JP5529065B2 - イムノクロマトキット及び検出装置 - Google Patents
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Description
まず、本発明の実施の形態の具体的説明に先立ち、ニトロセルロースに滴下する前、あるいは遅くとも、検出区域に試料が到達するまでに、比較的大きな植物組織成分を取り除くか、あるいはより小さくする代表的な手法を比較検討し、次に、本発明で採用する糖鎖分解酵素について説明する。
第1に、滴下前に濾過作業により比較的大きな植物組織成分のみを除去するという方法が考えられる。
遠心分離により除去を行うには、専用の装置が必要であり操作の手間がかかる。これも、簡便、迅速というイムノクロマトの本来の目的に沿わず、不適である。
非特許文献2(福岡農総試県報 B−9 57〜63(1989))には、ELISA法においては酵素を使用する例が記載されている。
植物組織成分を分解するのに界面活性剤の使用も考えられるため、検討を行ったが、植物組織成分による影響は取り除けず、実際にはむしろ免疫反応に阻害がかかり感度が低下する結果となった。よって、これも不適である。
他に、分解する方法として、熱分解、超臨界水処理による分解、マイクロ波照射による分解等の物理的な処理方法や、酸処理、アルカリ処理等の化学的処理方法がある。
(糖鎖分解酵素)
以下図面を参照しながら、本発明の実施の形態を説明する。以上の検討結果を踏まえ、本発明では、比較的大きな植物組織成分を取り除くか、あるいはより小さくする代表的な手法として、糖鎖分解酵素を使用する。
図1(a)は、本発明の一実施の形態における検査装置の正面図、図1(b)は、同側面図である。図2は、本発明の一実施の形態における磨砕容器の正面図である。
図2に示すように、本形態の磨砕容器は、容器本体17とノズルキャップ18とからなり、容器本体17にノズルキャップ18を装着して使用される。容器本体17の中に植物体と磨砕用の緩衝液を入れ、外から手揉みすることで植物体を磨砕することができる。
SDVの検出キットを使用し、酵素の存在の有無によって偽陽性発色の相違があることを確認した。
抗SDVモノクローナル抗体は、Kohler−Milstein(Nature,256,495−497,1975)の方法に準じて調製した。SDVを免疫したマウスの脾臓から抗体を産生する細胞を取り出し、別に用意したマウスの骨髄腫細胞(ミエローマ)と融合させ、抗SDVモノクローナル抗体4E6産生ハイブリドーマ細胞ならびに抗SDVモノクローナル抗体2G2産生ハイブリドーマ細胞を得た。
G.Frens(Nature,241,20−22,1973)の方法に従い金コロイド粒子を作製した。この金コロイドの10mLに対し、抗SDVモノクローナル抗体2G2を40μg、室温にて混合し、抗SDVモノクローナル抗体結合金コロイド(標識成分)を調製した。
抗SDVモノクローナル抗体結合金コロイドをOD520=1.0となるように調製し、反応確認のために対照としてウサギγグロブリン結合金コロイドをOD520=0.2となるように調製したものを混合し調製液を作製した。
抗SDVモノクローナル抗体4E6を、多孔質坦体13であるニトロセルロースメンブレン(ミリポア社:Hi−Flow(商標))の所定位置に、テスト当たり0.73μLでライン状に塗布し検出区域14を形成した。
糖鎖分解酵素のマセロチームR−10(商標)(ヤクルト薬品工業株式会社,Cat.373−1)を1テスト当たり2.5μgとなるように、濾紙パッドに塗布し、凍結乾燥させ、酵素添加滴下部濾紙パッドを作製した。
滴下部11としての濾紙パッド、抗SDVモノクローナル抗体結合金コロイド塗布パッド、抗SDVモノクローナル抗体固相化メンブレン、吸液部16としての濾紙とをそれぞれ重ね合わせ、粘着剤付きの台紙に貼付してSDVの検出装置を作製した。
植物体の試料には、偽陽性発色を確認するためにSDVに感染していない正常樹の新梢と、感度低下を生じていないかを確認するためにSDV感染樹の新梢を使用した。
(検出装置の作製)
実施例1における(抗SDVモノクローナル抗体の調製)から(検出装置の作製)までと同様に検出装置が作製されるが、(滴下部11の調製)において、酵素を添加せず、未処理の滴下部濾紙パッドを使用し、検出装置を作製した。
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(検出装置の作製)
実施例1における、(抗SDVモノクローナル抗体の調製)から(イムノクロマトに供する試料磨砕液の調製)までと同様に検出装置が作製されるが、(滴下部11の調製)において、酵素を添加せず、未処理の滴下部濾紙パッドを使用し、検出装置を作製した。
実施例1、実施例2、比較例1ついて、調製したそれぞれの試料磨砕液100μLを作製したクロマトの滴下部に滴下し、反応性を確認した。反応性の確認は、滴下を行ってから10分経過した時の検出区域を目視にて確認した。
実施例1、2と比較例1による結果をまとめると次の通りである。
酵 素 試料摩砕液
有無 部位 正常樹(判定) 感染樹(判定)
実施例1 有り 滴下部11に塗布 発色無し(-) 陽性(+++)
実施例2 有り 濾過部19に塗布 発色無し(-) 陽性(+++)
比較例1 無し − 緑色の偽陽性発色 陽性(+++)
なお、+++:強陽性、++,+:陽性、-:陰性
ASGV検出キットを使用し糖鎖分解酵素の種類と効果について確認した。
ここからSDVの検出キットではなくASGVの検出キットを使用し検討を行う。実施例1における、(抗SDVモノクローナル抗体の調製)から(イムノクロマトに供する試料磨砕液の調製)までと同様に検出装置が作製されるが、抗SDVモノクローナル抗体の代わりに抗ASGVモノクローナル抗体を使用し、ASGV検出装置を作製した。
植物体の試料には、偽陽性発色を確認するためにASGVに感染していない正常樹の新梢と、感度低下を生じていないかを確認するためにASGV感染樹の新梢を使用した。
調製したそれぞれの試料磨砕液100μLを作製したクロマトの滴下部に滴下し、反応性を確認した。反応性の確認は、滴下を行ってから10分経過した時の検出区域を目視にて確認した。
酵素の種類 正常樹(判定) 感染樹(判定)
なし 緑色の偽陽性発色 陽性(+++)
マセロチームR-10 発色無し(-) 陽性(+++)
ペクトリアーゼY-23 発色無し(-) 陽性(+++)
セルラーゼR10 発色無し(-) 陽性(+++)
なお、+++:強陽性、++,+:陽性、-:陰性
ASGV検出キットを使用し、酵素の有無によって、滴下した試料磨砕液が検出装置を流れる速さの相違があること、さらに、流れる速さの違いにより感度に相違があることを実証した。
実施例1における、(抗SDVモノクローナル抗体の調製)から(検出装置の作製)までと同様かつ、実施例3の様にモノクローナル抗体をSDVからASGVに置き換えて検出装置が作製されるが、(滴下部11の調製)において、滴下部11へマセロチームR−10(商標)を添加した滴下部濾紙パッドに加え、酵素未添加の滴下部濾紙パッドを使用したものを用い、それぞれ検出装置を作製した。
植物体の試料として磨砕時に粘性の低い果皮1と、粘性の高い果皮2および、果皮3を用いた。
調製した試料磨砕液100μLを作製したクロマトの滴下部に滴下し、標識区域12、多孔質担体13を流れながら経て、その滴下した試料磨砕液の最先端部が吸収部16に到達するまでの時間を計測し、到達時間の違いを確認した。さらに、感度を確認するために、5分、10分経過した時の検出区域を目視にて確認した。
結果は、上記表の通りとなり、粘性の低い植物体においては、酵素の有無による相違は見られなかったが、粘性の高い果皮において、酵素を添加した検出装置では、酵素を添加していない検出装置と比べ、流れる時間を半分以下に短縮することが観測された。
12 標識区域
13 多孔質担体
14 検出区域
15 対照区域
16 吸液部
17 容器本体
18 ノズルキャップ
19 濾過部
A モノクローナル抗体
B 固相化されたモノクローナル抗体
X 病原体
F 流れ方向
Claims (8)
- 緩衝液を内部に収納し、挿入される植物体を磨砕して試料摩砕液とするための磨砕容器と、
植物病原体を検出する検出装置とを備えるイムノクロマトキットであって、
前記検出装置は、
前記植物病原体を含むと疑われる試料磨砕液が滴下される滴下部と、
植物病原体に対して特異結合性を有する第1の抗体を有色粒子により標識したものを前記試料磨砕液により湿潤された状態において流動可能に保持する標識区域と、
前記植物病原体に対して特異結合性を有する第2の抗体が固相化される検出区域と、
前記検出区域とは異なる位置に設けられる対照区域とを備え、
前記試料磨砕液の流動方向において前記摩砕容器内がイムノクロマトキットにおいて最も上流側であり、前記滴下部、前記標識区域及び前記検出区域が前記検出装置内において、前記流動方向の上流側から下流側へと向けて順次連設され、
糖鎖分解酵素が前記検出区域へ至り得るように乾燥状態で保持されていることを特徴とするイムノクロマトキット。 - 前記糖鎖分解酵素が、前記検出装置内の前記検出区域より上流側に乾燥状態で保持されている請求項1記載のイムノクロマトキット。
- 前記摩砕容器は、前記試料摩砕液が前記流動方向において接触する濾過部を更に備え、前記糖分解酵素は、前記濾過部に乾燥状態で保持されている請求項1記載のイムノクロマトキット。
- 前記糖鎖分解酵素は、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、β−グルコシダーゼ、セルラーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、ペクトリアーゼ及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1から3のいずれかに記載のイムノクロマトキット。
- 前記試料磨砕液1000重量部に対して前記糖鎖分解酵素は1乃至100重量部含有されている請求項1から4のいずれかに記載のイムノクロマトキット。
- 前記植物病原体は、温州萎縮ウイルス(SDV)、カンキツモザイクウイルス(CiMV)及びリンゴステムグルービングウイルス(ASGV)の少なくとも一つである請求項1から5のいずれかに記載のイムノクロマトキット。
- 植物病原体を検出する検出装置であって、
前記植物病原体を含むと疑われる試料磨砕液が滴下される滴下部と、
植物病原体に対して特異結合性を有する第1の抗体を有色粒子により標識したものを前記試料磨砕液により湿潤された状態において流動可能に保持する標識区域と、
前記植物病原体に対して特異結合性を有する第2の抗体が固相化される検出区域と、
前記検出区域とは異なる位置に設けられる対照区域とを備え、
前記試料磨砕液の流動方向において前記滴下部が最も上流側であり、前記滴下部、前記標識区域及び前記検出区域が前記検出装置内において、前記流動方向の上流側から下流側へと向けて順次連設され、
糖鎖分解酵素が前記検出区域よりも前記流動方向の上流側に乾燥状態で保持されていることを特徴とする検出装置。 - 前記糖鎖分解酵素は、前記滴下部に乾燥状態で保持されていることを特徴とする請求項7記載の検出装置。
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