CN115552014A - 嵌合衔接子蛋白和调控基因表达的方法 - Google Patents

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郑玥婷
杨之芬
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Abstract

本公开提供了一种调控细胞中靶多核苷酸的表达的方法。所述方法可包括使系统在细胞中表达，其中细胞包含受体，该受体具有对配体具有特异性的配体结合结构域。所述方法可包括使细胞与特异性结合配体结合结构域的配体接触。在细胞中表达的系统可包含在接触时能够被激活的第一嵌合多肽和第二嵌合多肽。第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的一个可包含基因调节多肽(GMP)，该基因调节多肽包含连接至切割识别位点的致动部分。致动部分可以能够调控细胞中靶多核苷酸的表达。第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的另一个可包含能够切割GMP的切割识别位点的切割部分。

Description

嵌合衔接子蛋白和调控基因表达的方法
交叉引用
本申请要求提交于2020年3月5日的美国专利申请号62/985,876的权益，其以引用方式整体并入本文中。
背景技术
细胞活动的调控可以涉及配体与包含配体结合结构域和信号传导结构域的膜结合受体的结合。在配体与配体结合结构域之间形成复合物可以导致受体的构象修饰和/或化学修饰，这可以导致细胞内信号转导。在一些情形下，受体的信号传导结构域的或邻近于信号传导结构域的部分被磷酸化(例如，转磷酸化和/或自磷酸化)，从而导致其活性发生变化。这些事件可以与第二信使和/或辅因子部分(例如，蛋白质)的募集相结合。在一些情况下，受体的这种部分的变化导致与其他信号传导部分(例如，辅因子蛋白和/或其他受体)的结合。这些其他信号传导部分可以被激活，并且接着在细胞内执行各种功能。
发明内容
在一个方面，本公开提供了一种调控细胞中靶多核苷酸的表达或活性的方法，包括：(a)使系统在细胞中表达，其中细胞包含受体，所述受体具有对配体具有特异性的配体结合结构域；以及(b)使细胞与特异性结合所述配体结合结构域的配体接触，其中在细胞中表达的系统包含：在接触步骤(b)时能够被激活的第一嵌合多肽和第二嵌合多肽，其中第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的一个包含基因调节多肽(GMP)，所述基因调节多肽包含连接至切割识别位点的致动部分(actuator moiety)，所述致动部分能够调控细胞中靶多核苷酸的表达或活性，并且其中第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的另一个包含能够切割GMP的切割识别位点的切割部分，其中，在细胞与特异性结合所述受体的配体结合结构域的配体接触时，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽被激活，使得切割部分切割所述切割识别位点并从GMP释放致动部分，从而调控细胞中靶多核苷酸的表达或活性，并且其中受体是细胞的内源性受体。
在一些实施方案中，第一嵌合多肽包含第一衔接子部分，所述第一衔接子部分能够被激活以结合内源性受体的第一细胞内结构域。在本文公开的方法中的任一种的一些实施方案中，第二嵌合多肽包含第二衔接子部分，所述第二衔接子部分能够被激活以结合(i)内源性受体的第二细胞内结构域，(ii)第一衔接子部分，或(iii)内源性受体的下游信号传导部分。
在本文公开的方法中的任一种的一些实施方案中，第一嵌合多肽包含第一衔接子部分，所述第一衔接子部分能够被激活以结合内源性受体的第一下游信号传导部分。在本文公开的方法中的任一种的一些实施方案中，第二嵌合多肽包含第二衔接子部分，所述第二衔接子部分能够被激活以结合(i)第一衔接子部分，(ii)第一下游信号传导部分，或(iii)内源性受体的第二下游信号传导部分。
在另一方面，本公开提供了一种调控细胞中靶多核苷酸的表达或活性的方法，包括：(a)使系统在细胞中表达，其中细胞包含受体，所述受体具有对配体具有特异性的配体结合结构域；以及(b)使细胞与特异性结合所述配体结合结构域的配体接触，其中在细胞中表达的系统包含：在接触步骤(b)时能够被激活的第一嵌合多肽和第二嵌合多肽，其中第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的一个包含基因调节多肽(GMP)，所述基因调节多肽包含连接至切割识别位点的致动部分，所述致动部分能够调控细胞中靶多核苷酸的表达或活性，并且其中第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的另一个包含能够切割GMP的切割识别位点的切割部分，其中，在细胞与特异性结合所述受体的配体结合结构域的配体接触时，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽被激活，使得切割部分切割所述切割识别位点并从GMP释放致动部分，从而调控细胞中靶多核苷酸的表达或活性，并且其中第一嵌合多肽或第二嵌合多肽不能直接结合受体。
在一些实施方案中，第一嵌合多肽包含第一衔接子部分，所述第一衔接子部分能够被激活以结合受体的细胞内结构域，并且其中第二嵌合多肽不能直接结合所述受体。在本文公开的方法中的任一种的一些实施方案中，第二嵌合多肽包含第二衔接子部分，所述第二衔接子部分能够被激活以结合(i)第一衔接子部分或(ii)能够被激活以结合第一衔接子部分的受体的下游信号传导部分。
在本文公开的方法中的任一种的一些实施方案中，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽不能直接结合受体。在本文公开的方法中的任一种的一些实施方案中，第一嵌合多肽包含第一衔接子部分，所述第一衔接子部分能够被激活以结合受体的下游信号传导部分，并且其中第二嵌合多肽包含第二衔接子部分，所述第二衔接子部分能够被激活以结合(i)第一衔接子部分，(ii)下游信号传导部分，或(iii)受体的不同下游信号传导部分。
在本文公开的方法中的任一种的一些实施方案中，受体是内源性受体。
在本文公开的方法中的任一种的一些实施方案中，受体是异源性受体。在本文公开的方法中的任一种的一些实施方案中，异源性受体是嵌合抗原受体。
在本文公开的方法中的任一种的一些实施方案中，第一嵌合多肽包含GMP，并且其中第二嵌合多肽包含切割部分。
在本文公开的方法中的任一种的一些实施方案中，第二嵌合多肽包含GMP，并且其中第一嵌合多肽包含切割部分。
在本文公开的方法中的任一种的一些实施方案中，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽在接触步骤(b)时能够被激活以形成受体的信号传导复合物。
在本文公开的方法中的任一种的一些实施方案中，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽不结合配体。
在本文公开的方法中的任一种的一些实施方案中，受体是跨膜受体或细胞内受体。
在本文公开的方法中的任一种的一些实施方案中，受体包括T细胞受体(TCR)的至少一部分。在本文公开的方法中的任一种的一些实施方案中，TCR包括TCR的共同受体，包括CD3、CD4或CD8。在本文公开的方法中的任一种的一些实施方案中，受体的细胞内结构域包含至少一个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。在本文公开的方法中的任一种的一些实施方案中，第一衔接子部分或第二衔接子部分包括LCK、FYN、ZAP-70、LAT、SLP76、ITK、PLC-γ、VAV1、NCK、GADS、GRB2、PI3K、其片段，或它们的组合。
在本文公开的方法中的任一种的一些实施方案中，受体包括NKG2D的至少一部分。在本文公开的方法中的任一种的一些实施方案中，第一衔接子部分或第二衔接子部分包括DAP10、DAP12、PI3K、GRB2、VAV1、SYK、ZAP-70、其片段，或它们的组合。
在本文公开的方法中的任一种的一些实施方案中，受体包括选自以下的Toll样受体(TLR)的至少一部分：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13。在本文公开的方法中的任一种的一些实施方案中，第一衔接子部分或第二衔接子部分包括MyD88、Tube、Pelle、TIRAP、TRIF、TRAM、IRAK1、TRAK4、TRAF6、TAK1、TBK1、RIPK1、PI3K、IKK、其片段，或它们的组合。
在另一方面，本公开提供了一种用于调控细胞中靶多核苷酸的表达或活性的系统，包含：第一嵌合多肽和第二嵌合多肽，其中第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的一个包含基因调节多肽(GMP)，所述基因调节多肽包含与切割识别位点连接的致动部分，所述致动部分能够调控细胞中靶多核苷酸的表达或活性，并且其中第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的另一个包含能够切割GMP的切割识别位点的切割部分，其中细胞包含受体，所述受体具有对配体具有特异性的配体结合结构域，其中第一嵌合多肽和第二嵌合多肽在细胞与特异性结合内源性受体的配体结合结构域的配体接触时能够被激活，其中，在细胞与配体接触时，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽被激活，使得切割部分切割所述切割识别位点并从GMP释放致动部分，从而调控细胞中靶多核苷酸的表达或活性，其中受体是细胞的内源性受体。
在一些实施方案中，第一嵌合多肽包含第一衔接子部分，所述第一衔接子部分能够被激活以结合内源性受体的第一细胞内结构域。在本文公开的系统中的任一种的一些实施方案中，第二嵌合多肽包含第二衔接子部分，所述第二衔接子部分能够被激活以结合(i)内源性受体的第二细胞内结构域，(ii)第一衔接子部分，或(iii)内源性受体的下游信号传导部分。
在本文公开的系统中的任一种的一些实施方案中，第一嵌合多肽包含第一衔接子部分，所述第一衔接子部分能够被激活以结合内源性受体的第一下游信号传导部分。在本文公开的系统中的任一种的一些实施方案中，第二嵌合多肽包含第二衔接子部分，所述第二衔接子部分能够被激活以结合(i)第一衔接子部分，(ii)第一下游信号传导部分，或(iii)内源性受体的第二下游信号传导部分。
在另一方面，本公开提供了一种用于调控细胞中靶多核苷酸的表达或活性的系统，包含：第一嵌合多肽和第二嵌合多肽，其中第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的一个包含基因调节多肽(GMP)，所述基因调节多肽包含与切割识别位点连接的致动部分，所述致动部分能够调控细胞中靶多核苷酸的表达或活性，并且其中第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的另一个包含能够切割GMP的切割识别位点的切割部分，其中细胞包含受体，所述受体具有对配体具有特异性的配体结合结构域，其中第一嵌合多肽和第二嵌合多肽在细胞与特异性结合所述受体的配体结合结构域的配体接触时能够被激活，其中，在细胞与配体接触时，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽被激活，使得切割部分切割所述切割识别位点并从GMP释放致动部分，从而调控细胞中靶多核苷酸的表达或活性，并且其中第一嵌合多肽或第二嵌合多肽不能直接结合受体。
在一些实施方案中，第一嵌合多肽包含第一衔接子部分，所述第一衔接子部分能够被激活以结合受体的细胞内结构域，并且其中第二嵌合多肽不能直接结合所述受体。在本文公开的系统中的任一种的一些实施方案中，第二嵌合多肽包含第二衔接子部分，所述第二衔接子部分能够被激活以结合(i)第一衔接子部分或(ii)能够被激活以结合第一衔接子部分的受体的下游信号传导部分。
在本文公开的系统中的任一种的一些实施方案中，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽不能直接结合受体。在本文公开的系统中的任一种的一些实施方案中，第一嵌合多肽包含第一衔接子部分，所述第一衔接子部分能够被激活以结合受体的下游信号传导部分，并且其中第二嵌合多肽包含第二衔接子部分，所述第二衔接子部分能够被激活以结合(i)第一衔接子部分，(ii)下游信号传导部分，或(iii)受体的不同下游信号传导部分。
在本文公开的系统中的任一种的一些实施方案中，受体是内源性受体。
在本文公开的系统中的任一种的一些实施方案中，受体是异源性受体。在本文公开的系统中的任一种的一些实施方案中，异源性受体是嵌合抗原受体。
在本文公开的系统中的任一种的一些实施方案中，第一嵌合多肽包含GMP，并且其中第二嵌合多肽包含切割部分。
在本文公开的系统中的任一种的一些实施方案中，第二嵌合多肽包含GMP，并且其中第一嵌合多肽包含切割部分。
在本文公开的系统中的任一种的一些实施方案中，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽在接触时能够被激活以形成受体的信号传导复合物。
在本文公开的系统中的任一种的一些实施方案中，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽不结合配体。
在本文公开的系统中的任一种的一些实施方案中，受体是跨膜受体或细胞内受体。
在本文公开的系统中的任一种的一些实施方案中，受体包括T细胞受体(TCR)的至少一部分。在本文公开的系统中的任一种的一些实施方案中，TCR包括TCR的共同受体，包括CD3、CD4或CD8。在本文公开的系统中的任一种的一些实施方案中，受体的细胞内结构域包含至少一个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。在本文公开的系统中的任一种的一些实施方案中，第一衔接子部分或第二衔接子部分包括LCK、FYN、ZAP-70、LAT、SLP76、ITK、PLC-γ、VAV1、NCK、GADS、GRB2、PI3K、其片段，或它们的组合。
在本文公开的系统中的任一种的一些实施方案中，受体包括NKG2D的至少一部分。在本文公开的系统中的任一种的一些实施方案中，第一衔接子部分或第二衔接子部分包括DAP10、DAP12、PI3K、GRB2、VAV1、SYK、ZAP-70、其片段，或它们的组合。
在本文公开的系统中的任一种的一些实施方案中，受体包括选自以下的Toll样受体(TLR)的至少一部分：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13。在本文公开的系统中的任一种的一些实施方案中，第一衔接子部分或第二衔接子部分包括MyD88、Tube、Pelle、TIRAP、TRIF、TRAM、IRAK1、TRAK4、TRAF6、TAK1、TBK1、RIPK1、PI3K、IKK、其片段，或它们的组合。
本公开的另外的方面和优点根据以下详细描述将变得为本领域技术人员显而易知，其中仅示出并描述本公开的例示性实施方案。应当认识到，本公开能够具有其他以及不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种显然的方面做出修改，均不脱离本公开。因此，附图和说明书应被视为在本质上是说明性的而不是限制性的。
援引并入
在本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都以引用的方式并入本文中，其程度就如同每个单独的出版物、专利或专利申请都被具体和单独地指出以引用的方式并入一般。如果通过引用并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相矛盾，则本说明书旨在取代和/或优先于任何这样的矛盾材料。
附图说明
本发明的新颖特征在随附权利要求中具体阐述。通过参考对其中利用本发明的原理的例示性实施方案作出阐述的以下详细描述以及附图(在本文中也称“图”)获得对本发明的特征和优点的更好理解，在附图中：
图1A-1B示意性地示出由第一嵌合多肽和第二嵌合多肽形成受体的信号传导复合物或受体复合物；
图2A-2F示意性地示出由第一嵌合多肽和第二嵌合多肽形成的受体的信号传导复合物或受体复合物的各种构型；
图3A-3C示意性地示出募集第一嵌合多肽和第二嵌合多肽的内源性受体的不同实施方案；
图4示意性地示出编码第一嵌合多肽或第二嵌合多肽的不同表达盒；
图5A示出表达第一嵌合多肽和/或第二嵌合多肽的T细胞的比例，并且图5B示出在第一嵌合多肽和/或第二嵌合多肽的表达或活性后，在没有任何TCR激活的情况下表达PD1的T细胞的比例；
图6示出在第一嵌合多肽和/或第二嵌合多肽的表达或活性后，在TCR激活时表达PD1的T细胞的比例；并且
图7A和7B示出在第一嵌合多肽和/或第二嵌合多肽的表达或活性后，在TCR激活时表达PD1的T细胞的比例。
具体实施方式
在本公开中应认识到，条件性基因表达系统允许对一种或多种靶基因的条件性调控。在本公开中应认识到，条件性基因表达系统诸如药物诱导型基因表达系统允许响应于刺激诸如药物的存在而实现基因表达的激活和/或失活。然而，在本公开中应认识到，目前可获得的系统可能由于控制不精确、诱导(例如，基因表达的激活和/或失活)水平不足以及特异性的缺乏而受到限制。
鉴于上述情况，对于条件性地控制细胞中基因的表达或活性的替代性方法和系统存在相当大的需要。
虽然本文已经示出并描述本发明的各种实施方案，但是本领域技术人员显而易知此类实施方案仅作为举例来提供。许多改变、变化和替代可由本领域技术人员想到而不脱离本发明。应理解，可使用本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案。
除非另外指明，否则本文公开的一些方法的实践采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，所述技术在本领域的技术范围内。参见例如Sambrook和Green,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版(2012)；Current Protocols in Molecular Biology系列(F.M.Ausubel等人编)；MethodsIn Enzymology系列(Academic Press,Inc.),PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编(1995))，Harlow和Lane编(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,and Culture of Animal Cells:A Manual of BasicTechnique and Specialized Applications,第6版(R.I.Freshney编(2010))。
定义
如说明书和权利要求中所使用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指代物。例如，术语“跨膜受体”可以包括多种跨膜受体。
术语“约”或“大约”是指在本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，该误差范围将部分取决于该值是如何测得或确定的，即测量系统的限制。例如，按照本领域的实践，“约”可指在一个或多于一个标准偏差内。或者，“约”可指给定值的多达20％、多达10％、多达5％或多达1％的范围。或者，特别是对于生物系统或过程，该术语可指在值的一个数量级内，优选在值的5倍以内，更优选在2倍以内。在本申请和权利要求书中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则应假定术语“约”是指在该特定值的可接受误差范围内。
如本文所用，“细胞”可以指生物细胞。细胞可以是活生物体的基本的结构、功能和/或生物单位。细胞可以源自具有一个或多个细胞的任何生物体。一些非限制性实例包括：原核细胞、真核细胞、细菌细胞、古细菌细胞、单细胞真核生物的细胞、原生动物细胞、来自植物的细胞(例如来自种植作物、水果、蔬菜、谷物、大豆、玉米、玉蜀黍、小麦、种子、西红柿、水稻、木薯、甘蔗、南瓜、干草、马铃薯、棉花、大麻、烟草、开花植物、针叶树、裸子植物、蕨类植物、石松、角苔(hornworts)、苔类(liverworts)、藓类(mosses)的细胞)、藻细胞(例如，布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、海洋富油微拟球藻(Nannochloropsis gaditana)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、展枝马尾藻(Sargassum patens C.Agardh)等)、海藻(例如海带)、真菌细胞(例如，酵母细胞、来自蘑菇的细胞)、动物细胞、来自无脊椎动物(例如果蝇、刺胞动物、棘皮动物、线虫等)的细胞、来自脊椎动物(例如，鱼、两栖动物、爬行动物、鸟、哺乳动物)的细胞、来自哺乳动物(例如，猪、牛、山羊、绵羊、啮齿动物、大鼠、小鼠、非人灵长类动物、人等)的细胞等等。有时细胞并非源自天然生物体(例如，细胞可以是合成制备的，有时称为人工细胞)。
如本文可互换使用的术语“细胞死亡”或“细胞的死亡”可以是指导致细胞在体内或体外停止和/或减少正常代谢的过程或事件。细胞死亡可以由细胞本身诱导(自我诱导)或由另一个细胞(例如，相同类型或不同类型的另一个细胞)诱导。在一些情况下，细胞死亡可以包括但不限于程序性细胞死亡(即，凋亡)、在疾病状态下发生的细胞逐渐死亡(即，坏死)以及更直接的细胞死亡，诸如毒性(例如，细胞毒性，诸如急性细胞毒性)。在一些情况下，细胞凋亡可以是外在的(例如，经由通过细胞表面受体诸如死亡受体的信号传导)或内在的(例如，通过线粒体途径)。
如本文所用，术语“受体”是指对给定配体具有亲和力的分子(例如，多肽)。受体可以是天然存在的或合成的分子。给定配体(或配体)可以是天然存在的或合成的分子。受体可以以未改变的状态使用或作为与其他物类(例如，与一种或多种共同受体、一种或多种衔接子、脂筏等)的聚集体使用。受体的实例可包括但不限于细胞膜受体、可溶性受体、克隆受体、重组受体、复合碳水化合物和糖蛋白激素受体、药物受体、递质受体、内分泌物(autocoid)受体、细胞因子受体、抗体、抗体片段、工程化的抗体、抗体模拟物、分子识别单元、黏附分子、凝集素、整联蛋白、选择素、核酸和包含氨基酸、核苷酸、碳水化合物或非生物单体的合成异聚物，包括其类似物和衍生物，以及通过将这些分子中的任一个附接或结合至第二分子而形成的缀合物或复合物。
如本文所用，术语“细胞膜”是指将细胞的原生质与外部分隔开的边界膜、外膜、界面膜、原生质膜或细胞壁。因此，如此处所用的术语“细胞膜受体”或“跨膜受体”是指将细胞的原生质与外部分隔开的边界膜、外膜、界面膜、原生质膜或细胞壁中的受体。
如本文所用，术语“抗原”是指能够被选择性结合剂结合的分子或其片段(例如，配体)。例如，抗原可以是可以被选择性结合剂诸如受体结合的配体。又例如，抗原可以是可以被选择性结合剂诸如免疫蛋白(例如，抗体)结合的抗原性分子。抗原还可以指能够在动物中使用以产生能够与所述抗原结合的抗体的分子或其片段。
如本文所用，术语“抗体”是指具有免疫球蛋白样功能的蛋白质性结合分子。术语抗体包括抗体(例如，单克隆和多克隆抗体)以及其变体。抗体包括但不限于不同类别(即IgA、IgG、IgM、IgD和IgE)和亚类(诸如IgG1、IgG2等)的免疫球蛋白(Ig)。变体可以指保留相应抗体的结合特异性(例如，完全和/或部分)的功能衍生物或片段。抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、可变片段(Fv)、单链可变片段(scFv)、微型抗体(minibody)、双抗体(diabody)和单域抗体(“sdAb”或“纳米抗体”或“骆驼抗体(camelid)”)。术语抗体包括经优化、工程化或化学缀合的抗体和抗体的抗原结合片段。已经优化的抗体的实例包括亲和力成熟抗体。已经工程化的抗体的实例包括Fc优化的抗体(例如，在片段可结晶区域中优化的抗体)和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。
如本文所用，术语“Fc受体”或“FcR”通常是指可以与抗体的Fc区结合的受体或其任何变体。在某些实施方案中，FcR结合IgG抗体(γ受体，FcγR)并且包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，它们具有主要在其细胞质结构域中有所不同的相似氨基酸序列。术语“FcR”还包括新生儿受体FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿。
如本文所用，术语“核苷酸”通常是指碱基-糖-磷酸组合。核苷酸可包括合成核苷酸。核苷酸可包括合成核苷酸类似物。核苷酸可以是核酸序列的单体单元(例如，脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA))。术语核苷酸可包括核糖核苷三磷酸——三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸尿苷(UTP)、三磷酸胞苷(CTP)、三磷酸鸟苷(GTP)以及脱氧核糖核苷三磷酸例如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。这类衍生物可包括例如[αS]dATP、7-脱氮-dGTP和7-脱氮-dATP，以及对含有它们的核酸分子赋予核酸酶抗性的核苷酸衍生物。如本文所用，术语核苷酸可指双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)及其衍生物。双脱氧核苷三磷酸的说明性实例可包括但不限于ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP和ddTTP。核苷酸可以是未标记的或通过公知技术可检测地标记的。还可以用量子点进行标记。可检测性标记可包括例如放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记和酶标记。核苷酸的荧光标记可包括但不限于荧光素、5-羧基荧光素(FAM)、2′7′-二甲氧基-4′5-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、罗丹明、6-羧基罗丹明(R6G)、N,N,N′,N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、4-(4′-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)、Cascade Blue、Oregon Green、Texas Red、花菁和5-(2′-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)。荧光标记的核苷酸的具体实例可包括可从Perkin Elmer,Foster City,Calif获得的[R6G]dUTP、[TAMRA]dUTP、[R110]dCTP、[R6G]dCTP、[TAMRA]dCTP、[JOE]ddATP、[R6G]ddATP、[FAM]ddCTP、[R110]ddCTP、[TAMRA]ddGTP、[ROX]ddTTP、[dR6G]ddATP、[dR110]ddCTP、[dTAMRA]ddGTP和[dROX]ddTTP；可从Amersham,Arlington Heights,Ill.获得的FluoroLink DeoxyNucleotides、FluoroLink Cy3-dCTP、FluoroLink Cy5-dCTP、FluoroLink Fluor X-dCTP、FluoroLink Cy3-dUTP和FluoroLinkCy5-dUTP；可从Boehringer Mannheim,Indianapolis,Ind.获得的荧光素-15-dATP、荧光素-12-dUTP、四甲基-罗丹明-6-dUTP、IR770-9-dATP、荧光素-12-ddUTP、荧光素-12-UTP和荧光素-15-2'-dATP；以及可从Molecular Probes,Eugene,Oreg获得的染色体标记的核苷酸、BODIPY-FL-14-UTP、BODIPY-FL-4-UTP、BODIPY-TMR-14-UTP、BODIPY-TMR-14-dUTP、BODIPY-TR-14-UTP、BODIPY-TR-14-dUTP、Cascade Blue-7-UTP、Cascade Blue-7-dUTP、荧光素-12-UTP、荧光素-12-dUTP、Oregon Green 488-5-dUTP、罗丹明绿-5-UTP、罗丹明绿-5-dUTP、四甲基罗丹明-6-UTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、Texas Red-5-UTP、Texas Red-5-dUTP和Texas Red-12-dUTP。核苷酸还可以通过化学修饰进行标记或标示。化学修饰的单个核苷酸可以是生物素-dNTP。生物素化dNTP的一些非限制性实例可包括生物素-dATP(例如，bio-N6-ddATP、生物素-14-dATP)、生物素-dCTP(例如，生物素-11-dCTP、生物素-14-dCTP)和生物素-dUTP(例如，生物素-11-dUTP、生物素-16-dUTP、生物素-20-dUTP)。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换地用来指核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的任何长度的聚合形式，呈单链、双链或多链形式。多核苷酸对于细胞而言可以是外源的或内源的。多核苷酸可以存在于无细胞环境中。多核苷酸可以是基因或其片段。多核苷酸可以是DNA。多核苷酸可以是RNA。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。多核苷酸可包括一种或多种类似物(例如，改变的骨架、糖或核碱基)。在存在修饰的情况下，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。类似物的一些非限制性实例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、异种核酸、吗啉代核酸、锁核酸、二醇核酸、苏糖核酸、双脱氧核苷酸、蛹虫草菌素、7-脱氮-GTP、荧光团(例如，与糖连接的罗丹明或荧光素)、含巯基的核苷酸、生物素连接的核苷酸、荧光碱基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化核苷酸、肌苷、硫尿苷、假尿苷、二氢尿苷、辫苷和怀俄苷。多核苷酸的非限制性实例包括基因或基因片段的编码区或非编码区、由连锁分析定义的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支化多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、无细胞多核苷酸(包括无细胞DNA(cfDNA)和无细胞RNA(cfRNA))、核酸探针和引物。核苷酸的序列可被非核苷酸组分所间断。
如本文所用，术语“基因”是指核酸(例如，DNA诸如基因组DNA和cDNA)以及参与编码RNA转录物的其相应核苷酸序列。如本文关于基因组DNA所用的该术语包括间插非编码区以及调控区域，并且可以包括5'和3'末端。在一些用途中，该术语涵盖转录序列，包括5'和3'非翻译区(5'-UTR和3'-UTR)、外显子和内含子。在一些基因中，转录区域将包含编码多肽的“可读框”。在该术语的一些用途中，“基因”仅包含编码多肽所必需的编码序列(例如，“可读框”或“编码区”)。在一些情况下，基因不编码多肽，例如核糖体RNA基因(rRNA)和转移RNA(tRNA)基因。在一些情况下，术语“基因”不仅包括转录序列，而且还包括非转录区域，包括上游和下游调控区域、增强子和启动子。基因可以指“内源性基因”或在生物体的基因组中处于其天然位置的天然基因。基因可以指“外源性基因”或非天然基因。非天然基因可以指通常在宿主生物体中不存在但通过基因转移(例如，转基因)引入宿主生物体中的基因。非天然基因还可以指包含突变、插入和/或缺失的天然存在的核酸或多肽序列(例如，非天然序列)。
如本文所用，术语“靶多核苷酸”和“靶核酸”是指被本公开的致动部分靶向的核酸或多核苷酸。靶多核苷酸可以是DNA(例如，内源性或外源性的)。DNA可以指用以生成mRNA转录物的模板和/或调控由DNA模板转录mRNA的各种调控区域。靶多核苷酸可以是较大多核苷酸(例如染色体或染色体的区域)的部分。靶多核苷酸可以指染色体外序列(例如，附加体序列、微环序列、线粒体序列、叶绿体序列等)或染色体外序列的区域。靶多核苷酸可以是RNA。RNA可以是，例如，可以用作编码蛋白质的模板的mRNA。包含RNA的靶多核苷酸可以包括调控由mRNA模板翻译蛋白质的各种调控区域。靶多核苷酸可以编码基因产物(例如，编码RNA转录物的DNA或编码蛋白质产物的RNA)或包含调控基因产物的表达或活性的调控序列。通常，术语“靶序列”是指靶核酸单链上的核酸序列。靶序列可以是基因的部分、调控序列、基因组DNA、包括cfDNA和/或cfRNA的无细胞核酸、cDNA、融合基因以及RNA，包括mRNA、miRNA、rRNA等。靶多核苷酸当被致动部分靶向时，可以导致基因表达和/或活性的改变。靶多核苷酸当被致动部分靶向时，可以导致经编辑的核酸序列。靶核酸可以包含不可通过单个核苷酸置换而与核酸样品中的任何其他序列相关的核酸序列。靶核酸可以包含不可通过2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸置换而与核酸样品中的任何其他序列相关的核酸序列。在一些实施方案中，置换可不发生在靶核酸5'末端的5、10、15、20、25、30或35个核苷酸之内。在一些实施方案中，置换可不发生在靶核酸3'末端的5、10、15、20、25、30、35个核苷酸之内。
术语“转染”或“转染的”是指通过非病毒方法或基于病毒的方法将核酸引入细胞中。核酸分子可以是编码完整蛋白质或其功能部分的基因序列。参见例如Sambrook等人,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,18.1-18.88。
术语“表达”是指借此从DNA模板转录多核苷酸(例如转录成mRNA或其他RNA转录物)的一个或多个过程和/或借此将转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可统称为“基因产物”。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可包括真核细胞中mRNA的剪接。关于表达，“上调”通常是指相对于其在野生型状态下的表达水平，多核苷酸(例如，RNA，例如mRNA)和/或多肽序列的表达水平升高，而“下调”通常是指相对于其在野生型状态下的表达，多核苷酸(例如，RNA，例如mRNA)和/或多肽序列的表达水平降低。
如本文所用，术语“载体”可以指能够转移或转运有效负载核酸分子的核酸分子。有效负载核酸分子通常可以连接至(例如插入)载体核酸分子中。载体可包括在细胞中指导自主复制的序列，或者可包括足以允许整合到宿主细胞基因(例如，宿主细胞DNA)中的序列。载体的实例可包括但不限于质粒(例如，DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘粒、细菌人工染色体和病毒载体。
如本文所用，“质粒”通常是指非病毒表达载体，例如，编码基因和/或基因表达所必需的调控元件的核酸分子。如本文所用，“病毒载体”通常是指能够将另一核酸转运到细胞中的病毒衍生的核酸。当病毒载体存在于适当的环境中时，所述病毒载体能够指导由载体携带的一种或多种基因编码的一种或多种蛋白质的表达。病毒载体的实例包括但不限于γ-逆转录病毒载体、α-逆转录病毒载体、泡沫病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
本公开的任何实施方案的载体可以包含外源性、内源性或异源性控制序列，诸如启动子和/或增强子。“内源性”控制序列是与基因组中的给定基因天然连接的控制序列。“外源性”控制序列是通过遗传操纵(即，分子生物学技术)而与基因并列放置的控制序列，从而所述基因的转录由连接的增强子/启动子指导。“异源性”控制序列是来自与被遗传操纵的细胞不同的物种的外源性序列。“合成”控制序列可包含一种或多种内源性和/或外源性序列的元件，和/或在体外或在计算机上确定的为特定基因疗法提供最佳启动子和/或增强子活性的序列。
如本文所用，术语“互补”、“互补体”、“互补的”和“互补性”通常是指与给定序列完全互补且可杂交的序列。在一些情况下，与给定核酸杂交的序列被称为给定分子的“互补体”或“反向互补体”，前提是其在给定区域上的碱基序列能够与其结合配偶体的碱基序列互补地结合，从而例如形成A-T、A-U、G-C和G-U碱基对。通常，可与第二序列杂交的第一序列可与第二序列特异性地或选择性地杂交，从而在杂交反应期间，相对于与非靶序列杂交，优选与第二序列或第二序列组杂交(例如，在给定的条件集合(例如本领域常用的严格性条件)下在热力学上更稳定)。一般而言，可杂交的序列在其各自的全部或部分长度上享有一定程度的序列互补性，例如25％-100％的互补性，包括至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％的序列互补性。例如出于评估互补性百分比的目的，可以通过任何合适的比对算法来测量序列同一性，该算法包括但不限于Needleman-Wunsch算法(参见例如在www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html上可以获得的EMBOSSNeedle比对器，任选地使用默认设置)、BLAST算法(参见例如在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上可以获得的BLAST比对工具，任选地使用默认设置)或Smith-Waterman算法(参见例如在www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html上可以获得的EMBOSS Water比对器，任选地使用默认设置)。可以使用所选算法的任何合适的参数，包括默认参数，来评估最佳比对。
互补性可以是完全互补性或基本互补性/充分互补性。两个核酸之间的完全互补性可意指这两个核酸可以形成双链体，其中该双链体中的每个碱基都通过Watson-Crick配对而与互补碱基键合。基本互补性或充分互补性可意指一条链中的序列与相对链中的序列不完全互补和/或不完美互补，但是在杂交条件集合(例如，盐浓度和温度)下，两条链上的碱基之间发生足够的键合以形成稳定的杂交复合物。这样的条件可以如下预测：使用序列和标准数学计算来预测杂交链的Tm，或通过使用常规方法凭经验确定Tm。
如本文所用的，关于表达或活性的术语“调节”是指改变表达或活性的水平。调节可以在转录水平、转录后水平、翻译水平和/或翻译后水平下发生。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文可互换地用来指通过肽键连接的至少两个氨基酸残基的聚合物。该术语不表示聚合物的特定长度，也并非旨在暗示或区分该肽是使用重组技术、化学或酶合成产生的，还是天然存在的。该术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及包含至少一个修饰氨基酸的氨基酸聚合物。在一些情况下，该聚合物可被非氨基酸间断。该术语包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，以及具有或不具有二级和/或三级结构(例如，结构域)的蛋白质。该术语还包括已经例如通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、氧化以及其他任何操作例如与标记组分缀合而修饰的氨基酸聚合物。如本文所用，术语“氨基酸”通常是指天然和非天然氨基酸，包括但不限于修饰的氨基酸和氨基酸类似物。修饰的氨基酸可包括天然氨基酸和非天然氨基酸，它们已被化学修饰以包含非天然存在于氨基酸上的基团或化学部分。氨基酸类似物可指氨基酸衍生物。术语“氨基酸”包括D-氨基酸和L-氨基酸。
当在本文中关于多肽使用时，术语“变体”是指与野生型多肽相关但不相同的多肽，例如在氨基酸序列、结构(例如，二级和/或三级)、活性(例如，酶活性)和/或功能方面。变体包括与野生型多肽相比包含一个或多个氨基酸变异(例如，突变、插入和缺失)、截短、修饰或其组合的多肽。变体还包括野生型多肽的衍生物和野生型多肽的片段。
如本文所用，术语“同一性百分比(％)”是指在比对序列并在必要时引入空位以实现最大同一性百分比(即，可以在候选序列和参考序列之一或两者中引入空位以实现最佳比对，并且出于比较目的可以忽略非同源序列)之后，候选序列中与参考序列的氨基酸(或核酸)残基相同的氨基酸(或核酸)残基的百分比。为了确定同一性百分比的目的，可以通过本领域技术范围内的各种方式来实现比对，例如，使用可公开获得的计算机软件，例如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。可以通过使用BLAST将测试序列与比较序列进行比对，确定比对的测试序列中与比较序列相同位置处的氨基酸或核苷酸相同的氨基酸或核苷酸的数目，并且将相同氨基酸或核苷酸的数目除以比较序列中氨基酸或核苷酸的数目，从而计算两个序列的同一性百分比。
如本文所用，术语“基因调节多肽”或“GMP”是指至少包含能够调控基因的表达或活性和/或编辑核酸序列的致动部分的多肽。GMP可以包含不直接参与调节基因表达的另外的肽序列，例如靶向序列、多肽折叠结构域等。
如本文所用，术语“致动部分”是指可以调节基因的表达或活性以及/或者编辑核酸序列的部分，无论是外源的还是内源的。致动部分可以在转录水平、转录后水平、翻译水平和/或翻译后水平下调节基因的表达。致动部分可以在转录水平下调节基因表达，例如通过调节由DNA例如染色体DNA或cDNA产生mRNA。在一些实施方案中，致动部分募集与特定DNA序列结合的至少一种转录因子，从而控制遗传信息从DNA到mRNA转录的速率。致动部分本身可以与DNA结合并通过物理阻碍而调节转录，例如阻止蛋白质例如RNA聚合酶和其他相关蛋白质在DNA模板上装配。致动部分可以在翻译水平下调节基因表达，例如通过调节从mRNA模板产生蛋白质。在一些实施方案中，致动部分通过影响mRNA转录物的稳定性而在转录后水平下调节基因表达。在一些实施方案中，致动部分通过改变多肽修饰例如新合成的蛋白质的糖基化而在翻译后水平下调节基因表达。在一些实施方案中，致动部分通过编辑核酸序列(例如，基因组的区域)来调节基因的表达。在一些实施方案中，致动部分通过编辑mRNA模板来调节基因的表达。在一些情况下，编辑核酸序列可以改变基因表达的潜在模板。
致动部分可包含Cas蛋白或其修饰物。本文提及的Cas蛋白可以是一种类型的蛋白质或多肽。Cas蛋白可以指核酸酶。Cas蛋白可以指核糖核酸内切酶。Cas蛋白可以指Cas蛋白的任何修饰的(例如，缩短的、突变的、延长的)多肽序列或同源物。Cas蛋白可以是密码子优化的。Cas蛋白可以是Cas蛋白的密码子优化的同源物。Cas蛋白可以是酶促失活的、部分活性的、组成型活性的、完全活性的、诱导型活性的和/或更具活性的(例如比蛋白质或多肽的野生型同源物更具活性)。Cas蛋白可以是Cas9。Cas蛋白可以是Cpf1。Cas蛋白可以是C2c2。Cas蛋白可以是Cas13(例如，Cas13a、Cas13b、Cas13c或Cas13d)。cas蛋白可以是Cas12或其功能变体。Cas蛋白可以是Cas12e。Cas蛋白(例如，变异、突变、酶促失活和/或条件性酶促失活的定点多肽)可以结合至靶核酸。Cas蛋白(例如，变异、突变、酶促失活和/或条件性酶促失活的核糖核酸内切酶)可以结合至靶RNA或DNA。
如本文可互换使用的术语“失活核酸酶”或“死核酸酶(dead nuclease)”可以指核酸酶，其中核酸酶的功能完全或部分失活。在核酸酶是Cas蛋白的情况下，失活/死Cas核酸酶可称为“dCas”(例如，dCas9)。
如本文所用，术语“crRNA”通常可以指与野生型示例性crRNA(例如，来自酿脓链球菌(S.pyogenes)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)等的crRNA)具有至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％序列同一性和/或序列相似性的核酸。crRNA通常可以指与野生型示例性crRNA(例如，来自酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌等的crRNA)具有至多约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％序列同一性和/或序列相似性的核酸。crRNA可以指crRNA的修饰形式，其可以包含核苷酸变化，诸如缺失、插入或置换、变体、突变或嵌合体。crRNA可以是在至少6个邻接核苷酸的链段上与野生型示例性crRNA(例如，来自酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌等的crRNA)序列具有至少约60％序列同一性的核酸。例如，crRNA序列可以在至少6个邻接核苷酸的链段上与野生型示例性crRNA序列(例如，来自酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌等的crRNA)具有至少约60％同一性、至少约65％同一性、至少约70％同一性、至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性或100％同一性。
如本文所用，术语“tracrRNA”通常可以指与野生型示例性tracrRNA序列(例如，来自酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌等的tracrRNA)具有至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％序列同一性和/或序列相似性的核酸。tracrRNA可以指与野生型示例性tracrRNA序列(例如，来自酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌等的tracrRNA)具有至多约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％序列同一性和/或序列相似性的核酸。tracrRNA可以指tracrRNA的修饰形式，其可以包含核苷酸变化，诸如缺失、插入或置换、变体、突变或嵌合体。tracrRNA可以指可以在至少6个邻接核苷酸的链段上与野生型示例性tracrRNA(例如，来自酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌等的tracrRNA)序列具有至少约60％同一性的核酸。例如，tracrRNA序列可以在至少6个邻接核苷酸的链段上与野生型示例性tracrRNA(例如，来自酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌等的tracrRNA)序列具有至少约60％同一性、至少约65％同一性、至少约70％同一性、至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性或100％同一性。
如本文所用，“指导核酸”可以指可以与另一核酸杂交的核酸。指导核酸可以是RNA。指导核酸可以是DNA。指导核酸可以被编程为与核酸的序列位点特异性地结合。待靶向的核酸或靶核酸可以包含核苷酸。指导核酸可以包含核苷酸。靶核酸的部分可以与指导核酸的部分互补。双链靶多核苷酸中与指导核酸互补并杂交的链可以称为互补链。双链靶多核苷酸中与互补链互补并因此可能与指导核酸不互补的链可以称为非互补链。指导核酸可以包含一条多核苷酸链并且可以称为“单指导核酸”。指导核酸可以包含两条多核苷酸链并且可以称为“双指导核酸”。如果没有另外规定，则术语“指导核酸”可以是包含性的，指单指导核酸和双指导核酸两者。
指导核酸可包含可被称为“核酸靶向区段”或“核酸靶向序列”的区段。核酸靶向区段可包含可被称为“蛋白质结合区段”或“蛋白质结合序列”或“Cas蛋白结合区段”的子区段。
如本文所用，关于肽的术语“切割识别序列”或“切割识别位点”是指肽的位点，在所述位点处的化学键诸如肽键或二硫键可以被切割。可以通过各种方法实现切割。可以例如通过酶诸如蛋白酶来促进肽键的切割。
如本文所用，术语“靶向序列”是指编码靶向多肽的核苷酸序列和相应的氨基酸序列，所述靶向多肽介导蛋白质定位(或保留)至亚细胞位置，例如质膜或给定细胞器的膜、细胞核、胞质溶胶、线粒体、内质网(ER)、高尔基体、叶绿体、质外体、过氧化物酶体或其他细胞器。例如，靶向序列可以利用核定位信号(NLS)将蛋白质(例如，GMP)引导至细胞核；利用核输出信号(NES)引导至细胞核外部，例如引导至细胞质；利用线粒体靶向信号引导至线粒体；利用ER保留信号引导至内质网(ER)；利用过氧化物酶体靶向信号引导至过氧化物酶体；利用膜定位信号引导至质膜；或其组合。
如本文所用的，“融合”可指包含一个或多个非天然序列(例如，部分)的蛋白质和/或核酸。融合可包含一个或多个相同的非天然序列。融合可包含一个或多个不同的非天然序列。融合可以是嵌合体。融合可包含核酸亲和标签。融合可包含条形码。融合可包含肽亲和标签。融合可以提供位点定向多肽的亚细胞定位(例如，用于靶向至细胞核的核定位信号(NLS)、用于靶向至线粒体的线粒体定位信号、用于靶向至叶绿体的叶绿体定位信号、内质网(ER)保留信号等)。融合可以提供可用于追踪或纯化的非天然序列(例如，亲和标签)。融合可以是小分子，例如生物素或染料，例如Alexa fluor染料、花菁3染料、花菁5染料。
融合体可以指具有功能效应的任何蛋白质。例如，融合蛋白可以包含甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性或糖基化酶活性、乙酰转移酶活性、脱乙酰酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、去泛素化活性、腺苷酸化活性、去腺苷酸化活性、SUMO化活性、去SUMO化活性、核糖基化活性、去核糖基化活性、肉豆蔻酰化活性、重塑活性、蛋白酶活性、氧化还原酶活性、转移酶活性、水解酶活性、裂解酶活性、异构酶活性、合酶活性、合成酶活性，或去肉豆蔻酰化活性。效应蛋白可以修饰基因座。融合蛋白可以是Cas蛋白中的融合体。融合蛋白可以是Cas蛋白中的非天然序列。
因此，在一些实施方案中，致动部分可包含融合多肽。融合多肽可包含两个或更多个片段，所述片段各自赋予选自以下的至少一种活性：核酸酶活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性或糖基化酶活性、乙酰转移酶活性、脱乙酰酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、去泛素化活性、腺苷酸化活性、去腺苷酸化活性、SUMO化活性、去SUMO化活性、核糖基化活性、去核糖基化活性、肉豆蔻酰化活性、重塑活性、蛋白酶活性、氧化还原酶活性、转移酶活性、水解酶活性、裂解酶活性、异构酶活性、合酶活性、合成酶活性，以及去肉豆蔻酰化活性。
在一些情况下，致动部分可包含融合多肽，并且融合多肽可包含两个片段，所述片段各自赋予(i)核酸酶活性(或其修饰，例如Cas活性或降低的Cas活性)和(ii)水解酶活性(例如，胞苷脱氨酶活性)。在一些实例中，包含融合多肽的致动部分可以是核碱基编辑器。如本文可互换使用的术语“核碱基编辑器”或“碱基编辑器”可以指包含多肽的剂，所述多肽能够对核酸序列(例如，DNA或RNA)内的核碱基(例如，A、T、C、G或U)做出修饰。在一些情况下，碱基编辑器(例如，脱氨酶)可以能够使核酸内的碱基脱氨基。在一些情况下，碱基编辑器可以能够使DNA分子内的碱基脱氨基。在一些情况下，碱基编辑器可以能够使DNA中的胞嘧啶(C)脱氨基。在一些情况下，碱基编辑器可以能够将DNA分子内的碱基切除。在一些情况下，碱基编辑器可以能够将核酸(例如，DNA或RNA)分子内的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶切除。在一些情况下，碱基编辑器可以是包含与胞苷脱氨酶融合的可编程性核酸结合蛋白(例如，如本公开中提供的核酸酶，诸如Cas或dCas)的融合蛋白。在一些情况下，碱基编辑器可与尿嘧啶结合蛋白(UBP)诸如尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)融合。在一些情况下，碱基编辑器可与核酸聚合酶(NAP)结构域融合。在一些情况下，NAP结构域可以是跨损伤DNA聚合酶。在一些情况下，碱基编辑器可包含可编程性核酸结合蛋白、胞苷脱氨酶以及UBP(例如，UDG)。在一些情况下，碱基编辑器可包含可编程性核酸结合蛋白、胞苷脱氨酶以及核酸聚合酶(例如，跨损伤DNA聚合酶)。在一些情况下，碱基编辑器包含可编程性核酸结合蛋白、胞苷脱氨酶、UBP(例如，UDG)以及核酸聚合酶(例如，跨损伤DNA聚合酶)。
在一些实例中，碱基编辑器可在不需要双链断裂的情况下在许多细胞类型和包括哺乳动物在内的生物体中引入一种或多种转换突变(例如，C到T、G到A、A到G，或T到C)。
在一些情况下，致动部分可包含融合多肽，并且融合多肽可包含两个片段，所述片段各自赋予(i)核酸酶活性(或其修饰，例如Cas活性或降低的Cas活性)和(ii)聚合酶活性(例如，DNA或RNA聚合酶活性)。如此处所用，术语“聚合酶”可以指多肽，其能够催化以模板依赖性方式将一个或多个核苷酸或其类似物(例如，天然或合成核苷酸)添加至核酸分子。在一个实例中，由模板RNA分子编码的DNA插入序列可通过聚合酶(例如，逆转录酶)的作用而添加至靶DNA分子的3'末端。聚合酶的实例可包括但不限于(i)从水生栖热菌(Thermusaquaticus)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、沃氏热球菌(Pyrococcus woesei)、激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)、海滨热球菌(Thermococcus litoralis)和海栖热袍菌(Thermotoga maritima)分离的聚合酶，(ii)大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4 DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶，(iii)T7、T3、SP6 RNA聚合酶，以及(iv)AMV、M-MLV和HIV逆转录酶。
在一些实例中，致动部分可包含融合多肽，并且融合多肽可包含(i)Cas蛋白或其修饰物(例如，失活的Cas或Cas切口酶)，其偶联(例如，共价偶联)至(ii)逆转录酶。Cas蛋白可被构造成仅使靶核酸的一条链(例如，双链DNA分子的一条链)有切口。逆转录酶可被构造成通过从核酸模板(例如，RNA模板)拷贝来产生新的核酸序列(例如，新的DNA多核苷酸链)。这种致动部分可与工程化的gRNA(即，导引编辑gRNA(prime editing gRNA)，或pegRNA)一起发挥作用。pegRNA可包含多个区段。多个区段可包含(i)核酸靶向区段(例如，gRNA的间隔区域)，(ii)Cas蛋白结合区段(例如，作为两个单独的crRNA和tracrRNA分子，或作为单个支架分子)，(iii)编码期望的核酸编辑的逆转录酶模板区段，以及(iv)与靶核酸的切口链结合的结合区段。在一个实例中，pegRNA的逆转录酶模板区段可编码期望的DNA序列。可替代地，pegRNA的逆转录酶模板区段可编码与期望DNA序列具有互补性的互补DNA序列，从而当将互补DNA序列引入靶基因的第一链时，可随后将期望DNA序列添加至靶基因的第二和相反链(例如，通过一种或多种DNA修复机制)。
在一个实例中，(i)包含Cas蛋白和逆转录酶的致动部分和(ii)pegRNA的融合复合物可在不需要双链断裂的情况下在许多细胞类型和包括哺乳动物在内的生物体中引入一种或多种转换突变(例如，C到T、G到A、A到G，或T到C)。可替代地或附加地，这种融合复合物可在不需要双链断裂的情况下在许多细胞类型和包括哺乳动物在内的生物体中进行一种或多种转换突变(例如，C到A、C到G、G到C、G到T、A到C、A到T、T到A和T到G)，例如，对于纠正镰状细胞病所需的T-A到A-T突变。可替代地或附加地，这种融合复合物可将得失位(例如，插入和/或缺失)引入靶核酸或靶基因。融合复合物可向靶基因中引入至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或更多个核苷酸的添加。融合复合物可向靶基因中引入至多90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸的添加。融合复合物可向靶基因中引入至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或更多个核苷酸的缺失。融合复合物可向靶基因中引入至多90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸的缺失。融合复合物可以或可以不在基因中引入移码。
在一些情况下，工程化的gRNA(例如，pegRNA)可与部分(例如，多肽分子)偶联(例如，共价或非共价偶联)，所述部分赋予选自以下的至少一种活性：核酸酶活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性或糖基化酶活性、乙酰转移酶活性、脱乙酰酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、去泛素化活性、腺苷酸化活性、去腺苷酸化活性、SUMO化活性、去SUMO化活性、核糖基化活性、去核糖基化活性、肉豆蔻酰化活性、重塑活性、蛋白酶活性、氧化还原酶活性、转移酶活性、水解酶活性、裂解酶活性、异构酶活性、合酶活性、合成酶活性，以及去肉豆蔻酰化活性。在一个实例中，可通过核酸聚合酶识别和非共价结合pegRNA的片段(例如，环结构)的作用将pegRNA可操作地偶联至核酸聚合酶(例如，逆转录酶)。在这种情况下，核酸聚合酶可以或可以不与核酸酶(例如，Cas蛋白或dCas蛋白)共价偶联。
如本文所用，“非天然”可以指在天然核酸或蛋白质中未发现的核酸或多肽序列。非天然可以指亲和力标签。非天然可以指融合体。非天然可以指包含突变、插入和/或缺失的天然存在的核酸或多肽序列。非天然序列可表现出和/或编码也可以由与非天然序列融合的核酸和/或多肽序列表现出来的活性(例如，酶促活性、甲基转移酶活性、乙酰转移酶活性、激酶活性、泛素化活性等)。可通过基因工程将非天然核酸或多肽序列连接至天然存在的核酸或多肽序列(或其变体)，以产生编码嵌合核酸和/或多肽的嵌合核酸和/或多肽序列。
术语“对象”、“个体”和“患者”在本文可互换使用，是指脊椎动物，优选哺乳动物，例如人类。哺乳动物包括但不限于鼠、猿、人类、农场动物、竞技动物和宠物。还包括在体内获得或在体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。
如本文所用的，术语“治疗”和“处理”是指用于获得有益或期望的结果的方法，该结果包括但不限于治疗性益处和/或预防性益处。例如，治疗可以包括施用本文公开的系统或细胞群体。治疗性益处是指对一种或多种受治疗的疾病、病况或症状的任何治疗相关的改善或效应。对于预防性益处，可将组合物施用于有发生特定疾病、病况或症状的风险的对象，或报告了疾病的一种或多种生理症状的对象，即使可能尚未表现出该疾病、病况或症状。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指组合物的量，例如包含免疫细胞的组合物的量，例如包含本公开的系统的淋巴细胞(例如，T淋巴细胞和/或NK细胞)，该量在施用于有需要的对象时足以产生期望的活性。在本公开的上下文中，术语“治疗有效的”是指足以延迟通过本公开的方法治疗的病症的至少一种症状的表现、阻滞其进展、使其减轻或缓和的组合物的量。
术语“嵌合抗原受体”或替代地“CAR”在本文可用于指重组多肽构建体，其至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文也称为“细胞内或内在信号传导结构域”)，包括衍生自刺激性分子的功能性信号传导结构域。在一些情况下，刺激性分子可以是与T细胞受体复合物相关的ζ链。在一些情况下，细胞内信号传导结构域还包含衍生自至少一种共刺激性分子的一个或多个功能性信号传导结构域。在一些情况下，共刺激性分子可包括4-1BB(即，CD137)、CD27和/或CD28。在一个方面，CAR包含处于CAR融合蛋白的氨基端(N-ter)的任选前导序列。在一个方面，CAR还包含处于细胞外抗原识别结构域的N端的前导序列，其中在CAR的细胞加工和定位至细胞膜的过程中，任选地将前导序列从抗原识别结构域(例如，scFv)上切割下来。在一些情况下，CAR还可包含GMP，如本公开中所描述的。
如本文所用，CAR可以是第一代、第二代、第三代或第四代CAR系统、其功能变体，或它们的任何组合。第一代CAR(例如，CD19R或CD19CAR)包括对特定抗原具有特异性的抗原结合结构域(例如，抗体或其抗原结合片段，诸如scFv、Fab片段、VHH结构域或仅重链抗体的VH结构域)、衍生自适应性免疫受体的跨膜结构域(例如，来自CD28受体的跨膜结构域)以及衍生自适应性免疫受体的信号传导结构域(例如，衍生自CD3ζ受体或FcεRIγ的细胞内区域的一个或多个(例如，三个)ITAM结构域)。第二代CAR通过向CAR的细胞内信号传导结构域部分添加共刺激性结构域(例如，衍生自与T细胞受体诸如CD28、CD137/4-1BB和CD134/OX40协同作用的共刺激性受体)来修饰第一代CAR，它消除了与第一代CAR一起施用辅因子(例如，IL-2)的需要。第三代CAR将多个共刺激性结构域添加至CAR的细胞内信号传导结构域部分(例如，CD3ζ-CD28-OX40或CD3ζ-CD28-41BB)。第四代CAR通过向CAR的细胞内信号传导部分添加激活性细胞因子(例如，IL-12、IL-23或IL-27)来修饰第二代或第三代CAR(例如，处于一个或多个共刺激性结构域与CD3ζITAM结构域之间)或处于CAR诱导的启动子(例如，NFAT/IL-2最小启动子)的控制下。
术语“条件性地增强表达”是指多肽序列(例如，内源性多肽序列、嵌合多肽序列等)表达的发生受到一种或多种要求的限制而不是连续的。在增加、维持和/或减少多肽序列在细胞(例如，免疫细胞、干细胞等)中的表达时，可使细胞与刺激物(例如，配体或抗原)接触，以引发在细胞中表达多肽序列的条件性增强。在一些情况下，细胞可能在至少第一次接触刺激物之前没有开始表达多肽序列。在一些情况下，细胞可能已经开始表达多肽序列，并且在多肽序列的表达趋于平稳或降低后，可使细胞与刺激物接触，以引发在细胞中表达多肽序列的条件性增强。细胞可以是离体的(例如，在体外)或在体内的(例如，施用于对象)。在一些情况下，在细胞中表达多肽序列的条件性增强可以是暂时的或永久的。在一些情况下，可使细胞与刺激物接触至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。在一些情况下，可使细胞与刺激物接触至多约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1次。
在一些情况下，多肽序列(例如，Cas、dCas，或对细胞而言为内源性或外源性的不同蛋白质)的持续表达可能对宿主细胞具有脱靶效应，例如细胞毒性。在这种情况下，条件性地促进和/或增强多肽序列的表达(例如，通过使细胞与刺激物接触)可以是有益的，这至少是因为可控制(例如，减少或防止)细胞毒性。可替代地或附加地，条件性地促进和/或增强多肽序列的表达可以是有益的，因为可以控制(例如，减少或防止)宿主细胞合成多肽序列的持续代谢负担。不受理论的束缚，控制宿主细胞的代谢负担可以改善宿主细胞的活力、增殖和/或功能。
术语“可操作地连接”和“处于可操作的控制下”在本文中可互换使用，是指两个序列(例如，两个核苷酸序列、两个多肽序列、一个核苷酸序列和一个多肽序列)物理连接或功能性地连接，以便序列中的至少一个可以作用于另一个序列。在一些情况下，如果另外的核苷酸序列(例如，目标基因、转基因等)的表达(例如，转录和翻译)可以由基因调控序列(例如，启动子)控制，则所述基因调控序列和所述另外的核苷酸序列可操作地连接。因此，基因调控序列和待表达的另外的核苷酸序列可彼此物理连接，例如，通过将基因调控序列插入在待表达的另外的核苷酸序列的5'末端处或附近。可替代地，基因调控序列和待表达的另外的核苷酸序列可仅仅在物理上接近，以便基因调控序列功能性地连接至待表达的另外的核苷酸序列。在一些情况下，可操作地连接的两个序列可分隔开至少5、10、20、40、60、80、100、300、500、1500bp或更多。在一些情况下，可操作地连接的两个序列可分隔开至多1500、500、300、100、80、60、40、20、10、5bp或更少。
术语“启动子”在本文中可用于指调控性DNA区域，其控制基因的转录或表达并且可以定位成与RNA转录起始处的核苷酸或核苷酸区域相邻或重叠。启动子可包含特定DNA序列，其结合蛋白质因子，通常称为转录因子，其促进RNA聚合酶与导致基因转录的DNA的结合。‘基本启动子’，也称为‘核心启动子’，通常可指包含促进可操作地连接的多核苷酸的转录表达的所有基本必需元件的启动子。真核基本启动子通常但不一定包含TATA盒和/或CAAT盒。
术语“2A肽”可指一类病毒寡肽(例如，18-22个氨基酸(aa)长的病毒寡肽)，其在细胞(例如，真核细胞)中的翻译期间介导多肽的“切割”。名称“2A”是指病毒基因组的特定区域，并且不同的病毒2A通常以它们所来源的病毒命名。最早发现的2A是F2A(口蹄疫病毒)，之后还鉴定了E2A(马鼻炎A病毒)、P2A(猪捷申病毒-1 2A)和T2A(明脉扁刺蛾病毒(thoseaasigna virus)2A)。2A介导的“自我切割”的机制被认为是核糖体在2A序列的C端跳过了甘氨酰-脯氨酰肽键的形成。
嵌合多肽
在一个方面，本公开提供了一种调控细胞中靶多核苷酸的表达的方法。所述方法可包括(a)使系统在细胞中表达，其中细胞包含受体(例如，内源性受体)，所述受体具有对配体(例如，刺激物)具有特异性的配体结合结构域(即，刺激物结合结构域)；以及(b)使细胞与特异性结合所述配体结合结构域的配体接触。在细胞中表达的系统可包含在接触步骤(b)时能够被激活的第一嵌合多肽和第二嵌合多肽。受体可以是内源性受体或外源性受体。配体可以是来自另一细胞的小分子、多核苷酸、多肽、蛋白质、抗体、配体和/或受体等。
第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的一个可以包含基因调节多肽(GMP)，所述基因调节多肽包含连接至切割识别位点的致动部分。致动部分可以能够调控细胞中靶多核苷酸的表达。第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的另一个可包含能够切割GMP的切割识别位点的切割部分。
在细胞与特异性结合所述受体(例如内源性受体)的配体结合结构域的配体接触时，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽可被激活，使得切割部分切割所述切割识别位点并从GMP释放致动部分，从而调控细胞中靶多核苷酸的表达。在一些情况下，切割部分可切割所述切割识别位点并从GMP释放致动部分，致动部分的量足以调控细胞中靶多核苷酸的表达。
在一些情况下，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽在接触步骤(b)时可以能够被激活以形成受体的信号传导复合物。在一些情况下，形成受体的信号传导复合物可包括在(1)第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的至少一个与(2)之间进行复合(例如，直接或间接复合)，所述(2)为：(i)受体，(ii)受体的共同受体，和/或(iii)受体和/或共同受体的信号传导部分(例如，下游信号传导部分)。受体的共同受体可结合或可不结合受体。信号传导部分可结合或可不结合受体。受体和/或其共同受体的下游信号传导部分可以是受体和/或其共同受体的衔接子蛋白、激酶、水解酶(例如，脂肪酶、磷酸酶、糖苷酶、肽酶、核苷酶等)、核苷酸交换因子、其衔接子蛋白、其片段，或它们的组合。在一些情况下，复合可以是共价的(例如，二硫键)或非共价的(例如，氢键)。
在一些情况下，当形成受体的信号传导复合物时，第一嵌合多肽与第二嵌合多肽之间的相互作用可以是直接的和/或间接的。在第一嵌合多肽与第二嵌合多肽之间的直接相互作用中，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的至少一个可被构造成直接结合(例如，通过共价和/或非共价相互作用)第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的另一个。直接相互作用可足以诱导或促进切割部分的作用，以切割和释放(或识别、切割和释放)致动部分。在一个实例中，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽序列中的一个可包含结合序列(例如，衔接子多肽序列)，其被构造成与第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的另一个的至少一部分(例如，细胞内部分、细胞信号传导结构域等)结合。在第一嵌合多肽与第二嵌合多肽之间的间接相互作用中，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽可被构造成相对于细胞与刺激物没有接触的情况，在细胞与刺激物接触时彼此更接近(例如，一个被朝向另一个募集，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽变得彼此接近等)且彼此之间没有任何直接结合。间接相互作用可足以诱导或促进切割部分的作用，以切割和释放(或识别、切割和释放)致动部分。在一些实例中，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽可被构造成结合以下各项的不同部分：(i)受体，(ii)受体的共同受体，和/或(iii)受体和/或共同受体的下游信号传导部分。在一个实例中，受体可以是T细胞受体(TCR)，并且第一嵌合多肽和第二嵌合多肽可结合TCR的不同部分(例如，不同的细胞内部分)。在另一个实例中，受体可以是TCR，并且第一嵌合多肽和第二嵌合多肽可与T细胞激活接头(LAT)的不同部分结合，在TCR被刺激物激活时，所述T细胞激活接头被募集作为TCR的信号传导级联的部分。在不同的实例中，受体可以是TCR，并且第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的一个可结合TCR的部分(例如，细胞内部分)，而第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的另一个结合LAT的部分。
在一些情况下，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的至少一个可不与配体结合。在一个实例中，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽两者都可不与配体结合。可替代地或附加地，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的至少一个可与配体结合。在一个实例中，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽两者都可与配体结合。
第一嵌合多肽可以是跨膜蛋白或细胞内蛋白。第二嵌合多肽可以是跨膜蛋白或细胞内蛋白。在一些情况下，受体(例如，内源性受体)可以是跨膜受体或细胞内受体。
在一些情况下，第一嵌合多肽可包含第一衔接子部分，所述第一衔接子部分能够被激活以结合(1)受体的第一细胞内结构域，或(2)受体的第一下游信号传导部分。在一些情况下，第二嵌合多肽可包含第二衔接子部分，所述第二衔接子部分能够被激活以结合(1)受体的第二细胞内结构域，(2)受体的第二下游信号传导部分，或(3)处于激活状态的第一衔接子部分。
在一些情况下，第一衔接子部分可以能够被激活以结合受体的第一细胞内结构域，其中第二衔接子部分可以能够被激活以结合受体的第二细胞内结构域，并且内源性受体的第一和第二细胞内结构域可以是相同的或不同的。在一些情况下，第一衔接子部分可以能够被激活以结合受体的第一细胞内结构域，并且第二衔接子部分可以能够被激活以结合受体的第二下游信号传导部分。在一些情况下，第一衔接子部分可以能够被激活以结合受体的第一细胞内结构域，并且第二衔接子部分可以能够被激活以结合处于激活状态的第一衔接子部分。在一些情况下，第一衔接子部分可以能够被激活以结合受体的第一下游信号传导部分，第二衔接子部分可以能够被激活以结合受体的第二下游信号传导部分，并且受体的第一和第二下游信号传导部分可以是相同的或不同的。在一些情况下，第一衔接子部分可以能够被激活以结合受体的第一下游信号传导部分，并且第二衔接子部分可以能够被激活以结合处于激活状态的第一衔接子部分。
在一些情况下，第一衔接子部分和/或第二衔接子部分可包含受体(例如，内源性受体)的衔接子蛋白、激酶、水解酶、核苷酸交换因子、其衔接子蛋白、其片段，或它们的组合。水解酶可选自脂肪酶、磷酸酶、糖苷酶、肽酶和核苷酶。
在一些情况下，第一嵌合多肽可包含GMP，并且第二嵌合多肽可包含切割部分。在一些情况下，第二嵌合多肽可包含GMP，并且第一嵌合多肽可包含切割部分。
在一些情况下，受体可以是T细胞受体(TCR)，包括TCRA、TCRB、TCRG和/或TCRD。在一个实例中，细胞可包含TCRA和TCRB，它们可形成αβTCR复合物。包含αβTCR复合物的细胞可称为αβ细胞(例如，αβT细胞)。在另一个实例中，细胞可包含TCRG和TCRD，它们可形成γδTCR复合物。包含γδTCR复合物的细胞可称为γδ细胞(例如，γδT细胞)。TCR可包括TCR的共同受体，诸如CD3、CD4和/或CD8。CD3可包括CD3E、CD3D、CD3G和/或CD3Z。在一些情况下，CD3的细胞内结构域可包含至少一个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。在一些情况下，第一衔接子部分和/或第二衔接子部分可包括LCK、FYN、ZAP-70、LAT、SLP76、ITK、PLC-γ、VAV1、NCK、GADS、GRB2、PI3K、其片段，或它们的组合(参见Schwartzberg等人Nature ReviewsImmunology.2005年5月；5(4):284-95或Abraham等人Nature Reviews Immunology.2004年5月；4(4):301-8)。
如本文所公开的衔接子部分可以是内源性受体的衔接子蛋白、激酶、磷酸酶、核苷酸交换因子、其衔接子蛋白、其片段，或它们的组合。
在一些情况下，受体可包括C型凝集素样受体(诸如CD94家族受体)的至少一部分。CD95家族受体的实例可以包括NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2D、NKG2E、NKG2F和NKG2G。在这种情况下，第一衔接子部分和/或第二衔接子部分可包括C型凝集素样受体的信号传导衔接子(例如，跨膜信号传导衔接子)的至少一部分。在一些实例中，受体可以是NKG2D，包括NKG2D-L和NKG2D-S，并且与NKG2DL结合结构域结合并激活NKG2D信号传导的相应配体(即NKG2DL)可包括但不限于MICA、MICB和RAET1/ULBP家族(例如，RAET1 E/ULBP4、RAET1G/ULBP5、RAET1H/ULBP2、RAET1/ULBP1、RAET1 L/ULBP6和RAET1 N/ULBP3)。在一些情况下，受体可以是NKG2D，并且第一衔接子部分和/或第二衔接子部分可包括DAP10、DAP12、PI3K、GRB2、VAV1、SYK、ZAP-70、其片段，或它们的组合(参见Zafirova等人Cellular and Molecular LifeSciences.2011年8月；68(21):3519-29或Sheppard等人Frontiers in Immunology.2018年8月；9(1808):1-19)。
在一些情况下，受体可以是选自以下的Toll样受体(TLR)：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13。TLR的配体的实例可包括但不限于脂多糖、脂蛋白、三酰化脂肽、肽聚糖、鞭毛、单链RNA、双链RNA、CpG DNA、肌动蛋白抑制蛋白(profilin)和核糖体RNA。TLR的至少一种配体可源自细菌或病毒。在一些情况下，第一衔接子部分和/或第二衔接子部分可包括MyD88、Tube、Pelle、TIRAP、TRIF、TRAM、IRAK1、TRAK4、TRAF6、TAK1、TBK1、RIPK1、PI3K、IKK、其片段，或它们的组合(参见O’Neill等人Nature Reviews Immunology.2013年6月；13(6):453-60或Wang等人Frontiers inImmunology.2014年7月；5(367):1-11)。
在另一方面，本公开提供了一种用于调控细胞中靶多核苷酸的表达的系统。所述系统可包含第一嵌合多肽和第二嵌合多肽。第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的一个可包含基因调节多肽(GMP)，所述基因调节多肽包含连接至切割识别位点的致动部分。致动部分可以能够调控细胞中靶多核苷酸的表达。第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的另一个可包含能够切割GMP的切割识别位点的切割部分。细胞可包含受体，所述受体具有对配体具有特异性的配体结合结构域。第一嵌合多肽和第二嵌合多肽在细胞与特异性结合内源性受体的配体结合结构域的配体接触时可以能够被激活。在细胞与配体接触时，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽可被激活，使得切割部分切割所述切割识别位点并从GMP释放致动部分，从而调控细胞中靶多核苷酸的表达。在一些情况下，切割部分可切割所述切割识别位点并从GMP释放致动部分，致动部分的量足以调控细胞中靶多核苷酸的表达。受体可以是内源性受体或外源性受体。
在一些情况下，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽在所述接触时可以能够被激活以形成受体的信号传导复合物。在一些情况下，形成受体的信号传导复合物可包括在(1)第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的至少一个与(2)之间进行复合(例如，直接或间接复合)，所述(2)为：(i)受体，(ii)受体的共同受体，和/或(iii)受体和/或共同受体的信号传导部分(例如，下游信号传导部分)。在一些情况下，复合可以是共价的(例如，二硫键)或非共价的(例如，氢键)。
在一些情况下，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽可结合配体。在一些情况下，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽可不结合配体。
在一些情况下，第一嵌合多肽可以是跨膜蛋白或细胞内蛋白。在一些情况下，第二嵌合多肽可以是跨膜蛋白或细胞内蛋白。受体可以是跨膜受体或细胞内受体。
在一些情况下，第一嵌合多肽可包含第一衔接子部分，所述第一衔接子部分能够被激活以结合(1)内源性受体的第一细胞内结构域，或(2)受体的第一下游信号传导部分。在一些情况下，第二嵌合多肽可包含第二衔接子部分，所述第二衔接子部分能够被激活以结合(1)受体的第二细胞内结构域，(2)受体的第二下游信号传导部分，或(3)处于激活状态的第一衔接子部分。在一些情况下，第一衔接子部分可以能够被激活以结合受体的第一细胞内结构域，第二衔接子部分可以能够被激活以结合受体的第二细胞内结构域，并且受体的第一和第二细胞内结构域可以是相同的或不同的。在一些情况下，第一衔接子部分可以能够被激活以结合受体的第一细胞内结构域，并且第二衔接子部分可以能够被激活以结合受体的第二下游信号传导部分。在一些情况下，第一衔接子部分可以能够被激活以结合受体的第一细胞内结构域，并且第二衔接子部分可以能够被激活以结合处于激活状态的第一衔接子部分。在一些情况下，第一衔接子部分可以能够被激活以结合受体的第一下游信号传导部分，第二衔接子部分可以能够被激活以结合受体的第二下游信号传导部分，并且受体的第一和第二下游信号传导部分可以是相同的或不同的。在一些情况下，第一衔接子部分可以能够被激活以结合受体的第一下游信号传导部分，并且其中第二衔接子部分可以能够被激活以结合处于激活状态的第一衔接子部分。
在一些情况下，第一衔接子部分和/或第二衔接子部分可包含受体(例如，内源性受体)的衔接子蛋白、激酶、水解酶、磷酸酶、核苷酸交换因子、其衔接子蛋白、其片段，或它们的组合。水解酶可选自脂肪酶、磷酸酶、糖苷酶、肽酶和核苷酶。
在一些情况下，第一嵌合多肽可包含GMP，并且其中第二嵌合多肽可包含切割部分。在一些情况下，第二嵌合多肽可包含GMP，并且第一嵌合多肽包含切割部分。
在一些情况下，内源性受体可以是T细胞受体(TCR)，包括TCRA、TCRB、TCRG和/或TCRD。TCR可包括TCR的共同受体，包括CD3、CD4和/或CD8。CD3可包括CD3E、CD3D、CD3G和/或CD3Z。CD3的细胞内结构域可包含至少一个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。第一衔接子部分和/或第二衔接子部分可包括LCK、FYN、ZAP-70、LAT、SLP76、ITK、PLC-γ、VAV1、NCK、GADS、GRB2、PI3K、其片段，或它们的组合。
在一些情况下，内源性受体可以是NKG2D，包括NKG2D-L和NKG2D-S。第一衔接子部分和/或第二衔接子部分可包括DAP10、DAP12、PI3K、GRB2、VAV1、SYK、ZAP-70、其片段，或它们的组合。
在一些情况下，内源性受体可以是选自以下的Toll样受体(TLR)：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13。第一衔接子部分和/或第二衔接子部分可包括MyD88、Tube、Pelle、TIRAP、TRIF、TRAM、IRAK1、TRAK4、TRAF6、TAK1、TBK1、RIPK1、PI3K、IKK、其片段，或它们的组合。
在另一方面，本公开提供了一种调控细胞中靶多核苷酸的表达的方法。所述方法可包括(a)使系统在细胞中表达，其中细胞包含受体，所述受体具有对配体具有特异性的配体结合结构域；以及(b)使细胞与特异性结合所述配体结合结构域的配体接触。在细胞中表达的系统可包含在接触步骤(b)时能够被激活的第一嵌合多肽和第二嵌合多肽。第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的一个可包含基因调节多肽(GMP)，所述基因调节多肽包含连接至切割识别位点的致动部分，所述致动部分能够调控细胞中靶多核苷酸的表达。第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的另一个可包含能够切割GMP的切割识别位点的切割部分。第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的至少一个可不与受体直接接触。在细胞与特异性结合受体的配体结合结构域的配体接触时，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽可被激活，使得切割部分切割所述切割识别位点并从GMP释放致动部分，从而调控细胞中靶多核苷酸的表达。在一些情况下，切割部分可切割所述切割识别位点并从GMP释放致动部分，致动部分的量足以调控细胞中靶多核苷酸的表达。
受体可以是内源性受体或外源性受体。外源性受体可包括嵌合多肽。嵌合多肽可包括嵌合抗原受体。受体可以是异源性受体。
第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的至少一个可能缺乏与受体直接接触(例如，结合)的能力。在细胞与配体接触之前、期间和/或之后，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的至少一个可不与受体直接接触。在细胞与配体接触之前、期间和之后，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的至少一个可不与受体直接接触。在一些情况下，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中仅一个不与受体直接接触。
在一些情况下，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽在接触步骤(b)时能够被激活以形成受体的信号传导复合物。形成受体的信号传导复合物可包括在(1)第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的至少一个与(2)之间进行复合(例如，直接或间接复合)，所述(2)为：(i)受体，(ii)受体的共同受体，和/或(iii)受体和/或共同受体的信号传导部分(例如，下游信号传导部分)。在一些情况下，复合可以是共价的(例如，二硫键)或非共价的(例如，氢键)。
在一些情况下，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽结合配体。在一些情况下，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽不结合配体。
第一嵌合多肽可以是跨膜蛋白或细胞内蛋白。第二嵌合多肽可以是跨膜蛋白或细胞内蛋白。受体可以是跨膜受体或细胞内受体。
在一些情况下，第一嵌合多肽包含第一衔接子部分，所述第一衔接子部分能够被激活以结合(1)受体的细胞内结构域，或(2)受体的第一下游信号传导部分。在一些情况下，第二嵌合多肽包含第二衔接子部分，所述第二衔接子部分能够被激活以结合(1)受体的第二下游信号传导部分，或(2)处于激活状态的第一衔接子部分。
在一些情况下，第一衔接子部分能够被激活以结合受体的细胞内结构域，并且第二衔接子部分能够被激活以结合受体的第二下游信号传导部分。在一些情况下，第一衔接子部分能够被激活以结合受体的第一细胞内结构域，并且第二衔接子部分能够被激活以结合处于激活状态的第一衔接子部分。在一些情况下，第一衔接子部分能够被激活以结合受体的第一下游信号传导部分，第二衔接子部分能够被激活以结合受体的第二下游信号传导部分，并且受体的第一和第二下游信号传导部分是相同的或不同的。在一些情况下，第一衔接子部分能够被激活以结合受体的第一下游信号传导部分，并且第二衔接子部分能够被激活以结合处于激活状态的第一衔接子部分。
在一些情况下，受体是T细胞受体(TCR)，包括TCRA、TCRB、TCRG和/或TCRD。TCR可包括TCR的共同受体，包括CD3、CD4和/或CD8。CD3可包括CD3E、CD3D、CD3G和/或CD3Z。CD3的细胞内结构域可包含至少一个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。第一衔接子部分和/或第二衔接子部分可包括LCK、FYN、ZAP-70、LAT、SLP76、ITK、PLC-γ、VAV1、NCK、GADS、GRB2、PI3K、其片段，或它们的组合。
在一些情况下，受体是NKG2D，包括NKG2D-L和NKG2D-S。受体可以是NKG2D，并且第一衔接子部分和/或第二衔接子部分可包括DAP10、DAP12、PI3K、GRB2、VAV1、SYK、ZAP-70、其片段，或它们的组合。
在一些情况下，受体是选自以下的Toll样受体(TLR)：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13。第一衔接子部分和/或第二衔接子部分可包括MyD88、Tube、Pelle、TIRAP、TRIF、TRAM、IRAK1、TRAK4、TRAF6、TAK1、TBK1、RIPK1、PI3K、IKK、其片段，或它们的组合。
在另一方面，本公开提供了一种用于调控细胞中靶多核苷酸的表达的系统。所述系统可包含第一嵌合多肽和第二嵌合多肽。第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的一个可包含基因调节多肽(GMP)，所述基因调节多肽包含连接至切割识别位点的致动部分。致动部分可以能够调控细胞中靶多核苷酸的表达。第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的另一个可包含能够切割GMP的切割识别位点的切割部分。细胞可包含受体，所述受体具有对配体具有特异性的配体结合结构域。第一嵌合多肽和第二嵌合多肽在细胞与特异性结合所述受体的配体结合结构域的配体接触时可以能够被激活。第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的至少一个可不与受体直接接触。在细胞与配体接触时，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽可被激活，使得切割部分切割所述切割识别位点并从GMP释放致动部分，从而调控细胞中靶多核苷酸的表达。在一些情况下，切割部分可切割所述切割识别位点并从GMP释放致动部分，致动部分的量足以调控细胞中靶多核苷酸的表达。
受体可包括内源性受体或外源性受体。外源性受体可包括嵌合多肽。嵌合多肽可包括嵌合抗原受体。受体可以是异源性受体。
第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的至少一个可能缺乏与受体直接接触(例如，结合)的能力。在细胞与配体接触之前、期间和/或之后，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的至少一个可不与受体直接接触。在细胞与配体接触之前、期间和之后，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的至少一个可不与受体直接接触。在一些情况下，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中仅一个不与受体直接接触。
在一些情况下，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽在所述接触时能够被激活以形成受体的信号传导复合物。形成受体的信号传导复合物可包括在(1)第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的至少一个与(2)之间进行复合(例如，直接或间接复合)，所述(2)为：(i)受体，(ii)受体的共同受体，和/或(iii)受体和/或共同受体的信号传导部分(例如，下游信号传导部分)。在一些情况下，复合可以是共价的(例如，二硫键)或非共价的(例如，氢键)。
在一些情况下，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽可结合配体。在一些情况下，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽不结合配体。
在一些情况下，第一嵌合多肽是跨膜蛋白或细胞内蛋白。在一些情况下，第二嵌合多肽是跨膜蛋白或细胞内蛋白。受体可以是跨膜受体或细胞内受体。
在一些情况下，第一嵌合多肽包含第一衔接子部分，所述第一衔接子部分能够被激活以结合(1)受体的细胞内结构域，或(2)受体的第一下游信号传导部分。在一些情况下，第二嵌合多肽包含第二衔接子部分，所述第二衔接子部分能够被激活以结合(1)受体的第二下游信号传导部分，或(2)处于激活状态的第一衔接子部分。
在一些情况下，第一衔接子部分能够被激活以结合受体的细胞内结构域，并且第二衔接子部分能够被激活以结合受体的第二下游信号传导部分。在一些情况下，第一衔接子部分能够被激活以结合受体的第一细胞内结构域，并且第二衔接子部分能够被激活以结合处于激活状态的第一衔接子部分。在一些情况下，第一衔接子部分能够被激活以结合受体的第一下游信号传导部分，第二衔接子部分能够被激活以结合受体的第二下游信号传导部分，并且受体的第一和第二下游信号传导部分是相同的或不同的。在一些情况下，第一衔接子部分能够被激活以结合受体的第一下游信号传导部分，并且第二衔接子部分能够被激活以结合处于激活状态的第一衔接子部分。
在一些情况下，受体是T细胞受体(TCR)，包括TCRA、TCRB、TCRG和/或TCRD。TCR可包括TCR的共同受体，包括CD3、CD4和/或CD8。CD3可包括CD3E、CD3D、CD3G和/或CD3Z。CD3的细胞内结构域可包含至少一个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。第一衔接子部分和/或第二衔接子部分可包括LCK、FYN、ZAP-70、LAT、SLP76、ITK、PLC-γ、VAV1、NCK、GADS、GRB2、PI3K、其片段，或它们的组合。
在一些情况下，受体是NKG2D，包括NKG2D-L和NKG2D-S。受体可以是NKG2D，并且第一衔接子部分和/或第二衔接子部分包括DAP10、DAP12、PI3K、GRB2、VAV1、SYK、ZAP-70、其片段，或它们的组合。
在一些情况下，受体是选自以下的Toll样受体(TLR)：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13。第一衔接子部分和/或第二衔接子部分可包括MyD88、Tube、Pelle、TIRAP、TRIF、TRAM、IRAK1、TRAK4、TRAF6、TAK1、TBK1、RIPK1、PI3K、IKK、其片段，或它们的组合。
在另一方面，本公开提供了一种调控细胞中靶多核苷酸的表达的方法。所述方法可包括(a)使系统在细胞中表达，其中细胞包含受体，所述受体具有对配体具有特异性的配体结合结构域；以及(b)使细胞与特异性结合所述配体结合结构域的配体接触。在细胞中表达的系统可包含在接触步骤(b)时能够被激活的第一嵌合多肽和第二嵌合多肽。第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的一个可包含基因调节多肽(GMP)，所述基因调节多肽包含连接至切割识别位点的致动部分。致动部分可以能够调控细胞中靶多核苷酸的表达。第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的另一个可包含能够切割GMP的切割识别位点的切割部分。第一嵌合多肽和第二嵌合多肽可不与受体直接接触，但可与受体的信号传导相关。在细胞与特异性结合所述受体的配体结合结构域的配体接触时，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽可被激活，使得切割部分切割所述切割识别位点并从GMP释放致动部分，从而调控细胞中靶多核苷酸的表达。在一些情况下，切割部分可切割所述切割识别位点并从GMP释放致动部分，致动部分的量足以调控细胞中靶多核苷酸的表达。
在一些情况下，受体包括内源性受体或外源性受体。外源性受体可包括嵌合多肽。嵌合多肽可包括嵌合抗原受体。受体可以是异源性受体。
第一嵌合多肽和第二嵌合多肽两者均可能缺乏与受体直接接触(例如，结合)的能力。在细胞与配体接触之前、期间和/或之后，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽两者均可不与受体直接接触。在细胞与配体接触之前、期间和之后，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽两者均可不与受体直接接触。在一些情况下，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽两者均不与受体直接接触。
第一嵌合多肽和第二嵌合多肽在接触步骤(b)时可以能够被激活以形成受体的信号传导复合物。形成受体的信号传导复合物可包括在(1)第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的至少一个与(2)受体之间间接复合。可替代地或附加地，形成受体的信号传导复合物可包括在(1)第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的至少一个与(2)之间进行复合(例如，直接或间接复合)，所述(2)为：(ii)受体的共同受体，和/或(iii)受体和/或共同受体的信号传导部分(例如，下游信号传导部分)。在一些情况下，复合可以是共价的(例如，二硫键)或非共价的(例如，氢键)。
在一些情况下，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽可结合配体。第一嵌合多肽和第二嵌合多肽可不结合配体。
在一些情况下，第一嵌合多肽是跨膜蛋白或细胞内蛋白。在一些情况下，第二嵌合多肽是跨膜蛋白或细胞内蛋白。受体可以是跨膜受体或细胞内受体。
在一些情况下，第一嵌合多肽包含第一衔接子部分，所述第一衔接子部分能够被激活以结合受体的第一下游信号传导部分。在一些情况下，第二嵌合多肽包含第二衔接子部分，所述第二衔接子部分能够被激活以结合(A)受体的第二下游信号传导部分，或(B)处于激活状态的第一衔接子部分。
在一些情况下，第一衔接子部分能够被激活以结合受体的第一下游部分，第二衔接子部分能够被激活以结合受体的第二下游部分，并且受体的第一和第二下游部分是相同的或不同的。在一些情况下，第一衔接子部分能够被激活以结合受体的第一下游信号传导部分，并且第二衔接子部分能够被激活以结合处于激活状态的第一衔接子部分。
在一些情况下，受体是T细胞受体(TCR)，包括TCRA、TCRB、TCRG和/或TCRD。TCR可包括TCR的共同受体，包括CD3、CD4和/或CD8。CD3可包括CD3E、CD3D、CD3G和/或CD3Z。CD3的细胞内结构域可包含至少一个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。第一衔接子部分和/或第二衔接子部分可包括LAT、SLP76、ITK、PLC-γ、VAV1、NCK、GADS、GRB2、PI3K、其片段，或它们的组合。
在一些情况下，受体是NKG2D，包括NKG2D-L和NKG2D-S。受体可以是NKG2D，并且第一衔接子部分和/或第二衔接子部分可包括PI3K、GRB2、VAV1、SYK、ZAP-70、其片段，或它们的组合。
在一些情况下，受体是选自以的Toll样受体(TLR)：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13。第一衔接子部分和/或第二衔接子部分可包括Tube、Pelle、IRAK1、TRAK4、TRAF6、TAK1、TBK1、RIPK1、PI3K、IKK、其片段，或它们的组合。
在另一方面，本公开提供了一种用于调控细胞中靶多核苷酸的表达的系统。所述系统可包含第一嵌合多肽和第二嵌合多肽。第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的一个可包含基因调节多肽(GMP)，所述基因调节多肽包含连接至切割识别位点的致动部分。致动部分可以能够调控细胞中靶多核苷酸的表达。第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的另一个可包含能够切割GMP的切割识别位点的切割部分。细胞可包含受体，所述受体具有对配体具有特异性的配体结合结构域。第一嵌合多肽和第二嵌合多肽在细胞与特异性结合所述受体的配体结合结构域的配体接触时可以能够被激活。第一嵌合多肽和第二嵌合多肽可不与受体直接接触，但可与受体的信号传导相关。在细胞与配体接触时，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽可被激活，使得切割部分切割所述切割识别位点并从GMP释放致动部分，从而调控细胞中靶多核苷酸的表达。在一些情况下，切割部分可切割所述切割识别位点并从GMP释放致动部分，致动部分的量足以调控细胞中靶多核苷酸的表达。
在一些情况下，受体包括内源性受体或外源性受体。外源性受体可包括嵌合多肽。嵌合多肽可包括嵌合抗原受体。受体可以是异源性受体。
第一嵌合多肽和第二嵌合多肽两者均可能缺乏与受体直接接触(例如，结合)的能力。在细胞与配体接触之前、期间和/或之后，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽两者均可不与受体直接接触。在细胞与配体接触之前、期间和之后，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽两者均可不与受体直接接触。在一些情况下，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽两者均不与受体直接接触。
第一嵌合多肽和第二嵌合多肽在所述接触时可以能够被激活以形成受体的信号传导复合物。形成受体的信号传导复合物可包括在(1)第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的至少一个与(2)受体之间间接复合。可替代地或附加地，形成受体的信号传导复合物可包括在(1)第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的至少一个与(2)之间进行复合(例如，直接或间接复合)，所述(2)为：(ii)受体的共同受体，和/或(iii)受体和/或共同受体的信号传导部分(例如，下游信号传导部分)。在一些情况下，复合可以是共价的(例如，二硫键)或非共价的(例如，氢键)。
在一些情况下，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽可结合配体。在一些情况下，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽不结合配体。
在一些情况下，第一嵌合多肽是跨膜蛋白或细胞内蛋白。在一些情况下，第二嵌合多肽是跨膜蛋白或细胞内蛋白。受体可以是跨膜受体或细胞内受体。第一嵌合多肽可包含第一衔接子部分，所述第一衔接子部分能够被激活以结合受体的第一下游信号传导部分。第二嵌合多肽可包含第二衔接子部分，所述第二衔接子部分能够被激活以结合(A)受体的第二下游信号传导部分，或(B)处于激活状态的第一衔接子部分。
在一些情况下，第一衔接子部分能够被激活以结合受体的第一下游部分，第二衔接子部分能够被激活以结合受体的第二下游部分，并且受体的第一和第二下游部分是相同的或不同的。在一些情况下，第一衔接子部分能够被激活以结合受体的第一下游信号传导部分，并且第二衔接子部分能够被激活以结合处于激活状态的第一衔接子部分。
在一些情况下，受体是T细胞受体(TCR)，包括TCRA、TCRB、TCRG和/或TCRD。TCR可包括TCR的共同受体，包括CD3、CD4和/或CD8。CD3可包括CD3E、CD3D、CD3G和/或CD3Z。CD3的细胞内结构域可包含至少一个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。第一衔接子部分和/或第二衔接子部分可包括LAT、SLP76、ITK、PLC-γ、VAV1、NCK、GADS、GRB2、PI3K、其片段，或它们的组合。
在一些情况下，受体是NKG2D，包括NKG2D-L和NKG2D-S。受体可以是NKG2D，并且第一衔接子部分和/或第二衔接子部分可包括PI3K、GRB2、VAV1、SYK、ZAP-70、其片段，或它们的组合。
在一些情况下，受体是选自以的Toll样受体(TLR)：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13。第一衔接子部分和/或第二衔接子部分可包括Tube、Pelle、IRAK1、TRAK4、TRAF6、TAK1、TBK1、RIPK1、PI3K、IKK、其片段，或它们的组合。
结合亲和力
在一些情况下，本文在本公开中提供的两个目标分子之间(例如，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的一个与受体的部分之间、第一嵌合多肽与第二嵌合多肽之间等)的结合亲和力的一种或多种特征(例如，平衡解离常数(KD)、平衡缔合常数(KA)等)可通过诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、表面等离子体共振(SPR)、等温滴定量热法(ITC)、荧光去极化、一种或多种计算机模拟等技术进行评估。
在一些情况下，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的至少一个可与以下的至少一个直接复合：(i)受体，(ii)受体的共同受体，和/或(iii)受体和/或共同受体的信号传导部分(例如，下游信号传导部分)，其中KD(其中KD＝Koff(即“kd”)/Kon(即“ka”))为约10-15摩尔(M)至约10-5M。在一些情况下，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的至少一个可与以下的至少一个直接复合：(i)受体，(ii)受体的共同受体，和/或(iii)受体和/或共同受体的信号传导部分，其中KD为至少约10-15M、10-14M、10-13M、10-12M、10-11M、10-10M、10-9M、10-8M、10-7M、10-6M、10- 5M或更大。在一些情况下，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的至少一个可与以下的至少一个直接复合：(i)受体，(ii)受体的共同受体，和/或(iii)受体和/或共同受体的信号传导部分，其中KD为至多约10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10- 15M或更小。
在一些情况下，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽可以以约10-15摩尔(M)至约10-5M的KD彼此直接复合。在一些情况下，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽可以以至少约10-15M、10- 14M、10-13M、10-12M、10-11M、10-10M、10-9M、10-8M、10-7M、10-6M、10-5M或更大的KD彼此直接复合。在一些情况下，第一嵌合多肽和第二嵌合多肽可以以至多约10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10- 9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或更小的KD彼此直接复合。
GMP和致动部分
GMP可包含致动部分，所述致动部分调控细胞中靶多核苷酸的表达。细胞中的靶多核苷酸可编码靶多肽。在一些情况下，靶多肽可诱导或抑制细胞的增殖、分化和/或存活。致动部分可以结合至靶多核苷酸以调控由靶多核苷酸编码的靶基因的表达和/或活性。在一些实施方案中，靶多核苷酸包含基因组DNA。在一些实施方案中，靶多核苷酸包含质粒的区域，例如携带外源性基因的质粒。在一些实施方案中，靶多核苷酸包含RNA，例如mRNA。在一些实施方案中，靶多核苷酸包含内源性基因或基因产物。致动部分可以包括核酸酶(例如，DNA核酸酶和/或RNA核酸酶)、与野生型核酸酶相比为核酸酶缺陷型或具有降低的核酸酶活性的修饰核酸酶(例如，DNA核酸酶和/或RNA核酸酶)或其变体。致动部分可以调控基因的表达或活性和/或编辑核酸(例如，基因和/或基因产物)的序列。在一些实施方案中，致动部分包括DNA核酸酶，诸如工程化的(例如，可编程的或可靶向的)DNA核酸酶，以诱导对靶DNA序列的基因组编辑。在一些实施方案中，致动部分包括RNA核酸酶，诸如工程化的(例如，可编程的或可靶向的)RNA核酸酶，以诱导对靶RNA序列的编辑。在一些实施方案中，致动部分具有降低或最小核酸酶活性(例如，dCas)。具有降低或最小核酸酶活性的致动部分可以通过物理阻碍靶多核苷酸或者募集有效抑制或增强靶多核苷酸表达的附加因子来调控基因的表达和/或活性。致动部分可以物理阻碍靶多核苷酸或募集有效阻抑或增强靶多核苷酸表达的附加因子。在一些情况下，致动部分包括有效增加靶多核苷酸表达的激活因子。在一些实施方案中，致动部分包括有效增加靶多核苷酸表达的转录激活因子。在其他情况下，致动部分包括有效降低靶多核苷酸表达的阻遏物。转录激活因子的非限制性实例包括GAL4、VP16、VP64、p65亚结构域(NFκB)和VP64-p65-Rta(VPR)。在一些实施方案中，致动部分包括有效降低靶多核苷酸表达的转录阻遏物。转录阻遏物的非限制性实例包括Kruippel相关盒(KRAB或SKD)、Mad mSIN3相互作用结构域(SID)和ERF阻遏物结构域(ERD)。在一些实施方案中，致动部分包括衍生自可以诱导靶DNA序列的转录激活或阻遏的DNA核酸酶的无核酸酶DNA结合蛋白。在一些实施方案中，致动部分包括衍生自可以诱导靶RNA序列的转录激活或阻遏的RNA核酸酶的无核酸酶RNA结合蛋白。在一些实施方案中，致动部分是核酸引导的致动部分。在一些实施方案中，致动部分是DNA引导的致动部分。在一些实施方案中，致动部分是RNA引导的致动部分或其变体，所述RNA引导的致动部分与靶多核苷酸形成复合物。致动部分可以调控基因的表达或活性和/或编辑核酸序列，无论是外源的还是内源的。
可以使用任何合适的核酸酶。合适的核酸酶包括但不限于CRISPR相关(Cas)蛋白或Cas核酸酶，包括I型CRISPR相关(Cas)多肽、II型CRISPR相关(Cas)多肽、III型CRISPR相关(Cas)多肽、IV型CRISPR相关(Cas)多肽、V型CRISPR相关(Cas)多肽和VI型CRISPR相关(Cas)多肽；锌指核酸酶(ZFN)；转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)；大范围核酸酶；RNA结合蛋白(RBP)；CRISPR相关的RNA结合蛋白；重组酶；翻转酶；转座酶；Argonaute(Ago)蛋白质(例如，原核Argonaute(pAgo)、古细菌Argonaute(aAgo)和真核Argonaute(eAgo))；以及其任何变体。在一些情况下，致动部分是基本上缺乏DNA切割活性的CRISPR相关(Cas)蛋白或其片段(dCas)。在一些情况下，致动部分可以是Cas9和/或Cpf1。
任何靶基因都可以通过包含致动部分进行调控。考虑到涵盖本文所述基因的遗传同源物。例如，基因可以表现出与本文公开的基因的特定同一性和/或同源性。因此，考虑到可以调控表现出为或表现出至少约为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源性(在核酸或蛋白质水平下)的基因的表达。还考虑到可以调控表现出为或表现出来至少约约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性(在核酸或蛋白质水平下)的基因的表达。
GMP的施用
在一些情况下，向细胞施用GMP可以包括用递送媒介物(vehicle)处理细胞，所述递送媒介物包含GMP的至少一部分和/或编码GMP的至少一部分的多核苷酸。递送媒介物可以是病毒的或非病毒的。GMP的至少一部分和/或编码GMP的至少一部分的多核苷酸可共价和/或非共价(例如，以离子方式、通过氢键等)地附接至递送媒介物。可替代地或附加地，GMP的至少一部分和/或编码GMP的至少一部分的多核苷酸可被递送媒介物包封，而与递送媒介物没有任何物理附接。
在一些情况下，递送媒介物可包含对存在于细胞表面上或附近的一种或多种配体(例如，细胞表面受体的部分、多糖链、一种或多种细胞外蛋白)具有亲和力的靶向部分。靶向部分可增强递送媒介物对细胞的靶向和结合。靶向部分可增强递送媒介物细胞内进入、摄取和/或渗透到细胞中。靶向部分可连接(例如，通过共价键和/或非共价键)至递送媒介物的外表面。靶向部分可以是非天然分子、天然分子的至少一部分、其功能衍生物，或其组合。靶向部分可以是小分子、多核苷酸(例如，适配体)、多肽(例如，寡肽或蛋白质)、抗体或其功能片段、其功能衍生物，或其组合。
在一些情况下，递送媒介物可能不包含这种针对细胞的靶向部分。
病毒递送媒介物的实例可包括腺病毒、逆转录病毒、慢病毒(例如，人免疫缺陷病毒(HIV))、腺相关病毒(AAV)和/或单纯疱疹病毒(HSV)。在一个实例中，病毒递送媒介物可以是逆转录病毒。逆转录病毒可以是选自以下的γ-逆转录病毒：猫白血病病毒(FLV)、猫肉瘤病毒(Hardy-Zuckerman 4毒株)、Finkel-Biskis-Jinkins鼠肉瘤病毒(FBJMSV)、鼠白血病病毒(MLV)(例如弗里德鼠白血病病毒(Friend Murine Leukemia Virus，FMLV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus，MMLV)、鼠C型逆转录病毒(MTCR))、长臂猿白血病病毒(GALV)、考拉逆转录病毒(KR)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MMSV)、猪内源性逆转录病毒E(PERE)、网状内皮增生症病毒(RV)、毛猴肉瘤病毒(Woolly Monkey Sarcoma Virus，WMSV)、狒狒内源性病毒毒株M7(BEVSM7)、鼠骨肉瘤病毒(MOV)、小家鼠动员内源性多变性前病毒(Mus Musculus Mobilized Endogenous Polytropic Provirus，MMMEPP)、PreXMRV-1、RD114逆转录病毒、脾病灶形成病毒(SFFV)、阿伯森鼠白血病病毒(Abelson murineleukemia virus，AMLV)、鼠干细胞病毒(MSCV)，以及其变体。
递送媒介物可包含核苷酸(例如，多核苷酸)、氨基酸(例如，肽或多肽)、聚合物、金属、陶瓷、其衍生物，或其组合。在一个实例中，递送媒介物可包括金刚石纳米颗粒(“纳米金刚石”)、金纳米颗粒、银纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒等。递送媒介物可包括或可不包括流体(例如，液体或气体)。递送媒介物可具有各种形状和尺寸。例如，递送媒介物可以是球形、长方体或圆盘的形状，或任何部分形状或其形状组合。递送媒介物可具有为圆形、三角形、正方形、矩形、五边形、六边形或任何部分形状或其形状组合的横截面。
非病毒递送媒介物的实例可包括纳米颗粒、纳米球、纳米胶囊、微粒、微球、微胶囊、脂质体、纳米乳剂、固体脂质纳米颗粒、其变型或其组合。本公开的非病毒递送媒介物可通过以下方法制备，诸如但不限于纳米沉淀法、乳液溶剂蒸发法、乳液-交联法、乳液溶剂扩散法、微乳液法、气体抗溶剂沉淀法、离子胶凝法、研磨或尺寸减小法、PEG化法、盐析法、透析法、单或双乳化法、纳米喷雾干燥法、逐层法、去溶剂化法、超临界流体技术、超分子组装，或其组合。
在一些情况下，所述方法还可以包括将编码如本文在本公开中提供的第一嵌合多肽和/或第二嵌合多肽的至少一部分的核酸序列(例如，多核苷酸)整合到细胞的基因组中。在一些情况下，核酸序列可编码GMP的至少一部分。在一些情况下，编码第一和/或第二嵌合多肽的至少一部分的核酸序列(例如，多核苷酸)可整合到细胞的基因组中。在施用编码第一和/或第二嵌合多肽的至少一部分的核酸(例如，使用或不使用递送媒介物)时，核酸的至少一部分可整合到细胞的基因组中。整合的核酸的至少一部分可置于细胞的自体启动子的控制之下。可替代地或附加地，整合的核酸的至少一部分还可包含对于细胞而言是自体或异源(例如，异源启动子)的启动子。异源启动子可被构造成结合与细胞同源或异源的一种或多种分子(例如，RNA聚合酶、转录因子等)。
在用包含有效负载(例如，第一和/或第二嵌合多肽的至少一部分、编码第一和/或第二嵌合多肽的至少一部分的核酸等)的递送媒介物处理期间，细胞可以在体内和/或离体(例如，在体外)。
在一些情况下，可将包含有效负载的递送媒介物注射到对象的身体部分(例如，患者的静脉、骨髓等)，并且递送媒介物可与细胞在体内相互作用(例如，进入细胞)。注射方法的其他实例可包括皮内、皮下、肌内、静脉内、骨内、腹膜内、鞘内、硬膜外、心内、关节内、海绵体内和/或玻璃体内。
在一些情况下，可向对象至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次注射包含有效负载(payload)的递送媒介物剂量。在一些情况下，可向对象至多约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1次注射包含有效负载的递送媒介物剂量。在一些情况下，可以以至少每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、60、90、180、360或更多天一次的频率向对象注射包含有效负载的递送媒介物剂量。在一些情况下，可以以至多每360、180、90、60、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1天一次的频率向对象注射包含有效负载的递送媒介物剂量。
在一些情况下，可从对象中分离细胞，并且可用包含有效负载的递送媒介物处理分离的细胞(例如，在培养基中培养)。在用包含有效负载的递送媒介物处理之前、期间和/或之后，可允许或刺激分离的细胞增殖。在一些情况下，目标细胞可以是免疫细胞。在这种情况下，可从对象中分离免疫细胞(例如，T细胞)。可替代地或附加地，可从对象中分离不是免疫细胞的细胞(例如，干细胞、皮肤细胞等)，并且在用包含有效负载的递送媒介物处理之前，可诱导该分离的细胞分化为免疫细胞，转分化为免疫细胞，和/或表达一种或多种指示免疫细胞的标志物(例如，一种或多种TCR复合物)。在一些情况下，不是免疫细胞的细胞在分化为免疫细胞(例如，T细胞)和/或诱导一种或多种TCR复合物的表达之前可先去分化为诱导多能干细胞(iPSC)。随后，可将分离和处理的细胞注射(移植)到对象体内。
用至少有效负载处理(离体和/或在体内)以施用包含致动部分的GMR的本文提供的任何细胞可称为工程化的细胞(例如，工程化的免疫细胞，诸如工程化的T细胞)。
在一些情况下，可将这种工程化的细胞注射到对象的身体部分(例如，患者的静脉、骨髓等)，并且递送媒介物可与细胞在体内相互作用(例如，进入细胞)。注射方法的其他实例可包括皮内、皮下、肌内、静脉内、骨内、腹膜内。
在一些情况下，可向对象至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次注射工程化细胞(例如，被施用了GMP的细胞)的剂量。在一些情况下，可向对象至多约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1次注射工程化细胞的剂量。在一些情况下，可以以至少每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、60、90、180、360或更多天一次的频率向对象注射工程化细胞的剂量。在一些情况下，可以以至多每360、180、90、60、30、20、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1天一次的频率向对象注射工程化细胞的剂量。
在一些情况下，可向对象注射至少约0.5、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100(x109)个或更多个工程化的细胞。在一些情况下，可向对象注射至多约100、90、80、70、60、50、40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9.9、9.8、9.7、9.6、9.5、9.4、9.3、9.2、9.1、9.0、8.9、8.8、8.7、8.6、8.5、8.4、8.3、8.2、8.1、8.0、7.9、7.8、7.7、7.6、7.5、7.4、7.3、7.2、7.1、7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2、3.1、3.0、2.9、2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2、2.1、2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5(x109)个或更少个工程化的细胞。
在一些情况下，GMP可以是嵌合多肽的部分。嵌合多肽可以是或可以不是跨膜蛋白。在一个实例中，嵌合多肽可以是CAR，并且GMP可以是CAR的细胞内结构域的至少一部分。在另一个实例中，嵌合多肽可以是嵌合跨膜蛋白，并且GMP可以是嵌合跨膜蛋白的细胞内结构域的至少一部分。在一个不同实例中，包含GMP的嵌合多肽可以是细胞内蛋白。
在一些情况下，向细胞施用GMP可以包括用包含GMP的嵌合多肽的至少一部分和/或编码包含GMP的嵌合多肽的至少一部分的多核苷酸处理细胞。这种处理可在本文在本公开中提供的一种或多种递送媒介物存在或不存在的情况下发生。在一些情况下，所述方法还可以包括向细胞施用包含GMP的嵌合多肽，其中嵌合多肽是可操作的，以响应于刺激物(例如，本文在本公开中提供的受体的配体)而从嵌合多肽中释放GMP，并且其中所释放的GMP是可操作的，以调控细胞中靶多核苷酸的表达。在一些情况下，所述方法还可以包括向细胞施用包含GMP和核定位结构域的嵌合多肽，其中核定位结构域是可操作的，以响应于刺激物而将嵌合多肽易位至细胞核，并且其中易位的GMP是可操作的，以调控细胞中靶多核苷酸的表达。
在一些情况下，如上所述，核定位结构域可以衍生自转录因子。转录因子可以是可调控的转录因子，其仅是有活性的并且能够响应于信号或信号传导通路而易位到细胞核中。转录因子可以是可调控的转录因子，其主要是有活性的并且能够响应于信号或信号传导通路而易位到细胞核中。转录因子可以是可调控的转录因子，其通常是有活性的并且能够响应于信号或信号传导通路而易位到细胞核中。
在一些实例中，核定位结构域可以衍生自NFAT家族成员(例如，NFATp、NFAT1、NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFAT4、NFATx、NFATc4、NFAT3和NFAT5)、核因子κB(NF-κB)、NFKB1p50、激活蛋白1(AP-1)、转录家族成员的信号转导和激活蛋白(例如，STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6)、固醇反应元件结合蛋白(例如，SREBP-1和SREBF1)、光或昼夜节律或电磁感应蛋白诸如隐花色素(例如，CRY1、CRY2)、Timeless(TIM)、PER蛋白(例如，PER1、PER2和PER3)的PAS结构域，或其他转录因子或信号转导蛋白。
在一些情况下，在细胞的受体(例如，内源性受体，诸如免疫细胞的TCR)激活时，GMP的致动部分可以被激活，以相比于对照细胞将细胞中靶多核苷酸的表达(例如，细胞的内源性基因)调控至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、5倍、10倍、100倍、1000倍或更多。在一些情况下，在细胞的受体(例如，内源性受体，诸如免疫细胞的TCR)激活时，GMP的致动部分可以被激活，以相比于对照细胞将细胞中靶多核苷酸的表达(例如，细胞的内源性基因)调控至多1000倍、100倍、10倍、5倍、4.0倍、3.5倍、3.0倍、2.5倍、2.0倍、1.9倍、1.8倍、1.7倍、1.6倍、1.5倍、1.4倍、1.3倍、1.2倍、1.1倍或更少。在一些情况下，在细胞的受体(例如，内源性受体，诸如免疫细胞的TCR)激活时，GMP的致动部分可以被激活，以相比于对照细胞将细胞中靶多核苷酸的表达(例如，细胞的内源性基因)调控至少约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、200％或更多。在一些情况下，在细胞的受体(例如，内源性受体，诸如免疫细胞的TCR)激活时，GMP的致动部分可以被激活，以相比于对照细胞将细胞中靶多核苷酸的表达(例如，细胞的内源性基因)调控至多约200％、150％、140％、130％、120％、110％、100％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或更少。
如本文所公开的对照细胞是这样的细胞，其：(i)缺乏包含GMP的第一嵌合多肽(或表现出较低的表达水平)并且(ii)缺乏包含能够从GMP释放(和激活)致动部分的切割部分的第二嵌合多肽(或表现出较低的表达水平)。另选地，对照细胞可以是这样的细胞，其：(i)包含含有GMP的第一嵌合多肽并且(ii)缺乏包含能够从GMP释放(和激活)致动部分的切割部分的第二嵌合多肽(或表现出较低的表达水平)。另选地，对照细胞可以是这样的细胞，其：(i)缺乏包含GMP的第一嵌合多肽(或表现出较低的表达水平)并且(ii)包含含有能够从GMP释放(和激活)致动部分的切割部分的第二嵌合多肽。另选地，对照细胞可以是缺乏能够结合靶多核苷酸的指导核酸(例如，sgRNA)(或表现出较低表达水平)的细胞。另选地，对照细胞可以是包含不能结合靶多核苷酸的对照指导核酸(例如，sgRNA)的细胞。
如本文所公开的靶多核苷酸可以是DNA分子(例如，基因组或非基因组DNA序列)。另选地，靶多核苷酸可以是RNA分子(例如mRNA)。可以通过致动部分的作用增强靶多核苷酸的表达水平。另选地，可以通过致动部分的作用降低靶多核苷酸的表达水平。靶多核苷酸可以参与(例如，直接参与)细胞调控(例如，免疫细胞调控)。靶多核苷酸可以编码参与细胞调控(例如免疫细胞调控)的蛋白质。这种细胞调控可以增强细胞的活性(例如免疫细胞的活性)或降低细胞的活性。在一些情况下，靶多核苷酸可以编码免疫检查点调控剂(例如，免疫检查点抑制剂，诸如A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、NOX2、PD-1、TIM-3、VISTA、SIGLC7等)。在一些情况下，靶多核苷酸可以编码细胞的细胞因子。细胞因子可以包含选自以下的白介素(IL)：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-34、IL-35和IL-36。例如，靶多核苷酸可以编码IL-12(例如，IL12A和/或IL12B)。在一些情况下，靶多核苷酸可以编码细胞命运控制基因。细胞命运控制基因的非限制性实例可以包括：Pax(例如，PAX-1、PAX-2、PAX-3、PAX-4、PAX-5、PAX-6、PAX-7、PAX-8或PAX-9)；HOX(例如，HOX A1-7、9-11或13；HOX B1-9；HOX C4-6或8-13；HOX D1、3-4或8-13)、DLX(例如，DLX-2、DLX-4、DLX-5；小鼠DLX-1、DLX-2、DLX-3、DLX-5、DLX-6；DLX-7；)、PBC(例如，Pbx1、Pbx2或Pbx3)、MEINOX(例如，Meis1、Meis2、Meis3)、bHLH(例如，MyoD、肌细胞生成蛋白、myf-5、MASH-1和MASH-2)、LIM同源框(例如，ISLET-1、LIM-1、LMX1B、LHX2)、MSX(例如，MSX-1或MSX-2)、POU(例如，Oct-1、Oct-2、Oct-6和Pit-1)、PTX(例如，Ptx1、Ptx2)、NKX(例如，NKX2.5、NKX2.8、NKX3.1)、MADS盒(例如，SRF和mef2和)、SOX(例如，SOX-2、SOX-4、SOX-8、SOX-9、SOX-10、SOX-11、SOX-14和SOX-17)、T-盒(例如，TBX-5、TBX-6、TBX-10、TBX-18、TBX-19、TBX-20、TBX-21)、WNT(例如，WNT-1、WNT-2、WNT-3A、WNT4、WNT-5A、WNT-7a、WNT-7B、WNT-8A、WNT-10B、WNT-13、WNT-14)、BMP/TGF(例如，TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、BMP-1、BMP-2、BMP-3B(GDF10)、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、激活蛋白、GDF1、GDF5、GDF8、GDF9)以及hedgehog(例如，索尼克(Sonic)、印度或或沙漠hedgehog)。可替代地或附加地，靶多核苷酸可以编码细胞因子或细胞命运控制基因中的任一种的相应受体。这种受体的非限制性实例可以包括IL受体、WNT受体、BMP受体、TGF受体(例如，TGFβ受体，诸如TGFβ受体2)、刺猬受体(例如，PTCH1、PTCH2)等。例如，GMP的致动部分在其激活时可以下调TGF受体(例如，TGFβ受体2)的表达或活性。
在一些情况下，在细胞的受体激活时，GMP的致动部分可以被激活，以上调细胞中靶多核苷酸的表达或活性。在一些实例中，细胞中靶多核苷酸的表达或活性上调可以改善细胞功能，诸如细胞健康(例如，T细胞健康)、干性、耗竭的防止、存活和/或扩增。可以通过本文公开的系统和方法上调的靶多核苷酸的非限制性实例可以包括Id1/Id3(例如，用于改善或延长干性)、cJun或Jun(例如，用于防止T细胞耗竭)、TBX(例如，TBX-21，用于改善或延长干性)以及白介素(例如，IL-21，用于改善细胞的存活或扩增)。
在一些情况下，在细胞的受体激活时，GMP的致动部分可以被激活，以下调细胞中靶多核苷酸的表达或活性。在一些实例中，在细胞中靶多核苷酸的表达或活性下调可以增强细胞效力和/或生存能力(例如，T细胞效力和/或在肿瘤中的生存能力)。可以通过本文公开的系统和方法下调的靶多核苷酸的非限制性实例可以包括TOX(例如，TOX2，用于减少或防止T细胞耗竭)、SOCS(例如，SOCS-1，用于增强针对靶细胞诸如癌细胞或患病细胞的T细胞效力)、SHIP(例如，SHIP-1，用于减少或防止T细胞耗竭)、碱性亮氨酸拉链ATF样转录因子(BATF)(例如，用于减少或防止T细胞耗竭)以及β-2-微球蛋白(B2M)(例如，用于增强针对靶细胞诸如癌细胞或患病细胞的免疫原性)。
在一些情况下，与不存在GMP情况下的细胞相比，GMP可以调控细胞中靶多核苷酸的表达或活性持续至少1分钟、5分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、16小时、20小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、2周、3周、4周、2个月、4个月、6个月、1年或更长时间。在一些情况下，与不存在GMP情况下的细胞相比，GMP可以持续调控细胞中靶多核苷酸的表达或活性至多1年、6个月、4个月、2个月、4周、3周、2周、7天、6天、5天、4天、3天、2天、24小时、20小时、16小时、12小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟、10分钟、5分钟、1分钟或更短时间。
调控细胞中靶多核苷酸的表达或活性可以包括降低、增加、抑制和/或延长细胞中靶多核苷酸的表达或活性。调控细胞中靶多核苷酸的表达或活性可以是降低细胞中靶多核苷酸的表达或活性。调控细胞中靶多核苷酸的表达或活性可以是增加细胞中靶多核苷酸的表达或活性。
调控细胞中靶多核苷酸的表达或活性可直接和/或间接地允许调控细胞的活性。在一些情况下，调控细胞的活性可以包括减少和/或抑制细胞的自伤(self-inflictedinjury)、细胞被另一个细胞杀死，和/或细胞将另一个细胞杀死，从而改善(直接和/或间接)细胞的活力、增殖和/或功能。
在一些情况下，调控细胞的活性可以包括诱导和/或延长细胞的激活(例如，免疫细胞诸如T细胞的激活)。细胞的激活可以包括细胞的一种或多种生物活性(例如，迁移、增殖、一种或多种多肽的合成等)的激活。
在一些情况下，GMP可被构造用于减少和/或防止细胞的激活。
在一些情况下，包含致动部分的GMP可被构造用于增加或减少细胞中一种或多种血管生成因子的表达或活性。在一些情况下，包含致动部分的GMP可被构造用于减少细胞中一种或多种血管生成因子的表达或活性。在一些情况下，包含致动部分的GMP可被构造用于减少细胞中一种或多种血管生成因子的表达或活性。包含致动部分的GMP可与针对T细胞中编码一种或多种血管生成因子的一种或多种多核苷酸序列的指导RNA(例如，sgRNA)一起表达。GMP的致动部分连同指导RNA一起可被构造用于增加或减少细胞中一种或多种血管生成因子的表达或活性。
一种或多种血管生成因子可以包括促血管生成因子和/或抗血管生成因子。促血管生成因子的实例可以包括但不限于FGF、VEGF、VEGFR、NRP-1、Ang1、Ang2、PDGF(BB-同二聚体)、PDGFR、TGF-β、内皮糖蛋白、TGF-β受体、MCP-1、整联蛋白αVβ3、αVβ3、α5β1、VE-钙黏着蛋白、CD31、肝配蛋白、纤溶酶原激活剂、纤溶酶原激活剂抑制剂-1、eNOS、COX-2、AC133、Id1/Id3、血管生成素、HGF、Vegf、IL-17、IL-1α、IL-8、IL-6、Cxcl5、Fgfα、Fgfβ、Tgfα、Tgfβ、MMP(包括mmp9)、纤溶酶原激活剂抑制剂-1、血小板反应蛋白、血管生成素1、血管生成素2、双调蛋白、瘦素、内皮素-1、AAMP、AGGF1、AMOT、ANGLPTL3、ANGPTL4、BTG1、IL-1β、NOS3、TNFSF12和/或VASH2。
在一些情况下，编码GMP的核酸序列可整合到细胞的基因组中。
在一些情况下，切割识别位点可包含多肽序列，并且切割部分可包含蛋白酶活性。在一些情况下，切割识别位点可包含二硫键，并且切割部分可包含氧化还原酶活性。在一些情况下，切割识别位点可包含内含肽序列的第一部分，其与内含肽序列的第二部分反应以释放致动部分。
在一些情况下，切割部分仅在接近切割识别位点时才能切割识别位点。切割识别位点可以包含作为蛋白酶的识别序列的多肽序列。切割部分可以包含识别多肽序列的蛋白酶活性。包含蛋白酶活性的切割部分可以是蛋白酶，或其任何衍生物、变体或片段。蛋白酶可以指进行蛋白水解的任何酶，其中多肽被切割成较小的多肽或氨基酸。各种蛋白酶可以适合用作切割部分。一些蛋白酶可以是高度混杂的，使得广泛多种蛋白质底物被水解。一些蛋白酶可以是高度特异性的并且仅切割具有特定序列的底物，例如切割识别序列或肽切割结构域。在一些情况下，切割识别位点可以包含多个切割识别序列，并且每个切割识别序列可以被包含蛋白酶活性的相同或不同的切割部分(例如，蛋白酶)识别。可以用作切割部分的序列特异性蛋白酶包括但不限于超家族CA蛋白酶，例如家族C1、C2、C6、C10、C12、C16、C19、C28、C31、C32、C33、C39、C47、C51、C54、C58、C64、C65、C66、C67、C70、C71、C76、C78、C83、C85、C86、C87、C93、C96、C98和C101，包括木瓜蛋白酶(番木瓜(Carica papaya))、菠萝蛋白酶(菠萝(Ananas comosus))、组织蛋白酶K(苔)和钙蛋白酶(智人(Homo sapiens))；超家族CD蛋白酶，例如家族C11、C13、C14、C25、C50、C80和C84：诸如半胱天冬酶-1(褐家鼠(Rattusnorvegicus))和分离酶(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))；超家族CE蛋白酶，例如家族C5、C48、C55、C57、C63和C79，包括adenain(人腺病毒2型)；超家族CF蛋白酶，例如家族C15，包括焦谷氨酰-肽酶I(解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens))；超家族CL蛋白酶，例如家族C60和C82，包括分选酶A(金黄色葡萄球菌)；超家族CM蛋白酶，例如家族C18，包括丙型肝炎病毒肽酶2(丙型肝炎病毒)；超家族CN蛋白酶，例如家族C9，包括辛德比斯病毒型nsP2肽酶(辛德比斯病毒)；超家族CO蛋白酶，例如家族C40，包括二肽基-肽酶VI(球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus))；超家族CP蛋白酶，例如家族C97，包括DeSI-1肽酶(小家鼠(Mus musculus))；超家族PA蛋白酶，例如家族C3、C4、C24、C30、C37、C62、C74和C99，包括TEV蛋白酶(烟草蚀刻病毒)；超家族PB蛋白酶，例如家族C44、C45、C59、C69、C89和C95，包括酰胺基磷酸核糖基转移酶前体(智人)；超家族PC蛋白酶，家族C26和C56，包括
Figure BDA0003930168760000611
-谷氨酰水解酶(褐家鼠)；超家族PD蛋白酶，例如家族C46，包括刺猬蛋白(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))；超家族PE蛋白酶，例如家族P1，包括DmpA氨肽酶(人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi))；其他蛋白酶，例如家族C7、C8、C21、C23、C27、C36、C42、C53和C75。另外的蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶，例如超家族SB的那些，例如家族S8和S53，包括枯草杆菌蛋白酶(地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis))；超家族SC的那些，例如家族S9、S10、S15、S28、S33和S37，包括脯氨酰寡肽酶(野猪(Sus scrofa))；超家族SE的那些，例如家族S11、S12和S13，包括D-Ala-D-Ala肽酶C(大肠杆菌)；超家族SF的那些，例如家族S24和S26，包括信号肽酶I(大肠杆菌)；超家族SJ的那些，例如家族S16、S50和S69，包括lon-A肽酶(大肠杆菌)；超家族SK的那些，例如家族S14、S41和S49，包括Clp蛋白酶(大肠杆菌)；超家族SO的那些，例如家族S74，包括噬菌体K1F内切唾液酸酶CIMCD自切割蛋白(肠杆菌噬菌体K1F)；超家族SP的那些，例如家族S59，包括核孔蛋白145(智人)；超家族SR的那些，例如家族S60，包括乳铁蛋白(智人)；超家族SS的那些，家族S66，包括胞壁质四肽酶LD-羧肽酶(铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))；超家族ST的那些，例如家族S54，包括扁菱形蛋白(rhomboid)-1(黑腹果蝇)；超家族PA的那些，例如家族S1、S3、S6、S7、S29、S30、S31、S32、S39、S46、S55、S64、S65和S75，包括糜蛋白酶A(牛(Bos taurus))；超家族PB的那些，例如家族S45和S63，包括青霉素G酰基转移酶前体(大肠杆菌)；超家族PC的那些，例如家族S51，包括二肽酶E(大肠杆菌)；超家族PE的那些，例如家族P1，包括DmpA氨肽酶(人苍白杆菌)；那些未指定的，例如家族S48、S62、S68、S71、S72、S79和S81苏氨酸蛋白酶，例如超家族PB族的那些，例如家族T1、T2、T3和T6，包括古生菌蛋白酶体
Figure BDA0003930168760000621
组分(嗜酸热原体(Thermoplasmaacidophilum))；以及超家族PE族的那些，例如家族T5，包括鸟氨酸乙酰转移酶(酿酒酵母)；天冬氨酸蛋白酶，例如BACE1、BACE2；组织蛋白酶D；组织蛋白酶E；凝乳酶；napsin-A；猪笼草蛋白酶(nepenthesin)；胃蛋白酶；天冬氨酸蛋白酶(plasmepsin)；早老素；肾素；以及HIV-1蛋白酶和金属蛋白酶，例如外肽酶、金属外肽酶；内肽酶和金属内肽酶。切割识别序列(例如，多肽序列)可以被本文公开的任何蛋白酶识别。
在一些情况下，切割识别位点可以包含被蛋白酶识别的切割识别序列(例如，多肽序列或肽切割结构域)，所述蛋白酶选自：无色肽酶、氨肽酶、安克洛酶(ancrod)、血管紧张素转化酶、菠萝蛋白酶、钙蛋白酶、钙蛋白酶I、钙蛋白酶II、羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶G、羧肽酶P、羧肽酶W、羧肽酶Y、半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶11、半胱天冬酶12、半胱天冬酶13、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶G、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、木瓜凝乳蛋白酶、糜酶、糜蛋白酶、梭菌蛋白酶、胶原酶、补体C1r、补体C1s、补体因子D、补体因子I、黄瓜素、二肽基肽酶IV、弹性蛋白酶(白细胞)、弹性蛋白酶(胰腺)、内切蛋白酶Arg-C、内切蛋白酶Asp-N、内切蛋白酶Glu-C、内切蛋白酶Lys-C、肠激酶、因子Xa、无花果蛋白酶、弗林蛋白酶、颗粒酶A、颗粒酶B、HIV蛋白酶、IGase、组织激肽释放酶(kallikrein tissue)、亮氨酸氨肽酶(通用)、亮氨酸氨肽酶(胞质溶胶)、亮氨酸氨肽酶(微粒体)、基质金属蛋白酶、甲硫氨酸、氨肽酶、中性蛋白酶(neutrase)、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、纤溶酶、脯氨酸肽酶(prolidase)、链霉蛋白酶E、前列腺特异性抗原、来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的嗜碱蛋白酶、来自曲霉属(Aspergillus)的蛋白酶、来自斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)的蛋白酶、来自酱油曲霉(Aspergillus sojae)的蛋白酶、蛋白酶(地衣芽孢杆菌)(碱性或碱性蛋白酶)、来自多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)的蛋白酶、来自芽孢杆菌属物种的蛋白酶、来自根霉属物种(Rhizopus sp.)的蛋白酶、蛋白酶S、蛋白酶体、来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的蛋白酶、蛋白酶3、蛋白酶A、蛋白酶K、蛋白C、焦谷氨酸氨肽酶、凝乳酶、凝乳酶、链激酶、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、凝血酶、组织纤溶酶原激活剂、胰蛋白酶、类胰蛋白酶以及尿激酶。
可以在本公开的系统和方法中使用的蛋白酶和相关识别序列的更多细节公开于专利合作条约(PCT)专利申请号PCT/US17/012885和PCT专利申请号PCT/US17/012881，其中的每一个都通过引用而整体并入本文中。
在一些情况下，GMP的致动部分可以是RNA引导的致动部分或其变体，所述RNA引导的致动部分与靶多核苷酸形成复合物。在一些情况下，致动部分可以是基本上缺乏DNA切割活性的CRISPR相关(Cas)蛋白或其片段。在一些情况下，致动部分可以是Cas9和/或Cpf1。在一些情况下，致动部分可以包括有效增加靶多核苷酸的表达或活性的激活因子。在一些情况下，致动部分可以包括有效降低靶多核苷酸的表达或活性的阻遏物。
包含嵌合多肽(例如，嵌合受体多肽、嵌合衔接子多肽等)、CAR、GMP、配体(例如，抗原)、其修饰物以及包含它的表达盒的系统的设计和应用的更多细节公开于PCT专利申请号PCT/US17/012885、PCT专利申请号PCT/US17/012881、PCT专利申请号PCT/US18/041704、美国专利号9,856,497、美国非临时申请号15/806,756、美国非临时申请号16/029,299、美国非临时申请号16/029,299、美国临时申请号62/639,427、美国临时申请号62/639,386、美国临时申请号62/647,543以及美国临时申请号62/675,134，其中的每一个均通过引用而整体并入本文中。
细胞与配体的接触可以直接和/或间接发生。当配体结合细胞的部分时，可发生直接刺激。在一些情况下，配体可与细胞的受体结合。在一个实例中，配体可与受体的配体结合结构域结合。当配体激活不同的细胞或使其失活时可以发生间接刺激，所述不同的细胞是可操作的，以通过使用其细胞表面标志物(例如，细胞表面配体)结合细胞的受体来激活细胞。因此，可以激活细胞以调控细胞中靶多核苷酸的表达或活性。不同的细胞可以是与所述细胞相同(例如，相同类型的另一个细胞)或不同的细胞类型。
细胞与配体的接触可在将包含致动部分的GMP施用于细胞之前、期间和/或之后发生。在细胞(例如，细胞的受体)与配体接触期间，细胞可以是离体和/或在体内的。
细胞与配体的接触可在将细胞(例如，工程化的细胞)施用于对象之前、期间和/或之后发生。可在向对象施用细胞之前、期间和/或之后使细胞与配体接触至少约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5天或更长的时间段。可在向对象施用细胞之前、期间和/或之后使细胞与配体接触至多约6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、0.5天或更短的时间段。可在将细胞施用于对象之前使细胞与配体接触至少约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5天或更长的时间段。可在将细胞施用于对象之前使细胞与配体接触至多约6.5、6、5.5、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1、0.5天或更短的时间段。可在将细胞施用于对象之后使细胞与配体接触至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400天或更长的时间段。可在将细胞施用于对象之后使细胞与配体接触至多约400、390、380、370、360、350、340、330、320、310、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10天或更短的时间段。在一些情况下，可使细胞与配体接触至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多次。在一些情况下，可使细胞与配体接触至多约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1次。在一些情况下，可使细胞与剂量浓度为至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、900、1000国际单位/毫升(IU/mL)或更大的配体接触。在其他情况下，可使细胞与剂量浓度为至多约1000、900、800、790、780、770、760、750、740、730、720、710、700、690、680、670、660、650、640、630、620、610、600、590、580、570、560、550、540、530、520、510、500、490、480、470、460、450、440、430、420、410、400、390、380、370、360、350、340、330、320、310、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10IU/mL或更小的配体接触。
在一些情况下，细胞受体的配体(即，刺激物)可选自：白介素(例如，IL-2)、干扰素、转化生长因子(TGF)、分化簇(CD)受体的配体，以及其变体。刺激物可以是本公开中所述的抗原。在一些实例中，抗原可诱导免疫细胞(例如，T细胞)的迁移、存活、增殖和/或分化。在一些情况下，刺激物可包括疫苗(例如，免疫细胞疫苗)。疫苗可以是药物组合物，其包含至少一种在细胞(例如，免疫细胞)或动物中诱导免疫和/或保护反应的免疫保护分子。疫苗还可包含一种或多种增强免疫活性的附加组分(例如，佐剂)。在一个实例中，免疫细胞疫苗可以是肽疫苗(例如，p-27L)或病毒疫苗(例如，p-210M、rFP-210M)。
在一些情况下，细胞的配体结合结构域(例如，刺激物结合结构域)结合不是膜结合(例如，非膜结合)的抗原，例如由细胞(例如，靶细胞)分泌的细胞外抗原或位于细胞(例如，靶细胞)的细胞质中的抗原。抗原(例如，膜结合的和非膜结合的)可以与疾病相关，所述疾病诸如病毒、细菌和/或寄生虫感染；炎性和/或自身免疫性疾病；或赘生物，诸如癌症和/或肿瘤。可以被主题系统的嵌合跨膜受体多肽的配体结合结构域结合的抗原的非限制性实例包括但不限于1-40-β-淀粉样蛋白、4-1BB、5AC、5T4、707-AP、A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)、激活蛋白受体2B型(ACVR2B)、激活蛋白受体样激酶1(ALK1)、腺癌抗原、脂肪分化相关蛋白(adipophilin)、肾上腺受体β3(ADRB3)、AGS-22M6、α叶酸受体、甲胎蛋白(AFP)、AIM-2、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、雄激素受体、血管生成素2、血管生成素3、血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)、炭疽毒素、AOC3(VAP-1)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3(CD276)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis anthrax)、B细胞激活因子(BAFF)、B淋巴瘤细胞、骨髓基质细胞抗原2(BST2)、印迹位点调节物兄弟因子(Brother of the Regulator of Imprinted Sites，BORIS)、C242抗原、C5、CA-125、癌症抗原125(CA-125或MUC16)、癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)、癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)、碳酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原(CEA)、心肌肌球蛋白、CCCTC结合因子(CTCF)、CCL11(嗜酸细胞激活趋化因子-1)、CCR4、CCR5、CD11、CD123、CD125、CD140a、CD147(基础免疫球蛋白)、CD15、CD152、CD154(CD40L)、CD171、CD179a、CD18、CD19、CD2、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23(IgE受体)、CD24、CD25(IL-2受体的α链)、CD27、CD274、CD28、CD3、CD3ε、CD30、CD300分子样家族成员f(CD300LF)、CD319(SLAMF7)、CD33、CD37、CD38、CD4、CD40、CD40配体、CD41、CD44 v7、CD44 v8、CD44 v6、CD5、CD51、CD52、CD56、CD6、CD70、CD72、CD74、CD79A、CD79B、CD80、CD97、CEA相关抗原、CFD、ch4D5、X染色体可读框61(CXORF61)、紧密连接蛋白18.2(CLDN18.2)、紧密连接蛋白6(CLDN6)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、凝集因子A、CLCA2、集落刺激因子1受体(CSF1R)、CSF2、CTLA-4、C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)、C型凝集素样分子1(CLL-1或CLECL1)、C-X-C趋化因子受体4型、细胞周期蛋白B1、细胞色素P4501B1(CYP1B1)、cyp-B、巨细胞病毒、巨细胞病毒糖蛋白B、达比加群(dabigatran)、DLL4、DPP4、DR5、大肠杆菌志贺毒素1型、大肠杆菌志贺毒素2型、ecto-ADP-核糖基转移酶4(ART4)、含EGF样模块的黏蛋白样激素受体样2(EMR2)、EGF样结构域多重7(EGFL7)、延伸因子2突变型(ELF2M)、内毒素、肝配蛋白A2、肝配蛋白B2、肝配蛋白A型受体2、表皮生长因子受体(EGFR)、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、episialin、上皮细胞黏附分子(EpCAM)、上皮糖蛋白2(EGP-2)、上皮糖蛋白40(EGP-40)、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERG(跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)ETS融合基因)、大肠杆菌、位于染色体12p上的ETS易位-变体基因6(ETV6-AML)、呼吸道合胞病毒F蛋白、FAP、IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)、Fc受体样5(FCRL5)、胎儿乙酰胆碱受体、纤维蛋白IIβ链、成纤维细胞激活蛋白α(FAP)、纤连蛋白额外结构域-B、FGF-5、Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸水解酶、叶酸受体1、叶酸受体α、叶酸受体β、Fos相关抗原1、卷曲受体、岩藻糖基GM1、G250、G蛋白偶联受体20(GPR20)、G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)、神经节苷脂G2(GD2)、GD3神经节苷脂、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、GMCSF受体α链、GPNMB、GnT-V、生长分化因子8、GUCY2C、热休克蛋白70-2突变型(mut hsp70-2)、血球凝集素、甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎病毒、HER1、HER2/neu、HER3、globoH糖神经酰胺(GloboH)的六糖部分、HGF、HHGFR、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、组蛋白复合物、HIV-1、HLA-DR、HNGF、Hsp90、HST-2(FGF6)、人乳头瘤病毒E6(HPVE6)、人乳头瘤病毒E7(HPV E7)、人散射因子受体激酶、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、人TNF、ICAM-1(CD54)、iCE、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IgE、IgE Fc区、IGF-1、IGF-1受体、IGHE、IL-12、IL-13、IL-17、IL-17A、IL-17F、IL-1β、IL-20、IL-22、IL-23、IL-31、IL-31RA、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6受体、IL-9、免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)、甲型流感血球凝集素、胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、胰岛素样生长因子2(ILGF2)、整联蛋白α4β7、整联蛋白β2、整联蛋白α2、整联蛋白α4、整联蛋白α5β1、整联蛋白α7β7、整联蛋白αIIbβ3、整联蛋白αvβ3、干扰素α/β受体、干扰素γ诱导蛋白、白介素11受体α(IL-11Rα)、白介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)、肠羧基酯酶、激酶结构域区(KDR)、KIR2D、KIT(CD117)、L1细胞黏附分子(L1-CAM)、豆荚蛋白、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、Lewis-Y抗原、LFA-1(CD11a)、LINGO-1、脂磷壁酸、LOXL2、L-选择素(CD62L)、淋巴细胞抗原6复合物、基因座K 9(LY6K)、淋巴细胞抗原75(LY75)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、淋巴毒素-α(LT-α)或肿瘤坏死因子-β(TNF-β)、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF或MMIF)、M-CSF、乳腺分化抗原(NY-BR-1)、MCP-1、黑色素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)、黑色素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)、黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)、黑色素瘤相关抗原1(MAGE-A1)、间皮素、黏蛋白1、细胞表面相关(MUC1)、MUC-2、黏蛋白CanAg、髓鞘相关糖蛋白、肌肉生长抑制素、N-乙酰葡糖氨基转移酶V(NA17)、NCA-90(粒细胞抗原)、神经生长因子(NGF)、神经凋亡调控蛋白酶1、神经细胞黏附分子(NCAM)、神经突生长抑制剂(例如，NOGO-A、NOGO-B、NOGO-C)、神经纤毛蛋白-1(NRP1)、N-羟乙酰神经氨酸、NKG2D、Notch受体、o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)、嗅觉受体51E2(OR51E2)、癌胚抗原(h5T4)、由断点簇区(BCR)和阿伯森鼠白血病病毒癌基因同源物1(Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)、欧洲兔(Oryctolagus cuniculus)、OX-40、oxLDL、p53突变体、配对盒蛋白Pax-3(PAX3)、配对盒蛋白Pax-5(PAX5)、泛连接蛋白3(PANX3)、磷酸钠协同转运蛋白、磷脂酰丝氨酸、胎盘特异性1(PLAC1)、血小板衍生的生长因子受体α(PDGF-Rα)、血小板衍生的生长因子受体β(PDGFR-β)、聚唾液酸、前顶体素结合蛋白sp32(OY-TES1)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)、前列腺酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖凝集素8)、T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MelanA或MART1)、P15、P53、PRAME、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、前列腺癌细胞、前列腺特异性蛋白(prostein)、蛋白酶丝氨酸21(Testisin或PRSS21)、蛋白酶体(前体(Prosome)、巨蛋白因子(Macropain))亚基β型9(LMP2)、铜绿假单胞菌、狂犬病病毒糖蛋白、RAGE、Ras同源物家族成员C(RhoC)、核因子κ-B受体激活剂配体(RANKL)、晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、肾遍在蛋白1(RU1)、肾遍在蛋白2(RU2)、呼吸道合胞病毒、Rh血型D抗原、恒河猴因子、肉瘤易位断点、硬化蛋白(SOST)、选择素P、唾液酸路易斯黏附分子(sLe)、精子蛋白17(SPA17)、鞘氨醇-1-磷酸、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原1、2和3(SART1、SART2和SART3)、阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)、金黄色葡萄球菌、STEAP1、存活素(surviving)、多配体蛋白聚糖1(SDC1)+A314、SOX10、生存素(survivin)、存活素-2B、滑膜肉瘤、X断点2(SSX2)、T细胞受体、TCRΓ替代阅读框架蛋白(TARP)、端粒酶、TEM1、腱生蛋白C、TGF-β(例如，TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)、促甲状腺激素受体(TSHR)、组织因子途径抑制剂(TFPI)、Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))、TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)、TNF-α、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRG、转谷氨酰胺酶5(TGS5)、肿瘤抗原CTAA16.88、肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)、肿瘤内皮标志物7相关(TEM7R)、肿瘤蛋白p53(p53)、MUC1的肿瘤特异性糖基化、肿瘤相关钙信号转导蛋白2、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)+A327、TWEAK受体、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP1或糖蛋白75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TYRP2)、尿路斑块蛋白2(UPK2)、血管内皮生长因子(例如，VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PIGF)、血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、波形蛋白、v-myc禽骨髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤衍生同源物(MYCN)、血管性血友病因子(VWF)、维尔姆斯瘤蛋白(WT1)、X抗原家族成员1A(XAGE1)、β-淀粉样蛋白和κ-轻链，以及其变体。
在一些实施方案中，配体结合结构域与选自以下的抗原结合：707-AP、生物素化分子、a-辅肌动蛋白-4、abl-bcr alb-b3(b2a2)、abl-bcr alb-b4(b3a2)、脂肪分化相关蛋白、AFP、AIM-2、膜联蛋白II、ART-4、BAGE、b-连环蛋白、bcr-abl、bcr-abl p190(e1a2)、bcr-ablp210(b2a2)、bcr-abl p210(b3a2)、BING-4、CAG-3、CAIX、CAMEL、半胱天冬酶-8、CD171、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v7/8、CDC27、CDK-4、CEA、CLCA2、Cyp-B、DAM-10、DAM-6、DEK-CAN、EGFRvIII、EGP-2、EGP-40、ELF2、Ep-CAM、EphA2、EphA3、erb-B2、erb-B3、erb-B4、ES-ESO-1a、ETV6/AML、FBP、胎儿乙酰胆碱受体、FGF-5、FN、G250、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、GAGE-8、GD2、GD3、GnT-V、Gp100、gp75、Her-2、HLA-A*0201-R170I、HMW-MAA、HSP70-2 M、HST-2(FGF6)、HST-2/neu、hTERT、iCE、IL-11Rα、IL-13Rα2、KDR、KIAA0205、K-RAS、L1-细胞黏附分子、LAGE-1、LDLR/FUT、Lewis Y、MAGE-1、MAGE-10、MAGE-12、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-B1、MAGE-B2、苹果酸酶(Malic enzyme)、乳腺珠蛋白(Mammaglobin)-A、MART-1/Melan-A、MART-2、MC1R、M-CSF、间皮素、MUC1、MUC16、MUC2、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白(Myosin)、NA88-A、Neo-PAP、NKG2D、NPM/ALK、N-RAS、NY-ESO-1、OA1、OGT、癌胚胎抗原(oncofetal antigen)(h5T4)、OS-9、P多肽、P15、P53、PRAME、PSA、PSCA、PSMA、PTPRK、RAGE、ROR1、RU1、RU2、SART-1、SART-2、SART-3、SOX10、SSX-2、存活素、存活素-2B、SYT/SSX、TAG-72、TEL/AML1、TGFaRII、TGFbRII、TP1、TRAG-3、TRG、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TRP-2-6b、酪氨酸酶、VEGF-R2、WT1、α-叶酸受体以及κ-轻链。在一些实施方案中，配体结合结构域与肿瘤相关抗原结合。
在一些实施方案中，靶多核苷酸编码细胞因子。细胞因子的非限制性实例包括4-1BBL、激活蛋白βA、激活蛋白βB、激活蛋白βC、激活蛋白βE、artemin(ARTN)、BAFF/BLyS/TNFSF138、BMP10、BMP15、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、骨形态发生蛋白1(BMP1)、CCL1/TCA3、CCL11、CCL12/MCP-5、CCL13/MCP-4、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17/TARC、CCL18、CCL19、CCL2/MCP-1、CCL20、CCL21、CCL22/MDC、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL3L3、CCL4、CCL4L1/LAG-1、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CD153/CD30L/TNFSF8、CD40L/CD154/TNFSF5、CD40LG、CD70、CD70/CD27L/TNFSF7、CLCF1、c-MPL/CD110/TPOR、CNTF、CX3CL1、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、CXCL2/MIP-2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7/Ppbp、CXCL9、EDA-A1、FAM19A1、FAM19A2、FAM19A3、FAM19A4、FAM19A5、Fas配体/FASLG/CD95L/CD178、GDF10、GDF11、GDF15、GDF2、GDF3、GDF4、GDF5、GDF6、GDF7、GDF8、GDF9、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、生长分化因子1(GDF1)、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA2、IFNA4、IFNA5/IFNaG、IFNA7、IFNA8、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNZ、IFNω/IFNW1、IL11、IL18、IL18BP、IL1A、IL1B、IL1F10、IL1F3/IL1RA、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9、IL1RL2、IL31、IL33、IL6、IL8/CXCL8、抑制素-A、抑制素-B、瘦素、LIF、LTA/TNFB/TNFSF1、LTB/TNFC、神经营养因子(neurturin)(NRTN)、OSM、OX-40L/TNFSF4/CD252、persephin(PSPN)、RANKL/OPGL/TNFSF11(CD254)、TL1A/TNFSF15、TNFA、TNF-α/TNFA、TNFSF10/TRAIL/APO-2L(CD253)、TNFSF12、TNFSF13、TNFSF14/LIGHT/CD258、XCL1和XCL2。在一些实施方案中，靶基因编码免疫检查点抑制剂。此类免疫检查点抑制剂的非限制性实例包括PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、IDO、KIR和VISTA。在一些实施方案中，靶基因编码T细胞受体(TCR)α、β、γ和/或δ链。
可以将本发明系统引入各种免疫细胞，包括参与免疫应答的任何细胞中。在一些实施方案中，免疫细胞包括粒细胞，例如嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞；肥大细胞；可以发育成巨噬细胞的单核细胞；抗原呈递细胞，例如树突细胞；和淋巴细胞，例如自然杀伤细胞(NK细胞)、B细胞和T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是免疫效应细胞。免疫效应细胞是指可以响应于刺激而执行特定功能的免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是可以诱导细胞死亡的免疫效应细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，该淋巴细胞是NK细胞。在一些实施方案中，该淋巴细胞是T细胞。在一些实施方案中，该T细胞是激活的T细胞。T细胞包括幼稚和记忆细胞(例如中央记忆或TCM、效应记忆或TEM和效应记忆RA或TEMRA)、效应细胞(例如细胞毒性T细胞或CTL或Tc细胞)、辅助细胞(例如Th1、Th2、Th3、Th9、Th7、TFH)、调节细胞(例如Treg和Trl细胞)、自然杀伤性T细胞(NKT细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、淋巴细胞激活的杀伤细胞(LAK)、αβΤ细胞、γδΤ细胞和类似的独特类别的T细胞谱系。T细胞可以分为两大类：CD8+ T细胞和CD4+ T细胞，基于哪种蛋白质存在于细胞表面。表达本发明系统的T细胞可以执行多种功能，包括杀死感染的细胞以及激活或募集其他免疫细胞。CD8+ T细胞被称为细胞毒性T细胞或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。表达本发明系统的CTL可以参与识别和去除病毒感染的细胞和癌细胞。CTL具有专门的区室或颗粒，其中含有导致凋亡(例如，程序性细胞死亡)的细胞毒素。CD4+ T细胞可被细分为四个子集——Th1、Th2、Th17和Treg，其中“Th”是指“T辅助细胞”，但是也可以存在其他子集。Th1细胞可以协调针对细胞内微生物(尤其是细菌)的免疫应答。它们可以产生并分泌能够警告并激活其他免疫细胞(例如吞噬细菌的巨噬细胞)的分子。Th2细胞通过警告B细胞、粒细胞和肥大细胞来参与协调针对细胞外病原体如蠕虫(寄生性蠕虫)的免疫应答。Th17细胞可以产生白介素17(IL-17)，这是一种激活免疫和非免疫细胞的信号分子。Th17细胞对于募集嗜中性粒细胞至关重要。
多种细胞可以用作宿主细胞以实现本公开的系统和方法。可以应用(例如，转导)本文公开的任何实施方案(例如，包含或表达γδTCR复合物的细胞)的宿主细胞包括广泛多种细胞类型。宿主细胞可以在体外。宿主细胞可以在体内。宿主细胞可以是离体的。宿主细胞可以是分离的细胞。宿主细胞可以是生物体内部的细胞。宿主细胞可以是生物体。宿主细胞可以是细胞培养物中的细胞。宿主细胞可以是细胞集合中的一个。宿主细胞可以是哺乳动物细胞或衍生自哺乳动物细胞。宿主细胞可以是啮齿动物细胞或衍生自啮齿动物细胞。宿主细胞可以是人细胞或衍生自人细胞。宿主细胞可以是原核细胞或衍生自原核细胞。宿主细胞可以是细菌细胞或可以衍生自细菌细胞。宿主细胞可以是古细菌细胞或衍生自古细菌细胞。宿主细胞可以是真核细胞或衍生自真核细胞。宿主细胞可以是多能干细胞。宿主细胞可以是植物细胞或衍生自植物细胞。宿主细胞可以是动物细胞或衍生自动物细胞。宿主细胞可以是无脊椎动物细胞或衍生自无脊椎动物细胞。宿主细胞可以是脊椎动物细胞或衍生自脊椎动物细胞。宿主细胞可以是微生物细胞或衍生自微生物细胞。宿主细胞可以是真菌细胞或衍生自真菌细胞。宿主细胞可以来自特定的器官或组织。
如本公开中上文所述，宿主细胞可以是免疫细胞。
宿主细胞可以是干细胞或祖细胞。宿主细胞可以包括干细胞(例如，成体干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干(iPS)细胞)和祖细胞(例如，心脏祖细胞、神经祖细胞等)。宿主细胞可以包括哺乳动物干细胞和祖细胞，包括啮齿动物干细胞、啮齿动物祖细胞、人干细胞、人祖细胞等。克隆细胞可以包括细胞的后代。宿主细胞可以处于活生物体中。宿主细胞可以是遗传修饰的细胞。
宿主细胞可以是全能干细胞，然而，在本公开的一些实施方案中，可使用术语“细胞”但可不指代全能干细胞。宿主细胞可以是植物细胞，但在本公开的一些实施方案中，可使用术语“细胞”但可不指代植物细胞。宿主细胞可以是多能细胞。例如，宿主细胞可以是可以分化为造血细胞谱系中的其他细胞但不能分化为任何其他非造血细胞的多能造血细胞。宿主细胞可以能够发育成完整生物体。宿主细胞可以能够或可以不能发育成完整生物体。宿主细胞可以是完整生物体。
细胞的一种或多种内在信号传导通路(例如NFkB)中的多种可用于本文提供的实施方案。表1提供了示例性信号传导通路和与信号传导通路相关的基因。在本文提供的实施方案中，通过刺激物与细胞(例如，免疫细胞、干细胞等)结合和/或配体与跨膜受体结合激活的信号传导通路可以是表1提供的那些中的任一种。在一个实例中，在所提供的实施方案中，在刺激物与跨膜受体的刺激物结合结构域结合时被激活以驱动GMP表达的启动子可以包括驱动表1中提供的任何基因的启动子序列、启动子序列的任何变体，或任何部分启动子序列(例如，最小启动子序列)。
表1
Figure BDA0003930168760000741
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Figure BDA0003930168760000761
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治疗用途
本公开的系统和组合物可用于多种应用。例如，本公开的系统和方法可用于调控基因表达和/或细胞活性的方法中。在一个方面，本文公开的系统和组合物用于调控免疫细胞中的基因表达和/或细胞活性的方法中。使用主题系统调控的免疫细胞可用于多种应用，包括但不限于用于治疗疾病和病症的免疫疗法。可以使用本公开的经修饰的免疫细胞治疗的疾病和病症包括炎性病况、癌症和传染病。在一些实施方案中，使用免疫疗法治疗癌症。
使用本公开的系统和方法可以杀死多种靶细胞。可以应用该方法的靶细胞包括多种细胞类型。靶细胞可以是体外的。靶细胞可以是体内的。靶细胞可以是离体的。靶细胞可以是分离的细胞。靶细胞可以是生物体内的细胞。靶细胞可以是生物体。靶细胞可以是细胞培养中的细胞。靶细胞可以是细胞集合之一。靶细胞可以是哺乳动物细胞或衍生自哺乳动物细胞。靶细胞可以是啮齿动物细胞或衍生自啮齿动物细胞。靶细胞可以是人细胞或衍生自人细胞。靶细胞可以是原核细胞或衍生自原核细胞。靶细胞可以是细菌细胞或可以衍生自细菌细胞。靶细胞可以是古菌细胞或衍生自古菌细胞。靶细胞可以是真核细胞或衍生自真核细胞。靶细胞可以是多能干细胞。靶细胞可以是植物细胞或衍生自植物细胞。靶细胞可以是动物细胞或衍生自动物细胞。细胞可以是无脊椎动物细胞或衍生自无脊椎动物细胞。靶细胞可以是脊椎动物细胞或衍生自脊椎动物细胞。靶细胞可以是微生物细胞或衍生自微生物细胞。靶细胞可以是真菌细胞或衍生自真菌细胞。靶细胞可以来自特定器官或组织。
靶细胞可以是干细胞或祖细胞。靶细胞可包括干细胞(例如，成年干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干(iPS)细胞)和祖细胞(例如，心脏祖细胞、神经祖细胞等)。靶细胞可包括哺乳动物干细胞和祖细胞，包括啮齿动物干细胞、啮齿动物祖细胞、人干细胞、人祖细胞等。克隆细胞可包括细胞的子代。靶细胞可包括靶核酸。细胞可以在活生物体内。靶细胞可以是基因修饰的细胞。靶细胞可以是宿主细胞。
靶细胞可以是全能干细胞，但是，在本公开的一些实施方案中，可以使用术语“细胞”，但是可以不指全能干细胞。靶细胞可以是植物细胞，但是在本公开的一些实施方案中，可以使用术语“细胞”，但是可以不指植物细胞。靶细胞可以是多能细胞。例如，靶细胞可以是多能造血细胞，其可以分化为造血细胞谱系中的其他细胞，但是可能无法分化为其他任何非造血细胞。靶细胞可以能够发育成整个生物。靶细胞可能发育成完整的生物或可能无法发育成完整的生物。靶细胞可以是整个生物。
靶细胞可以是原代细胞。例如，原代细胞的培养物可以传代0次、1次、2次、4次、5次、10次、15次或更多次。细胞可以是单细胞生物。细胞可以在培养物中生长。
靶细胞可以是病变细胞。病变细胞可以具有改变的代谢、基因表达和/或形态学特征。病变细胞可以是癌细胞、糖尿病细胞和凋亡细胞。病变细胞可以是来自患病对象的细胞。示例性的疾病可包括血液病症、癌症、代谢紊乱、眼部病症、器官病症、肌肉骨骼病症、心脏病等。
如果靶细胞是原代细胞，则可以通过任何方法从个体收获它们。例如，白细胞可以通过单采血液成分术、白细胞单采术、密度梯度分离等来收获。来自组织如皮肤、肌肉、骨髓、脾、肝、胰腺、肺、肠、胃等的细胞可以通过活检来收获。可以使用适当的溶液来分散或悬浮收获的细胞。这样的溶液通常可以是平衡盐溶液(例如，生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Hank平衡盐溶液等)，其方便地补充有胎牛血清或其他天然存在的因子，并且与可接受的低浓度缓冲液结合。缓冲液可包括HEPES、磷酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液等。细胞可以立即使用，或者可以储存(例如，冷冻)。冷冻的细胞可以解冻，并且可以能够重复使用。可以将细胞冷冻在DMSO、血清、培养基缓冲液(例如，10％DMSO、50％血清、40％缓冲的培养基)和/或用于在冷冻温度下保存细胞的一些其他此类常见溶液中。
可以是靶细胞的细胞的非限制性实例包括但不限于淋巴样细胞，如B细胞、T细胞(细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、调节T细胞、T辅助细胞)、自然杀伤细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞(参见例如US20080241194)；髓样细胞，如粒细胞(嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞/多叶核嗜中性粒细胞)、单核细胞/巨噬细胞、红细胞(网织红细胞)、肥大细胞、血小板/巨核细胞、树突细胞；来自内分泌系统的细胞，包括甲状腺(甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞)、甲状旁腺(甲状旁腺主细胞、嗜酸性细胞)、肾上腺(嗜铬细胞)、松果体(松果体细胞)的细胞；神经系统的细胞，包括神经胶质细胞(星形胶质细胞、小胶质细胞)、大细胞神经分泌细胞、星状细胞、Boettcher细胞和垂体细胞(促性腺激素细胞、促肾上腺皮质素细胞、促甲状腺素细胞、生长激素细胞、催乳激素细胞)；呼吸系统的细胞，包括肺细胞(I型肺细胞、II型肺细胞)、克拉拉细胞、杯状细胞、尘细胞；循环系统的细胞，包括心肌细胞、周细胞；消化系统的细胞，包括胃(胃主细胞、壁细胞)、杯状细胞、帕内特细胞、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、S细胞；肠内分泌细胞，包括肠嗜铬细胞、APUD细胞、肝脏(肝细胞、库普弗细胞)、软骨/骨/肌肉；骨细胞，包括成骨细胞、骨细胞、破骨细胞、牙齿(成牙骨质细胞、成釉质细胞)；软骨细胞，包括成软骨细胞、软骨细胞；皮肤细胞，包括毛囊细胞、角质形成细胞、黑素细胞(痣细胞)；肌肉细胞，包括肌细胞；泌尿系统细胞，包括足细胞、肾小球旁细胞、肾小球内系膜细胞/肾小球外系膜细胞、肾近端肾小管刷状缘细胞、致密斑细胞；生殖系统细胞，包括精子、塞托利细胞、莱迪希细胞、卵子；以及其他细胞，包括脂肪细胞、成纤维细胞、腱细胞、表皮角质形成细胞(进行分化的表皮细胞)、表皮基底细胞(干细胞)、指甲和脚趾甲的角质形成细胞、甲床基底细胞(干细胞)、髓质毛干细胞、皮质毛干细胞、表皮毛干细胞、表皮毛根鞘细胞、赫胥黎层的毛根鞘细胞、亨勒层的毛根鞘细胞、外毛根鞘细胞、毛基质细胞(干细胞)、湿分层屏障上皮细胞、角膜、舌、口腔、食管、肛管、远侧尿道和阴道的复层鳞状上皮的表面上皮细胞、角膜、舌、口腔、食管、肛管、尿道和阴道的上皮的基底细胞(干细胞)、尿道上皮细胞(内衬在膀胱和尿道内)、外分泌分泌上皮细胞、唾液腺粘液细胞(富含多糖的分泌)、唾液腺浆液细胞(富含糖蛋白酶的分泌)、舌中的Von Ebner腺细胞(洗涤味蕾)、乳腺细胞(乳汁分泌)、泪腺细胞(泪液分泌)、耳中的耵聍腺细胞(蜡分泌)、外泌汗腺暗细胞(糖蛋白分泌)、外泌汗腺透明细胞(小分子分泌)、顶泌汗腺细胞(有气味的分泌，对性激素敏感)、眼睑的莫尔氏腺细胞(特化的汗腺)、皮脂腺细胞(富含脂质的皮脂分泌)、鼻的鲍曼氏腺细胞(洗涤嗅上皮)、十二指肠的布伦纳腺细胞(酶和碱性粘液)、精囊细胞(分泌精液组分，用于游动精子的果糖)、前列腺细胞(分泌精液组分)、尿道球腺细胞(粘液分泌)、巴多林腺细胞(阴道润滑剂分泌物)、利特雷腺细胞(粘液分泌物)、子宫内膜细胞(碳水化合物分泌)、呼吸道和消化道的分离杯状细胞(粘液分泌)、胃内衬粘液细胞(粘液分泌)、胃腺产酶细胞(胃蛋白酶原分泌)、胃腺泌酸细胞(盐酸分泌)、胰腺腺泡细胞(碳酸氢盐和消化酶分泌)、小肠的帕内特细胞(溶菌酶分泌)、肺的II型肺细胞(表面活性剂分泌)、肺的克拉拉细胞、激素分泌细胞、垂体前叶细胞、生长激素细胞、垂体催乳素细胞、促甲状腺素细胞、促性腺激素细胞、促肾上腺皮质素细胞、中间垂体细胞、大细胞神经分泌细胞、肠和呼吸道细胞、甲状腺细胞、甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞、甲状旁腺细胞、甲状旁腺主细胞、嗜酸性细胞、肾上腺细胞、嗜铬细胞、睾丸莱迪希细胞、卵泡的卵泡膜内层细胞、破裂卵泡的黄体细胞、颗粒黄体细胞、膜黄体细胞、肾小球旁细胞(肾素分泌)、肾脏致密斑细胞、代谢和贮藏细胞、屏障功能细胞(肺、肠、外分泌腺和泌尿生殖道)、肾脏、I型肺细胞(肺部内衬的气室)、胰腺导管细胞(泡心细胞)、非复层导管细胞(属于汗腺、唾液腺、乳腺等)、导管细胞(属于精囊、前列腺等)、封闭内部体腔内衬的上皮细胞、具有推进功能的纤毛细胞、细胞外基质分泌细胞、收缩细胞；骨骼肌细胞、干细胞、心肌细胞、血液和免疫系统细胞、红细胞(红血球)、巨核细胞(血小板前体)、单核细胞、结缔组织巨噬细胞(各种类型)、表皮朗格汉斯细胞、破骨细胞(骨中)、树突细胞(淋巴组织中)、小胶质细胞(中枢神经系统中)、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助T细胞、抑制T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、网织红细胞、血液和免疫系统的干细胞和定型祖细胞(各种类型)、多能干细胞、全能干细胞、诱导多能干细胞、成年干细胞、感觉传感器细胞、自主神经元细胞、感觉器官和周围神经元支持细胞、中枢神经系统神经元和神经胶质细胞、晶状体细胞、色素细胞、黑素细胞、视网膜色素上皮细胞、生殖细胞、卵原细胞/卵母细胞、精子细胞、精母细胞、精原细胞(精母细胞的干细胞)、精子、抚育细胞、卵泡细胞、塞托利细胞(睾丸中)、胸腺上皮细胞、间质细胞和肾间质细胞。
特别感兴趣的是癌细胞。在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。癌细胞的非限制性实例包括癌症的细胞，所述癌症包括棘皮瘤、腺泡细胞癌、听神经瘤、肢端着色斑性黑素瘤、顶端螺旋瘤、急性嗜酸细胞白血病、急性淋巴母细胞性白血病、急性巨核母细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、成熟的急性成髓细胞白血病、急性髓样树突细胞白血病、急性髓样白血病、急性早幼粒细胞性白血病、釉质瘤、腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、牙源性腺瘤样瘤、肾上腺皮质癌、成人T细胞白血病、侵袭性NK-细胞白血病、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、软组织腺泡状肉瘤、成釉细胞纤维瘤、肛门癌、间变性大细胞淋巴瘤、甲状腺未分化癌、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、血管肌脂瘤、血管肉瘤、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型性畸胎样横纹肌样瘤、基底细胞癌、基底细胞样癌、B-细胞白血病、B-细胞淋巴瘤、Bellini管癌、胆道癌、膀胱癌、母细胞瘤、骨癌、骨瘤、脑干胶质瘤、脑瘤、乳腺癌、Brenner瘤、支气管瘤、细支气管肺泡癌、棕色瘤、伯基特淋巴瘤、原发灶不明的癌症、类癌瘤、癌、原位癌、阴茎癌、原发灶不明癌、癌肉瘤、Castleman病、中枢神经系统胚胎瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、宫颈癌、胆管细胞癌、软骨瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、绒毛膜癌、脉络丛乳头状瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性单核细胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、慢性嗜中性粒细胞白血病、明细胞肿瘤、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、Degos病、隆凸性皮肤纤维肉瘤、皮样囊肿、结缔组织增生性小圆细胞瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胚胎发育不良神经上皮瘤、胚胎癌、内胚窦瘤、子宫内膜癌、子宫内膜子宫癌、子宫内膜样肿瘤、肠病相关的T细胞淋巴瘤、室管膜母细胞瘤、室管膜瘤、上皮样肉瘤、红白血病、食管癌、鼻腔神经胶质瘤、尤因家族肿瘤、尤因家族肉瘤、尤因肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、非乳腺性佩吉特病、输卵管癌、胎中胎、纤维瘤、纤维肉瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡性甲状腺癌、胆囊癌、胆囊癌、神经节胶质瘤、神经节瘤、胃癌、胃淋巴瘤、胃肠癌、胃肠类癌瘤、胃肠间质瘤、胃肠间质瘤、生殖细胞肿瘤、生殖细胞瘤、妊娠性绒毛膜癌、妊娠滋养细胞瘤、骨巨细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、胶质瘤、大脑胶质瘤病、血管球瘤、胰高血糖素瘤、成性腺细胞瘤、粒层细胞瘤、毛细胞白血病、毛细胞白血病、头颈癌、头颈癌、心脏癌、血管母细胞瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、恶性血液肿瘤、肝细胞癌、肝脾T细胞淋巴瘤、遗传性乳腺癌-卵巢癌综合征、霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑胶质瘤、炎性乳腺癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞瘤、幼年型粒单核细胞白血病、卡波西肉瘤、卡波西肉瘤、肾癌、Klatskin瘤、Krukenberg瘤、喉癌、喉癌、恶性雀斑样痣黑素瘤、白血病、白血病、唇癌和口腔癌、脂肪肉瘤、肺癌、黄体瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴上皮瘤、淋巴样白血病、淋巴瘤、巨球蛋白血症、恶性纤维组织细胞瘤、恶性纤维组织细胞瘤、骨恶性纤维组织细胞瘤、恶性胶质瘤、恶性间皮瘤、恶性外周神经鞘瘤、恶性棒状瘤、恶性特里顿瘤、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、肥大细胞淋巴瘤、纵膈生殖细胞瘤、纵隔肿瘤、甲状腺髓样癌、髓母细胞瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、黑素瘤、黑素瘤、脑膜瘤、Merkel细胞癌、间皮瘤、间皮瘤、原发灶隐匿转移性鳞状颈癌、转移性尿路上皮癌、混合Mullerian瘤、单核细胞性白血病、口腔癌、粘液瘤、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿病、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常疾病、骨髓增生异常综合征、髓样白血病、髓样肉瘤、骨髓增生性疾病、粘液瘤、鼻腔癌、鼻咽癌症、鼻咽癌、赘生物、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤、神经瘤、结节型黑素瘤、非霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、眼肿瘤学、少突星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、嗜酸粒细胞腺瘤、视神经鞘脑膜瘤、口癌、口癌、口咽癌、骨肉瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、乳腺Paget病、Pancoast瘤、胰腺癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻窦癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、血管周上皮样细胞瘤、咽癌、嗜铬细胞瘤、中度分化的松果体实质瘤、成松果体细胞瘤、垂体细胞瘤、垂体腺瘤、垂体瘤、浆细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、多胚瘤、前体T成淋巴细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、原发性肝细胞癌、原发性肝癌、原发性腹膜癌、原始神经外胚层瘤、前列腺癌、腹膜假粘液瘤、直肠癌、肾细胞癌、涉及染色体15上NUT基因的呼吸道癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌瘤、横纹肌肉瘤、Richter转化、骶尾部畸胎瘤、唾腺癌、肉瘤、施万鞘瘤神经鞘瘤病、皮脂腺癌、继发性肿瘤、精原细胞瘤、浆液性肿瘤、塞莱细胞瘤、性索间质瘤、Sezary综合征、Signet细胞癌、皮肤癌、小蓝圆细胞瘤、小细胞癌、小细胞肺癌、小细胞淋巴瘤、小肠癌、软组织肉瘤、生长抑素瘤、煤烟疣、脊髓瘤、脊髓肿瘤、脾边缘区淋巴瘤、鳞状细胞癌、胃癌、表浅扩散性黑素瘤、幕上原始神经外胚层瘤、表面上皮-间质瘤、滑膜肉瘤、T细胞急性淋巴母细胞性白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、T细胞白血病、T细胞淋巴瘤、T细胞幼淋巴细胞白血病、畸胎瘤、晚期淋巴癌、睾丸癌、泡膜细胞瘤、喉癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、移行细胞癌、脐尿管癌、尿道癌、泌尿生殖系统肿瘤、子宫肉瘤、葡萄膜黑素瘤、阴道癌、Verner Morrison综合征、疣状癌、视通路胶质瘤、外阴癌、Waldenstrom巨球蛋白血症、Warthin瘤、Wilms瘤以及它们的组合。在一些实施方案中，靶向的癌细胞代表癌细胞群体内的亚群，如癌症干细胞。在一些实施方案中，所述癌症是造血谱系的癌症，如淋巴瘤。所述抗原可以是肿瘤相关抗原。
在一些实施方案中，靶细胞形成肿瘤。用本文的方法治疗的肿瘤可导致肿瘤生长变稳定(例如，一个或多个肿瘤的大小增加不超过1％、5％、10％、15％或20％，并且/或者不转移)。在一些实施方案中，肿瘤稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或更多周。在一些实施方案中，肿瘤稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更多个月。在一些实施方案中，肿瘤稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年。在一些实施方案中，肿瘤的大小或肿瘤细胞的数目减少至少约5％、10％、15％、20％、25、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一些实施方案中，肿瘤被完全消除，或减少到低于检测水平。在一些实施方案中，对象在治疗后保持无肿瘤(例如处于缓解期)至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或更多周。在一些实施方案中，对象在治疗后保持无肿瘤至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更多个月。在一些实施方案中，对象在治疗后保持无肿瘤至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年。
靶细胞的死亡可以通过任何合适的方法来确定，包括但不限于在处理之前和之后对细胞进行计数，或者测量与活细胞或死细胞(例如活靶细胞或死靶细胞)相关的标志物的水平。细胞死亡的程度可以通过任何合适的方法来确定。在一些实施方案中，相对于起始条件确定细胞死亡的程度。例如，个体可以具有靶细胞的已知起始量，如已知大小的起始细胞团或以已知浓度循环靶细胞。在这样的情况下，细胞死亡的程度可以被表示为处理后存活细胞与起始细胞群体的比例。在一些实施方案中，可以通过合适的细胞死亡测定确定细胞死亡的程度。多种细胞死亡测定是可获得的，并且可以利用多种检测方法。检测方法的实例包括但不限于使用细胞染色、显微镜检查、流式细胞术、细胞分选及其组合。
当在治疗期结束后对肿瘤进行手术切除时，可以通过测量切除的坏死组织(即死亡组织)的百分比来确定在减小肿瘤大小方面的治疗效果。在一些实施方案中，如果切除的组织的坏死百分比大于约20％(例如，至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)，则治疗是治疗有效的。在一些实施方案中，切除的组织的坏死百分比为100％，即，不存在或检测不到活的肿瘤组织。
将靶细胞暴露于本文公开的免疫细胞或免疫细胞群体可以在体外或体内进行。将靶细胞暴露于免疫细胞或免疫细胞群体通常是指使靶细胞与免疫细胞接触和/或足够接近，以使靶细胞的抗原(例如，膜结合的或非膜结合的)可以与在免疫细胞中表达的嵌合跨膜受体多肽的配体相互作用域结合。通过将靶细胞和免疫细胞共培养，可以在体外将靶细胞暴露于免疫细胞或免疫细胞群体。靶细胞和免疫细胞可以共培养，例如，作为贴壁细胞或悬浮培养。靶细胞和免疫细胞可以在各种合适类型的细胞培养基中共培养，例如含有补充剂、生长因子、离子等。在一些情况下，可以通过将免疫细胞施用于对象(例如人类对象)并允许免疫细胞经由循环系统定位于靶细胞，而实现在体内将靶细胞暴露于免疫细胞或免疫细胞群体。在一些情况下，例如通过直接注射，可以将免疫细胞递送至靶细胞所定位的直接区域。
暴露可以进行任何合适的时间长度，例如至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时、至少4小时、至少5小时、至少6小时、至少7小时、至少8小时、至少12小时、至少16小时、至少20小时、至少24小时、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少1个月或更长时间。
在一些实施方案中，表达本文提供的系统的细胞在体外细胞死亡测定中诱导靶细胞的死亡。与不表达本公开的系统的对照细胞相比，表达本文提供的系统的细胞可表现出增强的诱导靶细胞死亡的能力。在一些情况下，诱导靶细胞死亡的增强的能力至少是诱导的细胞死亡的1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、5倍、10倍、100倍或1000倍增加。可以在任何合适的时间点确定诱导的细胞死亡的程度，例如，在细胞与靶细胞接触后至少4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、24小时、36小时、48小时或52小时。
在一些实施方案中，靶多核苷酸可包括一个或多个疾病相关的基因和多核苷酸，以及与信号传导生化途径相关的基因和多核苷酸。靶多核苷酸的实例包括信号传导生化途径相关的序列，例如，信号传导生化途径相关的基因或多核苷酸。靶多核苷酸的实例包括疾病相关的基因或多核苷酸。“疾病相关的”基因或多核苷酸是指与非疾病对照的组织或细胞相比，在衍生自受疾病影响的组织的细胞中以异常水平或异常形式产生转录或翻译产物的任何基因或多核苷酸。在一些实施方案中，其为变得以异常高水平表达的基因。在一些实施方案中，其为变得以异常低水平表达的基因。改变的表达可以与疾病的发生和/或进展相关。疾病相关的基因还指具有突变或遗传变异的基因，其对疾病的病因负有直接责任或与对疾病的病因有反应的基因连锁不平衡。转录或翻译的产物可能是已知的或未知的，并且可处于正常或异常水平。
疾病相关基因和多核苷酸的实例可获自约翰·霍普金斯大学(Johns HopkinsUniversity)(马里兰州巴尔的摩(Baltimore,Md.))的麦库西克·内森遗传医学研究所(McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine)和美国国家医学图书馆(NationalLibrary of Medicine)(马里兰州贝塞斯达(Bethesda,Md.))的国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)，可在万维网上获得。表2和3中提供了与某些疾病和病症相关的示例性基因。
这些基因和途径中的突变可导致产生影响功能的不适当的蛋白质或不适当量的蛋白质。
可与本公开的方法和组合物一起使用的启动子包括例如在真核细胞、哺乳动物细胞、非人哺乳动物细胞或人细胞中有活性的启动子。启动子可以是诱导型或组成型活性启动子。可替代地或附加地，启动子可以是组织或细胞特异性的。启动子可以是天然启动子或复合启动子。
合适的真核启动子(即在真核细胞中具有功能的启动子)的非限制性实例可以包括来自以下的那些：巨细胞病毒(CMV)立即早期、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的长末端重复(LTR)、人延伸因子1启动子(EF1)、泛素B启动子(UB)、包含与鸡β-活性启动子(CAG)融合的巨细胞病毒(CMV)增强子的杂交构建体、鼠干细胞病毒启动子(MSCV)、磷酸甘油酸激酶1基因座启动子(PGK)以及小鼠金属硫蛋白I。启动子可以是细胞、组织或肿瘤特异性的，诸如CD45启动子、AFP启动子、人白蛋白启动子(Alb)、MUC1启动子、COX2启动子、SP-B启动子、OG-2启动子。启动子可以是真菌启动子。启动子可以是植物启动子。可以找到植物启动子的数据库(例如，PlantProm)。表达载体还可包含用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体还可包括用于扩大表达的适当序列。表达载体的启动子的另一个实例可包括骨髓增殖性肉瘤病毒增强子、阴性对照区域缺失的、dl587rev引物结合位点取代的(MND)启动子。用于驱动RNA的启动子可以包括RNA Pol III启动子(例如，U6或H1)、Pol II启动子和/或tRNA(val)启动子。
表2
Figure BDA0003930168760000961
Figure BDA0003930168760000971
表3
Figure BDA0003930168760000972
Figure BDA0003930168760000981
Figure BDA0003930168760000991
Figure BDA0003930168760001001
本公开的系统和组合物可用于其他种类的应用。例如，本公开的系统和方法可用于在组织(例如，器官)生长、修复、再生、再生医学和/或工程化期间调节对细胞增殖、分化、转分化和/或去分化至关重要的基因表达和/或细胞活性的方法中。组织的实例包括上皮、结缔组织、神经、肌肉、器官和其他组织。其他示例性组织包括动脉、韧带、皮肤、肌腱、肾脏、神经、肝脏、胰腺、膀胱、骨骼、肺、血管、心脏瓣膜、软骨、眼睛等。
实施例
通过以下非限制性实施例进一步阐述本公开的各个方面。实施例1：由第一嵌合多肽和第二嵌合多肽形成受体的信号传导复合物。
图1A-1B示意性地示出受体(或受体复合物)的信号传导复合物的形成。图1A示出跨越膜102的跨膜受体多肽101。跨膜受体多肽包含具有配体结合结构域104的细胞外区域103和细胞内区域105。图1B示出配体106与配体结合结构域104结合以诱导受体的信号传导复合物的形成。信号传导复合物包含第一嵌合多肽107和第二嵌合多肽108。第一嵌合多肽107包含基因调节多肽(GMP)109，所述基因调节多肽包含能够调控靶基因的表达和/或活性或编辑细胞中的核酸序列的致动部分110。致动部分110连接至切割识别位点111。切割识别位点111的侧翼是第一衔接子部分112和致动部分110。第二嵌合多肽108包含与第二衔接子部分114连接的切割部分113。切割部分113可与第二衔接子部分114复合，或例如通过肽键和/或肽接头连接至第二衔接子部分114。切割部分113能够切割GMP 109的切割识别位点111。响应于配体106与配体结合结构域104的结合，跨膜受体多肽101在细胞内区域105中被修饰。在受体修饰(例如，磷酸化)之后，第一嵌合多肽107和第二嵌合多肽108可彼此结合115或彼此接近115，从而足以诱导切割部分113的作用，以从第一衔接子部分112切割并释放致动部分110。在释放时，致动部分110可以易位(例如，进入细胞核)以调控靶基因的表达和/或活性或编辑核酸序列。
图2A-2F示意性地示出跨膜受体多肽的信号传导复合物的各种构型。图2A示出信号传导复合物，其中第一嵌合多肽207和第二嵌合多肽208与跨越膜102的跨膜受体多肽101的细胞内区域105相互作用。跨膜受体多肽101包含具有配体结合结构域104的细胞外区域103和细胞内区域105。跨膜受体多肽101包含第一细胞内结构域215和第二细胞内结构域216。在配体106与配体结合结构域104结合时，跨膜受体多肽101在细胞内区域105中被修饰。在受体修饰(例如，磷酸化)之后，第一嵌合多肽207和第二嵌合多肽208彼此接近，从而形成信号传导复合物。
参考图2A，第一嵌合多肽207包含基因调节多肽(GMP)209，所述基因调节多肽包含能够调控靶基因的表达和/或活性或编辑细胞中的核酸序列的致动部分210。致动部分210连接至切割识别位点211。切割识别位点211的侧翼是第一衔接子部分212和致动部分210。第一衔接子部分212直接结合至第一细胞内结构域215。第二嵌合多肽208包含与第二衔接子部分214连接的切割部分213。第二衔接子部分214直接结合至第二细胞内结构域216。切割部分213可与第二衔接子部分214复合，或例如通过肽键和/或肽接头而连接至第二衔接子部分214。切割部分213能够切割GMP 209的切割识别位点211，从而释放致动部分210，所述致动部分进入细胞核以调控靶基因的表达和/或活性或者编辑核酸序列。
图2B示出信号传导复合物，其中第一嵌合多肽207和第二嵌合多肽208与跨越膜102的跨膜受体多肽101的细胞内区域105相互作用。跨膜受体多肽101包含具有配体结合结构域104的细胞外区域103和细胞内区域105。跨膜受体多肽101包含第一细胞内结构域215和第二细胞内结构域216。在配体106与配体结合结构域104结合时，跨膜受体多肽101在细胞内区域105中被修饰。在受体修饰(例如，磷酸化)之后，第一嵌合多肽207和第二嵌合多肽208彼此结合，从而形成信号传导复合物。
参考图2B，第一嵌合多肽207包含基因调节多肽(GMP)209，所述基因调节多肽包含能够调控靶基因的表达和/或活性或编辑细胞中的核酸序列的致动部分210。致动部分210连接至切割识别位点211。切割识别位点211的侧翼是第一衔接子部分212和致动部分210。第一衔接子部分212直接结合至第二细胞内结构域216。第二嵌合多肽208包含与第二衔接子部分214连接的切割部分213。第二衔接子部分214直接结合至第一衔接子部分212。第二衔接子部分214不直接结合至第二细胞内结构域216或细胞内区域105。切割部分213可与第二衔接子部分214复合，或例如通过肽键和/或肽接头连接至第二衔接子部分214。切割部分213能够切割GMP 209的切割识别位点211，从而释放致动部分210，所述致动部分进入细胞核以调控靶基因的表达和/或活性或者编辑核酸序列。
图2C示出信号传导复合物，其中第一嵌合多肽207、第二嵌合多肽208和第一信号传导部分217与跨越膜102的跨膜受体多肽101的细胞内区域105相互作用。跨膜受体多肽101包含具有配体结合结构域104的细胞外区域103和细胞内区域105。跨膜受体多肽101包含第一细胞内结构域215和第二细胞内结构域216。在配体106与配体结合结构域104结合时，跨膜受体多肽101在细胞内区域105中被修饰。在受体修饰(例如磷酸化)之后，第一信号传导部分217结合至细胞内区域105的第二细胞内结构域216，所述第一信号传导部分217还结合至第一嵌合多肽207，所述第一嵌合多肽结合至第二嵌合多肽208，从而形成信号传导复合物。
参考图2C，第一嵌合多肽207包含基因调节多肽(GMP)209，所述基因调节多肽包含能够调控靶基因的表达和/或活性或编辑细胞中的核酸序列的致动部分210。致动部分210连接至切割识别位点211。切割识别位点211的侧翼是第一衔接子部分212和致动部分210。第一衔接子部分212直接结合至第一信号传导部分217，所述第一信号传导部分直接结合至第二细胞内结构域216。第二嵌合多肽208包含与第二衔接子部分214连接的切割部分213。第二衔接子部分214直接结合至第一衔接子部分212。切割部分213可与第二衔接子部分214复合，或例如通过肽键和/或肽接头而连接至第二衔接子部分214。切割部分213能够切割GMP 209的切割识别位点211，从而释放致动部分210，所述致动部分进入细胞核以调控靶基因的表达和/或活性或者编辑核酸序列。
图2D示出信号传导复合物，其中第一嵌合多肽207和第二嵌合多肽208在跨越膜102的跨膜受体多肽101的信号传导期间彼此相互作用。跨膜受体多肽101包含具有配体结合结构域104的细胞外区域103和细胞内区域105。跨膜受体多肽101包含第一细胞内结构域215和第二细胞内结构域216。在配体106与配体结合结构域104结合时，跨膜受体多肽101在细胞内区域105中被修饰。在受体修饰(例如，磷酸化)之后，一个或多个细胞内信号传导级联被激活，在此期间，第一嵌合多肽207和第二嵌合多肽208彼此相互作用，从而形成信号传导复合物。
参考图2D，第一嵌合多肽207包含基因调节多肽(GMP)209，所述基因调节多肽包含能够调控靶基因的表达和/或活性或编辑细胞中的核酸序列的致动部分210。致动部分210连接至切割识别位点211。切割识别位点211的侧翼是第一衔接子部分212和致动部分210。第一衔接子部分212能够被激活以成为或结合受体的第一下游信号传导部分。第二嵌合多肽208包含与第二衔接子部分214连接的切割部分213。切割部分213可与第二衔接子部分214复合，或例如通过肽键和/或肽接头而连接至第二衔接子部分214。第二衔接子部分214能够被激活以结合第一衔接子部分212。在配体106与配体结合结构域104结合时，第一嵌合多肽207和第二嵌合多肽208不与受体直接接触，而是在跨膜受体多肽101的信号传导下游彼此缔合。切割部分213能够切割GMP 209的切割识别位点211，从而释放致动部分210，所述致动部分进入细胞核以调控靶基因的表达和/或活性或者编辑核酸序列。
图2E示出信号传导复合物，其中第一嵌合多肽207和第二嵌合多肽208在跨越膜102的跨膜受体多肽101的信号传导期间彼此相互作用。跨膜受体多肽101包含具有配体结合结构域104的细胞外区域103和细胞内区域105。跨膜受体多肽101包含第一细胞内结构域215和第二细胞内结构域216。在配体106与配体结合结构域104结合时，跨膜受体多肽101在细胞内区域105中被修饰。在受体修饰(例如，磷酸化)之后，第一嵌合多肽207和第二嵌合多肽208彼此结合，从而形成信号传导复合物。
参考图2E，第一嵌合多肽207包含基因调节多肽(GMP)209，所述基因调节多肽包含能够调控靶基因的表达和/或活性或编辑细胞中的核酸序列的致动部分210。致动部分210连接至切割识别位点211。切割识别位点211的侧翼是第一衔接子部分212和致动部分210。第二嵌合多肽208包含与第二衔接子部分214连接的切割部分213。切割部分213可与第二衔接子部分214复合，或例如通过肽键和/或肽接头而连接至第二衔接子部分214。第二衔接子部分214能够被激活以结合第一衔接子部分212。第一衔接子部分212和第二衔接子部分214是不同的部分。在配体106与配体结合结构域104结合时，可使用至少一个信号传导级联引发细胞应答，所述信号传导级联涉及另外的蛋白质，诸如直接与第二细胞内结构域216结合的第一信号传导部分217以及直接与第一信号传导部分217结合的第二信号传导部分218。信号传导级联可涉及第三信号传导部分219，其募集第一嵌合多肽207和第二嵌合多肽208以使它们在跨膜受体多肽101的信号传导下游彼此缔合。切割部分213能够切割GMP 209的切割识别位点211，从而释放致动部分210，所述致动部分进入细胞核以调控靶基因的表达和/或活性或者编辑核酸序列。
图2F示出信号传导复合物，其中第一嵌合多肽207和第二嵌合多肽208在跨越膜102的跨膜受体多肽101的信号传导期间彼此相互作用。跨膜受体多肽101包含具有配体结合结构域104的细胞外区域103和细胞内区域105。跨膜受体多肽101包含第一细胞内结构域215和第二细胞内结构域216。在配体106与配体结合结构域104结合时，跨膜受体多肽101在细胞内区域105中被修饰。在受体修饰(例如，磷酸化)之后，第一嵌合多肽207和第二嵌合多肽208彼此结合，从而形成信号传导复合物。
参考图2F，第一嵌合多肽207包含基因调节多肽(GMP)209，所述基因调节多肽包含能够调控靶基因的表达和/或活性或编辑细胞中的核酸序列的致动部分210。致动部分210连接至切割识别位点211。切割识别位点211的侧翼是第一衔接子部分212和致动部分210。第二嵌合多肽208包含与第二衔接子部分214连接的切割部分213。切割部分213可与第二衔接子部分214复合，或例如通过肽键和/或肽接头而连接至第二衔接子部分214。第二衔接子部分214能够被激活以结合第一衔接子部分212。第一衔接子部分212和第二衔接子部分214是相同的部分。在配体106与配体结合结构域104结合时，可使用至少一个信号传导级联引发细胞应答，所述信号传导级联涉及另外的蛋白质，诸如直接与第二细胞内结构域216结合的第一信号传导部分217以及直接与第一信号传导部分217结合的第二信号传导部分218。信号传导级联可涉及第三信号传导部分219，其募集第一嵌合多肽207和第二嵌合多肽208以使它们在跨膜受体多肽101的信号传导下游彼此缔合。切割部分213能够切割GMP 209的切割识别位点211，从而释放致动部分210，所述致动部分进入细胞核以调控靶基因的表达和/或活性或者编辑核酸序列。
实施例2：使用慢病毒由第一嵌合多肽和第二嵌合多肽形成内源性受体的信号传导复合物。
图3A-3C示意性地示出在细胞的内源性受体(例如，T细胞的内源性T细胞受体(TCR))信号传导时形成复合物(例如，直接复合、间接复合)的第一嵌合多肽和第二嵌合多肽的各种实施方案。例如，嵌合多肽包含在内源性受体激活时(例如，在抗原与内源性受体结合时)被募集至内源性受体(例如，内源性受体的细胞内部分)或朝向所述内源性受体募集的衔接子多肽的至少一部分。第一嵌合多肽和第二嵌合多肽可以包含相同的衔接子多肽或不同的衔接子多肽。第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的一个包含含有致动部分的基因调节多肽(GMP)，而第一嵌合多肽和第二嵌合多肽中的另一个包含在第一嵌合多肽和第二嵌合多肽复合时能够从GMP释放致动部分的切割部分。在一些情况下，在不存在这种复合的情况下，致动部分可能不促进对细胞内靶基因的调控(例如，达到可检测的水平)。在一些情况下，第一嵌合多肽和/或第二嵌合多肽可以是细胞内多肽。可替代地或附加地，第一嵌合多肽和/或第二嵌合多肽可以是膜结合多肽并且可以在内源性受体激活时被募集至内源性受体或朝向所述内源性受体募集。
参考图3A，细胞是T细胞并且内源性受体是TCR。第一嵌合多肽包含与任选地可操作地偶联于报道蛋白(例如，截短的大鼠神经生长因子受体(tNGFR))的烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶切割部分偶联的T细胞受体相关蛋白激酶70(ZAP70)的ζ链。第二嵌合多肽包含与任选地可操作地偶联于报道蛋白(例如，Q8)的Cas酶或其修饰物(例如，dCas-KRAB)偶联的T细胞激活接头(LAT)。在TCR激活时，第一嵌合多肽与TCR的细胞内部分结合，并且第二嵌合多肽与第一嵌合多肽结合(例如，通过ZAP70与LAT之间的结合)，以促进TEV从第二嵌合多肽中释放致动部分。
参考图3B，细胞是T细胞并且内源性受体是TCR。第一嵌合多肽包含与任选地可操作地偶联于报道蛋白(例如，截短的大鼠神经生长因子受体(tNGFR))的烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶切割部分偶联的生长因子受体结合蛋白2(GRB2)。第二嵌合多肽包含与任选地可操作地偶联于报道蛋白(例如，Q8)的Cas酶或其修饰物(例如，dCas-KRAB)偶联的T细胞激活接头(LAT)。在TCR激活时，TCR的衔接子蛋白与TCR的细胞内部分结合，并且第二嵌合多肽通过衔接子蛋白与LAT之间的结合而被募集朝向TCR。此外，第二嵌合多肽通过LAT与GRB2之间的结合而募集第一嵌合多肽，以促进TEV从第二嵌合多肽中释放致动部分。
参考图3C，细胞是T细胞并且内源性受体是TCR。第一嵌合多肽包含与任选地可操作地偶联于报道蛋白(例如，截短的大鼠神经生长因子受体(tNGFR))的烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶切割部分偶联的T细胞激活接头(LAT)。第二嵌合多肽包含与任选地可操作地偶联于报道蛋白(例如，Q8)的Cas酶或其修饰物(例如，dCas-KRAB)偶联的T细胞激活接头(LAT)。在TCR激活时，TCR的衔接子蛋白与TCR的细胞内部分结合，并且衔接子蛋白(1)通过衔接子蛋白与LAT之间的结合而募集第一嵌合多肽并且(2)通过衔接子蛋白与LAT之间的结合而募集第二嵌合多肽，以促进TEV从第二嵌合多肽中释放致动部分。
图4示意性示出编码本文公开的嵌合多肽中的任一种(例如，第一嵌合多肽或第二嵌合多肽)的表达盒(例如，病毒构建体，诸如慢病毒构建体)。例如，第一慢病毒构建体可以是编码EF1a-LAT-tcs-dCas9-KRAB-P2A-Q8的LV#1构建体。在另一个实例中，第二慢病毒构建体可以是编码mU6-PD1 gRNA/EF1a-衔接子-TEV-P2A-tNGFR的LV#2构建体。在一个不同实例中，第三慢病毒构建体可以是编码EF1a-衔接子-TEV-P2A-tNGFR而不编码任何sgRNA的LV#3构建体。
如图5所示，在第0天通过TCR(例如，OKT3/CD28)的抗原激活人原代T细胞。然后，在第1天，用如图4所示的第一慢病毒构建体(编码LAT-tcs-dCas9-KRAB-P2A-Q8(“Ldck”))转导人原代T细胞。然后，在第2天，用如图4所示的第二慢病毒构建体(编码PD1gRNA(“PD1sg”)和Zap70-TEV-P2A-tNGFR(“Zap70”))或第三慢病毒构建体(编码Zap70-TEV-P2A-tNGFR，但不编码sgRNA(“NOsg”))转导人原代T细胞。参考图5A，对于PD1sg和NOsg组两者，在第5天和第6天通过流式细胞术分析工程化的人原代T细胞的Q8和tNGFR表达水平，以将人原代T细胞计算机分选为下组：Zap70+(Ldck+Zap70+和仅Zap70+的组合)、Ldck+Zap70+、仅Zap70+、仅Ldck+，或双阴性(-/-)人原代T细胞。计算机分选是基于细胞中Q8和tNGFR的预确定的阈值表达水平。参考图5B，在第5天测量工程化的人原代T细胞的PD1表达水平(例如，通过流式细胞术)，并针对计算机分选组中的每一个绘图，以比较NOsg条件与PD1sg条件之间的差异。在这种情况下，人原代T细胞在第0天后未被TCR受体激活。在第0天的单次激活时，与其他对照细胞相比，包含Ldck构建体和Zap70构建体二者的工程化的人原代T细胞在NOsg条件与PD1sg条件之间表现出PD1表达水平的最大降低(例如，降低约40％)(或表达PD1的细胞比例的最大降低)。不受理论的束缚，可延长细胞在第0天的初始激活以促进TCR的持续激活，从而促进嵌合多肽的复合，以促进dCas9-KRAB致动部分的激活。
如图6所示，对如上文在图5中所述的工程化的人原代T细胞进行培养，直到第10天。然后，通过TCR(例如，OKT3/CD28)的激活剂再激活工程化的人原代T细胞，持续3天。随后，测量计算机分选的Zap70+(Ldck+Zap70+和仅Zap70+的组合)、Ldck+Zap70+、仅Zap70+、仅Ldck+或双阴性(-/-)人原代T细胞群中的PD1表达水平(例如，通过流式细胞术)并作图，以比较NOsg条件与PD1sg条件之间的差异。在细胞再激活时，与其他对照细胞相比，包含Ldck构建体和Zap70构建体二者的工程化的人原代T细胞在NOsg条件与PD1sg条件之间表现出PD1表达水平的最大降低(例如，降低约38％)(或表达PD1的细胞比例的最大降低)。
实施例3：使用γ-逆转录病毒由第一嵌合多肽和第二嵌合多肽形成内源性受体的信号传导复合物。
在第0天通过TCR激活剂(例如OKT3/CD28)激活人原代T细胞(供体1或供体2，如图所示)，然后转导一种或多种γ-逆转录病毒，每种病毒编码LAT.dCas9KRAB.Q8(“Ldck”)、Zap70.TEV.tNGFR/PD1sg、Zap70.TEV.tNGFR/Ctrlsg、Grb2.TEV.tNGFR/PD1sg或Grb2.TEV.tNGFR/Ctrlsg。PD1sg表示针对PD1基因的sgRNA。Ctrlsg表示不是针对PD1基因设计的对照sgRNA。在第6天，通过细胞分选仪分离和富集Q8+tNGFR+人原代T细胞的双阳性群。将分选的细胞进一步扩增，直到第14天，然后通过致动剂或TCR(例如，OKT3/CD28)再激活T细胞3天。随后，测量细胞中的PD1表达并作图，以比较NOsg条件与PD1sg条件之间的差异(图7A和7B)。
参考图7A，在来自供体1的Q8+tNGFR+双阳性人原代T细胞的扩增和再激活之后，进一步将细胞计算机分选为下组：Zap70+(Ldck+Zap70+和仅Zap70+的组合)、Ldck+Zap70+、仅Zap70+、仅Ldck+，或双阴性(-/-)人原代T细胞，然后对每组中PD1阳性细胞的比例绘图，从而比较NOsg条件与PD1sg条件之间的差异。在细胞扩增和再激活时，与其他对照细胞相比，表现出Ldck构建体和Zap70构建体二者的最高表达水平的工程化的人原代T细胞(“Ldck+Zap70+”)在NOsg条件与PD1sg条件之间表现出PD1表达水平的最大降低(例如，降低约23％)(或表达PD1的细胞比例的最大降低)。例如，在细胞扩增和再激活时，表现出相似的Ldck构建体表达水平和较低的Zap70构建体表达水平的工程化的人原代T细胞(“仅Ldck+”)在NOsg条件与PD1sg条件之间未表现出PD1表达水平(或表达PD1的细胞的比例)的任何降低。在另一个实例中，在细胞扩增和再激活时，表现出相似的Zap70构建体表达水平和较低的Ldck构建体表达水平的工程化的人原代T细胞(“仅Zap+”)在NOsg条件与PD1sg条件之间表现出PD1表达水平(或表达PD1的细胞比例)的仅约12％的降低。
参考图7A，对于供体2，计算机分选的所有组在NOsg条件与PD1sg条件之间均表现出PD1表达水平(或表达PD1的细胞比例)的降低。所有细胞均来自Q8+tNGFR+人原代T细胞的双阳性群。因此，不受理论的束缚，即使根据Zap70和Ldck构建体的相对表达水平将细胞计算机分选为不同的组，所有组中的细胞也可能都表达足够水平的Zap70构建体和Ldck构建体二者以在PD1sg存在的情况下引起PD1表达降低。
参考图7B，在来自供体1的Q8+tNGFR+双阳性人原代T细胞的扩增和再激活之后，进一步将细胞计算机分选为下组：Grb2+(Ldck+Grb2+和仅Grb2+的组合)、Ldck+Grb2+、仅Grb2+、仅Ldck+，或双阴性(-/-)人原代T细胞，然后对每组中PD1阳性细胞的比例绘图，从而比较NOsg条件与PD1sg条件之间的差异。在细胞扩增和再激活时，与其他对照细胞相比，表现出Ldck构建体和Grb2构建体二者的最高表达水平的工程化的人原代T细胞(“Ldck+Grb2+”)在NOsg条件与PD1sg条件之间表现出PD1表达水平的最大降低(例如，降低约22％)(或表达PD1的细胞比例的最大降低)。例如，在细胞扩增和再激活时，表现出相似的Grb2构建体表达水平和较低的Ldck构建体表达水平的工程化的人原代T细胞(“仅Grb2+”)在NOsg条件与PD1sg条件之间未表现出PD1表达水平(或表达PD1的细胞的比例)的任何降低。在另一个实例中，在细胞扩增和再激活时，表现出相似的Ldck构建体表达水平和较低的Grb2构建体表达水平的工程化的人原代T细胞(“仅Ldck+”)在NOsg条件与PD1sg条件之间表现出PD1表达水平(或表达PD1的细胞比例)的仅约7％的降低。
参考图7B，对于供体2，计算机分选的所有组在NOsg条件与PD1sg条件之间均表现出PD1表达水平(或表达PD1的细胞比例)的降低。所有细胞均来自Q8+tNGFR+人原代T细胞的双阳性群。因此，不受理论的束缚，即使根据Grb2和Ldck构建体的相对表达水平将细胞计算机分选为不同的组，所有组中的细胞也可能都表达水平足够水平的Grb2构建体和Ldck构建体二者以在PD1sg存在的情况下引起PD1表达降低。
尽管本文已示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员来说将显而易见，此类实施方案仅作为实例提供。本发明旨在不受本说明书中提供的具体实例的限制。尽管已经参考上述说明书描述了本发明，但本文中对实施方案的描述和说明不意在以限制性意义解释。本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换而不脱离本发明。此外，应当理解，本发明的所有方面均不限于本文所述的具体描述、构造或相对比例，其取决于各种条件和变量。应当理解，可在实践本发明时采用在本文中描述的本发明的实施方案的各种替代方案。因此，考虑到本发明还应涵盖任何此类替代方案、修改、变化形式或等同物。以下权利要求旨在限定本发明的范围并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (52)

1.一种调控细胞中靶多核苷酸的表达的方法，包括：
(a)使系统在所述细胞中表达，其中所述细胞包含受体，所述受体具有对配体具有特异性的配体结合结构域；以及
(b)使所述细胞与特异性结合所述配体结合结构域的所述配体接触，
其中在所述细胞中表达的所述系统包含：
在所述接触步骤(b)时能够被激活的第一嵌合多肽和第二嵌合多肽，其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽中的一个包含基因调节多肽(GMP)，所述基因调节多肽包含与切割识别位点连接的致动部分，所述致动部分能够调控所述细胞中所述靶多核苷酸的所述表达，并且其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽中的另一个包含能够切割所述GMP的所述切割识别位点的切割部分，
其中，在所述细胞与特异性结合所述受体的所述配体结合结构域的所述配体接触时，所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽被激活，使得所述切割部分切割所述切割识别位点并从所述GMP释放所述致动部分，从而调控所述细胞中所述靶多核苷酸的所述表达，并且
其中所述受体是所述细胞的内源性受体。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一嵌合多肽包含第一衔接子部分，所述第一衔接子部分能够被激活以结合所述内源性受体的第一细胞内结构域。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述第二嵌合多肽包含第二衔接子部分，所述第二衔接子部分能够被激活以结合(i)所述内源性受体的第二细胞内结构域，(ii)所述第一衔接子部分，或(iii)所述内源性受体的下游信号传导部分。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述第一嵌合多肽包含第一衔接子部分，所述第一衔接子部分能够被激活以结合所述内源性受体的第一下游信号传导部分。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述第二嵌合多肽包含第二衔接子部分，所述第二衔接子部分能够被激活以结合(i)所述第一衔接子部分，(ii)所述第一下游信号传导部分，或(iii)所述内源性受体的第二下游信号传导部分。
6.一种调控细胞中靶多核苷酸的表达的方法，包括：
(a)使系统在所述细胞中表达，其中所述细胞包含受体，所述受体具有对配体具有特异性的配体结合结构域；以及
(b)使所述细胞与特异性结合所述配体结合结构域的所述配体接触，
其中在所述细胞中表达的所述系统包含：
在所述接触步骤(b)时能够被激活的第一嵌合多肽和第二嵌合多肽，其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽中的一个包含基因调节多肽(GMP)，所述基因调节多肽包含与切割识别位点连接的致动部分，所述致动部分能够调控所述细胞中所述靶多核苷酸的所述表达，并且其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽中的另一个包含能够切割所述GMP的所述切割识别位点的切割部分，
其中，在所述细胞与特异性结合所述受体的所述配体结合结构域的所述配体接触时，所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽被激活，使得所述切割部分切割所述切割识别位点并从所述GMP释放所述致动部分，从而调控所述细胞中所述靶多核苷酸的所述表达，并且
其中所述第一嵌合多肽或所述第二嵌合多肽不能直接结合所述受体。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述第一嵌合多肽包含第一衔接子部分，所述第一衔接子部分能够被激活以结合所述受体的细胞内结构域，并且其中所述第二嵌合多肽不能直接结合所述受体。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述第二嵌合多肽包含第二衔接子部分，所述第二衔接子部分能够被激活以结合(i)所述第一衔接子部分或(ii)能够被激活以结合所述第一衔接子部分的所述受体的下游信号传导部分。
9.如权利要求6所述的方法，其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽不能直接结合所述受体。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述第一嵌合多肽包含第一衔接子部分，所述第一衔接子部分能够被激活以结合所述受体的下游信号传导部分，并且其中所述第二嵌合多肽包含第二衔接子部分，所述第二衔接子部分能够被激活以结合(i)所述第一衔接子部分，(ii)所述下游信号传导部分，或(iii)所述受体的不同下游信号传导部分。
11.如权利要求6-10中任一项所述的方法，其中所述受体是内源性受体。
12.如权利要求6-10中任一项所述的方法，其中所述受体是异源性受体。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述异源性受体是嵌合抗原受体。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述第一嵌合多肽包含所述GMP，并且其中所述第二嵌合多肽包含所述切割部分。
15.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述第二嵌合多肽包含所述GMP，并且其中所述第一嵌合多肽包含所述切割部分。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽在所述接触步骤(b)时能够被激活以形成所述受体的信号传导复合物。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽不结合所述配体。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受体是跨膜受体或细胞内受体。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述受体包括T细胞受体(TCR)的至少一部分。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述TCR包括TCR的共同受体，包括CD3、CD4或CD8。
21.如权利要求19-20中任一项所述的方法，其中所述受体的细胞内结构域包含至少一个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。
22.如权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述第一衔接子部分或所述第二衔接子部分包括LCK、FYN、ZAP-70、LAT、SLP76、ITK、PLC-γ、VAV1、NCK、GADS、GRB2、PI3K、其片段，或它们的组合。
23.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述受体包括NKG2D的至少一部分。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述第一衔接子部分或所述第二衔接子部分包括DAP10、DAP12、PI3K、GRB2、VAV1、SYK、ZAP-70、其片段，或它们的组合。
25.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述受体包括选自以下的Toll样受体(TLR)的至少一部分：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述第一衔接子部分或所述第二衔接子部分包括MyD88、Tube、Pelle、TIRAP、TRIF、TRAM、IRAK1、TRAK4、TRAF6、TAK1、TBK1、RIPK1、PI3K、IKK、其片段，或它们的组合。
27.一种用于调控细胞中靶多核苷酸的表达的系统，包含：
第一嵌合多肽和第二嵌合多肽，其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽中的一个包含基因调节多肽(GMP)，所述基因调节多肽包含与切割识别位点连接的致动部分，所述致动部分能够调控所述细胞中所述靶多核苷酸的所述表达，并且其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽中的另一个包含能够切割所述GMP的所述切割识别位点的切割部分，
其中所述细胞包含受体，所述受体具有对配体具有特异性的配体结合结构域，其中在所述细胞与特异性结合所述内源性受体的所述配体结合结构域的所述配体接触时，所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽能够被激活，
其中，在所述细胞与所述配体接触时，所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽被激活，使得所述切割部分切割所述切割识别位点并从所述GMP释放所述致动部分，从而调控所述细胞中所述靶多核苷酸的所述表达，
其中所述受体是所述细胞的内源性受体。
28.如权利要求27所述的系统，其中所述第一嵌合多肽包含第一衔接子部分，所述第一衔接子部分能够被激活以结合所述内源性受体的第一细胞内结构域。
29.如权利要求28所述的系统，其中所述第二嵌合多肽包含第二衔接子部分，所述第二衔接子部分能够被激活以结合(i)所述内源性受体的第二细胞内结构域，(ii)所述第一衔接子部分，或(iii)所述内源性受体的下游信号传导部分。
30.如权利要求27所述的系统，其中所述第一嵌合多肽包含第一衔接子部分，所述第一衔接子部分能够被激活以结合所述内源性受体的第一下游信号传导部分。
31.如权利要求30所述的系统，其中所述第二嵌合多肽包含第二衔接子部分，所述第二衔接子部分能够被激活以结合(i)所述第一衔接子部分，(ii)所述第一下游信号传导部分，或(iii)所述内源性受体的第二下游信号传导部分。
32.一种用于调控细胞中靶多核苷酸的表达的系统，包含：
第一嵌合多肽和第二嵌合多肽，其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽中的一个包含基因调节多肽(GMP)，所述基因调节多肽包含与切割识别位点连接的致动部分，所述致动部分能够调控所述细胞中所述靶多核苷酸的所述表达，并且其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽中的另一个包含能够切割所述GMP的所述切割识别位点的切割部分，
其中所述细胞包含受体，所述受体具有对配体具有特异性的配体结合结构域，其中在所述细胞与特异性结合所述受体的所述配体结合结构域的所述配体接触时，所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽能够被激活，
其中，在所述细胞与所述配体接触时，所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽被激活，使得所述切割部分切割所述切割识别位点并从所述GMP释放所述致动部分，从而调控所述细胞中所述靶多核苷酸的所述表达，并且
其中所述第一嵌合多肽或所述第二嵌合多肽不能直接结合所述受体。
33.如权利要求32所述的系统，其中所述第一嵌合多肽包含第一衔接子部分，所述第一衔接子部分能够被激活以结合所述受体的细胞内结构域，并且其中所述第二嵌合多肽不能直接结合所述受体。
34.如权利要求33所述的系统，其中所述第二嵌合多肽包含第二衔接子部分，所述第二衔接子部分能够被激活以结合(i)所述第一衔接子部分或(ii)能够被激活以结合所述第一衔接子部分的所述受体的下游信号传导部分。
35.如权利要求32所述的系统，其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽不能直接结合所述受体。
36.如权利要求35所述的系统，其中所述第一嵌合多肽包含第一衔接子部分，所述第一衔接子部分能够被激活以结合所述受体的下游信号传导部分，并且其中所述第二嵌合多肽包含第二衔接子部分，所述第二衔接子部分能够被激活以结合(i)所述第一衔接子部分，(ii)所述下游信号传导部分，或(iii)所述受体的不同下游信号传导部分。
37.如权利要求32-36中任一项所述的系统，其中所述受体是内源性受体。
38.如权利要求32-36中任一项所述的系统，其中所述受体是异源性受体。
39.如权利要求38所述的系统，其中所述异源性受体是嵌合抗原受体。
40.如权利要求27-39中任一项所述的系统，其中所述第一嵌合多肽包含所述GMP，并且其中所述第二嵌合多肽包含所述切割部分。
41.如权利要求27-39中任一项所述的系统，其中所述第二嵌合多肽包含所述GMP，并且其中所述第一嵌合多肽包含所述切割部分。
42.如权利要求27-41中任一项所述的系统，其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽在所述接触时能够被激活以形成所述受体的信号传导复合物。
43.如权利要求27-42中任一项所述的系统，其中所述第一嵌合多肽和所述第二嵌合多肽不结合所述配体。
44.如权利要求27-43中任一项所述的系统，其中所述受体是跨膜受体或细胞内受体。
45.如权利要求27-44中任一项所述的系统，其中所述受体包括T细胞受体(TCR)的至少一部分。
46.如权利要求45所述的系统，其中所述TCR包括TCR的共同受体，包括CD3、CD4或CD8。
47.如权利要求45-46中任一项所述的系统，其中所述受体的细胞内结构域包含至少一个免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。
48.如权利要求45-47中任一项所述的系统，其中所述第一衔接子部分或所述第二衔接子部分包括LCK、FYN、ZAP-70、LAT、SLP76、ITK、PLC-γ、VAV1、NCK、GADS、GRB2、PI3K、其片段，或它们的组合。
49.如权利要求27-44中任一项所述的系统，其中所述受体包括NKG2D的至少一部分。
50.如权利要求49所述的系统，其中所述第一衔接子部分或所述第二衔接子部分包括DAP10、DAP12、PI3K、GRB2、VAV1、SYK、ZAP-70、其片段，或它们的组合。
51.如权利要求27-44中任一项所述的系统，其中所述受体包括选自以下的Toll样受体(TLR)的至少一部分：TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TLR12和TLR13。
52.如权利要求51所述的系统，其中所述第一衔接子部分或所述第二衔接子部分包括MyD88、Tube、Pelle、TIRAP、TRIF、TRAM、IRAK1、TRAK4、TRAF6、TAK1、TBK1、RIPK1、PI3K、IKK、其片段，或它们的组合。
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