CN117881704A - 新融合蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

针对人类白细胞介素‑2(IL‑2)和干扰素α(IFNα)的改构；改构后IL‑2、IFNα或IL‑2/IFNα双因子和Fc形成的融合蛋白；以及这些融合蛋白的设计、制备和用途。IFNα通过基因突变，改变IFNα与其受体的结合能力，得到更优的融合蛋白，解决现有药物特异性弱和副作用大的缺点。

Description

新融合蛋白及其用途
交叉引用
本申请要求2022年5月13日提交的中国专利申请202210521837.5的优先权，其全部内容通过提述并入本文。
序列表
本申请包含序列表，并且其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及新型IL-2与IFNα和Fc融合蛋白的设计、制备及用途。
背景技术
IL-2，也称为T细胞生长因子，基因位于4号染色体，包括7kb的序列，由133个氨基酸组成，分子量约15kD。IL-2通过IL-2R发生作用，IL-2R包括三个亚基，IL-2Rα(即CD25)、IL-2Rβ(即CD122)和IL-2Rγ(即CD132)。三个亚基可以形成三种受体形式：高结合力受体包含所有三个亚基IL-2Rα/β/γ，中结合力受体包含IL-2Rβ/γ两个亚基和低结合力受体IL-2Rα。其中IL-2Rβ和IL-2Rγ是IL-2激活下游信号通路所必需的，当IL-2同时结合IL-2Rβ和IL-2Rγ时，两个受体亚基形成异源二聚体，磷酸化细胞内的STAT5，进入细胞核导致相应的基因转录和表达；IL-2Rα并非信号所必需，但可以促进IL-2与IL-2Rβ和IL-2Rγ的结合。IL-2Rγ在所有免疫细胞中均有表达；IL-2Rβ在CD8+T细胞、NK细胞、调节性T细胞中均有表达；而且在T细胞被激活后会提升表达水平；IL-2Rα在调节性T细胞持续高表达，在被激活的CD8+T细胞中会有短暂表达，随即下调表达水平[1,2]。IL-2是第二个批准的免疫疗法，用于治疗转移黑色素瘤(1988)及肾细胞癌(1992)；IFNα是第一个批准的免疫疗法(1986)，用于治疗毛状细胞白血病,后被批准治疗转移黑色素瘤、肾细胞癌、非霍奇金淋巴瘤、卡波济氏肉瘤。
IL-2药物的半衰期较短，所以已批准治疗肿瘤的IL-2药物需要较高剂量才有效果，而高剂量的IL-2会引起明显的毒副作用而不能广泛得到应用。对表达IL-2Rβ和IL-2Rγ的NK细胞和CD8+T细胞选择性较低，因此不能充分发挥NK细胞和CD8+T细胞杀伤肿瘤的能力[3,4]。
在另一方面，IFNα是机体免疫细胞产生的一种细胞因子，是机体受到病毒感染时，免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能接近的低分子糖蛋白。干扰素在机体的免疫系统中起着非常重要的作用[5,6]。重组人干扰素α已批准用于治疗病毒性感 染和肿瘤的治疗。由于干扰素α受体分布较广，在很多正常细胞中均有表达，所以容易引起明显的毒副作用。
本领域中需要产生新的细胞因子构建体，从而提供更有效的治疗效果和同时更小的副作用。
发明内容
为解决上述问题，本发明公开了新型IL-2与IFNα和Fc融合蛋白的设计、制备和用途，通过基因突变的方式，改变IL-2与其受体、IFNα与其受体的结合能力，解决现有药物特异性弱、半衰期短和副作用大的缺点。
在一些方面，本公开提供了融合蛋白，其包含IL-2部分和Fc部分，其中所述IL-2部分包含与野生型IL-2蛋白相比具有一个或多个突变的氨基酸序列，所述氨基酸序列为与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述突变包括参照SEQ ID NO:1中氨基酸位置的选自以下的一种或多种取代：R38A、L80F、R81D、L85V、I86V和I91F。
在一些实施方案中，所述Fc部分包含人IgG Fc，如人IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG3 Fc、IgG4 Fc或其变体。例如，所述Fc变体包含选自以下的一种或多种突变：L234A和L235A突变、以及M252Y、S254T和T256E突变。
在一些实施方案中，所述融合蛋白还包含IFNα部分。所述IFNα部分可包含与SEQ ID NO:6或5具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述IFNα部分包括参照SEQ ID NO:5中氨基酸位置的选自以下的一种或多种取代：R144A和R149A。
在一些实施方案中，所述融合蛋白包含：
(a)IL-2部分可操作地连接于Fc部分；
(b)IL-2部分可操作地连接于Fc部分且Fc部分可操作地连接于IFNα部分；
(c)IL-2部分可操作地连接于IFNα部分且IFNα部分可操作地连接于Fc部分；或
(d)IFNα部分可操作地连接于IL-2部分且IL-2部分可操作地连接于Fc部分。
在一些进一步的实施方案中，所述融合蛋白包含：
(a)IL-2部分可操作地连接于Fc部分；
(b)IL-2部分可操作地连接于Fc部分且Fc部分可操作地连接于IFNα部分；
(c)Fc部分可操作地连接于IL-2部分；或
(d)IFNα部分可操作地连接于Fc部分且Fc部分可操作地连接于IL-2部分。
在一些实施方案中，所述可操作地连接是直接连接或通过肽接头进行连接，任选地所述肽接头为GS系列接头，例如(GS)n，其中n＝1-5。在一些实施方案中，所述接头如SEQ ID NO:11所示。
在一些实施方案中，所述融合蛋白包含如SEQ ID NO:3、4、9或10所示的氨基酸序 列。
在一些方面，本公开提供了融合蛋白，其包含IFNα部分和Fc部分，其中所述IFNα部分包含与野生型IFNα蛋白相比具有一个或多个突变的氨基酸序列，所述氨基酸序列为与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述IFNα部分包括参照SEQ ID NO:5中氨基酸位置的选自以下的一种或多种取代：R144A和R149A。
在一些实施方案中，所述Fc部分包含人IgG Fc，如人IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG3 Fc、IgG4 Fc或其变体。例如，所述Fc变体包含选自以下的一种或多种突变：L234A和L235A突变、以及M252Y、S254T和T256E突变。
在一些实施方案中，所述融合蛋白从N末端到C末端包含：
(a)IFNα部分可操作地连接于Fc部分；或
(b)Fc部分可操作地连接于IFNα部分。
在一些实施方案中，融合蛋白包含如SEQ ID NO:7或8所示的氨基酸序列。
在一些方面，本公开提供了一种核酸分子，其包括编码本文公开的融合蛋白的核酸序列。
在一些方面，本公开提供了包含本文公开的核酸分子的载体。
在一些方面，本公开提供了包含本文公开的核酸分子或载体的宿主细胞。
在一些方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含本文公开的融合蛋白或编码其的核酸分子，以及药学上可接受的载剂。
在一些方面，本公开提供了一种用于生产本文公开的融合蛋白的方法，其包括以下步骤：
-在包含编码所述融合蛋白的载体的宿主细胞中表达所述融合蛋白；和
-从宿主细胞培养物中分离出所述融合蛋白。
在一些方面，本公开提供了一种调节受试者中的免疫应答的方法，其包括向受试者施用本文公开的融合蛋白或药物组合物。
在一些方面，本公开提供了一种用于治疗或预防受试者中的癌症或感染性疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的融合蛋白或药物组合物。
在一些实施方案中，所述癌症选自乳腺癌、胃癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、肾细胞癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌和白血病。
在一些方面，本公开提供了本文公开的融合蛋白在制备用于预防、治疗和/或管理癌症或感染性疾病的药物中的用途。
在一些方面，本公开提供了本文公开的融合蛋白用于治疗或预防癌症或感染性疾病。
在一些方面，本公开提供了一种试剂盒，包括包含本文公开的融合蛋白或药物组合物的容器。
本发明还涉及以下实施方案：
1.新型IL-2与IFNα和Fc融合蛋白，其特征在于，包括：IL-2与IFNα双因子Fc融合蛋白、IL-2与Fc融合蛋白、IFNα与Fc融合蛋白；
IL-2与IFNα双因子Fc融合蛋白：将突变型IL-2和突变型IFNα分别融合在Fc的N端或C端，得到多肽链IL-2-Fc-IFNα或IFNα-Fc-IL-2；
IL-2与Fc融合蛋白：将突变型IL-2融合在Fc的N端或C端，得到多肽链Fc-IL-2或IL-2-Fc；
IFNα与Fc融合蛋白：将突变型IFNα分别融合在Fc的N端或C端，得到多肽链Fc-IFNα或IFNα-Fc。
2.根据实施方案1所述的新型IL-2与IFNα和Fc融合蛋白，其特征在于，所述IL-2与IFNα双因子Fc融合蛋白中，Fc片段包括重链恒定区铰链区、重链恒定区第二个结构域CH2和重链恒定区第三个结构域CH3。
3.根据实施方案1所述的新型IL-2与IFNα和Fc融合蛋白，其特征在于，所述IL-2与Fc融合蛋白中，Fc片段包括重链恒定区铰链区、重链恒定区第二个结构域CH2和重链恒定区第三个结构域CH3。
4.根据实施方案1所述的新型IL-2与IFNα和Fc融合蛋白，其特征在于，所述IFNα与Fc融合蛋白，Fc片段包括重链恒定区铰链区、重链恒定区第二个结构域CH2和重链恒定区第三个结构域CH3。
5.根据实施方案1-2任一项所述的新型IL-2与IFNα和Fc融合蛋白，其特征在于，所述IL-2与IFNα双因子Fc融合蛋白，Fc片段还引入L234A和L235A突变，同时引入M252Y、S254T和T256E突变。
6.根据实施方案1或3任一项所述的新型IL-2与IFNα和Fc融合蛋白，其特征在于，所述的IL-2与Fc融合蛋白，Fc片段还引入L234A和L235A突变，同时引入M252Y、S254T和T256E突变。
7.根据实施方案1或4任一项所述的新型IL-2与IFNα和Fc融合蛋白，其特征在于，所述的IFNα与Fc融合蛋白，Fc片段还引入L234A和L235A突变，同时引入M252Y、S254T和T256E突变。
8.根据实施方案1所述的新型IL-2与IFNα和Fc融合蛋白，其特征在于，所述IL-2与IFNα双因子Fc融合蛋白，IL-2突变体为通过分子生物学手段在野生型IL-2基础上引入突变得到，所引入突变包括但不限于R38A、L80F、R81D、L85V、I86V和I91F。
9.根据实施方案3所述的新型IL-2与IFNα和Fc融合蛋白，其特征在于，所述IL-2与Fc融合蛋白，IL-2突变体为通过分子生物学手段在野生型IL-2基础上引入突变得到，所引入突变包括但不限于R38A、L80F、R81D、L85V、I86V和I91F。
10.根据实施方案1所述的新型IL-2与IFNα和Fc融合蛋白，其特征在于，所述IL- 2与IFNα双因子Fc融合蛋白，IFNα衍生物为通过分子生物学手段在野生型IFNα基础上引入突变得到，所进入突变包括但不限于R144A或R149A。
11.根据实施方案4所述的新型IL-2与IFNα和Fc融合蛋白，其特征在于，所述IFNα与Fc融合蛋白，IFNα衍生物为通过分子生物学手段在野生型IFNα基础上引入突变得到，所进入突变包括但不限于R144A或R149A。
12.制备如实施方案1-2中任一项所述的新型IL-2与IFNα和Fc融合蛋白的方法，其特征在于，IL-2与IFNα双因子Fc融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)将IL-2突变体通过柔性连接子连接在Fc片段N端或C端，将IFNα衍生物通过柔性连接子连接在Fc片段C端或N端，得到多肽链IL-2-Fc-IFNα或IFNα-Fc-IL-2；在Fc片段引入突变L234A、L235A、M252Y、S254T和T256E；
(2)将步骤(1)得到的DNA片段克隆至pcDNA系列载体或其它用于哺乳动物细胞表达系统的载体，得到重组载体；
(3)将步骤(2)中获得的重组载体转染至哺乳动物细胞以进行融合蛋白的表达，纯化后得到IL-2与IFNα双因子Fc融合蛋白。
13.制备如实施方案1或3中任一项所述的新型IL-2与IFNα和Fc融合蛋白的方法，其特征在于，IL-2与Fc融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)将IL-2突变体通过柔性连接子连接在Fc片段N端或C端，得到多肽链IL-2-Fc或Fc-IL-2；在Fc片段引入突变L234A、L235A、M252Y、S254T和T256E；
(2)将步骤(1)得到的DNA片段克隆至pcDNA系列载体或其它用于哺乳动物细胞表达系统的载体，得到重组载体；
(3)将步骤(2)中获得的重组载体转染至哺乳动物细胞以进行融合蛋白的表达，纯化后得到IL-2与Fc融合蛋白。
14.制备如实施方案1或4中任一项所述的新型IL-2与IFNα和Fc融合蛋白的方法，其特征在于，IFNα与Fc融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)将IFNα衍生物通过柔性连接子连接在Fc片段C端或N端，得到多肽链Fc-IFNα或IFNα-Fc；在Fc片段引入突变L234A、L235A、M252Y、S254T和T256E；
(2)将步骤(1)得到的DNA片段克隆至pcDNA系列载体或其它用于哺乳动物细胞表达系统的载体，得到重组载体；
(3)将步骤(2)中获得的重组载体转染至哺乳动物细胞以进行融合蛋白的表达，纯化后得到IFNα与Fc融合蛋白。
15.根据实施方案12-14任一项所述的制备新型IL-2与IFNα和Fc融合蛋白的方法，其特征在于，步骤(3)中哺乳动物细胞包括HEK293细胞、CHO细胞或上述细胞的衍生细胞。
16.根据实施方案12-14任一项所述的制备新型IL-2与IFNα和Fc融合蛋白的方法， 其特征在于，步骤(1)中Fc片段引入突变具体为：在Fc片段引入L234A和L235A突变，同时在Fc片段引入M252Y、S254T和T256E突变。
17.所述实施方案1-11中任一项所述的新型IL-2与IFNα和Fc融合蛋白在制备广谱抗肿瘤药物中的用途包括单药疗法治疗IL-2和IFN-a已批准的肿瘤治疗适应症以及和其他肿瘤治疗方法联合广谱治疗肿瘤。
18.实施方案12-16中任一项所述的方法制备的新型IL-2与IFNα和Fc融合蛋白在制备Fc融合蛋白药物中的用途包括单药疗法治疗IL-2和IFN-a已批准的肿瘤治疗适应症以及和其他肿瘤治疗方法联合广谱治疗肿瘤。
以上内容是一个概述，因此必要时包含细节的简化、概括和省略；因此，本领域技术人员将认识到，该概述仅是举例说明性的，并不意图以任何方式进行限制。本文所述的方法、组合物和用途和/或其他主题的其它方面、特征和优势将在本文所示的教导中变得明显。
附图说明
图1A例示了本发明涵盖的多种Fc融合蛋白结构示意图。每个小图上方到下方为从N端到C端，梯形表示铰链区。
图1B-1C分别例示了本发明Fc融合蛋白的SDS PAGE表达图和HPLC分析图。
图2例示了本发明Fc融合蛋白与受体IL-2Rα蛋白的结合能力检测图。
图3例示了本发明Fc融合蛋白与受体IL-2Rβ蛋白的结合能力检测图。
图4例示了本发明Fc融合蛋白与受体IFNαR2蛋白的结合能力检测图。
图5例示了本发明Fc融合蛋白与不同种属间受体IL-2Rα蛋白的结合能力检测图。
图6例示了本发明Fc融合蛋白与不同种属间受体IL-2Rβ蛋白的结合能力检测图。
图7例示了本发明Fc融合蛋白与不同种属间受体IFNαR2蛋白的结合能力检测图。
图8A和图8B分别例示了通过ELISA和Fortebio检测本发明Fc融合蛋白与FcRn蛋白的结合能力的结果图。
图9例示了本发明Fc融合蛋白刺激PBMC特定细胞亚群分布检测图。
图10例示了本发明Fc融合蛋白对CTLL-2小鼠T淋巴细胞刺激增殖能力检测。
图11A至图11D例示了本发明Fc融合蛋白对肿瘤细胞(A：NCI-N87；B：MDA-MB-231；C：A375；D：Burkitt's淋巴瘤细胞)的体外直接杀伤能力检测。
图12A至图12E例示了本发明Fc融合蛋白对肿瘤细胞(A：NCI-N87；B：MDA-MB-231；C：A375；D和E：Burkitt's淋巴瘤细胞)的体外综合杀伤能力检测。
图13例示了本发明Fc融合蛋白在ExVivo类器官系统中的药效活性。
发明详述
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技 术人员通常所理解的相同含义。本文引用的所有专利、专利申请和其他出版物均通过引用全文并入。如果本文中提出的定义与通过引用并入本文的专利、专利申请和其他出版物中提出的定义相冲突，则以本文中提出的定义为准。
如本文所用的,术语“IL-2”是指白细胞介素-2，旨在包括IL-2的任何形式，例如，1)天然未加工的IL-2分子、全长IL-2蛋白或天然存在的IL-2变体；2)在细胞内加工产生的IL-2的任何形式；或3)全长或经修饰形式。在本公开中，术语“IL-2”或“IL-2结构域”包括野生型IL-2和IL-2变体。
如本文所用的,术语“IFNα”是指干扰素α，旨在包括IFNα的任何形式，例如，1)天然未加工的IFNα分子、全长IFNα蛋白或天然存在的IFNα变体；2)在细胞内加工产生的IFNα的任何形式；或3)全长或经修饰形式。在本公开中，术语“IFNα”或“IFNα结构域”包括野生型IFNα和IFNα变体。
术语“变体”，就多肽或蛋白质而言，是指包括对天然蛋白质序列的一个或多个氨基酸突变的生物活性多肽。任选地，一个或多个氨基酸突变包括在氨基酸序列中某些位置的氨基酸取代和/或插入。优选地，变体与相应的天然序列多肽具有至少约80％的氨基酸序列同一性。这样的变体包括，例如，在多肽的N端和/或C端添加一个或多个氨基酸(天然存在的氨基酸和/或非天然存在的氨基酸)残基的多肽。用于本公开的变体可以通过本领域众所周知的各种方法来制备，例如对编码天然蛋白的DNA中的核苷酸进行定点诱变或噬菌体展示技术，从而产生编码变体的DNA，随后在重组细胞培养中表达该DNA。在本文公开的某些实施方案中，IL-2变体与野生型IL-2蛋白相比包括一个或多个取代。在本文公开的某些实施方案中，IFNα变体与野生型IFNα蛋白相比包括一个或多个取代。
如本文所用的术语“Fc”与关于抗体使用的含义相同，指的是抗体的以下部分，其包括第一重链的第二(CH2)和第三(CH3)恒定区通过二硫键与第二重链的第二和第三恒定区结合。Fc区也可以包括部分或全部的铰链区。抗体的Fc区负责各种效应器功能如ADCC和CDC，但不具有抗原结合功能。在本公开中，术语“Fc”包括野生型Fc和Fc变体。
如本文所用的，术语“可操作地连接”是指两个或更多个感兴趣的生物序列的并置(带有或不带有间隔区或接头或插入序列)以使得它们处于允许以意图方式起作用的关系。当就多肽使用时，是指以允许连接的产物具有意图的生物学功能的方式连接多肽序列。例如，融合蛋白可以可操作地连接于免疫球蛋白恒定区，以便提供具有配体结合活性的稳定产物。又例如，融合蛋白可以与免疫球蛋白恒定区通过其间的插入序列可操作地连接，并且该类插入序列可以是间隔区或可以包含更长的序列。
如本文所用的，当就氨基酸序列(例如肽、多肽或蛋白质)使用时，术语“融合”或“融合的”是指两个或更多个氨基酸序列的组合，例如通过化学键合或重组的方式，形成天然不存在的单个氨基酸序列。融合氨基酸序列可以通过两个编码多核苷酸序列的遗传重组产生，并且可以通过将包含重组多核苷酸的构建体引入宿主细胞的方法来表达。
本文所用的术语“融合蛋白”是指具有两个(或更多个)部分可操作地连接在一起的多肽，其中每个部分是具有不同性质的多肽。该特性可以是一种生物特性，如体外或体内的活性。该特性也可以是简单的化学或物理特性，如与靶抗原的结合、对反应的催化作用等。两部分可以通过单一肽键直接连接，或通过含有一个或多个氨基酸残基的肽接头连接。一般来说，这两个部分和接头将彼此处于读码框内。在某些实施方案中，融合蛋白是IL-2部分、Fc部分和IFNα部分的融合蛋白。在某些实施方案中，融合蛋白是IL-2部分和Fc部分的融合蛋白。在某些实施方案中，融合蛋白是Fc部分和IFNα部分的融合蛋白。
如本文所用，术语“载体”是指可以在其中插入多核苷酸的核酸媒介物。当载体允许插入其中的多核苷酸编码的蛋白质的表达时，该载体称为表达载体。载体可以通过转化、转导或转染入宿主细胞而使携带的遗传物质元件在宿主细胞中表达。载体是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于质粒，噬菌体，粘粒，人工染色体如酵母人工染色体(YAC)，细菌人工染色体(BAC)或P1衍生人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体和动物病毒。可用作载体的动物病毒包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)，腺病毒，腺相关病毒，疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)，痘病毒，杆状病毒，乳头瘤病毒，乳多空病毒(如SV40)。载体可以包含用于控制表达的多个元件，包括但不限于启动子序列，转录起始序列，增强子序列，选择元件和报告基因。另外，载体可以包含复制起点。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指可被工程化以产生感兴趣的蛋白质、蛋白质片段或肽的细胞系统。宿主细胞包括但不限于培养的细胞，例如来源于啮齿动物(大鼠，小鼠，豚鼠或仓鼠)的哺乳动物培养细胞，如CHO，BHK，NSO，SP2/0，YB2/0；或人组织或杂交瘤细胞，酵母细胞和昆虫细胞，以及包含在转基因动物或培养组织内的细胞。该术语不仅涵盖特定的受试细胞，还涵盖这种细胞的后代。由于突变或环境影响可能在后代中发生某些修饰，因此这样的后代可能与亲本细胞不同，但仍包括在术语“宿主细胞”的范围内。
如本文所用，术语“同一性”是指通过比对和比较序列确定的两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系。“百分比同一性”是指比较分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并基于被比较的最小分子的大小计算。对于这些计算，比对中的间隙(如果有的话)优选通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来寻址。可用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括在Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.编),1988,New York:Oxford University Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith,D.W.编),1993,New York:Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data,第I部分,(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编),1994,New Jersey:Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysis in Molecular Biology,New York:Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.和Devereux,J.编),1991,New York:M.Stockton Press；和Carillo等人,1988,SIAMJ.Applied Math.48:1073中描述的那些。
术语“受试者”包括任何人或非人动物，优选人。
如本文所用，术语“癌症”是指引发医学病况的任何肿瘤或恶性细胞生长，可以是增殖或转移介导的实体瘤和非实体瘤。
本文在治疗病况的情况中使用的术语“治疗”和“医治”一般涉及人或动物的治疗和疗法，其中实现了一些期望的治疗效果，例如，抑制病情进展，包括进展速度下降，进展速度停滞，病情消退，病情改善和病情治愈。还包括了作为预防措施(即预防、防护)的治疗。对于癌症，“治疗”可能是指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移或其某种组合。对于肿瘤，“治疗”包括去除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长和转移、预防或延迟肿瘤的发展或其某种组合。
如本文所用，术语“有效量”涉及活性化合物的量或包含活性化合物的材料、组合物或剂量的量，其在按照所需的治疗方案施用时有效用于产生与合理的益处/风险比相称的某些所需的治疗效果。
IL-2变体和IFNα变体
在某些方面，本公开提供了IL-2变体，其与野生型IL-2蛋白例如人类野生型IL-2蛋白相比包括一个或多个修饰，例如插入、缺失和/或取代。本公开进一步提供了融合蛋白，包括IL-2蛋白部分与Fc部分融合。IL2蛋白部分可包括野生型IL-2蛋白，或包括与野生型IL-2蛋白相比包含一个或多个修饰(如插入和/或取代)的IL-2变体。在一些实施方案中，相比于野生型IL-2蛋白，IL-2变体包含选自但不限于以下的一种或多种取代：R38A、L80F、R81D、L85V、I86V和I91F。例如，相比于野生型IL-2蛋白，IL-2变体中的第38位氨基酸被修饰。在一些实施方案中，IL-2变体还包含相比于野生型IL-2蛋白的保守性取代。在一些实施方案中，IL-2变体包含或组成为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-2变体包含或组成为与SEQ ID NO:2至少85％、至少90％、至少95％或至少99％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)相同的氨基酸序列。
在某些方面，本公开提供了IFNα变体，其与野生型IFNα蛋白例如人类野生型IFNα蛋白相比包括一个或多个修饰，例如插入、缺失和/或取代。本公开进一步提供了融合蛋白，包括IFNα蛋白部分与Fc部分融合。IFNα蛋白部分可包括野生型IFNα蛋白，或包括与野生型IFNα蛋白相比包含一个或多个修饰(如插入和/或取代)的IFNα变体。在一些实施方案中，相比于野生型IFNα蛋白，IFNα变体中的第R144和/或R149位氨基酸被修饰。在一些实施方案中，IFNα变体还包含相比于野生型IFNα蛋白的保守性取代。在一些实施方案中，IFNα变体包含或组成为SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，IFNα变体包含或组成为与SEQ ID NO:6至少85％、至少90％、至少95或至少99％(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)相同的氨基酸序列。
本发明的融合蛋白
在某些方面，本公开提供了包括IL-2部分和Fc部分的融合蛋白，包括IFNα部分和Fc部分的融合蛋白，以及包括IL-2部分、Fc部分和IFNα部分的融合蛋白。所述融合蛋白可以是单链或多条链的。在一些实施方案中，所述融合蛋白为双链同二聚体或异二聚体。每条链中的各IL-2部分、Fc部分和IFNα部分可以相同或不同。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白从N末端到C末端包含IL-2部分可操作地连接于Fc部分(又称为IL-2-Fc融合蛋白)。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白从N末端到C末端包含Fc部分可操作地连接于IL-2部分(又称为Fc-IL-2融合蛋白)。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白从N末端到C末端包含IFNα部分可操作地连接于Fc部分(又称为IFNα-Fc融合蛋白)。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白从N末端到C末端包含Fc部分可操作地连接于IFNα部分(又称为Fc-IFNα融合蛋白)。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白从N末端到C末端包含IL-2部分可操作地连接于Fc部分且该Fc部分可操作地连接于IFNα部分(又称为IL-2-Fc-IFNα融合蛋白)。
在一些实施方案中，本发明的融合蛋白从N末端到C末端包含IFNα部分可操作地连接于Fc部分且该Fc部分可操作地连接于IL-2部分(又称为IFNα-Fc-IL-2融合蛋白)。
所述融合蛋白中包含的IL-2部分可包含野生型IL-2蛋白或IL-2变体。所述融合蛋白中包含的IFNα部分可包含野生型IFNα蛋白或IFNα变体。所述融合蛋白中包含的Fc部分可包含野生型Fc或Fc变体。
在一些实施方案中，融合蛋白中包含的IL-2部分中的第38位氨基酸被修饰。已发现第38位氨基酸附近的区域对IL-2引起血管通透性增加起关键作用，因此对第38位氨基酸的改造可显著降低血管通透性。
在一些实施方案中，融合蛋白中包含经过修饰的干扰素α部分，与天然干扰素α相比其与干扰素α受体的亲和力显著降低。这种降低可引起干扰素α引起的毒副作用显著降低，同时保留其抗肿瘤的活性。在一些实施方案中，融合蛋白中包含的干扰素α部分中的R144或R149氨基酸被修饰。这些氨基酸对干扰素α与其受体结合起关键作用，突变后可引起亲和力显著降低，而不影响其抗肿瘤活性。
所述可操作地连接(或者表示为“-”)可以是两部分直接连接，或者通过接头例如肽接头进行连接。在一些实施方案中，IL-2部分通过肽接头可操作地连接于Fc部分。在一些实施方案中，IFNα部分通过肽接头可操作地连接于Fc部分。所述肽接头可以是本领域中常规使用的任何肽接头，例如GS系列接头，如SEQ ID NO:11所示。
本发明提供的融合蛋白可以提高治疗效果，降低毒副作用，提高治疗安全窗。
包含Fc区的融合蛋白
在一些实施方案中，本发明提供的融合蛋白还包含免疫球蛋白恒定结构域序列，例如人IgG的恒定结构域序列，更具体地可包含铰链区和Fc区，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc区序列。如本领域已知的，Fc是指由抗体的第一重链的第二和第三恒定区经由二硫键合结合至第二重链的第二和第三恒定区组成的抗体的部分，任选地Fc区还包含全部或部分的铰链区。本文中的Fc区既包括野生型Fc区还包括其变体，具有用于多种目的的不同突变。所述变体可在Fc区中包含一个或多个氨基酸残基修饰，例如取代。
在某些实施方案中，Fc区变体包含一个或多个氨基酸取代，其改善对新生儿Fc受体(FcRn)的pH依赖性结合。这样的变体可以具有延长的药代动力学半衰期，因为它在酸性pH结合FcRn从而使其能够逃离溶酶体中的降解并然后被转运并释放出细胞。工程化抗体分子以改善与FcRn的结合亲和力的方法在本领域中是众所周知的，参见，例如，Vaughn，D.等人，Structure，6(1):63-73，1998；Kontermann，R.等人，Antibody Engineering，Volume 1,Chapter 27:Engineering of the Fc region for improved PK,Springer,2010；Yeung,Y.等人,Cancer Research,70:3269-3277(2010)；和Hinton,P.等人,J.Immunology,176:346-356(2006)。
在某些实施方案中，本发明提供的融合蛋白包含L234A/L235A取代，以降低与受体FcgRIIIa的结合能力。在某些实施方案中，本发明提供的融合蛋白在Fc区的界面中包含一个或多个氨基酸取代，以协助和/或促进异二聚化。这些修饰包括将突起引入第一Fc多肽中和将腔引入第二Fc多肽中，其中突起可以位于腔中以促进第一和第二Fc多肽的相互作用而形成异二聚体或复合物。生成具有这些修饰的蛋白分子的方法在本领域中是已知的，例如，如在美国专利号5,731,168中所述。
在某些实施方案中，Fc结构域还包括三重突变M252Y/S254T/T256E(“YTE”)。据报道，这种三重突变导致与人新生儿Fc受体(FcRn)的结合增加了约10倍，并且含有YTE的人IgG在食蟹猴中的血清半衰期增加了近4倍(Oganesyan V.等人,Mol Immunol.2009年5月；46(8-9)：1750-5)。在一些进一步的实施方案中，Fc结构域包括另外的突变以增强Fc和人FcRn之间的相互作用。
在一些实施方案中，Fc变体包含或组成为与SEQ ID NO:12至少85％、至少90％或至少99％相同的氨基酸序列。
本发明的融合蛋白的特点
1.通过与Fc融合，延长药物的半衰期，减少细胞因子的用量，降低毒副作用。
2.通过对IL-2的改构，提高细胞因子对NK细胞和CD8+T细胞表面IL-2Rβ和IL-2Rγ的亲和力，增强这些细胞对肿瘤的杀伤作用。
3.对IL-2第38位氨基酸的改造可显著降低IL-2引起的血管通透性增加的毒副作用。
4.对R144和R149的改造可降低其与受体IFNαR2的结合能力，降低毒副作用，同时 保留其抗肿瘤活性。
5.综合以上特点，改构后的IL-2与IFNα和Fc融合蛋白可以克服目前IL-2与IFNα药物的缺点，改善治疗效果，降低毒副作用，提高治疗安全窗。
多核苷酸、载体和宿主细胞
在一些方面，本发明还提供编码此类融合蛋白的多核苷酸。所述多核苷酸可用于表达融合蛋白。在一些实施方案中，所述多核苷酸还可以用作用于实现多肽融合蛋白的体内表达的呈活性形式的治疗剂。
编码所述融合蛋白的多核苷酸易于使用本领域已知的常规程序进行分离和测序。所述多核苷酸也可以通过合成方法获得。优选地，所述多核苷酸经过密码子优化以便在真核宿主细胞，特别是哺乳动物细胞中表达。
使用已知的重组技术，可以将编码融合蛋白的多核苷酸插入载体中以进一步克隆(DNA的扩增)或表达。载体组分通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标志物基因、增强子元件、启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)以及转录终止序列。
在一些实施方案中，本公开提供了包含本文提供的编码融合蛋白的多核苷酸的载体(例如表达载体)，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)，和至少一个选择标志物。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)，腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)，痘病毒，杆状病毒，乳头瘤病毒，乳多空病毒(例如SV40)，λ噬菌体，和M13噬菌体，脂质体，质粒pcDNA3.3，pMD18-T，pOptivec，pCMV，pEGFP，pIRES，pQD-Hyg-GSeu，pALTER，pBAD，pcDNA，pCal，pL，pET，pGEMEX，pGEX，pCI，pEGFT，pSV2，pFUSE，pVITRO，pVIVO，pMAL，pMONO，pSELECT，pUNO，pDUO，Psg5L，pBABE，pWPXL，pBI，p15TV-L，pPro18，pTD，pRS10，pLexA，pACT2.2，pCMV-SCRIPT.RTM，pCDM8，pCDNA1.1/amp，pcDNA3.1，pRc/RSV，PCR 2.1，pEF-1，pFB，pSG5，pXT1，pCDEF3，pSVSPORT，pEF-Bos等。
可以将包含编码融合蛋白的多核苷酸序列的载体导入宿主细胞用于进行克隆或基因表达。用于在本文的载体中克隆或表达DNA的合适宿主细胞是原核生物、酵母或更高等的真核细胞。为此目的合适的原核生物包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌，如大肠杆菌。除了原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母是用于提供的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母或普通的面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其他属、种和菌株在本文中是普遍可获得的和有用的。
用于表达本文提供的融合蛋白的合适宿主细胞也可以衍生自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。在一些优选的实施方案中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些另外的优选的实施方案中，宿主细胞是其他哺乳动物细胞系，例如人 细胞系。
用上述表达或克隆载体转化宿主细胞用于产生融合蛋白并在经适当修饰的常规营养培养基中培养用于诱导启动子，选择转化子或扩增编码所需序列的基因。
用于产生本文提供的融合蛋白的宿主细胞可以在多种培养基中培养。这些培养基中的任何一种可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)，盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)，缓冲液(例如HEPES)，核苷酸(例如腺苷和胸苷)，抗生素(例如GENTAMYCINTM药物)，微量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)，和葡萄糖或等效能量来源。也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其他必要的补充剂。培养条件，例如温度、pH等是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于普通技术人员而言是显而易见的。
由细胞制备的融合蛋白可以使用例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱、硫酸铵沉淀、盐析和亲和色谱来纯化，其中亲和色谱是优选的纯化技术。
药物组合物
在一些方面，本发明提供包含与药学上可接受的载体一起配制的本发明的融合蛋白的组合物，例如药物组合物。这类组合物包含至少一种本发明的融合蛋白或编码该融合蛋白的多核苷酸。
如本文所使用的，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有药学上可接受的液体、凝胶或固体载体、水性媒介物、非水媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮液/分散剂、隔绝剂或螯合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒的辅助物质，本领域已知的其他组分或其各种组合等等。所述载体可以适于静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊髓、经表皮、玻璃体内注射或植入施用等。取决于给药途径，活性化合物，即本发明的成分，可以包被在材料中以防止所述化合物免受酸和其它可能灭活所述化合物的自然条件的作用。
本发明的药物组合物还可包括药学上可接受的抗氧化剂。可用于本发明的药物组合物中的适当的水性载体和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)和其适当的混合物、植物油如橄榄油及可注射的有机酯如油酸乙酯。例如，可以通过利用包衣材料(如卵磷脂)、在分散剂的情况下通过维持所需要的颗粒大小和通过利用表面活性剂维持适当的流动性。
这些组合物还可包含辅助剂如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。药物组合物可以是固体、糊剂、软膏、凝胶、液体、气雾剂、喷雾剂、聚合物、薄膜、乳液或混悬液形式。
在某些实施方案中，药物组合物配制成可注射的组合物。可以以任何常规形式制备可注射药物组合物，例如液体溶液，悬浮剂，乳剂或适于产生液体溶液、悬浮剂或乳剂的固体形式。用于注射的制备物可以包括准备注射的无菌和/或非热解溶液，无菌干燥可溶产品， 如冻干粉，准备在使用前与溶剂混合，包括皮下注射片剂，准备注射的无菌悬浮液，准备在使用前与媒介物组合的无菌干燥的不溶性产品，以及无菌和/或非热解乳液。溶液可以是水性或非水性的。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。
活性成分和小分子在本发明的药物组合物中的实际剂量水平可以有所变化，以便获得对特定患者、组成和施用模式有效实现期望治疗响应而对所述患者无毒性的活性成分的量。所选择的剂量水平取决于各种药代动力学因素，包括所使用的本发明的特定组合、或者其酯、盐或酰胺的活性、给药途径、施用时间、使用的特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所使用的特定组合联合使用的其它药物、化合物和/或材料、待治疗患者的年龄、性别、体重、病症、总体健康状况和在先病史、以及医学领域内熟知的类似因素。
本公开的应用
本公开的融合蛋白、药物组合物和方法具有许多体外和体内用途，包括例如免疫应答的增强。例如，可以将这些分子体外或离体施用于培养的细胞，或例如体内施用于人受试者，以增强各种情况下的免疫力。免疫应答可以被调节，例如被增强、刺激或上调。
例如，受试者包括需要调节免疫应答的人类患者。在一个具体的实施方案中，所述方法特别适合于体内治疗癌症。为了实现免疫力的增强，可以将融合蛋白单独地或与另一疗法组合施用。当融合蛋白与另一种药剂一起施用时，两者可以以任何顺序施用或同时施用。
在一些方面，本公开提供了治疗哺乳动物中病症或疾病的方法，其包括向需要治疗的受试者(例如人)施用治疗有效量的如本文公开的融合蛋白。所述病症或疾病可以是癌症，例如IL-2和IFNα可治疗的癌症。可以使用本公开提供的方法治疗或预防多种癌症，无论是恶性的还是良性的，以及是原发性的还是继发性的。癌症可以是实体瘤或血液恶性癌。
本文公开的融合蛋白可以作为单一疗法单独使用，或者可以与细胞免疫疗法、靶向疗法、化疗或放疗等组合使用。
本发明涉及的序列汇总
SEQ ID NO:1(野生型IL-2氨基酸序列)
SEQ ID NO:2(IL-2衍生物氨基酸序列)
SEQ ID NO:3(IL-2-Fc融合蛋白氨基酸序列)
SEQ ID NO:4(Fc-IL-2融合蛋白氨基酸序列)
SEQ ID NO:5(野生型IFNα氨基酸序列)
SEQ ID NO:6(IFNα衍生物氨基酸序列)
SEQ ID NO:7(IFNα-Fc融合蛋白氨基酸序列)
SEQ ID NO:8(Fc-IFNα融合蛋白氨基酸序列)
SEQ ID NO:9(IL-2-Fc-IFNα融合蛋白氨基酸序列)
SEQ ID NO:10(IFNα-Fc-IL-2融合蛋白氨基酸序列)
SEQ ID NO:11(柔性连接子氨基酸序列)
SEQ ID NO:12(Fc部分氨基酸序列)
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
实施例1：融合蛋白的分子构建与生产
构建了一种IL-2-Fc-IFNα融合蛋白，从N末端到C末端分别包含IL-2部分可操作地连接于免疫球蛋白Fc部分且该免疫球蛋白Fc部分可操作地连接于IFNα部分，该融合蛋白在下文中称为IL-2-Fc-IFNα，其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。还构建了IL-2-Fc融合蛋白，从N末端到C末端分别包含IL-2部分可操作地连接于免疫球蛋白Fc部分， 该融合蛋白在下文中称为IL-2-Fc，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。还构建了Fc-IFNα融合蛋白，从N末端到C末端分别包含免疫球蛋白Fc部分可操作地连接于IFNα部分，该融合蛋白在下文中称为Fc-IFNα，其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
通过常规的分子生物学技术PCR扩增抗体轻重链基因，并通过同源重组技术将编码氨基酸序列的基因连接到pcDNA3.4载体上。将测序后的阳性克隆提取质粒后转染到Expi293F细胞，在37℃/5％CO2/125rpm摇床中继续培养7天，培养结束后收集上清经proteinA亲和层析，获得纯化后的融合蛋白分子，并通过UV280结合理论消光系数确定抗体浓度。
图1B展示了IL-2-Fc-IFNα融合蛋白的SDS PAGE胶图，图1C显示了其HPLC纯度的分析图。
实施例2：ELISA检测与受体IL-2Rα蛋白的结合能力
包被IL-2Rα蛋白(10165-H08H，义翘神州)，包被浓度为2μg/ml，100ul/孔4℃过夜；用300ul/孔3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入不同浓度融合蛋白及其对照样品各100ul，37℃孵育1h；然后加入Anti-IFNα2 Rabbit pAb，37℃孵育1h，再加入Anti-Rabbit IgG HRP 37℃孵育1h；每孔加入100ul TMB显色5min后加入50ul终止液，酶标仪上读取OD450。
结果见图2。与野生型IL-2(11848-HNAH1-E，义翘神州)相比，IL-2-Fc及IL-2-Fc-IFNα与受体IL-2Rα蛋白的结合能力明显提高。
实施例3：ELISA检测与受体IL-2Rβ蛋白的结合能力
包被IL-2Rβ蛋白(10696-H05H，义翘神州)，包被浓度为2μg/ml，100ul/孔4℃过夜；用300ul/孔3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入不同浓度融合蛋白及其对照样品各100ul，37℃孵育1h；然后加入Anti-IFNα2 Rabbit pAb，37℃孵育1h，再加入Anti-Rabbit IgG HRP 37℃孵育1h；每孔加入100ul TMB显色5min后加入50ul终止液，酶标仪上读取OD450。
结果见图3。与野生型IL-2相比，IL-2-Fc及IL-2-Fc-IFNα与受体IL-2Rβ蛋白的结合能力有超24倍的提高。
实施例4：ELISA检测与受体IFNαR2蛋白的结合能力
包被IFNαR2蛋白(10359-H02H，义翘神州)，包被浓度为2μg/ml，100ul/孔4℃过夜；用300ul/孔3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入不同浓度融合蛋白及其对照样品各100ul，37℃孵育1h；然后加入Anti-IL-2 Rabbit pAb，37℃孵育1h，再加入Anti-Rabbit IgG HRP 37℃孵育1h；每孔加入100ul TMB显色5min后加入50ul终止液，酶标仪上读取OD450。
结果见图4。与野生型IFNα相比，Fc-IFNα与受体IFNαR2蛋白的结合能力明显降低 而IL-2-Fc-IFNα与受体IFNαR2蛋白的结合能力明显提高。
实施例5：ELISA检测与不同种属间受体IL-2Rα蛋白的结合能力
分别包被人、小鼠和食蟹猴IL-2Rα蛋白，包被浓度为2μg/ml，100ul/孔4℃过夜；用300ul/孔3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入不同浓度融合蛋白及其对照样品各100ul，37℃孵育1h；然后加入Anti-IFNα2 Rabbit pAb，37℃孵育1h，再加入Anti-Rabbit IgG HRP 37℃孵育1h；每孔加入100ul TMB显色5min后加入50ul终止液，酶标仪上读取OD450。
结果见图5。实验证实IL-2-Fc-IFNα与人、小鼠、食蟹猴受体IL-2Rα蛋白的结合能力相似，因此与小鼠及食蟹猴有种属交叉。
实施例6：ELISA检测与不同种属间受体IL-2Rβ蛋白的结合能力
分别包被人、小鼠和食蟹猴IL-2Rβ蛋白，包被浓度为2μg/ml，100ul/孔4℃过夜；用300ul/孔3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入不同浓度融合蛋白及其对照样品各100ul，37℃孵育1h；然后加入Anti-IFNα2 Rabbit pAb，37℃孵育1h，再加入Anti-Rabbit IgG HRP 37℃孵育1h；每孔加入100ul TMB显色5min后加入50ul终止液，酶标仪上读取OD450。
结果见图6。实验证实IL-2-Fc-IFNα与人、小鼠、食蟹猴受体IL-2Rβ蛋白均有种属交叉。其中与食蟹猴的IL-2Rβ蛋白结合能力和人的相似。与小鼠的IL-2Rβ蛋白结合低于和人的结合。
实施例7：ELISA检测与不同种属间受体IFNαR2蛋白的结合能力
分别包被人、小鼠和食蟹猴IFNαR2蛋白，包被浓度为2μg/ml，100ul/孔4℃过夜；用300ul/孔3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入不同浓度融合蛋白及其对照样品各100ul，37℃孵育1h；然后加入Anti-IL-2 Rabbit pAb，37℃孵育1h，再加入Anti-Rabbit IgG HRP 37℃孵育1h；每孔加入100ul TMB显色5min后加入50ul终止液，酶标仪上读取OD450。
结果见图7。实验证实IL-2-Fc-IFNα与人、小鼠、食蟹猴受体IFNαR2蛋白均有结合，展示了种属交叉。
实施例8：检测与FcRn蛋白的结合能力
8.1ELISA检测与FcRn蛋白的结合能力
包被FcRn蛋白(10359-H02H，义翘神州)，包被浓度为2μg/ml，100ul/孔4℃过夜；用300ul/孔3％脱脂奶粉37℃封闭1h；每孔加入不同浓度融合蛋白及其对照样品各100ul，37℃孵育1h；然后加入Anti-IFNα2 Rabbit pAb，37℃孵育1h，再加入Anti-Rabbit IgG HRP 37℃孵育1h；每孔加入100ul TMB显色5min后加入50ul终止液，，酶标仪上读取OD450。
结果见图8A。实验证实和Herceptin抗体(赫赛汀)相比，IL-2-Fc-IFNα与FcRn蛋白有显著增高的结合力
8.2 Fortebio检测与FcRn蛋白的结合能力
用ProA、HIS探针Load待测蛋白(浓度为4μg/ml)，然后与不同浓度FcRn(4ug/ml、1ug/ml、0.25ug/ml和0)蛋白结合、解离，计算待测分子与其的亲和力。
结果见图8B。实验证实和Herceptin抗体(赫赛汀)相比，IL-2-Fc-IFNα与FcRn蛋白有显著增高的亲和力。
实施例9：对人PBMC细胞刺激后免疫细胞亚群检测
按150000个细胞/孔将人新鲜PBMC铺板至96孔板中，按照试验设计加入500nM的蛋白，继续培养72h；孵育结束后，按流式检测要求染色分别标记Anti-Foxp3抗体(FITC)、Anti-CD4抗体(PE)、Anti-CD56抗体(PE)、Anti-CD8抗体(PE)和Anti-Granzyme B抗体(FITC)，采集并分析流式数据，进行数据汇总并分析。
结果见图9。实验证实IL-2-Fc-IFNα刺激PBMC中NK和CD8阳性T细胞激活、表达Granzyme B的能力与野生型IL-2保持相同活性；刺激Treg细胞(FOXP3+细胞)的增殖能力比野生型IL-2明显降低。
实施例10：对CTLL-2小鼠T淋巴细胞刺激增殖能力检测
培养扩增小鼠CTLL-2细胞至所需细胞量，按100000个细胞/孔将小鼠CTLL-2细胞铺板至96孔板中，按照试验设计加入不同浓度(100nM、4nM、800pM、400pM、200pM、100pM、50pM、25pM、0)蛋白，继续培养72h；采用CCK-8法测定活细胞Formazan表达量，进而评价细胞活力。具体操作按照说明书操作,培养结束后加入10％CCK-8溶液，混匀后，共孵育2-4小时，在酶标仪中采集吸光值数据。使用Excel软件分析处理数据，使用GraphPad Prism 7软件，根据吸光值数据拟合药效剂量曲线，计算IC50。
结果见图10。实验证实IL-2-Fc-IFNα刺激CTLL-2细胞增殖的能力比野生型IL-2高10倍。
实施例11：对肿瘤细胞的体外直接杀伤能力检测
直接杀伤能力是在没有免疫细胞的存在下，测定IFN-a对肿瘤细胞的直接杀伤。
11.1对人胃癌细胞株NCI-N87的直接杀伤能力检测
培养扩增人胃癌细胞NCI-N87至所需细胞量，按4000个细胞/孔将NCI-N87细胞铺板至96孔板中，按照试验设计加入不同浓度(4000nM、1000nM、250nM、100nM、62.5nM、 15.625nM、10nM、4nM、1.5625nM、1nM、244.14pM、156.25pM、100pM、100pM、10pM、1pM、0)蛋白，继续培养5天；采用CCK-8法测定活细胞Formazan表达量，进而评价细胞活力。具体操作按照说明书操作,培养结束后加入10％CCK-8溶液，混匀后，共孵育2-4小时，在酶标仪中采集吸光值数据。使用Excel软件分析处理数据，使用GraphPad Prism 7软件，根据吸光值数据拟合药效剂量曲线，计算IC50。
结果见图11A。野生型IFNα对NCI-N87细胞有显著杀伤功能；而IL-2-Fc-IFNα只有在高浓度下对NCI-N87细胞有杀伤作用。阴性对照TTI-622(SIRPa-Fc)对NCI-87细胞没有杀伤功能。
11.2对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231的直接杀伤能力检测
培养扩增人乳腺癌细胞MDA-MB-231至所需细胞量，按2000个细胞/孔将MDA-MB-231细胞铺板至96孔板中，按照试验设计加入不同浓度(4000nM、1000nM、250nM、62.5nM、15.625nM、4nM、1nM、244.14pM、61pM、15.26pM、0)蛋白，继续培养5天；采用CCK-8法测定活细胞Formazan表达量，进而评价细胞活力。具体操作按照说明书操作,培养结束后加入10％CCK-8溶液，混匀后，共孵育2-4小时，在酶标仪中采集吸光值数据。使用Excel软件分析处理数据，使用GraphPad Prism 7软件，根据吸光值数据拟合药效剂量曲线，计算IC50。
结果见图11B。野生型IFNα对MDA-MB-231细胞有显著杀伤功能；而IL-2-Fc-IFNα只有在高浓度下对MDA-MB-231细胞有杀伤作用。阴性对照TTI-622(SIRPa-Fc)对MDA-MB-231细胞没有杀伤功能。
11.3对人黑色素瘤细胞株A375的直接杀伤能力检测
培养扩增人乳腺癌细胞A375至所需细胞量，按1000个细胞/孔将A375细胞铺板至96孔板中，按照试验设计加入不同浓度(16000nM、1600nM、160nM、16nM、1.6nM、160pM、16pM、1.6pM、0.16pM、0)蛋白，继续培养5天；采用CCK-8法测定活细胞Formazan表达量，进而评价细胞活力。具体操作按照说明书操作,培养结束后加入10％CCK-8溶液，混匀后，共孵育2-4小时，在酶标仪中采集吸光值数据。使用Excel软件分析处理数据，使用GraphPad Prism 7软件，根据吸光值数据拟合药效剂量曲线，计算IC50。
结果见图11C。野生型IFNα对A375细胞有显著杀伤功能；而IL-2-Fc-IFNα只有在高浓度下对A375细胞有杀伤作用。阴性对照TTI-622(SIRPa-Fc)对A375细胞没有杀伤功能。
11.4对人Burkitt's淋巴瘤细胞株Daudi B细胞的直接杀伤能力检测
培养扩增人Burkitt's淋巴瘤细胞Daudi B细胞至所需细胞量，按10000个细胞/孔将Daudi B细胞铺板至96孔板中，按照试验设计加入不同浓度(62.5nM、12.5nM、2.5nM、500pM、250pM、125pM、62.5pM、31.25pM、15.625pM、7.813pM、4pM、2pM、0)蛋白，继续培养5天；采用CCK-8法测定活细胞Formazan表达量，进而评价细胞活力。具体操作按 照说明书操作,培养结束后加入10％CCK-8溶液，混匀后，共孵育2-4小时，在酶标仪中采集吸光值数据。使用Excel软件分析处理数据，使用GraphPad Prism 7软件，根据吸光值数据拟合药效剂量曲线，计算IC50。
结果见图11D。野生型IFNα对Daudi B细胞有显著杀伤功能；而IL-2-Fc-IFNα只有在较高浓度下对Daudi B细胞有杀伤作用。阴性对照TTI-622(SIRPa-Fc)对Daudi B细胞没有杀伤功能。
实验证实本发明的融合蛋白的直接杀伤功能相较于野生型IFNα2较弱，但仍保留IFNα臂直接杀伤功能。
实施例12：对肿瘤细胞的体外综合杀伤能力检测
综合杀伤功能是直接杀伤能力和间接杀伤能力的总和。综合杀伤能力在免疫细胞PBMC的存在下获得。
12.1对人胃癌细胞株NCI-N87的综合杀伤能力检测
培养扩增人胃癌细胞NCI-N87至所需细胞量，按4000个细胞/孔将NCI-N87细胞铺板至96孔板中，待6小时细胞贴壁；采购新鲜的人PBMC，按照效靶比10：1进行铺板，按照试验设计加入不同浓度(800nM、80nM、8nM、800pM、80pM、8pM、0.8pM、0)蛋白，继续培养5天；PBS三次洗板，移除PBMC，采用CCK-8法测定活细胞Formazan表达量，进而评价细胞活力。具体操作按照说明书操作,培养结束后加入10％CCK-8溶液，混匀后，共孵育2-4小时，在酶标仪中采集吸光值数据。使用Excel软件分析处理数据，使用GraphPad Prism 7软件，根据吸光值数据拟合药效剂量曲线，计算IC50。
结果见图12A。IL-2-Fc-IFNα对NCI-N87细胞的综合杀伤能力强于野生型IL-2。
12.2对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231的综合杀伤能力检测
培养扩增人乳腺癌细胞MDA-MB-231至所需细胞量，按4000个细胞/孔将MDA-MB-231细胞铺板至96孔板中，待6小时细胞贴壁；采购新鲜的人PBMC，按照效靶比10：1进行铺板，按照试验设计加入不同浓度(800nM、80nM、8nM、800pM、80pM、8pM、0.8pM、0)蛋白，继续培养5天；PBS三次洗板，移除PBMC，采用CCK-8法测定活细胞Formazan表达量，进而评价细胞活力。具体操作按照说明书操作,培养结束后加入10％CCK-8溶液，混匀后，共孵育2-4小时，在酶标仪中采集吸光值数据。使用Excel软件分析处理数据，使用GraphPad Prism 7软件，根据吸光值数据拟合药效剂量曲线，计算IC50。
结果见图12B。IL-2-Fc-IFN-a对MDA-MB-231细胞的综合杀伤能力和野生型IL-2相似。
12.3对人黑色素瘤细胞株A375的综合杀伤能力检测
培养扩增人黑色素瘤细胞A375至所需细胞量，按4000个细胞/孔将A375细胞铺板至96孔板中，待6小时细胞贴壁；采购新鲜的人PBMC，按照效靶比10：1进行铺板，按照试 验设计加入不同浓度(800nM、80nM、8nM、800pM、80pM、8pM、0.8pM、0)蛋白，继续培养5天；PBS三次洗板，移除PBMC，采用CCK-8法测定活细胞Formazan表达量，进而评价细胞活力。具体操作按照说明书操作,培养结束后加入10％CCK-8溶液，混匀后，共孵育2-4小时，在酶标仪中采集吸光值数据。使用Excel软件分析处理数据，使用GraphPad Prism 7软件，根据吸光值数据拟合药效剂量曲线，计算IC50。
结果见图12C。IL-2-Fc-IFN-a对A375细胞的综合杀伤能力显著强于野生型IL-2。
12.4对人Burkitt's淋巴瘤细胞株Daudi B细胞的综合杀伤能力检测
培养扩增人Burkitt's淋巴瘤细胞Daudi B细胞至所需细胞量，从供体处采集分离新鲜PBMC，按10000个细胞/孔将Daudi B细胞铺板至96孔板中,设置两个复孔，PBMC(效靶比设置为10：1和5：1)及不同浓度IAMA005(16nM、160nM)按实验排版设计加入对应孔板中,共3块板，按不同检测时间分别取用，Co-Culture培养24h、48h、72h后分布留取培养上清至LDH检测保存液中，并存放于-80度冰箱。每孔细胞分别重悬后按流式检测要求染色并进行检测，采集并分析流式数据，进行数据汇总并分析。结果见图12D。
培养扩增人Burkitt's淋巴瘤细胞Daudi B细胞至所需细胞量，对Daudi B细胞进行CFSE染色，再按20000个细胞/孔将Daudi B细胞铺板至96孔板中；采购新鲜的人PBMC，按照效靶比10：1进行铺板，按照试验设计加入不同浓度(800nM、80nM、8nM、800pM、80pM、8pM、0.8pM、0)蛋白，继续培养5天；PBS三次洗板并进行低速离心，移除细胞碎片，采用荧光酶标仪法测定活细胞荧光强度，进而评价细胞活力。使用Excel软件分析处理数据，使用GraphPad Prism 7软件，根据吸光值数据拟合药效剂量曲线，计算IC50。
结果见图12E。IL-2-Fc-IFN-a对Daudi B细胞的综合杀伤能力维持与野生型IL-2相当的活性。
实施例13：ExVivo类器官系统中的药效研究
收集乳腺癌患者胸水样本(鉴定为HER2 2+阳性)，分离样本中的细胞，包括肿瘤细胞和免疫细胞。候选药物和参比药物在体外与肿瘤细胞免疫细胞复合物共孵育。处理4-5天后，收集培养基和细胞进行分析，包括肿瘤细胞、Granzyme B、IFN-γ等。
结果见图13。在该例样本的ExVivo评价系统中，IL-2-Fc-IFN-a刺激的胸水免疫细胞抗肿瘤活性明显提升，其分泌的抗肿瘤活性细胞因子Granzyme B和IFN-γ亦显著升高。
上文结合附图描述了本公开的示范实施例。然而，本领域技术人员应当理解的是，本公开不局限于所公开的具体结构。在不脱离本公开的精神和范围的情况下，能够对本公开的示范实施例进行多种变化和改变。所有这些变化和改变均包含在由本公开的权利要求所限定的保护范围内。
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Claims (28)

  1. 一种融合蛋白，其包含IL-2部分和Fc部分，其中所述IL-2部分包含与野生型IL-2蛋白相比具有一个或多个突变的氨基酸序列，所述氨基酸序列为与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列。
  2. 权利要求1的融合蛋白，其中所述突变包括参照SEQ ID NO:1中氨基酸位置的选自以下的一种或多种取代：R38A、L80F、R81D、L85V、I86V和I91F。
  3. 权利要求1或2的融合蛋白，其中所述Fc部分包含人IgG Fc，如人IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG3 Fc、IgG4 Fc或其变体。
  4. 权利要求3的融合蛋白，其中所述Fc变体包含选自以下的一种或多种突变：L234A和L235A突变、以及M252Y、S254T和T256E突变。
  5. 权利要求1-4中任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白还包含IFNα部分。
  6. 权利要求5的融合蛋白，其中所述IFNα部分包含与SEQ ID NO:6或5具有至少90％同一性的氨基酸序列。
  7. 权利要求6的融合蛋白，其中所述IFNα部分包括参照SEQ ID NO:5中氨基酸位置的选自以下的一种或多种取代：R144A和R149A。
  8. 权利要求1-7中任一项的融合蛋白，其包含：
    (a)IL-2部分可操作地连接于Fc部分；
    (b)IL-2部分可操作地连接于Fc部分且Fc部分可操作地连接于IFNα部分；
    (c)IL-2部分可操作地连接于IFNα部分且IFNα部分可操作地连接于Fc部分；或
    (d)IFNα部分可操作地连接于IL-2部分且IL-2部分可操作地连接于Fc部分。
  9. 权利要求8的融合蛋白，其从N末端到C末端包含：
    (a)IL-2部分可操作地连接于Fc部分；
    (b)IL-2部分可操作地连接于Fc部分且Fc部分可操作地连接于IFNα部分；
    (c)Fc部分可操作地连接于IL-2部分；或
    (d)IFNα部分可操作地连接于Fc部分且Fc部分可操作地连接于IL-2部分。
  10. 权利要求8或9的融合蛋白，其中所述可操作地连接是直接连接或通过肽接头进行连接，任选地所述肽接头为GS系列接头，例如如SEQ ID NO:11所示的肽接头。
  11. 权利要求1-10中任一项的融合蛋白，其包含如SEQ ID NO:3、4、9或10所示的氨基酸序列。
  12. 一种融合蛋白，其包含IFNα部分和Fc部分，其中所述IFNα部分包含与野生型IFNα蛋白相比具有一个或多个突变的氨基酸序列，所述氨基酸序列为与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的氨基酸序列。
  13. 权利要求12的融合蛋白，其中所述IFNα部分包括参照SEQ ID NO:5中氨基酸位置的选自以下的一种或多种取代：R144A和R149A。
  14. 权利要求12或13的融合蛋白，其中所述Fc部分包含人IgG Fc，如人IgG1 Fc、IgG2 Fc、IgG3 Fc、IgG4 Fc或其变体。
  15. 权利要求14的融合蛋白，其中所述Fc变体包含选自以下的一种或多种突变：L234A和L235A突变、以及M252Y、S254T和T256E突变。
  16. 权利要求12-15中任一项的融合蛋白，其从N末端到C末端包含：
    (a)IFNα部分可操作地连接于Fc部分；或
    (b)Fc部分可操作地连接于IFNα部分。
  17. 权利要求16的融合蛋白，其包含如SEQ ID NO:7或8所示的氨基酸序列。
  18. 一种核酸分子，其包括编码权利要求1-16中任一项的融合蛋白的核酸序列。
  19. 包含权利要求18的核酸分子的载体。
  20. 包含权利要求18的核酸分子或权利要求19的载体的宿主细胞。
  21. 一种药物组合物，其包含权利要求1-16中任一项的融合蛋白或编码其的核酸分子，以及药学上可接受的载剂。
  22. 一种用于生产权利要求1-16中任一项的融合蛋白的方法，其包括以下步骤：
    -在包含编码所述融合蛋白的载体的宿主细胞中表达所述融合蛋白；和
    -从宿主细胞培养物中分离出所述融合蛋白。
  23. 一种调节受试者中的免疫应答的方法，其包括向受试者施用权利要求1-16中任一项的融合蛋白或权利要求21的药物组合物。
  24. 一种用于治疗或预防受试者中的癌症或感染性疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的权利要求1-16中任一项的融合蛋白或权利要求21的药物组合物。
  25. 权利要求24的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、胃癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、肾细胞癌、肝癌、前列腺癌、胰腺癌和白血病。
  26. 权利要求1-16中任一项的融合蛋白在制备用于预防、治疗和/或管理癌症或感染性疾病的药物中的用途。
  27. 权利要求1-16中任一项的融合蛋白，其用于治疗或预防癌症或感染性疾病。
  28. 一种试剂盒，包括包含权利要求1-16中任一项的融合蛋白或权利要求21的药物组合物的容器。
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