<Desc/Clms Page number 1>
Die Erfindung betrifft eine verbesserte Vakzine zur Immunisierung gegen TBE-Virusmfektionen sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung.
Das TBE (Tick-Borne-Encephalitis)-Virus ist in vielen europäischen Ländern, der ehemaligen Sowjetunion und China, endemisch. Die Krankheit stellt in einigen zentraleuropäischen Ländern, wie Österreich, Tschechien, Slowakei, Slowenien oder Ungarn, wo jedes Jahr mehrere hundert In Krankenhäuser aufgenommene Fälle registriert werden, ein signifikantes Problem für die öffentliche Gesundheit dar (WHO : EURO Reports and Studies, 104 ; 1983).
TEE-Virus, das in Form eines westlichen, europäischen und eines fernöstlichen Subtyps existiert,
EMI1.1
P. : Flaviviru-ses. In : Fields, B. N. (ed. ) Vlrology, Raven Press, N.Y. 1990, S 763-814).
Die Krankheit kann durch Impfung mit einem hochgereinigten Formalin-inaktivierten Ganzvirusimpfstoff (s. Kunz et al., J. Med. Virol., 6 (1980), 103-109), der eine Immunantwort gegen die Strukturproteine des Virus
EMI1.2
bestens bewährt, jedoch müssen grosse Volumina von infektiösen und potentiell gefährlichen Virussuspensionen im Verlauf des Herstellungsverfahrens gehandhabt werden Daher sind umfangreiche und teure Sicherheitsvorkehrungen erforderlich.
Die Fähigkeit von Antikörpern, das Virus zu neutralisieren, hängt davon ab, dass sie die native Struktur der Proteine an der Virusoberfläche erkennen. Im Falle von TBE-Viren und anderen Flavi-Viren handelt es sich dabei In erster Linie um das Protein E (s. Heinz und Mandl, APMIS, 101 (1994), 735-745). Für die Induktion von möglichst effizient wirksamen Antikörpern im Zuge einer Immunisierung ist es daher wünschenswert, dass der Impfstoff dieses Protein in der gleichen Form, wie es auch an der Oberfläche des infektiösen Virus vorliegt, enthält. Ganzvirustotimpfstoffe haben den Nachteil, dass das notwendige Inaktiverungsverfahren zu einer teilweisen Veränderung der nativen Proteinstruktur führen kann.
Die rekombinante DNA-Technologle bietet eine Möglichkeit, Ganzvirustotimpfstoffe durch rekombinante Proteine, die die wesentlichen Teile der die Immunantwort induzierenden Proteine enthalten, zu ersetzen.
Bei dieser gentechnischen Expression von einzelnen Virusproteinen ist jedoch nicht sichergestellt, dass die Antigenstruktur dieser rekombinanten Proteine jener der entsprechenden Proteine an der Virusoberfläche entspricht.
Die Expression von rekombinanten Oberflächen proteinen von TBE-Viren ist beispielsweise aus Allison et al., Gemeinsame Jahrestagung ÖBG-ÖGGGT (1993) P114, bekannt. Dabei wurde festgestellt, dass Protein E und Protein M bei deren rekombinanter Expression unter bestimmten Bedingungen in verschiedener Form, u. a. auch in Form von nicht-infektiösen subviralen Partikeln, abgesondert werden.
Solche subvirale Partikel sind für entfernte Verwandte der TBE-Viren, nämlich das Japanische Enzephalitis-Virus (JEV), Gelbfiebervirus und Dengue-Vlrus bekannt (s. Konishl et al., Virology 188 (1992), 714-720, oder WO 92/03545).
Es ist zwar in Komsh) et al. beschrieben, dass solche subviraten Partikel, welche mit Freund's komplettem Adjuvans emulsifizlert worden sind und das gesamte Protein E enthalten, eine gewisse Immunantwort In Mäusen auslösen, es wurde jedoch andererseits nachgewiesen, dass mit einem teilweise C-terminal verkürzten Protein E ein wesentlich effektiverer Schutz als mit dem gesamten Protein E gegen eine Flavivirusinfektion erreicht werden kann (WO 92/03161).
EMI1.3
sertes FSME-Virus enthält, wobei gemäss der dort beschriebenen Vakzine das Glykoprotein E In isolierter Form, also abgetrennt und von den üblichen Proteinbestandteilen des Virus und vom Dlssozlierungsmittel, vorliegen. Ein solcherart Isoliertes Glykoprotein E weist jedoch nur eine geringe Immunogenität auf.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun dann, einen verbesserten Impfstoff gegen TBEInfektionen zur Verfügung zu stellen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss gelöst durch eine Vakzine zur Immunisierung gegen Tick-borneEnzephalitis-Virus (TBE-Virus) -Infektlonen, welches nicht-Infektiöse, subvirale Partikel, die im wesentlichen das Protein E in seiner vollständigen nativen Form und gegebenenfalls das Protein prM/M enthalten, welche Proteine aus dem TBE-Virus abgeleitet sind, umfasst. Wesentlich ist dabei, dass das Protein E In seiner vollständigen nativen Form vorliegt, da nur damit ein effektiver Schutz herbeigeführt werden kann.
In der erfindungsgemässen Vakzine konnte die native Form des Protein E mit Hilfe verschiedener Analysen belegt werden, nämlich a) Analyse der Antigenstruktur mit monoklonalen Antikörpern, b) Fähigkeit zur säureinduzierten Konformationsänderungen und c) Hämagglutinationsaktivität
Die Tatsache, dass die erfindungsgemässe Vakzine aufgrund ihrer Zusammensetzung nicht infektiös sein kann, stellt für die Sicherheit des Impfstoffes einen wichtigen Aspekt im Hinblick auf bekannte Vakzinen dar.
<Desc/Clms Page number 2>
Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Vakzine ist das Protein E aus dem TBE-Virus abgeleitet, wobei-je nach Anwendungsgebiet - sowohl der westliche (europäische) Subtyp als auch der fernöstliche Subtyp verwendet wird. Vorzugsweise umfasst die Vakzine noch eine Upidkomponente, welche vorteilhafterweise in vesikulärer Form vorliegt.
Es hat sich gezeigt, dass-entgegen der Meinung der Fachwelt (s. WO 92103161) rekombinantes Protein E, welches aus TBE-Viren abgeleitet ist, nur in Form dieser nicht-infektiösen subviralen Partikel eine ausreichende Immunisierung gegen Infektionen bieten kann. Eine teilweise verkürzte Form des Protein E, bei welcher, wie in WO 92/03161, der C-terminale Membrananker entfernt worden ist, kann nicht zur Herstellung einer effektiven Vakzine herangezogen werden. Die erfindungsgemässe Vakzine enthält vorzugsweise nicht-infektiöse Partikel, die im wesentlichen frei sind von mittels PCR detektierbaren, von TBE-Virus abgeleiteten Nukleinsäuren. Dies kann beispielsweise mit der in Konishi et al. beschnebenen Methode gezeigt werden.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer TBE-Vakzine, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass - ein Zellkultursystem zur Verfügung gestellt wird, das die Kodierungssequenzen für die Proteine prM und E, welche Proteine aus dem TBE-Virus abgeleitet sind, enthält, - das Protein E In seiner vollständigen, nativen Form exprimiert wird, wobei - subvirale, nicht-infektiöse Partikel gebildet werden, welche im wesentlichen das rekombinante Protein
E in seiner vollständigen, nativen Form und gegebenenfalls das rekombinante Protein prM/M enthal- ten und - die Partikel gesammelt sowie direkt in eine zur Immunisierung geeignete Zusammensetzung aufgear- beitet werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren bietet den grossen Vorteil, dass ein Inaktivlerungsschntt für Viren, beispielsweise durch Formalin, nicht notwendig ist, was einerseits die Qualität der Vakzine erheblich verbessert (das Protein E liegt In nativer Form und nicht in durch die Formalinbehandlung veränderter und zumindest teilweise denatunerter Form vor) und andererseits die technische Produktion dieser Vakzine deutlich erleichtert werden, da die Partikel direkt (also ohne Formalinbehandlung) zu einer pharmazeutischen Präparation verarbeitet werden können.
Besonders bevorzugt bei der Durchführung des Verfahrens ist der Einsatz eines Zellkultursystems, welches die Kodierungssequenzen für die rekombinanten Proteine prM und E aus dem TBE-Virus in chromosomal integrierter Form enthält.
Es sind jedoch Zellkultursysteme, in welchen virale Vektoren zur Anwendung kommen, oder Zellkultursysteme, in welchen virusfrei, beispielsweise mit einem Plasmidvektor, gearbeitet wird, ebenfalls für die Herstellung der erfindungsgemässen Partikel geeignet.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens erfolgt sowohl die Expression der Proteine als auch die Bildung der Partikel kontinuierlich.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung von nicht-infektiösen, subviralen Partikeln enthaltend im wesentlichen das rekombinante Protein E in seiner vollständigen, nativen Form und gegebenenfalls das rekombinante Protein prM/M, welche Proteine aus dem TBE-Virus abgeleitet sind, zur Herstellung einer Vakzine zur aktiven Immunisierung gegen TBE-Virus-Infektionen.
EMI2.1
rekombinante Protein prM/M, welche Proteine aus dem TBE-Virus abgeleitet sind, zur Herstellung von Anti- TBE-Virus-tmmungiobu ! in-Präparationen.
EMI2.2
nung noch weiter erläutert.
Es zeigen : Fig. 1. eine schematische Darstellung der in den Expressionsplasmiden verwendeten Inserts, Fig. 2 eine schematische Darstellung des Plasmids pSVss, das nach den im Anhang zur vorliegenden Beschreibung angegebenen Modifikationen zur Expression der in Fig. 1 gezeigten Konstrukte verwendet wurde :
Fig. 3a, b, und c eine vollständige Nukleotid-und Aminosäuresequenz des In Fig. 1 dargestellten Konstrukts SV-PEwt ; Fig. 4 die Immunpräzipitation von mit Triton X-IOO solubilisieren Zelllysaten nach Transfektion mit den in Fig. 1 dargestellten Konstrukten sowie nach Infektion mit TBE-Virus (COS/TBE) ; Fig. 5 in einem Diagramm den Nachweis von Protein E mittels 4-Schicht ELISA in den Zellkulturüberständen von COS-Zellen, die mit den in Fig. 1 dargestellten Konstrukten transflzlert worden waren ; Fig. 6 die Immunpräzipitation des Zellkulturüberstandes von COS-Zellen nach Transfektion mit SVPEwt bzw.
SV-PEst Fig. 7 in einem Diagramm die Sedimentationsanalyse von COS-Zellkulturüberständen nach Transfektlon mit SV-PEwt und SV-PESt sowie nach Infektion mit dem TBE-Virus. Die Sedimentationsrichtung Ist von links nach rechts ; Fig. 8 eine Sedimentationsanalyse von rSP ohne (SV-PEwt) bzw. nach Behandlung mit 0, 5% Triton X-IOO.
Die Sedimentationsrichtung ist von links nach rechts ; Flg. 9 in einem
<Desc/Clms Page number 3>
Diagramm die SDS-PAGE von gereinigtem TBE-Virus und gereinigten rSPs; Coomassie-Blau Färbung; Fig. 10 in einem Diagramm die Reaktivität von 19 Protein E-spezifischen monoklonalen Antikörpern Im 4-Schicht ELISA mit TBE-Virus, Formalininaktiviertem TBE-Virus, rSP und rE* ; Fig. 11 die Reaktivität von TBE-Virus bzw. rSP im 4-Schicht ELISA mit den mAks B3, i2, IC3 und C6 ohne (pH 8, 0) bzw. nach Behandlung bei pH
EMI3.1
bzw. nach Behandlung bel pH 6, 0 ; Fig. 13 die Strategie für die PCR-Klonierung und die Mutagenese von TBE-Virus-Membran-Proteingenen;
Fig.14 die Konstruktion von Plasmidklonen, enthaltend Wifdtyp-prM'+E- Gene oder nur-E mit einem TAG-Stop am Codon 435 ; Plasmid-SV-pEst (SV-pE 04), der ein Wildtyp prMGen und ein modifiziertes E-Gen mit einem TAG-Stop-Codon im Carboxy-terminalen Bereich enthält (vgl.
Tabelle 3) unter Plasmid SV-Ewt (SV-01) ein ein Wildtyp-E-Gen ohne prM enthaltendes Konstrukt wurden mit Cfr101 vertaut, um die prM- und E-Gene auf separaten Restriktionsfragmenten zu erhalten. Diese Fragmente wurden ausgewechselt und zusammen ligiert, um die Plasmide SV-pEwt (Wildtyp prM + E) und SV-Est (nur E + Stop-Codon) zu schaffen ; und Fig. 15 die Detektion von TBE-Virus-Strukturmembranproteinen in transfektierten COS-Zellen mittels indirekter Immunofluoreszenz;
COS-Zellen, die mit den Plasmiden SV-pEwt (A, C und E) oder SV-Ewt (B, D und F) transfektiert worden waren, wurden 46 h nach der Transfektion fixiert und mittels lmmunfluoreszenzmikroskopie analysiert, wie in Matenalien und Methoden Im Anhang beschrieben, wobei polyklonales Anti-Rosetten-Kaninchen-Antieserum (A und B), Mäuse-Antl-E MAb B3 (C und D) und anti-prM-Mab8HI (E und F) verwendet wurde.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen näher beschrieben.
1. Herstellung der Partikel
Zu diesem Zweck wurden 4 Expressionsplasmide konstruiert, die das E-Protein bzw eine Membrananker-frele Form des E-Proteins allein bzw. gemeinsam mit prM enthalten (Fig. 1).
Ein Beispiel für die Herstellung dieser Plasmide ist im Anhang 1 beschrieben. der Teil der vorliegenden Beschreibung ist.
Das dort beschnebene Ausgangsplasmid pSVss ist in Fig. 2 dargestellt.
Die vollständige Sequenz des PEwt Inserts ist In Fig. 3a, bund c dargestellt.
COS-Zellen wurden mit den geeigneten Plasmiden transfizlert und auf die Expression rekombinanter Proteine wie folgt analysiert : DNA-Transfektion
Die DNA-Transfektonen erfolgten unter Verwendung eines BioRad Gene Pulser-Apparates. Die COSZellen wurden mit Trypsin behandelt, gewaschen, in PBS bei einer Konzentration von etwa 5 x 107 Zellen/ml resuspendiert und in Anwesenheit von CsCI-Gradientgereinigtem Plasmid mit einer Konzentration von 6 ug/ml elektroponert. Die Zellen wurden in Dulbecco's MEM, welches 10% fötales Rinderserum enthielt, während der ersten 24 Stunden nach der Transfektion gezüchtet, danach wurde das Medium durch Serum-freies Medium ersetzt, und die Inkubation wurde weitere 24 Stunden lang fortgesetzt, bis die Zellen oder das Medium geerntet wurden.
Analyse der exprimterten Proteine a. Immunopräzipitation von Zell-Lysaten Transfizierte Zellen wurden mit 3'S-Cystein markiert, mit 1% Triton X-100 solubilisiert und einer Immunprä- zipitation mit einem polyklonalen Kaninchenserum, das für TBE-Virus E und prM-Proteine spezifisch war, unterzogen. Wie aus Fig. 4 ersichtlich, führte die Expression der Konstrukte SV-PEwt und SV-Ewt zur Synthese von Protein E authentischer Grösse. Die aus SV-PEt und SV-Est synthetisierten Proteine waren, wie erwartet, Infolge ihrer C-terminalen Verkürzung etwas kleiner als das Wildtyp-E-Protein b.
Analyse der Sekretion von rekombmantem Protein im Zellüberstand Überstände von transfizierten Zellen wurden quantitativ auf das Vorhandensein von Protein E an den Tagen 0 bis 4 nach der Transfektion unter Verwendung eines vierschichtigen ELISA, wie in Heinz et al.,
EMI3.2
nur jene Konstrukte, die das prM-Protein co-exprimieren, zur Sekretion von Protein E führten. Immunopräzipitation aus den Überständen (Fig. 6) bestätigte, dass die abgeschiedenen Proteine dieselbe Grösse hatten
<Desc/Clms Page number 4>
wie die entsprechenden intrazellulären Proteine (vgl. Fig. 4).
Die Sekretion des rekombinanten Proteins stellt einen enormen Vorteil für Produktionszwecke dar, da damit die Notwendigkeit der Lyse der Zellen zur Gewinnung des erwünschten Proteins und des Entfernens von kontaminierendem Zellmaterial eliminiert wird. Unter geeigneten Bedingungen ermöglicht dies auch die kontinuierliche Ernte des rekombinanten Proteins, ohne die Zellen zu zerstören. c. Charakterisierung von abgeschiedenen rekombinanten Proteinen
Die in Fig. 5 gezeigten Überstände wurden einer Saccharose-Dichtegradienten-Zonatzentrifugation unter Verwendung von 5 bis 30% (Masse/Masse) Saccharose-Gradienten und eines Beckman SW-40-Rotors unterzogen. Die Zentrifugation erfolgte bei 38000 U/min und 4'C 100 Minuten lang.
Die Gradienten wurden fraktioniert, und Protein E wurde in jeder Fraktion mittels vierschichtigem ELISA (s. Heinz et al., J. Biol. Stand. (1986) 14 : 133-141) quantitativ bestimmt. Der Überstand aus Virus-infizierten Zellen wurde als Kontrolle verwendet, welche zwei Protein-E-hältige Peaks (Fig. 7) ergab, wovon einer dem kompletten Virus
EMI4.1
SV-PEwt transfizierten Zellen enthielt eine partikuläre Form von E mit einer Sedimentationsgeschwindigkeit ähnlich dem viralen SHA, während das C-terminal verkürzte Protein E von SV-PEst keine stabilen Teilchen bildete und oben auf dem Gradienten verblieb.
Die partikuläre Form aus SV-PEwt wurde"rekombinantes subvirales Teilchen" ("recombinant subviral particle", rSP) genannt, und die lösliche Form aus SV-PEst"rekombinantes E*" (rE*).
Eine Behandlung von rSP mit 0, 5% Triton X-100 dissoziierte die Teilchen, wie durch die Sedimentationsanalyse von Fig. 8 gezeigt, was auf die Anwesenheit einer Lipidmembran hindeutet.
Präparation von rSP und rE* a. Reinigung von rSP Überstände von mit SV-PEwt transfizierten COS-Zellen wurden durch 30minütige Zentnfugation bel 10000 U/min bei 4'C in einer Sorvall-Hochgeschwindigkeitszentrifuge geklärt, und die Teilchen wurden dann durch Zentrifugieren bei 44000 U/min, 4'C, während 120 min geerntet, wobei ein Beckman Ti45 Rotor verwendet wurde. Die rSP-hältige Pellet-Fraktion wurde in TAN-Puffer, pH 8,0, resuspendiert und auf einen 5-20% Saccharose-Gradienten, der mit demselben Puffer erzeugt worden war, aufgetragen.
Nach 90minütiger Zentrifugation bei 38000 U/min und 4*C unter Verwendung eines Beckman SW40-Rotors wurden die Proben fraktioniert, und die Peak-Fraktionen wurden durch Testen auf HA-Aktivität (Clarke und Casals, 1958, Aver. J. Trop. Med. Hyg. 7 : 561-573) identifiziert. Peak-Fraktionen aus dem Zonalgradienten wurden mittels Gleichgewichts-Zentrifugation (35. 000 U/min, 4'C, über Nacht) weiter gereinigt, und die Fraktionen wurden wiederum mittels HA identifiziert.
Gesamtprotein E wurde mittels 4-schichtige ELISA quantitativ bestimmt, und die Reinheit wurde unter Verwendung von Coomassie-Blau-Färbung mittels SDSPAGE bestimmt (Fig. 9). b. rE'-Präparation
Serum-freie Überstände aus SV-PEst-transfiz ! erten COS-Zeiien wurden wie oben beschneben geklärt und durch Ultrafiltration etwa 15-fach konzentnert.
EMI4.2
a. Analyse der Antigenstruktur mit monoklonalen Antikörpern b. Fähigkeit zu säureinduzierten Konformationsänderungen c. Hämaggiutinationsaktivftät zu a.
Antigenstruktur
Die Antigenstruktur des Formalin-inaktivierten Ganzvirus, von rSP und rE'wurde mit jener des nativen infektiösen Virus unter Verwendung von 19 Protein-E spezifischen monoklonalen Antikörpern verglichen
<Desc/Clms Page number 5>
(Mandl et al. 1989, J. Virol. 63 : 564-571 ; eigene Versuche).
Die Reaktivität Jedes einzelnen monoklonalen Antikörpers mit jeder der obigen Präparationen wurde in einem 4-Schichten ELISA wie von Heinz et al.,
EMI5.1
vorher bestimmten, konstanten Konzentration des Proteins E von 1 u. g/ml und jeder der monoklonalen Antikörper In einer Verdünnung eingesetzt, die mit dem nativen, infektiösen Virus einen Extinktionswert im Bereich von 0, 5 bis 1, 6 ergab.
EMI5.2
Virus praktisch identisch, sodass davon ausgegangen werden kann, dass das Protein E in den rSPs in derselben nativen Form wie auch am infektiösen Virus vorliegt.
Die Formalininaktivierung hingegen bewirkt signifikante Veränderungen in der Antigenstruktur, von der auch Epitope betroffen sind, die neutralisierende Antikörper binden. Dies betrifft sowohl den neutralisieren-
EMI5.3
wird, als auch Epitope im Bereich der Domäne A sowie in der Domäne B (Mandl et al., 1989, J. Virol. 63 : 564-571), die zumindest eine verringerte Reaktivität aufweisen.
Diese Analyse zeigt auch, dass E'in seiner Struktur keineswegs dem nativen Protein E an der Virusoberfläche entspricht. zu b. ) Säureinduzierte Konformationsänderungen
Das TBE-Virus dringt mit Hilfe von Rezeptor-vermittelter Endocytose in Zellen ein und gelangt dadurch in Endosomen, deren saurer pH ( < 6, 4) eine spezifische Konformationsänderung induziert, die für die Fusion der Virusmembran mit der Endosomenmembran und damit für die Infektiosität des Virus erforderlich ist. Diese strukturellen Veränderungen können durch die Änderung der Reaktivität einzelner mAks verfolgt werden (Heinz et al., 1994, Virology 198 : 109-117) und betreffen unter anderem die Epitope 12 und IC3 (starke Reduktion der Reaktivität) bzw. C6 (verstärkte Reaktivität), nicht aber das Epitop B3.
Diese Veränderungen sind für die Funktion des Proteins E essentiell. Die Fähigkeit, auf sauren pH in der beschriebenen Weise zu reagieren, stellt daher ebenfalls ein Kritenum dafür dar, ob das Protein E In
EMI5.4
Präparationen vor und nach Inkubation bei saurem pH mit den mAKs B3, i2, IC3 und C6 in einem 4-Schicht ELISA wie unter"Antigenstruktur"beschrieben analysiert. Die Ergebnisse sind 10 den Fig. 11 und 12 dargestellt und zeigen, dass saurer pH Im Protein E der rSPs die gleichen strukturellen Veränderungen
EMI5.5
ähnliche Umlagerungen ergibt (s.
Fig. 12). zu c) Spezifische Hämagglutinationsaktivität
Eine charakteristische Eigenschaft des infektiösen FSME Virus Ist seine Fähigkeit, unter bestimmten Bedingungen Gänseerythrozyten agglutineren zu können (Hämagglutinationsaktivität). Diese Eigenschaft wird dem Virus durch das Protein E vermittelt und Ist somit ein weiterer Indikator für das Vorliegen einer nativen, funktionellen Struktur dieses Proteins. Hämagglutinationstests wurden wie von Clarke und Casals (1958), Amer. J. Trop. Med. Hyg. 7 : 561-573 beschrieben unter Verwendung von Gänseerythrozyten bel einem pH von 6, 4 durchgeführt.
Infektiöses Virus, Formalin-Inaktiviertes Virus, rSP und rE'wurden auf einen im ELISA bestimmten Antigengehalt von 5 u. g/m ! eingesteht und im Hämagglutinationstest analysiert Das Ergebnis Ist In der nachfolgenden Tabelle 1 dargestellt. Daraus geht hervor, dass rSP die gleiche spezifische Hämagglutinationsaktivität besitzt wie infektiöse Virus, und dass diese durch Protein E vermittelte Aktivität bel der Formalininaktivierung fast vollständig verloren geht. Die Präparation rE'besitzt keinerlei messbare HA- Aktivität.
<Desc/Clms Page number 6>
Tabelle 1
EMI6.1
<tb>
<tb> HA-Aktivität
<tb> Präparation <SEP> HA-Titer
<tb> Infektiöse <SEP> Virus <SEP> 512
<tb> Formalin-inakt. <SEP> Virus <SEP> 4
<tb> rSP <SEP> 512
<tb> rE' < 2
<tb>
3. Immunogenität in Mäusen
Die Immunogenität folgender Antigen-Präparationen wurde durch Immunisierung von Mäusen analysiert : - Formalin-inaktiviertes gereinigtes Virus - rSP - rE'
Der Gehalt an Protein E wurde in einem Enzymimmunoassay ermittelt (Heinz et al., 1986, J. Biol-. Stand, 14 : 133-141) und alle Präparationen wurden auf dieselbe Antigenkonzentration von 5 ug/ml eingestellt.
Entsprechend der derzeit verwendeten TBE-Vakzine (FSME-Immun@) wurde als Verdünnungspuffer PBS pH 7, 4, enthaltend 0, 1% HumanalbumIn verwendet und 0. 2% AI (OH) 3 als Adjuvans zugegeben.
Die Immunogenität von rSP und rE* wurde auch ohne Zugabe von Adjuvans getestet.
Immmunisierungsprotokoil :
Mit jeder der Präparationen wurden Gruppen von je zehn 15 g schweren Swiss albino Mäusen (5 Weibchen und 5 Männchen) zweimal im Abstand von 14 Tagen subcutan immunisiert, wobei pro Maus und Immunisierung 0. 2 mi des Antigens verabreicht wurden. Eine Woche nach der zweiten Immunisierung erfolgte die Blutabnahme und alle Mäuse wurden mit 500 LDso des mäusepathogenen TBE-Virusstammes Hypr intraperitoneal infiziert (Challenge Test). Die Mäuse wurden über einen Zeitraum von 14 Tagen auf das Auftreten einer zum Tode führenden Enzephalitis beobachtet.
Identische Aliquots des Serums jeder einzelnen Maus aus einer 10er Gruppe, die mit dem selben Immunogen imununisiert worden waren, wurden gepoolt und der TBE-Virus-spezifische Antikörpergehalt im Enzymimmunoassay (ELISA), Hämaggiutinationshemmungstest (HHT) und Neutralisationstest analysiert.
Der ELISA wurde unter Verwendung von gereinigtem TBE-Virus als Antigen wie von Heinz et al. (1984), J. GenVirol 65 : 1921-1929 beschrieben durchgeführt. Der HHT erfolgte wie von Clarke und Casals (1958), Amer. J. Trop. Med. Hyg. 7 : 561-573 beschrieben, wobei Gänseerythrozyten bei einem End-pH von 6, 4 eingesetzt wurden. Für den Neutralisationstest wurden BHK-21 Zellen und eine Viruskonzentration von 500 infektiösen Einheiten verwendet.
Die Ergebnisse des Immunisierungsversuches sind in der nachstehenden Tabelle 2 zusammengefasst.
Daraus geht hervor, dass rSP sowohl ohne als auch mit Adjuvans genauso wie das Formalin-inaktivierte
EMI6.2
Immunisierung mit rE* keine (ohne Adjuvans) oder nur eine minimale Schutzwirkung (mit Adjuvans) zu beobachten.
In Bezug auf die Antikörperinduktion waren die rSPs dem Formalin-Inaktivierten Virus sogar überlegen, besonders deutlich bei Verwendung des Ai (OH) 3 Adjuvans. Dies betrifft sowohl die im ELISA nachgewiesenen Virus-bindenden Antikörper als auch die - für eine schützende Immunantwort noch bedeutenderen-im HHT und NT gemessenen Antikörper, die also spezifische Funktionen des Virus (Hämagglutination bzw Infektiosität) blockieren
In Übereinstimmung mit der nicht vorhandenen bzw. geringen protektiven Wirksamkeit war auch die Antikörperinduktion durch rE* sehr niedrig bzw. nicht nachweisbar.
Es zeigt sich also, dass rSPs hervorragende Immunogene darstellen, die vor der ansonsten tödlich verlaufenden Enzephalitis schützen und in Bezug auf die Induktion funktioneller, virusneutralisierender Antikörper, dem Formalin-Inaktivierten Ganzvirus sogar überlegen sind.
<Desc/Clms Page number 7>
EMI7.1
EMI7.2
<tb>
<tb> Immunisierung <SEP> von <SEP> Mäusen
<tb> Challenge <SEP> Test <SEP> Anzahl <SEP> Überlebende <SEP> Antikörper <SEP> Titer
<tb> pro <SEP> Gesamtzahl <SEP> (= <SEP> 10) <SEP>
<tb> ELISA <SEP> HHT <SEP> NT
<tb> Formalin-inakt.
<SEP> Virus <SEP> + <SEP> Adjuvans <SEP> 10/10 <SEP> 10000 <SEP> 40 <SEP> 20-40
<tb> rSPohneAdjuvans <SEP> 10/10 <SEP> 12000 <SEP> 80-160 <SEP> 40-80
<tb> rSP <SEP> + <SEP> Adjuvans <SEP> 10/10 <SEP> 30000 <SEP> 160 <SEP> 160
<tb> rE'ohne <SEP> Adjuvans <SEP> 0/10 <SEP> 100 <SEP> < <SEP> 10 <SEP> < <SEP> 10 <SEP>
<tb> rE'+ <SEP> Adjuvans <SEP> 1/10 <SEP> 4000 <SEP> < <SEP> 10 <SEP> < <SEP> 10-10
<tb> Puffer <SEP> Kontrolle <SEP> 0/10 <SEP> neg <SEP> < <SEP> 10 <SEP> < <SEP> 10 <SEP>
<tb>
Virus Genes 8 : 3. 187-198,1994 o 1994 Kluwer Academic Publishers, Boston, hergestellt in Holland Expression von klonierten HUlproteingenen vom Flavivirus Tick-Borne-Encephalitis-Virus in Säu- gezellen und Zufallsmutagenese mittels PCR
EMI7.3
Erhalten am 7.
Mai 1993 ; angenommen am 14. Juli 1993 Ansuchen um Nachdruck sollten genchtet werden an : Steven L. Allison, Institut für Virologie, Universität Wien, Kinderspitalgasse 15, A-1095 Wien, Österreich Zusammenfassung.
Die strukturellen Membranproteine prM und E des Flavivirus Tick-Borne-Encephalitis- (TBE)-Virus wurden in Säugerzellen zwecks Analyse der Struktur und molekularen Wechselwirkungen dieser Proteine expnmiert. Man machte sich dabei die natürliche Fehlerhäufigkeit der Taq-Polymerase zunutze, die bei der Amplifizierung mittels Polymerase-Kettenreaktion PCR verwendet wurde, um eine zufällig mutierte Population von Genen zu erzeugen, die dann unter der Kontrolle eines SV40-Promotors direkt in Plasmldexpresslonsvektoren kloniert wurden. Eine Analyse der Mutationsfrequenz durch direktes Sequenzleren von 22 separaten Klonen zeigte, dass die PCR Mutationen mit einer Rate produzierte, die
EMI7.4
Das ist eine Ideale Rate zur Bewertung der Bedeutung einzelner Aminosäurereste innerhalb von Proteindomänen, wodurch der potentielle Wert der PCR als Zufallsmutageneseverfahren gezeigt wird. Für WildtypprM-und-E-Proteine sowie eine deletierte E-Form kodierende Klone wurden auch durch Vereinigung von Teilen selektierter PCR-Klone konstruiert. Die Transfektion von COS-1-Zellen mit diesen Konstrukten resultierte in der Expression der prM- und E-Proteine, was durch Indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern (Mabs) nachgewiesen wurde. Der intrazelluläre Gehalt an TBEVirusantigen, gemessen 10 Lysaten von transfektierten Zellen mittels ELISA, erreichte annähernd 25 % von jenem, der In virusinfizierten COS-Zellen gefunden wurde.
Weiters wurde mittels Immunfluoreszenz unter Verwendung einer Reihe von 19 antl-E-Mabs gezeigt, dass die Antigenstruktur der expnmlerten E-Proteine nahezu identisch mit jener des E-Proteins infizierte Zellen war, wodurch die Eignung dieses Modellsystems als Werkzeug bel der Untersuchung der Flavivirus-Proteinstruktur bestätigt wurde.
Stichwörter : Flavivirus, Tick-Borne-Encephaiitis-Virus, Strukturproteine, Polymerase-Kettenreaktion, Mutagenese.
Einleitung Tick-Borne-Encephalitis- (TBE)-Virus ist ein wichtiger Krankheitserreger beim Menschen und gehört zur Gattung Flavivirus innerhalb der Familie Flavivlndae. Es ist endemisch in Zentraleuropa, Skandinavien und Teilen von Asien und stellt In diesen Gebieten ein signifikantes Problem für die öffentliche Gesundheit dar (1).
EMI7.5
<Desc/Clms Page number 8>
Das Haupthüllprotein E spielt eine zentrale Rolle 10 der Biologie von Flaviviren, indem es bedeutende virale Eintrittsfunktionen vermittelt und eine protektive Immunantwort im Wirt auslöst. Eine detaillierte Analyse der Struktur und der funktionellen Aktivitäten dieses Proteins ist daher von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Virulenzmechanismen, für die Gestaltung neuer Vakzine und für die Entwicklung antiviraler Strategien. Es gibt bereits eine beträchtliche Menge an Informationen betreffend die Struktur des Hüllproteins E des TBE-Virus, und es wurde ein Strukturmodell auf Basis einer Vielzahl von biochemischen und Immunologischen Daten vorgeschlagen (3, 4).
Die Analyse von 10 natürlichen und im Labor erzeugten TBE-Virusisolaten vorkommenden Mutationen gab Einsicht in die Organisation des EProteins (5, 6), doch erfordert das tiefere Eindringen in das Strukturmodell und die Identifikation spezifischer funktioneller Domänen die Schaffung und Analyse einer grossen Anzahl von veränderten Proteinen.
Das prM-Protein Ist der intrazelluläre Vorläufer von Protein M. Letztere Form findet sich nur in reifen
EMI8.1
induziert offensichtlich eine Reorganisation der Membranproteine, wodurch es zur Bildung von homooligomeren Formen von E kommt (7, 10). Untersuchungen mit unreifen Virionen, die prM enthalten, zeigten, dass die prM-Spaltung offensichtlich notwendig für die Infektiosität und E- Protein-vermittelte Fusionsaktivität Ist (11,12).
Es wird derzeit geglaubt, dass die Funktion von prM darin besteht, zu verhindern, dass das E-Protein durch einen niedrigen pH-Wert induzierte Konformitätsänderungen während des intrazellulären Transports in sauren Veslkeln durchmacht, was zu vorzeitigen Fusionsvorgangen und Inaktivierung des Virus führen würde (8, 12). Derzeit weiss man jedoch wenig über spezifische Bereiche von prM und E, die bel gegenseitigen Wechselwirkungen eine Rolle spielen. Eine Kartierung dieser Wechselwirkungen erfordert Co-Expressionsuntersuchungen unter Verwendung von deletierten oder mutierten Formen dieser Gene.
Eine detaillierte Analyse von prM- und E-Proteinen im Molekularbereich würde stark erleichtert durch die Erstellung eines Expressionssystems unter Verwendung einer gut charakterisierten Bank klonierter Virusgene, die zufällige Punktmutationen enthalten. Eine Expression dieser Gene und die Charakterisierung der resultierenden modifizierten Proteine könnte möglicherweise die Identifizierung bedeutender struktureller und funktioneller Elemente zulassen. Die Nützlichkeit eines solchen Systems wäre abhängig vom Grad, zu dem die Proteine In Ihrer nativen Konformation erzeugt werden könnten und der Einfachheit, mit der die Gene manipuliert werden könnten.
Flavivirus-Proteine werden normalerweise als ein Einzelpolypeptid translatiert, von dem sämtliche
EMI8.2
Verarbeitung mittels einer Kombination von viralen und zelluläre Proteasen (13) erzeugt werden. Die Membrantopologie und das Abzielen auf den Sekretionsweg der Hüllproteine werden teilweise durch interne Signale und Ankersequenzen innerhalb des Polyproteins bestimmt. Eine Anzahl von post-translationalen
EMI8.3
auch in der Bildung nativer Membranproteine involviert. Daher ist es für eine Untersuchung dieser Proteine in ihrem nativen Zustand notwendig, dass sie 10 eukaryontischen Zellen exprimiert werden.
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (14) ist eine leistungsfähige und vielseitige Technik zum Amplifizieren und Klonieren spezifischer Bereiche eines Genoms. Die beim Amplifizferungsvorgang verwendete
EMI8.4
mit einerFehlerhäufigkeit von 1, 1 x 10-4 pro Nukleotid (15). Diese Fehlerhäufigkeit ist bel Verwendung In einer Mehrfachzyklus-Amplifikation dazu geeignet, Zufallsmutationen in eine Genpopulation einzuführen.
In dieser Abhandlung führen wir die Verwendung der PCR zum Kloneren des TBE-Virus E-Gens oder der prM + E-Gene und Expression dieser Gene In CaS-Zellen vor. Wir evalueren auch die Eignung der PCR zur Erzeugung von Zufallsmutationen und präsentieren eine gut charakterisierte Bank mutanter Expressionskonstrukte zur Charakterisierung von Flavivirus-Membranproteinen Materialien und Methoden Virusproduktion und-reinigung Primäre Hühnerembryofibroblasten wurden mit dem TBE-Virus-Prototypstamm Neudörfi aus Gehirnsuspensionen von Mäusesäughngen infiziert.
Virusnachkommen wurden 2 Tage nach der Infektion aus Zeilkultur- überständen mittels Ultrazentrifugation gewonnen und mit zwei Saccharose-Dichtegradientenzentrifugations- zyklen gereinigt, wie früher beschrieben (16).
<Desc/Clms Page number 9>
EMI9.1
von Hexanucleotidpnmern mit Zufallssequenz wurden dann für die Doppelstrang-cDNA-Synthese mittels dem Verfahren nach Gubler und Hoffmann (18) unter Verwendung eines cDNA-Synthesesets von Boehnnger Mannheim entsprechend den Instruktionen des Herstellers verwendet.
Polymerase-Kettenreaktion Synthetische Oligonucleotidprimer wurden zur Amplifizierung von Teilen der cDNA entsprechend entweder dem TBE-Virus prM + E-Bereich oder E allein verwendet. Alle in dieser Abhandlung verwendeten Nukleottd- koordinaten sind ausgehend von Mandl et al. (17) dahingehend überarbeitet, dass sie die ersten 20 Nukleotide des TBE-Genoms (19) enthalten. Die 5'-Primer für die prM+E- und nur-E-Konstrukte waren 27mere mit den Sequenzen AAGCGGCCGCCATGGTTGGCTTGCAAA bzw. AAGCGGCCGCCATGGTTACCGTTGTGT. Die ersten 11 Nucleotide von jeder bestanden aus einer künstlichen Sequenz, enthaltend eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym Notl (GCGGCCGC), gefolgt von einer 16-Nucleotidsequenz entsprechend entweder den Nucleotide 388-403 (SV-PE-Relhe) oder 883-898 (SV-E-Reihe).
In jedem Fall wurde ein natürlich vorkommendes ATG-Codon stromaufwärts des entsprechenden Gens als Startcodon verwendet, und der Primer war so gestaltet, dass er AGT in einem geeigneten Kontext (GCCGCCATGG) für effiziente Translationsinitiation in COS-Zellen aufweist (20. 21). Das gleiche 28 Nukleotid-lange Oligonukleotid (ATGCGGCCGCTAGTCATACCATTCTGAG) wurde als 3'-Pnmer für belde Konstruktionen verwendet. Dieser Primer war an seinem 3'-Ende komplementär zu den Nucleotide 2535- 2550 und enthielt an seinem 5'-Ende eine Notl-Stelle und das Komplement (CTA) eines TAG-Stoppcodons im selben Leserahmen
Die PCR-Amplifikation wurde unter im wesentlichen Standardbedingungen gemäss dem Cetus-Protokoll (14) durchgeführt.
Die Reaktionsmischungen enthielten 50 mM KCI ; 10 mM Tris-HCI, pH 8, 3, 1, 5 mM
EMI9.2
und 3 E AmpliTaq-Polymerase (Perkin Eimer Cetus) In einem Gesamtvolumen von 100 u. L Die Proben wurden mit 100 ul Paraffinöl überdeckt und in einem Perkin Eimer Temperaturwechsler amplifiziert.
Die Proben wurden 6,5 min auf 94, C gehalten, dann auf eine Annealing-Temperatur von 40'C gekühlt, bevor Taq-Polymerase zugegeben wurde. Insgesamt wurden 35 Ampiifikationszyklen durchgeführt. Jeder
EMI9.3
5 min bei 94 * C,Phenol- und Chloroformextraktion gereinigt, Ethanol ausgefällt und in stenlem doppelt destilliertem Wasser w ! ederge ! öst. Die Qualität und Quantität der PCR-Produkte wurde mittels Agarosegelelektrophorese ermittelt, und die Proben wurden bei -20 C aufbewahrt, bis sie für die anschliessenden Klonlerschntte gebraucht wurden.
Klonierung, Transformation und DNA-Sequenzierung Für sämtliche lonier- und Transformationsschritte wurden Standard-DNA-Methoden verwendet (22) Restriktionsenzyme und DNA-Ligase wurden bei New England Biolabs bzw Stratagene gekauft.
Der Plasmidvektor pSV46, der zur Konstruktion von Expressionsklonen verwendet wurde, wurde grosszügigerweise von Dr. Uwe Schlokat (Immuno AG, Orth, Österreich) bereitgestellt. Der Vektor war ein Denvat des auf SV40 basierenden eukaryontischen Expressionsvektors pSVss (Clontech). von dem das das ss-Galactosidasegen enthaltende Insert (23) durch Verdau mit Notl und Religation entfernt worden war. Ein
EMI9.4
Hind Klenow-Einfüllung und Relegation entfernt.
PCR-Produkte wurden zur Bildung von kompatiblen Enden mit Notl verdaut und In Plasmid psV46 ligiert, welches mit Notl lineanslert und zur Verhinderung einer Rezirkulation des Vektors dephosphoryliert wurde. Die Transformation des E coli-Stamms HB101 wurde unter Verwendung der Ligationsmischungen ausgeführt, und es wurden ampicillinresistente Kolonien ausgewählt. Plasmide mit richtig onentierten Inserts wurden durch Restriktionsanalyse Identifiert und mittels CsCl-Gradientenzentrifugation gereinigt.
Für jedes Plasmidkonstrukt wurde gereinigte doppelsträngige Plasmid-DNA aus einer einzigen Präparation für die DNA-Sequenz-Bestimmung verwendet. Die Sequenzlerungsreaktlonen wurden In einem Perkin- Etmer-Temperaturwechster unter Verwendung von TBE-spezifischen Primern, AmpliTaq-Polymerase (Perkin Eimer Cetus) und mit fluoreszierendem Farbstoff markierten Didesoxyterminatoren gemäss den Instruktionen des Herstellers (Applied Biosystems) durchgeführt. Die Produkte der Sequenzlerungsreaktlonen wurden auf
<Desc/Clms Page number 10>
einem automatischen DNA-Sequenzer 373A von Applied Biosystems analysiert.
Infektion und Transfektion von COS-Zellen COS-1-Zellen (24) (freundlicherwelse von M. Huber und M. Billeter, Universität Zürich bereitgestellt) wurden In "COS-Medium", bestehend aus Dulbecco's MEM (Gibco-BRL), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, Penicillin (100 E/ml) und Streptomycin (100 u. g/ml) bei 37. C und 5 % C02 gehalten.
Plasmide, enthaltend kionierte TBE-Gene, wurden durch liposom-vermittelte Transfektion unter Verwendung einer Modifikation des Verfahrens von Feigner et al. (25) in COS-1-Zellen eingebracht. LipofectinReagens (Gibco-BRL) wurde 10 Opti-MEM-I-reduziertem Serummedium (Gibco-BRL) auf 20 u. g/ml verdünnt und mit einem gleichen Volumen an OptiMEM-I. enthaltend 8 ng/ml der entsprechenden Plasmid-DNA
EMI10.1
zur Entfernung von Spuren von Serum aus dem Wachstumsmedium zweimal mit 1 ml OpttMEM gewaschen worden waren, zugegeben. Die Zellen wurden mit der DNA-Lipofectln-Mischung 5 h bei 37.
C, 5 % C02, inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 1 ml komplettem COS-Medium, und die Inkubation wurde über Nacht fortgesetzt. 24 h nach der Transfektion wurde das Medium entfernt und durch frisches COS-Medium ersetzt, und die Inkubation wurde fortgesetzt bis ca. 46 h nach der Transfektion, zu welchem Zeitpunkt Zellen entweder zur Immunfluoreszenzanalyse fixiert oder zur Analyse auf mtrazelluläres Antigen mittels ELISA aufgelöst waren.
Das Verfahren zur Infektion von COS-Zellen mit TBE-Virus für Immunfluoreszenz-Kontrollen war im wesentlichen Identisch mit dem Transfektionsverfahren, mit der Ausnahme, dass anstelle von Plasma-DNA und Lipofektin TBE-Virus 10 Form einer Gehirnsuspension von Mäusesäuglingen, die 100fach In Optl-MEM- t-Medium verdünnt war, verwendet wurde.
Immun fluoreszenzbes timmung Auf Glasdeckgläsern gezüchtete COS-Zellen wurden 46 h nach der Infektion oder nach der Transfektion In einer 1 : 1-Mischung von Aceton und Methanol 10 min lang bei -20-C fixiert. Eine Indirekte Standardimmunfluoreszenz wurde unter Verwendung von entweder polyklonalem Kaninchenantiserum, das gegen TBE-
EMI10.2
von Langat-Virus. einen nah verwandten, von Zecken übertragenen Flavivirus, gerichtet war, wurde grosszügigerweise von L. lacono-Connors (Fort Detrick, MD) zur Verfügung gestellt. Die Produktion und Charakterisierung der Reihe von 19 E-spezifischen MAbs ist vorbeschrieben (4, 27).
Primärer Antikörper (Serum oder AscitesFlüssigkeit wurde 50fach in PBS verdünnt, und 25u. dieser Verdünnung wurden zu jedem Deckglas zugegeben. Die Zellen wurden dann bei 37. C 45 min lang in einer Feuchtkammer mit Antikörper inkubiert.
Nach zweimalige Waschen mit PBS wurden 25ni fluoreszierender sekundärer Antikörper, 10fach in PBS + 0, 001 % Naphthalin-Schwarz verdünnt, zugegeben und 45 min lang bei 37'C mit Zellen Inkubiert. Nach zwei weiteren PBS-Waschungen und 30minütigem Trocknen unter einem Ventilator wurden die Deckgläser mit DePex (Serva) auf einen Mikroskop-Objektträger befestigt. Die Präparate wurden unter Verwendung eines Nikon FXA-Fluoreszenz-Mikroskops photographiert.
ELISA TBE-Virusproteine expnmlerende COS-Zellen wurden durch Zugabe von 100111 eines 0,05 M Triethanolamin, pH 8, 0, 0, 1 M NaCI und 1% Triton X-100 enthaltenden Puffers direkt zu den Zellen In Jeder Vertiefung einer Platte mit 24 Vertiefungen gelöst. Nach 30 min auf Eis wurden die Lysate in Mlkrozentnfugenröhrchen transferiert, durch 5minütige Zentnfugation bei 4. C in einer Eppendorf-Mikrozentnfuge geklärt und bei - 80. C gelagert.
TBE E-Protein wurde durch vierschichtigen ELISA wie zuvor beschrieben (28) quantitativ bestimmt, wobei gereinigter TBE-Virus, der 1 h bei Zimmertemperatur in Lyse-Puffer vorbehandelt worden war, als Standard verwendet wurde.
<Desc/Clms Page number 11>
EMI11.1
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde, wie in Materialien und Methoden beschrieben, verwendet, um eine Minibank von cDNA-Plasmid-Klonen mit Inserts zu konstruieren, die entweder dem prM + E-Bereich (SV-PE-Relhe), Nucleotide 388-2550, oder dem E-Bereich (SV-E-Reihe), Nucleotide 883-2550, des TBEVirus-Genoms entsprachen (Fig.
13) Da die TBE-Virus-Strukturproteine normalerweise durch Co-Translationsprozessierung eines grossen Polyprotein-Vorläufers erzeugt werden, wurden die Translations-Start- und -Stop-Stellen in die Enden der PCRProdukte eingeführt, indem sie in die Oligonucleotid-Primer eingebaut wurden. In jedes Konstrukt wurde ein natürliches ATG-Codon, das in einem geeigneten Kontext placiert war, um als Initiator-Codon zu dienen, stromaufwärts der internen Signalsequenz eingeführt, um eine natürliche Prozessierung durch die WirtsSignalase und das richtige Hinführen In den Sekretionsweg zu ermöglichen. Auf ähnliche Weise wurde das TG-Stop-Codon in jedem Konstrukt stromabwärts der Signalase-Spaltungsstelle, die den Carboxy-Terminus von Protein E bildet, placiert.
Die Erkennungsstellen für das Restriktionsenzym Notl wurden ebenfalls in die Enden eingebaut, um ein nachfolgendes Kloneren der PCR-Produkte zu erleichtern.
Die PCR-DNAs wurden mit Notl geschnitten und in die Notl-Kionierungsstelle des Plasmidvektors pSV46, eine modifizierte Form von pSVss (vgl. Materialien und Methoden), ligiert, was ermöglichte, dass korrekt inserierte Gene unter der Steuerung des frühen SV40-Promotors exprimiert wurden (23). Der Vektor
EMI11.2
zur Verfügung, um eine Replikation der rekombinanten Plasmide in transfektierten COS-Zellen, die konstitu- tiv das grosse SV40-T-Antigen expnmleren (24) zu ermöglichen.
Die Ligationsmischungen wurden zur Durchführung einer Transformation In E. coli verwendet, und
EMI11.3
Plasmid wurde durch Verdau mit Restnktionsenzymen und Agarose-Geleiektrophorese bestimmt. Klone mit richtig onentierten Inserts wurden zur weiteren Analyse behalten.
Analyse von PCR-erzeugten Mutationen Um eine detaillierte Analyse der klonierten Inserts durchzuführen und die Effizienz der Mutagenese durch Taq-Polymerase zu beurteilen, wurden 13 einzelne E. coli-Klone, die Plasmide der SV-PE-Sene enthielten und 9, die Plasmide der SV-E-Serie enthielten, ausgewählt. Die Plasmid-DNA aus jedem Klon wurde gereinigt und durch vollständiges Sequenzieren der klonierten Inserts In beiden Strängen analysiert. Die cDNA-Sequenzen wurden dann mit der entsprechenden RNA-Sequenz des elterlichen Wildtyp-TBE-Viruss- tammsNeudörfl (17) verglichen.
Wie erwartet, enthielt jeder der Plasmid-Klone mehrere Nucleotidunterschiede in bezug auf die WildtypTBE-Virussequenz. Mit einigen Ausnahmen (siehe unten) waren die meisten dieser Veränderungen Einzelmutationen, die offensichtlich während der PCR-Amplifikation eingeführt worden waren, und wurden nur in einem einzigen Klon gefunden.
<Desc/Clms Page number 12>
EMI12.1
<tb>
<tb>
Tabelle <SEP> 3. <SEP> Zusammenfassung <SEP> PCR-erzeugter <SEP> Mutationen <SEP> Tabelle <SEP> 3 <SEP> (Forts.)
<tb> Aminosaureangerungen0 <SEP> Aminosäureänderungenb
<tb> Nucleotio- <SEP> NucleotidKlon <SEP> énderungena <SEP> prM <SEP> E <SEP> Klon <SEP> änderungen <SEP> a <SEP> prM <SEP> E
<tb> SV-PE <SEP> 06 <SEP> 782 <SEP> T-C <SEP> Leu <SEP> 101-Pro <SEP>
<tb> 01 <SEP> 94S <SEP> 5G-A <SEP> 865 <SEP> A-G <SEP> Lys129-Glu
<tb> 1122 <SEP> G-C <SEP> Gtn <SEP> 50-His <SEP> 002 <SEP> C-T <SEP>
<tb> 1395 <SEP> C-T <SEP> 1972 <SEP> G-A <SEP> Gly <SEP> 334-Ar%
<tb> 2027 <SEP> T-C <SEP> Val <SEP> 352-Als <SEP> 07' <SEP> 1327 <SEP> G-del <SEP> Ala <SEP> 119-Leseramen-
<tb> 2480 <SEP> A-G <SEP> 2248 <SEP> G-A <SEP> Ala <SEP> 426-Thr <SEP> verscrneo.
<tb>
02 <SEP> 2 <SEP> 551T-A <SEP> Val <SEP> 24-Glu <SEP> 08 <SEP> 701 <SEP> T-A <SEP> Lcu <SEP> 74-Gln
<tb> 10SO <SEP> G-A <SEP> 2092 <SEP> A-G <SEP> Met <SEP> 374-Val
<tb> 1153 <SEP> T-C <SEP> 2124 <SEP> T-C
<tb> 1168 <SEP> T-C <SEP> Ser <SEP> 66-Pro <SEP> 09 <SEP> <SEP> T-C'
<tb> 1690 <SEP> A-G <SEP> Arg <SEP> 2-0-Giy <SEP> 960 <SEP> A-T <SEP>
<tb> 2458 <SEP> G-del <SEP> Ala <SEP> 495-Leserament <SEP> 1746 <SEP> A-G
<tb> 03 <SEP> 952 <SEP> T-C <SEP> Cys158-ARg <SEP> versonietung <SEP> 2086 <SEP> A-G <SEP> tle <SEP> 372-Val
<tb> 976 <SEP> C-T <SEP> Are <SEP> :- <SEP> :
<SEP> ys <SEP> 2142 <SEP> T-C <SEP>
<tb> 1163 <SEP> A-G <SEP> Lys <SEP> 64-Arg <SEP> 2290 <SEP> G-A <SEP> Val <SEP> 440-Ile
<tb> 1679 <SEP> A-G <SEP> Asn <SEP> 230-Ser <SEP> 2361 <SEP> A-G
<tb> 1889 <SEP> T-A <SEP> Met <SEP> 306-Lys <SEP> SV-PE
<tb> 044 <SEP> 1434 <SEP> C-T <SEP> 104 <SEP> 1625 <SEP> A-G <SEP> Asp <SEP> 218-Gly
<tb> 2275 <SEP> 275 <SEP> Lys <SEP> 435-Stop <SEP> 2475 <SEP> T-C
<tb> 2364 <SEP> ga <SEP>
<tb> 05c <SEP> 701 <SEP> T-C <SEP> Leu <SEP> 74-Pro <SEP> 12e <SEP> 1203 <SEP> G-A <SEP> Met <SEP> 77-Ile
<tb> 1485 <SEP> C-A <SEP> 13e <SEP> 1366 <SEP> T-C <SEP> Tyr <SEP> 132-His
<tb> 1492 <SEP> T-C <SEP> 1381 <SEP> A-G <SEP> Ile <SEP> 137-Val
<tb> 1893 <SEP> T- <SEP> Cys <SEP> 307-5100 <SEP> 1728 <SEP> G-A <SEP> Met <SEP> 252-Ile
<tb> SV-E <SEP> 2134 <SEP> C-T
<tb> 01'1239 <SEP> C-T <SEP>
<tb> 02 <SEP> 1093 <SEP> A-T <SEP> Met <SEP> 41-Leu
<tb> 2301 <SEP>
C-T
<tb> oui <SEP> 321 <SEP> G-A <SEP> Val <SEP> 117-Ile
<tb> 1688 <SEP> A-G <SEP> Glu <SEP> 239-Gly
<tb> 1717 <SEP> G-A <SEP> Ala <SEP> 249-Thr
<tb> 2053 <SEP> A-G <SEP> Asn <SEP> 361-ASP <SEP>
<tb> 2092 <SEP> A-G <SEP> Met <SEP> 374Val
<tb> 04 <SEP> 2073 <SEP> T-C
<tb> 2438 <SEP> C-T <SEP> Ala <SEP> 489-Val
<tb> 05 <SEP> 938 <SEP> T-C <SEP> (Leu153-Prole
<tb> 973 <SEP> T-C <SEP> Ser <SEP> t-Pro <SEP>
<tb> 2401 <SEP> T-G <SEP> Ser <SEP> 477-Ala <SEP>
<tb> 06 <SEP> 891 <SEP> C-T
<tb> 1151 <SEP> G-A <SEP> Cys <SEP> 60-Tyr
<tb> 1364 <SEP> T <SEP> -C <SEP> Val <SEP> 131-Ala <SEP>
<tb> 1567 <SEP> A-G <SEP> Ile <SEP> 199-Val
<tb> 2045 <SEP> T-C <SEP> Ile <SEP> 358-The
<tb> 07 <SEP> 125-T-C
<tb> 1694 <SEP> T-C <SEP> Leu <SEP> 241-Pro
<tb> 1794 <SEP> A-G <SEP>
<tb> 2159 <SEP> G-T <SEP> Gly <SEP> 396-Val
<tb> 08 <SEP> 1806 <SEP> A-G
<tb> 2205 <SEP> A-G
<tb> 09 <SEP> 2491 <SEP>
A-dele
<tb>
EMI12.2
betre"SV-Ewt. "umobenannt. eAndere nicht durch PCR-erzeugte Mutationen nicht angefuhrt (vel. Text)
Nur der C-terminale Teil von prM war in diesem
Konstrukt vorhanden Wie 10 Tabelle 3 dargestelit, enthielten die 22 Sequenzierten I nserts (43. 549 bp insgesamt) 71 einzelne Nucleotidänderungen, die auf Taq-Polymerase-Fehler zurückzuführen waren. Von diesen Änderungen führten 42 (59%) zu Substitutionen In der vorausgesagten Aminosäuresequenz und 3 zu Deletionen, die zu Rahmenverschiebungen führten (Tabelle 4).
<Desc/Clms Page number 13>
Tabelle 4
EMI13.1
<tb>
<tb> PCR-Mutationshäufigkeit
<tb> Basenpaaränderungen <SEP> Anzahl <SEP> des <SEP> Auftretensa <SEP> Häufigkeit <SEP> (pro <SEP> bp)
<tb> G/C-AiT <SEP> 20 <SEP> (28%) <SEP> 4, <SEP> 59 <SEP> x <SEP> 10-4
<tb> G/C-T/A <SEP> 2 <SEP> (2.8%) <SEP> 4.59 <SEP> x <SEP> 10-5
<tb> G/C-C/G <SEP> 1 <SEP> (1,4%) <SEP> 2,30 <SEP> x <SEP> 10-5
<tb> A/T-G/C <SEP> 37 <SEP> (52%) <SEP> 8, <SEP> 50 <SEP> x <SEP> 10-4
<tb> A/T-C/G <SEP> 1 <SEP> (1,4%) <SEP> 2,30 <SEP> x <SEP> 10-5
<tb> A/T-T/A <SEP> 7 <SEP> (9. <SEP> 9%) <SEP> 1, <SEP> 61 <SEP> x <SEP> 10-4
<tb> G/C <SEP> Deletion <SEP> 2 <SEP> (2, <SEP> 8%) <SEP> 4, <SEP> 59 <SEP> x <SEP> 10-5
<tb> A/T <SEP> De <SEP> Deletion <SEP> 1 <SEP> (1.
<SEP> 4%) <SEP> 2, <SEP> 30 <SEP> x <SEP> 10-5 <SEP>
<tb> Übergänge <SEP> 57 <SEP> (80%) <SEP> 1, <SEP> 31 <SEP> x <SEP> 10-3 <SEP>
<tb> Transversionen <SEP> 11 <SEP> (15%) <SEP> 2, <SEP> 53 <SEP> x <SEP> 10-4
<tb> Alle <SEP> Mutationen <SEP> 71 <SEP> (100%) <SEP> 1, <SEP> 63 <SEP> x <SEP> 10-3
<tb> Aminosäuresubst. <SEP> 42 <SEP> (59%) <SEP> 9, <SEP> 64 <SEP> x <SEP> 10-4
<tb> Stille <SEP> Mutationen <SEP> 24 <SEP> (34%) <SEP> 5, <SEP> 51 <SEP> x <SEP> 10-4 <SEP>
<tb> Leserahmenverschiebungen <SEP> 3 <SEP> (4, <SEP> 2%) <SEP> 6, <SEP> 89 <SEP> x <SEP> 10-5
<tb> Term <SEP> i <SEP> nationscodons <SEP> 2 <SEP> (2, <SEP> 8%) <SEP> 4, <SEP> 59 <SEP> x <SEP> 10-5
<tb>
EMI13.2
<Desc/Clms Page number 14>
--GiCfragmente aus SV-PE04 und SV-E01 (nachfolgend SV-PEst bzw. SV-Ewt genannt) ausgetauscht, wie in Fig. 14 gezeigt.
Zu diesem Zweck wurden zwei Spaltstellen für das Restriktionsenzym Cfr101 verwendet, eine zwischen den Nucleotiden 960 und 961, nahe der Grenze der prM- und E-Gene, und die andere im Ampicillin-Resistenzgen des Vektors. Eines der resultierenden Plasmidkonstrukte, SV-PEwt, enthielt das Wildtyp-prM-Gen aus SV-PEst und das Wildtyp-E-Gen aus SV-Ewt, während dem anderen, SV-Est, das prM-Gen fehlte, dieses aber das Stop-Codon-enthaltende E-Gen aus SV-PEst enthielt. Diese Änderungen wurden durch Sequenzleren der Inserts belder Plasmide bestätigt.
Diese beiden Konstrukte vervollständigten ein Set aus vier Expressionsplasmiden zum Vergleichen der Struktur und der Verarbeitung von aus einem Wildtyp-Konstrukt (SV-PEwt) exprimierten E-Proteinen mit jenen, welchen prM (SV-Ewt), der EAnkerbereich (SV-PEst) oder beides (SV-Est) fehlte.
Detektion und quantitative Bestimmung von in COS-Zellen exprimierten TBE - Virus-Strukturproteinen Zum Beweis, dass die oben beschriebenen Expressionsplasmide zur Expression von TBE-Virus-prM- und EProteinen in Säugerzellen verwendet werden könnten und zum Vergleich der Expressionsmengen mit Virusinfizierten Zellen wurden rekombinante Plasmide, die kionierte TBE-Virus-E- oder prM + E-Gene enthielten, durch Liposom-vermittelte Transfektion in CaS-1-Zellen eingeführt. Die Expression der prM- und E-Proteine wurde durch indirekte Immunfluoreszenz (IF) nachgewiesen, wobei entweder Virusmembranprotein-spezifisches polyklonales Serum oder monoklonale Antikörper (Mabs), die gegen die Proteine prM oder E gerichtet waren, verwendet wurden.
Die maximale Fluoreszenzintensität wurde etwa 46 h nach der Infektion beobachtet, wobei etwa 50% der Zellen TBE-Virus-Antigen expnmierten. Alle der in Tabelle 3 aufgezählten Plasmide ergaben in der IF-Untersuchung positive Ergebnisse, wenn polyklonales anti-TBE-Serum verwendet wurde, obwohl die Fluoreszenz schwach war bei Zellen, die mit den fünf Plasmiden transfektiert worden waren, welche die Rahmenverschiebung am Codon 125 von E enthielten. Fig. 15 zeigt, dass sowohl SVPEwt als auch SV-Est ein E-Protein erzeugten, weiches unter Verwendung von anti-E-Mab B3 in Intrazellu- lären Membranen nachweisbar war.
Erwartungsgemäss reagierten die mit SV-PEwt und SV-PEst, jedoch nicht die mit SV-Ewt und SV-Est transfektierten Zellen mit dem anti-prMK Mab 8HI. was beweist, dass das prM-Protein In diesen Zellen anwesend war.
Intrazelluläre E-Proteine in Lysaten von COS-Zellen, die mit SV-PEwt, SV-PEst. SV-Ewt und SV-Est transfektiert worden waren, sowie In CaS-Zellen, die mit TBE-Virus infiziert worden waren, wurden unter Verwendung eines vierschichtigen ELISA quantitativ bestimmt, wobei mit Lyse-Puffer vorbehandelter, gereinigter TBE-Virus als Standard verwendet wurde. Wie in Tabelle 5 gezeigt, enthielten COS-Zellen, die mit SV-PEwt, dem Konstrukt mit den vollkommen intakten prM-und E-Genen. transfektiert worden waren, 46 h nach der Transfektion 13% so viel E-Protein wie die mit TBE-Virus infizierte Kontrolle.
Da praktisch alle infizierten Zellen mittels Immunfluoreszenz positiv waren (Daten nicht dargestellt), Im Vergleich zu etwa 50% durch Transfektion, scheint die intrazelluläre Menge der E-Protein-Expression < n SV-PEwt-transfektierten Zellen etwa ein Viertel von jener in Virus-infizierten COS-Zellen zu sein. SV-PEst, SV-Ewt und SV-Est, welchen der E-Anker, das prM-Gen, bzw. sowohl Anker als auch prM fehlt, enthielten alle etwas geringere Mengen an Intrazellulärem Virus-Antigen zum Zeitpunkt von 46 h. (Tabelle 5).
Tabelle 5
EMI14.1
<tb>
<tb> Quantitative <SEP> Bestimmung <SEP> von <SEP> TX-100-Lysaten <SEP> von <SEP> Plasmid-transfektierten <SEP> und <SEP> Virus-infizierten <SEP> COS-Zellen <SEP>
<tb> mitels <SEP> 4-schichtigem <SEP> ELISA
<tb> Virus <SEP> oder <SEP> Plasmid <SEP> E-Protein <SEP> (ng/ml) <SEP> % <SEP> Virus-infizierte <SEP> Kontrolle
<tb> TBE-Virus <SEP> 5, <SEP> 7 <SEP> 100
<tb> SV-PEwt <SEP> 0, <SEP> 76 <SEP> 13
<tb> SV-Ewt <SEP> 0, <SEP> 37 <SEP> 6, <SEP> 5 <SEP>
<tb> SV-PEst <SEP> 0, <SEP> 24 <SEP> 4, <SEP> 2 <SEP>
<tb> SV-Est <SEP> 0, <SEP> 16 <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP>
<tb>
<Desc/Clms Page number 15>
EMI15.1
rekombinanter E - ProteineDisulfidbrücken (33), die für die Erzeugung und Beibehaltung der nativen Struktur kritisch sind (2).
Zur Beurteilung der strukturellen Integrität der expnmlerten Proteine machten wir uns eine gut-bekannte Reihe monoklonaler Antikörper zunutze. die 19 verschiedene Epitope am TBE-Virus-E-Protein erkennen. Bindungsuntersuchungen mit diesen Mabs zeigten, dass das E-Protein 10 mindestens drei antigene Domänen gefaltet Ist und dass die meisten dieser Domänen diskontinuierlich und konformationsspezifisch sind (3, 4). Diese Mabs wurden daher In der Immunfluoreszenzbestimmung als Mittel verwendet, um zu testen, ob die durch Transfektion erzeugten rekombinanten Virus-Proteine nchtig gefaltet und verarbeitet waren.
Mit SV-PEwt. SV-Ewt. SV-PEst und SV-Est transfekterte COS-Zellen wurden in Methanol-Aceton fixiert und mit Jedem der 19 Mabs auf Ihre Reaktivität getestet. Wie In Tabelle 6 gezeigt, ergaben die transfektterten Zellen alle Reaktivitätsmuster, die jenen der Infizierten Zellen sehr ähnlich waren, was andeutete, dass die Im vorübergehenden Expressionssystem erzeugten E-Proteine strukturell nativem, intrazellulärem E-ähnlich waren.
Tabelle 6. Antigenreaktivität von intrazellulärem E-Protein in
Plasmid-transfektierten und mit TBE-Virus infizierten COS-Zellen mit E-spezifischen monoklonalen Antikörpern
EMI15.2
<tb>
<tb> MAB <SEP> SV-PEwt <SEP> SV-Ewt <SEP> SV-PEst <SEP> SV-Est <SEP> infiziert
<tb> A) <SEP> +1- <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> +1- <SEP>
<tb> A2 <SEP> +/- <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> +/A3 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> +/A4 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> A5 <SEP> + <SEP> + <SEP> +/- <SEP> - <SEP> +
<tb> B1 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> B2 <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> B",
<tb> B4 <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> B5 <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> +/ci
<tb> C2 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> C3 <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> C4 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> +
<tb> C5 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> c5
<tb> 12 <SEP> +/c6
<tb>
+ s arKe nuoreszenz - schwache Fluoreszenz - keine Fluoreszenz Mabs aus den Antigen-Domänen B (B1-B5) und C (C1-C6) ergaben Im allgemeinen eine starke Fluoreszenz. wogegen die Epitope der Domäne A, A1-A4. sowohl In transfektlerten als auch in infizierten Zellen
EMI15.3
nicht exponiert waren oder durch den Fixiervorgang zerstört wurden. Interessanterweise ergab Mab A5 eine starke Fluoreszenz In mit SV-PEwt und SV-Ewt. jedoch nicht mit SV-PEst und SV-Est transfektterten Zellen.
Dies lässt darauf schliessen. dass die C-terminale Domäne von E bel der Stabilisierung des A5-Epitops irgendwie eine Rolle spielen konnte. Die Bedeutung anderer feiner Unterschiede 10 der Reaktivität einiger der Mabs (z. B. AI. A2. i2, B5) muss noch mittels einer quantitativeren Technik ausgewertet werden.
Diskussion Zum Verständnis der molekularen Wechselwirkungen, die beim Viruszusammenbau, der Antigenstruktur und den funktionellen Aktivitäten. wie der Rezeptorerkennung und der Membranfusion, eine Rolle spielen, ist es von grossem praktischem Wert. ein Versuchssystem zur Verfügung zu haben, bel welchem zufällige
<Desc/Clms Page number 16>
oder stellengenchtete Mutationen in die Strukturproteine eingeführt werden können und die Auswirkungen dieser Änderungen leicht beurteilt werden können. Wir haben nun ein solches System für den TBE-Virus erstellt.
Zu diesem Zweck erzeugten wir eine Population von zufällig mutierten TBE-Virus-prM- und E-Genen durch Zunutzemachen der natürlichen Fehlerhäufigkeit der Taq-Polymerase in der PCR. Die PCR-Produkte wurden direkt in Plasmid-Expressionsvektoren, die eukaryontische Transkriptions- und Replikations-Steuer- elemente enthielten, inseriert, und eine Anzahl von einzelnen Klonen wurde Isoliert, um eine PlasmidMinibank zu schaffen. Die Häufigkeit von Mutationen in diesen Klonen war zur Herstellung einer begrenzten Anzahl zufälliger Aminosäureänderungen in den codierten Proteinen geeignet. Wenn die Plasmide durch Transfektion in die COS-Zeiien eingeführt wurden, wurden die Virus-Proteine in für die biochemische Analyse geeigneten Mengen synthetisiert.
Ausserdem zeigte sich, dass in diesen Zellen synthetisiertes EProtein strukturell mit nativem E-Protein in infizierten Zellen fast identisch war. So wurde ein gutes Modellsystem zur Untersuchung der Auswirkungen einzelner Änderungen in den prM- und E-Proteinen und zur Kartierung struktureller und funktioneller Domänen innerhalb dieser Proteine erstellt.
Die Verwendung eukaryontischer Expressionssysteme für die Entwicklung neuer rekombinanter Vakzine
EMI16.1
Coexpression von prM-und E-Genen aus japanische Encephalitis-Virus (35-39), Gelbfiebervirus (40) und Westnil-Virus (41) zum Transport und zur Sekretion leerer Virushüllpartikel, die reife E- und M-Proteine enthalten, führt.
Extrazelluläre Partikel wurden jedoch nicht effizient erzeugt, wenn E ohne prM exprimiert war (35, 38), oder wenn die Membranproteingene mit dem Capsidprotein im selben Polyprotein in Abwesenheit der Virusprotease NS3 co-exprimiert wurden (35, 36, 39. 41). Die Virusprotease, die eine Vorläuferform des Capsidproteins spaltet, schien zur effizienten Verarbeitung des Polyproteins an der C-prM-Verbindungsstelle durch die Wirts-Signalase notwendig zu sein, wenn das gesamte C-Gen vorhanden war (39. 41). Wenn jedoch Konstrukte ohne den Cytoplasmateil von C verwendet wurden, fand die Spaltung der prMSignal sequenz In normaler Weise statt und wurden extrazelluläre Partikel erzeugt, selbst wenn NS3 fehlte.
Diese Resultate deuten auf einen möglichen Mechanismus zur Koordination des Viruszusammenbaus aufgrund einer Regulierung der Polyproteinverarbeltung hin (41).
Konishl und Mason (38) berichteten kürzlich, dass die Co-Synthese der prM-und E-Proteine des Japanischen Enzephalitis-Virus zur richtigen Faltung und Reifung des E-Proteins notwendig 1St. Diese Autoren zeigten, dass die Expression von E aus Vaccinta-Rekombinanten in Abwesenheit von prM zu nicht nchtig gefalteten Proteinen führten, die unfähig waren, in Vinonen eingebaut zu werden, wogegen prM-und E-Konstrukte nchtig verarbeitet wurden. In der vorliegenden Untersuchung, bel welcher monoklonale Antikörper verwendet wurden, beobachteten wir nur geringe Unterschiede zwischen E-Proteinen, die in Gegenwart bzw. in Abwesenheit von prM expnmiert wurden. Zur Festlegung der genauen Rolle von prM bei der Verarbeitung von E sind noch weitere Untersuchungen notwendig.
Wir verwendeten die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) als Verfahren für sowohl das Kloneren als auch die Mutagenese von TBE-Virus-prM- und E-Proteinen. Die PCR ist eine wertvolle Technik für das Klonteren sehr spezifischer Bereiche eines Genoms, da sie durch sorgfältige Auswahl synthetischer OligonucleotidPrimer die Spezifizierung der genauen Grenzen des amplifizierten Bereichs ermöglicht. Sie ermöglicht auch geeignete spezifische Änderungen, wie die Einführung von Start- oder Stop-Codons, Steuerelementen oder
EMI16.2
Nachteil der PCR ist Jedoch, dass die routinemässig In PCR-Anwendungen verwendete Taq-Polymerase fehleranfällig ist und dazu neigt, gelegentlich ein falsches Nucleotid einzubauen, was zu Punktmutationen und manchmal zu Rahmenverschiebungen führt.
Während diese Eigenschaft ein Nachteil ist, wenn man will, dass die klonierte DNA eine exakte Kopie des ursprünglichen Gens ist, sind PCR-Standard- oder modifizierte Reaktionen auch zur absichtlichen Erzeugung von Plasmid-Klonenbanken, die Zufallsmutatio- nen enthalten, geeignet.
Leung et al. (42) und Cadwell und Joyce (31) veröffentlichten kürzlich Verfahren zur Zufallsmutagenese durch PCR unter Bedingungen, die die Taq-Polymerase-GenaUlgkelt weiter verringern. Zu diesen zählen die Steigerung der MgCI2- Konzentration, die Steigerung und Ung ! e) chgew ! chtung der dNTP-Konzentrationen und das Inkludieren von MnCI2 in der Reaktion.
Zum Zweck der vorliegenden Untersuchung waren solche Modifikationen nicht notwendig, und die natürliche Mutationshäufigkeit unter im wesentlichen Standardbedingungen war zur Erzeugung einer eine begrenzte Anzahl von Mutationen enthaltenden Klonenbank passend. Tatsächlich erhielten wir für ein 496 Aminosäuren langes TBE-Virus-E-Protein im Durchschnitt ein bis zwei Aminosäureänderungen pro Klon, was eine ideale Rate für die Identifizierung wichtiger einzelner Ammosäurereste ist. Ähnliche Beobachtungen wurden auch von Zhao et al. (43) beachtet, die zur
<Desc/Clms Page number 17>
Einführung von Zufallsmutationen in das 633 Nucleotide lange crp-Gen von E. coli Standard-PCRBedingungen verwendeten.
Wir beobachteten in unseren PCR-Klonen eine starke Mutationsbereitschaft zugunsten von G/C-A/T und A/T-'G/C-Übergängen. Es wurde bereits gezeigt, dass dieses Phänomen T : G-Misspaarungen während der Amplifikation zuzuschreiben ist (15). Kürzlich wurde von Cadwell und Joyce benchtet (31), dass diese natürliche Bereitschaft durch Einstellung der relativen Konzentrationen der dNTPs 10 der Reaktion eliminiert werden könnte. Diese Modifikation wäre potentiell nützlich, weil sie zu einer zufälligeren Verteilung von Mutationen führen würde und die Wahrscheinlichkeit der Identifizierung wichtiger Stellen dadurch zunehmen würde.
Die hier präsentierte Arbeit zeigte die potentielle Bedeutung der Verwendung einer PCR-Klonierung und Mutagenese zusammen mit einem eukaryontischen Expressionssystem für die Erkundung der Struktur von Virusmembranproteinen. Wir versuchen derzeit, eine Technik zum phenotypischen Screenen von Mutanten und funtklonelle Untersuchungen zu entwickeln, die die Vielfältigkeit dieses Verfahren weiter erhöhen.
Im Anhang zitierte Literaturstellen :
1. Kunz C., Acta Leidensla, 60, 1-14, 1992
2. Heinz F. X. und Roehng J. T. in van Regenmortel M. H. V. und Neurath A. R. (Hrsgb.) Immunochemistry of Viruses. II. The Basis for Seradiagnosis and Vaccines. Elsevier Science, Amsterdam, 1990, S. 289-
305.
EMI17.1
W.,1992. Arch Viral. Suppl. Im Druck, 1993.
9. Randolph V. B., Winkler G. und Stollar V., Virology 174, 450-458, 1990.
10. Heinz F. X. und Kunz C., J Gen Virol 46, 301-309,1980.
EMI17.2
16. Heinz FX. und Kunz C., J Gen Virol 57, 263-274, 1981.
17. Mandl C.W., Heinz F. X. und Kunz C., Virology 166, 197-205, 1988 18. Gubler U. und Hoffmann B. J., Gene 25, 263-269, 1983.
19. Mandl C. W., Heinz FX, Stöckl E. und Kunz C., Virology 173, 291-301, 1989.
20. Kozak M., Cell 44, 283-292, 1986.
21. Kozak M., J Mol Biol 196, 947-950, 1987.
22. Maniatis T, Fritsch E. F. und Sambrook J., Molecular Cloning : A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spnng Harbor, NY, 1982.
23. MacGregor G. R. und Caskey C. T., Nucleic Acids Res 17, 2365, 1989.
24. Gluzman Y., Cell 23, 175-182, 1981.
EMI17.3
L.,Danielsen M., Proc Natl Acad So USA 84,7413-7417, 1987.
26. Hemz F. X. und Kunz C., J Gen Virol 49, 125-132, 1980.
27. Heinz F X., Berger R., Tuma W. und Kunz C., Virology 126, 525-537, 1983.
28. Heinz F. X., Tuma W., Guirakhoo F. und Kunz C., J Biol Stand 14, 133-141, 1986.
29. Dunning A. M., Talmud P und Humphnes SE, Nucleic Acids Res 16, 10393, 1988.
EMI17.4
31. Cadwell R. C. und Joyce G. F., PCR Methods Applic 2, 28-33, 1992.
32. Eckert K. A. und Kunkel T. A, PCR Methods Applic 7. 17-24, 1991.
33. Nowak T. und Wengier G., Virology 156, 127-137, 1987.
34. Brandt W. E., J Infect Dis 162, 577-583, 1990.
EMI17.5
<Desc/Clms Page number 18>
EMI18.1
410,1991.
37. Konishi E. Pincus S., Paoletti E., Shope R. E., Burrage T. und Mason P W., Virology 188, 714-720, 1992.
38. Konishi E. und Mason P. W., J Viral 67, 1672-1675, 1993.
39. Sato T., Takamura C., Yasuda A., Miyamoto M., Kamogawa K. und Yasui K., Virology 192, 483-490, 1993.
40. Pincus S., Mason P. W., Konishi E., Fonseca B. A. L., Shope RE, Rice C. M. und Paoletti E., Vlrology
187, 290-297,1992.
41. Yamshchikov V. F. und Compans RW., Virology 192, 38-51, 1993.
42. Leung D. W., Chen E. und Goeddei D. V., Technique 1, 11-15, 1989.
43. Zhou Y., Zhang X. und Ebright R. H., Nucleic Acids Res 19, 6052, 1991.