HU222995B1 - Kullancsok által terjesztett agyvelőgyulladás (Tick-Borne Encephalitis/TBE) vírus fertőző cDNS-klónja, ebből készült rekombináns oltóanyag és eljárás előállítására - Google Patents
Kullancsok által terjesztett agyvelőgyulladás (Tick-Borne Encephalitis/TBE) vírus fertőző cDNS-klónja, ebből készült rekombináns oltóanyag és eljárás előállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU222995B1 HU222995B1 HU9502253A HU9502253A HU222995B1 HU 222995 B1 HU222995 B1 HU 222995B1 HU 9502253 A HU9502253 A HU 9502253A HU 9502253 A HU9502253 A HU 9502253A HU 222995 B1 HU222995 B1 HU 222995B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- cdna
- virus
- tbev
- sequence
- tbe
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 142
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 51
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 title claims abstract description 49
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 25
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 title abstract description 80
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 title 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 title 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 80
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 44
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 65
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 65
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 claims description 58
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 16
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 13
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 230000001018 virulence Effects 0.000 claims description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 claims description 4
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 claims description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 claims description 4
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 claims description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 4
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 claims description 3
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 claims description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 3
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 claims description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 claims description 2
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 claims description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 2
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 claims description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 57
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 49
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 24
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 18
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 17
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 10
- ZQOOYCZQENFIMC-STQMWFEESA-N Tyr-His Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZQOOYCZQENFIMC-STQMWFEESA-N 0.000 description 9
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 8
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N Lys-Arg Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N NPBGTPKLVJEOBE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 4
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 4
- PNVLWFYAPWAQMU-CIUDSAMLSA-N Val-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C PNVLWFYAPWAQMU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 4
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 4
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 101710144121 Non-structural protein 5 Proteins 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- BNODVYXZAAXSHW-IUCAKERBSA-N Arg-His Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 BNODVYXZAAXSHW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N Arg-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N Asn-Ser Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SONUFGRSSMFHFN-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- VGRHZPNRCLAHQA-IMJSIDKUSA-N Asp-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O VGRHZPNRCLAHQA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 2
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 2
- CLSDNFWKGFJIBZ-YUMQZZPRSA-N Gln-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O CLSDNFWKGFJIBZ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N Glu-Asp Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FYYSIASRLDJUNP-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- JWBXCSQZLLIOCI-GUBZILKMSA-N Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C JWBXCSQZLLIOCI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- WMDZARSFSMZOQO-DRZSPHRISA-N Ile-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 WMDZARSFSMZOQO-DRZSPHRISA-N 0.000 description 2
- BCXBIONYYJCSDF-CIUDSAMLSA-N Ile-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O BCXBIONYYJCSDF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N Leu-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XGDCYUQSFDQISZ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 101800001030 Non-structural protein 2A Proteins 0.000 description 2
- 101800001020 Non-structural protein 4A Proteins 0.000 description 2
- 101800001019 Non-structural protein 4B Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- RFCVXVPWSPOMFJ-STQMWFEESA-N Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 RFCVXVPWSPOMFJ-STQMWFEESA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 2
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 2
- 101100173636 Rattus norvegicus Fhl2 gene Proteins 0.000 description 2
- SSJMZMUVNKEENT-IMJSIDKUSA-N Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CO SSJMZMUVNKEENT-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N Ser-Pro Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WBAXJMCUFIXCNI-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 2
- VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N Thr-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VPZKQTYZIVOJDV-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- LUMXICQAOKVQOB-YWIQKCBGSA-N Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O LUMXICQAOKVQOB-YWIQKCBGSA-N 0.000 description 2
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 2
- 208000003152 Yellow Fever Diseases 0.000 description 2
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 238000000429 assembly Methods 0.000 description 2
- 230000000712 assembly Effects 0.000 description 2
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- YSGSDAIMSCVPHG-UHFFFAOYSA-N valyl-methionine Chemical compound CSCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)C(C)C YSGSDAIMSCVPHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- MYLBTCQBKAKUTJ-UHFFFAOYSA-N 7-methyl-6,8-bis(methylsulfanyl)pyrrolo[1,2-a]pyrazine Chemical compound C1=CN=CC2=C(SC)C(C)=C(SC)N21 MYLBTCQBKAKUTJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 1
- 241000710829 Dengue virus group Species 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 241000711557 Hepacivirus Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241000725177 Omsk hemorrhagic fever virus Species 0.000 description 1
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101100002024 Thermus aquaticus pstI gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000120645 Yellow fever virus group Species 0.000 description 1
- 229940124926 Yellow fever virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- FHHZHGZBHYYWTG-INFSMZHSSA-N [(2r,3s,4r,5r)-5-(2-amino-7-methyl-6-oxo-3h-purin-9-ium-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl [[[(2r,3s,4r,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-hydroxyphosphoryl] phosphate Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1[N+]([C@H]1[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=C(C(N=C(N)N4)=O)N=C3)O)O1)O)=CN2C FHHZHGZBHYYWTG-INFSMZHSSA-N 0.000 description 1
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229960003239 encephalitis vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 108010078274 isoleucylvaline Proteins 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N methyl acetate Chemical compound COC(C)=O KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000005727 virus proliferation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
A találmány kullancsok által terjesztett agyvelőgyulladás (Tick–BorneEncephalitis/TBE)-vírus fertőző klónjára, azt kódoló teljes cDNS-szekvenciára és az abból levezethető variánsokra és mutánsokravonatkozik, amelyek fertőző TBEV-RNS-transzkriptumot kódolnak. Atalálmány értelmében a cDNS-t úgy módosítják, hogy az attenuált TBE--vírust kódoljon, amely oltóanyag előállítására alkalmazható. ŕ
Description
A találmány kullancsok által terjesztett agy velőgyulladás (Tick-Bome Encephalitis/TBE)-vírus elleni oltóanyag rekombináns úton történő előállítására, az előállítást lehetővé tevő nukleinsavakra és transzformált gazdasejtekre vonatkozik. A találmány tárgya különösen a teljes, fertőző TBEV RNS-transzkriptumot kódoló cDNS. A találmány szerinti eljárással lehetővé válik olyan attenuált TBE-vírusok előállítása, amelyek különösen alkalmasak oltóanyag termelésére.
A kullancsok által terjesztett agyvelőgyulladás (Tick-Bome Encephalitis/TBE)-vírus a Flaviviridae családba tartozik. E víruscsaládhoz három nemzetség tartozik, nevezetesen a pestivírusok nemzetsége, a hepatitis C-vírusok nemzetsége és a flavivírusok nemzetsége. Leírásunkban a „flavivírus” kifejezést a nemzetség jelölésére, és nem a család jelölésére használjuk.
A flavivírusok nemzetségéhez mintegy 70 ismert faj tartozik, amelyek közül némelyik jelentős emberi betegségek kórokozója. Idetartozik különösen a sárgaláz vírusa, a Dengue-vírusok 1-4 típusa, a japán Bvírus és a TBE-vírus. Míg az először említett vírusokat, valamint a többi flavivírus nagy részét a szúnyogok viszik át az emberre, illetve különböző emlősállatokra, a „Tick-Bome”, azaz a kullancsok által terjesztett TBE-vírusok a flavivírusoknak egy biológiailagökológiailag és epidemiológiailag különálló alcsoportját képezik. A TBE-vírusok bizonyos molekulárbiológiai, genetikai tulajdonságaikban is eltérnek a többi flavivírustól.
A flavivírusok genomja egy egyszálú, kb. 11 000 nukleotidhosszúságú RNS-molekula. Ez egy pozitív szálú molekula, azaz orientációjában mRNS-nek felel meg. Erről az RNS-molekuláról a riboszómákban minden vírusprotein leolvasódik (transzlatálódik). A flavivírusok RNS-e fertőző, azaz a vírus-RNS a vírusrészecskének bármely más komponense nélkül alkalmas módon bejut a fertőzött sejtbe, ez produktív vírusfertőzéshez, azaz új, fertőző vírusrészecskék képződéséhez vezet.
Számos, flavivírusok által okozott betegség ellen léteznek, illetve fejlesztés alatt állnak oltóanyagok.
Elméletileg kétféle oltóanyag létezik, nevezetesen élő és elölt oltóanyagok.
Az élő oltóanyagok virulenciájukban gyengített (=attenuált) vírustörzsek, amelyek nem okoznak, vagy csak igen enyhe betegséget okoznak (apatogének), azonban a virulens vad típusú vírus ellen védő immunválaszt váltanak ki. A legtöbb eddig használt élő oltóanyag esetén vagy a természetben előforduló vírust (például vacciniavírus) használják, vagy olyan vírustörzseket alkalmaznak, amelyeket laboratóriumban különböző biológiai rendszereken ismételt passzálással módosítottak (például polio- és sárgalázvírusok). Sárgaláz ellen a harmincas évek óta alkalmaznak élő oltóanyagot. A négy Dengue-vírus-típus elleni élő oltóanyag klinikai kipróbálás alatt áll.
Az elölt oltóanyagok eredetileg virulens vírusokat tartalmaznak, amelyeket alkalmas biológiai rendszereken tenyésztenek, és kémiai kezeléssel (például formaldehides kezeléssel) inaktiválnak. Az elölt oltóanyagok előállítása során nagy mennyiségű virulens patogén vírussal kell dolgozni. Az inaktiválással a vírusrészecske szerkezeti tulajdonságai is megváltozhatnak. Ez kevésbé specifikus és kevésbé hatékony immunválasz kiváltását eredményezheti. Elölt oltóanyag alkalmazásakor a beoltott személy nem fertőződik meg, viszont olyan immunválasz váltódik ki, amely a replikációkompetens, virulens vírus ellen is véd. Ilyen elölt oltóanyagot alkalmaznak jelenleg a TBE-vírus és a japán B-vírus ellen (Monath, T. 1990).
Az oltóanyag-termelés során tekintetbe kell venni az RNS-vírusok nagy mutációs gyakoriságát. E nagy mutációs gyakoriság miatt egy, az oltóanyag előállításához alkalmazott kiindulási vírustenyészet mindig heterogén, és a passzálások során állandóan változik. Ezáltal a vírus tulajdonságai is megváltozhatnak, aminek következtében termeléstechnikai és biztonságtechnikai problémák adódhatnak. így például a sárgaláz 17D oltóanyag különböző alkalmazásban levő kiindulási vírustenyészetei már jelentős szekvenciabeli különbségeket mutatnak, ami feltételezhető biológiai különbségekre utal (Post et al., 1992; Ledger etal., 1992).
A fentiek alapján kézenfekvőén adódik, hogy az oltóanyag-termelésnél előnyös, ha heterogén kiindulási vírustenyészet helyett egyetlen egységes cDNS-klónból indulunk ki. Ennek megfelelően előnyös, ha az elölt oltóanyag előállításakor is egy specifikus attenuált vírustörzset alkalmazunk.
RNS-vírusok esetén fertőző cDNS-klón nélküli attenuált vírustörzsek csak vagy véletlenszerű izolálással a természetből, vagy véletlenszerű mutánsok szelekciójával, ismételt passzálással tenyészthetők ki laboratóriumban. Az ilyen vírustörzseknél gyakorlatilag nem befolyásolható az attenuálás molekuláris elve, annak mértéke és egy virulens vad típussá való visszaalakulás valószínűsége (ez utóbbi jelenti az élő oltóanyagok legfontosabb biztonsági faktorát). Ebből következik, hogy jelenleg a TBE-vírusnak nincs olyan törzse, amely élő oltóanyagként alkalmas.
Különböző flavivírusok géntechnológiai megváltoztatásáról és kinyeréséről ismeretes, hogy nagyon nehéz, sőt lehetetlen egy, a flavivírusgenom teljes információját tartalmazó cDNS-molekulát stabilan például E. coliba klónozni. E munka során különösen tekintetbe kell venni, hogy spontán mutációk következnek be, melyek odavezetnek, hogy fertőző RNS-t nem lehet nyerni. Feltételezik, hogy meghatározott szekvenciaelemek toxikusak azon baktériumokra nézve, amelyekben a cDNSklónok szaporitandók. Erre nézve a fellépő problémák azonban nagyon eltérőek: míg a Dengue-4 (Lai et al., 1991) és a japán B-vírus (Sumiyoshi et al., 1992) esetén a teljes cDNS-templátok előállításához találhatók voltak alkalmas vektorrendszerek, ez a probléma a sárgalázvírus esetén csak három különálló DNS-ffagmens klónozásával volt leküzdhető (Rice et al., 1989). Ezenkívül a Dengue-2 és más flavivírusok esetén mindeddig nem találtak megfelelő vektorrendszert. E stabilitási problémák pontos oka még nem ismert. Ennek megfelelően egy bizonyos flavivírus fertőző törzsének előállításánál nyert eredmények nem alkalmazhatók minden további nélkül egy másik flavivírus esetén.
HU 222 995 Bl
Különösen a TBE-vírus esetén nem volt eddig ismeretes, hogy milyen vektorrendszerben, milyen orientációban, továbbá melyik DNS-szekvencia és milyen gazdasejt alkalmazásával hozható létre fertőző TBEV-klón.
A találmány célja tehát, hogy a vírus-, illetve oltóanyag-termeléshez kiindulási anyagként egy fertőző kiónt biztosítsunk.
A „fertőző klón” kifejezésen azt értjük, hogy a vírus genomját egy cDNS formájában géntechnológiai módszerekkel olyan vektorrendszerbe visszük be, amely lehetővé teszi, hogy e genomon meghatározott változtatásokat hajtsunk végre, és alkalmas módszerekkel újra vírusokat állítsunk elő, amelyek adott esetben megváltoztatott tulajdonságokkal rendelkeznek. Ismeretes, hogy komplex genom esetén, különösen RNS-genomoknál e feladat elvégzése során számos problémát kell leküzdeni.
A találmány biztosít először egy olyan, teljes nukleinsavat, amely fertőző TBEV-RNS-transzkriptumot kódol, és amelyre jellemző(k)
a) egy, az 5. ábra szerinti szekvencia, illetve
b) olyan szekvenciák, amelyek az 5. ábra szerinti szekvenciával 70% mértékben homológok. Egyik előnyös megvalósítási mód szerint ez a homológia 80%, még előnyösebben 95%.
Az 5. ábra a TBE-vírus Neudörfl-törzsének teljes cDNS-ét ábrázolja. Ez a teljes szekvencia - beleértve az e törzs 5’ és 3’ nem kódoló nukleotidszekvenciáját is - a találmány szerinti eljárás esetén a fertőző TBEVklón előállításának egy fontos előfeltétele. A technika állása szerint eddig nyilvánosságra hozott szekvencia csupán egy részszekvenciát ölelt fel, amely a 10 488. nukleotidig terjedt. A 10489. helyzetben poli(A)-val kezdődő szekvencia új, és először teszi teljessé a fertőző TBEV-t kódoló nukleinsavat.
A géntechnológiai módszerek utóbbi években bekövetkezett gyors fejlődése egyre inkább lehetővé teszi, hogy nukleinsavakat célzott módon változtassunk meg. Az ismert módszerek azonban a kettős szálú DNS-molekula célzott genetikai módosítására korlátozódnak. Ezért a viszonylag kis kettős szálú DNS-molekulából álló genommal rendelkező vírusok már nagyon korán módosíthatók voltak célzott módon genetikailag: a genomot közvetlenül klónozták egy alkalmas bakteriális vektorrendszerbe, módosították és megváltoztatott formában gazdaszervezetbe vitték át, ahol az a kívánt vírusmutánsok képződését eredményezte (Shah, 1990).
A DNS-vírusokkal ellentétben az RNS-vírusok esetén jelentősen több ráfordítással kell eljárni. Először elő kell állítani az RNS-genom kettős szálú másolatát (cDNS-t). Ezt a cDNS-t azután egészben vagy fragmensek formájában alkalmas bakteriális rendszerbe klónozzuk, elemezzük és célzottan módosítjuk. Erről a DNSről azután in vitro vagy egy sejtben pozitív szálú RNSmásolatot készítünk, ami a kívánt, célzottan megváltoztatott vírus képződéséhez vezet. Előfeltétel, hogy egy ilyen fertőző klón a vírus replikációjához szükséges genetikai elemet tartalmazza. Egyetlen nukleotid hiánya vagy egyetlen hamis nukleotid beépülése odavezethet, hogy nem képződik fertőző vírus. A Neudörfl-törzs
5. ábrán bemutatott és rendelkezésre bocsátott szekvenciája alapján először válik lehetővé, hogy fertőző kiónhoz jussunk, ami lehetővé teszi, hogy egy TBE-vírus genomját célzottan módosítsuk. Ez úgy történik, hogy a klónozott cDNS-t fertőző RNS-sé alakítjuk. Ez történhet in vitro vagy a sejtben. Ehhez az szükséges, hogy ez a transzkripciós lépés egy olyan alkalmas promotor/enzim rendszer szabályozása alatt álljon, amely lehetővé teszi, hogy a teljes cDNS-klón RNS-sé fordítódjék le. A gyakran alkalmazott RNS-polimerázok, mint például az SP6, T3, T7 különböznek abban, hogy milyen hosszú transzkriptumokat képesek előállítani, rendelkeznek azzal a tulajdonsággal, hogy a transzkripciót minden egyes enzimnek megfelelően eltérő helyen szakítják meg. Ezzel kapcsolatosan mindeddig nem volt ismert, hogy melyik enzim képes a TBEV-genom cDNSklónját teljes RNS-sé átírni.
Mint az előbbiekben említettük, a cDNS-t mutációval a kódoló vagy nem kódoló területen célzottan megváltoztathatjuk. így a vírus virulenciája vagy kitermelése befolyásolható. A találmány által tehát rendelkezésre bocsátunk olyan TBEV-kódoló cDNS-szekvenciákat, amelyeket szubsztitúcióval, inszercióval vagy delécióval úgy változtattunk meg, hogy egy csökkentett virulenciájú TBEV termelődjék, illetve úgy, hogy a TBEV replikációs sebességét befolyásoljuk.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint olyan cDNS-t hozunk létre, amely az 5’-végben mutációt tartalmaz. A flavivírusok 5’-vége egy CAP-struktúrát hordoz az első nukleotidon, az A-n (Mandl et al., 1989). Ilyen struktúrát a szokásosan alkalmazott RNS-polimerázokkal csak rossz hatékonysággal lehet létrehozni. A találmány értelmében az 5. ábra szerinti cDNS-t úgy módosítjuk (3. ábra), hogy a CAP-ot egy 5’-végi G-re kapcsoljuk. így olyan RNS képződik, amely a természetes vírus-RNS-hez képest egy nukleotiddal meg van hosszabbítva. A cDNS ilyen célzott módosítása azt eredményezi, hogy a fertőző RNS lényegesen nagyobb hozammal termelődik.
A TBEV-t kódoló cDNS további módosítása a pr(M) hasítóhelynél hajtható végre. A pr(M)-protein hasítása az érett virionokban jelen levő M-proteinné a TBE-vírusok fertőzőképességéhez szükséges. E hasítás hatékonyságának csökkentése a vírus attenuálását eredményezi.
Egy további mutáció, amely a TBEV csökkent virulenciáját eredményezi, abban áll, hogy egy glikozilezési helyet eltávolítunk, például az E-protein megfelelő N-glikozilezési helyénél végzett mutációval.
Egy további mutáció történhet az E-protein 384. aminosavának megváltoztatásával, amint ez például a B4 mutánsok esetén történt (Holzmann et al., 1990).
A TBE-vírusok továbbá úgy attenuálhatók, hogy a 263. számú TBE-vírus-izolátumnak megfelelő egy vagy több mutációt hajtunk végre. Ez a törzs egy természetben előforduló TBE-vírus, amely attenuált tulajdonságokkal rendelkezik, és amelynek genomszekvenciája a 3. táblázatban megjelölt helyeken különbözik a TBEvírus Neudörfl-törzs szekvenciájától.
A TBEV-kódoló cDNS mutációjával, például a fentiekben ismertetett módon, olyan attenuált vírust nyerhe3
HU 222 995 Bl tünk, amely élő oltóanyagként alkalmazható. Legalább két attenuálási elv kombinálásával az attenuálás a kívánt mértékben hajtható végre, és a biztonság többszörösre fokozható. Az egyes aminosavmutációk visszaalakulási gyakorisága a genetikai kód degenerációjának kihasználásával, a megfelelő kodon két bázisának módosításával jelentősen korlátozható.
A találmány által lehetővé válik tehát, hogy véletlenszerűen a természetből izolált attenuált vírustörzsek helyett az attenuálás molekuláris elve alapján annak mértékét és a vad típussá való visszaalakulás valószínűségét célzottan befolyásoljuk. így először biztosítunk olyan TBEV-mutánsokat, amelyek élő oltóanyagként alkalmazhatók.
Ezenkívül a találmány értelmében lehetővé válik, hogy a TBE-vírus nem kódoló (NC) terminális régióit célzottan befolyásoljuk. A vírus-RNS ezen nem kódoló genomrészletei legtöbb esetben különösen fontos szabályozóelemeket tartalmaznak. Ezek az elemek meghatározzák a vírusgenom replikációját, befolyásolják a vírusproteinek képződését és valószínűleg szükségesek ahhoz, hogy biztosítsák a vírusgenom virionba való pakolását. Egy vírus biológiai tulajdonságait - beleértve a virulenciát és a patogenitást - tehát döntően az NCgenomrészletek befolyásolják. Ezért a fertőző TBEV funkcionálásához különösen fontos, hogy ezen NC-genomrészletek korrekt módon és genetikailag stabilan be legyenek építve a TBEV-kódoló cDNS-be.
Néhány, szúnyogok által teqesztett flavivírus összehasonlítása azt mutatta, hogy mind az 5’-, mind a 3’terminális NC-genomrészlet meghatározott, ezen vírusok között konzervatív szekvenciaelemeket tartalmaz. A TBE-vírusok genomszekvenciája ezen területének elemzése azonban az arányokban nagy eltéréseket mutat, amint ezt a szúnyogok által teqesztett vírusoknál találtuk. Az eltérések a következőkben foglalhatók össze:
i) az 5’ szekunder struktúrák a TBE-víruson belül nem konzervatívak, és a szúnyogok által teqesztett vírusok konzervatív szekunder struktúrájától eltérnek;
ii) míg a szúnyogok által terjesztett flavivírusok egy második startkodont tartalmaznak, ilyen a TBEvírusoknál nem fordul elő;
iii) míg a szúnyogok által teqesztett flavivírusok a 3’NC-régióban konzervatív szekvenciamotívumokat tartalmaznak, ilyenek a TBE-vírusoknál teljesen hiányoznak;
iv) a szúnyogok által teqesztett flavivírusok potenciális cirkularizáló szekvenciája nem rendelkezik homológgal a TBE-vírusoknál;
v) a TBE-vírus 3’-NC-régiója a közeli rokon törzsek esetén különösen nagy fokú variabilitást mutat, ami egyetlen más flavivírusnál sem található meg. így például a Neudörfl-törzs egy majdnem kétszer olyan hosszú 3’-NC-régiót tartalmaz (lásd az 5a. ábrát), mint a Hypr-törzs. Az előbbi olyan szekvenciaelemeket tartalmaz, amelyek más törzseknél és más flavivírusoknál nem fordulnak elő. Egyik ilyen elem a poli(A)-minta, amelynek hossza hat A és több száz A között változhat. Egy ilyen struktúra a szúnyogok által terjesztett flavivírusoknál sehol sem található.
A találmány tárgykörébe tartozik a Neudörfl-törzs először rendelkezésre bocsátott 3’-NC-régiója, amint az 5a. ábra ábrázolja, valamint az olyan 3’-NC-régiók, amelyek az 5a. ábrán bemutatottal 65%-ban, előnyösen 80%-ban homológok. Ezen 3’-NC-szekvencia alkalmazása különösen fontos a TBEV variánsai és altípusai elleni oltóanyagok előállításánál.
Ismeretes, hogy a TBEV a természetben különböző variánsok formájában fordul elő. Különösen Oroszország keleti részében és Kínában található egy távolkeleti altípusnak nevezett TBE-vírus, amely jelentősen súlyosabb betegségi tüneteket és magasabb morbiditást és letalitást mutat. Másrészt ezek az altípusok csakúgy, mint sok más TBE-vírustörzs, valamint más közeli rokon TBE-vírusok (például Looping III, török agyvelőgyulladás-vírus, Omsk haemorrhagiás láz vírus) többékevésbé erős eltérést mutatnak a Neudörfl-törzs antigénstruktúrájához képest. Optimális védőhatás eléréséhez azonban az oltóanyag antigén tulajdonságainak az illető területen jelen levő vírusok tulajdonságaival meg kell egyezniük. Mivel azonban ezek a törzsek részben eltérő virulenciát mutatnak, és 3’-NC-területük felépítésében egymástól szignifikánsan eltérhetnek, problémát jelent az összes említett törzs ellen saját specifikus fertőző kiónon alapuló attenuált oltóanyagot előállítani.
A találmány szerinti megoldással lehetővé válik, hogy olyan szekvenciákat, amelyek különböző törzsek, altípusok vagy közeli rokon vírusok proteinjeit kódolják, a Neudörfl-törzs 5a. ábrán bemutatott 3’-NC-régiójával vagy attól enyhén eltérő szekvenciával kombináljunk, így lehetővé válik, hogy kívánt antigén tulajdonságú, attenuált oltóanyagot állítsunk elő. A találmány tárgykörébe tartoznak tehát az olyan, fertőző TBEV-t kódoló nukleinsavak, amelyek egy tetszőleges TBEV-törzs vagy -altípus kódolószekvenciája mellett az 5a. ábra szerinti 3’ nem kódoló szekvenciát tartalmazzák.
Ezenkívül a találmány tárgykörébe tartoznak az olyan, fertőző TBEV-t kódoló nukleinsavak, amelyek az 5. ábra szerinti kódolószekvenciából és egy rokon vagy más TBEV-, vagy flavivírus 3’ nem kódoló szekvenciájából állnak. Különösen előnyösek az olyan konstrukciók, amelyek az 5. ábra szerinti TBEV-kódoló szekvenciát és a TBEV Hypr-törzs 3’ nem kódoló szekvenciáját tartalmazzák.
A találmány tárgykörébe tartozik az összes olyan fertőző TBEV-klón, amely az előbb említett szekvenciák transzkriptumaként adódik.
Ezenkívül a találmány tárgykörébe tartoznak az olyan cDNS-konstrukciók, amelyek egy immunmodulátort kódoló nukleotidszekvencia beépítésével hatékonyabb immunválasz kiváltására képes fertőző kiónt eredményeznek. Egészségügyi, szervezési és pénzügyi okokból kívánatos, hogy egy oltóanyag hosszan tartó és széles körű immunválaszt váltson ki. A jelenleg forgalomban levő legtöbb oltóanyag esetén gyakori frissítőoltásra van szükség, és különböző vírusok elleni oltást nem lehet egyetlen oltással elvégezni. A 3’-NC-régióba olyan további genetikai információk vihetők be, melyekkel az
HU 222 995 Bl immunválasz módosítható vagy stimulálható. Ez akkor is lehetséges, ha a 3’-NC-régió részeit a megfelelő, immunmodulátort kódoló szekvenciával cseréljük ki. Ilyen, immunmodulátort kódoló szekvenciák például interleukint, diftériatoxint, koleratoxint, E. coli hőlabilis toxint és pertussistoxint kódoló DNS-szekvenciák lehetnek. így egy vakcina hatékonysága fokozható és/vagy hosszabban tartó, illetve szélesebb körű (például több TBEV-variáns elleni) immunválasz váltható ki.
A találmány szerinti fertőző TBEV-klón előállítását az alábbi leírással és példákkal, valamint a következő ábrákkal ismertetjük:
1. ábra: a pBR322 vektorplazmid plazmidtérképét mutatja, különös tekintettel az ismertetett kiónok megalkotása szempontjából fontos restrikciósenzim-felismerőhelyekre.
2. ábra: a T7-2 klón plazmidtérképét mutatja a releváns restrikciósenzim-felismerőhelyek feltüntetésével.
3. ábra: a T7-2, NK-4, 3ND-1 és 3HA plazmidokban a vírusgenom 5’- és 3’-terminális végének megfelelő cDNS-szakaszok nukleotidszekvenciáját mutatja.
4. ábra: a 3ND-1 klón plazmidtérképét mutatja a releváns restrikciósenzim-felismerőhelyek feltüntetésével.
5. ábra: egy kettős szálú cDNS-t mutat, amelynek felső szála a TBEV Neudörfl-törzs genomjának felel meg. A 3’ nem kódoló területet úgy ábrázoltuk, ahogyan a 3ND-1 és NK-4 kiónokban jelen van, azaz egy 49 nukleotidhosszúságú poli(A)-farokkal ellátva. A hosszú nyitott leolvasási keret start- és stopkodonját bekereteztük. Az egyes vírusproteinek első aminosavát kódoló kodont aláhúztuk, és a megfelelő protein nevével jelöltük. Az
1. táblázatban megadott oligonukleotidoknak megfelelő szekvenciákat és a leírásban és a plazmidtérképeken bemutatott restrikciósenzim-felismerőhelyeket jelöltük és aláhúztuk.
5a. ábra: a TBEV Neudörfl-törzs 3’ nem kódoló szekvenciáját ábrázolja, ahogyan a 3ND-1 és NK-4 kiónokban jelen van, azaz egy 49 nukleotidhosszúságú poli(A)-farokkal ellátva. A hosszú nyitott leolvasási keretet lezáró stopkodont aláhúzással jelöltük.
6. ábra: az Nk-4 klón plazmidtérképét mutatja a releváns restrikciósenzim-felismerőhelyek feltüntetésével.
7. ábra: a 3HA klón plazmidtérképét mutatja a releváns restrikciósenzim-felismerőhelyek feltüntetésével.
8. ábra: a TBE-vírus Neudörfl-törzs és az RB4 mutáns neurovirulenciájának és a neuroinvazivitásának összehasonlítását mutatja.
1. táblázat: a cDNS TBE-vírus-RNS-ből történő előállításához és az oligonukleotidok inszertálásához alkalmazott primerek, valamint azoknak az 5. ábra szerinti TBEV-nukleotidszekvencián való pozíciójának listája,
2. táblázat: az előállított fertőző TBEV-klón és a
TBEV Neudörfl-törzs wt-szekvenciája közötti különbségeket mutatja. A fertőző TBEV-klón cDNS-ének és a Neudörfltörzs wt-DNS-szekvenciájának analízisével néhány, az IK előállításával képződő szekvenciaváltozást lehetett azonosítani.
3. táblázat: a TBEV Neudörfl-törzs és az attenuált természetes 263 izolátum között szekvenciabeli különbségeket mutatja.
3a. táblázat: azokat a módosításokat és azok helyzetét mutatja áttekintő formában, amelyek a találmány értelmében egy attenuált törzs kialakításához alkalmazhatók voltak.
A TBE-vírus találmány szerinti, fertőző TBEV-klón segítségével történő előállítása a következő lépésekkel történhet:
a) egy RNS-transzkriptumot állítunk elő in vitro egy olyan rekombináns DNS-konstrukcióból, amely az 5. ábra szerinti DNS-t magában foglalja,
b) gazdasejteket fertőzünk az a) lépésben kapott RNStranszkriptummal, és
c) kinyeijük a fertőző vírusrészecskéket.
Eljárhatunk úgy is, hogy az RNS transzkripcióját in vivő (azaz a gazdasejtben) végezzük:
a) gazdasejteket transzfektálunk olyan DNS-konstrukcióval, amely az 5. ábra szerinti DNS-t foglalja magában, és
b) kinyeijük a fertőző vírusrészecskéket.
A fentiekben ismertetett eljárásban a gazdasejtek transzformálásához, illetve transzfektálásához olyan DNS-konstiukciót alkalmazunk, amely a TBEV-t kódoló DNS-szekvencia mellett egy vektorrendszert és egy promotort is magában foglal. Alkalmas promotorok például a prokarióta SP6, T3 és T7 promotorok vagy az eukarióta CMV, RSV, ss-aktin, SV40 és adeno-2 promotorok.
Amennyiben egy, a virulenciájában módosított TBEV-klónt kívánunk előállítani, vagy a fertőző vírus kihozatalát kívánjuk javítani, egy, a fentiekben ismertetett módosított DNS-ből kell kiindulni. Ennek megfelelően egy TBE-vírus fertőző klón segítségével történő előállítása a következőképpen történhet:
a) egy RNS-transzkriptumot állítunk elő in vitro egy rekombináns, módosított DNS-konstrukcióból,
b) gazdasejteket transzfektálunk a vírus-RNS-transzkriptummal, és
c) kinyeijük a módosított fertőző vírusrészecskéket, vagy:
al) gazdasejteket transzfektálunk rekombináns, módosított DNS-konstrukcióval, és bl) kinyeqük a módosított fertőző vírusrészecskéket.
Az előbbiekben ismertetett, TBE-vírus egy fertőző TBEV-klón segítségével történő előállítására szolgáló eljárást transzformált, illetve transzfektált prokarióta vagy eukarióta gazdasejtek alkalmazásával végezzük, e gazdasejtek szintén a találmány tárgykörébe tartoznak. Gazdasejtként különösen alkalmasak az E. coli-, Verő-, CHO- és BHK-sejtek.
HU 222 995 ΒΙ
A találmány tárgykörébe tartozik továbbá a kullancsok által terjesztett agyvelógyulladás elleni oltóanyag, amely rekombináns TBE-vírust tartalmaz, farmakológiailag elfogadható hordozóanyaggal és adott esetben immunmódosító anyaggal együtt.
Amennyiben elölt oltóanyagot kívánunk előállítani, egy fertőző - és mint fent ismertettük - inaktivált TBEV-böl indulunk ki. Előnyösen attenuált vírust alkalmazunk. így - például a találmány szerinti fertőző klón segítségével - olyan attenuált törzset állítunk elő, amely az elölt oltóanyag termelése során kiindulási vírustörzsként alkalmazható. Az ilyen, legyengített patogenitású kiindulási vírustörzs alkalmazása csökkenti az elölt oltóanyag termelésével kapcsolatos biztonsági kockázatot. Amint fent ismertettük, kívánatos, hogy az alkalmazott vírustörzs megfelelő sejttenyészetekben a lehető leghatékonyabban szaporodjon, hogy a víruskihozatalt maximalizáljuk. A találmány értelmében fokozott kihozatalt érhetünk el, ha az 5a. ábra szerinti 3’ nem kódoló területben adott esetben mutációt hozunk létre. Ezzel egy időben a genom más helyein végzett mutációval olyan törzseket állíthatunk elő, amelyek ugyanolyan termelési költségek mellett nagyobb kihozatalt biztosítanak, míg a Neudörfl-törzshöz képest csökkent virulenciát mutatnak.
Az oltóanyag előállítása szakember számára ismert módon történik. Az oltóanyag egységdózisonként immunológiailag hatékony mennyiségű rekombináns vírust és farmakológiailag elfogadható hordozóanyagot, valamint adott esetben immunmódosító anyagot tartalmaz.
Élő oltóanyag előállításához különösen előnyös, ha attenuált vírusból indulunk ki. Ekkor a dózis egy felnőtt személy számára előnyösen 1-10 000 fertőző egység, különösen előnyösen 10-100 fertőző egység.
Az oltás nemcsak a találmány szerinti nukleinsavakból levezettetett vírusnak, hanem magának a nukleinsavnak az adagolásával történhet.
Ekkor a beoltott szervezet sejtjei az adagolt nukleinsavból olyan attenuált vírusokat produkálnak, amelyek immunválaszt váltanak ki. A találmány szerinti nukleinsav közvetlen adagolása azt a nagy előnyt biztosítják, hogy az oltóanyag-termelés során az eddigi élő oltóanyag-előállításnál szükségessel ellentétben a munkaigényes - például sejttenyészeteken végzett - vírusszaporítás fölöslegessé válik. Ebből következik, hogy a szokásos élő oltóanyaggal kapcsolatos problémák, mint például a tárolási stabilitás, termelési biztonság és tisztaság, megoldódnak.
A találmány szerinti oltóanyagot parenterális adagoláshoz, különösen intramuszkuláris adagoláshoz formuláljuk. Emellett lehetséges az is, hogy az oltóanyagot orális adagolási formában készítsük el.
A találmány szerinti megoldást a következő példákkal közelebbről bemutatjuk.
1. példa cDNS előállítása
TBE-vírust korábbról ismert eljárással (Heinz és Kunz, 1981) csirkeembrió fibroblaszt tenyészetekben növesztettünk és a felülúszóból tisztítottunk. A tisztítás lényegében véve a következő lépésekből állt: a vírus ülepítése ultracentrifúgálással, majd kétszeri szétválasztás szacharóz sűrűséggradiensen történő centrifúgálással.
A tisztított víruspreparátumból azután a vírusgenomi RNS-t fenollal és kloroformmal kétszer végzett extrahálással kinyertük és RN-áz-inhibitor (humán placenta eredetű RNasin, Promega gyártmány) jelenlétében etanollal kicsaptuk. Az így kapott RNS mennyiségét és integritását denaturált glioxál-agarózgélen végzett elektroforézissel, akridinnarancsfestéssel (McMaster és Carmichael, 1977) határoztuk meg. Kb. 1 pg ilyen RNS-t azután a specifikus DNS szintetizálására alkalmaztunk.
A kettős szálú DNS-t Gubler és Hoffinan módszerével (1983) a Boehringer-Mannheim cég cDNS-szintetizáló készlete (katalógusszám: 1013 882) alkalmazásával szintetizáltuk. A cDNS szintéziséhez primerként vagy véletlenszerűen kiválasztott hexanukleotidokat, vagy specifikus, legtöbb esetben 20 bázishosszúságú oligonukleotidokat alkalmaztunk [például T36, T45, T61, H01 oligopeptideket, lásd az 1. táblázatot, amelyeket előzőleg a Mandl és munkatársai által (1988 és 1989) publikált TBE-vírus-prototípus Neudörfl-törzs szekvenciáinak megfelelően szintetizáltunk (Medrobe, Oslo, Norvégia)]. A kapott cDNS-t 1%-os agarózgélen ellenőriztük, és vagy közvetlenül bakteriális plazmidba klónoztuk (lásd később), vagy 1:100,1:1000, illetve 1:10 000 mértékű hígításban polimeráz-láncreakcióban (PCR) specifikus fragmensek előállításához kiindulási anyagként alkalmaztuk. A PCR során a korábban leírt körülményeket (Mandl et al., 1989) alkalmaztuk. A hosszabb (1000-4500 bázispárhosszúságú) PCR-fragmensek előállításához 68 °C-on, ahol az enzimatikus DNS-szintézis végbemegy, az inkubációs időt 7 percre meghosszabbítottuk. A PCR-hez alkalmazott primerek szintetikus, a legtöbb esetben 20 bázishosszúságú oligonukleotidok (Medrobe) voltak, amelyeket 100 ng/ml koncentrációban alkalmaztunk. A vírusgenom végeinek megfelelő cDNS-molekula specifikus konstrukciójához és a specifikus mutagenezishez (lásd később) hosszabb (51 bázisig teqedő hosszúságú, lásd az 1. táblázatot) oligonukleotidokat is alkalmaztunk, amelyek a vírusgenomnak megfelelő szekvencia mellett más szekvenciaelemeket [restrikciósenzim-felismerőhelyeket, promotort, hibás nukleotidokat (mismatch) a mutagenezishez] is tartalmaztak. Ezeket a primereket 1 pg/ml koncentrációig alkalmaztuk a PCR-ben.
2. példa
A cDNS klónozása
A kettős szálú cDNS-t restrikciós enzimekkel hasítottuk, amelyeknek felismerőhelyei a TBE-vírus szekvenciájában a publikált genomszekvencia (Mandl et al., 1988, 1989) alapján ismert volt, és pBR322 plazmidba (lásd 1. ábra) klónoztuk. Ehhez 100 ng pBR322-t (New England Biolabs) ugyanazon restrikciós enzimekkel hasítottunk, szükséges esetben a megfelelő fragmenseket 1%-os agarózgélen (BioRad) végzett elektroforézis után elektroelúcióval (Elektroeluter, IBI gyártmány) izoláltuk és a cDNS-sel összekevertük. A elegyet fenol-kloroformos extrakcióval tisztítottuk, etanollal kicsaptuk, és 20-30 μΐ térfogatú ligációs pufferben (Stratagene) 16 °C-on 2 μΐ
HU 222 995 Bl
T4 DNS-ligáz (Stratagene) jelenlétében egy éjszakán át inkubáltuk. Ezután a ligációs elegyet az enzim inaktiválása érdekében 65 °C-on 5 percig melegítettük, és 2 μΐ 5-20-szoros hígítású elegyet E. coli (HB101 törzs) transzformálására használtunk. A transzformálást vagy hősokkmódszerrel (Maniatis et al., 1982), kompetens baktériumok (Epicurian E. coli, Stratagene) alkalmazásával, vagy GenePulser (BioRad) segítségével végzett elektroporációval végeztük. A rekombináns baktériumtelepeket szokásos laboratóriumi módszerekkel továbbtenyésztettük, és a plazmid-DNS izolálására használtuk (Maniatis et al., 1982).
A cDNS klónozásának fent ismertetett közvetlen módszerét példaképpen egy 3797 bázispár-hosszúságú, a pBR322 egyedülálló PsA helyére inszertált cDNSffagmens (PstI 3021-től PsA 6818-ig) előállítására (PsA klón, lásd később) használtuk. E módszer előnye, hogy az így klónozott cDNS-fragmensek rendszerint nem tartalmaznak hibát a nukleotidszekvenciában, mint ahogyan az a PCR alkalmazásakor gyakran megfigyelhető. Ezzel a módszerrel azonban a TBE-vírus genomja nem minden részletének megfelelő cDNS-fragmens volt klónozható. Különösen a vírusgenom végeinek megfelelő cDNS-fragmensek előállításához kellett PCR-t alkalmazni. A PCR-technikával előállított fragmenseket azután a fent ismertetett módszerrel klónoztuk vagy PCR-ben olyan oligonukleotidprimereket alkalmaztunk, amelyek 5’-végükön olyan restrikciósenzim-felismerőhelyeket tartalmaztak, amelyek azután a klónozásnál alkalmazhatók.
3. példa
A klónozott cDNS jellemzése és szekvenciaelemzése
Minden bakteriális plazmidba klónozott cDNS-fragmenst hosszúságára és a plazmidban való orientációjára, valamint az esetlegesen előforduló deléciókra vagy inszerciókra, vagy a rekombinációval létrejövő változásokra nézve elemeztünk. Ehhez néhány pg plazmidDNS-t a megfelelő E. coli HB101 telep 2-3 ml tenyészetéből tisztítottunk (Magic Mini Prep System, Promega) és különböző restrikciós enzimekkel emésztettünk. Ezután az 1-2%-os agarózgélen szétválasztott fragmensek specifikus mintázatot mutattak, amellyel a cDNSfragmensek első közelítésben jellemezhetők voltak. Azon plazmidokból, amelyeket ezen elemzés alapján kiválasztottunk, 1-2 pg-ot nagy tisztaságú formában állítottunk elő (CsCl-gradiens-tisztítás, Maniatis et al., 1982). Kb. 1 pg ilyen plazmidpreparátumokat egyenként szekvenciaelemzési reakcióba vittünk. A szekvenciaelemzést fluoreszcens színezékkel jelzett didezoxiterminációval (ABI, Perkin Elmer) és automatizált szekvenciaelemzővel (373A, ABI/Perkin Elmer gyártmány), a gyártó cég reagenseivel és a kettős szálú DNS szekvenálására ajánlott körülmények között végeztük. A szekvenálási reakcióban printerként mintegy száz 20 mérés oligonukleotidkollekciót (Medrobe, Oslo, Norvégia) alkalmaztunk, amelyeknek szekvenciája legfeljebb 400 nukleotidos szakaszokban komplementer volt a TBE-vírus Neudörfl-törzs plusz és mínusz szálával. E primer alkalmazásával a nukleotidszekvencia a genom tetszés szerinti helyén mindkét orientációban elemezhető volt. Elvileg csak olyan fragmenseket alkalmaztunk további klónozásra, amelyeknek szekvenciáját teljes mértékben meghatároztuk. A PCR során, az aminosavszekvencia megváltozásához vezető mutációkat a restrikciós fragmenseknek olyan más klónokból származó hibátlan fragmensekkel történő, standard módszerekkel (Maniatis et al., 1982) végrehajtott kicserélésével küszöböltük ki, amelyeket szintén PCR-technikával vagy a cDNS közvetlen klónozásával kaptunk. Az ilyen korrigált kiónok szekvenciáját azután teljes szekvenciaelemzéssel ismét ellenőriztük.
A szekvenciaadatok komputeres elemzését Microgenie (Beckman) és PcGene (Intellegenetics) szoftverekkel végeztük.
4. példa
T7-2 plazmid konstruálása és ismertetése
A T7-2 plazmid (2. ábra) a TBE-vírus Neudörfltörzs 5’-terminális területének cDNS-ét pBR322 plazmidba (1. ábra) inszertálva tartalmazza. A pBR322 Clal (23) és SaA (651) restrikciós enzim felismerőhelyeire egy TBEV-szekvenciát kódoló DNS-fragmenst inszertáltunk. Ez a fragmens magában foglalja az 5’-véget az 1. nukleotidhelytől a természetes TBEV-szekvenciában csak egyszer, a 3154-helyzetben előforduló Clal helyig. Az 5’-vég előtt található egy további nukleotid (G), amely a TBE-vírus természetes szekvenciájában nem fordul elő, továbbá egy T7 promotorszekvencia és a SaA restrikciósenzim-felismerőhely, amelynek segítségével a fragmens a vektorokba ligálható. Az 5’-vég pontos nukleotidszekvenciáját és az előtte elhelyezkedő szekvenciákat a 3. ábra mutatja. A szekvenciaelemzések azt mutatták, hogy a TBE-vírus Neudörfl-törzs természetes szekvenciájával ellentétben a T7-2 plazmid két nukleotidmódosulást tartalmaz (2. táblázat):
i) egy néma mutációt a 930-helyzetben (T->C), amely egy, a kiindulási anyagként alkalmazott víruspreparátum természetben előforduló változatának felel meg;
ii) egy néma mutációt a 3147-helyzetben (C-»T), amelyet azért iktattunk be, hogy a 3142-helyzetben levő Nhel helyet megszüntessük.
A T7-2 plazmid előállítását a következő konstrukciós lépésekkel végeztük.
Először az 1. példában ismertetett módon PCRtechnikával, T01 és T45 (lásd az 1. táblázatot) primerek segítségével előállítottunk egy cDNS-fragmenst, majd ezt SaA és Clal enzimmel hasított pBR322-be (lásd 1. ábrát) klónoztuk. A kapott klón tartalmazta a TBEvírus Neudörfl-törzs 1-3154. nukleotidhelyzetnek megfelelő szekvenciájának (lásd az 5. ábrát) pontosan megfelelő cDNS-szekvenciát, kivéve egyetlen néma mutációt a 930-helyzetben (lásd a 2. táblázatot). Ezt a fragmenst Nhel (3142) és Clal (3154) enzimekkel hasítottuk, és a kapott fragmenst, amely 9 bázispárból állt, és két 4 és 2 nukleotidhosszúságú túlnyúló véggel (lásd az 5. ábrát) rendelkezett, egy a T77 és T78 (lásd az 1. táblázatot) oligonukleotidokból képzett inszerttel cseréltük ki. így bevezettük a 3147-helyzetben levő mutációt.
HU 222 995 Bl
A további G nukleotid- és a T7 promotorszekvencia bevezetésére a TBEV-szekvencia nem kódoló 5’-végére az 5’-vég fragmensét a T01 primerrel bevezetett SaB helytől az Miül helyig (208-helyzet) egy olyan PCRfragmenssel cseréltük ki, amelyet a T83 (az Miül hely után hibridizálva, lásd az 5. ábrát) és T84 (amely egy T7 promotorszekvenciát, azelőtt egy SaB felismerőhelyet és utána egy további G-t tartalmaz, amely utóbbit a TBE-szekvencia húsz 5’-terminális nukleotidja követ; lásd az 1. táblázatot) primerekkel állítottunk elő, és a T7-2 plazmidot a fenti ismertetett módon kaptuk.
5. példa
A 3ND-1 plazmid konstruálása és ismertetése
A 3ND-1 plazmid a TBE-vírus Neudörfl-törzs-genomja 3’terminális területének (3017-11141. nukleotidok) megfelelő cDNS-t tartalmazza a pBR322 vektorba inszertálva. A Psíl-gyel (3607) és Λα/11-vel (4284) hasított pBR322-be egy olyan TBEV-cDNS-fragmenst inszertáltunk, amely a natív TBE-szekvenciát a Pstl restrikciósenzim-felismerőhelytől (3017-helyzet) 3’-végig (11 141-helyzet) foglalja magában. A két 3’-terminális nukleotid (CT; lásd a 3. ábrát) egy ott beiktatott Nhel hely részei, amelyeket egy Aatll hely követ, amelynek segítségével a fragmenst a vektorba ligáltuk. Ahogyan később ismertetjük, az VAel-gyel végzett emésztés és utána az így képződött 5’ túlnyúló végen végzett részleges feltöltés egy, a TBE-vírus szekvenciájának pontosan megfelelő 3’-véget eredményez. A 3’-vég pontos és a közvetlen szomszédos területek nukleotidszekvenciáját a 3. ábra mutatja. A TBE-vírus Neudörfl-törzs natív szekvenciájával ellentétben a 3ND-1 hat néma mutációt tartalmaz, amelyeket a 2. táblázatban foglaltunk össze. Ezeket a mutációkat a PCR-módszerben alkalmazott Taq polimeráz hibája okozza.
A 3ND-1 klón egy teljes 3’ nem kódoló szekvenciát tartalmaz, amely megfelel a TBE-vírus Neudörfltörzsének. Ilyen szekvencia mindeddig nem volt ismert. A 3ND-1 klón ezen szekvenciarészletét az 5. és 5a. ábrán teljes mértékben kilistáztuk. A belső poli(A)-szekvencia hossza a natív vírusban változó (Mandl et al., 1991), míg a 3ND-1 kiónban 49 nukleotidhosszúságú.
A 3ND-1 plazmidot a következő konstrukciós lépésekkel állítottuk elő.
A cDNS közvetlen (a 2. példában ismertetett) klónozásához Pstl kiónt állítottunk elő, amelyben a TBE-vírus 3021-helyzetétől 6818-helyzetéig teijedő fragmenst a pBR322 vektor egyedüli Pstl helyére inszertáltuk. Az inszert orientációját a pBR322 ampicillinrezisztenciagénjének orientációjával ellentétesre állítottuk be. Ebből a klónból a Miül (a TBE-ben 6446)/4öíII (a pBR322-ben 4284) fragmenst eltávolítottuk, és a T16 és T61 primerek (lásd az 1. táblázatot) segítségével előállított PCR-fragmenssel helyettesítettük. Ehhez a 4500 bázispár-hosszúságú PCR-fragmenst Aflul-gyel (a TBE szekvenciájának 6446-helyzete, lásd az 5. ábrát) és riadl-vel (a T61 primerben) emésztettük és a megfelelő felismerőhelyekre ligáltuk. Ezzel a TBEV-specifikus inszertet a (10 489helyzetnél kezdődő) poli(A)-szekvenciáig meghosszabbítottuk. A Neudörfl-törzs 3’ nem kódoló területének megfelelő cDNS-t a H01 primer (lásd az 1. táblázatot) segítségével állítottuk elő, a T27 és H05 primerekkel (lásd az 1. táblázatot) PCR-rel amplifikáltuk és pBR322-be a Dral (3230) és Aatll (4284) restrikciósenzim-felismerőhelyek közé klónoztuk (vö. 1. ábra). Az így kapott kiónok közül kiválasztottuk a Dra-7 plazmidot, amely egy, a TBEV-szekvencia 10482. nukleotidhelyzetétől a 3’-végig (11 142-helyzet) teijedő olyan inszertet tartalmaz, amely egy 49 nukleotidhosszúságú poli(A)-szekvenciát tartalmaz, és nem mutat nukleotidkülönbséget a TBE-vírus Neudörfl-törzs natív szekvenciájához képest. A Dral helytől (TBEV-genomban 10 484) a 3’-vég után levő Aatll helyig (lásd a 3. ábrát) teijedő fragmenst a fenti konstrukcióhoz hozzákapcsoltuk, hogy a 3ND-1 kiónt a fenti módon megkapjuk.
6. példa
Az NK—4 plazmid konstruálása és ismertetése
Az NK-4 plazmid a TBE-vírus Neudörfl-törzs teljes cDNS-szekvenciáját tartalmazza, a pBR322 vektorba a SaB (651) és az Aatll (4284) restrikciósenzim-felismerőhelyek közé inszertálva. Az 5’- és a 3’-vég a T7-2, illetve a 3ND-1 klón megfelelő végeinek felel meg (3. ábra). A 3’ nem kódoló szekvencia a 3ND-1 kiónnál ismertetettnek felel meg, és az 5a. ábra ábrázolja. A TBE-vírus Neudörfl-törzs natív szekvenciájától eltérő összesen nyolc néma mutáció a fent ismertetett plazmidok megfelelő helyének felel meg (2. táblázat).
Az NK-4 plazmid előállításához a C/al (3154)-Aatll 3’-terminális fragmenst a 3ND-l-ből izoláltuk és a Clal-gyel és AatU-vel hasított T7-2-be ligáltuk. Az így képzett plazmid 14,9 kb méretű volt, és csak elektroporációval volt bevihető E. coli HB101 sejtekbe. A rekombináns kiónok gyengén szaporodtak, és az NK-4 plazmidot a pBR322-höz képest 100-szor kisebb kópiaszámban tartalmazták.
7. példa
A 3HA plazmid konstruálása és ismertetése
A 3HA plazmid (7. ábra) olyan cDNS-t tartalmaz, amely a TBE-vírus Hypr-töizs genomja 3’-terminális régiójának felel meg. Az inszert a TBE-vírus 10 002. nukleotidjánál kezdődik. Az NS5 proteint kódoló genomszakasz egy részét, valamint a TBEV Hypr-töizs teljes 3’ nem kódoló szekvenciáját tartalmazza, a 10 835-helyzetben levő 3’-végig. Csakúgy, mint a 3ND-1 és NK-4 kiónoknál, közvetlenül a 3’-véghez egy Nhel felismerőhely található. Ehhez kapcsolódik egy BamHl felismerőhely, amelyet - csakúgy, mint a fragmens másik végén egy további őű/mHI helyet - azért vezettünk be, hogy a pBR322 vektor 375-helyzeténél levő megfelelő felismerőhelynél beiktatható legyen. A 3’-vég és környezetének pontos nukleotidszekvenciáját mutatja a 3. ábra.
A 3HA plazmid előállításához a TBEV Hypr-törzs genomi RNS-ének cDNS-ét a H01 primer segítségével (1. táblázat) állítottuk elő, és a megfelelő fragmenst PCR útján Hll és H12 primerek segítségével (1. táblázat) amplifikáltuk. A PCR primerek 5’-végükön BamHl felismerőhelyeket hoztak létre, amelyek arra szolgáltak, hogy a szegmenseket a pBR322 BamHl helyére klónoz8
HU 222 995 Bl zuk. Az 5’-terminális ZJű/mHI helyben a klónozás során egy bázis törlődik, és így a 3HA plazmidban nem funkcionális felismerőhelyként van jelen, tehát BawiHI-gyel nem hasítható. (A megfelelő restrikciós enzim felismerőhelye a 7. ábrán zárójelbe van téve.)
8. példa
Az RNS in vitro transzkripciója
Azokat a plazmidokat, amelyek egy T7 promotorszekvenciát tartalmaznak (NK-4 és T7-2), illetve ezen plazmidok másokkal alkotott ligációs termékeit (lásd később) arra használtuk, hogy in vitro transzkripcióval olyan RNS-t állítsunk elő, amely a TBE-vírus teljes genomjának felel meg. A transzkripciót CsCl-gradiensen tisztított DNS-sel MEGAscrip T7 kit (Ambion, Texas, USA) készletben levő reagensekkel, lényegében véve az előállító által megadott körülmények között hajtottuk végre. Az inkubációs időt 37 °C-on azonban 3 órára növeltük, és az RNS-szintézist befejező kezelést DNAselgyel a tipikus kísérletekben nem végeztük el. Ezenkívül a GTP nukleotid koncentrációját azokban az összeállításokban, amelyekben az m7G (5’)ppp(5’)G Cap analógot (Ambion) alkalmaztuk, egyötödére csökkentettük. 20 pl reakciótérfogatban kb. 1 pg DNS-t alkalmaztunk. A kapott RNS-t közvetlenül tovább felhasználtuk. Az RNStermék egy aliquotjának agarózgélen (McMaster és Carmichael, 1977) végzett elemzése azt mutatta, hogy az ilyen reakció-összeállításokban 1 pg DNS-ről körülbelül 10 pg olyan RNS szintetizálódik, amelynek a mérete megfelel a vírusgenom méretének.
9. példa
Az RNS transzfektálása eukarióta sejtekbe és a vírusszaporodás elemzése
BHK-sejteket tenyésztettünk 77 cm2-es palackokban szokásos laboratóriumi módszerekkel, és a majdnem összefüggő sejttenyészetet kétszer 5 ml tripszines EDTA-oldattal (Gibco) leoldottuk. A sejteket 10 ml sejttenyésztő tápoldatban szuszpendáltuk, és 50 ml-es Falcon-csőben Sigma 4K10 centrifugával 7 percig 20 °C-on 800 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálással ülepítettük. A sejtüledéket azután még kétszer hideg (4 °C-os), RNS-áz-mentes PBS-ben (Gibco) szuszpendáltuk, és a fenti módon ülepítettük. Ezután az üledéket 5 ml PBS-ben szuszpendáltuk, és 0,8 ml aliquotot (amely kb. 1 χ 106 sejtnek felel meg) bemértünk egy 0,4 cm-es elektroporációs küvettába (BioRad). A víruspreparátumtól megtisztított vagy T7 in vitro transzkripciójával előállított RNS-t közvetlenül a küvettába pipettáztuk és a sejtszuszpenzióval óvatosan összekevertük. Az alkalmazott RNS mennyisége néhány pikogramm és néhány milligramm között volt. Ezután a küvettát GenePulser készülékbe (BioRad) helyeztük, és az elektroporációt a következő paraméterekkel hajtottuk végre: 1,5 V feszültség; 25 pF kapacitás; „capacitance extenders” alkalmazása nélkül; a pulzusszabályozó „infinity”-re állításával. Ilyen körülmények között sejtkonstansként rendszerint 0,9 értéket kaptunk. Az első áramlökés után 10 másodperccel egy másodikat alkalmaztunk, majd a küvettát szobahőmérsékleten percig állni hagytuk. Csak ezután oltottuk át a sejteket egy új sejttenyésztő palackba, és a következő napig 5% borjúembrió-szérumot tartalmazó tápközegben tenyésztettük. Amikor a sejtek összefüggő réteget alkottak, a szérumkoncentrációt 1%-ra csökkentettük.
A vírusszaporodás ellenőrzésére a sejttenyészetfolyadékból naponta 50 mikroliter aliquotot vettünk, és -20 °C-on mélyhűtöttük. A TBE-vírust a sejttenyészetek felülúszójában négyrétegű ELISA-val (Heinz et al., 1986) mutattuk ki.
10. példa
TBE-vírus Neudörfl-törzs előállítása a rekombináns cDNS-ből
A TBE-vírus Neudörfl-törzset két különböző módon állítottuk elő az ismertetett rekombináns plazmidokból:
i) 1 pg NK-4 plazmidot 5 egység Nhel restrikciós enzimmel linearizáltunk és fenol/kloroform tisztításnak vetettük alá, majd etanollal kicsaptuk. A DNS-t Klenow-reakciópufferben (New England Biolabs) oldottuk és 30 pl össz-reakciótérfogatban dCTP és dTTP (Boehringer-Mannheim) nukleotidok és Klenow-enzim (New England Biolabs) jelenlétében 15 percig 37 °Con inkubáltuk. A reakcióterméket a fenti módon újra tisztítottuk, majd RNS-transzkripciós reakcióban alkalmaztuk.
ii) Több pg 3ND-1 plazmidot a fenti módon Nheigyel hasítottunk, és a túlnyúló 5’-végeket Klenow-reakcióban részlegesen feltöltöttük. Ezután a plazmidot C/al-gyel hasítottuk, és a kb. 8000 nukleotidhosszúságú TBE-specifikus fragmenst 0,3%-os SeaKem Gold Agarose (FCM)-gélen a többi reakcióterméktől elválasztottuk és elektroelúcióval tisztítottuk. E készítményből egy aliquotot agarózgélen kvantitatív módon elemeztünk. 500 ng T7-2 plazmidot Call-gye] linearizáltunk, és kb. 1-2 pg tisztított 3ND-1 fragmenssel egyesítettük. Az elegyet tisztítottuk, és 30 pl térfogatban T4 DNS-ligázzal (Stratagene) egy éjszakán át 16 °C-on ligáitok. A ligálási elegyet azután 65 °C-on 5 percig inaktiváltuk, újra tisztítottuk, és in vitro RNStranszkripciós reakcióban alkalmaztuk.
A fenti módszerek valamelyikével előállított RNS-t BHK-sejtekbe transzformáltuk (elektroporációval), és a vírusszaporodást a sejttenyészet felülúszójából négyrétegű ELISA-val követtük nyomon. A kapott rekombináns vírus antigénszerkezetét a TBE-vírus burokfehétjéje elleni monoklonális antitestek (Heinz et al., 1983; Guirakhoo et al., 1989) segítségével elemeztük, és úgy találtuk, hogy teljes mértékben megfelel a TBE-vírus Neudörfl-törzs natív szerkezetének.
Az NK-4 plazmidból előállított RNS specifikus fertőzőképességét a víruskészítményekből tisztított RNS fertőzőképességével hasonlítottuk össze. Különböző kísérletekben mindkét készítmény esetén fertőző egységenként 5 és 50 pg RNS-értéknek adódott (elektroporáció során BHK-sejtekre, a fent ismertetett módon). A transzkripciós reakció DNS-ázI-gyel a transzkripció után végzett kezelése semmilyen befolyást sem gyakorolt az RNS specifikus fertőzőképességére. A CAP9
HU 222 995 Bl analóg nélkül előállított RNS 1000-szer alacsonyabb fertőzőképességet mutatott. Ha a plazmidot nem Nhelgyel és utána Klenow-inkubálással kezeltük, hanem ΛαίΠ-vel hasítottuk, akkor kb. 10-szeresen csökkent specifikus fertőzőképességet kaptunk. Nem világos azonban, hogy a rekombináns vírus genomjának 3’vége a natív víruséval azonos-e, vagy további nukleotidokat tartalmaz, mivel az Aatll hely néhány nukleotiddal az Nhel hely után fekszik (lásd a 3. ábrát).
11. példa
TBE-vírus Neudörfl-törzs előállítása, amely egy másik törzs (Hypr-törzs) 3 ’-végét tartalmazza Több pg 3HA plazmidot TV/iel-gyel hasítottunk (így két fragmenst kaptunk: 4210 bp, 980 bp) és Klenowenzimmel inkubáltuk, az NK-4 plazmid kapcsán leírtak szerint. A plazmidot £agl-gyel tovább emésztettük (így négy fragmenst kaptunk: 3650, 800, 560 és 180 bp), és a kapott 800 nukleotidhosszúságú TBEVspecifikus fragmenst 1%-os agarózgélből tisztítottuk. 1 pg NK-4 plazmidot szintén hasítottunk £agl-gyel, a HA3 plazmid A7iel-£agl-fragmensének mintegy 200 ng-jával egyesítettük. Az elegyet tisztítottuk, ligáitok és RNS-sé írtuk át, a kapott RNS-t a fenti módon BHK-sejtekbe transzformáltuk. A képződött rekombináns vírusból RNS-t izoláltunk, és cDNS-t készítettünk róla. Erről a cDNS-ről PCR-módszerrel néhány rövid szakaszt amplifikáltunk, és ezen fragmensek szekvenciáját közvetlenül, klónozás nélkül elemeztük. A szekvenciaelemzés azt igazolta, hogy a rekombináns vírus a várt genomszerkezettel rendelkezik, a TBE-vírus Neudörfl-törzs szekvenciájával a 10 038-helyzetig és a TBE-vírus Hypr-törzs szekvenciájával a 10 039-helyzettől a 3’-végig. A monoklonális antitestekkel (Guirakhoo et al., 1989; Holzmann et al., 1992) meghatározott antigénszerkezet teljes mértékben megfelelt a Neudörfl-törzs antigénszerkezetének, azonban a rekombináns vírus a BHK-sejtekben a Hypr-törzsre jellemző erősebb citopatikus hatást mutatta, és nem a TBE-vírus Neudörfl-törzs által előhívott gyengébbet.
12. példa
A TBE-vírus egy attenuált mutánsának előállítása a rekombináns cDNS alkalmazásával A TBE-vírus Neudörfl-törzsének pontmutációja, ami az E-protein aminosavszekvenciájának 384-helyzetében levő tirozin hisztidinre való kicserélését eredményezi, a vírus neurovirulenciájának és neuroinvazivitásának szignifikáns attenuálásához vezet állatmodellben (egér) (Holzmann et al., 1990). A TBE-vírus ezen attenuált mutánsát a találmány szerinti fertőző klón segítségével most szintén előállítottuk.
A T7-2 plazmidot BamHI (1988) és Clal (3154) enzimmel hasítottuk, a kapott két, 5740 és 1170 bp hosszúságú fragmenst 1%-os agarózgélen elválasztottuk és eluáltuk. Az 1170 bp hosszúságú fragmenst Hinfl-gyel (felismerőhely a TBEV 2136-helyzetében) hasítottuk, és a kapott két 1020 bp és 150 bp hosszúságú fragmenst elválasztottuk, és az 1020 bp hosszúságú fragmenst eluáltuk. A kapott BamHUCall fragmens (5740 bp) és HinflJClal fragmens (1020) körülbelül azonos mennyiségét 4-5szörös moláris fölöslegben vett olyan kis PCR-fragmenssel összekevertük, amely a kívánt mutációt tartalmazta, és amelyet a következőképpen kaptunk: 1 ng T7-2 plazmidot alkalmaztunk PCR-reakcióban, T91 és MutOl primerekkel (1. táblázat). A MutOl primer mind a fent említett Hinjl helyet (2136), mind a mutálandó nukleotidhelyet (A helyett G a genom mínusz szálán a 2103-helyzetben) magában foglalja. A T91 prímért úgy pozícionáltuk, hogy a képződő PCR-fragmens az 1988. nukleotidhelyzetnél levő BamHI helyet is tartalmazza. A kapott PCRterméket RaiwHI-gyel és Hinfl-gyel hasítottuk, 1,2%-os agarózgélen elválasztottuk, és a 150 bp hosszúságú BamHUHinfl fragmenst elektroelúcióval izoláltuk, és a fent említett módon a két másik fragmenssel összekevertük. A három fragmens elegyét tisztítottuk, ligáitok, és E. coli HB101 sejtekbe transzformáltuk. A rekombináns plazmidokat izoláltok, és a kívánt szekvenciát szekvenciaelemzéssel azonosítottuk. A kapott plazmidot, amely egyetlen pontmutációban tér el a T7-2 plazmidtól, a T7-2 plazmiddal azonos módon TBE-vírus előállítására használtuk (lásd fent). A kapott rekombináns vírust (RB4) monoklonális antitestekkel (Heinz et al., 1983; Guirakhoo et al., 1989) elemeztük, és úgy találtuk, hogy ugyanolyan reakciómintát mutat, mint a Holzmann és munkatársai által (1990) ismertetett attenuált B4 mutáns.
13. példa
Az RB4 rekombináns mutáns virulenciatulajdonságainakjellemzése
A virulencia meghatározásához felnőtt Swiss Albínó egereket alkalmaztunk, amelyekben vad típusú Neudörfl-törzzsel végzett mind intracerebrális, mind szubkután beoltás után halálos kimenetelű agyvelőgyulladás fejlődik ki. 10 egérből álló csoportokat azonos mennyiségű, azaz 100 pfú (plakk-képző egység) Neudörfltörzzsel és RB4 mutánssal fertőztünk intracerebrálisan, illetve szubkután. Amint a 8. ábrán látható, az RB4 mutánsnak mind neurovirulenciája (ic. fertőzés), mind neuroinvazivitása (se. fertőzés) erősen csökkent a Neudörfl-törzshöz képest. A fertőző klón segítségével előállított RB4 vírus virulenciatolajdonságaiban tehát megfelel a monoklonális antitesttel szelektált VB4 variánsnak (Holzmann et al., 1990).
1. táblázat
Oligonukleotidszekvenciák
| Név | Szekvencia (5’—>3’) | |
| T01 | CGGTCGACGA TTTAGGTGAC ACTATAAGAT TTTCTTGCAC GTGCAT |
HU 222 995 Bl
1. táblázat (folytatás)
| Név | Szekvencia (5’->3*) |
| T16 | GACGGACGAA CAGATGAATA |
| T27 | CCCGGAAGGC TCGTAAAAGA |
| T45 | CCACCACATA GCGCACCAGG |
| T61 | CCGACGTCAA TATTTTTTTT TTTTTTTTTT TTGTTTAAAG |
| T77 | CTAGTCACAC TAT |
| T78 | CGATAGTGTG A |
| T83 | GCTACGGCAT GCCACAAGAT |
| T84 | CCGGCCGTCG ACTTAATACG ACTCACTATA GAGATTTTCT TGCACGTGCA T |
| T91 | AGGGGGGGCG GTTCTTGTTC |
| H01 | AGCGGGTGTT TTTCCGAGT |
| H05 | AAGACGTCGC TAGCGGGTGT TTTTCCGAGT CACA |
| Hll | CGCGGATCCA TCAACTCAGC AGTGCCT |
| H12 | CGCGGATCCG CTAGCGGGTG TTTTTCCGAG TCACA |
| MutOl | ATTGATGACT CAGTTCCCCA ACATGGATGA TGTT |
2. táblázat
Szekvenciabeli különbség a fertőző klón és a vad típusú TBE-vírus Neudörfl-törzs között
| Helyzet | Különbség (Neudörfl>I. K.) | Megjegyzés |
| „0” | G | további nukleotid az 5’-végen; T7-2-ben, ΝΚ.-4-ben |
| 930 | T->C | T7-2-ben, ΝΚ-4-ben |
| 3147 | C->T | Nhe I hely specifikusan eltávolítva; T7-2-ben, ΝΚ-4-ben |
| 4860 | C-»T | 3ND- 1-ben, ΝΚ-4-ben |
| 7434 | G—>A | 3ND-1-ben, ΝΚ-4-ben |
| | 7464 | G—>T | 3ND-l-ben, ΝΚ-4-ben |
| 7617 | T->C | 3ND-l-ben, ΝΚ-4-ben |
| 7638 | C-»A | 3ND-1-ben, ΝΚ-4-ben |
| 8493 | A—>G | 3ND- 1-ben, NK-4-ben |
3. táblázat
Szekvenciakülönbség a TBE-vírus-prototípus Neudörfl-törzs és az attenuált természetes 263. számú izolátum között
| Helyzet’ | Nukleotidb | Aminosav*1 |
| 5’-NC | ||
| 49 | G-T | |
| C | ||
| 183 | A-C | |
| 285 | C-T |
| Helyzet® | Nukleotid1’ | Aminosav” |
| 307 | T-C | |
| 345 | A-C | |
| 375 | G-A | |
| 432 | C-T | |
| 456 | C-T | |
| prM | ||
| 504 | T-C | |
| 585 | T-C |
HU 222 995 Bl
3. táblázat (folytatás)
| Helyzet’ | Nukleotidb | Aminosav1 |
| 591 | C-T | |
| 697 | T-C | Tyr-His (73) |
| 708 | C-T | |
| M | ||
| 754 | C-T | |
| 789 | A-G | |
| 798 | C-T | |
| 834 | T-C | |
| | 846 | G-A | |
| 882 | A-G | |
| 922 | A-G | Thr-Ala (60) |
| 930 | T-C | |
| 939 | T-G | |
| 960 | A-G | |
| 963 | G-T | |
| 966 | T-C | |
| E | ||
| 1014 | T-C | |
| 1035 | C-T | |
| 1065 | T-C | |
| 1068 | T-C | |
| 1127 | A-G | Asn-Ser (52) |
| 1 173 | C-T | |
| 1 191 | A-G | |
| 1200 | A-G | |
| 1471 | A-G | Ile-Val (167) |
| 1492 | T-C | |
| 1497 | T-C | |
| 1620 | T-C | |
| 1680 | C-T | |
| 1 833 | C-T | |
| 1932 | C-T | |
| 1 963 | A-T | Thr-Ser(331) |
| 2 037 | C-T | |
| 2 160 | G-A | |
| 2 283 | A-G | |
| 2 286 | T-C | |
| 2 301 | C-T | |
| 2 328 | G-A | |
| 2 343 | A-G | |
| 2 412 | T-C | |
| 2 439 | C-T | |
| NS1 | ||
| 2 469 | T-C |
| I Helyzet’ | Nukleotidb | Aminosav*1 |
| I 2541 | A-G | |
| 2553 | T-C | |
| 2 613 | G-A | |
| 1 2 628 | T-C | |
| | 2 658 | C-A | |
| 2 689 | T-C | |
| 2 859 | C-T | |
| 3 015 | A-G | |
| 3 021 | A-C | |
| 3 068 | G-A | Arg-Lys (203) |
| 3 180 | A-G | |
| 3 185 | T-C | Leu-Ser (242) |
| 3 225 | C-T | |
| 3 237 | T-C | |
| 1 3240 | C-T | |
| 3 271 | T-C | Tyr-His (271) |
| 3 288 | T-C | |
| 3 309 | C-A | |
| 3 363 | T-C | |
| 3 486 | G-A | |
| NS2A | ||
| 3 529 | T-C | |
| 3 546 | A-G | |
| 3 600 | G-A | |
| 1 3615 | G-A | |
| 3 633 | T-C | |
| 3 634 | A-T | Ile-Phe (40) |
| 3 642 | T-A | |
| 3 711 | C-T | |
| | 3 729 | G-A | |
| 3 732 | G-A | |
| 3 759 | C-T | |
| 3 805 | T-C | |
| 3 897 | G-T | Glu-Asp (127) |
| 3 898 | T-C | Phe-Leu (128) |
| 1 3 936 | G-A | |
| 3 981 | T-C | |
| 4 026 | C-T | |
| 4 047 | A-G | |
| 4 062 | A-T | |
| 4117 | G-A | Val-Ile (201) |
| I 4132 | G-A | |
| | 4134 | G-A | Gly-Arg (206) |
| 4 135 | T-C | |
| 4164 | A-G |
HU 222 995 Bl
3. táblázat (folytatás)
| Helyzet | Nukleotidb | Aminosav |
| 4183 | T-C | |
| 4186 | T-G | Ser-Ala (224) |
| 4191 | G-T | |
| NS2B | ||
| 4 276 | T-C | Ser-Pro (24) |
| 4 380 | T-G | |
| 4 387 | T-C | Tyr-His (61) |
| 4434 | G-T | |
| 4449 | T-A | |
| 4 504 | A-C | Ile-Leu (100) |
| 4 506 | T-G | |
| 4 533 | C-T | |
| NS3 | ||
| 4611 | T-C | |
| 4644 | C-T | |
| 4 683 | T-C | |
| 4 713 | G-A | |
| 4 737 | G-A | |
| 4 794 | C-T | |
| 4 816 | G-T | Ala-Ser (73) |
| 4 842 | T-C | |
| 4 916 | G-A | Arg-Lys (106) |
| 4 920 | G-C | |
| 4 971 | A-G | |
| 5 001 | G-A | |
| 5 058 | C-T | |
| 5 106 | A-G | |
| 5 127 | C-A | |
| 5154 | T-C | |
| 5 298 | A-G | |
| 5 316 | T-C | |
| 5 319 | T-C | |
| 5 381 | T-C | |
| 5 422 | A-C | |
| 5 439 | A-G | |
| 5 496 | C-T | |
| 5 520 | T-C | |
| 5 548 | C-T | |
| 5 553 | C-T | |
| 5 604 | T-C | |
| 5 643 | G-A | |
| 5 679 | T-C | |
| 5 740 | T-C | |
| 5 766 | T-C |
| Helyzet | Nukleotidb | Aminosav |
| 5 862 | T-C | |
| 5 910 | C-T | |
| 5 928 | A-G | |
| 5 964 | T-G | |
| 6 000 | A-G | |
| 6 015 | T-C | |
| 6 102 | A-G | |
| 6106 | T-C | |
| 6 267 | A-G | |
| 1 6 345 | C-T | |
| 1 6 381 | C-T | |
| 6 405 | T-C | |
| NS4A | ||
| 6 483 | A-G | |
| 6 501 | T-G | |
| 6 507 | C-T | |
| 6 508 | C-T | |
| 6 537 | T-C | |
| 6 549 | G-A | |
| 6 552 | T-C | |
| 6 655 | C-T | |
| 6 732 | C-G | |
| 6 738 | A-G | |
| 6 777 | T-C | |
| 6 795 | T-C | |
| 6 822 | T-C | |
| NS4B | ||
| 6 915 | G-A | |
| 6 921 | C-T | |
| 6 956 | C-T | Ala-Val (16) |
| 6 958 | C-T | |
| 6 975 | A-G | Glu-Gly (22) |
| | 7 014 | C-T | |
| 7 062 | C-T | |
| 7110 | C-T | |
| 7 224 | T-C | |
| 7 233 | C-T | |
| 7 254 | C-T | |
| 7 320 | T-C | |
| 7 442 | C-T | Thr-Ile (178) |
| 7 458 | G-T | Met-Ile (183) |
| 7 506 | A-T | |
| 7 539 | A-C | Arg-Ser(210) |
| 7 554 | G-A | |
| 7 555 | T-C |
HU 222 995 Bl
3. táblázat (folytatás)
| Helyzet” | Nukleotidb | Aminosav0 |
| 7 618 | T-C | |
| 7 650 | C-T | |
| 7 659 | T-C | |
| NS5 | ||
| 7 704 | G-A | |
| 7 725 | G-C | |
| 7 740 | T-C | |
| 7 755 | C-T | |
| 7 803 | A-G | |
| 7 816 | G-A | Val-Met(51) |
| 7 974 | T-C | |
| 7 988 | A-G | Lys-Arg (108) |
| 8 058 | C-T | |
| 8 161 | C-T | |
| 8 184 | C-T | |
| 8 247 | G-A | |
| 8 269 | C-A | Gln-Lys (202) |
| 8 340 | C-T | |
| 8 361 | C-T | |
| 8 370 | T-C | |
| 8 371 | G-A | Val-Ile (263) |
| 8 423 | A-G | Lys-Arg (253) |
| 8 436 | C-T | |
| | 8 454 | G-T | |
| 8 455 | A-C | |
| 8 469 | A-G | |
| 1 8 508 | G-A | |
| 8 529 | A-G | |
| 8 547 | T-C | |
| 8 694 | T-C | |
| 8 736 | A-G | |
| 8 760 | G-A | |
| 8 796 | T-A | |
| 8 805 | T-C | |
| | 8 841 | G-A | |
| 8 855 | G-A | Arg-Lys (397) |
| 8 856 | G-A | |
| 8 859 | A-G | |
| 8 966 | G-A | Arg-His (434) |
| 9 009 | T-C | |
| 9 022 | T-C | Tyr-His (453) |
| 9 045 | A-G | |
| 9 052 | C-T | |
| 9 060 | G-A |
| Helyzet” | Nukleotidb | Aminosav0 |
| 9 118 | T-C | |
| 9 306 | C-T | |
| 9 307 | T-C | |
| 9 348 | G-A | |
| 9 358 | T-C | |
| 9 417 | T-C | |
| 9 462 | C-T | |
| 9 471 | T-C | |
| 9 477 | T-C | |
| 9 498 | T-C | |
| 9 562 | T-C | |
| 9 759 | A-G | |
| 9 786 | A-C | |
| 9 828 | T-C | |
| 9 930 | T-C | |
| 9 972 | C-T | |
| 9 975 | A-G | |
| 10 005 | T-C | |
| 10 022 | C-T | Ala-Val (786) |
| 10 050 | G-A | |
| 10 059 | T-C | |
| 10 104 | T-C | |
| 10 123 | C-T | |
| 10 154 | G-A | Arg-Lys (830) |
| 10 171 | G-A | Asp-Asn (836) |
| 10 194 | T-C | |
| 10 229 | G-A | Arg-Lys (855) |
| 10 236 | A-G | |
| 3’-NC | ||
| 10407 | A-G | |
| 10438 | A-G | |
| 10452 | C-T |
” Helyzet a TBE-vírus Neudörfl-törzs nukleotidszekvenciájában b A bal oldali nukleotid a Neudörfl-töizs szekvenciájának, a jobb oldali a 263. izolátuménak felel meg.
c A bal oldali aminosav a Neudörfl-törzs szekvenciájának, a jobb oldali a 263. izolátuménak felel meg. A zárójelben levő szám az illető protein aminoterminálisától számított aminosavhelyzetet jelöli.
3a. táblázat
Példák a TBE-vírus Neudörfl-törzs nukleotidszekvenciájának módosítására a vírus attenuálása érdekében
| | Helyzet” | Nukleotidb | Helyzet” | Nukleotidb |
| 1471 | A-G | ||
| I 5’-NC | 1492 | T-C |
HU 222 995 Bl
3a. táblázat (folytatás)
| Helyzet* | Nukleotidb | Helyzet* | Nukleotidb |
| 49 | G-T | 1497 | T-C |
| C | 1 620 | T-C | |
| 183 | A-C | 1680 | C-T |
| 285 | C-T | 1 833 | C-T |
| 307 | T-C | 1932 | C-T |
| 345 | A-C | 1963 | A-T |
| 375 | G-A | 2 037 | C-T |
| 432 | C-T | 2 160 | G-A |
| 456 | C-T | 2 283 | A-G |
| prM | 2 286 | T-C | |
| 504 | T-C | 2 301 | C-T |
| 585 | T-C | 2 328 | G-A |
| 591 | C-T | 2 343 | A-G |
| 697 | T-C | 2 412 | T-C |
| 708 | C-T | 2 439 | C-T |
| M | NS1 | ||
| 754 | C-T | 2 469 | T-C |
| 789 | A-G | 2 541 | A-G |
| 798 | C-T | 2 553 | T-C |
| 834 | T-C | 2 613 | G-A |
| 846 | G-A | 2 628 | T-C |
| 882 | A-G | 2 658 | C-A |
| 922 | A-G | 2 689 | T-C |
| 930 | T-C | 2 859 | C-T |
| 939 | T-G | 3 015 | A-G |
| 960 | A-G | 3 021 | A-C |
| 963 | G-T | 3 068 | G-A |
| 1 966 | T-C | 3 180 | A-G |
| E | 3 185 | T-C | |
| 1014 | T-C | 3 225 | C-T |
| 1035 | C-T | 3 237 | T-C |
| 1065 | T-C | 3 240 | C-T |
| 1068 | T-C | 3 271 | T-C |
| 1 127 | A-G | 3 288 | T-C |
| 1173 | C-T | 3 309 | C-A |
| 1191 | A-G | 3 363 | T-C |
| 1200 | A-G | 3 486 | G-A |
| NS2A | |||
| 3 529 | T-C | 4 916 | G-A |
| 3 546 | A-G | 4 920 | G-C |
| 3 600 | G-A | 4 971 | A-G |
| 3 615 | G-A | 5 001 | G-A |
| 3 633 | T-C | 5 058 | C-T |
| Helyzet* | Nukleotidb | Helyzet* | Nukleotidb |
| 3 634 | A-T | 5 106 | A-G |
| 3 642 | T-A | 5 127 | C-A |
| 3 711 | C-T | 5 154 | T-C |
| 3 729 | G-A | 5 298 | A-G |
| 3 732 | G-A | 5 316 | T-C |
| 3 759 | C-T | 5 319 | T-C |
| 1 3 805 | T-C | 5 381 | T-C |
| 3 897 | G-T | 5 422 | A-C |
| 3 898 | T-C | 5 439 | A-G |
| 3 936 | G-A | 5 496 | C-T |
| 3 981 | T-C | 5 520 | T-C |
| 4 026 | C-T | 5 548 | C-T |
| | 4 047 | A-G | 5 553 | C-T |
| | 4 062 | A-T | 5 604 | T-C |
| 4117 | G-A | 5 643 | G-A |
| I 4132 | G-A | 5 679 | T-C |
| | 4134 | G-A | 5 740 | T-C |
| I 4135 | T-C | 5 766 | T-C |
| | 4164 | A-G | 5 862 | T-C |
| 4183 | T-C | 5 910 | C-T |
| I 4186 | T-G | 5 928 | A-G |
| | 4191 | G-T | 5 964 | T-G |
| NS2B | 6 000 | A-G | |
| 4 276 | T-C | 6 015 | T-C |
| 4 380 | T-G | 6 102 | A-G |
| 4 387 | T-C | 6106 | T-C |
| 4 434 | G-T | 6 267 | A-G |
| 4 449 | T-A | 6 345 | C-T |
| 4 504 | A-C | 6 381 | C-T |
| 4 506 | T-G | 6 405 | T-C |
| 4 533 | C-T | NS4A | |
| NS3 | 6 483 | A-G | |
| 4 611 | T-C | 6 501 | T-G |
| 4644 | C-T | 6 507 | C-T |
| 4 683 | T-C | 6 508 | C-T |
| 4 713 | G-A | 6 537 | T-C |
| 4 737 | G-A | 6 549 | G-A |
| 4 794 | C-T | 6 552 | T-C |
| 4 816 | G-T | 6 655 | C-T |
| 4 842 | T-C | 6 732 | C-G |
| 6 738 | A-G | 8 455 | A-C |
| 6 777 | T-C | 8 469 | A-G |
| 6 795 | T-C | 8 508 | G-A |
| 6 822 | T-C | 8 529 | A-G |
HU 222 995 Bl
3a. táblázat (folytatás)
| Helyzet’ | Nukleotidb | Helyzet’ | Nukleotidb |
| NS4B | 8 547 | T-C | |
| 6 915 | G-A | 8 694 | T-C |
| 6 921 | C-T | 8 736 | A-G |
| 6 956 | C-T | 8 760 | G-A |
| 6 958 | C-T | 8 796 | T-A |
| 6 975 | A-G | 8 805 | T-C |
| 7 014 | C-T | 8 841 | G-A |
| 7 062 | C-T | 8 855 | G-A |
| 7110 | C-T | 8 856 | G-A |
| 7 224 | T-C | 8 859 | A-G |
| 7 233 | C-T | 8 966 | G-A |
| 7 254 | C-T | 9 009 | T-C |
| 7 320 | T-C | 9 022 | T-C |
| 7 442 | C-T | 9 045 | A-G |
| 7 458 | G-T | 9 052 | C-T |
| 7 506 | A-T | 9 060 | G-A |
| 7 539 | A-C | 9118 | T-C |
| 7 554 | G-A | 9 306 | C-T |
| 7 555 | T-C | 9 307 | T-C |
| 7 618 | T-C | 9 348 | G-A |
| 7 650 | C-T | 9 358 | T-C |
| 7 659 | T-C | 9 417 | T-C |
| NS5 | 9 462 | C-T | |
| 7 704 | G-A | 9 471 | T-C |
| 7 725 | G-C | 9 477 | T-C |
| 7 740 | T-C | 9 498 | T-C |
| 7 755 | C-T | 9 562 | T-C |
| 7 803 | A-G | 9 759 | A-G |
| 7 816 | G-A | 9 786 | A-C |
| 7 974 | T-C | 9 828 | T-C |
| 7 988 | A-G | 9 930 | T-C |
| 8 058 | C-T | 9 972 | C-T |
| | 8161 | C-T | 9 975 | A-G |
| 8 184 | C-T | 10 005 | T-C |
| 8 247 | G-A | 10 022 | C-T |
| 8 269 | C-A | 10 050 | G-A |
| 8 340 | C-T | 10 059 | T-C |
| 8 361 | C-T | 10 104 | T-C |
| 8 370 | T-C | 10 123 | C-T |
| 8 371 | G-A | 10154 | G-A |
| 8 423 | A-G | 10 171 | G-A |
| 8 436 | C-T | 10 194 | T-C |
| 8 454 | G-T | 10 229 | G-A |
| Helyzet | Nukleotid6 | Helyzet | Nukleotid6 |
| 3’-NC | |||
| 10407 | A-G | ||
| 10438 | A-G | ||
| 10452 | C-T |
“ Helyzet a TBE-vírus Neudörfl-törzs nuklcotidszckvcnciájában 6 A bal oldali nukleotid a Neudörfl-törzs szekvenciájának, a jobb oldali a bevezetett módosításnak felel meg.
Irodalomjegyzék
Chambers, T. J., Hahn, C. S., Gallér, R., Rice, C. M. (1990). Favirus genome organization, expression and replication. Ann. rév. Microbiol. 44 : 649-688.
Emini, E. A., Schleif, W. A., Nunberg, J. H., Conley, A. J., Eda, Y., Tokiyoshi, S., Putney, S. D., Matsushita, S., Cobb, K. E., Jeti C. M., Eichberg, J. W., and Murthy,
K. K. (1992). Prevention of HIV-1 infection in chimpanzees by gp 120 V3 domain-specific monoclonal antibody. Natúré 355, 728-729.
Gao, G. F., Jiang, W. R., Hussain, Μ. H., Venugopal, K„ Gritsun, T. S., Reid, H. W., and Gould, E. A. (1993). Sequencing and antigenic studies of a Norwegian vírus isolated írom encephalomyelitic sheep confirm the existence of louping ill outside Great Britain and Ireland. J. Gén. Virol. 74, 109-114.
Gubler, U., and Hoffinan, B. J. (1983). A simple and very efficient method fór generating cDNA libraries. Gene 25, 263-269.
Guirakhoo, F., Heinz, F. X., and Kunz, C. (1989). Epitope model of tick-bome Encephalitis vírus envelope glycoprotein E: Analysis of structural properties, role of carbohydrate side chain, and conformational changes occuring at acidic pH. Virology 169, 90-99.
Haslov, K., Peterson, J. W., Baker, P. J. (1991). Adjuvanticity of pertussis toxin is mediated by differential effects on the activity of T suppresors, T amplifier and T helper cell. Immunobioi. 183: 40-54.
Hazamé, M., Mayumi-Aono, A., Asakawa, N., Kuroda, S., Hinuma, S., and Fujisawa, Y. (1993). Adjuvantindependent enhanced immuné responses to recombinant herpes simplex vírus type 1 glycoprotein D by fiision with biologically active interleukin-2. Vaccine 11, 629-635.
Heinz, F. X., Berger, R., Túrna, W., and Kunz, C. (1983). A topological and íúnctional model of epitopes on the structural glycoprotein of tick-bome encephalitis vírus defined by monoclonal antibodies. Virology 126, 525-537.
Heinz, F. X., and Kunz C. (1981). Homogeneity of the structural glycoprotein írom European isolates of tick-bome encephalitis vírus: Comparison with other flaviviruses. J. Gén. Virol. 57, 263-274.
Heinz, F. X., Túrna W., Guirakhoo, F., And Kunz, C. (1986). A model study of the use of monoclonal antibodies in capture enzyme immunoassays fór antigén quantification exploiting the epitope map of tick-bome encephalitis vírus. J. Bioi. Standard. 14, 133-141.
HU 222 995 Bl
Holzmann, H., Heinz, F. X., Mandl, C. W., Guirakhoo, F., and Kunz, C. (1990). A single amino acid substitution in the envelope protein E of tick-bome encephalitis vírus leads to attenuation in the mouse model. J. Virol. 64, 5156-5159.
Holzmann, H., Vorobyova, M. S., Ladyzhenskaya,
I. P., Ferenczi, E., Kundi, M., Kunz, C, and Heinz, F. X. (1992). Molecular epidemiology of tick-bome encephalitis vírus: cross-protection between European and Far Eastem subtypes. Vaccines 10, 345-349.
Hussain, A., Himeno, K., Mayumi, H., Kawamura, I., Tsuru, S., Nomoto, K. (1989). Immunomodulatory effects of cholera toxin in mice. Nat. Immun. Cell. Growth Regül. 8: 231-244.
Javaherian, K., Langlois, A. J., McDanal, C, Ross, K. L., Eckler, L. I., Jellis, C. L., Profy, A. T., Rusche, J. R., Bolognesi, D. P., Putney, S. D., and Matthews, T. J. (1989). Principal neutralizing domain of the humán immunodeficiency vírus type 1 envelope protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6768-6772.
Lai, C., Ihao, B., Hori, H., Bray, M. (1991). Infectious RNA transcribed írom cloned full-lenght cDNA of Dengue type 4 vírus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88: 5139-5143.
Ledger, T. N., Sil, B. K., Wills, M. R., Lewis, G., Kinney, R. M., Jennings, J. R., Stephenson, J. R., and Barrett, A. D. T. (1992). Variation in the biological function of envelope protein epitopes of yellow fever vaccine viruses detected with monoclonal antibodies. Biologicals 20, 117-128.
Mandl, C. W., Heinz, F. X., and Kunz, C. (1988). Sequence of the structural proteins of tick-bome encephalitis vírus (Western subtype) and comparative analysis with other flaviviruses. Virology 166, 197-205.
Mandl, C. W., Heinz, F. X., Stöckl, E., and Kunz, C. (1989). Genome sequence of tick-bome encephalitis vírus (Western subtype) and comparative analysis of nonstructural proteins with other flaviviruses. Virology 173, 291-301.
Mandl, C. W., Holzmann, H., Kunz, C., and Heinz, F. X. (1993). Complete genomic sequence of Powassan vírus: Evaluation of genetic elements in tick-bome versus mosquito-bome flaviviruses. Virology 194, 173-184.
Mandl, C. W., Kunz, C., and Heinz, F. X. (1991). Presence of poly(A) in a flavivirus: Significant differences between the 3’ noncoding regions of the genomic RNAs of tick-bome encephalitis vírus strains. J. Virol. 65, 4070-4077.
Maniatis, T., Fritsch, E. F., and Sambrook, J. (eds.) (1982). „Molecular Cloning, a Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
McMaster, G. K., and Carmichael, G. G. (1977). Analysis of single- and double-stranded nucleic acids on polyacrylamide and agarose gels by using glyoxal and acridine orange. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 11, 4835-4838.
Monath, T. P. (1990), Flaviviruses In: Fidds, B. N. (ed) Virology, Roven Press, pp. 107-151.
Pletnev, A. G., Bray, M., and Lai, C.-J. (1993). Chimeric tick-bome encephalitis and dengue type 4 viruses: Effects of mutations on neurovirulence in mice. J. Virol. 67, 4956-4963.
Post, P. R., Santos, C. N. D., Carvalho, R., Cruz, A. C. R., Rice, C. M., and Gallér, R. (1992). Heterogeneity in envelope protein sequences and N-linked glycosylation among yellow fever vírus vaccine strains. Virology 188, 160-167.
Rancaniello, V. R., Balttimore, D. (1981). Science, 214: 916-919.
Revaillard, J. P., Cozon, G., Czerkinsky, C. (1992). Órai administration of immunomodulators and the mucosal immuné system. Dev. Bioi. Stand. 77: 31-37.
Rice, C. M., Grakoui, A., Gallér, R., and Chambers, T. J. (1989). Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation. The New Bioi. 1, 285-296.
Rueckert, R. R. (1990). Picomaviridae and their replication. In: 8 Virology 2nd edn.8 (B. N. Fields, ed.) pp. 507-548, Raven Press, New York.
Shah, K. V. (1990). Polyomaviruses. In: SVirology 2nd edn.8 (B. N. Fields, ed.) pp. 1609-1624, Raven Press, New York.
Sumiyoshi, H., Hoke, C., Trent, D. W. (1992). Infectious Japanese Encephalitis Vírus RNA can be synthesized from in vitro ligated cDNA template. J. Virol. 66: 5425-5431.
Tagliabue, A., and Boraschi, D. (1993). Cytokines as vaccine adjuvants: Interleukin 1 and its synthetic peptide 163-171. Vaccine 11, 594-595.
Ulmer, J. F., Donnelley J. J., Parker, S. E., Rhodes, G. H., Felgner P. L., Dwarki, V. J., Gromkowski, S. H., Deck, R. R., DeWitt, C. M., Friedman, A., Hawe, L. A., Leander, K. R., Martinez, D., Perry, H. C., Shiver, J. W., Montgomery, D. L., Liu, M. A. (1993). Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. Science 259, 1745.
Venugopal, K., Buckley, A., Reid, H. W., and Gould E. A. (1992). Nucleotide sequence of the envelope glycoprotein of Negishi vírus shows very close homology to louping ill vírus. Virology 190, 515-521.
Whitby, J. E., Whitby, S. N., Jennings, A. D., Stephenson, J. R., and Barrett, A. D. T. (1993). Nucleotide sequence of the envelope protein of a Turkish isolate of tick-bome encephalitis (TBE) vírus is distinct from other viruses of the TBE vírus complex. J. Gén. Virol.
Claims (26)
1. cDNS, amely TBEV-t kódoló szekvenciákat tartalmaz, azzal jellemezve, hogy egy, az 5a. ábra szerinti szekvenciával legalább 80%-ban homológ 3’ nem kódoló szekvenciát tartalmaz, és egy fertőző TBEV-RNStranszkriptumot kódol.
2. Az 1. igénypont szerinti cDNS, azzal jellemezve, hogy az 5 a. ábra szerinti 3’ nem kódoló szekvenciát tartalmazza.
HU 222 995 Bl
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti cDNS, azzal jellemezve, hogy TBEV-kódoló szekvenciaként valamely a TBEV (W)-ből, TBEV (FE)-ből vagy ezek altípusaiból, vagy variánsaiból származó szekvenciát tartalmaz.
4. A 3. igénypont szerinti cDNS, azzal jellemezve, hogy az 5. ábra szerinti szekvenciát tartalmazza.
5. TBEV-t kódoló szekvenciát tartalmazó cDNS, azzal jellemezve, hogy az 5. ábra szerinti TBEV-t kódoló szekvenciát tartalmazza egy, a Neudörfl-törzstől eltérő TBEV-törzsből származó 3’ nem kódoló szekvenciával együtt, és egy fertőző transzkriptumot kódol.
6. Az 5. igénypont szerinti cDNS, azzal jellemezve, hogy a TBEV Hypr-törzs 3’ nem kódoló szekvenciáját tartalmazza.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti cDNS, azzal jellemezve, hogy egy, a TBEV virulenciáját csökkentő és/vagy a TBEV replikációját befolyásoló módosítást tartalmaz.
8. A 7. igénypont szerinti cDNS, azzal jellemezve, hogy a módosítás szubsztitúcióval, inszercióval vagy delécióval van végrehajtva.
9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti cDNS, azzal jellemezve, hogy az 1-helyzetben egy további G nukleotidot tartalmaz.
10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti cDNS, azzal jellemezve, hogy a p(RM) hasítóhelynél nukleotidszekvencia-módosítást tartalmaz.
11. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti cDNS, azzal jellemezve, hogy legalább egy N-glikozilezésihely-módosítást tartalmaz.
12. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti cDNS, azzal jellemezve, hogy legalább egy, a 3a. táblázat szerinti módosítást tartalmaz.
13. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti cDNS, azzal jellemezve, hogy a TBEV E-proteinje 384. aminosavának helyzetében módosítást tartalmaz.
14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti cDNS, azzal jellemezve, hogy tartalmaz továbbá egy immunmodulátort kódoló nukleotidszekvenciát.
15. A 14. igénypont szerinti cDNS, azzal jellemezve, hogy immunmodulátort kódoló szekvenciaként egy interleukint, diftériatoxint, koleratoxint vagy E. coli hőlabilis toxint, vagy pertussistoxint kódoló szekvenciát tartalmaz.
16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti cDNS, azzal jellemezve, hogy egy rekombináns DNSvektorban van jelen.
17. A 16. igénypont szerinti cDNS, azzal jellemezve, hogy egy rekombináns DNS-vektorban egy, az SP6, T3, T7 prokarióta promoterek valamelyike vagy egy, a CMV, RSV, β-aktin, SV4a vagy adeno-2 eukarióta promoterek valamelyike szabályozása alatt áll.
18. Fertőző RNS-transzkriptum, amely egy, az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti cDNS in vivő vagy in vitro transzkriptuma.
19. Eljárás rekombináns, módosított TBE-vírus előállítására, azzal jellemezve, hogy
- egy RNS-transzkriptumot állítunk elő in vitro egy, a 16. vagy 17. igénypont szerinti rekombináns DNS-vektorban jelen levő cDNS-ről, és a kapott RNStranszkriptummal gazdasejtet transzfektálunk,
- majd a kapott fertőző vírusrészecskéket kinyerjük.
20. Eljárás rekombináns, módosított TBE-vírus előállítására, azzal jellemezve, hogy
- egy, a 16. vagy 17. igénypont szerinti rekombináns DNS-vektorban jelen levő cDNS-sel gazdasejtet transzfektálunk,
- és a kapott fertőző vírusrészecskéket kinyerjük.
21. Rekombináns TBE-vírus, amely a 19. vagy 20. igénypont szerinti eljárással van előállítva.
22. TBE-oltóanyag, amely egy, a 21. igénypont szerinti rekombináns TBE-vírust tartalmaz farmakológiailag elfogadható hordozóval együtt.
23. A 22. igénypont szerinti oltóanyag, azzal jellemezve, hogy a rekombináns TBE-vírust attenuált formában tartalmazza.
24. A 22. vagy 23. igénypont szerinti oltóanyag, azzal jellemezve, hogy a rekombináns TBE-vírust inaktivált formában tartalmazza.
25. A 21. igénypont szerinti rekombináns TBE-vírus alkalmazása vírusinokulumként vírusszaporításhoz.
26. Az 1-18. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav alkalmazása oltóvírus előállítására.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4426622A DE4426622C1 (de) | 1994-07-27 | 1994-07-27 | Infektiöser cDNA-Klon des Tick-Borne Enzephalitis (TBE)-Virus, davon abgeleiteter rekombinanter Impfstoff und Herstellung desselben |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9502253D0 HU9502253D0 (en) | 1995-09-28 |
| HUT72840A HUT72840A (en) | 1996-05-28 |
| HU222995B1 true HU222995B1 (hu) | 2004-01-28 |
Family
ID=6524280
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9502253A HU222995B1 (hu) | 1994-07-27 | 1995-07-27 | Kullancsok által terjesztett agyvelőgyulladás (Tick-Borne Encephalitis/TBE) vírus fertőző cDNS-klónja, ebből készült rekombináns oltóanyag és eljárás előállítására |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0698665B1 (hu) |
| AT (1) | ATE166388T1 (hu) |
| CZ (1) | CZ289713B6 (hu) |
| DE (2) | DE4426622C1 (hu) |
| DK (1) | DK0698665T3 (hu) |
| ES (1) | ES2116660T3 (hu) |
| FI (1) | FI117897B (hu) |
| HU (1) | HU222995B1 (hu) |
| RU (1) | RU2202612C2 (hu) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19512142A1 (de) * | 1995-03-31 | 1996-10-02 | Immuno Ag | Infektiöser cDNA-Klon des Tick-Borne Enzephalitis (TBE)-Virus, davon abgeleiteter rekombinanter Impfstoff und Herstellung desselben sowie ein pharmazeutisches Produkt, das eine replizierbare Nukleinsäure enthält |
| DE19521705C2 (de) * | 1995-06-14 | 1997-10-09 | Immuno Ag | Immunogenes Konstrukt, Verfahren zu dessen Herstellung und Verwendung als Vakzine |
| CN115044595A (zh) * | 2022-05-16 | 2022-09-13 | 东北林业大学 | 检测人血清中蜱传脑炎病毒IgG抗体的酶联免疫测定试剂盒及其包被重组抗原的制备方法 |
-
1994
- 1994-07-27 DE DE4426622A patent/DE4426622C1/de not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-07-14 CZ CZ19951850A patent/CZ289713B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-07-21 RU RU95113231/13A patent/RU2202612C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-07-25 DK DK95111698T patent/DK0698665T3/da active
- 1995-07-25 AT AT95111698T patent/ATE166388T1/de active
- 1995-07-25 EP EP95111698A patent/EP0698665B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-25 ES ES95111698T patent/ES2116660T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-25 DE DE59502231T patent/DE59502231D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-26 FI FI953581A patent/FI117897B/fi not_active IP Right Cessation
- 1995-07-27 HU HU9502253A patent/HU222995B1/hu not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI953581A0 (fi) | 1995-07-26 |
| RU2202612C2 (ru) | 2003-04-20 |
| ES2116660T3 (es) | 1998-07-16 |
| CZ185095A3 (en) | 1996-02-14 |
| FI953581A (fi) | 1996-01-28 |
| EP0698665A3 (de) | 1996-10-23 |
| CZ289713B6 (cs) | 2002-03-13 |
| DE4426622C1 (de) | 1996-02-22 |
| DE59502231D1 (de) | 1998-06-25 |
| EP0698665B1 (de) | 1998-05-20 |
| FI117897B (fi) | 2007-04-13 |
| ATE166388T1 (de) | 1998-06-15 |
| EP0698665A2 (de) | 1996-02-28 |
| HU9502253D0 (en) | 1995-09-28 |
| DK0698665T3 (da) | 1999-02-15 |
| HUT72840A (en) | 1996-05-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4504464B2 (ja) | キメラフラビウイルスワクチン | |
| US6696281B1 (en) | Chimeric flavivirus vaccines | |
| EP1605047B1 (en) | Chimeric and/or growth-restricted flaviviruses | |
| WO1998037911A9 (en) | Chimeric flavivirus vaccines | |
| EP1575979B1 (en) | West nile virus vaccine | |
| WO2001039802A1 (en) | Chimeric flavivirus vaccines | |
| HU222995B1 (hu) | Kullancsok által terjesztett agyvelőgyulladás (Tick-Borne Encephalitis/TBE) vírus fertőző cDNS-klónja, ebből készült rekombináns oltóanyag és eljárás előállítására | |
| MXPA99007949A (es) | Vacunas de flavivirus quimerico |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HFG4 | Patent granted, date of granting |
Effective date: 20031128 |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |