CN105112391A - 一种人源精氨酸酶突变体及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种人源精氨酸酶突变体及其制备方法和用途。本发明提供一种人源精氨酸酶突变体,所述人源精氨酸酶突变体选自:与SEQ?ID?NO:1?具有80%以上同源性的多肽;或,包含与SEQ?ID?NO:1?具有80%以上同源性的多肽和用于延长半衰期的载体蛋白部分的融合蛋白。本发明所提供的人源精氨酸酶突变体与天然的人源Arginase相比,在生理条件下具有活性更高、更稳定的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种人源精氨酸酶突变体及其制备方法和用途,所述人源精氨酸酶突变体与天然的人源Arginase相比,在生理条件下具有活性更高、更稳定的优点。
背景技术
研究发现,许多肿瘤细胞存在一种或多种氨基酸合成障碍的情况,因而必须依赖血清中的氨基酸补给才能存活。这些对肿瘤细胞生存必须的氨基酸系统性消除会使这些恶性肿瘤细胞凋亡,同时对正常细胞几乎不产生任何副作用。酶介导的细胞外氨基酸清除机制成为一种新颖的癌症或其他疾病的治疗方法逐渐被人所熟悉。氨基酸缺失应用的最早例子是天冬酰胺酶,它能分解细胞生长和细胞生命维持所需的天冬酰胺。在许多白血病患者中,白血病细胞与正常细胞不同,它们自身不能合成天冬酰胺,必须依靠外界提供的天冬酰胺来维持生存。天冬酰胺酶的治疗耗尽体内肿瘤细胞所需的游离天冬酰胺,从而导致肿瘤细胞死亡,而正常细胞不会受到太大影响。同时在癌症治疗方面,氨基酸缺失相比其他途径具有更好的优势,因为对于那些血管化程度差或者隐藏在难以触及处的肿瘤组织都能起到很好的作用。因此,与抗体药物不同,酶介导的治疗方法并不依赖于肿瘤穿透。
近年来,氨基酸缺失治疗应用研究的热点主要是L-精氨酸(L-arginine)。绝大部分的肝癌、黑色素瘤、肾癌和前列腺癌组织细胞都不表达琥珀酸精氨酸合成酶(Argininosuccinatesynthase,ASS),因而会对L-arginine缺失敏感。2007年,Cheng等发现许多肝癌细胞鸟氨酸转氨甲酰酶(Ornithinetranscarbamylase)表达缺陷因而必须依赖外源的L-arginine供给。L-arginine缺失对于肝癌、黑色素瘤及其他尿素循环缺陷型癌细胞的选择性毒性已经做过大量的体外实验(包括动物模型和临床研究)。
精氨酸脱亚氨酶(ADI)能催化精氨酸向胍氨酸的转化,可被用来清除精氨酸。J.B.Jones和Takaku分别从恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)和支原体(Mycoplasmaarginini)中分别发现了能水解精氨酸的ADI,然而,这2种ADI毕竟是原核来源,与人的种属差异性极大,进入人体后很容易诱导生成抗体,形成抗原-抗体免疫复合物,从实验动物的血液循环中被快速清除。尽管有人可以将ADI进行PEG修饰,但是PEG-ADI(ADI-PEG20KD)产品的二期临床研究表明,ADI仍然在体内引发严重的中和抗体反应,表明种属差异性引起的免疫原性问题并未得到解决。
近年来,人源的精氨酸水解酶(Arginase)被认为是L-arginine缺陷治疗途径最有希望的产品。人体产生2种Mn2+依赖的Arginase异构体,都能将L-arginine催化水解为尿素和鸟氨酸。I型精氨酸水解酶(Arginase1)基因位于6号染色体上,主要在肝脏的细胞质中表达并且在尿素循环的最终步骤起到脱氮的作用。而II型精氨酸水解酶(Arginase2)基因位于14号染色体,主要在肾、脑和骨骼肌组织的线粒体中表达,为提供多胺和脯氨酸的合成提供L-鸟氨酸。早期临床研究表明,Arginase1对于一些肝癌患者能起到缓解作用。然而,Arginase1的最适pH条件为~9.5,因而在生理条件(pH7.4,血清L-arginine含量~120μM)下,活性并不高,并且KM(2.3mM)很高,与底物L-arginine的亲和力很低,加上稳定性也较差(血清t1/2约为4.8h)。因而,如何能获得一种免疫原性低且活性高的精氨酸水解酶,是目前科学界的一大研究热点。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种人源精氨酸酶突变体及其用途,用于解决现有技术中的问题。本发明所提供的人源精氨酸酶突变体与天然的人源Arginase相比,在生理条件下活性更高、更稳定。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明第一方面提供一种人源精氨酸酶突变体,所述人源精氨酸酶突变体选自:
与SEQIDNO:1具有80%以上同源性的多肽;或,
包含与SEQIDNO:1具有80%以上同源性的多肽和用于延长半衰期的载体蛋白部分的融合蛋白。
优选的,所述人源精氨酸酶突变体选自:
(1)氨基酸序列如SEQIDNo.2、SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示的多肽;
(2)氨基酸序列与SEQIDNo.2、SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示的多肽具有90%以上同源性,且具有SEQIDNo.2、SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示的多肽功能的多肽;
(3)包含(1)和(2)所述的多肽和用于延长半衰期的载体蛋白部分的融合蛋白。
优选的,所述(2)中的多肽具体指,SEQIDNo.2、SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示的多肽经过取代、缺失或者添加一个或多个氨基酸而得到的,且具有SEQIDNo.2、SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示的多肽功能的多肽。
优选的,所述用于延长半衰期的载体蛋白部分选自明胶样单元(GLK),聚乙二醇(PEG),人血清白蛋白(HSA)等中的一种或多种的组合。
更优选的,所述用于延长半衰期的载体蛋白部分的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。
进一步优选的,所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.6、SEQIDNo.7或SEQIDNo.8。
优选的,所述人源精氨酸酶突变体由SEQIDNo.13-18所示的多核苷酸序列编码。
本发明第二方面提供一种分离的多核苷酸,编码所述人源精氨酸酶突变体。
优选的,所述多核苷酸的序列如SEQIDNo.13-18所示。
本发明第三方面提供一种重组表达载体,包含所述多核苷酸。
本发明第四方面提供一种宿主细胞,所述细胞含有所述表达载体或基因组中整合有外源的所述的多核苷酸。
本发明第五方面提供一种人源精氨酸酶突变体的制备方法,包括如下步骤:
1)培养所述宿主细胞,使之表达所述人源精氨酸酶突变体;
2)收集含有所述人源精氨酸酶突变体的培养物;
3)从步骤2所得培养物中分离出所述人源精氨酸酶突变体。
本发明第六方面提供一种组合物,含有所述人源精氨酸酶突变体或所述宿主细胞的培养物,以及药学上可接受的载体。
本发明第七方面提供所述人源精氨酸酶突变体在制备或筛选L-arginine缺陷治疗药物中的用途。
优选的,所述L-arginine缺陷治疗药物具体为尿素循环缺陷型癌症治疗药物。
更优选的,癌症选自肝癌、黑色素瘤中的一种或多种的组合。
附图说明
图1显示为本发明Arg/pPIC9的质粒构建流程示意图。
图2显示为本发明mArg-rGLK1164表达载体示意图。
图3显示为本发明纯化蛋白电泳图,其中1.Arginase1,2.mArg1,3.mArg2,4.mArg3,5.mArg1-rGLK1164,6.mArg2-rGLK1164,7.mArg3-rGLK1164,M:分子量Marker。
图4显示为本发明Arginase1及突变体对L-精氨酸的水解活性示意图。
具体实施方式
除非下文另外定义,本发明所提及的所有技术和科学用语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的意义。
如本文所述,术语“免疫原性”是指能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞的特性。
如本文所述,术语“融合”是指在分子水平上对蛋白质进行改造。即在体外将蛋白质的编码基因通过PCR、酶切、连接等分子生物学手段,将两种或以上的蛋白或多肽片段连接在一起,置于同一启动子下进行表达。
如本文所述,术语“明胶样单元”(GLK)是指具有(Gly-X-Y)n结构的重复单元组成的一段多肽或蛋白,Gly为甘氨酸残基;X和Y分别为20种天然氨基酸除了Cys之外的任意氨基酸残基,且n为20-300。
如本文所述,术语“氨基酸残基”指任何天然或非天然氨基酸残基,尤其是20个天然氨基酸中的氨基酸残基。
如本文所述,术语“半衰期”是指药物从体内消除一半所需的时间,也是血药浓度下降一半所需要的时间,用t1/2表示。
如本文所述,术语“IC50”是指被测量的拮抗剂的半抑制浓度(50%抑制浓度)。在本发明中具体指一定浓度的物质诱导肿瘤细胞凋亡50%,该浓度称为50%抑制浓度,即凋亡细胞与全部细胞数之比等于50%时所对应的浓度。
如本文所述,生物学活性,术语“生物学活性”是指在生物体内或活细胞内具有的某种生理功能。
本发明发明人通过深入研究,发现了一种人源精氨酸酶突变体及其融合蛋白。所述人源精氨酸酶突变体与其融合蛋白与天然的Arginase1相比,不仅在生理条件下能够有效地降解精氨酸,水解精氨酸的效率显著提高,亲和力更高,而且更加地稳定,此外,还对癌细胞有良好的抑制作用,在此基础上完成了本发明。
本发明所提供的人源精氨酸酶突变体为I型人源精氨酸酶(Arginase1)的突变体,所述人源精氨酸酶突变体选自与SEQIDNO:1具有80%以上同源性的多肽或包含与SEQIDNO:1具有80%以上同源性的多肽和用于延长半衰期的载体蛋白部分的融合蛋白。所述人源精氨酸酶突变体优选选自:
(1)氨基酸序列如SEQIDNo.2、SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示的多肽;
(2)氨基酸序列与SEQIDNo.2、SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示的多肽具有90%以上同源性,且具有SEQIDNo.2、SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示的多肽功能的多肽;
(3)包含(1)和(2)所述的多肽和用于延长半衰期的载体蛋白部分的融合蛋白。
在本发明中,所述(2)中的多肽具体指与SEQIDNo.2、SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示的氨基酸序列存在差异,但其依然具有或基本具有SEQIDNo.2、SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示的多肽功能的多肽。具体来说,所述多肽可以是序列如SEQIDNo.2、SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示的多肽经过取代、缺失或者添加一个或多个氨基酸而得到的。
在本发明中,所述(3)中的人源精氨酸水解酶突变体具体指(1)和(2)所述的多肽经低免疫原性或无免疫原性的聚合物修饰或融合,而形成的融合蛋白。本领域技术人员可选择合适的载体蛋白部分,对(1)或(2)中所述的多肽进行修饰或融合,以延长人源精氨酸水解酶突变体在体内的半衰期,从而起到更好的治疗作用。
所述载体蛋白部分可以是天然来源的,如葡聚糖,也可以是人工设计重组表达的蛋白或多肽链,如明胶样单元(gelatin-likeprotein,GLK),也可以是人工合成的化合物,如聚乙二醇(PEG)。具体来说,可使用的用于延长半衰期的载体蛋白部分包括但不限于明胶样单元(GLK),聚乙二醇(PEG),人血清白蛋白(HSA)等中的一种或多种的组合。在本发明的其中一实施例中,所述载体蛋白部分为SEQIDNO:5的融合载体(专利号为200980103870.9中的rGLK1164),构建成mArg-rGLK1164形式的融合蛋白,其具体序列如SEQIDNo.6、SEQIDNo.7或SEQIDNo.8所示。融合后,mArg部分的亲和力及活性并没有明显的下降,动物实验表明,药效相比未融合的天然人源Arginase及mArg效果更优越。
在本发明一优选实施例中,所述人源精氨酸酶突变体由SEQIDNo.13-18所示的多核苷酸序列编码。
本发明还提供一种分离的多核苷酸,编码所述人源精氨酸酶突变体。在本发明一优选实施例中,所述多核苷酸的序列分别为SEQIDNo.13-18所示,分别编码氨基酸序列为SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.6、SEQIDNo.7或SEQIDNo.8的多肽。
本发明还提供一种重组表达载体,包含所述多核苷酸。所述表达载体可选自本领域各种可适用的表达载体,只要不对本发明的发明目的产生限制即可。所述表达载体可为原核表达载体或真核表达载体,优选为真核表达载体。具体可使用的表达载体包括但不限于:pPIC9、pPICZa、pcDNA3.1等。在本发明一优选实施例中,所述表达载体为pPIC9载体。
本发明还提供一种宿主细胞,所述细胞含有所述表达载体或基因组中整合有外源的所述的多核苷酸。所述宿主细胞可选自本领域各种可适用的宿主细胞,只要不对本发明的发明目的产生限制即可。具体可使用的宿主细胞包括但不限于:酵母、大肠杆菌、哺乳动物细胞等,优选的宿主细胞为酵母。在本发明一优选实施例中,所述宿主细胞为甲醇酵母Pichiapastor。
本发明还提供一种人源精氨酸酶突变体的制备方法,包括如下步骤:
1)培养所述宿主细胞,使之表达所述人源精氨酸酶突变体;
2)收集含有所述人源精氨酸酶突变体的培养物;
3)从步骤2所得培养物中分离出所述人源精氨酸酶突变体。
所述人源精氨酸酶突变体的制备方法具体如下:培养转化有能够表达人源精氨酸酶突变体的重组表达质粒的宿主细胞,诱导表达人源精氨酸酶突变体,发酵液离心后去除菌体,分离纯化后即得所述人源精氨酸酶突变体。所述分离纯化的方法可选用本领域各种可使用的纯化方法,只要不对本发明的发明目的产生限制即可。
在本发明一优选实施例中,具体为将编码基因双酶切后与pPIC9连接,获得重组表达质粒,将重组表达质粒转染甲醇酵母PichiapastorGS115(His-),平板划线后取单菌落接种,培养诱导表达以后,使用柱层析进行纯化,即得所述人源精氨酸酶突变体。本发明还提供一种组合物,含有所述人源精氨酸酶突变体或所述宿主细胞的培养物,以及药学上可接受的载体。所述组合物优选包括有效量的所述人源精氨酸酶突变体,本领域技术人员可根据实际用途确定组合物中人源精氨酸酶突变体的有效量。所述载体可选自本领域各种载体,只要不对本发明的发明目的产生限制即可,具体可使用的载体包括但不限于:水、缓冲液等。
本发明还提供所述人源精氨酸酶突变体在制备或筛选L-arginine缺陷治疗药物中的用途。本发明发明人通过细胞学活性实验验证,本发明所提供的人源精氨酸酶突变体(包括mArg1、mArg2、mArg3、mArg1-rGLK1164、mArg2-rGLK1164、mArg3-rGLK1164)对HepG2肝癌细胞的活性具有良好的抑制作用。
本发明中,所述L-arginine缺陷治疗药物具体指通过L-arginine缺失对靶标产生选择性毒性,从而缓解或治疗疾病的药物。在本发明一优选实施例中,所述L-arginine缺陷治疗药物具体为尿素循环缺陷型癌症治疗药物,更具体的,所述癌症选自肝癌。
如上所述,本发明的人源精氨酸酶,具有以下有益效果:
1)本发明所提供的人源精氨酸酶为I型人源精氨酸酶Arginase1的突变体,与天然的Arginase1相比,该Arginase1突变体能在生理条件下有效地降解精氨酸,在pH值为7.2-7.5的范围下,水解精氨酸的效率显著提高,亲和力更高,而且更加地稳定。
2)本发明所提供的人源精氨酸水解酶突变体对肝癌(HCC)细胞(实施例中为HepG2细胞)有良好的抑制作用,与天然的Arginase1相比,IC50明显下降。
3)本发明所提供的人源精氨酸水解酶突变体与天然Arginase1分别注射到小鼠体内,结果表明注射人源精氨酸水解酶突变体的小鼠,血浆中精氨酸浓度明显较低。
4)本发明所提供的人源精氨酸水解酶突变体在融合了GLK后,在体内的半衰期显著延长,降解精氨酸的效果也更明显。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中另外明确指出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明,具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,Secondedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989andThirdedition,2001;Ausubel等,CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,JohnWiley&Sons,NewYork,1987andperiodicupdates;theseriesMETHODSINENZYMOLOGY,AcademicPress,SanDiego;Wolffe,CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION,Thirdedition,AcademicPress,SanDiego,1998;METHODSINENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe,eds.),AcademicPress,SanDiego,1999;和METHODSINMOLECULARBIOLOGY,Vol.119,ChromatinProtocols(P.B.Becker,ed.)HumanaPress,Totowa,1999等。
实施例1
人源Arginase1的表达纯化
天然人源Arginase1基因由人工合成,全长序列如SEQIDNo.12所示,合成时在5'端加入了酵母GS115的α-factor信号肽序列,3'端则带有EcoRI识别位点,全长序列如SEQIDNo.19所示(其中5’端前12位和3’端最后6位为酶切位点),通过亚克隆构建于表达载体pPIC9(Invitrogen)上,构建成重组表达质粒Arg/pPIC9(Arg/pPIC9的质粒构建如图1所示)。以甲醇酵母PichiapastorGS115(His-)为表达宿主菌,通过电转化将线性化的Arg/pPIC9质粒到GS115中。平板放置于30℃培养3天,至单菌落出现(具体参照试剂盒说明书)。将上述转化的重组酵母单菌落接种至10mlBMGY液体培养基中,30℃,250rpm培养24小时后,静置过夜,弃上清,加入10ml含1v/v%甲醇的BMMY液体培养基,30℃,250rpm诱导表达。选取相对表达较高菌株作为表达株。表达株重新在1L的BMGY液体培养基中诱导,发酵液离心去除菌体后,用去离子水稀释至电导小于﹤5ms/cm,然后上样于20mMNaAc水溶液(pH5.0)平衡后的DiamondSPMustang(博格隆(上海)生物技术有限公司),用0.5MNaCl+20mMNaAc水溶液(pH5.0)洗脱,再将洗脱液稀释6倍并调pH到8.5,用SuperQ650M(东曹(上海)生物科技有限公司)在pH8.5条件下吸附,收集50%洗脱的洗脱峰(平衡缓冲液为20mMTris,pH8.5;洗脱缓冲液为20mMTris+0.5MNaCl水溶液(pH8.5)。最后将SuperQ650M柱洗脱的样品加入硫酸铵至终浓度0.5M,然后上样于ButylHPFastFlow(博格隆(上海)生物技术有限公司),平衡缓冲液为10mMNaAc+0.5M硫酸铵水溶液(pH5.0),洗脱缓冲液为10mMNaAc水溶液(pH5.0)。蛋白浓度测定采用Bradford法,验证结果如图3所示。
实施例2
Arginase突变体及mArg-rGLK1164融合蛋白的表达纯化
1.mArg1,mArg2及mArg3表达载体的构建
mArg1,mArg2及mArg3序列(分别为SEQIDNo.13-15所示)通过筛选获得,同样克隆至pPIC9载体上(插入载体的方法与实施例1相同),构建成表达载体mArg1/pPIC9,mArg2/pPIC9和mArg3/pPIC9。
2.mArg-rGLK1164融合蛋白表达载体的构建
以mArg1/pPIC9,mArg2/pPIC9和mArg3/pPIC9为模板,设计引物(SEQIDNO:9和SEQIDNO:10)扩增mArg1,mArg2及mArg3:
5’-GGAGTCCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTATGAGCGCCAAGTCCAGAACCATA-3’(SEQIDNO:9)
5’–GTCAGTGTTCACCGGGTGGACCCTTAGGTGGGTTAAGGTAGT-3’(SEQIDNO:10)
PCR扩增条件为:50μl反应体系中,加入0.5μl模板,25μmol/L的上下游引物各1μl,2mmol/L的dNTP4μl,5×PS缓冲液10μl,PrimeSTARDNA聚合酶2.5U。98℃变性10秒,68℃60秒,25个循环。PCR产物回收后,用XhoI/DraIII双酶切回收,纯化回收后与DraIII/EcoRI双酶切的rGLK1164片段(SEQIDNO:11)及XhoI/EcoRI双酶切的pPIC9连接,构建成mArg1-rGLK1164、mArg2-rGLK1164、mArg3-rGLK1164表达载体(mArg-rGLK1164表达载体的构建如图2所示)。
3.mArg及mArg-rGLK1164表达纯化
mArg1,mArg2、mArg3(表达载体分别为第一部分中所构建的mArg1/pPIC9,mArg2/pPIC9和mArg3/pPIC9表达载体)、mArg1-rGLK1164、mArg2-rGLK1164、mArg3-rGLK1164(表达载体分别为第二部分中所构建的mArg1-rGLK1164、mArg2-rGLK1164、mArg3-rGLK1164表达载体)重组蛋白诱导表达步骤同实施例1(使用甲醇酵母PichiapastorGS115(His-)为表达宿主菌进行表达),mArg1、mArg2和mArg3的纯化同Arginase1。mArg1-rGLK1164、mArg2-rGLK1164、mArg3-rGLK1164发酵液上清离心后用DiamondSPMustang纯化,平衡缓冲液为20mMPB(pH4.0)水溶液,洗脱缓冲液为20mmPB+0.5MNaCL(pH6.0)水溶液,洗脱样品稀释后上样于SuperQ-650M,平衡缓冲液为20mMNaAc(pH5.0)水溶液,洗脱缓冲液为20mmNaAc+0.5MNaAc(pH5.0)水溶液,收集洗脱样品后采用SephadexG25Medium(GEHealthcare)脱盐到20mMPB(pH6.0)缓冲液中,纯化结果如图3所示。与高亲水性的GLK融合后,在SDS-PAGE上的表观分子量(约160Kd)明显高于其理论分子量(75.5Kd)。
实施例3
Arginase活性的检测
1.精氨酸水解反应
精氨酸水解反应方案参考Holowatz等(AmJPhysiolRegulIntegrCompPhysiol.2011Sep;301(3):R763–R768.)并稍作修改:取50ul蛋白样品(1mg/ml),加入到75ul10mMMnCl2,反应缓冲液(0.1mMTris–HClbuffer,pH7.4)中,60℃缓慢振荡反应10分钟后,加入含有0.5ML-arginine水溶液,37℃反应1小时后,加入400ul酸混合物(H2SO4:H3PO4:H2O=1:3:7,v/v/v)终止反应。采用BUN血尿氮试剂盒测定尿素含量,并将测得的尿素含量转化为Arginase活性。PBS为阴性对照。结果如图4所示。三种突变体和其对应的融合蛋白与Arginase1一样,对L-arginine有着明显的降解作用,而且降解活性比Arginase1高,其中mArg2的活性最高。
2.细胞学活性验证
本发明采用细胞增殖抑制的方法检测Arginase的细胞学活性。在96孔板中种入HepG2肝癌细胞(500/孔),DMEM培养基含10%胎牛血清,37℃培养24小时后,细胞孔中加入含不同浓度Arginase1或突变体的新鲜培养基,37℃、5%CO2培养48小时。MTT法测量细胞存活率:每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT)水溶液,继续培养4h。每孔加入150ulDMSO,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在OD490nm处测量各孔的吸光值。如表1所示的结果表明,三种突变体对HepG2细胞都呈现出比野生型更高的抑制活性,其中mArg2的活性是野生型的3.5倍。融合了rGLK1164后,活性并无显著下降。
表1.Arginase1及突变体对HCC细胞系-HepG2肝癌细胞的抑制活性
样品 | IC50(IU/mL) |
Arginase 1 | 0.28 |
mArg1 | 0.18 |
mArg2 | 0.08 |
mArg3 | 0.13 |
mArg1-rGLK1164 | 0.22 |
mArg2-rGLK1164 | 0.10 |
mArg3-rGLK1164 | 0.17 |
实施例4
药效学验证
SPF级3月龄SD大鼠(约250克),每组动物数为6,雌雄对半,参照表2进行分组,注射,尾静脉采集血样于EDTA并与50%三氯乙酸水溶液混合,冰上放置30分钟,13000g离心20分钟沉淀蛋白,取上清用于L-精氨酸含量检测。取100ul上清溶解于与30mM苯二醛(OPA)、50mM巯基乙醇,40mM硼酸钠以及Brij-35(pH9.5)组成的水溶液,上样于BostonGreenODS柱,进行高效液相色谱分析。激发波长跟发射波长分别为340nm和455nm。计算曲线下峰面积并与标准品对照,计算出血清中L-精氨酸的含量。
表2.Arginase1及突变体的药效实验
如表3所示,注射了Arginase1及突变体的小鼠血清都有不同程度的精氨酸水平下降的情况。Arginase1的体内半衰期很短,因此精氨酸降解效率极低(只有微弱的下降)。同样突变体也存在半衰期的问题,但是由于活性比Arginase1高,因此精氨酸下降的水平仍明显。而融合了GLK的mArg2-rGLK1164明显地精氨酸水平大幅下降。
表3注射了Arginase1及突变体的小鼠血清中精氨酸含量测定结果
综上所述,本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (13)
1.一种人源精氨酸酶突变体,所述人源精氨酸酶突变体选自:
与SEQIDNO:1具有80%以上同源性的多肽;或,
包含与SEQIDNO:1具有80%以上同源性的多肽和用于延长半衰期的载体蛋白部分的融合蛋白。
2.如权利要求1所述的一种人源精氨酸酶突变体,其特征在于,所述人源精氨酸酶突变体选自:
(1)氨基酸序列如SEQIDNo.2、SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示的多肽;
(2)氨基酸序列与SEQIDNo.2、SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示的多肽具有90%以上同源性,且具有SEQIDNo.2、SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示的多肽功能的多肽;
(3)包含(1)和(2)所述的多肽和用于延长半衰期的载体蛋白部分的融合蛋白。
3.如权利要求2所述的一种人源精氨酸酶突变体,其特征在于,所述(2)中的多肽具体指,SEQIDNo.2、SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示的多肽经过取代、缺失或者添加一个或多个氨基酸而得到的,且具有SEQIDNo.2、SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示的多肽功能的多肽。
4.如权利要求2所述的一种人源精氨酸酶突变体,其特征在于,所述用于延长半衰期的载体蛋白部分明胶样单元,聚乙二醇,人血清白蛋白中的一种或多种的组合。
5.如权利要求4所述的一种人源精氨酸酶突变体,其特征在于,所述用于延长半衰期的载体蛋白部分的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。
6.如权利要求5所述的一种人源精氨酸酶突变体,其特征在于,所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.6、SEQIDNo.7或SEQIDNo.8。
7.一种分离的多核苷酸,编码如权利要求1-6任一权利要求所述的人源精氨酸酶突变体。
8.如权利要求7所述的一种分离的多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸的序列如SEQIDNo.13-18所示。
9.一种重组表达载体,包含如权利要求7-8任一权利要求所述的多核苷酸。
10.一种宿主细胞,所述细胞含有如权利要求9所述的所述表达载体或基因组中整合有外源的如权利要求7-8任一权利要求所述的多核苷酸。
11.一种人源精氨酸酶突变体的制备方法,包括如下步骤:
1)培养所述宿主细胞,使之表达所述人源精氨酸酶突变体;
2)收集含有所述人源精氨酸酶突变体的培养物;
3)从步骤2所得培养物中分离出所述人源精氨酸酶突变体。
12.一种组合物,含有如权利要求1-6任一权利要求所述的人源精氨酸酶突变体或权利要求10所述的宿主细胞的培养物,以及药学上可接受的载体。
13.如权利要求1-6任一权利要求所述的人源精氨酸酶突变体在制备或筛选L-arginine缺陷治疗药物中的用途,优选为在制备或筛选尿素循环缺陷型癌症治疗药物中的用途,更优选为在制备或筛选肝癌治疗药物中的用途。
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