EA038400B1

EA038400B1 - Полипептид стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа и его применение

Info

Publication number: EA038400B1
Application number: EA201692541A
Authority: EA
Inventors: Антоньетта Импальяццо; Ян Вилем Мейберг; Катарина Радошевич; Мишель Вагнер; Чжаоцин Дин
Original assignee: Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В.
Priority date: 2014-07-10
Filing date: 2015-07-09
Publication date: 2021-08-23
Also published as: CA2952351C; MY187261A; CN106661091B; AU2015286721A1; PE20170290A1; US10111944B2; BR112017000257A2; CA2952351A1; CN106661091A; EP3166962A1; AU2015286721B2; JP6735269B2; SG11201610443WA; PH12016502500A1; EP3587442A1; KR20170030590A; EA201692541A1; US20170209564A1; US20190015500A1; MX2017000394A

Abstract

Изобретение относится к полипептиду стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа А; кодирующей его молекуле нуклеиновой кислоты; содержащему ее вектору; содержащей их композиции и их применению для индукции иммунного ответа и в качестве вакцины против вируса гриппа А.

Description

Введение

Настоящее изобретение относится к области медицины. В настоящем документе обеспечиваются полипептиды стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа, способы получения полипептидов стеблевого домена гемагглютинина, композиции, содержащие их, вакцины, содержащие их, и способы их применения, в частности, для выявления, предупреждения и/или лечения гриппа.

Предпосылки изобретения

Вирусы гриппа являются основными патогенами человека, вызывая респираторное заболевание (обычно называемое грипп или инфлюэнца), которое колеблется по тяжести от субклинической инфекции до первичной вирусной пневмонии, которая может привести к смерти. Клинические эффекты инфекции различаются в зависимости от вирулентности штамма гриппа и воздействия, истории болезни, возраста и иммунного статуса хозяина. По оценкам, ежегодно приблизительно 1 млрд человек во всем мире подвергается инфицированию вирусом гриппа, что вызывает тяжелую болезнь в 3-5 миллионах случаев и ориентировочно от 300000 до 500000 смертей, связанных с гриппом. Большую часть этих инфекций можно отнести к вирусам гриппа А, несущим подтипы H1 или H3 гемагглютинина, при меньшем вкладе вирусов гриппа В, и, следовательно, представителей всех трех включают в сезонную вакцину. Современная практика иммунизации основана на ранней идентификации циркулирующих вирусов гриппа для обеспечения своевременного получения эффективной сезонной противогриппозной вакцины. Помимо неизбежных трудностей в прогнозировании того, какие штаммы будут преобладать во время следующего сезона, в неспособности современных вакцин предупредить заболеваемость и смертность также играют роль устойчивость к противовирусным препаратам и ускользание от иммунного ответа. В дополнение к этому, возможность пандемии, вызванной высоковирулентным штаммом вируса, происходящим из животных-резервуаров и рекомбинированным с увеличением распространения от человека к человеку, представляет собой значительную и реальную угрозу для глобального здравоохранения.

Вирусы гриппа А широко распространены в природе и могут инфицировать множество птиц и млекопитающих. Вирусы гриппа представляют собой оболочечные РНК-содержащие вирусы, которые принадлежат к семейству Orthomyxoviridae. Их геномы состоят из восьми однонитевых сегментов РНК, которые кодируют 11 различных белков: один нуклеопротеин (NP), три полимеразных белка (PA, PB1 и РВ2), два белка матрикса (M1 и М2), три неструктурных белка (NS1, NS2 и PB1-F2) и два наружных гликопротеина гемагглютинин (HA) и нейраминидазу (NA). Вирусы классифицируют на основании различий в антигенной структуре белков HA и NA, при этом их различные комбинации представляют уникальные подтипы вируса, которые дополнительно классифицируют на конкретные штаммы вируса гриппа. Хотя все известные подтипы можно обнаружить у птиц, циркулирующими в настоящее время подтипами человеческого гриппа А являются H1N1 и H3N2. Филогенетический анализ продемонстрировал подразделение гемагглютининов на две основные группы: подтипы H1, Н2, Н5 и Н9 inter alia в филогенетической группе 1 и подтипы H3, Н4 и Н7 inter alia в филогенетической группе 2.

Штаммы вируса гриппа типа В являются исключительно человеческими. Антигенная изменчивость HA в штаммах вируса гриппа типа В меньше, чем наблюдаемая в штаммах типа А. Две генетически и антигенно различающиеся линии вируса гриппа В, циркулирующие у людей, представлены линиями B/Yamagata/16/88 (также называемой B/Yamagata) и B/Victoria/2/87 (B/Victoria) (Ferguson et al., 2003). Хотя спектр заболеваний, вызываемых вирусами гриппа В, как правило, представлен более легкими формами, чем заболевания, вызываемые вирусами гриппа А, все же часто при инфицировании гриппом В наблюдается тяжелая болезнь, требующая госпитализации.

Известно, что антитела, которые нейтрализуют вирус гриппа, направлены главным образом к гемагглютинину (HA). Гемагглютинин или HA представляет собой трехмерный гликопротеин, который заякорен в вирусной оболочке и имеет двойную функцию: он отвечает за связывание с рецепторами клеточной поверхности, содержащими сиаловую кислоту, а после поглощения он опосредует слияние вирусной и эндосомальной мембраны, что приводит к высвобождению вирусной РНК в цитозоль клетки. HA содержит крупный головной домен и меньший стеблевой домен. Прикрепление к вирусной мембране опосредуется С-концевой якорной последовательностью, соединенной со стеблевым доменом. Белок подвергается посттрансляционному расщеплению в определенной петле с получением двух полипептидов, НА1 и НА2 (полную последовательность называют НАО). Мембранно-дистальная головная область происходит в основном из НА1, а мембранно-проксимальная стеблевая область - главным образом из НА2 (фиг. 1).

Причиной, по которой сезонная противогриппозная вакцина должна обновляться каждый год, является значительная изменчивость вируса. В молекуле гемагглютинина эта изменчивость особенно проявляется в головном домене, где антигенный дрейф и шифт привели к образованию большого количества различных вариантов. Поскольку он также представляет собой зону, которая является иммунодоминантной, большинство нейтрализующих антител направлены к данному домену и действуют путем препятствования связыванию с рецептором. Сочетанием иммунодоминантности и значительной изменчивости головного домена также объясняется то, что инфицирование определенным штаммом не вызывает иммунитет к другим штаммам: антитела, выработанные в результате первого инфицирования, распознают лишь ограниченное число штаммов, близкородственных вирусу первичной инфекции.

Недавно полипептиды стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа, в которых отсутствует весь или фактически весь глобулярный головной домен гемагглютинина вируса гриппа, были описаны и применены для генерирования иммунного ответа на один или несколько консервативных эпитопов полипептида стеблевого домена. Полагают, что эпитопы полипептида стеблевого домена являются менее иммуногенными, чем высокоиммуногенные области глобулярного головного домена, поэтому отсутствие глобулярного головного домена в полипептиде стеблевого домена может обеспечить возможность развития иммунного ответа против одного или нескольких эпитопов полипептида стеблевого домена (Steel et al., 2010). Steel et al., таким образом, создали новую молекулу посредством делеции аминокислотных остатков 53-2 76 в НА1 штаммов A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) и A/Hong Kong/1968 (H3N2) из первичной последовательности HA и замещения их короткой гибкой линкерной последовательностью GGGG. Вакцинация мышей конструкцией H3 НК68 не приводила к извлечению антисывороток, которые бы перекрестно реагировали с HA группы 1.

В дополнение, как показано в PCT/EP2012/073706, полипептиды стеблевого домена были весьма нестабильными и не принимали правильную конформацию, что доказано отсутствием связывания антител, которые, как было показано, связываются с консервативными эпитопами в стеблевой области.

В дополнение, Bommakanti et al.(2010) описали полипептид на основе НА2, содержащий аминокислотные остатки 1-172 из НА2, 7-аминокислотный линкер (GSAGSAG), аминокислотные остатки 7-46 из НА1, 6-аминокислотный линкер GSAGSA с последующими остатками 290-321 из НА1, с мутациями V297T, I300E, Y302T и С305Т в НА1. В основе данной разработанной конструкции лежала последовательность HA H3 (A/Hong Kong/1968). Полипептид обеспечивал перекрестную защиту только от другого штамма вируса гриппа в пределах подтипа H3 (A/Phil/2/82), но не от подтипа H1 (A/PR/8/34). В более ранней статье Bommakanti et al.(2012) описана последовательность стеблевого домена на основе HA из H1N1 A/Puerto Rico/8/1934 (H1HA0HA6). В этом полипептиде были подвергнуты делеции эквиваленты остатков 55-302 и выполнены мутации I311T, V314T, I316N, C319S, F406D, F409T и L416D. Полипептиды на основе как H3, так и НА экспрессировали в E.coli и, следовательно, в них отсутствовали гликаны, которые являются частью природных белков НА. При экспрессии в E.coli полипептид извлекают в основном в виде высокомолекулярных агрегатов и незначительной мономерной фракции. Полипептид связывается с CR6261 с двумя выраженными константами диссоциации 9 и 0,2 мкМ. Авторы показали, что мыши могут выжить при контрольном заражении в 1 дозе LD₉₀ гомологичным вирусом H1N1 A/Puerto Rico/8/1934 после иммунизации (дважды с интервалом в 4 недели) с 20 мкг белка со 100 мкг добавленного в качестве вспомогательного средства CpG7909. Авторы также описывают полипептиды, подвергнутые циркулярной пермутации, сравнимые с описанными выше для полипептидов, полученных из A/Hong Kong/1/1968. Эти полипептиды получены из HA из H1N1 A/Puerto Rico/8/1934, H1N1 A/North Carolina/20/99 или H1N1 A/California/07/2009 и могут обеспечивать частичную защиту на модели умеренного контрольного заражения (1LD90) мышей с H1N1 A/Puerto Rico/8/1934 (т.е. в пределах одного и того же подтипа). Образцы сыворотки крови морских свинок, иммунизированных этими полипептидами, не проявляли выявляемых уровней нейтрализации при тестировании в анализе нейтрализации.

Совсем недавно Lu et al.(2013) также описали растворимые полипептиды стеблевого домена, полученные из HA H1N1 A/California/05/2009. В конечной разработанной конструкции эквиваленты остатков 54-303 (нумерация согласно SEQ ID NO: 1) были подвергнуты делеции (лидерная последовательность, остатки 1-17, также отсутствует) и в В-петлю белка были введены две мутации, т.е. F407D и L413D. Кроме того, полипептид содержал С-концевой тримеризационный домен (фолдон). В дополнение, были введены два межмономерных дисульфидных мостика, один в зоне тримерного домена фолдона и один в положениях 430 и 431. Полипептид продуцируется в бесклеточной системе на основе экстрактов Е.coli (и поэтому в нем отсутствуют гликаны, которые являются частью встречающихся в природе белков НА) и извлекается в денатурированной форме, которую необходимо подвергнуть рефолдингу перед применением. Иммунологические данные или данные о защите от контрольного заражения гриппом не были показаны.

В недавней статье Mallajosyula et al.(2014) также сообщается о полипептиде стеблевого домена. В этой разработанной конструкции, в основе которой лежит HA H1N1 A/Puerto Rico/8/1934, делеции подвергнута не только значительная часть последовательности НА1 (остатки 42-289, нумерация согласно SEQ ID NO: 1), но также значительная часть N- и С-концевых последовательностей НА2 (соответственно остатки 344-383 и 457-565). Полипептид содержит тримеризационный домен фолдон на С-конце и также продуцируется в Е. coli, поэтому в нем отсутствуют гликаны, встречающиеся в природе на вирусном НА. Полипептид связывается с нейтрализующими антителами широкого спектра действия CR6261, F10 и FI6v3. Полипептид также тестировали в модели контрольного заражения гриппом (1 LD90 H1N1 A/Puerto Rico/8/1934), и он мог защищать мышей от смерти. Эквивалентные полипептиды, полученные из HA H1N1 A/New Caledonia/20/1999 и H1N1 A/California/04/2009, также могли обеспечивать частичную защиту. Полипептид, полученный из H5N1 A/Viet Nam/1203/2004, давал лишь ограниченную защиту в данной модели контрольного заражения. Более того, применяемая модель контрольного заражения является легкой моделью с относительно низкой вводимой дозой (1-2 LD90).

Таким образом, все еще существует потребность в безопасной и эффективной универсальной вак2 038400 цине, которая стимулирует выработку устойчивого ответа нейтрализующих антител широкого спектра действия и предоставляет защиту от широкого набора существующих и будущих штаммов вируса гриппа (как сезонного, так и пандемического), в частности обеспечивая защиту от одного или нескольких подтипов вируса гриппа А в пределах филогенетической группы 1 и/или группы 2 для эффективного предупреждения и терапии гриппа.

Краткое описание

В настоящем документе обеспечиваются полипептиды стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа, способы получения полипептидов стеблевого домена, композиции, содержащие их, вакцины, содержащие их, и способы их применения.

В первом аспекте настоящее изобретение предусматривает новые иммуногенные полипептиды, содержащие стеблевой домен гемагглютинина вируса гриппа и не имеющие глобулярной головки, названные как полипептиды стеблевого домена гемагглютинина (HA) гриппа. Полипептиды способны индуцировать иммунный ответ при введении субъекту, в частности, субъекту-человеку. Полипептиды по настоящему изобретению представляют консервативные эпитопы мембранно-проксимального стеблевого домена молекулы HA иммунной системе в отсутствие доминантных эпитопов, присутствующих в мембранно-дистальном головном домене. С этой целью часть первичной последовательности белка НАО, составляющую головной домен, удаляют и оставшуюся аминокислотную последовательность заново соединяют, либо непосредственно, либо, в некоторых вариантах осуществления, посредством введения короткой гибкой сшивающей последовательности (линкера) с восстановлением непрерывности аминокислотной цепи. Полученную последовательность дополнительно модифицируют путем введения специфических мутаций, которые стабилизируют нативную 3-мерную структуру оставшейся части молекулы НАО. Иммуногенные полипептиды не содержат полноразмерный НА1 домен вируса гриппа.

Настоящее изобретение обеспечивает новый полипептид стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа, содержащий:

(а) домен НА1 гемагглютинина вируса гриппа, который содержит N-концевой стеблевой сегмент НА1, ковалентно соединенный с помощью линкерной последовательности из 0-50 аминокислотных остатков с С-концевым стеблевым сегментом НА1, при этом указанный С-концевой сегмент НА1 соединен с (b) доменом НА2 гемагглютинина вируса гриппа, где домены НА1 и НА2 получены из подтипа вируса гриппа А, содержащего HA подтипа H1; и (c) где полипептид не содержит участок расщепления протеазами в месте сочленения между доменом НА1 и доменом НА2;

(d) где указанный N-концевой сегмент НА1 содержит аминокислоты 1-х НА1, предпочтительно аминокислоты p-x НА1, и где С-концевой стеблевой сегмент НА1 содержит аминокислоты от у до Сконцевой аминокислоты НА1, где x = аминокислота в положении 52 SEQ ID NO: 1 (или эквивалентном положении в другом гемагглютинине), p = аминокислота в положении 18 SEQ ID NO: 1 (или эквивалентном положении в другом гемагглютинине) и у = аминокислота в положении 321 SEQ ID NO: 1 (или эквивалентном положении в другом гемагглютинине);

(e) где область, содержащая аминокислотные остатки 402-418, содержит аминокислотную последовательность X₁NTQX₂TAX₃GKEX₄N(H/K)X₅E (K/R) (SEQ ID NO: 8), где

X1 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из M, E, K, V, R и Т;

Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из F, I, N, T, H, L и Y, предпочтительно I, L или Y;

Х3 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из V, A, G, I, R, F и S, предпочтительно А, I или F;

Х4 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из F, I, N, S, T, Y, E, K, M и V, предпочтительно I, Y, М или V;

Х5 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из L, H, I, N, R, предпочтительно I;

(f) где аминокислотный остаток в положении 337 (домен НА1) выбран из группы, состоящей из I, E, K, V, А, и Т, аминокислотный остаток в положении 34 0 (домен НА1) выбран из группы, состоящей из I, K, R, T, F, N, S и Y, аминокислотный остаток в положении 352 (домен НА2) выбран из группы, состоящей из D, V, Y, A, I, N, S, и Т, и аминокислотный остаток в положении 353 (домен НА2) выбран из группы, состоящей из K, R, T, E, G, и V; и (g) где полипептид дополнительно содержит дисульфидный мостик между аминокислотой в положении 324 и аминокислотой в положении 436; и (h) где дополнительная аминокислотная последовательность RMKQIEDKIEEIESK (SEQ ID NO: 20) введена в положения 419-433 или где последовательность RMKQIEDKIEEIESKQK (SEQ ID NO: 21) введена в положения 417-433.

В определенных вариантах осуществления полипептиды содержат полный домен НА2, т.е. домен

НА2, включающий в себя трансмембранный домен и внутриклеточную последовательность. В определенных вариантах осуществления домен НА2 был усечен. Таким образом, в определенных вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению не содержат внутриклеточные последовательности HA и трансмембранный домен. В определенных вариантах осуществления аминокислотная последовательность от положения 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 526, 528, 529 или 530 (или эквивалентного ему) домена НА2 до С-конца домена НА2 была удалена.

Согласно настоящему изобретению С-концевая аминокислота С-концевого стеблевого сегмента НА1 соединена с N-концевой аминокислотой домена НА2 с образованием, таким образом, сочленения между доменами НА1 и НА2. Полипептиды по настоящему изобретению не содержат участок расщепления протеазами в месте сочленения между доменами НА1 и НА2. В определенных вариантах осуществления С-концевой аминокислотный остаток в С-концевом стеблевом сегменте НА1 (аминокислота 343 в SEQ ID NO: 1) представляет собой любую аминокислоту, отличную от аргинина (R) или лизина (K), предпочтительно глутамин (Q).

Полипептиды по настоящему изобретению являются существенно меньшими, чем НАО, предпочтительно в них отсутствует вся или фактически вся глобулярная головка НА. Предпочтительно иммуногенные полипептиды имеют длину не более чем 360, предпочтительно не более чем 350, 340, 330, 320, 310, 305, 300, 295, 290, 285, 280, 275 или 270 аминокислот. В определенных вариантах осуществления иммуногенные полипептиды составляют от приблизительно 250 до приблизительно 350, предпочтительно от приблизительно 260 до приблизительно 340, предпочтительно от приблизительно 270 до приблизительно 330, предпочтительно от приблизительно 270 до приблизительно 330 аминокислот в длину.

Полипептиды по настоящему изобретению содержат консервативные эпитопы стеблевого домена группы 1 перекрестно-нейтрализующего антитела CR6261 (описанного в WO 2008/028946) и/или антитела CR9114 (описанного в WO 2013/007770), антитела, способного к связыванию и нейтрализации одновременно вирусов гриппа А группы 1 и группы 2, а также вирусов гриппа В. Таким образом, еще один аспект настоящего изобретения заключается в обеспечении полипептидов стеблевого домена НА, где указанные полипептиды стабильно представляют эпитопы антитела CR6261 и/или CR9114, как показано посредством связывания указанного антитела или антител с указанными полипептидами. В одном варианте осуществления полипептиды не связываются с CR8020 и CR8057 (описанными в WO 2010/130636), которые являются моноклональными антителами, связывающимися только с вирусами гриппа H3.

Полипептиды стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа, обеспечиваемые в настоящем документе, подходят для применения в иммуногенных композициях (например, вакцинах), способных генерировать иммунные ответы против одного/или множества штаммов вируса гриппа А и/или В, в частности, против вируса гриппа подтипа H1. В одном варианте осуществления полипептиды стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа способны генерировать иммунные ответы против штаммов вируса гриппа А филогенетической группы 1 и/или группы 2, в частности, против штаммов вируса гриппа как филогенетической группы 1, так и группы 2. В одном варианте осуществления полипептиды способны генерировать иммунный ответ против гомологичных штаммов вируса гриппа. В одном варианте осуществления полипептиды способны генерировать иммунный ответ против гетерологичных штаммов вируса гриппа одного и того же и/или разных подтипов. В дополнительном варианте осуществления полипептиды способны генерировать иммунный ответ против штаммов вируса гриппа как филогенетической группы 1, так и группы 2, а также штаммов вируса гриппа В.

Полипептиды согласно настоящему изобретению можно применять, например, в качестве самостоятельного средства терапии, и/или профилактики, и/или диагностики заболевания или состояния, вызываемого вирусом гриппа, в частности вирусом гриппа А из филогенетической группы 1 или 2 и/или вирусом гриппа В, или в комбинации с другими профилактическими и/или терапевтическими средствами лечения, такими как (существующие или будущие) вакцины, противовирусные средства и/или моноклональные антитела.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие полипептиды стеблевого домена HA вируса гриппа. В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие иммуногенные полипептиды.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способы индуцирования иммунного ответа у субъекта, при этом способ включает введение субъекту полипептида и/или молекулы нуклеиновой кислоты, и/или вектора согласно настоящему изобретению.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает композиции, содержащие полипептид и/или молекулу нуклеиновой кислоты, и/или вектор согласно настоящему изобретению. Композиции предпочтительно представляют собой иммуногенные композиции. Композиции, обеспечиваемые в настоящем документе, могут находиться в любой форме, которая позволяет вводить композиции субъекту, например мышам, хорькам или людям. В конкретном варианте осуществления композиции подходят для введения человеку. Полипептиды, молекулы нуклеиновых кислот и композиции можно применять в способах предупреждения и/или лечения заболевания, вызываемого вирусом гриппа, и/или для диагностических целей. Композиции могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В определенных вариантах осуществления композиции, описанные в настоящем документе, содержат вспомогательное средство или вводятся в комбинации с ним.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает полипептиды, нуклеиновые кислоты и/или векторы для применения в качестве вакцины. Настоящее изобретение, в частности, относится к иммуногенным полипептидам, нуклеиновым кислотам и/или векторам для применения в качестве вакцины для предупреждения и/или лечения заболевания или состояния, вызываемого подтипом вируса гриппа А филогенетической группы 1 и/или 2 и/или вирусом гриппа В, в частности, заболевания или состояния, вызываемого вирусом гриппа, содержащего HA подтипа H1.

Различные варианты осуществления и пути применения полипептидов согласно настоящему изобретению станут очевидными из нижеследующего подробного описания настоящего изобретения.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показана модель мономера HA в состоянии до слияния, представленная в виде нативного тримера. НА1 показан светло-серым, НА2 показан темно-серым. Указаны спираль А (важная часть эпитопа CR6261) и спираль CD (часть контактной поверхности тримера), как и петля, соединяющая эти элементы вторичной структуры. Также указаны С-конец НА1 и N-конец НА2. Пептид слияния расположен на N-конце НА2.

Фиг. 2. Результаты сэндвич-ELISA, полученные для надосадочных жидкостей культур, экспрессирующих SEQ ID NO: 65-71 и SEQ ID NO: 76-78, раскрыты в PCT/EP2014/060997. Захватывающие и детекторные антитела указаны над графиком. Mini-HA относится к растворимому варианту SEQ ID NO: 2, где эквивалент остатка 519-565 был замещен RSLVPRGSPGHHHHHH; при этом FL-HA-FFH относится к растворимому варианту SEQ ID NO: 1, содержащему С-концевую последовательность Flag-thrombin-foldon-His (SEQ ID NO: 4) от положения 520; FL-HA-7xHis относится к растворимому варианту SEQ ID NO: 1, содержащему С-концевую последовательность EGRHHHHHHH от положения 530.

Фиг. 3. Результаты сэндвич-ELISA, полученные для надосадочных жидкостей культур, экспрессирующих полипептиды по настоящему изобретению, которые содержат полученную из GCN4 последовательность RMKQIEDKIEEIESK (SEQ ID nO: 20) в положениях 419-433 (варианты t2). Захватывающие и детекторные антитела указаны над графиком. Mini-HA-t2 получают из Mini-HA путем введения SEQ ID NO: 20 в положения 419-433; FL-HA-FFH, FL-HA-7xHis, как указано выше.

Фиг. 4. Результаты сэндвич-ELISA, полученные для надосадочных жидкостей культур, экспрессирующих полипептиды по настоящему изобретению, которые содержат полученную из GCN4 последовательность RMKQIEDKIEEIESKQK (SEQ ID NO: 21) в положениях 417-433 (варианты t3). Захватывающие и детекторные антитела указаны над графиком. Mini-HA-t3 получают из Mini-HA путем введения SEQ ID NO: 21 в положения 417-433; FL-HA-FFH, FL-HA-7xHis, как указано выше.

Фиг. 5. Профили элюирования s55G7-t2, s127H1-t2 и s86B4-t2 из колонки для эксклюзионной хроматографии Superdex 200, заключительная стадия процедуры очистки. Пронумерованные линии под хроматограммой указывают на фракции, собранные в ходе процесса элюирования.

Фиг. 6. Анализ фракций, собранных в ходе элюирования в колонке для эксклюзионной хроматографии Superdex 200, с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Числа соответствуют фракциям, указанным на фиг. 5. Для выявления на вестерн-блоттинге применяли антитело, распознающее С-концевую His-метку.

Фиг. 7. Эксклюзионная хроматография (аналитическая колонка Tosoh G2000) в отношении s127H1t2 в присутствии и при отсутствии Fab-фрагментов нейтрализующих антител широкого спектра действия CR9114, CR6261 и CR8020. Значения молекулярного веса отдельных белков и/или комплексов определены посредством многоуглового светорассеяния в ходе элюирования из колонки, и они приведены в табл. 8.

Фиг. 8. Связывание полипептида s127H1-t2 по настоящему изобретению с моноклональными антителами CR6261 и CR9114 с применением биослойной интерферометрии. Верхние панели показывают индивидуальные кривые связывания для иммобилизованных моноклональных антител под воздействием различных концентраций s127H1-t2, нижние панели показывают анализ в равновесном состоянии, используемый для оценки Kd.

Фиг. 9. Выживаемость (А), потеря веса тела (В) и клинический показатель (С) для групп отрицательного (PBS, 3 иммунизации с интервалами в 3 недели) и положительного (15 мг/кг CR6261, 1 день до контрольного заражения) контроля. Мышей подвергали контрольному заражению летальной дозой (25xLD50) H1N1 A/Puerto Rico/8/34 через четыре недели после последней иммунизации и отслеживали в течение 21 дня. Планки погрешностей указывают на 95% доверительный интервал (В) или межквартильный размах (С).

Фиг. 10. Выживаемость (А), потеря веса тела (В) и клинический показатель (С) для экспериментальных групп, иммунизированных (3 иммунизации с интервалами в 3 недели) 10 мкг s127H1-t2, либо в присутствии, либо при отсутствии 10 мкг Matrix-M. Мышей подвергали контрольному заражению летальной дозой (25xLD50) H1N1 A/Puerto Rico/8/34 через четыре недели после последней иммунизации и отслеживали в течение 21 дня. В целях сравнения также показана группа отрицательного контроля (PBS).

Планки погрешностей указывают на 95% доверительный интервал (В) или межквартильный размах (С)

Фиг. 11. Результаты ELISA для сыворотки крови в группах отрицательного контроля и экспериментальных группах с применением s127H1-t2 (А) или растворимой формы полноразмерного HA (В) в качестве антигена. Полосы представляют медианное значение.

Фиг. 12. Антитела, индуцированные после иммунизации полипептидом s127H1-t2 по настоящему изобретению с добавленным вспомогательным средством, способны конкурировать с CR9114 за связывание с полноразмерным HA H1N1 A/Brisbane/59/07 в конкурентном ELISA (А). В целях сравнения на отдельном графике показаны уровни конкуренции с моноклональными антителами немеченным CR9114 (т.е. самоконкуренции) и несвязывающими CR8020 и CR-JB, оба из которых находятся в серийном разведении из исходной концентрации 5 мкг/мл.

Фиг. 13. Выживаемость (А), относительная потеря веса тела (В) и клинический показатель (С) для групп отрицательного (PBS, 3 иммунизации с интервалами в 3 недели) и положительного (15 мг/кг CR6261, 1 день до контрольного заражения) контроля. Мышей подвергали контрольному заражению летальной дозой (25xLD50) H1N1 A/Puerto Rico/8/34 через четыре недели после последней иммунизации и отслеживали в течение 21 дня. Планки погрешностей указывают на 95% доверительный интервал (В) или межквартильный размах (С).

Фиг. 14. Выживаемость для групп, иммунизированных 1 раз (А), 2 раза (В) или 3 раза (С) 30 мкг s127H1-t2-cl18long в присутствии 10 мкг Matrix-M. Мышей подвергали контрольному заражению летальной дозой (25xLD50) H1N1 A/Puerto Rico/8/34 через четыре недели после последней иммунизации и отслеживали в течение 21 дня. В целях сравнения также показана группа отрицательного контроля (PBS).

Фиг. 15. Относительное изменение веса тела для групп, иммунизированных 1 раз (А), 2 раза (В) или 3 раза 30 мкг S127H1-t2-cl18long в присутствии 10 мкг Matrix-M. Мышей подвергали контрольному заражению летальной дозой (25xLD50) H1N1 A/Puerto Rico/8/34 через четыре недели после последней иммунизации и отслеживали в течение 21 дня. В целях сравнения также показана группа отрицательного контроля (PBS). Планки погрешностей указывают на 95% доверительный интервал.

Фиг. 16. Клинические показатели для групп, иммунизированных 1 раз (А), 2 раза (В) или 3 раза 30 мкг s127H1-t2-cl18long в присутствии 10 мкг Matrix-M. Мышей подвергали контрольному заражению летальной дозой (25xLD50) H1N1 A/Puerto Rico/8/34 через четыре недели после последней иммунизации и отслеживали в течение 21 дня. В целях сравнения также показана группа отрицательного контроля (PBS). Планки погрешностей указывают на межквартильный размах.

Фиг. 17. Результаты ELISA для сыворотки крови до контрольного заражения (через 4 недели после заключительной иммунизации) в группах отрицательного контроля и экспериментальных группах с применением s127H1-t2-cl18long (A) или растворимой формы полноразмерного HA (В) в качестве антигена. Полосы представляют медианное значение.

Фиг. 18. Антитела, индуцированные после иммунизации полипептидом s127H1-t2-cl18long по настоящему изобретению с добавленным в качестве вспомогательного средства Matrix-M способны конкурировать с CR9114 за связывание с полноразмерным HA H1N1 A/Brisbane/59/07 в конкурентном ELISA (А). В целях сравнения на отдельном графике (В) показаны уровни конкуренции с моноклональными антителами немеченым CR9114 (т.е. самоконкуренции) и несвязывающим CR8020, оба из которых находятся в серийном разведении из исходной концентрации 5 мкг/мл. Полосы представляют медианное значение.

Фиг. 19. (А) Выживаемость для групп отрицательного (PBS, 3 иммунизации с интервалами в 3 недели) и положительного (15 мг/кг CR6261, 1 день до контрольного заражения) контроля. Мышей подвергали контрольному заражению летальной дозой (12,5xLD50) H5N1 A/Hong Kong/156/97 через четыре недели после последней иммунизации. (В) Выживаемость, (С) относительное изменение веса тела и (D) медианные клинические показатели для группы, иммунизированной 3 раза 30 мкг s127H1-t2 в присутствии 10 мкг Matrix-M. Планки погрешностей указывают на 95% доверительный интервал (С) или межквартильный размах (D). Мышей подвергали контрольному заражению летальной дозой (12,5xLD50) H5N1 A/Hong Kong/156/97 через четыре недели после последней иммунизации и отслеживали в течение 21 дня. В целях сравнения на В, С, D также показана группа отрицательного контроля (PBS).

Фиг. 20. Результаты ELISA для образцов сыворотки крови от мышей, иммунизированных 3 раза полипептидом s127H1-t2 по настоящему изобретению согласно описанному в примере 5, с применением полноразмерных HA из ряда штаммов вируса гриппа группы 1 (H1, Н5 и Н9) и группы II (H3 и Н7) в качестве антигена. Индуцированные антитела распознают все тестируемые FL HA из группы 1.

Фиг. 21. (А) Выживаемость для групп отрицательного (PBS, 3 иммунизации с интервалами в 3 недели) и положительного (15 мг/кг CR6261, 1 день до контрольного заражения) контроля. Мышей подвергали контрольному заражению летальной дозой (12,5xLD50) H1N1 A/Brisbane/59/2007 через четыре недели после последней иммунизации. (В) Выживаемость, (С) относительное изменение веса тела и (D) медианные клинические показатели для группы, иммунизированной 3 раза 30 мкг s127H1-t2 в присутствии 10 мкг Matrix-M. Планки погрешностей указывают на 95% доверительный интервал (С) или межквартильный размах (D). Мышей подвергали контрольному заражению летальной дозой (12,5xLD50)

H1N1 A/Brisbane/59/2007 через четыре недели после последней иммунизации и отслеживали в течение 21 дня. В целях сравнения на В, С, D также показана группа отрицательного контроля (PBS).

Фиг. 22. Анализ нейтрализации псевдочастиц с применением образцов сыворотки крови от мышей, иммунизированных полипептидом s127H1-t2 по настоящему изобретению или PBS.

Фиг. 23. Анализ антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) в модели. Образцы сыворотки крови мышей, иммунизированных полипептидом s127H1-t2 по настоящему изобретению, проявляют 30-40-кратную индукцию активности передачи сигналов через FcyRIV при наиболее высоких сывороточных концентрациях при применении клеток-мишеней, трансфицированных FL HA H5N1 A/Hong Kong/156/97 (А) или H1N1 A/Brisbane/59/07 (В), в качестве источника антигена.

Фиг. 24. Выживаемость (А) и % изменение веса тела (В) мышей после переливания сыворотки крови и контрольного заражения H5N1 A/Hong Kong/156/97 согласно описанному в примере 9.

Фиг. 25. Титры полноразмерного НА (H1N1 A/Brisbane/59/2007), определенные посредством ELISA у мышей-доноров (D) в день 70 и мышей-реципиентов (R) до переливания сыворотки крови (день -4) или контрольного заражения (день 0). Данные анализировали с применением подхода на основе определения средневзвешенного наклона. Незакрашенные символы обозначают измерения при LOD. Полосы обозначают медианные значения.

Фиг. 26. Выживаемость (А) и % изменение веса тела (В) мышей после иммунизации и контрольного заражения H1N1 A/NL/602/09 согласно описанному в примере 10.

Фиг. 27. (А): титры полноразмерного НА (H1N1 A/Brisbane/59/2007), определенные посредством ELISA у мышей, иммунизированных согласно описанному в примере 10. Данные анализировали с применением подхода на основе определения средневзвешенного наклона. Незакрашенные символы обозначают измерения при LOD. Полосы обозначают медианные значения. (В): конкурентное связывание с сывороточным IgG и CR9114, полученное после иммунизации мышей согласно описанному в примере 10. В качестве антигена применяли FL HA H1N1 A/Brisbane/59/2007. Показанные данные представляют собой групповые медианные значения, планки погрешностей обозначают межквартильный размах. Указаны данные для CR9114 и CR8020 с использованием исходного раствора с 5 мкг/мл и разведения аналогично образцам сыворотки.

Фиг. 28. Первичный скрининг в отношении в общей сумме 10472 клонов (5544 и 4928 из набора 1 и 2, соответственно). Данные нормализованы в отношении среднего значения связывания и экспрессии FL НА, включенных в эксперимент. 20% наилучших клонов из анализа сэндвич-ELISA с применением CR9114 (панель А), также характеризующихся экспрессией FL HA при уровне экспрессии >50% и сигналами связывания с CR6261 при уровне >80% сигналов, наблюдаемых в случае использования FL HA (панель В), считали хитами; при этом данная процедура давала 703 хитов (596 и 107 из библиотек 1 и 2, соответственно).

Фиг. 29. Результаты сэндвич-ELISA с применением CR9114 для полипептидов по настоящему изобретению (А) под SEQ ID NO: 158-162, где все содержат С-концевую последовательность Flag-foldon-His (В) под SEQ ID NO: 163-166, где все содержащат С-концевую последовательность TCS-His.

Фиг. 30. Результаты SEC MALS для SEQ ID NO: 158 в присутствии и при отсутствии Fabфрагментов CR9114 (указан как CRF9114) или CR6261 (указан как CRF6261). Значение молекулярной массы, полученное благодаря анализу многоуглового светорассеяния, приведено в примере 12 и указывает на образование комплексов с 3 Fab-фрагментами на тример полипептида по настоящему изобретению.

Фиг. 31. Выживаемость (А) и % изменение веса тела (В) мышей после иммунизации и контрольного заражения H1N1 A/Brisbane/59/07 согласно описанному в примере 13.

Фиг. 32. (А): титры полноразмерного НА (H1N1 A/Brisbane/59/2007), определенные посредством ELISA у мышей, иммунизированных согласно описанному в примере 13. Данные анализировали с применением подхода на основе определения средневзвешенного наклона. Незакрашенные символы обозначают измерения при LOD. Полосы обозначают медианные значения. (В): конкурентное связывание с сывороточным IgG и CR9114, полученное после иммунизации мышей согласно описанному в примере 18. В качестве антигена применяли FL HA H1N1 A/Brisbane/59/2007. Показанные данные представляют собой групповые медианные значения, планки погрешностей обозначают межквартильный размах. Указаны уровни для CR9114 и CR8020 с использованием исходного раствора с 5 мкг/мл и разведения аналогично образцам сыворотки.

Фиг. 33. Выживаемость (А) и % изменение веса тела (В) мышей после иммунизации и контрольного заражения H5N1 A/Hong Kong/156/97 согласно описанному в примере 14.

Фиг. 34. (А): титры полноразмерного НА (H1N1 A/Brisbane/59/2007), определенные посредством ELISA у мышей, иммунизированных согласно описанному в примере 14. Данные анализировали с применением подхода на основе определения средневзвешенного наклона. Незакрашенные символы обозначают измерения при LOD. Полосы обозначают медианные значения. (В): конкурентное связывание с сывороточным IgG и CR9114, полученное после иммунизации мышей согласно описанному в примере 18. В качестве антигена применяли FL HA H1N1 A/Brisbane/59/2007. Показанные данные представляют со7 038400 бой групповые медианные значения, планки погрешностей обозначают межквартильный размах. Указаны уровни для CR9114 и CR8020 с использованием исходного раствора с 5 мкг/мл и разведения аналогично образцам сыворотки.

Фиг. 35. Выживаемость (А) и % изменение веса тела (В) мышей после иммунизации и контрольного заражения H1N1 A/Puerto Rico/8/1934 согласно описанному в примере 15.

Фиг. 36. (А): титры полноразмерного НА (H1N1 A/Brisbane/59/2007), определенные посредством ELISA у мышей, иммунизированных согласно описанному в примере 15. Данные анализировали с применением подхода на основе определения средневзвешенного наклона. Незакрашенные символы обозначают измерения при LOD. Полосы обозначают медианные значения. (В): конкурентное связывание с сывороточным IgG и CR9114, полученное после иммунизации мышей согласно описанному в примере 18. В качестве антигена применяли FL HA H1N1 A/Brisbane/59/2007. Показанные данные представляют собой групповые медианные значения, планки погрешностей обозначают межквартильный размах. Указаны уровни для CR9114 и CR8020 с использованием исходного раствора с 5 мкг/мл и разведения аналогично образцам сыворотки.

Определения

Ниже даны определения терминов, используемых в настоящем изобретении.

Аминокислота согласно настоящему изобретению может быть любой из 20 природных (или стандартных аминокислот) или их вариантами, такими как, например, D-пролин (D-энантиомер пролина), или любыми вариантами, которые не обнаружены в природе в белках, такими как, например, норлейцин. Стандартные аминокислоты можно разделить на несколько групп, исходя из их свойств. Важными факторами являются заряд, гидрофильность или гидрофобность, размер и функциональные группы. Эти свойства являются важными для структуры белков и белок-белковых взаимодействий. Некоторые аминокислоты обладают особыми свойствами, например цистеин, который может образовывать ковалентные дисульфидные связи (или дисульфидные мостики) с другими цистеиновыми остатками, пролин, который образует цикл с полипептидным каркасом, и глицин, который является более гибким, чем другие аминокислоты. В табл. 2 представлены аббревиатуры и свойства стандартных аминокислот.

Термин идентичность аминокислотных последовательностей относится к степени идентичности или сходства между парой выровненных аминокислотных последовательностей, как правило, выраженной в виде процентного значения. Процент идентичности представляет собой процентное значение аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые являются идентичными (т.е. аминокислотный остаток в данном положении в выравнивании является таким же остатком) или сходными (т.е. аминокислотная замена в данном положении в выравнивании представляет собой консервативную замену, обсуждаемую ниже) с соответствующим аминокислотным остатком в пептиде после выравнивания последовательностей и введения гэпов, если это необходимо, для достижения максимального процента гомологии последовательностей. Гомологию последовательностей, в том числе процентные значения идентичности и сходства последовательностей, определяют с применением методик выравнивания последовательностей, хорошо известных из уровня техники, например, путем визуального осмотра и математических расчетов, или, более Предпочтительно сравнение осуществляют путем сравнивания информации о последовательностях с помощью компьютерной программы. Иллюстративной предпочтительной компьютерной программой является разработанная Genetics Computer Group (GCG; Мэдисон, Висконсин) программа GAP версии 10.0 пакета Wisconsin (Devereux et al.(1984)).

Консервативная замена относится к замене аминокислоты одного класса другой аминокислотой того же класса. В конкретных вариантах осуществления консервативная замена не изменяет структуру или функцию, или и то, и другое, полипептида. Классы аминокислот для целей выполнения консервативной замены включают гидрофобные (например, Met, Ala, Val, Leu), нейтральные гидрофильные (например, Cys, Ser, Thr), кислые (например, Asp, Glu), основные (например, Asn, Gln, His, Lys, Arg), разрушители конформации (например, Gly, Pro) и ароматические (например, Trp, Tyr, Phe).

Используемые в настоящем документе термины заболевание и нарушение используют взаимозаменяемо по отношению к состоянию субъекта. В некоторых вариантах осуществления состояние представляет собой вирусную инфекцию, в частности, гриппозную вирусную инфекцию. В конкретных вариантах осуществления термин заболевание относится к патологическому состоянию, обусловленному наличием вируса в клетке или субъекте или инвазией вируса в клетку или субъекта. В определенных вариантах осуществления состояние представляет собой заболевание у субъекта, тяжесть которого уменьшают путем индуцирования иммунного ответа у субъекта посредством введения иммуногенной композиции.

Используемый в настоящем документе термин эффективное количество применительно к введению терапевтического средства субъекту относится к количеству терапевтического средства, которое имеет профилактический(профилактические) и/или терапевтический(терапевтические) эффект(эффекты). В определенных вариантах осуществления эффективное количество применительно к введению терапевтического средства субъекту относится к количеству терапевтического средства, которое является достаточным для достижения снижения или облегчения тяжести гриппозной вирусной инфекции, заболевания или симптома, ассоциированного с ней, такого как, без ограничений, снижение продолжитель8 038400 ности гриппозной вирусной инфекции, заболевания или симптома, ассоциированного с ней, предупреждение прогрессирования гриппозной вирусной инфекции, заболевания или симптома, ассоциированного с ней, предупреждение развития, или начала проявления, или рецидива гриппозной вирусной инфекции, заболевания или симптома, ассоциированного с ней, предупреждение или снижение распространения вируса гриппа от одного субъекта к другому субъекту, снижение частоты госпитализации субъекта и/или длительности госпитализации, увеличение выживаемости субъекта с гриппозной вирусной инфекцией или заболеванием, ассоциированным с ней, устранение гриппозной вирусной инфекции или заболевания, ассоциированного с ней, ингибирование или уменьшение репликации вируса гриппа, уменьшение титра вируса гриппа и/или усиление и/или улучшение профилактического(профилактических) или терапевтического(терапевтических) эффекта(эффектов) другого терапевтического средства. В определенных вариантах осуществления эффективное количество не приводит к полной защите от заболевания, вызываемого вирусом гриппа, но приводит к снижению титра или уменьшению количества вирусов гриппа по сравнению с необработанным субъектом. Преимущества уменьшения титра, количества или общей нагрузки вируса гриппа включают, без ограничений, меньшую тяжесть симптомов инфекции, меньшее количество симптомов инфекции и уменьшение длительности заболевания, ассоциированного с инфекцией.

Подразумевают, что применяемое в настоящем документе выражение хозяин относится к организму или клетке, в которую был введен вектор, такой как вектор для клонирования или вектор экспрессии. Организм или клетка могут быть прокариотическими или эукариотическими. Предпочтительно хозяин включает выделенные клетки-хозяева, например, клетки-хозяева в культуре. Выражение клеткихозяева означает лишь, что клетки модифицировали для (сверх)-экспрессии полипептидов по настоящему изобретению. Следует понимать, что термин хозяин предназначен для обозначения не только конкретного рассматриваемого организма или клетки, но также и потомства такого организма или клетки. Поскольку вследствие мутации либо влияний окружающей среды в последующих поколениях могут иметь место определенные модификации, такое потомство может в действительности не быть идентичным родительскому организму или клетке, но все еще быть включенным в объем термина хозяин, используемого в настоящем документе.

Предусматривается, что вслед за применяемым в настоящем документе выражением включенный или включающий следуют слова без ограничения.

Используемый в настоящем документе термин инфекция означает инвазию, размножение и/или наличие вируса в клетке или субъекте. В одном варианте осуществления инфекция представляет собой активную инфекцию, т.е. такую, при которой вирус реплицируется в клетке или субъекте. Такая инфекция характеризуется распространением вируса в другие клетки, ткани и/или органы из клеток, тканей и/или органов, изначально инфицированных вирусом. Инфекция также может представлять собой латентную инфекцию, т.е. такую, при которой вирус не реплицируется. В определенных вариантах осуществления инфекция относится к патологическому состоянию, обусловленному наличием вируса в клетке или субъекте или инвазией вируса в клетку или субъекта.

Вирусы гриппа классифицируют на типы вируса гриппа: род А, В и С. Выражение подтип вируса гриппа, применяемое в настоящем документе, относится к вариантам вируса гриппа А, которые характеризуются комбинациями поверхностных вирусных белков гемагглютинина (H) и нейраминидазы (N). Согласно настоящему изобретению подтипы вируса гриппа могут быть названы по их номеру Н, такому как, например, вирус гриппа, содержащий HA подтипа H3, вирус гриппа подтипа H3 или грипп H3, или по комбинации номера Н и номера N, такой как, например, подтип H3N2 вируса гриппа или H3N2. Термин подтип специфически включает все индивидуальные штаммы в пределах каждого подтипа, которые, как правило, являются результатом мутаций и показывают различные патогенные профили, в том числе природные изоляты, а также искусственные мутанты или реассортанты и т.п. Такие штаммы также можно называть различными изолятами вирусного подтипа. Соответственно, применяемые в настоящем документе термины штаммы и изоляты можно применять взаимозаменяемо. Существующая номенклатура штаммов или изолятов вируса гриппа человека включает тип (род) вируса, т.е. А, В или С, географическое место первого выделения, номер штамма и год выделения, обычно с описанием антигенов HA и NA, приведенным в скобках, например A/Moscow/10/00 (H3N2). Штаммы, отличные от человеческих, также включают в свою номенклатуру хозяина, из которого они происходят. Подтипы вируса гриппа А можно дополнительно классифицировать путем ссылки на их филогенетическую группу. Филогенетический анализ продемонстрировал подразделение гемагглютининов на две основные группы: inter alia подтипы H1, Н2, Н5 и Н9 в филогенетической группе 1 (вирусы гриппа группы 1) и inter alia подтипы H3, Н4, Н7 и H10 в филогенетической группе 2 (вирусы гриппа группы 2).

Используемый в настоящем документе термин заболевание, вызываемое вирусом гриппа относится к патологическому состоянию, обусловленному наличием вируса гриппа, например вируса гриппа А или В, в клетке или субъекте или инвазией вируса гриппа в клетку или субъекта. В конкретных вариантах осуществления данный термин относится к респираторной болезни, вызываемой вирусом гриппа.

Используемый в настоящем документе термин нуклеиновая кислота предназначен для включения молекул ДНК (например, кДНК или геномной ДНК) и молекул РНК (например, мРНК), а также аналогов

ДНК и РНК, созданных с применением аналогов нуклеотидов. Нуклеиновая кислота может быть однонитевой или двунитевой. Молекулы нуклеиновых кислот могут быть модифицированы химическим или биохимическим путем или могут содержать неприродные или дериватизированные нуклеотидные основания, что будет совершенно понятно специалистам в данной области техники. Такие модификации включают, например, метки, метилирование, замену одного или нескольких встречающихся в природе нуклеотидов аналогом, модификации межнуклеотидных связей, такие как незаряженные связи (например, метилфосфонатные, фосфотриэфирные, фосфорамидатные, карбаматные и т.д.), заряженные связи (например, фосфоротиоатные, фосфородитиоатные и т.д.), подвешенные фрагменты (например, полипептиды), интеркаляторы (например, акридин, псорален и т.д.), хелатирующие вещества, алкилирующие вещества и модифицированные связи (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.). Упоминание последовательности нуклеиновой кислоты охватывает комплементарную ей последовательность, если не указано иное. Таким образом, упоминание молекулы нуклеиновой кислоты с конкретной последовательностью следует понимать как охватывающее комплементарную ей нить с ее комплементарной последовательностью. Комплементарная нить также применима, например, для антисмысловых терапевтических средств, гибридизационных зондов и праймеров для ПЦР.

Применяемая в настоящем документе в определенных вариантах осуществления нумерация аминокислот в HA основана на нумерации аминокислот в НАО вируса гриппа дикого типа, например, нумерации аминокислот в штамме вируса гриппа H1N1 A/Brisbane/59/2007 (SEQ ID NO: 1). Применяемая в настоящем изобретении формулировка аминокислота в положении x в НА, таким образом, означает аминокислоту, соответствующую аминокислоте в положении x в НАО определенного вируса гриппа дикого типа, например, A/Brisbane/59/2007 (SEQ ID NO: 1; где аминокислоты домена НА2 были указаны курсивом). Специалисту в данной области техники будет понятно, что путем множественного выравнивания последовательностей можно определить эквивалентные аминокислоты в других штаммах и/или подтипах вируса гриппа. Необходимо отметить, что в системе нумерации, применяемой во всем описании, 1 относится к N-концевой аминокислоте незрелого белка НАО (SEQ ID NO: 1). Зрелая последовательность начинается, например, с положения 18 SEQ ID NO: 1. Специалисту в данной области техники будет понятно, что лидерная последовательность (или сигнальная последовательность), которая определяет направление транспорта белка в ходе продуцирования (например, соответствующая аминокислотам 1-17 SEQ ID NO: 1), обычно отсутствует в конечном полипептиде, который, например, применяют в вакцине. В определенных вариантах осуществления полипептиды согласно настоящему изобретению, таким образом, содержат аминокислотную последовательность без лидерной последовательности, т.е. в основе этой аминокислотной последовательности лежит аминокислотная последовательность НАО без сигнальной последовательности.

Полипептид относится к полимеру аминокислот, соединенных амидными связями, как известно специалисту в данной области техники. Данный термин, используемый в настоящем документе, может означать одну полипептидную цепь, соединенную с помощью ковалентных амидных связей. Данный термин может также означать несколько полипептидных цепей, связанных с помощью нековалентных взаимодействий, таких как ионные контакты, водородные связи, ван-дер-ваальсовы контакты и гидрофобные контакты. Специалистам в данной области техники будет понятно, что данный термин включает полипептиды, которые были модифицированы, например, путем посттрансляционного процессинга, такого как отщепление сигнального пептида, образование дисульфидных связей, гликозилирование (например, N-сцепленное и О-сцепленное гликозилирование), расщепление протеазой и липидная модификация (например, S-пальмитоилирование).

Полипептид стеблевого домена относится к полипептиду, который содержит одну или несколько полипептидных цепей, образующих стеблевой домен встречающегося в природе (или дикого типа) гемагглютинина (HA). Как правило, полипептид стеблевого домена представляет собой одну полипептидную цепь (т.е. соответствует стеблевому домену полипептидного гемагглютинина НАО) или две полипептидные цепи (т.е. соответствует стеблевому домену полипептидного гемагглютинина НА1, связанного с полипептидным гемагглютинином НА2). Согласно настоящему изобретению полипептид стеблевого домена содержит одну или несколько мутаций по сравнению с молекулой HA дикого типа, в частности, один или несколько аминокислотных остатков HA дикого типа могут быть заменены другими аминокислотами, которые не встречаются в природе в соответствующем положении в конкретном HA дикого типа. Полипептиды стеблевого домена согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать одну или несколько линкерных последовательностей, как описано ниже.

Выражение вектор обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, в которую может быть вставлена вторая молекула нуклеиновой кислоты для введения хозяину, где она будет реплицироваться и в некоторых случаях экспрессироваться. Другими словами, вектор способен транспортировать молекулу нуклеиновой кислоты, к которой он был присоединен. Под применяемым в данном документе термином вектор подразумеваются векторы для клонирования, а также векторы экспрессии. Векторы включают, без ограничений, плазмиды, космиды, бактериальные искусственные хромосомы (ВАС) и искусственные хромосомы дрожжей (YAC), а также векторы, полученные из бактериофагов или вирусов растений или животных (в том числе человека). Векторы содержат точку начала репликации, распознаваемую предпо10 038400 лагаемым хозяином, и в случае векторов экспрессии - промоторные и другие регуляторные области, распознаваемые хозяином. Определенные векторы способны к автономной репликации в хозяине, которому они введены (например, векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации, могут реплицироваться в бактериях). Другие векторы можно встроить в геном хозяина после введения хозяину, и они, таким образом, реплицируются наряду с геномом хозяина.

Используемый в настоящем документе термин дикого типа применительно к вирусу относится к вирусам гриппа, которые являются преобладающими, циркулируют в естественных условиях и вызывают типичные вспышки заболевания.

Подробное описание

Вирусы гриппа имеют значительное влияние на глобальное здравоохранение населения, вызывая миллионы случаев тяжелой болезни каждый год, тысячи смертей и значительные экономические потери. Существующие трехвалентные противогриппозные вакцины вызывают сильный ответ с образованием нейтрализующих антител к вакцинным штаммам и близкородственным изолятам, который, однако, редко распространяется на более отличающиеся штаммы в пределах подтипа или на другие подтипы. В дополнение, выбор соответствующих вакцинных штаммов представляет много сложностей и часто приводит к недостаточной защите. Более того, прогнозирование подтипа следующего пандемического вируса, в том числе того, когда и где он появится, в настоящее время невозможно.

Гемагглютинин (HA) является основным гликопротеином оболочки вирусов гриппа А, который представляет собой основную мишень для нейтрализующих антител. Гемагглютинин имеет две главные функции в ходе процесса проникновения. Во-первых, гемагглютинин опосредует прикрепление вируса к поверхности клеток-мишеней благодаря взаимодействию с рецепторами, содержащими сиаловую кислоту. Во-вторых, после эндоцитоза вируса гемагглютинин в дальнейшем инициирует слияние вирусной и эндосомальной мембран с высвобождением вирусного генома в цитоплазму клетки-мишени. HA содержит крупный эктодомен из ~500 аминокислот, который расщепляется ферментами хозяина с образованием двух полипептидов, остающихся соединенными дисульфидной связью. Большая часть N-концевого фрагмента (НА1, 320-330 аминокислот) образует мембранно-дистальный глобулярный домен, который содержит рецептор-связывающий участок и большинство детерминант, распознаваемых антителами, нейтрализующими вирус. Меньшая С-концевая часть (НА2, ~180 аминокислот) образует стеблеподобную структуру, которая заякоривает глобулярный домен на клеточной или вирусной мембране. Степень гомологии последовательности между подтипами является меньшей для полипептидов НА1 (34-59% гомология между подтипами), чем для полипептидов НА2 (51-80% гомология). Наиболее консервативная область представляет собой последовательность вблизи участка расщепления, в частности 23 N-концевые аминокислоты НА2, которые являются консервативными среди всех подтипов вируса гриппа A (Lorieau et al., 2010). Часть этой области доступна в виде поверхностной петли в молекулепредшественнице HA (HA0), но становится недоступной после расщепления HA0 на НА1 и НА2.

Большинство нейтрализующих антител связываются с петлями, которые окружают рецепторсвязывающий участок, и препятствуют связыванию с рецептором и прикреплению. Так как эти петли являются высоковариабельными, большинство антител, нацеленных на эти области, являются штаммоспецифическими, что объясняет то, почему существующие вакцины вызывают выработку такого ограниченного штаммоспецифического иммунитета. Недавно, однако, были созданы полностью человеческие моноклональные антитела к гемагглютинину вируса гриппа с широким спектром перекрестнонейтрализующей активности. Функциональный и структурный анализ выявил, что эти антитела препятствуют процессу слияния мембран и направлены к высоко консервативным эпитопам в стеблевом домене белка HA вируса гриппа (Throsby et al., 2008; Ekiert et al., 2009, WO 2008/028946, WO 2010/130636, WO 2013/007770).

Полипептиды стеблевого домена, стабильно представляющие эпитопы этих антител, описаны в одновременно находящейся на рассмотрении заявке на патент PCT/EP2012/073706. По меньшей мере некоторые из полипептидов стеблевого домена, описанных в настоящем документе, стабильно представляют эпитоп CR6261 и/или CR9114 и являются иммуногенными у мышей. Дополнительные иммуногенные полипептиды стеблевого домена, стабильно представляющие эпитоп CR6261 и/или CR9114, были описаны в одновременно находящейся на рассмотрении заявке на патент PCT/EP2014/060997.

По настоящему изобретению были сконструированы новые полипептиды стеблевого домена НА, представляющие эти эпитопы. Эти полипептиды можно применять для создания универсальной эпитопной вакцины, индуцирующей защиту от широкого круга штаммов вируса гриппа. Как и в ранее описанных полипептидах стеблевого домена, высоковариабельную и иммунодоминантную часть, т.е. головной домен, сначала удаляют из полноразмерной молекулы HA для создания полипептида стеблевого домена, также называемого mini-HA, чтобы перенаправить иммунный ответ на стеблевой домен, где расположены эпитопы нейтрализующих антител широкого спектра действия. Нейтрализующие антитела широкого спектра, упомянутые выше, использовали для проверки правильной укладки вновь созданных молекул и для подтверждения наличия нейтрализующих эпитопов.

Новые полипептиды стеблевого домена по настоящему изобретению демонстрируют увеличенное связывание с антителами, в частности CR6261 и/или CR9114, и/или увеличенную склонность к мульти11 038400 меризации и увеличению стабильности по сравнению со связыванием этих антител со стеблевыми полипептидами, описанными ранее (PCT/EP2012/073706 и PCT/EP2014/060997).

Полипептиды стеблевого домена по настоящему изобретению способны представлять консервативные эпитопы мембранно-проксимального стеблевого домена молекулы HA иммунной системе в отсутствие доминантных эпитопов, присутствующих в мембранно-дистальном головном домене. С этой целью часть первичной последовательности белка НАО, составляющую головной домен, удаляют и заново соединяют либо непосредственно, либо в некоторых вариантах осуществления посредством введения короткой гибкой сшивающей последовательности (линкера) с восстановлением непрерывности аминокислотной цепи. Полученную полипептидную последовательность дополнительно модифицируют путем введения специфических мутаций, которые стабилизируют нативную 3-мерную структуру оставшейся части молекулы НАО.

Настоящее изобретение, в частности, обеспечивает полипептиды стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа, содержащие:

(а) домен НА1 гемагглютинина вируса гриппа, который содержит N-концевой стеблевой сегмент НА1, ковалентно соединенный с помощью линкерной последовательности из 0-50 аминокислотных остатков с С-концевым стеблевым сегментом НА1, при этом указанный С-концевой сегмент НА1 соединен с (b) доменом НА2 гемагглютинина вируса гриппа, где домены НА1 и НА2 получены из подтипа вируса гриппа А, содержащего HA подтипа H1;

(c) где полипептид не содержит участок расщепления протеазами в месте сочленения между НА1 и НА2 доменом;

(d) где указанный N-концевой сегмент НА1 содержит аминокислоты 1-х НА1, предпочтительно аминокислоты р-х НА1, и где С-концевой стеблевой сегмент НА1 содержит аминокислоты от у до С-концевой аминокислоты НА1, где x = аминокислота в положении 52 SEQ ID NO: 1 (или эквивалентном положении в гемагглютинине другого штамма вируса гриппа), p = аминокислота в положении 18 SEQ ID NO: 1 (или эквивалентном положении в гемагглютинине другого штамма вируса гриппа) и y = аминокислота в положении 321 SEQ ID NO: 1 (или эквивалентном положении в другом гемагглютинине);

(e) где область, содержащая аминокислотные остатки 402-418, содержит аминокислотную последовательность X₁NTQX₂TAX₃GKEX₄N(H/K)X5E (K/R) (SEQ ID NO: 8), где

X1 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из M, E, K, V, R и Т,

Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из F, I, N, T, H, L и Y, предпочтительно I, L или Y,

Х₃ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из V, A, G, I, R, F и S, предпочтительно А, I или F,

Х₄ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из F, I, N, S, T, Y, E, K, M и V, предпочтительно I, Y, М или V,

Х₅ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из L, H, I, N, R, предпочтительно I;

(f) где аминокислотный остаток в положении 337 (домен НА1) выбран из группы, состоящей из I, E, K, V, А, и Т, аминокислотный остаток в положении 34 0 (домен НА1) выбран из группы, состоящей из I, К, R, T, F, N, S и Y, аминокислотный остаток в положении 352 (домен НА2) выбран из группы, состоящей из D, V, Y, A, I, N, S, и Т, и аминокислотный остаток в положении 353 (домен НА2) выбран из группы, состоящей из K, R, T, E, G, и V; и (g) где полипептид дополнительно содержит дисульфидный мостик между аминокислотой в положении 324 и аминокислотой в положении 436; и (h) где аминокислотная последовательность RMKQIEDKIEEIESK (SEQ ID NO: 20) введена в положения 419-433 или где последовательность RMKQIEDKIEEIESKQK (SEQ ID NO: 21) введена в положения 417-433.

Настоящее изобретение, таким образом, обеспечивает стабильные стеблевые полипептиды гемагглютинина, которые имитируют трехмерную конформацию стебля природной молекулы гемагглютинина.

Полипептиды по настоящему изобретению не содержат полноразмерный домен НА1.

Полипептиды, таким образом, являются существенно меньшими, чем НАО, предпочтительно в них отсутствует вся или фактически вся глобулярная головка НА. Предпочтительно иммуногенные полипептиды имеют длину не более чем 360, предпочтительно не более чем 350, 340, 330, 320, 310, 305, 300, 295, 290, 285, 280, 275 или 270 аминокислот. В определенных вариантах осуществления иммуногенные полипептиды составляют от приблизительно 250 до приблизительно 350, предпочтительно от приблизительно 260 до приблизительно 340, предпочтительно от приблизительно 270 до приблизительно 330, предпочтительно от приблизительно 270 до приблизительно 330 аминокислот в длину.

Согласно настоящему изобретению N-концевой сегмент НА1 относится к полипептидному сег12 038400 менту, который соответствует аминоконцевому участку домена НА1 молекулы гемагглютинина (HA) гриппа. N-концевой полипептидный сегмент НА1 содержит аминокислоты от положения 1 до положения х домена НА1, где аминокислота в положении х представляет собой аминокислотный остаток в пределах НА1. Выражение С-концевой сегмент НА1 относится к полипептидному сегменту, который соответствует карбоксиконцевому участку домена НА1 гемагглютинина вируса гриппа. С-концевой полипептидный сегмент НА1 содержит аминокислоты от положения у до С-концевой аминокислоты домена НА1 включительно, где аминокислота в положении у представляет собой аминокислотный остаток в пределах НА1. Согласно настоящему изобретению у больше чем х и ввиду этого сегмент домена НА1 между N-концевым сегментом НА1 и С-концевым сегментом НА1, т.е. между аминокислотой в положении х и аминокислотой в положении у НА1, был подвергнут делеции и в некоторых вариантах осуществления замещен линкерной последовательностью. Таким образом, в определенных вариантах осуществления делеция в сегменте НА1 охватывает аминокислотную последовательность от аминокислоты в положении x+1 до аминокислоты в положении y-1 включительно.

В определенных вариантах осуществления полипептиды не содержат сигнальную последовательность. Таким образом, в определенных вариантах осуществления N-концевой сегмент НА1 содержит аминокислоты р-х НА1, где р представляет собой первую аминокислоту зрелой молекулы HA (например, р=18 в случае SEQ ID NO: 1). Специалист в данной области техники сможет определить эквивалентную аминокислоту в других гемагглютининах и получить полипептиды, описанные в настоящем документе, без сигнальных пептидов, например аминокислот 1-17 SEQ ID NO: 1 или эквивалентного положения в других штаммах вируса гриппа H1 (см., например, табл. 2), в положении x домена НА1.

Согласно настоящему изобретению N-концевой сегмент НА1 содержит аминокислоты 1-х, предпочтительно р-х домена НА1, где x=52 и р=18 в SEQ ID NO: 1 или в эквивалентном положении аминокислоты в других последовательностях HA подтипа H1.

Согласно настоящему изобретению С-концевой полипептидный сегмент НА1 содержит аминокислоты от положения у до С-концевой аминокислоты домена НА1 H1 включительно, где у представляет собой 321 или эквивалентное положение аминокислоты в других последовательностях HA подтипа H1.

Согласно настоящему изобретению N-концевой стеблевой сегмент НА1, таким образом, содержит аминокислотные остатки 1-52 НА1, предпочтительно аминокислотные остатки 18-52 НА1, и С-концевой стеблевой сегмент НА1 содержит аминокислотные остатки 321-343 НА1. В определенных вариантах осуществления N-концевой стеблевой сегмент НА1 состоит из аминокислотных остатков 1-52 НА1, предпочтительно из аминокислотных остатков 18-52 НА1, и С-концевой стеблевой сегмент НА1 состоит из аминокислотных остатков 321-343 НА1.

Согласно настоящему изобретению полипептиды не содержат участок расщепления протеазами в месте сочленения между доменами НА1 и НА2. Таким образом, полипептиды стеблевого домена гемагглютинина являются устойчивыми к расщеплению протеазой на стыке между НА1 и НА2. Специалистам в данной области техники известно, что последовательность Arg (R) - Gly (G), объединяющая НА1 и НА2 (т.е. положения аминокислот 343 и 344 в SEQ ID NO: 1), представляет собой участок распознавания для трипсина и трипсиноподобных протеаз и, как правило, расщепляется для активации гемагглютинина. Поскольку полипептиды стеблевого домена НА, описанные в настоящем документе, не должны быть активированы, полипептиды стеблевого домена гемагглютинина по настоящему изобретению являются устойчивыми к расщеплению протеазами. Согласно настоящему изобретению участок расщепления протеазами, таким образом, был удален с целью предупреждения расщепления полипептида в участке расщепления между НА1 и НА2 доменом. В определенных вариантах осуществления участок расщепления протеазами был удален посредством мутации С-концевой аминокислоты С-концевого сегмента НА1 и/или мутации N-концевой аминокислоты домена НА2 для получения последовательности, которая является устойчивой к расщеплению протеазой. В определенных вариантах осуществления удаления участка расщепления между НА1 и НА2 в определенных вариантах осуществления можно достичь посредством мутации замены R (в небольшом ряде случаев K) на Q в положении Р1 (см., например, Sun et al., 2 010, для пояснения номенклатуры участка расщепления (положение 343 в SEQ ID NO: 1). Таким образом, в определенных вариантах осуществления С-концевой аминокислотный остаток в С-концевом стеблевом сегменте НА1 представляет собой любую аминокислоту, отличную от аргинина (R) или лизина (K). В определенных вариантах осуществления С-концевая аминокислота в НА1 представляет собой глутамин (Q), серин (S), треонин (Т), аспарагин (N), аспарагиновую кислоту (D) или глутаминовую кислоту (Е). В определенных вариантах осуществления С-концевой аминокислотный остаток в С-концевом стеблевом сегменте НА1 представляет собой глутамин (Q).

Согласно настоящему изобретению полипептиды получены из или лежат в основе HA H1, т.е. НА, содержащем аминокислотную последовательность вируса гриппа подтипа H1. В конкретном варианте осуществления полипептиды содержат стеблевые домены гемагглютинина из или на основе HA вируса гриппа А, включая HA из подтипа H1, например из вируса гриппа A/Brisbane/59/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 1), как описано ниже. Специалисту в данной области техники будет понятно, что также и другие вирусы гриппа А, содержащие HA подтипа H1, можно применять в соответствии с настоящим изобретением. В определенных вариантах осуществления полипептиды содержат стеблевые домены ге магглютинина, которые получены из или лежат в основе HA вируса гриппа А Н1, выбранного из табл. 2. Под выражением получено из или лежит в основе следует понимать, что N-концевые сегменты и/или С-концевые сегменты домена НА1 и/или домена НА2 обладают по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью аминокислотной последовательности с соответствующими N-концевыми и/или С-концевыми сегментами доменов НА1 и/или НА2 встречающегося в природе гемагглютинина вируса гриппа подтипа H1, известного специалистам в данной области техники или обнаруженного позже.

Согласно настоящему изобретению домен НА2 содержит одну или несколько мутаций в аминокислотной последовательности НА2, соединяющей С-концевой остаток спирали А с N-концевым остатком спирали CD (фиг. 1). Аминокислотная последовательность НА2 H1, соединяющая С-концевой остаток спирали А и N-концевой остаток спирали CD, содержит аминокислотную последовательность, содержащую остатки 402-418 HA вируса гриппа (нумерация согласно SEQ ID NO: 1), которая включает в себя аминокислотную последовательность MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R) (SEQ ID NO: 7).

В определенных вариантах осуществления аминокислотная последовательность, соединяющая С-концевой остаток спирали А с N-концевым остатком CD-спирали, т.е. область, содержащая аминокислотные остатки 402-418 HA вируса гриппа серотипа H1 (нумерация согласно SEQ ID NO: 1), содержит аминокислотную последовательность X₁NTQX₂TAX₃GKEX₄N(H/K)X₅E (K/R) (SEQ ID NO: 8).

Согласно настоящему изобретению одна или несколько аминокислот в положениях 402, 406, 409, 413 и 416 (нумерация относится к SEQ ID NO: 1), т.е. одна или несколько аминокислот X1, Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅, были подвергнуты мутации, т.е. включают в себя аминокислоту, которая не встречается в этих положениях в вирусе гриппа дикого типа, который лежит в основе стеблевого полипептида.

В определенных вариантах осуществления мутировавшая аминокислота в положении 402, т.е. X1, представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из M, E, K, V, R и Т.

В определенных вариантах осуществления мутировавшая аминокислота в положении 406, т.е. Х₂, представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из F, I, N, T, H, L и Y, предпочтительно I, L или Y.

В определенных вариантах осуществления мутировавшая аминокислота в положении 409, т.е. Х₃, представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из V, A, G, I, R, F и S, предпочтительно А, I или F.

В определенных вариантах осуществления мутировавшая аминокислота в положении 413, т.е. Х₄, представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из F, I, N, S, Т, Y, E, K, М и V, предпочтительно I, Y, М или V.

В определенных вариантах осуществления мутировавшая аминокислота в положении 416, т.е. Х₅, представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из L, H, I, N, R, предпочтительно I.

Комбинации этих мутаций также возможны.

В определенных вариантах осуществления X1 представляет собой М, Х₂ представляет собой Y, Х₃представляет собой I, Х₄представляет собой Y, и Х₅ представляет собой S.

Согласно настоящему изобретению стеблевые полипептиды содержат одну или несколько дополнительных мутаций, т.е. аминокислотных замен, в домене НА1 и/или домене НА2 по сравнению с аминокислотной последовательностью соответствующих доменов НА1 и/или НА2 вируса гриппа дикого типа, т.е. вируса гриппа, который лежит в основе стеблевых полипептидов.

В определенных вариантах осуществления один или несколько аминокислотных остатков рядом с участком расщепления НАО (остаток 343 в SEQ ID NO: 1) были подвергнуты мутации. В определенных вариантах осуществления один или несколько аминокислотных остатков в положениях 337, 340, 352 или 353 в SEQ ID NO: 1 или эквивалентных положениях в других вирусах гриппа были подвергнуты мутации, т.е. заменены аминокислотой, которая не встречается в соответствующем положении в аминокислотной последовательности HA вируса гриппа дикого типа, который лежит в основе стеблевого полипептида. В табл. 6 показана встречающаяся в природе аминокислотная изменчивость.

В определенных вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну мутацию в положении 352 в SEQ ID NO: 1 или в эквивалентном положении в других вирусах гриппа.

В определенных вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну мутацию в положении 353 в SEQ ID NO: 1 или в эквивалентном положении в других вирусах гриппа.

В определенных вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну мутацию в положении 337 в SEQ ID NO: 1 или в эквивалентном положении в других вирусах гриппа.

В определенных вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну мутацию в положении 340 в SEQ ID NO: 1 или в эквивалентном положении в других вирусах гриппа.

В определенных вариантах осуществления мутировавший аминокислотный остаток в положении 337 (домен НА1) выбран из группы, состоящей из: I, E, K, V, А и Т.

В определенных вариантах осуществления мутировавший аминокислотный остаток в положении

340 (домен НА1) выбран из группы, состоящей из: I, K, R, T, F, N, S и Y.

352 (домен НА2) выбран из группы, состоящей из: D, V, Y, A, I, N, S и Т.

В определенных вариантах осуществления мутировавший аминокислотный остаток в положении 353 (домен НА2) выбран из группы, состоящей из: K, R, T, E, G и V.

В определенных вариантах осуществления при мутации аминокислоты в последовательность вводится консенсусный участок для N-гликозилирования, например, N-X-T/S (где X представляет собой любую встречающуюся в природе аминокислоту, за исключением Р), как это, например, имеет место в случае I340N в SEQ ID NO: 6.

В определенных вариантах осуществления мутировавшая аминокислота представляет собой аминокислоту, которая не встречается в природе в последовательностях из того же подтипа.

В определенных вариантах осуществления мутировавший аминокислотный остаток в положении 337 (домен НА1) представляет собой K.

В определенных вариантах осуществления мутировавший аминокислотный остаток в положении 340 (домен НА1) представляет собой K.

В определенных вариантах осуществления мутировавший аминокислотный остаток в положении 352 (домен НА2) представляет собой F.

В определенных вариантах осуществления мутировавший аминокислотный остаток в положении 353 (домен НА2) представляет собой Т.

Снова необходимо отметить, что во всем документе нумерация аминокислот основана на нумерации аминокислот в НАО H1, в частности на нумерации аминокислот в штамме вируса гриппа H1N1 A/Brisbane/59/2007 (SEQ ID NO: 1). Специалист в данной области техники сможет определить эквивалентные (или соответствующие) аминокислоты в HA из других вирусов гриппа и таким образом будет иметь возможность определить эквивалентные мутации, см., например, табл. 2 для выравнивания последовательностей различных вирусов гриппа H1.

Согласно настоящему изобретению полипептиды дополнительно содержат дисульфидный мостик между аминокислотой в положении 324 и аминокислотой в положении 436. Таким образом, согласно настоящему изобретению в полипептиды стеблевого домена был введен по меньшей мере один дисульфидный мостик, предпочтительно между аминокислотами в положениях 324 и 436 (или эквивалентных им) в H1 A/Brisbane/59/2007 (SEQ ID NO: 1). В определенных вариантах осуществления полипептиды, таким образом, дополнительно содержат мутацию R324C в домене НА1 и Т436С в домене НА2. Специалисты в данной области техники могут легко определить эквивалентные положения путем выравнивания последовательностей с помощью подходящего алгоритма, такого как Clustal, MUSCLE и т.д. Сконструированные дисульфидные мостики создают посредством мутации замены на цистеин по меньшей мере одного (если другой уже является цистеином), но обычно двух остатков, являющихся пространственно близкими, которые будут спонтанно или путем активного окисления образовывать ковалентную связь между атомами серы этих остатков.

В определенных вариантах осуществления полипептиды дополнительно содержат одну или несколько дополнительных мутаций в домене НА1 и/или НА2 по сравнению с аминокислотной последовательностью НА, из которого происходят домены НА1 и НА2. Таким образом, стабильность стеблевых полипептидов дополнительно увеличивается.

Заявители ранее выявили нейтрализующие антитела широкого спектра, выделенные из первичных В-клеток человека от вакцинированных индивидуумов, некоторые из них были специфическими для группы 1 (например, CR6261, как описано в WO 2008/028946), а некоторые из них были специфическими для группы 2 вирусов гриппа (например, CR8020, как описано в WO 2010/130636). Подробный анализ эпитопов этих моноклональных антител выявил причину отсутствия перекрестной реактивности этих специфичных антител. В обоих случаях наличие гликанов в различных положениях молекул HA группы 1 или группы 2 по меньшей мере частично объясняло тот факт, что антитела являются группоспецифическими. После идентификации CR9114-подобных антител, которые перекрестно реагируют со многими молекулами HA группы 1 и 2, как описано ниже, стало ясно, что в иммунной системе человека можно вызвать выработку нейтрализующих антител очень широкого спектра действия к вирусам гриппа. Однако, с учетом необходимости в схеме ежегодной вакцинации, выработка этих антител после инфицирования или вакцинации (сезонными) вирусами гриппа подтипов H1 и/или H3, по-видимому, не вызывается или вызывается лишь в очень низкой степени.

По настоящему изобретению предусмотрены полипептиды, которые имитируют специфические эпитопы CR6261 и/или CR9114 и которые могут быть использованы в качестве иммуногенных полипептидов, например, чтобы вызвать перекрестно нейтрализующие антитела при введении in vivo, либо отдельно, либо в комбинации с другими профилактическими и/или терапевтическими методами лечения. Под перекрестно нейтрализующими антителами подразумевают антитела, которые способны нейтрализовать по меньшей мере два, предпочтительно по меньшей мере три, четыре или пять различных подтипов вирусов гриппа А из филогенетической группы 1 и/или по меньшей мере два, предпочтительно по меньшей мере три, четыре или пять различных подтипов вирусов гриппа А из филогенетической группы и/или по меньшей мере два различных подтипа вирусов гриппа В, в частности по меньшей мере все штаммы вируса, которые нейтрализуются с помощью CR6261 и CR9114.

Полипептиды по настоящему изобретению содержат эпитоп связывающихся со стеблем нейтрализующих антител к вирусу гриппа CR6261 и/или CR9114. В определенных вариантах осуществления полипептиды, таким образом, избирательно связываются с антителами CR6261 и/или CR9114. В определенных вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению не связываются с антителами CR8020 и/или CR8057. Применяемое в настоящем изобретении CR6261 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; CR9114 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12. CR8057 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. CR8020 содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18.

Как описано выше, полипептиды содержат домен НА1 гемагглютинина вируса гриппа, который содержит N-концевой стеблевой сегмент НА1, ковалентно связанный сшивающей последовательностью из 0-50 аминокислотных остатков с С-концевым стеблевым сегментом НА1. Сшивающая последовательность, если присутствует, не встречается в природном HA или HA дикого типа. В определенных вариантах осуществления линкер представляет собой пептид, который содержит один аминокислотный остаток, два или менее аминокислотных остатка, три или менее аминокислотных остатка, четыре или менее аминокислотных остатка, пять или менее аминокислотных остатков, десять или менее аминокислотных остатков, 15 или менее аминокислотных остатков, или 20 или менее аминокислотных остатков, или 30 или менее аминокислотных остатков, или 40 или менее аминокислотных остатков, или 50 или менее аминокислотных остатков. В конкретном варианте осуществления линкерная последовательность представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из

G, GS,

GGG, GSG, GSA, GSGS, GSAG, GGGG, GSAGS, GSGSG, GSAGSA, GSAGSAG и GSGSGSG.

В определенных вариантах осуществления N-концевой сегмент НА1 непосредственно соединен с С-концевым сегментом НА1, т.е. полипептиды не содержат линкерную последовательность.

НА вируса гриппа в своей нативной форме существует в виде тримера на клеточной или вирусной мембране. В определенных вариантах осуществления внутриклеточную и трансмембранную последовательность удаляют, так что после экспрессии в клетках продуцируется секретируемый (растворимый) полипептид. Были описаны способы экспрессии и очистки секретируемых эктодоменов HA были описаны (см., например, Dopheide et al., 2009; Ekiert et al., 2009, 2011; Stevens et al., 2004, 2006; Wilson et al., 1981). Специалисту в данной области техники будет понятно, что эти способы можно также применять непосредственно к полипептидам стеблевого домена по настоящему изобретению для достижения экспрессии секретируемого (растворимого) полипептида. Таким образом, эти полипептиды также охватываются настоящим изобретением.

В определенных вариантах осуществления полипептиды содержат полный домен НА2, соответственно включающий в себя трансмембранную и внутриклеточную последовательности. В других вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению не содержат внутриклеточные последовательности HA и трансмембранный домен. В определенных вариантах осуществления полипептиды содержат усеченный домен НА2. В определенных вариантах осуществления внутриклеточная и трансмембранная последовательности, например аминокислотная последовательность от положения 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 526, 528, 529 или 530 (или эквивалентного ему) домена НА2 до С-конца домена НА2 (нумерация согласно SEQ ID NO: 1), была удалена для получения растворимого полипептида после экспрессии в клетках.

В определенных вариантах осуществления С-концевая часть домена НА2 от положения 519 до С-концевой аминокислоты была подвергнута делеции. В дополнительных вариантах осуществления С-концевая часть домена НА2 от положения 530 до С-концевой аминокислоты была подвергнута делеции.

Необязательно, последовательность His-метки (НННННН (SEQ ID NO: 15) или ННННННН (SEQ ID NO: 16)), необязательно присоединяемую посредством линкера, можно соединить с (необязательно усеченным) доменом НА2 для целей очистки. Линкер необязательно может содержать участок протеолитического расщепления для ферментативного удаления His-метки после очистки.

В определенных вариантах осуществления полипептиды дополнительно стабилизируют путем введения последовательности, которая, как известно, образует тримерные структуры, т.е.

GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 3), на С-конце НА2, необязательно присоединяемой посредством линкера. Таким образом, в определенных вариантах осуществления С-концевая часть домена НА2 была замещена аминокислотной последовательностью GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 3), необязательно присоединяемой посредством линкера. Линкер может необязательно содержать участок расщепления для последующего процессинга согласно протоколам, хорошо известным специалистам в данной области техники. Для облегчения очистки растворимой формы можно добавить последовательность метки, например, His-метку (НННННН (SEQ ID NO: 15) или ННННННН (SEQ ID NO: 16)) или FLAG-метку (dykddddk) (SEQ id NO: 22) или их комбинацию, необязательно присоединяемую посредством коротких линкеров. Линкер может необязательно содержать участок (часть участка) протеолитического расщепления, например, IEGR (SEQ ID NO: 24) (фактор X) или LVPRGS (SEQ ID NO: 23) (тромбин), для последующего процессинга согласно протоколам, хорошо известным специалистам в данной области техники. Процессированные белки также охватываются настоящим изобретением.

В определенных вариантах осуществления С-концевая часть домена НА2 в положениях 519-565 была подвергнута делеции (нумерация согласно SEQ ID NO: 1) и замещена на

SGRDYKDDDDKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH (SEQ ID NO: 4).

В определенных вариантах осуществления С-концевая часть домена НА2 в положениях 530-565 была подвергнута делеции (нумерация согласно SEQ ID NO: 1) и замещена на

SGRDYKDDDDKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH (SEQ ID NO: 4) .

Нативный HA существует в виде тримера на клеточной поверхности. Большинство взаимодействий между отдельными мономерами, которые удерживают их в тримере вместе, происходят в головном домене, тогда как в стеблевом домене тримеризация опосредована образованием тримерного суперспирального мотива. После удаления головки третичная структура дестабилизируется, и, следовательно, для увеличения стабильности белка необходимы модификации. Путем усиления склонности к спиралеобразованию у спирали CD можно создать более стабильный белок.

В полипептидах, описанных в одновременно находящейся на рассмотрении заявке PCT/EP2014/060997, последовательность MKQIEDKIEEIESKQ (SEQ ID NO: 5), полученная из белка-активатора транскрипции дрожжей GCN4 и известная как тримеризующая, была введена в CD-спираль в положения 419-433 (или эквивалентные им). Данная последовательность обладает высокой склонностью к образованию спиральных вторичных структур и вследствие этого может повышать общую стабильность полипептидов по настоящему изобретению.

Согласно настоящему изобретению было неожиданно показано, что стабильность и мультимеризированное состояние полипептида зависят от точного местоположения и последовательности для полученной из GCN4 последовательности в первичной последовательности полипептидов по настоящему изобретению.

Таким образом, согласно настоящему изобретению последовательность RMKQIEDKIEEIESK (SEQ ID NO: 20) введена в положения 419-433 (нумерация согласно SEQ ID NO: 1) или последовательность rmkqiedkieeieskqk (seq id no: 21) введена в положения 417-433.

В определенных вариантах осуществления полипептиды являются гликозилированными.

В исследовании, которое привело к настоящему изобретению, например, s74H9 (SEQ ID NO: 65), s127H1 (SEQ ID NO: 66), s71H2 (SEQ ID NO: 71), s86B4 (SEQ ID NO: 67), s115A1 (SEQ ID NO: 70), S2201C9 (SEQ ID NO: 77), s55G7 (SEQ ID NO: 68), s113E7 (SEQ ID NO: 78), s6E12 (SEQ ID NO: 69), s181H9 (SEQ ID NO: 76), описанные в одновременно находящейся на рассмотрении заявке на патент PCT/EP2014/060997, были модифицированы с помощью методик молекулярной биологии, хорошо известных специалистам в данной области техники, для создания последовательностей s74H9-t2 (SEQ ID NO: 93), s127H1-t2 (SEQ ID NO: 91), s71H2-t2 (SEQ ID NO: 97), s86B4-t2 (SEQ ID NO: 92), s115A1-t2 (SEQ ID NO: 96), s220C9-t2 (SEQ ID NO: 99), s55G7-t2 (SEQ ID NO: 95), s113E7-t2 (SEQ ID NO: 100), s6E12-t2 (SEQ ID NO: 94), s181H9-t2 (SEQ ID NO: 98), содержащих последовательность RMKQIEDKIEEIESK (SEQ ID NO: 20) в положениях 419-433.

Подобным образом создавали полипептиды s74H9-t3 (SEQ ID NO: 123), s127H1-t3 (SEQ ID NO: 121), s71H2-t3 (SEQ ID NO: 127), s86B4-t3 (SEQ ID NO: 122), s115A1-t3 (SEQ ID NO: 126), s2201C9-t3 (SEQ ID NO: 129), s55G7-t3 (SEQ ID NO: 125), s113E7-t3 (SEQ ID NO: 130), s6E12-t3 (SEQ ID NO: 124), s181H9-t3 (SEQ ID NO: 128), содержащие последовательность RMKQIEDKIEEIESKQK (SEQ ID NO: 21) в положениях 417-433.

Полипептиды по настоящему изобретению показывают увеличенное связывание антител к вирусу гриппа, в частности CR6261 и/или CR9114, и/или увеличенную склонность к мультимеризации и/или увеличению стабильности, по сравнению со стеблевыми полипептидами, описанными ранее (PCT/EP2012/073706 и PCT/EP2014/060997).

В определенных вариантах осуществления полипептиды содержат аминокислотную последова17 038400 тельность:

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNXiPSX 2QSQGLFGAIAGX3X4EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5 NTQX6TAX₇GKEX₈NKX₉ERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEK VKS QLKNNAKEIGNGC FE FYHKCNDECME SVKNGTYDYPKYS EE SKLNREKIDGVS GRDYKDDD DKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH (SEQ ID NO: 145), где X1 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из E, I, K, V, А и Т;

Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из I, К, R, T, F, N, S и Y;

Х₃ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из D, F, V, Y, A, I, N, S и T;

Х4 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из I, K, R, T, E, G и V;

Х₅ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из M, E, K, V, R, Т;

Х₆ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из F, I, N, S, T, Y, Н и L;

Х₇ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, G, I, R, Т, V, F и S;

Х₈ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из F, I, N, S, T, Y, G, E, K, М и V; и

Х₉ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Н, I, L, N, R и S.

В определенных вариантах осуществления полипептиды содержат аминокислотную последовательность:

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX1PSX 2QSQGLFGAIAGX3X4EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5 NTQX₆TAX₇GKEX₈NKX₉ERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEK VKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDG (SEQ ID NO: 14 6) , где X1 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Е, I, K, V, А и Т;

Х2 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из I, K, R, T, F, N, S и Y;

Х3 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из D, F, V, Y, A, I, N, S и Т;

Х₄ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из I, K, R, T, E, G и V;

Х5 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из M, E, K, V, R, Т;

Х6 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из F, I, N, S, T, Y, Н и L;

Х7 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из A, G, I, R, Т, V, F и S;

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNXiPSX 2QSQGLFGAIAGX3X4EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5 ntqx₆tax₇gkex₈nkx₉errmkqiedkieeieskiwcynaellvllenertldfhdsnvknlyek VKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQ IEG (SEQ ID NO: 147), где X1 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Е, I, K, V, А и Т;

Х₂ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из I, K, R, T, F, N, S и Y;

Х9 представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Н, I, L, N, R и S.

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNXiPSX ₂QSQGLFGAIAGX3X₄EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5 ntqx₆tax₇gkex₈nkx₉errmkqiedkieeieskiwcynaellvllenertldfhdsnvknlyek VKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQ ILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI (SEQ ID NO: 148), где Х₁ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Е, I, K, V, А и Т;

Х₃ представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из D, F, V, Y, A, I, N, S и Т;

В определенных вариантах осуществления X1 представляет собой K, Х₂ представляет собой K, Х₃представляет собой F, Х₄ представляет собой Т, Х₅ представляет собой М, Х₆ представляет собой Y, Х₇представляет собой I, Х₈ представляет собой Y и Х₉ представляет собой S в SEQ ID NO: 145-148.

Полипептиды стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа можно получить согласно любой методике, которая считается подходящей для специалиста в данной области техники, включая методики, описанные ниже.

Таким образом, иммуногенные полипептиды по настоящему изобретению можно синтезировать в виде последовательностей ДНК с помощью стандартных способов, известных из уровня техники, и клонировать, а затем экспрессировать in vitro или in vivo c применением подходящих ферментов рестрикции и способов, известных из уровня техники. Настоящее изобретение, таким образом, также относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим описанные выше полипептиды. Настоящее изобретение дополнительно относится к векторам, содержащим нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды по настоящему изобретению. В определенных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению является частью вектора, например, плазмиды. С такими векторами можно легко производить манипуляции с помощью способов, хорошо известных специалисту в данной области техники, и их, например, можно разработать так, чтобы они были способны к репликации в прокариотических и/или эукариотических клетках. В дополнение, многие векторы можно непосредственно или в форме выделенного из них необходимого фрагмента применять для трансформации эукариотических клеток и интегрировать целиком или частично в геном таких клеток, получая стабильные клеткихозяева, содержащие необходимую нуклеиновую кислоту в своем геноме. Применяемый вектор может представлять собой любой вектор, который подходит для клонирования ДНК и который можно применять для транскрипции нуклеиновой кислоты, представляющей интерес. При применении клеток-хозяев предпочтительно, чтобы вектор представлял собой интегрирующий вектор. В качестве альтернативы, вектор может представлять собой эписомально реплицирующийся вектор.

Специалист в данной области техники способен выбрать подходящие векторы экспрессии и вставить последовательности нуклеиновых кислот по настоящему изобретению функциональным образом. Специалистам в данной области техники хорошо известно, что для достижения экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды, последовательности, способные управлять экспрессией, можно функционально связать с последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид, с получением рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот, кодирующих белок или полипептид в экспрессируемом формате. Как правило, промоторную последовательность помещают выше последовательностей, которые должны экспрессироваться. В данной области техники доступны многие векторы экспрессии, например серия векторов pcDNA и pEF от Invitrogen, pMSCV и pTK-Hyg от BD Sciences, pCMV-Script от Stratagene и т.д., которые можно применять для получения подходящих промоторов и/или последовательностей терминаторов транскрипции, последовательностей поли-А и т.п. Если последовательность, кодирующая полипептид, представляющий интерес, вставлена надлежащим образом относительно последовательностей, регулирующих транскрипцию и трансляцию кодируемого полипептида, то полученная кассета экспрессии применима для продуцирования полипептида, представляющего интерес, что называется экспрессией. Последовательности, управляющие экспрессией, могут включать в себя промоторы, энхансеры и т.п., а также их комбинации. Они должны быть способными функционировать в клетке-хозяине, тем самым управляя экспрессией последовательностей нуклеиновых кислот, которые функционально связаны с ними. Специалист в данной области техники осведомлен о том, что для достижения экспрессии гена в клетках-хозяевах можно применять различные промоторы. Промоторы могут быть конститутивными или регулируемыми, и их можно получить из разных источников, в том числе вирусов, прокариотических или эукариотических источников, или разрабатывать искусст венным путем. Экспрессия нуклеиновых кислот, представляющих интерес, может происходить под управлением природного промотора или его производного или под управлением полностью гетерологичного промотора (Kaufman, 2000). Некоторые хорошо известные и наиболее часто применяемые промоторы для экспрессии в эукариотических клетках включают в себя промоторы, полученные из вирусов, таких как аденовирус, например, промотор Е1А, промоторы, полученные из цитомегаловируса (CMV), такие как немедленно-ранний (IE) промотор CMV (называемый в настоящем документе промотором CMV) (получаемый, например, из pcDNA, Invitrogen), промоторы, полученные из вируса обезьян 40 (SV40) (Das et al., 1985), и т.п. Из эукариотических клеток также можно получить подходящие промоторы, такие как промоторы генов металлотионеинов (МТ), промотор гена фактора элонгации 1α (EF-1a) (Gill et al., 2001), промотор гена убиквитина С или UB6 (Gill et al., 2001), промотор гена актина, промотор гена иммуноглобулина, промоторы генов теплового шока и т.п. Тестирование промоторной функции и силы промотора является стандартной практикой для специалиста в данной области техники и, как правило, может, например, охватывать клонирование тестируемого гена, такого как ген lacZ, люциферазы, GFP и т.д., позади промоторной последовательности и тестирование экспрессии тестируемого гена. Разумеется, промоторы можно изменять посредством делеции, добавления, мутации последовательностей в них и тестировать на функциональность с обнаружением новых, ослабленных или улучшенных, промоторных последовательностей. Согласно настоящему изобретению сильные промоторы, которые дают высокие уровни транскрипции в выбранных эукариотических клетках, являются предпочтительными.

Конструкции можно вводить путем трансфекции в эукариотические клетки (например, клетки растений, грибов, дрожжей или животных) или приемлемые прокариотические системы экспрессии, такие как Е. coli, с применением способов, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. В некоторых случаях приемлемую последовательность метки (такой как, например, но без ограничения, his-, myc-, strep- или flag-метка) или полного белка (такого как, например, но без ограничения, мальтозу связывающий белок или глутатион-S-трансфераза) можно добавить к последовательностям по настоящему изобретению для обеспечения очистки и/или идентификации полипептидов из клеток или супернатанта. Необязательно можно включить последовательность, содержащую специфический участок протеолиза, для последующего удаления метки путем протеолитического расщепления.

Очищенные полипептиды можно анализировать с помощью спектроскопических способов, известных из уровня техники (например, спектроскопии кругового дихроизма, инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье и ЯМР-спектроскопии или рентгеновской кристаллографии), для исследования наличия необходимых структур, таких как спирали и бета-складчатые слои. ELISA, Octet и FACS и т.п. можно применять для исследования связывания полипептидов по настоящему изобретению с нейтрализующими антителами широкого спектра действия, описанными ранее (CR6261, CR9114, CR8057). Таким образом, можно выбрать полипептиды согласно настоящему изобретению, имеющие нужную конформацию.

Настоящее изобретение дополнительно относится к иммуногенным композициям, содержащим терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного из полипептидов и/или нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Иммуногенные композиции предпочтительно дополнительно содержат фармацевтически приемлемый носитель. В контексте настоящего изобретения термин фармацевтически приемлемый означает, что носитель в используемых дозах и концентрациях не будет вызывать нежелательных или вредных эффектов у субъектов, которым его вводят. Такие фармацевтически приемлемые носители и наполнители хорошо известны из уровня техники (см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18^th edition, A.R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; и Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3^rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]).

Термин носитель относится к разбавителю, вспомогательному средству, наполнителю или инертной среде, с которыми вводят композицию. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина можно, например, использовать в качестве жидких носителей, в частности, для инъекционных растворов. Точный состав должен соответствовать способу введения. Полипептиды и/или молекулы нуклеиновых кислот предпочтительно составляют и вводят в виде стерильного раствора. Стерильные растворы получают путем стерилизующей фильтрации или с помощью других способов, широко известных из уровня техники. Затем растворы можно лиофилизировать или наливать в контейнеры для лекарственных форм. рН раствора обычно находится в диапазоне рН от 3,0 до 9,5, например рН от 5,0 до 7,5.

Настоящее изобретение также относится к полипептидам стеблевого домена HA гриппа, молекулам нуклеиновых кислот и/или векторам, описанным выше, для применения в индукции иммунного ответа против белка HA вируса гриппа. Настоящее изобретение также относится к способам индукции иммунного ответа у субъекта, при этом способ включает введение субъекту полипептида, молекулы нуклеиновой кислоты и/или иммуногенной композиции, описанных выше. Субъект согласно настоящему изобретению предпочтительно представляет собой млекопитающее, которое способно инфицироваться возбудителем инфекционного заболевания, в частности, вирусом гриппа, или может иным образом получить пользу от индукции иммунного ответа, при этом такой субъект, например, является грызуном, например, мышью, хорьком, или домашним или сельскохозяйственным животным, или приматом, отличным от человека, или человеком. Субъект предпочтительно является субъектом-человеком. Настоящее изобретение, таким образом, обеспечивает способы индукции иммунного ответа на гемагглютинин (HA) вируса гриппа, в частности, вируса гриппа А группы 1 и/или группы 2, такого как вирус гриппа, содержащий HA подтипа H1, Н2, H3, Н4, Н5, Н7 и/или Н10, и/или вируса гриппа В, у субъекта с использованием полипептидов, нуклеиновых кислот и/или иммуногенных композиций, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение обеспечивает способы индукции иммунного ответа на вирус гриппа, содержащий HA подтипа H1, у субъекта с использованием полипептидов, нуклеиновых кислот и/или иммуногенных композиций, описанных в настоящем документе.

В некоторых вариантах осуществления индуцируемый иммунный ответ является эффективным для предупреждения и/или лечения гриппозной вирусной инфекции, вызываемой подтипами вируса гриппа А из группы 1 и/или группы 2 и/или вирусами гриппа В. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ, индуцируемый полипептидами, нуклеиновыми кислотами и/или иммуногенными композициями, описанными в настоящем документе, является эффективным для предупреждения и/или лечения вызываемой вирусом гриппа А и/или В инфекции, вызываемой двумя, тремя, четырьмя, пятью или шестью подтипами вирусов гриппа А и/или В. В некоторых вариантах осуществления индуцируемый иммунный ответ является эффективным для предупреждения и/или лечения гриппозной вирусной инфекции, вызываемой вирусом гриппа, содержащим HA подтипа H1.

Поскольку хорошо известно, что небольшие белки и/или молекулы нуклеиновых кислот не всегда эффективно индуцируют сильный иммунный ответ, может быть необходимо увеличить иммуногенность полипептидов и/или молекул нуклеиновых кислот путем добавления вспомогательного средства. В определенных вариантах осуществления иммуногенные композиции, описанные в настоящем документе, содержат вспомогательное средство или вводятся в комбинации с ним. Вспомогательное средство для введения в комбинации с композицией, описанной в настоящем документе, можно вводить до введения, одновременно с введением или после введения указанной композиции. Примеры подходящих вспомогательных средств включают в себя соли алюминия, такие как гидроксид алюминия и/или фосфат алюминия; композиции масляных эмульсий (или композиции типа масло в воде), в том числе эмульсии сквалена в воде, такие как MF59 (см., например, WO 90/14837); составы на основе сапонина, такие как, например, QS21 и иммуностимулирующие комплексы (ISCOM) (см., например, US 5057540; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762, WO 2005/002 620); бактериальные или микробные производные, примерами которых являются монофосфорил-липид A (MPL), 3-О-деацилированный MPL (3dMPL), олигонуклеотиды, содержащие CpG-мотив, ADP-рибозилирующие бактериальные токсины или их мутантные формы, такие как термолабильный энтеротоксин LT E. coli, холерный токсин СТ, коклюшный токсин РТ или столбнячный анатоксин ТТ, Matrix M (Isconova). В дополнение, можно применять известные иммуностимулирующие технологии, такие как слияние полипептидов по настоящему изобретению с белками, известными из уровня техники как усиливающие иммунный ответ (например, со столбнячным анатоксином, CRM197, rCTB, бактериальными флагеллинами или другими), или включение полипептидов в виросомы, или их комбинации. Другими неограничивающими примерами, которые можно применять, являются, например, раскрытые Coffman et al.(2010).

В одном варианте осуществления полипептиды стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа по настоящему изобретению включены в векторы на основе вирусоподобных частиц (VLP). VLP обычно содержат вирусный(вирусные) полипептид(полипептиды), как правило, полученный(полученные) из структурного(структурных) белка(белков) вируса. Предпочтительно VLP не способны к репликации. В определенных вариантах осуществления VLP могут не иметь полного генома вируса или могут содержать часть генома вируса. В некоторых вариантах осуществления VLP не способны инфицировать клетку. В некоторых вариантах осуществления VLP экспрессируют на своей поверхности один или несколько вирусных (например, поверхностный гликопротеин вируса) или невирусных (например, антитело или белок) нацеливающих фрагментов, известных специалисту в данной области техники.

В конкретном варианте осуществления полипептид по настоящему изобретению включен в виросому. Виросому, содержащую полипептид согласно настоящему изобретению, можно получить с помощью методик, известных специалисту в данной области техники. Например, виросому можно получить путем разрушения очищенного вируса, извлечения генома и повторной сборки частиц с вирусными белками (например, полипептидом стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа) и липидами с образованием липидных частиц, содержащих вирусные белки.

Настоящее изобретение также относится к описанным выше полипептидам, нуклеиновым кислотам и/или иммуногенным композициям для индуцирования иммунного ответа у субъекта против гриппа НА, в частности, для применения в качестве вакцины. Полипептиды стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа, нуклеиновые кислоты, кодирующие такие полипептиды, или векторы, содержащие такие нуклеиновые кислоты или полипептиды, описанные в настоящем документе, таким образом, можно применять для того, чтобы вызвать выработку нейтрализующих антител к вирусам гриппа, например к стеблевой области гемагглютинина вируса гриппа. Настоящее изобретение, в частности, относится к полипептидам, нуклеиновым кислотам и/или иммуногенным композициям, описанным выше, для применения в качестве вакцины для предупреждения и/или лечения заболевания или состояния, вызываемого вирусом гриппа А из филогенетической группы 1 и/или филогенетической группы 2 и/или вирусом гриппа В. В одном варианте осуществления вакцину можно применять для предупреждения и/или лечения заболеваний, вызываемых двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью или более различными подтипами из филогенетической группы 1 и/или 2 и/или вирусами гриппа В. В одном варианте осуществления вакцину можно применять для предупреждения и/или лечения гриппозной инфекции, вызываемой вирусом гриппа, содержащим HA подтипа H1.

Полипептиды по настоящему изобретению можно применять после синтеза in vitro или в подходящей клеточной системе экспрессии, в том числе в бактериальных и эукариотических клетках, или в качестве альтернативы можно экспрессировать in vivo в субъекте, нуждающемся в этом, путем экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей иммуногенный полипептид. Такие вакцины на основе нуклеиновых кислот могут принимать любую форму, в том числе голой ДНК, плазмид или вирусных векторов, в том числе аденовирусных векторов.

Введение полипептидов, молекул нуклеиновых кислот и/или иммуногенных композиций согласно настоящему изобретению можно выполнить с использованием стандартных путей введения. Неограничивающие примеры включают в себя парентеральное введение, такое как внутривенное, внутрикожное, чрескожное, внутримышечное, подкожное и т.д., или введение через слизистую оболочку, например, интраназальное, пероральное и т.п. Специалист в данной области техники будет способен определить различные возможности для введения полипептидов, молекул нуклеиновых кислот и/или иммуногенных композиций согласно настоящему изобретению с целью индукции иммунного ответа. В определенных вариантах осуществления полипептид, молекулу нуклеиновой кислоты и/или иммуногенную композицию (или вакцину) вводят более чем один раз, т.е. в так называемом режиме гомологичного прайм-буста. В определенных вариантах осуществления, где полипептид, молекулу нуклеиновой кислоты и/или иммуногенную композицию вводят более чем один раз, введение второй дозы можно выполнять через интервал времени, например, в одну неделю или более после введения первой дозы, две недели или более после введения первой дозы, три недели или более после введения первой дозы, один месяц или более после введения первой дозы, шесть недель или более после введения первой дозы, два месяца или более после введения первой дозы, 3 месяца или более после введения первой дозы, 4 месяца или более после введения первой дозы и т.д., вплоть до нескольких лет после введения первой дозы полипептида, молекулы нуклеиновой кислоты и/или иммуногенной композиции. Вакцину также можно вводить более двух раз, например, три раза, четыре раза и т.д., так, чтобы за первым примирующим введением следовало более чем одно бустерное введение. В других вариантах осуществления полипептид, молекулу нуклеиновой кислоты и/или иммуногенную композицию согласно настоящему изобретению вводят только один раз.

Полипептиды, молекулы нуклеиновой кислоты и/или иммуногенные композиции можно также вводить либо как начальную дозу, либо как повторную дозу в режиме гетерологичного прайм-буста.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способы предупреждения и/или лечения заболевания, вызываемого вирусом гриппа, у субъекта с использованием полипептидов, нуклеиновых кислот и/или композиций, описанных в настоящем документе. В конкретном варианте осуществления способ профилактики и/или лечения заболевания вирусом гриппа у субъекта включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества полипептида, нуклеиновой кислоты и/или иммуногенной композиции, как описано выше. Терапевтически эффективное количество относится к количеству полипептида, нуклеиновой кислоты и/или композиции, определенных в настоящем документе, которое является эффективным для предупреждения, облегчения и/или лечения заболевания или состояния, обусловленного инфицированием вирусом гриппа А из группы 1 или 2 и/или вирусом гриппа В, предпочтительно заболевания, обусловленного инфицированием вирусом гриппа А, содержащим HA подтипа H1. Предупреждение охватывает ингибирование или снижение распространения вируса гриппа или ингибирование или ослабление начала проявления, развития или прогрессирования одного или нескольких симптомов, ассоциированных с инфицированием вирусом гриппа. Применяемое в настоящем документе облегчение может относиться к ослаблению видимых или ощутимых симптомов заболевания, виремии или любых других поддающихся измерению проявлений гриппозной инфекции.

Нуждающиеся в лечении включают тех, которые уже имеют состояние, обусловленное инфицированием вирусом гриппа А из группы 1 или группы 2 или вирусом гриппа В, а также тех, у которых необходимо предупредить инфицирование вирусом гриппа. Полипептиды, нуклеиновые кислоты и/или композиции по настоящему изобретению, таким образом, можно ввести наивному субъекту, т.е. субъекту, который не страдает заболеванием, вызванным инфекцией вируса гриппа, или не был и в настоящее время не инфицирован вирусом гриппа, или субъектам, которые уже являются и/или были инфицированы вирусом гриппа.

В одном варианте осуществления предупреждение и/или лечение может быть нацелено на группы пациентов, которые являются восприимчивыми к гриппозной вирусной инфекции. Такие группы пациентов включают, без ограничений, например, пожилых (например, в возрасте >50 лет, в возрасте >60 лет и предпочтительно в возрасте >65 лет), молодых (например, в возрасте <5 лет, в возрасте <1 года), госпи22 038400 тализированных пациентов и пациентов, которые получали лечение противовирусным соединением, но продемонстрировали неудовлетворительный противовирусный ответ.

В другом варианте осуществления полипептиды, нуклеиновые кислоты и/или иммуногенные композиции можно вводить субъекту в комбинации с одним или несколькими другими активными средствами, такими как существующие или будущие противогриппозные вакцины, моноклональные антитела и/или противовирусные средства и/или антибактериальные и/или иммуномодулирующие средства. Одно или несколько других активных средств могут быть полезными в лечении и/или предупреждении заболевания, вызываемого вирусом гриппа, или могут облегчать симптом или состояние, ассоциированное с заболеванием, вызываемым вирусом гриппа. В некоторых вариантах осуществления одно или несколько других активных средств представляют собой обезболивающие средства, жаропонижающие лекарственные препараты или терапевтические средства, которые облегчают дыхание или способствуют ему.

Режимы дозирования полипептидов и/или молекул нуклеиновых кислот по настоящему изобретению можно скорректировать для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического ответа). Подходящий диапазон доз может, например, составлять 0,1-100 мг/кг веса тела, предпочтительно 1-50 мг/кг веса тела, предпочтительно 0,5-15 мг/кг веса тела. Точная доза полипептидов и/или молекул нуклеиновых кислот, которые подлежат использованию, будет, например, зависеть от пути введения и серьезности инфекции или заболевания, вызываемого ею, и должна быть выбрана в соответствии с решением практикующего врача и состоянием каждого субъекта. Например, эффективные дозы варьируют в зависимости от участка-мишени, физиологического состояния пациента (в том числе возраста, массы тела, состояния здоровья) и того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Как правило, пациент является человеком, однако лечению также можно подвергать млекопитающих, отличных от человека, в том числе трансгенных млекопитающих. Для оптимизации безопасности и эффективности подбирают оптимальные лечебные дозы.

Полипептиды по настоящему изобретению также можно применять для проверки связывания моноклональных антител, идентифицированных в качестве потенциальных терапевтических средствкандидатов. В дополнение, полипептиды по настоящему изобретению можно применять в качестве диагностического средства, например, для тестирования иммунного статуса индивидуума путем установления способности антител в сыворотке крови такого индивидуума к связыванию с полипептидом по настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу диагностики in vitro для выявления наличия гриппозной инфекции у пациента, при этом указанный способ включает стадии а) приведения биологического образца, полученного из указанного пациента, в контакт с полипептидом согласно настоящему изобретению и b) выявления наличия комплексов антитело-антиген.

Полипептиды по настоящему изобретению также можно применять для идентификации новых связывающих молекул или улучшения существующих связывающих молекул, таких как моноклональные антитела и противовирусные средства.

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами и фигурами. Примеры не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом.

Примеры

Пример 1. Стеблевые полипептиды, как описано в PCT/EP2014/060997.

В PCT/EP2012/073706 раскрыты полипептиды стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа, композиции и вакцины на их основе, а также способы их применения в области предупреждения и/или лечения гриппа. В PCT/EP2014/060997 раскрыты дополнительные последовательности полипептидов стеблевого домена, полученных из полноразмерного НА H1N1 A/Brisbane/59/2007 (seq id no: 1), которые были получены посредством сайтнаправленной мутации в Hl-mini2-clusterl+5+6-GCN4 (seq id NO: 2) и которые также стабильно представляли эпитоп нейтрализующего антитела широкого спектра действия CR6261 (Throsby et al., 2009; Ekiert et al., 2010) и/или CR9114.

Hl-mini2-clusterl+5+6-GCN4 (SEQ ID NO: 2) был получен из полноразмерного НА H1N1 A/Brisbane/59/2007 (SEQ ID NO: 1) посредством осуществления следующих стадий.

(1) Удаление участка расщепления в НАО. Расщепление HA дикого типа в данном участке приводит к образованию НА1 и НА2. Удаления можно достичь посредством мутации замены R на Q в положении Р1 (см., например, Sun et al., 2010 для пояснения номенклатуры участка расщепления (положение 343 в SEQ ID NO: 1).

(2) Удаление головного домена посредством делеции аминокислот 53-320 в SEQ ID NO: 1. Оставшиеся N- и С-концевые части последовательности соединяли с помощью гибкого линкера из четырех остатков, GGGG.

(3) Увеличение растворимости петли (между А-спиралью и CD-спиралью), образованной остатками 402-418 (или их эквивалентами) в ^ш A/Brisbane/59/2007 (SEQ ID NO: 1), для того, чтобы одновременно увеличить стабильность конформации до слияния и дестабилизировать конформацию после слияния модифицированного НА. В Hl-mini2-clusterl+5+6-GCN4 (SEQ ID NO: 2) вводили мутации F406S, V409T, F413G и L416S (нумерация относится к SEQ ID NO: 1).

(4) Введение дисульфидного мостика между аминокислотами в положениях 324 и 436 в H1

A/Brisbane/59/2007; этого достигают посредством введения мутаций R324C и Y436C (нумерация относится к SEQ ID NO: 1).

(5) Введение полученной из GCN4 последовательности mkqiedkieeieskq (seq id NO: 5), которая известна как тримеризующая, в положения 419433 (нумерация относится к SEQ ID NO: 1).

В определенных вариантах осуществления последовательность трансмембранного и внутриклеточного домена была подвергнута делеции от положения 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 526, 527, 528, 529 или 530 (или эквивалентного ему, как определено по выравниванию последовательностей) НА2 до С-конца НА2 (нумерация согласно SEQ ID NO: 1), так что после экспрессии в клетках продуцировался секретируемый (растворимый) полипептид. Растворимый полипептид дополнительно стабилизировали путем введения последовательности, которая, как известно, образует тримерные структуры, т.е. последовательности фолдона gyipeaprdgqayvrkdgewvllstfl (seq id no: 3) , необязательно присоединяемой посредством короткого линкера согласно описанному выше. Линкер может необязательно содержать участок расщепления для последующего процессинга согласно протоколам, хорошо известным специалистам в данной области техники. Для облегчения очистки и выявления растворимой формы можно необязательно добавить последовательность метки, например, гистидиновую метку (НННННН (SEQ ID NO: 15) или ННННННН (SEQ ID NO: 16)) или FLAG-метку (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 22) или их комбинацию, необязательно присоединяемую посредством коротких линкеров. Линкер может необязательно содержать участок (часть участка) протеолитического расщепления, например, LVPRGS (SEQ ID NO: 23) (тромбин) или IEGR (SEQ ID NO: 24) (фактор X), для последующего процессинга согласно протоколам, хорошо известным специалистам в данной области техники. Процессированные белки также охватываются настоящим изобретением.

Примером такой С-концевой последовательности, объединяющей FLAG-метку, участок расщепления тромбином, фолдон и последовательности His, является SEQ ID NO: 4 - FLAG-thrombin-foldon-His. Эту последовательность объединяли с растворимой формой последовательности Hl-mini2-clusterl+5+6-GCN4 (SEQ ID NO: 2) для создания исходной последовательности (SEQ ID NO: 6), которую применяли для создания новых полипептидов по настоящему изобретению путем мутагенеза. Эта последовательность не содержит лидерную последовательность, соответствующую аминокислотам 1-17 в SEQ ID NO: 1 и 2.

Полипептиды стеблевого домена, таким образом, создавали посредством делеции части последовательности гемагглютинина, которая кодирует головной домен молекулы, и повторного соединения N- и С-концевой частей последовательности по обе стороны от места делеции посредством линкера согласно описанному в РСТ/2012/073706 и выше. При удалении головного домена часть молекулы, которая была ранее защищена от водного растворителя, остается доступной для него, что потенциально дестабилизирует структуру полипептидов по настоящему изобретению. По этой причине остатки в В-петле (в частности, аминокислотные остатки 406 (F и S в SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно), 409 (V и Т), 413 (F и G) и 416 (L и S)) подвергали мутации в различных комбинациях с применением исходной последовательности SEQ ID NO: 6 в качестве исходной точки. SEQ ID NO: 6 создавали из Hl-mini2-cluster 1 + 5+6-GCN4 (SEQ ID NO: 2) путем удаления лидерной последовательности и замещения остатков 520-565 последовательностью

FLAG-thrombin-foldon-His (SEQ ID NO: 4).

Подобным образом, в зоне вблизи пептида слияния ряд гидрофобных остатков является доступным для растворителя, что обусловлено тем фактом, что, в отличие от нативного полноразмерного НА, полипептиды по настоящему изобретению не могут расщепляться и подвергаются соответствующему конформационному изменению, при котором гидрофобный пептид слияния погружается во внутреннюю часть белка. Чтобы решить эту проблему, некоторые или все из остатков I337, I340, F352 и I353 в SEQ ID NO: 2 также подвергали мутации.

Таким образом, создавали растворимые формы стеблевых полипептидов HA 74Н9 (SEQ ID NO: 57), 127H1 (SEQ ID NO: 55), 71H2 (SEQ ID NO: 61), 86B4 (SEQ ID NO: 56), 115A1 (SEQ ID NO: 60), 2201С9 (SEQ ID NO: 63), 55G7 (SEQ ID NO: 59), 113E7 (SEQ ID NO: 64), 6E12 (SEQ ID NO: 58), 181H9 (SEQ ID NO: 62) создавали.

Последовательности ДНК, кодирующие полипептиды, описанные выше, вводили путем трансформации в Pichia pastoris или вводили путем трансфекции в клетки HEK293F с применением протоколов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Конструкции, применяемые для экспрессии в клетках млекопитающих, содержали лидерную последовательность HA (остатки 1-17 в SEQ ID NO: 1 и 2), тогда как в конструкциях, применяемых для экспрессии в P. pastoris, лидерная последовательность HA была замещена лидерной последовательностью альфа-фактора дрожжей (SEQ ID NO: 7). Экспрессируемый таким образом белок направляют в среду для культивирования клеток, что тем самым позволяет определить связывание и экспрессию без дополнительной очистки полипептидов по настоящему изобре24 038400 тению. Все последовательности содержали С-концевую последовательность FLAG-foldon-HIS (SEQ ID NO: 4).

Связывание моноклональных антител (CR6261, CR9114, CR8020) с полипептидами определяли посредством ELISA. Для этого планшеты для ELISA обрабатывали в течение ночи 2 мкг/мл раствора моноклонального антитела (20 мкл/лунка) при 4°С. После удаления раствора антитела оставшуюся поверхность блокировали 4% раствором порошкового обезжиренного сухого молока в PBS в течение не менее 1 ч при комнатной температуре. После промывания планшетов 20 мкл среды для культивирования клеток (неразведенной или разведенной) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение по меньшей мере 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты для ELISA промывали и добавляли 20 мкл раствора антитела к FLAG-HRP (Sigma A8952, разведенного в 2000 раз в 4% обезжиренном сухом молоке в PBS-Tween). После инкубирования (1 ч. при комнатной температуре) планшеты еще раз промывали и добавляли 20 мкл люминесцентного субстрата (Thermoscientific, № по кат. 34078) для обнаружения сигнала. В качестве альтернативы, для обнаружения сигнала можно применять способ колориметрического выявления.

Экспрессию полипептидов по настоящему изобретению определяли в анализе гомогенной флуоресценции с временным разрешением (в отношении общего описания см., например, Degorce et al., Curr. Chem. Genomics 2009 3: 22-32). Для этого смесь меченного тербием (Tb) моноклонального антитела к FLAG (донора) и меченного А1еха488 моноклонального антитела к His (акцептора) (раствор HTRF) получали путем добавления 210,5 мкл антитела к FLAG, меченного ТВ (исходный раствор 26 мкг/мл), и 1,68 мл антитела к HIS, меченного 488 (исходный раствор 50 мкг/мл), к 80 мл смеси 1 к 1 культуральной среды и 50 мМ HEPES + 0,1% BSA. В каждую лунку планшета для ELISA добавляли 19 мкл раствора HTRF и добавляли 1 мкл культуральной среды. При возбуждении и после задержки, обеспечивающей затухание мешающих короткоживущих фоновых сигналов, проистекающих от других соединений (белков, компонентов среды и т.д.), определяли показатель испускания флуоресценции при 520 и 665 нм. Это является мерой общего содержания белка в образце и применяется для нормализации сигналов связывания mAb между различными экспериментами.

Полипептиды, приведенные в табл. 3 и 4, экспрессировали в P. pastoris, следуя протоколам, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Собирали культуральную среду, и определяли связывание с CR6261 и экспрессию полипептидов стеблевого домена согласно описанному выше. Поскольку ответ в анализе связывания сопоставим с концентрацией экспрессируемого белка, сигнал связывания в ELISA нормализовали к экспрессии белка путем сравнения соотношения сигнала связывания и сигнала в анализе HTRF для каждой экспрессируемой последовательности. Все экспрессируемые полипептиды характеризуются более высоким соотношением сигнала связывания с CR6261 и сигнала HTRF по сравнению с исходной последовательностью SEQ ID NO: 6.

В дополнение, соотношение сигнала связывания с CR6261 и сигнала HTRF рассчитывали и сравнивали с соотношением, рассчитанным для исходной последовательности SEQ ID NO: 6. Результаты приведены в столбце 5 табл. 3 и 4; все экспрессируемые белки характеризуются более высокими соотношениями, что указывает на то, что стеблевые полипептиды, описанные выше, демонстрируют увеличенное связывание с CR6261.

Пример 2. Разработка и определение характеристик полипептидов по настоящему изобретению.

Полипептиды по настоящему изобретению содержат последовательность RMKQIEDKIEEIESK (SEQ ID NO: 20) или RMKQIEDKIEEIESKQK (SEQ ID NO: 21), полученную из белка-активатора транскрипции дрожжей GCN4, в CD-спирали. Данная последовательность обладает высокой склонностью к образованию спиральных вторичных структур и вследствие этого может повышать общую стабильность полипептида по настоящему изобретению. Согласно настоящему изобретению было неожиданно обнаружено, что стабильность и агрегированное состояние полипептидов по настоящему изобретению зависят от точного местоположения и последовательности для полученной из GCN4 последовательности в первичной последовательности полипептидов по настоящему изобретению.

Таким образом, в данном примере авторы настоящего изобретения описывают новый набор полипептидов по настоящему изобретению, где последовательность RMKQIEDKIEEIESK (SEQ ID NO: 20) введена в положения 419-433 (нумерация согласно SEQ ID NO: 1; например, SEQ ID NO: 81-110) или последовательность dmkqiedkieeieskqk (seq id no: 21) введена в положения 417-433 (например, SEQ ID NO: 111-140).

Для этого полипептиды, описанные в примере 1, т.е. 74Н9 (SEQ ID NO: 57), 127H1 (SEQ ID NO: 55), 71Н2 (SEQ ID NO: 61), 86B4 (SEQ ID NO: 56), 115A1 (SEQ ID NO: 60), 2201C9 (SEQ ID NO: 63), 55G7 (SEQ ID NO: 59), 113E7 (SEQ ID NO: 64), 6E12 (SEQ ID NO: 58), 181H9 (SEQ ID NO: 62) были модифицированы с помощью методик молекулярной биологии, хорошо известных специалистам в данной области техники, для создания последовательностей 74H9-t2 (SEQ ID NO: 83), 127H1-t2 (SEQ ID NO: 81), 71H2-t2 (SEQ ID NO: 87), 86B4-t2 (SEQ ID NO: 82), 115A1-t2 (SEQ ID NO: 86), 220C9-t2 (SEQ ID NO: 89), 55G7-t2 (SEQ ID NO: 85), 113E7-t2 (SEQ ID NO: 90), 6E12-t2 (SEQ ID NO: 84), 181H9-t2 (SEQ ID NO: 88), содержащих последовательность

RMKQIEDKIEEIESK (SEQ ID NO: 20) в положениях 419-433.

Подобным образом создавали последовательности 74H9-t3 (SEQ ID NO: 113), 127H1-t3 (SEQ ID NO: 111), 71H2-t3 (SEQ ID NO: 117), 86B4-t3 (SEQ ID NO: 112), 115A1-t3 (SEQ ID NO: 116), 2201C9-t3 (SEQ ID NO: 119), 55G7-t3 (SEQ ID NO: 115), 113E7-t3 (SEQ ID NO: 120), 6E12-t3 (SEQ ID NO: 114), 181H9-t3 (SEQ ID NO: 118), содержащие последовательность

RMKQIEDKIEEIESKQK (SEQ ID NO: 21) в положениях 417-433.

Полипептиды по настоящему изобретению можно создать на основе последовательности молекул HA различных штаммов вирусов. SEQ ID NO: 149-155, например, описаны полипептиды по настоящему изобретению на основе последовательности HA штамма H1N1 A/California/07/09.

Как описано ранее, растворимые полипептиды по настоящему изобретению можно создать путем удаления С-концевой части последовательностей на основе НА, например, от остатка 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 526, 528, 529 или 530 домена НА2 до С-конца домена НА2 (нумерация согласно SEQ ID NO: 1).

Полипептиды можно дополнительно стабилизировать путем введения последовательности, которая, как известно, образует тримерные структуры, т.е. gyipeaprdgqayvrkdgewvllstfl (seq id no: 3) , необязательно присоединенной посредством линкера. Линкер может необязательно содержать участок расщепления для последующего процессинга согласно протоколам, хорошо известным специалистам в данной области техники. Для облегчения очистки растворимой формы можно добавить последовательность метки, например, His-метку (ННННННН (SEQ ID NO: 16) или НННННН (SEQ ID NO: 15)) или FLAG-метку (DYKDDDDK) (SEQ ID NO: 22) или их комбинацию, необязательно присоединяемую посредством коротких линкеров. Линкер может необязательно содержать участок (часть участка) протеолитического расщепления, например, IEGR (SEQ ID NO: 24) (фактор X) или LVPRGS (SEQ ID NO: 23) (тромбин), для последующего процессинга согласно протоколам, хорошо известным специалистам в данной области техники. Процессированные белки также охватываются настоящим изобретением.

Растворимые формы полипептидов SEQ ID NO: 55-64 и 81-90 создавали путем замещения эквивалентов остатков 519-565 (нумерация относится к SEQ ID NO: 1) последовательностью RSLVPRGSPGHHHHHH, содержащей как модифицированный участок расщепления тромбином, так и 6гистидиновую метку (SEQ ID NO: 15), и экспрессировали в клетках HEK293F, следуя протоколам, хорошо известным специалистам в данной области техники.

В целях сравнения растворимые формы

Hl-mini2-clusterl+5+6-GCN4t2 (SEQ ID NO: 52) и Hl-mini2-cluster 1 + 5+ 6-GCN413 (SEQ ID NO:

53) .

Собирали культуральную среду, и выявляли связывание с CR6261, CR9114 посредством сэндвичELISA с применением покрывающего mAb CR6261 или CR9114 для захвата полипептида по настоящему изобретению непосредственно из культуральной среды и антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP), направленного к С-концевой His-метке, для целей выявления. В качестве альтернативы, в сэндвич-ELISA для выявления захваченных с помощью CR9114 полипептидов по настоящему изобретению применяли биотинилированное CR9114 в комбинации со стрептавидином, конъюгированным с HRP. Данный формат обеспечивает возможность выявления наличия мультимерных форм полипептидов по настоящему изобретению. Все тестируемые полипептиды по настоящему изобретению были способны к связыванию с CR9114 (фиг. 2А и 2В, фиг. 3А и 3В и фиг. 4А и 4В) и CR6261 (фиг. 2С и 2D, фиг. 3С и 3D, фиг. 4С и 4D), как определено посредством ELISA. Повышенные уровни мультимеризации, выявляемые посредством захвата с помощью CR9114 в сэндвич-ELISA с применением биотинилированного CR9114 для выявления, наблюдались для s55G7-t2 (SEQ ID NO: 95), s86B4-t2 (SEQ ID NO: 92), s115A1-t2 (SEQ ID NO: 96), s127H1-t2 (SEQ ID NO: 91), s113E7-t2 (SEQ ID NO: 100), s220C9-t2 (SEQ ID NO: 99), s71H2-t3 (SEQ ID NO: 127), s127H1-t3 (SEQ ID NO: 121), s74H9-t3 (SEQ ID NO: 123), как показано на фиг. 2Е и 2F,. 3Е и 3F и 4Е и 4F.

С целью получения препаратов полипептидов по настоящему изобретению высокой степени чистоты для определения дополнительных характеристик, клетки HEK293F трансфицировали вектором экспрессии pcDNA2004, содержащим гены, кодирующие растворимые формы 127H1-t2 (SEQ ID NO: 81), 86B4-t2 (SEQ ID NO: 82) и 55G7-t2 (SEQ ID NO: 85). Специалисту в данной области техники будет понятно, что лидерная последовательность (или сигнальная последовательность), которая определяет направление транспорта белка в ходе продуцирования (соответствующая аминокислотам 1-17 SEQ ID NO: 1), будет отсутствовать в секретируемом конечном полипептиде.

Для получения полипептидов по настоящему изобретению 1,0х10⁶ клеток/мл высеивали путем осаждения клеток HEK293F (Invitrogen) при 300g в течение 5 мин и ресуспендирования в 300 мл подогретой среды Freestyle™ на колбу SF1000. Эту культуру инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 10% СО₂ при 110 об/мин в инкубаторе Multitron. Через 1 ч плазмидную ДНК отмеривали пипеткой в 9,9 мл среды Optimem до концентрации 1,0 мкг/мл в 300 мл объема культуры. Параллельно 440 мкл 293fectin® отмеривали пипеткой в 9,9 мл среды Optimem и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Че26 038400 рез 5 мин смесь плазмидная ДНК/Optimem добавляли к смеси 293fectin®/Optimem и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин. После инкубирования смесь плазмидная ДНК/293fectin® добавляли по каплям к клеточной суспензии. Трансфицированную культуру инкубировали при 37°С, 10% СО₂ и 110 об/мин в инкубаторе Multitron. В день 7 клетки отделяли от культуральной среды путем центрифугирования (30 мин при 3000g), при этом надосадочную жидкость, содержащую растворимые полипептиды по настоящему изобретению, фильтровали через верхний бутылочный фильтр на 0,2 мкм для дополнительной обработки.

Для целей очистки 1500 мл (s127H1_t2), 1800 мл (s86B4_t2) и 2400 мл (s55G7_t2) надосадочной жидкости культуры вносили в колонку с Ni-сефарозой HP на 24 мл, предварительно уравновешенную промывочным буфером (20 мМ TRIS, 500 мМ NaCl, pH 7,8). После этапа промывки с 10 мМ имидазола в промывочном буфере связанные полипептиды по настоящему изобретению элюировали ступенчатым градиентом 300 мМ имидазола в промывочном буфере. Пики элюента собирали, концентрировали и вносили в колонку для эксклюзионной хроматографии для дополнительной очистки (Superdex 200). Профили элюирования показаны на фиг. 5. Фракции 55G7-t2 и 127H1-t2 собирали, объединяли, как указано на фигуре, и анализировали с помощью SDS-PAGE (фиг. 6), ELISA и аналитической эксклюзионной хроматографии в сочетании с многоугловым светорассеянием (SEC-MALS) для оценивания молекулярной массы. Результаты ELISA подтвердили связывание полипептидов по настоящему изобретению с CR6261 и CR9114, но не с CR8020. Результаты SEC-MALS обобщены в табл. 8.

На фиг. 5 и в табл. 8 указано, что полипептид s127H1-t2 по настоящему изобретению характеризуется более высоким выходом (~30 мг белка/л надосадочной жидкости культуры) по сравнению с s55G7t2 и s86B4-t2. Большинство белков характеризуется молекулярным весом 62 кДа, что занимает промежуточное положение между ожидаемыми значениями для мономера или димера. Для подтверждения агрегированного состояния белка эксперимент по SEC-MALS повторяли в присутствии Fab-фрагментов, полученных из CR6261, CR9114 и CR8020. Результаты показаны на фиг. 7 и обобщены в табл. 8.

Результаты демонстрируют, что растворимая форма полипептида s127H1-t2 по настоящему изобретению образует комплекс (о чем свидетельствует сдвиг пика на SEC-хроматограмме) в присутствии Fabфрагментов CR6261 и CR9114, но не в случае CR8020. Это согласуется со специфичностью реакций связывания Fab-фрагментов, поскольку CR6261 и CR9114 связываются с НА, полученными из группы 1, тогда как CR8020 - нет. Размер комплекса приведен в табл. 8, и это указывает, что полипептид s127H1-t2 связывается с одним-двумя Fab-фрагментами, что указывает на то, что по меньшей мере часть популяции очищенного полипептида s127H1-t2 по настоящему изобретению находится в димерной форме.

Для дополнительного анализа реакции связывания между полипептидом 127H1-t2 по настоящему изобретению и mAb CR6261 и CR9114, а также для подтверждения наличия конформационных эпитопов CR6261 и CR9114 изучали образование этими антителами комплексов с очищенным белком с помощью биослойной интерферометрии (Octet Red³⁸⁴, Forte Bio). Для этого биотинилированные CR6261, CR9114 и CR8020 иммобилизовали на покрытых стрептавидином сенсорах, которые впоследствии подвергали воздействию сначала раствора очищенного полипептида по настоящему изобретению для измерения скорости ассоциации, а затем промывочного раствора для измерения скорости диссоциации. Результаты показаны на фиг. 8.

Оба иммобилизованных CR6261 и CR9114 распознают полипептид по настоящему изобретению, о чем свидетельствуют четкие ответы после воздействия растворимой формы 127H1-t2 (фиг. 8). Чтобы оценить константу диссоциации для связывающего взаимодействия, проводили титрование с применением серий 2-кратных разведений. Сенсоры, содержащие иммобилизованное CR6261 или CR9114, подвергали воздействию растворов растворимого s127H1-t2 в концентрациях 40, 20, 10, 5, 2,5, 1,3 и 0,63 нМ соответственно, и регистрировали конечный ответ через 6600 с. Ответы откладывали на графике в зависимости от концентрации полипептида стеблевого домена, и проводили аппроксимацию 1:1 к модели связывания в стационарном состоянии, получая константу диссоциации Kd 3,5 нМ для комплекса CR6261/полипептид стеблевого домена и 2,3 нМ для комплекса с CR9114 (фиг. 8).

В заключение полипептид s127H1-t2 по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 91) продуцируется в больших количествах и способен связываться с нейтрализующими моноклональными антителами широкого спектра действия CR6261 и CR9114 с высокой аффинностью, что подтверждает наличие соответствующих нейтрализующих эпитопов в этом полипептиде стеблевого домена. Полипептид обладает склонностью к образованию димерных структур.

Пример 3. Оценка профилактической эффективности полипептида по настоящему изобретению в модели летального контрольного заражения гриппом.

С целью оценки профилактической эффективности полипептидов s127H1-t2 по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 91) на модели летального контрольного заражения гриппом группы из 10 самок мышей BALB/c (возрастом 6-8 недель) иммунизировали 3 раза с 3-недельными интервалами 10 мкг очищенного s127H1-t2 как без добавления вспомогательного средства, так и усиленного 10 мкг Matrix-M. В качестве положительного контроля для модели контрольного заражения i.m. вводили нейтрализующее антитело широкого спектра - моноклональное антитело CR6261 (15 мг/кг) за 1 день до контрольного за ражения, тогда как иммунизация с PBS служила в качестве отрицательного контроля. Через четыре недели после последней иммунизации мышей подвергали контрольному заражению 25xLD50 гетерологичного вируса для контрольного заражения (H1N1 A/Puerto Rico/8/34) и ежедневно отслеживали (выживаемость, вес, клинические показатели) в течение 3 недель. Сыворотку крови до контрольного заражения тестировали в анализах ELISA на связывание с полипептидом s127H1-t2 по настоящему изобретению, который применяли для иммунизации (для проверки правильности иммунизации), на связывание с растворимым полноразмерным HA H1N1 A/Brisbane/59/07 (для проверки распознавания полноразмерного НА) и на конкуренцию с нейтрализующим антителом широкого спектра действия, моноклональным антителом CR9114, за связывание с полноразмерным HA (для определения того, связываются ли индуцированные антитела в непосредственной близости с эпитопом нейтрализующего антитела широкого спектра действия CR9114). Результаты показаны на фиг. 9-12.

Результаты демонстрируют, что эксперимент является достоверным, поскольку все мыши в контрольной группе с PBS погибают от инфекции в день 7 после контрольного заражения, тогда как группа положительного контроля (15 мг/кг CR6261, за 1 день до контрольного заражения) полностью защищена (фиг. 9). В отличие от мышей, обработанных PBS, 3 из 10 мышей, иммунизированных не усиленным полипептидом s127H1-t2 по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 91) и 10 из 10 мышей, иммунизированных усиленным полипептидом по настоящему изобретению, выживают после летального контрольного заражения (см. фиг. 10). По сравнению с контрольной группой с PBS для групп, иммунизированных полипептидом s127H1-t2 по настоящему изобретению, наблюдается увеличение доли выживших, увеличение продолжительности выживания и снижение клинического показателя. Различия являются наиболее выраженными для группы, получающей полипептид по настоящему изобретению с добавленным вспомогательным средством, но они также наблюдаются для группы, получающей полипептид без добавленного вспомогательного средства.

Данные ELISA с применением s127H1-t2 или растворимого полноразмерного HA в качестве антигена указывают, что полипептид s127H1 по настоящему изобретению является иммуногенным и индуцирует антитела, которые способны распознавать полноразмерный НА, независимо от применения вспомогательного средства (фиг. 11A и 11В).

Для более глубокого понимания иммунологического ответа на иммунизацию проводили ELISA с конкурентным связыванием. С этой целью планшет, связывающий полноразмерный НА, инкубируют с образцами сыворотки крови в серийном разведении, после чего добавляют CR9114-6uotuh в заранее определенной титрованной концентрации. После дополнительной инкубации оценивают количество связанного СК9114-биотина с использованием конъюгированной со стрептавидином пероксидазы хрена согласно протоколам, хорошо известным в уровне техники. Данные анализируют с использованием линейной регрессии OD против log разведения, выраженного как наклон OD (AOD/10-кратное разведение). Данные показывают, что выявляемые уровни антител, которые способны конкурировать за связывание с нейтрализующим антителом широкого спектра действия CR9114, индуцируются путем иммунизации усиленными полипептидами по настоящему изобретению, на что указывают повышенные уровни конкуренции, наблюдаемые на фиг. 12А. Для сравнения уровни конкуренции с немеченным CR9114 (т.е. самоконкуренция) и несвязывающими моноклональными антителами CR8020 и CR-JB, оба в серийном разведении из исходной концентрации 5 мкг/мл, показаны на отдельном графике.

В заключение авторы настоящего изобретения показали, что иммунизация полипептидами s127H1t2 по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 91) может защищать мышей от летального инфицирования гриппом. Полипептид является иммуногенным и индуцирует выработку антител, которые могут связываться с полноразмерным НА. Если полипептид по настоящему изобретению применяют комбинации со вспомогательным средством, то по меньшей мере часть выявляемых индуцированных антител связывается с эпитопом, который представляет собой эпитоп нейтрализующего моноклонального антитела широкого спектра действия CR9114, или рядом с ним.

Пример 4. Оценка профилактической эффективности полипептида по настоящему изобретению в модели летального контрольного заражения гриппом.

С целью дополнительной оценки профилактической эффективности полипептидов s127H1-t2 по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 91) в модели летального контрольного заражения гриппом группы из 10 самок мышей BALB/c (в возрасте 6-8 недель) иммунизировали 1, 2 и 3 раза с интервалами в 3 недели 30 мкг очищенного s127H1-t2 с 10 мкг добавленного в качестве вспомогательного средства Matrix-M. В качестве положительного контроля для модели контрольного заражения i.v. вводили нейтрализующее антитело широкого спектра действия, моноклональное антитело CR6261 (15 мг/кг), за 1 день до контрольного заражения, тогда как иммунизация с PBS служила в качестве отрицательного контроля. Через четыре недели после последней иммунизации мышей подвергали контрольному заражению 25xLD50 гетерологичного вируса для контрольного заражения (H1N1 A/Puerto Rico/8/34) и ежедневно отслеживали (выживаемость, вес, клинические показатели) в течение 3 недель. Сыворотку крови до контрольного заражения, полученную через 4 недели после заключительной иммунизации, тестировали в анализах ELISA на связывание с полипептидом s127H1-t2 по настоящему изобретению, который применяли для иммунизации (для проверки правильности иммунизации), на связывание с растворимым полноразмерным HA H1N1 A/Brisbane/59/07 (для проверки распознавания полноразмерного НА) и на конкуренцию с нейтрализующим антителом широкого спектра действия, моноклональным антителом CR9114, за связывание с полноразмерным HA (для определения того, связываются ли индуцированные антитела в непосредственной близости с эпитопом нейтрализующего антитела широкого спектра действия CR9114). Результаты показаны на фиг. 13-18.

Результаты демонстрируют, что эксперимент является достоверным, поскольку все мыши в контрольной группе с PBS погибают от инфекции в день 7 после контрольного заражения, тогда как группа положительного контроля (15 мг/кг CR6261, за 1 день до контрольного заражения) была полностью защищена (фиг. 13А). Все мыши, однократно иммунизированные s127H1-t2 (SEQ ID NO: 91), погибают от инфекции между днем 7 и 9 (фиг. 14А). В противоположность этому, после двух иммунизации 8 из 10 мышей выживали и после 3 иммунизации все мыши (10 из 10) выживали после летального контрольного заражения (фиг. 14В, 14С). Также снижалась потеря веса тела у групп, многократно иммунизированных, с наиболее низкими процентными значениями, которые наблюдали для иммунизированных три раза животных (фиг. 15В, 15С). По сравнению с контрольной группой с PBS, для групп, иммунизированных два или три раза полипептидом s127H1-t2 по настоящему изобретению, наблюдается статистически значимое увеличение доли выживших, увеличение продолжительности выживания, снижение потери веса тела и снижение клинического показателя (см. фиг. 16В, 16С).

Данные ELISA в моменты времени до контрольного заражения через 4 недели после заключительной иммунизации с применением s127H1-t2 (фиг. 17А) или растворимого полноразмерного HA (фиг. 17В) в качестве антигена указывают на то, что полипептид S127H1 по настоящему изобретению является иммуногенным и индуцирует выработку антител, которые способны к распознаванию полноразмерного HA даже после одной иммунизации, хотя уровни являются значимо более высокими после двух и трех иммунизации. С применением анализа конкурентного связывания CR9114, описанного выше, выявляемые уровни антител, которые способны конкурировать за связывание с нейтрализующим антителом широкого спектра действия CR9114, были индуцированы после двух и трех иммунизации полипептидом s127H1-t2 по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 91) (фиг. 18А). Для сравнения уровни конкуренции с немеченым CR9114 (т.е. самоконкуренция) и несвязывающими моноклональными антителами CR8020 и CR-JB, оба в серийном разведении из исходной концентрации 5 мкг/мл, показаны на отдельном графике (фиг. 18В).

В заключение авторы настоящего изобретения показали, что иммунизация два и три раза полипептидом s127H1-t2 по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 91) может защищать мышей от летального инфицирования гриппом. Полипептид является иммуногенным и индуцирует выработку антител, которые могут связываться с полноразмерным НА. По меньшей мере часть индуцированных антител связываются с эпитопом, который представляет собой эпитоп нейтрализующего моноклонального антитела широкого спектра действия CR9114, или рядом с ним.

Пример 5. Оценка профилактической эффективности полипептида по настоящему изобретению в модели летального контрольного заражения гетеросубтипическим вирусом гриппа H5N1.

С целью дополнительной оценки профилактической эффективности полипептидов s127H1-t2- по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 91) в модели летального контрольного заражения вирусом гриппа H5N1 группы из 8-12 самок мышей BALB/c (в возрасте 6-8 недель) иммунизировали 3 раза с интервалами в 3 недели 30 мкг очищенного s127H1-t2 с 10 мкг добавленного в качестве вспомогательного средства Matrix-M. В качестве положительного контроля для модели контрольного заражения i.v. вводили нейтрализующее антитело широкого спектра действия, моноклональное антитело CR6261 (15 мг/кг), за 1 день до контрольного заражения, тогда как иммунизация с PBS служила в качестве отрицательного контроля. Через четыре недели после последней иммунизации мышей подвергали контрольному заражению 12,5xLD50 гетеросубтипического вируса для контрольного заражения (H5N1 A/Hong Kong/156/97) и ежедневно отслеживали (выживаемость, вес, клинические показатели) в течение 3 недель.

Результаты демонстрируют, что эксперимент является достоверным, поскольку все мыши в контрольной группе с PBS погибают от инфекции в дни 8-10 после контрольного заражения, тогда как группа положительного контроля (15 мг/кг CR6261, за 1 день до контрольного заражения) полностью защищена (фиг. 19А). Восемь из 10 (80%) мышей, иммунизированных s127H1-t2 (SEQ ID NO: 91), выживают после летального контрольного заражения (фиг. 19В). Средняя потеря веса тела составляет примерно 15% в день 9, но при этом выжившие животные восстанавливают и набирают вес тела (фиг. 19С). Медианный клинический показатель составляет 1,5 в дни 3-6, но начиная от дня 8 и далее у выживших мышей не наблюдали никаких клинических симптомов (фиг. 19D). По сравнению с контрольной группой с PBS для группы, иммунизированной полипептидом s127H1-t2 по настоящему изобретению, наблюдается статистически значимое увеличение доли выживших, увеличение продолжительности выживания, уменьшение потери веса тела и снижение клинических показателей. В заключение, авторы настоящего изобретения показали, что иммунизация полипептидом s127H1-t2 по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 91) может защищать мышей от летального инфицирования гетеросубтипическим штаммом H5N1 вируса гриппа.

Пример 6. Оценка широты спектра связывания для сывороточных антител, выработка которых вызывается посредством иммунизации полипептидом по настоящему изобретению.

Образцы сыворотки крови до контрольного заражения от мышей, иммунизированных 3 раза согласно описанному в примере 5, также тестировали на связывание с полноразмерными HA ряда других штаммов вируса гриппа из группы 1 (H1, Н5 и Н9) и группы 2 (H3 и Н7) посредством ELISA, следуя протоколам, хорошо известным из уровня техники (фиг. 20). Результаты демонстрируют, что антитела, индуцированные полипептидом s127H1-t2 по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 91), эффективно распознают эпитопы, присутствующие в нативных последовательностях FL НА, и что эпитопы, с которыми связываются антитела, являются консервативными среди различных штаммов вируса гриппа из группы 1, включая HA H1, Н5 и Н9.

Пример 7. Оценка профилактической эффективности полипептида по настоящему изобретению в модели летального контрольного заражения вирусом гриппа H1N1 A/Brisbane/59/2007

С целью дополнительной оценки профилактической эффективности s127H1-t2 (SEQ ID NO: 91) в модели летального контрольного заражения вирусом гриппа H1N1 группы из 8-18 самок мышей BALB/c (в возрасте 6-8 недель) иммунизировали 3 раза с интервалами в 3 недели 30 мкг очищенного s127H1-t2 с 10 мкг добавленного в качестве вспомогательного средства Matrix-M. В качестве положительного контроля для модели контрольного заражения i.v. вводили нейтрализующее антитело широкого спектра действия, моноклональное антитело CR6261 (15 мг/кг), за 1 день до контрольного заражения, тогда как иммунизация с PBS служила в качестве отрицательного контроля. Через четыре недели после последней иммунизации мышей подвергали контрольному заражению 12,5xLD50 вируса для контрольного заражения (H1N1 A/Brisbane/59/2007) и ежедневно отслеживали (выживаемость, вес, клинические показатели) в течение 3 недель.

Результаты демонстрируют, что эксперимент является достоверным, поскольку все мыши в контрольной группе с PBS погибают от инфекции в дни 7-10 после контрольного заражения, тогда как группа положительного контроля (15 мг/кг CR6261, за 1 день до контрольного заражения) полностью защищена (фиг. 21А). 10 из 10 мышей, иммунизированных s127H1-t2 (SEQ ID NO: 91), выживают после летального контрольного заражения (фиг. 21В). В дополнение, потеря веса тела через 5 дней после инфицирования составляет в среднем приблизительно 20% (фиг. 21С), однако в течение 21-дневного периода последующего наблюдения животные полностью восстанавливаются. Медианные клинические показатели достигают пика со значением 3 через 2-9 дней после инфицирования, но возвращаются на исходный уровень (0), начиная с дня 16 после инфицирования (фиг. 21D). По сравнению с контрольной группой с PBS, для группы, иммунизированной полипептидом s127H1-t2 по настоящему изобретению, наблюдается статистически значимое увеличение доли выживших, увеличение продолжительности выживания, уменьшение потери веса тела и снижение клинических показателей.

В заключение, авторы настоящего изобретения показали, что иммунизация полипептидом s127H1-t2 по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 91) может защищать мышей от летального инфицирования H1N1 A/Brisbane/59/2007.

Пример 8. Оценка наличия нейтрализующих антител к вирусу гриппа в образцах сыворотки крови мышей, иммунизированных полипептидом по настоящему изобретению.

Для дополнительного исследования антитело-опосредованных эффекторных механизмов, играющих роль в защите от гриппа, образцы сыворотки крови до контрольного заражения тестировали в анализе нейтрализации псевдочастиц (Alberini et al., 2009) с применением псевдочастиц, полученных из H5N1 A/Vietnam/1194/04, как описано ниже.

Анализ нейтрализации псевдочастиц.

Псевдочастицы, экспрессирующие FL НА, получали согласно описанному ранее (Temperton et al., 2007). Нейтрализующие антитела определяли с применением одного цикла трансдукции клеток HEK293 псевдочастицами Н5 A/Vietnam/1194/04, кодирующими репортерный ген люциферазы, согласно описанному ранее (Alberini et al., 2009) с некоторыми модификациями. Вкратце, термоинактивированные (30 мин при 56°С) образцы сыворотки крови до контрольного заражения серийно разводили с 3-кратным шагом в среде для выращивания (среде MEM Игла с EBSS (Lonza, Базель, Швейцария), дополненной 2 мМ L-глутамина (Lonza), 1% раствором заменимых аминокислот (Lonza), 100 ед./мл пенициллина/стрептомицина (Lonza) и 10% FBS (Euroclone, Перо, Италия) в трех повторностях в 96-луночных плоскодонных культуральных планшетах, и добавляли подобранное количество псевдочастиц Н5 A/Vietnam/1194/04 (с получением 10⁶ относительных единиц люминесценции (RLU) после инфицирования). Спустя 1 ч инкубирования при 37°С и 5% CO2 добавляли 10⁴ клеток HEK293 на лунку. Спустя 48 ч инкубирования при 37°С и 5% CO2 добавляли субстрат для люциферазы (Britelite Plus, Perkin Elmer, Уолтем, Массачусетс), и с помощью люминометра (Mithras LB 940, Berthold Technologies, Германия) измеряли люминесценцию согласно инструкциям производителя.

Образцы сыворотки крови до контрольного заражения, полученные от животных, иммунизированных полипептидом s127H1-t2 по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 91) согласно описанному в примерах 5-7, демонстрировали выявляемую нейтрализацию при высоких сывороточных концентрациях при применении анализа нейтрализации псевдочастиц (фиг. 22). Это демонстрирует способность полипепти30 038400 да по настоящему изобретению при применении в качестве иммуногена вызывать выработку нейтрализующих антител широкого спектра действия.

Помимо непосредственной нейтрализации вируса, Fc-опосредованные эффекторные механизмы, такие как антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC) и антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP), существенно способствуют защите от гриппа, при этом bnAb, направленные на стеблевой домен, являются особенно эффективными в этих механизмах (DiLillo et al., 2014). С целью тестирования того, были ли антитела, выработка которых вызывается после иммунизации полипептидом s127H1-t21181ong по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 186), способными индуцировать ADCC, авторы настоящего изобретения тестировали образцы сыворотки крови с применением анализа ADCC в модели (Parekh et al., 2012; Schneuriger et al., 2012; Cheng et al., 2014), адаптированного для мышей, как описано ниже.

Анализ антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) в модели.

Эпителиальные клетки А549, полученные из карциномы легкого человека (АТСС CCL-185), выдерживали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM), дополненной 10% термоинактивированной фетальной телячьей сывороткой крови, при 37°С, 10% СО₂. За два дня до эксперимента клетки А549 трансфицировали плазмидной ДНК, кодирующей НА Н5 A/Hong Kong/156/97 или НА H1 A/Brisbane/59/2007, с помощью Lipofectamine 2000 (Invitrogen) в Opti-MEM (Invitrogen). За день до анализа трансфицированные клетки собирали и высевали в белые 96-луночные планшеты (Costar) для анализа ADCC и в черный 96-луночный планшет с прозрачным дном (BD Falcon) для визуализации. Через 24 ч образцы разводили в аналитическом буфере (4% FBS (Gibco) со сверхнизким содержанием IgG в RPMI 1640 (Gibco)) и подвергали термоинактивации в течение 30 мин при 56°С с последующим серийным разведением в аналитическом буфере. Для биологического анализа ADCC клетки А549 дополняли свежим аналитическим буфером и к клеткам добавляли разведения антител и эффекторные клетки Jurkat, экспрессирующие Fc-гамма-рецептор IV мыши (FcyRIV; Promega), для биологического анализа ADCC и инкубировали в течение б часов при 37°С в соотношении мишень/эффектор 1:4,5. Клетки уравновешивали до комнатной температуры в течение 15 мин. перед добавлением субстрата Bio-Glo для люциферазной системы (Promega). Через 10 мин на Synergy Neo (Biotek) считывали люминесценцию. Данные выражены в виде кратности индукции сигнала в отсутствие сыворотки крови.

Путем применения данного анализа образцы сыворотки крови до контрольного заражения, полученные от животных, иммунизированных полипептидом s127H1-t2 по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 91) согласно описанному в примерах 5-7, тестировали на активность передачи сигналов через FcyRIV с применением клеток-мишеней, трансфицированных FL HA H5N1 A/Hong Kong/156/97 или H1N1 A/Brisbane/59/07 в качестве источника антигена (фиг. 23). В обоих случаях наблюдается 30кратная индукция при наиболее высокой тестируемой сывороточной концентрации, что демонстрирует способность полипептида по настоящему изобретению вызывать выработку антител, которые активируют передачу сигналов через FcyRIV, указывая на эффекторную функцию ADCC/ADCP у мышей.

Эти результаты, показанные в примерах 5-8, демонстрируют способность полипептида s127H1-t2 по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 91) вызывать выработку нацеленных на стеблевой домен, нейтрализующих и опосредующих ADCC антител и защищать мышей от летального контрольного заражения гомологичными, гетерологичными и гетеросубтипическими штаммами вируса гриппа из группы I.

Пример 9. Защита от летального контрольного заражения H5N1 А/Нопд Копд/156/97 посредством пассивного переливания сыворотки крови от мышей, иммунизированных полипептидами по настоящему изобретению.

Для определения вклада антител, индуцированных полипептидами по настоящему изобретению, в наблюдаемую защиту проводили исследования по переливанию. Целью данного исследования было определение того, придает ли пассивное переливание (многократное дозирование) сыворотки крови от мышей, иммунизированных три раза s127H1-t2 (SEQ ID NO: 91) и s127H1-t2long (SEQ ID NO: 101), содержащими дополнительную His-метку в присутствии вспомогательного средства (Matrix-M), защиту от летального контрольного заражения вирусом гриппа H5N1 A/Hong Kong/156/97.

Группы самок мышей-доноров BALB/c (в возрасте 6-8 недель) иммунизировали 3 раза с интервалом в 3 недели 30 мкг s127H1-t2 (SEQ ID NO: 91), s127H1-t2long (SEQ ID NO: 101), содержащими С-концевую His-метку, с 10 мкг добавленного в качестве вспомогательного средства Matrix-M или PBS. Через четыре недели после последней иммунизации (день 70) сыворотку крови выделяли, объединяли в каждой группе и переливали мышам-реципиентам (самки BALB/c, возраст 6-8 недель, n=10 на группу). Каждая мышь получала 400 мкл сыворотки крови i.p. в три последовательных дня до контрольного заражения (дни -3, -2 и -1). В качестве положительного контроля для модели контрольного заражения вводили CR6261 (15 мг/кг) за 1 день до контрольного заражения (n=8), при этом инъекция PBS служила в качестве отрицательного контроля (n=8). В день 0 мышей подвергали контрольному заражению 12,5xLD50 вируса для контрольного заражения и отслеживали (выживаемость, вес, клинические показатели) в течение 3 недель.

Для проверки иммуногенности полипептидов по настоящему изобретению у мышей-доноров и оп31 038400 ределения уровней НА-специфичных антител после переливания сыворотки крови мышам-реципиентам объединенные образцы сыворотки терминальной крови (день 70) мышей-доноров, объединенные образцы сыворотки крови ранее не участвовавших в эксперименте мышей-реципиентов до переливания сыворотки крови (день -4), а также отдельные образцы сыворотки крови мышей-реципиентов после 3 переливаний сыворотки крови непосредственно перед контрольным заражением (день 0) тестировали в ELISA на связывание с FL HA H1N1 A/Brisbane/59/07.

Результаты.

Контрольное заражение.

Эксперимент являлся достоверным; все мыши в контрольной группе с PBS погибают от инфекции в день 13 после контрольного заражения или до него (медианное значение 9,5 дней), тогда как группа положительного контроля (15 мг/кг CR6261, за 1 день до контрольного заражения) полностью защищена (р<0,001).

Три переливания сыворотки крови от мышей, иммунизированных полипептидом по настоящему изобретению с добавленным в качестве вспомогательного средства Matrix-M, SEQ ID NO: 91, ранее не участвовавшим в эксперименте мышам-реципиентам приводят к значимому увеличению продолжительности выживания (р=0,007) и снижению клинических показателей (р=0,012), по сравнению с контрольной группой с PBS для переливания сыворотки крови (фиг. 24).

Три переливания сыворотки крови от мышей, иммунизированных полипептидом по настоящему изобретению с добавленным в качестве вспомогательного средства Matrix-M, SEQ ID NO: 101, ранее не участвовавшим в эксперименте мышам-реципиентам приводят к значимому увеличению доли выживших (р=0,002), увеличению продолжительности выживания (р<0,001), уменьшению потери веса тела (р=0,002) и снижению клинических показателей (р<0,001), по сравнению с контрольной группой с PBS для переливания сыворотки крови, (фиг. 24)

У полипептидов по настоящему изобретению исследуемые титры антител, специфичных к FL HA A/Brisbane/59/07, после трех переливаний сыворотки крови были сходны с уровнями, полученными после активной иммунизации (фиг. 25).

Вывод.

Компоненты сыворотки крови (наиболее вероятно, антитела), индуцируемые 3-кратной иммунизацией полипептидами по настоящему изобретению SEQ ID NO: 91 и 101 с добавленным в качестве вспомогательного средства Matrix-M могут защитить мышей от летального контрольного заражения с H5N1 A/Hong Kong/156/97 (процентные значения выживаемости составляют 30 и 78% соответственно).

Пример 10. Профилактическая эффективность полипептидов по настоящему изобретению in vivo в модели контрольного заражения мышей H1N1 A/NL/602/09.

Определяли профилактическую эффективность полипептидов s127H1-t2 по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 91) и S127H1-t2long (SEQ ID NO: 101), содержащих дополнительную His-метку с Matrix-M в модели контрольного заражения H1N1 A/NL/602/09, по сравнению с контрольной группой с PBS.

Группы из 10 самок мышей BALB/c (в возрасте 6-8 недель) иммунизировали 3 раза с интервалом в 3 недели 30 мкг полипептидов по настоящему изобретению с 10 мкг Matrix-M. В качестве положительного контроля для модели контрольного заражения вводили CR6261 (15 мг/кг) за 1 день до контрольного заражения (n=8), при этом инъекция PBS служила в качестве отрицательного контроля (n=18). Через четыре недели после последней иммунизации мышей подвергали контрольному заражению 12,5xLD50 вируса для контрольного заражения и отслеживали (выживаемость, вес, клинические показатели) в течение 3 недель.

Для проверки иммуногенности полипептидов по настоящему изобретению образцы сыворотки крови до контрольного заражения (день -1) тестировали в анализах ELISA на связывание с FL HA H1N1 A/Brisbane/59/07. Для определения того, связываются ли индуцированные антитела в непосредственной близости с эпитопом для CR9114, проводили конкурентный ELISA с применением CR9114. Данные о конкуренции выражали с применением наклона OD, с помощью которого можно количественно оценить ответы.

Результаты.

Эксперимент является достоверным; все мыши в контрольной группе с PBS погибают от инфекции в день 8 после контрольного заражения или до него (медианное значение 5 дней), тогда как группа положительного контроля (15 мг/кг CR6261, за 1 день до контрольного заражения) полностью защищена (р<0,001).

Три иммунизации s127H1-t2 с добавленным в качестве вспомогательного средства Matrix-M (SEQ ID NO: 91) и s127H1-t2long (SEQ ID NO: 101), содержащим дополнительную His-метку, приводят к значимому увеличению доли выживших (р<0,001), увеличению продолжительности выживания (р<0,001) и снижению клинических показателей (р<0,001) по сравнению с контрольной группой с PBS (фиг. 26).

Три иммунизации варианта mini-HA H1 s127H1-t2 с добавленным в качестве вспомогательного средства Matrix-M (SEQ ID NO: 91) приводят к значимому уменьшению веса тела (р<0,001) по сравне32 038400 нию с контрольной группой с PBS (фиг. 26).

Титры антител IgG к FL HA H1N1 A/Brisbane/59/07, индуцированных полипептидами по настоящему изобретению, являются значимо более высокими по сравнению с PBS для всех тестируемых вариантов mini-HA H1 (р<0,001) (фиг. 27А).

Вариант mini-HA H1 s127H1-t2 (SEQ ID NO: 91) характеризовался значимо более высокими титрами антител IgG к FL HA H1N1 A/Brisbane/59/07 по сравнению с s127H1-t2long (SEQ ID NO: 101), содержащим дополнительную His-метку (р=0,021) (фиг. 27А).

Все тестируемые полипептиды по настоящему изобретению с добавленным в качестве вспомогательного средства Matrix-M характеризовались значимо более высокими титрами антител, конкурирующих с CR9114, по сравнению с PBS (р<0,001) (фиг. 27В).

Вывод.

Полипептиды s127H1-t2 по настоящему изобретению с добавленным в качестве вспомогательного средства Matrix-M (SEQ ID NO: 91) и s127H1-t2long (SEQ ID NO: 101), содержащие дополнительную Hisметку, придают защиту от летального контрольного заражения H1N1 A/NL/602/09, которая проявляется в увеличении доли выживших, продолжительности выживания и снижении клинических показателей. Кроме того, s127H1-t2 с добавленным в качестве вспомогательного средства Matrix-M (SEQ ID NO: 91), также приводил к снижению потери веса тела после летального контрольного заражения H1N1 A/NL/602/09.

Пример 11. Скрининг библиотеки.

В PCT/EP2012/073706 раскрыты полипептиды стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа, композиции и вакцины на их основе, а также способы их применения в области предупреждения и/или лечения гриппа. В настоящем документе мы описываем дополнительные последовательности полипептидов стеблевого домена, полученные из полноразмерного НА из H1N1 A/Brisbane/59/2007 (SEQ ID NO: 1). Полипептиды стеблевого домена получают путем сайт-направленной мутации в Hl-mini2-clusterl + 5+6-GCN4t2 (SEQ id NO: 52) и представляют нейтрализующий эпитоп гриппа широкого спектра для CR6261 (Throsby et al., 2009; Ekiert et al.2010) и/или CR9114.

Hl-mini2-clusterl + 5+6-GCN4t2 (SEQ ID NO: 52) был получен из полноразмерного НА H1N1 A/Brisbane/59/2007 (SEQ ID NO: 1) посредством осуществления следующих стадий.

Удаление участка расщепления в НАО. Расщепление HA дикого типа в данном участке приводит к образованию НА1 и НА2. Удаления можно достичь посредством мутации замены R на Q в положении Р1 (см., например, Sun et al., 2010 для пояснения номенклатуры участка расщепления (положение 343 в SEQ ID NO: 1).

Удаление головного домена посредством делеции аминокислот 53-320 в SEQ ID NO: 1. Оставшиеся N- и С-концевые части последовательности соединяли с помощью гибкого линкера из четырех остатков, GGGG.

Увеличение растворимости петли (между А-спиралью и CD-спиралью), образованной остатками 402-418 (или их эквивалентами) в ^ш A/Brisbane/59/2007 (SEQ ID NO: 1), для того, чтобы одновременно увеличить стабильность конформации до слияния и дестабилизировать конформацию после слияния модифицированного НА. В Hl-mini2-clusterl + 5+6-GCN4 (SEQ ID NO: 2) вводили мутации F406S, V409T, F413G и L416S (нумерация относится к SEQ ID NO: 1).

Введение дисульфидного мостика между аминокислотами в положениях 324 и 436 в H1 A/Brisbane/59/2007; этого достигают посредством введения мутаций R324C и Y436C (нумерация относится к SEQ ID NO: 1).

Введение полученной из GCN4 последовательности

RMKQIEDKIEEIESK (SEQ ID NO: 20), которая известна как тримеризующая, в положения 419-433 (нумерация относится к SEQ ID NO: 1).

В определенных вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат внутриклеточные последовательности HA и трансмембранный домен. В других вариантах осуществления последовательность трансмембранного и внутриклеточного домена была удалена от положения (или эквивалентного ему, как определено по выравниванию последовательности) 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 526, 527, 528, 529 или 530 из НА2 до С-конца НА2 (нумерация согласно SEQ ID NO: 1), так что секретируемый (растворимый) полипептид получают после экспрессии в клетках. Растворимый полипептид можно дополнительно стабилизировать путем введения последовательности, которая, как известно, образует тримерные структуры, т.е. последовательность-фолдон ayvrkdgewvll (seq id no: з), необязательно присоединяемой посредством короткого линкера согласно описанному выше. Линкер может необязательно содержать участок расщепления для последующего процессинга согласно протоколам, хорошо известным специалистам в данной области техники. Для облегчения очистки и выявления растворимой формы можно необязательно добавить последовательность метки, например гистидиновую метку (ННННННН (SEQ ID NO: 16) или НННННН (SEQ ID NO: 15, или FLAG-метку (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 22), или их комбинацию, необязательно присоединяемую посредством коротких линкеров.

Линкер может необязательно содержать участок (часть участка) протеолитического расщепления, например, LVPRGS (SEQ ID NO: 23) (тромбин) или IEGR (SEQ ID NO: 24) (фактор X), для последующего процессинга согласно протоколам, хорошо известным специалистам в данной области техники. Процессированные белки также охватываются настоящим изобретением.

Примером такой С-концевой последовательности, объединяющей FLAG-метку, участок расщепления тромбином, фолдон и последовательности His, является SEQ ID NO: 4 - FLAG-thrombin-foldon-His. Эту последовательность объединяли с растворимой формой последовательности Hl-mini2-clusterl + 5+6-GCN4t2 (SEQ ID no: si) для создания исходной последовательности (SEQ ID NO: 156), которую применяли для создания новых полипептидов по настоящему изобретению путем мутагенеза. Эта последовательность не содержит лидерную последовательность, соответствующую аминокислотам 1-17 в SEQ ID NO: 1 и 2.

Полипептиды стеблевого домена создают посредством делеции части последовательности гемагглютинина, которая кодирует головной домен молекулы, и повторного соединения N- и С-концевых частей последовательности по обе стороны от делеции посредством линкера, как описано в РСТ/2012/073706 и выше. При удалении головного домена часть молекулы, которая была ранее защищена от водного растворителя, остается доступной для него, что потенциально дестабилизирует структуру полипептидов по настоящему изобретению. По этой причине остатки в В-петле (в частности, аминокислотные остатки 406 (F и S в SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно), 409 (V и Т), 413 (F и G) и 416 (L и S)) подвергали мутации в различных комбинациях с применением исходной последовательности SEQ ID NO: 156 в качестве исходной точки. SEQ ID NO: 156 создавали из Hl-mini2-clusterl+5+6-GCN4t2 (seq id NO: 52) путем удаления лидерной последовательности и замещения остатков 520-565 последовательностью FLAG-thrombin-foldon-His (SEQ ID NO: 4).

Аналогичным образом, в области вокруг гибридного пептида ряд гидрофобных остатков открывают для растворителя, что обусловлено тем фактом, что в отличие от нативного полноразмерного HA полипептиды по настоящему изобретению не могут быть расщеплены и проходят ассоциированное конформационное изменение, которое погружает гидрофобный гибридный пептид во внутреннюю часть белка. Чтобы решить эту проблему, некоторые или все из остатков I337, I340, F352 и I353 в SEQ ID NO: 156 также подвергали мутации.

Два различных набора мутантных полипептидов раскрыты в табл. 9. Во всех случаях данные полипептиды содержат SEQ ID NO: 20 в положениях 419-433 (нумерация согласно SEQ ID NO: 1).

Пример 12 Идентификация, очистка и определение характеристик тримерных полипептидов по настоящему изобретению.

Были созданы библиотеки полипептидов, как описано в примере 11 (набор 1 и набор 2), содержащие SEQ ID NO: 20 в положениях 419-433. Независимо трансфицировали отдельные клоны в клетки HEK2 93F и скрининговую культуральную среду для мультимеров (сэндвич-ELISA с применением CR9114), связывания с CR6261 (ELISA) и экспрессии белка (анализ HTRF). Хиты на основе сэндвичELISA с применением CR9114, ELISA и анализа HTRF в отношении CR9114, CR6261 и CR8020, подтверждали и им давали оценку.

Оценивали мультимеризацию посредством перекрестного сшивания с первичным амином (присутствует в остатках лизина), специфическим кросслинкером BS3 с последующим SDS-PAGE (см. ниже). По причине обширной мультимеризации С-концевую последовательность метки Flag-foldon-His (FFH) замещали участком расщепления тромбином и последовательностью His-метки (TCSHis). Как следствие, мультимеризация, содержащая последовательности TCS-His (сэндвич-анализ CR9114, перекрестное сшивание BS3), была повторно подтверждена, и клонам давали оценку и отбирали. Выбранные клоны экспрессировали, очищали и охарактеризовывали.

Исследования перекрестного сшивания проводили следующим образом.

Добавляли кросслинкер BS3 (бис-(сульфосукцинимидил)суберат) непосредственно в культуральную среду.

Инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре.

Собирали среду и анализировали с помощью SDS-PAGE/вестерн-блоттинга в восстанавливающих (R, 5 мМ DTT) и в невосстанавливающих (NR) условиях.

В восстанавливающих условиях только перекрестно сшитые с BS3 образцы остались ковалентно соединенными.

Выявление mini-HA посредством вестерн-блоттинга с применением His-метки специфического mAb.

Результаты.

1. Были успешно созданы две библиотеки с высоким качеством (точные на >90% в отношении ORF), включающие SEQ ID NO: 20 в положениях 419-433 и ожидаемые изменения в последовательности (>97% рандомизации).

2. Все 10472 клона (5544 и 4928 из набора 1 и 2 соответственно) оценивали в первичном скрининге (фиг. 28).

3. Клонов, характеризующихся экспрессией FL HA при уровне экспрессии >50% и сигналами свя- зывания с CR6261 при уровне >80% сигналов, наблюдаемых в случае использования FL НА, считали хитами; при этом данная процедура давала 703 хитов (596 и 107 из библиотек 1 и 2, соответственно).

4. 658 из 703 хитов сохранились после подтверждающего скрининга.

5. Исследование перекрестного сшивания 20% наилучших хитов (111) показало наличие мультимеров более высокого порядка, что может потенциально препятствовать очистке тримерных образцов.

6. 20% наилучших подтвержденных хитов (111) были успешно клонированы для замещения FFH Сконца последовательностью TCS-His, с последующим сэндвич-ELISA с применением CR9114 и оценкой исследования перекрестного сшивания.

7. Исследования перекрестного сшивания выдали 9 клонов, которые считали наиболее перспективными тримерами-кандидатами (SEQ ID NO: 158-166, табл. 11). Основываясь на сэндвич-ELISA с применением CR9114 (фиг. 29), три кандидата (2 с TCS-His, 1 с FFH С-концом) отбирали для экспрессии и очистки.

8. Два из выбранных кандидатов экспрессировались плохо, и очистку не предпринимали. Последовательность-кандидат GW1.5E2.FFH (SEQ ID NO: 158) очищали до гомогенности (7,6 мг от общего белка; чистота >95%, HP-SEC), следуя процедурам, описанным в примере 4.

9. Определение характеристик GW1.5E2.FFH (SEQ ID NO: 158) посредством анализа SEC-MALS указывает на образование тримера в растворе, со связыванием 3 Fab-фрагментов CR9114 или CR6261 связывания на тример (фиг. 30 и табл. 10). Kdapp, как определено из измерений бислойной интерферометрии (Octet), составляет 1 нМ для каждого из CR6261 и CR9114. Как и ожидалось, связывание CR8020 (отрицательный контроль) невозможно определить каким-либо способом.

Вывод.

Идентифицировали нековалентный тримерный полипептид по настоящему изобретению (GW1.5E2.FFH, SEQ ID NO: 158), который связывает bnAbs CR6261 и CR9114 с высокой аффинностью со стехиометрическим соотношением 3:1.

Пример 13. Профилактическая эффективность полипептида mini-HA sH1 GW1.5E2-FFH по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 158) в мышиной модели заражения H1N1 A/Brisbane/59/07.

Определяли профилактическую эффективность mini-HA sH1 GW1.5E2-FFH (SEQ ID NO: 158) с добавленным в качестве вспомогательного средства Matrix-M в модели контрольного заражения H1N1 A/Brisbane/59/07, по сравнению с контрольной группой с PBS.

Группы из 10 самок мышей BALB/c (в возрасте 6-8 недель) иммунизировали 3 раза с интервалом в 3 недели 30 мкг mini-HA sH1 GW1.5E2-FFH (SEQ ID NO: 158) с 10 мкг добавленного в качестве вспомогательного средства Matrix-M. В качестве положительного контроля для модели контрольного заражения вводили CR6261 (15 мг/кг) за 1 день до контрольного заражения (n=8), при этом инъекция PBS служила в качестве отрицательного контроля (n=16). Через четыре недели после последней иммунизации мышей подвергали контрольному заражению 12,5xLD50 вируса для контрольного заражения и отслеживали (выживаемость, вес, клинические показатели) в течение 3 недель.

Для проверки иммуногенности mini-HA sH1 GW1.5E2-FFH (SEQ ID NO: 158) образцы сыворотки крови до контрольного заражения (день -1) тестировали в анализах ELISA на связывание с FL HA из H1N1 A/Brisbane/59/07. Для определения того, связываются ли антитела, индуцированные полипептидом mini-HA sH1 GW1.5E2-FFH по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 158), в непосредственной близости с эпитопом для CR9114, проводили конкурентный ELISA с применением CR9114. Данные о конкуренции представляли в виде % конкуренции, определяемого как (А-Р)/Ах100), где А представляет собой максимальный OD-сигнал связывания CR9114 с FL HA в отсутствие сыворотки крови, а Р представляет собой OD-сигнал связывания CR9114 с FL HA в присутствии сыворотки крови в указанном разведении, или выражали с применением показателя наклона OD, с помощью которого можно количественно оценить ответы; в качестве эталона включали растворы CR9114 и CR8020 (исходная концентрация 5 мг/мл).

Результаты.

Эксперимент являлся достоверным; все мыши в контрольной группе с PBS (n=16) погибают от инфекции в день 10 после контрольного заражения или до него (медианное значение 8 дней), тогда как группа положительного контроля (n=8, 15 мг/кг CR6261, за 1 день до контрольного заражения) полностью защищена (р<0,001).

Три иммунизации mini-HA sH1 GW1.5E2-FFH (SEQ ID NO: 158) с добавленным в качестве вспомогательного средства Matrix-M приводили к значимому увеличению доли выживших (р<0,001), увеличению продолжительности выживания (р<0,001), уменьшению потери веса тела (р<0,001) и снижению клинических показателей (р<0,001) по сравнению с контрольной группой с PBS (фиг. 31).

Титры антител IgG к FL HA H1N1 A/Brisbane/59/07, индуцированных mini-HA sH1 GW1.5E2-FFH (SEQ ID NO: 158) до контрольного заражения, являются значимо более высокими по сравнению с PBS (р<0,001) (фиг. 32А).

Титры антител IgG к FL HA H1N1 A/Brisbane/59/07 выходят на плато после двух иммунизаций (не показано).

Полипептид mini-HA sH1 GW1.5E2-FFH по настоящему изобретению с добавленным в качестве вспомогательного средства Matrix-M (SEQ ID NO: 158) индуцирует значимо более высокие титры антител, конкурирующих с CR9114, по сравнению с PBS (р<0,001) (фиг. 32В).

Вывод.

Полипептид mini-HA sH1 GW1.5E2-FFH по настоящему изобретению с добавленным в качестве вспомогательного средства Matrix-M (SEQ ID NO: 158) придает защиту от летального контрольного заражения H1N1 A/Brisbane/59/07.

Пример 14. Профилактическая эффективность полипептида mini-HA sH1 GW1.5E2-FFH по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 158) в мышиной модели заражения H5N1 A/Hong Kong/156/97.

Определяли профилактическую эффективность главных вариантов mini-HA H1 с добавленным в качестве вспомогательного средства Matrix-M в модели контрольного заражения H5N1 A/Hong Kong/156/97 по сравнению с контрольной группой с PBS.

Группы из 10 самок мышей BALB/c (в возрасте 6-8 недель) иммунизировали 3 раза с интервалом в 3 недели 30 мкг полипептида mini-HA sH1 GW1.5E2-FFH по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 158) с 10 мкг добавленного в качестве вспомогательного средства Matrix-M. В качестве положительного контроля для модели контрольного заражения вводили CR6261 (15 мг/кг) за 1 день до контрольного заражения (n=8), при этом инъекция PBS служила в качестве отрицательного контроля (n=16). Через четыре недели после последней иммунизации мышей подвергали контрольному заражению 12,5xLD50 вируса для контрольного заражения и отслеживали (выживаемость, вес, клинические показатели) в течение 3 недель.

Для проверки иммуногенности полипептида mini-HA sH1 GW1.5E2-FFH по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 158) образцы сыворотки крови до контрольного заражения (день -1) тестировали в анализах ELISA на связывание с FL HA из H1N1 A/Brisbane/59/07. Для определения того, связываются ли антитела, индуцированные mini-HA, в непосредственной близости с эпитопом для CR9114, проводили конкурентный ELISA с применением CR9114. Данные о конкуренции представляли в виде % конкуренции, определяемого как (А-Р)/Ах100), где А представляет собой максимальный OD-сигнал связывания CR9114 с FL HA в отсутствие сыворотки крови, а Р представляет собой OD-сигнал связывания CR9114 с FL HA в присутствии сыворотки крови в указанном разведении, или выражали с применением показателя наклона OD, с помощью которого можно количественно оценить ответы; в качестве эталона включали растворы CR9114 и CR8020 (исходная концентрация 5 мкг/мл). Результаты Эксперимент являлся достоверным; 15 из 16 мышей в контрольной группе с PBS погибают от инфекции в день 9 после контрольного заражения или до него (медианное значение 9 дней), тогда как группа положительного контроля (n=8, 15 мг/кг CR6261, за 1 день до контрольного заражения) полностью защищена (р<0,001).

Три иммунизации полипептидом mini-HA sH1 GW1.5E2-FFH по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 158) с добавленным в качестве вспомогательного средства Matrix-M приводили к значимому увеличению доли выживших (р<0,001), увеличению продолжительности выживания (р<0,001), уменьшению потери веса тела (р<0,001) и снижению клинических показателей (р<0,001) по сравнению с контрольной группой с PBS (фиг. 33).

Титры антител IgG к FL HA H1N1 A/Brisbane/59/07, индуцированных полипептидом mini-HA sH1 GW1.5E2-FFH по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 158) до контрольного заражения, являются значимо более высокими по сравнению с PBS (р<0,001) (фиг. 34А).

Полипептид mini-HA sH1 GW1.5E2-FFH по настоящему изобретению с добавленным в качестве вспомогательного средства Matrix-M (SEQ ID NO: 158) индуцирует значимо более высокие титры антител, конкурирующих с CR9114, по сравнению с PBS (р<0,001) (фиг. 34В).

Вывод Полипептид mini-HA sH1 GW1.5E2-FFH по настоящему изобретению с добавленным в качестве вспомогательного средства Matrix-M (SEQ ID NO: 158) придает гетеросубтипическую защиту от летального контрольного заражения H5N1 A/Hong Kong/156/97.

Пример 15. Профилактическая эффективность полипептида mini-HA sH1 GW1. 5E2-FFH по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 158) в мышиной модели заражения H1N1 A/Puerto Rico/8/34.

Определяли профилактическую эффективность полипептида mini-HA sH1 GW1.5E2-FFH по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 158) с добавленным в качестве вспомогательного средства Matrix-M в модели контрольного заражения H1N1 A/Puerto Rico/8/1934 по сравнению с контрольной группой с PBS.

Группы из 10 самок мышей BALB/c (в возрасте 6-8 недель) иммунизировали 3 раза с интервалом в 3 недели 30 мкг полипептида mini-HA sH1 GW1.5E2-FFH по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 158) с 10 мкг добавленного в качестве вспомогательного средства Matrix-M. В качестве положительного контроля для модели контрольного заражения вводили CR6261 (15 мг/кг) за 1 день до контрольного заражения (n=8), при этом 3 иммунизации PBS служили в качестве отрицательного контроля (n=16). Через четыре недели после последней иммунизации мышей подвергали контрольному заражению 25xLD50 вируса для контрольного заражения и отслеживали (выживаемость, вес, клинические показатели) в течение 3 недель.

Для проверки иммуногенности полипептида mini-HA sH1 GW1.5E2-FFH по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 158) образцы сыворотки крови до контрольного заражения (день -1) тестировали в анализе ELISA на связывание с FL HA из H1N1 A/Brisbane/59/07. Для определения того, связываются ли антитела, индуцированные mini-HA, в непосредственной близости с эпитопом для CR9114, проводили конкурентный ELISA с применением CR9114. Данные о конкуренции представляли в виде % конкуренции', определяемого как (А-Р)/Ах100), где А представляет собой максимальный OD-сигнал связывания CR9114 с FL HA в отсутствие сыворотки крови, а Р представляет собой OD-сигнал связывания CR9114 с FL HA в присутствии сыворотки крови в указанном разведении, или выражали с применением показателя наклона OD, с помощью которого можно количественно оценить ответы; в качестве эталона включали растворы CR9114 и CR8020 (исходная концентрация 5 мкг/мл).

Результаты.

Эксперимент является достоверным; все мыши в контрольной группе с PBS (n=16) погибают от инфекции в день 9 после контрольного заражения или до него (медианное значение 8 дней), тогда как группа положительного контроля (n=8, 15 мг/кг CR6261, за 1 день до контрольного заражения) полностью защищена (р<0,001).

Три иммунизации полипептидом mini-HA sH1 GW1.5E2-FFH по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 158) с добавленным в качестве вспомогательного средства Matrix-M приводил к значимому увеличению доли выживших (р<0,001), увеличению продолжительности выживания (р<0,001), уменьшению потери веса тела (р<0,001) и снижению клинических показателей (р<0,001) по сравнению с контрольной группой с PBS (фиг. 35).

Титры антител IgG к FL HA H1N1 A/Brisbane/59/07, индуцированных полипептидом mini-HA sH1 GW1.5E2-FFH по настоящему изобретению (SEQ ID NO: 158), являются значимо более высокими по сравнению с PBS (р<0,001) (фиг. 36А).

Полипептид mini-HA sH1 GW1.5E2-FFH по настоящему изобретению с добавленным в качестве вспомогательного средства Matrix-M (SEQ ID NO: 158) индуцирует значимо более высокие титры антител, конкурирующих с CR9114, по сравнению с PBS (р<0,001) (фиг. 36В).

Вывод.

Полипептид mini-HA sH1 GW1.5E2-FFH по настоящему изобретению с добавленным в качестве вспомогательного средства Matrix-M (SEQ ID NO: 158) придает защиту от летального контрольного заражения H1N1 A/Puerto Rico/8/34.

Таблица 1 ___________Стандартные аминокислоты, аббревиатуры и свойства___________

Аминокислота	3-буквенная	1-буквенная	Полярность боковой цепи	Заряд боковой цепи (pH 7,4)
Аланин	Ala	A	Неполярная	Нейтральный
Аргинин	Arg	R	Полярная	Положительный
Аспарагин	Asn	N	Полярная	Нейтральный
Аспарагиновая кислота	Asp	D	Полярная	Отрицательный
Цистеин	Cys	C	Неполярная	Нейтральный
Глутаминовая кислота	Glu	E	Полярная	Отрицательный
Глутамин	Gin	Q	Полярная	Нейтральный
Глицин	Gly	G	Неполярная	Нейтральный
Гистидин	His	H	Полярная	Положительный (10%) нейтральны! (90%)
Изолейцин	lie	I	Неполярная	Нейтральный
Лейцин	Leu	L	Неполярная	Нейтральный
Лизин	Lys	К	Полярная	Положительный
Метионин	Met	M	Неполярная	Нейтральный
Фенилаланин	Phe	F	Неполярная	Нейтральный
Пролин	Pro	P	Неполярная	Нейтральный
Серин	Ser	S	Полярная	Нейтральный
Треонин	Thr	T	Полярная	Нейтральный
Триптофан	Trp	W	Неполярная	Нейтральный
Тирозин	Tyr	Y	Полярная	Нейтральный
Валин	Val	V	Неполярная	Нейтральный

Таблица 2

Выравнивание последовательности для последовательностей H1 согласно специфическим вариантам осуществления настоящего изобретения

1. A/Solomon Islands/6/2003 (H1N1) (SEQ ID NO: 25)

2. A/Brisbane/59/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 1)

3. А/New Caledonia/20/1999 (H1N1) (SEQ ID NO: 26)

4. A/California/07/2009 (H1N1) (SEQ ID NO: 27)

5. A/swine/Hubei/Sl/2009 (H1N1) (SEQ ID NO: 28)

6. A/swine/Haseluenne/IDT2617/2003 (H1N1) (SEQ ID NO: 29)

7. А/NewYork/8/2006 (H1N1) (SEQ ID NO: 30)

8 .	A/SolomonIslands/3/2006 (H1N1)	(SEQ ID NO: 31)
9.	А/NewYork/146/2000 (H1N1) (SEQ	ID NO: 32)
10	. A/NewYork/653/1996 (H1N1) (SEQ	ID NO: 33)
11	. A/Beijing/262/1995 (H1N1) (SEQ	ID NO: 34)

12. A/Texas/36/1991 (H1N1) (SEQ ID NO: 35)

13. А/Singapore/6/1986 (H1N1) (SEQ ID NO: 36)

14. A/Chile/1/1983 (H1N1) (SEQ ID NO: 37)

15. A/Baylor/11515/1982 (H1N1) (SEQ ID NO: 38)

16. A/Brazil/11/1978 (H1N1) (SEQ ID NO: 39)

17. A/USSR/90/1977 (H1N1) (SEQ ID NO: 40)

18. A/NewJersey/8/1976 (H1N1) (SEQ ID NO: 41)

19. А/Denver/1957 (H1N1) (SEQ ID NO: 42)

20. A/Albany/4835/1948 (H1N1) (SEQ ID NO: 43)

21. А/FortMonmouth/1/1947 (H1N1) (SEQ ID NO: 44)

22. А/Cameron/1946 (H1N1) (SEQ ID NO: 45)

23. A/Weiss/1943 (H1N1) (SEQ ID NO: 46)

24. A/Iowa/1943 (H1N1) (SEQ ID NO: 47)

25. А/Bellamy/1942 (H1N1) (SEQ ID NO: 48)

26. A/PuertoRico/8/1934 (H1N1) (SEQ ID NO: 49)

27. A/WSN/1933 (H1N1) (SEQ ID NO: 50)

28. A/SouthCarolina/1/1918 (H1N1) (SEQ ID NO: 51)

1. MKVKLLVLLC TFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL

EDSHNGKLCL 60

2. MKVKLLVLLC TFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL

ENSHNGKLCL 60

3. MKAKLLVLLC TFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL

EDSHNGKLCL 60

4. MKAILWLLY TFATANADTL CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL

EDKHNGKLCK 60

5. MEAKLFVLFC AFTALKADTF CVGYHANYST HTVDTILEKN VTVTHSVNLL

ENSHNGKLCS 60

6. MEAKLFVLFC AFTALKADTI CVGYHANNST DTVDTILEKN VTVTHSINLL

ENNHNGKLCS 60

7. MKVKLLVLLC TFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL

EDSHNGKLCL 60

8. MKVKLLVLLC TFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL

EDSHNGKLCL 60

9. MKAKLLVLLC AFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL

EDSHNGKLCR 60

10. MKAKLLVLLC AFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL

EDSHNGKLCR 60

11. MKAKLLVLLC TFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL

EDSHNGKLCL 60

12. MKAKLLVLLC AFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL

EDSHNGKLCR 60

13. MKAKLLVLLC AFTATDADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL

EDSHNGKLCR 60

14. MKAKLLVLLC ALSATDADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL

EDNHNGKLCK 60

15. MKAKLLVLLC ALSATDADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL

EDSHNGKLCR 60

16. MKAKLLVLLC ALSATDADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL

EDSHNGKLCR 60

17. MKAKLLVLLC ALSATDADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL

EDSHNGKLCR 60

18. MKAKLLVLLC AFTATDADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL

EDSHNGKLCR 60

19. MKAKLLILLC ALSATDADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL

EDSHNGKLCR 60

20. MKAKLLVLLC ALSATDADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL

EDSHNGKLCR 60

21. MKAKLLILLC ALTATDADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL

EDSHNGKLCR 60

22. MKAKLLILLC ALSATDADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL

EDSHNGKLCR 60

23. MKARLLVLLC ALAATDADTI CIGYHANNST DTVDTILEKN VTVTHSVNLL

EDSHNGKLCR 60

24. MKARLLVLLC ALAATDADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL

EDSHNGKLCR 60

25. MKARLLVLLC AIAATDADTI CIGYHANNST DTVDTILEKN VTVTHSVNLL

EDSHNGKLCR 60

26. MKANLLVLLC ALAAADADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL EDSHNGKLCR 60

27. MKAKLLVLLY AFVATDADTI CIGYHANNST DTVDTIFEKN VAVTHSVNLL EDRHNGKLCK 60

28. MEARLLVLLC AFAATNADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL EDSHNGKLCK 60

1. LKGIAPLQLG NCSVAGWILG NPECELLISR ESWSYIVEKP NPENGTCYPG HFADYEELRE 120

2. LKGIAPLQLG NCSVAGWILG NPECELLISK ESWSYIVEKP NPENGTCYPG HFADYEELRE 120

3. LKGIAPLQLG NCSVAGWILG NPECELLISK ESWSYIVETP NPENGTCYPG YFADYEELRE 120

4. LRGVAPLHLG KCNIAGWILG NPECESLSTA SSWSYIVETP SSDNGTCYPG DFIDYEELRE 120

5. LNGKIPLQLG NCNVAGWILG NPKCDLLLTA NSSSYIIETS KSKNGACYPG EFADYEELKE 120

6. LNGKAPLQLG NCNVAGWILG NPECDLLLTV DSWSYIIETS NSKNGACYPG EFADYEELRE 120

7. LKGIAPLQLG NCSVAGWILG NPECELLISK ESWSYIVETP NPENGTCYPG YFADYEELRE 120

8. LKGIAPLQLG NCSVAGWILG NPECELLISR ESWSYIVEKP NPENGTCYPG HFADYEELRE 120

9. LKGTAPLQLG NCSIAGWILG NPECESLFSK ESWSYIAETP NPKNGTCYPG YFADYEELRE 120

10. LKGTAPLQLG NCSVAGWILG NPECESLFSK ESWSYIAETP NPENGTCYPG YFADYEELRE 120

11. LKGIAPLQLG NCSVAGWILG NPECESLISK ESWSYIVETP NPENGTCYPG YFADYEELRE 120

12. LKGIAPLQLG NCSVAGWILG NPKCESLFSK ESWSYIAETP NPENGTCYPG YFADYEELRE 120

13. LKGIAPLQLG NCSIAGWILG NPECESLFSK KSWSYIAETP NSENGTCYPG YFADYEELRE 120

14. LKGIAPLQLG KCSIAGWILG NPECESLFSK KSWSYIAETP NSENGTCYPG YFADYEELRE 120

15. LKGIAPLQLG

KCSIAGWILG

NPECESLFSK

KSWSYIAETP

NSENGTCYPG

YFADYEELRE 120

16. LKGIAPLQLG

KCSIAGWILG

NPECESLFSK

KSWSYIAETP

NSENGTCYPG

YFADYEELRE 120

17. LKGIAPLQLG

KCNIAGWILG

NPECESLFSK

KSWSYIAETP

NSENGTCYPG

YFADYEELRE 120

18. LKGIAPLQLG

NCSIAGWILG

NPECESLFSK

KSWSYIAETP

NSENGTCYPG

YFADYEELRE 120

19. LKGKAPLQLG

NCNIAGWVLG

NPECESLLSN

RSWSYIAETP

NSENGTCYPG

DFADYEELRE 120

20. LKGIAPLQLG

KCNIAGWILG

NPECESLFSK

KSWSYIAETP

NSENGTCYPG

YFADYEELRE 120

21. LKGIAPLQLG

KCNIAGWILG

NPECESLLSK

RSWSYIAETP

NSENGACYPG

DFADYEELRE 120

22. LKGIAPLQLG

KCNIAGWILG

NPECESLLSK

RSWSYIAETP

NSENGACYPG

DFADYEELRE 120

23. LKGIAPLQLG

KCNIAGWILG

NPECESLLSE

RSWSYIVETP

NSENGTCYPG

DFTDYEELRE 120

24. LKGIAPLQLG

KCNIAGWILG

NPECESLLSE

RSWSYIVETP

NSENGTCYPG

DFIDYEELRE 120

25. LKGIAPLQLG

KCNIAGWILG

NPECESLLSE

RSWSYIVETP

NSENGTCYPG

DFIDYEELRE 120

26. LKGIAPLQLG

KCNIAGWLLG

NPECDPLLPV

RSWSYIVETP

NSENGICYPG

DFIDYEELRE 120

27. LKGIAPLQLG

KCNITGWLLG

NPECDSLLPA

RSWSYIVETP

NSENGACYPG

DFIDYEELRE 120

28. LKGIAPLQLG

KCNIAGWLLG

NPECDLLLTA

SSWSYIVETS

NSENGTCYPG

DFIDYEELRE 120

1. QLSSVSSFER

FEIFPKESSW

PNHTTT-GVS

ASCSHNGESS

FYKNLLWLTG

KNGLYPNLSK 179

2. QLSSVSSFER

FEIFPKESSW

PNHTVT-GVS

ASCSHNGESS

FYRNLLWLTG

KNGLYPNLSK 179

3.

QLSSVSSFER

FEIFPKESSW

PNHTVT-GVS

ASCSHNGKSS

FYRNLLWLTG

KNGLYPNLSK 179

4. QLSSVSSFER FEIFPKTSSW PNHDSNKGVT AACPHAGAKS FYKNLIWLVK KGNSYPKLSK 180

5. QLSTVSSFER FEIFPKAISW PDHDATRGTT VACSHSGVNS FYRNLLSTVK KGNSYPKLSK 180

6. QLSTVSSFER FEIFPKATSW PNHDTTRGTT ISCSHSGANS FYRNLLWIVK KGNSYPKLSK 180

7. QLSSVSSFER FEIFPKESSW PNHTVT-GVS ASCSHNGKSS FYRNLLWLTG KNGLYPNLSK 179

8. QLSSVSSFER FEIFPKESSW PNHTTT-GVS ASCSHNGESS FYKNLLWLTG KNGLYPNLSK 179

9. QLSSVSSFER FEIFPKDSSW PNHTVTKGVT ASCSHNGKSS FYKNLLWLTE KNGLYPNLSK 180

10. QLSSVSSFER FEIFPKESSW PNHTVTKGVT ASCSHNGKSS FYKNLLWLTE KNGLYPNLSK 180

11. QLSSVSSFER FEIFPKESSW PNHTVT-GVT ASCSHNGKSS FYRNLLWLTE KNGLYPNLSN 179

12. QLSSVSSFER FEIFPKESSW PNHTVTKGVT TSCSHNGKSS FYRNLLWLTK KNGLYPNVSK 180

13. QLSSVSSFER FEIFPKESSW PNHTVTKGVT ASCSHKGRSS FYRNLLWLTK KNGSYPNLSK 180

14. QLSSVSSFER FEIFPKESSW PKHNVTKGVT AACSHKGKSS FYRNLLWLTE KNGSYPNLSK 180

15. QLSSVSSFER FEIFPKESSW PKHSVTRGVT ASCSHKGKSS FYRNLLWLTE KNGSYPNLSK 180

16. QLSSVSSFER FEIFPKERSW PKHNITRGVT ASCSHKGKSS FYRNLLWLTE KNGSYPNLSK 180

17. QLSSVSSFER FEIFPKERSW PKHNVTRGVT ASCSHKGKSS FYRNLLWLTE KNGSYPNLSK 180

18. QLSSVSSFER FEIFPKESSW PNHTVTKGVT ASCSHKGRSS FYRNLLWLTK KNGSYPNLSK 180

19. QLSSVSSFER FEIFPKERSW PNHTTR-GVT AACPHARKSS FYKNLVWLTE ANGSYPNLSR 179

20. QLSSVSSFER FEIFPKERSW PKHNITRGVT AACSHKGKSS FYRNLLWLTE KNGSYPNLNK 180

21. QLSSVSSFER FEIFPKERSW PKHNITRGVT AACSHAGKSS FYKNLLWLTE TDGSYPKLSK 180

22. QLSSVSSFER FEIFPKGRSW PEHNIDIGVT AACSHAGKSS FYKNLLWLTE KDGSYPNLNK 180

23. QLSSVSSFER FEIFPKESSW PKHNTARGVT AACSHAGKSS FYRNLLWLTE KDGSYPNLKN 180

24. QLSSVSSFER FEIFSKESSW PKHTTG-GVT AACSHAGKSS FYRNLLWLTE KDGSYPNLNN 179

25. QLSSVTSFER FEIFPKETSW PKHNTTKGVT AACSHAGKCS FYRNLLWLTE KDGSYPNLNN 180

26. QLSSVSSFER FEIFPKESSW PNHNTN-GVT AACSHEGKSS FYRNLLWLTE KEGSYPKLKN 179

27. QLSSVSSLER FEIFPKESSW PNHTFN-GVT VSCSHRGKSS FYRNLLWLTK KGDSYPKLTN 179

28. QLSSVSSFEK FEIFPKTSSW PNHETTKGVT AACSYAGASS FYRNLLWLTK KGSSYPKLSK 180

1. SYANNKEKEV LVLWGVHHPP NIGDQRALYH KENAYVSWS SHYSRKFTPE IAKRPKVRDQ 239

2. SYANNKEKEV LVLWGVHHPP NIGNQKALYH TENAYVSWS SHYSRKFTPE IAKRPKVRDQ 239

3. SYVNNKEKEV LVLWGVHHPP NIGNQRALYH TENAYVSWS SHYSRRFTPE IAKRPKVRDQ 239

4. SYINDKGKEV LVLWGIHHPS TSADQQSLYQ NADAYVFVGS SRYSKKFKPE IAIRPKVRXX 240

5. SYTNNKGKEV LVIWGVHHPP TDSVQQTLYQ NKHTYVSVGS SKYYKRFTPE IVARPKVRGQ 240

6. SYTNNKGKEV LVIWGVHHPP TDSDQQTLYQ NNHTYVSVGS SKYYQRFTPE IVTRPKVRGQ 240

7. SYANNKEKEV LVLWGVHHPP NIGDQRALYH TENAYVSWS SHYSRRFTPE IAKRPKVRDQ 239

8. SYANNKEKEV LVLWGVHHPP NIGDQRALYH KENAYVSWS SHYSRKFTPE IAKRPKVRDQ 239

9. SYVNKKGKEV LVLWGVHHPS NMGDQRAIYH KENAYVSVLS SHYSRRFTPE IAKRPKVRDQ 240

10. SYVNNKEKEV LVLWGVHHPS NIGDQRAIYH TENAYVSWS SHYSRRFTPE ITKRPKVRDQ 240

11. SYVNNKEKEV

IAKRPKVRGQ 239

12. SYVNNKEKEV

IAKRPKVRDQ 240

13. SYVNNKEKEV

IAKRPKVRDQ 240

14. SYVNNKEKEV

IAKRPKVRNQ 240

15. SYVNDKEKEV

IAKRPKVRDQ 240

16. SYVNNKEKEV

IAKRPKVRGQ 240

17. SYVNNKEKEV

IAERPKVRGQ 240

18. SYVNNKEKEV

IAKRPKVRDQ 240

19. SYVNNQEKEV

IAKRPKVRDQ 239

20. SYVNNKEKEV

IAERPKVRGQ 240

21. SYVNNKEKEV

IAERPKVRGQ 240

22. SYVNKKEKEV

IAERPKVRGQ 240

23. SYVNKKGKEV

IAERPKVRDQ 240

24. SYVNKKGKEV

IAERPKVRGQ 239

25. SYVNKKGKEV

IAERPKVRGQ 240

26. SYVNKKGKEV

IAERPKVRDQ 239

27. SYVNNKGKEV

IAARPKVKDQ 239

28. SYVNNKGKEV

LVLWGVHHPS	NIRDQRAIYH	TENAYVSWS	SHYSRRFTPE
LVLWGVHHPS	NIGDQRAIYH	TENAYVSWS	SHYSRRFTPE
LVLWGVHHPS	NIGDQRAIYH	TENAYVSWS	SHYNRRFTPE
LVLWGVHHPS	NIEDQKTIYR	KENAYVSWS	SHYNRRFTPE
LVLWGVHHPS	NIEDQKTIYR	KENAYVSWS	SHYNRRFTPE
LVLWGVHHPS	NIEDQKTIYR	KENAYVSWS	SNYNRRFTPE
LVLWGVHHPS	NIEDQKTIYR	KENAYVSWS	SNYNRRFTPE
LVLWGVHHPS	NIGDQRAIYH	TENAYVSWS	SHYNRRFTPE
LVLWGVHHPS	NIEEQRALYR	KDNAYVSWS	SNYNRRFTPE
LVLWGVHHPS	NIEDQKTLYR	KENAYVSWS	SNYNRRFTPE
LVLWGVHHPS	NIEDQKTLYR	KENAYVSWS	SNYNRRFTPE
LILWGVHHPP	NIENQKTLYR	KENAYVSWS	SNYNRRFTPE
LVLWGVHHPS	SIKEQQTLYQ	KENAYVSWS	SNYNRRFTPE
LVLWGVHHPS	NIKDQQTLYQ	KENAYVSWS	SNYNRRFTPE
LVLWGVHHPS	NIKDQQTLYQ	KENAYVSWS	SNYNRRFTPE
LVLWGIHHPP	NSKEQQNLYQ	NENAYVSWT	SNYNRRFTPE
LVLWGVHHPS	SSDEQQSLYS	NGNAYVSVAS	SNYNRRFTPE
LVLWGVHHPP	TGTDQQSLYQ	NADAYVSVGS	SKYNRRFTPE

IAARPKVRDQ 240

1. EGRINYYWTL LEPGDTIIFE ANGNLIAPRY AFALSRGFGS GIINSNAPMD

ECDAKCQTPQ 299

2. EGRINYYWTL LEPGDTIIFE ANGNLIAPRY AFALSRGFGS GIINSNAPMD KCDAKCQTPQ 299

3. EGRINYYWTL LEPGDTIIFE ANGNLIAPWY AFALSRGFGS GIITSNAPMD ECDAKCQTPQ 299

4. EGRMNYYWTL VEPGDKITFE ATGNLWPRY AFAMERNAGS GIIISDTPVH DCNTTCQTPK 300

5. AGRMNYYWTL FDQGDTITFE ATGNLIAPWH AFALKKGSSS GIMLSDAQVH NCTTKCQTPH 300

6. AGRMNYYWTL LDQGDTITFE ATGNLIAPWH AFALNKGPSS GIMISDAHVH NCTTKCQTPH 300

7. EGRINYYWTL LEPGDTIIFE ANGNLIAPRE AFALSRGFGS GIITSNAPMD ECDAKCQTPQ 299

8. EGRINYYWTL LEPGDTIIFE ANGNLIAPRY AFALSRGFGS GIINSNAPMD

ECDAKCQTPQ 299

9. EGRINYYWTL LEPGDTIIFE ANGNLIAPWY AFALSRGFGS GIIISNASMG

ECDAKCQTPQ 300

10. EGRINYYWTL LEPGDTIIFE ANGNLIAPWY AFALSRGFGS GIITSNASMG ECDAKCQTPQ 300

11. EGRINYYWTL LEPGDTIIFE ANGNLIAPWY AFALSRGFGS GIITSNAPMN ECDAKCQTPQ 299

12. EGRINYYWTL LEPGDTIIFE ANGNLIAPWY AFALSRGFGS GIITSNASMD

ECDAKCQTPQ 300

13. EGRINYYWTL LEPGDTIIFE ANGNLIAPWY AFALSRGFGS GIITSNASMD ECDAKCQTPQ 300

14. EGRINYYWTL LEPGDTIIFE ANGNLIAPWY AFALSRGFGS GIITSNASMD ECDAKCQTPQ 300

15. EGRINYYWTL LEPGDTIIFE ANGNLIAPWY AFALSRGFGS GIITSNVSMD ECDAKCQTPQ 300

16. EGRINYYWTL LEPGDTIIFE ANGNLIAPWY AFALSRGFGS GIITSNASMD ECDTKCQTPQ 300

17. AGRINYYWTL LEPGDTIIFE ANGNLIAPWH AFALNRGFGS GIITSNASMD

ECDTKCQTPQ 300

18. EGRINYYWTL LEPGDTIIFE ANGNLIAPWY AFALSRGFGS GIITSNASMD ECDAKCQTPQ 300

19. SGRMNYYWTL LEPGDTIIFE ATGNLIAPWY AFALSRGPGS GIITSNAPLD ECDTKCQTPQ 299

20. AGRINYYWTL LEPGDTIIFE ANGNLIAPWH AFALSRGFGS GIITSNASMD ECDTKCQTPQ 300

21. AGRINYYWTL LEPGDTIIFE ANGNLIAPWY AFALSRDFGS GIITSNASMD ECDTKCQTPQ 300

22. AGRINYYWTL LEPGDTIIFE ANGNLIAPWY AFALNRGIGS GIITSNASMD ECDTKCQTPQ 300

23. AGRMNYYWTL LEPGDTIIFE ANGNLIAPWY AFALSRGFGS GIITSNASMH ECDTKCQTPQ 300

24. AGRINYYWTL LKPGDTIMFE ANGNLIAPWY AFALSRGFGS GIITSNASMH ECDTKCQTPQ 299

25. AGRMNYYWTL LEPGDTIIFE ANGNLIAPWY AFALSRGFGS GIITSNASMH ECNTKCQTPQ 300

26. AGRMNYYWTL LKPGDTIIFE ANGNLIAPMY AFALRRGFGS GIITSNASMH ECNTKCQTPL 299

27. HGRMNYYWTL LEPGDTIIFE ATGNLIAPWY AFALSRGFES GIITSNASMH ECNTKCQTPQ 299

28. AGRMNYYWTL LEPGDTITFE ATGNLIAPWY AFALNRGSGS GIITSDAPVH DCNTKCQTPH 300

1. GAINSSLPFQ NVHPVTIGEC PKYVRSAKLR MVTGLRNIPS IQSRGLFGAI AGFIEGGWTG 359

2. GAINSSLPFQ NVHPVTIGEC PKYVRSAKLR MVTGLRNIPS IQSRGLFGAI AGFIEGGWTG 359

3. GAINSSLPFQ NVHPVTIGEC PKYVRSAKLR MVTGLRNIPS IQSRGLFGAI AGFIEGGWTG 359

4. GAINTSLPFQ NIHPITIGKC PKYVKSTKLR LATGLRNIPS IQSRGLFGAI AGFIEGGWTG 360

5. GALKNNLPLQ NVHLFTIGEC PKYVKSTQLR MATGLRNIPS IQSRGLFGAI AGFIEGGRTG 360

6. GALKSNLPFQ NVHPSTIGEC PKYVKSTQLR MATGLRNIPS IQSRGLFGAI AGFIEGGWTG 360

7. GAINSSLPFQ NVHPVTIGEC PKYVRSAKLR MVTGLRNIPS IQSRGLFGAI AGFIEGGWTG 359

8. GAINSSLPFQ NVHPVTIGEC PKYVRSAKLR MVTGLRNIPS IQSRGLFGAI AGFIEGGWTG 359

9. GAINSSLPFQ NVHPVTIGEC PKYVRSTKLR MVTGLRNVPS IQSRGLFGAI AGFIEGGWTG 360

10. GAINSSLPFQ NVHPVTIGEC PKYVRSTKLR MVTGLRNIPS IQSRGLFGAI AGFIEGGWTG 360

11. GAINSSLPFQ NVHPVTIGEC PKYVRSTKLR MVTGLRNIPS IQSRGLFGAI AGFIEGGWTG 359

12. GAINSSLPFQ NVHPVTIGEC PKYVRSTKLR MVTGLRNIPS IQSRGLFGAI AGFIEGGWTG 360

13. GAINSSLPFQ NVHPVTIGEC PKYVRSTKLR MVTGLRNIPS IQSRGLFGAI AGFIEGGWTG 360

14. GAINSSLPFQ NVHPVTIGEC PKYVRSTKLR MVTGLRNIPS IQSRGLFGAI AGFIEGGWTG 360

15. GAINSSLPFQ NVHPVTIGEC PKYVRSTKLR MVTGLRNIPS IQSRGLFGAI AGFIEGGWTG 360

16. GAINSSLPFQ NVHPVTIGEC PKYVRSTKLR MVTGLRNIPS IQSRGLFGAI AGFIEGGWTG 360

17. GAINSSLPFQ NIHPVTIGEC PKYVRSTKLR MVTGLRNIPS IQSRGLFGAI AGFIEGGWTG 360

18. GAINSSLPFQ NVHPVTIGEC PKYVRSTKLR MVTGLRNIPS IQSRGLFGAI AGFIEGGWTG 360

19. GAINSSLPFQ NIHPVTIGEC PKYVRSTKLR MVTGLRNIPS VQSRGLFGAI AGFIEGGWTG 359

20. GAINSSLPFQ NIHPVTIGEC PKYVRSTKLR MVTGLRNIPS IQSRGLFGAI AGFIEGGWTG 360

21. GAINSSLPFQ NIHPVTIGEC PKYVRSTKLR MVTGLRNIPS IQSRGLFGAI AGFIEGGWTG 360

22. GAINSSLPFQ NIHPFTIGEC PKYVRSTKLR MVTGLRNIPS IQSRGLFGAI AGFIEGGWDG 360

23. GAINSSLPFQ NIHPVTIGEC PKYVRSTKLR MVTGLRNIPS IQSRGLFGAI AGFIEGGWTG 360

24. GAINSSLPFQ NIHPVTIGEC PKYVRSTKLR MVTGLRNIPS IQSRGLFGAI AGFIEGGWTG 359

25. GAINSSLPFQ

NIHPVTIGEC

PKYVRSTKLR

MVTGLRNIPS

IQSRGLFGAI

AGFIEGGWTG 360

26. GAINSSLPYQ

NIHPVTIGEC

PKYVRSAKLR

MVTGLRNIPS

IQSRGLFGAI

AGFIEGGWTG 359

27. GSINSNLPFQ

NIHPVTIGEC

PKYVRSTKLR

MVTGLRNIPS

IQYRGLFGAI

AGFIEGGWTG 359

28. GAINSSLPFQ

NIHPVTIGEC

PKYVRSTKLR

MATGLRNIPS

IQSRGLFGAI

AGFIEGGWTG 360

MVDGWYGYHH

QNEQGSGYAA

DQKSTQNAIN

GITNKVNSVI

EKMNTQFTAV

GKEFNKLERR 419

MVDGWYGYHH

QNEQGSGYAA

DQKSTQNAIN

GITNKVNSVI

EKMNTQFTAV

GKEFNKLERR 419

3. MVDGWYGYHH

QNEQGSGYAA

DQKSTQNAIN

GITNKVNSVI

EKMNTQFTAV

GKEFNKLERR 419 . MVDGWYGYHH

QNEQGSGYAA

DLKSTQNAID

EITNKVNSVI

EKMNTQFTAV

GKEFNHLEKR 420

5. MIDGWYGYHH

QNEQGSGYAA

DQKSTQIAID

GINNKANSVI

GKMNIQLTSV

GKEFNSLEKR 420

6. MIDGWYGYHH

QNEQGSGYAA

DQKSTQIAID

GINNKVNSII

EKMNTQFTSV

GKEFNDLEKR 420 . MVDGWYGYHH

QNEQGSGYAA

DQKSTQNAIN

GITNKVNSVI

EKMNTQFTAV

GKEFNKLERR 419

MVDGWYGYHH

QNEQGSGYAA

DQKSTQNAIN

GITNKVNSVI

EKMNTQFTAV

GKEFNKLERR 419

9.

MIDGWYGYHH

QNEQGSGYAA

DQKSTQNAIN

GITNKVNSII

EKMNTQFTAV

GKEFNKLERR 420

10.

MIDGWYGYHH

QNEQGSGYAA

DQKSTQNAID

GITNKVNSVI

EKMNTQFTAV

GKEFNKLERR 420 .

MMDGWYGYHH

QNEQGSGYAA

DQKSTQNAIN

GITNKVNSVI

EKMNTQFTAV

GKEFNKLERR 419

12. MIDGWYGYHH

QNEQGSGYAA

DQKSTQNAIN

GITNKVNSVI

EKMNTQFTAV

GKEFNKLERR 420

13. MIDGWYGYHH

QNEQGSGYAA

DQKSTQNAIN

GITNKVNSVI

EKMNTQFTAV

GKEFNKLERR 420

14. MIDGWYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAIN GITNKVNSII EKMNTQFTAV GKEFNKLEKR 420

15. MIDGWYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAIN GITNKVNSVI EKMNTQFTAV GKEFNKLEKR 420

16. MIDGWYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAIN GITNKVNSVI EKMNTQFTAV GKEFNKLEKR 420

17. MIDGWYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAIN GITNKVNSVI EKMNTQFTAV GKEFNKLEKR 420

18. MIDGWYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAIN GITNKVNSVI EKMNTQFTAV GKEFNKLERR 420

19. MMDGWYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAIN GITNKVNSVI EKMNTQFTAV GKEFNKLEKR 419

20. MIDGWYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAIN GITNKVNSVI EKMNTQFTAV GKEFNKLEKR 420

21. MIDGWYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAIN WITNKVNSVI EKMNTQFTAV GKEFNKLEKR 420

22. MIDGWYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAIN GITNKVNSVI EKMNTQFTAV GKEFNKLEKR 420

23. MIDGWYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAIN GITNKVNSVI EKMNTQFTAV GKEFNNLEKR 420

24. MIDGWYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAIN GITNKVNSVI EKMNTQFTAV GKEFNNLEKR 419

25. MIDGWYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAIN GITNKVNSVI EKMNTQFTAV GKEFNNLEKR 420

26. MIDGWYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAIN GITNKVNSVI EKMNTQFTAV GKEFNKLEKR 419

27. MIDGWYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAIN GITNKVNSVI EKMNTQFTAV GKEFNNLEKR 419

28. MIDGWYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAID GITNKVNSVI EKMNTQFTAV GKEFNNLERR 420

1. MENLNKKVDD GFIDIWTYNA ELLVLLENER TLDFHDSNVK NLYEKVKSQL KNNAKEIGNG 479

2. MENLNKKVDD GFIDIWTYNA ELLVLLENER TLDFHDSNVK NLYEKVKSQL

KNNAKEIGNG 479

3. MENLNKKVDD

GFLDIWTYNA

ELLVLLENER

TLDFHDSNVK

NLYEKVKSQL

KNNAKEIGNG 479 . IENLNKKVDD

GFLDIWTYNA

ELLVLLENER

TLDYHDSNVK

NLYEKVRSQL

KNNAKEIGNG 480

5. KENLNKTVDD

RFLDVWTFNA

ELLVLLENQR

TLEFHDLNIK

SLYEKVKSHL

RNNDKEIGNG 480

6.

IENLNKKVDD

GFLDVWTYNA

ELLILLENER

TLDFHDFNVK

NLYEKVKSQL

RNNAKEIGNG 480 . MENLNKKVDD

GFLDIWTYNA

ELLVLLENER

TLDFHDSNVK

NLYEKVKSQL

KNNAKEIGNG 479

MENLNKKVDD

GFIDIWTYNA

ELLVLLENER

TLDFHDSNVK

NLYEKVKSQL

KNNAKEIGNG 479

9.

MENLNKKVDD

GFLDIWTYNA

ELLVLLENER

TLDFHDLNVK

NLYEKVKNQL

KNNAKEIGNG 480 . MENLNKKVDD

GFLDIWTYNA

ELLVLLENER

TLDFHDSNVK

NLYEKVKTQL

KNNAKEIGNG 480 . MENLNKKVDD

GFLDIWTYNA

ELLVLLENER

TLDFHDSNVK

NLYEKVKSQL

KNNAKEIGNG 479 .

MENLNKKVDD

GFLDIWTYNA

ELLVLLENGR

TLDFHDSNVK

NLYEKVKSQL

KNNAKEIGNG 480

13.

MENLNKKVDD

GFLDIWTYNA

ELLVLLENER

TLDFHDSNVK

NLYEKVKSQL

KNNAKEIGNG 480 . MENLNKKVDD

GFLDIWTYNA

ELLVLLENER

TLDFHDSNVK

NLYEKVKSQL

KNNAKEIGNG 480 . MENLNKKVDD

GFLDIWTYNA

ELLVLLENER

TLDFHDSNVK

NLYEKVKSQL

KNNAKEIGNG 480 . MENLNKKVDD

GFLDIWTYNA

ELLVLLENER

TLDFHDSNVK

NLYEKVKSQL

KNNAKEIGNG 480 .

MENLNKKVDD

GFLDIWTYNA

ELLVLLENER

TLDFHDSNVK

NLYEKVKSQL

KNNAKEIGNG 480 . MENLNKKVDD

GFLDIWTYNA

ELLVLLENER

TLDFHDSNVK

NLYEKVKSQL

KNNAKEIGNG 480 . MENLNKKVDD

GFMDIWTYNA

ELLVLLENER

TLDFHDSNVK

NLYEKVKNQL

RNNAKELGNG 479

20.

MENLNKKVDD

GFLDIWTYNA

ELLVLLENER

TLDFHDSNVK

NLYEKVKSQL

KNNAKEIGNG 480 . MENLNKKVDD

GFLDIWTYNA

ELLVLLENER

TLDFHDSNVK

NLYEKVKNQL

RNNAKEIGNG 480

22. MENLNKKVDD

GFLDIWTYNA

ELLVLLENER

TLDFHDSNVK

NLYEKVKNQL

RNNAKEIGNG 480

23.

MENLNKKVDD

GFLDIWTYNA

ELLILLENER

TLDFHDSNVK

NLYEKVKSQL

RNNAKEIGNG 480 .

MENLNKKVDD

GFLDIWTYNA

ELLVLLENER

TLDFHDSNVK

NLYEKVKNQL

RNNAKEIGNG 479

5 . MENLNKKVDD

GFLDIWTYNA

ELLVLLENER

TLDFHDSNVK

NLYEKVKSQL

RNNAKEIGNG 480

6 . MENLNNKVDD

GFLDIWTYNA

ELLVLLENER

TLDFHDSNVK

NLYEKVKSQL

RNNAKEIGNG 479 .

MENLNKKVDD

GFLDIWTYNA

ELLVLLENER

TLDFHDLNVK

NLYEKVKSQL

RNNAKEIGNG 479

28. IENLNKKVDD

GFLDIWTYNA

ELLVLLENER

TLDFHDSNVR

NLYEKVKSQL

RNNAKEIGNG 480

1. CFEFYHKCND ECMESVKNGT YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI

LAIYSTVASS 539

2. CFEFYHKCND ECMESVKNGT YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI

LAIYSTVASS 539

3. CFEFYHKCNN ECMESVKNGT YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI

LAIYSTVASS 539

4. CFEFYHKCDN TCMESVKNGT YDYPKYSEEA KLNREEIDGV KLESTRIYQI

LAIYSTVASS 540

5. CFEFYHKRDN ECLECVKNGT YNYPKYSEES KFNREEIVGV KLESMGIHQI

LAIYSTVASS 540

6. CFEFYHKCDN ECMESVKNGT YNYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVHQI

LAIYSTVASS 540

7. CFEFYHKCND ECMESVKNGT YDYPKYSEES KLNRERIDGV KLESMGVYQI

LAIYSTVASS 539

8. CFEFYHKCND ECMESVKNGT YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI

LAIYSTVASS 539

9. CFEFYHKCNN ECMESVKNGT YDYPKYSKES KLNREKIDGV KLESMGVYQI

LAIYSTVASS 540

10. CFEFYHKCNN ECMESVKNGT YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASS 540

11. CFEFYHKCNN ECMESVKNGT YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASS 539

12. CFEFYHKCNN ECMESVKNGT YDYPKYSEES KLNRGKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASS 540

13. CFEFYHKCNN ECMESVKNGT YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASS 540

14. CFEFYHKCNN ECMESVKNGT YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASS 540

15. CFEFYHKCNN ECMESVKNGT YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASS 540

16. CFEFYHKCNN ECMESVKNGT YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASS 540

17. CFEFYHKCNN ECMESVKNGT YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAI YSTVASS 54 0

18. CFEFYHKCNN ECMESVKNGT YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASS 540

19. CFEFYHKCDN ECMESVKNGT YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYRI LAIYSTVASS 539

20. CFEFYHKCNN ECMESVKNGT YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASS 540

21. CFEFYHKCNN ECMESVKNGT YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASS 540

22. CFEFYHKCNN ECMESVKNGT YDYPKFSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASS 540

23. CFEFYHKCNN ECMESVKNGT YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASS 540

24. CFEFYHKCNN ECMESVKNGT YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTAASS 539

25. CFEFYHKCNN ECMESVKNGT YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASS 540

26. CFEFYHKCDN ECMESVRNGT YDYPKYSEES KLNREKVDGV KLESMGIYQI

LAIYSTVASS 539

27. CFEFYHKCDN ECMESVRNGT YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI

LAIYSTVASS 539

28. CFEFYHKCDD ACMESVRNGT YDYPKYSEES KLNREEIDGV KLESMGVYQI

LAIYSTVASS 540

YY 4c

1.	LVLLVSLGAI	SFWMCSNGSL	QCRICI	565
2 .	LVLLVSLGAI	SFWMCSNGSL	QCRICI	565
3.	LVLLVSLGAI	SFWMCSNGSL	QCRICI	565
4 .	LVLWSLGAI	SFWMCSNGSL	QCRICI	566
5.	LVLLVSLGAI	SFWMCSNGSL	QCRVCI	566
6.	LVLLVSLGAI	SFWMCSNGSL	QCRICI	566
7 .	LVLLVSLGAI	SFWMCSNGSL	QCRICI	565
8 .	LVLLVSLGAI	SFWMCSNGSL	QCRICI	565
9.	LVLLVSLGAI	SFWMCSNGSL	QCRICI	566

10. LVLLVSLGAI SFWMCSNGSL QCRICI566

11. LVLLVSLGAI SFWMCSNGSL QCRICI565

12. LVLLVSLGAI SFWMCSNGSL QCRICI566

13. LVLLVSLGAI SFWMCSNGSL QCRICI566

14. LVLLVSLGAI SFWMCSNGSL QCRICI566

15. LVLLVSLGAI SFWMCSNGSL QCRICI566

16. LVLLVSLGAI SFWMCSNGSL QCRICI566

17. LVLLVSLGAI SFWMCSNGSL QCRICI566

18. LVLLVSLGAI SFWMCSNGSL QCRICI566

19. LVLLVSLGAI SFWMCSNGSL QCRICI565

20. LVLLVSLGAI SFWMCSNGSL QCRICI566

21. LVLLVSLGAI SFWMCSNGSL QCRICI566

22. LVLLVSLGAI SFWMCSNGSL QCRICI566

23. LVLLVSLGAI SFWMCSNGSL QCRICI566

24. LVLLVSLGAI SFWMCSNGSL QCRICI565

25. LVLLVSLGAI SFWMCSNGSL QCRICI566

26. LVLLVSLGAI SFWMCSNGSL QCRICI565

27. LVLLVSLGAI SFWMCSNGSL QCRICI565

28. LVLLVSLGAI SFWMCSNGSL QCRICI566

Таблица 3

Полипептиды, экспрессированные в P. pastoris. Экспрессию и связывание с CR6261 определяли согласно описанному и рассчитывали соотношение сигналов связывания и экспрессии

SET1

Fusion peptide area

В-1оор

337

340

352

353

402

406

409

413

416

clone

CR6261 binding signal

HTRF signal

ratio

fold increase of ratio over parental Hl mini-HA

E, 1, К, V

1, К, R, Т

D, F, V, Y

1, К, R, Т

Е, К, Μ, V

F, 1, N, S, Т, Y

A, G, 1, R, Т, V

F, 1, N, S, Τ,Υ

Η, 1, L, Ν, R, S

' 239Е11

1076944

1492

721,81

121,52

К

1

γ

Т

м

F

1

Ν

R

127Н1

800024

6572

121,73

20,49

К

F

т

м

γ

I

γ

S

' 171Е5

879704

11508

76,44

12,87

К

т

F

т

м

I

А

F

S

239D2

570424

9279

61,47

10,35

К

к

F

т

м

I

V

F

Ν

247В2

414984

7583

54,73

9,21

К

|

γ

7

V

γ

|

F

S

253 D4

395824

7546

52,45

8,83

К

т

F

Т

м

γ

А

γ

Н

252F5

421824

8621

48,93

8,24

V

к

γ

Т

м

γ

V

γ

Ν

220С9

1086064

22606

48,04

8,09

К

т

F

Т

м

F

Т

γ

L

125D3

139824

2937

47,61

8,02

К

к

F

т

м

Y

G

т

Н

137С11

416504

9167

45,44

7,65

V

к

F

т

м

γ

|

Ν

Н

131В5

844344

20419

41,35

6,96

К

т

F

т

м

I

V

γ

Н

233F11

583024

14389

40,52

6,82

К

к

γ

т

м

т

|

G

S

234С5

377864

9465

39,92

6,72

I

γ

т

м

F

Т

Ν

L

115 Al

1176904

30389

38,73

6,52

К

к

γ

т

м

I

V

γ

|

185G7

505864

13560

37,31

6,28

К

к

γ

т

м

I

V

|

S

275D4

327344

9030

36,25

6,10

К

к

γ

т

м

т

S

244В8

273744

7757

35,29

5,94

|

т

γ

т

м

γ

А

|

S

252В8

284984

8252

34,54

5,81

К

I

γ

т

м

S

|

Ν

L

213С11

667024

20624

32,34

5,44

V

к

γ

т

м

I

V

F

Н

174G3

491184

15320

32,06

5,40

К

т

γ

к

V

S

G

γ

L

125D10

133904

4241

31,57

5,31

К

|

γ

т

м

γ

V

Ν

R

127А7

233064

7498

31,08

5,23

Е

т

γ

т

м

I

|

L

304G11

110504

3588

30,8

5,19

К

к

γ

к

м

F

Т

F

S

162А11

364024

11939

30,49

5,13

V

к

γ

т

м

F

А

F

|

271F10

315304

10348

30,47

5,13

|

к

γ

т

м

|

А

|

L

218G11

958504

33710

28,43

4,79

|

т

γ

I

м

I

|

I

Ν

251С8

269544

9634

27,98

4,71

К

т

γ

к

м

γ

|

Ν

L

258А6

165624

6004

27,59

4,64

|

т

γ

т

м

γ

Т

F

Н

134А4

456304

17366

26,28

4,42

К

I

γ

I

м

I

А

γ

Ν

214С11

317904

12120

26,23

4,42

Е

|

γ

т

м

γ

V

S

182G8

399864

15262

26,2

4,41

К

γ

т

м

Т

V

|

113Е7

966064

38018

25,41

4,28

К

F

т

м

γ

т

I

Н

230G9

854584

34093

25,07

4,22

К

γ

т

м

γ

т

F

R

222G4

419064

16996

24,66

4,15

К

т

F

I

V

I

|

γ

L

182D7

418944

17096

24,51

4,13

|

т

γ

т

м

I

|

F

Ν

272Н2

263264

10844

24,28

4,09

К

т

γ

т

м

S

А

Ν

Н

191С8

309064

12753

24,23

4,08

|

т

γ

т

V

I

А

F

|

123С10

237824

9843

24,16

4,07

К

|

γ

к

м

F

А

Т

L

284В9

1663504

70812

23,49

3,95

К

т

Y

R

м

1

R

Т

L

134A3

531784

23414

22,71

3,82

к

F

I

м

I

|

Ν

S

188F4

287384

12888

22,3

3,75

к

γ

т

м

S

V

Т

Н

189В7

336344

15207

22,12

3,72

Е

т

F

т

м

γ

V

F

Ν

148D5

329144

14994

21,95

3,70

Е

т

γ

I

м

F

G

S

Н

194С8

242304

11113

21,8

3,67

|

т

F

т

м

F

V

F

|

188А8

279144

13001

21,47

3,61

К

т

γ

к

м

F

V

S

|

162ВЗ

279584

13159

21,25

3,58

V

т

γ

т

м

γ

т

Ν

204С5

832784

39330

21,17

3,56

V

к

F

т

V

|

γ

L

216Е5

334904

15873

21,1

3,55

V

т

F

т

м

F

R

Υ

R

129С2

199464

9486

21,03

3,54

V

R

γ

I

м

|

γ

S

286Е8

158704

7662

20,71

3,49

Е

I

F

т

м

F

|

γ

S

264G4

180504

8751

20,63

3,47

К

R

γ

т

V

|

V

F

S

214С4

302264

14709

20,55

3,46

|

F

т

V

F

А

S

125А8

212224

10327

20,55

3,46

К

1

F

т

V

1

V

Υ

1

123G2

498584

24442

20,4

3,43

|

Т

γ

|

м

γ

Т

F

L

187C6

345464

16932

20,4

3,43

E

К

γ

К

м

F

|

Н

134H10

591704

29253

20,23

3,41

К

т

γ

Т

V

|

Т

F

|

187H10

299224

15289

19,57

3,29

К

т

γ

|

м

I

G

F

L

101D4

336584

17243

19,52

3,29

1

к

γ

|

м

I

1

S

Ν

193B6

206904

10650

19,43

3,27

К

к

γ

R

м

F

1

S

Ν

137C5

295944

15406

19,21

3,23

1

R

F

Т

V

I

1

Ν

112 F3

449824

24169

18,61

3,13

V

R

F

|

м

I

1

γ

S

176A5

193104

10476

18,43

3,10

1

т

F

Т

V

F

1

F

|

213B2

131704

7178

18,35

3,09

К

к

γ

т

м

т

V

F

L

307A10

114984

6348

18,11

3,05

1

к

F

т

м

γ

G

γ

Н

126C3

219944

12413

17,72

2,98

Ε

т

F

|

м

F

G

Т

|

263B6

151184

8800

17,18

2,89

1

т

γ

|

м

S

т

γ

|

138F11

147864

8788

16,83

2,83

Ε

R

γ

R

м

F

V

F

L

134D3

303504

18129

16,74

2,82

Ε

R

F

|

м

γ

т

F

S

131D5

344504

20857

16,52

2,78

V

т

γ

|

V

|

А

F

S

138F8

347704

21081

16,49

2,78

К

т

γ

I

м

γ

А

F

Н

301F11

116904

7108

16,45

2,77

V

т

F

Т

V

γ

|

S

Н

112G6

543944

33149

16,41

2,76

V

R

γ

I

м

F

|

S

|

245C9

180024

10980

16,4

2,76

V

R

F

Т

V

F

V

Т

L

123 E2

477064

29184

16,35

2,75

V

Т

γ

Т

V

F

V

F

S

266A11

90584

5696

15,9

2,68

V

т

γ

Т

м

γ

|

Т

R

104C4

521224

34458

15,13

2,55

V

к

γ

|

м

F

G

F

Ν

194E4

408584

27424

14,9

2,51

Ε

к

F

Т

м

|

Т

F

|

206B11

358744

24697

14,53

2,45

V

R

γ

т

м

F

Т

|

L

192C4

343184

23932

14,34

2,41

К

т

Υ

к

м

1

V

Т

Ν

125H3

317384

22785

13,93

2,35

1

т

F

т

м

I

А

γ

R

145C9

182344

13108

13,91

2,34

1

т

F

I

V

γ

|

S

Ν

243D6

132144

9596

13,77

2,32

1

R

F

т

м

Ν

V

γ

R

182D3

142664

10487

13,6

2,29

1

т

γ

R

м

F

А

G

S

181H9

310504

23153

13,41

2,26

V

к

F

|

м

F

V

F

Ν

163 ЕЗ

183544

14033

13,08

2,20

Ε

к

γ

К

м

|

V

|

L

145 Е7

132224

10312

12,82

2,16

1

т

F

К

V

|

F

S

275G3

115104

9180

12,54

2,11

V

т

γ

|

м

Т

А

S

191D5

123824

10048

12,32

2,07

1

R

F

Т

м

Т

G

F

S

188G10

142504

11593

12,29

2,07

V

т

γ

|

V

|

А

F

S

171F6

140464

11555

12,16

2,05

К

т

γ

Т

м

S

Т

γ

L

125С2

83624

7009

11,93

2,01

1

|

F

т

V

|

Т

S

206В8

285824

24166

11,83

1,99

V

|

γ

т

м

I

т

F

Н

145 F2

498504

42457

11,74

1,98

1

К

F

т

м

F

R

F

S

199 F3

328504

29850

11,01

1,85

К

т

γ

т

м

Ν

G

S

181Н11

186664

17205

10,85

1,83

V

т

γ

т

м

|

Ν

R

188С8

113344

10520

10,77

1,81

1

к

γ

т

м

S

Т

γ

L

' 189Е10

188864

18252

10,35

1,74

К

т

γ

т

м

S

G

S

146G7

533864

52422

10,18

1,71

V

т

γ

I

м

γ

Т

|

182Н2

109624

10976

9,99

1,68

К

|

F

т

V

I

|

т

L

262В9

94744

9584

9,89

1,66

|

К

γ

т

м

F

R

F

R

' 145Е8

211504

21732

9,73

1,64

Е

к

F

к

V

|

V

F

|

249В11

145184

14995

9,68

1,63

К

к

F

т

м

S

Т

G

Н

182С6

92944

9939

9,35

1,57

К

R

D

|

м

F

|

Ν

SEQ ID NO: 6AV + 2SD

9,28

1,56

SEQ ID NO: 6 AV

238077

40100

5,94

1,00

Таблица 4

Полипептиды, экспрессированные в P. pastoris.

Экспрессию и связывание с CR6261 определяли согласно описанному и рассчитывали соотношение сигналов связывания и экспрессии

Set 2

Fusion peptide area

В-1оор

337

340

352

353

402

406

409

413

416

fold

increase

clone

CR6261 binding signal

HTRF signal

ratio

of ratio over parental

A, E, Ι,Κ,Τ, V

F, l,N,S, Т,

A, D, F, S,T,V,

, N,

E.G, l,K, R, V

M.R.T

F, H,L,Y

F, 1, S, Т

Е, К, M.V

I.L.R. S

SEQ ID

NO:6

86В4

1077144

13862

77,7

13,08

к

N

γ

К

М

F

1

М

1

7А7

987824

13452

73,43

12,36

т

N

γ

V

м

γ

F

Е

R

55G7

616184

8767

70,28

11,83

К

N

γ

V

м

γ

1

М

L

71Н2

1109984

16750

66,27

11,16

К

N

F

к

м

L

1

V

S

86ВЗ

900904

14448

62,35

10,50

К

N

γ

к

м

L

1

V

R

71А4

1064144

17597

60,47

10,18

т

N

γ

V

м

γ

F

Е

R

51G3

460304

7773

59,22

9,97

т

1

F

V

м

L

F

Е

S

84В8

582144

10091

57,69

9,71

к

N

γ

1

м

F

М

S

79С2

364184

7116

51,18

8,62

т

N

γ

R

м

F

Т

V

S

69G8

481344

9479

50,78

8,55

1

N

F

R

м

L

1

V

L

79D5

702584

13981

50,25

8,46

А

N

F

К

м

L

F

V

L

54Н4

291744

5857

49,81

8,39

К

1

γ

К

м

L

1

Е

L

11Н6

427384

9146

46,73

7,87

К

N

γ

Е

м

F

т

Е

S

90А9

413664

9025

45,84

7,72

К

S

γ

V

м

Y

т

V

S

75G5

1011384

26695

37,89

6,38

Е

S

γ

V

м

L

F

Е

R

8А10

360104

9630

37,39

6,29

К

N

γ

V

м

L

1

V

R

72D4

329944

8881

37,15

6,25

V

N

F

R

м

F

S

М

S

74Н9

1283144

35494

36,15

6,09

К

N

F

К

м

Y

F

М

S

88С5

471424

13355

35,3

5,94

К

N

γ

R

м

L

1

V

R

61А9

383064

10864

35,26

5,94

т

N

F

R

м

F

Е

L

86Н9

457344

13340

34,28

5,77

к

N

F

G

м

F

Т

V

S

71D3

1573024

46711

33,68

5,67

1

S

γ

V

м

F

1

V

L

9С6

270984

8235

32,91

5,54

к

т

γ

V

м

Y

т

К

1

81F11

317824

9964

31,9

5,37

к

1

F

V

м

F

V

S

84Е10

255064

7996

31,9

5,37

1

N

F

R

м

F

S

V

S

71С4

1350144

44339

30,45

5,13

к

N

F

G

м

F

1

V

S

84D3

84424

2920

28,91

4,87

Е

N

F

К

м

L

1

Е

S

96Н8

205904

7224

28,5

4,80

К

Y

К

м

F

1

М

S

85А7

235704

8416

28,01

4,72

К

N

γ

Е

м

L

F

V

R

50G10

264144

9470

27,89

4,70

т

N

F

Е

м

F

V

S

6А1

299824

10912

27,48

4,63

А

N

F

R

м

F

М

S

91С4

1157424

44837

25,81

4,35

К

N

F

G

м

L

1

М

R

2С4

258264

10139

25,47

4,29

1

N

F

V

м

F

1

V

L

63C3

188184

7625

24,68

4,15

Е

Т

Y

К

м

L

F

V

L

850

196024

8115

24,16

4,07

К

N

V

G

м

F

V

1

67С10

306104

12907

23,72

3,99

Е

Т

F

V

м

F

М

L

10F9

165984

7113

23,34

3,93

1

γ

V

м

γ

F

Е

R

4С1

385504

16548

23,3

3,92

К

N

S

V

м

F

1

Е

1

86G3

183944

7995

23,01

3,87

т

S

γ

V

м

F

Т

V

L

51G10

215264

9727

22,13

3,73

А

N

γ

R

м

F

1

К

S

58А5

90744

4142

21,91

3,69

V

Т

F

R

м

L

1

М

S

56F8

235344

10823

21,74

3,66

1

N

F

Е

м

F

т

Е

L

67С11

209184

9856

21,22

3,57

К

γ

1

м

F

Е

1

91С8

333584

16012

20,83

3,51

К

N

F

G

м

L

1

К

S

48В11

302864

14946

20,26

3,41

1

N

А

G

м

L

1

Е

S

78F11

84104

4155

20,24

3,41

1

F

R

м

Y

F

Е

1

76А10

136984

6841

20,02

3,37

1

Y

F

V

М

γ

F

Е

1

55Н2

58104

2984

19,47

3,28

1

Y

V

М

F

V

S

74D7

358784

18453

19,44

3,27

К

N

А

G

М

F

1

М

S

11В4

166464

8679

19,18

3,23

т

S

F

V

М

Y

т

V

S

56F4

185984

9740

19,09

3,21

т

F

Е

М

F

S

м

S

71Е7

202704

10688

18,97

3,19

к

N

S

R

М

Y

1

Е

S

48В10

102904

5480

18,78

3,16

1

F

К

М

L

F

М

S

48D11

120584

6807

17,71

2,98

Е

Y

V

М

F

т

V

S

35H3

106224

6092

17,44

2,94

V

S

F

V

М

L

S

м

R

53G10

107784

6188

17,42

2,93

т

N

F

V

М

L

т

V

S

86F1

158624

9145

17,35

2,92

1

F

V

М

Y

1

V

|

9С10

114144

6595

17,31

2,91

1

Y

V

М

н

S

V

S

6Е12

372504

22044

16,9

2,85

Е

N

F

1

М

L

F

V

L

2D9

316024

19245

16,42

2,76

К

N

1

М

Y

F

Е

L

27В10

187344

11465

16,34

2,75

К

N

V

М

L

F

Е

S

79F8

185264

11801

15,7

2,64

1

N

V

1

м

F

Т

Е

S

11F4

150824

9996

15,09

2,54

1

Y

F

V

м

Y

F

V

L

60А2

92664

6166

15,03

2,53

Е

N

Y

V

м

F

S

Е

L

58С8

277144

18603

14,9

2,51

А

S

Y

1

м

L

S

Е

L

12С6

289184

20023

14,44

2,43

1

N

S

V

м

L

1

Е

L

89F11

84824

5908

14,36

2,42

Т

1

Y

1

м

L

S

V

S

96G5

108264

7589

14,27

2,40

V

N

F

1

м

Y

F

м

S

29С2

177904

12921

13,77

2,32

к

N

F

G

м

Y

F

м

R

56D2

145624

10658

13,66

2,30

Е

Т

F

1

м

F

к

S

66С8

184544

13591

13,58

2,29

К

N

V

1

м

L

F

V

L

69D2

445704

34266

13,01

2,19

V

F

V

м

Y

Т

Е

S

75 Е9

134504

10422

12,91

2,17

1

F

G

м

F

S

Е

1

97G10

253104

20061

12,62

2,12

Е

S

F

1

м

F

Е

|

36Е4

196104

15917

12,32

2,07

1

N

к

м

F

V

L

7D9

77824

6320

12,31

2,07

к

N

F

V

м

F

м

L

1F2

148544

12244

12,13

2,04

к

N

Y

V

м

F

м

1

76D10

113664

9729

11,68

1,97

т

N

А

к

м

L

Т

Е

S

36Н2

171144

14761

11,59

1,95

т

N

Y

к

м

Н

F

м

R

86G2

69704

6069

11,49

1,93

Е

N

F

V

м

L

1

Е

R

63 D3

145784

13100

11,13

1,87

К

N

1

G

м

F

Т

Е

L

96А7

83304

7575

11

1,85

V

1

F

V

м

F

S

V

S

36D6

71304

6569

10,85

1,83

1

N

А

G

м

F

т

Е

|

91F10

14784

1394

10,6

1,78

т

N

Y

G

м

F

1

Е

R

80F10

90864

8609

10,55

1,78

1

S

V

м

L

1

Е

S

75 Н8

103304

10074

10,25

1,73

А

N

V

м

F

М

S

57В8

58384

5800

10,07

1,70

К

1

Y

1

м

F

V

1

8D7

73424

7324

10,03

1,69

к

N

F

V

м

L

F

Е

L

58А11

53264

5363

9,93

1,67

V

Т

Y

1

м

F

Т

V

S

7В6

60384

6137

9,84

1,66

к

1

S

Е

м

F

1

м

S

87Н5

78104

7994

9,77

1,64

Е

1

F

1

м

F

V

S

70F6

418624

43334

9,66

1,63

К

N

1

G

м

L

Т

Е

R

26Н1

79744

8268

9,64

1,62

Е

N

F

1

м

L

S

V

1

78G2

56704

6055

9,36

1,58

V

1

Y

G

м

L

F

Е

S

SEQ ID NO: 6 AV + 2SD 9,28 1,56

SEQ ID Νθ| 23807?! 4QlQo| 5,9д| 1,00

Таблица 5

Полипептиды, экспрессированные в HEK293F.

Экспрессию и связывание с CR6261 определяли согласно описанному и рассчитывали соотношение сигналов связывания и включенные в каждый клон, указаны в табл. 4 и 5

Clone	CR6261 binding signal	HTRF signal	ratio	fold increase of ratio over parental SEQ ID NO: 6
127Н1	24150000	327363	73,77	4,25
86В4	19970680	334887	59,63	3,44
^Т 171Е5	6625080	235511	28,13	1,62
7А7	6191080	242461	25,53	1,47
71Н2	21080360	336346	62,67	3,61
220С9	8493560	162872	52,15	3,00
131В5	5725640	139561	41,03	2,36
115А1	9557640	175377	54,50	3,14
74Н9	26144240	344988	75,78	4,37
71С4	6413600	214495	29,90	1,72
91С4	8442400	245138	34,44	1,98
' 113Е7	13005960	260748	49,88	2,87
' 6Е12	15326000	309443	49,53	2,85
181Н9	11892520	324690	36,63	2,11
SEQIDN0:6AV	5661550	326077	17,36	1,00

Таблица 6

Вариабельность природной последовательности в указанных положениях в % от общего числа последовательностей для каждого подтипа

Положение	Аминокислота	Н1	НЗ	Н5	Н7
337	V	67	99	19	100
	I	32	1	2
	Т	0,8		3
	S			73
	Y			0,1
	N			0,5
	А			2
	G			0,1

340	I	99		21	98
	V	0,43
	Т	0,03	0,5
	К		97
	R		2	47
	G			29
	Е			0,3
	S				2

352	F	100	100	100	100

353	I	99,9	100	100	100
	L	0,1

402	М	100		100
	Т		99, 8		100
	S		0,0 2

Очистка и сила связывания с mAb полипептидов

Таблица 7

	SEQ ID NO:	Объем надосадочной жидкости (мл)	Выход (мг/л культуры)	Чистота по HPSEC (%)	K_d ^a₽P CR6261 (нМ)	K_d ^aPP CR9114 (нМ)
S127H1	35	1376	9, 0	100, 0	130	10
s86B4	36	1380	9, 0	96, 0	150	13
s 55G7	37	1460	18,1	100, 0	150	9
s74H9	34	1335	11,3	99,7	130	10
s6E12	38	1479	13,1	90, 8	390	34

В табл. 8 приведены значения молекулярного веса, определенные с помощью SEC-MALS, для полипептидов по настоящему изобретению и их комплексов с Fab-фрагментами CR6261 и CR9114. Теоретические (теор.) значения оценивают на основании последовательности полипептида по настоящему изобретению (предполагая мономер) и дополнительного вклада приблизительно 10 кДа от присоединенных гликанов. Значения молекулярного веса Fab-фрагментов CR6261, CR9114 и CR8020 также определяли с помощью SEC-MALS, и они составили 48, 49 и 47 кДа соответственно.

Таблица 8

	SEQ ID NO:	Мол. вес (кДа)	Мол. вес комплекса с CR6261 (кДа)	Мол. вес комплекса с CR9114 (кДа)
		Теор.	Наблюдаемый	Теор.	Наблюдаемый	Теор.	Наблюдаемый
S127H1	35	40	39	87	74	86	83
s86B4	36	40	40	88	75	87	83
s 5 5 G7	37	40	40	90	66	87	80
s74H9	34	40	41	89	72	88	83
s6E12	38	40	40	88	67	87	80

Таблица 9

Мутации, созданные в SEQ ID NO: 156.

Соответствующие аминокислоты в SEQ ID NO: 1 (полноразмерный, wt НА) и SEQ ID NO: 52 также указаны

Набор 1 Положение	1 остаток	введенные аминокислоты
SEQ ID NO:	1	SEQ ID NO:	156
337	I		I	E, К, V
340	I		I	К, R, T
352	F		F	D, V, Y
353	I	I	К, R, Т
406	F	S	I, N, T, Y, S
409	V	T	A, G, I, R, T, V
413	F	G	I, N, S, T, Y, G
416	L	S	Η, I, N, R, S

Набор 2
Положение	остаток	введенные аминокислоты
	SEQ ID NO: 1	SEQ ID NO: 156
337	I	I	A, E, К, T, V
340	I	I	F, N, S, T, Y
352	F	F	A, D, I, N, S, T, V, Y
353	I	I	E, G, K, R, V
406	F	S	F, H, L, Y, S
409	V	T	F, I, S, T
413	F	G	E, K, Μ, V, G
416	L	S	I, R, s

В табл. 10 приведены значения молекулярного веса, определенные с помощью SEC-MALS, для полипептидов по настоящему изобретению и их комплексов с Fab-фрагментами CR6261 и CR9114. Теоретические значения (приведенные в скобках) высчитаны на основании последовательности полипептида по настоящему изобретению (предполагая тример) и дополнительного вклада приблизительно 10 кДа от присоединенных гликанов. Значения молекулярного веса Fab-фрагментов CR6261, CR9114 и CR8020 также определяли с помощью SEC-MALS, и они составили 48, 49 и 47 кДа соответственно.

Таблица 10

Название конструкции	** Мол. вес (кДа)
	Белок	Белок в комплексе с
CRF9114	CRF6261
SEQ ID NO: 158	118 (120)	236 (246)	201 (255)
FL HA H1N1 *	210 (210)	343 (345)	396 (363)

*Включенные данные для справки.

**Как определено из SEC MALS; теоретические значения для тримерного FL HA или SEQ ID NO: 158 и тримерного FL HA или SEQ ID NO: 158 в комплексе с 3 Fab поданы в скобках.

Таблица 11

Полипептиды по настоящему изобретению, полученные из SEQ ID NO: 156 и выбранные, как описано в примерах 11 и 12. Указаны только остатки, которые изменялись в наборе 1 и наборе 2, все другие остатки _____________________идентичны SEQ ID NO: 156._____________________

С-конец	название клона	SEQ ID NO:	число остатков
			337	340	352	353	406	409	413	416
Flag-foldon-His		156	I	I	F	I	S	Т	G	S

Flag-foldon-His	GWl,5D10 GWl,5E2 GWl,7H3 GWl,9C7 GWl,8C7	159 158 160 161 162	к к E К E	к I к I R	F Y F Y F	К к т R К	F I F Т Y	т т G Т V	Y Т I I Т	N R N S S

TCS-His	GWl,5E2 GWl,9A5 GWl,9E8 GWl,2C8	163 164 165 166	К К К I	I К I Т	Y F Y Y	К Т К К	I S F S	Т А А V	Т Y Т Y	R S N N

Ссылки Alberini et al. (2009), Vaccine 27: 5998-6003.

Bommakanti et al. (2010), PNAS 107(31): 13701-13706. Bommakanti et al. (2012), J Virol 86: 13434. Cheng et al. (2014), J. Immunol. Methods 1-13. (del:10.1016/j.jim.2014.07.010) Coffman et al. (2010), Immunity 33: 492. Devereux et al. (1984), Nucl. Acids Res. 12: 387. DiLillo et al. (2014), Nat Med 20, 143. Dopheide TA, Ward CW. (1981) J Gen Virol. 367-370. Ekiert et al. (2009), Science 324:246. Ekiert et al. (2011), Science 333: 844. Ferguson et al. (2003), Nature 422: 428-443. Lorieau et al. 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107: 11341.

Lu et al. (2013), www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1308701110.

Mallajosyula et al. (2014) www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1402766111. Parekh et al. (2012), mAbs 4: 310. Schnueriger et al. (2011), Molecular Immunology 48: 1512. Steel et al. (2010), mBio 1(1): 1-9. Steven et al. (2004) Science 303: 1866. Steven et al. (2006) Science 312: 404. Temperton et al. (2007) Viruses 1: 105-12. Throsby et al. (2008), Pios One 12(3): 1-15. Wilson et al (1981) Nature 289: 366.

Последовательности

SEQ ID NO: 1: Полноразмерный Hl (A/Brisbane/59/2007)

MKVKLLVLLC TFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL 50

ENSHNGKLCL LKGIAPLQLG NCSVAGWILG NPECELLISK ESWSYIVEKP 100

NPENGTCYPG HFADYEELRE QLSSVSSFER FEIFPKESSW PNHTVTGVSA 150

SCSHNGESSF YRNLLWLTGK NGLYPNLSKS YANNKEKEVL VLWGVHHPPN 200

IGDQKALYHT ENAYVSWSS HYSRKFTPEI AKRPKVRDQE GRINYYWTLL 250

EPGDTIIFEA NGNLIAPRYA FALSRGFGSG IINSNAPMDK CDAKCQTPQG 300

AINSSLPFQN VHPVTIGECP KYVRSAKLRM VTGLRNIPSI QSRGLFGAIA 350

GFIEGGWTGM VDGWYGYHHQ NEQGSGYAAD QKSTQNAING ITNKVNSVIE 400

KMNTQFTAVG KEFNKLERRM ENLNKKVDDG FIDIWTYNAE LLVLLENEBPEMF

УДЕРЖИВАНИЯ 450

LDFHDSNVKN LYEKVKSQLK NNAKEIGNGC FEFYHKCNDE CMESVKNGTY 500

DYPKYSEESK LNREKIDGVK LESMGVYQIL AIYSTVASSL VLLVSLGAIS 550

FWMCSNGSLQ CRICI 565

SEQ ID NO: 2: Hl-mini2-clusterl+5+6-GCN4

MKVKLLVLLC TFTATYA DTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL 50

ENGGGGKYVC SAKLRMVTGL RNIPSIQSQG LFGAIAGFIE GGWTGMVDGW 100

YGYHHQNEQG SGYAADQKST QNAINGITNK VNSVIEKMNT QSTATGKEGN 150

KSERMKQIED KIEEIESKQI WCYNAELLVL LENERTLDFH DSNVKNLYEK 200

VKSQLKNNAK EIGNGCFEFY HKCNDECMES VKNGTYDYPK YSEESKLNRE 250

KIDGVKLESM GVYQILAIYS TVASSLVLLV SLGAISFWMC SNGSLQCRIC 300

I 301

SEQ ID NO: 3: foldon

GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL

SEQ ID NO: 4: FLAG-thrombin-foldon-HIS

SGRDYKDDDDKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH

SEQ ID NO: 5:

MKQIEDKIEEIESKQ

SEQ ID NO: 6: Hl-mini2-clusterl+5+6-GCN4 без лидерной последовательности и с FLAG-thrombin-foldon-HIS

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNIPSI QSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QSTATGKEGNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVSGRDYKDDDDKLV PRGS PGS GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLS T FLGHHHHHH

SEQ ID NO: 7: остаток консенсусной последовательности Hl 402-418 (нумерация согласно SEQ ID NO:1)

402 MNTQFTAVG KEFN(H/K)LE(K/R) 418 >БЕЛОК VH ЦЕПИ SC09-114 (SEQ ID NO: 11)

QVQLVQS GAEVKKPGS SVKVS OKS S GGT SNNYAISWVRQAPGQGLDWMGGIS PIFGS TA

YAQKFQGRVTISADIFSNTAYMELNSLTSEDTAVYFCARHGNYYYYSGMDVWGQGTTVTVSS >БЕЛОК VL ЦЕПИ SC09-114 (SEQ ID NO: 12)

SYVLTQPPAVSGTPGQRVTISCSGSDSNIGRRSVNWYQQFPGTAPKLLIYSNDQRPSW

PDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEAEYYCAAWDDSLKGAVFGGGTQLTVL >БЕЛОК VH ЦЕПИ CR6261 (SEQ ID NO: 9)

EVQLVESGAEVKKPGSSVKVSCKASGGPFR SYAISWVRQAPGQGPEWMGGIIPIFGTTKYAP KFQGRVTITADDFAGTVYMELSSLRSEDTAMY YCAKHMGYQVRETMDVWGKGTTVTVSS >БЕЛОК VL ЦЕПИ CR6261 (SEQ ID NO: 10)

QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIG NDYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDR FSGSKSGTSATLGITGLQTGDEANYYCATWDR RPTAYVVFGGGTKLTVLG >БЕЛОК VH ЦЕПИ SC08-057 (SEQ ID NO: 13)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTDSVIFMSWVRQAPGKGLECVSIIYIDDSTYY

ADSVKGRFTISRHNSMGTVFLEMNSLRPDDTAVYYCATESGDFGDQTGPYHYYAMDV >БЕЛОК VL ЦЕПИ SC08-057 (SEQ ID NO: 14)

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGSSGDIGGYNAVSWYQHHPGKAPKLMIYEVTSRPSG

VSDRFSASRSGDTASLTVSGLQAEDEAHYYCCSFADSNILI >БЕЛОК VH ЦЕПИ SC08-020 (SEQ ID NO: 17)

QVQLQQSGAEVKTPGASVKVSCKASGYTFTRFGVSWIRQAPGQGLEWIGWISAYNGDTY YAQKFQARVTMTTDTSTTTAYMEMRSLRSDDTAVYYCAREPPLFYSSWSLDN >БЕЛОК VL ЦЕПИ SC08-020 (SEQ ID NO: 18)

EIVXTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMNYLAWFQQKPGQAPRLLIYGASRRATGI PDRISGSGSGTDFTLTISRLEPADFAVYYCQQYGTSPRT

SEQ ID NO: 52: Hl-mini2-clusterl+5+6-GCN4t2

MKVKLLVLLC TFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL 50

ENGGGGKYVC SAKLRMVTGL RNIPSIQSQG LFGALAGFLE GGWTGMVDGW 100

YGYHHQNEQG SGYAADQKST QNAINGITNK VNSVIEKMNT QSTATGKEGN 150

KSERRMKQIE DKIEEIESKT WCYNAELLVL LENERTLDFH DSNVKNLYEK 200

VKSQLKNNAK ELGNGCFEFY HKCNDECMES VKNGTYDYPK YSEESKLNRE 250

KTDGVKLESM GVYQILAIYS TVASSLVLLV SLGALSFWMC SNGSLQCRIC 300

I 301

SEQ ID NO: 53: Hl-mini2-clusterl+5+6-GCN4t3

MKVKLLVLLC TFTATYADTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL 50

ENGGGGKYVC SAKLRMVTGL RNIPSIQSQG LFGAIAGFIE GGWTGMVDGW 100

YGYHHQNEQG SGYAADQKST QNAINGITNK VNSVIEKMNT QSTATGKEGN 150

KSRMKQIEDK IEEIESKQKI WCYNAELLVL LENERTLDFH DSNVKNLYEK 200

VKSQLKNNAK ELGNGCFEFY HKCNDECMES VKNGTYDYPK YSEESKLNRE 250

KLDGVKLESM GVYQLLALYS TVASSLVLLV SLGALSFWMC SNGSLQCRLC 300

L 301

SEQ ID NO: 55: 127H1

MKVKLLVLLCTFTATYADTIСIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTOYTAIGKEYNKSERMKOIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 56: 86B4

MKVKLLVLLCTFTATYADTIСIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTOFTAIGKEMNKIERMKOIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 57: 74H9

MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNS TDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQYTAFGKEMNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 58: 6E12

MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNS TDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNEPSNQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQLTAFGKEVNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 59: 55G7

MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNS TDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKL RMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGIT NKVNSVIEKMNTQYTAIGKEMNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDS NVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVK LESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 60 : 115A1

MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNS TDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGYTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQITAVGKEYNKIERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDG VKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 61: 71H2

MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNS TDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLEGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQLTAIGKEVNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 62: 181H9

MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNS TDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNVPSKQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKNERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 63:22009

MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNKPSTQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQFTATGKEYNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 64: 113E7

MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQYTATGKEINKHERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 65: s74H9

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSN QSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QYTAFGKEMNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 66: S127H1

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSK QSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QYTAIGKEYNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 67: s86B4

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSN QSQGLFGAIAGYKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QFTAIGKEMNKIERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 68: s55G7

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSN QSQGLFGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QYTAIGKEMNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 69: s6E12

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNEPSN QSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QLTAFGKEVNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 70: S115A1

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSK QSQGLFGAIAGYTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QITAVGKEYNKIERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 71: s71H2

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSN QSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QLTAIGKEVNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 76: S181H9

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNVPSK QSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QFTAVGKEFNKNERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 77: s220C9

DTIСIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPS T QSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QFTATGKEYNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 78: S113E7

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSK QSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QYTATGKEINKHERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 72: s74H9-long

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSN

QSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT

QYTAFGKEMNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ

LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 73: sl27Hl-long

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSK

QSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT

QYTAIGKEYNKSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ

LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 74: s86B4-long

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSN

QSQGLFGAIAGYKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT

QFTAIGKEMNKIERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ

LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 75: s55G7-long

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSN

QSQGLFGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT

QYTAIGKEMNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ

LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 144: s6E12-long

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNEPSN

QSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT

QLTAFGKEVNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ

LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 79: sll5Along

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSK

QSQGLFGAIAGYTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT

QITAVGKEYNKIERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ

LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 80: s71H21ong

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSN

QSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT

OLTAIGKEVNKSERMKOIEDKIEEIESKOIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSO

LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 81: 127Hl-t2

MKVKLLVLLCTFTATYADTIСIGYHANNS TDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTOYTAIGKEYNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 82: 86B4-t2

MKVKLLVLLCTFTATYADTIСIGYHANNS TDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQFTAIGKEMNKIERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 83: 74H9-t2

MKVKLLVLLCTFTATYADTIСIGYHANNS TDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQYTAFGKEMNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 84: 6E12-t2

MKVKLLVLLCTFTATYADTIСIGYHANNS TDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNEPSNQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQLTAFGKEVNKLERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 85: 55G7-t2

MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKL RMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGIT NKVNSVIEKMNTQYTAIGKEMNKLERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDS NVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVK LESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 86 : 115A1-L2

MKVKLLVLLCTFTATYADTIСIGYHANNS TDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGYTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQITAVGKEYNKIERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 87: 71H2-t2

MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQLTAIGKEVNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 88: 181H9-t2

MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNVPSKQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKNERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 89:220C9-t2

MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNKPSTQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQFTATGKEYNKLERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 90: 113E7-t2

MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQYTATGKEINKHERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 91: sl27Hl-t2

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSK QSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT OYTAIGKEYNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSO LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 92: s86B4-t2

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSN QSQGLFGAIAGYKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QFTAIGKEMNKIERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 93: s74H9-t2

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSN QSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QYTAFGKEMNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 94: s6E12-t2

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNEPSN QSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QLTAFGKEVNKLERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 95: s55G7-t2

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGL FGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAI GKEMNKLERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNA KEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH

SEQ ID NO: 96 : sll5Al-t2

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSK QSQGLFGAIAGYTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QITAVGKEYNKIERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 97: s71H2-t2

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSN QSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QLTAIGKEVNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 98: sl81H9-t2

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNVPSK QSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QFTAVGKEFNKNERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 99:s220C9-t2

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPS T QSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QFTATGKEYNKLERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 100: sll3E7-t2

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSK QSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QYTATGKEINKHERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 101: s!27Hl-t21ong

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSK QSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QYTAIGKEYNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 102: s86B4-t21ong

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSN QSQGLFGAIAGYKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QFTAIGKEMNKIERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 103: s74H9-t21ong

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSN QSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QYTAFGKEMNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 104: s6E12-t21ong

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNEPSN QSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QLTAFGKEVNKLERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 105: s55G7-t21ong

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGL FGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAI GKEMNKLERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNA KEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 106: sll5Al-t21ong

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSK QSQGLFGAIAGYTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QITAVGKEYNKIERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 107: s71H2-t21ong

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSN QSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QLTAIGKEVNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 108: s181H9-t2long

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNVPSK QSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QFTAVGKEFNKNERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 109: s220C9-t21ong

DTIСIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPS T QSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QFTATGKEYNKLERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 110: sll3E7-t21ong

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSK QSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QYTATGKEINKHERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 111: 127Hl-t3

MKVKLLVLLCTFTATYADTIСIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNKSRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 112: 86B4-t3

MKVKLLVLLCTFTATYADTIСIGYHANNS TDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQFTAIGKEMNKIRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTL

DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 113: 74H9-t3

MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQYTAFGKEMNKSRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 114: 6E12-t3

MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNEPSNQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQLTAFGKEVNKLRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 115: 55G7-t3

MKVKLLVLLCTFTATYADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKL RMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGIT NKVNSVIEKMNTQYTAIGKEMNKLRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDS NVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVK LESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 116 : 115Al-t3

MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGYTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQITAVGKEYNKIRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 117: 71H2-t3

MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQLTAIGKEVNKSRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 118: 181H9-t3

MKVKLLVLLCT FTATYADTIСIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNVPSKQSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNKNRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTL

SEQ ID NO: 119:220C9-t3

MKVKLLVLLCTFTATYADTIСIGYHANNS TDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNKPSTQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQFTATGKEYNKLRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 120: 113E7-t3

MKVKLLVLLCTFTATYADTIСIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYV CSAKLRMVTGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNA INGITNKVNSVIEKMNTQYTATGKEINKHRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTL DFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREK IDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 121: sl27Hl-t3

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSK QSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QYTAIGKEYNKSRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 122: s86B4-t3

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSN QSQGLFGAIAGYKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QFTAIGKEMNKIRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 123: s74H9-t3

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSN QSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QYTAFGKEMNKSRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 124: s6E12-t3

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNEPSN QSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QLTAFGKEVNKLRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ

LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH НН

SEQ ID NO: 125: s55G7-t3

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGL FGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAI GKEMNKLRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNA KEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHHHH

SEQ ID NO: 126 : sll5Al-t3

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSK QSQGLFGAIAGYTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QITAVGKEYNKIRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 127: s71H2-t3

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSN QSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QLTAIGKEVNKSRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 128: sl81H9-t3

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNVPSK QSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QFTAVGKEFNKNRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 129:s220C9-t3

DTIСIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPS T QSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QFTATGKEYNKLRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 130: sll3E7-t3

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSK QSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QYTATGKEINKHRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ

LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGRSLVPRGSPGHHHH HH

SEQ ID NO: 131: sl27Hl-t31ong

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSK QSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QYTAIGKEYNKSRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 132: s86B4-t31ong

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSN QSQGLFGAIAGYKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QFTAIGKEMNKIRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 133: s74H9-t31ong

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSN QSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QYTAFGKEMNKSRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 134: s6E12-t31ong

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNEPSN QSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QLTAFGKEVNKLRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 135: s55G7-t31ong

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSNQSQGL FGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQYTAI GKEMNKLRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNA KEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 136: sll5Al-t31ong

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSK QSQGLFGAIAGYTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QITAVGKEYNKIRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 137: s71H2-t31ong

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSN QSQGLFGAIAGFKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT

QLTAIGKEVNKSRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 138: sl81H9-t31ong

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNVPSK QSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QFTAVGKEFNKNRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 139: s220C9-t31ong

DTIСIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPS T QSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QFTATGKEYNKLRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 140: sll3E7-t31ong

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSK QSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QYTATGKEINKHRMKQIEDKIEEIESKQKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 141: sl81H91ong

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNVPSK QSQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QFTAVGKEFNKNERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 142: s220C91ong

DTIСIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPS T

QSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QFTATGKEYNKLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 143: sll3E71ong

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSK QSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNT QYTATGKEINKHERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQ LKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG

SEQ ID NO: 149: smHl Cali3964-55G7

MKAILWLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYV CSTKLRLATGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNA IDEITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEMNHLERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTL

DYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREE IDGRS LVPRGS PGHHHHHH

SEQ ID NO: 150: smHl Cali3964-86B4

MKAILWLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYV CSTKLRLATGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNA IDEITNKVNSVIEKMNTQFTAIGKEMNHIERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTL DYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREE IDGRS LVPRGS PGHHHHHH

SEQ ID NO: 151: smHl Cali3964-127H1

MKAILWLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYV CSTKLRLATGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNA IDEITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNHSERMKQIEDKIEEIESKQIWCYNAELLVLLENERTL DYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREE IDGRS LVPRGS PGHHHHHH

SEQ ID NO: 152: _smHl Cali3964-55G7-t2

MKAILWLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYV CSTKLRLATGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYVEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNA IDEITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEMNHLERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTL DYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREE IDGRS LVPRGS PGHHHHHH

SEQ ID NO: 153: _smHl Cali3964-86B4-t2

MKAILWLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYV CSTKLRLATGLRNKPSNQSQGLFGAIAGYKEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNA IDEITNKVNSVIEKMNTQFTAIGKEMNHIERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTL DYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREE IDGRS LVPRGS PGHHHHHH

SEQ ID NO: 154: smHl Cali3964-127Hl-t2

MKAILWLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYV CSTKLRLATGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNA IDEITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNHSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTL DYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREE IDGRS LVPRGS PGHHHHHH

SEQ ID NO: 155: mHl Cali3964-127Hl-t2

MKAILWLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDGGGGKYV CSTKLRLATGLRNKPSKQSQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNA IDEITNKVNSVIEKMNTQYTAIGKEYNHSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTL

DYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREE IDGVKLESTRIYQILAIYSTVASSLVLVVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 156: sHl-mini2-clusterl+5+6-GCN4t2 без лидерной последовательности и с FLAG-foldon-HIS

DTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL ENGGGGKYVC SAKLRMVTGL

RNIPSIQSQG QNAINGITNK	LFGALAGFLE VNSVIEKMNT	GGWTGMVDGW QSTATGKEGN	YGYHHQNEQG KSERRMKQIE	SGYAADQKST DKIEEIESKI
WCYNAELLVL	LENERTLDFH	DSNVKNLYEK	VKSQLKNNAK	EIGNGCFEFY
HKCNDECMES	VKNGTYDYPK	YSEESKLNRE	KLDGVSGROY	KDDDDKPGSG
YIPEAPRDGQ AYVRKDGEWV LLSTFLGHHH HHH SEQ ID NO: 157: mini-НА Hl GW1.5E2 MKVKLLVLLC TFTATYADTI CIGYHANNST	DTVDTVLEKN	VTVTHSVNLL
ENGGGGKYVC	SAKLRMVTGL	RNKPSIQSQG	LFGAIAGYKE	GGWTGMVDGW
YGYHHQNEQG	SGYAADQKST	QNAINGITNK	VNSVIEKMNT	QITATGKETN
KRERRMKQIE	DKIEEIESKI	WCYNAELLVL	LENERTLDFH	DSNVKNLYEK
VKSQLKNNAK	EIGNGCFEFY	HKCNDECMES	VKNGTYDYPK	YSEESKLNRE
KIDGVKLESM	GVYQILAIYS TVASSLVLLV SLGAISFWMC SNGSLQCRICI

SEQ ID NO: 158 mini-НА sHl GW1.5E2-FFH (#5145)

DTI CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL ENGGGGKYVC SAKLRMVTGL RNKPSIQSQG LFGAIAGYKE GGWTGMVDGW YGYHHQNEQG SGYAADQKST

QNAINGITNK VNSVIEKMNT QITATGKETN KRERRMKQIE DKIEEIESKI

WCYNAELLVL LENERTLDFH DSNVKNLYEK VKSQLKNNAK EIGNGCFEFY

HKCNDECMES VKNGTYDYPK YSEESKLNRE KIDGVSGRDY KDDDDKPGSG

YIPEAPRDGQ AYVRKDGEWV LLSTFLGHHH HHH

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Полипептид стеблевого домена гемагглютинина вируса гриппа, происходящий из вируса гриппа A/Brisbane/59/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 1), содержащий аминокислотную последовательность:

DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNKPSKQ SQGLFGAIAGFTEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKMNTQ YTAIGKEYNKSERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQL KNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDG (SEQ ID NO: 146) .
2. Полипептид по п.1, избирательно связывающийся с антителами CR6261 и/или CR9114.
3. Полипептид по п.1 или 2, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 91 и SEQ ID NO: 101.
4. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид по любому из пп.1, 2 или 3.
5. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.4.
6. Композиция, содержащая полипептид по любому из пп.1, 2 или 3 и/или молекулу нуклеиновой кислоты по п.4, для индукции иммунного ответа против вируса гриппа А.
7. Применение полипептида по любому из пп.1, 2 или 3 для индукции иммунного ответа против вируса гриппа А.
8. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по п.4 для индукции иммунного ответа против вируса гриппа А.
9. Применение вектора по п.5 для индукции иммунного ответа против вируса гриппа А.
10. Применение полипептида по любому из пп.1, 2 или 3 в качестве вакцины против вируса гриппа А.
11. Применение молекулы нуклеиновой кислоты по п.4 в качестве вакцины против вируса гриппа А.
12. Применение вектора по п.5 в качестве вакцины против вируса гриппа А.