CN106117352B

CN106117352B - 抗A型肉毒毒素的人源单链抗体E3-scFv及其应用

Info

Publication number: CN106117352B
Application number: CN201610520546.9A
Authority: CN
Inventors: 岳玉环; 徐艳玲; 张国利; 田园; 吴广谋; 刘雨玲; 李泽鸿; 周博; 田多; 付玉和; 赵新; 侯天全; 张陪陪
Original assignee: Institute of Military Veterinary Academy of Military Medical Sciences PLA
Current assignee: Institute of Military Veterinary Academy of Military Medical Sciences PLA
Priority date: 2016-07-05
Filing date: 2016-07-05
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2036-07-05
Also published as: CN106117352A

Abstract

本发明提供了抗A型肉毒毒素的人源单链抗体E3‑scFv，它是利用人工合成的重组蛋白BontAL，及筛选抗A型肉毒毒素的人源单链抗体的底物GFP‑HIS6‑SNAP25（62）‑VAMP（57）‑C，在人源化抗A型肉毒毒素酶抗体库中筛选出来的，亲和常数为（1.92±0.47）×10⁷L/mol，为生产抗A型肉毒毒素特效救治药物及快速检测A型肉毒毒素奠定了基础。

Description

抗A型肉毒毒素的人源单链抗体E3-scFv及其应用

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及抗A型肉毒毒素的人源单链抗体E3-scFv，及其在生产治疗A型肉毒毒素中毒药物方面、检测A型肉毒毒素方面的应用。

背景技术

肉毒毒素是一种嗜神经蛋白毒素，能致使人及动物毒，少至0.1~1.0µg含量可致人中毒身亡。它已被美国疾病控制和预防中心指定为对人类的威胁类似于炭疽的生物武器，被列为六个最主要的生物战剂之一。依据毒素进入体内途径的不同分为四个类型，一、食源性中毒；二、婴儿感染性肉毒中毒；三、创伤性肉毒中毒；四、吸入性中毒。

肉毒毒素是肉毒梭菌在自然状态下或者是在培养基中形成，通过细菌裂解释放到环境或培养液中，这种形态的毒素被称为前体毒素，其分子量范围在300 kDa到900 kDa。前体毒素通常以复合体的形式存在，由神经毒素（Bont），由一个或多个能够包围和保护毒素的非毒性蛋白组成，包括血凝素（HA）,非毒素非血凝素（NTNH）。临床上所说的肉毒毒素通常指具有神经毒性作用的神经毒素部分。

肉毒毒素根据其抗原性的不同，共存在七种血清型（A、B、C、D、E、F、G、），近年来又发现第八种血清型。尽管七种血清型的肉毒毒素组成成分与它的作用机制略有差别，但是它们有着相近的分子量和相似结构。成熟肉毒毒素均由约150 kDa的单链多肽组成，蛋白质成熟时通过细菌介导的蛋白酶将150kDa的单链多肽切割裂解成两个不相等的多肽片段，两个片段由一个二硫键连接，形成一个分子量为50kDa的轻链片段（LC）和一个分子量为100kDa的重链片段（HC）。其中轻链有一个催化功能域，重链由同轻链并列的α-螺旋转导域H_N区，激发转导的H_CN功能区和神经节苷脂结合区H_CC组成。与H_N区紧邻是一个含有54个氨基酸肽段，即所谓的带区，具有封闭轻链酶活性区，防止轻链折叠构象改变。轻链为锌离子肽链内切酶活性功能区，由α-螺旋和β-折叠共同组成球形结构。单独的轻链和重链均无毒性，只有双链才具有生物学毒性。

轻链由细胞内毒素蛋白组成，具有锌离子依赖内切酶活性，可抑制神经递质的释放。肉毒毒素的活性区埋藏（~20 Å深）于轻链中，表面负电荷，可通过一个通道获得。梭状神经毒素的活性位点包括一个单一的锌原子，这个锌原子历来被认为有功能，但是不起结构性作用。可以通过用金属螯合剂去除锌，但是通过在二级结构上加入游离的锌原子来重新获得锌，毒素与底物结合的能力几乎不变，但轻链的生物学活性却大大的降低了，只相当于原来的30%。位于轻链中心有一个高度保守的锌结合模块HExxH （X是任意的氨基酸）序列。HExxH 序列中含有一个由3个组氨酸整合的锌离子，并对突触泡膜蛋白质具有特异性蛋白水解活性，这个催化位点位于蛋白质表面较深的裂缝中。

在人类肉毒中毒中，A型肉毒毒素和B型肉毒毒素占据最重要的地位，其中A型肉毒毒素轻链上的His 222, Glu223 和His226残基共同组成了锌结合模块HExxH 序列的一部分，并且在协调活性区锌（His 222 和His226）和一个水分子（Glu223残基）的作用机制中起了直接的作用。Glu261 是协调锌的第三配体。甚至有人认为A型肉毒毒素的催化机理与嗜热菌蛋白酶是相似的，这是因为基于结构和序列相似的基础上，他们的活性位点也是相似的。从Glu223到 Asp的突变使得活性几乎全部失去，去除His226使A型肉毒毒素失去了催化活性。肉毒毒素中中和残基的突变使催化速度常数明显降低，但是不影响锌结合和底物结合，人们提出，这些残基在过渡态稳定中发挥了作用。

另外，在LC活性中心还有一些氨基酸残基，如Phe266、Glu350Arg363和Tyr366。它们的功能主要是维持和稳定轻链活性中心的结构和/或它与被结合底物的相对位置，以此保证轻链最佳的酶解能力；

LC通过二硫键与HC的N端连接。在二硫键存在的状态下，毒素重链H_N结构域形成一条loop结构，将深陷于轻链表面裂缝中的Zn²⁺催化部位遮蔽住，从而不表现酶活性。在双链毒素进入神经细胞后，二硫键被还原，释放出的轻链才能表现锌离子内肽酶活性，催化部位能够容纳底物16个氨基酸残基。催化部位的锌离子除同4个组氨酸残基的咪唑环、1个结合于保守谷氨酸的水分子形成配位键外，还与另一分子的谷氨酸羧基形成配位键，1个色氨酸分子很可能也参与锌离子的配位。毒素轻链的这种独特锌离子配位形式、空间结构与其他所有已知的金属蛋白酶的三维结构都不同，应当属于一个新型的金属蛋白酶家族。

肉毒毒素的致病机理

1、靶细胞的识别与结合

前体毒素进入胃肠道，在消化过程中，非毒素组分对神经毒素起到保护作用，使其不会受到各种消化酶和胃酸的侵蚀。由于分子量过大，毒素分子不是以扩散的方式，而是以“内凹”和细胞摄入的方式通过肠粘膜上皮屏障，而不会破坏胃肠道。然后进入小肠中，在小肠的微碱性环境下，前提毒素中的神经毒素解离出来，进入血液及淋巴循环，在运动神经和交感神经处发挥其毒性作用。尽管神经毒素可侵入不同的组织和器官,但不能穿透血脑屏障,其惟一的亲和靶点是外周胆碱能神经末梢。在胆碱能神经末梢，毒素的轻链能够抑制神经递质乙酰胆碱在神经肌肉接头处的释放，导致肌肉麻痹。在这一毒性作用过程中，神经毒素的各功能域都有参与，具体的过程可分为三个阶段。

靶细胞的结合与内化

在靶细胞的识别与结合这一过程中，肉毒毒素重链的结合域发挥了作用。结合域能够识别胆碱能神经末梢，并与其发生特异性结合。结合域结合到运动神经元的神经节苷脂和位于末端神经细胞膜表面小结上的蛋白受体，特别是具有亲和力的GD1b, GT1b 和GQ1b类神经节苷脂。然后由含有唾液酸的寡糖组成的神经节苷脂连接到神经酰胺。通过对神经节苷脂分布及对其亲和结合力的研究，可以确定，神经节苷脂不是唯一能促进肉毒毒素结合的分子，而双受体模型的提出表明，在发生内化作用前，肉毒毒素就已经结合到了蛋白受体上。尽管有一些证据表明，突触结合蛋白可能参与了A、B和E型的内化作用，但是梭菌属家族每一个成员的受体，还没有完全确定。每个毒素与其蛋白共受体都是特异性同源的，B型肉毒毒素与唾液酸乳糖的混合物就与肉毒毒素蛋白部分相似，表明了神经毒素与神经节苷脂结合的一个"锁和钥匙"原理。这个观察成功说明了一个观点，那就是神经节苷脂结合使肉毒毒素靠近蛋白受体，促进了毒素的识别和内化。

一旦结合到神经元表面，母体分子裂解，重链和轻链通过锌原子结合到达神经元细胞膜，并且被内化进入细胞囊泡，形成一个包裹着毒素分子的酸性小囊泡。即内化过程。这一受体介导的内吞过程与时间，温度及突触活动均有关。

2、易位肉毒毒素的轻链必须从囊泡小室或者胞内体中出来，并且在H链N-末端作用下的通过膜运输能够成功进入细胞溶质的靶蛋白，这一过程是称为轻链易位；与其它梭菌毒素一样，肉毒毒素进入细胞内的酸性小泡后，会因pH的变化而发生结构重组。尽管进入突触小泡和胞内小泡是显而易见，但是肉毒毒素易位进入胞内小泡的特性尚未断然确定。pH的降低使肉毒毒素结构发生变化，从而导致其在分子中有较大的疏水性，并且增加了脂双层的渗透性。这样毒素的重链和轻链能够嵌入小泡的脂双层内，一旦嵌入，就会在磷脂双层和PC12膜上形成离子通道。这个通道是具有选择性的，分子量大的分子无法通过，所以目前普遍认为毒素轻链可以通过离子通道从小泡腔内转运到神经细胞胞质。据此有三种轻链跨膜转运假说模型，即管道模型（tunnel model），裂缝模型(cleft model)和裂解模型(lysis model)。其中裂缝模型理论认为，在低pH时，蛋白质的分子构想发生了改变，此时HC可形成一个亲水性的裂隙，并且在轻链穿膜过程中将其亲水表面包围。在此模式中形成了亲水性和疏水性的相互作用。轻链的羧基端因为二硫键与重链氨基端相连而最先进入到胞质。实现易位后，由于胞质的pH高于酸性小泡，使轻链结构重新折叠，重新回到具有催化活性。

在低pH值下，A和B型肉毒毒素的HN域发生构象上的变化，最终跨越人工膜形成离子通道，并且在体内pH的环境下，形成的通道的活性是最大的。C型肉毒毒素在脂膜形成的离子通道与白喉毒素形成的相似，并且也是只在低pH下形成。肉毒毒素离子通道只允许阳离子通过，但是可以在体外阻止氯喹。然而对于小孔径离子通道的研究，我们尚未清楚肉毒毒素形成的通道是不是毒素轻链进入细胞溶质的必经之路。数据显示，在低 pH下轻链的结构有一个戏剧性的变化，就是可能产生一个选择性的LC结构并且更适合于易位。尽管这在体内还没被证实，但是通过低pH诱导结构变化是完全可逆的。

肉毒毒素能够在神经传递发挥作用，就必须通过蛋白水解使LC与HN接头处暴露的表面产生缺口，从而使非活性的单链分子量为150-kDa的毒素活化。少数的细菌和组织蛋白酶能够实现这个裂解反应，并产生有活性的双链神经毒素。产生切口后，轻链和重链仍然通过非共价键相互作用，并且由一个单一的二硫键连接。这种链间的二硫键(A型肉毒毒素中的Cys430–Cys454)的减少是轻链活化的第二阶段，这是轻链自由进入运动神经元胞质溶胶和与底物间相互作用必不可少的阶段。正如前面提到的，在低pH情况下，轻链有一个戏剧性的变化。这种结构的变化有助于易位带（如果在易位点HN域确实是靠近轻链）的重组和导致轻链的最终活化。神经元信号转导通路可以与肉毒毒素-LC活动密切联系在一起的。因此，轻链活化的完成最终可能是发生在胞质溶胶中的，紧接着从低pH的小室中易位。

3、抑制神经递质释放

神经小结处有突触小囊泡，其中包含乙酰胆碱，它是能穿过神经肌肉接头刺激肌肉收缩的一种神经递质。该乙酰胆碱的小囊泡被一个叫做SNARE复合体的蛋白聚合物所结合。为了穿过神经肌肉交界处实现信号的传递，突触前神经小结中的乙酰胆碱小囊泡必须被释放到突触间隙中。在这里，神经递质在肌肉板上结合到特定受体上，触发离子通道打开，从而导致相邻横纹肌的去极化和收缩。乙酰胆碱的释放，需要有SNARE 蛋白的参与，它能够介导突触小泡与神经元细胞膜的融合。

SNARE复合体蛋白参与突触小泡上质膜融合，而肉毒毒素轻链的作用是阻碍胞吐作用。更具体地说，就是在肌肉接头处，神经毒素通过切割SNARE蛋白（乙酰胆碱分子胞吐作用所必须的物质）阻断了囊泡内容物释放到细胞外环境中，抑制乙酰胆碱的释放，从而抑制神经传递。据证实，单独的SNARE蛋白裂解不会妨碍SNARE复合体形成，但是却会导致非功能性复合物在Ca²⁺内流和融合之间的耦合被破坏。毒素在抑制神经递质释放时，需要Ca²⁺的参与，而在突触末梢Ca²⁺浓度增加会影响肉毒毒素的作用效果。

轻链作为锌肽链内切酶蛋白切割致使SNARE复合物不稳定，成为非功能性，从而抑制乙酰胆碱释放到突触间隙。囊泡释放到突触间隙的数量越少，动作电位传播的概率就越低，从而引起肌肉纤维的收缩。结果导致肌肉自身的化学去神经术而引起弛缓性麻痹。现有研究表明SNARE复合物由VAMP、SNAP-25和syntaxin三种蛋白质组成，下表所示为不同类型的肉毒毒素的靶蛋白及其切割位点。

噬菌体展示技术的基本原理是把外源DNA插入噬菌体编码外壳蛋白pIII或pVIiI的基因中，使外源DNA片断对应的表达产物融合在噬菌体的外壳蛋白中形成融合蛋白(fusion protein)，呈现在噬菌体表面。噬菌体展示技术的显著优点是：建立了基因型(genotype)和表型(phenotype)之间直接的物理联系，从而使筛选简便高效。将外源蛋白或多肽表达于噬菌体表面，就可根据其性质利用它与其他生物或非生物物质的亲和性对含目的基因的噬菌体进行筛选。以噬菌体抗体库的筛选为例，将Fab(fragment antigenbinding)表达在噬菌体表面，以相应的抗原为亲和性配体筛选，可以快速高效地从大量克隆中筛选表达特异性抗体的噬菌体。因此，用噬菌体展示技术制备高亲和性抗体与传统的杂交瘤单克隆抗体技术相比具有明显的优势。

噬菌体抗体在膜表面表达，是通过Fab段或ScFv 与单链噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白而完成。其特点是“ 它既可识别相应的抗原并与其结合，又能够感染宿主菌进行再扩增”。利用其可再扩增的特性，以靶抗原通过亲和吸附-洗脱-扩增，可筛选到靶分子的配体肽链。再经突变和链置换方法改进抗体亲和力，最终便获得高亲和力的特异性抗体。噬菌体抗体库的筛选包括两个主要步骤：淘筛和鉴定。淘筛是将噬菌体抗体库与选择用的抗原共同孵育，通过几轮洗脱，收集结合的噬菌体。将获得的噬菌体感染细菌并扩增，再进行下一轮的淘筛。经几轮淘筛后，便可富集到与抗原特异性结合的噬菌体感染的多克隆菌株。鉴定过程是从噬菌体感染的多克隆菌株中挑选出单克隆菌株。即将淘筛出的噬菌体感染细菌、铺板、挑选，即可得到高特异性单克隆菌株。

从噬菌体抗体库中筛选表达特异性抗体的噬菌体的经典方法主要有两种：(1)将纯抗原包被在固相介质上，如酶标板、免疫试管或亲和层析柱，然后加入待筛选的噬菌体，洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体。(2)将抗原与生物素基团相连，再将其固定在包被有streptavidin的顺磁珠上对噬菌体进行筛选。两种方法中均需加脱脂牛奶(或BSA，其效果较差)封闭未被抗原占据的位点，以避免噬菌体非特异性的结合。对于前一方法，回收与抗原特异性结合的噬菌体可用碱性溶液(如三乙基胺，(triethy—lamine)或酸性溶液(如甘氨酸一盐酸，glycine_HCl)洗脱，或用可溶的抗原或半抗原洗脱；对于后一方法，用二巯基苏糖醇(dithiothret01，DTT)通过破坏抗原与生物素之间的二硫键来洗脱。回收的噬菌体感染宿主菌，增殖后进行下一轮筛选。一般经过3—5轮这样的筛选可得到表达高亲和性的目的抗体的克隆。每一轮筛选都需要进行检测，以证实筛选的有效性。

英国MRC HGMP资源中心创建的Human Single Fold scFv Libraries I+J(Tomlinson I + J)是当今成熟的全人源噬菌体抗体库，其库容超过10⁸全人源噬菌体单链抗体，本研究利用该噬菌体库淘选特异性抗A型肉毒毒素单链抗体，并对阳性单链抗体进行系统分析，以期创制A型肉毒毒素中毒治疗抗体类药物奠定物质基础。

本发明人通过对肉毒毒素的作用机理的了解及研究，确定肉毒毒素能够引起人畜共患病，且主要攻击体内的神经突触系统，其致病机理为，肉毒毒素通过其重链C端结构域结合于胆碱能神经元的突触前膜，形成毒素受体复合物内化进入细胞囊泡，然后轻链锌内肽酶酶活性区从细胞内的酸性空间释放进入细胞质。一旦从囊泡中释放出来，轻链通过切割SNARE复合物蛋白来阻止乙酰胆碱的释放，引起肌肉麻痹。因此轻链为主要的致病部位。目前，世界上中毒还是以A型居多，这是由于A型毒素在美容领域和医学领域应用的增加，其中毒的风险和几率也相应增加。

发明内容

本发明的目的是为解决异源性血清抗体在治疗A型肉毒毒素中毒，存在引起免疫反应或传染疾病的问题，而提供一种全人源的单链抗体ScFv，抗A型肉毒毒素的人源单链抗体E3-scFv。

抗A型肉毒毒素酶的人源单链抗体E3-scFv，其碱基序列如序列表SEQ ID NO.7所示；

抗A型肉毒毒素酶的人源单链抗体E3-scFv，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示；

抗A型肉毒毒素酶的人源单链抗体E3-scFv在生产治疗A型肉毒毒素酶中毒药物方面的应用；

抗A型肉毒毒素酶的人源单链抗体E3-scFv在检测A型肉毒毒素方面的应用。

本发明提供了抗A型肉毒毒素酶的人源单链抗体E3-scFv，它是利用人工合成的重组蛋白BontA轻链蛋白，及筛选抗A型肉毒毒素酶的人源单链抗体的底物GFP-HIS6-SNAP25（62）-VAMP（57）-C，人源化抗A型肉毒毒素酶抗体库中筛选出来的，亲和常数为（1.92±0.47）×10⁷L/mol，为生产抗A 型肉毒毒素特效救治药物及快速检测A型肉毒毒素奠定了基础。

附图说明

图1为双酶切重组质粒pET-28(a)-BoNT/AL质粒鉴定结果；1.3.5.7为pET-28(a)-BoNT/AL切前；2.4.6.8质粒酶切后；M. DNA marker DL2000；

图2为重组蛋白表达形式鉴定其中：1.3.5.7分别为37℃、阴性对照、25℃、30℃诱导上清；2、4、6、8：37 ℃、阴性对照、25 ℃、 30℃诱导沉淀；M：蛋白质Marker；

图3为重组蛋白包涵体洗涤的SDS-PAGE结果分析；其中：1-3：0.5%、1%、2%Trition洗涤上清；4-9：1mol、2mol、3mol、4mol、6mol、8molUrea洗涤上清；10-12： 4mol、 6mol、8molUrea洗涤沉淀样品；M：蛋白质Marker；

图4为重组蛋白纯化产物SDS-PAGE结果分析；1：0.1mol/LNaOH ；2：200mmol/L咪唑洗脱样品；3-4：50 mmol/L咪唑洗脱峰2、峰1；5-6：20 mmol/L咪唑洗脱峰2、峰1；7：流川；8：原样；M：蛋白Marker；

图5重组蛋白复性结果分析，1：复性蛋白；M：蛋白Marker；

图6纯化后E3-scFv SDS-PAGE结果分析；1:流穿 2:55%硫酸铵原样 3:纯化后scFv。

具体实施方式

实施例1：A型肉毒毒素轻链基因与PET-28a载体连接

以pGEM-BontA质粒为模板，设计特异性引物如下：

P1_A: 5′-CATGCATATGAATAAACAATTTAATTATAAAGATC-3′

P2_A: 5′- CGGAATTCTTAATTGTATCCTTTATCTAATGATT-3′

PCR合成两端插入EcoR

和Nde

酶切位点的BontAL基因，产物经琼脂糖凝胶电泳分析后回收目的片段。经测序其碱基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

将EcoR

和Nde

双酶切的载体PET-28a大片段与目的基因BontAL小片段回收，并用T4 DNA连接酶连接，得到重组质粒PET-28a-BontAL，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，含kan抗性的琼脂糖平板进行初步筛选。挑选单菌落于LB液体培养基中培养；用质粒回收试剂盒提取质粒。

用限制性内切酶进行双酶切鉴定，并送检测序鉴定。琼脂糖凝胶电泳分析酶切前后条带位置变化，并且在预期目的条带位置处有相应大小的片段（见图1）。证明目的基因已连接至载体上，成功构建PET-28a-BontAL。

实施例2：重组蛋白PET-28a-BontAL表达产物的SDS-PAGE结果分析

将重组质粒PET-28a-BontAL转化至表达菌-大肠杆菌BL21（DE3），不同温度条件下IPTG诱导表达后，SDS-PAGE结果显示：37℃、30℃沉淀中重组蛋白PET-28a-BontAL在50KD左右处有一明显表达带，大小与理论值相符；见图2；并且绝大部分蛋白位于沉淀中，因此此目的蛋白为包涵体表达。

实施例3：包涵体蛋白BontAL的洗涤

包涵体的纯化处理，首先对包涵体进行洗涤，除去部分杂质，然后溶解打开包涵体，使聚合在一起的蛋白彼此在裂解液的条件下打开分离，然后进一步纯化目的蛋白。

用不同含量的Trition对包涵体进行洗涤，Trition变形能力弱，只能起到初步洗涤的作用。随后逐步增加尿素浓度，渐进的洗涤打开包涵体，SDS-PAGE分析得到，2%的Trition能够去除部分杂质，2M尿素也有此作用，4M尿素开始目的蛋白开始分离，8M尿素能够完全打散包涵体，如图3。

实施例4：包涵体蛋白BontAL的纯化和复性

经8M尿素溶解的包涵体，上清经金属螯合层析Cu²⁺柱，收集200mmol咪唑洗脱蛋白。SDS-PAGE分析如图4，除去了大部分杂质；用逐步透析复性的方法，每隔12个小时更换透析液，直至完全透析至Tris中，用金属螯合层析Cu²⁺进行浓缩。蛋白透析至PBS中。SDS-PAGE鉴定如图5，复性蛋白纯度以达到。

实施例5：全人源抗Bont-AL-scFv抗体的筛选

纯化的重组蛋白为抗原包被于96孔酶标板上，4℃过夜。次日弃上清，用2%的Milk-PBS 37℃封闭2h，加入噬菌体抗体库（噬菌体库原始来源：Source bioscience（英国），中国经销商：北京西美科技有限公司），滴度为1.0×10¹³，室温下剧烈晃动孵育60min，静置60min。后弃去液体，用含0.1%Twenn-20的PBS洗涤10次，洗涤后将每孔中残留的液体轻轻拍干，每孔加入50µL洗脱液（5mg/mL的胰酶-PBS），室温下剧烈晃动10min，洗脱噬菌体，收集4℃保存。

用洗脱下的噬菌体侵染E.coli TG1，并涂布于TYE平板上（含100µg/mLAmp和1%的葡萄糖）37℃过夜培养。利用辅助噬菌体KM13扩增噬菌体库，通过PEG/NaCl回收噬菌体。重复以上过程3次，共4轮筛选，收集筛选的噬菌体库。

实施例6：抗Bont-AL-scFv阳性菌株鉴定

筛选后的噬菌体侵染E.coli HB2151，诱导表达后，利用ELISA鉴定，置酶标仪测定OD值（波长为490nm），每个样品做双孔测定，取OD平均值。以2%Milk-PBS为阴性对照，阳性克隆菌株确定标准为：OD值为阴性对照的3倍以上，共获得27株阳性克隆菌株。

阳性菌株生物活性检测，将GFP-SNAP25-VAMP（氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，其基因序列SEQ ID NO.3所示）用包被液稀释，每孔包被30µg于检测板（PierceMaleimide Activated 96-well Plates,Black,15153）中，4℃过夜，用Wash buffer洗涤3次，将27株阳性菌株，诱导表达离心后，将100µL上清和6 µg Bont-AL混匀，加入到检测板中，37℃作用2h，每份样品做双孔测定，再用Wash buffer洗涤3次，在多功能酶标仪上检测荧光强度，得出2株活性较好的菌株。按照Tomlinson I+J试剂盒上的pIT-2载体的基因序列，合成两条特异性PCR引物扩增scFv全基因片段。

P1 LMB3: 5’—CAG GAA ACA GCT ATG AC—3’

P2 pHEN: 5’ —CTA TGC GGC CCC ATT CA—3’

经检测2株阳性菌株，均能够出现明显867bp条带，含有完整的scFv。

测序鉴定其序列并经Blast数据库分析得出：得出2株阳性菌株均为人源单链抗体，分析如下：

D2-scFv

M K Y L L P T A A A G L L

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L L A A Q P A M A E V Q L

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L E S G G G L V Q P G G S

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CDR-H1

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S Y A M S W V R Q A P G K

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I S R D N S K N T L Y L Q

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M N S L R A E D T A V Y Y

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S S Y L N W Y Q Q K P G K

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R A A A H H H H H H G A A

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E Q K L I S E E D L N G A

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A

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E3-scFv

M K Y L L P T A A A G L L

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实施例7：抗Bont-AL-scFv纯化以及抗体亲和常数KD值测定

2株强阳性克隆菌株在37℃培养，至OD600到0.9，加入诱导剂30℃培养过夜（16h），过夜培养物4℃，3500×g离心30min，上清为表达的scFv，大小为31000。诱导上清先后经过55%饱和度硫酸铵沉淀和rProtein-A亲和层析后，得到纯度在90%以上的样品；利用非竞争酶免疫法测定D2和E3单链抗体的亲和常数，分别以4 µg/mL、2µg/mL、1µg/mL和0.5 µg/mL包被Bont-AL，将单链抗体浓度调整到10^-6 mol/L，倍比稀释1:2~1:512，用1:5000倍稀释的Protein A-HRP抗体作为二抗，OPD显色，测定OD490nm吸光值，每个样品做双孔测定，取OD平均值。根据抗原抗体结合反应的S形曲线图，能够求解出在不同抗原浓度下板书吸光值的抗体浓度，带入到公式KA=（n-1）/2(nAb’-Ab)计算亲和常数，其中Ab’和Ab表示当抗原为Ag’和Ag时，产生半数吸光值的抗体浓度（mol/L），n=Ag/Ag’，当n=2时可以得到3个KA值，n=4时可得2个KA值，n=8时得1个KA值，把六个KA值取平均数就是最终的亲和常数数值。

从下表看出D2单链抗体的亲和常数为（6.89±0.65）×10⁶L/mol，E3的亲和常数为（1.92±0.47）×10⁷L/mol。

<110> 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所

<120> 抗A型肉毒毒素的人源单链抗体E3-scFv及其应用

<160> 2

<210> 1

<211> 1374

<212> DNA

<213> 人工

<400> 1

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggatcctg taaatggtgt tgatattgct tatataaaaa ttccaaatgc aggacaaatg 120

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tcatattatg attcaacata tttaagtaca gataatgaaa aagataatta tttaaaggga 300

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atagtaaggg gaataccatt ttggggtgga agtacaatag atacagaatt aaaagttatt 420

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ctagtaataa taggaccctc agctgatatt atacagtttg aatgtaaaag ctttggacat 540

gaagttttga atcttacgcg aaatggttat ggctctactc aatacattag atttagccca 600

gattttacat ttggttttga ggagtcactt gaagttgata caaatcctct tttaggtgca 660

ggcaaatttg ctacagatcc agcagtaaca ttagcacatg aacttataca tgctggacat 720

agattatatg gaatagcaat taatccaaat agggttttta aagtaaatac taatgcctat 780

tatgaaatga gtgggttaga agtaagcttt gaggaactta gaacatttgg gggacatgat 840

gcaaagttta tagatagttt acaggaaaac gaatttcgtc tatattatta taataagttt 900

aaagatatag caagtacact taataaagct aaatcaatag taggtactac tgcttcatta 960

cagtatatga aaaatgtttt taaagagaaa tatctcctat ctgaagatac atctggaaaa 1020

ttttcggtag ataaattaaa atttgataag ttatacaaaa tgttaacaga gatttacaca 1080

gaggataatt ttgttaagtt ttttaaagta cttaacagaa aaacatattt gaattttgat 1140

aaagccgtat ttaagataaa tatagtacct aaggtaaatt acacaatata tgatggattt 1200

aatttaagaa atacaaattt agcagcaaac tttaatggtc aaaatacaga aattaataat 1260

atgaatttta ctaaactaaa aaattttact ggattgtttg aattttataa gttgctatgt 1320

gtaagaggga taataacttc taaaactaaa tcattagata aaggatacaa ttaa 1374

<160> 2

<210> 2

<211> 457

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

5 10 15

Arg Gly Ser His Met Asp Pro Val Asn Gly Val Asp Ile Ala Tyr Ile

20 25 30

Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro Val Lys Ala Phe Lys Ile

35 40 45

His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg Asp Thr Phe Thr Asn Pro

50 55 60

Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu Ala Lys Gln Val Pro Val

65 70 75 80

Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr Asp Asn Glu Lys Asp Asn

85 90 95

Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu Arg Ile Tyr Ser Thr Asp

100 105 110

Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val Arg Gly Ile Pro Phe Trp

115 120 125

Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys Val Ile Asp Thr Asn Cys

130 135 140

Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr Arg Ser Glu Glu Leu Asn

145 150 155 160

Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile Ile Gln Phe Glu Cys Lys

165 170 175

Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr Arg Asn Gly Tyr Gly Ser

180 185 190

Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe Thr Phe Gly Phe Glu Glu

195 200 205

Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu Gly Ala Gly Lys Phe Ala

210 215 220

Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu Leu Ile His Ala Gly His

225 230 235 240

Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn Arg Val Phe Lys Val Asn

245 250 255

Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu Glu Val Ser Phe Glu Glu

260 265 270

Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys Phe Ile Asp Ser Leu Gln

275 280 285

Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn Lys Phe Lys Asp Ile Ala

290 295 300

Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val Gly Thr Thr Ala Ser Leu

305 310 315 320

Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys Tyr Leu Leu Ser Glu Asp

325 330 335

Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu Lys Phe Asp Lys Leu Tyr

340 345 350

Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp Asn Phe Val Lys Phe Phe

355 360 365

Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn Phe Asp Lys Ala Val Phe

370 375 380

Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr Thr Ile Tyr Asp Gly Phe

385 390 395 400

Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn Phe Asn Gly Gln Asn Thr

405 410 415

Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu Lys Asn Phe Thr Gly Leu

420 425 430

Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg Gly Ile Ile Thr Ser Lys

435 440 445

Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn

450 455

<210> 3

<211> 1112

<212> DNA

<213> 人工

<400> 3

ccatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg 60

acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct 120

acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca 180

ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga 240

agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct 300

tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc 360

tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc 420

acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga 480

acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg 540

ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc 600

actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg 660

tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagg 720

gatcccatca tcatcatcat catatggatg aaaacctaga gcaggtgagc ggcatcatcg 780

ggaacctccg tcacatggcc ctggatatgg gcaatgagat cgatacacag aatcgccaga 840

tcgacaggat catggagaag gctgattcca acaaaaccag aattgatgag gccaaccaac 900

gtgcaacaaa gatgctggga agtggtgaat tcgcccaggt ggatgaggtg gtggacatca 960

tgagggtgaa cgtggacaag gtcctggagc gagaccagaa gctgtcggag ctggacgacc 1020

gtgcagatgc actccaggcg ggggcctccc agtttgaaac aagcgcagcc aagctcaagc 1080

gcaaatactg gtggaaaaac tgctaaaagc tt 1112

<210> 4

<211> 365

<212> PRT

<213> 人工

<400> 4

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile The Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly

225 230 235 240

Ser His His His His His His Met Asp Glu Asn Leu Glu Gln Val Ser

245 250 255

Gly Ile Ile Gly Asn Leu Arg His Met Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu

260 265 270

Ile Asp Thr Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp

275 280 285

Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met

290 295 300

Leu Gly Ser Gly Glu Phe Ala Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met

305 310 315 320

Arg Val Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu

325 330 335

Leu Asp Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu

340 345 350

Thr Ser Ala Ala Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Cys

355 360 365

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工

<400> 5

atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60

atggccgagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 120

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caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcaacgattt ctaggcatgg tacgattaca 240

aagtacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctcca gagacaattc caagaacacg 300

ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtatatta ctgtgcgaaa 360

cttgctacta cgtttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc gagcggtgga 420

ggcggttcag gcggaggtgg cagcggcggt ggcgggtcga cggacatcca gatgacccag 480

tctccatcct ccctgtctgc atctgtagga gacagagtca ccatcacttg ccgggcaagt 540

cagagcatta gcagctattt aaattggtat cagcagaaac cagggaaagc ccctaagctc 600

ctgatctatc gtgcatcctc tttgcaacca tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca 660

gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa cctgaagatt ttgcaactta ctactgtcaa 720

caggctaata cgaggcctct tacgttcggc caagggacca aggtggaaat caaacgggcg 780

gccgcacatc atcatcacca tcacggggcc gcagaacaaa aactcatctc agaagaggat 840

ctgaatgggg ccgcatag 858

<210> 6

<211> 285

<212> PRT

<213> 人工

<400> 6

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly

20 25 30

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

35 40 45

Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Arg His Gly Thr Ile Thr

65 70 75 80

Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

85 90 95

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

100 105 110

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Leu Ala Thr Thr Phe Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Ser Leu

195 200 205

Gln Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

210 215 220

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

225 230 235 240

Gln Ala Asn Thr Arg Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

245 250 255

Ile Lys Arg Ala Ala Ala His His His His His His Gly Ala Ala Glu

260 265 270

Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala

275 280 285

<210> 7

<211> 870

<212> DNA

<213> 人工

<400> 7

atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60

atggccgagg tgcagctgtt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 120

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gctgagaaga cgtttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc gagcggtgga 420

ggcggttcag gcggaggtgg cagcggcggt ggcgggtcga cggacatcca gatgacccag 480

tctccatcct ccctgtctgc atctgtagga gacagagtca ccatcacttg ccgggcaagt 540

cagagcatta gcagctattt aaattggtat cagcagaaac cagggaaagc ccctaagctc 600

ctgatctatc gtgcatcccg tttgcaaagt ggggtcccat caaggttcag tggcagtgga 660

tctgggacag atttcactct caccatcagc agtctgcaac ctgaagattt tgcaacttac 720

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tcagaagagg atctgaatgg ggccgcatag 870

<210> 8

<211> 289

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 8

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly

20 25 30

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

100 105 110

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115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln

145 150 155 160

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

165 170 175

Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln

180 185 190

Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Arg Leu

195 200 205

Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

210 215 220

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Gln Gln Leu Ala Leu Arg Pro Arg Leu Thr Phe Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala His His His His His His

260 265 270

Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala

275 280 285

Ala

289

Claims

1.抗A型肉毒毒素酶的人源单链抗体E3-scFv，其特征在于：碱基序列如序列表SEQ IDNO.7所示。

2.抗A型肉毒毒素酶的人源单链抗体E3-scFv，其特征在于：氨基酸序列如序列表SEQID NO.8所示。

3.根据权利要求1所述的抗A型肉毒毒素酶的人源单链抗体E3-scFv在生产治疗A型肉毒毒素酶中毒药物方面的应用。

4.检测A型肉毒毒素的试剂盒，它包括：权利要求1所述的抗A型肉毒毒素酶的人源单链抗体E3-scFv。