TW201704258A - 調控免疫反應之方法及多肽 - Google Patents

Abstract

本發明驚奇地發現TLT-1直接結合至免疫細胞並觸發細胞以表現免疫抑制表型；即，下調HLA-DR並上調PD-L1。藉由TLT-1或TLT-1衍生之多肽誘導PD-L1並降低HLA-DR可因此用於治療與免疫高反應性相關之疾病，例如自體免疫性疾病、過敏反應、移植排斥及移植物抗宿主病症。

Description

調控免疫反應之方法及多肽

本發明係關於免疫反應之調控。特定地，本發明係關於藉由使TLT-1直接結合至免疫細胞且觸發細胞表現免疫抑制表型來調控免疫反應之方法及多肽。

血小板係重要的止血介體。最新進展表明，血小板可影響先天性及適應性免疫反應二者。經活化血小板可釋放可溶性介體(例如可溶性CD40L)，該等介體與白血球相互作用以調控發炎過程且可促使患有敗血症之患者的免疫失調。TREM樣轉錄物-1(TLT-1)僅在靜息血小板巨核細胞之α顆粒中及經活化血小板之表面上觀察到。TLT-1係TREM家族之成員，該TREM家族由單一V-set免疫球蛋白(Ig)結構域、短胞質尾區及跨膜結構域中之帶電殘基組成。使用針對TLT-1之抗體的最新研究揭示蛋白質在凝血酶誘導之血小板凝集中之作用(Giomarelli B、Washington VA、Chisholm MM、Quigley L、McMahon JB等人，(2007)Inhibition of thrombin-induced platelet aggregation using human single-chain Fv antibodies specific for TREM-like transcript-1.Thromb Haemost 97：955-963)。US7553936 B2係關於調控血小板活性之方法及組合物及用於治療個體之與血小板活性相關之疾病或病症之方法及組合物，其包括以有效調控血小板活性之量投與 單鏈抗TREM樣轉錄物-1(TLT-1)抗體或其功能性片段或變體。

在正常人類血清中觀察到TLT-1細胞外結構域之小的可溶性片段(12及14kDa)，但在血漿中未觀察到。研究已顯示TLT-1可藉由與纖維蛋白原連接以促進血小板凝聚用作止血之調節劑，且亦展示高含量之可溶性TLT-1(sTLT-1)與散播性血管內凝血評分間之顯著相關性。US 20040180409 A1提供TLT-1核酸及蛋白分子，其可在各種細胞過程(例如，血液凝固及免疫反應)之調節中用作調控劑。血漿中之經延長sTLT-1表現與患有敗血性休克之患者之縮短存活期相關(Washington AV、Gibot S、Acevedo I、Gattis J、Quigley L等人，(2009)TREM-like transcript-1 protects against inflammation-associated hemorrhage by facilitating platelet aggregation in mice and humans.J Clin Invest 119：1489-1501)。US20130029921 A1揭示TLT-1及TLT-1衍生之肽藉由特異性抑制TREM-1活性展現抗發炎性質。最近，Derive等人展示sTLT-1可結合至可溶性TREM-1配體，從而干擾白血球活化(Derive M、Bouazza Y、Sennoun N、Marchionni S、Quigley L等人，(2012)Soluble TREM-like transcript-1 regulates leukocyte activation and controls microbial sepsis.J Immunol 188：5585-5592)。總之，sTLT-1之該等臨床及活體外研究表明其可具有雙重效應，在血小板凝聚中起作用且在敗血症期間調介白血球功能。

因此，仍需要開發用於調控免疫反應之藥劑或療法。

本發明提供調控免疫反應之方法，其包括使TREM樣轉錄物1(TLT-1)多肽結合至免疫細胞，其中TLT-1多肽至免疫細胞之結合抑制免疫反應。在一實施例中，TLT-1多肽至免疫細胞之結合治療及/或預防與免疫高反應性相關之疾病；較佳地，該疾病係自體免疫性疾病、過敏反應、移植排斥或移植物抗宿主病症。在一些實施例中，TLT-1 多肽係下文所述之彼等。

本發明亦提供多肽，其包括包含SEQ ID NO：1、2或42之至少5個胺基酸或與SEQ ID NO：1、2或42具有至少約50%的胺基酸序列一致性之胺基酸序列或其生物活性片段或變體。在一些實施例中，多肽包括與SEQ ID NO：1、2或42中所述之胺基酸序列具有至少約80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列；較佳地，多肽包括SEQ ID NO：1、2或42中所述之胺基酸序列。在一實施例中，該多肽係重組多肽或合成多肽。

在一些實施例中，多肽經聚乙二醇化或與組織靶標分子、白蛋白或血清白蛋白結合肽偶聯。在一些實施例中，多肽與組織靶標分子、白蛋白或血清白蛋白結合肽融合。

本發明進一步提供包括本發明之TLT-1多肽及醫藥上可接受之載劑之組合物。本發明亦提供治療及/或預防與免疫高反應性相關之疾病之方法，其包括向個體投與本發明之TLT-1多肽或包括TLT-1多肽之組合物。

本發明進一步提供TLT-1融合蛋白，其包括與一或多個異質多肽或本發明之其他TLT-1多肽融合之本發明之TLT-1多肽。

本發明進一步提供經聚乙二醇化之TLT-1多肽，其包括一或多個可操作地連接至本發明之TLT-1多肽之N-末端之至少一個胺基酸殘基之聚乙二醇(PEG)分子。

本發明進一步提供TLT-1多肽偶聯物，其包括偶聯至免疫抑制劑之本發明之TLT-1多肽。

圖1顯示TLT-1與白血球間之相互作用。將PBMC與rsTLT-1一起培育1小時並用生物素-山羊抗TLT-1抗體APC-抗生物素蛋白染色以檢測TLT-1之表面結合。(A)繪示各種白血球在TLT-1處理存在或不存在 下之代表性FACS直方圖。單核球、PMN及淋巴球係基於其FSC/SSC性質設門(粗線直方圖，經rsTLT-1處理之細胞；虛線直方圖，未經處理之細胞；細虛線直方圖，適當同種型對照)。TLT-1與單核球及PMN結合，但不與淋巴球結合。(B)繪示不同濃度之rsTLT-1至單核球及PMN之結合。PMN及單核球能夠以劑量依賴方式結合rsTLT-1。數值表示為來自3次獨立實驗的平均值±SEM。

圖2顯示sTLT-1對單核球中HLA-DR及PD-L1分子之表面表現之效應。(A)將單核球與rsTLT-1(10μg/ml)一起培育3天。在指示時間點處，收穫細胞且使用流式細胞術分析HLA-DR及PD-L1分子。利用rsTLT-1處理導致下調HLA-DR表現之趨勢。與此相比，rsTLT-1初免上調PD-L1於單核球上之表現量。(B)將單核球與不同濃度之rsTLT-1一起培育2天。然後收穫細胞且使用流式細胞術分析HLA-DR及PD-L1分子。表面分子表現呈現為相對於利用對照培養基處理之細胞(虛線)之每一天之平均螢光強度(MFI)。數值表示為來自3次獨立實驗的平均值±SEM。

圖3顯示TLT-1多肽對單核球中PD-L1分子之表面表現之效應。(A)繪示TLT-1之細胞外結構域及所設計TLT-1多肽之結構特徵。(B)顯示將單核球與不同長度之TLT-1多肽(10μg/ml)及10μg/ml之rsTLT-1一起培育1天。然後收穫細胞且使用流式細胞術分析PD-L1分子。表面分子表現呈現為相對於利用培養基對照處理之細胞(虛線)之每一天之MFI。

圖4顯示TLT-1 15-63多肽對單核球中HLA-DR分子之表面表現之效應。將單核球與10μg/ml的TLT-1 15-63多肽及10μg/ml rsTLT-1一起培育2天。然後收穫細胞且使用流式細胞術分析HLA-DR分子。表面分子表現呈現為相對於利用培養基對照處理細胞(虛線)之每一天之MFI。

在闡述本發明組合物、方法及分離方法前，應理解，本發明並不限於此，此乃因此等組合物、方法及條件可有所變化。亦應理解，本文所用之術語僅出於闡述特定實施例之目的，且並非意欲限制，此乃因本發明之範圍將僅受限於隨附申請專利範圍。

本發明意外發現TLT-1直接結合至免疫細胞並觸發細胞以表現免疫抑制表型；即藉由結合下調HLA-DR並上調PD-L1。藉由TLT-1或TLT-1多肽誘導PD-L1並減少HLA-DR可因此用於治療與免疫高反應性相關之疾病，例如自體免疫性疾病、過敏反應、移植排斥及移植物抗宿主病症。

定義

除非另外定義，否則本文所用全部技術及科學術語均具有與熟習本發明所屬技術領域者通常所瞭解含義相同的含義。任何與本文所述類似或等效之方法及材料均可用於本發明之實踐或測試中，此乃因應瞭解修改及變化涵蓋於本發明之精神及範圍內。

除非另有說明，否則「一(a或an)」意指一或多個。

如本文所用，胺基酸殘基縮寫如下：丙胺酸(Ala；A)、天冬醯胺(Asn；N)、天冬胺酸(Asp；D)、精胺酸(Arg；R)、半胱胺酸(Cys；C)、麩胺酸(Glu；E)、麩醯胺酸(Gln；Q)、甘胺酸(Gly；G)、組胺酸(His；H)、異白胺酸(Ile；I)、白胺酸(Leu；L)、離胺酸(Lys；K)、甲硫胺酸(Met；M)、苯丙胺酸(Phe；F)、脯胺酸(Pro；P)、絲胺酸(Ser；S)、蘇胺酸(Thr；T)、色胺酸(Trp；W)、酪胺酸(Tyr；Y)及纈胺酸(Val；V)。

如本文所用，術語「PD-L1」係指程式化死亡配體1(PD-L1)、分化簇274(CD274)或B7同系物1(B7-H1)。PD-L1係40kDa 1型跨膜蛋白，其在諸如懷孕、自體免疫性疾病、癌症、敗血症及其他傳染病 (例如結核分枝桿菌、巨細胞病毒及肝炎)之特定事件期間在抑制免疫系統中起主要作用。

如本文所用，術語「單核球」亦稱為單核白血球，其屬涉及一線防禦機制之一類白血球且公認為能夠分化成樹突細胞或巨噬細胞前體。單核球通常在血液系統中移動。因應於外部刺激信號，單核球分泌許多免疫調節細胞因子，移動至組織中之感染位點並分化成巨噬細胞。

如本文所用，術語「調控」包含與對照相比通常以統計學上顯著或生理學上顯著之量「增加」或「刺激」以及「減少」或「降低」。

如本文所用，「一致性」係指兩個或兩個以上多肽或蛋白質序列間之關係，如藉由比較序列所測定。在業內，「一致性」亦係指多肽或蛋白質間之序列相關程度，如藉由此等序列串間之匹配所測定。「一致性」可容易地藉由已知生物資訊方法計算。兩個多肽或兩個多肽序列之「一致性%」係藉由使用GAP電腦程式(GCG Wisconsin Package，版本10.3之一部分)使用其預設參數比較序列來測定。

如本文所用，術語「生物活性片段」意指本發明所涵蓋多肽之胺基酸片段，該片段亦具有本文所述多肽之效能。

如本文所用，術語「變體」係指野生型或已藉由取代、插入、交叉、缺失及/或其他遺傳操作改變之胺基酸序列。出於本發明之目的，變體並不受限於生成該變體之特定方法。在一些實施例中，變體序列與親代序列相比可具有增加、減少或實質上類似之活性或性質。在一些實施例中，多肽與野生型多肽之胺基酸序列相比可含有一或多個已突變之胺基酸殘基。在一些實施例中，在構成大多數之變體多肽中，多肽之一或多個胺基酸殘基與親代多肽相比可保持恆定、不變或未經取代。在一些實施例中，親代多肽係作為生成具有經改良之穩健 性或其他性質之變體之基礎。變體亦可在二級結構、四級結構及摺疊程度中之至少一者方面中不同。

如本文所用，術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」各自係指包括兩個或兩個以上藉由肽鍵彼此連結之胺基酸殘基之分子。該等術語涵蓋(例如)天然及人工蛋白質、蛋白質片段及蛋白質序列之多肽類似物(例如變體及融合蛋白)以及翻譯後修飾或以其他方式共價或非共價修飾之蛋白。肽、多肽或蛋白質可係單體或聚合物。

如本文所用，術語「多肽片段」係指與相應全長蛋白質相比，胺基末端及/或羧基末端缺失之多肽。片段亦可由蛋白水解(或其他)處理產生，該處理(例如)導致一至五個胺基酸之胺基及/或羧基末端與所預計相比有所變化。片段可進一步在其末端之一或兩者處包括一或多個額外胺基酸，例如來自不同的天然蛋白質之胺基酸序列或人工胺基酸序列(例如，人工連接體序列或標籤蛋白)。

如本文所用，術語「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成份外對個體無毒之成份。醫藥上可接受之載劑包含但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。

如本文所用，術語「個體」係指脊椎動物、較佳地哺乳動物、更佳地人類。哺乳動物包含(但不限於)人類、農場動物、運動動物及寵物。

如本文所用，術語「有效量」係指足以實現有益或期望之臨床結果之量。有效量可以一或多次投與來投與。出於本發明之目的，有效量係足以診斷、減輕、改善、穩定、逆轉、減慢或延遲疾病狀態之進展之量。

如本文所用，術語「治療」(「treatment」、「treating」、「treat」)及諸如此類通常係指獲得期望之藥理學及/或生理學效應。該效應在完全或部分預防疾病或其症狀方面可係預防性的，及/或在 部分或完全穩定或治癒疾病及/或可歸因於該疾病之不良效應方面可係治療性的。本文所用「治療(treatment)」涵蓋哺乳動物、特定而言人類之疾病之任何治療，且包括：(a)防止疾病或症狀在易患該疾病或症狀但尚未診斷出患有該疾病或症狀之個體中發生；(b)抑制疾病症狀，即遏止其發展；或(c)緩解疾病症狀，即使該疾病或症狀消退。

本文所用術語「預防」係指阻止疾病狀態或病況在患者或個體中發生之預防性(preventative或prophylactic)措施。預防亦可包含降低疾病狀態或病況在患者或個體中發生之可能性及阻礙或遏止該疾病狀態或病況之發作。

在提供值之範圍之情形中，則應瞭解，該範圍之上限與下限之間之每一中間值(除非上下文另有明確指示，否則精確至下限之單位的十分之一)及所述範圍中之任何其他所述或中間值均涵蓋於本發明內。該等較小範圍之上限及下限可獨立地包含於該等較小範圍中且亦涵蓋於本發明內，受限於所述範圍中任何具體排除之限值。在所述範圍包含限值之一或二者之情形中，本發明中亦包含排除彼等所包含限值之任一或二者的範圍。

免疫反應之調控

本發明意外發現TLT-1至免疫細胞之直接結合觸發細胞以藉助下調HLA-DR及上調PD-L1表現免疫抑制表型。

在一態樣中，本發明提供調控免疫反應之方法，其包括使TREM樣轉錄物1(TLT-1)多肽結合至免疫細胞，其中TLT-1多肽至免疫細胞之結合抑制免疫反應。在一實施例中，TLT-1多肽係下文所述之彼等。

在一實施例中，本發明提供治療及/或預防與免疫高反應性相關之疾病之方法，其包括向個體投與有效量之TLT-1多肽。在一些實施 例中，疾病包含(但不限於)自體免疫性疾病、過敏反應、移植排斥及移植物抗宿主病症。

藉由TLT-1多肽結合至單核球可誘導PD-L1之表現且可減少HLA-DR，由此治療與免疫高反應性相關之疾病。能夠結合至免疫細胞之任何TLT-1多肽(包含全長TLT-1及其多肽片段)可達成上述對PD-L1及HLA-DR之調控。

TLT-1多肽

本發明驚奇地發現TLT-1細胞外結構域之序列負責至免疫細胞之結合；較佳地，包括至少30個胺基酸之序列(TLT-1 34-63)、包括至少49個胺基酸之序列(TLT-1 15-63)或包括至少147個胺基酸之序列(TLT-1 16-162)。藉由使TLT-1多肽接合於免疫細胞上可誘導PD-L1之表現且可減少HLA-DR，此表明藉由TLT-1或TLT-1多肽之PD-L1之誘導及HLA-DR之減少可因此用於治療與免疫高反應性相關之疾病，例如自體免疫性疾病、過敏反應、移植排斥及移植物抗宿主病症。

在另一態樣中，本發明提供多肽，其包括包含SEQ ID NO：1之至少5個胺基酸或與SEQ ID NO：1具有至少約80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列、或其生物活性片段或變體。

(SEQ ID NO：1)

在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO：1具有至少80%(例如，至少80%、85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)之胺基酸序列一致性。

在一實施例中，多肽包括包含SEQ ID NO：2之5個胺基酸或與SEQ ID NO：2中所述胺基酸序列具有至少約80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列、或其生物活性片段或變體。

(SEQ ID NO：2)

在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO：2具有至少80%(例如，至少80%、85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)之胺基酸序列一致性。

在一實施例中，多肽包括包含SEQ ID NO：3之5個胺基酸或與SEQ ID NO：42中所述胺基酸序列具有至少約70%的胺基酸序列一致性之胺基酸序列、或其生物活性片段或變體。

(SEQ ID NO：3)

在一些實施例中，多肽與SEQ ID NO：3具有至少70%(例如，至少70%、80%、85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)之胺基酸序列一致性。

在一些實施例中，本發明提供多肽，其包括在本文所述之TLT-1胺基酸序列之任一者中之一或多個插入、取代及/或缺失。較佳地，TLT-1胺基酸序列係SEQ ID NO：1、2或3。

多肽可經由重組方法及化學合成產生。此外，可使用功能上等效之多肽，其中該等效之多肽可含有導致沉默變化之胺基酸殘基之缺失、添加或取代，從而產生在路徑基因產物上差異性表現之功能等效物。胺基酸取代可基於所涉及殘基在極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性及/或兩親性特性方面中之類似性來進行。如本文所用「功能上等效」係指能夠展現實質上類似之活體內活性之蛋白質。

可使用此項技術熟知之技術藉由重組DNA技術或合成技術產生 多肽。熟習此項技術者熟知之方法可用於構築含有編碼序列及適當轉錄/翻譯控制信號之表現載體。該等方法包含(例如)活體外重組DNA技術、合成技術及活體內重組/遺傳重組。或者，可化學合成能夠編碼所關注多肽之RNA。

通常，將編碼序列置於在期望宿主細胞中起作用之啟動子控制下來產生相對大量之基因產物。熟知種類極多之啟動子且可端視特定應用而定用於本發明之表現載體中。一般地，所選擇之啟動子取決於該啟動子在其中具有活性之細胞。亦視情況包含其他表現控制序列，例如核糖體結合位點、轉錄終止位點及諸如此類。包含該等控制序列中之一或多者之構築體稱為「表現盒」。表現可利用適於特定宿主細胞之啟動子及其他調節劑在原核及真核細胞中達成。實例性宿主細胞包含(但不限於)大腸桿菌(E.coli)、其他細菌宿主、酵母及各種高等真核細胞，例如COS、CHO及HeLa細胞系及骨髓瘤細胞系。

一旦表現，重組多肽可根據業內之標準程序來純化，包含硫酸銨沈澱、親和管柱、離子交換及/或粒徑排阻層析、凝膠電泳及諸如此類(通常參見R.Scopes,Protein Purification,Springer-Verlag,N.Y.(1982),Deutscher,Methods in Enzymology第182卷：Guide to Protein Purification.,Academic Press,Inc.N.Y.(1990))。

作為重組方法之替代，多肽可以化學方式合成。此等方法通常包含固態途徑，但亦可利用基於溶液之化學方法及組合或固態與溶液途徑之組合。用於合成蛋白之固態方法之實例由Merrifield(1964)J.Am.Chem.Soc.85：2149；及Houghton(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.,82：5132闡述。可合成本發明蛋白質之多肽片段且然後連結在一起。實施此等反應之方法由Grant(1992)Synthetic Peptides：A User Guide,W.H.Freeman and Co.,N.Y.及「Principles of Peptide Synthesis,」(Bodansky及Trost編輯)，Springer-Verlag,Inc.N.Y.,(1993)中闡述。

在另一態樣中，本發明提供TLT-1融合蛋白，其包括與一或多個異質多肽或本發明之其他TLT-1多肽融合之本發明之TLT-1多肽。TLT-1多肽直接或經由胺基酸連接體共價連接至一或多個異質多肽或本發明之另一TLT-1多肽。形成融合蛋白之多肽通常C末端連接至N末端，但其亦可C末端連接至C末端、N末端連接至N末端、N末端連接至C末端。融合蛋白之多肽可呈任一順序且可包含組成多肽中之任一或兩者中之多於一者。異質多肽之實例包含(但不限於)白蛋白、血清白蛋白結合肽、細胞穿透肽(CPP)、組織靶標分子及免疫抑制肽。較佳地，異質多肽係白蛋白或血清白蛋白結合肽。

本發明亦提供經聚乙二醇化之TLT-1多肽，其包括一或多個可操作地連接至本發明TLT-1多肽之N-末端之至少一個胺基酸殘基之聚乙二醇(PEG)分子。分子之聚乙二醇化可根據(例如)在Youngster等人，Curr Pharm Des(2002),8：2139中所述之方法來實施。任一類型之聚乙二醇均適於本發明，前提係PEG-多肽仍具有可根據此項技術已知之方法分析之功能活性。較佳地，本發明之聚乙二醇係PEG 1000、PEG 2000、PEG 3000、PEG 5000、PEG 10000、PEG 15000、PEG 20000、PEG 30000、PEG 40000或PEG 50000。在一實例中，經聚乙二醇化之TLT-1多肽包括單體TLT-1多肽。在另一實例中，經聚乙二醇化之分子包括寡聚TLT-1多肽。在又一實例中，經聚乙二醇化之TLT-1多肽包括多臂PEG，其中一或多個單體TLT-1多肽可操作地連接至多臂PEG。

本發明亦包括TLT-1多肽偶聯物，其包括偶聯至免疫抑制劑、組織靶標分子、白蛋白或血清白蛋白結合肽之本發明之TLT-1多肽。

本發明多肽之組合物

在另一態樣中，本發明提供包括本發明之TLT-1多肽之組合物。在一些實施例中，此等組合物可投與個體。在一些實施例中，本發明 之TLT-1多肽可提供於包括一或多種其他組份之組合物中，該等組份包含(但不限於)醫藥上可接受之載劑、佐劑、潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑、防腐劑及/或適於組合物預期用途之任何其他組份。此等組合物可採取溶液、懸浮液、乳液及諸如此類之形式。術語「醫藥上可接受之載劑」包含各種稀釋劑、賦形劑及/或媒劑，本發明之TLT-1多肽、蛋白質及/或蛋白質複合物可提供於其中或與其一起提供。醫藥上可接受之載劑包含(但不限於)以下載劑：已知對於遞送至人類及/或其他動物個體安全、及/或由聯邦或州政府之管理機構批准、及/或列示於美國藥典(U.S.Pharmacopeia)及/或其他公認藥典中、及/或自一或多個公認管理機構獲得用於人類及/或其他動物中之特定或個別批准。此等醫藥上可接受之載劑包含(但不限於)水、水溶液(例如鹽水溶液、緩衝劑及諸如此類)、有機溶劑(例如某些醇及油，包含石油、動物、植物或合成來源者，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油)及諸如此類。

在一實施例中，本發明之TLT-1多肽可提供於包括一或多種額外活性組份(例如一或多種額外免疫抑制劑)之組合物中。免疫抑制劑包含(但不限於)糖皮質激素、細胞抑制劑、烷基化劑、抗代謝物、胺甲喋呤、硫唑嘌呤、巰基嘌呤、放線菌素、蒽環類、絲裂黴素C、博來黴素(bleomycin)、光輝黴素、抗CD20抗體、莫羅單抗(muromonab)-CD3、巴利昔單抗(basiliximab)、達克珠單抗(daclizumab)、環孢素、他克莫司(tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)、干擾素、類鴉片、TNF結合蛋白、麥考酚酯(mycophenolate)、芬戈莫德(fingolimod)及多球殼菌素(myriocin)。

在一些實施例中，本發明之組合物包括「有效量」之本發明之TLT-1多肽。「有效量」係達成期望最終結果所需之量。有效達成期望最終結果之本發明TLT-1多肽之量將取決於各種因素，包含(但不限 於)預期個體之物種(例如係人類或係一些其他動物物種)、預期個體之年齡及/或性別、計劃投與途徑、計劃投藥方案、任何持續性疾病或病況之嚴重程度及諸如此類。有效量(其可係有效量之範圍)可無需任何過多實驗而藉由標準技術測定，例如在預期個體物種或任何適宜動物模型物種中使用活體外分析及/或活體內分析。適宜分析包含(但不限於)涉及自劑量-反應曲線及/或源生自活體外及/或活體內模型系統之其他數據外推之彼等。在一些實施例中，有效量可根據醫師或獸醫從業人員基於特定情況之判斷來確定。

在一實施例中，TLT-1多肽之有效量在每次投與約0.0002mg/kg體重至約20mg/kg體重之間之範圍內。

投與方法

在一些實施例中，本發明提供包括向個體投與本發明之TLT-1多肽之方法。此等方法可包括用於治療患有與免疫高反應性相關之疾病之個體之方法，該疾病係例如自體免疫性疾病、過敏反應、移植排斥及移植物抗宿主病症。

可投與本發明之TLT-1多肽、或包含此TLT-1多肽之組合物(例如在治療方法之期間)之個體包含任何及全部動物物種。在一些實施例中，個體係哺乳動物物種。哺乳動物個體包含(但不限於)人類、非人類靈長類、齧齒類動物、兔及雪貂。

此項技術已知各種遞送系統且可使用任何適宜遞送系統以將本發明組合物投與個體。此等遞送系統包含(但不限於)皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外及經口遞送系統。本發明之組合物可藉由任一方便途徑投與，例如藉由輸注或濃注、藉由經上皮或皮膚黏膜襯裡(例如，口腔黏膜、直腸及腸黏膜等)吸收，且可與其他生物活性劑一起投與。投與可為全身性或局部。

在一些此等實施例中，較佳投與單一劑量。然而，在其他實施 例中，可藉由相同或不同途徑投與額外劑量以達成期望效應。在一些實施例中，投藥方案可包括單一投與。在其他實施例中，投藥方案可包括多次投與。

實例

以下實例所用之材料及方法闡述於下文中。

人類細胞分離及細胞培養

來自健康志願者之白血球濃縮物係自台灣血液基金會(Taiwan Blood Service Foundation)(台灣臺北市(Taipei,Taiwan))獲得。獲得關於參與此研究之書面知情同意書，該研究係由馬偕紀念醫院人體試驗委員會(Institutional Review Board of the MacKay Memorial Hospital)批准。如前所述分離人類單核球。簡言之，使用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare)梯度離心分離末梢血單核細胞(PBMC)。使用CD14 MACS微珠粒(Miltenyi Biotec)藉由實施CD14選擇進一步純化單核球。使用流式細胞術分析確認之單核球純度為約90%。

重組可溶性TLT-1及TLT-1多肽之生成

為生成重組可溶性TLT-1(rsTLT-1)，使用大腸桿菌表現編碼N末端具有聚組胺酸標籤之人類TLT-1細胞外結構域(Glu16-Pro162)之pET28a(+)-rsTLT-1並使用Ni-NTA管柱(Novagen)將其純化。使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定且使用考馬斯藍(coomassie blue)染色可視化之重組蛋白之純度為>95%。使用LAL分析(QCL-1000)檢查經純化蛋白質之內毒素污染。所有蛋白質均係無菌的且內毒素濃度低於檢測限值(<0.1EU/μg蛋白質)。TLT-1多肽係由Kelowna International Scientific Inc.(臺灣臺北市)化學合成。

流式細胞分析 對於TLT-1結合實驗，將PBMC在37℃下在5% CO₂之加濕氣氛中於AIM-V培養基(Life Technologies)中培育過夜，以允許血小板自細胞表面脫落。為篩選用於特異性結合TLT-1之白血 球，將經分離PBMC與不同濃度TLT-1及競爭肽一起在37℃培育1小時。然後洗滌細胞並用經生物素偶聯之山羊抗TLT-1抗體(R&D Systems)染色。單核球、多型核白血球(PMN)及淋巴球係基於其FSC/SSC性質設門。為分析經TLT-1或TLT-1多肽初免之單核球之表面表型，將細胞於冰上黑暗中與以下稀釋於含有1% BSA的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之mAbs一起培育30分鐘：HLA-DR-PE、PD-L1-FITC、CD14-PerCP(BD Biosciences)。使用FACS Calibur檢測螢光，且使用FCS Express version 3(De Novo Software)實施數據分析。

統計學分析

數據係使用Prism 6.0(GraphPad)分析並表示為平均值±SEM。使用司徒頓t測試(Student’s t test)實施群組間比較。使用皮爾森相關係數(Pearson’s correlation coefficient)測定相關性。P值<0.05視為顯著。

實例1 TLT-1與白血球間之相互作用

為測定TLT-1是否結合至白血球，將白血球與10μg/ml rsTLT-1一起培育1小時且然後藉由使用流式細胞術檢測TLT-1之細胞表面結合。如圖1A所示，檢測到rsTLT-1與PMN及單核球結合，但未與淋巴球結合。此外，觀察到PMN及單核球結合rsTLT-1之結合係劑量依賴性的(圖1B)。該等結果表明TLT-1之受體存在於人類PMN及單核球上。

實例2 TLT-1改變HLA-DR及PD-L1分子在單核球中之表面表現

為研究sTLT-1之存在是否可調控HLA-DR及PD-L1在單核球上之表現，首先將人類單核球與rsTLT-1(10μg/ml)一起培育並連續3天檢查HLA-DR及PD-L1之表現。如圖3A(左)所示，在第一個24小時內，HLA-DR因rsTLT-1顯著上調，之後在稍後時間點其表現快速下調。PD-L1之表現在24小時內亦顯著增加但在整個隨後3天實驗中保持上 調(圖2A，右)。其次，研究sTLT-1對HLA-DR及PD-L1之表現之劑量效應。圖2B(左)顯示在與rsTLT-1一起培育48小時時，HLA-DR在單核球上之表現減少，且該下調與增加之rsTLT-1濃度顯著相關。相比之下，PD-L1之表現隨著增加之rsTLT-1濃度顯著上調(圖2B，右)。總之，數據表明由rsTLT-1刺激之單核球具有免疫抑制表型。

實例3 TLT-1 15-63多肽改變PD-L1及HLA-DR分子在單核球中之表面表現

TLT-1具有單一細胞外Ig可變(Ig V)結構域，該結構域含有9條β鏈，該等β鏈形成2個藉由鏈B及鏈F間之保守二硫鍵鎖定在一起之反平行β片層。此外，TLT-1具有另一二硫橋以穩定其C-C’β髮夾。為篩選sTLT-1之功能結構域，根據其V-型Ig結構合成不同長度之多肽(圖3A)。多肽序列顯示於表I中。將人類單核球與不同多肽(10μg/ml)一起培育並檢查PD-L1之表現達24小時。如圖3B中所示，在經TLT-1 15-63肽處理之單核球中，PD-L1在24小時內表現顯著增加。此外，利用TLT-1 34-63肽處理亦誘導PD-L1表現。在與TLT-1 15-63肽一起培育48小時時，HLA-DR在單核球上之表現亦減少(圖4)。因此，TLT-1 15-63可用作治療劑以藉助上調PD-L1表現並下調HLA-DR表現治療高免疫相關疾病。

<110> 台灣基督長老教會馬偕醫療財團法人馬偕紀念醫院

<120> 調控免疫反應之方法及多肽

<130> L88340/CN24524

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重組多肽

<400> 1

<210> 2

<211> 49

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重組多肽

<400> 2

<210> 3

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 重組多肽

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 多肽名稱：TLT-1 20-39

<400> 4

<210> 5

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 多肽名稱：TLT-1 15-46

<400> 5

<210> 6

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 多肽名稱：TLT-1 15-53

<400> 6

<210> 7

<211> 49

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 多肽名稱：TLT-1 15-63

<400> 7

<210> 8

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 多肽名稱：TLT-1 40-63

<400> 8

<210> 9

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 多肽名稱：TLT-1 34-63

<400> 9

<210> 10

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 藉由MS/MS串聯分析鑑別之肽-整合素β2 (CD18)

<400> 10

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 藉由MS/MS串聯分析鑑別之肽-整合素β2 (CD18)

<400> 11

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 藉由MS/MS串聯分析鑑別之肽-整合素β2 (CD18)

<400> 12

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 藉由MS/MS串聯分析鑑別之肽-整合素β2 (CD18)

<400> 13

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 藉由MMS/MS串聯分析鑑別之肽-整合素β2 (CD18)

<400> 14

<210> 15

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 藉由MS/MS串聯分析鑑別之肽-整合素β2 (CD18)

<400> 15

<210> 16

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 藉由MS/MS串聯分析鑑別之肽-整合素β2 (CD18)

<400> 16

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 藉由MS/MS串聯分析鑑別之肽-整合素-αM (CD11b)

<400> 17

<210> 18

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 藉由MS/MS串聯分析鑑別之肽-整合素-αM (CD11b)

<400> 18

<210> 19

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 藉由MS/MS串聯分析鑑別之肽-整合素-αM (CD11b)

<400> 19

<210> 20

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 由MS/MS串聯分析鑑別之肽-CD33

<400> 20

<210> 21

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 由MS/MS串聯分析鑑別之肽-CD33

<400> 21

<210> 22

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 由MS/MS串聯分析鑑別之肽-CD33

<400> 22

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 由MS/MS串聯分析鑑別之肽-HSP90

<400> 23

<210> 24

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 由MS/MS串聯分析鑑別之肽-HSP90

<400> 24

<210> 25

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 由MS/MS串聯分析鑑別之肽-HSP90

<400> 25

<210> 26

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 由MS/MS串聯分析鑑別之肽-HSP90

<400> 26

Claims (21)

1. 一種調控免疫反應之方法，其包括使TREM樣轉錄物1(TLT-1)多肽結合至免疫細胞，其中該TLT-1多肽至該免疫細胞之結合抑制免疫反應。
2. 如請求項1之方法，其中TLT-1多肽至該免疫細胞之該結合治療及/或預防與免疫高反應性相關之疾病。
3. 如請求項2之方法，其中與免疫高反應性相關之該疾病係自體免疫性疾病、過敏反應、移植排斥或移植物抗宿主病症。
4. 如請求項1或2之方法，其中該免疫細胞係單核球或嗜中性球。
5. 如請求項1、2或3之方法，其中該TLT-1多肽係包括包含SEQ ID NO：1之至少5個胺基酸或與SEQ ID NO：1具有至少約80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列、或其生物活性片段或變體之多肽。
6. 如請求項5之方法，其中該多肽包括包含SEQ ID NO：2之至少5個胺基酸或與SEQ ID NO：2中所述之胺基酸序列具有至少約80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列、或其生物活性片段或變體。
7. 如請求項5之方法，其中該多肽包括包含SEQ ID NO：3之至少5個胺基酸或與SEQ ID NO：3中所述胺基酸序列具有至少約80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列、或其生物活性片段或變體。
8. 如請求項5、6或7之方法，其中該多肽具有SEQ ID NO：1、2或3中所述之胺基酸序列。
9. 一種多肽，其包括包含SEQ ID NO：1之至少5個胺基酸或與SEQ ID NO：1具有至少約80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列、或其生物活性片段或變體。
10. 如請求項9之多肽，其中該多肽包括SEQ ID NO：1中所述之胺基酸序列。
11. 一種多肽，其包括包含SEQ ID NO：2之至少5個胺基酸或與SEQ ID NO：2具有至少約80%胺基酸序列一致性之胺基酸序列、或其生物活性片段或變體。
12. 如請求項11之重組多肽，其中該多肽包括SEQ ID NO：2中所述之胺基酸序列。
13. 一種多肽，其包括包含SEQ ID NO：3之至少5個胺基酸或與SEQ ID NO：3具有至少約70%胺基酸序列一致性之胺基酸序列、或其生物活性片段或變體。
14. 如請求項13之多肽，其中該多肽包括SEQ ID NO：3中所述之胺基酸序列。
15. 如請求項9至14中任一項之多肽，其中該多肽經聚乙二醇化或與組織靶標分子、白蛋白或血清白蛋白結合肽偶聯。
16. 如請求項9至14中任一項之多肽，其中該多肽與組織靶標分子、白蛋白或血清白蛋白結合肽融合。
17. 一種組合物，其包括如請求項9至16中任一項之TLT-1多肽及醫藥上可接受之載劑。
18. 如請求項17之組合物，其進一步包括一或多種額外免疫抑制劑。
19. 如請求項18之組合物，其中該免疫抑制劑係糖皮質激素、細胞抑制劑、烷基化劑、抗代謝物、胺甲喋呤、硫唑嘌呤、巰基嘌呤、放線菌素、蒽環類、絲裂黴素C(mitomycin C)、博來黴素(bleomycin)、光輝黴素(mithramycin)、抗-CD20抗體、莫羅單抗(muromonab)-CD3、巴利昔單抗(basiliximab)、達克珠單抗(daclizumab)、環孢素、他克莫司(tacrolimus)、西羅莫司(sirolimus)、干擾素、類鴉片、TNF結合蛋白、麥考酚酯(mycophenolate)、芬戈莫德(fingolimod)或多球殼菌素 (myriocin)。
20. 一種治療及/或預防與免疫高反應性相關之疾病之方法，其包括向個體投與如請求項9至16中任一項之TLT-1多肽或如請求項17至19中任一項之組合物。
21. 如請求項20之方法，其中該疾病係自體免疫性疾病、過敏反應、移植排斥或移植物抗宿主病症。