BRPI0611733A2 - compostos que mantêm pluripotência de células-tronco embriÈnicas - Google Patents
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Abstract
COMPOSTOS QUE MANTêM PLURIPOTêNCIA DE CéLULAS-TRONCO EMBRIONICAS. A presente invenção refere-se a métodos e a composições para cultura de células-tronco (CT) embriónicas. Os métodos referem-se a crescimento das células CI na presença de moléculas pequenas que mantêm a pluripotêncialauto-renovaçáo das células sem células aumentadoras e LIF nas condições livres de soro. Esses métodos em parte facilitam muito mais consistência na produção de células-tronco embriónicas, proporcionando, por exemplo, novos caminhos nas aplicações práticas de células-tronco embriónicas na medicina regenerativa.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOS-TOS QUE MANTÊM PLURIPOTÊNCIA DE CÉLULAS-TRONCO EMBRIÔNICAS11
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
Campo da Invenção
Este pedido reivindica o benefício de prioridade a Pedido de Pa-tente Provisório U.S. Número 60/689.359, depositado em 10 de junho de2005. A descrição total desse pedido é incorporado neste relatório como re-ferência em sua totalidade e para todos os propósitos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a métodos e a composições paracultivar células-tronco embriônicas (ES). Os métodos referem-se a cresci-mento das células ES na presença de moléculas pequenas que mantêm apluripotência/auto-renovação das células em células alimentadoras e LIF emcondições livres de soro. Esses métodos em parte facilitam muito mais con-sistência na produção de células-tronco embriônicas, proporcionando, porexemplo, novos caminhos nas aplicações práticas de células-tronco embriô-nicas na medicina regenerativa.Antecedentes
Células-tronco embriônicas são difíceis de manter-se na cultura
porque elas tendem a espontaneamente diferenciar-se (isto é, adquirem ca-racterísticas estruturais e/ou funcionais especializadas). Células-tronco dife-renciam-se como resultado de muitos fatores, incluindo fatores de cresci-mento, moléculas e componentes de matriz extracelular, estressores ambi-entais e interações diretas célula-a-célula.
Culturas de geração de células-tronco embriônicas murinas ouhumanas que permanecem em um estado de proliferação não-diferenciado éum processo em multietapas que inclui crescimento das células no meio decrescimento suplementado com soro fetal bovino e algumas vezes em umacamada "alimentadora" de células em não-divisão. As células-tronco embri-ônicas de camundongo podem ser crescidas in vitro sem células alimentado-ras se o fator inibitório da leucemia citocina (LIF) é adicionado ao meio decultura mas isso é apenas eficaz sob densidades celulares moderadas a al-tas e formação de colônias de células simples exigirem a presença de soroou uma camada alimentadora. Além disso, para células-tronco embriônicashumanas, mesmo na presença de soro, LIF não é adequado para suportarauto-renovação.
A presente invenção proporciona um método de usar moléculaspequenas para auto-renovação de células-tronco embriônicas em condiçõesde cultura livre de soro sem o uso de LlF. Ao usar moléculas pequenas dainvenção para manter pluripotência de células-tronco embriônicas permitemuito mais consistência na produção de células-tronco embriônicas, propor-cionando, por exemplo, novos caminhos nas aplicações práticas de células-tronco embriônicas na medicina regenerativa.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Em um aspecto, a presente invenção proporciona um método demanter células-tronco pluripotentes, método este que compreende as etapasde crescimento das células em: a) um meio basal; e b) um composto deFórmula I:
<formula>formula see original document page 3</formula>
em que:
R1 é selecionado de hidrogênio, Ci-6alquila, C2-6alquenila, C6-Ioaril-Co-4alquila, C5-ioheteroaril-Co-4alquila, C3-ioCicloalquil-Co-4alquila e C3.ioheterocicloalquil-Co-4alquila; em que qualquer alquila ou alquenila de Ri éopcionalmente substituída por um a três radicais independentemente sele-cionados de halo, hidróxi, Ci-6alquila e -NR2R3; em que qualquer arila, hete-roarila, cicloalquila ou heterocicloalquila de Ri é opcionalmente substituídapor um a três radicais selecionados de halo, hidróxi, ciano, Ci.6alquila, Ci-6alcóxi, C2-6alquenila, alquila substituída por halo, alcóxi substituído halo, -XNR2R3, -XOXNR2R3, -XNR2S(O)0-2R3, -XC(O)NR2R3, -XNR2C(O)XOR2, -XNR2C(O)NR2R3, -XNR2XNR2R3, -XC(O)NR2XNR2R3, -XNR2XOR2, -XOR2,-XNR2C(=NR2)NR2R3, -XS(0)o-2R4, -XNR2C(O)R2, -XNR2C(O)XNR2R3i -XNR2C(O)R4, -XC(O)R4, -XR4, -XC(O)OR3 e -XS(O)0-2NR2R3; em que X éuma ligação ou Ci.4alquileno; R2 e R3 são, independentemente selecionadosde hidrogênio, Ci-6alquila e C3-i2cicloalquila; e R4 é C3.i0heterocicloalquilaopcionalmente substituída com 1 a 3 radicais selecionados de Ci-6alquila, -XNR2R3, -XNR2XNR2R2, XNR2XOR2 e -XOR2; em que X, R2 e R3 são, con-forme descritos acima; e os derivados de N-óxido, derivados de pró-fármaco,derivados protegidos, isômeros individuais e mistura de isômeros destes; eos sais e solvatos farmaceuticamente aceitáveis (por exemplo, hidratos)desses compostos.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Definições
"Alquila" como um grupo e como um elemento estrutural de ou-tros grupos, por exemplo, alquila e alcóxi substuídos por halo, pode ser decadeia normal ou ramificada. Ci-4-alcóxi inclui, metóxi, etóxi, e similares. Al-quila substituída por halo inclui trifluormetila, pentafluoretila, e similares.
"Arila" significa uma montagem de anel aromático monocíclicoou bicíclico fundido contendo seis a dez átomos de carbono no anel. Por e-xemplo, arila poderá ser fenila ou naftila, preferencialmente fenila. "Arileno"significa um radical divalente derivado de um grupo arila. "Heteroarila" é co-mo definido para arila em que um ou mais dos membros do anel são um he-teroátomo. Por exemplo, heteroarila inclui piridila, indolila, indazolila, quino-xalinila, quinolinila, benzofuranila, benzopiranila, benzotiopiranila, ben-zo[1,3]dioxol, imidazolila, benzo-imidazolila, pirimidinila, furanila, oxazolila,isoxazolila, triazolila, tetrazolila, pirazolila, tienila, etc.
"Cicloalquila" significa uma montagem de anel moncíclico, bicí-clico fundido ou policíclico em ponte saturado ou parcialmente insaturadocontendo o número de átomos indicados no anel. Por exemplo, C3.iocicloalquila incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, cicloexila, etc. "He-terocicloalquila" significa cicloalquila, conforme definida neste pedido, con-tanto que um ou mais dos carbonos indicados no anel, sejam substituídospor uma porção selecionada e -O-, -N=, -NR-, -C(O)-, -S-, -S(O)- ou -S(O)2-,em que R é hidrogênio, Ci-4alquila ou um grupo de proteção nitrogênio. Porexemplo, C3-8heterocicloalquila conforme usada neste pedido descreve com-postos da invenção que inclui morfolino, pirrolidinila, piperazinila, piperidinila,piperidinilona, 2-Oxo-pirrolidin-1-ila, 1,4-dioxa-8-aza-espiro[4.5]dec-8-ila, etc.
"Halogênio" (ou halo) preferencialmente representa cloro ou flú-or, mas poderá também ser bromo ou iodo.
"Tratar", "tratamento" e "trato" referem-se a um método de aliviarou abater uma doença e/ou seus sintomas concomitantes.
Descrição das Modalidades Preferidas
A presente invenção refere-se a métodos e a composições paracultivar células ES. Os métodos referem-se a crescimento das células ES napresença de molécula pequenas que mantêm a pluripotência/auto-renovação das células sem células alimentadoras e LIF em condições livresde soro.
Em uma modalidade, com referência a compostos de Fórmula I:
R1 é selecionada de hidrogênio, Ci-6alquila, C2-6alquenila, C6-i0aril-Co-4alquila, C5-ioheteroaril-C0.4alquila, C3-ioCicloalquil-Co-4alquila e C3.-i0heterocicloalquil-C0-4alquila; em que qualquer alquila ou alquenila de Ri éopcionalmente substituída por um a três radicais independentemente sele-cionados de halo, hidróxi, Ci-6alquila e -NR2R3; em que qualquer arila, hete-roarila, cicloalquila ou heterocicloalquila de Ri é opcionalmente substituídapor um a três radicais selecionados de halo, hidróxi, ciano, Ci-6alquila, Ci-6alcóxi, C2-6alquenila, alquila substituída por halo, alcóxi substituído por halo,-XNR2R3, -XOXNR2R3, -XNR2S(O)0^R3, -XC(O)NR2R3, -XNR2C(O)XOR2,-XNR2C(O)NR2R3, -XNR2XNR2R3, -XC(O)NR2XNR2R3, -XNR2XOR2, -XOR2, -XNR2C(=NR2)NR2R3, -XS(0)o-2R4, -XNR2C(O)R2,XNR2C(O)XNR2R3, -XNR2C(O)R4, -XC(O)R4, -XR4, -XC(O)OR3 e -XS(O)0-2NR2R3; em que X é uma ligação ou Ci.4alquileno; R2 e R3 são, independen-temente selecionados de hidrogênio, Ci-6alquila e C3.i2cicloalquila; e R4 é C3.10heterocicloalquila opcionalmente substituída com 1 a 3 radicais seleciona-dos de Ci-6alquila, -XNR2R3, -XNR2XNR2R2, XNR2XOR2 e -XOR2; em queX, R2 e R3 são, conforme descritos acima.Em uma outra modalidade, Ri é selecionado de hidrogênio, meti-la, etila, isopropila, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, cicloexila, pirimidinila,3-hidróxi-1 -metil-propil hidróxi-etila, fenila, morfolino, benzila, [1,2,4]triazol-4-ila, alila, 2-metil-alila, 2-(2-oxo-pirrolidin-1-il)-etila, piperazinil-etila, piperazinil-propila, tiazolila, oxazolila, piridinila, pirazolila, piperidinila, tiazolila, etil-pirrolidinil-metila, morfolino-propila, dimetil-amino-propila, dietil-amino-propila, dietil-amino-butila, etóxi-carbonil-metila e [1,2,4]triazin-3-ila,[1,3,4]tiadiazolila; em que qualquer arila, heteroarila, cicloalquila ou heteroci-cloalquila é opcionalmente substituída com 1 a 3 radicais independentemen-te selecionado de metila, etila, ciano, hidróxi, metóxi, amino-carbonil-amino,hidróxi-metila, metil-piperazinila, metil-piperazinil-carbonila, etil-piperazinila,metil-piperazinil-metila, morfolino-sulfonila, metil-piperazinil-sulfonila, metil-piperazinil-carbonil-amino, metil-sulfonil-amino, amino-carbonila, amino-sulfonila, hidróxi-etila, hidróxi-metil-carbonil-amino, formil-amino, dimetil-amino, dimetil-amino-metila, dimetil-amino-etila, isopropil-amino-etila, carbó-xi, amino-etil-amino, metil-amino-etila, morfolino-etila, morfolino-metila, ami-no-etila, imidazolil-propila, piperazinil-etila, piperazinila, trifluormetila, dietil-amino-etila, flúor, morfolino, dimetil-amino-etil-amino-carbonila, dietil-amino-etóxi, 2-amino-propionilamino, dimetil-amino-pirrolidinila, (2-dimetilamino-etil)-metil-amino, 2-dimetilamino-1 -metil-etóxi e dietil-amino.
Compostos da invenção preferidos são selecionados de: N-{3-[7-(2-Etil-2H-pirazol-3-ilamino)-1-metil-2-oxo-1,4-diidro-2H-pirimido[4,5-d]pirimidin-3-il]-4-metil-fenil}-3-trifluormetil-benzamida; N-{4-Metil-3-[1-metil-7-(2-metil-2H-pirazol-3-ilamino)-2-oxo-1,4-diidro-2H-pirimido[4,5-d]pirimidin-3-il]-fenil}-3-trifluormetil-benzamida; N-{3-[7-(2,6-dimetil-piridin-4-ilamino)-1 -metil-2-oxo-1,4-diidro-2H-pirimido[4,5-d]pirimidin-3-il]-4-metil-fenil}-3-trifluormetil-benzamida; N-{3-[7-(3-Hidróxi-fenilamino)-1 -metil-2-oxo-1,4-diidro-2H-pirimido[4,5-d]pirimidin-3-il]-4-metil-fenil}-3-trifluormetil-benzamida;N-{3-[7-(2,5-Dimetil-2H-pirazol-3-ilamino)-1-metil-2-oxo-1,4-diidro-2H-pirimido[4,5-d]pirimidin-3-il]-4-metil-fenil}-3-trifluormetil-benzamida; N-{3-[7-(3-Amino-fenilamino)-1-metil-2-oxo-1,4-diidro-2H-pirimido[4,5-d]pirimidin-3-il]-4-metil-fenil}-3-trifluormetil-benzamida; N-{3-[7-(3-metanossulfonilamino-fenilamino)-1 -metil-2-oxo-1,4-diidro-2H-pirimido[4,5-d]pirimidin-3-il]-4-metil-fenil}-3-trifluormetil-benzamida; N-[4-metil-3-(1 -metil-7-metilamino-2-oxo-1,4-diidro-2H-pirimido[4,5-d]pirimidin-3-il)-fen^ e N-[3-(y-Etilamino-l-metil^-oxo-M-diidro^H-pirimido^.õ^fenil]-3-trifluormetil-benzamida.
Compostos de Fórmula I adicionais preferidos são detalhadosnos Exemplos e Tabala I, infra.
Utilidade
Células ES são derivadas de embriões de pré-implantação eretêm a potência ao desenvolvimento de células progenitoras fetais, sendocapaz de gerar tipos celulares e tissulares de todas as três camadas degermes in vitro e in vivo. Células ES podem ser vistas como células que têmde ser escolhidas entre auto-renovação (pluripotência) ou predestinaçõesalternativas de diferenciação em cada divisão. Os sinais que governam aescolha de caminho de diferenciação são proporcionados por fatores decrescimento no microambiente de células. Fatores de crescimento podemser disponíveis no soro ou podem ser produzidos por células alimentadoras.
Identificação desses fatores de crescimento e definição de suasrespectivas entradas são críticas para entendimento da regulação de desen-volvimento e fisiológica de geração de tecido mediada por células-tronco,recuperação e reparo. Além disso, estender esse conhecimento para contro-lar a expansão e diferenciação de células-tronco ex vivo mantém promessade aplicações na medicina regenerativa e descoberta biofarmacêutica.
Células ES de camundongo foram originalmente isoladas e man-tidas por co-cultura em uma camada alimentadora de fibroblastos embrioná-rios de camundongo mitoticamente inativados. A função essencial da cama-da alimentadora de fibroblasto é proporcionar o fator inibitório de leucemiacitocina (LIF). Fibroblastos LIF nulos são deficientes em suportar auto-renovação e LIF podem substituir a exigência de alimentadores tanto empropagação rotineira quanto derivação de novo de células ES de camundon-go. LIF e citocinas correlatas que empenham o receptor gp130 proporcionaro caminho apenas molecularmente definido que sustentará auto-renovaçãoa longo prazo de células ES de camundongo com retenção dos atributoscardinais de fenótipo não-diferenciado, pluripotência e capacidade de coloni-zação embrionária.
Células ES podem ser propagadas em um substituto de sorocomercial suplementado com LlF, mas isso é apenas eficaz sob densidadescelulares moderadas a altas e formação de colônias a partir de células sim-ples exigir a presença de soro ou uma camada alimentadora. Além disso,para células ES humanas, mesmo na presença de soro, LIF não é adequadopara suportar auto-renovação.
Os métodos da presente invenção permitem a manutenção decélulas-tronco pluripotentes sem células alimentadoras e LIF nas condiçõeslivres de soro. Compostos da invenção efetuam auto-renovação de célulasmES via sua interação com ERK1 e RasGAP. Por exemplo, ativação deERK1/2 sustentada leva à diferenciação neuronal enquanto se inibe Ras-GAP poderá ativar sinalização por Ras ou GTPases semelhante a Ras, quepor sua vez pode aumentar auto-renovação através de P13K ou outros ca-minhos de sinalização.
Proteínas morfogênicas ósseas (BMPs) são envolvidas como ofator contido no soro ou proporcionado por camadas alimentadoras que a-gem de comum acordo com LIF para manter células ES de camundongonão-diferenciado in vitro. Tem-se sugerido que BMPs pode substituir exigên-cias de soro e células alimentadoras em cultura de células ES por meio deativação do caminho Smad e indução de expressão do gene Id, um alvo co-mum de sinalização Smad que parece bloquear diferenciação negativamenteregulando proteínas do tipo hélice-alça-hélice básicas. Embora o mecanismoexato por meio do qual BMP promove auto-renovação de células ES nãoseja certo, trabalho recente sugere que ele pode também inibir o caminhoproteína quinase ativado por mitogênio (MAPK) independente de Smads.Essencialmente, inibição de p38 MAPK facilita derivação de células ES deblastocistoscom falta de Alk-3 (BMPRIA), e células ES podem ser derivadosde blastocistos com falta de Smad4 (o parceiro comum de todos os Smads),suportam a hipótese que BMP age por meio de diferentes mecanismos de-pendendo da presença ou ausência de soro e alimentadores.
Considerando a possibilidade de que soro e células alimentado-ras proporcionam sinais de sobrevivência celular manifestam-se como fato-res de crescimento e citocinas e que sinais de sobrevivência extrínsecas sãoespecialmente críticos em baixas condições de densidade celular, em queestimulação por meio de fatores de autocrina e parácrino são mínimos, célu-las ES provavelmente tornam-se apoptóticas em condições de cultura subó-timas (isto é, na ausência de soro e células alimentadoras). Sob baixa den-sidade celular, células ES infreqüentemente geram colônias pluripotentes.
Para analisar o efeito de citocinas únicas, fatores de crescimento, e outrasmoléculas da auto-renovação e diferenciação de células ES, seria ótimo secélulas pudessem ser protegidas de morte celular apoptótica em condiçõeslivres de soro e livres de alimentador. Embora o uso de meios suplementa-dos de N2- e B27- expande células ES em condições livres de soro e livresde alimentador aperfeiçoe viabilidade e, desse modo, permite sua sobrevi-vência mesmo sob baixas condições de densidade celular, LIF mais essessuplementos não podem suportar a auto-renovação de células ES a não serque a cultura seja adicionalmente suplementada com BMP. Porque suple-mentos N2 e B27 contêm hormônios (corticosterona, progesterona e T3) eacetato de retinila (um precursor de ácido retinóico) e alguns desses compo-nentes são usados em protocolos de diferenciação de células ES, sua pre-sença complica a análise dos efeitos de citocinas simples, fatores de cresci-mento e outras moléculas na auto-renovação e diferenciação de células ES.
Conseqüentemente, o desenvolvimento de moléculas pequenaspara auto-renovação de células ES nas condições de cultura livres de soro,tais como descritas pela presente invenção, permitirá muito mais consistên-cia na produção de células ES, proporcionando novos caminhos na aplica-ção prática de células ES na pesquisa e na medicina regenerativa.
Adicionalmente, o desenvolvimento de moléculas pequenas paraauto-renovação de células ES nas condições de cultura livres de soro, taiscomo descritas pela presente invenção, é essencial para delimitar o ambien-te de cultura de células ES e desse modo permitir a definição e controle deentradas de sinalização que direcionam auto-renovação ou diferenciação.
O mecanismo de pluripotência poderá também contribuir paranosso entendimento de tumorigênese (células-tronco pluripotentes podemformar tumores in vivo, e alterações moleculares nos genes "stemness" po-derão também levar a tumores). Além disso, há um crescimento corporal deevidência que sugere uma relação próxima entre células-tronco e célulastumorosas: os mecanismos de auto-renovação de células-tronco normais ecélulas tumorosas são similares; desregulação de caminhos de sinalizaçãode desenvolvimento envolvidos na auto-renovação de células-tronco é asso-ciada a oncogênese; tumores contêm "células-tronco cancerosas" que pode-rão originar-se de células-tronco normais.Processos para Produção de Compostos da Invenção
A presente invenção também inclui processos para a preparaçãode compostos da invenção. Nas reações descritas, poderá ser necessárioproteger grupos funcionais reativos, por exemplo grupos hidróxi, amino, imi-no, tio ou carbóxi, em que esses são desejados no produto final, para evitarsua participação indesejável nas reações. Grupos de proteção convencio-nais podem ser usados de acordo com a prática padrão, por exemplo, verT.W. Greene e P. G. M. Wuts in " Protective Groups in Organic Chemis-try"("Gr upos Protetores na Química Orgânica"), John Wiley and Sons, 1991.
Compostos de Fórmula I podem ser preparados por procedimen-to como no seguinte Esquema de Reação I:
Esquema de Reações I
<formula>formula see original document page 10</formula>
em que:
em que Ri é como definido para Fórmula I no resumo da Invenção.
Compostos de Fórmula I podem ser preparados por meio de a -coplamento de compostos de fórmula 2 com compostos de fórmula 3 usandoum reagente de ativação acila adequado (por exemplo, HATU) na presençade uma base adequada (por exemplo, DlEA, ou similares) e um solventeapropriado (por exemplo, DMF) e podem levar até 3 horas para completarse.
Compostos de Fórmula I podem ser preparados por procedimen-to como no seguinte Esquema de Reação II:
Esquema de Reações Il
<formula>formula see original document page 11</formula>
em que
R1 é como definido para Fórmula I no resumo da Invenção.
Um composto de Fórmula I pode ser preparado por meio de rea-ção de um composto de fórmula 4 com uma amina adequada na ausênciaou presença de um solvente apropriado (por exemplo, AcOH-água). Umcomposto de Fórmula I pode ser também preparado por meio de reação deum composto de fórmula 4 com uma amina adequada na presença de umsolvente adequado (por exemplo, 1-butanol) com o auxiliar de ácido p-toluenossulfônico sob temperaturas elevadas.
Alternativamente, um composto de Fórmula I pode ser prepara-do por meio de reação de um composto de fórmula 4 com um composto defórmula RiH através de três métodos. Para a heteroarilamina ou arilamina, areação prossegue na presença de um catalisador adequado (por exemplo,sal de Pd (II), ou similares) e um solvente adequado (por.exemplo, 1,4-dioxano, ou similares), em uma temperatura na faixa de cerca de 80 a cercade 150°C e pode levar até cerca de 20 horas para completar-se. As condi-ções de reação para deslocamento de alquilamina envolve aquecimento deum composto de fórmula 4 com 5-10 equivalentes de amina em um solventeadequado (por exemplo, DMSO, DMF, ou similares). Para condensações defórmula 4 com arilamina, essas são realizadas na presença de ácido (porexemplo, TsOH, HOAc, HCI, ou similares) em um solvente adequado (porexemplo, DMSO, DMF, álcool ou similares).Exemplos detalhados da síntese de um composto de Fórmula Ipodem ser encontrados nos Exemplos, infra.
Processos Adicionais para Produção de Compostos da Invenção
Um composto da invenção pode ser preparado como um sal deadição de ácido farmaceuticamente aceitável mediante reação da forma ba-se livre do composto com um ácido inorgânico ou orgânico farmaceutica-mente aceitável. Alternativamente, um sal de adição de base farmaceutica-mente aceitável de um composto da invenção pode ser preparado reagindoa forma ácida livre do composto com uma base inorgânica ou orgânica far-maceuticamente aceitável. Alternativamente, as formas salinas dos compos-tos da invenção podem ser preparadas usando sais dos materiais de partidaou intermediários.
As formas de ácido livre ou base livre dos compostos da inven-ção podem ser preparadas a partir do sal de adição base ou sal de adiçãoácido correspondentes, respectivamente. Por exemplo, um composto da in-venção em uma forma sal de adição de ácido pode ser convertida na baselivre correspondente por meio de tratamento com uma base adequada (porexemplo, solução de hidróxido de amônio, hidróxido de sódio e similares).Um composto da invenção em uma forma de sal de adição base pode serconvertido no ácido livre correspondente por meio de tratamento com umácido adequado (por exemplo, ácido clorídrico, etc.).
Compostos da invenção em forma não-oxidada podem ser pre-parados de N-óxidos de compostos da invenção por meio de tratamento comum agente de redução (por exemplo, enxofre, dióxido de enxofre, trifenil fos-fina, boridreto de lítio, boridreto de sódio, tricloreto de fósforo, tribrometo, ousimilares) em um solvente orgânico inerte adequado (por exemplo, acetoni-trila, etanol, dioxano aquoso, ou similares) sob 0 a 80°C.
Derivados pró-fármaco dos compostos da invenção podem serpreparados por métodos conhecidos daqueles versados no estado da técni-ca (por exemplo, para detalhes adicionais ver Saulnier e outros, (1994), Bio-organic and Medicinal Chemistry Letters, Vol. 4, p. 1985). Por exemplo, pró-fármacos apropriados podem ser preparados por meio de reação de umcomposto não-derivado da invenção com um agente de carbamilação ade-quado (por exemplo, 1,1-aciloxialquilcarbanocloridato, carbonato de para-nitrofenila, ou similares).
Derivados protegidos dos compostos da invenção podem serproduzidos por meios conhecidos daqueles versados no estado da técnica.
Uma descrição detalhada de técnicas aplicáveis para a criação de grupos deproteção e sua remoção pode ser encontrada in T. W. Greene, nProtectingGroups in Organic Chemistry", 3a edição, John Wiley and Sons, Inc., 1999.
Compostos da presente invenção podem ser convenientementepreparados, ou formados durante o processo da invenção, como solvatos(por exemplo, hidratos). Hidratos de compostos da presente invenção podemser convenientemente preparados através de recristalização de uma misturaaquosa/solvente orgânico, usando solventes orgânicos tais como dioxina,tetraidrofurano ou metanol.
Compostos da invenção podem ser preparados como seus este-reoisômeros individuais por meio de reação de uma mistura racêmica docomposto com um agente de resolução opticamente ativo para formar umpar de compostos diastereoisoméricos, separando os diastereoisômeros erecuperando os enantiômeros opticamente puros. Embora resolução de e-nantiômeros possa ser realizada usando derivados diastereoisoméricos co-valentes dos compostos da invenção, complexos dissociáveis são preferidos(por exemplo, sais diastereosiméricos cristalinos). Diastereisômeros apre-sentam propriedades físicas distintas (por exemplo, pontos de fusão, pontosde ebulição, solubilidades, reatividade, etc.) e podem ser prontamente sepa-rados por levar vantagem dessas dissimilaridades. Os diastereisômeros po-dem ser separados por cromatografia, ou preferencialmente, através de téc-nicas de separação/resolução baseadas sob diferenças na solubilidade. Oenantiômero opticamente puro é em seguida recuperado, juntamente com oagente de resolução, por quaisquer meios práticos que não resultaria na ra-cemização. Uma descrição mais detalhada das técnicas aplicáveis para aresolução de estereoisômeros de compostos de sua mistura racêmica podeser encontrada in Jean Jacques, Andre Collet, Samuel H. Wilen, "Enantio-mers, Racemates and fíesolutions" ("Enantiômeros, Racematos e Resolu-ções"), John Wiley And Sons, Inc., 1981.
No resumo, os compostos de Fórmula I podem ser produzidospor um processo, o qual envolve:
(a) aqueles de esquemas de reação I e II; e
(b) opcionalmente conversão de um composto da invenção emum sal farmaceuticamente aceitável;
(c) opcionalmente conversão de uma forma salina de um com-posto da invenção em uma forma não-salina;
(d) opcionalmente conversão de uma forma não-oxidada de umcomposto da invenção em um N-óxido farmaceuticamente aceitável;
(e) opcionalmente conversão de uma forma N-óxido de um com-posto da invenção em sua forma não-oxidada;
(f) opcionalmente resolução de um isômero individual de umcomposto da invenção a partir de uma mistura de isômeros;
(g) opcionalmente conversão de um composto da invenção não-derivado em um derivado pró-fármaco farmaceuticamente aceitável; e
(h) opcionalmente conversão de um derivado pró-fármaco de umcomposto da invenção a sua forma não-derivada.
Na medida em que a produção dos materiais de partida não éparticularmente descrita, os compostos são conhecidos ou podem ser prepa-rados analogamente a métodos conhecidos no estado da técnica ou confor-me descritos nos Exemplos daqui por diante.
Aquele versado no estado da técnica entenderá que as trans-formações acima são apenas representativas de métodos para preparaçãodos compostos da presente invenção, e que outros métodos bem conheci-dos podem ser similarmente usados.
Exemplos
A presente invenção é adicionalmente exemplificada, mas nãose limita, pelos seguintes exemplos que ilustram a preparação de compostosde Fórmula I (Exemplos) de acordo com a invenção.
Exemplo 1N-(3-í7-(3-Amino-fenilamino)-1-metil-2-oxo-1.4-diidro-2H-pirimidol[4,5-d]piri-midin-3-il1-4-metil-fenil)-3-trifluormetil-benzamida
<formula>formula see original document page 15</formula>
5-Bromo-2,4-dicloro-pirimidina (2,41 g, 10,6 mmols) é lentamen-te tratado com metilamina (8 M em EtOH, 3,3 ml_) em THF (15 mL) sob cer-ca de -20°C. Após agitação por 30 minutos sob cerca de -20°C, a misturareacional é dividida entre CHCI3 e NaHCO3 saturado. A camada aquosa éextraída com CHCb adicional duas vezes e a camada orgânica combinada ésecada sobre MgSC>4, filtrada e concentrada. O produto bruto é purificadopor meio de cromatografia de coluna (SiO2, EtOAc/Hexano = 3/7) para for-necer 1,76 g (75%) de (5-bromo-2-cloro-pirimidin-4-il)-metilamina como umsólido branco.
Uma mistura de (5-bromo-2-cloro-pirimidin-4-il)-metilamina (3,75g, 16,9 mmols), tris(dibenzilidinoacetona)dipaládio(0) (388 mg, 0,4 mmol), etri-2-furilfosfina (777 mg, 3,3 mmols) em DMF é agitada por 20 minutos sobtemperatura ambiente e em seguida tributilvinilestanho (5,93 mL, 20,3mmols) é adicionado. Após agitação por 16 horas sob cerca de 65°C, a mis-tura reacional é esfriada a temperatura ambiente e agitada com uma soluçãoaquosa a 10% de fluoreto de potássio (800 mL) e éter dietílico (600 mL) por1 hora antes de filtragem através de uma almofada de Celite. A almofada deCelite é enxaguada com uma porção adicional de éter dietílico (200 mL). Acamada aquosa é separada e extraída com CHCI3. O extrato orgânico com-binado é secado sobre MgS04 e concentrado sob pressão reduzida parafornecer óleo bruto que é purificado através de cromatografia de coluna ins-tantânea (SiO2, EtOAc/Hx = 1/4) para fornecer (2-cloro-5-vinil-pirimidin-4-il)-metilamina (2,63 g, 92%) como um sólido branco.
Uma solução de (2-cloro-5-vinil-pirimidin-4-il)-metilamina (2,50 g,14,7 mmols) em CHCI3ZMeOH (15 mU15 mL) é borbulhado por ozônio por30 minutos e em seguida passado por uma corrente de argônio por 3 minu-tos sob -78°C. A mistura reacional é deixada aquecer até temperatura ambi-ente e tratada com sulfeto de dimetila (3,24 mL, 44,1 mmols). A mistura rea-cional é concentrada sob pressão reduzida para fornecer óleo incolor que épurificado através de cromatografia de coluna instantânea (SiO2, EtOAc/Hx =1/3) sobre sílica-gel para fornecer 2-cloro-4-metilamino-pirimidina-5-carbaldeído (2,40 g, 95%) como um sólido branco.
Uma solução de 2-cloro-4-metilamino-pirimidino-5-carbaldeído(1,08 g, 6,3 mmols) e N-(3-amino-4-metil-fenil)-3-trifluormetilbenzamida (2,04g, 6,9 mmols) em MeOH (70 mL) é agitada por 2 horas a 45°C e em seguidatratada com cianoboridreto sódico (1,19 g, 18,9 mmols) e ácido acético (1mL) seqüencialmente. Após agitação por 2 horas a temperatura ambiente, amistura reacional é diluída com CHCI3 e lavada com NaHCO3 saturado. Acamada orgânica é secada sobre MgSO4 e concentrada sob pressão reduzi-da. O resíduo é purificado por meio de cromatografia de coluna instantânea(SiO2, EtOAc/hexano = 1/2) para fornecer N-{3-[(2-cloro-4-metilaminopirimidin-5-ilmetil)amino]-4-metilfenil}-3-trifluormetilbenzamida(1,80 g, 64%) como um sólido branco.
A uma solução agitada de N-{3-[(2-cloro-4-metilaminopirimidin-5-ilmetil)amino]-4-metilfenil}-3-trifluormetilbenzamida (559 mg, 1,24 mmol) etrietilamina (693 μί, 4,97 mmols) em THF (15 mL) é adicionado trifosgênio(147 mg, 0,49 mmol) em THF (5 mL) a O0C, e a mistura é agitada por 30 mi-nutos sob temperatura ambiente. O precipitado é filtrado fora e o filtrado éagitado por 3 horas a 110°C. A mistura reacional é em seguida diluída comEtOAc e lavada com NaHCO3 saturado. A camada orgânica é secada sobreMgSO4 e concentrada sob pressão reduzida para fornecer óleo bruto que épurificado por meio de cromatografia de coluna instantânea (SiO2, EtO-Ac/hexano = 1/2) para fornecer N-[3-(7-cloro-2-oxo-1,4-diidro-2H-pirimi-do[4,5-d]pirimidin-3-il)-4-metilfenil]-3-trifluormetilbenzamida (420 mg, 71%)como um sólido branco.
Uma mistura de N-[3-(7-cloro-2-oxo-1,4-diidro-2H-pirimido[4,5-d]pirimidin-3-il)-4-metilfenil]-3-trifluormetilbenzamida (35,0 mg, 73,6 mmols) efenilenodiamina (79,5 mg, 736 mmols) é agitada por 1 hora a 100°C. A mis-tura é esfriada a temperatura ambiente e suspensa em metanol. O precipita-do é coletado e lavado com metanol para fornecer N-(3-í7-(3-amino-fenilaminoV1-metil-2-oxo-1^-diidro-2H-Dirimidor4.5-dlpirimidin-3-in-4-metil-fenil)-3-trifluormetil-benzamida (34 mg, 84%) como um sólido branco; RMNde 1H, 400 MHz (DMSOd6) δ 9,22 (s, 1H), 8,29 (s, 1H), 8,25 (d, 1H), 8,10 (s,1H), 7,95 (d, 1H), 7,78-7,76 (m, 2H), 7,62 (dd, 1H), 7,30 (d, 1H), 7,05 (d, 1H),6,88 (d, 1H), 6,87 (s, 1H), 6,17 (dd, 1H), 4,92 (s, 2H), 4,67 (d, 1H), 4,49 (d,1H), 3,33 (s, 3H), 2,12 (s, 3H); EM m/z 548,3 (M + 1).
Exemplo 2
N-í4-Metil-3-(1-metil-7-metilamino-2^-dioxo-1,4-diidro-2H-pirimidof4.5-dlpiri-midin-3-il)-fenin-3-trifluormetil-benzamida
<formula>formula see original document page 17</formula>
A uma solução agitada de 4-cloro-2-metilsulfanil-5-pirimidino-carboxilato de etila (4,50 g, 19,4 mmols) em MeOH é adicionado NH3 7 N(13,9 ml_) em MeOH a O0C e a mistura é agitada por 2 horas a temperaturaambiente. A mistura reacional é diluída com EtOAc e lavada com solução deNaHCO3 saturado. A camada orgânica é secada sobre MgSO4, filtrada econcentrada. O produto bruto é cristalizado a partir do solvente de EtOAc ehexano misto para fornecer 2,90 g (66%) de 4-amino-2-metilsulfanil-5-pirimidinocarboxilato de etila como um sólido branco.
A uma solução agitada de 4-amino-2-metilsulfanil-5-pirimidino-carboxilato de etila (2,79 g, 13,1 mmols) é adicionado NaOH 4 N (3,9 mL) ea mistura é agitada por 3 horas a 60°C. A mistura reacional é concentradapara fornecer 4-amino-2-metilsulfanil-5-pirimidinacarboxilato em uma formade sal de sódio em rendimento quantitativo.
A uma solução de 4-amino-2-metilsulfanil-5-pirimidinocarboxilatoem uma forma de sal de sódio (1,28 g, 6,2 mmols), N-(3-Amino-4-metil-fenil)-3-trifluormetil-benzamida (1,82 g, 6,2 mmols), e DIEA (3,22 mL, 18,5 mmols)em DMF é adicionada HATU (2,82 g, 7,42 mmols), e a mistura é agitada por1 ha temperatura ambiente. A mistura reacional é diluída com EtOAc e la-vada com 5% de solução aquosa Na2S2O3, solução aquosa saturada NaH-CO3 e salmoura. A camada orgânica é secada sobre MgSO4 e concentradaem pressão reduzida. O produto bruto é cristalizado de MeOH para fornecerácido 4-amino-2-metilsulfanil-pirimidino-5-carboxílico [2-metil-5-(3-trifluor-metil-benzoilamino)-fenil]-amida (1,79 g, 61%) como um sólido branco.
A uma solução agitada de ácido 4-amino-2-metilsulfanil-pirimi-dina-5-carboxílico [2-metil-5-(3-trifluormetil-benzoilamino)-fenil]-amida (286mg, 0,62 mmol) e diisopropiletilamina (864 μΙ_, 4,96 mmols) em dioxano (10mL) é adicionado a uma solução de trifosgênio (184 mg, 0,62 mmol) em dio-xano (2 mL) a 0°C, e a mistura é agitada por 12 h a 100°C. A mistura reacio-nal é diluída com EtOAc (50 mL), e lavada com solução saturada NaHCO3. Acamada orgânica é secada sobre MgSO4, filtrada, concentrada sob pressãoreduzida e cristalizada de MeOH para fornecer N-[4-Metil-3-(7-metilsulfanil-2,4-dioxo-1,4-diidro-2H-pirimido[4,5-d]pirimidin-3-il)-fenil]-3-trifluormetil-ben-zamida (166 mg, 55%) como um sólido branco cristalino.
À suspensão de NaH (dispersão a 60% em óleo mineral, 19,7mg, 0,49 mmol) em DMF é adicionada N-[4-Metil-3-(7-metilsulfanil-2,4-dioxo-1,4-diidro-2H-pirimido[4,5-d]pirimidin-3-il)-fenil]-3-trifluormetil-benzamida (218mg, 0,45 mmol) a 0°C. Quando evolução de H2 foi cessada, iodometano (84μl, 1,35 mmol) é adicionado e a mistura reacional é agitada por 3 horas atemperatura ambiente. A mistura é diluída com acetato de etila, e lavadacom 5% de solução aquosa Na2S2O3 para remover DMF. A camada orgânicaé secada sobre MgSO4 e concentrada sob pressão reduzida. O produto bru-to é cristalizado de MeOH para fornecer N-[4-Metil-3-(1-metil-7-metilsulfanil-2,4-dioxo-1,4-diidro-2H-pirimido[4,5-d]pirimidin-3-il)-fenil]-3-trifluormetil-benzamida (184 mg, 82%) como um sólido branco.
A uma solução agitada de N-[4-Metil-3-(1-metil-7-metilsulfanil-2,4-dioxo-1,4-diidro-2H-pirimido[4,5-d]pirimidin-3-il)-fenil]-3-trifluormetil-bem-zamida (184 mg, 0,37 mmol) no solvente de DMF misto (4 mL) e clorofórmio(4 mL) é adicionado m-ácido cloroperoxibenzóico (77% máx., 97 mg, 44mmols) e a mistura é agitada por 1 h sob temperatura ambiente. A mistura édiluída com clorofórmio, e lavada com solução aquosa a 5% de Na2S2O3 esolução saturada de NaHCO3. A camada orgânica é secada sobre MgSO4 econcentrada sob pressão reduzida para fornecer N-[3-(7-metanossulfinil-1-metil-2,4-dioxo-1,4-diidro-2H^irimido[4,5-d]pirimidin-3-il)-4-metil-fenHtrifluormetil-benzamida (167 mg, 88%).
N-[3-(7-Metanossulfinil-1-metil-2,4-dioxo-1,4-diidro-2H-pirimi-do[4,5-d]pirimidin-3-il)-4-metil-fenil]-3-trifluormetil-benzamida (30 mg, 58μπιοΐβ) é dissolvida em solução de metilamina 2 M (1 ml_) em THF e a mistu-ra é agitada por 1 h a 60°C. A mistura reacional é concentrada, dissolvidaem DMSO, e purificada através de LCMS preparativa para fornecer N-[4-metil-3-(1-metil-7-metilamino-2,4-dioxo-1,4-diidro-2H-pirimido[4,5-d]pirimidin-3-il)-fenil]-3-trifluormetil-benzamida (20 mg, 71%); RMN de 1H 400 MHz(DMSO-d6) δ 10,70 (s, 1H), 8,95 (s, 0,33 H), 8,85 (s, 0,66 H), 8,39 (m, 3H),8,11 (d, 1H), 7,93 (t, 1H), 7,84 (m, 2H), 7,49 (d, 1H), 3,65 (d, 2H), 3,58 (s,1H), 3,08 (m, 3H), 2,17 (s, 3H); EM m/z 485,3 (M + 1).
Repetindo os procedimentos descritos nos exemplos acima, u-sando materiais de partida apropriados, os seguintes compostos de FórmulaI, conforme identificados na Tabela 1, são obtidos.
Tabela 1
<table>table see original document page 19</column></row><table><table>table see original document page 20</column></row><table><table>table see original document page 21</column></row><table>
Ensaios
Usando uma linhagem celular ES de camundongo dependentede células alimentadoras (que é engenheirada com um constructo repórterOct4-GFP e expressa GFP no estado não-diferenciado, pluripotente), com-postos são selecionados por sua capacidade de manter o estado não-diferenciado de células ES sem células alimentadoras e LlF. Compostos dainvenção mantêm células ES de camundongo nos estados não-diferenciadospor mais de 10 passagens sem a necessidade de LIF e camadas alimenta-doras. Células ES pluripotentes expressam Oct4, Nanog, ALP, SSEA-1 eformam colônias compactas. Diferenciações são indicadas pela presença decolônias soltas e células tais como planas e/ou pedra arredondada. As célu-las ES de camundongo expandidas pelo composto da invenção retêm mar-cadores múltiplos de células pluripotentes, incluindo Oct-4, nanog, SSEA-1 eALP e podem diferenciar-se em células neuronais e cardíacas funcionais invitro e contribuir para camundongos quiméricos sadios in vivo. Verifica-setambém que compostos da invenção não ativam caminho Wnt através doensaio repórter TOPfIash descrito e não ativam caminho JAK-STAT atravésde western blotting.
Manutenção de auto-renovação de Célula-tronco Embriônica de Camundon-go (mES)
Células ES de camundongos são mantidas com células de ca-mada alimentadora em GM sobre placas revestidas com gelatina. CélulasES de camundongo são movidas a cada três dias usando 0,05% de tripsina-EDTA (0,5ml/cavidade). A razão ótima de divisão é 1:6.
Materiais usados para manutenção de células ES, e exemplos 4e 5, infra, incluem: células Oct4-GFP mES (células dependentes de camadaalimentadora); células mES R1 (células independentes de camada alimenta-dora); DMEM (GIBCO, 11965-084); Kouckout DMEM (KO DMEM) (GIBCO,10829-018); DMEM/F12 (GIBCO, 11330-032); Soro Bovino Fetal (FBS)(GIBCO, 26140-079); Knockout Serum Replacer (KO-SR), (GIBCO, 10828-028); B-27 Suplemento livre de soro (50X), (GIBCO 17504-044); SuplementoN-2 (100X) (GIBCO, 17502-048); LIF (106 unidades) (Chemicon, ESG1106);L-Glutamina (GIBCO, 25030-081); aminoácidos não-essenciais (GIBCO,11140-050); 2-Mercaptoetanol (1000X), (GIBCO, 21985-023); 0,05% deTripsina-EDTA (GIBCO, 25300-054); 0,1% de solução gelatinosa (Stemcelltech., 07903); Meio basal (MB): KO DMEM, 15% de KO-SR, 1X de L-glutamina, 1X de aminoácido não-essencial, 1X de 2-mercaptoetanol; e meiode Growth (GM): Meio basal + 103 unidades de LIF.
Seleção para Identificar Compostos da Invenção:
As placas de 384 cavidades são revestidas com 0,1% de solu-ção gelatinosa a 37°C da noite para o dia. A solução gelatinosa é removidapor meio de aspiração. Células Oct4-GFP ES (dependentes de camada ali-mentadora) de camundongo são plaqueadas em placas revestidas com gela-tina em 1000 células/δθμΐ de GM/cavidade. Após incubação da noite para odia, o meio é alterado com BM e 5 μΜ de composto são adicionados a cadacavidade. Após 3 dias de incubação, o meio é substituído e o composto éadicionado novamente. Após 3 dias adicionais, as células são fixas e ensai-adas usando um sistema leitor de placa de imagem fluorométrica (FLIPR).
As cavidades em que as células mantiveram a expressão GFP são selecio-nadas como seqüências (hits) primárias. As seqüências (hits) primárias sãoadicionalmente confirmadas com a morfologia de colônia de células ES decamundongo. Usando esse método, são identificados compostos da inven-ção que mantêm a auto-renovação de células ES de camundongo sob con-dição livre de camada alimentadora.
Exemplo 3
Células ES de Camundongo mantêm Pluripotência em Meio de Diferencia-ção (MD)
DM induzido por ácido retinóico (RA): BM+0,3 μΜ de RA1 DMinduzido por SBF (FBS): DMEM, 20% de FBS. Placas de noventa e seis ca-vidades são revestidas com 0,1% de solução gelatinosa a 37°C da noite pa-ra o dia. A solução gelatinosa é removida por meio de aspiração. Células-tronco embriônicas de camundongos são plaqueadas em placas revestidascom gelatina em 104 células/50 μΙ de GM/cavidade. Após incubação da noitepara o dia, o meio é alterado para DM e 3 μΜ de um composto da invençãosão adicionados a cada cavidade. Após incubação de 3 dias, o meio é subs-tituído com meio fresco e composto. Após 3 dias adicionais, as células sãofixas e ensaiadas com expressão de marcadores pluripotentes e morfologiade colônias. Uma concentração eficaz é medida pela manutenção de ex-pressão de GFP e morfologia de colônias. Uma lista de concentrações efica-zes de vários compostos da invenção é descrita na Tabela 3, infra.
Exemplo 4
Condição de Cultura de Passagens Múltiplas Livres de Camada Alimentadora
Placas de seis cavidades são revestidas com 1 ml de gelatina a0,1% por cavidade e incubadas a 37°C da noite para o dia. Após remoção desolução gelatinosa, as células ES de camundongo são plaqueadas em 2 χ105 células/2 ml de meio de cultura por cavidade. As células são passadasde 3 em 3 dias usando 0,05% de Tripsina-EDTA (0,5ml/cavidade). A razãoótima de divisão é dependente do meio de cultura diferente (tabela 2). Tabe-la 2 mostra exemplos de diferentes condições de cultura livre de camadaalimentadora em que o composto da invenção é N-(4-Metil-3-f 1 -metil-7-(2-metil-2H-pirazol-3-ilamino)-2-oxo-1.4-diidro-2H-pirimidof4.5-d1pirimidin-3-il1-fenil)-3-trifluormetil-benzamida (composto 213, tabela 1).Tabela 2: Diferentes condições de cultura livres de camada alimentadora.
<table>table see original document page 24</column></row><table>
Tabela 3:
<table>table see original document page 24</column></row><table><table>table see original document page 25</column></row><table><table>table see original document page 26</column></row><table>
Deve-se entender que os exemplos e modalidades descritasneste relatório são para fins ilustrativos apenas e que várias modificações oualterações à luz destas, serão sugeridas aqueles versados no estado da téc-nica e devem ser incluídas dentro do espírito e alcance deste pedido e esco-po das reivindicações anexas. Todos as publicações, patentes, e pedidos depatente citados neste relatório são por meio deste incorporados como refe-rência para todos os propósitos.
Claims (6)
1. Método de manter células-tronco pluripotentes, o qual com-preende as etapas de crescimento das células em: a) um meio basal; e b)um composto de Fórmula I:<formula>formula see original document page 27</formula>em que:R1 é selecionado de hidrogênio, Ci-6alquila, C2-6alquenila, C6-loaril-Co-4alquila, C5-ioheteroaril-Co-4alquila, C3-ioCicloalquil-C0-4alquila e C3-10heterocicloalquil-Co-4alquila; em que qualquer alquila ou alquenila de Ri éopcionalmente substituída por um a três radicais independentemente sele-cionado de halo, hidróxi, Ci-6alquila e -NR2R3; em que qualquer arila, hete-roarila, cicloalquila ou heterocicloalquila de Ri é opcionalmente substituídapor um a três radicais selecionados de halo, hidróxi, ciano, Ci-6alquila, Ci--6alcóxi, C2-GalCiueniIa, alquila substituída por halo, alcóxi substituído por halo,-XNR2R3, -XOXNR2R3, -XNR2S(O)0-2R3, -XC(O)NR2R3, -XNR2C(O)XOR2,-XNR2C(O)NR2R3, -XNR2XNR2R3, -XC(O)NR2XNR2R3, -XNR2XOR2, -XOR2, -XNR2C(=NR2)NR2R3, -XS(0)o-2R4, -XNR2C(O)R2,XNR2C(O)XNR2R3, -XNR2C(O)R4, -XC(O)R4, -XR4, -XC(O)OR3 e -XS(O)0-2NR2R3; em que X é uma ligação ou Ci-4alquileno; R2 e R3 são, independen-temente selecionados de hidrogênio, C1^alquila e C3-i2Cicloalquila; e R4 é C3.-10heterocicloalquila opcionalmente substituída com 1 a 3 radicais seleciona-dos de Ci-6alquila, -XNR2R3, -XNR2XNR2R2, XNR2XOR2 e -XOR2; em queX, R2 e R3 são conforme descritos acima; e os sais farmaceuticamente acei-táveis, hidratos, solvatos e isômeros dos mesmos.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que as célulassão células de mamíferos.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que as célulassão células-tronco embriônicas humanas.
4. Composto, de acordo com a reivindicação 4, no qual Ri é se-lecionado de hidrogênio, metila, etila, isopropila, ciclopropila, ciclobutila, ci-clopentila, cicloexila, pirimidinila, 3-hidróxi-1 -metil-propil hidróxi-etila, fenila,morfolino, benzila, [1,2,4]triazol-4-ila, alila, 2-metil-alila, 2-(2-oxo-pirrolidin-1-il)-etila, piperazinil-etila, piperazinil-propila, tiazolila, oxazolila, piridinila, pira-zolila, piperidinila, tiazolila, etil-pirrolidinil-metila, morfolino-propila, dimetil-amino-propila, dietil-amino-propila, dietil-amino-butila, etóxi-carbonil-metila e[1,2,4]triazin-3-ila, [1,3,4]tiadiazolila; em que qualquer arila, heteroarila, ci-cloalquila ou heterocicloalquila é opcionalmente substituída com 1 a 3 radi-cais independentemente selecionados de metila, etila, ciano, hidróxi, metóxi,amino-carbonil-amino, hidróxi-metila, metil-piperazinila, metil-piperazinil-carbonila, etil-piperazinila, metil-piperazinil-metila, morfolino-sulfonila, metil-piperazinil-sulfonila, metil-piperazinil-carbonil-amino, metil-sulfonil-amino,amino-carbonila, amino-sulfonila, hidróxi-etila, hidróxi-metil-carbonil-amino,formil-amino, dimetil-amino, dimetil-amino-metila, dimetil-amino-etila, isopro-pil-amino-etila, carbóxi, amino-etil-amino, metil-amino-etila, morfolino-etila,morfolino-metila, amino-etila, imidazolil-propila, piperazinil-etila, piperazinila,trifluormetila, dietil-amino-etila, flúor, morfolino, dimetil-amino-etil-amino-carbonila, dietil-amino-etóxi, 2-amino-propionilamino, dimetil-amino-pirrolidinila, (2-dimetilamino-etil)-metil-amino, 2-dimetilamino-1-metil-etóxi edietil-amino.
5.
Composto, de acordo com a reivindicação 4, selecionado de:N-{3-[7-(2-Etil-2H-pirazol-3-ilamino)-1-metil-2-oxo-1,4-diidro-2H-pirimido[4,5-d]pirimidin-3-il]-4-metil-fenil}-3-trifluormetil-benzamida; N-{4-metil-3-[1-metil--7-(2-metil-2H-pirazol-3-ilamino)-2-oxo-1,4-diidro-2H-pirimido[4,5-d]pirimidin--3-il]-fenil}-3-trifluormetil-benzamida; N-{3-[7-(2,6-dimetil-piridin-4-ilamino)-1 -metil-2-oxo-1,4-diidro-2H-pirimido[4,5-d]pirimidin-3-il]-4-metil-fenil}-3-trifluormetil-benzamida; N-{3-[7-(3-Hidróxi-fenilamino)-1 -metil-2-oxo-1,4-diidro-2H-pirimido[4,5-d]pirimidin-3-il]-4-metil-fenil}-3-trifluormetil-benzamida;N-{3-[7-(3-Amino-fenilamino)-1-metil-2-oxo-1,4-diidro-2H--pirimido[4,5-d]pirimidin-3-il]-4-metil-fenil}-3-trifluormetil-benzamida; N-{3-[7-(3-metanossulfonilamino-fenilamino)-1-metil-2-oxo-1,4-diidro-2H-pirimido[4,5-d]pirimidin-3-il]-4-metil-fenil}-3-trifluormetil-benzamida; N-{3-[7-(2,5-dimetil--2H-pirazol-3-ilamino)-1-metil-2-oxo-1,4-diidro-2H-pirimido[4,5-d]pirimidin-3-il]--4-metil-fenil}-3-trifluormetil-benzamida; N-[4-metil-3-(1-metil-7-metilamino-2-oxo-1,4-diidro-2H-pirimido[4,5-d]pirimidin-3-il)-fenil]-3-trifluormetie N-[3-(7-etilamino-1 -metil-2-oxo-1,4-diidro-2H-pirimido[4,5-d]pirimidin-3-il)-4-metil-fenil]-3-trifluormetil-benzamida.
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