펩타이드 구조체를 도입할 수 있다. 이러한 구조체는 발현 구조체일 수 있으며 하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 결합된 하나 이상의 유도가능한 프로모터를 포함할 수 있다. 일실시형태에서, 하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드의 발현을 스테로이드에 의한 투여량 의존 방식으로 조절하기 위해 엑디손 유도가능 시스템을 사용할 수 있다. 이러한 시스템은, 전체 개시내용이 본 명세서에 참조병합되는 미국 특허 제 5,534,418호에 상세히 설명되어 있다.
또한 다른 프로모터도 적용할 수 있다. 진핵 세포에서 유용한 적합한 바이러스 전사 프로모터의 예는 유인원 바이러스(simian virus) 40, 아데노바이러스, 라우스 사르코마 바이러스(rous Sarcoma virus) 및 사이토메갈로바이러스로부터의 전사 프로모터이다. 이종 유전자의 전사를 자극하는 교류(tranacting) 전사 활성화인자가 프로모터를 활성화시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, SV 40 T 항원, 아데노바이러스 E1A 및 E1B 단백질은 CMV 주요 중간체 초기(MIE; major intermmediate early) 프로모터를 포함하는 이종 유전자의 특정 바이러스 프로모터에 작용할 수 있다. 교류 활성을 갖는 다른 분자에는 허피스 바이러스의 중간체 초기 단백질, C-myc, 및 인간 및 유인원의 AIDS 바이러스의 유전자가 포함된다.
다른 실시형태에서, 발현 구조체는 유도가능한 프로모터 및 스크리닝가능하거나 선택가능한 마커를 포함하여 하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 선택하거나 검출할 수 있다. 예를 들어, 녹색 형광 단백질(green fluorescence protein; GFP) 또는 강화된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescence protein; EGF)과 같은 임의의 적합한 선택 또는 스크리닝 마커가 본 발명에 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드가 발현될 수 있다. 항-세포자멸사 폴리펩타이드에는 세포 내에서 세포자멸사를 저해하거나 감소시키는 활성을 갖는 임의의 폴리펩타이드가 포함된다. 예를 들어, 항-세포자멸사 폴리펩타이드는 예를 들어, 진핵 세포 또는 바이러스 내의 유전자와 같은 이종 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화될 수 있다. 일실시형태에서, 항-세포자멸사 폴리펩타이드는 Bcl-2족, Aven족, 아데노바이러스 또는 바큐로바이러스(baculovirus) 항-사멸 단백질족, 또는 이의 단편 중 한 성분이다. 다른 실시형태에서, 항-세포자멸사 폴리펩타이드는 Bcl-2, Bcl-xL, Aven, E1B-19K, 또는 p35이다. 또다른 실시형태에서, 하나의 항-세포자멸사 폴리펩타이드가 발현될 경우, 이는 Aven, Bcl-xL상호작용 인자, 카스파제-1 유도 세포자멸사로부터 세포를 보호하는 인자, 사이토크롬 c 및 dATP에 의한 카스파제의 활성화를 저해하는 인자, 항-세포자멸사 Bcl-2 성분에 결합하는 인자, 또는 Apaf-1에 결합하는 인자가 아니다.
재조합 세포에서, 항-세포자멸사 폴리펩타이드는 단독으로 또는 다른 것들과 함께 발현될 수 있다. 예를 들어, Aven만을 발현시키거나 Aven과 E1B-19K를 공동-발현시킬 수 있다. 하나 이상의 발현 구조체는 둘 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현하는 데 사용될 수 있다. 일실시형태에서, 재조합 세포는 하나 이상의 다른 항-세포자멸사 폴리펩타이드와 함께 Aven을 발현한다.
본 발명의 재조합 세포에는 당업자에게 공지되고 입수가능한 임의의 적합한 세포가 포함된다. 일실시형태에서, 재조합 세포는 예를 들어, 인간, 마우스, 또는 설치류 세포와 같은 포유류 세포이다. 다른 실시형태에서, 재조합 세포는 BHK 세포 또는 CHO 5C11과 같은 CHO 세포이다. 또한, 본 발명의 방법은 대규모의 생물반응기 또는 상업 생산용 배양 장치에서의 재조합 세포에 적용될 수 있다. 다른 적합한 세포에는 COS, CV-1, SP2/0 및 하이브리도마가 포함된다.
일실시형태에 따르면, 본 발명의 재조합 세포는 하나 이상의 원하는 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 이종 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이러한 폴리펩타이드에는 이에 제한되는 것은 아니나, 항체, 효소, 수용체, 사이토카인, 세포-표면 인자, 세포 대사산물, 세포-분비 인자, 바이러스 인자, 및 막-결합 인자가 포함될 수 있다. 일실시형태에서, 이러한 폴리펩타이드는 이에 제한되는 것은 아니나, 항-CD154(gp 39) 항체(IDEC-131), 항-CD20(Rituxan, ZevalinTM) 항체, 항-CD80(B7.1) 항체(IDEC 114), 항-CD23 항체(IDEC 152), 항-CD4 항체(IDEC 151), 및 항-종양 항원 항체가 포함된다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드의 발현은 재조합 세포에 의한 세포-관련 산물의 생산을 증가시킨다. 세포-관련 산물은 세포 기능으로 인해 생산되는 임의의 산물이 될 수 있다. 예를 들어, 세포-관련 산물은 재조합 또는 내생 단백질, 항체, 효소, 수용체, 사이토카인, 세포-표면 인자, 막-결합 인자, 또는 폴리뉴클레오타이드의 발현이 될 수 있다. 일실시형태에서, 세포-관련 산물은 바이러스 인자, 세포 대사산물, 또는 임의의 세포 구성성분이다. 다른 실시형태에서, 세포-관련 산물은 세포 자체가 될 수 있다.
본 발명은 또한 세포-관련 산물의 생산에 유용한 재조합 세포를 제공한다. 이 세포들은 하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현하거나 이를 발현하도록 유도될 수 있다. 일실시형태에서, 이 세포들은 두 개 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현한다. 이 세포들은 또한 이의 증가된 생존율 및 세포 기능, 예를들어, 세포-관련 산물의 증가된 생산으로 인해 세포 치료법에 사용될 수도 있다.
본 발명을 더 설명하기 위해, 하기의 실시예를 제공한다. 이 실시예는 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다.
실시예 1
벡터 및 트랜스펙션
NEOSPLA(도 1)라고 하는 IDEC 특허 발현 벡터는 엑손 1 및 2로 나뉘는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 항체 IDEC 131를 코딩하는 인간 면역글로불린 경쇄, 마우스의 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자 및 항체 IDEC 131을 코딩하는 인간 면역글로불린 중쇄 유전자를 포함한다. 이 NEOSPLA 벡터를 본 발명의 바람직한 실시형태의 세포주를 개발하는 동안 제 1회의 트랜스펙션에 사용하였다. NEOSPLA 발현 벡터는 미합중국 특허 5,648,267호, 5,733,779호, 6,017,733호,6,159,730호에 실질적으로 기재되어 있으며, 이 네개의 특허는 모두 본 명세서에 전반적으로 참조 병합되어 있다.
인간화된 항-CD154 항체(IDEC 131)는 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 실시형태에 의해 생산된 원하던 매우 유용한 단백질이다. CD154는 CD40에 대한 리간드이며, 이는 미성숙 및 성숙 B 림프구의 세포 표면 분자이고, 이는 항체에 의해 가교결합되는 경우 B 세포 증식을 유도한다. 항-CD154 항체는 본 명세서에 그 전체가 참조 병합되어 있는 미합중국 특허 6,001,358호에 실질적으로 기재되어 있다.
항-세포자멸사 유전자의 구조적 발현이 생산 세포주에서, 연속적으로 성장하기 위하여 필요한 장기간에 걸친 세포 분열을 방해할 수 있다는 것이 가능성있게 고려되었다는 점에서, 유도가능 프로모터 시스템을 바람직한 실시형태에서 구조 프로모터 대신 사용한다. 그러나, 본 발명의 일부 특정한 실시형태에서, 항-세포자멸사 유전자의 구조적 발현이 적당하거나 바람직할 수 있었다는 것도 전적으로 가능하다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서 사용된 벡터 pVgRXR(Invitrogen, Carlsbad, CA)은 엑디손-유도가능 발현 시스템을 특징으로 한다. 초파리로부터의 기능적 하이브리드 엑디손 스테로이드 호르몬 수용체의 서브유닛은 둘 모두 조절기 벡터 pVgRXR로부터 구조적으로 발현되지만, 궁극적으로 관심의 대상이 되고 있는 유전자를 발현하는 하이브리드 엑디손-반응 프로모터(p-△-HSP)는 제 2 스테로이드 호르몬 유도가능 발현 벡터 상에 위치된다. 포유류 세포는 우선 pVgRXR 로, 트랜스펙션되고 기능적 하이브리드 엑디손 스테로이드 호르몬 수용체를 발현할 안정한 세포주가 제오신(Zeocin)의 노출에 의해 선택된다. 유도인자 스테로이드, 포나스테론 A의 존재 하에, 기능적 하이브리드 엑디손 스테로이드 호르몬 수용체는 하이브리드 엑디손 반응 프로모터의 상류와 결합함으로써 관심대상인 유전자의 발현을 활성화시킨다. 스테로이드 호르몬이 이러한 세포주에 공급되는 경우, 스테로이드 호르몬 유도가능 프로모터로부터의 전사를 자극하는 이들의 능력은, 베타 갈락토시다제와 같은 쉽게 측정가능한 유전자 산물로 유도가능 발현 벡터를 일시적으로 트랜스펙션시켜 측정할 수 있다. 이들 안정한 제오신 내성 세포주의 대부분은 스테로이드 반응 유전자를 유도하지 않을 것이다.
스테로이드 유도를 지지하기에 충분한 수준으로 하이브리드 스테로이드 호르몬 수용체를 안정하게 발현하는 변형된 세포주를 만든 후, 퓨로마이신(puromycin)에 대한 우세한 선택가능 표지 유전자 뿐만 아니라 스테로이드 반응 프로모터의 조절 하에 관심대상인 유전자를 포함하는 플라스미드를 이 세포주 내에 트랜스팩션시킨다. 이어서, 퓨로마이신에 대해 선택함으로써 프로모터를 안정하게 발현하는 세포주를 얻는다. 그리고 나서, 이러한 세포주를 스테로이드 호르몬이 제공되는 경우, 관심대상인 유전자를 유도하는 이들의 능력에 대해 분석한다. 이들 세포주의 대부분은 스테로이드에 의해 유도되지 않는다. 앞서 기재한 바와 같이, 스테로이드 유도 시스템은 본 명세서에 그 전체가 참조병합되어 있는 미합중국 특허 5,534,418호(에반스)에 실질적으로 기재되어 있었다.
이 엑디손-유도가능 시스템을 본 발명의 세포주 실시형태의 개발의 후-항체IDEC 131 단계에서 제 2회 및 제 3회에서 각각 사용하였다. 제 2 트랜스펙션 단계에서는 pVgRXR 을 IDEC 131 세포주에 도입하였다. 제 3 트랜스펙션 단계에서는 녹색 형광 단백질(GFP)에 대한 유전자가 있거나 없는 상태에서 엑손-유도가능 유전자를 도입하였다.
인비트로겐 발현 벡터 pIND를 변형시켜 관심대상인 세개의 추가 유전자까지 수용할 수 있었으며, 우세한 선택가능 표지 유전자 네오마이신 포스포트랜스퍼라제를 결핍하고 이를 선택가능 퓨로마이신 내성 유전자로 대체함으로써 추가적으로 변형시켰다. 이러한 연속되는 일련의 트랜스팩션에서, 발현 벡터의 변형은, 각 경우에 GFP가 있거나 없이, Aven 유전자, E1B-19K 유전자 및 이 유전자 모두를 함께 갖는 실시형태를 포함하였다. 이러한 벡터의 예는 도 2 및 3에 나타낸다. 도 2는 변형된 인비트로겐 발현 벡터 PX+E1B-19K를 나타내고; 도 3은 변형된 인비트로겐 벡터 PX+Aven+E1B-19K를 나타낸다. 이와 같은 벡터를 제 3회의 트랜스펙션에 사용하여, 이들 두 항-세포자멸사 단백질을 모두 단독으로 및 조합하여 발현하는 세포주를 만들었다. GFP가 스테로이드 유도에 반응하여 이러한 CHO 세포에서 발현되는 경우, 이는 단백질 발현의 양성 표지를 제공하며, 이는 유세포분석기에 의해 고-발현 스테로이드 유도가능 세포의 분류 및 선택에 유용하다.
Aven cDNA 폴리뉴클레오타이드 및 Aven 폴리펩타이드 아미노산 서열에 대한 상세한 서열목록은 도 4에 나타낸다; E1B-19K cDNA 폴리뉴클레오타이드 및 E1B-19K 폴리펩타이드 아미노산의 서열목록은 도 5에 나타낸다.
실시예 2
세포 집단의 유래
중국 헴스터 난소(CHO) 세포와 같은 치료 단백질의 상업적 제조에 사용되는 포유류 세포는, 대대로 무한히 연속적인 일련의 분열이 계속될 수 있는 불멸화된 세포주이다. 이는 대략 50 세대에서 노화 및 분열 정지로 명백히 나타나는 유한한 수명을 갖는 정상적인 배수염색체 동물 세포의 일차 배양액과 현저하게 대조적이다.
일반적으로, 단일세포로부터의 세포 집단에서 유래함으로써 세포주의 표준 수준의 동종성이 얻어진다. 집단이 단일 세포 조상 근원을 갖는 것이 절대적으로 입증가능한 것으로는 고려되지 않으나, 이것이 그 경우라는 매우 높은 가능성을 제공하는 것으로 인정되는 확고한 방법이 확립되었다. 단일 세포 클로닝으로 알려진 이러한 방법은, 통계적으로 세포 배양 웰 속으로 분취된 단위 부피 내의 세포가 하나 미만인 시점까지, 현탁된 세포를 배양액에 희석하여 수행된다. 배양 웰 당 세포가 하나 이하로 존재함을 확인하기 위하여, 시각 및 자동화된 방법으로 통계적인 방법을 보조한다. 이들 웰 내에 작은 집단이 나타남에 따라, 이들은 단일 세포 유래일 가능성이 높은 것으로 고려될 수 있다. 이러한 접근법은, 하기에 상세화된 실시예 7 및 8에 사용된 세포 집단의 개발에서 사용된 접근법이다.
동종 세포 집단을 얻기 위한 다른 접근법은, 유세포분석법으로 측정할 수 있는 기준에 의해 표현형이 동종인 세포 풀(pool)을 선택하는 것이다. 유세포분석법은 개별 세포의 형광 또는 광 산란 특성을 하나씩 측정하고, 이러한 측정에 기초하여 각 세포를 수집하거나 버리도록 결정하는 방법이다. 이는 고도로 동종인 세포의풀을 만들 수 있는 효과적인 방법이며, 이는 이어서 특정 집단으로 증대되거나 축적될 수 있다. 그러나, 이러한 집단은 동종일 수 있고, 상기된 바와 같은 단일 세포-유래 집단으로부터 어떤 수단에 의해 구별할 수 없을 수 있으며, 이는 단일 세포 근원 표준에 의해 정의될 때 클로날로 고려되지 않는다. 이러한 유세포분석법의 장점은, 단일 세포에서 유래하는 집단보다 훨씬 더 빠르게 원하는 특징에 대해 동종인 큰 집단을 얻을 수 있다는 것이다. 이러한 유세포분석 선택 방법은 하기 실시예 5 및 6에서 사용된, 집단 생성에 사용되는 방법이다. 유세포분석 선택가능 특징은 하기 상세화된 것과 같이, 녹색 형광 단백질(GFP)의 발현이었다.
실시예 3
세포주 유래
본 발명에 기재된 세포주의 직접적인 모체인, CHO 5C11 세포주는 항-세포자멸사 유전자의 발현 및 본 발명의 방법 및 하기된 바람직한 실시형태의 확인을 지지하는 두가지 큰 특징을 갖는다. 모세포주는 원하는 단백질인 항체 IDEC 131을 분비하고, 이는 사이토졸 하이브리드 엑디손 스테로이드 호르몬 수용체를 발현하는데, 이는 항-세포자멸사 유전자의 발현을 유도하는 시스템의 성분이다.
CHO 5C11 세포주는 콜롬비아 대학(Urlaub, PNAS 83(17):6519-23(1986))에서 개발된 중국 햄스터 난소 세포주, CHO DG44로부터 유래한다. CHO DG44 주는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)의 발현이 결핍되고, 따라서 게놈 증폭에 대해 선택하기 위하여 사용된 독성제인 메토트렉세이트에 대한 내성을 얻기 위하여 트랜스펙션된 DHFR 의 발현에 의존한다. 이를 현 상태까지 개발함에 있어, CHO 5C11 주에는이의 개발의 DG44 단계 이후로 두가지 주요 트랜스팩션이 행해진다.
CHO DG44 주의 제 1 트랜스펙션에는 항체 IDEC 131 에 대한 코딩 서열을 포함하는 NEOSPLA 벡터를 사용하였다. 집단이 단일 세포로부터 유래되었을 것으로 생각되는 조건 하에 네오마이신에서 선택이 행해졌고, 항체-생산 세포주가 증대되었다. 얻어지는 고도 생산성 네오마이신-내성 세포주 중 하나인 G418을 추가 개발을 위해 선택하였다.
항체 생산성 G418 세포주를, 5nM, 50nM 및 최종적으로 500nM의 농도로 점진적으로 증가되는 메토트렉세이트에서 성장시켜 추가적으로 선택압 및 항체-발현 증폭시키되, 각 단계는 집단이 단일 세포로부터 유래하여 500E9로 확인된 세포주가 얻어졌을 것으로 생각되는 선택 조건 하에 실시되었다.
제 2 트랜스펙션 단계에서, 이 500nM 메토트렉세이트-내성 세포주를 벡터 pVgRXR 로 일렉트로포레이션에 의해 트랜스펙션하고 제오신(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)에서 선택하였는데, 이를 통해 스테로이드-유도성 발현 시스템이 숙주 세포에 주어진다. 얻어지는 후-트랜스펙션 제오신-내성 세포주를, 세포주가 단일 세포로부터 유래되었을 것으로 생각되는 조건 하에 선택하였다. 이어서, 스테로이드 유도가능 베타-갈락토시다제 유전자를 사용한 일시적 트랜스펙션에 의해 이러한 개별 세포주를 유도가능성에 대해 시험하고, 스테로이드-수용체 유도가능 세포주인, CHO 5C11을 얻었다. 세포주 CHO 5C11은 플라스미드 pVgRXR의 단일 통합 부위를 가지며, 단일 세포로부터의 이의 개연적인 유래를 강화한다.
이어서, 제 3 트랜스펙션 단계에서, CHO 5C11 주를 본 명세서에 개시된 본발명의 실시예에서 사용된 일련의 트랜스펙션된 주의 모체로 사용하였다. 인비트로겐 벡터계를 변형시켜 세개까지의 추가 개별 유전자를 더 발현하고 퓨로마이신 내성에 대한 우세한 선택가능 표지를 도입하였다. 따라서, 각각 (1) 녹색 형광 단백질(GFP),(2) GFP+Aven, (3)GFP+E1B-19K, 및 (4) GFP+Aven+E1B-19K (5) E1B-19K, 및 (6) Aven+EIB-19K를 포함하는 여섯개의 벡터 시스템을 구성하였다. GFP는 형광 표지 단백질이고, 이의 발현은 유세포분석법에 의한 선택이 가능하도록 한다. Aven 및 E1B-19K는 상기된 두가지 항-세포자멸사 단백질에 대한 유전자이다.
GFP를 포함하는 플라스미드의 경우, 후-트랜스펙션 세포 집단을 우선 퓨로마이신-선택압 하에 성장시켜, 다양한 트랜스펙션된 집단의 안정한 단백질-발현 풀을 얻는다. 이들 집단 각각의 스테로이드 유도에 반응하여 트랜스펙션된 유전자를 발현하는 능력을 유세포분석기 내에서의 스테로이드-유도된 GFP의 발현을 조사하여 추적하였고, 유세포분석법으로 고도 형광성 세포를 정확히 선택하여 모았다(pool). 다른 새로 트랜스펙션된 유전자를 세포 용해물의 웨스턴-블롯 연구로 확인하였다. 이러한 접근법을 통해, 단백질 발현 속도 면에서 동종인 세포 집단을 얻으나, 이 집단은 단일 세포로부터 유래하지 않는다.
다른 접근법에서, 트랜스펙션에서 유래하고, E1B-19K를 포함하는 벡터(5번, 상기 목록에서와 같음) 및 E1B-19K 및 Aven을 포함하는 벡터(6번, 상기 목록에서와 같음)를 사용한 안정한 형질전환에 대해 퓨로마이신-선택된 세포를, 잠재적으로 단일 세포인 배양물 내에 분리시키고, 고도 유도가능성 집단이 확인될 수 있는 시점까지 증대시켰다. 이어서, 이러한 잠재적으로 단일-세포-유래된 집단을 일련의 배양물로 증대시키고, 궁극적으로 하기된 바와 같이 실험예 3 및 4에 하기된 바와 같이 사용하였다.
실시예 4
세포 배양 시스템 및 배양액
CHO 5C11주를 무혈청 배양액 지브코 제품인(Gibco product)(Grand Island, NY)CHO SSFM II에서 성장시켰다. 고세포 밀도 배양물의 일부를 신선한 배양액을 갖는 새 배양으로 연속적으로 옮겨 세포 배양물을 연속적으로 성장시킨다. 하기된 바와 같이 시험예 7 및 8에서, 무혈청 CHO SSFM II 배양액의 무-글루코스 변형물을 사용하였다. 배치 또는 최종 배양물을 사용하여, 배양물 부피 1 내지 2㎖를 포함하는 세포 배양 접시 및 배양물 50 내지 200㎖를 포함하는 스피너 플라스크와 같은 소규모 시스템에서 실험 연구를 실시하였다.
본 발명을 광범위한 세포 종류, 배양 시스템 및 배양 배지에 적용할 수 있다. 일반적으로, 시판 배양 시스템은 1 내지 50,000ℓ의 부피를 갖는 생물 반응기 용기를 포함한다. 일반적으로 세포는 자유 현탁액에서 성장되나, 부착-의존성 및 응집된 세포인 예도 일반적이다. 다수의 문헌들이 대규모 배양 수단 및 이와 관련하여 고려할 사항에 대해 다루고 있다 ; 참고문헌은 다음과 같다. R.J.Freshney, Animal Cell Culture" A Practical Approach, 2nd Ed., Oxford University Press, New York, 1992 and M. Bulter, Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, Oxford University Press, New York, 1991. 세포 배양배지의 고려사항에 대해 상세히 언급한 대표적 문헌은 다음과 같다. ATCC Media Handbook, Coteal.al., published by the American Type Culture Collection, Rockville, MD, 1984.
실시예 5
도 6에 나타낸 이 연구에서, (1) GFP 단독, (2) GFP 및 Aven (3) GFP 및 E1B-19K, (4) GFP 및 Aven과 EIB19K의 조합으로 트랜스펙션된 세포, 및 (5) 비-트랜스펙션된 모세포의 생존을 세포 배양 접시에서 3일 배양한 배양물에서 비교하였다. 세포를 실험 배양을 개시할 때까지 일반적인 배양액, 즉 CHO SSFM II에서 성장시켰고, 그 결과, 배양액이 무-글루코스 배양액으로 변화되었고, 5μM의 포나스테론 A를 첨가함으로써 트랜스펙션된 유전자가 도입되었다. 무-글루코스 환경은, 세포를 중대한 영양소 위기에 처하도록 하여, 그 결과, 강한 세포자멸사 자극을 만든다.
무-글루코스 환경에서 1일 종료까지, 최초에 생존율 95%였던 모든 배양액이 생존율이 결핍되었으나, Aven+E1B-19K 배양물은 80%로 떨어진 반면, 모든 다른 배양물은 약 70%로 떨어졌다. Aven+E1B-19K 배양물은 다른 배양물에 비해 이후 2일동안 상당히 높은 생존율을 계속 보인다. 2일 종료시, E1B-19K-트랜스펙션 및 Aven-트랜스펙션으로 표시되는 두 배양물 대 GFP(단독) 및 비-트랜스펙션된 모주로 표시되는 두 대조구 배양물 간의 생존율에 큰 차이가 나타났다. 따라서, 2일에 Aven+E1B-19K 배양물의 생존율은 80%, Aven 및 E1B-19K 배양물의 생존율은 약 60% 인 반면, 대조구 배양물은 30% 내지 40%이다. 3일까지, Aven+E1B-19K 배양물은 75% 생존율, E1B-19K 배양물은 45% 생존율, 및 Aven 배양물 및 대조구 배양물 모두는 0생존율을 보인다.
이러한 데이터들은, 각 유전자인, E1B-19K 단독 및 Aven 단독의 발현이 영양소 결핍으로 스트레스를 받은 CHO 세포에서 항-세포자멸사 효과를 가지며, E1B-19K 단독의 발현은 Aven 단독의 효과보다 상당히 더 크다는 것을 보여준다. 두 유전자, E1B-19K 및 Aven는, 이들의 개별 효과에 비해, 함께 상승효과를 나타낸다. 즉, 조합 발현 효과는 이들의 개별 효과를 단순히 합한 것보다 크다. 후자의 결론은, Aven 단독은 3일에 생존이 증대되는 이점을 전혀 제공하지 않으나, E1B-19K와 조합시 이의 발현은 E1B-19K 단독 발현 세포보다 생존이 20% 증대된다는 관찰을 통해 지지된다.
실시예 6
도 7에 나타낸 이 연구에서, (1) GFP 단독으로 트랜스펙션된 세포, (2) GFP 및 Aven으로 트랜스펙션된 세포, (3) GFP 및 E1B-19K으로 트랜스펙션된 세포, (4) GFP 및 Aven과 EIB19K의 조합으로 트랜스펙션된 세포, 및 (5) 비-트랜스펙션된 모세포의 기능을 비교하였다. 다섯 세포 형태 각각을 포나스테론 A의 존재 및 부재하에 배양하여, 총 10 실험 그룹을 만들었다.
시험 스피너 배양의 개시 2일 전에, 5μM 포나스테론 A를 항-세포자멸사 유전자를 완전히 유도하기 위해 실험 기간 동안 스테로이드가 존재하도록 하려는 세포 배양액에 첨가하였다. 250K 세포/㎖를 일반적인 글루코스-포함 배양액 안의 스피너 플라스크에 접종함으로써 각 실험 배양을 개시하였다. 2일에, 배양액을 무-글루코스 배양액으로 바꾸고 배양을 계속하였다.
데이터를 시각화하기 쉽도록, 실험 결과를 생존율을 배양 일수의 함수로서 나타내는 다섯개의 그래프로 나눈다.
·도 7a는 포나스테론 A가 있거나 없이, 대조구 GFP-단독 배양물에서 2일까지 일어나는 생존율의 급격한 결핍을 보여준다.
·도 7b는 포나스테론 A가 있거나 없는 Aven 배양물과, (Aven 발현을 유도하는) 포나스테론의 존재가 배양 3일에 걸쳐 세포의 적은 % 생존을 증가시키는 효과를 갖는다는 것을 보여준다.
·도 7c는 포나스테론 A가 있거나 없는 E1B-19K 세포와, 두 배양물 모두의 생존율이 대조구(도 6a) 및 Aven 단독(도 6b)의 생존율보다 훨씬 크고, 스테로이드의 존재가 생존율을 크게 증가시키는 효과를 갖는다는 것을 보여준다.
·도 7d는 포나스테론 A가 있거나 없는 E1B-19K+Aven 세포를 보여준다. 포나스테론의 존재 하에 이들 세포의 생존율은, 모든 다른 배양물에서 이미 생존이 완전히 실패한 3일째에 80%이고, 배양 5일째가 되서야 생존율이 0으로 떨어진다.
·도 7e는 맞대어 비교할 목적으로 두 개의 가장 상이한 그룹인, 열등한 생존율을 보이는 GFP 대조 그룹 및 가장 높은 생존율을 보이는 E1B-19K 그룹에 촛점을 맞추되, 두 세포 형태는 각각 포나스테론의 존재 하에 있다.
이들 데이터는, E1B-19K 단독 및 Aven 단독 각각의 발현이 항-세포자멸사 생존율-증가 효과를 가지며, E1B-19K 단독의 효과는 Aven 단독의 효과보다 배우 크고 우수하고, 두 조합된 유전자의 발현은 상승효과를 보인다, 즉 개별 유전자 효과를 더함으로 기대되는 것보다 크다는 점에서, 실시예 1의 결과를 확인시킨다. 항-세포자멸사 효과가 구체적으로 이러한 트랜스펙션된 유전자의 발현과 관계된다는 것은 또한, 이 효과가 스테로이드 유도에 따라 전적으로 결정된다는 관찰에 의해 지지된다.
실시예 7
도 8에 나타낸 이 연구는, 양세포 배양물 성장 및 항체 생산 모두에 대한 E1B-19K 및 Aven 모두로 트랜스펙션된 안정한 세포주의 기능 대 대조구로서의 모 5C11 주의 기능의 비교를 포함하였다. 실시예 4에서 뿐만 아니라 이 실시예에서의 트랜스펙션된 세포주(E1B-19K 및 Aven)를 트랜스펙션 후 단일 세포 클로닝을 통해 얻었다.
스피너 플라스크 배양물을 3×105세포/㎖로 접종하고 9일동안 배치 배양으로서 성장시켰다. 트랜스펙션된 스테로이드-유도가능 유전자를 효과적으로 유도하는 5μM 농도의 스테로이드 포나스테론을 배양물 모두에 첨가하였다. 세포수를 얻고 항체 농도를 ELISA로 측정하기 위해 배양물 시료를 날마다 회수하였다.
이 데이터는 배양물이 6일까지 매우 유사한 기능을 갖는 것을 보여준다. 6일에, 대조구 배양물의 생존율이 E1B-19K+Aven 배양물의 생존율보다 약간 떨어졌고, E1B-19K+Aven의 항체 역가가 대조구 배양물의 항체 역가보다 약간 증가하였다는 점에서 약간 차이가 나타난다. 이어서 3일동안, 이러한 차이는 점차 커진다. 9일까지, 대조구 배양물의 생존율은 28%까지 떨어지는 반면, E1B-19K+Aven 배양물은 78%의 생존율을 갖는다. 대조구 배양물의 최종 역가는 247㎎/L였으나, E1B-19K+Aven 배양물의 최종 역가는 309㎎/L에 달했고 약 20% 증가하였다.
실시예 8
도 9에 나타낸 이 연구는 E1B-19K + Aven 으로 안정하게 트랜스펙션된 세포주 내에서의 스테로이드 유도의 효과에 대한 시험을 나타낸다. 따라서, E1B-19K + Aven 세포의 두 배양물을 300K 세포/㎖로 접종하였다; 2일에 5μM 포나스테론 A를 하나의 (실험) 배양물에 첨가하고, 다른(대조구) 배양물은 스테로이드를 첨가하지 않았다. 두 배양물은 배양 처음 6일동안 매우 유사한 기능을 보였으나, 스테로이드-유도된 배양물은 생존율이 약간 더 좋았다. 8일까지, 대조구 배양물의 생존율은 60%까지 떨어졌으나, 스테로이드-유도된 세포주는 90% 생존하였다. 9일에, 대조구 배양물의 생존율은 35%인 반면, 스테로이드-유도된 배양물은 70%였다. 마지막으로, 10일에, 대조구 배양물은 30% 생존한 반면, 유도된 세포주는 40% 생존하였다. 대조구 배양물의 최종 역가는 240mgs/ℓ인 반면, 스테로이드-유도된 배양물은 290mgs/ℓ로서 약 20% 증가하였다.
실시예 7 및 8은, 세포자멸사 스트레스가, 9 내지 10일에 걸쳐 증대되는 배치 배양 과정동안의 영양소 고갈 및 독성 생성 스트레스인 경우이다. 세포자멸사는, 대조구 세포의 경우, 배치 배양 약 6 또는 7일에 시작되는 세포의 급감으로 명백히 나타난다. 처음 두 실시예 모두의 결론은, 트랜스펙션된 항-세포자멸사 유전자 E1B-19K 및 Aven의 발현의 조합 효과가 배양물의 수명을 연장시켜 약 20%까지 배양물 항체 역가를 증가시키며, 이러한 두 유전자의 활성은 실제로 스테로이드 유도에 따라 결정된다는 것이다.
실시예 9
다른 단백질 치료 제품의 실시예
본 발명의 일 실시형태를 나타내는 상기 실시예들은 인간화된 항-CD154 항체(IDEC 131)의 생산과 관련이 있다. CD154는 CD40의 리간드로, 이는 미성숙 및 성숙한 B 림프구의 세포 표면 분자이고, 이는 항체에 의해 가교결합되는 경우에 B 세포 증폭을 유도한다.
치료 단백질 산물, 특히 항체, 및 당업자가 본 발명의 방법을 적용할 수 있는 포유류 세포 발효 과정에 의한 이의 제조에 대한 바람직한 실시예는 다음과 같다:
미합중국 특허 5,811,524호, 5,840,298호, 5,866,125호, 5,939,068호, 5,955,364호 및 5,958,765호에 기재된 바와 같은 인간 RSV 융합 단백질에 대한 항체.
미합중국 특허 5,736,137호 및 5,776,456호에 기재된 바와 같은 B 세포 림프종의 치료를 위해 설계된 인간 CD20에 대한 항체.
미합중국 특허 5,658,570호, 5,681,722호, 5,693,780호, 5,750,105호 및 5,756,096호에 기재된 바와 같은, 인간을 치료하기 위한 구세계 원숭이 부분 및 인간 부분을 포함하는 키메라 재조합 항체.
미합중국 특허 6,011,138호에 기재된 바와 같은, B 세포에 의한 IL-4 유도된 IgE 생산을 저해하는, 인간 감마 1 불변 도메인을 포함하는 모노클로날 항체인 인간 CD23에 대한 항체.
미합중국 특허 6,113,898호에 기재된 바와 같은, 자가면역 질환의 치료 및 이식 거부 방지에 특이 면역억제제로 사용되는, 인간 B7.1(CD80) 및 B7.2(CD86)에 대한 영장류화된 항체.
미합중국 특허 6,136,310호에 기재된 바와 같은, 구세계 원숭이 가변 서열 및 인간 불변 도메인 서열을 포함하는, 인간 CD4 감마 1 불변 도메인에 대한 키메라 항체.
실시예 10
Aven은 혈청 결핍 이후 BcI-x L 의 기능을 촉진한다
많은 포유류 세포는, 이들이 무혈청 환경 하에 성장하도록 적응되어 있지 않다면, 배양물 내에서 증식하기 위하여 혈청을 필요로 한다. 혈청은 세포에 성장 인자, 영양소, 대사산물, 호르몬 및 사이토카인을 제공하며, 생물반응기 배양동안 항-세포자멸사 효과를 제공한다. 본 발명자는 CHO-K1가 혈청 결핍 후 세포자멸사한다는 것을 알았다(도 10 및 Mastrangelo et al., Bioreg. Bioeng. 67(5): 544-54(2000), Figueroa et al., Bioreg. Bioeng. 7(3):211-222(2001)). 영양소 및 성장 인자 고갈이 생물학적 산물의 제조동안 발생할 수 있으므로, 세포 배양물 내에 이러한 환경의 모델로서 혈청 결핍 연구가 개시되었다.
이 결과를 극복하기 위하여 세포를 유전자 조작할 수 있는지를 확인하기 위하여, 10% FBS 에서 성장되고 Aven, Bcl-xL및 Bcl-xL+Aven 을 발현하는 CHO 세포를 연속적으로 무혈청 배양액에 노출시켰다. 이어서, 도 11a에 도시된 바와 같이, 결핍 수일 후 생존율을 조사하였다. 유전자 조작된 세포주는 혈청 결핍 2일 후까지 CHO K-1 모세포를 능가하는 것으로 관찰되었다. Aven 발현은 혈청 결핍 후 처음 2일동안 보호를 제공하였고, 이 때 배양물이 90% 보다 큰 생존율을 유지하도록 하였다. 사실상, 2일에 회수시 CHO-aven 세포의 생존율은 CHO-bcl-xL의 생존율보다 높았고 CHO-bcl-xL+aven의 생존율과 유사했다. 그러나, Bcl-xL에 의해 제공된 보호와 비교하면 혈청 회수 2일 후에 Aven의 발현에 의해 제공된 보호는 최소였다. 전체적으로, CHO-bcl-xL+aven은 CHO-bcl-xL, CHO-aven 및 모 CHO K-1을 능가했다. Aven 및 Bcl-xL의 조합으로 제공된 증진된 보호는 혈청 결핍 3일 후까지 명백하였고, 무혈청 배양액에 노출 후 5일동안 유지되었다. CHO-bcl-xL+aven 생존율은 20%를 조금 넘었고, CHO-bcl-xL은 이때 60%보다 낮은 생존율을 보였다. 보호가 연장된 기간동안 유지되었는지를 알아보기 위해 회수 9일 후에 생존율 측정이 또한 행해졌다(도 11b). 혈청 결핍 9일 후에, 모 CHO-K1 세포 생존율은 7% 였고, 하나의 항-세포자멸사 유전자를 발현하는 세포는 생존율이 10%를 약간 넘었다. 그러나, CHO-bcl-xL+aven은 24%의 생존율을 유지하였고, 이는 단지 하나의 유전자를 발현하는 세포의 생존율의 두배였고, 대조구보다 세배 높았다.
실시예 11
Aven은 4일 및 5일 소비된 배양액에서 BcL-x L 의 기능을 강화시킨다
영양소 및 성장 인자의 고갈과 함께 대사 찌꺼기 산물 및 세포의 사이토졸부스러기의 축적은 종종 많은 생물반응기 운전의 종료 전에 나타나며 세포 생존에 불리한 환경을 생성할 수 있다. 이러한 환경을 설계하기 위해, CHO 세포를 4일 및 5일 배양한 배양액에 노출시키고 Aven, BcL-xL및 BcL-xL+Aven의 발현 효과를 평가하였다. 소비된 배양액(spent medium)을 생성하기 위해, CHO K-1 세포를 통과시키고 배양액 수집 전에 DMEM 완전 배양액 중에서 4일 또는 5일 동안 증대시켰다. 수집 시간에 4일 및 5일 소비된 배양액 간에 세포의 생존율의 상당한 차이가 관찰되었다. CHO K-1 증대 4일 후, 대사 찌꺼기 산물의 축적, 혈청의 고갈(완충액 특성), 및 배양 자가분비 신호에 의해 배양액(황색/오렌지색)이 산성화되었으나, 배양액은 생존하였지만(75% 이상의 생존율) 100% 융합을 나타냈다. 배양한지 5일 후, CHO K-1 생존율이 30% 이하의 생존율로 매우 감소하였으며 세포는 배양액(강한 황색)의 추가 산성화를 수반하면서 플라스크로부터 완전히 떨어졌다. 배양액의 계속적인 산성화는 주로 큰 비율의 세포 사멸의 존재 및 세포 포함물의 배양액으로의 용해 및 방출에 기인할 것이다. 도 10에 나타난 바와 같이, 4일 및 5일 소비된 배양액 조건에 CHO 세포를 노출시켰더니 세포자멸사가 유도되었다.
소비된 배양액에서 세포 생존율을 검사하기 위해, 세포를 PBS로 두 번 세척하고 나서 소비된 배양액에 노출시켰다. 4일 지난 매질에 노출시킨 후, 유전자 조작된 CHO K-1 세포주는 거의 모든 시점에서 모 CHO K-1보다 높은 생존율(도 12a 및 도 12b)을 나타냈다. Aven 단독의 발현은 생존율이 모 CHO K-1와 동등한 수준(도 12a)까지 떨어진 시점에서 노출 3일 후에 대한 생존율을 강화시켰다. 이것이 클론또는 발현된 유전자의 특징인지를 확인하기 위해, 두 개의 서로 다른 CHO-aven클론을 4일 소비된 배양액에 노출시켰다. 흥미롭게도, 두 개의 클론 모두 처음 3일 동안 생존율이 증가되고 나서 야생형(wild-type) CHO 세포 또는 그 이하의 수준으로 하락하는 동일한 보호 특징 패턴을 나타냈다. 대조적으로, Bcl-xL를 발현한 CHO 세포는 4일 소비된 배양액에 대한 서로 다른 패턴의 감도를 나타냈다(도 12b). 노출 1일 후, CHO-bcl-xL은 CHO-K1을 포함하는 다른 세포주와 비교하여 생존율이 가장 현저히 하락했다. 노출 2일 후, CHO-bcl-xL생존율이 안정화되었으며 Bcl-xL의 발현은 소비된 배양액에 노출을 지속하는 동안 모 CHO-K1과 유사한 보호를 나타냈다. 4일 소비된 배양액에 매일 노출시켰을 때 CHO-bcl-xL+aven의 생존율은 CHO-aven, CHO-bcl-xL및 모 CHO-K1와 동등하거나 그 이상이었다. 두 개의 항-세포자멸사 유전자를 포함하는 세포주는 4일 소비된 배양액에 노출시킨 4일의 지속기간 내내 85% 이상의 생존율을 유지하였으며, 이러한 동일한 시점에 모 CHO-K1 및 CHO-aven의 생존율은 약 40%였다.
4일 소비된 배양액에 노출시켰을 때의 세포사멸율과 비교하여 5일 소비된 배양액에 노출시킨 후에 세포사멸율이 상당히 증가하였다. 5일 소비된 배양액에 노출시킨 세포에 대한 세포 배양물 생존율은 도 12c에 나타난 바와 같이 2일 노출시킨 후 심하게 떨어진다. 4일 소비된 배양액에서 CHO-K1의 생존율은 68%이었으며, 이 수준은 5일 지난 배양액의 독성 증가의 결과로 급격히 14%로 떨어졌다. 그러나, 다시 한번, 유전자 조작된 CHO 세포주는 모 CHO K-1을 능가하였다. 두 개의 서로 다른 클론의 발현은 모 CHO K-1에 대해 비교할 경우 5일 소비된 배양액에 노출시켜 유도된 예정된 세포사멸에 대해 약간의 보호를 제공한다. Bcl-xL의 발현은 5일 소비된 배양액에서 40%를 초과하는 생존율로 독성에 대해 훨씬 더 많은 보호를 제공한다. 5일 소비된 배양액에 노출 시킨 후의 세포사멸율은 상기 환경에 노출시킨지 2일 후에 48%의 생존율을 갖는 Bcl-xL및 Aven의 공동-발현에 의해 최대로 변화되었다. 그러나, Bcl-xL을 단독으로 사용하여 두 개의 유전자를 발현시켜 얻어지는 강화된 보호는 보다 독성인 5일 소비된 배양액에서는 4일 소비된 배양액에서 이미 관찰된 것만큼 크지 않았다. CHO-bclxL+aven의 생존율은 4일 소비된 배양액 중의 CHO-bclxL보다 내내 거의 20% 포인트 높았으며, 고도로 산성화되고 독성을 갖는 5일 소비된 배양액과의 차이는 8% 포인트 이하였다.
실시예 12
엑디손 유도가능 발현 시스템을 사용한 추가 결핍 연구
본 실시예에 사용되고 이미 기재된 엑디손 유도가능 시스템 및 벡터 시스템은 도 13a 및 13b에 개략적으로 도시되어 있다. 도 13c에 추가로 나타난 바와 같이, pVgRXR로부터 RXR과 VgEcR이 발현되고, 리간드(포나스테론 A)를 추가하면 헤테로다이머인 RXR과 VgEcR이 변형된 엑디손 수용체 내의 VP16 트랜스활성화 도메인으로부터 활성화된 전사를 갖는 하이브리드 엑디손 반응 성분(EGRE)에 결합하도록 유도된다.
도 14에 나타난 바와 같이, α-GFP, α-Aven 또는 α-E1B-19K를 발현하는 이러한 유도가능한 발현 시스템을 포함하는 CHO 세포를 5 μM 포나스테론 A를 사용하여유도하였다.
도 15에 나타난 바와 같이, 이러한 유도가능한 발현 시스템을 사용하여 글루코스 결핍 실험을 수행하고(실험 시작 전 48시간 동안 5μM 포나스테론 A를 사용하여 6-웰 배양액에서 세포 집단을 유도하였다) 시간의 경과에 따른 세포 생존율을 측정하였다. 도 16은 GFP 대조구에 대한 스피너 플라스크 결과를 포함하며, 도 17은 E1B-19K를 발현하는 세포에 대한 결과를 포함하고, 도 18은 스피너 플라스크에서 글루코스 결핍 조건 하에 E1B-19K 대 GFP를 발현하는 세포의 세포 생존율을 포함하여 이루어지는 결과를 포함한다.
도 19, 20 및 21은 각각 포나스테론 A로 유도한 후 Aven, Aven + E1B19K, 및 Aven + E1B19K 대 GFP의 발현을 비교하는 실험의 결과를 포함한다.
이러한 결과는 포나스테론 A를 사용한 유도 후 Aven과 E1B-19K가 안정하게 발현되고, Aven 단독으로는 글루코스 결핍에 의해 개시된 세포자멸사에 대해 거의 보호를 제공하지 않았지만, Aven의 공동-발현은 글루코스 결핍에 의해 개시된 세포자멸사에 대한 E1B-19K 보호를 강화시켰다는 추가적인 증거를 제공한다.
실시예 13
IDEC-131 항-세포자멸사 세포주(14C6)를 사용한 결과
본 실시예에서, CHO 세포주(단일 세포 분리)를 발현하는 IDEC-131을 500 nM메소트렉세이트와 접촉시키고 제오신 내성 조건 하에서 배양된 5C11을 생산하기 위해 스테로이드 수용체 헤테로다이머를 구조적으로 발현하는 pVgRXR 벡터(인비트로겐 벡터)로 트랜스펙션시킨다.
그리고 나서 이 세포를 특정 항-세포자멸사 유전자(변형된 인비트로겐 벡터는 Aven + E1B-19K 유전자를 포함함)로 변형된 동일한 유도가능 발현 벡터로 트랜스펙션시키고, 포나스테론 A로 상기 세포를 유도하고 트랜스펙션된 세포를 제오신/퓨로마이신 내성 조건 하에서 배양하였다(이 실험은 도 22에 개략적으로 나타나 있다).
그리고 나서 세포주를 성장률, 특이적 생산성(pg/세포/일), 유도가능한 단백질 발현(웨스턴 블롯법에 의해), 및 항체 역가(ELISA/HPLC)를 포함하는 기준에 기초하여 원형 500 E9 세포주와 비교하였다.
이 실험에서, 14개의 세포주가 E1B-19K를 발현하고 Aven과 E1B19K 모두를 발현한 것으로 평가되었다. 유도 및 비유도 조건 하에서 100 ㎖ 부피, 1 x 2배, 2 x 3배에서 세 가지 실험을 수행하였다.
이 실험의 결과는 도 22 내지 26에 포함되어 있다. E1B19K의 발현은 세포 배양물 지속기간(w/wo 유도)을 연장하였지만 세포 성장에 명백한 효과를 나타냈으며 항체 생산을 증진시키지 않았음을 나타낸 결과가 이에 포함된다.
대조적으로, Aven + E1B 19K를 공동-발현한 세포는 배양물의 지속기간을 유도 후 3일까지 연장시켰으며, 항체 역가를 상당히 증진시켰다(모 CHO 세포주 500E9에 비해 20-30%까지). 이들 세포는 이들 항-세포자멸사 유전자의 저수준 구조적 발현을 나타낸다.
실시예 14
생물반응기 연구 #1
이 실험에서, 세 개의 세포주(14C6, 15C3 및 15E2)를 5 ℓ 생물반응기에서 유가배양법(fed batch process)으로 평가하였다. 단일 반응기, 유도 대 비유도된 조건 하에서 이중 반응기를 사용하고 3가지 서로 다른 방법, 및 고밀도 접종법을 사용하여 이 실험을 수행하였다.
이러한 생물반응기 연구의 결과는 도 28 내지 31에 포함되어 있다. 이 연구 결과는 유도 및 비유도된 15C3 세포주가 500E9보다 높은 세포 생존율, 생존가능한 세포 밀도 및 역가를 가졌음을 나타낸다.
상기 실험 결과는 또한 15C3의 특이적 생산성이 14C6보다 높았지만 둘다 500 E9 세포주보다는 낮았음을 나타낸다. 또한 포나스테론 유도는 15C3 세포주의 항체 역가를 개선시키지는 않았음이 관찰되었다.
실시예 15
생물반응기 연구 #2
이 실험에서, 유도된 초기 대수기 조건 하에서 유도제로 포나스테론 A를 재사용하여, 다시 15C3 항체 생산 세포주를 배양하였다. 이 결과는 도 32 내지 37에 포함되어 있으며 비유도된 배양물이 500E9 세포주보다 높은 생존율, 세포 밀도, 및 역가를 생산하였음을 나타낸다.
구체적으로, 비유도된 배양물에서의 항체 역가는 500E9 세포주에서보다 20-30% 높았다. 또한 유도는 배양물 수명을 증가시켰지만 항체 역가를 개선시키지는 않았으며 특이적 생산성은 500E9 세포주보다 낮은 것으로 관찰되었다.
실시예 16
생물반응기 연구 #3
동일한 500E9 및 15C3 세포주를 100% 신선 배양액에서 고밀도로 접종하고, 중간-대수기에서 유도하는 것을 특징으로 하는 제 3 생물반응기 연구를 수행하였다. 이 연구의 결과는 도 35 내지 37에 포함되어 있다. 이 결과는, 15C3 배양물이 500E9보다 높은 세포 유도체 및 역가를 생산하였으며 비유도 배양물 역가는 500E9보다 20-30% 높았음을 나타낸다. 이 결과는 또한 15C3의 특이적 생산성이 500E9보다 낮았음을 나타낸다.
따라서, 결론적으로 상기 실시예에 기재된 실험의 결과는, CHO DG44 세포주가 배양을 연장시키고 글루코스를 제거할 경우 세포자멸사적 세포 사멸을 겪으며, 항-세포자멸사 유전자를 단독으로 또는 조합하여 발현하는 세포주는 시험된 항-세포자멸사 유전자(Aven 및 E1B-19K 유전자)를 모두 발현하는 CHO 세포주에 대해 스피너 플라스크 및 생물반응기 배양에서 세포 생존율 및 생산성의 증가를 나타낸다는 것을 입증한다.
이 결과는, 바람직하게 엑디손 유도가능 발현 시스템에서와 같이 유도가능한 프로모터의 조절 하에서의 하나 이상의 항-세포자멸사 유전자의 발현이 예를 들어, 원하는 재조합 단백질을 생산하는 포유류 세포 배양물과 같은 세포 배양물의 특이적 생산성을 증진시키는 실용적인 수단을 제공함을 나타낸다.
본 출원에 인용된 모든 특허 및 비특허 참조문헌은 전체 개시내용이 본 명세서에 참조병합된다.
연구 결과의 상세한 설명이 본 발명의 몇몇 실시형태에 기재되지만, 상기 기재내용은 단지 예시일 뿐이며 개시된 발명의 제한이 되지는 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 하기의 특허청구범위에 의해서만 제한될 것이다.

Claims (61)

  1. 세포 내에서 하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현시켜 세포 내에서의 예정된 세포사멸을 예방하거나 지연시키는 단계를 포함하여 이루어지고, 세포 내에서 하나의 항-세포자멸사 폴리펩타이드가 발현될 경우 항-세포자멸사 폴리펩타이드가 Aven이 아닌 것을 특징으로 하며, 상기 세포가 마우스 골수종 세포가 아닌 것을 특징으로 하는, 재조합 세포에서 예정된 세포사멸을 예방하거나 지연시키는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 세포가 하나 이상의 원하는 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 이종 폴리뉴클레오타이드를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 원하는 폴리펩타이드가 항체, 효소, 수용체, 사이토카인, 세포-표면 인자, 세포 대사산물, 세포-분비 인자, 바이러스 인자, 및 막-결합 인자로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 항체가 항-CD154 항체(IDEC-131), 항-CD20 항체(Rituxan,ZevalinTM), 항-B7 항체(IDEC 114), 항-CD23 항체(IDEC 152), 항-CD4 항체(IDEC151), 및 항-종양 항원 항체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드의 발현이 상기의 하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 결합된 하나 이상의 유도가능한 이종 프로모터에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 유도가능한 이종 프로모터가 스테로이드에 의해 유도가능한 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 유도가능한 이종 프로모터가 엑디손 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 5항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 상기의 하나 이상의 유도가능한 이종 프로모터에 작동가능하게 결합된 스크리닝가능하거나 선택가능한 마커를 더 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 스크리닝가능하거나 선택가능한 마커가 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 강화된 녹색 형광 단백질(EGF)인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 항-세포자멸사 폴리펩타이드가 진핵 세포 또는 바이러스 내의 유전자에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항에 있어서,
    항-세포자멸사 폴리펩타이드가 Bcl-xL, Bcl-2, Aven, E1B-19K, 및 p35로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항에 있어서,
    하나의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 항-세포자멸사 폴리펩타이드가 E1B-19K인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1항에 있어서,
    두 개 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현하는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 두 개 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드가 E1B-19K 및 Aven을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 인간 세포, 마우스 세포, 및 설치류 세포로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 CHO 5C11인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 16항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 BHK 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 상업적 생산용인 대규모 생물반응기 또는 배양 장치 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 세포 내에서 하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현시켜 세포에 의한 세포-관련 산물의 생산을 증가시키는 단계를 포함하여 이루어지고, 세포에 하나의 항-세포자멸사 폴리펩타이드가 발현될 경우 항-세포자멸사 폴리펩타이드가 Aven이 아닌 것을 특징으로 하는, 재조합 세포에 의한 세포-관련 산물의 생산을 증가시키는 방법.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 세포-관련 산물이 재조합 단백질, 항체, 효소, 수용체, 사이토카인, 세포-표면 인자, 세포 대사산물, 세포-분비 인자, 바이러스 인자, 막-결합 인자, 및폴리뉴클레오타이드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서,
    상기 항체가 항-CD154 항체(IDEC-131), 항-CD20 항체(Rituxan, ZevalinTM), 항-B7 항체(IDEC 114), 항-CD23 항체(IDEC 152), 항-CD4 항체(IDEC151), 및 항-종양 항원 항체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 22항에 있어서,
    하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드의 발현이 상기의 하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 결합된 하나 이상의 유도가능한 이종 프로모터에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25항에 있어서,
    상기 유도가능한 이종 프로모터가 스테로이드에 의해 유도가능한 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 25항에 있어서,
    상기 유도가능한 이종 프로모터가 엑디손 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 25항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 상기의 하나 이상의 유도가능한 이종 프로모터에 작동가능하게 결합된 스크리닝가능하거나 선택가능한 마커를 더 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28항에 있어서,
    상기 스크리닝가능하거나 선택가능한 마커가 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 강화된 녹색 형광 단백질(EGF)인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 22항에 있어서,
    상기 항-세포자멸사 폴리펩타이드가 진핵 세포 또는 바이러스 내의 유전자에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 22항에 있어서,
    항-세포자멸사 폴리펩타이드가 Bcl-xL, Bcl-2, Aven, E1B-19K, 및 p35로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 22항에 있어서,
    하나의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현시키는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서,
    상기 항-세포자멸사 폴리펩타이드가 E1B-19K인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 22항에 있어서,
    두 개 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현시키는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 34항에 있어서,
    상기 두 개 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드가 E1B-19K 및 Aven을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 22항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 인간 세포, 마우스 세포, 및 설치류 세포로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 36항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 38항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 CHO 5C11인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 36항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 BHK 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 22항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 상업적 생산용인 대규모 생물반응기 또는 배양 장치 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 세포 내에서 하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현시켜 재조합 세포의 생산을 증가시키는 단계를 포함하여 이루어지고, 세포 내에서 하나의 항-세포자멸사 폴리펩타이드가 발현될 경우 항-세포자멸사 폴리펩타이드가 Aven이 아닌 것을 특징으로 하는, 재조합 세포의 생산을 증가시키는 방법.
  43. 두 개 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현하거나 발현할 수 있는 세포-관련 산물의 생산에 유용한 재조합 세포.
  44. 제 43항에 있어서,
    항-세포자멸사 폴리펩타이드가 진핵 세포 또는 바이러스 내의 유전자에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
  45. 제 43항에 있어서,
    상기 항-세포자멸사 폴리펩타이드가 Bcl-xL, Bcl-2, Aven, E1B-19K, 및 p35로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
  46. 제 43항에 있어서,
    상기 두 개 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드가 E1B-19K 및 Aven을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 세포.
  47. 제 43항에 있어서,
    상기 세포-관련 산물이 재조합 단백질, 항체, 효소, 수용체, 사이토카인, 세포-표면 인자, 세포 대사산물, 세포-분비 인자, 바이러스 인자, 막-결합 인자, 및 폴리뉴클레오타이드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 43항에 있어서,
    상기 항체가 항-CD154 항체(IDEC-131), 항-CD20 항체(Rituxan, ZevalinTM), 항-B7 항체(IDEC 114), 항-CD23 항체(IDEC 152), 항-CD4 항체(IDEC151), 및 항-종양 항원 항체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 43항에 있어서,
    하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드의 발현이 상기의 하나 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 결합된 하나 이상의 유도가능한 이종 프로모터에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 49항에 있어서,
    상기 유도가능한 이종 프로모터가 스테로이드에 의해 유도가능한 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 49항에 있어서,
    상기 유도가능한 이종 프로모터가 엑디손 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 49항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 상기의 하나 이상의 유도가능한 이종 프로모터에 작동가능하게 결합된 스크리닝가능하거나 선택가능한 마커를 더 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 52항에 있어서,
    상기 스크리닝가능하거나 선택가능한 마커가 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 강화된 녹색 형광 단백질(EGF)인 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 43항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 43항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 인간 세포, 마우스 세포, 및 설치류 세포로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 43항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 56항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 CHO 5C11인 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 43항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 BHK 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 43항에 있어서,
    상기 재조합 세포가 상업적 생산용인 대규모 생물반응기 또는 배양 장치 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 두 개 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현하거나 발현할 수 있는 세포의 하나 이상의 생물학적 기능을 생성하는 데 유용한 세포의 집단.
  61. 두 개 이상의 항-세포자멸사 폴리펩타이드를 발현하거나 이를 발현할 수 있는 세포 치료법에 유용한 세포의 집단.
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