TW201713346A - 調控免疫反應之方法及抗體 - Google Patents

Abstract

本發明出人意料地發現PD-L1之表現可藉由調節劑結合至免疫細胞及/或其他細胞上之CD11b來調節，藉此治療及/或預防與免疫抑制及/或免疫衰竭(immune exhaustion)相關之疾病，諸如慢性感染、敗血症、癌症中之免疫缺陷及老化中之免疫衰老。

Description

調控免疫反應之方法及抗體

本發明係關於免疫療法之領域。特定言之，本發明係關於藉由調節細胞上之CD11b表現以調控免疫反應之方法及抗體。

普遍咸信表現免疫原性抗原之癌細胞可誘發抗腫瘤形成之有效免疫反應。另外，腫瘤微環境富含可觸發TLR傳訊以活化抗腫瘤反應之組分(Standiford TJ,Keshamouni VG(2012)Breaking the tolerance for tumor：Targeting negative regulators of TLR signaling.Oncoimmunology 1：340-345)。意謂，在疾病之初始階段，癌細胞可有機會經免疫系統識別及排斥，該免疫系統對發展中之腫瘤發揮宿主保護及腫瘤建模作用兩者。然而，癌細胞亦具有許多負調節機制以逃避免疫監視，諸如MHC分子之下調或抗原處理及呈現機械；增加抑制細胞介素之分泌；及表現抑制分子以誘發對癌細胞之免疫耐受性。因此，通常認為癌症病患具有較差之免疫力。因此，仍需要開發用於逆轉與免疫抑制相關之癌症之藥劑或療法。

整合素αM(CD11b、CR3A及ITGAM)係形成表現於許多免疫細胞(包括單核細胞、顆粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、自然殺手細胞及骨髓衍生之抑制細胞)之表面上之異二聚整合素αMβ2分子之蛋白質次單元。整合素αMβ2藉由通過其雜亂配體庫調節細胞黏附、遷移、 趨化作用及吞噬作用介導炎症。近期研究已指示藉由調控TLR4反應用於炎症之關鍵作用(Han C、Jin J、Xu S、Liu H、LiN等人，(2010)Integrin CD11b negatively regulates TLR-triggered inflammatory responses by activating Syk and promoting degradation of MyD88 and TRIF via Cbl-b.Nat Immunol 11：734-742)。血管之腔側內之各種內源性整合素αMβ2配體(諸如血纖維蛋白原)可觸發TLR4傳訊。與β2整合素偶合之ITAM之高結合性連接瞬時誘發TLR活化，但通過靶向MyD88及TRIF以進行Cbl-b介導之蛋白水解降解以迅速抑制TLR傳訊。因此，整合素αMβ2可充當選擇性抑制TLR傳訊通道之組分以阻斷TLR家族之效應之負調節劑(Wang L、Gordon RA、Huynh L、Su X、Park Min KH等人，(2010)Indirect inhibition of Toll-like receptor and type I interferon responses by ITAM-coupled receptors and integrins.Immunity 32：518-530)。

PD-L1係共抑制蛋白中之一者，其以變化之濃度表現於許多類型之免疫細胞上且組成性地表現於單核細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞、T細胞、B細胞、上皮細胞及血管內皮細胞上。一經正誘發(諸如IFN-γ及有絲分裂刺激)，則PD-L1將經進一步上調。PD-L1結合至其受體PD-1(其發現於經活化之T細胞上)，藉由於經活化之T細胞中誘發共抑制訊息(其促進T細胞凋亡及無反應性)以產生強效免疫抑制(Butte MJ、Keir ME、Phamduy TB、Sharpe AH、Freeman GJ(2007)Programmed death-1 ligand 1 interacts specifically with the B7-1 costimulatory molecule to inhibit T cell responses.Immunity 27：111-122；Francisco LM、Salinas VH、Brown KE、Vanguri VK、Freeman GJ等人，(2009)PD-L1 regulates the development,maintenance,and function of induced regulatory T cells.J Exp Med 206：3015-3029)。PD-L1/PD-1相互作用之完整性對避免過度免疫反應亦係重要的。PD-L1 與PD-1之間之相互作用之缺陷可導致免疫反應之失控傳播，從而導致諸如以下之病症：自體免疫疾病、超敏反應、移植排斥及移植物抗宿主疾病。

US 8,008,449提供經分離之特異性結合至PD-1之單株抗體(特定言之人類單株抗體)。US 8,354,509係關於阻斷人類程式化死亡受體1(hPD-1)與其配體(hPD-L1或hPD-L2)之結合之抗體。US 8,900,587揭示阻斷hPD-1與hPD-L1或hPD-L2之結合之抗體及通過PD-1路徑增加(或減少下調)免疫細胞之活性之方法。US 9,067,999及US 9,073,994提供經由利用由PD-1、PD-L1或PD-L2誘發之免疫抑制訊息之抑制所引起之免疫增強作用以用於癌症或感染治療之組合物及使用其等之療法。然而，上文專利中提及之抗體對療法具有低反應率。US 20140099254A1提供誘發針對癌症或感染性疾病之免疫反應之方法，其包括向患有癌症或感染性疾病之個體投與選自由以下組成之群之兩種或更多種藥劑之組合：(i)白細胞重定向雙特異性抗體，其包括ADAM17、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD8、CD11a、CD11b、CD14、CD16、CD16b、CD25、CD28、CD30、CD32a、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD56、CD57、CD64、CD69、CD74、CD89、CD90、CD137、CD177、CEACAM6、CEACAM8、HLA-DR α鏈、KIR及SLC44A2；(ii)干擾素；(iii)查核點抑制劑抗體，其包括CTLA4、PD1、PD-L1、LAG3、B7-H3、B7-H4.KIR及TIM3；及(iv)抗體-藥物結合物(ADC)。然而，此參考僅組合許多已知免疫相關成分，然而其對該等成分間之相互影響毫無提示。

本發明意外發現PD-L1之表現可藉由使CD11b調節劑結合至免疫細胞及/或其他細胞上之CD11b來抑制。CD11b調節劑結合至CD11b將減少LPS致敏單核細胞上之PD-L1表現。在LPS誘發之免疫抑制單核細 胞或來自患有敗血性休克之病患之單核細胞中，當細胞受LPS激發時，CD11b調節劑結合至CD11b亦減少PD-L1表現。

本發明提供用於抑制免疫細胞中PD-L1表現之方法，其包括使該免疫細胞與結合至該細胞上CD11b之CD11b調節劑接觸，藉此調節該等免疫細胞之PD-L1表現。

本發明提供用於免疫細胞中逆轉免疫抑制或免疫衰竭或誘發預存免疫力之方法，其包括使該免疫細胞與結合至該細胞上CD11b之CD11b調節劑接觸。

本發明提供用於判定對CD11b調節劑具有反應性之個體之方法，該方法包括偵測生物樣品或個體中之PD-L1是否被抑制，方式為藉由使該生物樣品或該個體中之免疫細胞與CD11b調節劑接觸並偵測該CD11b調節劑對免疫細胞上PD-L1之抑制，其中該PD-L1抑制指示該個體對CD11b調節劑具有反應性。

在一些實施例中，本文描述之CD11b調節劑係抑制CD11b表現之RNAi劑、抗CD11b抗體或調控CD11b之小分子化合物。

在一個實施例中，該免疫細胞係T細胞或單核細胞或顆粒細胞或巨噬細胞或骨髓衍生之抑制細胞或自然殺手細胞。在一個實施例中，該CD11b結合增加IFN-γ、IL-12或CD8 T細胞。在另一實施例中，CD11b調節劑結合至細胞上之CD11b治療及/或預防與免疫抑制相關之疾病。在另一實施例中，該與免疫抑制或免疫衰竭相關之疾病係急性及/或慢性感染中之免疫細胞T細胞衰竭、敗血症、癌症中之免疫缺陷或老化中之免疫衰老。

在一個實施例中，預防及/或治療癌症之方法包括投與額外之活性劑或療法。在一些實施例中，該額外之活性劑係免疫查核點療法、放射療法或化學療法。

本發明亦提供抗CD11b抗體或其抗原結合部分，其包含以下中之 至少一者：由NYWIN(SEQ ID NO：1)或GFSLTSNSIS(SEQ ID NO：2)之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO：1或2具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性之胺基酸序列之變體組成之重鏈互補決定區1(H-CDR1)；由NIYPSDTYINHNQKFKD(SEQ ID NO：3)或AIWSGGGTDYNSDLKS(SEQ ID NO：4)之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO：3或4具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性之胺基酸序列之變體組成之重鏈CDR2(H-CDR2)；及由SAYANYFDY(SEQ ID NO：5)或RGGYPYYFDY(SEQ ID NO：6)之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO：5或6具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性之胺基酸序列之變體組成之重鏈CDR3(H-CDR3)；且包含以下中之至少一者：由RASQNIGTSIH(SEQ ID NO：7)或KSSQSLLYSENQENYLA(SEQ ID NO：8)之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO：7或8具有85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性之胺基酸序列之變體組成之輕鏈CDR1(L-CDR1)；由YASESIS(SEQ ID NO：9)或WASTRQS(SEQ ID NO：10)之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO：9或10中之任一者具有85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性之胺基酸序列之變體組成之輕鏈CDR2(L-CDR2)；及由QQSDSWPTLT(SEQ ID NO：11)或QQYYDTPLT(SEQ ID NO：12)之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO：11或12中之任一者具有85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性之胺基酸序列之變體組成之輕鏈CDR3(L-CDR3)；使得該經分離之抗體或其抗原結合部分結合至CD11b。

在一些實施例中，本文描述之CDR包含一或更多種嵌入、取代及/或刪除。

在另一實施例中，本發明提供抗CD11b抗體或其抗原結合部分，其包含(i)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO：1之H-CDR1、包含SEQ ID NO：3之H-CDR2及包含SEQ ID NO：5之H-CDR3之重鏈可變區，及(ii)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO：7之L-CDR1、包含SEQ ID NO：9之L-CDR2及包含SEQ ID NO：11之L-CDR3；或(iii)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO：2之H-CDR1、包含SEQ ID NO：4之H-CDR2及包含SEQ ID NO：6之H-CDR3之重鏈可變區，及(iv)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO：8之L-CDR1、包含SEQ ID NO：10之L-CDR2及包含SEQ ID NO：12之L-CDR3。在另一實施例中，H-CDR1具有由SEQ ID NO：1或2組成之胺基酸序列；H-CDR2具有由SEQ ID NO：3或4組成之胺基酸序列；H-CDR3具有由SEQ ID NO：5或6組成之胺基酸序列；L-CDR1具有由SEQ ID NO：7或8組成之胺基酸序列；L-CDR2具有由SEQ ID NO：9或10組成之胺基酸序列及L-CDR3具有由SEQ ID NO：11或12組成之胺基酸序列。

另外，本發明提供人類化抗CD11b抗體或其抗原結合部分，其包含：(a)包含由SEQ ID NO：13組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及(ii)包含由SEQ ID NO：23組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；(c)包含由SEQ ID NO：14組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及(ii)包含由SEQ ID NO：24組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；(e)包含由SEQ ID NO：15組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及(f)包含由SEQ ID NO：25組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；(g)包含由SEQ ID NO：16組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及(h)包含由SEQ ID NO：26組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；(i)包含由SEQ ID NO：17組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及(j)包含由SEQ ID NO：27組成之胺基酸序列之輕鏈可變區； (k)包含由SEQ ID NO：18組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及(l)包含由SEQ ID NO：28組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；(m)包含由SEQ ID NO：19組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及(n)包含由SEQ ID NO：29組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；(o)包含由SEQ ID NO：20組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及(p)包含由SEQ ID NO：30組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；(q)包含由SEQ ID NO：21組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及(r)包含由SEQ ID NO：31組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；或(s)包含由SEQ ID NO：22組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及(t)包含由SEQ ID NO：32組成之胺基酸序列之輕鏈可變區。

本發明亦提供包含抗CD11b抗體或其抗原結合部分之組合物。本發明亦提供包括向個體投與本發明之人類化抗CD11b抗體之方法。此等方法包括用於抑制免疫細胞中PD-L1表現；免疫細胞中逆轉免疫抑制或免疫衰竭或誘發預存免疫力；測定個體中之PD-L1；及治療或預防急性及/或慢性感染、敗血症、癌症中之免疫缺陷或老化中之免疫衰老之方法。本發明之抗CD11b抗體可用於上文提及之方法中。

圖1顯示CD11b與抗CD11b抗體之結合改變PD-L1之表面表現。人類單核細胞經LPS(100ng/ml)在同型對照IgG或抗CD11b抗體(ICRF44)之存在下刺激18hr。獲得該等細胞並使用流動式細胞測量術分析HLA-DR、PD-L1、CD80及CD86分子。表面分子表現呈現為MFI。值呈現為來自3組獨立實驗之平均值±SEM。

圖2A及B分別顯示結合CD11b對細胞黏附血纖維蛋白原及減少PD-L1表現之效應。圖2A顯示ML-C19-A對K562/CD11b細胞黏附血纖維蛋白原之效應。25000個K562/CD11b細胞在10μM ML-C19-A或DMSO之存在下在37℃下黏附於塗覆血纖維蛋白原(20μg/ml)之孔之 底部，保持20min。結果藉由基於螢光素酶之CellTiter-Glo(Promega CO.)定量。各條柱表示來自代表性實驗之一式三份測定之平均值±SEM。圖2B顯示以CD11b拮抗劑結合CD11b會減少單核細胞上之PD-L1表現。人類單核細胞經LPS(100ng/ml)在DMSO對照或10μM之ML-C19-A之存在下刺激18hr。獲得該等細胞並使用流動式細胞測量術分析PD-L1分子。表面分子表現呈現為MFI。值呈現為來自10組獨立實驗之平均值±SEM。

圖3顯示抗CD11b抗體單一療法對B16F10腫瘤之生長之效應。對C57BL/6小鼠在第0天皮下注射2 x 10⁵個B16F10細胞。在第7天，對小鼠(n=5隻/組)腹腔內(ip)注射對照IgG(5mg/kg)或大鼠抗小鼠CD11b抗體。每三至四天重複注射。在第18天，處死小鼠。量測腫瘤體積且結果呈現為平均值±SEM。

圖4顯示抗CD11b抗體治療後之腫瘤浸潤性白細胞中之MDSC及CD8 T細胞群體。對C57BL/6小鼠在第0天皮下注射2 x 10⁵個B16F10細胞。在第7天，對小鼠(n=5隻/組)腹腔內注射對照IgG(5mg/kg)或大鼠抗小鼠CD11b抗體。每三至四天重複注射。在第18天，處死小鼠。用膠原蛋白酶消化腫瘤及藉由流動式細胞測量術分析腫瘤浸潤性白細胞。

圖5顯示抗CD11b治療後之血液中之WBC及IAIE+/CD8 T細胞上之PD-L1表現。在第0天，經由尾靜脈向各小鼠內注射2x10⁵個B16F10細胞。在第1天，對小鼠(n=3隻/組)腹腔內注射對照IgG(5mg/kg)或抗小鼠CD11b抗體(5mg/kg)。每三至四天重複注射。在第15天，處死小鼠。獲得WBC細胞並使用流動式細胞測量術分析PD-L1分子及IAIE+/CD8 T細胞。

圖6顯示帶腫瘤之小鼠中之IFN-γ、IL-12及TNF-α之產生藉由使用抗CD11b抗體之治療逆轉。在第0天經由尾靜脈向各小鼠內注射2x10⁵ 個B16F10細胞。在第1天，對小鼠(n=3隻/組)腹腔內注射對照IgG(5mg/kg)或大鼠抗小鼠CD11b抗體(5mg/kg)。每三至四天重複注射。在第9天，處死小鼠。血漿細胞介素藉由BD CBA小鼠炎症套組定量。

圖7顯示抗CD11b抗體單一療法對LLC1腫瘤之生長之效應。對C57BL/6小鼠在第0天皮下注射1 x 10⁶個LLC1細胞。在第7天，對小鼠(n=5隻/組)腹腔內注射對照IgG(5mg/kg)或大鼠抗小鼠CD11b抗體。每三至四天重複注射。量測腫瘤體積且結果呈現為平均值±SEM。

圖8顯示抗CD11b抗體單一療法在LLC1腫瘤模型中對存活率之效應。對C57BL/6小鼠在第0天皮下注射1 x 10⁶個LLC1細胞。在第7天，對小鼠(n=5隻/組)腹腔內注射對照IgG(5mg/kg)或大鼠抗小鼠CD11b抗體。每三至四天重複注射。針對抗CD11b抗體對各組中經治療之小鼠之長期存活率之效應來分析小鼠。

圖9顯示抗CD11b抗體及抗PD1組合療法對LLC1肺轉移模型之效應。在第0天經由尾靜脈向各小鼠內注射1x10⁶個LLC1細胞。在第1天，對小鼠(n=3隻/組)腹腔內注射對照IgG(10mg/kg)、抗小鼠CD11b抗體(10mg/kg)、抗PD1抗體(10mg/kg)或抗CD11b(10mg/kg)+抗PD1(10mg/kg)。每三至四天重複注射。在第15天，處死小鼠且接種之腫瘤數量計數為在顯微鏡下存在於肺中之結節之總數量。

圖10顯示在肺轉移模型中抗CD11b抗體及抗PD1組合療法對存活率之影響。在第0天經由尾靜脈向各小鼠內注射1x10⁶個LLC1細胞。在第1天，對小鼠(n=4-5隻/組)腹腔內注射對照IgG(10mg/kg)、抗小鼠CD11b抗體(10mg/kg)、抗PD1抗體(10mg/kg)或抗CD11b(10mg/kg)+抗PD1(10mg/kg)。每三至四天重複注射。針對組合療法對各組中經治療之小鼠之長期存活率之效應來分析小鼠。

圖11顯示抗CD11b抗體及紫杉醇組合療法對B16F10腫瘤之生長之效應。對C57BL/6小鼠在第0天皮下注射2 x10⁵個B16F10細胞。在第7 天，對小鼠(n=5隻/組)腹腔內注射對照IgG(5mg/kg)、抗小鼠CD11b抗體(5mg/kg)、紫杉醇(10mg/kg)+對照IgG(5mg/kg)或紫杉醇(10mg/kg)+抗CD11b抗體(5mg/kg)。每三至四天重複注射。量測腫瘤體積且結果呈現為平均值±SEM。

圖12顯示在B16F10模型中抗CD11b抗體及紫杉醇組合療法對存活率之效應。對C57BL/6小鼠在第0天皮下注射2 x10⁵個B16F10細胞。在第7天，對小鼠(n=5隻/組)腹腔內注射對照IgG(5mg/kg)、抗小鼠CD11b抗體(5mg/kg)、紫杉醇(10mg/kg)+對照IgG(5mg/kg)或紫杉醇(10mg/kg)+抗CD11b(5mg/kg)。每三至四天重複注射。針對組合療法對各組中經治療之小鼠之長期存活率之效應來分析小鼠。

圖13顯示以抗CD11b抗體結合CD11b會減少經1μg/ml LPS激發之LPS誘發之免疫抑制單核細胞中之PD-L1表現。(A)人類單核細胞係分離自健康志願者且經100ng/ml LPS預處理2天以誘發免疫抑制。(B)LPS誘發之免疫抑制單核細胞在10μg/ml IgG1或抗CD11b抗體(ICRF44)之存在下經1μg/ml LPS激發18hr。清洗經處理之細胞並藉由流動式細胞測量術分析。表面PD-L1表現呈現為MFI。

圖14顯示當經1μg/ml LPS激發時，以抗CD11b抗體結合CD11b減少來自患有敗血性休克之病患之人類單核細胞中之PD-L1表現。人類單核細胞係分離自患有敗血性休克之病患且在10μg/ml IgG1或抗CD11b抗體之存在下經1μg/ml LPS激發18hr。清洗經處理之細胞並藉由流動式細胞測量術分析。表面PD-L1表現呈現為MFI。

圖15顯示人類化CD11b抗體之輕鏈可變區之胺基酸序列。CDR以加下劃線之字母顯示。

圖16顯示人類化CD11b抗體之重鏈可變區之胺基酸序列。CDR以加下劃線之字母顯示。

圖17顯示人類化抗CD11b抗體之結合活性。將K562細胞或經人 類CD11b轉染之細胞(K562/CD11b)用10μg/ml人類化抗CD11b抗體培養30min。經結合之Ab藉由結合FITC之小鼠抗人類IgG偵測。該等細胞藉由流動式細胞測量術分析。虛線表示結合K562細胞之抗體。實線表示結合至K562/CD11b細胞之抗體。

圖18顯示以抗CD11b抗體結合CD11b減少LPS致敏人類單核細胞中之PD-L1表現。致敏單核細胞在同型對照IgG、抗CD11b抗體(ICRF44)或人類化抗CD11b抗體之存在下培養18hr。收穫該等細胞並使用流動式細胞測量術分析單核細胞上之PD-L1表現。

在描述本發明之組合物、方法及分離方法論前，應瞭解此發明不受其等之限制，因為此等組合物、方法及條件可變化。亦應瞭解本文使用之術語係僅出於描述特定之實施例之目的，且無意具有限制性。

本發明意外發現PD-L1之表現可藉由使調節劑結合至免疫細胞及/或其他細胞上之CD11b來抑制，藉此治療及/或預防與免疫抑制相關之疾病，諸如慢性感染、敗血症、癌症中之免疫缺陷及老化中之免疫衰老。

定義

除非另有定義，否則本文使用之所有技術及科學術語具有本發明所屬領域中的一般技術者通常所瞭解之相同含義。與彼等文本描述者類似或等效之任何方法及材料可用於本發明之實務或測試中，因為將瞭解修飾及變化包含於本發明之精神及範圍內。

除非另有說明，否則「一」或「一個」意謂一或多個。

如本文使用，如下縮寫胺基酸殘基：丙胺酸(Ala；A)、天冬醯胺酸(Asn；N)、天冬胺酸(Asp；D)、精胺酸(Arg；R)、半胱胺酸(Cys；C)、麩胺酸(Glu；E)、麩醯胺酸(Gln；Q)、甘胺酸(Gly；G)、組胺酸 (His；H)、異白胺酸(Ile；I)、白胺酸(Leu；L)、離胺酸(Lys；K)、甲硫胺酸(Met；M)、苯丙胺酸(Phe；F)、脯胺酸(Pro；P)、絲胺酸(Ser；S)、蘇胺酸(Thr；T)、色胺酸(Trp；W)、酪胺酸(Tyr；Y)及纈胺酸(Val；V)。

如本文使用，術語「CD11b」係指整合素αM(ITGAM)，其係異二聚整合素αMβ2之次單元。整合素αMβ2之第二次單元係常見整合素β2次單元(稱為CD18)。整合素αMβ2亦稱為巨噬細胞-1抗原(Mac-1)或互補受體3(CR3)，其係表現於白細胞之表面上，該等白細胞包括單核細胞、顆粒細胞、巨噬細胞及自然殺手細胞。

如本文使用，術語「PD-L1」係指程式化死亡配體1(PD-L1)，其係分化簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1)。PD-L1係40kDa 1型跨膜蛋白，其在特定事件(諸如懷孕、自體免疫疾病、癌症、敗血症及其他感染性疾病(諸如結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis)、巨細胞病毒(cytomegalovirus)及肝炎))期間對抑制免疫系統起主要作用。

如本文使用，術語「單核細胞」，亦稱為單核白細胞，其屬於涉及一線防禦機制之白血球之一種類型且公認可分化為樹突狀細胞或巨噬細胞前驅物。單核細胞通常在血液系統中移動。回應於外部刺激訊息時，單核細胞分泌許多免疫調節細胞介素，移動至組織中之感染部位並分化為巨噬細胞。

如本文使用，術語「調控」包括相較於對照組通常處於統計學顯著量或生理學顯著量之「增加」或「刺激」及「降低」或「減少」。

如本文使用，術語「個體」意謂針對治療或療法所選擇之人類或非人類動物。

如本文使用，「一致性」係指兩個或更多個多肽或蛋白質序列間之關係(如藉由比較該等序列判定)。在此項技術中，「一致性」亦係 指多肽或蛋白質間之序列相關程度(如藉由此等序列串之間之匹配判定)。「一致性」藉由已知的生物資訊方法可容易地計算。兩個聚核苷酸或兩個多肽序列之「一致性百分率」係藉由使用GAP電腦程式(GCG Wisconsin Package之一部分，10.3版(Accelrys,San Diego,Calif.))使用其預設參數比較該等序列而測定。

如本文使用，術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」各係指包含藉由肽鍵彼此相連之兩個或更多個胺基酸殘基之分子。此等術語包含(例如)天然及人造蛋白質、蛋白質序列之蛋白質片段及多肽類似物(諸如突變體、變體及融合蛋白)及轉譯後(或以其他方式共價或非共價)修飾之蛋白質。肽、多肽或蛋白質可為單體或聚合的。

如本文使用，術語「親和力」係指在分子(例如，抗體)之單一結合位點與其結合配偶體(例如，抗原)之間之非共價相互作用之總強度。除非另有指示，否則如本文使用，「結合親和力」係指反映結合對(例如，抗體與抗原)之成員間之1：1相互作用之固有結合親和力。分子X對其配偶體Y之親和力可通常藉由解離常數(Kd)表示。親和力可藉由此項技術中已知的常用方法量測，該等方法包括彼等本文描述者。下文描述用於量測結合親和力之特定闡述性及例示性實施例。

如本文使用，術語「抗體」係以最廣義使用且特定涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、單價抗體、多價抗體及抗體片段，只要其等顯示所需之生物活性即可(例如，Fab及/或單臂抗體)。

如本文使用，術語「抗體片段」係指除完整抗體外之分子，其包含完整抗體之一部分，其結合該完整抗體所結合之抗原。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如，scFv)；及自抗體片段形成之多特異性抗體。

如本文使用，術語抗體之「抗原結合片段」係指抗體之保留特異性結合至抗原之能力之一或多個部分。已顯示抗體之抗原結合功能可藉由全長抗體之片段進行。包含於術語抗體之「抗原結合片段」內之結合片段之實例包括(i)Fab片段，由V_L、V_H、C_L及C_H1域組成之單價片段；(ii)F(ab')₂片段，包含藉由二硫鍵在鉸鏈區連接之兩個Fab片段之二價片段；(iii)由V_H及C_H1域組成之Fd片段；(iv)由抗體之單臂之V_L及V_H域組成之Fv片段；(v)由V_H域組成之dAb片段；及(vi)經分離之互補決定區(CDR)。此等抗體片段係使用習知程序獲得，諸如蛋白水解片段化程序，如描述於J.Goding，Antibodies：Principles and Practice，第98至118頁(N.Y.Academic Press 1983)中。該等片段以與完整抗體相同之方式針對效用進行篩選。

如本文使用，術語「互補決定區」(CDR)係指抗體內之其中此等蛋白質互補抗原之形狀之區域。本文使用首字母縮略詞CDR意謂「互補決定區」。

抗體之「可變區」係指抗體輕鏈之可變區或抗體重鏈之可變區(單獨或組合)。重鏈及輕鏈之可變區各由四個藉由三個CDR(亦稱為高度可變區)連接之框架區(FR)組成。各鏈中之CDR係與有助於形成抗體之抗原結合部位之來自其他鏈之CDR藉由FR靠近地固定在一起。可用以識別CDR之邊界之例示性公約包括(例如)Kabat定義及Chothia定義。該Kabat定義係基於序列變異性(參見Kabat等人，1992,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,NIH,Washington D.C.)，該Chothia定義係基於結構環區之位置(Chothia等人，1989,Nature 342：877-883)。CDR識別之其他方法包括「IMGT定義」(Lefranc,M.-P.等人，1999,Nucleic Acids Res.27：209-212)及「AbM定義」，其係Kabat與Chothia間之折中且係使用Oxford Molecular's AbM抗體建模軟體衍生，或CDR之「接觸定 義」基於所觀察到之抗原接觸，闡述於MacCallum等人，1996,J.Mol.Biol.262：732-745中。如本文使用，CDR可係指藉由Kabat編號系統定義之CDR。

如本文使用，術語「人類化抗體」或「人類化抗體片段」係一種特定類型的嵌合抗體，其包括免疫球蛋白胺基酸序列變體或其片段，其可結合至預定抗原，且其包含一或多個大體上具有人類免疫球蛋白之胺基酸序列之框架(FR)及一或多個大體上具有非人類免疫球蛋白之胺基酸序列之互補決定區(CDR)。通常稱為「輸入」序列之此非人類胺基酸序列通常取自「輸入」抗體域，特別是可變域。一般而言，人類化抗體包括非人類抗體之至少該CDRs或高度可變區(HVLs)嵌入人類重鏈或輕鏈可變域之FRs間。

如本文使用，「人類抗體」係具有胺基酸序列對應於人類或人類細胞產生或利用人類抗體庫或其他人類抗體編碼序列自非人類來源衍生之抗體之胺基酸序列之抗體。人類抗體之此定義特定排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。

如本文使用，術語「嵌合抗體」係指含有來自一種抗體之一或多個區域及來自一或多種其他抗體之一或多個區域之抗體。

如本文使用，術語「重鏈」包括全長重鏈及其具有足夠可變區序列以賦予對抗原決定基之特異性之片段。全長重鏈包括可變區域(V_H)及三個恆定區域(CH₁、CH₂及CH₃)。該VH域係位於該多肽之胺基端，及該CH₃域係位於羧基端。

如本文使用，術語「輕鏈」包括全長輕鏈及其具有足夠可變區序列以賦予對抗原決定基之特異性之片段。全長輕鏈包括可變區域(V_L)及恆定區域(C_L)。類似於重鏈，輕鏈之可變區域係位於多肽之胺基端。

如本文使用，術語「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥調配物中 之除活性成分外之對個體無毒性的成分。醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。

如本文使用，術語「個體」係指脊椎動物，較佳係哺乳動物，更佳係人類。哺乳動物包括(但不限於)人類、農場動物、競技類動物及寵物。

如本文使用，術語「有效量」係指足以產生有利或所需之臨床結果之量。有效量可以一或更多次投與進行投與。出於此發明之目的，有效量係足以診斷、減輕、緩解、穩定、逆轉、減緩或延遲疾病狀態之發展之量。

如本文使用，術語「治療(treatment、treating、treat及類似用語)」通常係指獲得所需之藥理及/或生理效應。該效應就完全或部分預防疾病或其症狀而言可為預防性的及/或就部分或完全穩定或治癒疾病及/或歸因於該疾病之不利影響而言係治療性的。如本文使用之「治療」涵蓋哺乳動物(特定言之，人類)之疾病之任何治療，且包括：(a)預防可能易患該疾病或症狀但未診斷為已患有其之個體中出現該疾病或病症；(b)抑制該疾病症狀，即，阻止其發展；或(c)緩解該疾病症狀，即，引起該疾病或症狀之消退。

如本文使用之術語「預防」係指阻止病患或個體中出現疾病狀態或病症之預防性(preventative)或預防性(prophylactic)措施。預防亦可包括減少病患或個體中出現疾病狀態或病症之可能性及阻礙或阻止該疾病狀態或病症之發作。

在提供值範圍之情況下，應瞭解介於該範圍之上限值及下限值之間之各介入值(至下限值之單位之十分之一，除非內文明確規定)及該規定範圍中之任何其他規定值或介入值係包含於本發明內。此等較小範圍之上限值及下限值可獨立地包括於該等較小範圍中，且亦係包含於本發明內，受制於該規定範圍中之任何經特定排除之臨限值。在 規定範圍包括該等臨限值中之一者或兩者之情況下，排除彼等經包括之臨限值中之一者或者兩者外之範圍亦包括於本發明中。

影響PD-L1表現之CD-11b調節劑之結合

本發明意外發現通過使用與表現於免疫細胞之表面上之CD11b分子反應之CD11b調節劑之治療逆轉與敗血症、慢性感染及癌症中涉及之免疫抑制狀態相關之症狀。

在一個態樣中，本發明提供用於抑制免疫細胞中PD-L1表現之方法，其包括使該免疫細胞與結合該細胞上CD11b之CD11b調節劑接觸，藉此抑制該免疫細胞之PD-L1表現。或者，本發明提供CD11b調節劑在製造用於抑制免疫細胞中PD-L1表現之製劑中之用途。本發明亦提供用於抑制免疫細胞中PD-L1表現之CD11b調節劑。

在另一態樣中，本發明提供用於免疫細胞中逆轉免疫抑制或免疫衰竭或誘發預存免疫力之方法，其包括使該等免疫細胞與結合該等細胞上CD11b之CD11b調節劑接觸。或者，本發明提供CD11b調節劑在製造用於免疫細胞中逆轉免疫抑制或免疫衰竭或誘發預存免疫力之製劑中之用途。本發明亦提供用於免疫細胞中逆轉免疫抑制或免疫衰竭或誘發預存免疫力之CD11b調節劑。

在另一態樣中，本發明提供用於判定對CD11b調節劑具有反應性之個體之方法，該方法包括偵測生物樣品或個體中之PD-L1是否被抑制，方式為藉由使該生物樣品或該個體中之免疫細胞與CD11b調節劑接觸並偵測該CD11b調節劑對免疫細胞上PD-L1之抑制，其中該PD-L1抑制指示該個體對該CD11b調節劑具有反應性。

在一個實施例中，本文描述之CD11b調節劑係抑制CD11b表現之RNAi劑、抗CD11b抗體或調控CD11b之小分子化合物。

在一些實施例中，抑制CD11b表現之RNAi劑係抑制CD11b表現之微小RNA(miRNA)或短小干擾RNA(siRNA)。在一些實施例中，該抗 CD11b抗體係單株、嵌合、人類化、人類或雙特異性抗CD11b抗體。

在一些實施例中，調控CD11b之小分子化合物之實例包括(但不限於)描述於US 8,268,816、US 20120035154、WO002007039616、WO002006111371、WO002007054128、WO00199901258、J Immunol 2010,184，第3917至26頁及Cancer Discov,2012,2，第1091至99頁中之化合物。較佳地，該化合物係選自由下列各物組成之群：

在一個實施例中，該免疫細胞係單核細胞、顆粒細胞、巨噬細胞、骨髓衍生之抑制細胞或自然殺手細胞或T細胞。

在一個實施例中，CD11b結合增加IFN-γ、IL-12或CD8 T細胞。在另一實施例中，CD11b調節劑結合至細胞上之CD11b治療及/或預防與免疫抑制相關之疾病。

在另一實施例中，與免疫抑制或免疫衰竭相關之疾病係急性及/或慢性感染中之T細胞衰竭、敗血症、癌症中之免疫缺陷或老化中之免疫衰老。因此，本發明提供用於治療或預防個體之急性及/或慢性感染、敗血症、癌症中之免疫缺陷或老化中之免疫衰老之方法，其包括向個體投與有效量之CD11b調節劑。

在一個實施例中，本文描述之癌症係對免疫療法具有反應性之癌症。對免疫療法具有反應性之癌症之實例包括(但不限於)黑色素瘤、肺癌、肺鱗狀細胞癌、頭頸癌、乳癌、卵巢癌、子宮癌、前列腺癌、胃癌、子宮頸癌、食道癌、膀胱癌、腎癌、腦癌、肝癌、結腸癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌、睾丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰門癌、霍奇金氏病(Hodgkin’s Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖 癌、慢性或急性白血病(包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴球性白血病)、兒童之實體腫瘤、淋巴球性淋巴瘤、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)之贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、髓軸腫瘤、腦幹神經膠瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、表皮樣癌、鱗狀細胞癌及T細胞淋巴瘤。

在一個實施例中，該癌症係轉移癌、難治性癌症(refractory cancer)、復發性癌症(relapsed cancer)或晚期癌症(advanced cancer)。

在一個實施例中，預防及/或治療癌症之方法包括投與額外之活性劑或療法。在一些實施例中，該額外之活性劑係免疫查核點療法、放射療法或化學療法。

在一個實施例中，該CD11b調節劑及該免疫查核點療法、放射療法或化學療法係同時、循序或分別投與。在另一實施例中，該免疫查核點療法包括投與免疫查核點蛋白。較佳地，該免疫查核點蛋白係抗PD-1配體或抗CTLA-4抗體或抗PD-L1抗體，或其抗原結合片段或其任何組合。抗PD-1配體之實例包括(但不限於)抗PD-1抗體(諸如納武單抗(nivolumab)及派姆單抗(pembrolizumab))及抗CTLA-4抗體(諸如易普利姆瑪單抗(ipilimumab))。

在另一實施例中，該化學療法包括投與化學治療劑。該化學治療劑之實例包括(但不限於)烷化劑、抗代謝物、抗微管劑、拓樸異構酶抑制劑或細胞毒性抗生素。較佳地，該化學治療劑係順鉑、5-Fu、紫杉醇、多西他賽(docetaxel)、長春瑞濱(vinorelbine)、長春地辛(vindesine)、長春氟寧(vinflunine)、吉西他濱(gemcitabine)、胺甲喋呤(methotrexate)、吉非替尼(gefitinib)、拉帕替尼(lapatinib)或埃羅替尼(erlotinib)。

本文描述之CD11b調節劑及其他藥劑可調配成調配物或組合物。 本發明之調配物或醫藥組合物可以許多方法投與，其取決於需要局部治療抑或全身治療且取決於待治療之區域。投與可為經口或非經腸。

在某些實施例中，如本文描述之化合物及組合物係非經腸投與。非經腸投與包括靜脈內、動脈內、皮下、腹腔內或肌內注射或輸注。

在某些實施例中，用於非經腸投與之調配物或組合物可包括無菌水溶液，其等亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他合適之添加劑諸如(但不限於)滲透增強劑、載劑化合物及其他醫藥上可接受之載劑或賦形劑。

在某些實施例中，用於經口投與之調配物或組合物可包括(但不限於)醫藥載劑、賦形劑、粉劑或顆粒、微粒、奈米顆粒、溶於水或非水性介質中之懸浮液或溶液、膠囊、凝膠膠囊、藥囊、錠劑或迷你型錠劑。可能需要增稠劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑。

給藥係取決於待治療之疾病狀態之嚴重性及反應性，且療程持續數天至數月，或直至實現治癒或達成疾病狀態之減少。給藥亦取決於藥物效力及代謝。

免疫細胞中之PD-L1表現之水平可充當用於逆轉免疫抑制及免疫衰竭及誘發預存免疫力之新穎治療目標。

本發明之抗CD11b抗體

本文提供新穎抗CD11b抗體及其等於治療及/或預防與免疫抑制及免疫衰竭相關之疾病(諸如癌症免疫療法、慢性感染中之T細胞衰竭、敗血症、癌症中之免疫缺陷及老化中之免疫衰老)中之使用方法。

在一個態樣中，本發明提供抗CD11b抗體或其抗原結合部分，其包含以下中之至少一者：由NYWIN(SEQ ID NO：1)或GFSLTSNSIS (SEQ ID NO：2)之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO：1或2具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性之胺基酸序列之變體組成之重鏈互補決定區1(H-CDR1)；由NIYPSDTYINHNQKFKD(SEQ ID NO：3)或AIWSGGGTDYNSDLKS(SEQ ID NO：4)之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO：3或4具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性之胺基酸序列之變體組成之重鏈CDR2(H-CDR2)；及由SAYANYFDY(SEQ ID NO：5)或RGGYPYYFDY(SEQ ID NO：6)之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO：5或6具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性之胺基酸序列之變體組成之重鏈CDR3(H-CDR3)；且包含以下中之至少一者：由RASQNIGTSIH(SEQ ID NO：7)或KSSQSLLYSENQENYLA(SEQ ID NO：8)之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO：7或8具有85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性之胺基酸序列之變體組成之輕鏈CDR1(L-CDR1)；由YASESIS(SEQ ID NO：9)或WASTRQS(SEQ ID NO：10)之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO：9或10中之任一者具有85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性之胺基酸序列之變體組成之輕鏈CDR2(L-CDR2)；及由QQSDSWPTLT(SEQ ID NO：11)或QQYYDTPLT(SEQ ID NO：12)之該等胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO：11或12中之任一者具有85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性之胺基酸序列之變體組成之輕鏈CDR3(L-CDR3)；使得該經分離之抗體或其抗原結合部分結合至CD11b。

在一些實施例中，本文描述之CDR包含一或更多種嵌入、取代及/或刪除。

在另一實施例中，本發明提供抗CD11b抗體或其抗原結合部分， 其包含(i)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO：1之H-CDR1、包含SEQ ID NO：3之H-CDR2及包含SEQ ID NO：5之H-CDR3之重鏈可變區，及(ii)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO：7之L-CDR1、包含SEQ ID NO：9之L-CDR2及包含SEQ ID NO：11之L-CDR3；或(iii)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO：2之H-CDR1、包含SEQ ID NO：4之H-CDR2及包含SEQ ID NO：6之H-CDR3之重鏈可變區，及(iv)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO：8之L-CDR1、包含SEQ ID NO：10之L-CDR2及包含SEQ ID NO：12之L-CDR3。在另一實施例中，H-CDR1具有由SEQ ID NO：1或2組成之胺基酸序列；H-CDR2具有由SEQ ID NO：3或4組成之胺基酸序列；H-CDR3具有由SEQ ID NO：5或6組成之胺基酸序列；L-CDR1具有由SEQ ID NO：7或8組成之胺基酸序列；L-CDR2具有由SEQ ID NO：9或10組成之胺基酸序列及L-CDR3具有由SEQ ID NO：11或12組成之胺基酸序列。

在一個態樣中，本發明提供重鏈可變區或其抗原結合部分，其包含具有由SEQ ID NO：1或2組成之胺基酸序列之H-CDR1、具有由SEQ ID NO：3或4組成之胺基酸序列之H-CDR2及具有由SEQ ID NO：5或6組成之胺基酸序列之H-CDR3之重鏈可變區。

在一個態樣中，本發明提供輕鏈可變區或其抗原結合部分，其包含具有由SEQ ID NO：7或8組成之胺基酸序列之L-CDR1，具有由SEQ ID NO：9或10組成之胺基酸序列之L-CDR2，及具有由SEQ ID NO：11或12組成之胺基酸序列之L-CDR3。

在一個實施例中，本發明提供人類化抗CD11b抗體或其抗原結合部分，其包含(i)包含與SEQ ID NO：13至22之胺基酸序列中之任一者具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性之胺基酸序列之重鏈可變區，及(ii)包含與SEQ ID NO：23至32之胺基酸序列中之任一者具有至少90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性之胺基酸序列之輕鏈可變區。

在另一實施例中，本發明提供人類化抗CD11b抗體或其抗原結合部分，其包括包含由SEQ ID NO：13至22組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO：23至32組成之胺基酸序列之輕鏈可變區。

較佳地，本發明提供人類化抗CD11b抗體或其抗原結合部分，其包含：(a)包含由SEQ ID NO：13組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO：23組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；(b)包含由SEQ ID NO：14組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO：24組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；(c)包含由SEQ ID NO：15組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO：25組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；(d)包含由SEQ ID NO：16組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO：26組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；(e)包含由SEQ ID NO：17組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO：27組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；(f)包含由SEQ ID NO：18組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO：28組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；(g)包含由SEQ ID NO：19組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO：29組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；(h)包含由SEQ ID NO：20組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO：30組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；(i)包含由SEQ ID NO：21組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO：31組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；或 (j)包含由SEQ ID NO：22組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO：32組成之胺基酸序列之輕鏈可變區。

SEQ ID NO：13至32之胺基酸序列如下所列：本發明之人類化抗CD11b抗體之重鏈可變區：(SEQ ID NO：13至22)

VH1 (SEQ ID NO：13)

VH2 (SEQ ID NO：14)

VH3 (SEQ ID NO：15)

VH4 (SEQ ID NO：16)

VH5 (SEQ ID NO：17)

HC1 (SEQ ID NO：18)

HC2 (SEQ ID NO：19)

HC3 (SEQ ID NO：20)

HC4 (SEQ ID NO：21)

HC5 (SEQ ID NO：22)

本發明之人類化抗CD11b抗體之輕鏈可變區：(SEQ ID NO：23至32)

VL1 (SEQ ID NO：23)

VL2 (SEQ ID NO：24)

VL3 (SEQ ID NO：25)

VL4 (SEQ ID NO：26)

VL5 (SEQ ID NO：27)

LC1 (SEQ ID NO：28)

LC2 (SEQ ID NO：29)

LC3 (SEQ ID NO：30)

LC4 (SEQ ID NO：31)

LC5 (SEQ ID NO：32)

此項技術中熟知用於製備實際上針對任何靶抗原之單株抗體之技術。參見，例如，Kohler及Milstein，Nature 256：495(1975)，及Coligan等人(編)，Current Protocols In Immunology，第1卷，第2.5.1至2.6.7頁(John Wiley & Sons 1991)。單株抗體可藉由以下步驟來獲得：向小鼠或雞注射包含抗原之組合物，移除脾以獲得B淋巴細胞，融合B淋巴細胞與骨髓瘤細胞以產生融合瘤，選殖該等融合瘤，篩選針對該抗原產生抗體之陽性純系，培養該等針對該抗原產生抗體之純系，及自該等融合瘤培養物中分離該等抗體。

各種技術(諸如嵌合或人類化抗體之產生)可涉及抗體選殖及構築之程序。用於受關注之抗體之抗原結合可變輕鏈及可變重鏈序列可藉由各種分子選殖程序獲得。嵌合抗體係其中人類抗體之可變區已經被(例如)小鼠抗體之可變區(包括小鼠抗體之互補決定區(CDR))置換之重組蛋白。嵌合抗體當向個體投與時顯示減小之免疫原性及增加之穩定性。此項技術中熟知用於構築嵌合抗體之方法。嵌合多株抗體可藉由將來自小鼠免疫球蛋白之重及輕可變鏈之小鼠CDR轉移至人類抗體之相應可變域內來人類化。該嵌合多株抗體中之小鼠框架區(FR)亦經人類FR序列置換。

例如，編碼特異性結合CD11b之人類化抗體之VL及/或VH之核酸可藉由活體外方法(諸如聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)、基於轉錄之擴增系統(TAS)等)加以選殖或擴增。例如，編碼該蛋白質之聚核苷酸可藉由cDNA之聚合酶鏈反應使用基於該分子之DNA序列之引物來分離。熟習此項技術者熟知各種選殖及活體外擴增方法論。聚核苷酸亦可藉由用選自所需之聚核苷酸之序列之探針在嚴苛之雜合條件下篩選基因體或cDNA庫而分離。

該等聚核苷酸包括重組DNA，其併入載體內；併入自主複製質體或病毒內或併入原核生物或真核生物之基因體DNA內，或其作為獨立於其他序列之個別分子(例如，cDNA)存在。本發明之核苷酸可為核醣核苷酸、去氧核醣核苷酸或任何一種核苷酸之經修飾之形式。該術語包括DNA之單股及雙股形式。

編碼特異性結合CD11b之人類化抗體之VL及/或VH之DNA序列可藉由DNA轉移至合適之宿主細胞內而在活體外表現。該細胞可為原核細胞或真核細胞。該術語亦包括標的宿主細胞之任何子代。應瞭解所有子代可能不同於親代細胞，因為在複製期間可能發生突變。此項技術中已知穩定轉移之方法，其意謂外源DNA連續保持於宿主中。

編碼特異性結合CD11b之人類化抗體之VL及/或VH之聚核苷酸序列可操作地連接至表現控制序列。可操作地連接至編碼序列之表現控制序列係經接合使得該編碼序列之表現在與該等表現控制序列相容之條件下達成。該等表現控制序列包括(但不限於)適當之啟動子、強化子、轉錄終止子、在編碼蛋白質之基因前之起始密碼子(例如ATG)、用於內含子之剪接訊息(維持該基因之正確閱讀框架以允許mRNA之適當轉譯)，及終止密碼子。

編碼特異性結合CD11b之人類化抗體之VL及/或VH之聚核苷酸序列可嵌入表現載體內。該表現載體之實例包括(但不限於)質體、病 毒，或其他可經操作以容許序列之嵌入或併入且可表現於原核生物或真核生物中之媒介體。宿主可包括微生物、酵母、昆蟲及哺乳類生物。此項技術中熟知於原核生物中表現具有真核或病毒序列之DNA序列之方法。此項技術中已知可於宿主中表現及複製之生物功能病毒及質體DNA載體。以重組DNA轉形宿主細胞可藉由熟習此項技術者熟知之習知技術進行。

經重組表現之多肽之分離及純化可藉由習知方式(包括製備型層析法及免疫分離)進行。

人類化可通常遵循此項技術中已知的習知方法進行，藉由以嚙齒動物CDR或CDR序列代替人類抗體之相應序列。因此，此等「人類化」抗體係其中大體上小於已經來自非人類物種之相應序列取代之完整人類可變域之抗體。實際上，人類化抗體通常係其中一些CDR殘基及(可能)一些FR殘基經來自非人類(例如)嚙齒動物抗體之類似位置之殘基取代之人類抗體。

選擇待用於製造人類化抗體中之人類可變域(輕及重兩者)對減小抗原性係非常重要的。嚙齒動物抗體之可變域之序列針對整個已知人類可變域序列庫進行篩選。然後最接近嚙齒動物之序列之人類序列被公認為係用於人類化抗體之人類框架(FR)。另一方法使用衍生自輕鏈或重鏈之特定子群之所有人類抗體之一致性序列之特定框架。相同框架可用於數種不同之人類化抗體。

抗體結合部分包括(例如)Fab、Fab'、F(ab)₂、F(ab')₂、Fv、scFv及類似物。此等片段使用此項技術中熟知之方法產生自完整抗體，例如藉由使用酶(諸如木瓜酶(以產生Fab片段)或胃蛋白酶(以產生F(ab')₂片段))之蛋白水解裂解。

可對編碼本文描述之多肽之核酸作出修飾而不降低其生物活性。可作出一些修飾以促進靶分子選殖、表現或併入融合蛋白中。此 等修飾係熟習此項技術者熟知且包括(例如)終止密碼子，添加至胺基端處以提供起始、位置之甲硫胺酸，放置於任一末端上以產生便於定位之限制位置之額外之胺基酸或在純化步驟中有幫助之額外胺基酸。除重組方法外，本發明之抗體亦可使用此項技術中熟知的標準肽合成以完整或部分構築。

在另一態樣中，本發明提供包含本發明之抗CD11b抗體之組合物。在一些實施例中，此等組合物可投與給個體。在一些實施例中，本發明之抗CD11b抗體可提供於包含一或更多種其他組分(包括(但不限於)醫藥上可接受之載劑、佐劑、潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑、防腐劑及/或任何其他適用於組合物之預期用途之組分)之組合物中。此等組合物可採取溶液、懸浮液、乳液及類似物之形式。術語「醫藥上可接受之載劑」包括各種稀釋劑、賦形劑及/或媒介體。醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)已知對遞送至人類及/或其他動物個體係安全之載劑，及/或由聯邦或州政府之監管機構批准之載劑，及/或列於美國藥典中及/或其他公認之藥典中之載劑，及/或接受來自一或多個公認之監管機構之特定或個別批准以用於人類及/或其他動物中之載劑。此等醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)水、水溶液(諸如生理鹽水溶液、緩衝劑及類似物)、有機溶劑(諸如某些醇及油，其等包括彼等石油、動物、蔬菜或合成起源之油(諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油))及類似物。

在一個實施例中，本發明之人類化抗CD11b抗體可提供於包含一或更多種「化學治療劑」(其等係用於治療癌症之化學化合物，亦稱為抗腫瘤藥物)之組合物中。抗腫瘤藥物通常根據化學結構及藥物起源之差異而歸類為烷化劑、抗新陳代謝藥物、抗腫瘤抗生素、蒽環類抗生素、抗腫瘤草藥及激素。取決於週期或相特異性，抗腫瘤之化學治療藥物可歸類為(1)細胞週期非特異性藥劑(CCNSA)，諸如烷化 劑、抗腫瘤抗生素及鉑配位錯合物等，及(2)細胞週期特異性藥劑(CCSA)，諸如抗代謝藥物、長春花生物鹼等。

在一些實施例中，本發明之組合物包含「有效量」之本發明之抗CD11b抗體。「有效量」係達成所需目標結果所需要之量。有效達成所需目標結果之本發明之人類化抗CD11b抗體之量將取決於各種因素，其等包括(但不限於)預期個體之物種(例如，是否係人類抑或係一些其他動物物種)、預期個體之年齡及/或性別、經計劃之投與途徑、經計劃之給藥方案、任何進行中之疾病或病症之嚴重性及類似因素。有效量(其可為有效量之範圍)可藉由標準技術測定而無需任何過度之實驗，例如，使用在預期個體物種或任何合適之動物模型物種中之活體外分析及/或活體內分析。合適之分析包括(但不限於)彼等涉及來自劑量-反應曲線之外推法及/或衍生自活體外及/或活體內模型系統之其他資料者。在一些實施例中，該有效量可根據醫學或獸醫從業者基於特定情況之判斷而判定。

在一個實施例中，人類化抗CD11b抗體之有效量在自每次投與時介於約0.01mg/kg至約40mg/kg體重之範圍內；較佳地，介於約0.01mg/kg至約30mg/kg、約0.01mg/kg至約20mg/kg、約0.01mg/kg至約10mg/kg、約1mg/kg至約40mg/kg、約1mg/kg至約30mg/kg、約1mg/kg至約20mg/kg、約1mg/kg至約10mg/kg、約2mg/kg至約40mg/kg、約2mg/kg至約30mg/kg、約2mg/kg至約20mg/kg、約2mg/kg至約10mg/kg、約5mg/kg至約40mg/kg、約5mg/kg至約30mg/kg、約5mg/kg至約20mg/kg或約5mg/kg至約10mg/kg或約1mg/kg至約5mg/kg之範圍內。

在一些實施例中，本發明提供方法，該等方法包括向個體投與本發明之人類化抗CD11b抗體。此等方法包括用於抑制免疫細胞中PD-L1表現、免疫細胞中逆轉免疫抑制或免疫衰竭或誘發預存免疫 力、偵測個體中之PD-L1及治療或預防急性及/或慢性感染、敗血症、癌症中之免疫缺陷或老化中之免疫衰老之方法。本發明之抗CD11b抗體可用於上文提及之方法中。

本文描述之癌症係對免疫療法具有反應性之癌症且該等癌症之實例係如本文描述。預防及/或治療癌症之方法包含投與額外之活性劑或療法。該等額外之活性劑、其等實施例及投與係如本文描述。

可投與(例如，在治療之方法之過程中)本發明之抗CD11b抗體或包含該抗CD11b抗體之組合物之個體包括任何及所有動物物種。在一些實施例中，該等個體係哺乳類物種。哺乳類個體包括(但不限於)人類、非人類靈長類動物、嚙齒動物、兔及雪貂。

此項技術中已知各種遞送系統且可使用任何合適之遞送系統以向個體投與本發明之組合物。此等遞送系統包括(但不限於)皮內、肌內、腹腔內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜上及經口遞送系統。本發明之組合物可藉由任何便捷之途徑投與，例如藉由輸注或快速濃注，藉由通過上皮或黏膜皮膚內襯(例如，口腔黏膜、直腸黏膜及腸黏膜等)吸收且可連同其他生物活性劑一起投與。投與可為全身投與或局部投與。

在一些此類實施例中，單一劑量之投與較佳。然而，在其他實施例中，額外之劑量可藉由達成所需效應之相同或不同之途徑投與。在一些實施例中，給藥方案可包含單一投與。在其他實施例中，給藥方案可包含多次投與。

實例

下文描述用於下列實例中之材料及方法：

材料及方法

人類細胞分離及細胞培養

來自健康志願者之白血球濃縮物係獲得自台灣血液服務基金會 (臺北，台灣)。獲得用於參與研究之書面知情同意書，其經馬偕紀念醫院人體試驗委員會(Institutional Review Board of the Mackay Memorial Hospital)批准。人類單核細胞如先前描述經分離。簡而言之，周邊血液單核細胞(PBMC)使用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare)梯度離心分離法進行分離。該等單核細胞藉由使用CD14 MACS微珠(Miltenyi Biotec)進行CD14選擇來進一步純化。使用流動式細胞測量術分析證實之單核細胞純度係約90%。

動物及腫瘤細胞系。

C57BL/6小鼠(6至8週齡)購買自國家實驗動物中心(臺北，台灣)。所有動物實驗均在無特定病原之條件下且根據經馬偕紀念醫院動物護理及使用委員會(臺北，台灣)批准之指導方針進行。在治療開始時及在治療期間每天量測各小鼠之體重。B16F10係鼠科黑色素瘤細胞及LLC1係鼠科Lewis氏肺癌。所有細胞均係衍生自C57BL/6小鼠。細胞在37℃下於5% CO₂濕潤氣氛中維持於杜貝卡氏改良伊格培養基(DMEM)、10%熱滅活胎小牛血清、2mM L-麩醯胺酸、青黴素(100U/ml)及鏈黴素(100μg/ml)中。

抗體及試劑

針對人類單核細胞研究

來自大腸桿菌(O111：B4)之LPS係獲得自Sigma。對人類CD11b具有特異性之鼠科結合抗體(ICRF44)及用於對照抗體之小鼠IgG1均係購買自Biolegend。

針對鼠科癌症模型

對鼠科CD11b(M1/70)具有特異性之大鼠結合抗體、大鼠對照IgG2b抗體(LTF-2)、亞美尼亞倉鼠抗鼠科PD1(J43)及亞美尼亞倉鼠對照IgG均係購買自BioXcell。紫杉醇係係獲得自馬偕紀念醫院之化學療法藥物。

癌症治療之方案

皮下腫瘤模型

對C57BL/6小鼠皮下接種2×10⁵個B16F10細胞或1x10⁶個LLC1細胞。在腫瘤接種後7天，開始治療。用不同抗體及化學藥物每週兩次腹腔內(ip)治療帶腫瘤小鼠。監測小鼠並每週兩次針對可觸知的腫瘤之形成進行評分且若腫瘤超過3000mm³之預定尺寸則處死該等小鼠。腫瘤體積用卡尺量測並用下式計算：A×B²×0.54，其中A係最大直徑及B係最小直徑。

肺轉移模型

在第0天經由尾靜脈向各小鼠注射2x10⁵個B16F10細胞或LLC1細胞。在第1天，小鼠腹腔內注射各種抗體。每三至四天重複注射。在第15天，處死小鼠且將腫瘤接種之量計算為在顯微鏡下存在於肺中之結節之總數量。在其他實驗中，針對組合療法對各組中經治療之小鼠之長期存活率之效應分析小鼠。

流動式細胞測量分析

針對人類單核細胞研究

單核細胞係經抗CD11b(ICRF44)或適當之同型對照抗體預先培養1小時。隨後向該等細胞中添加100ng/ml LPS並培養整夜。為分析LPS致敏單核細胞之表面表現型，將該等細胞在冰上於黑暗中用下列稀釋於含有1% BSA之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之mAb培養30分鐘：PD-L1-FITC、CD80-PE、CD86-PE、HLA-DR-PE及CD14-PerCP(BD Biosciences)。單核細胞、多形核白細胞(PMN)及淋巴細胞基於其等FSC/SSC性質進行閘控。使用FACS Calibur偵測螢光，且使用FCS Express，第3版(De Novo軟體)進行資料分析。

針對鼠科癌症研究

為獲得腫瘤浸潤性白細胞，藉由膠原蛋白酶IV(Sigma)消化腫瘤 組織。單一細胞懸浮液用下列抗體染色：CD45-PE、Ly-6G-FITC、Ly-6C-APC及CD8b.2-FITC。腫瘤浸潤性白細胞係經閘控自CD45+群體。使用FACS Calibur偵測螢光，且使用FCS Express，第3版(De Novo軟體)進行資料分析。

為分離來自各實驗之白血球(WBC)，全血細胞藉由RBC裂解緩衝液裂解。單一細胞懸浮液用下列抗體染色：PD-L1-APC、IAIE-APC及CD8b.2-FITC(Biolegend)。單核細胞、多形核白細胞(PMN)及淋巴細胞係基於其等FSC/SSC性質。使用FACS Calibur偵測螢光，且使用FCS Express，第3版(De Novo軟體)進行資料分析。

細胞介素定量

培養物上清液中之人類IL-6、IL-10、IL-12及TNF-α藉由商業酶聯免疫吸附法(ELISA；R&D系統)根據製造商使用說明進行偵測。血漿中之鼠科IL-12、IFN-γ及TNF-α藉由BD CBA小鼠炎症套組定量。

實例1：結合CD11b將減少LPS致敏單核細胞上之PD-L1表現

在此實例中，吾人研究整合素αMβ2(Mac-1)之阻斷是否可在功能上增加TLR反應。如圖1中所示，CD11b結合劑(諸如抗CD11b抗體(ICRF44))之投與可減少單核細胞上之LPS誘發之PD-L1表現。相比之下，抗CD11b抗體治療不改變LPS致敏單核細胞上之HLA-DR、CD80及CD86表現水平。以ML-C19-A(CD11b拮抗劑之小分子)(圖2A)結合CD11b亦證實LPS致敏單核細胞中之抑制PD-L1表現(圖2B)。此等結果一起表明CD11b在LPS致敏單核細胞上之PD-L1表現之誘發中起關鍵作用。

實例2：CD11b結合於抗腫瘤免疫力中之效應

為檢測CD11b結合於抗腫瘤免疫力中之效應，將抗小鼠CD11b(M1/70)抗體作為B16F10鼠科腫瘤模型中之單一療法進行測試。對C57BL/6小鼠在第0天皮下注射B16F10細胞。在第7天，對小鼠腹腔內 (ip)注射對照IgG(5mg/kg)或抗小鼠CD11b抗體(5mg/kg)。每三至四天重複注射。藉由針對各組監測腫瘤體積及長期存活率而測定效用。如圖3中所示，以抗小鼠CD11b抗體結合CD11b強效抑制B16F10腫瘤之皮下生長(在第18天，對照IgG相比於抗CD11b=1054±385.4mm³相比於502.7±268.2mm³)。吾人檢測免疫細胞群體於腫瘤中之比例。在腫瘤接種後之第18天，以抗CD11b抗體結合CD11b減少腫瘤浸潤性骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)之局部聚集，MDSC抑制T細胞且導致經腫瘤浸潤之CD8 T細胞之增加(圖4)。同時，以抗CD11b抗體結合CD11b將免疫抑制腫瘤微環境轉變成免疫刺激狀態，其有利地有助於抗腫瘤效應。吾人進一步檢測免疫細胞群體在抗CD11b抗體治療後於周邊中之比例。在腫瘤注射後之第15天，抗CD11b治療導致CD11b陽性白血球中之PD-L1表現減少，同時IAIE陽性CD8 T細胞(經活化之T細胞)於CD8 T細胞中之百分率增加(圖5)。IFN-γ、IL-12及TNF-α之血漿濃度反映各種炎性或惡性疾病中之免疫刺激狀態。吾人量測經抗CD11b抗體治療之帶腫瘤之小鼠中之血漿IFN-γ、IL-12及TNF-α濃度。相較於對照IgG治療，經抗CD11b抗體治療之小鼠顯示高血漿IFN-γ、IL-12及TNF-α水平(圖6)。

CD11b結合亦證實不同之同基因LLC1腫瘤模型中之效用。使用5mg/kg抗CD11b抗體之治療強效抑制LLC1腫瘤之腫瘤生長(圖7)並延長動物存活(圖8)(中值存活天數對照IgG：31天；抗CD11b：42天)。

實例3：CD11b結合及免疫查核點療法於抗腫瘤免疫力中之協同效應

經組合之治療證實不同之同基因LLC1肺轉移模型中之效用。使用抗CD11b(10mg/kg)+抗PD-1(10mg/kg)抗體之治療強效減少LLC1腫瘤之腫瘤結節(圖9)(在第15天，對照IgG相比於抗CD11b相比於抗PD-1相比於抗CD11b+抗PD-1=200±13相比於167相比於164±11相 比於131±2)並延長動物存活(圖10)(中值存活天數對照IgG：24天；抗CD11b：24天；抗PD-1：22天；抗CD11b+抗PD-1：26天)。

實例4：CD11b結合及化學療法於抗腫瘤免疫力中之協同效應

CD11b結合亦增強化學療法。在此實例中，在第0天植入B16F10細胞。在第7天，對小鼠腹腔內注射對照IgG(5mg/kg)、抗小鼠CD11b抗體(5mg/kg)、紫杉醇(10mg/kg)+對照IgG(5mg/kg)或紫杉醇(10mg/kg)+抗CD11b(5mg/kg)。每三至四天重複注射。如圖11中所示，使用紫杉醇加抗CD11b抗體之組合之治療有效控制腫瘤生長。組合治療之有效性亦證實於長期存活率中(圖12)(中值存活天數對照IgG：25天；抗CD11b：32天；紫杉醇+對照IgG：25天；紫杉醇+抗CD11b：32天)。

實例5：在來自患有敗血性休克之病患之LPS誘發之免疫抑制單核細胞或單核細胞中，以抗CD11b抗體結合CD11b在細胞經LPS挑戰時亦減少PD-L1表現。

敗血症(一種由嚴重感染引起之全身性炎性反應症候群)仍係全球健康護理問題及威脅生命之疾病。越發明顯的係，敗血症啟動隨時間變化之雙相免疫反應。在敗血症之初始階段期間，全身性高度炎性免疫反應可全身產生炎性細胞介素(包括介白素(IL)-1、IL-6及腫瘤壞死因子(TNF)-α)，其可引起血液動力學不穩定性、多器官功能障礙、凝血異常及休克。隨高度炎性免疫反應而來者係幾乎同時產生抗炎性細胞介素(包括IL-10及腫瘤生長因子(TGF)-β)；免疫系統迅速進入免疫高度活性狀態(稱為免疫麻痺)，其表現為無法根除原發性感染及後期醫院內感染之發展。於患有敗血症之病患中觀察到之免疫麻痺之指示項包括淋巴細胞異常、單核細胞去活化伴減弱之人類白細胞抗原-DR(HLA-DR)表面表現、及在活體外刺激下之低TNF-α產生。單核細胞HLA-DR表現之持續減少指示患有敗血症之病患之醫院內感染及死亡 之高風險。最近，觀察到患有敗血性休克之病患之單核細胞中之高程式死亡配體-1(PD-L1)表現且其與繼發性醫院內感染及死亡率之高發生相關(Guignant C、Lepape A、Huang X、Kherouf H、Denis L等人，(2011)Programmed death-1 levels correlate with increased mortality,nosocomial infection and immune dysfunctions in septic shock patients.Crit Care 15：R99)。因此，單核細胞中之PD-L1表現之水平可充當免疫麻痺之新穎標誌。

已報告單核細胞對LPS歷時2天之先前曝露將使其等變為免疫抑制單核細胞(Wolk K，Docke WD，von Baehr V，Volk HD及Sabat R.(2000)Impaired antigen presentation by human monocytes during endotoxin tolerance.Blood 96：218)。臨床上，此等細胞與免疫麻痺及死亡率相關。吾人建立可複製之LPS誘發之免疫抑制單核細胞，其中人類單核細胞經100ng/ml LPS預先培養2天。相較於新鮮之經分離之人類單核細胞，LPS誘發之免疫抑制單核細胞在細胞表面上表現更高之PD-L1水平(圖13A)。為檢測CD11b調節劑在LPS誘發之免疫抑制單核細胞中之效應，使細胞在IgG1或抗CD11b抗體(ICRF44)之存在下曝露於1μg/ml LPS，歷時18hr。如圖13B中所示，以抗CD11b抗體(ICRF44)結合CD11b在細胞經LPS激發時減少LPS誘發之免疫抑制單核細胞中之PD-L1表現。此外，抗CD11b抗體(ICRF44)治療亦一經活體外LPS刺激即減少來自患有敗血性休克之病患之單核細胞中之PD-L1表現(圖14)。

實例6：結合人類CD11b之人類化抗體

針對人類抗體資料庫搜索鼠科抗人類CD11b抗體之可變域序列。選擇10組對鼠科抗人類CD11b具有高同源性之人類框架序列作為用於輕鏈及重鏈兩者之人類接受者。同時，分析N-醣化基序。因此應避免候選人類可變區中之潛在醣化位置。10個輕鏈之人類化可變域表示為 VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、LC1、LC2、LC3、LC4及LC5(圖15)，而10個重鏈之人類化可變域表示為VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、HC1、HC2、HC3、HC4及HC5(圖16)。此等輕鏈及重鏈肽序列可提供以高親和力結合至人類抗CD11b之人類化抗體或抗原結合部分。

實例7：人類化CD11b抗體之功能活性

人類化抗CD11b抗體之特異性藉由流動式細胞測量術使用表現CD11b之K562細胞測定。如圖17中所示，此實例中之所有人類化抗CD11b抗體可結合至經CD11b轉染之K562細胞。相反，此等抗體不結合至K562細胞。綜合而言，此等結果證實人類化抗CD11b抗體可特異性結合至CD11b抗原決定基。

為檢測人類化抗CD11b抗體之功能活性，抗體係用於量測抗體抑制單核細胞之表面上之PD-L1表現之能力之LPS致敏單核細胞中。如圖18中所示，藉由LPS上調PD-L1可藉由人類化抗CD11b抗體顯著減少。

總而言之，吾人描述一系列針對人類αM域之人類化抗CD11b抗體。人類化抗CD11b抗體之結合可減少LPS致敏單核細胞上之PD-L1表現。

<110> 台灣基督長老教會馬偕醫療財團法人馬偕紀念醫院

<120> 調控免疫反應之方法及抗體

<130> L88340/CN24523

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> PRT

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<223> H-CDR1

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<223> 人類化抗CD11b抗體之重鏈可變區-VH1

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<223> 人類化抗CD11b抗體之重鏈可變區-HC1

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<223> 人類化抗CD11b抗體之重鏈可變區-HC2

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<223> 人類化抗CD11b抗體之重鏈可變區-HC3

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<212> PRT

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<223> 人類化抗CD11b抗體之重鏈可變區-HC4

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<223> 人類化抗CD11b抗體之重鏈可變區-HC5

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<213> 人造

<220>

<223> 人類化抗CD11b抗體之輕鏈可變區-VL1

<400> 23

<210> 24

<211> 108

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人類化抗CD11b抗體之輕鏈可變區-VL2

<400> 24

<210> 25

<211> 108

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人類化抗CD11b抗體之輕鏈可變區-VL3

<400> 25

<210> 26

<211> 108

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人類化抗CD11b抗體之輕鏈可變區-VL4

<400> 26

<210> 27

<211> 108

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人類化抗CD11b抗體之輕鏈可變區-VL5

<400> 27

<210> 28

<211> 113

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人類化抗CD11b抗體之輕鏈可變區-LC1

<400> 28

<210> 29

<211> 113

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人類化抗CD11b抗體之輕鏈可變區-LC2

<400> 29

<210> 30

<211> 113

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人類化抗CD11b抗體之輕鏈可變區-LC3

<400> 30

<210> 31

<211> 113

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人類化抗CD11b抗體之輕鏈可變區-LC4

<400> 31

<210> 32

<211> 113

<212> PRT

<213> 人造

<220>

<223> 人類化抗CD11b抗體之輕鏈可變區-LC5

<400> 32

Claims (58)

1. 一種用於抑制免疫細胞中PD-L1表現之方法，其包括使該免疫細胞與結合至該細胞上CD11b之CD11b調節劑接觸，藉此抑制該免疫細胞之PD-L1表現。
2. 一種用於免疫細胞中逆轉免疫抑制或免疫衰竭(immune exhaustion)或誘發預存免疫力之方法，其包括使該免疫細胞與結合至該細胞上CD11b之CD11b調節劑接觸。
3. 一種用於判定對CD11b調節劑具有反應性之個體之方法，該方法包括偵測生物樣品或個體中之PD-L1是否被抑制，方式為藉由使該生物樣品或該個體中之免疫細胞與CD11b調節劑接觸並進一步偵測該免疫細胞上PD-L1之抑制，其中該PD-L1抑制指示該個體對CD11b調節劑具有反應性。
4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該CD11b調節劑係RNAi劑、結合至CD11b之抗CD11b抗體或核苷酸類似物、結合至CD11b之小分子化合物。
5. 如請求項4之方法，其中該RNAi劑係抑制CD11b表現之微小RNA(miRNA)或短小干擾RNA(siRNA)。
6. 如請求項4之方法，其中該抗CD11b抗體係單株、嵌合、人類化、人類或雙特異性抗CD11b抗體或其抗原結合片段。
7. 如請求項4之方法，其中該小分子化合物係：
8. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該免疫細胞係單核細胞或顆粒細胞或巨噬細胞或骨髓衍生之抑制細胞或自然殺手細胞或T細胞。
9. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該CD11b結合增加IFN-γ、IL-12或CD8 T細胞。
10. 如請求項1至3中任一項之方法，其中CD11b調節劑結合至細胞上之CD11b治療及/或預防與免疫抑制相關之疾病。
11. 如請求項10之方法，其中與免疫抑制或免疫衰竭相關之疾病係急性及/或慢性感染、敗血症、癌症或老化中之免疫衰老。
12. 一種用於治療或預防急性及/或慢性感染、敗血症、癌症或老化中之免疫衰老之方法，其包括向個體投與有效量之CD11b調節劑。
13. 如請求項11至12之方法，其中該癌症係黑色素瘤、肺癌、肺鱗狀細胞癌、頭頸癌、乳癌、卵巢癌、子宮癌、前列腺癌、胃癌、子宮頸癌、食道癌、膀胱癌、腎癌、腦癌、肝癌、結腸癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌、睾丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰門癌、霍奇金氏病(Hodgkin’s Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病(包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴球性白血病)、兒童之實體腫瘤、淋巴球性淋巴瘤、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)之贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、髓軸(spinal axis)腫瘤、腦幹神經膠瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、表皮樣癌、鱗狀細胞癌及T細胞淋巴瘤。
14. 如請求項11至12之方法，其中該癌症係轉移癌、難治性癌症、復發性癌症或晚期癌症。
15. 如請求項12之方法，其中癌症之預防及/或治療包含投與額外之 活性劑或療法。
16. 如請求項15之方法，其中該額外之活性劑係免疫查核點療法、放射療法或化學療法。
17. 如請求項16之方法，其中該CD11b調節劑及該免疫查核點療法、放射療法或化學療法係同時、循序或分別投與。
18. 如請求項17之方法，其中該免疫查核點療法包含投與免疫查核點蛋白。
19. 如請求項18之方法，其中該免疫查核點蛋白係抗PD-1抗體或PD-1配體或抗CTLA-4抗體或CTLA-4配體或抗PD-L1抗體或PD-L1配體，或其抗原結合片段，或其任何組合。
20. 如請求項19之方法，其中該抗PD-1抗體係納武單抗(nivolumab)或派姆單抗(pembrolizumab)，及該抗CTLA-4抗體係易普利姆瑪單抗(ipilimumab)，及該抗PD-L1抗體係阿特珠單抗(atezolizu-mab)。
21. 如請求項16至17之方法，其中該化學療法包含投與化學治療劑。
22. 如請求項21之方法，其中該化學治療劑係烷化劑、抗代謝物、抗微管劑、拓樸異構酶抑制劑或細胞毒性抗生素。
23. 如請求項21之方法，其中該化學治療劑係順鉑、5-Fu、紫杉醇、多西他賽(docetaxel)、長春瑞濱(vinorelbine)、長春地辛(vindesine)、長春氟寧(vinflunine)、吉西他濱(gemcitabine)、胺甲喋呤(methotrexate)、吉非替尼(gefitinib)、拉帕替尼(lapatinib)或埃羅替尼(erlotinib)。
24. 一種抗CD11b抗體或其抗原結合部分，其包含以下中之至少一者：由NYWIN(SEQ ID NO：1)或GFSLTSNSIS(SEQ ID NO：2)之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO：1或2具有至少85%一致性之胺基 酸序列之變體組成之重鏈互補決定區1(H-CDR1)；由NIYPSDTYINHNQKFKD(SEQ ID NO：3)或AIWSGGGTDYNSDLKS(SEQ ID NO：4)之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO：3或4具有至少85%一致性之胺基酸序列之變體組成之重鏈CDR2(H-CDR2)；及由SAYANYFDY(SEQ ID NO：5)或RGGYPYYFDY(SEQ ID NO：6)之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO：5或6具有至少85%一致性之胺基酸序列之變體組成之重鏈CDR3(H-CDR3)；且包含以下中之至少一者：由RASQNIGTSIH(SEQ ID NO：7)或KSSQSLLYSENQENYLA(SEQ ID NO：8)之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO：7或8具有85%一致性之胺基酸序列之變體組成之輕鏈CDR1(L-CDR1)；由YASESIS(SEQ ID NO：9)或WASTRQS(SEQ ID NO：10)之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO：9或10中之任一者具有85%一致性之胺基酸序列之變體組成之輕鏈CDR2(L-CDR2)；及由QQSDSWPTLT(SEQ ID NO：11)或QQYYDTPLT(SEQ ID NO：12)之胺基酸殘基或具有與SEQ ID NO：11或12中之任一者具有85%一致性之胺基酸序列之變體組成之輕鏈CDR3(L-CDR3)；使得該經分離之抗體或其抗原結合部分結合至CD11b。
25. 如請求項24之抗CD11b抗體或其抗原結合部分，其包含(i)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO：1之H-CDR1、包含SEQ ID NO：3之H-CDR2及包含SEQ ID NO：5之H-CDR3之重鏈可變區，及(ii)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO：7之L-CDR1、包含SEQ ID NO：9之L-CDR2及包含SEQ ID NO：11之L-CDR3；或(iii)重鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO：2之H-CDR1、包含SEQ ID NO：4之H-CDR2及包含SEQ ID NO：6之H-CDR3之重鏈可變區，及(iv)輕鏈可變區，其包括包含SEQ ID NO：8之L-CDR1、包含SEQ ID NO：10之L-CDR2及包含SEQ ID NO：12之L-CDR3。
26. 如請求項24或25之抗CD11b抗體或其抗原結合部分，其係嵌合、人類化或人類抗體。
27. 一種重鏈可變區或其抗原結合部分，其包含具有由SEQ ID NO：1或2組成之胺基酸序列之H-CDR1、具有由SEQ ID NO：3或4組成之胺基酸序列之H-CDR2，及具有由SEQ ID NO：5或6組成之胺基酸序列之H-CDR3之重鏈可變區。
28. 一種輕鏈可變區或其抗原結合部分，其包含具有由SEQ ID NO：7或8組成之胺基酸序列之L-CDR1、具有由SEQ ID NO：9或10組成之胺基酸序列之L-CDR2，及具有由SEQ ID NO：11或12組成之胺基酸序列之L-CDR3。
29. 一種人類化抗CD11b抗體或其抗原結合部分，其包含(i)包含與SEQ ID NO：13至22之胺基酸序列中之任一者具有至少90%一致性之胺基酸序列之重鏈可變區，及(ii)包含與SEQ ID NO：23至32之胺基酸序列中之任一者具有至少90%一致性之胺基酸序列之輕鏈可變區。
30. 如請求項31之人類化抗CD11b抗體或其抗原結合部分，其包括包含由SEQ ID NO：13至22組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO：23至32組成之胺基酸序列之輕鏈可變區。
31. 一種人類化抗CD11b抗體或其抗原結合部分，其包含：(a)包含由SEQ ID NO：13組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO：23組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；(b)包含由SEQ ID NO：14組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO：24組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；(c)包含由SEQ ID NO：15組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO：25組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；(d)包含由SEQ ID NO：16組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及 包含由SEQ ID NO：26組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；(e)包含由SEQ ID NO：17組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO：27組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；(f)包含由SEQ ID NO：18組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO：28組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；(g)包含由SEQ ID NO：19組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO：29組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；(h)包含由SEQ ID NO：20組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO：30組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；(i)包含由SEQ ID NO：21組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO：31組成之胺基酸序列之輕鏈可變區；或(j)包含由SEQ ID NO：22組成之胺基酸序列之重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO：32組成之胺基酸序列之輕鏈可變區。
32. 一種組合物，其包含如請求項24至31中任一項之抗CD11b抗體或其抗原結合部分。
33. 如請求項32之組合物，其包含額外之活性劑。
34. 如請求項33之組合物，其中該額外之活性劑係免疫查核點蛋白或化學治療劑。
35. 如請求項34之組合物，其中該免疫查核點蛋白係抗PD-1抗體或PD-1配體或抗CTLA-4抗體或CTLA-4配體或抗PD-L1抗體或PD-L1配體，或其抗原結合片段，或其任何組合。
36. 如請求項35之組合物，其中抗PD-1抗體係納武單抗或派姆單抗及該抗CTLA-4抗體係易普利姆瑪單抗及該抗PD-L1抗體係阿特珠單抗。
37. 如請求項34之組合物，其中該化學治療劑係烷化劑、抗代謝物、抗微管劑、拓樸異構酶抑制劑或細胞毒性抗生素。
38. 如請求項34之組合物，其中該化學治療劑係順鉑、5-Fu、紫杉醇、多西他賽、長春瑞濱、長春地辛、長春氟寧、吉西他濱、胺甲喋呤、吉非替尼、拉帕替尼或埃羅替尼。
39. 一種用於抑制免疫細胞中PD-L1表現之方法，其包括使該免疫細胞與結合該細胞上CD11b之如請求項24至31中任一項之抗CD11b抗體或其抗原結合部分接觸，藉此抑制該免疫細胞之PD-L1表現。
40. 一種用於免疫細胞中逆轉免疫抑制或免疫衰竭或誘發預存免疫力之方法，其包括使該免疫細胞與結合該細胞上CD11b之如請求項24至31中任一項之抗CD11b抗體或其抗原結合部分接觸。
41. 一種用於判定對CD11b調節劑具有反應性之個體之方法，該方法包括偵測生物樣品或個體中之PD-1是否被抑制，方式為藉由使該生物樣品或該個體中之免疫細胞與如請求項24至31中任一項之抗CD11b抗體或其抗原結合部分接觸並進一步偵測該免疫細胞上PD-L1之抑制。
42. 如請求項39至41中任一項之方法，其中該免疫細胞係單核細胞或顆粒細胞或巨噬細胞或骨髓衍生之抑制細胞或自然殺手細胞或T細胞。
43. 如請求項39至41中任一項之方法，其中該CD11b結合增加IFN-γ、IL-12、TNF-α或CD8 T細胞。
44. 如請求項39至41中任一項之方法，其中該抗CD11b抗體或其抗原結合片段結合至細胞上CD11b治療及/或預防與免疫抑制相關之疾病。
45. 如請求項44之方法，其中與免疫抑制相關之疾病係急性及/或慢性感染、敗血症、癌症或老化中之免疫衰老。
46. 一種用於治療或預防急性及/或慢性感染、敗血症、癌症或老化 中之免疫衰老之方法，其包括向個體投與有效量之請求項24至31中任一項之抗CD11b抗體或其抗原結合部分。
47. 如請求項45或56之方法，其中該癌症係黑色素瘤、肺癌、肺鱗狀細胞癌、頭頸癌、乳癌、卵巢癌、子宮癌、前列腺癌、胃癌、子宮頸癌、食道癌、膀胱癌、腎癌、腦癌、肝癌、結腸癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌、睾丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰門癌、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病(包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴球性白血病)、兒童之實體腫瘤、淋巴球性淋巴瘤、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)之贅瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、髓軸腫瘤、腦幹神經膠瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌及T細胞淋巴瘤。
48. 如請求項45或46之方法，其中該癌症係轉移癌、難治性癌症、復發性癌症或晚期癌症。
49. 如請求項45或46之方法，其中癌症之預防及/或治療包含投與額外之活性劑或療法。
50. 如請求項49之方法，其中該額外之活性劑係免疫查核點療法、放射療法或化學療法。
51. 如請求項50之方法，其中如請求項24至31中任一項之抗CD11b抗體或其抗原結合部分及該免疫查核點療法、放射療法或化學療法係同時、循序或分別投與。
52. 如請求項51之方法，其中該免疫查核點療法包含投與免疫查核點蛋白。
53. 如請求項52之方法，其中該免疫查核點蛋白係抗PD-1抗體或PD-1配體或抗CTLA-4抗體或CTLA-4配體或抗PD-L1抗體或PD-L1配體，或其抗原結合片段，或其任何組合。
54. 如請求項53之方法，其中該抗PD-1抗體係納武單抗或派姆單抗及該抗CTLA-4抗體係易普利姆瑪單抗及該抗PD-L1係阿特珠單抗。
55. 如請求項50之方法，其中該化學療法包含投與化學治療劑。
56. 如請求項55之方法，其中該化學治療劑係烷化劑、抗代謝物、抗微管劑、拓樸異構酶抑制劑或細胞毒性抗生素。
57. 如請求項55之方法，其中該化學治療劑係順鉑、5-Fu、紫杉醇、多西他賽、長春瑞濱、長春地辛、長春氟寧、吉西他濱、胺甲喋呤、吉非替尼、拉帕替尼或埃羅替尼。
58. 如請求項39、40或46之方法，其中如請求項24至31中任一項之抗CD11抗體或其抗原結合部分之有效量係介於約0.01mg/kg至約40mg/kg體重之範圍內。