JP4435563B2 - アポトーシスプロセスの阻害および細胞性能の改善 - Google Patents

Description

（関連出願）
本出願は、２００１年７月１０日出願の米国仮特許出願番号６０／３０３，８１３号（この全体が参考として援用される）に対する優先権を主張する。

（発明の分野）
本発明は、組換え細胞におけるプログラム細胞死を防止するかまたは遅延させることに関する。より詳細には、本発明は、組換え細胞におけるプログラム細胞死を、この細胞内に１つ以上の抗アポトーシス性ポリペプチドを発現させることによって阻害することに関する。

本発明はさらに、組換え細胞による細胞関連産物（例えば、組換えタンパク質（例えば、抗体））の生成を、この細胞内に１つ以上の抗アポトーシス性ポリペプチドを発現させることによって増加させることに関する。さらに、本発明は、抗アポトーシス性ポリペプチドを発現する組換え細胞を提供する。このような細胞は、細胞療法について、または細胞関連産物の生成（特に、商業的生成の大規模バイオリアクターにおいて）について、有用である。

（発明の背景）
製薬製造環境または商業用製造環境における真核生物細胞による高価な治療用タンパク質または診断用タンパク質の生成は、利用可能な発酵器容積および発酵プロセス時間に関してストリンジェントな制約にさらされる。長期にわたる製造用発酵系列の観点から、生成効率は、操作の単位時間当たりのタンパク質生成速度を最大化すること、操作していない時間の最小化、および生成速度が遅い間の操作時間部分の最小化に由来する。

製造用設定におけるタンパク質生産性を増大させるためのある広範なアプローチは、容器内の細胞密度を増加させることである。細胞密度のかなりの増加は、適切にバランスのとれた培養培地処方物の開発によって、栄養素給餌アプローチによって、および細胞を保持する系を介した培地の灌流によって達成され得る。これらのアプローチはまた、細胞密度の増加に加えて、バッチ培養物の寿命全体を増加させることにおいて効果的であり得る。

製造生産性を増大させるための別の基本的アプローチは、細胞自身によるタンパク質生成速度を増加させること（すなわち、特定の細胞生産性（生成したタンパク質の量／細胞／日）を増加させること）である。伝統的には、高率の生産性を有する細胞を獲得する方法は、多段階工程として生じる。ここで、第１に、細胞の大集団が、目的のタンパク質についての遺伝子でトランスフェクトされ、そして第２に、より単一細胞クローンの大きな集団が増殖され、より高い生成細胞株が、さらなる細胞株開発のために同定および選択される。トランスフェクトされた細胞集団において出現するタンパク質生成速度に関する不均質は、一般に、第１に、宿主細胞のゲノムへの新たな遺伝物質の組込み位置の差異、そして第２に、組込まれたＤＮＡ配列の総数（コピー数）の差異に起因する。よって、宿主ゲノムへの異種性ＤＮＡ組込みの部位を標的化するための方法もまた開発されており、その結果、このＤＮＡ配列は、ＲＮＡへの高レベルの転写に関連する部位へ組込まれ得る。これらのアプローチの例は、ＮＥＯＳＰＬＡベクターに関する米国特許第５，６４８，２６７号、同第５，７３３，７７９号、同第６，０１７，７３３号、および同第６，１５９，７３０号、ならびに相同組換えに関する米国特許第５，８３０，６９８号および同第５，９９８，１４４号によって提供される。

また、目的のタンパク質についての遺伝子の、毒性因子に対する耐性を付与するタンパク質についての別の遺伝子との同時トランスフェクションは、高生成細胞を選択する方法を提供する。増殖細胞を漸増濃度のこのような毒性因子に曝露することによって、耐性遺伝子のより多くのコピー数を有する細胞が選択される。これらの細胞は、しばしば耐性遺伝子のゲノム増幅のプロセスを行うことが見出される。目的のタンパク質をコードする隣接遺伝子の同時増幅は、しばしば所望のタンパク質の細胞特異的生成のレベル増加を導く（Ｒｉｎｇｏｌｄ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ １（３）：１６５−７５（１９８１）；Ｋａｕｆｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９（４）：６０１−２１（１９８２））。

細胞培養物製造プロセスの生化学的操作とは全く別の起源を用いる生物学的研究の分野において、過去１０年以上にわたってアポトーシス（プログラム細胞死のプロセス）について大いに研究された。これらの発展に伴う概念上の進歩は、細胞死を生じる天然の生理学的プロセスが存在するということである。もちろん、細胞死はまた、細胞の完全性を破壊する外傷の直接的かつ迅速な結果として生じ得る。その際、細胞またはその残りは、壊死に至る。アポトーシスは、本質的には天然または発達段階での広範な種々の環境または刺激によって、疾患プロセスの一部としてかまたは生理学的ストレスに応じて開始され得る。例えば、発達段階でのプロセス（これによって器官が成熟するかまたは再編成する）は、他の新たな種類の細胞の出現を導く特定の種類の細胞の死を含み得る。よって、遺伝子レベルおよび生化学レベルでアポトーシスを理解すること、ならびにアポトーシスを促進するかまたは停止するかのいずれかで介在する方法についての研究は、医科学においてかなり興味ある領域として現れる。

しかし、アポトーシスはまた、哺乳動物細胞のインビトロでの培養中に必然的に生じる細胞死についての主要な経路として認識されるようになった。細胞培養の基本形態（研究室および大規模製造環境の両方で行われる）は、バッチ培養と呼ばれる。バッチ培養は、健康で活動的に増殖する細胞接種物を用いて開始され；この培養物は、ピークの細胞密度まで増殖し、減衰期に入り、そしてこの細胞集団が死に絶えるまでの経過をたどる。細胞培養物の後の減衰期は、環境がその細胞にストレス性となる（栄養素が欠乏する場合）とき、および毒性代謝物の濃度が増加するときである。さらに、発酵環境自体が他のストレス性因子（例えば、ハードウェア、混合に伴う流体および気体の乱流、ならびにパイプおよびラインを介する培養物の移動によって作製される剪断力）を提供し得る。これらの因子（栄養素の制限、培養物中の毒性因子、および物理的ストレス）の全てが、培養中の細胞におけるアポトーシスを開始し、よって、その培養物全体としての平均寿命を制限する役割を担うことが示された。

アポトーシスプロセスにおいて重要な役割を担うタンパク質のいくつかが、最近発見され、そしてこれらの遺伝子が、単離およびクローニングされた。Ｅ１Ｂ−１９Ｋは、アデノウイルスタンパク質であり、これは、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシス性のメンバーである。感染に対するこの細胞の応答は、アポトーシスカスケードを開始することである。この防御機構を使用して、感染細胞を組織から除去する。しかし、特定のウイルスは、アポトーシスを抑制する感染プロセスの初期に発現したタンパク質をコードすることによってアポトーシス応答と戦う方法を発展させた。アデノウイルス感染の間、細胞中のウイルス遺伝子発現は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域によって調節される。Ｅ１領域は、２つの転写単位（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）から構成される。Ｅ１Ｂ単位は、アデノウイルスの異なる２つの腫瘍抗原（１９ｋＤａタンパク質および５５ｋＤａタンパク質）をコードする。アポトーシスのインヒビターであるＥ１Ｂ−１９Ｋの作用は、細胞死経路において多段階でアポトーシスを阻害する抗アポトーシス性タンパク質Ｂｃｌ−２の作用と類似することが理解される。アポトーシス抑制の１つの機構は、ミトコンドリア膜の安定化を介しこれによってサイトゾルへのチトクロムＣおよび他のプロアポトーシス性因子の放出を防止する、と考えられている（Ｖａｎｄｅｒ Ｈｅｉｄｅｎ Ｃｅｌｌ ９１（５）：６２７−３７（１９９７））。チトクロムＣは、カスパーゼカスケードの開始に関連する複合体中のＡｐａｆ−１への結合に関連する。Ｚｏｕ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（１７）：１１５４９−５６（１９９９）。Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー（Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌ）はまた、Ａｐａｆ−１に直接結合することによってＡｐａｆ−１の活性化をブロックする（Ｈｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（１０）：５４８１−５（１９９８）；ＰＮＡＳ ９５（８）：４３８６−９１（１９９８））。

別の抗アポトーシス性タンパク質は、遍在性膜タンパク質であるＡｖｅｎである。Ａｖｅｎの抗アポトーシス性活性は、カスパーゼアクチベーターＡｐａｆ−１の自己結合を妨害することによってカスパーゼ９の活性化を阻害するその能力に帰する（Ｃｈａｕ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．６：３１−４０（２０００））。Ａｖｅｎはまた、ＢＨＫ（新生児ハムスター腎臓）細胞においてＢｃｌ−Ｘ_Ｌの抗アポトーシス性活性を増強することが示されており、このことは、ＡｖｅｎとＢｃｌ−Ｘ_Ｌとの間の相互作用を示唆する（Ｃｈａｕ（２０００））。

タンパク質生産性を増加させるための上記の種々のアプローチの全てが、種々の程度で首尾よく行われてきた。にもかかわらず、特に、大規模商業的生成において、細胞関連産物（例えば、組換えタンパク質）の生成を増加する方法の開発の必要性がなお存在する。さらに、プログラム細胞死を防止するかまたは遅延させるための方法を開発する必要性が、存在する。

（発明の要旨および目的）
本発明の目的は、組換え細胞でのプログラム細胞死を防止するかまたは遅延させる方法を提供することである。ここで、この細胞は、マウス骨髄腫細胞ではない。本方法は、１つ以上の抗アポトーシス性ポリペプチド（例えば、細胞性Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ、Ｂｃｌ−２、Ａｖｅｎ、またはウイルスタンパク質Ｅ１Ｂ−１９Ｋおよびｐ３５）をその細胞中で発現させる工程またはその発現を誘導する工程を包含し、その結果、その細胞でのプログラム細胞死は、防止されるかまたは遅延される。ここで、この細胞においてある抗アポトーシス性ポリペプチドを発現させる場合、この抗アポトーシス性ポリペプチドは、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ相互作用因子（例えば、Ａｖｅｎ）ではない。

より詳細には、１つ以上の所望のポリペプチド（例えば、抗体（例えば、抗ＣＤ１５４（ＩＤＥＣ−１３１）抗体、抗ＣＤ２０抗体（例えば、ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（ＡＴＣＣ受託番号６９１１９によって生成される非ホジキン病リンパ腫の処置についてのＦＤＡ承認を有するキメラ抗ＣＤ２０（Ｚｅｖａｌｉｎ^ＴＭ））、抗ＣＤ８０（ＩＤＥＣ１１４）抗体、抗ＣＤ２３抗体（ＩＤＥＣ１５２）、抗ＣＤ４抗体（ＩＤＥＣ１５１）、および抗腫瘍抗原抗体、酵素、レセプター、サイトカイン、細胞表面因子、細胞代謝物、細胞分泌因子、ウイルス因子、ならびに膜結合因子）をコードする１つ以上の異種性ポリヌクレオチドを含む組換え細胞でのプログラム細胞死を防止するかまたは遅延させる方法を提供することが、本発明の目的である。

組換え細胞による細胞関連産物の生成を増加させる方法を提供することが、本発明の別の目的である。本方法は、細胞において１つ以上の抗アポトーシス性ポリペプチドを発現させる工程またはこの発現を誘導する工程を包含し、その結果、この細胞による細胞関連産物の生成が増加される。ここで、この細胞においてある抗アポトーシス性ポリペプチドを発現させる場合、この抗アポトーシス性ポリペプチドは、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ相互作用因子（例えば、Ａｖｅｎ）ではない。

組換え細胞の生成を増加させる方法を提供することが、本発明のなお別の目的である。本方法は、細胞において１つ以上の抗アポトーシス性ポリペプチドを発現させる工程またはこの発現を誘導する工程を包含し、その結果、組換え細胞の生成が増加される。ここで、この細胞においてある抗アポトーシス性ポリペプチドを発現させる場合、この抗アポトーシス性ポリペプチドは、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ相互作用因子（例えば、Ａｖｅｎ）ではない。

細胞関連産物を生成するために有用な組換え細胞を提供することが、本発明の別の目的である。この組換え細胞は、少なくとも２つの抗アポトーシス性ポリペプチドを発現するか、またはそれを発現するように誘導され得る。

細胞の１つ以上の生物学的機能を生成するために有用な細胞集団を提供することが、本発明のなお別の目的である。この細胞集団は、少なくとも２つの抗アポトーシス性ポリペプチドを発現するか、またはそれを発現するように誘導され得る。

細胞療法に有用な細胞集団を提供することが、本発明のさらに別の目的である。この細胞集団は、１つ以上の抗アポトーシス性ポリペプチドを発現するか、またはそれを発現するように誘導され得る。

（発明の詳細な説明）
上記のように、本発明は、組換え細胞（特に、組換え細胞、好ましくは、細胞関連産物を生成する哺乳動物細胞）におけるプログラム細胞死の防止または遅延に関する。細胞におけるアポトーシスを阻害することが細胞生存率および細胞性能を向上させるということが、本発明の発見である。よって、本発明は、組換え細胞にて１つ以上の抗アポトーシス性ポリペプチドを発現させることによってこの細胞でのプログラム細胞死を防止するかまたは遅延させる方法を提供する。本発明はまた、組換え細胞において１つ以上の抗アポトーシス性ポリペプチドを発現させることによってこの細胞での細胞関連産物の生成を増加させる方法を提供する。さらに、本発明は、細胞関連産物の生成または細胞療法について有用な組換え細胞を提供する。

このアプローチが培養物中での哺乳動物細胞および他の真核生物細胞における細胞死を阻害する能力を使用して、目的の細胞によって生成される任意のネイティブなタンパク質もしくは異種性タンパク質またはウイルスの生成を潜在的に改善し得る。ネイティブまたは異種性である目的の産物標的としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：抗体、サイトカイン、増殖因子、ホルモン、血清タンパク質、レセプター、酵素、リガンド、細胞分泌因子、細胞代謝物、およびウイルスベクター（これらは、哺乳動物細胞または他の真核生物細胞によって天然に生成されるか、または遺伝子操作後に生成される）。遺伝子操作技術は、標準的組換えＤＮＡ技術を含む。ここで、目的の標的遺伝子は、組込まれた遺伝子が異種性タンパク質として発現することを可能にするために、哺乳動物ゲノムまたは染色体外エレメントに組込まれる。本出願に記載される技術は、細胞培養プロセスが進行する間にアポトーシスが生じる全ての哺乳動物細胞株および他の真核生物細胞に適切である。適切な細胞株としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、新生児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＦＯ哺乳動物細胞および他の真核生物細胞（例えば、Ｓｆ−９細胞、Ｓｆ−２１細胞およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ昆虫細胞）。これらの細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）のような供給源より取得され得る。このような技術は、プログラム細胞死を被る任意の真核生物細胞に適切であり得、そして上記で列挙されたタンパク質のような目的の異種性タンパク質を生成するために遺伝子操作され得る。

標的タンパク質およびウイルスは、バイオテクノロジーでの適用または製薬での適用のために哺乳動物細胞または他の真核生物細胞において生成され得るものを含む。この技術を用いる適用のために可能性のあるいくつかの目的のタンパク質としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：増殖因子およびサイトカイン（例えば、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子（増殖因子）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、インターロイキン１α、インターロイキン１β、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン６、インターロイキン８、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１３、インターロイキン１５、インターロイキン１７およびインターロイキン１８、インターフェロンαおよびインターフェロンγ、内皮増殖因子、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、インスリン、レプチン、神経成長因子、腫瘍壊死因子α、血小板由来増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、骨形態形成タンパク質ならびに幹細胞因子）；酵素（例えば、ヌクレアーゼ、トリプシン、アプロチニンおよびキナーゼ）；細胞培養試薬（例えば、ラミニン、コラーゲンおよびフィブロネクチン）；血漿タンパク質および血清タンパク質（例えば、トランスフェリン組織プラスミノーゲンアクチベーター、プラスミノーゲン、プラスミン、およびトロンビンならびに第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子および第Ｘ因子）；サイトカイン、サイトカインレセプター、増殖因子および他のレセプター、リガンド、ならびに細胞関連因子に対するモノクローナル抗体；レセプター（例えば、腫瘍壊死因子レセプター１および腫瘍壊死因子レセプター２；エリスロポエチンレセプター、トランスフェリンレセプター、インターロイキンレセプター、レプチンレセプター、ＰセレクチンおよびＬセレクチン、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ）；リガンド（例えば、ＦＡＳリガンドおよびＣＤリガンド）；代謝物（例えば、脂質、脂肪、ヌクレオチドおよび炭水化物）；ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）。このリストは、現在生成される多くの異種性タンパク質および他の産物を含むが、この技術は、他の現在のタンパク質および産物ならびに未知のタンパク質および産物にも同等に適切である。ここで、培養物中の真核生物の生成細胞は、生成プロセスの間にアポトーシスを被る。

本発明によれば、細胞における１つ以上の抗アポトーシス性ポリペプチドの発現は、当業者に公知の任意の適切な手段によって達成され得る。例えば、１つ以上の抗アポトーシス性ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド構築物を導入し得る。このような構築物は、発現構築物であり得、そして１つ以上の抗アポトーシス性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された少なくとも１つの誘導性プロモーターを含み得る。１実施形態において、エクジソン誘導性の系を使用して、ステロイドによる用量依存的な様式で１つ以上の抗アポトーシス性ポリペプチドの発現を制御する。このような系は、米国特許第５，５３４，４１８号（その全内容が、本明細書中で参考として援用される）に詳細に記載されている。

他のプロモーターもまた適用可能である。真核生物細胞において有用な適切なウイルス転写プロモーターの例は、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、ラウス肉腫ウイルスおよびサイトメガロウイルス由来のプロモーターである。異種遺伝子の転写を刺激するトランス活性化転写活性化因子が、プロモーターを活性化するために使用され得る。例えば、ＳＶ ４０ Ｔ抗原、アデノウイルスのＥ１Ａタンパク質およびＥ１Ｂタンパク質は、異種遺伝子の特定のウイルスプロモーター（ＣＭＶ主要中間初期（ｍａｊｏｒ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）（ＭＩＥ）プロモーターを含む）に対して作用し得る。トランス活性化活性を有する他の分子としては、ヘルペスウイルスの最初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）タンパク質、Ｃ−ｍｙｃならびにヒトおよびサルのＡＩＤＳウイルスの遺伝子が挙げられる。

別の実施形態において、発現構築物は、誘導性プロモーターおよびスクリーニング可能なマーカーまたは選択マーカーを含み、その結果、１つ以上の抗アポトーシス性ポリペプチドを発現する細胞は、選択または検出され得る。任意の適切な選択マーカーまたはスクリーニングマーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦ））が、本発明のために使用され得る。

本発明によれば、１つ以上の抗アポトーシス性ポリペプチドが発現され得る。抗アポトーシス性ポリペプチドとしては、細胞におけるアポトーシスを阻害または低減する能力を有する任意のポリペプチドが挙げられる。例えば、抗アポトーシス性ポリペプチドは、異種ポリヌクレオチド（例えば、真核生物細胞またはウイルス中の遺伝子）によってコードされ得る。１実施形態において、抗アポトーシス性ポリペプチドは、Ｂｃｌ−２ファミリー、Ａｖｅｎファミリー、アデノウイルスもしくはバキュロウイルスの抗デス（ｄｅａｔｈ）タンパク質ファミリーのメンバー、またはこれらのフラグメントである。別の実施形態において、抗アポトーシス性ポリペプチドは、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ、Ａｖｅｎ、Ｅ１Ｂ−１９Ｋまたはｐ３５である。なお別の実施形態において、１つの抗アポトーシス性ポリペプチドが発現される場合、このポリペプチドは、Ａｖｅｎでも、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ相互作用因子でも、カスパーゼ−１誘導性のアポトーシスから細胞を保護する因子でも、チトクロムｃおよびｄＡＴＰによるカスパーゼの活性化を阻害する因子でも、抗アポトーシスＢｃｌ−２メンバーに結合する因子でも、Ａｐａｆ−１に結合する因子でもない。

組換え細胞において、抗アポトーシス性ポリペプチドは、単独でかまたは他と組み合わせて発現され得る。例えば、Ａｖｅｎのみを発現し得るか、またはＡｖｅｎおよびＥ１Ｂ−１９Ｋを同時発現し得る。１つ以上の発現構築物が、２つ以上の抗アポトーシス性ポリペプチドを発現するために使用され得る。１実施形態において、組換え細胞は、１つ以上の他の抗アポトーシス性ポリペプチドと組み合わせて、Ａｖｅｎを発現する。

本発明の組換え細胞としては、当業者に公知かつ入手可能な任意の適切な細胞が挙げられる。１実施形態において、この組換え細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、マウス細胞または齧歯類細胞）である。別の実施形態において、この組換え細胞は、ＢＨＫ細胞またはＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯ ５Ｃ１１）である。さらに、本発明の方法は、市販の大規模なバイオリアクタまたは培養デバイスにおいて、組換え細胞に適用され得る。他の適切な細胞としては、ＣＯＳ、ＣＶ−１、ＳＰ２／０およびハイブリドーマが挙げられる。

１実施形態によれば、本発明の組換え細胞は、１つ以上の所望のポリペプチドをコードする１つ以上の異種ポリヌクレオチドを含む。このようなポリペプチドとしては、限定ではなく、抗体、酵素、レセプター、サイトカイン、細胞表面因子、細胞代謝物、細胞分泌因子、ウイルス因子および膜結合因子のいずれかが挙げられ得る。１実施形態において、このようなポリペプチドとしては、限定ではなく、抗ＣＤ１５４（ｇｐ３９）抗体（ＩＤＥＣ−１３１）、抗ＣＤ２０（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｚｅｖａｌｉｎ^ＴＭ）抗体、抗ＣＤ８０（Ｂ７．１）抗体（ＩＤＥＣ １１４）、抗ＣＤ２３抗体（ＩＤＥＣ １５２）、抗ＣＤ４抗体（ＩＤＥＣ １５１）および抗腫瘍抗原抗体を含む抗体が挙げられる。

本発明の別の特徴によれば、１つ以上の抗アポトーシス性ポリペプチドを発現することは、組換え細胞による細胞関連産物の産生を増大させる。細胞関連産物は、細胞性能に起因して産生される任意の産物であり得る。例えば、細胞関連産物は、組換えタンパク質もしくは内因性タンパク質、抗体、酵素、レセプター、サイトカイン、細胞表面因子、膜結合因子またはポリヌクレオチドの発現であり得る。１実施形態において、細胞関連産物は、ウイルス因子、細胞代謝物または任意の細胞成分である。別の実施形態において、細胞関連産物は、細胞自体であり得る。

本発明はまた、細胞関連産物を産生するために有用な組換え細胞を提供する。これらの細胞は、１つ以上の抗アポトーシス性ポリペプチドを発現するか、または発現するように誘導され得る。１実施形態において、これらの細胞は、少なくとも２つの抗アポトーシス性ポリペプチドを発現する。これらの細胞はまた、その増大した生存性および細胞性能（例えば、細胞関連産物の増大した産生）に起因して、細胞療法のために使用され得る。

本発明をさらに例示するために、以下の実施例を提供する。これらの実施例は、本発明をさらに限定することを意図せず、そして本発明をさらに限定するとは解釈されない。

（実施例１）
（ベクターおよびトランスフェクション）
ＩＤＥＣ所有の発現ベクター（ＮＥＯＳＰＬＡと称される）（図１）は、エキソン１およびエキソン２に分割されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、抗体ＩＤＥＣ １３１をコードするヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子および抗体ＩＤＥＣ １３１をコードするヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子を含む。このＮＥＯＳＰＬＡベクターを、本発明の好ましい実施形態の細胞株の開発中に、第１ラウンドのトランスフェクションにおいて使用した。このＮＥＯＳＰＬＡ発現ベクターは、米国特許第５，６４８，２６７号、同第５，７３３，７７９号、同第６，０１７，７３３号、同第６，１５９，７３０号（これら４つ全ては、その全体が本明細書中で参考として援用される）に実質的に記載されている。

ヒト化抗ＣＤ１５４抗体（ＩＤＥＣ １３１）は、本明細書中に記載されるような本発明の実施形態によって産生される、所望の重要性の高いタンパク質である。ＣＤ１５４は、ＣＤ４０のリガンドであり、ＣＤ４０は、未成熟Ｂリンパ球および成熟Ｂリンパ球の細胞表面分子であり、これは、抗体によって架橋されると、Ｂ細胞増殖を誘導する。抗ＣＤ１５４抗体は、米国特許第６，００１，３５８号（これは、その内容が本明細書中で参考として援用される）に実質的に記載されている。

誘導性プロモーター系を、好ましい実施形態において、構成的プロモーターよりも利用する。なぜなら、構成的プロモーターは、抗アポトーシス遺伝子の構成的発現が、特に継続的に増殖する必要がある産生細胞株において、長期にわたって細胞分裂を妨害し得るからである。しかし、本発明のいくつかの特定の実施形態において、抗アポトーシス遺伝子の構成的発現は、適切かつ所望され得ることは、全く可能である。

本発明の好ましい実施形態において使用されるベクターｐＶｇＲＸＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡより）は、エクジソン誘導性の発現系を特徴とする。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来の機能的ハイブリッドエクジソンステロイドホルモンレセプターの両方のサブユニットは、調節ベクターｐＶｇＲＸＲから構成的に発現されるが、目的の遺伝子の発現を最終的に駆動するハイブリッドエクジソン応答性プロモーター（ｐ−Δ−ＨＳＰ）は、第二のステロイドホルモン誘導性発現ベクター上に位置する。哺乳動物細胞は、最初にｐＶｇＲＸＲでトランスフェクトされ、次いで安定な細胞株（これは、おそらく、機能的なハイブリッドエクジソンステロイドホルモンレセプターを発現する）は、Ｚｅｏｐｃｉｎへの曝露によって選択される。誘導因子ステロイドであるポナステロンＡ（ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ Ａ）の存在下で、機能的なハイブリッドエクジソンステロイドホルモンレセプターは、ハイブリッドエクジソン応答性プロモーターの上流に結合し、それによって、目的の遺伝子の発現を活性化する。ステロイドホルモンがこれらの細胞株に供給される場合、ステロイドホルモン誘導性プロモーターからの転写を刺激するその能力は、βガラクトシダーゼのような容易に測定可能な遺伝子産物を用いる、誘導性発現ベクターの一過性のトランスフェクションによって測定され得る。これらの安定なＺｅｏｃｉｎ耐性細胞のほとんどは、ステロイド応答性遺伝子を誘導しない。

ステロイド誘導を支持するに十分なレベルでハイブリッドステロイドホルモンレセプターを安定に発現する改変細胞株を樹立した後、ステロイド応答性プロモーターの制御下で目的の遺伝子、およびピューロマイシンについての優性選択マーカー遺伝子を含むプラスミドが、この細胞株にトランスフェクトされる。次いで、このプロモーターを安定に発現する細胞株が、ピューロマイシンについての選択によって、誘導される。次いで、これらの細胞株は、ステロイドホルモンが提供される場合の、目的の遺伝子を誘導する能力についてアッセイされる。これらの細胞株のほとんどは、ステロイドによって誘導されない。上記のように、ステロイド誘導系は、Ｅｖａｎｓによる米国特許第５，５３４，４１８号（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）に実質的に記載されている。

このエクジソン誘導性の系を、本発明の細胞株の実施形態の開発の、ＩＤＥＣ １３１抗体後の段階の、第二ラウンドおよび第三ラウンドにおいてそれぞれ使用した。第二のトランスフェクション工程は、ＩＤＥＣ １３１細胞株へのｐＶｇＲＸＲの導入であった。第三のトランスフェクション工程は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子を伴うかまたは伴わないかのいずれかの、エクジソン誘導性遺伝子の導入であった。

Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの発現ベクターｐＩＮＤを、３つのさらなる目的の遺伝子に対応し得るように改変し、そして優性の選択マーカー遺伝子であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼの除去、および選択可能なピューロマイシン耐性遺伝子によるその置換によってさらに改変した。これらの引き続くラウンドのトランスフェクションにおいて、発現ベクターの改変は、Ａｖｅｎ遺伝子、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ遺伝子およびこれら両方の遺伝子を一緒に保有する実施形態（各々の場合において、ＧＦＰを伴うかまたは伴わない）を含む。このようなベクターの例を、図２および図３に示す。図２は、改変されたＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎの発現ベクターＰＸ＋Ｅ１Ｂ−１９Ｋを示し；図３は、改変されたＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎの発現ベクターＰＸ＋Ａｖｅｎ＋Ｅ１Ｂ−１９Ｋを示す。これらのようなベクターを、第三ラウンドのトランスフェクションにおいて使用して、これら２つの抗アポトーシスタンパク質を、単独および組み合わせての両方で発現する細胞株を作製した。ＧＦＰが、ステロイド誘導に応答してこれらのＣＨＯ細胞において発現される場合、フローサイトメトリーによる、高発現ステロイド誘導性細胞を分別および選択する際に有用な、ＧＦＰは、タンパク質発現の陽性マーカーを提供する。

Ａｖｅｎ ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列およびＡｖｅｎポリペプチドのアミノ酸配列についての詳細な配列表を、図４に示す；Ｅ１Ｂ−１９Ｋ ｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列およびＥ１Ｂ−１９Ｋポリペプチドのアミノ酸配列についての配列表を、図５に示す。

（実施例２）
（細胞集団の誘導）
治療タンパク質の商業的製造において使用される哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）は、代々無制限に、連続的な分裂ラウンドを受け続け得る、不死化細胞株である。これは、正常な二倍体動物細胞の初代培養物（これは、約５０世代での分裂の老化および停止として現れる、有限の寿命を有する）とは、非常に対照的である。

一般に、細胞株の均質性の標準的なレベルは、単一の細胞に由来する細胞集団を有することによって達成される。集団が単一の細胞先祖供給源を有することは、完全には立証可能ではないと考えられるが、この場合に非常に高い可能性を生じるとして受容される、厳密な方法が確立されている。単一細胞クローニングとして公知のこの手順は、統計的に細胞培養ウェルへ分割される単位容積中に１個未満の細胞が存在する点まで、培養培地中に懸濁細胞を希釈することによって達成される。可視的かつ自動化された方法が、培養ウェル当たり１個以下の細胞の存在を確実にするために、この統計的方法を援護する。従って、これらのウェル内に小さい集団が出現する場合、これらは、単一の細胞に由来する可能性が高いとみなされ得る。このアプローチは、以下に詳述される実施例７および実施例８において使用される細胞集団の発達において使用されるアプローチである。

均質な細胞集団を得るための別のアプローチは、細胞プールを選択することであり、これらの細胞は、フローサイトメトリーによって測定され得る基準によって、表現型的に均質である。フローサイトメトリーは、個々の細胞の蛍光散乱特徴または光散乱特徴を１個ずつ測定し、これらの測定に基づいて各々の細胞を収集または拒絶するという決定を行う方法である。これは、非常に均質な細胞プールを作製し得る強力な方法であり、この細胞プールは、次いで、増殖され得、そして特定の集団として貯蔵され得る。この集団は均質であり得るが、上記のような単一細胞由来の集団からの任意の測定によっては識別不能であり得、単一の細胞供給源標準によって規定されるようなクローン性であるとはみなされない。このフローサイトメトリー法の利点は、所望の特性について均質の大集団が、単一細胞に起源する集団よりも、かなり迅速に獲得され得ることである。このフローサイトメトリー選択手順は、以下の実施例５および実施例６において使用される集団の生成において使用される手順である。フローサイトメトリーにより選択可能な特徴は、以下に詳述するように、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現であった。

（実施例３）
（細胞株履歴）
ＣＨＯ ５Ｃ１１細胞株（本発明に記載される細胞株の直接の親）は、抗アポトーシス遺伝子の発現ならびに本明細書中に記載される本発明の方法および好ましい実施形態の実施を支持する、２つの重要な特徴を有する。この親細胞株は、所望のタンパク質（抗体ＩＤＥＣ １３１）を分泌し、そして細胞質ゾルハイブリッドエクジソンステロイドホルモンレセプター（これは、抗アポトーシス遺伝子の発現が誘導される系の成分である）を発現する。

ＣＨＯ ５Ｃ１１細胞株は、Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにて開発されたチャイニーズハムスター卵巣細胞株である、ＣＨＯ ＤＧ４４に由来する（Ｕｒｌａｕｂ、ＰＮＡＳ ８３（１７）：６５１９−２３（１９８６））。このＣＨＯ ＤＧ４４株は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現を欠損し、従って、ゲノム増幅について選択するために使用される毒性因子であるメトトレキセートに対する耐性を獲得するために、トランスフェクトされたＤＨＦＲの発現に依存する。その現在の状態への開発段階において、ＣＨＯ ５Ｃ１１株は、ＤＧ４４の開発段階以降、２つの主要なトランスフェクション事象を経た。

ＣＨＯ ＤＧ４４株の最初のトランスフェクションは、抗体ＩＤＥＣ １３１のコード配列を含むＮＥＯＳＰＬＡベクターによるトランスフェクションであった。ネオマイシンでの選択を、集団が単一細胞に由来した可能性がある条件下で実施し、そして抗体産生細胞株を増殖させた。得られた高産生性ネオマイシン耐性細胞株の１つであるＧ４１８を、さらなる開発のために選択した。

抗体産生Ｇ４１８細胞株を、さらなる選択圧、ならびに５ｎＭ、５０ｎＭおよび最終的に５００ｎＭの濃度で段階的に増大するメトトレキセート中での増殖による抗体発現増幅に供した。集団が単一細胞に由来した可能性がある選択条件下で実施される各工程により、５００Ｅ９として特定される細胞株を得た。

第二のトランスフェクション工程において、この５００ｎＭメトトレキセート耐性細胞株を、ベクターｐＶｇＲＸＲを用いるエレクトロポレーションによってトランスフェクトし、そしてＺｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡより）（これは、宿主細胞において、ステロイド誘導性発現系を付与する）中で選択した。得られたトランスフェクション後のＺｅｏｃｉｎ耐性細胞株を、細胞株が単一細胞に由来した可能性がある条件下で選択した。次いで、これらの個々の細胞株を、ステロイド誘導性β−ガラクトシダーゼ遺伝子を用いる一過性のトランスフェクションによって誘導性について試験して、ステロイドレセプター誘導性細胞株であるＣＨＯ ５Ｃ１１を得た。この細胞株ＣＨＯ ５Ｃ１１は、プラスミドｐＶｇＲＸＲの単一の組み込み部位を有し、単一細胞からのその誘導の尤度を強化する。

第三のトランスフェクション工程において、次いで、ＣＨＯ ５Ｃ１１株を、以下に開示される本発明の実施例において使用されるトランスフェクト株シリーズについての親として使用した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのベクター系を、３個までのさらなる別個の遺伝子のさらなる発現およびピューロマイシン耐性についての優性な選択マーカーの導入を可能にするように改変した。従って、それぞれ以下を含む、６つのベクター系を構築した：（１）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、（２）ＧＦＰ＋Ａｖｅｎ、（３）ＧＦＰ＋Ｅ１Ｂ−１９Ｋ、および（４）ＧＦＰ＋Ａｖｅｎ＋Ｅ１Ｂ−１９Ｋ、（５）Ｅ１Ｂ−１９Ｋおよび（６）Ａｖｅｎ＋Ｅ１Ｂ−１９Ｋ。ＧＦＰは、蛍光を発するマーカータンパク質であり、その発現により、フローサイトメトリーによる選択が可能となる。ＡｖｅｎおよびＥ１Ｂ−１９Ｋは、２つの上記の抗アポトーシスタンパク質の遺伝子である。

ＧＦＰ含有プラスミドの場合、トランスフェクション後の細胞集団を、最初に、ピューロマイシン選択圧下で増殖させて、種々のトランスフェクト集団の、安定なタンパク質発現プールを得た。これらの集団の各々が、ステロイド誘導に応答してトランスフェクトされた遺伝子を発現する能力を、フローサイトメーターにおいてステロイド誘導性のＧＦＰの発現をモニタリングすることによって追跡し、そして高度に蛍光を発する細胞を、フローサイトメトリーによって陽性に選択し、そしてプールした。他の新たにトランスフェクトされた遺伝子の発現を、細胞溶解物のウエスタンブロット研究によって確認した。このアプローチにより、タンパク質発現の速度に関して均質な細胞集団が得られるが、この集団は、単一細胞に由来しない。

別のアプローチにおいて、Ｅ１Ｂ−１９Ｋを含むベクター（上記で列挙した番号５）およびＥ１Ｂ−１９ＫとＡｖｅｎとを含むベクター（上記で列挙した番号６）を用いたトランスフェクションに由来し、そして安定な形質転換についてピューロマイシンで選択された細胞を、潜在的に単一細胞培養物へと単離し、そして高度に誘導性の集団が単離され得る点まで増殖させた。次いで、このような潜在的に単一細胞に由来する集団を、連続培養によって増殖させ、そして最終的に、以下に詳述される実験実施例３および４において使用した。

（実施例４）
（細胞培養系および培地）
ＣＨＯ ５Ｃ１１株は、無血清培地ＣＨＯ ＳＳＦＭ ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）製品）中で増殖されている。細胞培養物を、高い細胞密度の培養物の一部を、新鮮な培地を有する新たな培養物へと連続的に継代することによって、継続的に増殖させる。以下に詳述される実験実施例７および８において、無血清ＣＨＯ ＳＳＦＭ ＩＩ培地の、グルコースを含まない改変型を使用した。バッチ培養物または最終培養物を使用する実験的研究は、小規模系（例えば、１〜２ｍｌの培養物容積を含む細胞培養皿、および５０〜２００ｍｌの容積の培養物を含む攪拌（スピナー）フラスコ）で実施されている。

本発明の実施は、広範な種々の細胞型、培養系および培養培地に対して適用され得る。一般に、市販の培養系は、１リットルと５０，０００リットルとの間の範囲の容積を有するバイオリアクタ容器を含む。一般には、細胞を遊離（ｆｒｅｅ）懸濁で増殖させるが、接着依存性の細胞および凝集細胞の例もまた、一般的である。多数の参考文献番号は、大規模培養および関連の考慮事項を意味する；例示的な参考文献は、Ｒ．Ｊ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第２版、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｒ Ｙｏｒｋ、１９９２およびＭ．Ｂｕｔｌｅｒ、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１である。細胞培養培地の考慮事項について詳述している代表的な参考文献は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、１９８４によって刊行された、ＣｏｔｅらのＡＴＣＣ Ｍｅｄｉａ Ｈａｎｄｂｏｏｋである。

（実施例５）
この研究（図６に示される）において、（１）ＧＦＰのみをトランスフェクトされた細胞、（２）ＧＦＰおよびＡｖｅｎをトランスフェクトされた細胞、（３）ＧＦＰおよびＥ１Ｂ−１９Ｋをトランスフェクトされた細胞、（４）ＧＦＰならびにＡｖｅｎおよびＥ１Ｂ−１９Ｋの組合せをトランスフェクトされた細胞、ならびに（５）非トランスフェクト親細胞の生存を、細胞培養ディッシュ中での３日間の培養で比較した。細胞を、実験培養の開始まで通常培地（すなわち、ＣＨＯ ＳＳＦＭ ＩＩ）で増殖し、実験培養の開始のときに、培地を無グルコース培地に変え、そしてトランスフェクトされる遺伝子の導入を、５μＭポナステロンＡの添加によってもたらす。無グルコース環境によって、細胞が、重大な栄養危機に供され、従って、強力なアポトーシス刺激が作り出される。

無グルコース環境における１日目の結論として、全ての培養物（初期生存度９５％を有した）は、生存度の減少を被ったが、Ａｖｅｎ＋Ｅ１Ｂ−１９Ｋ培養物の生存度は、８０％に減少した一方で、他の培養物は、全て約７０％に減少した。Ａｖｅｎ＋Ｅ１Ｂ−１９Ｋ培養物は、次の２日間にわたって、他の培養物よりも有意に高い生存度を示し続ける。２日目の結果として、生存度の有意差は、Ｅ１Ｂ−１９ＫトランスフェクションおよびＡｖｅｎトランスフェクションを表す２つの培養物と、ＧＦＰ（単独）および非トランスフェクト親株により表される２つのコントロール培養物との間で表れた。従って、２日目に、Ａｖｅｎ＋Ｅ１Ｂ−１９Ｋ培養物の生存度は、８０％であり、Ａｖｅｎ培養物の生存度およびＥ１Ｂ−１９Ｋ培養物の生存度は、両方とも約６０％であり、一方、コントロール培養物は、３０％〜４０％である。３日目に、Ａｖｅｎ＋Ｅ１Ｂ−１９Ｋ培養物は、７５％の生存度であり、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ培養物は、４５％の生存度であり、そしてＡｖｅｎ培養物および両方のコントロール培養物は、ゼロの生存度を示す。

これらのデータは、各遺伝子、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ単独およびＡｖｅｎ単独の発現が、栄養欠乏によるストレスを受けるＣＨＯ細胞における抗アポトーシス効果を有し、そしてＥ１Ｂ−１９Ｋ単独の発現の効果がＡｖｅｎ単独よりもかなり大きいことを示す。２つの遺伝子（Ｅ１Ｂ−１９ＫおよびＡｖｅｎ）の効果はともに、それらの個々の効果に対して相乗的である（すなわち、組合せ発現の効果は、それらの個々の効果の単純な加算よりも大きい）。後者の結論は、Ａｖｅｎ単独が３日目になんの生存限界の利益を提供しないようである一方、Ｅ１Ｂ−１９Ｋとの組合せでの発現は、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ単独を発現する細胞よも２０％高い生存限界を与えるという観察により支持される。

（実施例６）
この研究（図７に示される）において、（１）ＧＦＰのみをトランスフェクトされた細胞、（２）ＧＦＰおよびＡｖｅｎをトランスフェクトされた細胞、（３）ＧＦＰおよびＥ１Ｂ−１９Ｋをトランスフェクトされた細胞、（４）ＧＦＰならびにＡｖｅｎおよびＥ１Ｂ−１９Ｋの組合せをトランスフェクトされた細胞、ならびに（５）非トランスフェクト親細胞の性能を比較した。５個の細胞型のそれぞれを、ポナステロンＡの存在下および非存在下で培養し、このようにして合計１０の実験群を作製した。

試験スピナー（ｓｐｉｎｎｅｒ）培養の開始の２日前に、５μＭポナステロンＡを細胞の培地に添加した。この培地には、抗アポトーシス遺伝子の完全な導入をもたらすために、実験期間の間、ステロイドが存在すべきであった。各実験培養は、２５０Ｋ細胞／ｍｌをスピナーフラスコ中で、正常グルコース含有培地に播種することによって開始された。２日目に、培地を無グルコース培地に変更し、そして培養を続けた。

データの視覚化を容易にするために、実験からの結果を、培養の日数の関数として、生存度を示す５つのグラフに分けた。

・図７ａは、ポナステロンＡを伴うおよび伴わないコントロールＧＦＰ単独培養物において、２日目までに生じる生存度の急激な減少を示す。

・図７ｂは、ポナステロンＡを伴うおよび伴わないＡｖｅｎ培養を示し、ポナステロンの存在（これは、Ａｖｅｎ発現を誘導する）は、培養の３日目まで、少ない割合の細胞の生存増加に効果を有することを示す。

・図７ｃは、ポナステロンＡを伴うおよび伴わないＥ１Ｂ−１９Ｋ細胞を示し、そして両方の培養物の生存度が、コントロール（図６ａ）およびＡｖｅｎ単独（図６ｂ）の生存度よりも有意に高いことを示し、そしてステロイドの存在が、顕著に増加した生存をもたらすことを示す。

・図７ｄは、ポナステロンＡを伴うおよび伴わないＥ１Ｂ−１９Ｋ＋Ａｖｅｎ細胞を示す。ポナステロンの存在下でのこれらの細胞の生存度は、全ての他の培養物がすでに完全に死滅した３日目に、８０％まで延び、生存度が０に落ちる培養の５日目まで生きて死滅しない。

・図７ｅは、接戦した（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ）比較のために２つの最も異なる群（乏しい生存度を示すＧＦＰコントロール群、および非常に高い生存度を示すＥ１Ｂ−１９Ｋ群；ポナステロンの存在下での２つの細胞型のそれぞれ）に焦点を当てる。

これらのデータは、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ単独およびＡｖｅｎ単独のそれぞれの発現が、抗アポトーシス生存度増加効果を有すること、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ単独の効果が、Ａｖｅｎ単独の効果よりも非常に重大となりそして大きいこと、および２つの遺伝子の組合せの発現が、相乗的効果（すなわち、個々の遺伝子効果の加算から予期される結果よりも大きな結果）を生じるという点で、実施例１の結果を確証付けた。抗アポトーシス効果が、これらのトランスフェクトされた遺伝子の発現に特異的に関連付けられることは、これらの効果がステロイド誘導に完全に依存するという観測によってさらに支持される。

（実施例７）
この研究（図８に示される）は、Ｅ１Ｂ−１９ＫおよびＡｖｅｎの両方をトランスフェクトされた安定な細胞株の性能と、コントロールとしての親５Ｃ１１株の性能とを、両方の細胞培養物の増殖および抗体産生に関して比較することを含んだ。この実施例ならびに実施例４においてトランスフェクトされた細胞株（Ｅ１Ｂ−１９ＫおよびＡｖｅｎ）、トランスフェクション後、１回の細胞クローニングによって誘導された。

スピナーフラスコ培養物を、３×１０^５細胞／ｍｌで播種し、そして９日間、バッチ培養として増殖させた。５μＭの濃度のステロイドポナステロン（これは、トランスフェクトされたステロイド誘導性遺伝子を効果的に誘導する）を、両方の培養物に添加した。培養サンプルを細胞数を得るためおよびＥＬＩＳＡによる抗体濃度測定のために毎日取り出した。

このデータは、培養物が、６日目まで、非常に類似した性能を有することを示す。６日目にはコントロール培養物の生存度が、Ｅ１Ｂ−１９ｋ＋Ａｖｅｎ培養物の生存度よりわずかに下に減少し、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ＋Ａｖｅｎの抗体価がコントロール培養物の抗体価よりもわずかに上に増加するという点で、小さな差異が見られる。次の３日間にわたって、これらの差異は、次第に大きくなる。９日目までに、コントロール培養物の生存度は、２８％まで減少するのに対して、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ＋Ａｖｅｎ培養物は、７８％の生存度を有する。コントロール培養物の最終力価は、２４７ｍｇ／Ｌであるが、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ＋Ａｖｅｎ培養物の最終力価は、３０９ｍｇ／Ｌ（約２０％の増加）に達した。

（実施例８）
この研究（図９に示される）は、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ＋Ａｖｅｎを安定にトランスフェクトした細胞株における、ステロイド誘導の効力に関する試験を表す。従って、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ＋Ａｖｅｎ細胞の２つの培養物を３００Ｋ細胞／ｍｌで播種し；５μＭのポナステロンＡを、２日目に１つの（実験）培養物に添加し、一方、他の（コントロール）培養物は、いかなるステロイドも受容しなかった。２つの培養物は、最初の６日間の培養の間、非常に類似した性能を示すが、ステロイド誘導培養物は、わずかにより良い生存度を示す。８日目までに、コントロール培養物の生存度は、６０％まで減少し、一方、ステロイド誘導細胞株は、９０％の生存を維持した。９日目に、コントロール培養物の生存度は、３５％であったが、ステロイド誘導培養物は、７０％であった。最後に、１０日目において、コントロール培養物は、３０％の生存度であったが、誘導細胞株は、４０％の生存度であった。コントロール培養物の最終力価は、２４０ｍｇ／リットルであったが、ステロイド誘導培養物の最終力価は、２９０ｍｇ／リットル（約２０％の増加）であった。

実施例７および８は、アポトーシスストレスが栄養欠乏のストレスである場合であり、そして毒性は、９〜１０日間にわたるバッチ培養の過程にわたって蓄積する。アポトーシスは、細胞の急激な全滅（これは、コントロール細胞の場合、バッチ培養のおよそ６日目または７日目あたりで始まる）として明示される。トランスフェクトされた抗アポトーシス遺伝子Ｅ１Ｂ−１９ＫおよびＡｖｅｎの発現の組合せ効果が、培養の寿命を延ばすこと、約２０％培養抗体力価を増加すること、そしてこれら２つの遺伝子の活性が、ステロイド誘導に実際に依存していることが、最初の２つの実施例と合わせた結論である。

（実施例９）
（他のタンパク質治療産物実施例）
上記実施例は、本発明の１つの実施形態を示し、ヒト化抗ＣＤ−１５４抗体（ＩＤＥＣ１３１）の産生に関する。ＣＤ１５４は、ＣＤ４０に対するリガンドであり、ＣＤ４０は、未成熟Ｂリンパ球および成熟Ｂリンパ球の細胞表面分子であり、これは、抗体によって架橋される場合、Ｂ細胞増殖を誘導する。

治療タンパク質産物（特に、抗体）、および当業者が本発明の方法を適用し得る哺乳動物細胞発酵プロセスによるそれらの製造の好ましい例は、以下の通りである：
ヒトＲＳＶ融合タンパク質に対する抗体（米国特許第５，８１１，５２４号、同第５，８４０，２９８号、同第５，８６６，１２５号、同第５，９３９，０６８号、同第５，９５５，３６４号、および同第５，９５８，７６５号に記載される）。

ヒトＣＤ２０に対する抗体（Ｂ細胞リンパ腫の処置のために設計された）（米国特許第５，７３６，１３７号および同第５，７７６，４５６号に記載される）。

キメラ組換え抗体（ヒト治療のために、旧世界ザル部分およびヒト部分を含む）（米国特許第５，６５８，５７０号、同第５，６８１，７２２号、同第５，６９３，７８０号、同第５，７５０，１０５号および同第５，７５６，０９６号に記載される）。

ヒトＣＤ２３に対する抗体（ヒトγ１定常ドメインを含むモノクローナル）（これは、Ｂ細胞によるＩＬ−４誘導ＩｇＥ産生を阻害する）（米国特許第６，０１１，１３８号に記載される）。

ヒトＢ７．１（ＣＤ８０）およびＢ７．２（ＣＤ８６）に対する霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗体（自己免疫疾患の処置における特異的な免疫抑制剤としておよび移植拒絶の防止に有用）（米国特許第６，１１３，８９８号に記載される）。

ヒトＣＤ４γ１定常ドメインに対するキメラ抗体（旧世界ザルの可変配列およびヒト定常ドメイン配列を含む）（米国特許第６，１３６，３１０号に記載される）。

（実施例１０）
（Ａｖｅｎは、血清欠乏後にＢｃｌ−ｘ_Ｌの機能を増強する）
多くの哺乳動物細胞は、無血清環境中で増殖するように適合されない限り、培養中で増殖するために血清を必要とする。血清は、細胞に、増殖因子、栄養素、代謝産物、ホルモン、およびサイトカインを提供する。血清は、バイオリアクター培養の間に抗アポトーシス効果を提供することが示されている。本発明者らは、血清欠乏後に、ＣＨＯ−Ｋ１がアポトーシスを経験することを示した（図１０およびＭａｓｔｒａｎｇｅｌｏら、Ｂｉｏｒｅｇ．Ｂｉｏｅｎｇ．６７（５）：５４４〜５４（２０００）、Ｆｉｇｕｅｒｏａら、Ｂｉｏｒｅｇ．Ｂｉｏｅｎｇ．７（３）：２１１〜２２２（２００１））。栄養素および増殖因子の欠乏が、生物学的産物の産生の間に生じ得るので、血清欠乏研究を、細胞培養におけるこの環境についてのモデルとして開始した。

この傷害を克服するように細胞が操作され得るか否かを決定するために、１０％ＦＢＳ中で増殖した、Ａｖｅｎ発現ＣＨＯ細胞、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ発現ＣＨＯ細胞、およびＢｃｌ−ｘ_Ｌ＋Ａｖｅｎ発現ＣＨＯ細胞を、その後、無血清培地に曝露した。その後、図１１Ａに示されるように、欠乏後の複数の日に生存度をモニターした。操作した細胞株が、血清欠乏後２日目までに、親ＣＨＯ Ｋ−１細胞より優れた性能を示すことが観察された。Ａｖｅｎ発現は、血清欠乏後の最初の２日の間に防御を提供し、そしてその培養物が、この時点で９０％を超える生存度を維持することが可能にした。実際、ＣＨＯ−ａｖｅｎ細胞の生存度は、２日間の撤退時のＣＨＯ−ｂｃｌ−ｘ_Ｌの生存度よりも高く、ＣＨＯ−ｂｃｌ−ｘ_Ｌ＋ａｖｅｎの生存度に匹敵した。しかし、Ａｖｅｎの発現により提供された防御は、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌにより提供された防御と比較した場合、血清撤退の２日後に最小であった。全体として、ＣＨＯ−ｂｃｌ−ｘ_Ｌ＋ａｖｅｎは、ＣＨＯ−ｂｃｌ−ｘ_Ｌ、ＣＨＯ−ａｖｅｎ、および親ＣＨＯ Ｋ−１よりも優れた性能を示した。ＡｖｅｎとＢｃｌ−ｘ_Ｌとの組み合わせにより提供された防御増強は、血清欠乏３日後まで明らかであり、無血清培地への曝露後５日間維持された。ＣＨＯ−ｂｃｌ−ｘ_Ｌ＋ａｖｅｎは、８５％を超える生存度を維持した；一方、ＣＨＯ−Ｋ１の生存度は、２０％を超えるに過ぎず、ＣＨＯ−ｂｃｌ−ｘ_Ｌは、同じ時点で、６０％未満の生存度を示した。この防御が長期間維持されたか否かを観察するために、生存度測定を、撤退後９日目に行った（図１１Ｂ）。血清欠乏後９日目に、親ＣＨＯ−Ｋ１細胞の生存度は７％の生存度であり、１つの抗アポトーシス遺伝子を発現する細胞は、１０％よりわずかに高い生存度を有した。しかし、ＣＨＯ−ｂｃｌ−ｘ_Ｌ＋ａｖｅｎは、生存度２４％を維持した。これは、たった１つの遺伝子を発現する細胞の生存度の２倍であり、コントロールより３倍大きい。

（実施例１１）
（Ａｖｅｎは、４日間使用済み培地および５日間使用済み培地の下で、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌの機能を増強する）
代謝排泄物および細胞ゾル細片の蓄積には、栄養素および増殖因子の欠乏とともに、しばしば、多くのバイオリアクター作動の終了近くに遭遇し、細胞生存に不都合な環境を生じ得る。そのような環境をモデル化するために、ＣＨＯ細胞を、４日間培養物および５日間培養物からの培地に曝露し、Ａｖｅｎ発現効果、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ発現効果、およびＢｃｌ−ｘ_Ｌ＋Ａｖｅｎ発現効果を評価した。この使用済み培地を生成するために、ＣＨＯ Ｋ−１細胞を、ＤＭＥＭ完全培地において継代し、培地収集前の４日間または５日間増殖させた。４日間使用済み培地と５日間使用済み培地との間の有意な差異が、収集時点における細胞の生存度において観察された。４日間のＣＨＯ Ｋ−１増殖の後、その培地（黄色／オレンジ色）は、代謝排泄物の蓄積、血清の欠乏（緩衝化溶液の特性）、および培養オートクラインシグナルによって酸性化されたが、その培養物は、生存可能のままであった（７５％より高い生存度）。しかしその培養物は、１００％コンフルエントであった。５日間の培養の後、ＣＨＯ Ｋ−１の生存度は、３０％を下回る生存度まで深刻に減少した。この細胞は、フラスコから完全に剥離し、培養培地のさらなる酸性化（強い黄色）を伴った。継続したこの培地の酸性化は、高い割合の細胞死および細胞溶解の存在と、培地中へのその細胞内容物の放出とに、主に帰せられるようである。図１０に示されるように、ＣＨＯ細胞を４日間使用済み培地および５日間使用済み培地に曝露すると、アポトーシスを誘導した。

使用済み培地における細胞生存度を試験するために、細胞をＰＢＳで２回洗浄して、血清の除去を確実にし、その後、使用済み培養培地に曝露した。４日間使用済み培地に曝露した後、操作されたＣＨＯ Ｋ−１細胞株は、ほぼ全ての時点で、親ＣＨＯ Ｋ−１より高い生存度を示した（図１２Ａおよび１２Ｂ）。Ａｖｅｎ単独の発現は、曝露後３日間生存度を増強した。この時点で、生存度は、親ＣＨＯ Ｋ−１のレベルに匹敵するレベルにまで低下した（図１２Ａ）。このことが、そのクローンの特徴であったのかまたは発現された遺伝子の特徴であったのかを決定するために、２つの異なるＣＨＯ−ａｖｅｎクローンを、４日間使用済み培地に曝露した。興味深いことに、両方のクローンは、同じ特徴的防御パターンを示した。このパターンにおいて、生存度は、最初の３日間増強され、その後、野生型ＣＨＯ細胞のレベルまたはその下のレベルにまで低下した。対照的に、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌを発現するＣＨＯ細胞は、４日間使用済み培地に対して異なる感受性パターンを示した（図１２Ｂ）。曝露後１日目に、ＣＨＯ−ｂｃｌ−ｘ_Ｌは、ＣＨＯ−Ｋ１を含む他の細胞株と比較した場合に、最も有意な生存度低下を有した。曝露後２日目に、ＣＨＯ−ｂｃｌ−ｘ_Ｌ生存度は安定化し、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌの発現が、使用済み培地に対する曝露期間の間、親ＣＨＯ−Ｋ１に匹敵する防御を提供した。ＣＨＯ−ｂｃｌ−ｘ_Ｌ＋ａｖｅｎの生存度は、４日間使用済み培地への曝露のすべての時点で、ＣＨＯ−ａｖｅｎ、ＣＨＯ−ｂｃｌ−ｘ_Ｌおよび親ＣＨＯ Ｋ−１と等しいかまたはそれより良好であった。２つの抗アポトーシス遺伝子を保有する細胞株は、４日間使用済み培地への４日間の曝露期間の間中、８５％を超える生存度を維持した。一方、親ＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ−ａｖｅｎの生存度は、同じ時点で約４０％であった。

細胞死率は、４日間使用済み培地における細胞死率と比較して、５日間使用済み培地への曝露後に有意に増加された。５日間使用済み培地に曝露された細胞についての細胞培養物生存度は、図１２Ｃに示されるような２日間の曝露後に、深刻に低下した。ＣＨＯ−Ｋ１の生存度は４日間使用済み培地において６８％であった間、そのレベルは、５日間使用済み培地の毒性増加の結果として、急速に１４％まで低下した。しかし、またもや、操作されたＣＨＯ細胞株は、親ＣＨＯ Ｋ−１より優れた性能を示した。２つの異なるクローンにおけるＡｖｅｎの発現は、親ＣＨＯ Ｋ−１と比較した場合に、５日間使用済み培地への曝露により誘導されるプログラムされた細胞死に対して、いくらかの防御を提供した。Ｂｃｌ−ｘ_Ｌの発現は、その毒性に対してさらに高い防御を提供し、５日間使用済み培地において４０％を超える生存度であった。５日間使用済み培地への曝露後の細胞死率は、Ｂｃｌ−ｘ_ＬとＡｖｅｎとの同時発現により最も変化し、その環境において２日間後に生存度４８％であった。しかし、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ単独を上回る、２つの遺伝子の発現により提供された防御の増強は、４日間使用済み培地において以前に観察された程度には、より毒性が高い５日間使用済み培地において大きくなかった。ＣＨＯ−ｂｃｌｘ_Ｌ＋ａｖｅｎの生存度は、矛盾なく、４日間使用済み培地においてＣＨＯ−ｂｃｌｘ_Ｌよりもほぼ２０％ポイント高かった。一方、その差異は、非常に酸性であり毒性である５日間使用済み培地において、８％ポイント未満であった。

（実施例１２）
（エクジソン誘導発現系を使用するさらなる欠乏研究）
本実施例において使用し以前に記載されたエクジソン誘導系およびベクター系を、それぞれ、図１３ａおよび図１３ｂに図示する。図１３ｃにさらに示されるように、ＲＸＲおよびＶｇＥｃＲが、ｐＶｇＲＸＲから発現される。そして、リガンド（すなわち、ポナステロンＡ）の添加により、ヘテロダイマーであるＲＸＲおよびＶｇＥｃＲがハイブリッドエクジソン応答エレメント（ＥＧＲＥ）に結合するのが誘導され、改変型エクジソンレセプターにおけるＶＰ１６トランス活性化ドメインから転写が活性化される。

図１４に示されるように、α−ＧＦＰ、α−Ａｖｅｎまたはα−Ｅ１Ｂ−１９Ｋを発現するこの誘導性発現系を含むＣＨＯ細胞を、５μＭのポナステロンＡを用いて誘導した。

図１５に示されるように、グルコース欠乏実験を、この誘導性発現系（この系において、６ウェル培養物中の細胞集団を、実験開始前に４８時間の間、５μＭのポナステロンを用いて誘導した）を使用して実施し、そして細胞生存度を経時的に測定した。図１６は、ＧＦＰコントロール群についてのスピナーフラスコの結果を含み、図１７は、Ｅ１Ｂ−１９Ｋを発現する細胞についての結果を含み、そして図１８は、スピナーフラスコ中にてグルコース欠乏条件下でのＧＦＰ発現細胞の生存度に対するＥ１Ｂ−１９Ｋ発現細胞の生存度を含む結果を含む。

図１９、図２０、および図２１は、それぞれ、ＧＦＰ発現に対するＡｖｅｎ発現、ＧＦＰ発現に対するＡｖｅｎ＋Ｅ１Ｂ１９Ｋ発現、およびＧＦＰ発現に対するＡｖｅｎ＋Ｅ１Ｂ１９Ｋ発現をポナステロンＡによる誘導後に比較する実験の結果を含む。

これらの結果は、ＡｖｅｎおよびＥ１Ｂ−１９Ｋが、ポナステロンＡによる誘導後に安定して発現されること、Ａｖｅｎ単独は、グルコース欠乏により開始されるアポトーシスに対してほとんど防御を提供しなかったこと、しかし、Ａｖｅｎの同時発現は、グルコース欠乏により開始されるアポトーシスに対するＥ１Ｂ−１９Ｋ防御を有意に増加したことのさらなる証拠を提供する。

（実施例１３）
（ＩＤＥＣ−１３１抗アポトーシス細胞株（１４Ｃ６）を用いた結果）
本実施例において、ＩＤＥＣ−１３１発現ＣＨＯ細胞株（単一の細胞単離物）を５００ｎＭメトトレキセートと接触させ、ステロイドレセプターへテロダイマーを構成的に発現するｐＶｇＲＸＲベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎベクター）でトランスフェクトし、ゼオシン耐性条件下で培養される５Ｃ１１を生成する。

次いで、これらの細胞を特定の抗アポトーシス遺伝子に対して改変された同じ誘導性発現ベクターでトランスフェクトし（改変Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎベクターは、Ａｖｅｎ遺伝子＋Ｅ１Ｂ−１９Ｋ遺伝子を含む）、そしてこれら細胞をポナステロンＡで誘導し、そしてトランスフェクトされた細胞を、ゼオシン／ピューロマイシン耐性条件下で培養する（これらの実験は、図２２に模式的に示される）。

次いで、細胞株を、増殖率、比生産性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）（ｐｇ／細胞／日）、誘導性タンパク質発現（ウエスタンブロットによる）、および抗体力価（ＥＬＩＳＡ／ＨＰＬＣ）を含む基準に基づいて、元の５００Ｅ９細胞株と比較した。

これらの実験において、Ｅ１Ｂ−１９Ｋを発現する、およびＡｖｅｎとＥ１Ｂ１９Ｋとの両方を発現する、１４の細胞株を評価した。３つの実験を、誘導条件および非誘導条件下で、１００ｍＬ容量、１×二連（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）、２×三連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で、行った。

これらの実験の結果は、図２２〜２６に含まれる。それらに含まれる結果は、Ｅ１Ｂ１９Ｋの発現が、細胞培養期間（誘導あり／なし）を延長したが、細胞増殖に対して明白な効果を有し、そして抗体産生を増強しなかったことを示す。

対照的に、Ａｖｅｎ＋Ｅ１Ｂ １９Ｋを同時発現した細胞は、誘導３日後まで細胞培養の期間を伸ばし、そして抗体力価を有意に増強した（親ＣＨＯ細胞株５００Ｅ９に対して２０〜３０％まで）。これらの細胞は、これらの抗アポトーシス遺伝子の低レベルの構成的発現を示す（図２７Ａおよび図２７Ｂ）。

（実施例１４）
（バイオリアクターリアクター研究＃１）
これらの実験において、これらの細胞株（１４Ｃ６、１５Ｃ３および１５Ｅ２）を、供給バッチプロセスで、５Ｌのバイオリアクター中で評価した。３つの実験を、誘導条件対非誘導条件下で、１つのリアクター、二連のリアクターを用いて、そして３つの異なるプロセス、および高密度播種を用いて、行った。

これらのバイオリアクター研究の結果は、図２８〜３１に含まれる。この研究の結果は、誘導された１５Ｃ３細胞株および誘導されていない１５Ｃ３細胞株の両方が、５００Ｅ９より高い細胞生存率、生存細胞密度、および力価を有したことを示す。

この実験結果はさらに、１５Ｃ３の比生産性が１４Ｃ６より高かったが、両方とも５００ Ｅ９細胞株より低かったことを示す。ポナステロン誘導が１５Ｃ３細胞株の抗体力価を改善しなかったこともまた、観察された。

（実施例１５）
（バイオリアクター研究＃２）
これらの実験において、１５Ｃ３抗体産生細胞株を、再度ポナステロンＡを誘導剤として用いて、誘導初期対数期条件下で培養した。これらの結果は、図３２〜３７中に含まれ、そして非誘導培養物が、５００Ｅ９細胞株よりも高い生存率、細胞密度、および力価を生じたことを示す。

詳細には、非誘導培養物において、抗体力価は、５００Ｅ９細胞株におけるより２０〜３０％高かった。誘導は、培養寿命を増大したが、抗体力価を改善しなかったこと、および比生産性は、５００Ｅ９細胞株におけるより低かったこともまた、観察された。

（実施例１６）
（バイオリアクター研究＃３）
第３のバイオリアクター研究を行った。ここでは、同じ５００Ｅ９細胞株および１５Ｃ３細胞株を１００％新鮮培地中に高密度で播種し、中期対数期で誘導した。この研究の結果は、図３５〜３７に含まれる。これらの結果は、１５Ｃ３培養物がより５００Ｅ９よりも高い細胞派生物および力価を生じたことを示し、非誘導培養物力価は５００Ｅ９についてよりも２０〜３０％高い。誘導は再度、培養寿命を増大したが、抗体力価を改善しなかった。この結果はまた、１５Ｃ３の比生産性が５００Ｅ９より低かったことを示す。

従って、結局、以前の実施例に記載の実験の結果は、ＣＨＯ ＤＧ４４細胞株が、長期培養およびグルコース欠乏に供せられた場合にアポトーシス細胞死を受けること、および抗アポトーシス遺伝子を単独または組み合わせて発現する細胞株が、試験される両抗アポトーシス遺伝子（Ａｖｅｎ遺伝子およびＥ１Ｂ−１９Ｋ遺伝子）を発現するＣＨＯ細胞株についてスピナーフラスコおよびバイオリアクター培養物中の細胞生存率および生産性の増加を示すことを実証する。

これらの結果は、１つ以上の抗アポトーシス遺伝子の、好ましくは、エクジソン誘導発現系におけるような誘導性プロモーターの制御下での発現が、細胞培養物、例えば、所望の組換えタンパク質を産生する哺乳動物細胞培養物の比生産性を増強する実行可能な手段を提供することを示す。

本願に引用された全ての特許文献および非特許文献は、本明細書中においてその全体が参考として援用されている。

所見の詳細な説明が本発明のいくつかの実施形態を記載しているが、上記の記載は、開示された発明の単なる例示であって、制限ではないことが理解されるべきである。本発明は、続く特許請求の範囲によってのみ制限されるべきである。

図１は、抗体ＩＤＥＣ１３１を発現するために使用したＮＥＯＳＰＬＡ発現ベクターを示す。 図２は、誘導性発現ベクターであるプラスミドＰＸ＋Ｅ１Ｂ−１９Ｋを示す。 図３は、誘導性発現ベクターであるプラスミドＰＸ＋Ａｖｅｎ＋Ｅ１Ｂ−１９Ｋを示す。 図４は、Ａｖｅｎ ｃＤＮＡポリヌクレオチド配列およびＡｖｅｎポリペプチドアミノ酸配列を示す。 図５は、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ ｃＤＮＡポリヌクレオチド配列およびＥ１Ｂ−１９Ｋポリペプチドアミノ酸配列を示す。 図６は、細胞生存率に関するデータを示す：以下の細胞のグルコースを欠乏させた培養での３日間生存を比較する：（１）ＧＦＰ単独でトランスフェクトした細胞、（２）ＧＦＰ＋Ａｖｅｎでトランスフェクトした細胞、（３）ＧＦＰ＋Ｅ１Ｂ−１９Ｋでトランスフェクトした細胞、（４）ＧＦＰ＋Ａｖｅｎ＋Ｅ１Ｂ１９Ｋでトランスフェクトした細胞、および（５）トランスフェクトしていない親細胞。 図７Ａは、細胞生存率に関するデータを示す：以下の細胞のグルコースを欠乏させた培養での３日間生存を比較する：（１）ＧＦＰ単独でトランスフェクトした細胞、（２）ＧＦＰ＋Ａｖｅｎでトランスフェクトした細胞、（３）ＧＦＰ＋Ｅ１Ｂ−１９Ｋでトランスフェクトした細胞、（４）ＧＦＰ＋Ａｖｅｎ＋Ｅ１Ｂ１９Ｋでトランスフェクトした細胞。各培養は、ステロイド誘導の存在下および非存在下である。 図７Ｂは、細胞生存率に関するデータを示す：以下の細胞のグルコ ースを欠乏させた培養での３日間生存を比較する：（１）ＧＦＰ単独でトランスフェクトした細胞、（２）ＧＦＰ＋Ａｖｅｎでトランスフェクトした細胞、（３）ＧＦＰ＋Ｅ１Ｂ−１９Ｋでトランスフェクトした細胞、（４）ＧＦＰ＋Ａｖｅｎ＋Ｅ１Ｂ１９Ｋでトランスフェクトした細胞。各培養は、ステロイド誘導の存在下および非存在下である。 図７Ｃは、細胞生存率に関するデータを示す：以下の細胞のグルコ ースを欠乏させた培養での３日間生存を比較する：（１）ＧＦＰ単独でトランスフェクトした細胞、（２）ＧＦＰ＋Ａｖｅｎでトランスフェクトした細胞、（３）ＧＦＰ＋Ｅ１Ｂ−１９Ｋでトランスフェクトした細胞、（４）ＧＦＰ＋Ａｖｅｎ＋Ｅ１Ｂ１９Ｋでトランスフェクトした細胞。各培養は、ステロイド誘導の存在下および非存在下である。 図７Ｄは、細胞生存率に関するデータを示す：以下の細胞のグルコ ースを欠乏させた培養での３日間生存を比較する：（１）ＧＦＰ単独でトランスフェクトした細胞、（２）ＧＦＰ＋Ａｖｅｎでトランスフェクトした細胞、（３）ＧＦＰ＋Ｅ１Ｂ−１９Ｋでトランスフェクトした細胞、（４）ＧＦＰ＋Ａｖｅｎ＋Ｅ１Ｂ１９Ｋでトランスフェクトした細胞。各培養は、ステロイド誘導の存在下および非存在下である。 図７Ｅは、細胞生存率に関するデータを示す：以下の細胞のグルコ ースを欠乏させた培養での３日間生存を比較する：（１）ＧＦＰ単独でトランスフェクトした細胞、（２）ＧＦＰ＋Ａｖｅｎでトランスフェクトした細胞、（３）ＧＦＰ＋Ｅ１Ｂ−１９Ｋでトランスフェクトした細胞、（４）ＧＦＰ＋Ａｖｅｎ＋Ｅ１Ｂ１９Ｋでトランスフェクトした細胞。各培養は、ステロイド誘導の存在下および非存在下である。 図８は、抗アポトーシス性ポリペプチドの誘導性発現に関するデータを示す：Ｅ１Ｂ−１９ＫおよびＡｖｅｎを発現するステロイド誘導性細胞のバッチ培養性能を、トランスフェクトしていないＣＨＯ細胞株と、生存率および抗体産生レベルに関して比較する。 図９は、抗アポトーシス性ポリペプチドの誘導性発現に関するデータを示す：Ｅ１Ｂ−１９ＫおよびＡｖｅｎでトランスフェクトしたが、これらのトランスフェクトした遺伝子の発現のステロイド誘導を伴うかまたは伴わない細胞のバッチ培養性能を生存率および抗体産生レベルに関して比較する。 図１０は、ＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１）が血清欠乏および培地の消費の後にアポトーシスを被ることを示す結果を含む。 図１１Ａは、Ａｖｅｎ、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ、およびＢｃｌ−ｘ_Ｌ＋Ａｖｅｎを発現する、１０％ＦＢＳ中で培養され、続いて、培養、すなわち、無血清培地への曝露されたＣＨＯ細胞に関する細胞生存率データを含む。 図１１Ｂは、Ａｖｅｎ、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ、およびＢｃｌ−ｘ_Ｌ＋Ａｖｅｎを発現する、１０％ＦＢＳ中で培養され、続いて、培養、すなわち、無血清培地への曝露されたＣＨＯ細胞に関する細胞生存率データを含む。 図１２Ａはまた、生存率データを含み、ここで、Ａｖｅｎを発現するＣＨＯ細胞を、無血清培地で培養し、そしてこのような培養後に細胞生存率を測定する。 図１２Ｂはまた、生存率データを含み、ここで、Ａｖｅｎ、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ、およびＢｃｌ−ｘ_Ｌ＋Ａｖｅｎを発現するＣＨＯ細胞を、無血清培地で培養し、そしてこのような培養後に細胞生存率を測定する。 図１２Ｃはまた、生存率データを含み、ここで、Ａｖｅｎ、Ｂｃｌ−ｘ_Ｌ、およびＢｃｌ−ｘ_Ｌ＋Ａｖｅｎを発現するＣＨＯ細胞を、無血清培地で培養し、そしてこのような培養後に細胞生存率を測定する。 図１３Ａは、本実施例において利用した誘導発現系を示す。 図１３Ｂは、本実施例において利用した誘導発現系を示す。 図１３Ｃは、本実施例において利用した誘導発現系を示す。 図１４は、ＣＨＯ細胞での抗アポトーシス性遺伝子α−Ａｖｅｎおよびα−Ｅ１Ｂ−１９Ｋの誘導性発現を示す。 図１５は、６ウェル培養を使用するグルコース欠乏実験結果を含む。 図１６は、スピナーフラスコ培養において行ったグルコース欠乏実験結果を含む。 図１７は、スピナーフラスコ培養において行ったグルコース欠乏実験結果を含む。 図１８は、スピナーフラスコ培養において行ったグルコース欠乏実験結果を含む。 図１９は、スピナーフラスコ培養において行ったグルコース欠乏実験結果を含む。 図２０は、スピナーフラスコ培養において行ったグルコース欠乏実験結果を含む。 図２１は、スピナーフラスコ培養において行ったグルコース欠乏実験結果を含む。 図２２は、ＩＤＥＣ−１３１を発現するＣＨＯ細胞株の生成、および抗アポトーシス性遺伝子を含むその目的の誘導性発現ベクターの生成を図示する。 図２３は、他のスピナーフラスコの結果を含む。 図２４は、他のスピナーフラスコの結果を含む。 図２５は、他のスピナーフラスコの結果を含む。 図２６は、他のスピナーフラスコの結果を含む。 図２７Ａは、誘導条件下または非誘導条件下での異なる細胞株でのＩＤＥＣ１３１の相対的発現を比較する。 図２７Ｂは、誘導条件下または非誘導条件下での異なる細胞株でのＩＤＥＣ１３１の相対的発現を比較する。 図２８は、バイオリアクター研究＃１の結果を含む。 図２８は、バイオリアクター研究＃１の結果を含む。 図３９は、バイオリアクター研究＃１の結果を含む。 図３１は、バイオリアクター研究＃１の結果を含む。 図３２は、バイオリアクター研究＃２の結果を含む。 図３３は、バイオリアクター研究＃２の結果を含む。 図３４は、バイオリアクター研究＃２の結果を含む。 図３５は、バイオリアクター研究＃３の結果を含む。 図３６は、バイオリアクター研究＃３の結果を含む。 図３７は、バイオリアクター研究＃３の結果を含む。

Claims (48)

1. 単離された組換え細胞において、プログラムされた細胞死を防止または遅延する方法であって、
   ここで該細胞は、マウス骨髄腫細胞ではなく、
   該方法は、該細胞におけるプログラムされた細胞死が防止または遅延されるように、該細胞内でＥ１Ｂ−１９ＫポリペプチドとともにＡｖｅｎポリペプチドを発現する工程を包含する、
   方法。
2. 前記細胞が、１つ以上の所望のポリペプチドをコードする１つ以上の異種ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記所望のポリペプチドが、抗体、酵素、レセプター、サイトカイン、細胞表面因子、細胞代謝物、細胞分泌因子、ウイルス因子、および膜結合因子からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
4. 前記抗体が、抗ＣＤ１５４抗体（ＩＤＥＣ−１３１）、抗ＣＤ２０抗体（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｚｅｖａｌｉｎ^ＴＭ）、抗Ｂ７抗体（ＩＤＥＣ １１４）、抗ＣＤ２３抗体（ＩＤＥＣ １５２）、抗ＣＤ４抗体（ＩＤＥＣ１５１）、および抗腫瘍抗原抗体からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
5. ＡｖｅｎポリペプチドおよびＥ１Ｂ−１９Ｋポリペプチドの発現が、該ＡｖｅｎポリペプチドおよびＥ１Ｂ−１９Ｋポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、少なくとも１つの誘導性異種プロモーターによって制御される、請求項１に記載の方法。
6. 前記誘導性異種プロモーターがステロイドによって誘導される、請求項５に記載の方法。
7. 前記誘導性異種プロモーターがエクジソンプロモーターである、請求項５に記載の方法。
8. 前記単離された組換え細胞が、前記少なくとも１つの誘導性異種プロモーターに作動可能に連結されたスクリーニングマーカーまたは選択マーカーをさらに含む、請求項５に記載の方法。
9. 前記スクリーニングマーカーまたは選択マーカーが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦ）である、請求項８に記載の方法。
10. 前記ＡｖｅｎポリペプチドおよびＥ１Ｂ−１９Ｋポリペプチドが、真核生物細胞またはウイルスの遺伝子によってコードされる、請求項１に記載の方法。
11. 前記単離された組換え細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の方法。
12. 前記単離された組換え細胞が、ヒト細胞、マウス細胞、および齧歯類細胞からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記単離された組換え細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１１に記載の方法。
14. 前記単離された組換え細胞がＣＨＯ ５Ｃ１１である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記単離された組換え細胞がＢＨＫ細胞である、請求項１１に記載の方法。
16. 前記単離された組換え細胞が、大容量のバイオリアクターまたは市販製品の培養デバイス中にある、請求項１に記載の方法。
17. 単離された組換え細胞によって、細胞関連産物の産生を増加する方法であって、該方法は、該細胞による細胞関連産物の産生が増加されるように、該細胞において、Ｅ１Ｂ−１９ＫポリペプチドとともにＡｖｅｎポリペプチドを発現する工程を包含する、方法。
18. 前記細胞関連産物が、組換えタンパク質、抗体、酵素、レセプター、サイトカイン、細胞表面因子、細胞代謝物、細胞分泌因子、ウイルス因子、膜結合因子、およびポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記抗体が、抗ＣＤ１５４抗体（ＩＤＥＣ−１３１）、抗ＣＤ２０抗体（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｚｅｖａｌｉｎ^ＴＭ）、抗Ｂ７抗体（ＩＤＥＣ１１４）、抗ＣＤ２３抗体（ＩＤＥＣ１５２）、抗ＣＤ４抗体（ＩＤＥＣ１５１）、および抗腫瘍抗原抗体からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
20. ＡｖｅｎポリペプチドおよびＥ１Ｂ−１９Ｋポリペプチドの発現が、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、少なくとも１つの誘導性異種プロモーターによって制御される、請求項１７に記載の方法。
21. 前記誘導性異種プロモーターがステロイドによって誘導される、請求項２０に記載の方法。
22. 前記誘導性異種プロモーターがエクジソンプロモーターである、請求項２０に記載の方法。
23. 前記単離された組換え細胞が、前記少なくとも１つの誘導性異種プロモーターに作動可能に連結されたスクリーニングマーカーまたは選択マーカーをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
24. 前記スクリーニングマーカーまたは選択マーカーが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦ）である、請求項２３に記載の方法。
25. 前記ＡｖｅｎポリペプチドおよびＥ１Ｂ−１９Ｋポリペプチドが、真核生物細胞またはウイルスの遺伝子によってコードされる、請求項１７に記載の方法。
26. 前記単離された組換え細胞が哺乳動物細胞である、請求項１７に記載の方法。
27. 前記単離された組換え細胞が、ヒト細胞、マウス細胞、および齧歯類細胞からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
28. 前記単離された組換え細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２６に記載の方法。
29. 前記単離された組換え細胞がＣＨＯ ５Ｃ１１である、請求項２８に記載の方法。
30. 前記単離された組換え細胞がＢＨＫ細胞である、請求項２６に記載の方法。
31. 前記単離された組換え細胞が、大容量のバイオリアクターまたは市販製品の培養デバイス中にある、請求項１７に記載の方法。
32. ＡｖｅｎポリペプチドおよびＥ１Ｂ−１９Ｋポリペプチドを発現する、細胞関連産物の産生に有用な、単離された組換え細胞。
33. 前記ＡｖｅｎポリペプチドおよびＥ１Ｂ−１９Ｋポリペプチドが、真核生物細胞またはウイルスの遺伝子によってコードされる、請求項３２に記載の組換え細胞。
34. 前記細胞関連産物が、組換えタンパク質、抗体、酵素、レセプター、サイトカイン、細胞表面因子、細胞代謝物、細胞分泌因子、ウイルス因子、膜結合因子、およびポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項３２に記載の組換え細胞。
35. 前記抗体が、抗ＣＤ１５４抗体（ＩＤＥＣ−１３１）、抗ＣＤ２０抗体（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｚｅｖａｌｉｎ^ＴＭ）、抗Ｂ７抗体（ＩＤＥＣ１１４）、抗ＣＤ２３抗体（ＩＤＥＣ１５２）、抗ＣＤ４抗体（ＩＤＥＣ１５１）、および抗腫瘍抗原抗体からなる群から選択される、請求項３２に記載の組換え細胞。
36. ＡｖｅｎポリペプチドおよびＥ１Ｂ−１９Ｋポリペプチドの発現が、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、少なくとも１つの誘導性異種プロモーターによって制御される、請求項３２に記載の組換え細胞。
37. 前記誘導性異種プロモーターがステロイドによって誘導される、請求項３６に記載の組換え細胞。
38. 前記誘導性異種プロモーターがエクジソンプロモーターである、請求項３６に記載の組換え細胞。
39. 前記組換え細胞が、前記少なくとも１つの誘導性異種プロモーターに作動可能に連結されたスクリーニングマーカーまたは選択マーカーをさらに含む、請求項３６に記載の組換え細胞。
40. 前記スクリーニングマーカーまたは選択マーカーが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦ）である、請求項３９に記載の組換え細胞。
41. 前記組換え細胞が哺乳動物細胞である、請求項３２に記載の組換え細胞。
42. 前記組換え細胞が、ヒト細胞、マウス細胞、および齧歯類細胞からなる群から選択される、請求項３２に記載の組換え細胞。
43. 前記組換え細胞がＣＨＯ細胞である、請求項３２に記載の組換え細胞。
44. 前記組換え細胞がＣＨＯ ５Ｃ１１である、請求項４３に記載の組換え細胞。
45. 前記組換え細胞がＢＨＫ細胞である、請求項３２に記載の組換え細胞。
46. 前記細胞が、大容量のバイオリアクターまたは市販製品の培養デバイス中で、細胞関連産物を産生する、請求項３２に記載の組換え細胞。
47. 細胞の１つ以上の生物学的機能を生じるのに有用な細胞集団であって、各細胞がＡｖｅｎポリペプチドおよびＥ１Ｂ−１９Ｋポリペプチドを発現する、細胞集団。
48. 細胞療法に有用な細胞集団であって、各細胞がＡｖｅｎポリペプチドおよびＥ１Ｂ−１９Ｋポリペプチドを発現する、細胞集団。

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