KR102461538B1 - 인플루엔자 바이러스 백신 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드, 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드의 제공 방법, 이를 포함하는 조성물, 이를 포함하는 백신, 및 특히 인플루엔자의 검출, 예방 및/또는 치료에서의 그들의 이용 방법이 본 명세서에 제공된다.

Description

인플루엔자 바이러스 백신 및 이의 용도{INFLUENZA VIRUS VACCINES AND USES THEREOF}
도입
본 발명은 의약(medicine) 분야에 관한 것이다. 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인(hemagglutinin stem domain) 폴리펩티드, 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드의 제공 방법, 이를 포함하는 조성물, 이를 포함하는 백신, 및 특히 인플루엔자의 검출, 예방 및/또는 치료에서의 이들의 이용 방법이 본 명세서에 제공된다.
인플루엔자 바이러스는 중증도가 준임상적 감염으로부터 사망을 야기할 수 있는 원발성 바이러스성 폐렴까지의 범위인 호흡기 질병(통상 "인플루엔자" 또는 "플루"로 지칭)을 야기하는 주요 인간 병원체이다. 감염의 임상 효과는 인플루엔자 균주(strain)의 발병력 및 숙주의 노출, 병력, 연령 및 면역 상태에 따라 달라진다. 매년 전 세계적으로 대략 10억 명의 사람들이 인플루엔자 바이러스로 감염을 겪어, 3백만 내지 5백만의 사례에서 중증의 병이 야기되고, 300,000 내지 500,000건의 인플루엔자 관련 사망이 발생하는 것으로 추정된다. 대부분의 이들 감염은 기여도가 보다 적은 인플루엔자 B 바이러스와 함께, H1 또는 H3 헤마글루티닌 서브타입을 지니는 인플루엔자 A 바이러스에 기인할 수 있으며, 이에 따라, 대표적인 3가지 모두가 계절성 백신에 포함된다. 현행의 면역화 실행은 효과적인 계절성 인플루엔자 백신의 시기적절한 생성을 가능하게 하기 위하여, 유행하는 인플루엔자 바이러스의 조기의 확인에 의존한다. 다음 계절 동안 우세적일 균주를 예측함에 있어서 내재적인 어려움과 별개로, 항바이러스 내성 및 면역 회피는 또한 현행의 백신이 이환 및 사망을 예방하지 못하게 한다. 이에 더하여, 동물 병원소로부터 비롯되고, 인간 대 인간 확산을 증가시키도록 재배열된(reassorted) 고도의 발병력의 바이러스 균주에 의해 야기되는 범유행의 가능성은 세계의 보건에 대하여 상당한 현실적인 위협을 제기한다.
인플루엔자 A 바이러스는 자연에서 널리 분포되어 있으며, 다양한 조류 및 포유류를 감염시킬 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 오르토믹소비리대(Orthomyxoviridae)의 과에 속하는 외피(enveloped) RNA 바이러스이다. 이들의 게놈은 11가지 상이한 단백질, 1가지 핵단백질(NP), 3가지 중합효소 단백질(PA, PB1 및 PB2), 2가지 기질 단백질(M1 및 M2), 3가지 비-구조 단백질(NS1, NS2 및 PB1-F2) 및 2가지 외부 당단백질: 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA)를 암호화하는 8개의 단일 가닥 RNA 세그먼트(segment)로 구성된다. 바이러스는 HA 및 NA 단백질의 항원 구조의 차이를 기반으로 하여 분류되며, 이들의 상이한 조합은 특정 인플루엔자 바이러스 균주로 더 분류되는 독특한 바이러스 서브타입을 나타낸다. 모든 공지되어 있는 서브타입이 조류에서 관찰될 수 있지만, 현재 유행하는 인간 인플루엔자 A 서브타입은 H1N1 및 H3N2이다. 계통발생 분석에 의해, 2개의 주요 그룹으로의 헤마글루티닌의 세분이 입증되었다: 특히, 계통발생 그룹 1에서 H1, H2, H5 및 H9 서브타입, 그리고 특히, 계통발생 그룹 2에서 H3, H4 및 H7 서브타입.
인플루엔자 B형 바이러스 균주는 엄격하게 인간이다. 인플루엔자 B형 바이러스 균주 내의 HA의 항원 변이는 A형 균주에서 관찰되는 것보다 더 작다. B/Yamagata/16/88(B/Yamagata로도 지칭) 및 B/Victoria/2/87(B/Victoria) 계통으로 표시되는 바와 같은 인플루엔자 B 바이러스의 2가지의 유전학적 및 항원적으로 별개의 계통이 인간에서 유행하고 있다(문헌[Ferguson et al., 2003]). 인플루엔자 B 바이러스에 의해 야기되는 질병의 스펙트럼은 일반적으로 인플루엔자 A 바이러스에 의해 야기되는 것보다 더 경증이지만, 입원을 필요로 하는 중증의 병이 인플루엔자 B 감염에서 여전히 빈번하게 관찰된다.
인플루엔자 바이러스를 중화시키는 항체가 주로 헤마글루티닌(HA)에 대해 유도되는 것이 알려져 있다. 헤마글루티닌 또는 HA는 바이러스 코트에 부착된 삼량체 당단백질이며 이중의 기능을 갖는다: 세포 표면 수용체 시알산으로의 결합을 담당하는 기능, 및 이것이 흡수 후에 바이러스 및 엔도솜 막의 융합을 매개하여 세포의 세포질 내의 바이러스 RNA의 방출을 야기하는 기능. HA는 큰 헤드 도메인(head domain) 및 보다 작은 스템 도메인을 포함한다. 바이러스 막으로의 부착은 스템 도메인에 연결된 C-말단 고정(anchoring) 서열에 의해 매개된다. 단백질은 지정된 루프에서 번역 후 절단되어, 2가지 폴리펩티드, HA1 및 HA2를 생성한다(전체 서열은 HA0으로 지칭). 막 원위 헤드 영역은 주로 HA1으로부터 유래하며, 막 근위 스템 영역은 주로 HA2로부터 유래된다(도 1).
계절성 인플루엔자 백신이 매년 갱신되어야 하는 이유는 바이러스의 큰 변이성 때문이다. 헤마글루티닌 분자에서, 이러한 변이는 특히 항원 소변이(drift) 및 대변이(shift)가 다수의 상이한 변이체를 야기하는 헤드 도메인에서 나타난다. 이것이 또한 면역우성인 영역이기 때문에, 대부분의 중화 항체는 이러한 도메인에 대해 유도되며, 수용체 결합을 방해함으로써 작용한다. 헤드 도메인의 큰 변이 및 면역우성의 조합은 또한 특정 균주로의 감염이 다른 균주에 대한 면역성을 야기하지 않는 이유를 설명한다: 제1 감염에 의해 유도되는 항체는 일차 감염의 바이러스와 밀접하게 관련된 제한된 수의 균주만을 인식한다.
최근에, 모든 또는 실질적으로 모든 인플루엔자 헤마글루티닌 구형 헤드 도메인이 결여된 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드가 기술되었으며, 이는 스템 도메인 폴리펩티드의 하나 이상의 보존된 에피토프에 대한 면역 반응을 생성하기 위해 사용된다. 스템 도메인 폴리펩티드의 에피토프가 구형 헤드 도메인의 고도의 면역원성 영역보다 면역원성이 더 적어서, 이에 따라, 스템 도메인 폴리펩티드 내의 구형 헤드 도메인의 부재는 스템 도메인 폴리펩티드의 하나 이상의 에피토프에 대한 면역 반응이 발생하게 할 수 있는 것으로 여겨진다(문헌[Steel et al., 2010]). 이에 따라, 스틸(Steel) 등은 HA 일차 서열로부터 A/Puerto Rico/8/1934(H1N1) 및 A/Hong Kong/1968(H3N2) 균주의 HA1의 아미노산 잔기 53 내지 276을 결실시키고, 이를 짧은 유연성(flexible) 연결 서열 GGGG로 대체함으로써 신규한 분자를 생성하였다. H3 HK68 작제물을 사용한 마우스의 백신접종은 그룹 1 HA와 교차 반응성인 항혈청을 유도하지 않았다. 또한 PCT/EP2012/073706호에 나타낸 바와 같이, 스템 도메인 폴리펩티드는 매우 불안정하며, 스템 영역 내의 보존된 에피토프에 결합하는 것으로 보이는 항체의 결합의 결여에 의해 입증된 바와 같이, 올바른 형태를 취하지 않았다.
또한, 문헌[Bommakanti, et al., (2010)]에서는 HA2의 아미노산 잔기 1 내지 172, 7-아미노산 링커(GSAGSAG), HA1의 아미노산 잔기 7 내지 46, 6-아미노산 링커 GSAGSA에 이어서 HA1 내에 돌연변이 V297T, I300E, Y302T 및 C305T가 있는 HA1의 잔기 290 내지 321을 포함하는 HA2 기반의 폴리펩티드를 기재하고 있다. 해당 설계는 H3 HA(A/Hong Kong/1968)의 서열을 기반으로 하였다. 폴리펩티드는 H1 서브타입(A/PR/8/34)에 대해서는 교차 보호를 제공하지 않고, H3 서브타입(A/Phil/2/82) 내의 다른 인플루엔자 바이러스 균주에 대해서만 오직 교차 보호를 제공하였다. 문헌[Bommakanti et al (2012)]에 의한 더욱 최근의 논문에, H1N1 A/Puerto Rico/8/1934(H1HA0HA6)로부터의 HA를 기반으로 한 스템 도메인 서열이 기재되어 있다. 이러한 폴리펩티드에서, 잔기 55 내지 302의 등가물이 결실되고, 돌연변이 I311T, V314T, I316N, C319S, F406D, F409T 및 L416D가 이루어졌다. H3 및 HA 기반의 폴리펩티드 둘 모두를 에스케리키아 콜라이(E. coli)에서 발현시켰으며, 이에 따라, 자연 발생 HA 단백질의 부분인 글리칸이 결여되어 있다. 폴리펩티드는 에스케리키아 콜라이에서 발현되는 경우, 주로 고분자량 응집물 및 부수적인 단량체 분획으로서 회수된다. 폴리펩티드는 9 및 0.2 μM의 2개의 겉보기 해리 상수로 CR6261에 결합한다. 저자는 마우스가 100 ㎍의 CpG7909가 보강된 20 ㎍의 단백질을 사용한 면역화(2회, 4주 간격) 후에 1 LD90의 상동성 H1N1 A/Puerto Rico/8/1934 바이러스를 사용한 시험감염을 견뎌낼 수 있음을 보여준다. 또한, 저자는 A/Hong Kong/1/1968 유래의 폴리펩티드에 대하여 상기 기재된 것들과 유사한 순환 순열 폴리펩티드를 기재하고 있다. 이들 폴리펩티드는 H1N1 A/Puerto Rico/8/1934, H1N1 A/North Carolina/20/99 또는 H1N1 A/California/07/2009로부터의 HA의 것으로부터 유래하며, H1N1 A/Puerto Rico/8/1934(즉, 동일한 서브타입 내)의 마우스의 온건한 시험감염(1LD90) 모델에서 부분적인 보호를 제공할 수 있다. 이들 폴리펩티드로 면역화된 기니 피그 유래의 혈청은 중화 검정에서 시험되는 경우 검출 가능한 중화 수준을 나타내지 않았다.
더욱 최근에, 문헌[Lu et al (2013)]에는 또한, H1N1 A/California/05/2009의 HA로부터 유래한 가용성 스템 도메인 폴리펩티드가 기재되었다. 최종 설계에서, 잔기 54 내지 303(SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링)의 등가물이 결실되었으며(리더 서열, 잔기 1 내지 17도 또한 존재하지 않음), 2개의 돌연변이, 즉, F407D 및 L413D가 단백질의 B-루프 내로 도입되었다. 추가로, 폴리펩티드는 C-말단 삼량체화 도메인(폴드온(foldon))을 함유하였다. 또한, 2개의 단량체간 이황화 가교가 도입되었는데, 하나는 삼량체 폴드온 도메인의 영역 내에, 하나는 위치 430 및 431에 도입되었다. 폴리펩티드는 에스케리키아 콜라이 기반의 무세포 시스템에서 생성되고(이에 따라, 자연 발생 HA 단백질의 부분인 글리칸이 결여됨), 변성 형태로 회수되며, 이는 이용 전에 재폴딩을 필요로 한다. 면역학적 또는 인플루엔자 시험감염으로부터의 보호 데이터가 나타나지 않았다.
최근의 문헌에서, 문헌[Mallajosyula et al (2014)]에는 또한 스템 도메인 폴리펩티드가 보고되어 있다. 이러한 설계에서, H1N1 A/Puerto Rico/8/1934로부터의 HA를 기반으로 하여, HA1 서열의 큰 부분(잔기 42 내지 289, SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링)뿐 아니라 HA2의 N- 및 C-말단 서열의 큰 부분(각각 잔기 344 내지 383 및 457 내지 565)이 결실되었다. 폴리펩티드는 C-말단에 폴드온 삼량체화 도메인을 함유하며, 또한, 에스케리키아 콜라이에서 생성되어, 바이러스 HA 상에 자연 발생 글리칸이 결여되어 있다. 폴리펩티드는 광범위 중화 항체 CR6261, F10 및 FI6v3에 결합한다. 또한, 폴리펩티드를 인플루엔자 시험감염 모델(1LD90의 H1N1 A/Puerto Rico/8/1934)에서 시험하였으며, 사망으로부터 마우스를 보호할 수 있었다. H1N1 A/New Caledonia/20/1999 및 H1N1 A/California/04/2009의 HA로부터 유래한 등가의 폴리펩티드는 또한, 부분적으로 보호할 수 있었다. H5N1 A/Viet Nam/1203/2004로부터 유래한 폴리펩티드는 이러한 시험감염 모델에서 오직 제한된 보호만을 제공하였다. 더욱이, 사용되는 시험감염 모델은 상대적으로 낮은 용량(1-2 LD90)을 투여하여 온건하다.
따라서, 강력한 광범위 중화 항체 반응의 생성을 자극하고, 광범위한 세트의 현재 및 장래의 인플루엔자 바이러스 균주(계절성 및 유행성 둘 모두)에 대한 보호를 제공하여, 특히 인플루엔자의 효과적인 예방 및 치료를 위한 계통발생 그룹 1 및/또는 그룹 2 내의 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스 서브타입에 대한 보호를 제공하는 안전하고 효과적이며 보편적인 백신이 여전히 필요하다.
요약
인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드, 스템 도메인 폴리펩티드의 제공 방법, 이를 포함하는 조성물, 이를 포함하는 백신 및 이들의 이용 방법이 본 명세서에 제공된다.
제1 양태에서, 본 발명은 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 스템 도메인 폴리펩티드로 지칭되는, 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인을 포함하고 구형 헤드가 결여된 신규한 면역원성 폴리펩티드를 제공한다. 폴리펩티드는 대상, 특히 인간 대상에 투여되는 경우 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 막 원위 헤드 도메인에 존재하는 우성 에피토프의 부재 하에, 막 근위 스템 도메인 HA 분자의 보존 에피토프를 면역계에 제시한다. 이를 위하여, 헤드 도메인을 구성하는 HA0 단백질의 일차 서열의 일부를 제거하고, 나머지 아미노산 서열을 직접적으로 또는 일부 구현예에서는 짧은 유연성 연결 서열('링커')을 도입하여 다시 연결하여, 아미노산 사슬의 연속성을 복구시킨다. HA0 분자의 나머지 부분의 고유 3차원 구조를 안정화시키는 특정 돌연변이를 도입함으로써 생성된 서열을 더 변형시킨다. 면역원성 폴리펩티드는 인플루엔자 바이러스의 전장 HA1 도메인을 포함하지 않는다.
본 발명은 (a) 0 내지 50개의 아미노산 잔기의 연결 서열에 의해 HA1 C-말단 스템 세그먼트에 공유적으로 연결된 HA1 N-말단 스템 세그먼트를 포함하는 인플루엔자 헤마글루티닌 HA1 도메인을 포함하는 신규한 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드를 제공하며, 상기 HA1 C-말단 세그먼트는 (b) 인플루엔자 헤마글루티닌 HA2 도메인에 연결되고, HA1 및 HA2 도메인은 H1 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 서브타입으로부터 유래되고;
(c) 폴리펩티드는 HA1 도메인과 HA2 도메인 사이의 접합부에 프로테아제 절단 부위를 포함하지 않고;
(d) 상기 HA1 N-말단 세그먼트는 HA1의 아미노산 1 내지 x, 바람직하게는 HA1의 아미노산 p 내지 x를 포함하고, HA1 C-말단 스템 세그먼트는 HA1의 아미노산 y 내지 C-말단 아미노산을 포함하고, 여기서, x는 SEQ ID NO: 1의 위치 52(또는 다른 헤마글루티닌 내의 동등한 위치)에서의 아미노산이고, p는 SEQ ID NO: 1의 위치 18(또는 다른 헤마글루티닌 내의 동등한 위치)에서의 아미노산이고, y는 SEQ ID NO: 1의 위치 321(또는 다른 헤마글루티닌 내의 동등한 위치)에서의 아미노산이고;
(e) 아미노산 잔기 402 내지 418을 포함하는 영역이 아미노산 서열 X1NTQX2TAX3GKEX4N(H/K)X5E(K/R)(SEQ ID NO: 8)을 포함하고,
여기서, X1은 M, E, K, V, R 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
X2는 F, I, N, T, H, L 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 바람직하게는 I, L 또는 Y이고,
X3은 V, A, G, I, R, F 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 바람직하게는 A, I 또는 F이고,
X4는 F, I, N, S, T, Y, E, K, M 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 바람직하게는 I, Y, M 또는 V이고,
X5는 L, H, I, N, R로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 바람직하게는 I이고;
(f) 위치 337(HA1 도메인)에서의 아미노산 잔기가 I, E, K, V, A 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고,
위치 340(HA1 도메인)에서의 아미노산 잔기가 I, K, R, T, F, N, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고,
위치 352(HA2 도메인)에서의 아미노산 잔기가 D, V, Y, A, I, N, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고,
위치 353(HA2 도메인)에서의 아미노산 잔기가 K, R, T, E, G 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고;
(g) 폴리펩티드가 위치 324에서의 아미노산과 위치 436에서의 아미노산 사이에 이황화 가교를 더 포함하고;
(h) 추가로 아미노산 서열 RMKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO: 20)가 위치 419 내지 433에 도입되거나, 서열 RMKQIEDKIEEIESKQK(SEQ ID NO: 21)가 위치 417 내지 433에 도입된다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 완전한 HA2 도메인, 즉, 막횡단 도메인 및 세포내 서열을 포함하는 HA2 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, HA2 도메인은 절단된다(truncated). 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 HA의 세포내 서열 및 막횡단 도메인을 함유하지 않는다. 특정 구현예에서, HA2 도메인의 위치 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 526, 528, 529 또는 530(또는 이의 등가물)으로부터 HA2 도메인의 C-말단까지의 아미노산 서열이 제거된다.
본 발명에 따르면, HA1 C-말단 스템 세그먼트의 C-말단 아미노산을 HA2 도메인의 N-말단 아미노산에 연결시켜, HA1과 HA2 도메인 사이에 접합부를 형성한다. 본 발명의 폴리펩티드는 HA1 및 HA2 도메인 사이의 접합부에 프로테아제 절단 부위를 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, HA1 C-말단 스템 세그먼트의 C-말단 아미노산 잔기(SEQ ID NO: 1에서 아미노산 343)는 아르기닌(R) 또는 라이신(K) 이외의 임의의 아미노산, 바람직하게는 글루타민(Q)이다.
본 발명의 폴리펩티드는 실질적으로 HA0보다 더 작으며, 바람직하게는 HA의 구형 헤드의 전부 또는 실질적으로 전부가 결여된다. 바람직하게는, 면역원성 폴리펩티드는 360개 이하, 바람직하게는 350, 340, 330, 320, 310, 305, 300, 295, 290, 285, 280, 275 또는 270개 이하의 아미노산 길이이다. 특정 구현예에서, 면역원성 폴리펩티드는 약 250 내지 약 350, 바람직하게는 약 260 내지 약 340, 바람직하게는 약 270 내지 약 330, 바람직하게는 약 270 내지 약 330개 아미노산 길이이다.
본 발명의 폴리펩티드는 그룹 1 교차-중화 항체 CR6261(WO2008/028946호에 개시된 바와 같음) 및/또는 항체 CR9114(WO2013/007770호에 기재된 바와 같음), 즉, 그룹 1 및 그룹 2 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스에 결합하고, 이를 중화시킬 수 있는 항체의 보존된 스템 도메인 에피토프를 포함한다. 따라서, 본 발명의 다른 양태는 HA 스템 도메인 폴리펩티드를 제공하는 것이며, 상기 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드로의 상기 항체 또는 항체들의 결합에 의해 나타난 바와 같이, 항체 CR6261 및/또는 CR9114의 에피토프를 안정적으로 제시한다. 일 구현예에서, 폴리펩티드는 오직 H3 인플루엔자 바이러스에만 결합하는 모노클로널 항체인 CR8020 및 CR8057(WO 2010/130636호에 기재됨)에 결합하지 않는다.
본 명세서에 제공된 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드는 하나의/또는 복수의 인플루엔자 바이러스 A 및/또는 B 균주에 대한, 특히 H1 서브타입의 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 생성할 수 있는 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)에 사용하기에 적합하다. 일 구현예에서, 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드는 계통발생 그룹 1 및/또는 그룹 2의 인플루엔자 A 바이러스 균주에 대하여, 특히 계통발생 그룹 1 및 그룹 2 둘 모두의 인플루엔자 바이러스 균주에 대하여 면역 반응을 생성할 수 있다. 일 구현예에서, 폴리펩티드는 동종 인플루엔자 바이러스 균주에 대하여 면역 반응을 생성할 수 있다. 일 구현예에서, 폴리펩티드는 동일하고/거나 상이한 서브타입의 이종 인플루엔자 바이러스 균주에 대하여 면역 반응을 생성할 수 있다. 추가의 구현예에서, 폴리펩티드는 계통발생 그룹 1 및 그룹 2 둘 모두의 인플루엔자 바이러스 균주 및 인플루엔자 B 바이러스 균주에 대하여 면역 반응을 생성할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 예를 들어, 인플루엔자 바이러스, 특히 계통발생 그룹 1 또는 2의 인플루엔자 A 바이러스 및/또는 인플루엔자 B 바이러스에 의해 야기되는 질병 또는 질환의 독립형 치료 및/또는 예방 및/또는 진단에서, 또는 다른 예방 및/또는 치료적 처치, 예를 들어, (기존의 또는 장래의) 백신, 항바이러스제 및/또는 모노클로널 항체와 병용하여 사용될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 인플루엔자 HA 스템 도메인 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 면역원성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 대상에서의 면역 반응의 유도 방법을 제공하며, 해당 방법은 본 발명에 따른 폴리펩티드 및/또는 핵산 분자 및/또는 벡터를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드 및/또는 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 바람직하게는 면역원성 조성물이다. 본 명세서에 제공되는 조성물은 조성물이 대상, 예를 들어, 마우스, 페럿(ferret) 또는 인간에게 투여되게 하는 임의의 형태로 존재할 수 있다. 구체적인 구현예에서, 조성물은 인간 투여에 적합하다. 폴리펩티드, 핵산 분자 및 조성물은 인플루엔자 바이러스 질병의 예방 및/또는 치료 방법에서 및/또는 진단 목적을 위해 사용될 수 있다. 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 더 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 보강제(adjuvant)를 포함하거나 이와 함께 투여된다.
다른 양태에서, 본 발명은 백신으로 사용하기 위한 폴리펩티드, 핵산 및/또는 벡터를 제공한다. 본 발명은 특히, 계통발생 그룹 1 및/또는 2의 인플루엔자 바이러스 A 서브타입 및/또는 인플루엔자 B 바이러스에 의해 야기되는 질병 또는 질환, 특히 H1 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 의해 야기되는 질병 또는 질환의 예방 및/또는 치료에서 백신으로 사용하기 위한 면역원성 폴리펩티드, 핵산 및/또는 벡터에 관한 것이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 다양한 구현예 및 용도는 본 발명의 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 고유의 삼량체에 존재하는 바와 같은 사전 융합 상태의 HA 단량체의 모델을 보여준다. HA1은 연회색으로 나타나 있으며, HA2는 진회색으로 나타나 있다. 헬릭스 A(CR6261의 에피토프의 중요한 부분) 및 헬릭스 CD(삼량체 경계면의 부분)가 이들 2차 구조 성분을 연결하는 루프와 같이 표시된다. HA1의 C-말단 및 HA2의 N-말단도 또한 나타나 있다. 융합 펩티드는 HA2의 N-말단에 위치한다.
도 2. PCT/EP2014/060997호에 개시된 SEQ ID NO: 65 내지 71 및 SEQ ID NO: 76 내지 78을 발현하는 배양물의 상청액에 대하여 수득된 샌드위치 ELISA 결과. 포획 및 검출 항체가 그래프 위에 표시되어 있다. 미니-HA는 잔기 519 내지 565의 등가물이 RSLVPRGSPGHHHHHH에 의해 대체된 SEQ ID NO: 2의 가용성 버전을 지칭하고; FL-HA-FFH는 위치 520으로부터 C-말단 Flag-트롬빈-폴드온-His 서열(SEQ ID NO: 4)을 함유하는 SEQ ID NO: 1의 가용성 버전을 지칭하고; FL-HA-7xHis는 위치 530으로부터 C-말단 서열 EGRHHHHHHH를 함유하는 SEQ ID NO: 1의 가용성 버전을 지칭한다.
도 3. 위치 419 내지 433에 GCN4 유래 서열 RMKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO: 20)를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드(t2 변이체)를 발현하는 배양물의 상청액에 대하여 수득된 샌드위치 ELISA 결과. 포획 및 검출 항체가 그래프 위에 표시되어 있다. 미니-HA-t2는 위치 419 내지 433에 SEQ ID NO: 20을 도입함으로써 미니-HA로부터 유래되며; FL-HA-FFH, FL-HA-7xHis는 상기와 같다.
도 4. 위치 417 내지 433에 GCN4 유래 서열 RMKQIEDKIEEIESKQK(SEQ ID NO: 21)를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드(t3 변이체)를 발현하는 배양물의 상청액에 대하여 수득된 샌드위치 ELISA 결과. 포획 및 검출 항체가 그래프 위에 표시되어 있다. 미니-HA-t3은 위치 417 내지 433에 SEQ ID NO: 21을 도입함으로써 미니-HA로부터 유래되며; FL-HA-FFH, FL-HA-7xHis는 상기와 같다.
도 5. 정제 절차에서의 최종 단계인 Superdex 200 크기 배제 컬럼으로부터의 s55G7-t2, s127H1-t2 및 s86B4-t2의 용리 프로파일. 크로마토그램 아래의 번호가 붙은 선은 용리 과정 동안 수집된 분획을 나타낸다.
도 6. Superdex 200 크기 배제 컬럼의 용리 동안 수집된 분획의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석. 수는 도 5에 나타낸 분획에 상응한다. 웨스턴 블롯에서의 검출을 위하여, C-말단 his-태그를 인식하는 항체를 사용하였다.
도 7. 광범위 중화 항체 CR9114, CR6261 및 CR8020의 Fab 단편의 존재 및 부재하의 s127H1-t2의 크기 배제 크로마토그래피(Tosoh G2000 분석 컬럼). 개별 단백질 및/또는 복합체의 분자량을 컬럼으로부터의 용리 동안 다중각 광산란에 의해 결정하였으며, 표 8에 열거되어 있다.
도 8. 바이오층 간섭법(biolayer interferometry)을 사용한 모노클로널 항체 CR6261 및 CR9114로의 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2의 결합. 상측 패널은 다양한 농도의 s127H1-t2에 노출된 고정화된 모노클로널 항체에 대한 개별 결합 곡선을 보여주며, 하측 패널은 Kd를 추정하기 위해 사용되는 정상 상태 분석을 보여준다.
도 9. 음성(PBS, 3주 간격으로 3회의 면역화) 및 양성(15 ㎎/㎏ CR6261, 시험감염 1일 전) 대조군에 대한 생존(a), 체중 감소(b) 및 임상 점수(c). 마우스를 마지막 면역화 후 4주에 치명적인 용량(25xLD50)의 H1N1 A/Puererto Rico/8/34로 시험 감염시키고 21일 동안 모니터링하였다. 오차 막대는 95% 신뢰 구간(b) 또는 사분범위(c)를 나타낸다.
도 10. 10 ㎍ 매트릭스(Matrix)-M의 존재 또는 부재하에, 10 ㎍의 s127H1-t2로 면역화된(3주 간격으로 3회의 면역화) 실험군에 대한 생존(a), 체중 감소(b) 및 임상 점수(c). 마우스를 마지막 면역화 후 4주에 치명적인 용량(25xLD50)의 H1N1 A/Puerto Rico/8/34로 시험 감염시키고 21일 동안 모니터링하였다. 비교를 위하여, 음성 대조군(PBS)도 또한 나타나 있다. 오차 막대는 95% 신뢰 구간(b) 또는 사분범위(c)를 나타낸다.
도 11. 항원으로서 s127H1-t2(a) 또는 가용성 형태의 전장 HA(b)를 사용한 음성 대조군 및 실험군의 혈청에 대한 ELISA 결과. 막대는 중간값을 나타낸다.
도 12. 보강된 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2로의 면역화 후에 유도되는 항체는 경쟁 ELISA에서 H1N1 A/Brisbane/59/07로부터의 전장 HA로의 결합을 위해 CR9114와 경쟁할 수 있다(a). 비교를 위하여, 비표지된 CR9114(즉, 자가-경쟁) 및 둘 모두 5 ㎍/㎖ 출발 농도로부터 단계 희석한 비-결합 모노클로널 항체 CR8020 및 CR-JB에 의한 경쟁 수준은 개별 그래프에 나타나 있다.
도 13. 음성(PBS, 3주 간격으로 3회의 면역화) 및 양성(15 ㎎/㎏ CR6261, 시험감염 1일 전) 대조군에 대한 생존(a), 상대 체중 감소(b) 및 임상 점수(c). 마우스를 마지막 면역화 후 4주에 치명적인 용량(25xLD50)의 H1N1 A/Puerto Rico/8/34로 시험 감염시키고 21일 동안 모니터링하였다. 오차 막대는 95% 신뢰 구간(b) 또는 사분범위(c)를 나타낸다.
도 14. 10 ㎍의 매트릭스-M의 존재하에 30 ㎍의 s127H1-t2-cl18long로 1회(a), 2회(b) 또는 3회(c) 면역화시킨 그룹에 대한 생존. 마우스를 마지막 면역화 후 4주에 치명적인 용량(25xLD50)의 H1N1 A/Puerto Rico/8/34로 시험 감염시키고 21일 동안 모니터링하였다. 비교를 위하여, 음성 대조군(PBS)도 또한 나타나 있다.
도 15. 10 ㎍의 매트릭스-M의 존재하에 30 ㎍의 s127H1-t2-cl18long로 1회(a), 2회(b) 또는 3회(c) 면역화시킨 그룹에 대한 상대 체중 변화. 마우스를 마지막 면역화 후 4주에 치명적인 용량(25xLD50)의 H1N1 A/Puerto Rico/8/34로 시험 감염시키고 21일 동안 모니터링하였다. 비교를 위하여, 음성 대조군(PBS)도 또한 나타나 있다. 오차 막대는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 16. 10 ㎍의 매트릭스-M의 존재하에 30 ㎍의 s127H1-t2-cl18long로 1회(a), 2회(b) 또는 3회(c) 면역화시킨 그룹에 대한 임상 점수. 마우스를 마지막 면역화 후 4주에 치명적인 용량(25xLD50)의 H1N1 A/Puerto Rico/8/34로 시험 감염시키고 21일 동안 모니터링하였다. 비교를 위하여, 음성 대조군(PBS)도 또한 나타나 있다. 오차 막대는 사분범위를 나타낸다.
도 17. 음성 대조군 및 항원으로서 s127H1-t2-cl18long(a) 또는 가용성 형태의 전장 HA(b)를 사용한 실험군의 사전-시험감염 혈청(마지막 면역화 후 4주)에 대한 ELISA 결과. 막대는 중간값을 나타낸다.
도 18. 매트릭스-M이 보강된 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2-cl18long으로의 면역화 후에 유도되는 항체는 경쟁 ELISA에서 H1N1 A/Brisbane/59/07로부터의 전장 HA로의 결합을 위해 CR9114와 경쟁할 수 있다(a). 비교를 위하여, 비표지된 CR9114(즉, 자가-경쟁) 및 둘 모두 5 ㎍/㎖ 출발 농도로부터 단계 희석한 비-결합 모노클로널 항체 CR8020에 의한 경쟁 수준은 개별 그래프에 나타나 있다(b). 막대는 중간값을 나타낸다.
도 19. (a) 음성(PBS, 3주의 간격으로 3회의 면역화) 및 양성(15 ㎎/㎏ CR6261, 시험감염 1일 전) 대조군에 대한 생존. 마우스를 마지막 면역화 4주 후에 치명적인 용량(12.5xLD50)의 H5N1 A/Hong Kong/156/97로 시험 감염시켰다. 10 ㎍의 매트릭스-M의 존재하에 30 ㎍의 s127H1-t2로 3회 면역화시킨 그룹에 대한 (b) 생존, (c) 상대 체중 변화 및 (d) 임상 점수 중간값. 오차 막대는 95% 신뢰 구간(c) 또는 사분범위(d)를 나타낸다. 마우스를 마지막 면역화 4주 후에 치명적인 용량(12.5xLD50)의 H5N1 A/Hong Kong/156/97로 시험 감염시키고, 21일 동안 모니터링하였다. 비교를 위하여, 음성 대조군(PBS)도 또한, b, c 및 d에 나타나 있다.
도 20. 항원으로서 다수의 그룹 1(H1, H5 및 H9) 및 그룹 II(H3 및 H7) 인플루엔자 균주로부터의 전장 HA의 것을 사용하여, 실시예 5에 기재된 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2로 3회 면역화시킨 마우스로부터의 혈청에 대한 ELISA 결과. 유도된 항체는 그룹 1로부터의 모든 시험된 FL HA의 것을 인식한다.
도 21. (a) 음성(PBS, 3주 간격으로 3회의 면역화) 및 양성(15 ㎎/㎏ CR6261, 시험감염 1일 전) 대조군에 대한 생존. 마우스를 마지막 면역화 4주 후에 치명적인 용량(12.5xLD50)의 H1N1 A/Brisbane/59/2007로 시험 감염시켰다. 10 ㎍의 매트릭스-M의 존재하에 30 ㎍의 s127H1-t2로 3회 면역화시킨 그룹에 대한 (b) 생존, (c) 상대 체중 변화 및 (d) 임상 점수 중간값. 오차 막대는 95% 신뢰 구간(c) 또는 사분범위(d)를 나타낸다. 마우스를 마지막 면역화 4주 후에 치명적인 용량(12.5xLD50)의 H1N1 A/Brisbane/59/200으로 시험 감염시키고, 21일 동안 모니터링하였다. 비교를 위하여, 음성 대조군(PBS)도 또한, b, c 및 d에 나타나 있다.
도 22. 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2 또는 PBS로 면역화시킨 마우스로부터의 혈청을 사용한 유사입자(pseudoparticle) 중화 검정.
도 23. 항체 의존성 세포독성(ADCC) 대리 검정. 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2로 면역화시킨 마우스로부터의 혈청은 항원의 공급원으로서 H5N1 A/Hong Kong/156/97(a) 또는 H1N1 A/Brisbane/59/07(b)로부터의 FL HA로 트랜스펙션시킨 표적 세포를 사용하여 가장 높은 혈청 농도에서 FcγRIV 신호전달 활성의 30 내지 40배 유도를 나타낸다.
도 24. 실시예 9에 기재된 바와 같은 혈청 전달 및 H5N1 A/Hong Kong/156/97로의 시험감염 후의 마우스의 생존(a) 및 체중 변화%(b).
도 25. 제70일의 공여자 마우스(D) 및 혈청 전달 이전(제-4일) 또는 시험감염일(제0일)의 수여자 마우스(R)의 전장 HA(H1N1 A/Brisbane/59/2007) ELISA 역가. 데이터를 기울기 기반의 가중 평균 접근법을 사용하여 분석하였다. 백색 기호는 LOD에서의 측정을 나타낸다. 막대는 중간값을 나타낸다.
도 26. 실시예 10에 기재된 바와 같은 면역화 및 H1N1 A/NL/602/09로의 시험감염 후의 마우스의 생존(a) 및 체중 변화%(b).
도 27. (a): 실시예 10에 기재된 바와 같이 면역화시킨 마우스의 전장 HA(H1N1 A/Brisbane/59/2007) ELISA 역가. 데이터를 기울기 기반의 가중 평균 접근법을 사용하여 분석하였다. 백색 기호는 LOD에서의 측정을 나타낸다. 막대는 중간값을 나타낸다. (b): 실시예 10에 기재된 바와 같은 마우스의 면역화 후에 수득되는 혈청 IgG CR9114 경쟁 결합. H1N1 A/Brisbane/59/2007로부터의 FL HA를 항원으로 사용하였다. 나타낸 데이터는 그룹 중간값이고, 오차 막대는 사분범위를 나타낸다. 5 ㎍/㎖ 용액으로부터 출발하고, 혈청 시료와 동일한 방식으로 희석한 CR9114 및 CR8020에 대한 데이터가 나타나 있다.
도 28. 총 10472개 클론의 일차 스크린(각각 세트 1 및 2로부터 5544개 및 4928개). 데이터를 실험에 포함된 FL HA 결합 및 발현의 평균에 대하여 정규화시킨다. 또한, FL HA 발현의 50% 초과의 발현을 나타내는 CR9114 샌드위치 검정에서의 상위 20% 클론(패널 a) 및 FL HA에 대하여 관찰되는 신호의 80% 초과의 CR6261로의 결합 신호(패널 b)를 힛트(hit)로 간주하였으며; 이러한 절차는 703개의 힛트를 제공하였다(각각 라이브러리 1 및 2로부터 596개 및 107개).
도 29. 본 발명의 폴리펩티드 (a) 모두 C-말단 Flag-폴드온-his 서열을 함유하는 SEQ ID NO: 158 내지 162 (b) 모두 C-말단 TCS-his 서열을 함유하는 SEQ ID NO: 163 내지 166에 대한 CR9114 샌드위치 ELISA 결과.
도 30. CR9114(CRF9114로 나타냄) 또는 CR6261(CRF6261로 나타냄)의 Fab 단편의 존재 및 부재하의 SEQ ID NO: 158에 대한 SEC MALS 결과. 다중각 광산란 분석으로부터 유래한 분자량은 실시예 12에 제공되어 있으며, 본 발명의 폴리펩티드의 삼량체마다 3개의 Fab 단편과의 복합체 형성을 나타낸다.
도 31. 실시예 13에 기재된 바와 같은 면역화 및 H1N1 A/Brisbane/59/07로의 시험감염 후의 마우스의 생존(a) 및 체중 변화%(b).
도 32. (a): 실시예 13에 기재된 바와 같이 면역화시킨 마우스의 전장 HA(H1N1 A/Brisbane/59/2007) ELISA 역가. 데이터를 기울기 기반의 가중 평균 접근법을 사용하여 분석하였다. 백색 기호는 LOD에서의 측정을 나타낸다. 막대는 중간값을 나타낸다. (b): 실시예 18에 기재된 바와 같은 마우스의 면역화 후에 수득되는 혈청 IgG CR9114 경쟁 결합. H1N1 A/Brisbane/59/2007로부터의 FL HA를 항원으로 사용하였다. 나타낸 데이터는 그룹 중간값이고, 오차 막대는 사분범위를 나타낸다. 5 ㎍/㎖ 용액으로부터 출발하고, 혈청 시료와 동일한 방식으로 희석한 CR9114 및 CR8020에 대한 수준이 나타나 있다.
도 33. 실시예 14에 기재된 바와 같은 면역화 및 H5N1 A/Hon Kong/156/97로의 시험감염 후의 마우스의 생존(a) 및 체중 변화%(b).
도 34. (a): 실시예 14에 기재된 바와 같이 면역화시킨 마우스의 전장 HA(H1N1 A/Brisbane/59/2007) ELISA 역가. 데이터를 기울기 기반의 가중 평균 접근법을 사용하여 분석하였다. 백색 기호는 LOD에서의 측정을 나타낸다. 막대는 중간값을 나타낸다. (b): 실시예 18에 기재된 바와 같은 마우스의 면역화 후에 수득되는 혈청 IgG CR9114 경쟁 결합. H1N1 A/Brisbane/59/2007로부터의 FL HA를 항원으로 사용하였다. 나타낸 데이터는 그룹 중간값이고, 오차 막대는 사분범위를 나타낸다. 5 ㎍/㎖ 용액으로부터 출발하고, 혈청 시료와 동일한 방식으로 희석한 CR9114 및 CR8020에 대한 수준이 나타나 있다.
도 35. 실시예 15에 기재된 바와 같은 면역화 및 H1N1 A/Puerto Rico/8/1934로의 시험감염 후의 마우스의 생존(a) 및 체중 변화%(b).
도 36. (a): 실시예 15에 기재된 바와 같이 면역화시킨 마우스의 전장 HA(H1N1 A/Brisbane/59/2007) ELISA 역가. 데이터를 기울기 기반의 가중 평균 접근법을 사용하여 분석하였다. 백색 기호는 LOD에서의 측정을 나타낸다. 막대는 중간값을 나타낸다. (b): 실시예 18에 기재된 바와 같은 마우스의 면역화 후에 수득되는 혈청 IgG CR9114 경쟁 결합. H1N1 A/Brisbane/59/2007로부터의 FL HA를 항원으로 사용하였다. 나타낸 데이터는 그룹 중간값이고, 오차 막대는 사분범위를 나타낸다. 5 ㎍/㎖ 용액으로부터 출발하고, 혈청 시료와 동일한 방식으로 희석한 CR9114 및 CR8020에 대한 수준이 나타나 있다.
정의
본 발명에 사용되는 바와 같은 용어의 정의가 하기에 제공된다.
본 발명에 따른 아미노산은 20개의 자연 발생(또는 '표준' 아미노산) 또는 이의 변이체, 예를 들어, D-프롤린(프롤린의 D-거울상 이성질체), 또는 자연적으로 단백질에서 관찰되지 않는 임의의 변이체, 예를 들어, 노르류신 중 임의의 것일 수 있다. 표준 아미노산은 이들의 특성에 기초하여 몇몇 그룹으로 분류될 수 있다. 중요한 요인은 전하, 친수성 또는 소수성, 크기 및 작용기이다. 이들 특성은 단백질 구조 및 단백질-단백질 상호작용에 중요하다. 몇몇 아미노산, 예를 들어, 다른 시스테인 잔기에 대하여 공유적 이황화 결합(또는 이황화 가교)을 형성할 수 있는 시스테인, 폴리펩티드 백본에 대하여 환을 형성하는 프롤린 및 다른 아미노산보다 유연성이 더 큰 글리신은 특별한 특성을 갖는다. 표 2는 표준 아미노산의 약어 및 특성을 보여준다.
용어 "아미노산 서열 동일성"은 통상 백분율로 표현되는 정렬된 아미노산 서열의 쌍 간의 동일성 또는 유사성 정도를 말한다. 동일성 백분율은 서열 상동성 최대 백분율을 달성하기 위하여 서열을 정렬하고 필요에 따라 갭을 도입한 후에 펩티드에서의 상응하는 아미노산 잔기에 대하여 동일한(즉, 정렬 내의 주어진 위치에서의 아미노산 잔기가 동일한 잔기임) 또는 유사한(즉, 정렬 내의 주어진 위치에서의 아미노산 치환이 하기에 논의되는 바와 같은 보존적 치환임) 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율이다. 서열 동일성 및 유사성의 백분율을 포함하는 서열 상동성은 육안 검사 및 수학적 계산에 의해서와 같이 당업계에 널리 공지되어 있는 서열 정렬 기술을 사용하여 결정되거나, 또는 더욱 바람직하게는 비교는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 서열 정보를 비교함으로써 행해진다. 예시적인 바람직한 컴퓨터 프로그램에는 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)(GCG; 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 위스콘신(Wisconsin) 패키지 버전 10.0 프로그램, 'GAP'(문헌[Devereux et al. (1984)])이 있다.
"보존적 치환"은 한 부류의 아미노산이 동일한 부류의 다른 아미노산으로 대체되는 것을 말한다. 특정 구현예에서, 보존적 치환은 폴리펩티드의 구조 또는 기능 또는 둘 모두를 변경시키지 않는다. 보존적 치환의 목적을 위한 아미노산의 부류는 소수성(예를 들어, Met, Ala, Val, Leu), 중성 친수성(예를 들어, Cys, Ser, Thr), 산성(예를 들어, Asp, Glu), 염기성(예를 들어, Asn, Gln, His, Lys, Arg), 형태 파괴물질(disrupter)(예를 들어, Gly, Pro) 및 방향족(예를 들어, Trp, Tyr, Phe)을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "질병" 및 "장애"는 대상에서의 질환(condition)을 지칭하기 위하여 상호교환 가능하게 사용된다. 일부 구현예에서, 질환은 바이러스 감염, 특히 인플루엔자 바이러스 감염이다. 특정 구현예에서, 용어 "질병"은 세포 또는 대상에서의 바이러스의 존재로부터 야기되거나, 또는 바이러스에 의한 세포 또는 대상의 침습에 의해 야기되는 병태(pathological state)를 말한다. 특정 구현예에서, 질환은 대상 내의 질병이며, 이의 중증도는 면역원성 조성물의 투여를 통하여 대상에서 면역 반응을 유도함으로써 감소된다.
대상으로의 치료제의 투여와 관련하여 본 명세서에 사용되는 용어 "유효량"은 예방 및/또는 치료 효과(들)를 갖는 치료제의 양을 지칭한다. 특정 구현예에서, 대상으로의 치료제의 투여와 관련하여, "유효량"은 인플루엔자 바이러스 감염, 이와 관련된 질병 또는 증상(symptom)의 중증도의 감소 또는 개선, 예를 들어, 비제한적으로, 인플루엔자 바이러스 감염, 이와 관련된 질병 또는 증상의 기간의 감소, 인플루엔자 바이러스 감염, 이와 관련된 질병 또는 증상의 진행의 예방, 인플루엔자 바이러스 감염, 이와 관련된 질병 또는 증상의 발생 또는 발병 또는 재발의 예방, 한 대상으로부터 다른 대상으로의 인플루엔자 바이러스의 확산의 예방 또는 감소, 대상의 입원 및/또는 입원 기간의 감소, 인플루엔자 바이러스 감염 또는 이와 관련된 질병을 지닌 대상의 생존의 증가, 인플루엔자 바이러스 감염 또는 이와 관련된 질병의 제거, 인플루엔자 바이러스 복제의 억제 또는 감소, 인플루엔자 바이러스 역가의 감소; 및/또는 다른 치료제의 예방 또는 치료 효과(들)의 향상 및/또는 개선을 달성하기에 충분한 치료제의 양을 말한다. 특정 구현예에서, 유효량은 인플루엔자 바이러스 질병으로부터의 완전한 보호를 야기하지 않으나, 미처리 대상에 비하여 더 낮은 역가 또는 감소된 개수의 인플루엔자 바이러스로 이어진다. 인플루엔자 바이러스의 역가, 개수 또는 전체 부하(burden)의 감소의 이익에는 중증도가 더 낮은 감염의 증상, 더 적은 감염의 증상 및 감염과 관련된 질병의 기간의 감소가 포함되나 이들에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 용어 "숙주"는 벡터, 예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터가 도입되는 유기체 또는 세포를 말하는 것으로 의도된다. 유기체 또는 세포는 원핵 또는 진핵일 수 있다. 바람직하게는, 숙주는 분리된 숙주 세포, 예를 들어, 배양 중인 숙주 세포를 포함한다. 용어 "숙주 세포"는 단지 세포가 본 발명의 폴리펩티드의 (과)발현을 위해 변형된 것을 의미한다. 용어 숙주가 특정 대상 유기체 또는 세포뿐 아니라 이러한 유기체 또는 세포의 자손도 지칭하고자 하는 것으로 이해되어야 한다. 특정 변형이 돌연변이 또는 환경 영향 중 어느 하나 때문에 이후의 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 모 유기체 또는 세포와 동일하지 않을 수 있으나, 여전히 본 명세서에 사용되는 용어 "숙주"의 범주 내에 포함된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "포함되는" 또는 "포함하는"은 용어 "비제한적으로"가 뒤따르는 것으로 간주된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "감염"은 세포 또는 대상 내의 바이러스의 배가(multiplication) 및/또는 존재에 의한 침습을 의미한다. 일 구현예에서, 감염은 "활성" 감염, 즉, 바이러스가 세포 또는 대상에서 복제하고 있는 것이다. 이러한 감염은 바이러스에 의해 처음 감염된 세포, 조직 및/또는 기관으로부터 다른 세포, 조직 및/또는 기관으로의 바이러스의 확산을 특징으로 한다. 감염은 또한 잠복 감염, 즉, 바이러스가 복제하고 있지 않은 것일 수도 있다. 특정 구현예에서, 감염은 세포 또는 대상에서의 바이러스의 존재로부터 야기되거나, 또는 바이러스에 의한 세포 또는 대상의 침습에 의해 야기되는 병태를 말한다.
인플루엔자 바이러스는 속 A, B 및 C의 인플루엔자 바이러스 타입으로 분류된다. 본 명세서에 사용되는 용어 "인플루엔자 바이러스 서브타입"은 헤마글루티닌(H) 및 뉴라미다제(N) 바이러스 표면 단백질의 조합을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스 변이체를 말한다. 본 발명에 따르면, 인플루엔자 바이러스 서브타입은 이들의 H 번호에 의해, 예를 들어, "H3 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스", "H3 서브타입의 인플루엔자 바이러스" 또는 "H3 인플루엔자"에 의해, 또는 H 번호 및 N 번호의 조합, 예를 들어, "인플루엔자 바이러스 서브타입 H3N2" 또는 "H3N2"에 의해 지칭될 수 있다. 용어 "서브타입"은 구체적으로 보통 돌연변이로부터 야기되는 각각의 서브타입 내의 모든 개별 "균주"를 포함하며, 천연 분리주 및 인공 돌연변이체 또는 재배열체 등을 포함하여, 상이한 병리학적 프로파일을 보인다. 이러한 균주는 또한 바이러스 서브타입의 다양한 "분리주"로 지칭될 수도 있다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 용어 "균주" 및 "분리주"는 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 인간 인플루엔자 바이러스 균주 또는 분리주에 대한 현행의 명명법은 예를 들어, A/Moscow/10/00(H3N2)와 같이, 보통 괄호 안에 제공되는 HA 및 NA의 항원 설명과 함께, 바이러스의 타입(속), 즉, A, B 또는 C, 처음 분리한 지리학적 위치, 균주 번호 및 분리한 해를 포함한다. 비-인간 균주는 또한 명명에 있어 기원하는 숙주를 포함한다. 인플루엔자 A 바이러스 서브타입은 이들의 계통발생 그룹을 참조하여 더 분류될 수 있다. 계통발생 분석은 2가지 주요 그룹으로의 헤마글루티닌의 세분을 보여준다: 특히, 계통발생 그룹 1("그룹 1" 인플루엔자 바이러스)에서의 H1, H2, H5 및 H9 서브타입 및 특히, 계통발생 그룹 2("그룹 2" 인플루엔자 바이러스)에서의 H3, H4, H7 및 H10 서브타입.
본 명세서에 사용되는 용어 "인플루엔자 바이러스 질병"은 세포 또는 대상에서의 인플루엔자 바이러스, 예를 들어, 인플루엔자 A 또는 B 바이러스의 존재로부터 야기되거나, 또는 인플루엔자 바이러스에 의한 세포 또는 대상의 침습으로부터 야기되는 병태를 지칭한다. 특정 구현예에서, 상기 용어는 인플루엔자 바이러스에 의해 야기되는 호흡기 병을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "핵산"은 DNA 분자(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA) 또는 RNA 분자(예를 들어, mRNA) 및 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산 분자는 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 당업자에 의해 용이하게 인식될 것과 같이 비천연 또는 유도체화 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 표지, 메틸화, 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드 사이 변형, 예를 들어, 비하전 연결기(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 카르바메이트 등), 하전된 연결기(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 펜덴트 부분(예를 들어, 폴리펩티드), 인터칼레이터(intercalator)(예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등), 킬레이터(chelator), 알킬레이터(alkylator) 및 변형된 연결기(예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)를 포함한다. 핵산 서열에 대한 언급은 달리 특정되지 않는 한 이의 상보체를 포함한다. 따라서, 특정 서열을 갖는 핵산 분자에 대한 언급은 이의 상보 서열을 지니는 이의 상보 가닥을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 상보 가닥은 또한 예를 들어, 안티-센스 치료법, 혼성화 프로브 및 PCR 프라이머에 유용하다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, HA에서의 아미노산의 넘버링은 야생형 인플루엔자 바이러스의 HA0에서의 아미노산의 넘버링, 예를 들어, H1N1 인플루엔자 균주 A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO: 1)의 아미노산의 넘버링에 기초한다. 이에 따라, 본 명세서에 사용되는 용어 "HA에서의 위치 "x"의 아미노산"은 특정 야생형 인플루엔자 바이러스, 예를 들어, A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO: 1; 여기서, HA2 도메인의 아미노산은 이탤릭체로 나타나 있음)의 HA0에서의 위치 x의 아미노산에 상응하는 아미노산을 의미한다. 다른 인플루엔자 바이러스 균주 및/또는 서브타입에서의 동등한 아미노산이 다수의 서열 정렬에 의해 결정될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 본 출원에 사용된 넘버링 시스템에서, 1이 비성숙 HA0 단백질(SEQ ID NO: 1)의 N-말단 아미노산을 지칭하는 것을 주목한다. 성숙 서열은 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 위치 18에서 시작한다. 생성 동안 단백질의 수송을 지시하는 리더 서열(또는 신호 서열)(예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 17에 상응)이 일반적으로 예를 들어, 백신에 사용되는 최종 폴리펩티드에 존재하지 않는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 이에 따라, 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 리더 서열이 없는 아미노산 서열을 포함하며, 즉, 아미노산 서열은 신호 서열이 없는 HA0의 아미노산 서열에 기초한다.
"폴리펩티드"는 당업자에게 알려져 있는 바와 같이 아미드 결합에 의해 연결된 아미노산의 폴리머를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 용어는 공유 아미드 결합에 의해 연결된 단일 폴리펩티드 사슬을 지칭할 수 있다. 상기 용어는 또한 비공유 상호작용, 예를 들어, 이온 접촉, 수소 결합, 반데르발스 접촉 및 소수성 접촉에 의해 회합된 다수의 폴리펩티드 사슬을 지칭할 수 있다. 당업자는 상기 용어가 예를 들어, 번역 후 가공, 예를 들어, 신호 펩티드 절단, 이황화 결합 형성, 글리코실화(예를 들어, N-연결 및 O-연결 글리코실화), 프로테아제 절단 및 지질 변형(예를 들어, S-팔미토일화(palmitoylation))에 의해 변형되는 폴리펩티드를 포함하는 것을 인식할 것이다.
"스템 도메인 폴리펩티드"는 자연 발생(또는 야생형) 헤마글루티닌(HA)의 스템 도메인을 구성하는 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 스템 도메인 폴리펩티드는 단일의 폴리펩티드 사슬(즉, 헤마글루티닌 HA0 폴리펩티드의 스템 도메인에 상응) 또는 2개의 폴리펩티드 사슬(즉, 헤마글루티닌 HA2 폴리펩티드와 회합된 헤마글루티닌 HA1 폴리펩티드의 스템 도메인에 상응)이다. 본 발명에 따르면, 스템 도메인 폴리펩티드는 야생형 HA 분자와 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 특히 야생형 HA의 하나 이상의 아미노산 잔기는 특정 야생형 HA에서의 상응하는 위치에서 자연 발생하지 않는 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 본 발명에 따른 스템 도메인 폴리펩티드는 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 연결 서열을 더 포함할 수 있다.
용어 "벡터"는 제2 핵산 분자가 이것이 복제되고 일부 경우에 발현될 숙주로의 도입을 위해 삽입될 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 다시 말하면, 벡터는 이것이 연결된 핵산 분자를 수송할 수 있다. 클로닝 및 발현 벡터는 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"에 의해 고려된다. 벡터는 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체(BAC) 및 효모 인공 염색체(YAC) 및 박테리오파지 또는 식물 또는 동물(인간 포함) 바이러스로부터 유래한 벡터를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 벡터는 제안된 숙주에 의해 인식되는 복제 원점, 및 발현 벡터의 경우에는 숙주에 의해 인식되는 프로모터 및 다른 조절 영역을 포함한다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주에서 자가 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 원점을 갖는 벡터는 박테리아에서 복제할 수 있음). 다른 벡터는 숙주로의 도입시에 숙주의 게놈에 통합되고, 이에 의해, 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다.
바이러스에 관련하여 본 명세서에 사용되는 용어 "야생형"은 우성이며, 자연적으로 유행하고, 전형적인 질병의 출현을 유발하는 인플루엔자 바이러스를 지칭한다.
상세한 설명
인플루엔자 바이러스는 세계 공중 보건에 상당한 영향을 가져, 매년 수백만의 중증의 병의 사례, 수천의 사망 및 상당한 경제적 손실을 야기한다. 현행의 3가 인플루엔자 백신은 백신 균주 및 밀접하게 관련된 분리주에 대하여 강력한 중화 항체 반응을 유도하나, 서브타입 내의 더욱 분기된 균주 또는 다른 서브타입으로 드물게 확대된다. 또한, 적절한 백신 균주의 선택은 많은 시험감염을 제시하며, 준최적의 보호를 빈번하게 야기한다. 추가로, 다음의 유행성 바이러스가 발생할 시기와 장소를 비롯하여 이의 서브타입을 예측하는 것은 현재 불가능하다.
헤마글루티닌(HA)은 중화 항체의 주요 표적인 인플루엔자 A 바이러스 유래의 주요 외피 당단백질이다. 헤마글루티닌은 유입 과정 동안 2가지 주요 기능을 갖는다. 먼저, 헤마글루티닌은 시알산 수용체와의 상호작용을 통하여 표적 세포의 표면으로의 바이러스의 부착을 매개한다. 두 번째로, 바이러스의 세포내 이입 후에, 헤마글루티닌은 이후에 바이러스 및 엔도솜 막의 융합을 촉발시켜, 이의 게놈을 표적 세포의 세포질로 방출시킨다. HA는 숙주 유래의 효소에 의해 절단되어, 이황화 결합에 의해 연결 유지되는 2개의 폴리펩티드를 생성하는 약 500개 아미노산의 큰 엑토도메인을 포함한다. 대다수의 N-말단 단편(HA1, 320 내지 330개 아미노산)은 바이러스-중화 항체에 의해 인식되는 대부분의 결정인자(determinant) 및 수용체 결합 부위를 함유하는 막-원위 구형 도메인을 형성한다. 보다 작은 C-말단 부분(HA2, 약 180개 아미노산)은 구형 도메인을 세포 또는 바이러스 막에 고정시키는 스템-유사 구조를 형성한다. 서브타입 간의 서열 상동성 정도는 HA2 폴리펩티드(51% 내지 80% 상동성)에서보다 HA1 폴리펩티드(서브타입들 간에 34% 내지 59% 상동성)에서 더 작다. 가장 보존된 영역은 절단 부위 근처의 서열, 특히 HA2 N-말단 23개 아미노산이며, 이는 모든 인플루엔자 A 바이러스 서브타입 간에 보존된다(문헌[Lorieau et al., 2010]). 이러한 영역의 부분은 HA 전구체 분자(HA0)에서 표면 루프로서 노출되나, HA0가 HA1 및 HA2로 절단되는 경우 접근불가능하게 된다.
대부분의 중화 항체는 수용체 결합 부위를 둘러싸는 루프에 결합하며, 수용체 결합 및 부착을 방해한다. 이들 루프가 매우 가변적이기 때문에, 이들 영역을 표적화하는 대부분의 항체는 균주에 특이적이어서, 이는 현행의 백신이 이러한 제한된 균주 특이적 면역성을 유도하는 이유를 설명한다. 그러나 최근에, 광범위한 교차 중화능을 지닌 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌에 대한 완전 인간 모노클로널 항체가 생성되었다. 기능적 및 구조적 분석에 의해, 이들 항체가 막 융합 과정을 방해하고, 인플루엔자 HA 단백질의 스템 도메인 내의 고도로 보존된 에피토프에 대해 유도되는 것이 드러났다(문헌[Throsby et al., 2008]; 문헌[Ekiert et al. 2009], WO 2008/028946호, WO2010/130636호, WO 2013/007770호).
이들 항체의 에피토프를 안정적으로 제시하는 스템 도메인 폴리펩티드는 동시 계류 중인 특허 출원 PCT/EP2012/073706호에 기재되어 있다. 본 명세서에 기재된 스템 도메인 폴리펩티드의 적어도 일부는 CR6261 및/또는 CR9114의 에피토프를 안정적으로 제시하며, 마우스에서 면역원성이다. CR6261 및/또는 CR9114의 에피토프를 안정적으로 제시하는 추가의 면역원성 스템 도메인 폴리펩티드는 동시 계류 중인 특허 출원 PCT/EP2014/060997호에 기재되어 있다.
본 발명에 따르면, 이들 에피토프를 제시하는 신규한 HA 스템 도메인 폴리펩티드가 설계된다. 이들 폴리펩티드를 사용하여, 광범위한 인플루엔자 균주에 대한 보호를 유도하는 보편적 에피토프 기반의 백신을 생성할 수 있다. 이전에 기재된 스템 도메인 폴리펩티드에서와 같이, 매우 가변적인 면역우성 부분, 즉, 헤드 도메인을 먼저 전장 HA 분자로부터 제거하여, 미니-HA로도 지칭되는 스템 도메인 폴리펩티드를 생성하여, 광범위 중화 항체에 대한 에피토프가 위치한 스템 도메인을 향해 면역 반응을 재유도시킨다. 상기 언급된 광범위 중화 항체를 사용하여, 신규하게 생성된 분자의 올바른 폴딩(folding)을 조사(probe)하고, 중화 에피토프의 존재를 확인하였다.
본 발명의 신규한 스템 도메인 폴리펩티드는 이전에 기재된 스템 폴리펩티드로의 그들 항체의 결합(PCT/EP2012/073706호 및 PCT/EP2014/060997호)과 비교하여, 항체, 특히 CR6261 및/또는 CR9114의 증가된 결합 및/또는 증가된 다량체화 경향 및 증가된 안정성을 보인다.
본 발명의 스템 도메인 폴리펩티드는 막 원위 헤드 도메인에 존재하는 우성 에피토프의 부재 하에, 막 근위 스템 도메인 HA 분자의 보존된 에피토프를 면역계에 제시할 수 있다. 이를 위해, 헤드 도메인을 구성하는 HA0 단백질의 일차 서열의 부분을 제거하고, 직접적으로 또는 일부 구현예에서는 짧은 유연성 연결 서열('링커')을 도입하여 재연결시켜, 폴리펩티드 사슬의 연속성을 복구시킨다. 생성된 폴리펩티드 서열은 HA0 분자의 나머지 부분의 고유 3차원 구조를 안정화시키는 특정 돌연변이를 도입함으로써 더 변형된다.
본 발명은 (a) 0 내지 50개의 아미노산 잔기의 연결 서열에 의해 HA1 C-말단 스템 세그먼트에 공유적으로 연결된 HA1 N-말단 스템 세그먼트를 포함하는 인플루엔자 헤마글루티닌 HA1 도메인을 포함하는 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드를 제공하며, 상기 HA1 C-말단 세그먼트는
(b) 인플루엔자 헤마글루티닌 HA2 도메인에 연결되고, HA1 및 HA2 도메인은 H1 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 서브타입으로부터 유래되고;
(c) 폴리펩티드는 HA1과 HA2 도메인 사이의 접합부에 프로테아제 절단 부위를 포함하지 않고;
(d) 상기 HA1 N-말단 세그먼트는 HA1의 아미노산 1 내지 x, 바람직하게는 HA1의 아미노산 p 내지 x를 포함하고, HA1 C-말단 스템 세그먼트는 HA1의 아미노산 y 내지 C-말단 아미노산을 포함하고, 여기서, x는 SEQ ID NO: 1의 위치 52(또는 다른 인플루엔자 바이러스 균주의 헤마글루티닌 내의 동등한 위치)에서의 아미노산이고, p는 SEQ ID NO: 1의 위치 18(또는 다른 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 내의 동등한 위치)에서의 아미노산이고, y는 SEQ ID NO: 1의 위치 321(또는 다른 헤마글루티닌 내의 동등한 위치)에서의 아미노산이고;
(e) 아미노산 잔기 402 내지 418을 포함하는 영역이 아미노산 서열 X1NTQX2TAX3GKEX4N(H/K)X5E(K/R)(SEQ ID NO: 8)을 포함하고,
X1은 M, E, K, V, R 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고,
X2는 F, I, N, T, H, L 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 바람직하게는 I, L 또는 Y이고,
X3은 V, A, G, I, R, F 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 바람직하게는 A, I 또는 F이고,
X4는 F, I, N, S, T, Y, E, K, M 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 바람직하게는 I, Y, M 또는 V이고,
X5는 L, H, I, N, R로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 바람직하게는 I이고;
(f) 위치 337(HA1 도메인)에서의 아미노산 잔기가 I, E, K, V, A 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고,
위치 340(HA1 도메인)에서의 아미노산 잔기가 I, K, R, T, F, N, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되고,
위치 352(HA2 도메인)에서의 아미노산 잔기가 D, V, Y, A, I, N, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되고,
위치 353(HA2 도메인)에서의 아미노산 잔기가 K, R, T, E, G 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되고;
(g) 폴리펩티드가 위치 324에서의 아미노산과 위치 436에서의 아미노산 사이에 이황화 가교를 더 포함하고;
(h) 아미노산 서열 RMKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO: 20)가 위치 419 내지 433에 도입되거나, 서열 RMKQIEDKIEEIESKQK(SEQ ID NO: 21)가 위치 417 내지 433에 도입된다.
따라서, 본 발명은 자연 헤마글루티닌 분자의 스템의 3차원 형태를 모방하는 안정한 헤마글루티닌 스템 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드는 전장 HA1 도메인을 포함하지 않는다.
따라서, 폴리펩티드는 실질적으로 HA0보다 더 작으며, 바람직하게는 HA의 구형 헤드의 전부 또는 실질적으로 전부가 결여된다. 바람직하게는, 면역원성 폴리펩티드는 360개 이하, 바람직하게는 350, 340, 330, 320, 310, 305, 300, 295, 290, 285, 280, 275 또는 270개 이하의 아미노산 길이이다. 특정 구현예에서, 면역원성 폴리펩티드는 약 250 내지 약 350개, 바람직하게는 약 260 내지 약 340개, 바람직하게는 약 270 내지 약 330개, 바람직하게는 약 270 내지 약 330개 아미노산 길이이다.
본 발명에 따르면, "HA1 N-말단 세그먼트"는 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 분자의 HA1 도메인의 아미노-말단 부분에 상응하는 폴리펩티드 세그먼트를 지칭한다. HA1 N-말단 폴리펩티드 세그먼트는 HA1 도메인의 위치 1로부터 위치 x까지의 아미노산을 포함하며, 여기서, 위치 x에서의 아미노산은 HA1 내의 아미노산 잔기이다. 용어 "HA1 C-말단 세그먼트"는 인플루엔자 헤마글루티닌 HA1 도메인의 카르복시-말단 부분에 상응하는 폴리펩티드 세그먼트를 지칭한다. HA1 C-말단 폴리펩티드 세그먼트는 HA1 도메인의 위치 y로부터 C-말단 아미노산까지(C-말단 아미노산 포함)의 아미노산을 포함하며, 위치 y에서의 아미노산은 HA1 내의 아미노산 잔기이다. 본 발명에 따르면, y는 x보다 더 커서, HA1 N-말단 세그먼트와 HA1 C-말단 세그먼트 사이, 즉, HA1의 위치 x에서의 아미노산과 위치 y에서의 아미노산 사이의 HA1 도메인의 세그먼트는 결실되고, 일부 구현예에서는 연결 서열에 의해 대체된다. 따라서, 특정 구현예에서, HA1 세그먼트 내의 결실은 위치 x+1에서의 아미노산으로부터 위치 y-1에서의 아미노산까지(위치 y-1에서의 아미노산 포함)의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 신호 서열을 포함하지 않는다. 따라서, 특정 구현예에서, HA1 N-말단 세그먼트는 HA1의 아미노산 p 내지 x를 포함하며, 여기서, p는 성숙 HA 분자의 첫 번째 아미노산이다(예를 들어, SEQ ID NO: 1의 경우에 p=18). 숙련자는 다른 헤마글루티닌 내의 동등한 아미노산을 결정하고, 신호 펩티드(예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 17 또는 다른 H1 인플루엔자 바이러스 균주에서의 동등한 위치(예를 들어, 표 2 참조)) 없이, HA1 도메인의 위치 x까지 본 명세서에 기재된 폴리펩티드를 제조할 수 있을 것이다.
본 발명에 따르면, HA1 N-말단 세그먼트는 HA1 도메인의 아미노산 1 내지 x, 바람직하게는 p 내지 x를 포함하며, 여기서, SEQ ID NO: 1에서 x는 52이고, p는 18이거나, 또는 H1 서브타입의 다른 HA 서열 내의 동등한 아미노산 위치이다.
본 발명에 따르면, HA1 C-말단 폴리펩티드 세그먼트는 H1 HA1 도메인의 위치 y로부터 C-말단 아미노산까지(C-말단 아미노산 포함)의 아미노산을 포함하며, 여기서, y는 321 또는 H1 서브타입의 다른 HA 서열 내의 동등한 아미노산 위치이다.
따라서, 본 발명에 따르면, HA1 N-말단 스템 세그먼트는 HA1의 아미노산 잔기 1 내지 52, 바람직하게는 HA1의 아미노산 잔기 18 내지 52를 포함하며, HA1 C-말단 스템 세그먼트는 HA1의 아미노산 잔기 321 내지 343을 포함한다. 특정 구현예에서, HA1 N-말단 스템 세그먼트는 HA1의 아미노산 잔기 1 내지 52, 바람직하게는 HA1의 아미노산 잔기 18 내지 52로 이루어지며, HA1 C-말단 스템 세그먼트는 HA1의 아미노산 잔기 321 내지 343으로 이루어진다.
본 발명에 따르면, 폴리펩티드는 HA1과 HA2 도메인 사이의 접합부에 프로테아제 절단 부위를 포함하지 않는다. 따라서, 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드는 HA1과 HA2 사이의 접합부에서 프로테아제 절단에 내성이 있다. HA1과 HA2에 걸쳐있는(spanning) Arg(R)-Gly(G) 서열(즉, SEQ ID NO: 1 내의 아미노산 위치 343 및 344)이 트립신 및 트립신-유사 프로테아제에 대한 인식 부위이며, 전형적으로 헤마글루티닌 활성화를 위해 절단되는 것이 당업자에 알려져 있다. 본 명세서에 기재된 HA 스템 도메인 폴리펩티드가 활성화되지 않아야 하기 때문에, 본 발명의 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드는 프로테아제 절단에 대하여 저항성이 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 프로테아제 절단 부위가 제거되어, HA1과 HA2 도메인 사이의 절단 부위에서의 폴리펩티드의 절단이 방지된다. 특정 구현예에서, 프로테아제 절단 부위가 C-말단 HA1 세그먼트의 C-말단 아미노산의 돌연변이 및/또는 HA2 도메인의 N-말단 아미노산의 돌연변이에 의해 제거되어, 프로테아제 절단에 대하여 저항성인 서열이 수득된다. 특정 구현예에서, HA1과 HA2 사이의 절단 부위의 제거는 특정 구현예에서, P1 위치에서의 R(소수의 경우에는 K)에서 Q로의 돌연변이에 의해 달성될 수 있다(예를 들어, 절단 부위(SEQ ID NO: 1에서의 위치 343)의 명명의 설명에 대해서는 문헌[Sun et al, 2010]을 참조한다). 따라서, 특정 구현예에서, HA1 C-말단 스템 세그먼트의 C-말단 아미노산 잔기는 아르기닌(R) 또는 라이신(K) 이외의 임의의 아미노산이다. 특정 구현예에서, HA1 C-말단 아미노산은 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 아스파라긴(N), 아스파르트산(D) 또는 글루탐산(E)이다. 특정 구현예에서, HA1 C-말단 스템 세그먼트의 C-말단 아미노산 잔기는 글루타민(Q)이다.
본 발명에 따르면, 폴리펩티드는 H1 HA, 즉, H1 서브타입의 인플루엔자 바이러스로부터의 아미노산 서열을 포함하는 HA로부터 유래하거나, 그에 기반한다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 예를 들어, 하기 기재된 바와 같은 인플루엔자 바이러스 A/Brisbane/59/2007(H1N1)(SEQ ID NO: 1)로부터의 것과 같은 H1 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스의 HA로부터의 또는 그에 기반한 헤마글루티닌 스템 도메인을 포함한다. H1 서브타입의 HA를 포함하는 다른 인플루엔자 A 바이러스도 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있는 것을 당업자가 이해할 것이다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 표 2로부터 선택되는 인플루엔자 A H1 바이러스의 HA로부터 유래하거나, 그에 기반한 헤마글루티닌 스템 도메인을 포함한다. "유래하는" 또는 "기반한"은 HA1 도메인 및/또는 HA2 도메인의 N-말단 세그먼트 및/또는 C-말단 세그먼트가 당업자에게 알려져 있거나, 이후에 발견되는 H1 서브타입의 자연 발생 인플루엔자 헤마글루티닌의 HA1 및/또는 HA2 도메인의 상응하는 N-말단 및/또는 C-말단 세그먼트와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 의미한다.
본 발명에 따르면, HA2 도메인은 헬릭스 A의 C-말단 잔기를 헬릭스 CD의 N-말단 잔기에 연결하는 HA2 아미노산 서열 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다(도 1). 헬릭스 A의 C-말단 잔기와 헬릭스 CD의 N-말단 잔기를 연결하는 H1 HA2 아미노산 서열은 아미노산 서열 MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)(SEQ ID NO: 7)을 포함하는 인플루엔자 HA의 잔기 402 내지 418(SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링)을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 헬릭스 A의 C-말단 잔기를 헬릭스 CD의 N-말단 잔기에 연결하는 아미노산 서열, 즉, 혈청형 H1의 인플루엔자 HA의 아미노산 잔기 402 내지 418(SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링)을 포함하는 영역은 아미노산 서열 X1NTQX2TAX3GKEX4N(H/K)X5E(K/R)(SEQ ID NO: 8)을 포함한다.
본 발명에 따르면, 위치 402, 406, 409, 413 및 416(넘버링은 SEQ ID NO: 1을 나타냄)에서의 아미노산 중 하나 이상, 즉, 아미노산 X1, X2, X3, X4 및 X5 중 하나 이상은 돌연변이되고, 다시 말하면, 스템 폴리펩티드가 기반으로 하는 야생형 인플루엔자 바이러스 내의 그들 위치에 발생하지 않는 아미노산을 포함한다.
특정 구현예에서, 위치 402에서의 돌연변이된 아미노산, 즉, X1은 M, E, K, V, R 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다.
특정 구현예에서, 위치 406에서의 돌연변이된 아미노산, 즉, X2는 F, I, N, T, H, L 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 바람직하게는 I, L 또는 Y이다.
특정 구현예에서, 위치 409에서의 돌연변이된 아미노산, 즉, X3은 V, A, G, I, R, F 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 바람직하게는 A, I 또는 F이다.
특정 구현예에서, 위치 413에서의 돌연변이된 아미노산, 즉, X4는 F, I, N, S, T, Y, E, K, M 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 바람직하게는 I, Y, M 또는 V이다.
특정 구현예에서, 위치 416에서의 돌연변이된 아미노산, 즉, X5는 L, H, I, N, R로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 바람직하게는 I이다.
이들 돌연변이의 조합도 또한 가능하다.
특정 구현예에서, X1은 M이고, X2는 Y이고, X3은 I이고, X4는 Y이고, X5는 S이다.
본 발명에 따르면, 스템 폴리펩티드는 상응하는 야생형 인플루엔자 바이러스 HA1 및/또는 HA2 도메인, 즉, 스템 폴리펩티드가 기반으로 하는 인플루엔자 바이러스의 아미노산 서열과 비교하여, HA1 도메인 및/또는 HA2 도메인 내에 하나 이상의 추가의 돌연변이, 즉, 아미노산 치환을 포함한다.
특정 구현예에서, HA0 절단 부위(SEQ ID NO: 1에서 잔기 343)에 가까운 하나 이상의 아미노산 잔기가 돌연변이된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 1의 위치 337, 340, 352 또는 353, 또는 다른 인플루엔자 바이러스 내의 동등한 위치에서의 아미노산 잔기 중 하나 이상이 돌연변이되며, 다시 말하면, 스템 폴리펩티드가 기반으로 하는 야생형 인플루엔자 바이러스의 HA의 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에서 발생하지 않는 아미노산에 의해 치환된다. 표 6은 자연 발생 아미노산 변이를 보여준다.
특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 352 또는 다른 인플루엔자 바이러스의 동등한 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 353 또는 다른 인플루엔자 바이러스의 동등한 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 337 또는 다른 인플루엔자 바이러스의 동등한 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 340 또는 다른 인플루엔자 바이러스의 동등한 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
특정 구현예에서, 위치 337(HA1 도메인)에서의 돌연변이된 아미노산 잔기는 I, E, K, V, A 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 위치 340(HA1 도메인)에서의 돌연변이된 아미노산 잔기는 I, K, R, T, F, N, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 위치 352(HA2 도메인)에서의 돌연변이된 아미노산 잔기는 D, V, Y, A, I, N, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 위치 353(HA2 도메인)에서의 돌연변이된 아미노산 잔기는 K, R, T, E, G 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 돌연변이된 아미노산은 예를 들어, SEQ ID NO: 6에서의 I340N에서와 같이, 컨센서스 N-글리코실화, 예를 들어, N-X-T/S(여기서, X는 P를 제외한 임의의 자연 발생 아미노산임)를 서열에 도입한다.
특정 구현예에서, 돌연변이된 아미노산은 동일한 서브타입의 서열에서 자연적으로 발생하지 않는 아미노산이다.
특정 구현예에서, 위치 337(HA1 도메인)에서의 돌연변이된 아미노산 잔기는 K이다.
특정 구현예에서, 위치 340(HA1 도메인)에서의 돌연변이된 아미노산 잔기는 K이다.
특정 구현예에서, 위치 352(HA2 도메인)에서의 돌연변이된 아미노산 잔기는 F이다.
특정 구현예에서, 위치 353(HA2 도메인)에서의 돌연변이된 아미노산 잔기는 T이다.
본 명세서에서, 아미노산의 넘버링이 H1 HA0에서의 아미노산의 넘버링, 특히, H1N1 인플루엔자 균주 A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO: 1)의 아미노산의 넘버링에 기반하는 것을 다시 주목한다. 숙련자는 다른 인플루엔자 바이러스의 HA에서 동등한(또는 상응하는) 아미노산을 결정할 수 있을 것이며, 이에 따라, 동등한 돌연변이를 결정할 수 있을 것이며, 예를 들어, 상이한 H1 인플루엔자 바이러스의 서열 정렬에 대해서는 표 2를 참조한다.
본 발명에 따르면, 폴리펩티드는 위치 324에서의 아미노산과 위치 436에서의 아미노산 사이에 이황화 가교를 더 포함한다. 따라서, 본 발명에 따르면, 적어도 하나의 이황화 가교는 스템 도메인 폴리펩티드 내에, 바람직하게는 H1 A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO: 1)에서 위치 324와 436(또는 이의 동등한 위치)의 아미노산 사이에 도입된다. 이에 따라, 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 HA1 도메인에 돌연변이 R324C 및 HA2 도메인에 T436C를 더 포함한다. 클러스털, 머슬 등과 같은 적합한 알고리즘을 사용하여 서열을 정렬시킴으로써 동등한 위치가 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 조작된 이황화 가교는 적어도 하나(다른 것이 이미 시스테인이라면), 그러나 통상 공간적으로 가까운 2개의 잔기를 시스테인으로 돌연변이시킴으로써 생성되며, 이 시스테인은 자발적으로 또는 활성 산화에 의해 이들 잔기의 황 원자 간에 공유 결합을 형성할 것이다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 HA1 및 HA2 도메인이 유래한 HA의 아미노산 서열에 비하여 HA1 및/또는 HA2 도메인에 하나 이상의 추가의 돌연변이를 더 포함한다. 따라서, 스템 폴리펩티드의 안정성은 더욱 증가된다.
본 발명자들은 이전에, 백신접종 개체 유래의 일차 인간 B-세포로부터 분리된 광범위 중화 항체를 확인하였으며, 이중 일부는 그룹 1에 대해 특이적이며(예를 들어, CR6261, WO 2008/028946호에 기재된 바와 같음) 이중 일부는 그룹 2 인플루엔자 바이러스(예를 들어, WO 2010/130636호에 기재된 바와 같은 CR8020)에 대하여 특이적이었다. 이들 모노클로널 항체의 에피토프의 상세한 분석에 의해, 이들 특정 항체의 교차 반응성의 결여의 이유가 드러났다. 둘 모두의 경우에, 상이한 위치 상의 그룹 1 또는 그룹 2 HA 분자에서의 글리칸의 존재는 항체가 그룹-특이적인 사실을 적어도 부분적으로 설명한다. 하기에 기재된 바와 같이, 많은 그룹 1 및 2 HA 분자와 교차 반응성인 CR9114-유사 항체의 동정으로, 인간 면역계가 인플루엔자 바이러스에 대한 매우 광범위한 중화 항체를 유도할 수 있는 것이 명백해진다. 그러나 연간 백신접종 계획의 필요를 고려해볼 때, 이들 항체는 서브타입 H1 및/또는 H3의 (계절성) 인플루엔자 바이러스로의 감염 또는 백신접종 후에 명백하게 유도되지 않거나, 매우 낮은 정도로만 유도된다.
본 발명에 따르면, CR6261 및/또는 CR9114의 특정 에피토프를 모방하며, 예를 들어, 단독으로 또는 다른 예방적 및/또는 치료적 처치와 병용하여 생체내에 투여되는 경우 교차 중화 항체를 유도하기 위한 면역원성 폴리펩티드로서 사용될 수 있는 폴리펩티드가 제공된다. "교차 중화 항체"에서, 항체는 계통발생 그룹 1의 인플루엔자 A 바이러스의 적어도 2가지, 바람직하게는 적어도 3가지, 4가지 또는 5가지의 상이한 서브타입 및/또는 계통발생 그룹 2의 인플루엔자 A 바이러스의 적어도 2가지, 바람직하게는 적어도 3가지, 4가지 또는 5가지의 상이한 서브타입 및/또는 인플루엔자 B 바이러스의 적어도 2가지의 상이한 서브타입, 특히, CR6261 및 CR9114에 의해 중화되는 적어도 모든 바이러스 균주를 중화시킬 수 있음을 의미한다.
본 발명의 폴리펩티드는 스템-결합 인플루엔자 중화 항체 CR6261 및/또는 CR9114의 에피토프를 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 이에 따라 항체 CR6261 및/또는 CR9114에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 항체 CR8020 및/또는 CR8057에 결합하지 않는다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, CR6261은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; CR9114는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. CR8057은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. CR8020은 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
상기 기재된 바와 같이, 폴리펩티드는 0 내지 50개의 아미노산 잔기의 연결 서열에 의해 HA1 C-말단 스템 세그먼트에 공유적으로 연결되는 HA1 N-말단 스템 세그먼트를 포함하는 인플루엔자 헤마글루티닌 HA1 도메인을 포함한다. 연결 서열은 존재하는 경우, 자연 발생 또는 야생형 HA에서는 발생하지 않는다. 특정 구현예에서, 링커는 하나의 아미노산 잔기, 2개 이하의 아미노산 잔기, 3개 이하의 아미노산 잔기, 4개 이하의 아미노산 잔기, 5개 이하의 아미노산 잔기, 10개 이하의 아미노산 잔기, 15개 이하의 아미노산 잔기 또는 20개 이하의 아미노산 잔기 또는 30개 이하의 아미노산 잔기 또는 40개 이하의 아미노산 잔기 또는 50개 이하의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드이다. 특정 구현예에서, 연결 서열은 G, GS, GGG, GSG, GSA, GSGS, GSAG, GGGG, GSAGS, GSGSG, GSAGSA, GSAGSAG 및 GSGSGSG로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다.
특정 구현예에서, HA1 N-말단 세그먼트는 HA1 C-말단 세그먼트에 직접 연결되며, 즉, 폴리펩티드는 연결 서열을 포함하지 않는다.
인플루엔자 HA는 그의 고유 형태가 세포 또는 바이러스 막 상에 삼량체로서 존재한다. 특정 구현예에서, 세포내 및 막횡단 서열을 제거하여, 세포에서의 발현 후에 분비되는(가용성) 폴리펩티드가 생성되게 한다. HA를 발현하고, 그의 분비된 엑토도메인을 정제하기 위한 방법이 기재된다(예를 들어, 문헌[Dopheide et al 2009]; 문헌[Ekiert et al 2009, 2011]; 문헌[Stevens et al 2004, 2006]; 문헌[Wilson et al 1981] 참조). 당업자는 이들 방법이 또한 분비된(가용성) 폴리펩티드의 발현을 달성하기 위하여 본 발명의 스템 도메인 폴리펩티드에 직접 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 이들 폴리펩티드도 또한 본 발명에 포함된다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 완전한 HA2 도메인을 포함하여, 이에 따라, 막횡단 및 세포내 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 HA의 세포내 서열 및 막횡단 도메인을 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 절단된 HA2 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포내 및 막횡단 서열, 예를 들어, HA2 도메인의 위치 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 526, 528, 529 또는 530(또는 그의 동등한 위치)으로부터 HA2 도메인의 C-말단까지(SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링)의 아미노산 서열을 제거하여, 세포에서의 발현 후에 가용성 폴리펩티드를 생성하였다.
특정 구현예에서, 위치 519로부터 C-말단 아미노산까지의 HA2 도메인의 C-말단 부분이 결실된다. 추가의 구현예에서, 위치 530으로부터 C-말단 아미노산까지의 HA2 도메인의 C-말단 부분이 결실된다.
선택적으로, his-태그 서열(HHHHHH(SEQ ID NO: 15) 또는 HHHHHHH(SEQ ID NO: 16))은 정제 목적을 위하여 (선택적으로 절단된) HA2 도메인에 연결될 수 있으며, 선택적으로, 링커를 통해 연결될 수 있다. 선택적으로, 링커는 단백질 가수분해 절단 부위를 함유하여, 정제 후에 his-태그를 효소에 의해 제거할 수 있다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 선택적으로 링커를 통해 연결되는, 삼량체 구조를 형성하는 것으로 알려져 있는 서열, 즉, GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO: 3)을 HA2의 C-말단에 도입함으로써 더 안정화된다. 따라서, 특정 구현예에서, HA2 도메인의 C-말단 부분은 선택적으로 링커를 통해 연결되는 아미노산 서열 GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO: 3)에 의해 대체된다. 링커는 선택적으로 당업자에게 널리 알려져 있는 프로토콜에 따라 이후의 처리를 위한 절단 부위를 함유할 수 있다. 가용성 형태의 정제를 용이하게 하기 위하여, 선택적으로 짧은 링커를 통해 연결되는 태그 서열, 예를 들어, his 태그(HHHHHH(SEQ ID NO: 15) 또는 HHHHHHH(SEQ ID NO: 16)) 또는 FLAG 태그(DYKDDDDK)(SEQ ID NO: 22) 또는 이들의 조합을 부가할 수 있다. 링커는 선택적으로 당업자에게 널리 알려져 있는 프로토콜에 따라 이후의 처리를 위한 단백질 가수분해 절단 부위(의 부분), 예를 들어, IEGR (SEQ ID NO: 24)(인자 X) 또는 LVPRGS(SEQ ID NO: 23)(트롬빈)를 함유할 수 있다. 또한, 처리된 단백질은 본 발명에 포함된다.
특정 구현예에서, 위치 519 내지 565의 HA2 도메인의 C-말단 부분이 결실되고(SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링), SGRDYKDDDDKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH(SEQ ID NO: 4)에 의해 대체된다.
특정 구현예에서, 위치 530 내지 565의 HA2 도메인의 C-말단 부분이 결실되고(SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링), SGRDYKDDDDKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH(SEQ ID NO: 4)에 의해 대체된다.
고유 HA는 세포 표면상에 삼량체로서 존재한다. 함께 삼량체를 유지시키는 개별 단량체 간의 대부분의 상호작용은 헤드 도메인 내에 위치하는 한편, 스템 도메인에서, 삼량체화는 삼량체 꼬인 코일(coiled coil) 모티프의 형성에 의해 매개된다. 헤드의 제거 후에, 삼차 구조는 불안정화되고, 이에 따라, 단백질 안정성을 증가시키기 위해 변형이 필요하다. 헬릭스 CD의 나선 경향을 강화시킴으로써, 더욱 안정한 단백질이 생성될 수 있다.
동시-계류 중인 출원 PCT/EP2014/060997호에 기재된 폴리펩티드에서, 효모 전사 활성화 단백질 GCN4로부터 유래하고, 삼량체화하는 것으로 알려져 있는 서열 MKQIEDKIEEIESKQ(SEQ ID NO: 5)를 위치 419 내지 433(그의 동등한 위치)에서 CD 헬릭스에 도입하였다. 이러한 서열은 나선형 2차 구조를 형성하는 경향이 높고, 이러한 방식으로 본 발명의 폴리펩티드의 전체 안정성을 향상시킬 수 있다.
본 발명에 따르면, 놀랍게도, 폴리펩티드의 안정성 및 다량체화 상태가 본 발명의 폴리펩티드의 일차 서열에서의 GCN4 유래 서열의 정확한 위치 및 서열에 좌우되는 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명에 따르면, 서열 RMKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO: 20)가 위치 419 내지 433(SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링)에 도입되거나, 서열 RMKQIEDKIEEIESKQK(SEQ ID NO: 21)는 위치 417 내지 433에 도입된다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 글리코실화된다.
본 발명으로 이어지는 연구에서, 예를 들어, 동시-계류 중인 특허 출원 PCT/EP2014/060997호에 기재된 s74H9(SEQ ID NO: 65), s127H1(SEQ ID NO: 66), s71H2(SEQ ID NO: 71), s86B4(SEQ ID NO: 67), s115A1(SEQ ID NO: 70), s2201C9(SEQ ID NO: 77), s55G7(SEQ ID NO: 68), s113E7(SEQ ID NO: 78), s6E12(SEQ ID NO: 69), s181H9(SEQ ID NO: 76)를 당업자에게 널리 알려져 있는 분자 생물학 기술을 사용하여 변형시켜, 위치 419 내지 433에 서열 RMKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO: 20)를 함유하는 서열 s74H9-t2(SEQ ID NO: 93), s127H1-t2(SEQ ID NO: 91), s71H2-t2(SEQ ID NO: 97), s86B4-t2(SEQ ID NO: 92), s115A1-t2(SEQ ID NO: 96), s220C9-t2(SEQ ID NO: 99), s55G7-t2(SEQ ID NO: 95), s113E7-t2(SEQ ID NO: 100), s6E12-t2(SEQ ID NO: 94), s181H9-t2(SEQ ID NO: 98)를 생성하였다.
유사한 방식으로, 위치 417 내지 433에 서열 RMKQIEDKIEEIESKQK(SEQ ID NO: 21)를 함유하는 폴리펩티드 s74H9-t3(SEQ ID NO: 123), s127H1-t3(SEQ ID NO: 121), s71H2-t3(SEQ ID NO: 127), s86B4-t3(SEQ ID NO: 122), s115A1-t3(SEQ ID NO: 126), s2201C9-t3(SEQ ID NO: 129), s55G7-t3(SEQ ID NO: 125), s113E7-t3(SEQ ID NO: 130), s6E12-t3(SEQ ID NO: 124), s181H9-t3(SEQ ID NO: 128)을 생성하였다.
본 발명의 폴리펩티드는 이전에 기재된(PCT/EP2012/073706호 및 PCT/EP2014/060997호) 스템 폴리펩티드에 비하여, 인플루엔자 항체, 특히 CR6261 및/또는 CR9114의 결합 증가 및/또는 다량체화 경향 증가 및/또는 안정성 증가를 보여준다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 아미노산 서열:
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX 1 PSX 2 QSQGLFGAIAGX 3 X 4 EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX 5 NTQX 6 TAX 7 GKEX 8 NKX 9 ERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVSGRDYKDDDDKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH(SEQ ID NO: 145)를 포함하며,
여기서, X1은 E, I, K, V, A 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X2는 I, K, R, T, F, N, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X3은 D, F, V, Y, A, I, N, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X4는 I, K, R, T, E, G 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X5는 M, E, K, V, R, T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X6은 F, I, N, S, T, Y, H 및 L로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X7은 A, G, I, R, T, V, F 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X8은 F, I, N, S, T, Y, G, E, K, M 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X9는 H, I, L, N, R 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 아미노산 서열:
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX 1 PSX 2 QSQGLFGAIAGX 3 X 4 EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX 5 NTQX 6 TAX 7 GKEX 8 NKX 9 ERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDG(SEQ ID NO: 146)를 포함하고,
여기서, X1은 E, I, K, V, A 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X2는 I, K, R, T, F, N, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X3은 D, F, V, Y, A, I, N, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X4는 I, K, R, T, E, G 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X5는 M, E, K, V, R, T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X6은 F, I, N, S, T, Y, H 및 L로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X7은 A, G, I, R, T, V, F 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X8은 F, I, N, S, T, Y, G, E, K, M 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X9는 H, I, L, N, R 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 아미노산 서열:
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX 1 PSX 2 QSQGLFGAIAGX 3 X 4 EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX 5 NTQX 6 TAX 7 GKEX 8 NKX 9 ERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG(SEQ ID NO: 147)를 포함하고,
여기서, X1은 E, I, K, V, A 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X2는 I, K, R, T, F, N, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X3은 D, F, V, Y, A, I, N, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X4는 I, K, R, T, E, G 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X5는 M, E, K, V, R, T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X6은 F, I, N, S, T, Y, H 및 L로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X7은 A, G, I, R, T, V, F 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X8은 F, I, N, S, T, Y, G, E, K, M 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X9는 H, I, L, N, R 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 아미노산 서열:
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX 1 PSX 2 QSQGLFGAIAGX 3 X 4 EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX 5 NTQX 6 TAX 7 GKEX 8 NKX 9 ERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI(SEQ ID NO: 148)를 포함하고,
여기서, X1은 E, I, K, V, A 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X2는 I, K, R, T, F, N, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X3은 D, F, V, Y, A, I, N, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X4는 I, K, R, T, E, G 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X5는 M, E, K, V, R, T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X6은 F, I, N, S, T, Y, H 및 L로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X7은 A, G, I, R, T, V, F 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X8은 F, I, N, S, T, Y, G, E, K, M 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X9는 H, I, L, N, R 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다.
특정 구현예에서, SEQ ID NO: 145 내지 148에서 X1은 K이고, X2는 K이고, X3은 F이고, X4는 T이고, X5는 M이고, X6은 Y이고, X7은 I이고, X8은 Y이고, X9는 S이다.
인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드는 하기에 기재된 기술을 포함하는 숙련자에게 적합한 것으로 여겨지는 임의의 기술에 따라 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명의 면역원성 폴리펩티드는 당업계에 공지되어 있는 표준 방법에 의해 DNA 서열로서 합성되고, 적합한 제한 효소와 당업계에 공지되어 있는 방법을 사용하여 클로닝되고, 이후에 시험관내 또는 생체내에서 발현될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 벡터, 예를 들어 플라스미드의 일부이다. 이러한 벡터는 당업자에게 널리 공지되어 있는 방법에 의해 용이하게 조작될 수 있으며, 예를 들어, 원핵 및/또는 진핵 세포에서 복제될 수 있도록 설계될 수 있다. 또한, 많은 벡터는 진핵 세포의 형질전환을 위해 직접적으로 또는 그것으로부터 분리된 요망되는 단편의 형태로 사용될 수 있으며, 전체가 또는 일부가 이러한 세포의 게놈 내로 통합되어, 이들의 게놈에 요망되는 핵산을 포함하는 안정한 숙주 세포가 초래될 것이다. 사용되는 벡터는 DNA를 클로닝하는 데 적합하고 대상 핵산의 전사에 사용될 수 있는 임의의 벡터일 수 있다. 숙주 세포가 사용되는 경우, 벡터가 통합 벡터인 것이 바람직하다. 대안적으로, 벡터는 에피솜 복제 벡터일 수 있다.
당업자는 적합한 발현 벡터를 선택하고, 본 발명의 핵산 서열을 기능적 방식으로 삽입할 수 있다. 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 발현을 수득하기 위하여, 발현을 추진할 수 있는 서열을 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 기능적으로 연결하여, 발현 가능한 형식으로 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 핵산 분자가 초래될 수 있는 것이 당업계에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 프로모터 서열은 발현되어야 하는 서열의 업스트림에 배치된다. 많은 발현 벡터, 예를 들어, 인비트로겐(Invitrogen)의 pcDNA 및 pEF 벡터 시리즈, 비디 사이언스즈(BD Sciences)로부터의 pMSCV 및 pTK-Hyg, 스트라타진(Stratagene)으로부터의 pCMV-Script 등이 당업계에서 이용 가능하며, 이는 적합한 프로모터 및/또는 전사 터미네이터 서열, 폴리A 서열 등을 수득하기 위해 사용될 수 있다. 대상 폴리펩티드를 암호화하는 서열이 암호화된 폴리펩티드의 전사 및 번역을 관리하는 서열에 관하여 적절하게 삽입되는 경우, 생성된 발현 카세트는 발현으로 지칭되는 대상 폴리펩티드의 생성에 유용하다. 발현을 추진하는 서열은 프로모터, 인핸서(enhancer) 등 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 이들은 숙주 세포에서 작용할 수 있어서, 이에 의해 이들에 기능적으로 연결된 핵산 서열의 발현을 추진해야 한다. 당업자는 다양한 프로모터가 숙주 세포에서의 유전자의 발현을 수득하기 위해 사용될 수 있음을 알고 있다. 프로모터는 구성형(constitutive)이거나 조절형(regulated)일 수 있으며, 바이러스, 원핵 또는 진핵 공급원을 포함하는 다양한 공급원으로부터 수득되거나 인공적으로 설계될 수 있다. 대상 핵산의 발현은 천연 프로모터 또는 이의 유도체로부터, 또는 전적으로 이종성인 프로모터로부터 이루어질 수 있다(문헌[Kaufman, 2000]). 진핵 세포에서의 발현을 위해 널리 공지되어 있고 많이 사용되는 일부 프로모터는 바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스로부터 유래한 프로모터, 예를 들어, E1A 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV)로부터 유래한 프로모터, 예를 들어, CMV 즉시 조기(immediate early, IE) 프로모터(본 명세서에서 CMV 프로모터로 지칭)(예를 들어, 인비트로겐사의 pcDNA로부터 수득 가능), 시미안 바이러스(Simian Virus) 40(SV40)으로부터 유래된 프로모터(문헌[Das et al, 1985]) 등을 포함한다. 적합한 프로모터, 예를 들어, 메탈로티오네인(MT) 프로모터, 연장 인자 1α(EF-1α) 프로모터(문헌[Gill et al., 2001]), 유비퀴틴 C 또는 UB6 프로모터(문헌[Gill et al., 2001]), 액틴 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 열 충격 프로모터 등은 또한 진핵 세포로부터 유래할 수도 있다. 프로모터 기능 및 프로모터 세기에 대한 시험은 당업자에게 통상적인 상황이며, 일반적으로 예를 들어, 프로모터 서열 뒤의 시험 유전자, 예를 들어, lacZ, 루시퍼라제, GFP 등의 클로닝과 시험 유전자의 발현에 대한 시험을 포함할 수 있다. 물론, 프로모터를 그 안의 서열의 결실, 부가, 돌연변이에 의해 변경하고, 작용성에 대해 시험하여, 신규한, 약독화된 또는 개선된 프로모터 서열을 찾을 수 있다. 본 발명에 따르면, 선택된 진핵 세포에서 높은 전사 수준을 제공하는 강력한 프로모터가 바람직하다.
작제물은 당업자에게 널리 공지되어 있는 방법을 사용하여 진핵 세포(예를 들어, 식물, 진균, 효모 또는 동물 세포) 또는 에스케리키아 콜라이와 같은 적합한 원핵 발현 시스템으로 트랜스펙션될 수 있다. 일부 경우에, 적합한 '태그' 서열(예를 들어, 비제한적으로, his-, myc-, strep- 또는 flag-태그) 또는 완전한 단백질(예를 들어, 비제한적으로, 말토스 결합 단백질 또는 글루타티온 S 트랜스퍼라제)을 본 발명의 서열에 부가하여, 세포 또는 상청액으로부터 폴리펩티드의 정제 및/또는 확인을 가능하게 할 수 있다. 선택적으로, 특정 단백질 가수분해 부위를 함유하는 서열을 포함시켜, 이후에 단백질 가수분해에 의해 태그를 제거할 수 있다.
정제된 폴리펩티드를 당업계에 공지되어 있는 분광 방법(예를 들어, 원편광 분광법, 푸리에 변환 적외 분광법 및 NMR 분광법 또는 X-선 결정학)에 의해 분석하여, 헬릭스 및 베타 시트와 같은 요망되는 구조의 존재를 조사할 수 있다. ELISA, Octet 및 FACS 등을 사용하여, 이전에 기재된 광범위 중화 항체(CR6261, CR9114, CR8057)로의 본 발명의 폴리펩티드의 결합을 조사할 수 있다. 따라서, 올바른 형태를 갖는 본 발명에 따른 폴리펩티드가 선택될 수 있다.
본 발명은 추가로 치료적 유효량의 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 핵산 중 적어도 하나를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 면역원성 조성물은 바람직하게는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함한다. 본 발명의 문맥에서, 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 담체가 사용되는 용량 및 농도에서, 그들이 투여되는 대상에 원치 않는 또는 유해한 효과를 야기하지 않을 것을 의미한다. 이러한 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제는 당업계에 널리 공지되어 있다(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]]; 문헌[Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]]; 및 문헌[Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]] 참조). 용어 "담체"는 조성물과 함께 투여되는 희석제, 보강제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 염수 용액 및 덱스트로스 및 글리세롤 수용액이 특히 주사 가능한 용액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 정확한 제형은 투여 방식을 따라야 한다. 폴리펩티드 및/또는 핵산 분자는 바람직하게는 멸균 용액으로서 제형화되고 투여된다. 멸균 용액은 멸균 여과에 의해 또는 그 자체가 당업계에 공지되어 있는 기타 방법에 의해 제조된다. 이어서, 용액은 동결건조되거나, 약제 투여 컨테이너에 채워질 수 있다. 용액의 pH는 일반적으로 pH 3.0 내지 9.5, 예를 들어, pH 5.0 내지 7.5 범위이다.
본 발명은 또한 인플루엔자 HA 단백질에 대한 면역 반응의 유도에 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 인플루엔자 HA 스템 도메인 폴리펩티드, 핵산 분자 및/또는 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 대상에서의 면역 반응의 유도 방법에 관한 것이며, 해당 방법은 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 핵산 분자 및/또는 면역원성 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따른 대상은 바람직하게는 감염성 질환-유발 물질, 특히 인플루엔자 바이러스에 감염될 수 있거나, 다르게는 면역 반응의 유도로부터 이익을 얻을 수 있는 포유류이며, 예를 들어, 이러한 대상은 설치류, 예를 들어, 마우스, 페럿, 애완동물 또는 가축, 또는 비인간 영장류 또는 인간이다. 바람직하게는 대상은 인간 대상이다. 이에 따라, 본 발명은 대상에서의, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드, 핵산 및/또는 면역원성 조성물을 사용한 특히 그룹 1 및/또는 그룹 2 인플루엔자 A 바이러스, 예를 들어, H1, H2, H3, H4, H5, H7 및/또는 H10 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스 및/또는 인플루엔자 B 바이러스의 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA)에 대한 면역 반응의 유도 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 폴리펩티드, 핵산 및/또는 면역원성 조성물을 사용하여 대상에서 H1 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 유도되는 면역 반응은 그룹 1 및/또는 그룹 2 인플루엔자 A 바이러스 서브타입 및/또는 인플루엔자 B 바이러스에 의해 야기되는 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하고/거나 치료하는데 효과적이다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드, 핵산 및/또는 면역원성 조성물에 의해 유도되는 면역 반응은 인플루엔자 A 및/또는 B 바이러스 중 2, 3, 4, 5 또는 6가지 서브타입에 의해 야기되는 인플루엔자 A 및/또는 B 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하는데 효과적이다. 일부 구현예에서, 유도되는 면역 반응은 H1 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 의해 야기되는 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하고/거나 치료하는데 유효하다.
작은 단백질 및/또는 핵산 분자가 언제나 강력한 면역 반응을 효과적으로 유도하는 것이 아닌 것이 널리 공지되어 있기 때문에, 보강제를 첨가함으로써 폴리펩티드 및/또는 핵산 분자의 면역원성을 증가시키는 것이 필요할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 면역원성 조성물은 보강제를 포함하거나 보강제와 병용하여 투여된다. 본 명세서에 기재된 조성물과 병용하여 투여하기 위한 보강제는 상기 조성물의 투여 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 투여될 수 있다. 적합한 보강제의 예에는 알루미늄 염, 예를 들어, 수산화알루미늄 및/또는 인산알루미늄; 스쿠알렌-워터(squalene-water) 에멀젼, 예를 들어, MF59를 비롯한 오일-에멀젼 조성물(또는 수중유 조성물)(예를 들어, WO 90/14837호 참조); 사포닌 제형, 예를 들어, QS21 및 면역자극 복합체(ISCOMS)(예를 들어, US 5,057,540호; WO 90/03184호, WO 96/11711호, WO 2004/004762호, WO 2005/002620호 참조); 예에 모노포스포릴 지질 A(MPL), 3-O-데아실화 MPL(3dMPL), CpG-모티프 함유 올리고뉴클레오티드, ADP-리보실화 박테리아 독소 또는 이의 돌연변이체, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이 이열성 장독소 LT, 콜레라 독소 CT, 백일해 독소 PT 또는 파상풍 톡소이드 TT, 매트릭스 M(이소코노바(Isconova))이 있는 박테리아 또는 미생물 유도체가 포함된다. 또한, 공지되어 있는 면역증강 기술, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 면역 반응을 향상시키는 것으로 당업계에 알려져 있는 단백질(예를 들어, 파상풍 톡소이드, CRM197, rCTB, 박테리아 플라젤린 또는 기타의 것)에 융합시키는 것, 폴리펩티드를 비로좀(virosome)에 포함시키는 것 또는 이들의 조합이 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 비제한적인 다른 예는 예를 들어, 문헌[Coffman et al. (2010)]에 의해 개시된다.
일 구현예에서, 본 발명의 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드는 바이러스 유사 입자(VLP) 벡터에 혼입된다. VLP는 일반적으로, 전형적으로 바이러스의 구조 단백질(들)로부터 유래하는 바이러스 폴리펩티드(들)를 포함한다. 바람직하게는 VLP는 복제할 수 없다. 특정 구현예에서, VLP는 바이러스의 완전한 게놈이 결여되거나, 바이러스의 게놈의 일부를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, VLP는 세포를 감염시킬 수 없다. 일부 구현예에서, VLP는 당업자에게 공지되어 있는 하나 이상의 바이러스(예를 들어, 바이러스 표면 당단백질) 또는 비-바이러스(예를 들어, 항체 또는 단백질) 표적화 부분을 그들의 표면 상에 발현한다.
구체적인 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 비로좀 내로 혼입된다. 본 발명에 따른 폴리펩티드를 함유하는 비로좀은 당업자에게 공지되어 있는 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 비로좀은 정제된 바이러스를 파괴하고, 게놈을 추출하고, 입자와 바이러스 단백질(예를 들어, 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드) 및 지질을 다시 조립하여 바이러스 단백질을 함유하는 지질 입자를 형성함으로써 생성될 수 있다.
또한, 본 발명은 특히 백신으로 사용하기 위한 인플루엔자 HA에 대하여 대상에서 면역 반응을 유도하기 위한 상기 기재된 폴리펩티드, 핵산 및/또는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 이에 따라, 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드, 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또는 본 명세서에 기재된 이러한 핵산 또는 폴리펩티드를 포함하는 벡터를 사용하여, 인플루엔자 바이러스에 대한, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 스템 영역에 대한 중화 항체를 유도할 수 있다. 본 발명은 특히, 계통발생 그룹 1 및/또는 계통발생 그룹 2의 인플루엔자 A 바이러스 및/또는 인플루엔자 B 바이러스에 의해 야기되는 질병 또는 질환의 예방 및/또는 치료에서 백신으로 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 핵산 및/또는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 일 구현예에서, 백신은 계통발생 그룹 1 및/또는 2의 2, 3, 4, 5, 6가지 이상의 상이한 서브타입 및/또는 인플루엔자 B 바이러스에 의해 야기되는 질병의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 백신은 H1 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 의해 야기되는 인플루엔자 감염의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 시험관내 또는 박테리아 및 진핵 세포를 포함하는 적합한 세포 발현 시스템에서의 합성 후에 사용되거나, 대안적으로 면역원성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 발현시킴으로써 이를 필요로 하는 대상에서 생체내 발현될 수 있다. 이러한 핵산 백신은 네이키드(naked) DNA, 플라스미드 또는 아데노바이러스 벡터를 비롯한 바이러스 벡터를 포함하는 임의의 형태를 취할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드, 핵산 분자 및/또는 면역원성 조성물의 투여는 표준 투여 경로를 사용하여 수행될 수 있다. 비제한적인 예에는 비경구 투여, 예를 들어, 정맥내, 피내, 경피, 근육내, 피하 등 또는 점막 투여, 예를 들어, 비내, 구강 등이 포함된다. 당업자는 본 발명에 따른 폴리펩티드, 핵산 분자 및/또는 면역원성 조성물을 투여하여 면역 반응을 유도할 다양한 가능성을 결정할 수 있을 것이다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드, 핵산 분자 및/또는 면역원성 조성물(또는 백신)은 1회를 초과하여, 즉, 소위 상동 초회감작-부스트(prime-boost) 요법으로 투여된다. 폴리펩티드, 핵산 분자 및/또는 면역원성 조성물이 1회 넘게 투여되는 특정 구현예에서, 제2 용량의 투여는 예를 들어, 제1 용량의 투여 후 1주 이상, 제1 용량의 투여 후 2주 이상, 제1 용량의 투여 후 3주 이상, 제1 용량의 투여 후 1개월 이상, 제1 용량의 투여 후 6주 이상, 제1 용량의 투여 후 2개월 이상, 제1 용량의 투여 후 3개월 이상, 제1 용량의 투여 후 4개월 이상 등, 폴리펩티드, 핵산 분자 및/또는 면역원성 조성물의 제1 용량의 투여 후 최대 수년의 시간 간격 후에 수행될 수 있다. 또한, 2회 초과, 예를 들어, 3회, 4회 등으로 백신을 투여하여, 제1 초회감작 투여가 1회 초과의 부스팅 투여로 이어지게 하는 것이 가능하다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드, 핵산 분자 및/또는 면역원성 조성물은 오직 1회 투여된다.
또한, 폴리펩티드, 핵산 분자 및/또는 면역원성 조성물이 비상동 초회감작-부스트 요법에서 초회감작으로서 또는 부스트로서 투여될 수도 있다.
본 발명은 추가로, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드, 핵산 및/또는 조성물을 사용한, 대상에서의 인플루엔자 바이러스 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 구체적인 구현예에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 질병의 예방 및/또는 치료 방법은 유효량의, 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 핵산 및/또는 면역원성 조성물을 인플루엔자 바이러스 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 치료적 유효량은 그룹 1 또는 2 인플루엔자 A 바이러스 및/또는 인플루엔자 B 바이러스에 의한 감염으로부터 야기되는 질병 또는 질환, 바람직하게는 H1 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스에 의한 감염으로부터 야기되는 질병의 예방, 개선 및/또는 치료에 유효한 본 명세서에 정의된 바와 같은 폴리펩티드, 핵산 및/또는 조성물의 양을 지칭한다. 예방은 인플루엔자 바이러스의 확산의 억제 또는 감소, 또는 인플루엔자 바이러스에 의한 감염과 관련된 증상 중 하나 이상의 발병, 발생 또는 진행의 억제 또는 감소를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 개선은 인플루엔자 감염의 가시적인 또는 감지 가능한 질병 증상, 바이러스혈증, 또는 임의의 다른 측정 가능한 징후(manifestation)의 감소를 지칭할 수 있다.
치료를 필요로 하는 대상은 그룹 1 또는 그룹 2 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스로의 감염으로부터 야기되는 질환을 이미 앓고 있는 대상 및 인플루엔자 바이러스로의 감염이 예방되어야 하는 대상을 포함한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드, 핵산 및/또는 조성물은 나이브(naive) 대상, 즉, 인플루엔자 바이러스 감염에 의해 야기되는 질병을 갖지 않거나, 인플루엔자 바이러스 감염으로 감염된 적이 없으며 현재 감염되지 않은 대상, 또는 인플루엔자 바이러스에 이미 감염되고/거나 이에 감염된 적이 있는 대상에게 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 예방 및/또는 치료는 인플루엔자 바이러스 감염에 감수성인 환자 그룹에 표적화될 수 있다. 이러한 환자 그룹에는 예를 들어, 노인(예를 들어, 50세 이상, 60세 이상, 바람직하게는 65세 이상), 유아(예를 들어, 5세 이하, 1세 이하), 입원 환자 및 항바이러스 화합물로 치료된 적이 있으나 부적절한 항바이러스 반응을 보인 환자가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
다른 구현예에서, 폴리펩티드, 핵산 및/또는 면역원성 조성물은 하나 이상의 다른 활성제, 예를 들어, 기존의 또는 장래의 인플루엔자 백신, 모노클로널 항체 및/또는 항바이러스제 및/또는 항박테리아제 및/또는 면역조절제와 병용하여 대상에게 투여될 수 있다. 하나 이상의 다른 활성제는 인플루엔자 바이러스 질병의 치료 및/또는 예방에 유리할 수 있거나 인플루엔자 바이러스 질병과 관련된 증상 또는 질환을 개선할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 다른 활성제는 진통제, 해열 약제 또는 호흡을 완화하거나 보조하는 치료제이다.
본 발명의 폴리펩티드 및/또는 핵산 분자의 투여 요법을 조정하여, 최적의 요망되는 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공할 수 있다. 적합한 투여 범위는 예를 들어, 0.1 내지 100 ㎎/㎏(체중), 바람직하게는 1 내지 50 ㎎/㎏(체중), 바람직하게는 0.5 내지 15 ㎎/㎏(체중)일 수 있다. 사용될 폴리펩티드 및/또는 핵산 분자의 정확한 용량은 예를 들어, 투여 경로 및 감염 또는 이에 의해 야기되는 질병의 중증도에 따라 달라질 것이며, 진료의의 판단과 각 대상의 환경에 따라 결정되어야 한다. 예를 들어, 유효 용량은 표적 부위, 환자의 생리학적 상태(연령, 체중, 건강 포함) 및 처치가 예방적 처치인지 치료적 처치인지에 따라 달라진다. 통상, 환자는 인간이나 트랜스제닉 포유류를 포함하는 비인간 포유류도 또한 치료될 수 있다. 치료 용량을 최적으로 적정하여 안전성과 효능을 최적화시킨다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여, 잠재적인 치료 후보물질로서 확인된 모노클로널 항체의 결합을 입증할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드를 진단 도구로 사용하여, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드에 결합할 수 있는 이러한 개체의 혈청 중의 항체가 존재하는지의 여부를 확립함으로써, 개체의 면역 상태를 시험할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 또한 환자에서 인플루엔자 감염의 존재를 검출하기 위한 시험관내 진단 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 a) 상기 환자로부터 수득된 생물학적 시료를 본 발명에 따른 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및 b) 항체-항원 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여, 신규한 결합 분자를 확인하거나 기존의 결합 분자, 예를 들어, 모노클로널 항체 및 항바이러스제를 개선할 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예 및 도면에 추가로 예시된다. 실시예는 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: PCT/EP2014/060997호에 기재된 바와 같은 스템 기반의 폴리펩티드
PCT/EP2012/073706호에는 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드, 조성물 및 백신, 및 인플루엔자의 예방 및/또는 치료의 분야에서의 그들의 이용 방법이 개시되어 있다. PCT/EP2014/060997호에는 H1N1 A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO: 1)의 전장 HA로부터 유래된 스템 도메인 폴리펩티드의 추가의 서열이 개시되어 있으며, 이는 H1-미니2-클러스터1+5+6-GCN4(SEQ ID NO: 2)의 위치-지정 돌연변이에 의해 수득되었으며, 또한 CR6261(문헌[Throsby et al, 2009]; 문헌[Ekiert et al 2010]) 및/또는 CR9114의 광범위 중화 에피토프를 안정적으로 제시하였다.
하기의 단계를 행함으로써 H1-미니2-클러스터1+5+6-GCN4(SEQ ID NO: 2)를 H1N1 A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO: 1)의 전장 HA로부터 유도하였다:
1. HA0 내의 절단 부위의 제거. 이러한 부위에서의 야생형 HA의 절단은 HA1 및 HA2를 초래한다. 당해 제거는 P1 위치에서의 R에서 Q로의 돌연변이에 의해 달성될 수 있다(예를 들어, 절단 부위(SEQ ID NO: 1에서 위치 343)의 명명법의 설명에 대해서는 문헌[Sun et al, 2010] 참조).
2. SEQ ID NO; 1로부터 아미노산 53 내지 320을 결실시킴에 의한 헤드 도메인의 제거. 서열의 나머지 N- 및 C-말단 부분을 4개 잔기의 유연성 링커, GGGG에 의해 연결하였다.
3. 변형된 HA의 융합 이전 형태의 안정성을 증가시키고, 융합 이후 형태를 불안정화시키기 위한, H1 A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO: 1) 내의 잔기 402 내지 418(그의 동등한 잔기)에 의해 형성되는 루프(A-헬릭스와 CD-헬릭스 사이)의 가용성의 증가. H1-미니2-클러스터1+5+6-GCN4(SEQ ID NO: 2)에, 돌연변이 F406S, V409T, F413G 및 L416S(넘버링은 SEQ ID NO: 1을 언급함)를 도입하였다.
4. H1 A/Brisbane/59/2007에서 위치 324 및 436에서의 아미노산 사이의 이황화 가교의 도입; 이것은 돌연변이 R324C 및 Y436C를 도입함으로써 달성된다(넘버링은 SEQ ID NO: 1을 언급함).
5. 위치 419 내지 433(넘버링은 SEQ ID NO: 1을 언급함)에, 삼량체화하는 것으로 알려져 있는 GCN4 유래 서열 MKQIEDKIEEIESKQ(SEQ ID NO: 5)의 도입.
특정 구현예에서, 막횡단 및 세포내 도메인의 서열을 HA2의 위치 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 526, 527, 528, 529 또는 530(또는 서열 정렬로부터 결정시 그의 동등한 위치)으로부터 HA2의 C-말단(SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링)까지 결실시켜, 세포에서의 발현 후에 분비된(가용성) 폴리펩티드가 생성되게 하였다. 가용성 폴리펩티드를 삼량체 구조를 형성하는 것으로 알려져 있는 서열, 즉, 선택적으로 상기 기재된 바와 같은 짧은 링커를 통해 연결되는 폴드온 서열 GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO: 3)을 도입함으로써 더욱 안정화시켰다. 링커는 선택적으로 당업자에게 널리 공지되어 있는 프로토콜에 따른 이후의 처리를 위한 절단 부위를 함유할 수 있다. 가용성 형태의 정제 및 검출을 용이하게 하기 위하여, 태그 서열, 예를 들어, 선택적으로 짧은 링커를 통해 연결되는 히스티딘 태그(HHHHHH(SEQ ID NO: 15) 또는 HHHHHHH(SEQ ID NO: 16) 또는 FLAG 태그(DYKDDDDK; SEQ ID NO: 22) 또는 이들의 조합이 선택적으로 부가될 수 있다. 링커는 선택적으로 당업자에게 널리 공지되어 있는 프로토콜에 따른 이후의 처리를 위한 단백질 가수분해 절단 부위(또는 그의 부분), 예를 들어, LVPRGS(SEQ ID NO: 23)(트롬빈) 또는 IEGR(SEQ ID NO: 24)(인자 X)을 함유할 수 있다. 처리된 단백질도 또한 본 발명에 포함된다.
FLAG-태그, 트롬빈 절단 부위, 폴드온 및 His 서열을 조합한 이러한 C-말단 서열의 예는 SEQ ID NO: 4 FLAG-트롬빈-폴드온-His이다. 이러한 서열을 가용성 형태의 H1-미니2-클러스터1+5+6-GCN4(SEQ ID NO: 2) 서열과 조합하여, 모체 서열(SEQ ID NO: 6)을 생성하였으며, 이를 사용하여, 돌연변이유발에 의해 본 발명의 신규한 폴리펩티드를 생성하였다. 이러한 서열은 SEQ ID NO: 1 및 2의 아미노산 1 내지 17에 상응하는 리더 서열을 함유하지 않는다.
따라서, 분자의 헤드 도메인을 암호화하는 헤마글루티닌 서열의 부분을 결실시키고, PCT/2012/073706호 및 상기에 기재된 바와 같이 링커를 통해 결실의 어느 하나의 측에 서열의 N- 및 C-말단 부분을 재연결시킴으로써 스템 도메인 폴리펩티드를 생성하였다. 헤드 도메인의 제거는 이전에 수성 용매로부터 보호된 분자의 부분이 노출되게 하여, 잠재적으로 본 발명의 폴리펩티드의 구조를 불안정화시켰다. 이런 이유로, B-루프 내의 잔기(특히 아미노산 잔기 406(각각 SEQ ID NO: 1 및 2에서 F 및 S), 409(V 및 T) 413(F 및 G) 및 416(L 및 S))를 출발점으로서 모체 서열 SEQ ID NO: 6을 사용하여 다양한 조합으로 돌연변이시켰다. 리더 서열을 제거하고, 잔기 520 내지 565를 Flag-트롬빈-폴드온--his 서열(SEQ ID NO: 4)로 대체함으로써 SEQ ID NO: 6을 H1-미니2-클러스터1+5+6-GCN4(SEQ ID NO: 2)로부터 생성하였다.
유사하게, 융합 펩티드 주변의 영역에서, 다수의 소수성 잔기가 용매에 노출되며, 이는 고유 전장 HA와 달리, 폴리펩티드가 절단될 수 없고, 소수성 융합 펩티드를 단백질의 내부에 매립하는 관련 입체구조 변화를 겪을 수 없다는 사실에 의해 야기된다. 이러한 문제를 다루기 위하여, SEQ ID NO: 2에서의 잔기 I337, I340, F352 및 I353 중 일부 또는 전부도 또한 돌연변이시켰다.
이러한 방식에서, 가용성 형태의 HA 스템 폴리펩티드 74H9(SEQ ID NO: 57), 127H1(SEQ ID NO: 55), 71H2(SEQ ID NO: 61), 86B4(SEQ ID NO: 56), 115A1(SEQ ID NO: 60), 2201C9(SEQ ID NO: 63), 55G7(SEQ ID NO: 59), 113E7(SEQ ID NO: 64), 6E12(SEQ ID NO: 58), 181H9(SEQ ID NO: 62)를 생성하였다.
상기 기재된 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 당업자에게 널리 공지된 프로토콜을 사용하여 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 내로 형질전환시키거나, HEK293F 세포 내로 트랜스펙션시켰다. 포유동물 세포에서의 발현을 위해 사용되는 작제물은 HA 리더 서열(SEQ ID NO: 1 및 2에서의 잔기 1 내지 17)을 함유하는 한편, 피키아 파스토리스에서의 발현을 위해 사용되는 작제물에서, HA 리더 서열을 효모 알파 인자 리더 서열(SEQ ID NO: 7)로 대체하였다. 이러한 방식으로, 발현된 단백질을 세포 배양 배지로 지향시켜, 이에 따라, 결합 및 발현이 본 발명의 폴리펩티드의 추가의 정제 없이 결정되게 하였다. 모든 서열은 FLAG-폴드온-HIS C-말단 서열(SEQ ID NO: 4)을 함유하였다.
폴리펩티드에 결합하는 모노클로널 항체(CR6261, CR9114, CR8020)를 ELISA에 의해 결정하였다. 이를 위하여, ELISA 플레이트를 4℃에서 2 ㎍/㎖ 모노클로널 항체 용액(20 ㎕/웰)으로 하룻밤 처리하였다. 항체 용액의 제거 후에, 남아 있는 표면을 실온에서 최소 1시간 동안 PBS 중 4% 무지방 분유의 용액으로 블로킹하였다. 플레이트의 세척 후에, 20 ㎕의 세포 배양 배지(그대로 또는 희석)를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, ELISA 플레이트를 세척하고, 20 ㎕의 항-FLAG-HRP 항체 용액(Sigma A8952, PBS-Tween 중 4% 무지방 분유의 용액 중 2000배 희석)을 첨가하였다. 인큐베이션(실온에서 1시간) 후에, 플레이트를 1회 이상 세척하고, 20 ㎕의 발광 기질(Thermoscientific C#34078)을 첨가하여, 신호를 발생시켰다. 대안적으로, 비색 검출 방법을 사용하여, 신호를 발생시켰다.
본 발명의 폴리펩티드의 발현을 균일 시간-분해 형광 검정으로부터 결정하였다(일반적인 설명을 위하여, 예를 들어, 문헌[Degorce et al., Curr. Chem. Genomics 2009 3: 22-32] 참조). 이를 위하여, 210.5 ㎕ 항-FLAG-TB(원액 26 ㎍/㎖) 및 1.68 ㎖의 항-HIS-488(원액 50 ㎍/㎖)을 배양 배지 및 50 mM HEPES + 0.1% BSA의 1 대 1 혼합물 80 ㎖에 첨가함으로써 테르븀(Tb) 표지된 항-FLAG 모노클로널 항체(공여자) 및 Alexa488 표지된 항-His 모노클로널 항체(수여자)(HTRF 용액)의 혼합물을 제조하였다. 19 ㎕의 HTRF 용액을 ELISA 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 1 ㎕의 배양 배지를 첨가하였다. 여기 시에, 그리고 다른 화합물(단백질, 배지 성분 등)로부터 발생하는 간섭 단기 백그라운드 신호가 붕괴되게 하기 위한 지연 후에, 520 및 665 nm에서의 형광 방출의 비를 결정하였다. 이것은 시료 중 총 단백질 함량의 척도이며, 이를 이용하여, 상이한 실험 간의 mAb 결합 신호를 정규화시킨다.
표 3 및 표 4에 열거된 폴리펩티드를 당업자에게 널리 공지된 프로토콜에 따라 피키아 파스토리스에서 발현시켰다. 배양 배지를 수집하고, 스템 도메인 폴리펩티드의 CR6261로의 결합 및 그의 발현을 상기 기재된 바와 같이 결정하였다. 결합 검정에서의 반응이 발현 단백질의 농도에 따라 축척되기 때문에, 각각의 발현된 서열에 대한 HTRF 검정에서의 신호에 비하여 결합 신호의 비를 비교함으로써, ELISA 결합 신호를 단백질 발현에 대하여 정규화시켰다. 모든 발현된 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 6의 모체 서열에 비하여, 더 높은 비의 CR6261 결합 대 HTRF 신호를 나타낸다.
또한, CR6261 결합 대 HTRF 신호의 비를 계산하고, 모체 서열 SEQ ID NO: 6에 대하여 계산된 비와 비교하였다. 결과는 표 3 및 표 4의 5열에 열거되어 있으며; 모든 발현된 단백질은 더 높은 비를 나타내며, 이는 상기 기재된 스템 폴리펩티드가 증가된 CR6261의 결합을 보이는 것을 나타낸다.
실시예 2: 본 발명의 폴리펩티드의 설계 및 특성화
본 발명의 폴리펩티드는 CD 헬릭스 내에 효모 전사 활성화 단백질 GCN4로부터 유래된 서열 RMKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO: 20) 또는 RMKQIEDKIEEIESKQK(SEQ ID NO: 21)를 함유한다. 이러한 서열은 나선형 이차 구조를 형성하는 경향이 높고, 이러한 방식으로, 본 발명의 폴리펩티드의 전체 안정성을 증진시킬 수 있다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성 및 응집 상태가 본 발명의 폴리펩티드의 일차 서열에서의 GCN4 유래 서열의 정확한 위치와 서열에 좌우되는 것이 놀랍게도 관찰되었다.
따라서, 본 명세서에서, 본 발명자들은 서열 RMKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO: 20)가 위치 419 내지 433(SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링; 예를 들어, SEQ ID NO. 81 내지 110)에 도입되거나, 서열 RMKQIEDKIEEIESKQK(SEQ ID NO: 21)가 위치 417 내지 433(예를 들어, SEQ ID NO 111 내지 140)에 도입된 신규한 세트의 본 발명의 폴리펩티드를 설명한다.
이를 위하여, 실시예 1에 기재된 폴리펩티드, 즉, 74H9(SEQ ID NO: 57), 127H1(SEQ ID NO: 55), 71H2(SEQ ID NO: 61), 86B4(SEQ ID NO: 56), 115A1(SEQ ID NO: 60), 2201C9(SEQ ID NO: 63), 55G7(SEQ ID NO: 59), 113E7(SEQ ID NO: 64), 6E12(SEQ ID NO: 58), 181H9(SEQ ID NO: 62)를 당업자에게 널리 공지된 분자 생물학의 기술을 사용하여 변형시켜, 위치 419 내지 433에 서열 RMKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO: 20)를 함유하는 서열 74H9-t2(SEQ ID NO: 83), 127H1-t2(SEQ ID NO: 81), 71H2-t2(SEQ ID NO: 87), 86B4-t2(SEQ ID NO: 82), 115A1-t2(SEQ ID NO: 86), 220C9-t2(SEQ ID NO: 89), 55G7-t2(SEQ ID NO: 85), 113E7-t2(SEQ ID NO: 90), 6E12-t2(SEQ ID NO: 84), 181H9-t2(SEQ ID NO: 88)를 생성하였다.
유사한 방식으로, 위치 417 내지 433에 서열 RMKQIEDKIEEIESKQK(SEQ ID NO: 21)를 함유하는 서열 74H9-t3(SEQ ID NO: 113), 127H1-t3(SEQ ID NO: 111), 71H2-t3(SEQ ID NO: 117), 86B4-t3(SEQ ID NO: 112), 115A1-t3(SEQ ID NO: 116), 2201C9-t3(SEQ ID NO: 119), 55G7-t3(SEQ ID NO: 115), 113E7-t3(SEQ ID NO: 120), 6E12-t3(SEQ ID NO: 114), 181H9-t3(SEQ ID NO: 118)을 생성하였다.
본 발명의 폴리펩티드는 상이한 바이러스 균주 유래의 HA 분자의 서열을 기반으로 생성될 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO: 149 내지 155에는 H1N1 A/California/07/09 균주의 HA 서열을 기반으로 하는 본 발명의 폴리펩티드가 기재되어 있다.
이전에 기재된 바와 같이, 예를 들어, HA2 도메인의 잔기 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 526, 528, 529 또는 530으로부터 HA2 도메인의 C-말단(SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링)까지의 HA 기반의 서열의 C-말단 부분을 제거함으로써 본 발명의 가용성 폴리펩티드가 생성될 수 있다.
폴리펩티드는 삼량체 구조를 형성하는 것으로 공지된 서열, 즉, 선택적으로 링커를 통해 연결되는 GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO: 3)을 도입함으로써 더욱 안정화될 수 있다. 링커는 선택적으로 당업자에게 널리 공지된 프로토콜에 따라 이후의 처리를 위한 절단 부위를 함유할 수 있다. 가용성 형태의 정제를 용이하게 하기 위하여, 선택적으로 짧은 링커를 통해 연결되는 태그 서열, 예를 들어, his 태그(HHHHHHH(SEQ ID NO: 16) 또는 HHHHHH(SEQ ID NO: 15)) 또는 FLAG 태그(DYKDDDDK)(SEQ ID NO: 22) 또는 이들의 조합을 부가할 수 있다. 링커는 선택적으로 당업자에게 널리 알려져 있는 프로토콜에 따라 이후의 처리를 위한 단백질 가수분해 절단 부위(의 부분), 예를 들어, IEGR(SEQ ID NO: 24)(인자 X) 또는 LVPRGS(SEQ ID NO: 23)(트롬빈)를 함유할 수 있다. 또한, 처리된 단백질은 본 발명에 포함된다.
잔기 519 내지 565(넘버링은 SEQ ID NO: 1을 언급함)의 등가물을 변형된 트롬빈 절단 부위 및 6개의 히스티딘 태그(SEQ ID NO: 15) 둘 모두를 함유하는 서열 RSLVPRGSPGHHHHHH로 대체함으로써, SEQ ID NO: 55 내지 64 및 81 내지 90의 가용성 형태의 폴리펩티드를 생성하고, 당업자에게 널리 공지된 프로토콜에 따라 HEK293F 세포에서 발현시켰다.
비교를 위하여, 가용성 형태의 H1-미니2-클러스터1+5+6-GCN4t2(SEQ ID NO: 52) 및 H1-미니2-클러스터1+5+6-GCN4t3(SEQ ID NO: 53). 배양 배지를 수집하고, CR6261, CR9114로의 결합을 배양 배지로부터 본 발명의 폴리펩티드를 직접 포획하기 위한 코팅된 mAb CR6261 또는 CR9114 및 검출 목적을 위한 C-말단 his-태그에 대하여 유도된 서양고추냉이 과산화효소(HRP) 컨쥬게이트된 항체를 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 검출하였다. 대안적으로, HRP-컨쥬게이트된 스트렙트아비딘과 함께 비오티닐화 CR9114를 샌드위치 ELISA에서 CR9114 포획된 본 발명의 폴리펩티드의 검출을 위해 사용하였다. 이러한 형식은 본 발명의 다량체 형태의 폴리펩티드의 존재의 검출을 가능하게 한다. 시험된 본 발명의 모든 폴리펩티드는 ELISA에 의해 결정시, CR9114(도 2a 및 도 2b, 도 3a 및 도 3b 및 도 4a 및 도 4b) 및 CR6261(도 2c 및 도 2d, 도 3c 및 도 3d, 도 4c 및 도 4d)에 결합할 수 있었다. CR9114 포획 - 비오티닐화 CR9114 검출 샌드위치 ELISA에 의해 검출시 증가된 수준의 다량체화가 도 2e 및 도 2f, 도 3e 및 도 3f 및 도 4e 및 도 4f에 나타낸 바와 같이, s55G7-t2(SEQ ID NO: 95), s86B4-t2(SEQ ID NO: 92), s115A1-t2(SEQ ID NO: 96), s127H1-t2(SEQ ID NO: 91), s113E7-t2(SEQ ID NO: 100), s220C9-t2(SEQ ID NO: 99), s71H2-t3(SEQ ID NO: 127), s127H1-t3(SEQ ID NO: 121), s74H9-t3(SEQ ID NO: 123)에 대하여 관찰되었다.
추가의 특성화를 위하여 본 발명의 폴리펩티드의 고도로 순수한 제제를 수득하기 위하여, 가용성 형태의 127H1-t2(SEQ ID NO: 81), 86B4-t2(SEQ ID NO: 82) 및 55G7-t2(SEQ ID NO: 85)를 암호화하는 유전자를 함유하는 발현 벡터 pcDNA2004로 HEK293F 세포를 트랜스펙션시켰다. 생성 동안 단백질의 수송을 유도하는 리더 서열(또는 신호 서열)(SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 17에 상응)이 분비된 최종 폴리펩티드에 존재하지 않을 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
본 발명의 폴리펩티드를 생성하기 위하여, HEK293F 세포(인비트로겐)를 300g에서 5분 동안 회전 침강시키고, SF1000 플라스크마다 300 ㎖의 사전 가온 프리스타일(Freestyle)™ 배지에 재현탁화시킴으로써 1.0*106vc/㎖을 씨딩하였다. 이러한 배양물을 멀티트론(multitron) 인큐베이터에서, 110 rpm에서 37℃, 10% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 1시간 후에, 플라스미드 DNA를 9.9 ㎖의 옵티멤(Optimem) 배지에서 300 ㎖ 배양 부피 중에 1.0 ㎍/㎖의 농도로 피펫팅하였다. 병행하여, 440 ㎕의 293펙틴®을 9.9 ㎖의 옵티멤 배지에서 피펫팅하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 5분 후에, 플라스미드 DNA/옵티멤 믹스를 293펙틴®/옵티멤 믹스에 첨가하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 플라스미드 DNA/293펙틴® 믹스를 세포 현탁액에 적가하였다. 트랜스펙션된 배양물을 멀티트론 인큐베이터에서, 37℃, 10% CO2 및 110 rpm에서 인큐베이션시켰다. 제7일에, 세포를 원심분리(3000g에서 30분)에 의해 배양 배지로부터 분리하는 한편, 본 발명의 가용성 폴리펩티드를 함유하는 상청액을 추가의 처리를 위하여 0.2㎛ 바틀 탑(bottle top) 필터에 대하여 여과하였다.
정제 목적을 위하여, 1500 ㎖(s127H1_t2), 1800 ㎖(s86B4_t2) 및 2400 ㎖(s55G7_t2)의 배양 상청액을 세척 완충제(20 mM TRIS, 500 mM NaCl, pH 7.8)에서 사전-평형화된 24 ㎖ Ni 세파로스(Sepharose) HP 컬럼에 적용하였다. 세척 완충제 중 10 mM 이미다졸을 사용한 세척 단계 후에, 본 발명의 결합된 폴리펩티드를 세척 완충제 중 단계식 기울기의 300 mM 이미다졸로 용리시켰다. 용리 피크를 수집하고, 농축시키고, 추가의 정제를 위해 크기 배제 컬럼에 적용하였다(슈퍼덱스(Superdex) 200). 용리 프로파일이 도 5에 나타나 있다. 55G7-t2 및 127H1-t2에 대하여, 분획을 수집하고, 도면에 나타낸 바와 같이 풀링하고, SDS-PAGE(도 6), ELISA 및 다중각 광산란과 병용되는 분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석하여, 분자량을 추정하였다(SEC-MALS). ELISA 결과에 의해, CR6261 및 CR9114로 본 발명의 폴리펩티드가 결합하지만, CR8020으로는 결합하지 않는 것이 확인되었다. SEC-MALS 결과는 표 8에 요약되어 있다.
도 5 및 표 8은 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2가 s55G7-t2 및 s86B4-t2에 비하여 더 높은 수율(약 30 ㎎ 단백질/ℓ(배양 상청액))을 갖는 것을 나타낸다. 대다수의 단백질은 62 kDa의 분자량을 나타내며, 이는 단량체 또는 이량체에 대하여 예상되는 것 사이이다. 단백질의 응집 상태를 확인하기 위하여, CR6261, CR9114 및 CR8020으로부터 유래된 Fab-단편의 존재하에 SEC-MALS 실험을 반복하였다. 결과는 도 7에 나타나 있으며, 표 8에 요약되어 있다.
결과는 가용성 형태의 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2가 CR6261 및 CR9114로부터의 Fab 단편의 존재하에 복합체를 형성하지만, CR8020으로는 그렇지 않은 것을 보여준다(SEC 크로마토그램에서 피크의 이동에 의해 증명되는 바와 같음). CR6261 및 CR9114가 그룹 1로부터 유래된 HA에 결합하는 한편, CR8020이 그렇지 않기 때문에, 이것은 Fab 단편의 결합 반응의 특이성과 일치한다. 복합체의 크기는 표 8에 열거되어 있으며, 이것은 폴리펩티드 s127H1-t2가 1 내지 2개의 Fab 단편에 결합하는 것을 나타내며, 이는 본 발명의 정제된 폴리펩티드 s127H1-t2의 집단 중 적어도 일부가 이량체 형태로 존재하는 것을 나타낸다.
본 발명의 폴리펩티드 127H1-t2 및 mAb의 CR6261 및 CR9114 간의 결합 반응을 추가로 분석할 뿐 아니라, CR6261 및 CR9114의 형태 에피토프의 존재를 확인하기 위하여, 이들 항체와 정제된 단백질의 복합체화를 바이오층 간섭법(Octet Red384, Forte Bio)에 의해 연구하였다. 이를 위하여, 비오티닐화 CR6261, CR9114 및 CR8020을 스트렙트아비딘 코팅된 센서에 고정화시키고, 이후에 먼저 본 발명의 정제된 폴리펩티드의 용액에 노출시켜, 회합률을 측정한 다음 세척 용액에 노출시켜, 해리율을 측정하였다. 결과는 도 8에 나타나 있다.
고정화된 CR6261 및 CR9114는 둘 모두 가용성 형태의 127H1-t2로의 노출 후의 명백한 반응에 의해 입증되는 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드를 인식한다(도 8). 결합 상호작용에 대한 해리 상수를 추정하기 위하여, 2배 연속 희석을 사용하여 적정을 수행하였다. 고정화된 CR6261 또는 CR9114를 함유하는 센서를 각각 40, 20, 10, 5, 2.5, 1.3 및 0.63 nM의 농도에서 가용성 s127H1-t2 용액에 노출시키고, 6600초 후에 최종 반응을 기록하였다. 반응을 스템 도메인 폴리펩티드 농도의 함수로서 플롯팅하고, 정상 상태 1:1 결합 모델로의 핏팅을 수행하여, CR6261/스템 도메인 폴리펩티드 복합체에 대하여 3.5 nM 및 CR9114 복합체에 대하여 2.3 nM의 해리 상수 Kd를 제공하였다(도 8).
결과적으로, 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2(SEQ ID NO: 91)는 다량으로 생성되며, 광범위 중화 모노클로널 항체 CR6261 및 CR9114에 높은 친화성으로 결합할 수 있으며, 이는 이러한 스템 도메인 폴리펩티드에서의 상응하는 중화 에피토프의 존재를 확인시켜 준다. 폴리펩티드는 이량체 구조를 형성하는 경향을 갖는다.
실시예 3: 치명적인 인플루엔자 시험감염 모델에서의 본 발명의 폴리펩티드의 보호 효능의 평가
치명적인 인플루엔자 시험감염 모델에서 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2(SEQ ID NO: 91)의 보호 효능을 평가하기 위하여, 10마리의 암컷 BALB/c 마우스(6 내지 8주령)의 그룹을 10 ㎍ 매트릭스-M이 보강되지 않거나, 이것이 보강된 10 ㎍의 정제된 s127H1-t2를 사용하여 3주 간격으로 3회 면역화시켰다. 시험감염 모델에 대한 양성 대조군으로서, 광범위 중화 항체 모노클로널 항체 CR6261(15 ㎎/㎏)을 시험감염 1일 전에 근육내 투여하는 한편, PBS로의 면역화를 음성 대조군으로 제공하였다. 마지막 면역화 후 4주에, 마우스를 25xLD50 이종 시험감염 바이러스(H1N1 A/Puerto Rico/8/34)로 시험 감염시키고, 3주 동안 매일 모니터링하였다(생존, 체중, 임상 점수). 사전-시험감염 혈청을 면역화를 위해 사용되는 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2로의 결합에 대하여(정확한 면역화를 확인하기 위함), 가용성 H1N1 A/Brisbane/59/07 전장 HA로의 결합에 대하여(전장 HA의 인식을 입증하기 위함), 그리고 전장 HA로의 결합을 위한 광범위 중화 항체 모노클로널 항체 CR9114와의 경쟁에 대하여(유도되는 항체가 광범위 중화 CR9114 에피토프와 매우 근접하게 결합하는지의 여부를 결정하기 위함) ELISA 검정에서 시험한다. 결과는 도 9 내지 도 12에 나타나 있다.
결과는 PBS 대조군에서의 모든 마우스가 시험감염 7일 후에 감염에 굴복하는 한편 양성 대조군(15 ㎎/㎏ CR6261, 시험감염 1일 전)이 완전히 보호되기 때문에, 실험이 유효한 것을 보여준다(도 9). PBS 처치 마우스와 대조적으로, 비보강된 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2(SEQ ID NO: 91)로 면역화시킨 10마리의 마우스 중 3마리 및 보강된 본 발명의 폴리펩티드로 면역화시킨 10마리의 마우스 중 10마리가 치명적인 시험감염을 견뎌낸다(도 10 참조). PBS 대조군에 비하여, 증가된 생존비, 증가된 생존 시간 및 감소된 임상 점수가 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2로 면역화시킨 그룹에 대하여 관찰된다. 보강된 본 발명의 폴리펩티드를 제공받은 그룹에 대하여 차이가 가장 현저하지만, 비보강된 폴리펩티드를 제공받은 그룹에 대해서도 또한 관찰된다.
항원으로서 s127H1-t2 또는 가용성 전장 HA를 사용한 ELISA 데이터에 의해, 본 발명의 폴리펩티드 s127H1이 면역원성이며, 보강제의 사용과 관련 없이, 전장 HA를 인식할 수 있는 항체를 유도하는 것이 나타난다(도 11a 및 도 11b).
면역화에 대한 면역학적 반응을 더욱 이해하기 위하여, 경쟁 결합 ELISA를 수행하였다. 이를 위하여, 플레이트 결합된 전장 HA를 단계 희석된 혈청 시료와 인큐베이션시킨 후에, 소정의 적정된 농도의 CR9114-비오틴을 첨가한다. 추가의 인큐베이션 후에, 당업계에 널리 공지된 프로토콜에 따라 스트렙트아비딘-컨쥬게이트된 서양고추냉이 퍼옥시다제를 사용하여 결합된 CR9114-비오틴의 양을 정량화시킨다. 데이터를 로그 희석에 대한 OD의 선형 회귀를 사용하여 분석하고, '기울기 OD'(ΔOD/10 배수 희석)로 표현한다. 데이터는 도 12a에서 관찰된 상승된 경쟁 수준에 의해 나타낸 바와 같이, 광범위 중화 항체 CR9114와의 결합을 위해 경쟁할 수 있는 검출 가능한 수준의 항체가 보강된 본 발명의 폴리펩티드를 사용한 면역화에 의해 유도되는 것을 보여준다. 비교로서, 비표지된 CR9114(즉, 자가-경쟁) 및 둘 모두 5 ㎍/㎖ 출발 농도로부터 단계 희석된 비-결합 모노클로널 항체 CR8020 및 CR-JB에 의해 유도되는 수준이 개별 그래프에 나타나 있다. 결론적으로, 본 발명자들은 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2(SEQ ID NO: 91)로의 면역화가 마우스를 인플루엔자로의 치명적인 감염에 대해 보호할 수 있음을 보여주었다. 폴리펩티드는 면역원성이고, 전장 HA에 결합할 수 있는 항체를 유도한다. 본 발명의 폴리펩티드가 보강제와 병용되는 경우, 유도된 검출 가능한 항체의 적어도 일부는 모노클로널 항체 CR9114의 광범위 중화 에피토프의 에피토프에 또는 그 가까이에 결합한다.
실시예 4: 치명적인 인플루엔자 시험감염 모델에서의 본 발명의 폴리펩티드의 보호 효능의 평가
치명적인 인플루엔자 시험감염 모델에서, 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2(SEQ ID NO: 91)의 보호 효능을 더욱 평가하기 위하여, 10마리의 암컷 BALB/c 마우스(6 내지 8주령)의 그룹을 10 ㎍의 매트릭스-M이 보강된 30 ㎍의 정제된 s127H1-t2를 사용하여 3주 간격으로 1, 2 및 3회 면역화시켰다. 시험감염 모델을 위한 양성 대조군으로서, 광범위 중화 항체 모노클로널 항체 CR6261(15 mg/kg)을 시험감염 1일 전에 정맥내 투여하는 한편, PBS로의 면역화를 음성 대조군으로 제공하였다. 마지막 면역화 4주 후에, 마우스를 25xLD50 이종 시험감염 바이러스(H1N1 A/Puerto Rico/8/34)로 시험 감염시키고, 3주 동안 매일 모니터링하였다(생존, 체중, 임상 점수). 최종 면역화 후 4주에 수득되는 시험감염 이전의 혈청을 면역화를 위해 사용되는 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2로의 결합에 대하여(정확한 면역화를 확인하기 위함), 가용성 H1N1 A/Brisbane/59/07 전장 HA로의 결합에 대하여(전장 HA의 인식을 입증하기 위함), 그리고 전장 HA로의 결합을 위한 광범위 중화 항체 모노클로널 항체 CR9114와의 경쟁에 대하여(유도되는 항체가 광범위 중화 CR9114 에피토프와 매우 근접하게 결합하는지의 여부를 결정하기 위함) ELISA 검정에서 시험하였다. 결과는 도 13 내지 도 18에 나타나 있다.
결과는 PBS 대조군에서의 모든 마우스가 시험감염 7일 후에 감염에 굴복하는 한편 양성 대조군(15 ㎎/㎏ CR6261, 시험감염 1일 전)이 완전히 보호되기 때문에, 실험이 유효한 것을 보여준다(도 13a). s127H1-t2(SEQ ID NO: 91)로 1회 면역화시킨 마우스는 모두 제7일 내지 제9일에 감염에 굴복하였다(도 14a). 대조적으로, 2회의 면역화 후에, 10마리의 마우스 중 8마리가 생존하였으며, 3회의 면역화 후에, 모든 마우스(10마리 중 10마리)가 치명적인 시험감염을 견뎌냈다(도 14b, 도 14c). 또한, 다수 회 면역화시킨 그룹에 대하여 체중 감소가 줄었으며, 3회 면역화시킨 동물에 대하여 가장 낮은 백분율이 관찰되었다(도 15b, 도 15c). PBS 대조군에 비하여, 통계적으로 유의미한 증가된 생존비, 증가된 생존 시간, 축소된 체중 감소 및 감소된 임상 점수(도 16b, 도 16c 참조)가 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2로 2회 또는 3회 면역화시킨 그룹에 대하여 관찰되었다.
항원으로서 s127H1-t2(도 17a) 또는 가용성 전장 HA(도 17b)를 사용한 최종 면역화 후 4주의 사전-시험감염 시점으로부터의 ELISA 데이터는 본 발명의 폴리펩티드 s127H1이 면역원성이며, 2회 및 3회 면역화 후에 수준이 유의미하게 더 높지만, 심지어 1회의 면역화 후에도 전장 HA를 인식할 수 있는 항체를 유도하는 것을 나타낸다. 상기 기재된 CR9114 경쟁 결합 검정을 사용하여, 광범위 중화 항체 CR9114와의 결합을 위해 경쟁할 수 있는 검출 가능한 수준의 항체가 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2(SEQ ID NO: 91)로의 2회 및 3회의 면역화 후에 유도되었다(도 18a). 비교로서, 비표지된 CR9114(즉, 자가-경쟁) 및 둘 모두 5 ㎍/㎖ 출발 농도로부터 단계 희석된 비-결합 모노클로널 항체 CR8020 및 CR-JB에 의해 유도되는 수준은 개별 그래프에 나타나 있다(도 18b).
결론적으로, 본 발명자들은 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2(SEQ ID NO: 91)로의 2회 및 3회의 면역화가 마우스를 인플루엔자로의 치명적인 감염에 대해 보호할 수 있음을 보여주었다. 폴리펩티드는 면역원성이고, 전장 HA에 결합할 수 있는 항체를 유도한다. 유도된 항체의 적어도 일부는 모노클로널 항체 CR9114의 광범위 중화 에피토프의 에피토프에 또는 그 가까이에 결합한다.
실시예 5: 치명적인 이종아형 H5N1 인플루엔자 시험감염 모델에서의 본 발명의 폴리펩티드의 보호 효능의 평가
치명적인 H5N1 인플루엔자 시험감염 모델에서, 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2(SEQ ID NO: 91)의 보호 효능을 더욱 평가하기 위하여, 8 내지 12마리의 암컷 BALB/c 마우스(6 내지 8주령)의 그룹을 10 ㎍의 매트릭스-M이 보강된 30 ㎍의 정제된 s127H1-t2를 사용하여 3주 간격으로 3회 면역화시켰다. 시험감염 모델을 위한 양성 대조군으로서, 광범위 중화 항체 모노클로널 항체 CR6261(15 mg/kg)을 시험감염 1일 전에 정맥내 투여하는 한편, PBS로의 면역화를 음성 대조군으로 제공하였다. 마지막 면역화 4주 후에, 마우스를 12.5xLD50 이종아형 시험감염 바이러스(H5N1 A/Hong Kong/156/97)로 시험 감염시키고, 3주 동안 매일 모니터링하였다(생존, 체중, 임상 점수).
결과는 PBS 대조군에서의 모든 마우스가 시험감염 후 8 내지 10일에 감염에 굴복하는 한편 양성 대조군(15 ㎎/㎏ CR6261, 시험감염 전 1일)이 완전히 보호되기 때문에, 실험이 유효한 것을 보여준다(도 19a). s127H1-t2(SEQ ID NO: 91)로 면역화시킨 10마리 중 8마리의 마우스(80%)는 치명적인 시험감염을 견뎌냈다(도 19b). 평균 체중 감소는 제9일에 대략 15%이지만, 생존 동물이 체중을 회복하고 체중이 증가되었다(도 19c). 임상 점수 중간값은 제3일 내지 제6일에 1.5이지만, 제8일부터 계속, 임상 증상이 생존 마우스에 대하여 관찰되지 않았다(도 19d). PBS 대조군에 비하여, 통계적으로 유의미한 증가된 생존비, 증가된 생존 시간, 체중 감소의 축소 및 감소된 임상 점수가 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2로 면역화시킨 그룹에 대하여 관찰된다. 결론적으로, 본 발명자들은 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2(SEQ ID NO: 91)로의 면역화가 이종아형 H5N1 인플루엔자 균주로의 치명적인 감염에 대하여 마우스를 보호할 수 있음을 보여주었다.
실시예 6: 본 발명의 폴리펩티드로의 면역화를 통해 유도되는 혈청의 결합의 폭의 평가
실시예 5에 기재된 바와 같이 3회 면역화시킨 마우스로부터의 사전-시험감염 혈청도 또한, 당업계에 널리 공지된 프로토콜에 따라 ELISA에 의해 다수의 다른 그룹 1(H1, H5 및 H9) 및 그룹 2(H3 및 H7) 인플루엔자 균주로부터의 전장 HA에 대한 결합에 대하여 시험하였다(도 20). 결과는 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2(SEQ ID NO: 91)로 유도된 항체가 FL HA의 고유 서열에 존재하는 에피토프를 효율적으로 인식하고, 항체가 결합하는 에피토프가 H1, H5 및 H9 HA를 포함하는 상이한 그룹 1 인플루엔자 균주 중에 보존되는 것을 입증한다.
실시예 7: 치명적인 H1N1 A/Brisbane/59/2007 인플루엔자 시험감염 모델에서의 본 발명의 폴리펩티드의 보호 효능의 평가
치명적인 H1N1 인플루엔자 시험감염 모델에서, s127H1-t2(SEQ ID NO: 91)의 보호 효능을 더욱 평가하기 위하여, 8 내지 18마리의 암컷 BALB/c 마우스(6 내지 8주령)의 그룹을 10 ㎍의 매트릭스-M이 보강된 30 ㎍의 정제된 s127H1-t2를 사용하여 3주 간격으로 3회 면역화시켰다. 시험감염 모델을 위한 양성 대조군으로서, 광범위 중화 항체 모노클로널 항체 CR6261(15 mg/kg)을 시험감염 1일 전에 정맥내 투여하는 한편, PBS로의 면역화를 음성 대조군으로 제공하였다. 마지막 면역화 4주 후에, 마우스를 12.5xLD50 시험감염 바이러스(H1N1 A/Brisbane/59/2007)로 시험 감염시키고, 3주 동안 매일 모니터링하였다(생존, 체중, 임상 점수).
결과는 PBS 대조군에서의 모든 마우스가 시험감염 후 7 내지 10일에 감염에 굴복하는 한편, 양성 대조군(15 ㎎/㎏ CR6261, 시험감염 전 1일)이 완전히 보호되기 때문에, 실험이 유효한 것을 보여준다(도 21a). s127H1-t2(SEQ ID NO: 91)로 면역화시킨 10마리 중 10마리의 마우스는 치명적인 시험감염을 견뎌냈다(도 21b). 또한, 체중 감소는 감염 후 평균 5일에 약 20%이지만(도 21c), 동물은 21일 추적 기간 내에 완전히 회복한다. 임상 점수 중간값은 감염 후 2 내지 9일에 3의 값에서 피크에 달하지만, 감염 후 16일부터 계속 기준선 수준(0)으로 복귀된다(도 21d). PBS 대조군에 비하여, 통계적으로 유의미한 증가된 생존비, 증가된 생존 시간, 체중 감소의 축소 및 감소된 임상 점수가 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2로 면역화시킨 그룹에 대하여 관찰된다.
결론적으로, 본 발명자들은 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2(SEQ ID NO: 91)로의 면역화가 H1N1 A/Brisbane/59/2007로의 치명적인 감염에 대하여 마우스를 보호할 수 있음을 보여주었다.
실시예 8: 본 발명의 폴리펩티드로 면역화시킨 마우스의 혈청에서의 인플루엔자 중화 항체의 존재의 평가
인플루엔자에 대한 보호에서 역할을 수행하는 항체-매개의 이펙터 메커니즘을 더욱 조사하기 위하여, 사전-시험감염 혈청을 하기 기재된 바와 같은 H5N1 A/Vietnam/1194/04로부터 유래된 유사입자를 사용하여 유사입자 중화 검정(문헌[Alberini et al 2009])에서 시험하였다.
유사입자 중화 검정
FL HA를 발현하는 유사입자를 이전에 기재된 바와 같이 생성하였다(문헌[Temperton et al., 2007]). 소수의 변형과 함께, 이전에 기재된 바와 같이(문헌[Alberini et al 2009]), 루시퍼라제 리포터 유전자를 암호화하는 H5 A/Vietnam/1194/04 유사입자를 사용한 HEK293 세포의 단일 회차의 형질도입을 사용하여 중화 항체를 결정하였다. 약술하면, 열-불활성화된(56℃에서 30분) 사전-시험감염 혈청 시료를 96-웰 편평 바닥 배양 플레이트에 3벌로, 성장 배지(2 mM L-글루타민(론자(Lonza)), 1% 비필수 아미노산 용액(론자), 100 U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신(론자) 및 10% FBS(이탈리아 페로 소재의 유로클론(Euroclone))가 보충된 EBSS(스위스 바젤 소재의 론자)가 있는 MEM 이글(Eagle))에 3배 단계 희석하고, 적정된 수의 H5 A/Vietnam/1194/04 유사입자(감염 후 106 상대 발광 단위(RLU) 제공)를 첨가하였다. 37℃, 5% CO2에서 1시간 인큐베이션 후에, 웰마다 104개의 HEK293 세포를 첨가하였다. 37℃, 5% CO2에서 48시간 인큐베이션 후에, 루시퍼라제 기질(브리텔리에 플러스(Britelie Plus), 매사추세츠주 월섬 소재의 퍼킨 엘머(Perkin Elmer))을 첨가하고, 제조처의 지침에 따라 발광측정기(미트라스(Mithras) LB 940, 독일 소재의 버솔드 테크놀로지즈(Berthold Technologies))를 사용하여 발광을 측정하였다.
실시예 5, 6 및 7에 기재된 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2(SEQ ID NO: 91)로 면역화시킨 동물로부터 수득된 사전 시험감염 혈청은 유사입자 중화 검정을 사용하여 높은 혈청 농도에서 검출 가능한 중화를 보였다(도 22). 이것은 면역원으로 사용되는 경우, 광범위 중화 항체를 유도하는 본 발명의 폴리펩티드의 능력을 입증한다.
직접적인 바이러스 중화 외에, Fc-매개의 이펙터 메커니즘, 예를 들어, 항체 의존성 세포독성(ADCC) 및 항체 의존성 세포 식세포작용(ADCP)은 실질적으로 인플루엔자에 대한 보호에 기여하며, 스템-유도 bnAb는 이들 메커니즘에 특히 효율적이다(문헌[DiLillo et al., 2014]). 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2l18long(SEQ ID NO: 186)으로의 면역화 후에 유도되는 항체가 ADCC를 유도할 수 있는지의 여부를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 하기 기재된 바와 같이 마우스를 위해 조정된 ADCC 대용물 검정을 사용하여 사전-시험감염 혈청을 시험하였다(문헌[Parekh et al., 2012]; 문헌[Schneuriger et al., 2012]; 문헌[Cheng et al., 2014]).
항체 의존성 세포독성( ADCC ) 대용물 검정
인간 폐 암종-유래 A549 상피 세포(ATCC CCL-185)를 37℃, 10% CO2에서, 10% 열 불활성화 우태아 혈청이 보충된 둘베코(Dulbecco) 변형 이글 배지(DMEM)에 유지하였다. 실험 2일 전에, A549 세포를 Opti-MEM(인비트로겐) 중 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(인비트로겐)을 사용하여 H5 A/Hong Kong/156/97 HA 또는 H1 A/Brisbane/59/2007 HA를 암호화하는 플라스미드 DNA로 트랜스펙션시켰다. 검정 1일 전에, 트랜스펙션된 세포를 수집하고, ADCC를 위해 백색 96-웰 플레이트(코스타(Costar)에, 그리고 영상화를 위해 흑색 투명 바닥 96-웰 플레이트(비디 팔콘(BD Falcon))에 씨딩하였다. 24시간 후에, 시료를 검정 완충제(RPMI 1640(집코(Gibco)) 중 4% 극저 IgG FBS(집코)) 중에 희석하고, 56℃에서 30분 동안 열 불활성화시킨 다음, 검정 완충제 중에 단계 희석하였다. ADCC 생물검정을 위하여, A549 세포를 신선한 검정 완충제로 다시 채우고, 항체 희석물 및 마우스 Fc 감마 수용체 IV(FcγRIV; 프로메가(Promega))를 발현하는 ADCC 생물검정 Jurkat 이펙터 세포를 세포에 첨가하고, 1:4.5의 표적-이펙터 비로 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 15분 동안 실온으로 평형화시킨 다음, Bio-Glo 루시퍼라제 시스템 기질(프로메가)을 첨가하였다. 10분 후에 발광을 시너지 네오(Synergy Neo)(바이오테크(Biotek))에서 판독하였다. 데이터를 혈청의 부재 하의 신호의 배수 유도로서 표현한다.
이러한 검정을 사용하여, 실시예 5, 6 및 7에 기재된 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2(SEQ ID NO: 91)로 면역화시킨 동물로부터 수득한 사전-시험감염 혈청을 항원의 공급원으로서 H5N1 A/Hong Kong/156/97 또는 H1N1 A/Brisbane/59/07로부터의 FL HA로 트랜스펙션시킨 표적 세포를 사용하여 FcγRIV 신호전달 활성에 대하여 시험하였다(도 23). 둘 모두의 경우에, 시험한 가장 높은 혈청 농도에서 30배 유도가 관찰되며, 이는 마우스에서의 ADCC/ADCP 이펙터 기능을 나타내는 FcγRIV 신호전달을 활성화시키는 항체를 유도하는 본 발명의 폴리펩티드의 능력을 입증한다.
실시예 5 내지 8에 나타낸 이들 결과는 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2(SEQ ID NO: 91)의 능력이 스템-표적화, 중화 및 ADCC-매개 항체를 유도하고, 상동성, 이종 및 이종아형 그룹 I 인플루엔자 균주로의 치명적인 시험감염에 대하여 마우스를 보호할 수 있음을 보여준다.
실시예 9: 본 발명의 폴리펩티드로 면역화시킨 마우스로부터의 혈청의 수동 전달에 의한 H5N1 A/Hong Kong/156/97로의 치명적인 시험감염으로부터의 보호
관찰되는 보호에 대한 본 발명의 폴리펩티드에 의해 유도되는 항체의 기여를 결정하기 위하여, 전달 연구를 수행하였다. 이러한 연구의 목적은 보강제(매트릭스-M)의 존재하에 s127H1-t2(SEQ ID NO: 91) 및 추가의 His-태그를 함유하는 s127H1-t2long(SEQ ID NO: 101)으로 3회 면역화시킨 마우스로부터의 혈청의 수동 전달(다수의 투여)이 H5N1 인플루엔자 A/Hong Kong/156/97로의 치명적인 시험 감염에 대한 보호를 부여하는지의 여부를 평가하는 것이었다.
암컷 BALB/c 공여자 마우스(6 내지 8주령)의 그룹을 10 ㎍ 매트릭스-M 또는 PBS가 보강된 30 ㎍의 s127H1-t2(SEQ ID NO: 91) 및 C-말단 His-태그를 함유하는 s127H1-t2long(SEQ ID NO: 101)으로 3주 간격으로 3회 면역화시켰다. 마지막 면역화 후 4주(제70일)에, 혈청을 분리하고, 그룹마다 풀링하고, 수여자 마우스로 전달하였다(암컷 BALB/c, 6 내지 8주령, 그룹마다 n=10). 각 마우스에 시험감염 이전 3일 연속으로(제-3일, 제-2일 및 제-1일) 400 ㎕ 혈청을 복강내 제공하였다. 시험감염 모델에 대한 양성 대조군으로서, CR6261(15 ㎎/㎏)을 시험감염 1일 전에 투여하는 한편(n=8), PBS로의 주사를 음성 대조군으로 제공하였다(n=8). 제0일에, 마우스를 12.5xLD50 시험감염 바이러스로 시험 감염시키고, 3주 동안 모니터링하였다(생존, 체중, 임상 점수).
공여자 마우스에서 본 발명의 폴리펩티드의 면역원성을 입증하고, 수여자 마우스로의 혈청의 전달 후에 HA-특이적 항체 수준을 평가하기 위하여, 공여자 마우스의 최종 채혈일(제70일)의 풀링된 혈청 시료, 혈청 전달 이전의 나이브 수여자 마우스의 풀링된 혈청 시료(제-4일) 및 시험감염 직전 3회의 혈청 전달 후의 수여자 마우스의 개별 혈청 시료(제0일)를 H1N1 A/Brisbane/59/07로부터의 FL HA로의 결합에 대하여 ELISA에서 시험하였다.
결과
시험감염
- 실험은 유효하였고; PBS 대조군에서 모든 마우스가 시험감염 후 13일에 또는 그 이전에 감염에 굴복하는 한편(중간값 9.5일), 양성 대조군(15 ㎎/㎏ CR6261, 시험감염 1일 전)은 완전히 보호된다(p<0.001).
- 매트릭스-M이 보강된 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 91 면역화된 마우스로부터의 혈청의 나이브 수여자 마우스로의 3회의 혈청 전달은 PBS 혈청 전달 대조군에 비하여, 생존 시간의 유의미한 증가(p=0.007) 및 임상 점수의 감소(p=0.012)를 야기한다(도 24).
- 매트릭스-M이 보강된 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 101 면역화된 마우스로부터의 혈청의 나이브 수여자 마우스로의 3회의 혈청 전달은 PBS 혈청 전달 대조군에 비하여, 생존비의 유의미한 증가(p=0.002), 생존 시간의 증가(p<0.001), 체중 감소의 축소(p=0.002) 및 임상 점수의 감소(p<0.001)를 야기한다(도 24).
- 본 발명의 폴리펩티드에 대하여, 3회의 혈청 전달 후에 시험된 FL HA A/Brisbane/59/07 특이적 항체 역가는 능동 면역화 후에 수득되는 수준과 유사하였다(도 25).
결론
매트릭스-M이 보강된 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 91 및 101로의 3회의 면역화에 의해 유도되는 혈청 성분(아마도 항체)은 H5N1 A/Hong Kong/156/97로의 치명적인 시험감염으로부터 마우스를 보호할 수 있다(생존 백분율은 각각 30 및 78%이다).
실시예 10: 마우스에서의 H1N1 A/NL/602/09 시험감염 모델에서의 본 발명의 폴리펩티드의 생체내 보호 효능
PBS 대조군에 비하여 H1N1 A/NL/602/09 시험감염 모델에서 매트릭스-M과 함께, 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2(SEQ ID NO: 91) 및 추가의 His-태그를 함유하는 s127H1-t2long(SEQ ID NO: 101)의 보호 효능을 결정하였다.
10마리의 암컷 BALB/c 마우스(6 내지 8주령)의 그룹을 10 ㎍의 매트릭스-M과 함께 30 ㎍의 본 발명의 폴리펩티드로 3주 간격으로 3회 면역화시켰다. 시험감염을 위한 양성 대조군으로서, 모델 CR6261(15 ㎎/㎏)을 시험감염 1일 전에 투여하는 한편(n=8), PBS로의 주사를 음성 대조군으로 제공하였다(n=18). 마지막 면역화 4주 후에, 마우스를 12.5xLD50 시험감염 바이러스로 시험 감염시키고, 3주 동안 모니터링하였다(생존, 체중, 임상 점수).
본 발명의 폴리펩티드의 면역원성을 입증하기 위하여, 사전-시험감염 혈청(제-1일)을 H1N1 A/Brisbane/59/07로부터의 FL HA로의 결합에 대하여 ELISA 검정에서 시험하였다. 유도된 항체가 CR9114 에피토프에 매우 인접하게 결합하는지의 여부를 결정하기 위하여, CR9114 경쟁 ELISA를 수행하였다. 경쟁 데이터를 반응을 정량화할 수 있도록 기울기 OD를 사용하여 표현하였다.
결과
- 실험은 유효하였고; PBS 대조군에서 모든 마우스가 시험감염 후 8일에 또는 그 이전에 감염에 굴복하는 한편(중간값 5일), 양성 대조군(15 ㎎/㎏ CR6261, 시험감염 1일 전)은 완전히 보호된다(p<0.001).
- 매트릭스-M이 보강된 s127H1-t2(SEQ ID NO: 91) 및 추가의 His-태그를 함유하는 s127H1-t2long(SEQ ID NO: 101)로의 3회의 면역화는 PBS 대조군에 비하여, 생존비의 유의미한 증가(p<0.001), 생존 시간의 증가(p<0.001) 및 임상 점수의 감소(p<0.001)를 야기한다(도 26).
- 매트릭스-M이 보강된 H1 미니-HA 변이체 s127H1-t2(SEQ ID NO: 91)로의 3회의 면역화는 PBS 대조군에 비하여, 체중의 유의미한 감소(p<0.001)를 야기한다(도 26).
- 본 발명의 폴리펩티드에 의해 유도되는 H1N1 A/Brisbane/59/07 FL HA에 대한 IgG 항체 역가는 시험된 모든 H1 미니-HA 변이체에 대하여 PBS에 비하여 유의미하게 더 높다(p<0.001)(도 27a).
- H1 미니-HA 변이체 s127H1-t2(SEQ ID NO: 91)는 추가의 His-태그를 함유하는 s127H1-t2long(SEQ ID NO: 101)에 비하여 유의미하게 더 높은 H1N1 A/Brisbane/59/07 FL HA에 대한 IgG 항체 역가를 갖는다(도 27a).
- 시험된 모든 매트릭스-M이 보강된 본 발명의 폴리펩티드는 PBS에 비하여 유의미하게 더 높은 CR9114 경쟁 역가를 갖는다(p<0.001)(도 27b).
결론:
매트릭스-M이 보강된 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2(SEQ ID NO: 91) 및 추가의 His-태그를 함유하는 s127H1-t2long(SEQ ID NO: 101)은 H1N1 A/NL/602/09로의 치명적인 시험감염에 대하여 보호를 부여하며, 이는 생존비, 생존 기간의 증가 및 임상 점수의 감소로 관찰된다. 또한, 매트릭스-M이 보강된 s127H1-t2(SEQ ID NO: 91)는 H1N1 A/NL/602/09로의 치명적인 시험감염 후에 감소된 체중 감소도 또한 초래한다.
실시예 11: 라이브러리 스크리닝
PCT/EP2012/073706호에는 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드, 조성물 및 백신 및 인플루엔자의 예방 및/또는 치료 분야에서의 그들의 이용 방법이 개시되어 있다. 본 명세서에서, 본 발명자들은 H1N1 A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO: 1)의 전장 HA로부터 유래된 스템 도메인 폴리펩티드의 추가의 서열을 기술한다. 스템 도메인 폴리펩티드는 H1-미니2-클러스터1+5+6-GCN4t2(SEQ ID NO: 52)의 위치-지정 돌연변이에 의해 수득되며, CR6261(문헌[Throsby et al, 2009]; 문헌[Ekiert et al 2010]) 및/또는 CR9114의 광범위 인플루엔자 중화 에피토프를 제시한다.
H1-미니2-클러스터1+5+6-GCN4t2(SEQ ID NO: 52)를 하기의 단계를 행함으로써 H1N1 A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO: 1)의 전장 HA로부터 유도하였다:
- HA0 내의 절단 부위의 제거. 이러한 부위에서의 야생형 HA의 절단은 HA1 및 HA2를 초래한다. 당해 제거는 P1 위치에서의 R에서 Q로의 돌연변이에 의해 달성될 수 있다(예를 들어, 절단 부위(SEQ ID NO: 1에서 위치 343)의 명명법의 설명에 대해서는 문헌[Sun et al, 2010] 참조).
- SEQ ID NO; 1로부터 아미노산 53 내지 320을 결실시킴에 의한 헤드 도메인의 제거. 서열의 나머지 N- 및 C-말단 부분을 4개 잔기의 유연성 링커, GGGG에 의해 연결하였다.
- 변형된 HA의 융합 이전 형태의 안정성을 증가시키고, 융합 이후 형태를 불안정화시키기 위한, H1 A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO: 1) 내의 잔기 402 내지 418(그의 동등한 잔기)에 의해 형성되는 루프(A-헬릭스와 CD-헬릭스 사이)의 가용성의 증가. H1-미니2-클러스터1+5+6-GCN4(SEQ ID NO: 2)에, 돌연변이 F406S, V409T, F413G 및 L416S(넘버링은 SEQ ID NO: 1을 언급함)를 도입하였다.
- H1 A/Brisbane/59/2007에서 위치 324 및 436에서의 아미노산 사이의 이황화 가교의 도입; 이것은 돌연변이 R324C 및 Y436C를 도입함으로써 달성된다(넘버링은 SEQ ID NO: 1을 언급함).
- 위치 419 내지 433(넘버링은 SEQ ID NO: 1을 언급함)에 삼량체화하는 것으로 알려져 있는 GCN4 유래 서열 RMKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO: 20)의 도입.
특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 HA의 세포내 서열 및 막횡단 도메인을 함유한다. 다른 구현예에서, 막횡단 및 세포내 도메인의 서열을 HA2의 위치 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 526, 527, 528, 529 또는 530(또는 서열 정렬로부터 결정시 그의 동등한 위치)으로부터 HA2의 C-말단(SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링)까지 결실시켜, 세포에서의 발현 후에 분비된(가용성) 폴리펩티드가 생성되게 하였다. 가용성 폴리펩티드를 삼량체 구조를 형성하는 것으로 알려져 있는 서열, 즉, 선택적으로 상기 기재된 바와 같이 짧은 링커를 통해 연결되는 폴드온 서열 AYVRKDGEWVLL(SEQ ID NO: 3)을 도입함으로써 더욱 안정화시킬 수 있다. 링커는 선택적으로 당업자에게 널리 공지되어 있는 프로토콜에 따른 이후의 처리를 위한 절단 부위를 함유할 수 있다. 가용성 형태의 정제 및 검출을 용이하게 하기 위하여, 태그 서열, 예를 들어, 선택적으로 짧은 링커를 통해 연결되는 히스티딘 태그(HHHHHHH(SEQ ID NO: 16) 또는 HHHHHH(SEQ ID NO: 15) 또는 FLAG 태그(DYKDDDDK; SEQ ID NO: 22) 또는 이들의 조합이 선택적으로 부가될 수 있다. 링커는 선택적으로 당업자에게 널리 공지되어 있는 프로토콜에 따른 이후의 처리를 위한 단백질 가수분해 절단 부위(그의 부분), 예를 들어, LVPRGS(SEQ ID NO: 23)(트롬빈) 또는 IEGR(SEQ ID NO: 24)(인자 X)을 함유할 수 있다. 처리된 단백질도 또한 본 발명에 포함된다.
FLAG-태그, 트롬빈 절단 부위, 폴드온 및 His 서열을 조합한 이러한 C-말단 서열의 예는 SEQ ID NO: 4 FLAG-트롬빈-폴드온-His이다. 이러한 서열을 가용성 형태의 H1-미니2-클러스터1+5+6-GCN4t2(SEQ ID NO: 51) 서열과 조합하여, 모체 서열(SEQ ID NO: 156)을 생성하였으며, 이를 사용하여, 돌연변이유발에 의해 본 발명의 신규한 폴리펩티드를 생성하였다. 이러한 서열은 SEQ ID NO: 1 및 2의 아미노산 1 내지 17에 상응하는 리더 서열을 함유하지 않는다.
분자의 헤드 도메인을 암호화하는 헤마글루티닌 서열의 부분을 결실시키고, PCT/2012/073706호 및 상기에 기재된 바와 같이 링커를 통해 결실의 어느 하나의 측에 서열의 N- 및 C-말단 부분을 재연결시킴으로써 스템 도메인 폴리펩티드를 생성한다. 헤드 도메인의 제거는 이전에 수성 용매로부터 보호된 분자의 부분이 노출되게 하여, 잠재적으로 본 발명의 폴리펩티드의 구조를 불안정화시킨다. 이런 이유로, B-루프 내의 잔기(특히 아미노산 잔기 406(각각 SEQ ID NO: 1 및 2에서 F 및 S), 409(V 및 T) 413(F 및 G) 및 416(L 및 S))를 출발점으로서 모체 서열 SEQ ID NO: 156을 사용하여 다양한 조합으로 돌연변이시켰다. 리더 서열을 제거하고, 잔기 520 내지 565를 Flag-트롬빈-폴드온--his 서열(SEQ ID NO: 4)로 대체함으로써 SEQ ID NO: 156을 H1-미니2-클러스터1+5+6-GCN4t2(SEQ ID NO: 52)로부터 생성하였다.
유사하게, 융합 펩티드 주변의 영역에서, 다수의 소수성 잔기가 용매에 노출되며, 이는 고유 전장 HA와 달리, 본 발명의 폴리펩티드가 절단될 수 없고, 소수성 융합 펩티드를 단백질의 내부에 매립하는 관련 형태 변화를 겪을 수 없다는 사실에 의해 야기된다. 이러한 문제를 다루기 위하여, SEQ ID NO: 156에서의 잔기 I337, I340, F352 및 I353 중 일부 또는 전부도 또한 돌연변이시켰다.
2가지 상이한 세트의 돌연변이 폴리펩티드가 표 9에 개시되어 있다. 모든 경우에, 이들 폴리펩티드는 위치 419 내지 433에 SEQ ID NO: 20을 함유한다(넘버링은 SEQ ID NO: 1을 언급함).
실시예 12: 본 발명의 삼량체 폴리펩티드의 확인, 정제 및 특성화.
위치 419 내지 433에 SEQ ID NO: 20을 함유하는 실시예 11에 기재된 바와 같은 폴리펩티드의 라이브러리(세트 1 및 세트 2)를 생성하였다. 단일의 클론으로부터 HEK293F 세포로 개별적으로 트랜스펙션시키고, 다량체(CR9114 샌드위치 ELISA), CR6261 결합(ELISA) 및 단백질 발현(HTRF 검정)에 대하여 배양 배지를 스크리닝하였다. CR9114 샌드위치 검정, CR9114, CR6261 및 CR8020 ELISA 및 HTRF 검정을 기반으로 한 힛트를 확인하고 순위를 정하였다.
일차 아민(라이신 잔기에 존재) 특이적 교차 결합제 BS3과의 교차 결합에 이어서, SDS-PAGE(하기 참조)에 의해 다량체화를 평가하였다. 광범위 다량체화 때문에, C-말단 Flag-폴드온-His(FFH) 태그 서열을 트롬빈 절단 부위 및 his-태그 서열(TCShis)로 대체하였다. 이후에, TCS-his 함유 서열의 다량체화(CR9114 샌드위치 검정, BS3 교차 결합)를 재확인하고, 클론의 순위를 정하고, 선택하였다. 선택된 클론을 발현하고, 정제하고, 특성화시켰다.
교차 결합 검정을 하기와 같이 수행하였다:
· 배양 배지에 교차 결합제 BS3(비스(설포석신이미딜)수베레이트)를 직접 첨가한다.
· 실온에서 30분 동안 인큐베이션시킨다.
· 배지를 수집하고, 환원(R, 5 mM DTT) 및 비-환원(NR) 조건하에 SDS-PAGE/웨스턴 블롯에 의해 분석한다.
· 오직 환원 조건하에서만, BS3-교차 결합된 종이 계속 공유 결합될 것이다.
· his-태그 특이적 mAb를 사용한 웨스턴 블롯팅을 통한 미니-HA의 검출.
결과:
1. 위치 419 내지 433에 SEQ ID NO: 20을 함유하고, 예상되는 서열 변이(97% 초과의 무작위화)를 함유하는 고 품질(90% 초과의 올바른 ORF)의 2개의 라이브러리를 성공적으로 생성하였다.
2. 총 10472개의 클론(각각 세트 1 및 2로부터 5544개 및 4928개)을 일차 스크린에서 평가하였다(도 28).
3. FL HA 발현의 50% 초과의 발현을 나타내는 클론 및 FL HA에 대하여 관찰되는 신호의 80% 초과의 CR6261로의 결합 신호를 힛트로 고려하였으며; 이러한 절차는 703개의 힛트를 제공하였다(각각 라이브러리 1 및 2로부터 596개 및 107개).
4. 확인 스크리닝 후에 703개 중 658개의 힛트가 유지되었다.
5. 상위 20%의 힛트(111)의 교차 결합 검정에 의해, 잠재적으로 삼량체 종의 정제를 간섭할 수 있는 보다 고차의 다량체의 존재가 나타났다.
6. 상위 20%의 확인된 힛트(111)를 성공적으로 클로닝하여, FFH C-말단을 TCS-his 서열로 대체한 다음, CR9114 샌드위치 ELISA 및 교차 결합 검정 평가를 행하였다.
7. 교차 결합 검정에 의해, 가장 유망한 삼량체 후보물질로 여겨지는 9개의 클론을 제공하였다(SEQ ID NO: 158 내지 166, 표 11). CR9114 샌드위치 ELISA에 기반하여(도 29), 3개의 후보물질(TCS-his가 있는 2개, FFH C-말단이 있는 1개)을 발현 및 정제를 위해 선택하였다.
8. 선택된 후보물질 중 2개는 잘 발현하지 않았으며, 정제를 계속하지 않았다. 후보물질 GW1.5E2.FFH(SEQ ID NO: 158)를 실시예 4에 기재된 바와 같은 절차에 따라, 균질해질 때까지 정제하였다(7.6 mg의 총 단백질; 95% 초과의 순도, HP-SEC).
9. SEC-MALS 분석에 의한 GW1.5E2.FFH(SEQ ID NO: 158)의 특성화에 의해, 용액 중 삼량체 형성과 함께, 삼량체마다 CR9114 또는 CR6261의 3개의 Fab 단편이 결합하는 것이 나타난다(도 30 및 하기 표 10). 이중층 간섭계 측정(Octet)으로부터 결정되는 바와 같은 Kd app는 CR6261 및 CR9114 둘 모두에 대하여 1 nM이다. 예상되는 바와 같이, CR8020(음성 대조군)의 결합은 어느 하나의 방법에 의해 검출될 수 없었다.
결론: 3:1 화학량론에서, 고 친화성으로 bnAb CR6261 및 CR9114에 결합하는 본 발명의 비-공유 삼량체 폴리펩티드(GW1.5E2.FFH, SEQ ID NO: 158)를 확인하였다.
실시예 13: H1N1 A/Brisbane/59/07 마우스 모델에서의 본 발명의 폴리펩티드 sH1 미니-HA GW1.5E2-FFH(SEQ ID NO: 158)의 보호 효능 .
PBS 대조군에 비하여 H1N1 A/Brisbane/59/07 시험감염 모델에서 매트릭스-M이 보강된 sH1 미니-HA GW1.5E2-FFH(SEQ ID NO: 158)의 보호 효능을 결정하였다.
10마리의 암컷 BALB/c 마우스(6 내지 8주령)의 그룹을 10 ㎍의 매트릭스-M이 보강된 30 ㎍의 sH1 미니-HA GW1.5E2-FFH(SEQ ID NO: 158)로 3주 간격으로 3회 면역화시켰다. 시험감염 모델을 위한 양성 대조군으로서, CR6261(15 ㎎/㎏)을 시험감염 1일 전에 투여하는 한편(n=8), PBS로의 주사를 음성 대조군으로 제공하였다(n=16). 마지막 면역화 4주 후에, 마우스를 12.5xLD50 시험감염 바이러스로 시험 감염시키고, 3주 동안 모니터링하였다(생존, 체중, 임상 점수).
sH1 미니-HA GW1.5E2-FFH(SEQ ID NO: 158)의 면역원성을 입증하기 위하여, 사전-시험감염 혈청(제-1일)을 H1N1 A/Brisbane/59/07로부터의 FL HA로의 결합에 대하여 ELISA 검정에서 시험하였다. 본 발명의 폴리펩티드 sH1 미니-HA GW1.5E2-FFH(SEQ ID NO: 158)가 CR9114 에피토프에 인접하게 결합하는지의 여부를 결정하기 위하여, CR9114 경쟁 ELISA를 수행하였다. 경쟁 데이터를 (A-P)/Ax100으로 정의되며, A는 혈청이 존재하지 않는 경우 FL HA에 결합하는 CR9114의 최대 OD 신호이며, P는 주어진 희석의 혈청의 존재하에 FL HA에 결합하는 CR9114의 OD 신호인 '경쟁%'로서 가시화시키거나, 기울기 OD 계량을 사용하여 표현하여, 반응을 정량화하였으며; 참조를 위하여, CR9114 및 CR8020(출발 농도 5 ㎎/㎖) 용액을 포함시켰다.
결과:
- 실험은 유효하였고; PBS 대조군(n=16)에서 모든 마우스가 시험감염 후 10일에 또는 그 이전에 감염에 굴복하는 한편(중간값 8일), 양성 대조군(n=8, 15 ㎎/㎏ CR6261, 시험감염 1일 전)은 완전히 보호된다(p<0.001).
- 매트릭스-M이 보강된 sH1 미니-HA GW1.5E2-FFH(SEQ ID NO: 158)로의 3회의 면역화는 PBS 대조군에 비하여, 생존비의 유의미한 증가(p<0.001), 생존 시간의 증가(p<0.001), 체중 감소의 축소(p<0.001) 및 임상 점수의 감소(p<0.001)를 야기한다(도 31).
- sH1 미니-HA GW1.5E2-FFH(SEQ ID NO: 158)에 의해 유도되는 H1N1 A/Brisbane/59/07 FL HA에 대한 사전-시험감염 IgG 항체 역가는 PBS에 비하여 유의미하게 더 높다(p≤0.001)(도 32a).
- 2회의 면역화 후의 H1N1 A/Brisbane/59/07 FL HA 안정기에 대한 IgG 항체 역가(미도시).
- 매트릭스-M이 보강된 본 발명의 폴리펩티드 sH1 미니-HA GW1.5E2-FFH(SEQ ID NO: 158)는 PBS에 비하여 유의미하게 더 높은 CR9114 경쟁 역가를 유도한다(p<0.001)(도 32b).
결론: 매트릭스-M이 보강된 본 발명의 폴리펩티드 sH1 미니-HA GW1.5E2-FFH(SEQ ID NO: 158)는 H1N1 A/Brisbane/59/07로의 치명적인 시험 감염에 대한 보호를 부여한다.
실시예 14: H5N1 A/Hong Kong/156/97 마우스 모델에서의 본 발명의 폴리펩티드 sH1 미니-HA GW1.5E2-FFH(SEQ ID NO: 158)의 보호 효능
PBS 대조군에 비하여 H5N1 A/Hong Kong/156/97 시험감염 모델에서 매트릭스-M이 보강된 선도 H1 미니-HA 변이체의 보호 효능을 결정하였다.
10마리의 암컷 BALB/c 마우스(6 내지 8주령)의 그룹을 10 ㎍의 매트릭스-M이 보강된 30 ㎍의 본 발명의 폴리펩티드 sH1 미니-HA GW1.5E2-FFH(SEQ ID NO: 158)로 3주 간격으로 3회 면역화시켰다. 시험감염 모델을 위한 양성 대조군으로서, CR6261(15 ㎎/㎏)을 시험감염 1일 전에 투여하는 한편(n=8), PBS로의 주사를 음성 대조군으로 사용하였다(n=16). 마지막 면역화 4주 후에, 마우스를 12.5xLD50 시험감염 바이러스로 시험 감염시키고, 3주 동안 모니터링하였다(생존, 체중, 임상 점수).
본 발명의 폴리펩티드 sH1 미니-HA GW1.5E2-FFH(SEQ ID NO: 158)의 면역원성을 입증하기 위하여, 사전-시험감염 혈청(제-1일)을 H1N1 A/Brisbane/59/07로부터의 FL HA로의 결합에 대하여 ELISA 검정에서 시험하였다. 미니-HA 유도된 항체가 CR9114 에피토프에 인접하게 결합하는지의 여부를 결정하기 위하여, CR9114 경쟁 ELISA를 수행하였다. 경쟁 데이터를 (A-P)/Ax100으로 정의되며, A는 혈청이 존재하지 않는 경우 FL HA에 결합하는 CR9114의 최대 OD 신호이며, P는 주어진 희석의 혈청의 존재하에 FL HA에 결합하는 CR9114의 OD 신호인 '경쟁%'로서 가시화시키거나, 기울기 OD 계량을 사용하여 표현하여, 반응을 정량화할 수 있었으며; 참조를 위하여, CR9114 및 CR8020(출발 농도 5 ㎍/㎖) 용액을 포함시켰다.
결과:
- 실험은 유효하였고; PBS 대조군에서 16마리 중 15마리의 마우스가 시험감염 후 9일에 또는 그 이전에 감염에 굴복하는 한편(중간값 9일), 양성 대조군(n=8, 15 ㎎/㎏ CR6261, 시험감염 1일 전)은 완전히 보호된다(p<0.001).
- 매트릭스-M이 보강된 본 발명의 폴리펩티드 sH1 미니-HA GW1.5E2-FFH(SEQ ID NO: 158)로의 3회의 면역화는 PBS 대조군에 비하여, 생존비의 유의미한 증가(p<0.001), 생존 시간의 증가(p<0.001), 체중 감소의 축소(p<0.001) 및 임상 점수의 감소(p<0.001)를 야기한다(도 33).
- 본 발명의 폴리펩티드 sH1 미니-HA GW1.5E2-FFH(SEQ ID NO: 158)에 의해 유도되는 H1N1 A/Brisbane/59/07 FL HA에 대한 사전-시험감염 IgG 항체 역가는 PBS에 비하여 유의미하게 더 높다(p≤0.001)(도 34a).
- 매트릭스-M이 보강된 본 발명의 폴리펩티드 sH1 미니-HA GW1.5E2-FFH(SEQ ID NO: 158)는 PBS에 비하여 유의미하게 더 높은 CR9114 경쟁 역가를 유도한다(p<0.001)(도 34b).
결론: 매트릭스-M이 보강된 본 발명의 폴리펩티드 sH1 미니-HA GW1.5E2-FFH(SEQ ID NO: 158)는 H5N1 A/Hong Kong/156/97로의 치명적인 시험감염에 대하여 이종아형 보호를 부여한다.
실시예 15: H1N1 A/Puerto Rico/8/34 마우스 모델에서의 본 발명의 폴리펩티드 sH1 미니-HA GW1.5E2-FFH(SEQ ID NO: 158)의 보호 효능
PBS 대조군에 비하여 H1N1 A/Puerto Rico/8/1934 시험감염 모델에서 매트릭스-M이 보강된 본 발명의 폴리펩티드 sH1 미니-HA GW1.5E2-FFH(SEQ ID NO: 158)의 보호 효능을 결정하였다.
10마리의 암컷 BALB/c 마우스(6 내지 8주령)의 그룹을 10 ㎍의 매트릭스-M이 보강된 30 ㎍의 본 발명의 폴리펩티드 sH1 미니-HA GW1.5E2-FFH(SEQ ID NO: 158)로 3주 간격으로 3회 면역화시켰다. 시험감염 모델을 위한 양성 대조군으로서, CR6261(15 ㎎/㎏)을 시험감염 1일 전에 투여하는 한편(n=8), PBS로의 3회의 면역화를 음성 대조군으로 제공하였다(n=16). 마지막 면역화 4주 후에, 마우스를 25xLD50 시험감염 바이러스로 시험 감염시키고, 3주 동안 모니터링하였다(생존, 체중, 임상 점수).
본 발명의 폴리펩티드 sH1 미니-HA GW1.5E2-FFH(SEQ ID NO: 158)의 면역원성을 입증하기 위하여, 사전-시험감염 혈청(제-1일)을 H1N1 A/Brisbane/59/07로부터의 FL HA로의 결합에 대하여 ELISA 검정에서 시험하였다. 미니-HA 유도된 항체가 CR9114 에피토프에 인접하게 결합하는지의 여부를 결정하기 위하여, CR9114 경쟁 ELISA를 수행하였다. 경쟁 데이터를 (A-P)/Ax100으로 정의되며, A는 혈청이 존재하지 않는 경우 FL HA에 결합하는 CR9114의 최대 OD 신호이며, P는 주어진 희석의 혈청의 존재하에 FL HA에 결합하는 CR9114의 OD 신호인 '경쟁%'로서 가시화시키거나, 기울기 OD 계량을 사용하여 표현하여, 반응을 정량화할 수 있었으며; 참조를 위하여, CR9114 및 CR8020(출발 농도 5 ㎍/㎖) 용액을 포함시켰다.
결과
- 실험은 유효하고; PBS 대조군(n=16)에서 모든 마우스가 시험감염 후 9일에 또는 그 이전에 감염에 굴복하는 한편(중간값 8일), 양성 대조군(n=8, 15 ㎎/㎏ CR6261, 시험감염 1일 전)은 완전히 보호된다(p<0.001).
- 매트릭스-M이 보강된 본 발명의 폴리펩티드 sH1 미니-HA GW1.5E2-FFH(SEQ ID NO: 158)로의 3회의 면역화는 PBS 대조군에 비하여, 생존비의 유의미한 증가(p<0.001), 생존 시간의 증가(p<0.001), 체중 감소의 축소(p<0.001) 및 임상 점수의 감소(p<0.001)를 야기한다(도 35).
- 본 발명의 폴리펩티드 sH1 미니-HA GW1.5E2-FFH(SEQ ID NO: 158)에 의해 유도되는 H1N1 A/Brisbane/59/07 FL HA에 대한 사전-시험감염 IgG 항체 역가는 PBS에 비하여 유의미하게 더 높다(p<0.001)(도 36a).
- 매트릭스-M이 보강된 본 발명의 폴리펩티드 sH1 미니-HA GW1.5E2-FFH(SEQ ID NO: 158)는 PBS에 비하여 유의미하게 더 높은 CR9114 경쟁 역가를 유도한다(p<0.001)(도 36b).
결론: 매트릭스-M이 보강된 본 발명의 폴리펩티드 sH1 미니-HA GW1.5E2-FFH(SEQ ID NO: 158)는 H1N1 A/Puerto Rico/8/34로의 치명적인 시험감염에 대하여 보호를 부여한다.
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참고문헌
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서열
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SEQUENCE LISTING <110> Crucell Holland B.V. <120> INFLUENZA VIRUS VACCINES AND USES THEREOF <130> 0240 WO 00 ORD <150> EP14176451.4 <151> 2014-07-10 <160> 158 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 565 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H1 Full length (A/Brisbane/59/2007) <400> 1 Met Lys Val Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asn Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly Ile 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Ser Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu Ile Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Lys Pro Asn Pro Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly His Phe 100 105 110 Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125 Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr 130 135 140 Val Thr Gly Val Ser Ala Ser Cys 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Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His 355 360 365 His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr 370 375 380 Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu 385 390 395 400 Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu 405 410 415 Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Ile 420 425 430 Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu 435 440 445 Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys 450 455 460 Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys 465 470 475 480 Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asp Glu Cys Met Glu Ser Val Lys 485 490 495 Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn 500 505 510 Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln 515 520 525 Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val 530 535 540 Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln 545 550 555 560 Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 2 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H1-mini2-cluster1+5+6-GCN4 <400> 2 Met Lys Val Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asn Gly Gly Gly Gly Lys Tyr Val Cys Ser Ala Lys Leu 50 55 60 Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Gln Gly 65 70 75 80 Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met 85 90 95 Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly 100 105 110 Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr 115 120 125 Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Ser Thr Ala 130 135 140 Thr Gly Lys Glu Gly Asn Lys Ser Glu Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp 145 150 155 160 Lys Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Gln Ile Trp Cys Tyr Asn Ala Glu 165 170 175 Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser 180 185 190 Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn 195 200 205 Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn 210 215 220 Asp Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys 225 230 235 240 Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys 245 250 255 Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val 260 265 270 Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp 275 280 285 Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 290 295 300 <210> 3 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> foldon <400> 3 Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys 1 5 10 15 Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 20 25 <210> 4 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLAG-thrombin-foldon-HIS <400> 4 Ser Gly Arg Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu Val Pro Arg Gly 1 5 10 15 Ser Pro Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala 20 25 30 Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly 35 40 45 His His His His His His 50 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Trimerization domain <400> 5 Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Gln 1 5 10 15 <210> 6 <211> 292 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H1-mini2-cluster1+5+6-GCN4 without leader sequence and with FLAG-thrombin-foldon-HIS <400> 6 Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val 1 5 10 15 Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu 20 25 30 Leu Glu Asn Gly Gly Gly Gly Lys Tyr Val Cys Ser Ala Lys Leu Arg 35 40 45 Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Gln Gly Leu 50 55 60 Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val 65 70 75 80 Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr 85 90 95 Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn 100 105 110 Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Ser Thr Ala Thr 115 120 125 Gly Lys Glu Gly 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OR K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> X= K OR R <400> 7 Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Xaa Leu Glu 1 5 10 15 Xaa <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H1 HA2 amino acid sequence connecting the C-terminal residue of helix A and the N-terminal residue of helix CD <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X= M, E, K, V, R, T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X= F, I, N, T, H, L, Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X= V, A, G, I, R, F, S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> X= F, I, N, S, T, Y, E, K, M, V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X= F, I, N, S, T, Y, E, K, M, V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X= H or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> X= L, H, I, N, R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> X= K or R <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 8 Xaa Asn Thr Gln Xaa Thr Ala Xaa Gly Lys Glu Xaa Asn Xaa Xaa Leu 1 5 10 15 Glu Xaa <210> 9 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CR6261 VH <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Pro Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Asp Phe Ala Gly Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys His Met Gly Tyr Gln Val Arg Glu Thr Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CR6261 VL PROTEIN <400> 10 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asp 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 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Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu 225 230 235 240 Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Glu Gly 245 250 <210> 148 <211> 284 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SYNTHETIC <220> <221> MISC_FEATURE <222> (56)..(56) <223> X1= E, I, K, V, A, or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (58)..(58) <223> X2= I, K, R, T, F, N, S, or Y <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (71)..(71) <223> X3= I, D, F, V, Y, A, I, N, S, T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (72)..(72) <223> X4= I, K, R, T, E, G, V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (121)..(121) <223> X5= M, E, K, V, R, T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (125)..(125) <223> X6= F, I, N, S, T, Y, H, L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (128)..(128) <223> X7= A, G, I, R, T, V, F, S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (132)..(132) <223> X8= F, I, N, S, T, Y, G, E, K, M, V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (135)..(135) <223> X9= H, I, L, N, R, S <400> 148 Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val 1 5 10 15 Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu 20 25 30 Leu Glu Asn Gly Gly Gly Gly Lys Tyr Val Cys Ser Ala Lys Leu Arg 35 40 45 Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Xaa Pro Ser Xaa Gln Ser Gln Gly Leu 50 55 60 Phe Gly Ala Ile Ala Gly Xaa Xaa Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val 65 70 75 80 Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr 85 90 95 Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn 100 105 110 Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Xaa Asn Thr Gln Xaa Thr Ala Xaa 115 120 125 Gly Lys Glu Xaa Asn Lys Xaa Glu Arg Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp 130 135 140 Lys Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Ile Trp Cys Tyr Asn Ala Glu Leu 145 150 155 160 Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn 165 170 175 Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala 180 185 190 Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asp 195 200 205 Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr 210 215 220 Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu 225 230 235 240 Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala 245 250 255 Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met 260 265 270 Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 275 280 <210> 149 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> smH1 Cali3964-55G7 <400> 149 Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn 1 5 10 15 Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Gly Gly Gly Gly Lys Tyr Val Cys Ser Thr Lys Leu 50 55 60 Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Lys Pro Ser Asn Gln Ser Gln Gly 65 70 75 80 Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Tyr Val Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met 85 90 95 Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly 100 105 110 Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr 115 120 125 Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Tyr Thr Ala 130 135 140 Ile Gly Lys Glu Met Asn His Leu Glu Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp 145 150 155 160 Lys Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Gln Ile Trp Cys Tyr Asn Ala Glu 165 170 175 Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser 180 185 190 Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn 195 200 205 Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp 210 215 220 Asn Thr Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys 225 230 235 240 Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Arg Ser 245 250 255 Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly His His His His His His 260 265 270 <210> 150 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> smH1 Cali3964-86B4 <400> 150 Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn 1 5 10 15 Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Gly Gly Gly Gly Lys Tyr Val Cys Ser Thr Lys Leu 50 55 60 Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Lys Pro Ser Asn Gln Ser Gln Gly 65 70 75 80 Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Tyr Lys Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met 85 90 95 Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly 100 105 110 Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr 115 120 125 Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala 130 135 140 Ile Gly Lys Glu Met Asn His Ile Glu Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp 145 150 155 160 Lys Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Gln Ile Trp Cys Tyr Asn Ala Glu 165 170 175 Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser 180 185 190 Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn 195 200 205 Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp 210 215 220 Asn Thr Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys 225 230 235 240 Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Arg Ser 245 250 255 Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly His His His His His His 260 265 270 <210> 151 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> smH1 Cali3964-127H1 <400> 151 Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn 1 5 10 15 Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Gly Gly Gly Gly Lys Tyr Val Cys Ser Thr Lys Leu 50 55 60 Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Lys Pro Ser Lys Gln Ser Gln Gly 65 70 75 80 Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Thr Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met 85 90 95 Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly 100 105 110 Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr 115 120 125 Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Tyr Thr Ala 130 135 140 Ile Gly Lys Glu Tyr Asn His Ser Glu Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp 145 150 155 160 Lys Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Gln Ile Trp Cys Tyr Asn Ala Glu 165 170 175 Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser 180 185 190 Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn 195 200 205 Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp 210 215 220 Asn Thr Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys 225 230 235 240 Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Arg Ser 245 250 255 Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly His His His His His His 260 265 270 <210> 152 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> smH1 Cali3964-55G7-t2 <400> 152 Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn 1 5 10 15 Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Gly Gly Gly Gly Lys Tyr Val Cys Ser Thr Lys Leu 50 55 60 Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Lys Pro Ser Asn Gln Ser Gln Gly 65 70 75 80 Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Tyr Val Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met 85 90 95 Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly 100 105 110 Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr 115 120 125 Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Tyr Thr Ala 130 135 140 Ile Gly Lys Glu Met Asn His Leu Glu Arg Arg Met Lys Gln Ile Glu 145 150 155 160 Asp Lys Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Ile Trp Cys Tyr Asn Ala Glu 165 170 175 Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser 180 185 190 Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn 195 200 205 Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp 210 215 220 Asn Thr Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys 225 230 235 240 Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Arg Ser 245 250 255 Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly His His His His His His 260 265 270 <210> 153 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> smH1 Cali3964-86B4-t2 <400> 153 Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn 1 5 10 15 Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Gly Gly Gly Gly Lys Tyr Val Cys Ser Thr Lys Leu 50 55 60 Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Lys Pro Ser Asn Gln Ser Gln Gly 65 70 75 80 Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Tyr Lys Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met 85 90 95 Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly 100 105 110 Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr 115 120 125 Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala 130 135 140 Ile Gly Lys Glu Met Asn His Ile Glu Arg Arg Met Lys Gln Ile Glu 145 150 155 160 Asp Lys Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Ile Trp Cys Tyr Asn Ala Glu 165 170 175 Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser 180 185 190 Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn 195 200 205 Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp 210 215 220 Asn Thr Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys 225 230 235 240 Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Arg Ser 245 250 255 Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly His His His His His His 260 265 270 <210> 154 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> smH1 Cali3964-127H1-t2 <400> 154 Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn 1 5 10 15 Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Gly Gly Gly Gly Lys Tyr Val Cys Ser Thr Lys Leu 50 55 60 Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Lys Pro Ser Lys Gln Ser Gln Gly 65 70 75 80 Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Thr Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met 85 90 95 Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly 100 105 110 Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr 115 120 125 Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Tyr Thr Ala 130 135 140 Ile Gly Lys Glu Tyr Asn His Ser Glu Arg Arg Met Lys Gln Ile Glu 145 150 155 160 Asp Lys Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Ile Trp Cys Tyr Asn Ala Glu 165 170 175 Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser 180 185 190 Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn 195 200 205 Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp 210 215 220 Asn Thr Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys 225 230 235 240 Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Arg Ser 245 250 255 Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly His His His His His His 260 265 270 <210> 155 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mH1 Cali3964-127H1-t2 <400> 155 Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn 1 5 10 15 Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Gly Gly Gly Gly Lys Tyr Val Cys Ser Thr Lys Leu 50 55 60 Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Lys Pro Ser Lys Gln Ser Gln Gly 65 70 75 80 Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Thr Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met 85 90 95 Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly 100 105 110 Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr 115 120 125 Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Tyr Thr Ala 130 135 140 Ile Gly Lys Glu Tyr Asn His Ser Glu Arg Arg Met Lys Gln Ile Glu 145 150 155 160 Asp Lys Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Ile Trp Cys Tyr Asn Ala Glu 165 170 175 Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser 180 185 190 Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn 195 200 205 Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp 210 215 220 Asn Thr Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys 225 230 235 240 Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys 245 250 255 Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val 260 265 270 Ala Ser Ser Leu Val Leu Val Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp 275 280 285 Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 290 295 300 <210> 156 <211> 286 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sH1-mini2-cluster1+5+6-GCN4t2 without leader sequence and with FLAG-foldon-HIS <400> 156 Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val 1 5 10 15 Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu 20 25 30 Leu Glu Asn Gly Gly Gly Gly Lys Tyr Val Cys Ser Ala Lys Leu Arg 35 40 45 Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Gln Gly Leu 50 55 60 Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val 65 70 75 80 Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr 85 90 95 Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn 100 105 110 Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Ser Thr Ala Thr 115 120 125 Gly Lys Glu Gly Asn Lys Ser Glu Arg Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp 130 135 140 Lys Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Ile Trp Cys Tyr Asn Ala Glu Leu 145 150 155 160 Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn 165 170 175 Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala 180 185 190 Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asp 195 200 205 Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr 210 215 220 Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Ser Gly 225 230 235 240 Arg Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Pro Gly Ser Gly Tyr Ile Pro 245 250 255 Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp 260 265 270 Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly His His His His His His 275 280 285 <210> 157 <211> 301 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H1 mini-HA GW1.5E2 <400> 157 Met Lys Val Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asn Gly Gly Gly Gly Lys Tyr Val Cys Ser Ala Lys Leu 50 55 60 Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Lys Pro Ser Ile Gln Ser Gln Gly 65 70 75 80 Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Tyr Lys Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met 85 90 95 Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly 100 105 110 Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr 115 120 125 Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Ile Thr Ala 130 135 140 Thr Gly Lys Glu Thr Asn Lys Arg Glu Arg Arg Met Lys Gln Ile Glu 145 150 155 160 Asp Lys Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Ile Trp Cys Tyr Asn Ala Glu 165 170 175 Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser 180 185 190 Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn 195 200 205 Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn 210 215 220 Asp Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys 225 230 235 240 Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys 245 250 255 Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val 260 265 270 Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp 275 280 285 Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 290 295 300 <210> 158 <211> 286 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mini-HA GW1.5E2-FFH (#5145) <400> 158 Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val 1 5 10 15 Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu 20 25 30 Leu Glu Asn Gly Gly Gly Gly Lys Tyr Val Cys Ser Ala Lys Leu Arg 35 40 45 Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Lys Pro Ser Ile Gln Ser Gln Gly Leu 50 55 60 Phe Gly Ala Ile Ala Gly Tyr Lys Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val 65 70 75 80 Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr 85 90 95 Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn 100 105 110 Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Ile Thr Ala Thr 115 120 125 Gly Lys Glu Thr Asn Lys Arg Glu Arg Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp 130 135 140 Lys Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Ile Trp Cys Tyr Asn Ala Glu Leu 145 150 155 160 Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn 165 170 175 Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala 180 185 190 Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asp 195 200 205 Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr 210 215 220 Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Ser Gly 225 230 235 240 Arg Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Pro Gly Ser Gly Tyr Ile Pro 245 250 255 Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp 260 265 270 Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly His His His His His His 275 280 285

Claims (15)

  1. 하기 SEQ ID NO: 146의 아미노산 서열을 포함하는 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드:
    DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX1 PSX2 QSQGLFGAIAGX3X4 EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5 NTQX6 TAX7 GKEX8 NKX9 ERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDG (SEQ ID NO: 146)
    여기서, X1은 K, X2는 K, X3은 F, X4는 T, X5는 M, X6은 Y, X7은 I, X8은 Y, 및 X9는 S인, 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 항체 CR6261 및 CR9114 중 하나 이상에 선택적으로 결합(selectively bind)하는 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 항체 CR8020 및 CR8057 중 하나 이상에 결합하지 않는 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 91, 및 SEQ ID NO: 101 로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자.
  6. 제5항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩티드; 및 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자 중 하나 이상을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 약제 또는 백신으로 사용하기 위한, 폴리펩티드.
  9. 제5항에 있어서, 약제 또는 백신으로 사용하기 위한, 핵산 분자.
  10. 제6항에 있어서, 약제 또는 백신으로 사용하기 위한, 벡터.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한, 폴리펩티드.
  12. 제5항에 있어서, 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한, 핵산 분자.
  13. 제6항에 있어서, 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한, 벡터.

  14. 삭제
  15. 삭제
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