JP2006502378A - クロストリジウム毒素に関する細胞ベースの蛍光共鳴エネルギー転移（ｆｒｅｔ）アッセイ - Google Patents

クロストリジウム毒素に関する細胞ベースの蛍光共鳴エネルギー転移（ｆｒｅｔ）アッセイ Download PDF

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Abstract

本発明は、(a) ドナー・フルオロフォア；ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および切断部位がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間にあり、適切な条件下、共鳴エネルギー転移がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間で示される切断部位を含むクロストリジウム毒素認識配列を含むクロストリジウム毒素基質を有する細胞を試料と接触させ、(b) ドナー・フルオロフォアを励起させ、(c)接触細胞をコントロール細胞と比較して共鳴エネルギー転移を決定することによりクロストリジウム毒素活性を決定する方法を提供し、この方法では、コントロール細胞と比較した接触細胞の共鳴エネルギー転移における差異がクロストリジウム毒素活性を示す。

Description

技術分野
本発明は、一般的には蛍光共鳴エネルギー転移およびプロテアーゼアッセイに関し、より具体的には、クロストリジウム毒素活性を細胞ベースでアッセイする方法に関する。
背景技術
破傷風、およびまれではあるが致死的な疾患となる可能性のあるボツリヌス中毒症の神経麻痺症候群は、クロストリジウム属の細菌によって産生される神経毒素により引き起こされる。これらのクロストリジウム神経毒素は、神経細胞に対し非常に強くまた特異的な毒であり、ボツリヌス毒素のヒト致死量はナノグラムのオーダーである。従って、食料品中に存在するボツリヌス毒素が微量であっても公衆衛生を害し、それは厳しい試験を通して回避されなければならない。
しかしながら、それらの潜在的に有害な作用にも関わらず、低用量に制御されたボツリヌス神経毒素は治療薬として、および美容用途に関して使用され成功を収めている。特に、ボツリヌス毒素は、様々な局所または分節的失調、斜視、およびコリン作動性神経終末活性の可逆的抑制が望まれる他の症状の治療管理に使用されている。ヒトにおけるボツリヌス神経毒素の確立された治療的使用には、眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、喉頭(laringeal)発声障害、局所多汗症、過流涎、口顎ジストニア、頚部ジストニア、斜頚、斜視、肢ジストニア、職業性痙攣および筋波動症が含まれるが、これらに限定されない(Rossetto et al, Toxicon 39:27-41 (2001))。例えば、少量のボツリヌス神経毒素Ａの痙攣組織への筋肉内注射は、脳傷害、脊髄傷害、脳卒中、多発性硬化症および脳性麻痺による痙縮の処置に効果的に用いられている。クロストリジウム神経毒素のさらなる臨床用途の可能性は、現在調査されている。
食料品中の少量のボツリヌス毒素に関する潜在的危険性および的確な医薬製剤を調製する必要性がある場合、現在食品および医薬品業界においてボツリヌス神経毒素についてのアッセイが用いられている。食品業界では、新しい食品包装方法の有効性を確認し、食品の安全性を保証するために、ボツリヌス神経毒素に対するアッセイが要求される。ボツリヌス毒素の臨床上の用途は増加しており、製品調製および品質管理のためのボツリヌス神経毒素活性に対する的確なアッセイが必要とされる。両産業において、現在マウス致死試験がボツリヌス神経毒素活性をアッセイするのに唯一使用されている。
残念なことに、マウス致死アッセイにはいくつかの欠点がある：多数の実験動物が必要とされることによる費用；特異性の欠如；大きな動物集団を使用しない場合に不正確なアッセイとなる可能性および多数の動物の生命を犠牲にする必要性。従って、マウス致死アッセイを補完し、そしてその必要性を減少させうる新規な方法が必要とされている。毒素のタンパク質分解活性の測定に加え、このような代替方法は毒素の細胞取込および毒素軽鎖の細胞のサイトゾルへの送達をも必要とすべきである。本発明は、クロストリジウム毒素活性についての新規な細胞ベースアッセイを提供することによりこの要求を満たし、また、関連する利点をも提供する。
発明の要旨
本発明は、送達薬剤およびクロストリジウム毒素基質を含む組成物を提供し、このクロストリジウム毒素基質は、ドナー・フルオロフォア；ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および切断部位がドナー・フルオロフォアとアクセプターの間にあり、適切な条件下、共鳴エネルギー転移がドナー・フルオロフォアとアクセプターの間で見られるクロストリジウム毒素認識配列を含む。本発明の基質組成物において、送達薬剤は、例えばクロストリジウム毒素基質に共有結合されていてもよく、さらに、例えば、タンパク質、ペプチドまたはペプチド模倣物であっても良い。ある態様においては、基質組成物は、送達薬剤がクロストリジウム毒素基質と動作可能に縮合しているキメラタンパク質、ペプチドまたはペプチド模倣物である。このようなキメラ基質組成物は、例えば、最大５０または１００残基長のペプチドまたはペプチド模倣物であり得る。
種々の送達薬剤が本発明の基質組成物中でクロストリジウム毒素基質に共有結合されていてもよく、これにはアンテナペディアタンパク質またはその活性フラグメント（例えば、アミノ酸配列RQIKIWFQNRRMKWKK（配列番号１）を有する活性フラグメント）、HIV TATタンパク質またはその活性フラグメント（例えば、アミノ酸配列YGRKKRRQRRR（配列番号２）を有する活性フラグメント）、および単純ヘルペスウィルスVP22タンパク質またはその活性フラグメント（例えば、配列番号３のアミノ酸配列を有する単純ヘルペスウィルスVP22タンパク質またはその活性フラグメント）が含まれるがこれらに限定されない。
また、本発明は、送達薬剤がクロストリジウム毒素基質と非共有的に結合している基質組成物を提供する。クロストリジウム毒素基質と非共有的に結合し得る代表的な送達薬剤としては、ChariotTMおよびMPGペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
種々のクロストリジウム毒素基質が本発明の基質組成物において有用である。このようなクロストリジウム毒素基質は、例えば、ボツリヌス毒素認識配列を含むボツリヌス毒素基質または破傷風毒素認識配列を含む破傷風毒素基質であり得る。ある態様において、本発明は、１つとして、BoNT/A認識配列を含有するBoNT/A基質を含む基質組成物を提供する。このようなBoNT/A基質は、例えば、SNAP-25の少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はGln-Argを含む）またはそのペプチド模倣物を含みうる。別の態様において、本発明はBoNT/B認識配列を有するBoNT/B基質を含む基質組成物を提供する。本発明の基質組成物において有用なBoNT/B基質としては、VAMPの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はGln-Pheを含む）またはそのペプチド模倣物を有する基質が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる態様において、本発明はBoNT/C1認識配列を有するBoNT/C1基質を提供する。本発明において有用なBoNT/C1基質としては、シンタキシンの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はLys-Alaを含む）またはそのペプチド模倣物を含む基質、およびSNAP-25の少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はArg-Alaを含む）またはそのペプチド模倣物を含む基質が挙げられるが、これらに限定されない。別の態様において、本発明はBoNT/D認識配列を有するBoNT/D基質を提供する。種々のBoNT/D基質が本発明の基質組成物において有用であり、これはVAMPの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はLys-Leuを含む）またはそのペプチド模倣物を有するBoNT/D基質が含まれるがこれらに限定されない。
さらなる態様において、本発明は、１つとして、BoNT/E認識配列を含有するBoNT/E基質を含む基質組成物を提供する。このようなBoNT/E基質は、例えば、SNAP-25の少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はArg-Ileを含む）またはそれらのペプチド模倣物を有していても良い。さらなる態様において、BoNT/F認識配列を有するBoNT/F基質を含有する基質組成物を本明細書中に提供する。本発明の組成物において有用なBoNT/F基質は、例えば、VAMPの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はGln-Lysを含む）またはそれらのペプチド模倣物を有していても良い。なおさらなる態様において、本発明は、１つには、BoNT/G認識配列を有するBoNT/G基質を含む基質組成物を提供する。有用なBoNT/G基質には、VAMPの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はAla-Alaを含む）またはそれらのペプチド模倣物を含むが、これらに限定しない。さらなる態様において、本発明は、１つには、TeNT認識配列を含有するTeNT基質を含む基質組成物を提供する。本発明において有用な種々のTeNT基質としては、VAMPの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はGln-Pheを含む）またはそれらのペプチド模倣物を有する基質が挙げられる。
種々のドナー・フルオロフォアおよびアクセプターが本発明の基質組成物において有用である。非限定的な例として、本発明において有用なドナー・フルオロフォアとしては、Alexa Fluor（登録商標）488、DABCYLおよびBODIPYが挙げられる。本発明において有用なアクセプターとしては、非蛍光アクセプター並びにアクセプターフルオロフォアが挙げられ、１つの態様においてアクセプターは少なくとも１マイクロ秒の蛍光寿命を有するアクセプターフルオロフォアである。他の態様において、本発明はアクセプターがEDANS、QSY（登録商標）またはテトラメチルローダミンである基質組成物を提供する。
クロストリジウム毒素基質を含有する細胞もさらに、本明細書中に提供され、この基質はドナー・フルオロフォア；ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および切断部位がドナー・フルオロフォアとアクセプターの間にあり、適切な条件下、共鳴エネルギー転移がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間で示されるクロストリジウム毒素認識配列を含む。１態様において、細胞はトランスフェクト細胞である。別の態様において、細胞は安定にトランスフェクトした細胞である。本発明において種々の細胞が有用であり、これには初代培養細胞、株化細胞、ヒト細胞、神経細胞（例えば、初代培養ニューロン、株化ニューロンおよびヒトニューロン）および非神経細胞（例えば、膵腺房細胞）が含まれるが、これらに限定しない。本発明に有用なニューロンとしては、中枢神経系（CNS）ニューロン、および末梢ニューロンが挙げられ、非限定的な例として、本発明に有用なニューロンは、神経芽細胞腫、脊髄ニューロン、後根神経節ニューロン、大脳皮質ニューロン、小脳ニューロン、海馬ニューロンまたは運動ニューロンであり得る。
さらに、本明細書中において発明はドナー・フルオロフォア；ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および切断部位がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間にあり、適切な条件下、共鳴エネルギー転移がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間で提示されるクロストリジウム毒素認識配列を含むクロストリジウム毒素基質をコードする核酸分子を含有する細胞を提供する。任意の種々の細胞が有用であり得、ヒト細胞、神経細胞および非神経細胞が含まれるがこれらに限定されない。このような細胞は、例えば、クロストリジウム毒素基質をコードする核酸分子の安定なトランスフェクションにより製造することができる。クロストリジウム毒素基質をコードする核酸分子を、例えば、構成性調節エレメントまたは誘導性調節エレメントのような調節エレメントに連結することができる。種々の誘導性調節エレメントが本発明において有用であり、テトラサイクリン調節型調節エレメント、およびエクジソン誘導性調節エレメントが挙げられるが、これらに限定しない。本発明において有用な、遺伝子上にコードされているドナー・フルオロフォアおよびアクセプターとしては、緑色蛍光タンパク質(GFP) および本明細書中以下に開示し、当該分野において公知の他のものが挙げられる。
本発明はまた、(a) ドナー・フルオロフォア；ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および切断部位がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間にあり、適切な条件下で共鳴エネルギー転移がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間で示されるクロストリジウム毒素認識配列を含むクロストリジウム毒素基質を含有する細胞を試料と接触させ、(b) ドナー・フルオロフォアを励起させ、(c)接触細胞の共鳴エネルギー転移をコントロール細胞と比較して決定する（コントロール細胞と比較した接触細胞の共鳴エネルギー転移における差異がクロストリジウム毒素活性を示す）ことによりクロストリジウム毒素活性を決定する方法を提供する。
本発明の方法において有用なクロストリジウム毒素基質は、任意の血清型のボツリヌス毒素基質または破傷風毒素基質であり得る。従って、本発明の方法は、例えば、BoNT/A認識配列を含むBoNT/A基質、BoNT/B認識配列を含むBoNT/B基質、BoNT/C1認識配列を含むBoNT/C1基質、BoNT/D認識配列を含むBoNT/D基質、BoNT/E認識配列を含むBoNT/E基質、BoNT/F認識配列を含むBoNT/F基質、BoNT/G認識配列を含むBoNT/G基質またはTeNT認識配列を含むTeNT毒素基質を用いて実施することができる。
本発明の方法に従い、クロストリジウム毒素活性に関して種々の試料をアッセイすることができる。このような試料としては、未精製の細胞溶解物、単離したクロストリジウム毒素、製剤化クロストリジウム毒素製品（例えば、BOTOX（登録商標））および食品が挙げられるが、これらに限定しない。
本発明の方法において、共鳴エネルギー転移は様々な方法によって測定可能である。ある態様では、本発明の方法は接触させた細胞（接触細胞）のドナー蛍光強度の検出工程を含み、この工程において、コントロール細胞と比較した接触細胞のドナー蛍光強度の上昇はクロストリジウム毒素活性を示す。別の態様において、本発明の方法は接触細胞のアクセプター蛍光強度の検出工程を含み、この工程において、コントロール細胞と比較した接触細胞のアクセプター蛍光強度の減少はクロストリジウム毒素活性を示す。さらなる態様において、本発明の方法は接触細胞のアクセプター発光極大およびドナー・フルオロフォア発光極大を検出する工程を含み、この工程において、アクセプター発光極大付近からドナー・フルオロフォア発光極大付近への発光極大のシフトがクロストリジウム毒素活性を示す。なおさらなる態様において、本発明の方法は、接触細胞のドナー・フルオロフォア発光極大付近の蛍光振幅に対するアクセプター発光極大付近での蛍光振幅の比を検出する工程を含み、ここでコントロール細胞と比較した接触細胞の比の減少はクロストリジウム毒素活性を示す。さらに別の態様において、本発明の方法は接触細胞におけるドナー・フルオロフォアの励起状態の寿命を検出する工程を含み、ここでコントロール細胞と比較した接触細胞におけるドナー・フルオロフォア励起状態寿命の増加はクロストリジウム毒素活性を示す。所望であれば、時間的に間隔を置いて共鳴得エネルギー転移を測定する工程を１回以上反復してもよい。さらに、所望であれば、クロストリジウム毒素活性に適した条件を選択してアッセイを線形にすることができる。
発明の詳細な説明
本発明は、試料中の活性クロストリジウム毒素の有無を測定するため、または全ての血清型のボツリヌス毒素および破傷風毒素を含むいずれかのクロストリジウム毒素の活性を測定するための、インビボおよびインビトロでの細胞ベースのアッセイを提供する。本発明の新規な基質組成物、細胞およびアッセイにより、動物毒性研究に対する必要性が減少し、さらになお、複数の毒性機能、すなわち、毒素の結合および細胞内取込、細胞質サイトゾルへのトランスロケーションおよびプロテアーゼ活性を分析するために役立つ。これらの新規な組成物および方法は、未精製かつ大量の試料ならびに高度に精製されている二本鎖毒素(dichain toxins)または製剤化した毒素製品を分析するために使用することができ、さらに自動化ハイスループットアッセイフォーマットに適用しやすい。
以下に述べるように、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ)は、二つの分子の電子励起状態における距離依存性の相互作用であり、ここでは光子は発光されることなく励起がドナー・フルオロフォアからアクセプターに転移される。エネルギー転移の過程は、ドナー・フルオロフォアの蛍光強度および励起状態寿命の減少（クエンチング）を生じ、アクセプターがフルオロフォアの場合はアクセプターの発光強度の増加を生じる。活性毒素を含む試料と接触させた後、本発明の細胞中でのクロストリジウム毒素基質の切断に際して、共鳴エネルギー転移は減少し、これは例えばドナー蛍光発光の増加、アクセプター蛍光発光の減少、またはアクセプター発光極大付近からドナー発光極大付近への発光極大のシフトにより検出することができる。必要であれば、試料中の活性クロストリジウム毒素の量は、ＦＲＥＴの程度の差異の関数として適当な基準を用いて計算することができる。
本発明が関係する破傷風およびボツリヌス神経毒素はクロストリジウム属によって産生される。これらの毒素は破傷風及びボツリヌス中毒症の神経麻痺症候群を引き起こし、破傷風毒素が主に中枢系に作用し、ボツリヌス毒素は末梢神経系に作用する。クロストリジウム神経毒素は類似の細胞中毒機序を共用し、神経伝達物質の放出を阻害する。ジスルフィド結合した二つのポリペプチド鎖より構成されるこれらの毒素において、大きい方のサブユニットは、神経特異的結合および小さい方のサブユニットの細胞質内へのトランスロケーションに関与する。ニューロン細胞内におけるトランスロケーションおよび還元の際、小さい方の鎖が、神経ニューロエキソサイトーシス(neuroexocytosis)に関与するタンパク質成分に特異的なペプチダーゼ活性を示す。クロストリジウム毒素の標的である「ＳＮＡＲＥ」タンパク質は、様々な非神経細胞タイプにおけるエキソサイトーシスに共通しており、ニューロンと同様にこれらの細胞において、軽鎖ペプチダーゼ活性がエキソサイトーシスを阻害する。
破傷風神経毒素およびボツリヌス神経毒素Ｂ、Ｄ、Ｆ、およびＧは、シナプス小胞膜内在性タンパク質であるＶＡＭＰ（シナプトブレビン(synaptobrevin)としても公知）を特異的に認識する。ＶＡＭＰは神経毒素に応じて異なる結合部位で切断される。ボツリヌスＡおよびＥ神経毒素は、シナプス前膜のタンパク質であるSNAP-25を、そのタンパク質のカルボキシ末端部分における二つの異なる部位で特異的に認識および切断する。ボツリヌス神経毒素Ｃは、SNAP-25に加えて、神経細胞膜タンパク質であるシンタキシン(syntaxin)を切断する。クロストリジウム神経毒素の三つのタンパク質標的は酵母からヒトまで保存されているが、切断部位および毒素感受性は必ずしも保存されていない（以下参照；Humeau et al., Biochimie 82:427 446 (2000); Niemann et al., Trends in Cell Biol. 4:179 185 (1994); および Pellizzari et al., Phil. Trans. R. Soc. London 354:259-268 (1999))も参照）。
天然の破傷風およびボツリヌス神経毒素は、リーダー配列のない１５０ｋＤａの不活性ポリペプチド鎖として産生される。これらの毒素は、露出したプロテアーゼ感受性ループのところで細菌または組織プロテイナーゼによって切断され、活性二本鎖毒素を生成し得る。天然のクロストリジウム毒素は、重鎖（Ｈ、１００ｋＤａ）および軽鎖（Ｌ、５０ｋＤａ）を架橋する鎖間ジスルフィド結合を一つ含む；このような架橋は、細胞外に加えられた毒素の神経毒性にとって重要である(Montecucco and Schiavo, Quarterly Rev. Biophysics 28:423-472 (1995))。
図１に示すように、クロストリジウム毒素は三つの別個の５０ｋＤａドメインに折り畳まれているようであり、各ドメインは別個の機能的役割を有する。図２に描かれるように、クロストリジウム毒素の細胞中毒機序は４つの異なる段階より成る：（１）結合、（２）内在化、（３）膜トランスロケーション、および（４）酵素的標的修飾。重鎖のカルボキシ末端部分（ＨＣ）は神経特異的結合において機能し、一方Ｈ鎖のアミノ末端部分（ＨＮ）は、膜トランスロケーションにおいて機能する。Ｌ鎖は、細胞内触媒活性に関与する(Montecucco and Schiavo, 前述, 1995)。
８種類のヒトクロストリジウム神経毒素のアミノ酸配列は、対応する遺伝子に由来している(Neimann, 「Molecular Biology of Clostridial Neurotoxins」、Sourcebook of Bacterial Protein Toxins Alouf and Freer (Eds.) 303-348頁、London: Academic Press 1991)。Ｌ鎖およびＨ鎖は、それぞれおよそ４３９および８４３残基より構成される。相同的なセグメントは、ほとんどまたは全く類似しない領域によって隔てられている。Ｌ鎖の最も良く保存された領域は、アミノ末端部分（１００残基）および中心領域（TeNTの２１６−２４４残基に対応）、および鎖間ジスルフィド結合を形成している二つのシステインである。この２１６−２４４の領域は、亜鉛−エンドペプチダーゼに特徴的なHis-Glu-X-X-His結合モチーフを含む。
クロストリジウム毒素重鎖は軽鎖ほど良好には保存されておらず、ＨＣのカルボキシ末端部分（TeNTの１１４０−１３１５残基に対応）が最も変化に富んでいる。このことは、ＨＣドメインが神経終末への結合に関与していること、および異なる神経毒素はおそらく異なる受容体に結合するという事実と一致する。
クロストリジウム毒素のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の比較により、それらが共通の先祖遺伝子に由来することがわかる。これら遺伝子の拡散は、クロストリジウム神経毒素遺伝子が移動性の遺伝子エレメント上に位置するという事実により促進されている可能性がある。以下にさらに述べるように、７種類のボツリヌス毒素の配列変異体が当該分野において公知である。例えば、図５から図７、および Humeau et al., 前述, 2000 参照。
前述のように、クロストリジウム神経毒素の本来の標的としては、ＶＡＭＰ、SNAP-25、およびシンタキシンが挙げられる。ＶＡＭＰはシナプス小胞膜に結合しており、一方SNAP-25およびシンタキシンは標的膜に結合している（図３参照）。BoNT/AおよびBoNT/EはSNAP-25をカルボキシ末端領域において切断してそれぞれ９または２６アミノ酸残基を放出し、BoNT/C1もまたSNAP-25をカルボキシ末端付近で切断する。ボツリヌス血清型BoNT/B、BoNT/D、BoNT/FおよびBoNT/G、および破傷風毒素は、ＶＡＭＰの保存された中心部分に作用し、ＶＡＭＰのアミノ末端部分を細胞質ゾル中へ放出する。BoNT/C1は、シンタキシンを細胞質膜表面付近の単一の部位で切断する。従ってBoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/F、BoNT/G、およびTeNTのタンパク質分解により、ＶＡＭＰおよびシンタキシンの細胞質ドメインの大部分が放出されるが、一方BoNT/A、BoNT/C1またはBoNT/Eの切断によっては、SNAP-25の小さな部分しか放出されない (Montecucco and Schiavo, 前述, 1995)。
膜貫通セグメントを欠く約２０６残基のタンパク質である天然のSNAP-25は、神経細胞膜の細胞質ゾル表面に結合している（図３、Hodel et al., Int. J. Biochemistry and Cell Biology 30:1069-1073 (1998)も参照）。ショウジョウバエから哺乳動物まで高度に保存されたホモログに加えて、SNAP-25関連タンパク質はまた酵母からもクローニングされている。SNAP-25は発生中の軸索伸長に必要であり、また成熟神経系における神経終末可塑性にとって必要な可能性がある。ヒトにおいては、発生中に二つのアイソフォームが異なって発現する；アイソフォームａは、胎児段階の発生の間に構成的に発現し、一方アイソフォームｂは出生時に現れ成年期に優性になる。SNAP-23のようなSNAP-25アナログもまた、神経系外部、例えば膵臓細胞に発現している。
天然のＶＡＭＰは約１２０残基のタンパク質であり、正確な長さは種およびアイソタイプに依存する。図３に示すように、ＶＡＭＰは短いカルボキシ末端セグメントを小胞内腔内に含むが、一方でその分子のほとんどは細胞質ゾルに露出している。プロリンリッチなアミノ末端３０残基は種およびアイソフォーム間で相違するが、ＶＡＭＰの中心部分（３０−９６残基）は荷電および親水性残基に富み、かつ既知の切断部位を含み、高度に保存されている。ＶＡＭＰは、シナプトフィジンとともにシナプス小胞膜上に局在している。
ヒト、ラット、ウシ、シビレエイ、ショウジョウバエ、酵母、イカおよびアメフラシのホモログを含む、様々なＶＡＭＰの種ホモログが当該分野において知られている。さらに、VAMP-1、VAMP-2およびセルブレビン(cellubrevin)を含む、多数のVAMPアイソフォームが同定されており、かつ非神経細胞において非感受性型が同定されている。VAMP-1およびVAMP-2の分布は相異なる細胞タイプにおいて様々であるが、VAMPはおそらくすべての脊椎動物組織に存在する。ニワトリおよびラットのVAMP-1は、TeNTまたはBoNT/Bによっては切断されない。これらのVAMP-1ホモログは、TeNTまたはBoNT/B切断部位において、ヒトまたはマウスVAMP-1ではグルタミンが存在する場所にバリンを有する。置換はBoNT/D、／Ｆ、または／Ｇには影響せず、それらはVAMP-1およびVAMP-2の両方を同様の率で切断する。
シンタキシンは神経細胞膜の細胞質ゾル表面に位置し、カルボキシ末端セグメントを介して膜に固定されており、そのタンパク質のほとんどが細胞質ゾルに露出している。シンタキシンは、シナプス前膜の活性領域にカルシウムチャンネルと共に局在し、ここで神経伝達物質の放出が起こる。さらに、シンタキシンはＳＳＶ膜タンパク質であるシナプトタグミンと相互作用し、細胞膜と小胞の間に機能的架橋を形成する。様々なシンタキシンアイソフォームが同定されている。幾分長さの異なる二つのアイソフォーム（２８５残基および２８８残基）が神経細胞において同定されており（アイソフォーム１Ａおよび１Ｂ）、アイソフォーム２、３、４、および５は他の組織で発現されている。異なるアイソフォームはBoNT/C1に対する感受性が様々であり、シンタキシン１Ａ、１Ｂ、２および３アイソフォームが本毒素によって切断される。
本発明は、送達薬剤、ならびにクロストリジウム毒素基質を含有する基質組成物を提供し、該クロストリジウム毒素基質は、ドナー・フルオロフォア；ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；およびドナー・フルオロフォアとアクセプターの間にある切断部位を含み、適切な条件下、共鳴エネルギー転移はドナー・フルオロフォアとアクセプターの間で見られるクロストリジウム毒素認識配列を含む。本発明の基質組成物において、送達薬剤は、例えば、クロストリジウム毒素基質に共有結合されていてもよく、さらに例えば、タンパク質、ペプチド又はペプチド模倣物であってもよい。１つの態様において、基質組成物はキメラタンパク質、ペプチドまたはペプチド模倣物であり、送達薬剤はクロストリジウム毒素基質と作動可能に縮合している。このようなキメラ基質組成物は、例えば、最大５０または１００残基長を有するペプチドまたはペプチド模倣物であり得る。
本発明の基質組成物において、種々の送達薬剤をクロストリジウム毒素基質に共有結合させることができ、これにはアンテナペディアタンパク質またはその活性フラグメント（例えば、アミノ酸配列：RQIKIWFQNRRMKWKK（配列番号１）を有する活性フラグメント）、HIV TATタンパク質またはその活性フラグメント（例えば、アミノ酸配列：YGRKKRRQRRR（配列番号２）を有する活性フラグメントまたは単純ヘルペスウィルスVP22タンパク質またはその活性フラグメント（例えば、アミノ酸配列（配列番号３）を有する単純ヘルペスウィルスVP22タンパク質又はその活性フラグメント）が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明はまた、送達薬剤がクロストリジウム毒素基質に非共有的に結合している基質組成物を提供する。非共有結合でクロストリジウム毒素基質と結合することができる代表的な送達薬剤としては、ChariotTMおよびMPGペプチドが挙げられるが、これらに限定しない。
種々のドナー・フルオロフォアおよびアクセプターが本発明の基質組成物において有用である。非限定的な例として、本発明において有用なドナー・フルオロフォアとしては、Alexa Fluor（登録商標）488、DABCYLおよびBODIPYが挙げられる。本発明において有用なアクセプターとしては、非蛍光アクセプターおよびアクセプター・フルオロフォアが挙げられ、１態様において、アクセプターは少なくとも１マイクロ秒の蛍光寿命を有するアクセプター・フルオロフォアである。他の態様において、本発明はアクセプターがテトラメチルローダミン、EDANSまたはQSY(登録商標)7である基質組成物を提供する。本発明の基質組成物において有用な代表的なドナー・フルオロフォア・アクセプター・ペアとしては、フルオレセイン-テトメチルローダミン、Alexa Fluor(登録商標)488-テトメチルローダミン、DABCYL-EDANS、蛍光色素-QSY(登録商標)7およびAlexa Fluor(登録商標)-488-QSY(登録商標)7が挙げられるが、これらに限定しない。
本発明の基質組成物において種々のクロストリジウム毒素基質が有用である。このようなクロストリジウム毒素基質としては、ボツリヌス毒素認識配列を含むボツリヌス毒素基質および破傷風毒素認識配列を含む破傷風毒素基質が挙げられる。従って、１態様において、本発明は送達薬剤およびBoNT/A基質を含むBoNT/A基質組成物を提供し、該基質はドナー・フルオロフォア；ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および切断部位がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間にあり、適切な条件下で共鳴エネルギー転移はドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間で示されるBoNT/A認識配列を含む。BoNT/A基質としては、例えば、少なくとも６個のSNAP-25の連続残基（該６個の連続残基はGln-Argを含む）またはそのペプチド模倣物を挙げることができる。本発明のBoNT/A基質組成物は、例えば、最大２０、３０、４０、５０または１００残基を有するペプチドまたはペプチド模倣物であり得、種々のドナー・フルオロフォア・アクセプター組合せの任意のものを含み得、これには、フルオレセイン-テトラメチルローダミン、DABCYL-EDANSおよびAlexa Fluor(登録商標)488-QSY(登録商標)7を挙げることができるがこれらに限定されない。
また、本発明は送達薬剤およびBoNT/B基質を含有するBoNT/B基質組成物を提供し、該基質はドナー・フルオロフォア；ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および切断部位がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間にあり、適切な条件下で共鳴エネルギー転移がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間で示されるBoNT/B認識配列を含む。本発明に有用なBoNT/B基質としては、例えば、少なくとも６個のVAMPの連続残基（該６個の連続残基はGln-Pheを含む）またはそのペプチド模倣物が挙げられ得る。本発明のBoNT/B基質組成物は、例えば、最大２０、３０、４０、５０または１００残基を有するペプチドまたはペプチド模倣物であり得る。種々のドナー・フルオロフォア-アクセプター組合せが本発明のBoNT/B基質組成物において有用であり、このようなフルオロフォア-アクセプター・ペアとしてはフルオレセイン-テトラメチルローダミン、DABCYL-EDANSおよびAlexa Fluor(登録商標)488-QSY(登録商標)7を挙げることができるがこれらに限定しないことが理解される。
さらに、送達薬剤およびBoNT/C1基質を含むBoNT/C1基質組成物が本明細書中に提供され、該基質はドナー・フルオロフォア；ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および切断部位がドナー・フルオロフォアおよびアクセプターの間にあり、適切な条件下で共鳴エネルギー転移がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間で示されるBoNT/C1認識配列を含む。本発明の基質組成物において有用なBoNT/C1基質としては、シンタキシンの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はLys-Alaを含む）またはそのペプチド模倣物を有する基質、SNP-25の少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はArg-Alaを含む）またはそのペプチド模倣物を有する残基が挙げられる。本発明のBoNT/C1基質組成物は、例えば、種々の長さを有するペプチドまたはペプチド模倣物であり、例えば、最大２０、３０、４０、５０または１００残基を有するペプチドまたはペプチド模倣物であり得る。種々のドナー・フルオロフォア-アクセプター組合せが本発明のBoNT/C1基質組成物において有用であり、フルオレセイン-テトラメチルローダミン、DABCYL-EDANSおよびAlexa Fluor(登録商標)488-QSY(登録商標)7を挙げることができるがこれらに限定しない。
また、本発明は送達薬剤およびBoNT/D基質を含有するBoNT/D基質組成物を提供し、該基質はドナー・フルオロフォア；ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および切断部位がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間にあり、適切な条件下で共鳴エネルギー転移がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間で示されるBoNT/D認識配列を含む。種々のBoNT/D基質が本発明の基質組成物に有用であり、これには、VAMPの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はLys-Leuを含む）またはそのペプチド模倣物を含むBoNT/D基質が挙げられるが、これらに限定しない。上記の他の基質組成物に関しては、BoNT/D基質組成物は、例えば、最大２０、３０、４０、５０または１００残基を有するペプチドまたはペプチド模倣物であり得、任意の種々のドナー・フルオロフォア-アクセプター組合せ（例えば、フルオレセイン-テトラメチルローダミン、DABCYL-EDANSまたはAlexa Fluor(登録商標)488-QSY(登録商標)7）を挙げることができる。
さらに、本発明は送達薬剤およびBoNT/E基質を含有するBoNT/E基質組成物を提供し、該基質はドナー・フルオロフォア；ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および切断部位がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間にあり、適切な条件下で共鳴エネルギー転移がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間で示されるBoNT/E認識配列を含む。本発明において有用なBoNT/E基質は、例えば、SNAP-25の少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はArg-Ileを含む）またはそのペプチド模倣物を有しうる。本発明のBoNT/E基質組成物は、例えば、最大２０、３０、４０、５０または１００残基を有するペプチドまたはペプチド模倣物であり得る。さらにこのような基質組成物として、例えば、ドナー・フルオロフォア-アクセプター組合せ（例えば、フルオレセイン-テトラメチルローダミン、DABCYL-EDANSおよびAlexa Fluor(登録商標)488-QSY(登録商標)7）を挙げることができる。
また、送達薬剤およびBoNT/F基質を含有するBoNT/F基質組成物が本明細書において提供され、該基質はドナー・フルオロフォア；ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および切断部位がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間にあり、適切な条件下で共鳴エネルギー転移がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間で示されるBoNT/F認識配列を含む。本発明の基質組成物において有用なBoNT/F基質は、例えば、VAMPの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はGln-Lysを含む）またはそのペプチド模倣物を有しうる。さらに、本発明のBoNT/F基質組成物は、例えば、最大２０、３０、４０、５０または１００残基を有するペプチドまたはペプチド模倣物であり得る。当業者であれば、任意の種々のフルオロフォア-アクセプター組合せがBoNT/F基質組成物中で有用であり、これらには、非限定的な例として、フルオレセイン-テトラメチルローダミン、DABCYL-EDANSおよびAlexa Fluor(登録商標)488-QSY(登録商標)7が挙げられることを理解する。
本発明はさらに、送達薬剤およびBoNT/G基質を含有するBoNT/G基質組成物を提供し、該基質はドナー・フルオロフォア；ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および切断部位がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間にあり、適切な条件下で共鳴エネルギー転移がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間で示されるBoNT/G認識配列を含む。有用なBoNT/G基質としては、VAMPの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はAla-Alaを含む）またはそのペプチド模倣物を有しうる基質が挙げられるがこれらに限定しない。本発明のBoNT/G基質組成物は、例えば、最大２０、３０、４０、５０または１００残基を有するペプチドまたはペプチド模倣物であり、例えば、ドナー・フルオロフォア-アクセプター組合せ（例えば、フルオレセイン-テトラメチルローダミン、DABCYL-EDANSまたはAlexa Fluor(登録商標)488-QSY(登録商標)7）を挙げることができる。
本発明はまた、送達薬剤およびTeNT基質を含有するTeNT基質組成物を提供し、該基質はドナー・フルオロフォア；ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および切断部位がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間にあり、適切な条件下で共鳴エネルギー転移がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間で示されるTeNT認識配列を含む。種々のTeNT基質が本発明の基質中において有用であり、VAMPの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はGln-Pheを含む）またはそのペプチド模倣物を有しうる基質が挙げられる。このような、本発明のTeNT基質組成物は、例えば、最大２０、３０、４０、５０または１００残基を有するペプチドまたはペプチド模倣物であり得る。さらに、種々のフルオロフォア-アクセプター組合せが本発明のTeNT基質組合せにおいて有用であり、これらの組合せとしては、フルオレセイン-テトラメチルローダミン、DABCYL-EDANSおよびAlexa Fluor(登録商標)488-QSY(登録商標)7を挙げることができるがこれらに限定しない。
本発明の基質組成物では、送達薬剤によりクロストリジウム毒素基質の細胞（例えば、ニューロンまたは膵腺房細胞のような腺細胞）への取込が容易になる。送達薬剤はクロストリジウム毒素基質に共有結合されるか、またはクロストリジウム毒素基質と非共有的な会合により結合し得る。非限定的な例として、本発明の基質組成物において有用な送達薬剤には、アンテナペディアタンパク質、HIV TATタンパク質、単純ヘルペスウィルスVP22タンパク質およびそれらの活性フラグメント、ならびにChariotTMおよび他のMPGペプチドのような送達薬剤が挙げられる（これらは各々以下にさらに記載する）。
本明細書中で用いる用語「送達薬剤」は、会合型または結合型クロストリジウム毒素 基質の細胞内へのインターナリゼーションを可能にする、または増加させる任意の分子を意味する。送達薬剤は当該分野において公知であり、例としてタンパク質形質導入ペプチドおよびペプチド模倣物および細胞透過性ペプチドおよびペプチド模倣物が挙げられるが、これらに限定しない。用語、送達薬剤は、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子、核酸分子、リポソーム、脂質、ウィルス、レトロウィルスおよび細胞を含むが、これらに限定しない。本発明に有用な送達薬剤を含む基質組成物は、通常、インターナリゼーションの際に細胞内小胞中には保持されず、それよりも最終的には細胞質等に送達される。従って、用語、送達薬剤は、細胞細胞質または核へと会合型または連結型基質を輸送する分子を含むが、これらに限定しない。さらに、用語「送達薬剤」は、任意のメカニズムによりインターナライズされる分子を包含し、これには受容体介在エンドサイトーシスを介して機能する送達薬剤および受容体介在エンドサイトーシスと無関係の送達薬剤が含まれることが理解される。
種々の送達薬剤を本発明の組成物におけるクロストリジウム毒素基質に共有結合することができ、これにはタンパク質形質導入ペプチド、細胞透過性ペプチド、ホスフォペプチド、D-アミノ酸を含むペプチド、および他の変性型またはホールディング型、修飾型または非修飾型の、天然または合成のタンパク質、ペプチドおよびペプチド模倣物が含まれるが、これらに限定しない。このような送達薬剤としては、核タンパク質および分泌型タンパク質およびそれらの活性フラグメントおよびアナログが挙げられるが、これらに限定しない。特定の態様において、本発明において有用な送達薬剤は50残基長未満、40残基長未満、30残基長未満、20残基長未満または15残基長未満の長さを有するペプチドまたはペプチド模倣物である。さらなる態様において、本発明において有用な送達薬剤は主に疎水性のペプチドまたはペプチド模倣物である。別の態様において、本発明において有用な送達薬剤は主に塩基性のペプチドまたはペプチド模倣物である。さらに別の態様において、本発明において有用な送達薬剤は、両親媒性αへリックスのペプチドまたはペプチド模倣物のようなαへリックスのペプチドまたはペプチド模倣物である。さらなる態様において、本発明において有用な送達薬剤は塩基性両親媒性のペプチドまたはペプチド模倣物のような、両親媒性ペプチドまたはペプチド模倣物である。そしてさらなる態様において、本発明において有用な送達薬剤は変性ペプチドまたは変性ペプチド模倣物であり、これは変性型またはフォールディング型クロストリジウム毒素基質に連結されている。変性は、例えば、WO 99/55899に記載されるように、インターナリゼーションを容易にすることが示されている。
非限定的な例として、クロストリジウム毒素基質に共有結合した場合に、本発明で用いるために適した送達薬剤としては、毛様体神経栄養因子 (CNTF) またはその活性フラグメント、カベオリン(caveolin)またはその活性フラグメント、インターロイキン-1β(IL-1β)またはその活性フラグメント、チオレドキシンまたはその活性フラグメント、アンテナペディアまたはその活性フラグメント（例えば、ペネトラチン(penetratin)-1 (配列番号1))、線維芽細胞増殖因子-1 (FGF-1) またはその活性フラグメント、エングレイルド(Engrailed)またはその活性フラグメント、Hoxa-5またはその活性フラグメント、カポジ 線維芽細胞増殖因子(kFGF)またはその活性フラグメント（例えば、AAVALLPAVLLALLAP (配列番号22）、ヒトβ３インテグリンまたはその活性フラグメント（例えば、疎水性シグナル配列）、核内保留配列(nuclear localization sequence) (NLS) （例えば、TPPKKKRKVEDP (配列番号23)）、FGF-2またはその活性フラグメント、トランスポータン(transportan)またはその活性フラグメント(例えば、GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (配列番号24))、ラクトフェリンまたはその活性フラグメント、VP22またはその活性フラグメント、HIVＩ型トランス作用因子 (HIV TAT) またはその活性フラグメント(例えば、YGRKKRRQRRR (配列番号２))、または熱ショックタンパク質(例えば、HSP70またはその活性フラグメント）が挙げられる。これらおよび追加の送達薬剤は、例えば、Ho, Cancer Res. 61:474-477 (2001); Schwarze and Dowdy, Trends Pharmacol. Sci. 21:45-48 (2000); Prochiantz, Curr. Opin. Cell Biol. 12:400-406 (2000); Ford et al., Gene Therapy 8:1-4 (2001); Dunican and Doherty, Biopolymers Peptide Sci. 60:45-60 (2001)および Schwartz and Zhang, Curr. Opin. Mol. Ther. 2:162-167 (2000)に記載されているように当該分野において周知である。
１態様において、本発明はホメオタンパク質(homeoprotein)またはその活性フラグメント(例えば、ホメオドメインまたはその活性フラグメント)である送達薬剤を用いて実施される。ホメオタンパク質はへリックス・ターン・へリックスタンパク質であり、これはホメオドメインと称される約６０残基のDNA結合ドメインを含む。種々のホメオタンパク質、ホメオドメインおよびその活性フラグメントが本発明において有用な送達薬剤であるかもしれず、これにはアンテナペディア、エングレイルド１ (Enl)、エングレイルド２ (En2)、Hoxa-5、Hoxc-8、Hoxb-4およびKnotted-1 (KN1)が挙げられるが、これらに限定しない。例えば、En1およびEn1はCOS7細胞内で発現されており、この場合は最初に分泌された後に他の細胞によりインターナリゼーションされる。例えば、Prochiantz, 前述、 2000を参照。
別の態様において、本発明の基質組成物は、ホメオドメインタンパク質、アンテナペディア、またはそれらの活性フラグメントである送達薬剤を含む。アンテナペディアは、神経膜を横切って転位する発生段階に重要なショウジョウバエのホメオタンパク質のファミリーの一員である。アンテナペディアホメオドメインの３番目のへリックスである16残基ペプチド「ペネトラチン（penetratin）-1」(配列番号１)は、生存細胞内にインターナライズされる。インターナリゼーションは３７℃と４℃の両方で生じ、送達が受容体介在性またはエネルギー依存性のいずれでもないことを示している。さらなる送達薬剤としては、ペネトラチン−１に対する配列に関連したペプチドおよびペプチド模倣物 (例えば、以下の表Ａに示されるペプチドのいずれか１つまたは別のペネトラチン由来ペプチドまたはペプチド模倣物を含むがこれらに限定しない) が挙げられ、レトロインバース(retroinverse)または全D-アミノ酸ペプチドまたはペプチド模倣物、または関連しているがαへリックスではないペプチドまたはペプチド模倣物(例えば、Prochiantz、前述、2000、参照)を含む。１態様において、このようなペネトラチン由来ペプチドは、ペネトラチン-1（配列番号１）のトリプトファン、フェニルアラニンおよびグルタミン残基を保持する。
Figure 2006502378
別の態様において、本発明の基質組成物としてはHIVトランス作用因子(TAT)タンパク質またはその活性フラグメントである送達薬剤が挙げられる。このような送達薬剤としては、例えば、HIV TATの47〜57または47〜59残基と同一または類似の配列を挙げることができる (Schwartz et al., Science 285:1569-1572 (1999)およびHo et al.,前述、2001)。例えば、インビトロおよびインビボでヒトおよびマウス細胞の原形質膜を貫くHIV TATの47〜57残基 (YGRKKRRQRRR；配列番号２)を含む融合タンパク質 (Schwartz and Zhang, 前述、2000)等、15〜120KDaの種々のタンパク質が、HIV TAT送達薬剤に融合させた場合に生物学的活性を保持することが示されている。HIV TAT送達薬剤は正に荷電していてもよく、例えば、エネルギー、受容体、トランスポーターおよびエンドサイトーシスに依存しない様式で機能して共有結合したクロストリジウム毒素基質を、例えば、標的細胞の90〜100％に送達させることができる。
また、本発明の基質組成物は送達薬剤として単純ヘルペスウィルスVP22タンパク質またはその活性フラグメントを挙げることができる。１態様において、本発明の基質組成物はHSV I型(HSV-1) VP22タンパク質またはその活性フラグメントを含む。核転写因子であるHSV VP22は、非古典的エンドサイトーシスを介して原形質膜を通り、GAP接合部および物理的接触とは関係なく細胞に侵入することができる。種々の異なるタンパク質との融合物として、HSV VP22は異なる型の細胞(最終分化細胞を含む)への取込を生じ (Ford et al., 前述、2001; Schwartz and Zhang, 前述、2000)、例えば、培養細胞の90〜100％に架橋型クロストリジウム毒素基質を送達するように機能することができる。
別の態様において、本発明において有用な送達薬剤は、疎水性シグナル配列に対応するか、または由来する。このような送達薬剤は、例えば、カポジ線維芽細胞増殖因子(kFGF)またはその活性フラグメント（例えば、AAVALLPAVLLALLAP (配列番号22)）、ヒトβ3インテグリンまたはその活性フラグメントまたは別の疎水性送達薬剤（例えば、Dunican and Doherty, 前述, 2001に記載のもののうちの１つであり得る。
また、本発明において有用な送達薬剤は天然の送達薬剤(例えば、タンパク質形質導入ドメイン(PTD))の特徴を１つ以上共有する合成配列であり得る。このような送達薬剤としては、L-およびD-アルギニンオリゴマー(例えば、L-またはD-アルギニンおよび関連ペプチドの９マー(Wender et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 97:13003-13008 (2000))が挙げられるがこれらに限定しない。さらに、このような送達薬剤としては、塩基性ペプチドおよびペプチド模倣物、塩基性αへリックスペプチドおよびペプチド模倣物ならびにHIV TATの47〜57残基のような天然タンパク質形質導入ドメインと比較して最適化されたアルギニンアラインメントまたは最適化されたαへリックス特性を有するペプチドおよびペプチド模倣物が挙げられる。例えば、Ho et al., 前述、2001およびWO 99/29721を参照のこと。本発明において有用な送達薬剤のさらに非限定的な例としては、SCWKn (配列番号32)、(LARL)n (配列番号33)、HA2、RGD、K16RGD (配列番号34)、ロリゴマー(loligomer)、AlkCWK18 (配列番号35)、DiCWK18 (配列番号36)、DipaLytic、Plae (配列番号37)、Kplae (配列番号38)、および当該分野において公知であるか、または日常的手順で製造することができる他の送達薬剤が挙げられる(例えば、Schwartz and Zhang, 前述, 2000、参照)。当業者であれば、これらおよび他の天然の送達薬剤および合成送達薬剤が本発明の基質組成物において有用であり得ることを理解する。
また、本発明において有用な送達薬剤は、非共有結合により会合したクロストリジウム毒素基質の細胞内取込を可能にする、または増加させる薬剤であり得る。１態様において、このような送達薬剤は２個の独立したドメイン（疎水性ドメインおよび親水性ドメイン）を含むペプチドである。別の態様において、このような送達薬剤はMPGペプチドであり、SV40大型T抗原HIV-1の核内保留配列(NLS)およびHIV-1 gP41の融合ペプチドドメインの両方に由来するペプチドである。さらなる態様において、このような送達薬剤はアミノ酸配列GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV (配列番号39)を有するMPGペプチドである。なおさらなる態様において、このような送達薬剤はPep-1のような両親媒性ペプチドである。共有結合非存在下で機能するこれらおよび関連する送達薬剤（しばしば、「タンパク質トランスフェクション製品」としても公知）は、例えば、Morris et al., Nucl. Acids Res. 27:3510-3517 (1999); Morris et al., J. Biol. Chem. 274:24941-24946 (1999)およびMorris et al., Nature Biotech. 19:1173-1176 (2001)に記載されているように当該分野において周知である。このようなペプチド送達薬剤は日常的な方法により製造することができ、市販されている（例えば、ChariotTM製品はActive Motif (Carlsbad, Calif.)から入手）。
本発明において有用なクロストリジウム毒素基質として、１つはドナー・フルオロフォアが挙げられる。本明細書中で用いる用語「ドナー・フルオロフォア」は、ある波長の光が照射されたときに、異なる波長の光（蛍光とも称する）を放出する分子を意味する。用語フルオロフォアは、当該分野において「蛍光色素（フルオロクローム）」なる用語と同義語である。
また、本発明において有用なクロストリジウム毒素基質として、１つはアクセプターが挙げられる。本明細書中で用いる用語「アクセプター」は、ドナー・フルオロフォアからその励起の際にエネルギーを吸収することができる分子を意味し、フルオロフォアおよび非蛍光分子を包含する用語である。クロストリジウム毒素基質において有用なアクセプターは、基質中に含まれるドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有する。通常、本発明において有用なアクセプターは、ドナー・フルオロフォアの励起に適した波長での吸収はかなり低い。
上記のように、アクセプターはドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有する。本明細書中で用いる用語「重なる」は、本明細書中でアクセプターの吸収スペクトルおよびドナー・フルオロフォアの発光スペクトルに関して用いる場合、部分的または完全に共有する吸収スペクトルおよび発光スペクトルを意味する。従って、このような重なるスペクトルでは、ドナー・フルオロフォア発光スペクトルの範囲の上限(high end)はアクセプター吸収スペクトルの範囲の下限(low end)よりも高い。
本発明において有用なクロストリジウム毒素基質は、ドナー・フルオロフォアおよびドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプターの間に「ある」切断部位を含む。従って、切断部位をフルオロフォアとアクセプターとの間に配置することにより、この部位での切断がフルオロフォアを含む第１の分子とアクセプターを含む第２の分子を生じる。クロストリジウム毒素認識配列の全てまたは一部のみがドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間にあるかもしれないことが理解される。
本発明において有用なクロストリジウム毒素基質は、１つとして、切断部位を含むクロストリジウム毒素認識配列を含む。このようなクロストリジウム毒素基質は、クロストリジウム毒素プロテアーゼ活性に適した条件下での少なくとも１つのクロストリジウム毒素による切断に感受性である。
本明細書中で用いる用語「クロストリジウム毒素認識配列」は、クロストリジウム毒素プロテアーゼ活性に適した条件下、クロストリジウム毒素によって切断容易な結合におけるタンパク分解を検出可能とするのに十分な近接または非近接認識エレメントを備えた切断容易な結合を意味する。種々の有用なクロストリジウム毒素認識配列を本明細書中以下に記載する。
具体的な態様において、本発明の基質組成物は、キメラのタンパク質、ペプチドまたはペプチド模倣物である。本発明の基質組成物は、例えば、最大20残基、最大40残基、最大50残基、最大100残基、最大150残基、最大200残基、最大250残基、最大300残基、最大350残基または最大400残基を有するキメラのペプチドまたはペプチド模倣物であり得る。
本明細書中で用いる用語「ペプチド模倣物」は、それが構造的に基づいているペプチド基質と同じクロストリジウム毒素によって切断されるペプチド様分子を意味するのに広く使用される。そのようなペプチド模倣物は、化学修飾ペプチド、非天然アミノ酸を含有するペプチド様分子、およびペプトイド（Ｎ置換グリシンのオリゴマー集合より生じるペプチド様分子）を含み、そのペプチド模倣物が由来するペプチド基質と同じクロストリジウム毒素によって切断される（例えば、Goodman and Ro, Peptidomimetics for Drug Design, 「Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery」、第１巻 (ed. M.E. Wolff; John Wiley & Sons 1995)、803-861頁参照）。
種々のペプチド模倣物が当該分野において公知であり、例えば、拘束（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）アミノ酸、ペプチド二次構造を模倣する非ペプチド構成要素、またはアミド結合イソスター(isostere)を含有するペプチド様分子を含む様ペプチド様分子が挙げられる。拘束非天然アミノ酸を含むペプチド模倣物としては、例えば、αメチル化アミノ酸、α，α−ジアルキルグリシンまたはα−アミノシクロアルカンカルボン酸;Ｎα−Ｃα環化アミノ酸; Ｎα−メチル化アミノ酸；β−またはγ−アミノシクロアルカンカルボン酸;α，β−不飽和アミノ酸; β，β−ジメチルまたはβ−メチルアミノ酸;β-置換-2,3-メタノアミノ酸;Ｎ−ＣδまたはＣα−Ｃδ環化アミノ酸; または置換プロリンまたは別のアミノ酸模倣物を含むことができる。さらに、ペプチド二次構造を模するペプチド模倣物は、例えば、非ペプチドβ-ターン模倣物、γ-ターン模倣物、βシート構造の模倣物、またはへリックス構造の模倣物を含むことができ、それら各々は、当業界において周知である。ペプチド模倣物はまた、例えば、レトロ-インバーソ（retro-inverso）改変のようなアミド結合イソスター；還元アミド結合；メチレンチオエーテルまたはメチレンスルホキシド結合; メチレンエーテル結合; エチレン結合; チオアミド結合; トランス-オレフィンまたはフルオロオレフィン結合; 1,5-二置換テトラゾール環; ケトメチレンまたはフルオロケトメチレン結合または別のアミドイソスターを含む、ペプチド様分子であってよい。当業者は、これらおよび他のペプチド模倣物が、本明細書で使用される用語「ペプチド模倣物」の意味に包含されることを理解している。
本明細書中において、例えば、ドナー・フルオロフォア；ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および切断部位がドナー・フルオロフォアとアクセプターの間にあり、適切な条件下、共鳴エネルギー転移がドナー・フルオロフォアとアクセプターの間で示されるクロストリジウム毒素認識配列を含むクロストリジウム毒素基質を含有する細胞を提供する。１態様において、該細胞はトランスフェクト細胞である。別の態様において、該細胞は安定にトランスフェクトした細胞である。本発明において種々の細胞が有用であり、初代培養細胞、株化細胞、ヒト細胞、神経細胞（例えば、初代培養ニューロン、株化ニューロンおよびヒトニューロン）および非神経細胞（例えば、膵腺房細胞のような腺細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に有用なニューロンとしては、CNSニューロン、および末梢ニューロンが挙げられ、非限定的な例として、このようなニューロンには、神経芽細胞腫、脊髄ニューロン、後根神経節ニューロン、大脳皮質ニューロン、小脳ニューロン、海馬ニューロンまたは運動ニューロンが挙げられる。
本発明の細胞において、場合により、クロストリジウム毒素基質は送達薬剤に共有結合により連結されていてもよい。このような送達薬剤は、例えば、タンパク質、ペプチドまたはペプチド模倣物であってもよい。種々の送達薬剤が本発明の細胞において有用であり得、これにはアンテナペディアタンパク質またはその活性フラグメント（例えば、アミノ酸配列RQIKIWFQNRRMKWKK (配列番号１)を有する活性フラグメント）、HIV TATタンパク質またはその活性フラグメント（例えば、アミノ酸配列YGRKKRRQRRR (配列番号2)を有する活性フラグメント）または単純ヘルペスウィルスVP22タンパク質またはその活性フラグメント（例えば、アミノ酸配列配列番号3を有する単純ヘルペスウィルスVP22タンパク質またはその活性フラグメント）が挙げられるが、これらに限定されない。１態様において、本発明はクロストリジウム毒素基質および該基質に作用可能に縮合している送達薬剤を含むキメラタンパク質、ペプチドまたはペプチド模倣物を含む細胞を提供する。このようなキメラタンパク質、ペプチドまたはペプチド模倣物は、例えば、最大50または100残基長を有しうる。
種々のクロストリジウム毒素基質は、本発明の細胞中に含まれうる。このようなクロストリジウム毒素基質としては、全血清型のボツリヌス毒素基質ならびに破傷風毒素基質が挙げられる。１態様において、本発明は、１つとしてBoNT/A認識配列を有するBoNT/A基質を含む細胞を提供する。このようなBoNT/A基質としては、例えば、SNAP-25の少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はGln-Argを含む）またはそれらのペプチド模倣物をあげることができる。別の態様において、本発明は１つとしてBoNT/B認識配列を有するBoNT/B基質を含む細胞を提供する。本発明の細胞において有用なBoNT/B基質としては、VAMPの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はGln-Pheを含む）またはそれらのペプチド模倣物を有する基質を挙げることができるが、これらに限定しない。さらなる態様において、本発明は１つとして、BoNT/C1認識配列を含むBoNT/C1基質を含有する細胞を提供し、本発明の細胞に有用なBoNT/C1基質はシンタキシンの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はLys-Alaを含む）またはそのペプチド模倣物を有するもの、ならびにSNAP-25の少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はArg−Alaを含む）またはそのペプチド模倣物を有するものが挙げられる。別の態様において、本発明は１つとしてBoNT/D認識配列を含むBoNT/D基質を含有する細胞を提供する。種々のBoNT/D基質は本発明の細胞において有用であり、VAMPの少なくとも６個の連続残基を有するBoNT/D基質（該６個の連続残基はLys-Leuを含む）またはそのペプチド模倣物が挙げられるが、これに限定されない。
さらなる態様において、本発明は、１つとしてBoNT/E認識配列を有するBoNT/E基質を含む細胞を提供する。このようなBoNT/E基質は、例えば、SNAP-25の少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はArg-Ileを含む）またはそのペプチド模倣物を有し得る。さらなる態様において、１つとしてBoNT/F認識配列を有するBoNT/F基質を含む細胞を本明細書中において提供する。本発明の細胞において有用なBoNT/F基質は、例えば、VAMPの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はGln-Lysを含む）またはそのペプチド模倣物を有しうる。なおさらなる態様において、本発明は１つとしてBoNT/G認識配列を有するBoNT/G基質を含む細胞を提供する。有用なBoNT/G基質としては、VAMPの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はAla-Alaを含む）またはそのペプチド模倣物を有するものが挙げられるが、これらに限定するわけではない。さらなる態様において、本発明は、１つとして、TeNT認識配列を有するTeNT基質を含む細胞を提供する。種々のTeNT基質が本発明において有用であり、これにはVAMPの少なくとも６個の連続する残基（該６個の連続残基はGln-Pheを含む）またはそのペプチド模倣物を有するものが挙げられるが、これらに限定するわけではない。
本明細書中にさらに記載するように、種々のドナー・フルオロフォアおよびアクセプターが本発明の細胞において有用である。本発明において有用なドナー・フルオロフォアとしては、Alexa Fluor(登録商標)488、DABCYLおよびBODIPYが挙げられるが、これらに限定しない。本発明において有用なアクセプターとしては、非蛍光アクセプターおよびアクセプター・フルオロフォア（少なくとも１μ秒の蛍光寿命を有するアクセプター・フルオロフォアを含む）が挙げられる。さらに、本発明の細胞において有用なアクセプターとしては、テトラメチルローダミン、EDANSおよびQSY(登録商標)7が挙げられる。
本明細書中で用いる用語「細胞」は、クロストリジウム毒素に結合する受容体を少なくとも１つ発現するか、または発現するように遺伝子操作されているかもしれない任意の真核細胞を意味する。用語、細胞は、初代培養細胞、培養細胞、株化細胞、正常細胞、形質転換細胞、腫瘍細胞、感染細胞、安定なまたは一過的なトランスフェクト細胞（安定かつ一過的なトランスフェクト細胞を含む）および増殖性および最終分化細胞、ならびに種々の種および細胞型の細胞を含むが、これらに限定しない。従って、細胞との用語は、例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ウマ、霊長類およびヒト細胞のような哺乳動物細胞を含むが、これらに限定しない。本発明において有用な細胞は、増殖期または静止期のような任意の状態で、無傷であるか、またはエレクトロポレーションまたはジギトニンでの処理等を介して透過化 (permeabilized)されており、さらに単離型であるであるか、または異種細胞集団、組織または器官の一部であり得ることが理解される。さらに、本発明に有用な細胞としては、構成性または誘導性プロモーターの制御下でクロストリジウム毒素基質を発現するものが挙げられ、本発明において有用なこれらおよび他の細胞は１種またはそれ以上の内因性クロストリジウム毒素標的タンパク質を発現しうるか、または低レベルまたは検出不可能なレベルの１種または全ての標的タンパク質（例えば、SNAP-25、VAMPおよびシンタキシン）を発現し得ることが理解される。
本発明において有用な細胞としては、１種またはそれ以上の低親和性または高親和性の内因性クロストリジウム毒素受容体を発現する細胞が挙げられ、低親和性または検出不可能なレベルの内因性受容体を発現する細胞、および１種またはそれ以上のクロストリジウム毒素受容体をコードする１種またはそれ以上の外来性核酸分子を発現するようにトランスフェクトされているか、または遺伝子操作されている細胞、ならびに１種またはそれ以上のクロストリジウム毒素血清型に対する内因性および外来性の毒素受容体の組合せを発現する細胞が挙げられる。細胞の選択は、１つとしてはアッセイするクロストリジウム毒素に依存することが理解される。例えば、BoNT/A活性についてアッセイするために、BoNT/Aに対して低親和性または高親和性の受容体を発現するか、または発現するように遺伝子操作されている細胞を選択する。
１態様において、本発明は、ドナー・フルオロフォア；ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および切断部位がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間にあり、適切な条件下で共鳴エネルギー転位がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間で示されるクロストリジウム毒素認識配列を含有するクロストリジウム毒素基質を含むニューロンを提供する。
種々のニューロンは本発明において有用であり得る。非限定的な例として、本発明において有用なニューロンは、初代培養ニューロン、株化ニューロン、形質転換ニューロン、安定にトランスフェクトしたニューロン、または運動ニューロンまたは感覚ニューロンであり得、さらに、哺乳動物、マウス、ラット、霊長類またはヒトニューロンであり得る。本発明において有用なニューロンは、末梢性ニューロンまたはCNSニューロンであり得る。非限定的な例としては、脊髄ニューロン（例えば、胚の脊髄ニューロン、後根神経節(DRG) ニューロン、大脳皮質ニューロン、小脳ニューロン、海馬ニューロンおよび運動ニューロン）は以下にさらに記載するように本発明において有用であり得る。
本発明において有用な代表的なニューロンとしては、胚のDRGニューロンの初代培養系（例えば、Welch et al., Toxicon 38:245-258 (2000)に記載の胚のラットDRGニューロンの初代培養系) ならびに胎仔後根ニューロンの初代培養系（例えば、Neale et al., J. Cell Biol. 147:1249-1260 (1999)またはChaddock et al., Infect. Immun. 68:2587-2593 (2000)に記載のマウス胎仔後根ニューロンの初代培養系)が挙げられるが、これらに限定しない。
本発明において有用な代表的な神経細胞株としては、LA-N-2、SH-SY5Y、N2a、NS-20YおよびNIE-115のような神経芽腫細胞、NG108-C15のような神経芽細胞種／神経膠腫ハイブリッドを含むハイブリッド細胞株、NSC-34およびNSC-19のような運動ニューロン細胞株、M4bのような脊髄細胞株、CNS細胞株、CNhのような大脳皮質細胞株、G4bのような後根神経節細胞株、HT-22のような海馬細胞株およびPC12のような褐色細胞腫細胞株が挙げられるがこれらに限定しない。
本発明に有用な神経細胞株は、例えば、マウス、霊長類またはヒト神経芽腫細胞株のような神経芽腫細胞株であり得る。本発明に有用な代表的な神経芽細胞腫細胞株としては、LA-N-2, SH-SY5Y、N2a、NS-20YおよびNIE-115が挙げられるが、これらに限定しない。例えば、本発明はLA-N-2ヒト神経芽腫細胞株とを用いて実施することができるが、これはコリン作動性ニューロンの特性を有し、良く特徴付けられたコリン作動性マーカーを発現する (Rylett et al., J. Neurochem. 61:1388-1397 (1993); Singh et al., J. Neurosci. Res. 25:476-485 (1990)およびYeh et al., Neuroscience 27:309-315 (1988))。さらなる例として、本発明はSH-SY5Yヒト神経芽腫細胞株を用いて実施することができ、これはボツリヌス毒素に暴露したときにK+/Ca2+により誘発される[3H]-ノルアドレナリンの放出の阻害を示す(Purkiss et al., Neurotoxicology 22:447-453 (2001))。
ハイブリッド神経細胞株（例えば、マウス、霊長類およびヒトのハイブリッド神経細胞株）もまた、本発明において有用である。このようなハイブリッド細胞株としては、神経芽細胞腫ハイブリッド（例えば、神経芽細胞腫/神経膠腫ハイブリッド）が挙げられる。例えば、NG108-C15細胞株はマウス神経芽細胞腫とラット神経膠腫瘍細胞とのハイブリッドであり、本発明において有用であり得る(Yokosawa et al., Infect. Immun. 57:272-277 (1989); Yokosawa et al., Toxicon 29:261-264 (1991))。NG108-C15細胞株を遺伝子操作して、例えば、BoNT/C1活性についてアッセイするためにBoNT/C1基質を含ませることができる。さらなるハイブリッド細胞株としては、神経芽細胞腫と脊髄ニューロンのハイブリッドであるNSC細胞株を挙げることができ、これは発生中の運動ニューロン と似ている(Cashman et al., Dev. Dyn. 194:209-221 (1992))。
また、本発明において有用な神経細胞株は運動ニューロン細胞（例えば、マウス、霊長類またはヒト運動ニューロン細胞株）であり得る。NSC-34およびNSC-19は、本発明において有用な代表的な運動ニューロン細胞株である。これらの細胞株は、マウス神経芽細胞腫 (N18TG2) と単離した胎仔(12-14日齢) のマウス脊髄運動ニューロンのクローン性ハイブリッド(clonal hybrid)であり、運動ニューロンの特徴を示し、多極ニューロン様表現型を示す(Eggett et al., J. Neurochem. 74:1895-1902 (2000))。NSC-34およびNSC-19細胞は、運動ニューロンのマーカーであるコリンアセチルトランスフェラーゼ(CHAT)を高レベルで発現する。これらの細胞はまた、活動電位を生じ、神経フィラメントトリプレットタンパク質(neurofilament triplet protein)を発現し、アセチルコリンを合成し、貯蔵し、および放出する。
また、本発明において有用な神経細胞株は脊髄細胞株（例えば、マウス、霊長類またはヒト脊髄細胞株) であり得る。例えば、ヒト脊髄細胞株は、テトラサイクリン抑止性v-myc癌遺伝子（Li et al., J. Neurosci. Res. 59:342-352 (2000)に記載）を用いて不死化したヒト胎児脊髄細胞(妊娠第一期胚児)の前駆細胞をから作成することができる。このような細胞はコリンアセチルトランスフェラーゼのような神経表現型マーカーを発現する機能的ニューロンへの迅速な分化（rapid differentiation）(４〜７日目)の前に増殖性の成長条件(proliferative growth condition)で無限に増殖することができる。別の例として、マウス脊髄細胞株は、胎仔脊髄培養物を形質転換培地を用いて不死化することにより作成することができる。このような脊髄細胞株は、例えば、マウスM4b株であり、NSE、シナプトフィジン、MAP-2およびコリンアセチルトランスフェラーゼのような神経マーカーを発現することができ、適当な刺激の際にアセチルコリンを放出する(Cardenas et al., J. Neurosci. Res. 68:46-58 (2002))。
ヒト中枢神経系(CNS)細胞株（マウス、霊長類およびヒトCNS細胞株を含む）もまた、本発明において有用であり得る。有用なCNS細胞株は、例えば、テトラサイクリン抑止性v-myc癌遺伝子を用いて不死化したヒトCNS細胞株であり得る（Sah et al., Nature Biotechnol. 15:574-580 (1997)に記載）。癌遺伝子を抑制すると、細胞はニューロンに分化する。
大脳皮質 (CNh)細胞株もまた、本発明において有用なニューロンである。有用な大脳皮質細胞株としては、マウス、霊長類およびヒト細胞株が挙げられるが、これらに限定しない。例えば、12〜16日齢胎仔からのマウス皮質初代培養系は、インビトロで形質変換を誘導するラット甲状腺細胞株由来の順化培地中で細胞を培養すること等により不死化することができる。不死化細胞は、適切な培地を用いて神経細胞マーカーを発現するニューロンへと分化することができる。これらの分化細胞はコリンアセチルトランスフェラーゼを発現し、脱分極およびニコチン刺激に応答してアセチルコリンおよびグルタミン酸を分泌する(Allen et al., Eur. J. Neurosci. 12:3259-3264 (2000))。
後根神経節細胞株（マウス、霊長類およびヒト後根神経節細胞株を含む）もまた、本発明において有用であり得る。胚後根神経節初代培養系は、上記のように形質転換順化培地を用いて不死化することができる。分化の際に、細胞株は免疫組織化学的によると神経形質を示し、グリアマーカーを欠失している。神経伝達物質(例えば、アセチルコリン）の遊離は、カリウムおよびニコチンに応答して誘発されうる (Allen et al., Neuroreport 13:491-496 (2002))。本発明において有用な代表的なDRG細胞株はマウスDRG細胞株 G4bである。
また、本発明は海馬細胞株(マウス、霊長類およびヒト海馬株を含む)を用いて実施することができる。非限定的な例として、マウス海馬細胞株であるHT-22が本発明において有用であり得る。当業者であれば、これらおよびさらなる初代培養ニューロンおよび株化ニューロンが本発明の組成物および方法において有用であり得る。
本発明は、インタクトな細胞および透過化細胞の両方を用いて実施することができる。ある態様において、本発明の細胞を、例えば、エレクトロポレーションまたはジギトニンもしくは低イオン強度緩衝液への暴露を介して透過化する。さらなる１態様において、本発明の細胞は透過化PC12細胞である。
上記のように、本発明において有用なニューロンは、１種またはそれ以上のクロストリジウム毒素に対して低親和性または高親和性の内在性または外来性の受容体を発現することが理解される。このようなニューロンはまた、通常、クロストリジウム毒素に暴露させた際に、例えば、50 nM未満、5 nM未満、0.5 nM未満、0.05 nM未満、0.005 nM未満、0.0005 nM未満、0.00005 nM未満、または0.000005 nM未満のIC50でエクソサイトーシスの阻害を示す。特定の態様において、本発明は、BoNT/A に暴露させた際に、50 nM未満、5 nM未満、0.5 nM未満、0.05 nM未満、0.005 nM未満、0.0005 nM未満、0.00005 nM未満、または0.000005 nM未満のIC50でエクソサイトーシスの阻害を示すBoNT/A基質を含むニューロンを提供する。さらなる態様において、本発明は、BoNT/Bに暴露させた際に、50 nM未満、5 nM未満、0.5 nM未満、0.05 nM未満、0.005 nM未満、0.0005 nM未満、0.00005 nM未満、または0.000005 nM未満のIC50でエクソサイトーシスの阻害を示すBoNT/B基質を含むニューロンを提供する。他の態様において、本発明は、BoNT/C1に暴露させた際に、50 nM未満、5 nM未満、0.5 nM未満、0.05 nM未満、0.005 nM未満、0.0005 nM未満、0.00005 nM未満、または0.000005 nM未満のIC50でエクソサイトーシスの阻害を示すBoNT/C1基質を含むニューロンを提供する。なおさらなる態様において、本発明は、BoNT/Dに暴露させた際に、50 nM未満、5 nM未満、0.5 nM未満、0.05 nM未満、0.005 nM未満、0.0005 nM未満、0.00005 nM未満、または0.000005 nM未満のIC50でエクソサイトーシスの阻害を示すBoNT/D基質を含むニューロンを提供する。さらなる態様において、本発明は、BoNT/Eに暴露させた際に、50 nM未満、5 nM未満、0.5 nM未満、0.05 nM未満、0.005 nM未満、0.0005 nM未満、0.00005 nM未満、または0.000005 nM未満のIC50でエクソサイトーシスの阻害を示すBoNT/E基質を含むニューロンを提供する。なおさらなる態様において、本発明は、BoNT/Fに暴露させた際に、50 nM未満、5 nM未満、0.5 nM未満、0.05 nM未満、0.005 nM未満、0.0005 nM未満、0.00005 nM未満、または0.000005 nM未満のIC50でエクソサイトーシスの阻害を示すBoNT/F基質を含むニューロンを提供する。さらなる態様において、本発明は、BoNT/Gに暴露させた際に、50 nM未満、5 nM未満、0.5 nM未満、0.05 nM未満、0.005 nM未満、0.0005 nM未満、0.00005 nM未満、または0.000005 nM未満のIC50でエクソサイトーシスの阻害を示すBoNT/G基質を含むニューロンを提供する。なおさらなる態様において、本発明は、TeNTに暴露させた際に、50 nM未満、5 nM未満、0.5 nM未満、0.05 nM未満、0.005 nM未満、0.0005 nM未満、0.00005 nM未満、または0.000005 nM未満のIC50でエクソサイトーシスの阻害を示すTeNT基質を含むニューロンを提供する。同じニューロンが異なる血清型のクロストリジウム毒素に対して２種またはそれ以上の受容体を発現し、個々の血清型毒素各々に対して同一または異なるIC50を有し得ることが理解される。
種々の非神経細胞(初代培養細胞および株化細胞を含む）もまた、本発明において有用である。このような非神経細胞には、初代培養細胞、株化細胞、安定かつ一過的なトランスフェクト細胞および腫瘍細胞ならびに全ての種起源の細胞(哺乳動物、マウス、ラット、霊長類およびヒト細胞を含む)を包含する。非限定的な例として、本発明において有用な非神経細胞としては、膵腺房細胞のような腺細胞、膵島β細胞および膵島細胞腺腫HITまたはINS-1細胞、線維芽細胞、筋細胞および肝細胞が挙げられる。
さらに、本発明において有用な非神経細胞としては、以下の初代培養細胞または株化細胞、下垂体前葉細胞、副腎細胞（例えば、副腎髄質のクロム親和細胞）、胃細胞（例えば、クロム親和性様細胞）、膵細胞（例えば、膵島β細胞）、卵巣細胞（例えば、ステロイド産生卵巣細胞（steroid-producing ovarian cells））、腎細胞（例えば、髄質内層集合管(IMCD)細胞）、膵腺房細胞、血小板、好中球、好酸球、肥満細胞、上皮細胞（例えば、頂端部細胞膜の細胞）およびグルコース輸送体(GLUT4)転移に関連する細胞が挙げられるが、これらに限定しない。非限定的な例として、本発明において有用な非神経細胞としてはSNAP-25認識配列を有するクロストリジウム毒素基質を含有していても良く、このような非神経細胞は、例えば、初代培養系または株化した下垂体前葉細胞、副腎細胞（例えば、副腎髄質のクロム親和性細胞）、胃細胞（例えば、クロム親和性様細胞）、膵細胞（例えば、膵島β細胞）または卵巣細胞（例えば、ステロイド産生卵巣細胞）であり得る。さらなる非限定的な例として、本発明において有用な非神経細胞はSNAP-23認識配列を有するクロストリジウム毒素基質を含み得、このような非神経細胞は、例えば、腎細胞（例えば、髄質内層集合管(IMCD)細胞）、膵腺房細胞、血小板、好中球、好酸球、肥満細胞、上皮細胞（例えば、頂端部細胞膜の１つ）およびグルコース輸送体(GLUT4)転移に関連する細胞であり得る。これらおよび種々の他の初代培養系および株化非神経細胞は本発明において有用であり得ることが理解される。
１態様において、本発明はドナー・フルオロフォア；ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および切断部位がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間にあり、適切な条件下、共鳴エネルギー転移がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間で示されるクロストリジウム毒素認識配列を含むクロストリジウム毒素基質をコードする核酸分子を含む株化非神経細胞を提供する。このような株化非神経細胞は、例えば、クロストリジウム毒素基質をコードする核酸分子で安定にトランスフェクトされていても良い。
内在性の、またはトランスフェクトしたクロストリジウム毒素受容体を発現する細胞は、日常的な方法（毒素取込に関する直接アッセイおよび間接アッセイを含む）により同定することができることが理解される。このような方法は、例えば、標識毒素（蛍光標識したまたは放射標識した毒素など）に頼るものであり得る。また、このような方法は、例えば、細胞内毒素を検出するために使用しうる抗毒素抗体を用いて、免疫細胞化学またはウェスタンブロッティングなどにより行うことができる。さらに、クロストリジウム毒素受容体を発現し、それゆえクロストリジウム毒素を１種またはそれ以上取り込む細胞もまた、開裂した標的タンパク質に関してアッセイすることにより同定することができる。例えば、SNAP-25197（BoNT/Aの開裂産物）を特異的に認識する抗体を用いるウェスタンブロッティングを用いて、BoNT/Aの取込についてアッセイすることができる。さらに周知のアッセイとしては、ニューロン内のエクソサイトーシスの阻害の指標として3H-ノルアドレナリンまたは他の神経伝達物質分泌の検出、または内分泌細胞（例えば、下垂体前葉細胞または卵巣細胞）からのホルモンの遊離の検出が挙げられる。細胞内毒素、毒素開裂産物または毒素機能に対するこれらの、および類似のアッセイは、本発明の組成物および方法において有用なニューロンまたは他の細胞を選択する際に有用であり得る。
本発明はさらに、「複合」クロストリジウム毒素基質を組み込む細胞を提供する。このような複合クロストリジウム毒素基質は、（ａ）アフィニティー・カップルの第一のパートナーと連結した、ドナー・フルオロフォア−アクセプター・ペアの第一のメンバー、および（ｂ）切断部位を含むクロストリジウム毒素認識配列を含み、認識配列はドナー・フルオロフォア−アクセプター・ペアの第二のメンバーおよびアフィニティーカップルの第二のパートナーと連結し、切断部位はドナー・フルオロフォア−アクセプター・ペアの第二のメンバーとアフィニティーカップルの第二のパートナーの間に介在し、ここで（ａ）および（ｂ）は、適切な条件下、共鳴エネルギー転移がドナー・フルオロフォア−アクセプター・ペアの第一と第二のメンバーの間で見られるように、安定に会合している。つまり、複合クロストリジウム毒素基質は、事実上、二つの部分がアフィニティー・カップルを介して安定に会合している二連のクロストリジウム毒素基質である。他のクロストリジウム毒素に関して、共鳴エネルギー転移は複合基質の切断の際に変化する。本明細書に記載の、および当該分野において周知のクロストリジウム毒素認識配列および切断部位が、複合クロストリジウム毒素基質において有用であり得ることが理解される。
本明細書中で用いる用語「ドナー・フルオロフォア−アクセプター・ペア」は、ドナー・フルオロフォアおよびドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプターを意味する。本ペアの第一のメンバーがドナー・フルオロフォアである場合、本ペアの第二のメンバーはアクセプターである。該ペアの第一のメンバーがアクセプターである場合、該ペアの第二のメンバーはドナー・フルオロフォアである。
１態様において、ドナー・フルオロフォア・アクセプター・ペアの第１のメンバーはドナー・フルオロフォアであり、第２のメンバーはアクセプターである。別の態様において、ドナー・フルオロフォア・アクセプター・ペアの第１のメンバーはアクセプターであり、第２のメンバーはドナー・フルオロフォアである。種々のドナー・フルオロフォアおよびアクセプターを、本発明の細胞または方法において有用な複合クロストリジウム毒素基質に組み込むことができ、本明細書中以下に記載のドナー・フルオロフォアおよびアクセプターを含む。１態様において、ドナー・フルオロフォアは蛍光タンパク質である。別の態様において、各ドナー・フルオロフォアまたはアクセプターは蛍光タンパク質である。有用な蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）が挙げられるがこれらに限定しない。
本明細書中で用いる用語「アフィニティーカップル」は、安定な非共有結合的会合を形成することができる二つの分子を意味する。複合基質において有用なアフィニティーカップルには、SNAP-25-シンタキシン、VAMP-シナプトタグミン、ストレプトアビジン-ビオチン、Sペプチド-Sタンパク質、受容体-リガンド、二量体受容体または他の相互作用タンパク質が挙げられるがこれらに限定しない。１態様において、アフィニティー・カップルはSNAP-25-シンタキシンである。別の態様において、アフィニティー・カップルはVAMP-シナプトタグミンである。
また、本発明はドナー・フルオロフォア；ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および切断部位がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間にあり、適切な条件下で共鳴エネルギー転移がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間で示されるクロストリジウム毒素認識配列を含むクロストリジウム毒素基質をコードする核酸分子を提供する。クロストリジウム毒素基質をコードする核酸分子は、例えば、調節エレメント（構成性調節エレメントまたは誘導性調節エレメント等（例えば、テトラサイクリン調節型調節エレメントまたはエクジソン誘導性調節エレメント。しかしこれらに限定しない）に連結され得る。遺伝子上にコードされている本発明のクロストリジウム毒素基質において有用な、遺伝子上コードされているドナー・フルオロフォアおよびアクセプターとしては、本明細書中以下に開示し、当該分野において公知である緑色蛍光タンパク質(GFP)および他の蛍光タンパク質が挙げられる。
１態様において、コードされているクロストリジウム毒素認識配列は、ヒトSNAP-25 (配列番号4)の34〜206残基である。別の態様において、コードされているクロストリジウム毒素認識配列はSNAP-25 (配列番号4) の34〜206残基であり、ドナー・フルオロフォアまたはアクセプターは緑色蛍光タンパク質である。他の態様において、コードされているクロストリジウム毒素認識配列はヒトSNAP-25 (配列番号4)の34〜206残基であり、ドナー・フルオロフォアおよびアクセプターは各々、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質である。
本発明の核酸分子はさらに、場合により種々の構成性または誘導性の調節エレメント（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）のいずれかを備えることができる。誘導性発現系は、制御された細胞内レベルの基質を生じることができるという利点を有する。本発明において有用な構成性調節エレメントとしては、サイトメガロウィルス (CMV)、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ(HSV TK)、サルウィルス40(SV40)初期（early）、5'側長末端反復(LTR)、伸長因子-1α(EF-1α)およびポリユビキチン(polybiquitin) (UbC) 調節エレメントを挙げることができるが、これらに限定しない。本発明に有用な誘導性調節エレメントとしては、テトラサイクリン誘導性およびテトラサイクリン抑制性のエレメント（例えば、Tet-OnTMおよびTet-OffTM(BD Biosciences)）、エクジソン誘導性エレメントおよびGAL4調節性エレメント（例えば、GeneSwitchTMシステム(Invitrogen)）を挙げることができる。当業者は、これらおよび他の構成性および誘導性の調節エレメントは本発明の核酸分子に含まれうることを理解する。
遺伝子上にコードされている種々のドナー・フルオロフォアおよびアクセプターの任意のものが本発明の核酸分子および細胞において有用である。このようなドナー・フルオロフォアおよびアクセプターとしては、遺伝子上コードされている色素、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、またはｄｓＲｅｄ（BD Biosciences Clontech; Palo Alto, CA）のような赤色蛍光タンパク質が挙げられる。このような遺伝子上コードされているドナー・フルオロフォアおよびアクセプターは、例えば、Selvin，前述、2000およびMahajan et al., Chemistry and Biology 6:401-409 (1999)に記載されているように当該分野において周知である。例えば、ＣＦＰは４３３ｎｍに励起極大を、４７６ｎｍに発光極大を有し、アクセプターとしてのＹＦＰ（５２７ｎｍに発光極大）と組み合わせて、ドナー・フルオロフォアとして使用できる。要すれば、ＢＦＰは、アクセプターとしてのＧＦＰと組み合わせてドナー・フルオロフォアとして使用でき、または、ＣＦＰは、アクセプターとしてのＹＦＰと組み合わせてドナー・フルオロフォアとして使用できる。クラゲ(Aequorea)関連蛍光タンパク質を含む、更なる遺伝子上コードされているドナー・フルオロフォアおよびアクセプターは、例えば米国特許番号5,981,200に記載されるように、当該分野において周知である。
本発明はさらに、遺伝子上コードされているクロストリジウム毒素基質を含む細胞を提供する。従って、本発明はドナー・フルオロフォア；ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および切断部位がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間にあり、適切な条件下、共鳴エネルギー転移がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間で示されるクロストリジウム毒素認識配列を備えたクロストリジウム毒素基質をコードする核酸分子を含有する細胞を提供する。核酸分子は、例えば、ヒトSNAP-25 (配列番号4)の34〜206残基をコードするかもしれず、さらに、例えば、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質のようなドナー・フルオロフォアならびに緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質のようなアクセプターを含むかもしれない。
種々の任意の細胞をクロストリジウム毒素基質をコードする核酸分子を含むように遺伝子操作することができ、これにはヒト細胞、神経細胞および非神経細胞が挙げられるがこれらに限定しない。１態様において、クロストリジウム毒素基質をコードする核酸分子は細胞に安定にトランスフェクトされている。別の態様においては、クロストリジウム毒素基質をコードする核酸は構成性調節エレメントまたは誘導性調節エレメントのような調節エレメントに連結されている。種々の誘導性調節エレメントが本発明において有用であり、これらには、テトラサイクリン調節型調節エレメントおよびエクジソン誘導性調節エレメントを含むが、これらに限定しない。遺伝子上コードされている本発明のクロストリジウム毒素基質は、種々の遺伝子上コードされているドナー・フルオロフォアまたはアクセプター（例えば、GFP）を誘導しうる。
クロストリジウム毒素基質をコードする核酸分子を含有する細胞は、種々の日常的な方法（周知の一過性トランスフェクション方法および安定なトランスフェクション方法を含む）のいずれかにより製造することができる。非限定的な例としては、核酸分子を細胞（神経細胞および非神経細胞を含む）に導入するための日常的な方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクチン、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレン-またはポリリジン媒介性トランスフェクション、ならびに抗体、グラミシジンS、人工ウィルスエンベロープまたは他の細胞内キャリア（例えば，TAT）への結合が挙げられる。Cibelli et al., Nat. Biotech. 16:642-646 (1998); Lamb and Gearhart, Cur. Opin. Gen. Dev. 5:342-348 (1995); Choi (米国特許番号6,069,010); and Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 9.16.4-9.16.11頁 (2000)参照。
本発明はまた、試料中のクロストリジウム毒素活性を測定するためのキットを提供する。このようなキットは、バイアルまたは他の容器中に本発明の基質組成物または細胞を含有し、また、通常は使用説明書（instructions for use）を備えている。１態様において、本発明のキットはさらに、ポジティブコントロールとしてクロストリジウム毒素基質を開裂しうる既知量のボツリヌス毒死または破傷風毒素を含有し、これはキット中に含まれる基質組成物または細胞中に組み込まれている。別の態様において、キットは本発明の基質組成物を含有し、さらに一方または両方の開裂産物をポジティブコントロールとして備える。このようなキットは、例えば、ドナー・フルオロフォアをポジティブコントロールとして含む本発明の基質組成物および対応する開裂産物を含有していてもよい。本発明は、本発明の細胞およびポジティブコントロールを含むキットを提供する場合、このポジティブコントロールは同じ細胞型の細胞であると理解され、これは未開裂のクロストリジウム毒素基質のかわりに一方または両方の対応する開裂産物を有する。このようなポジティブコントロール細胞は、例えば、ドナー・フルオロフォアを含む開裂産物を含みうる。
さらに以下に記載するように、異なるクロストリジウム毒素基質を含有する同一または異なる型の細胞の組合せは２種またはそれ以上のクロストリジウム毒素の活性を測定するために有用であり得る。従って、１態様において、本発明は、２つの異なるクロストリジウム毒素に対する認識配列を有する少なくとも２種の本発明の基質組成物を含有する、クロストリジウム毒素活性を測定するためのキットを提供する。別の態様において、本発明は２つの異なるクロストリジウム毒素に対する認識配列を有する、２種の異なるクロストリジウム毒素基質を含有する少なくとも２種の本発明の細胞を含む、クロストリジウム毒素活性を測定するためのキットを提供する。
また、本発明は、（ａ）ドナー・フルオロフォア；ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および切断部位がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間にあり、適切な条件下、共鳴エネルギー転移がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間で示されるクロストリジウム毒素認識配列を有するクロストリジウム基質を含む細胞と接触させること、(b) ドナー・フルオロフォアを励起させること、および(c)接触細胞の共鳴エネルギー転移をコントロール細胞と比較して決定すること（ここで、コントロール細胞と比較した接触細胞の共鳴エネルギー転移の差はクロストリジウム毒素活性を示す。）によりクロストリジウム毒素活性を測定する方法を提供する。
有利なことに、本発明の方法は毒素活性に必要とされる種々の異なる工程についてクロストリジウム毒素をアッセイするために実施することができる。それゆえ、本発明の方法はクロストリジウム毒素が、細胞内取込のための機能的結合ドメイン、軽鎖を細胞質ゾルに送達するための機能的転移ドメインおよび機能的タンパク質分解ドメインを有するかどうかを決定するために用いることができる。これら３つの機能のいずれかを欠いている場合、本発明の方法により通常はネガティブな結果が得られる。
本発明の方法において、クロストリジウム毒素基質は場合により、例えば、タンパク質、ペプチドまたはペプチド模倣物であり得る送達薬剤に共有結合していてもよい。有用な送達薬剤としては、例えば、アンテナペディアタンパク質またはその活性フラグメント（例えば、アミノ酸配列RQIKIWFQNRRMKWKK (配列番号１)を有する活性フラグメント）、HIV TATタンパク質またはその活性フラグメント（例えば、アミノ酸配列YGRKKRRQRRR (配列番号2) を有する活性フラグメント）および単純ヘルペスウィルスVP22タンパク質またはその活性フラグメント（例えば、アミノ酸配列配列番号3）を有する単純ヘルペスウィルスVP22またはその活性フラグメントが挙げられる。１態様において、本発明の方法は、クロストリジウム毒素基質および基質に操作可能に縮合している送達薬剤を含むキメラタンパク質、ペプチドまたはペプチド模倣物を含む細胞を用いて実施される。このようなキメラタンパク質、ペプチドまたはペプチド模倣物は、例えば、最大50または100残基長を有しうる。
本発明の方法に有用なクロストリジウム毒素基質は、任意の血清型のボツリヌス毒素基質または破傷風毒素基質であり得る。それゆえ、本発明の方法はBoNT/A認識配列を含むBoNT/A基質を含有する細胞、BoNT/B認識配列を含むBoNT/B基質を含有する細胞、BoNT/C1認識配列を含むBoNT/C1基質を含有する細胞、BoNT/D認識配列を含むBoNT/D基質を含有する細胞、BoNT/E認識配列を含むBoNT/E基質を含有する細胞、BoNT/F認識配列を含むBoNT/F基質を含有する細胞、BoNT/G認識配列を含むBoNT/G基質を含有する細胞またはTeNT認識配列を含むTeNT基質を含有する細胞を用いて実施しうる。種々のドナー・フルオロフォアおよびアクセプターを本発明の方法に有用なクロストリジウム毒素基質に組み込むことができることが理解される。非限定的な例として、有用なドナー・フルオロフォアとしてはAlexa(登録商標) 488、DABCYLおよびBODIPYが挙げられ、有用なアクセプターとしてはEDANS、QSY(登録商標)7およびテトラメチルローダミンが挙げられる。本明細書中以下にさらに記載するように、本発明の方法に有用なアクセプターには非蛍光アクセプターおよびアクセプターフルオロフォアが含まれ、これには比較的長い蛍光寿命（少なくとも１μ秒）を有するアクセプターフルオロフォアが挙げられる。
種々の細胞が本発明の方法に有用であり、これには初代培養細胞、株化細胞、ヒト細胞、ニューロン（例えば、初代培養ニューロン、株化ニューロンおよびヒトニューロン）および非神経細胞（例えば、膵腺房細胞）が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法によりクロストリジウム毒素活性を測定するために有用なニューロンとしては、中枢神経系ニューロン、および末梢ニューロンが挙げられ、非限定的な例として、このようなニューロンは、神経芽腫細胞、脊髄ニューロン、後根神経節ニューロン、大脳皮質ニューロン、小脳ニューロン、海馬ニューロンまたは運動ニューロンであり得る。
当業者であれば、本発明の方法に従って種々の試料をクロストリジウム毒素活性についてアッセイし得ることを理解する。このような試料としては、未精製の細胞溶解物、単離したクロストリジウム毒素、製剤化クロストリジウム毒素製品（例えば、BOTOX（登録商標）および食品を挙げることができるが、これらに限定しない。
種々の方法を用いて、本発明の方法におけるドナー・フルオロフォアの励起の後の共鳴エネルギー転移を測定することができる。１態様において、本発明の方法は、コントロール細胞と比較した接触細胞のドナー蛍光強度を測定する工程を含み、ここでコントロール細胞と比較して接触細胞のドナー蛍光強度の増加はクロストリジウム毒素活性を示す。別の態様において、本発明の方法は、コントロール細胞と比較して接触細胞のアクセプター蛍光強度の検出工程を含み、ここでコントロール細胞と比較した接触細胞のアクセプター蛍光強度の減少はクロストリジウム毒素活性を示す。さらなる態様において、本発明の方法は、コントロール細胞と比較した接触細胞のアクセプターの発光極大およびドナー・フルオロフォアの発光極大を検出する工程を含み、この工程において、アクセプター 発光極大付近からドナー・フルオロフォア発光極大付近への発光極大のシフトはクロストリジウム毒素活性を示す。なおさらなる態様において、本発明の方法は、接触細胞のアクセプター発光極大付近の蛍光振幅のドナー・フルオロフォア発光極大付近の蛍光振幅に対する比をコントロール細胞と比較して検出する工程を含み、この工程において、コントロール細胞と比較しての接触細胞での比の減少はクロストリジウム毒素活性を示す。さらなる別の態様において、本発明の方法は、コントロール細胞と比較しての接触細胞におけるドナー・フルオロフォアの励起状態の寿命を検出する工程を含み、この場合、コントロール細胞と比較しての接触細胞におけるドナー・フルオロフォアの励起状態の寿命の増加はクロストリジウム毒素活性を示す。要すれば、共鳴エネルギー転移を検出する工程を時間の間隔を開けて１回以上後で繰り返すことができる。さらに、クロストリジウム毒素活性に適した条件は、必要に応じてアッセイが線形になるように選択することができる。
以下にさらに記載するように、本発明の方法は未精製の試料ならびに高度に精製した二本鎖毒素に適用可能であることが理解される。非限定的な例として、本発明の方法は、食品または飲料試料中のクロストリジウム毒素活性をアッセイするため、例えば、クロストリジウム毒素に曝されたか、またはクロストリジウム毒素の症状を１種以上有する、ヒトまたは動物由来のサンプルをアッセイするため、クロストリジウム毒素の産生および精製の間の活性を追跡するため、および製剤化クロストリジウム毒素産物（医薬品および化粧品を含む）をアッセイするために有用であり得る。
本発明の方法は任意のクロストリジウム毒素の活性を測定するために使用することができる。１態様において、本発明の方法は、BoNT/A基質を含む細胞に頼ってBoNT/A活性を測定する。このようなBoNT/A基質は、本明細書中に記載の任意のBoNT/A基質であってよく、例えば、SNAP-25の少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はGln-Argを含む）を含有するBoNT/A基質である。別の態様において、本発明の方法はBoNT/B基質を含む細胞に頼ってBoNT/B活性を決定する。このようなBoNT/B基質は、本明細書中に記載の任意のBoNT/B基質であってよく、例えば、VAMPの少なくとも６個の連続残基を含むBoNT/B基質（該６個の連続残基はGln-Pheを含む）である。また、本発明の方法はBoNT/C1基質を含む細胞を利用してBoNT/C1活性を決定することができる。本発明の方法において有用なBoNT/C1基質は、本明細書中に記載の任意のBoNT/C1基質であってよく、例えば、シンタキシンの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はLys-Alaを含む）を有するか、またはSNAP-25の少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はArg-Alaを含む）を有するBoNT/C1基質であり得る。
別の態様において、本発明の方法はBoNT/D基質を有する細胞に頼ってBoNT/D活性を決定する。このようなBoNT/D基質は、本明細書中に記載の任意のBoNT/D基質であってよく、例えば、VAMPの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はLys-Leuを含む）を含有するBoNT/D基質である。さらなる態様において、本発明の方法はBoNT/E基質を含む細胞を用いて実施してBoNT/E活性を決定する。本発明の方法において有用なBoNT/E基質は、本明細書中に記載の任意のBoNT/E基質であってよく、例えば、SNAP-25の少なくとも６個の連続残基を含むBoNT/E基質（該６個の連続残基はArg-Ileを含む）である。なおさらなる態様において、本発明の方法はBoNT/F基質を有する細胞に頼ってBoNT/F活性を決定する。本発明の方法に有用なBoNT/F基質は、本明細書中に記載の任意のBoNT/F基質であってよく、例えば、VAMPの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はGln-Lysを含む）を含有するBoNT/F基質である。
本発明の方法はBoNT/G基質を含む細胞を利用してBoNT/G活性を決定することができる。本発明の方法において有用なBoNT/G基質は、本明細書中に記載の任意のBoNT/G基質であってよく、例えば、VAMPの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はAla-Alaを含む）を有するBoNT/G基質である。また、本発明の方法はTeNTプロテアーゼ活性を測定するために有用であり得、この場合、TeNT基質を有する細胞に頼る。本明細書中に記載の任意のTeNT基質が本発明の方法において有用であり、例えば、VAMPの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はGln-Pheを含む）を有するTeNT基質であり得る。
種々の試料が本発明の方法において有用である。本明細書中で用いる用語「試料」は、活性クロストリジウム毒素を含む、または含む可能性がある任意の生物学的物質を意味する。従って、試料なる用語は、精製または一部精製したクロストリジウム毒素；天然または非天然の配列を有する組換え一本鎖または二本鎖毒素；修飾プロテアーゼ特異性を有する組換えクロストリジウム毒素；改変細胞特異性を有する組換えクロストリジウム毒素；複数のクロストリジウム毒素種またはサブタイプ由来の構造エレメントを含むキメラ毒素；バルク毒素；製剤化製品；例えば、クロストリジウム毒素をコードする組換え核酸を含むように遺伝子操作された、細胞、または未精製、分画化または一部精製細胞溶解物；細菌、バキュロウィルスおよび酵母溶解物；生、調理済、半調理済または加工済食物；飲料；動物飼料；土壌試料；水試料；池堆積物；ローション；化粧品；および臨床製剤を包含するが、これらに限定されない。さらに、試料なる用語は組織試料を含み、それは哺乳動物組織試料、家畜組織試料（例えば、ヒツジ、ウシおよびブタ組織試料）；霊長類組織試料およびヒト組織試料が挙げられるが、これらに限定しないことが理解される。このような試料には、例えば幼児腸試料のような腸試料および傷から得られた組織試料が挙げられるが、これらに限定しない。
本発明の方法においてアッセイした精製または一部精製クロストリジウム毒素の濃度は、通常、約0.0001〜5000 ng/ml毒素の範囲にあり、例えば、約0.001〜5000 ng/ml、0.01〜5000 ng/ml、0.1〜5000 ng/ml、1〜5000 ng/mlまたは10〜5000 ng/ml毒素の範囲にあり、この毒素は、例えば、精製組換え二本鎖毒素またはヒト血清アルブミンおよび賦形剤を含有する製剤化クロストリジウム毒素製品であり得る。一般的には、本発明の方法でアッセイされる精製毒素の量は、０．１ｐｇから１０μｇの範囲である。精製、一部精製、または未精製試料は、標準曲線に対してクロストリジウム毒素活性をアッセイするのに都合のよい範囲内になるように希釈してもよいことが理解される。同様に、毒素濃度が次第に高い濃度になるとアッセイの線形が犠牲になるかもしれないので、アッセイが線形になるように試料を希釈するか、または試料の量を制限しても良いことを当業者は理解している。
本発明の方法において、１つには、用いる細胞型、発現させる毒素受容体の親和性、アッセイする毒素の量および型に応じて、任意の種々の時間の長さの間、細胞をクロストリジウム毒素と接触させてよいことを、当業者は理解する。非限定的な例として、細胞を最大１時間、２時間、４時間、８時間、16時間、24時間、48時間または72時間の間、毒素と接触させてもよい。
本発明の方法において、種々の方法により共鳴エネルギー転移を測定することができる。１態様において、共鳴エネルギー転移を測定する工程は、接触細胞のドナー蛍光強度を測定することを含み、この場合、コントロール細胞と比較した接触細胞のドナー蛍光強度の増加はクロストリジウム毒素活性を示す。別の態様において、共鳴エネルギー転移を測定する工程は接触細胞のアクセプター蛍光強度を測定することを含み、この場合、コントロール細胞と比較した接触細胞のアクセプター蛍光強度の減少はクロストリジウム毒素活性を示す。さらなる態様において、共鳴エネルギー転移を測定する工程はアクセプター発光極大およびドナー・フルオロフォア発光極大を検出することを含み、この場合、発光極大のアクセプター発光極大付近からドナー・フルオロフォア発光極大付近へのシフトはクロストリジウム毒素活性を示す。さらなる態様において、共鳴エネルギー転移を測定する工程は、アクセプター発光極大付近の蛍光振幅のドナー・フルオロフォア発光極大付近の蛍光振幅に対する比を測定することを含み、この場合、コントロール細胞と比較した接触細胞における比の減少はクロストリジウム毒素活性を示す。なおさらなる態様において、共鳴エネルギー転移を測定する工程は、接触細胞中でのドナー・フルオロフォアの励起状態の寿命を検出することにより実施され、この場合、コントロール細胞と比較した接触細胞におけるドナー・フルオロフォア励起状態の寿命の増加は、クロストリジウム毒素活性を示す。
クロストリジウム毒素活性を測定するための本発明の方法では、細胞を試料と接触させ、この細胞は第１ドナー・フルオロフォア；ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有する第１アクセプター；およびドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間にある切断部位を有する第１クロストリジウム毒素認識配列を有するクロストリジウム毒素基質を含み、適切な条件下でドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間で共鳴エネルギー転移が示される。要すれば、第２クロストリジウム毒素基質が同じ細胞に含まれてもよく、この第２基質は第２ドナー・フルオロフォア；第２ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有する第２アクセプター；および第１クロストリジウム毒素認識配列を切断する毒素とは異なるクロストリジウム毒素により切断される第２クロストリジウム毒素認識配列を含む。第２基質中のドナー・フルオロフォア-アクセプターペアは、第１基質中のドナー・フルオロフォア-アクセプターペアと同一または異なっていても良い。この方法では、１つのサンプルを１つより多くのクロストリジウム毒素の存在について都合良くアッセイすることができる。
任意のクロストリジウム毒素組合せ（例えば、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上のクロストリジウム毒素）に関してアッセイできることが理解される。例えば、２、３、４、５、６、７または８種類のBoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/GおよびTeNTの任意の組合せをアッセイすることができる。例えば、本明細書中上記のように選択した、７種の基質を含有する同一または異なる型の７個の細胞（これらは各々、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/FまたはBoNT/G認識配列、および切断部位に隣接するフルオレセインおよびテトラメチルローダミンを含む）。これら各細胞を、ボツリヌス毒素活性に適した条件下で試料と接触させた後、約488nmの吸収波長でドナー・フルオロフォアを励起し、エネルギー転移を測定する。アクセプターであるテトラメチルローダミンの発光極大(585nm)におけるフルオレセインの発光極大(520nm)へのシフトは、少なくとも１種類のボツリヌス毒素の活性を示す。そのようなアッセイは、例えば、任意のボツリヌス毒素または他のクロストリジウム毒素の存在について食物試料または組織試料をアッセイするのに有用であるかもしれず、要すれば、その後の、個々のクロストリジウム毒素またはクロストリジウム毒素の特定の組み合わせのための１つまたはそれ以上のアッセイと組み合わせることができる。
別の態様においては、同一または異なる細胞（例えば、ニューロン）に含まれる２つまたはそれ以上の異なるクロストリジウム毒素基質であって各々相異なるドナー・フルオロフォア−アクセプター・ペアを含有するものを用いて、１つの試料を２つまたはそれ以上の異なるクロストリジウム毒素についてアッセイする。複数の基質の使用は、例えば米国特許番号6,180,340に記載されるように、アッセイのダイナミック・レンジを拡張するのに有用であり得る。複数のクロストリジウム毒素基質の使用の例として、第１および第２のクロストリジウム毒素基質を有する細胞を用いて、１つのサンプルをBoNT/AおよびBoNT/B活性に関してアッセイすることができ、第１クロストリジウム毒素基質は、BoNT/A認識配列および切断部位が介在するドナー・フルオロフォアであるフルオレセインおよびアクセプターであるテトラメチルローダミンを含み、第２クロストリジウム毒素基質はBoNT/B認識配列と切断部位が介在するドナー・フルオロフォアであるEDANSおよびアクセプターであるDABCYLを含む。第１ドナー・フルオロフォアであるフルオレセインは約488 nmで励起し、BoNT/A活性を示すフルオレセイン (約520 nm)の蛍光強度の増加を用いて、エネルギー転移を測定する。第２のドナー・フルオロフォアであるEDANSは、約340 nmの吸収波長で励起し、BoNT/B活性を示すEDANSの蛍光強度 (約490 nm)の増加を伴う。同様に、１つの試料をアッセイするのに２つまたはそれ以上の異なるドナー・フルオロフォアを一緒に用いる場合、例えば以下のランタニドの組み合わせ、または全てを、組み合わせることができる：テルビウム、ジスプロシウム、ユーロピウム、およびサマリウム(EG&G（登録商標） Wallac)。これらランタニドは、崩壊時間および波長に基づいてはっきりと区別できるスペクトルを有する。当業者は、第二のドナー・フルオロフォアの励起の前、それと同時、またはその後に第一のドナー・フルオロフォアを励起できること、および、第二の基質のエネルギー転移の測定の前、それと同時、またはその後に第一の基質のエネルギー転移を測定できることを理解している。
本発明の方法は、細胞内のクロストリジウム毒素基質に組み込まれているドナー・フルオロフォアを励起することに関与する。当業者は、通常、ドナー・フルオロフォアはドナー・フルオロフォアの最適吸収波長（励起波長）において、またはその近傍で励起されることを理解している。例えば、ドナー・フルオロフォアがフルオレセインである場合、488 nmの最適吸収波長で、またはその付近でドナーを励起できる。
クロストリジウム毒素基質のタンパク分解、つまりクロストリジウム毒素活性は、様々な手段によって検出することができ、例えば、増加したドナー蛍光強度;減少したアクセプター蛍光強度；アクセプター発光極大付近からドナー・フルオロフォア発光極大付近への、発光極大におけるシフト；アクセプター発光極大付近の蛍光振幅のドナー・フルオロフォア発光極大付近の蛍光振幅に対する比率の減少；または増加したドナー・フルオロフォア励起状態寿命を検出することにより検出することができる。適切な蛍光強度または励起状態寿命は、適当な波長または波長範囲にて検出されることは理解される。例えば、ドナー蛍光強度を検出する場合、適切な波長は、ドナー・フルオロフォアの発光極大またはその付近であるか、またはドナー・フルオロフォアの発光極大を包含する、またはその付近の、波長の範囲である。
細胞中のクロストリジウム毒素基質の絶対量、励起強度、および励起波長での濁度または他のバックグラウンド吸収の変化は、ドナーおよびアクセプター・フルオロフォアの蛍光強度にほぼ平行して影響することが認識される。従って、発光強度の比率は、基質の絶対量、励起強度、および濁度もしくは他のバックグラウンド吸収に依存せず、クロストリジウム毒素活性の有用な指標であり得ることが理解される。同様に、ドナー・フルオロフォアの励起状態寿命は、基質の絶対量、励起強度、および濁度もしくは他のバックグラウンド吸収に依存せず、本発明の方法において有用であり得ることを当業者は理解している。
１態様において、ドナー蛍光強度を検出することにより本発明の方法を実施し、ドナー蛍光強度の増加がクロストリジウム毒素プロテアーゼ活性を示す。このような強度の増加は、例えば、試料と接触していない同一または類似の細胞の同波長での蛍光強度と比較して、少なくとも２倍、３倍、５倍、10倍、20倍またはそれ以上であり得る。
ドナー蛍光強度の検出に関して、励起をドナー・フルオロフォア吸収の波長に設定し、ドナー・フルオロフォアの発光をモニターする。通常、ドナー・フルオロフォアの発光波長は、アクセプター蛍光からの寄与がほとんどまたは全く観察されないように選択する。アクセプターが存在するとドナー蛍光をクエンチングする。エネルギー転移効率、Ｅは、Ｅ＝１−ＩＤＡ／ＩＤにより計算され、ここでＩＤＡおよびＩＤは、アクセプターの存在および非存在下におけるドナー強度である。どちらも同じドナー・フルオロフォア濃度で正規化する。要すれば、ドナー・フルオロフォア濃度を必要としない時間分解測定を、Ｅ＝１−｛τＤＡ｝／τＤで行うことができ、ここで｛τＤＡ｝および｛τＤ｝は、アクセプターの存在下および非存在下におけるドナー・フルオロフォアの振幅平均寿命である。
ある態様において、発光極大における、アクセプター発光極大付近からドナー・フルオロフォア発光極大付近へのシフトを、共鳴エネルギー転移の測定として検出することにより本発明を実施する。例えば、テトラメチルローダミンアクセプターをドナー・フルオロフォアであるフルオレセインと組み合わせる場合、減少した共鳴エネルギー転移、つまりクロストリジウム毒素活性の指標として、主に赤色の発光から主に緑色の発光へのシフトを検出することができる。発光極大において観察されるシフトは、一般に完全なシフトでなく、発光強度の一部分しかドナー・フルオロフォア発光極大付近へシフトしないであろうことが理解される。
本発明のいくつかの方法においては、接触細胞の共鳴エネルギー転移をコントロール細胞と比較して測定する。一般にそのようなコントロール細胞は、接触細胞と同一または類似する型の細胞であり、同じ条件下で増殖させたが、いずれの試料とも接触させていないか、または規定のネガティブ試料または規定のポジティブ試料と接触させている細胞である。種々のコントロール細胞が本発明の方法において有用であること、およびコントロール細胞はポジティブコントロール細胞またはネガティブコントロール細胞であり得ることを当業者は理解する。コントロール細胞は、例えば、活性なクロストリジウム毒素を欠くことが公知の類似の規定のネガティブ試料と接触させているか、またはいずれの試料とも接触させていない、同一または類似のクロストリジウム毒素基質を含む類似または同一の細胞のような、ネガティブコントロール細胞であり得る。また、コントロール細胞は、例えば、切断部位でのクロストリジウム毒素基質のタンパク分解から生じる１または両方の切断産物を含む細胞のようなポジティブコントロール細胞、または活性クロストリジウム毒素を含むことが公知である規定のポジティブサンプルと接触させた、同一または類似の基質を含む細胞であり得る。ポジティブコントロール細胞としては、ドナー・フルオロフォア含有切断産物を含む細胞、アクセプター含有切断産物を含む細胞、および両方の切断産物を含む細胞が挙げられる。
本発明のクロストリジウム毒素活性の測定方法は、試料と接触させたクロストリジウム毒素基質を含む細胞の共鳴エネルギー転移をコントロール細胞と比較して測定することを包含し、「固定時間」アッセイとして、または連続時間アッセイとして行うことができる。従って、ある態様においてFRET測定は、１つまたはそれ以上の時間間隔をおいた後に繰り返される。蛍光共鳴エネルギー転移は、例えば、２またはそれ以上、５またはそれ以上、１０またはそれ以上、または２０またはそれ以上の異なる時点で測定できる。蛍光強度およびＦＲＥＴの他の指標はまた、周知の方法によって連続的に検出することができる (例えば、Wang et al., 前述, 1993; Holskin et al., 前述, 1995; およびKakiuchi et al., 前述, 1999参照)。
本発明の方法において、接触細胞の蛍光は、通常、フルオリメーター（fluorimeter）を用いて測定される。一般に、第１の波長を有する励起源からの励起放射は励起光系(excitation optics)を通過する。励起光系は、細胞中の基質を励起する励起放射を引き起こす。それに応答して、基質中のフルオロフォアが励起波長と異なる波長を有する放射を発する。その後、集光系がその発光を収集する；スキャン中特定の温度に細胞を維持するため、要すれば、該機器は温度制御装置を備える。要すれば、複数軸並行移動台により、複数の試料を含むマイクロタイタープレートを動かして異なるウェルが露出するよう位置付ける。複数軸並行移動台、温度制御装置、自動焦点機能、および画像化およびデータ収集に関する電子機器は、適切なデジタルコンピューターにより管理し得ることが理解される。
さらに、本発明の方法は自動化することができ、さらに、９６ウェル、３８４ウェル、または１５３６ウェルプレートを用いるハイスループットまたはウルトラハイスループットフォーマットに設定できるが、これらに限定されない。一例として、９６ウェルプレートアッセイ用に設計されたMolecular Devices FLIPR（登録商標）装置システム(Molecular Devices; Sunnyvale, CA)を用いて蛍光発光を検出することができる(Schroeder et al., J. Biomol. Screening 1:75-80 (1996))。FLIPRは、水冷４８８ｎｍアルゴンイオンレーザー（５ワット）またはキセノンアークランプ、および、プレート全体を照らし、画像化するための電化結合素子（ＣＣＤ）カメラを備えた半共焦点最適系（semiconfocal optimal system）を利用する。FPM-2 96ウェルプレートリーダー(Folley Consulting and Research; Round Lake, Illinois)もまた、本発明の方法において蛍光発光を検出するのに有用であり得る。これらおよび適切な分光学的互換性を有する他の自動化系、例えば、ECLIPSEキュベットリーダー(Varian Cary; Walnut Creek, CA)、SPECTRAmax GEMINI XS (Molecular Devices)、および他の系、例えばPerkin Elmerの他の系が、本発明の方法において有用であり得ることを当業者は理解している。
要すれば、本発明の方法はインビボで実施できる。非限定的な例として、本発明の方法は、マウス、ラット、寄生虫または魚で行うことができる。本発明のインビボでのクロストリジウム毒素活性の測定方法は、(a) ドナー・フルオロフォア；ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および切断部位がドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間にあり、適切な条件下、ドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間で共鳴エネルギー転移が示されるクロストリジウム毒素認識配列を含むクロストリジウム毒素基質を送達薬剤と共に含有する基質組成物を動物に投与し、(b)試料を用いて動物を処置し、(c) ドナー・フルオロフォアを励起させ、そして(d)処置動物の共鳴エネルギー転移をコントロール動物と比較して測定することを含み、ここでコントロール動物と比較した処置動物の共鳴エネルギー転移の差異はクロストリジウム毒素活性を示す。例えば、HIV TATベースの送達薬剤は、標的タンパク質をインビボで効率よく送達することが示されている (Schwartz et al., Science 285:1569-1572 (1999))。１態様において、本発明のインビボ方法は、HIV TAT由来送達薬剤を含む基質組成物を用いて行われる。さらなる態様において、基質組成物は動物の脊髄に投与される。なおさらなる態様において、毒素活性の経時的な持続性は、共鳴エネルギー転移を２時点以上で測定することによりアッセイする。
本発明は、一つには、FRET、すなわち、エネルギーが分子内長距離双極子カップリング（intramolecular long-range dipole-dipole coupling）を介して励起されたドナー・フルオロフォアからアクセプター（別のフルオロフォアであってもよい）に非放射性に転移される物理学的過程に依存する。ＦＲＥＴは、ドナー・フルオロフォアとアクセプターの分子内分離の逆６乗(inverse sixth power)に依存し、また、効率よい転移のために、ドナー・フルオロフォアとアクセプターは近接して、例えば約１０Åから約１００Åで隔てられている。効率的なエネルギー転移は、ドナー・フルオロフォアおよびアクセプターのスペクトル特性およびそれらの相対配向に依存する。１０から１００Åを越える効果的な転移のため、ドナー・フルオロフォアの量子収率は一般的に少なくとも０．１であり、アクセプターの吸収係数は一般的に少なくとも１０００である（Clegg, Current Opinion in Biotech. 6:103 110 (1995); およびSelvin, Nature Structural Biol. 7:730-734 (2000))参照）。
本発明において有用なクロストリジウム毒素基質において、ドナー・フルオロフォアおよびアクセプターは、ドナー・フルオロフォアが励起された場合にドナー・フルオロフォアおよびアクセプターが共鳴エネルギー転移を示すよう選択される。ドナー・フルオロフォア／アクセプター・ペアを選択するにあたり考慮すべき因子の一つは、ドナー・フルオロフォアとアクセプターの間のＦＲＥＴの効率である。ある態様において本発明は、最適な条件下、ドナー・フルオロフォアとアクセプターの間のＦＲＥＴの効率が少なくとも１０％であるクロストリジウム毒素基質に頼る。別の態様において本発明は、最適な条件下、ドナー・フルオロフォアとアクセプターの間のＦＲＥＴの効率が少なくとも２０％であるクロストリジウム毒素基質に頼る。なお更なる態様において、本発明は、最適な条件下、ドナー・フルオロフォアとアクセプターの間のＦＲＥＴの効率が少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％である、クロストリジウム毒素基質に頼る。
当業界において周知のように、ＦＲＥＴの効率は、Ｆｏｅｒｓｔｅｒ等式によって示されるように、ドナー・フルオロフォアとアクセプターの分離距離および配向、ならびにドナー・フルオロフォアの蛍光量子収率並びにアクセプターとのエネルギー的重複に依存する。特に、ＦＲＥＴの効率（Ｅ）は、以下のように測定できる：
Ｅ＝１−ＦＤＡ／ＦＤ＝１／（１＋（Ｒ／Ｒ０）６）
（式中、ＦＤＡおよびＦＤは、それぞれ、アクセプターの存在または非存在下のドナー・フルオロフォアの蛍光強度であり、Ｒはドナー・フルオロフォアとアクセプターの間の距離である）。
Ｆｏｅｒｓｔｅｒ半径（Ｒ０）は、共鳴エネルギー転移が５０％有効、すなわち、励起ドナー・フルオロフォアの５０％がＦＲＥＴによって不活性化される距離である。Ｆｏｅｒｓｔｅｒ半径の大きさは、ドナー・フルオロフォアの量子収率；アクセプターの消光係数；および、ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルとアクセプターの励起スペクトルの間の重複に依存する。
ＲＯ＝［８．８×１０２３・κ２・ｎ−４・ＱＹＤ・Ｊ（λ）］１／６ Å
（式中、
κ２＝双極子配向因子（dipole orientation factor）(レンジ０から４；κ２＝２／３、ランダムに配向したドナーおよびアクセプターについて）、
ＱＹＤ＝アクセプター非存在下におけるドナーの蛍光量子収率、
ｎ＝屈折率、
Ｊ(λ)＝スペクトル重複積分（spectral overlap integral）
＝∫εＡ（λ）・ＦＤ（λ）・λ４ｄλ ｃｍ３Ｍ−１
（式中、εＡ＝アクセプターの励起係数、
ＦＤ＝全積分強度のフラクションとしてのドナー蛍光発光強度である）、
である(Foerster, Ann. Physik 2:55 75 (1948))。
様々なドナー・フルオロフォア／アクセプターペアについての典型的Ｆｏｅｒｓｔｅｒ半径値を、以下の表Ｂに示す（Wu and Brand, Analytical Biochem. 218:1-13 (1994)も参照）。Ｆｏｅｒｓｔｅｒ半径の総合的一覧もまた、当該分野にて知られている（例えば、 Berlman, Energy Transfer Parameters of Aromatic Compounds Academic Press, New York 1973 参照）。さらに、Ｆｏｅｒｓｔｅｒ半径(Ｒｏ）の構成因子は環境に依存し、観察される実際の値は一覧の値とは異なり得ることを当業者は認識している。
様々な組み合わせにおける多くのドナー・フルオロフォアおよびアクセプターは、いずれも本発明において有用なクロストリジウム毒素基質に含まれ得る。ドナー・フルオロフォアは、一般的に、ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルとアクセプターの励起スペクトルとの間に実質的スペクトル重複が存在するように選択される。さらに、ドナー・フルオロフォアは、例えば、Ｈｅｌｉｕｍ−Ｃａｄｍｉｕｍ４４２ｎｍまたはアルゴン４８８ｎｍのような都合の良いレーザー周波数に近い励起極大を有し、それ故レーザー光はドナー・フルオロフォアを励起する、都合良い効果的手段として機能する。ある態様において、アクセプター部分の発光スペクトルの波長極大は、ドナー・フルオロフォアの励起スペクトルの波長極大より少なくとも１０ｎｍ大きい。さらなる態様において、アクセプターは、可視スペクトルの赤色部分に発光スペクトルを有するフルオロフォアである。さらなる態様において、アクセプターはスペクトルの赤外領域に発光スペクトルを有するフルオロフォアである。様々なドナー・フルオロフォア−アクセプター・ペア、およびそれらのＦｏｅｒｓｔｅｒ半径が、本明細書中表ＢおよびＣに与えられている。Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 6th Edition, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, 1996も参照。
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ＡＮＡＩ, ２−アントラセンス（anthracence） Ｎ−アセチルイミダゾール；
ＢＰＥ, Ｂ−フィコエリトリン；
ＣＦ, カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル；
ＣＰＭ, ７−ジエチルアミノ−３−（４'−マレイミジルフェニル）−４−メチルクマリン；
ＣＹ５, カルボキシメチルインドシアニン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル；
ｄｉＩ−Ｃ１８, １,１'−ジオクタデシル−３−３,３,３',３'−テトラメチル−インドカルボシアニン；
ｄｉＯ−Ｃ１４, ３,３'−ジテトラデシルオキサカルボシアニン；
ＤＡＢＭ, ４−ジメチルアミノフェニルアゾ−フェニル−４'−マレイミド；
ＤＡＣＭ, （７−（ジメチルアミノ）クマリン−４−イル）−アセチル；
ＤＡＮＺ, ダンシルアジリジン（dansylaziridine）；
ＤＤＰＭ, Ｎ−（４−ジメチルアミノ−３,５−ジニトロフェニル）マレイミド；
ＤＭＡＭＳ, ジメチルアミノ−４−マレイミドスチルベン（maleimidostilbene）；
ＤＳＭＮ, Ｎ−（２,５'−ジメトキシスチベン（dimethoxystiben）−４−イル）−マレイミド;
ＤＮＰ, ２,４−ジニトロフェニル;
ε−Ａ, １,Ｎ６−エタノアデノシン;
ＥＩＡ, ５−ヨードアセテトアミド（iodoacetetamido）エオシン;
ＥＩＴＣ, エオシン−５−イソチオシアネート;
ＥＮＡＩ, エオシン Ｎ−アセチルイミダゾール；
ＥＭ, エオシンマレイミド;
ＥｒＩＴＣ, エリスロシン−５'-イソチオシアネート;
ＥＴＳＣ, エオシン チオセミカラジド（thiosemicarazide）;
Ｆ２ＤＮＢ, １,５−ジフルオロ(difluro)−２,４'−ジニトロベンゼン;
Ｆ２ＤＰＳ, ４,４'−ジフルオロ−３,３'−ジニトロフェニルスルホン;
ＦＩＴＣ, フルオレセインチオセミカルバジド；
ＩＡＡＮＳ, ２−（４'−ヨードアセトアミド）アニリーノ）ナフタレン−６−スルホン酸；
ＩＡＥＤＡＮＳ, ５−（２−（（ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）−ナフタレン−１−スルホン酸；
ＩＡＦ, ５−ヨードアセトアミドフルオレセイン；
ＩＡＮＢＤ, Ｎ−（（２−（ヨードアセトキシ）エチル）−Ｎ−メチル）アミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１,３−ジアゾール；
ＩＰＭ, ３（４−イソチオシアネートフェニル）７−ジエチル−４−アミノ−４−メチルクマリン;
ＩＳＡ, ４−（ヨードアセトアミド）サリチル酸；
ＬＲＨ, リスアミンローダミン（lissaminerhodamine）;
ＬＹ, ルシファーイエロー；
ｍＢＢＲ, モノブロモビアマン（monobromobiamane）;
ＭＮＡ, （２−メトキシ−１−ナフチル）−メチル；
ＮＡＡ, ２−ナフトキシ酢酸；
ＮＢＤ, ７−ニトロ−２,１,３−ベンズオキサジアゾール（benzoxadiazol）−４−イル；
ＮＣＰ, Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ'−（１−ピレニル）カルボジイミド；
ＯＤＲ, オクタデシルローダミン；
ＰＭ, Ｎ−（１−ピレン）−マレイミド；
ＳＲＨ, スルホローダミン；
ＴＭＲ, テトラメチルローダミン；
ＴＮＰ, トリニトロフェニル； および
ＴＲ, テキサスレッド。
トリプトファンまたはチロシンのような芳香族アミノ酸はまた、クロストリジウム毒素基質および本明細書中に開示の組成物および方法において有用なドナー・フルオロフォアであり得る。トリプトファンまたはチロシンがドナー・フルオロフォアである典型的ドナー・フルオロフォア−アクセプター・ペア、および適当なＦｏｅｒｓｔｅｒ距離を以下の表Ｃに示す。修飾アミノ酸もまた、本発明において有用なクロストリジウム毒素基質中のドナー・フルオロフォアまたはアクセプターとして有用であり得る。そのような蛍光またはクエンチング修飾アミノ酸は当該分野において既知であり、例えば、蛍光アミノ酸であるＬ−ピレニルアラニン（Ｐｙａ）および非蛍光アクセプターであるｐ−ニトロフェニルアラニン（Ｎｏｐ）が挙げられる（例えば、Anne et al., Analytical Biochem. 291:253-261 (2001)に記載）。
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上記観点から、様々なドナー・フルオロフォア／アクセプター・ペアが本発明において有用なクロストリジウム毒素基質に含まれうることが理解される。クロストリジウム毒素基質において有用なドナー・フルオロフォア−アクセプターペアは、例えば、ローダミン；テキサスレッド；エオシン；ＲＯＸ(６−カルボキシ-Ｘ-ローダミン；Applied Biosystems Division of Perkin Elmer Corporation; Foster City, CA)；またはＴＡＭＲＡ(Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ−テトラメチル−６−カルボキシ−ローダミン；Applied Biosystems) と組み合わせたドナー・フルオロフォア・フルオレセインであり得る。本発明において有用なドナー・フルオロフォア−アクセプター・ペアはまた、例えば、ドナー・フルオロフォア・カスケードブルー（アクセプターとしてフルオレセインを有する）；ドナー・フルオロフォアＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０(４,４−ジフルオロ−５,７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ,４ａ−ジアザ−Ｓ−インダセン（indacene）（アクセプターとしてＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５４２／５６３(４,４−ジフルオロ−５−ｐ−メトキシフェニル−４−ボラ−３ａ,４ａ−ジアザ−Ｓ−インダセン）との組み合わせ）；またはＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５４２／５６３(アクセプターとしてＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５６４／５７０(４,４−ジフルオロ−５−スチリル−４−ボラ−３ａ,４ａ−ジアザ−Ｓ−インダセン）との組み合わせ）。ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）の名前の後の数字は、該分子の励起極大および発光極大を反映する（ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）化合物は、Molecular Probes (Eugene Oregon)から市販されている）ことが理解される。
本発明において有用なクロストリジウム毒素基質には、ドナー・フルオロフォアがフルオレセインであるものが挙げられる。ある態様において、クロストリジウム毒素基質は、ドナー・フルオロフォアとしてフルオレセインを、アクセプターとしてテトラメチルローダミンを含む。そのような基質は、４８０ｎｍから５０５ｎｍの範囲で、例えば、４８８ｎｍまたは４９２ｎｍで励起でき、発光は５２０ｎｍ（λｅｍフルオレセイン）、５８５ｎｍ（λｅｍテトラメチルローダミン）、またはその両方で検出できる。クロストリジウム毒素切断部位における基質の切断前は、テトラメチルローダミン発光強度は、フルオレセインのものよりも大きい。基質切断の結果、テトラメチルローダミンに対するフルオレセインの強度の比率が変化する。一般的に切断により、フルオレセインが主な発光フルオロフォアとなる。フルオレセインおよびテトラメチルローダミンを含むタンパク質およびペプチドを調製する方法は、当業界において周知である(例えば、Matsumoto et al., Bioorg. Med. Chem. Letters 10:1857 1861 (2000)参照）。
また、クロストリジウム毒素基質に有用なドナー・フルオロフォアは、例えば、ＥＤＡＮＳ (λＡｂ３４０ｎＭ, λＥｍ４９０ｎｍ)であり、それはＤＡＢＣＹＬのようなアクセプターと組み合わせることができる。ＤＡＢＣＹＬおよびＥＤＡＮＳをクロストリジウム毒素基質中で組み合わせた場合、切断前の基質においてエネルギーがＥＤＡＮＳドナー・フルオロフォアからＤＡＢＣＹＬアクセプターへ転移し、その結果ＥＤＡＮＳ発光蛍光のクエンチングが生じる。毒素切断部位で切断されると、切断されたＥＤＡＮＳ産物の蛍光は増加し、例えば遊離ドナー・フルオロフォアレベルまで回復し得る。切断前の基質における効率的な蛍光クエンチングは、ＥＤＡＮＳ発光スペクトルおよびＤＡＢＣＹＬ吸収スペクトルの好ましいエネルギー的重複、およびＥＤＡＮＳドナー・フルオロフォアの比較的長い励起状態寿命の結果として生じる(Wang et al., Tetrahedron Lett. 31:6493-6496 (1991); Holskin et al., Anal. Biochem. 226:148-155 (1995); および Wang et al., Anal. Biochem. 210:351-359 (1993))。
ダンシル(ＤＮＳまたは５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホニル）もまた、クロストリジウム毒素基質においてドナー・フルオロフォアまたはアクセプターとして有用であり得る。ある態様において、クロストリジウム毒素基質は、ダンシルをドナー・フルオロフォアとして含む；ダンシル・ドナーは、例えば、ダンシル・ドナー・フルオロフォアと近接する場合にクエンチャーとして働くＰｈｅ（ｐＮＯ２）のようなニトロフェニル残基アクセプターと組み合わせることができる。例えばニトロフェニル残基と組み合わせた、ダンシル・ドナー・フルオロフォアを含有する基質は、例えばFlorentin et. al., Anal. Biochem. 141:62-69 (1984) または Goudreau et. al., Anal. Biochem. 219:87-95 (1994)に記載されるように調製できる。別の態様において、クロストリジウム毒素基質は、アクセプターとしてダンシルを含む。ダンシル・アクセプターは、例えばＴｒｐ（λｅｘ２９０ｎｍ, λｅｍ３６０ｎｍ）のようなドナー・フルオロフォアと組み合わせた場合、クエンチャーとして機能しうる。Ｔｒｐおよびダンシルを含むクロストリジウム毒素基質において、Ｔｒｐ蛍光は、ダンシル基へのエネルギー転移によって６０％クエンチングでき、このクエンチングは、毒素切断部位における毒素プロテアーゼ活性の存在下、顕著に減少または消失され得る（例えば、Geoghegan et al., FEBS Letters 262:119-122 (1990)参照）。
十分に分離した発光極大を有するドナー−アクセプター・ペアはクロストリジウム毒素基質において有用であり得、それゆえに本発明の基質組成物、細胞および方法において有用であり得ることが理解される。十分分離した発光極大により、ドナー発光の混入がなく、変化したアクセプター発光の検出が可能になる。ドナー・フルオロフォアもしくはアクセプター、またはその両方が、例えば、近赤外（例えば６５０ｎｍより大）において、発光することができる。そのような近赤外発光ドナー・フルオロフォアおよびアクセプターは、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７のようなシアニン色素を含む(Selvin, 前述, 2000)。ある態様において、クロストリジウム毒素基質は、Ｃｙ３およびＣｙ５をドナー・フルオロフォア−アクセプターペアとして含む。Ｃｙ３は５７０ｎｍで最も強く発光し、Ｃｙ５は６７０ｎｍで最も強く発光する。そのようなシアニン色素は、例えば Gruber et al., Bioconj. Chem. 11:161-166 (2000) に記載されるように、簡単な合成により製造できる。
クロストリジウム毒素基質において有用なドナー・フルオロフォアはまた、例えば、希土類元素としてもまた知られるラントニド原子であってよい。テルビウム（Ｔｂ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）およびサマリウム（Ｓｍ）のようなランタニドは、鋭く突き立った波長、励起パルスに続くミリ秒の寿命を有し、極性がなく、かつ高量子収率を有する。テルビウムまたはユーロピウムキレートのようなランタニド・ドナー・フルオロフォアは、有機色素アクセプターを含む様々なアクセプターと組み合わせることができる。Ｅｕキレート・ドナー・フルオロフォアは、例えば、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）と組み合わせることができ、Ｔｂキレート・ドナー・フルオロフォアは、例えば、テトラメチルローダミンと組み合わせることができる。直接励起によるバックグラウンド蛍光は時間的に除かれる。有機アクセプターの寿命は、一般的に、ナノ秒範囲内であり、一方、感光発光はドナー・フルオロフォアの寿命に従い、マイクロ秒からミリ秒のオーダーである（Selvin, 前述, 2000参照）。従って、共鳴エネルギー転移の測定は、励起に続いて非特異的干渉蛍光が退色した後、比較的後の段階で開始できる。ランタニドキレートは当該分野において周知であり、例えばＥＧ＆Ｇ（登録商標）Wallac (Turku, Finland）から市販されている。
本発明において有用なドナー・フルオロフォアはまた、周知のフルオロフォア(７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル （Ｍｃａ）であってよく、クエンチャーである２,４−ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）のようなアクセプターと組み合わせることができる。例えば、Kakiuchiら、J. Virol. Methods 80:77-84 (1999)参照。クロストリジウム毒素基質においてＭｃａがＤｎｐのような適切なクエンチャーと組み合わされると、クロストリジウム毒素切断部位における切断の際にＭｃａからのドナー発光蛍光（λＥｍ３９３ｎｍ）の増加が検出され、これは毒素活性の指標である。
本発明において有用なドナー・フルオロフォアはまた、例えば、２−アミノベンゾイル（Ａｂｚ）基であり、要すれば、２,４−ジニトロフェニル（Ｄｎｐ）のようなクエンチャーと組み合わせることができる。切断前のクロストリジウム毒素基質において、Ｄｎｐ基は、共鳴エネルギー転移によってＡｂｚ基の蛍光をクエンチングする。基質のタンパク分解的切断はクエンチングを軽減し、その結果放出されたＡｂｚフラグメントの濃度に比例して蛍光が増加する。例えば、Ａｂｚをアミノ末端に含み、かつリジンのようなＤｎｐ誘導体化残基を含むクロストリジウム毒素基質は、例えば Le Bonniec et al., Biochemistry 35:7114-7122 (1996)に記載される日常的な方法によって調製可能である。
また、本発明において有用なドナー・フルオロフォアまたはアクセプターは、Molecular Probes (Eugene, OR)から市販のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素であり得る。本発明の基質組成物、細胞および方法において有用なＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素には、例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０が挙げられる。
本発明において有用なドナー・フルオロフォアまたはアクセプターはまた、遺伝子上にコードされた色素であり得る（上記）。ＧＦＰ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、またはＹＦＰのような遺伝子上にコードされた色素は、互いにＦＲＥＴペアを形成することができ、あるいは他の適したドナー・フルオロフォアまたはアクセプターと組み合わせ得ることが理解される。ある態様において、クロストリジウム毒素基質は遺伝子上にコードされているドナー・フルオロフォアおよび遺伝子上にコードされているアクセプターを含む。
別の態様において、クロストリジウム毒素基質は少なくともマイクロ秒の比較的長い蛍光寿命を有するフルオロフォアを含む。不純物の蛍光寿命はそれよりも短いので、そのようなアクセプターは蛍光発光の時間分解測定を可能にし、シグナル対ノイズ比率を増強できる。時間分解蛍光に有用なドナー・フルオロフォア／アクセプター・ペアは、例えば、１０５ｋＤａのフィコビリプロテイン（phycobiliprotein）・アクセプター・フルオロフォアであるアロフィコシアニンと組み合わせた、Ｅｕ-トリスビピリジン（trisbipyridine）クリプテート(ＴＢＰ−ＥＵ３＋, λＥｘ ３３７ ｎｍ)のようなユーロピウムクリプテート・ドナー・フルオロフォアであり得る(Sittampalam et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1:384-391 (1997))。Ｅｕ-トリスビピリジンクリプテートは、光を捕獲し、それをケージ化ＥＵ３＋へと導く二つのビピリジル基を有する。このドナー・フルオロフォアは、長い蛍光寿命を有し、アロフィコシアニンに近接したときに非放射的にエネルギーをそのアクセプターに転移し、ドナー・フルオロフォア−アクセプター距離９．５ｎｍで５０％より大きい転移効率を示す。ＴＢＰ−ＥＵ３＋およびアロフィコシアニンの両者およびそれらの分光学的特性は、生物学的培地中で非常に安定であり、アロフィコシアニンはドナーの長い寿命に従い発光し（λＥｍ＝６６５ｎｍ）、時間分解検出を可能にする(Kolb et al., J. Biomol. Screening 1:203-210 (1996)）。そのようなドナー・フルオロフォア−アクセプターペアを含む基質の調製方法は、例えば、Kolb et al., 前述, 1996、および、Sittampalam et al., 前述, 1997に記載されるように、当該分野において周知である。
さらなる態様において、本発明は、しばしば「真のクエンチャー」として示される、非蛍光アクセプターを含むクロストリジウム毒素基質に依存する。非蛍光アクセプターは、例えば、直接的（非感光）アクセプター励起の結果生じるバックグラウンド蛍光を除去するのに有用であり得る。様々な非蛍光アクセプターが当該分野において公知であり、例えば、ＤＡＢＣＹＬおよびＱＳＹ（登録商標）７色素が含まれる（Molecular Probes, 前述, 1996参照）。
本発明において有用なクロストリジウム毒素基質は、ドナー・フルオロフォアおよびアクセプターの間に位置するクロストリジウム毒素基質切断部位を含む。ある態様において、ドナー・フルオロフォアは該切断部位のアミノ末端に位置し、一方アクセプターは該切断部位のカルボキシ末端に位置する。別の態様においては、ドナー・フルオロフォアは該切断部位のカルボキシ末端に位置し、一方アクセプターは該切断部位のアミノ末端に位置する。
当業者は、本発明において有用なクロストリジウム毒素基質においてドナー・フルオロフォアおよびアクセプターを選択し、そして位置づける際にいくつか考慮する点があることを理解している。ドナー・フルオロフォアおよびアクセプターは一般に、クロストリジウム毒素に対する基質結合または該毒素によるタンパク分解への障害を最小限にするように位置づけられる。従って、ドナー・フルオロフォアおよびアクセプターを、例えば、結合に重要である結合型または非結合型相互作用の破壊を最小限にするように、かつ立体障害を最小限にするように、選択し位置づけることができる。さらに、アクセプターおよびドナー・フルオロフォアの間の空間距離は、一般に、ドナー・フルオロフォアからアクセプターへの効率的エネルギー転移を達成するよう制限される。
標準的命名において、クロストリジウム毒素切断部位周辺の配列は、Ｐ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’で示され、Ｐ１−Ｐ１’が切断容易な結合である。具体的な態様においては、本発明は、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５またはＰ＞５の位置の残基がドナー・フルオロフォアまたはアクセプターと結合したアミノ酸で置換されており、Ｐ１’、Ｐ２’、Ｐ３’、Ｐ４’、Ｐ５’またはＰ＞５’の位置の残基がドナー・フルオロフォアまたはアクセプターと結合したアミノ酸で置換されているクロストリジウム毒素基質を含む、基質組成物、細胞または方法を提供する。他の態様において、本発明は、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４、またはＰ＞５における残基がドナー・フルオロフォアまたはアクセプターと結合したアミノ酸と置換されており、Ｐ２’、Ｐ３’、Ｐ５’またはＰ＞５’の位置の残基がドナー・フルオロフォアまたはアクセプターと結合したアミノ酸と置換されているクロストリジウム毒素基質組み込んでいる基質組成物、細胞または方法を提供する。ドナー・フルオロフォアまたはアクセプターに結合した残基のアミノ酸側鎖は、その他の点では天然の標的タンパク質の対応する位置に存在する残基と同一であってよく、または、例えば異なる側鎖を含んでもよいことがさらに理解される。本発明によってさらに提供されるのは、Ｐ３、Ｐ４、またはＰ＞５の位置の残基がドナー・フルオロフォアまたはアクセプターと結合したアミノ酸で置換されており、Ｐ２’、Ｐ３’、Ｐ５’またはＰ＞５’の位置の残基がドナー・フルオロフォアまたはアクセプターと結合したアミノ酸で置換されているクロストリジウム毒素基質を組み込む基質組成物、細胞または方法である。同様に、ドナー・フルオロフォアまたはアクセプターに結合した残基のアミノ酸側鎖は、その他の点では天然の標的タンパク質の対応する位置に存在する残基と同一であってよく、または、例えば異なる側鎖を含んでもよい。
前述のように、ドナー・フルオロフォアからアクセプターへのエネルギー転移の効率は、一つには、ドナー・フルオロフォアおよびアクセプター分子の空間分離に依存する。ドナー・フルオロフォアとアクセプターの間の距離が増加するにつれて、アクセプターへのエネルギー転移が小さくなり、それゆえ、切断前であっても、ドナー・フルオロフォアシグナルが増加する。基質切断の際におけるドナー・フルオロフォアの蛍光収量の全体的増加は、基質におけるドナー・フルオロフォアとアクセプターの間の分離距離、ドナー・フルオロフォアおよびアクセプターの間のスペクトル重複、および基質の濃度を含む、多くの因子に依存する。基質濃度が増加するにつれて、ドナーの分子間クエンチングがタンパク質分解切断後であっても一因子になりうることを当業者は理解している。この現象は「内部フィルター効果」と表される。当業者であればさらに、基質の細胞内濃度が、例えば、誘導性プロモーターまたは細胞が暴露される外部基質濃度の使用を通じて制御できることを理解する。
Ｆｏｅｒｓｔｅｒ距離、即ち５０％エネルギー転移のためのドナー・フルオロフォアとアクセプターの間の分離は、優れた感受性を与えるドナー・フルオロフォアとアクセプターの間の空間分離を意味する。ペプチド基質について、近接する残基は、最も広がった構造において約３．６Åの距離によって隔てられている。例えば、フルオレセイン／テトラメチルローダミン・ペアについて計算したＦｏｅｒｓｔｅｒ距離は５５Åであり、これは最も広がった構造におけるフルオレセインとテトラメチルローダミンの間の約１５残基の空間分離を意味する。溶液中のペプチドおよびペプチド模倣物は完全に広がった構造を有することはまれなので、ドナー・フルオロフォアおよびアクセプターは、１残基につき３．６Åを用いて行った計算に基づいて期待されるよりもより広く隔てられているかもしれないが、例えば、約50アミノ酸により隔てられているドナー-アクセプターペア間のFRETの発生により示されるように、依然としてＦｏｅｒｓｔｅｒ距離内に留まっている場合がある(Graham et al., Analyt. Biochem. 296: 208-217 (2001))。
Ｆｏｅｒｓｔｅｒ理論は、ドナー・フルオロフォアとアクセプターの間の非常に弱い相互作用に基づく。一方のフルオロフォアの、吸収のような分光学的性質は、他方の存在下で変化を受けるべきではないので、該理論が有効な最短距離範囲を規定する。多くのドナー・フルオロフォア−アクセプター・ペアにとって、ドナー・フルオロフォアとアクセプターが約１０Åから１００Åの距離によって隔てられている場合に、Ｆｏｅｒｓｔｅｒ理論は有効であることが理解される。しかしながら、特定のドナー・フルオロフォア−アクセプター・ペアにとっては、Ｆｏｅｒｓｔｅｒ理論は、サブピコ秒技術によって測定されるので１０Å以下で有効である(Kaschke and Ernsting, Ultrafast Phenomenon in Spectroscopy (Klose and Wilhelmi (Eds.)) Springer-Verlag, Berlin 1990。
従って、特定の態様において本発明は、ドナー・フルオロフォアが最大１００Åの距離でアクセプターから隔てられているクロストリジウム毒素基質を組み込んでいる基質組成物、細胞または方法を提供する。他の態様において、本発明は、ドナー・フルオロフォアが最大９０Å、８０Å、７０Å、６０Å、５０Å、４０Å、３０Åまたは２０Åの距離でアクセプターから隔てられている、クロストリジウム毒素基質を組み込んでいる基質組成物、細胞または方法を提供する。さらなる態様において、本発明は、ドナー・フルオロフォアが１０Åから１００Å、１０Åから８０Å、１０Åから６０Å、１０Åから４０Å、１０Åから２０Å、２０Åから１００Å、２０Åから８０Å、２０Åから６０Å、２０Åから４０Å、４０Åから１００Å、４０Åから８０Åまたは４０Åから６０Åの距離でアクセプターから隔てられている、クロストリジウム毒素基質を組み込む基質組成物、細胞または方法を提供する。なおさらなる態様において、本発明は、ドナー・フルオロフォアが最大６残基、最大８残基、最大10残基、最大12残基、最大15残基、最大20残基、最大25残基、最大30残基、最大35残基、最大40残基、最大45残基、最大50残基、最大60残基、最大70残基、最大80残基、最大90残基、最大100残基、最大150残基、最大200残基または最大天然のクロストリジウム毒素標的タンパク質全長でアクセプターから隔てられている、クロストリジウム毒素基質を組み込む基質組成物、細胞または方法を提供する。
当業者は、本発明において有用なクロストリジウム毒素基質を、ＦＲＥＴの効率およびプロテアーゼ活性の検出能力を最適化するように設計できることを理解している。当業者は、要すれば、高量子収率を有するドナー・フルオロフォアを選択することができ、また要すれば、Ｆｏｅｒｓｔｅｒ距離を最大化するため、高消光係数を有するアクセプターを選択し得ることを理解している。当業者はさらに、アクセプターの直接励起により生じる蛍光は、共鳴エネルギー転移の結果生じる蛍光と区別するのが難しい場合があることを理解している。従って、ドナー・フルオロフォアおよびアクセプターは、アクセプターの直接励起を生じない波長においてドナーを励起できるように、それらの励起スペクトルが比較的ほとんど重ならないものを選択し得ることが認識される。さらに、本発明において有用なクロストリジウム毒素基質は、二つの発光が容易に区別できるように、ドナー・フルオロフォアおよびアクセプターの発光スペクトルがかなりほとんど重複しないように設計できることが認識されている。要すれば、高蛍光量子収率を有するアクセプターを選択することができる。アクセプター蛍光発光をクロストリジウム毒素プロテアーゼ活性の唯一の指標として、または上記のように発光比率の一部分として検出するならば、そのようなアクセプターが好ましい。
ドナー・フルオロフォア、アクセプター、またはその両者は、ボツリヌスまたは破傷風毒素ホロ酵素の活性部位キャビティー内に位置し得ることが理解される。当業者は、要すれば、ドナー・フルオロフォア、アクセプター、またはその両者が、毒素と結合した場合に毒素ホロ酵素の活性部位キャビティーから排除されるように、本発明に有用なクロストリジウム毒素基質を設計できることを理解している。例えば、毒素と結合した場合に、ドナー・フルオロフォア、アクセプター、またはその両者が毒素ホロ酵素の活性部位キャビティーから排除される、ボツリヌス毒素基質または破傷風毒素基質を本クロストリジウム毒素基質は含みうる。本発明は、例えば、毒素と結合した場合に、ドナー・フルオロフォア、アクセプター、またはその両者が毒素ホロ酵素の活性部位キャビティーから排除される、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/GまたはTeNT基質を組み込む基質組成物、細胞、または方法を提供する。ある態様において、BoNT/A基質はヒトSNAP-25の少なくとも６つの残基であって、Ｇｌｎ１９７−Ａｒｇ１９８を含むものを含有し、さらに、残基Ａｒｇ１９１からＭｅｔ２０２の外側に配置され、BoNT/Aホロ酵素の活性部位キャビティー内に存在し得るドナー・フルオロフォア、アクセプター、またはその両者を含む。別の態様において、BoNT/B基質は、Ｇｌｎ７６−Ｐｈｅ７７を含むVAMP-2の少なくとも６つの残基を含有し、さらに、VAMP-2の残基Ｌｅｕ７０からＡｌａ８１の外側に配置され、BoNT/Bホロ酵素の活性部位キャビティー内に存在し得るドナー・フルオロフォア、アクセプター、またはその両者を含む。
ＶＡＭＰ基質およびBoNT/B軽鎖（ＬＣ／Ｂ）の複合体において、水素結合アクセプターまたはドナーを含有する側鎖を有するVAMP残基のほとんど全てが、ＬＣ／Ｂと水素結合していた。従って、本発明において有用なクロストリジウム毒素基質は、要すれば、例えばＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｓｎまたはＧｌｎ残基による水素結合の可能性が、該クロストリジウム毒素基質において、その毒素による切断に感受性のある本来のタンパク質と比較して減少しないように調製できることは理解できる。具体的態様において、本発明は水素結合の可能性が、対応するクロストリジウム毒素による切断に感受性のある本来のタンパク質と比較してその基質において減少していない、クロストリジウム毒素基質を組み込んでいる基質組成物、細胞または方法を提供する。
ドナー・フルオロフォア、アクセプター、およびクロストリジウム毒素認識配列に加えて、本発明に有用なクロストリジウム毒素基質は、場合により１つまたはそれ以上の更なる構成要素を含みうることが理解される。例として、ＧＧＧＧＳ（配列番号40）のような柔軟性あるスペーサー配列が本発明に有用なクロストリジウム毒素基質に含まれ得る。さらに、クロストリジウム毒素基質は、以下のうち１つまたはそれ以上（但しこれらに限定されない）を含むことができる：アフィニティータグ、例えば、ＨＩＳ6、ビオチン、または、ＦＬＡＧ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ｃ−ｍｙｃまたはＡＵ１のようなエピトープ；イムノグロブリンヒンジ領域；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドリンカー；ヘアピンターンペプチドまたはペプチド模倣物；または、親水性配列、もしくはクロストリジウム毒素基質の溶解性または安定性を促進する別の構成要素または配列。
タンパク質、ペプチド、およびペプチド模倣物をドナー・フルオロフォアまたはアクセプターを含むように修飾する方法は、当該分野において周知である(Fairclough and Cantor, Methods Enzymol. 48:347-379 (1978); Glaser et al., Chemical Modification of Proteins Elsevier Biochemical Press, Amsterdam (1975); Haugland, Excited States of Biopolymers (Steiner Ed.) 29〜58頁, Plenum Press, New York (1983); Means and Feeney, Bioconjugate Chem. 1:2〜12 (1990); Matthews et al., Methods Enzymol. 208:468〜496 (1991); Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification 2nd Ed., CRC Press, Boca Ratan, Florida. (1991); Haugland，前述、1996)。ドナー・フルオロフォアまたはアクセプターを、例えばクロストリジウム毒素認識配列を含むペプチドまたは模擬ペプチドに連結するために種々の基を用いることができる。本発明の基質組成物、細胞および方法において有用なクロストリジウム毒素基質を産生するのにドナー・フルオロフォアまたはアクセプターをペプチドまたはペプチド模倣物の所望の位置に連結するため、例えばチオール基を使用することができる。ハロアセチルおよびマレイミド標識試薬もまた、本発明において有用なクロストリジウム毒素基質の調製においてドナー・フルオロフォアまたはアクセプターを連結するために使用できる(例えば Wu and Brand, 前述, 1994参照）。
ＧＦＰおよびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）のようなタンパク質を含むドナー・フルオロフォアおよびアクセプターは、様々な手段によってクロストリジウム毒素認識配列に結合することができる。ドナー・フルオロフォアまたはアクセプターは、例えば、クロス−リンカー部分を介する化学的手段によって結合できる。クロス−リンカーは当該分野において周知であり、例えばＢＭＨおよびＳＰＤＰのような、ホモ−またはヘテロ−二機能クロス−リンカーを含む。ドナー・フルオロフォアのみを含む基質が混入すると、高蛍光バックグラウンドが生じうることを当業者は理解している。そのようなバックグラウンドは、例えば、クロストリジウム毒素基質の調製において、ドナー・フルオロフォアに対して比較的過剰のアクセプターを使用することにより減少させる、または防ぐことができる。ドナー・フルオロフォアまたはアクセプターがタンパク質である場合、タンパク質のアミノ−またはカルボキシ−末端に特異的に分子を連結するため、周知の化学的方法を用いることができる。例えば、「Chemical Approaches to Protein Engineering」、Protein Engineering：A Practical Approach, Rees et al. (Eds) Oxford University Press, 1992参照。
クロストリジウム毒素が特異的かつ別個の切断部位を有することは周知である。BoNT/AはＧｌｎ−Ａｒｇ結合を切断する。BoNT/BおよびTeNTはＧｌｎ−Ｐｈｅ結合を切断する。BoNT/C1はＬｙｓ−ＡｌａまたはＡｒｇ−Ａｌａ結合を切断する。BoNT/DはＬｙｓ−Ｌｅｕ結合を切断する。BoNT/EはＡｒｇ−Ｉｌｅ結合を切断する。BoNT/FはＧｌｎ−Ｌｙｓ結合を切断する。およびBoNT/GはＡｌａ−Ａｌａ結合を切断する（表Ｄ参照）。標準的命名において、クロストリジウム毒素切断部位周辺の配列は、Ｐ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’−Ｐ３’−Ｐ４’−Ｐ５’で示され、Ｐ１−Ｐ１’が切断容易な結合である。Ｐ１またはＰ１’部位、または両方を、天然の残基に代えて別のアミノ酸またはアミノ酸模倣物に置換できることが理解される。例えば、Ｐ１位置（Ｇｌｎ）がアラニン、２−アミノ酪酸またはアスパラギン残基に改変されたBoNT/A基質が調製されている。これらの基質は、Ｐ１−Ａｒｇ結合においてBoNT/Aによって加水分解された(Schmidt and Bostian, J. Protein Chem. 16:19-26 (1997))。切断容易な結合、例えばBoNT/Aの切断容易な結合のＰ１位置に置換を導入することができることが認識されるが、Ｐ１’残基の保存が有利であり得ることがさらに理解される(Vaidyanathan et al., J. Neurochem. 72:327-337 (1999))。従って、特定の態様において、クロストリジウム毒素によって切断される標的タンパク質の天然の残基と比較して、Ｐ１’残基が改変または置換されていない、クロストリジウム毒素認識配列を有するクロストリジウム毒素基質に頼る基質組成物、細胞または方法を本発明は提供する。他の態様において、本発明はクロストリジウム毒素によって切断される標的タンパク質の天然の残基と比較してＰ１残基が改変または置換されている認識配列を有するクロストリジウム毒素基質に頼る基質組成物、細胞または方法を提供する。そのようなクロストリジウム毒素基質はＰ１およびＰ１’残基の間のペプチド結合切断に対する感受性を保持している。
Figure 2006502378
SNAP-25、VAMPおよびシンタキシンは、αヘリックス構造に適合すると推定される領域内に位置する短いモチーフを共有する（図４参照）。このモチーフは、本神経毒素に感受性のある動物に発現するSNAP-25、VAMPおよびシンタキシンアイソフォーム中に存在する。反対に、これらの神経毒素に対して抵抗性のあるショウジョウバエおよび酵母のホモログ、およびエキソサイトーシスに関与しないシンタキシンアイソフォームは、これらVAMPおよびシンタキシンタンパク質のαへリックスモチーフ領域中に配列変動を含む。
αヘリックスモチーフの複数の反復が、クロストリジウム毒素による切断に感受性のあるタンパク質に存在する。SNAP-25において４つのコピーが天然に存在する。VAMPにおいて二つのコピーが天然に存在する。およびシンタキシンにおいて２つのコピーが天然に存在する（図４Ａ参照）。さらに、αへリックスモチーフの特異的配列に相当するペプチドは、インビトロおよびインビボにおいて神経毒性活性を阻害することができ、このようなペプチドは異なる神経毒素を交差阻害することができる。さらに、このようなペプチドに対して惹起させた抗体は、この３つの標的タンパク質の間で交差反応でき、このことは、このαへリックスモチーフが細胞表面上に露出し、三つの標的タンパク質各々において良く似た構造をとっていることを意味している。これらの知見と一致して、SNAP-25特異的、VAMP特異的およびシンタキシン特異的な神経毒素は、同じ結合部位に対し競合することによって互いに交差阻害するが、非特異的には標的を切断しない。これらの結果は、クロストリジウム毒素認識配列が、要すれば、αヘリックスモチーフを少なくとも１つ含み得ることを意味する。以下に詳説するが、BoNT/Aに対する１６ｍｅｒおよび１７ｍｅｒ基質によって証明されるように、αヘリックスモチーフはクロストリジウム毒素による切断に必要ではないことが認識される。
複数のαへリックスモチーフが天然のSNAP-25、VAMPおよびシンタキシンの標的タンパク質において見出されるが、本発明の基質組成物、細胞および方法において有用なクロストリジウム毒素認識配列は１つのαへリックスモチーフを有しうる。具体的な態様において、本発明は２つまたはそれ以上のαへリックスモチーフを含むクロストリジウム毒素認識配列に依存する。BoNT/AまたはBoNT/E認識配列は、例えば、S4αへリックスモチーフを単独で、または１つ以上の追加のαへリックスモチーフと組み合わせて含んでいても良く、BoNT/B、BoNT/GまたはTeNT認識配列は、例えば、V2αへリックスモチーフを単独で、または１つ以上の追加のαへリックスモチーフと組み合わせて含んでいてもよく、BoNT/C1認識配列は、例えば、S4αへリックスモチーフを単独で、または１つ以上の追加のαへリックスモチーフと組み合わせて含んでいるか、またはX2αへリックスモチーフを単独で、または１つ以上の追加のαへリックスモチーフと組み合わせて含んでいても良く、そしてBoNT/DまたはBoNT/F認識配列は、例えば、V1αへリックスモチーフを単独で、または１つ以上のαへリックスモチーフと組み合わせて含んでいても良い（図４Ａ参照）。
種々のBoNT/A基質が本発明において有用である。本発明の基質組成物、細胞および方法において有用なBoNT/A基質は、例えば、SNAP-25の少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はGln-Argを含む）またはそのペプチド模倣物を含みうる。このようなBoNT/A基質は、例えば、ヒトSNAP-25の少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はGln197-Arg198を含む）またはそのペプチド模倣物を有し得る。このようなBoNT/A基質は、例えば、アミノ酸配列Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys (配列番号41)、または例えば、ヒトSNAP-25 (配列番号4)の187〜203残基を含有しうる。要すれば、BoNT/A基質はさらに、カルボキシ末端アミドを含有する。
本明細書で用いる用語「Ａ血清型ボツリヌス毒素認識配列」は、「BoNT/A認識配列」と同義語であり、クロストリジウム毒素プロテアーゼ活性に適した条件下、BoNT/Aによって切断容易な結合におけるタンパク分解を検出可能とするのに十分な近接または非近接認識エレメントを備えた、その切断容易な結合を意味する。BoNT/Aによって切断される切断容易な結合は、例えば、Ｇｌｎ−Ａｌａである。
様々なBoNT/A認識配列が当該分野において周知であり、本発明に有用である。BoNT/A認識配列は、例えば、ヒトSNAP-25の１３４−２０６残基または１３７−２０６残基を有することができる(Ekong et al., 前述, 1997；米国特許番号5,962,637)。また、BoNT/A認識配列としては配列Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (配列番号４９)またはそのペプチド模倣物（ヒトSNAP-25の１９０−２０２残基に相当）；Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys (配列番号５０) またはそのペプチド模倣物（ヒトSNAP-25の１８７−２０１残基に相当）；Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (配列番号５１) またはそのペプチド模倣物（ヒトSNAP-25の１８７−２０２残基に相当）；Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met-Leu (配列番号５２) またはそのペプチド模倣物（ヒトSNAP-25の１８７−２０３残基に相当）；Asp-Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (配列番号５３) またはそのペプチド模倣物（ヒトSNAP-25の１８６−２０２残基に相当）；またはAsp-Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met-Leu (配列番号５４) またはそのペプチド模倣物（ヒトSNAP-25の１８６−２０３残基に相当）を挙げることができるが、これらに限定されない。例えば、Schmidt and Bostian, J. Protein Chem. 14:703-708 (1995); Schmidt and Bostian, 前述, 1997; Schmidt et al., FEBS Letters 435:61-64 (1998)；およびSchmidt and Bostian, 米国特許番号5,965,699参照。要すれば、類似のBoNT/A認識配列は、別のBoNT/A感受性SNAP-25アイソフォームまたはマウス、ラット、ゴールドフィッシュまたはゼブラフィッシュSNAP-25のようなホモログの対応する（相同性ある）セグメントから調製することができるか、または、本明細書に開示されているか、または当該分野において公知（例えば米国特許番号5,965,699）のいずれかであり得る。
本発明において有用なBoNT/A認識配列は、Ａ血清型ボツリヌス毒素による切断に感受性のあるタンパク質のセグメントに対応するかもしれず、またはBoNT/A感受性タンパク質のセグメントに実質的に類似するかもしれない。表Ｅに示すように、BoNT/Aによる切断に感受性のある様々な天然タンパク質が当業界において知られており、例えば、ヒト、マウス、およびラットのSNAP-25、ゴールドフィッシュのSNAP-25ＡおよびSNAP-25Ｂが挙げられる。従って、本発明に有用なBoNT/A認識配列は、例えば、ヒトSNAP-25、マウスSNAP-25、ラットSNAP-25、ゴールドフィッシュSNAP-25Ａまたは２５Ｂ、またはBoNT/Aによる切断に感受性のある別の天然タンパク質の、セグメントに対応するかもしれない。さらに、BoNT/Aによって切断される本来のSNAP-25アミノ酸配列を比較すると、そのような配列は完全には保存されていないことがわかり（表Ｅおよび図５参照）、このことは、天然BoNT/A感受性SNAP-25配列と比較して、様々なアミノ酸置換および改変が本発明に有用なBoNT/A認識配列中で許容され得ることを示す。
Figure 2006502378
Figure 2006502378
クロストリジウム毒素基質、例えばBoNT/A基質は、対応するクロストリジウム毒素によって切断される天然配列と比較して、一つまたは複数の改変を有することができる。例えば、ヒトSNAP-25の１８７−２０３残基に相当する１７ｍｅｒと比較して、BoNT/A基質におけるＡｓｐ１９３のＡｓｎとの置換により、タンパク分解の相対率が０．２３になる；Ｇｌｕ１９４のＧｌｎとの置換により、相対率は２．０８になる；Ａｌａ１９５の２−アミノ酪酸との置換により、相対率が０．３８となる；そしてＧｌｎ１９７のＡｓｎ、２−アミノ酪酸、またはＡｌａとの置換により、相対率がそれぞれ０．６６、０．２５、または０．１９となる（表Ｆ参照）。その上、Ａｌａ１９９と２−アミノ酪酸との置換により、相対率は０．７９となる；Ｔｈｒ２００のＳｅｒまたは２−アミノ酪酸との置換により、相対率はそれぞれ０．２６または１．２０となる；Ｌｙｓ２０１のＡｌａとの置換により、相対率は０．１２になる；そしてＭｅｔ２０２のＡｌａまたはノルロイシンとの置換により、相対率はそれぞれ０．３８または１．２０になる。Schmidt and Bostian, 前述, 1997参照。これらの結果は、クロストリジウム毒素基質において、天然の毒素感受性配列と比較して様々な残基が置換可能であることを意味している。BoNT/Aの場合、これらの結果は、Ｇｌｕ１９４、Ａｌａ１９５、Ｇｌｎ１９７、Ａｌａ１９９、Ｔｈｒ２００およびＭｅｔ２０２、Ｌｅｕ２０３、Ｇｌｙ２０４、Ｓｅｒ２０５、およびＧｌｙ２０６を含む（ただしこれらに限定されない）残基およびＧｌｎ−Ａｒｇの切断容易な結合からもっとも離れている残基が、置換可能であること、または、本発明において有用なBoNT/A基質においてドナー・フルオロフォアまたはアクセプターと結合できることを意味している。このようなBoNT/A基質は、クロストリジウム毒素プロテアーゼ活性に適した条件下、BoNT/Aによって、その切断容易な結合で検出可能にタンパク質分解される。それゆえ、BoNT/A基質は、要すれば、天然SNAP-25配列に対する一つまたはいくつかのアミノ酸置換、付加または欠失を含むことができる。
Figure 2006502378
種々のBoNT/B基質が本発明において有用である。本発明において有用なBoNT/B基質は、例えば、VAMPの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はGln-Pheを含む）またはそのペプチド模倣物を含み得る。例えば、BoNT/B基質はヒトVAMP-2の少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はGln76-Phe77を含む）またはそのペプチド模倣物を含みうる。１態様において、BoNT/B基質はアミノ酸配列Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser (配列番号42)またはそのペプチド模倣物を含む。他の態様において、BoNT/B基質はヒトVAMP-2 (配列番号11)の55〜94残基、ヒトVAMP-2 (配列番号11)の60〜94残基、またはヒトVAMP-2 (配列番号11)の60〜88残基またはこれらの配列のうちの１つのペプチド模倣物を含む。
本明細書で用いる用語「Ｂ血清型ボツリヌス毒素認識配列」は、「BoNT/B認識配列」と同義語であり、適した条件下、BoNT/Bによって切断容易な結合での検出可能なタンパク分解に十分な近接または非近接認識エレメントを備えた、切断容易な結合を意味する。BoNT/Bによって切断される切断容易な結合は、例えば、Gln-Pheである。
種々のBoNT/B認識配列が当該分野において周知であるか、または日常的な方法により定義されうる。このようなBoNT/B認識配列は、例えば、ヒトVAMP-1またはヒトVAMP-2のようなVAMPタンパク質の親水性コアのいくらかまたは全てに対応する配列を含み得る。BoNT/B認識配列は、ヒトVAMP-2 (配列番号11)の33〜94残基、45〜94残基、55〜94残基、60〜94残基、65〜94残基、60〜88残基またはヒトVAMP-1 (配列番号10)の60〜94残基を含みうるが、これらに限定しない。例えば、Shoneら、Eur. J. Biochem. 217: 965-971 (1993)および米国特許番号5,962,637参照。要すれば、類似のBoNT/B認識配列は別のBoNT/B感受性VAMPアイソフォームまたはホモログ（例えば、ヒトVAMP-1）またはラットまたはニワトリVAMP-2の対応する（相同な）セグメントから製造することができる。
従って、BoNT/B認識配列はB血清型ボツリヌス毒素による切断に感受性のあるタンパク質のセグメントに対応しうるか、またはBoNT/B感受性タンパク質のこのようなセグメントに実質的に類似しうることが理解される。表Ｇに示すように、BoNT/Bによる切断に感受性のある種々の天然タンパク質が当該分野において公知であり、例えば、ヒト、マウスおよびウシのVAMP-1およびVAMP-2、ラットVAMP-2、ラットセルブレビン、ニワトリVAMP-2、シビレエイVAMP-1、キタムラサキウニVAMP、アメフラシVAMP、イカVAMP、C. elegans VAMP、ショウジョウバエ n-syb、およびヒルVAMPが挙げら得る。それゆえ、BoNT/B基質に含まれるBoNT/B認識配列は、例えば、ヒトVAMP-1またはVAMP-2、マウスVAMP-1またはVAMP-2、ウシVAMP-1またはVAMP-2、ラットVAMP-2、ラットセルブレビン、ニワトリ、VAMP-2、シビレエイVAMP-1、キタムラサキウニVAMP、アメフラシVAMP、イカVAMP、C. elegans VAMP、ショウジョウバエn-syb、ヒルVAMPまたはBoNT/Bによる切断に感受性のある別の天然タンパク質のセグメントに対応し得る。さらに、表Ｇに示されるように、BoNT/Bにより切断されるネイティブなVAMPアミノ酸配列の比較により、このような配列が完全には保存されていないことが示され（図６も参照）、これは天然VAMP配列と比較して種々のアミノ酸置換および修飾が、例えば、本発明のBoNT/B基質組成物において有用なBoNT/B基質に寛容されうることを示す。
種々のBoNT/C1基質が本発明において有用である。本発明において有用なBoNT/C1基質は、例えば、シンタキシンの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はLys-Alaを含む）またはそのペプチド模倣物を有し得る。例として、BoNT/C1基質はヒトシンタキシンの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はLys253-Ala254を含む）またはそのペプチド模倣物を有しうる。１態様において、BoNT/C1基質はアミノ酸配列Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Tyr (配列番号43)またはそのペプチド模倣物を含有する。
また、BoNT/C1基質は、例えば、SNAP-25の少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はArg-Alaを含む）またはそのペプチド模倣物を含有しうる。このようなBoNT/C1基質は、例えば、ヒトSNAP-25の少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はArg198-Alal99を含む）またはそのペプチド模倣物を含みうる。１態様において、BoNT/C1基質はヒトSNAP-25 (配列番号4)の93〜202残基またはそのペプチド模倣物を含有する。
本明細書中で用いる用語「C1血清型ボツリヌス毒素認識配列」は「BoNT/C1認識配列」と同義語であり、適した条件下、BoNT/C1によって切断容易な結合での検出可能なタンパク分解に十分な近接または非近接認識エレメントを備えた、切断容易な結合を意味する。BoNT/C1によって切断される切断容易な結合は、例えば、Lys-AlaまたはArg-Alaである。
Figure 2006502378
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BoNT/C1認識配列はC1血清型ボツリヌス毒素による切断に感受性のあるタンパク質のセグメントに対応しうるか、またはBoNT/C1感受性タンパク質のセグメントに実質的に類似しうることが理解される。表Ｈに示すように、BoNT/C1による切断に感受性のある種々の天然のタンパク質が当該分野において公知であり、例えば、ヒト、ラット、マウスおよびウシのシンタキシン1Aおよび1B、ラットシンタキシン2および3、キタムラサキウニシンタキシン、アメフラシシンタキシン1、イカシンタキシン、ショウジョウバエDsynt1およびヒルシンタキシン1が挙げられる。それゆえ、BoNT/C1基質において有用なBoNT/C1認識配列は、例えば、ヒト、ラット、マウスまたはウシのシンタキシン1Aまたは1B、ラットシンタキシン2、ラットシンタキシン3、キタムラサキウニシンタキシン、アメフラシシンタキシン1、イカシンタキシン、ショウジョウバエDsynt1、ヒルシンタキシン1またはBoNT/C1による切断に感受性のある別の天然タンパク質のセグメントに対応しうる。さらに、BoNT/C1により切断されるネイティブなシンタキシンアミノ酸配列の比較により、このような配列が完全には保存されていないことが示され（表Ｈおよび図７参照）、これは天然のBoNT/C1感受性シンタキシン配列と比較して種々のアミノ酸置換および修飾が本発明に有用なBoNT/C1基質中で寛容されうることを示す。
種々の天然のSNAP-25タンパク質もまた、BoNT/C1による切断に感受性があり、これにはヒト、マウスおよびラットSNAP-25、ゴールドフィッシュSNAP25Aおよび25B、およびショウジョウバエおよびヒルのSNAP-25が挙げられる。従って、BoNT/C1基質において有用なBoNT/C1認識配列は、例えば、ヒト、マウスまたはラットのSNAP-25、ゴールドフィッシュSNAP-25Aまたは25B、シビレエイSNAP-25、ゼブラフィッシュSNAP-25、ショウジョウバエSNAP-25、ヒルSNAP-25、またはBoNT/C1による切断に感受性のある別の天然タンパク質のセグメントに対応し得る。種々の天然シンタキシン配列に関して上に記載したように、BoNT/C1により切断されるネイティブなSNAP-25アミノ酸配列の比較は、顕著な配列多様性を示し（上記表Ｅおよび図５参照）、天然のBoNT/C1感受性SNAP-25配列と比較して種々のアミノ酸置換および修飾が本発明において有用なBoNT/C1基質において寛容されうることを示す。
当業者であれば、種々のBoNT/D基質が本発明に有用であることを認識する。本発明において有用なBoNT/D基質は、例えば、VAMPの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はLys-Leuを含む）またはそのペプチド模倣物を有しうる。１態様において、BoNT/D基質はヒトVAMPの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はLys59-Leu60を含む）またはそのペプチド模倣物を有しうる。別の態様において、BoNT/D基質はアミノ酸配列Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu (配列番号44)またはそのペプチド模倣物を含む。さらなる態様において、BoNT/D基質はラットVAMP-2 (配列番号109)の27〜116残基またはそのペプチド模倣物を含む。
用語「Ｄ血清型ボツリヌス毒素認識配列」は「BoNT/D認識配列」と同義語であり、適した条件下、BoNT/Dによって切断容易な結合におけるタンパク分解を検出可能とするのに十分な近接または非近接認識エレメントを備えた、切断容易な結合を意味する。BoNT/Dによって切断される切断容易な結合は、例えば、Lys-Leuであり得る。
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種々のBoNT/D認識配列が当該分野において周知であるか、または日常的な方法により定義されうる。BoNT/D認識配列としては、例えば、ラットVAMP-2 (配列番号109; Yamasaki et. al., J. Biol. Chem. 269:12764-12772 (1994))の27〜116残基、37〜116残基、1〜86残基、1〜76残基または1〜69残基を含みうる。それゆえ、BoNT/D認識配列は、例えば、ラットVAMP-2 (配列番号109)の27〜69残基または37〜69残基を含みうる。要すれば、類似のBoNT/D認識配列を別のBoNT/D感受性VAMPアイソフォームまたはホモログ（例えば、ヒトVAMP-1またはヒトVAMP-2）の対応する（相同な）セグメントから製造することができる。
BoNT/D認識配列はＤ血清型ボツリヌス毒素による切断に感受性のあるタンパク質のセグメントに対応し得るか、またはBoNT/D感受性タンパク質のセグメントに実質的に類似しうる。表Ｈに示すように、BoNT/Dによる切断に感受性のある種々の天然タンパク質が当該分野において公知であり、例えば、ヒト、マウスおよびウシVAMP-1およびVAMP-2、ラットVAMP-1およびVAMP-2、ラットセルブレビン、ニワトリVAMP-1およびVAMP-2、シビレエイVAMP-1、アメフラシVAMP、イカVAMP、ショウジョウバエsybおよびn-syb、ならびにヒルVAMPが挙げられる。従って、BoNT/D認識配列は、例えば、ヒトVAMP-1またはVAMP-2、マウスVAMP-1またはVAMP-2、ウシVAMP-1またはVAMP-2、ラットVAMP-1またはVAMP-2、ラットセルブレビン、ニワトリVAMP-1またはVAMP-2、シビレエイVAMP-1、アメフラシVAMP、イカVAMP、ショウジョウバエsybまたはn-syb、ヒルVAMP、またはBoNT/Dによる切断に感受性のある別の天然タンパク質のセグメントに対応しうる。さらに、上記表Ｈに示されるように、BoNT/Dにより切断される天然のVAMPアミノ酸配列の比較により、顕著な配列多様性（図６も参照）が示され、これは天然のBoNT/D感受性VAMP配列と比較して種々のアミノ酸置換および修飾が本発明において有用なBoNT/D基質において寛容されうることを示す。
種々のBoNT/E基質が本発明において有用である。BoNT/E基質は、例えば、SNAP-25の少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はArg-Ileを含む）またはそのペプチド模倣物を含み得る。このようなBoNT/E基質は、例えば、ヒトSNAP-25の少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はArg180-Ile181を含む）またはそのペプチド模倣物を含みうる。特定の態様において、BoNT/E基質はアミノ酸配列Gln-Ile-Asp-Arg-Ile-Met-Glu-Lys (配列番号45)またはそのペプチド模倣物を含む。他の態様において、BoNT/E基質はヒトSNAP-25 (配列番号4)の156〜186残基またはそのペプチド模倣物を含む。
本明細書中で用いる用語「Ｅ血清型ボツリヌス毒素認識配列」は「BoNT/E認識配列」と同義であり、適切な条件下でBoNT/Eによる切断容易な結合で検出可能なタンパク質分解に十分な隣接または非隣接認識エレメントを備えた、切断容易な結合を意味する。BoNT/Eによって切断される切断容易な結合は、例えば、Arg-Ileである。
当業者であれば、BoNT/E認識配列がＥ血清型ボツリヌス毒素による切断に感受性のあるタンパク質のセグメントに対応することができるか、またはBoNT/E感受性タンパク質のセグメントに実質的に類似し得ることを理解する。BoNT/Eによる切断に感受性のある種々の天然タンパク質が当該分野において公知であり、例えば、ヒト、マウスおよびラットのSNAP-25、マウスSNAP-23、ニワトリSNAP-25、ゴールドフィッシュSNAP-25AおよびSNAP-25B、ゼブラフィッシュSNAP-25、C. elegans SNAP-25およびヒルSNAP-25が挙げられる (表Ｅ参照)。従って、BoNT/E認識配列は、例えば、ヒトSNAP-25、マウスSNAP-25、ラットSNAP-25、マウスSNAP-23、ニワトリSNAP-25、ゴールドフィッシュのSNAP-25Aまたは25B、C. elegans SNAP-25、ヒルSNAP-25、またはBoNT/Eによる切断に感受性のある別の天然タンパク質のセグメントに対応しうる。さらに、上記表Eおよび図5に示すように、BoNT/Eにより切断されたネイティブなSNAP-23およびSNAP-25アミノ酸配列を比較すると、このような配列は完全に保存的ではないことが示され、このことは天然のBoNT/E感受性SNAP-23またはSNAP-25配列と比較して種々のアミノ酸置換および改変が本発明において有用なBoNT/E基質において寛容されうることを示す。
種々の有用なBoNT/F基質が本発明において有用であり得る。このようなBoNT/F基質としては、例えば、VAMPの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はGln-Lysを含む）またはそのペプチド模倣物を挙げることができる。１態様において、BoNT/F基質はヒトVAMPの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はGln58-Lys59を含む）またはそのペプチド模倣物を有する。別の態様において、BoNT/F基質は、ラットVAMP-2 (配列番号109)の27〜116残基またはそのペプチド模倣物を含む。さらなる態様において、BoNT/F基質はアミノ酸配列Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu (配列番号46)またはそのペプチド模倣物を含む。
本明細書で用いる用語「Ｆ血清型ボツリヌス毒素認識配列」は、「ＢｏＮＴ／Ｆ認識配列」と同義語であり、適した条件下、BoNT/Fによって切断容易な結合での検出可能なタンパク分解に十分な近接または非近接認識エレメントを備えた、切断容易な結合を意味する。BoNT/Fによって切断される切断容易な結合は、例えば、Ｇｌｎ−Ｌｙｓであり得る。
様々なBoNT/F認識配列が当該分野において周知であるか、または日常的な方法で規定できる。BoNT/F認識配列は、例えばラットVAMP-2（配列番号109、Yamasaki et al., 前述, 1994）の27−116残基、37−116残基、１−86残基、１−76残基または１−69残基を含むことができる。BoNT/F認識配列はまた、例えばラットVAMP-2（配列番号109）の２７−６９残基または３７−６９残基を含むことができる。類似のBoNT/F認識配列は、要すれば、別のBoNT/F感受性VAMPアイソフォームまたはヒトVAMP-1またはヒトVAMP-2のようなホモログの、対応する（相同性ある）セグメントから調製できることが理解される。
BoNT/F認識配列は、Ｆ血清型ボツリヌス毒素による切断に感受性のあるタンパク質のセグメントに一致してよく、またはBoNT/F感受性タンパク質のセグメントに実質的に類似してもよい。BoNT/Fによる切断に感受性のある様々な天然タンパク質が当該分野において公知であり、例えば、ヒト、マウス、およびウシVAMP-1およびVAMP-2、ラットVAMP-1およびVAMP-2、ラットセルブレビン、ニワトリVAMP-1およびVAMP-2、シビレエイVAMP-1、アメフラシＶＡＭＰ、ショウジョウバエｓｙｂおよびヒルＶＡＭＰを含む（表Ｈ参照）。従って、BoNT/F認識配列は、例えば、ヒトVAMP-1またはVAMP-2、マウスVAMP-1またはVAMP-2、ウシVAMP-1またはVAMP-2、ラットVAMP-1またはVAMP-2、ラットセルブレビン、ニワトリVAMP-1またはVAMP-2、シビレエイVAMP-1、アメフラシVAMP、ショウジョウバエｓｙｂ、ヒルVAMP、またはBoNT/Fによる切断に感受性のある別の天然タンパク質の、セグメントと一致してよい。さらに、上記表Ｈに示されるように、BoNT/Fによって切断される本来のVAMPアミノ酸配列を比較すると、そのような配列は完全には保存されておらず（図６も参照）、このことは、天然BoNT/F感受性VAMP配列と比較して、様々なアミノ酸置換および改変が本発明において有用なBoNT/F基質において寛容されることを意味している。
他のクロストリジウム毒素基質に関して、種々のBoNT/G基質が本発明において有用であり得る。本発明において有用なBoNT/G基質は、例えば、VAMPの少なくとも６個の連続残基（該６個の連続残基はAla-Alaを含む）またはそのペプチド模倣物を有し得る。このようなBoNT/G基質は、例えば、ヒトVAMPの少なくとも６個の連続残基（Ala83-Ala84を含む）またはそのペプチド模倣物を有し得る。ある態様において、BoNT/G基質はアミノ酸配列Glu-Thr-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys (配列番号47)またはそのペプチド模倣物を含む。
本明細書で用いる用語「Ｇ血清型ボツリヌス毒素認識配列」は、「BoNT/G認識配列」と同義語であり、適した条件下、BoNT/Gによって切断容易な結合におけるタンパク分解を検出可能とするのに十分な近接または非近接認識エレメントを備えた、切断容易な結合を意味する。BoNT/Gによって切断される切断容易な結合は、例えば、Ａｌａ−Ａｌａであり得る。
BoNT/G認識配列は、Ｇ血清型ボツリヌス毒素による切断に感受性のあるタンパク質のセグメントに一致してよく、またはそのようなBoNT/G感受性セグメントに実質的に類似してもよい。上記表Ｈに示されるように、BoNT/Gによる切断に感受性のある様々な天然タンパク質が当業界において知られており、例えば、ヒト、マウス、およびウシVAMP-1およびVAMP-2、ラットVAMP-1およびVAMP-2、ラットセルブレビン、ニワトリVAMP-1およびVAMP-2およびシビレエイVAMP-1が挙げられる。従って、BoNT/G認識配列は、例えば、ヒトVAMP-1またはVAMP-2、マウスVAMP-1またはVAMP-2、ウシVAMP-1またはVAMP-2、ラットVAMP-1またはVAMP-2、ラットセルブレビン、ニワトリVAMP-1またはVAMP-2、シビレエイVAMP-1、またはBoNT/Gによる切断に感受性のある別の天然タンパク質の、セグメントと対応するかもしれない。さらに、上記表Ｈに示されるように、BoNT/Gによって切断される本来のVAMPアミノ酸配列を比較すると、そのような配列は完全には保存されておらず（図６も参照）、このことは、天然BoNT/G感受性VAMP配列と比較して、様々なアミノ酸置換および改変が本発明に有用なBoNT/G基質において寛容され得ることを意味している。
種々のTeNT基質が本明細書中に開示する組成物および方法において有用であり得る。本発明において有用なTeNT基質は、例えば、VAMPの少なくとも６つの連続残基（該６個の連続残基はＧｌｎ−Ｐｈｅを含む）またはそのペプチド模倣物を有し得る。例えば、そのようなTeNT基質は、ヒトVAMP-2の少なくとも６つの連続残基（該６個の連続残基はＧｌｎ７６−Ｐｈｅ７７を含む）またはそのペプチド模倣物を有し得る。ある態様において、TeNT基質は、アミノ酸配列Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser (配列番号48)またはそのペプチド模倣物を含む。別の態様において、TeNT基質は、ヒトVAMP-2（配列番号11）の33−94残基、ヒトVAMP-2（配列番号11）の25−93残基、ラットVAMP-2（配列番号109）の27−116残基、またはこれら配列のうち一つのペプチド模倣物を含む。
本明細書中で用いる用語「破傷風毒素認識配列」は、適した条件下、破傷風毒素によって切断容易な結合での検出可能なタンパク分解に十分な近接または非近接認識エレメントを備えた、切断容易な結合を意味する。TeNTによって切断される切断容易な結合は、例えば、Ｇｌｎ−Ｐｈｅであり得る。
様々なTeNT認識配列が当該分野において周知であるか、または日常的な方法で規定でき、ヒトVAMP-1またはヒトVAMP-2のようなVAMPタンパク質の親水性コアのいくつかまたは全てに対応する配列を含む。TeNT認識配列は、例えばヒトVAMP-2（配列番号11、Cornille et. al., Eur. J. Biochem. 222:173-181 (1994); Foranら、Biochem. 33: 15365-15374 (1994)）の25-93残基または33−94残基、ラットVAMP-2（配列番号109、Yamasaki et al., 前述, 1994）の51−93残基または１−86残基、またはヒトVAMP-1（配列番号10）の33−94残基を含むことができる。TeNT認識配列はまた、例えばヒトVAMP-2（配列番号11）またはラットVAMP-2（配列番号109）の25−86残基、33−86残基、または51−86残基を含むことができる。類似のTeNT認識配列は、要すれば、別のTeNT感受性VAMPアイソフォームまたはヒトVAMP-1またはキタムラサキウニまたはアメフラシVAMPのような種ホモログの、対応する（相同性ある）セグメントから調製できることが理解される。
つまり、TeNT認識配列は、破傷風毒素による切断に感受性のあるタンパク質のセグメントに対応しうるか、またはTeNT感受性タンパク質のセグメントに実質的に類似し得る。上記表Ｈに示されるように、TeNTによる切断に感受性のある様々な天然タンパク質が当業界において知られており、例えば、ヒト、マウス、およびウシVAMP-1およびVAMP-2、ラットVAMP-2、ラットセルブレビン、ニワトリVAMP-2、シビレエイVAMP-1、キタムラサキウニVAMP、アメフラシVAMP、イカVAMP、C. elegans VAMP、ショウジョウバエn-sybおよびヒルVAMPを含む。従って、TeNT認識配列は、例えば、ヒトVAMP-1またはVAMP-2、マウスVAMP-1またはVAMP-2、ウシVAMP-1またはVAMP-2、ラットVAMP-2、ラットセルブレビン、ニワトリVAMP-2、シビレエイVAMP-1、キタムラサキウニVAMP、アメフラシVAMP、イカVAMP、C. elegans VAMP、ショウジョウバエn-syb、ヒルVAMPまたはTeNTによる切断に感受性のある別の天然タンパク質のセグメントと対応し得る。さらに、TeNTによって切断されるネイティブなVAMPアミノ酸配列の比較により、そのような配列は完全には保存されていないことがわかり（表Ｈおよび図６）、このことは、天然TeNT感受性VAMP配列と比較して、様々なアミノ酸置換および改変が本発明において有用なTeNT基質において寛容されることを意味している。
本発明の基質組成物、細胞または方法において有用なクロストリジウム毒素基質は、同一または異なるクロストリジウム毒素に対する１つまたは複数の区とストリジウム毒素切断部位を含むことができる。具体的な態様において、本発明はクロストリジウム毒素基質が唯一のクロストリジウム毒素切断部位を含む、基質組成物、細胞または方法を提供する。他の態様において、本発明は同一のクロストリジウム毒素に対してクロストリジウム毒素基質が複数の切断部位を有している、基質組成物、細胞または方法を提供する。これらの切断部位は、同一または異なるクロストリジウム毒素認識配列が伴ってもよい。例えば、本発明の基質組成物は同じドナー・フルオロフォアとアクセプターとの間にある同じクロストリジウム毒素に対して複数の切断部位を有するクロストリジウム毒素を含んでも良い。本発明の基質組成物、細胞または方法において有用なクロストリジウム毒素基質は、例えば、同じクロストリジウム毒素に対して２以上、３以上、５以上または10以上の切断部位を有していても良い。本発明において有用なクロストリジウム毒素基質はまた、例えば、同じクロストリジウム毒素に対して２、３、４、５、６、７、８、９または10個の切断部位を有していてもよく、複数の切断部位は同一または異なるドナー・フルオロフォア・アクセプター・ペアの間にあっても良い。
本発明の基質組成物、細胞または方法において有用なクロストリジウム毒素基質はまた、異なるクロストリジウム毒素に対する切断部位および認識配列を含みうる。具体的な態様において、本発明は、全てが同一のドナー・フルオロフォア-アクセプター・ペアの間にある異なるクロストリジウム毒素に対する複数の切断部位をクロストリジウム毒素基質が有する、基質組成物、細胞または方法を提供する。本発明の基質組成物、細胞または方法は、全てが同一のドナー・フルオロフォア・アクセプター・ペアの間にある２種またはそれ以上、３種またはそれ以上あるいは５種またはそれ以上のクロストリジウム毒素に対する切断部位を有するクロストリジウム毒素基質を含みうる。本発明の基質組成物、細胞または方法はまた、２種またはそれ以上、３種またはそれ以上、あるいは５種またはそれ以上の異なるクロストリジウム毒素に対する切断部位が少なくとも２種のドナー・フルオロフォア-アクセプター・ペアの間にあるクロストリジウム毒素基質を組み込む。具体的な態様において、本発明は２、３、４、５、６、７または８種の異なるクロストリジウム毒素に対する切断部位を有するクロストリジウム毒素基質を含む基質組成物、細胞または方法を提供し、この切断部位は同一または異なるドナー・フルオロフォア-アクセプター・ペアの間にある。さらなる態様において、本発明は、クロストリジウム毒素基質が、例えば、クロストリジウム毒素BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/GおよびTeNTの任意の組合せに対する、２、３、４、５、６、７または８個の切断部位の任意の組合せを有している基質組成物、細胞または方法を提供する。
上記の全ての学術論文、文献および特許引例は、括弧内のものもそうでないものも、以前に記載されているか否かに関わらず、それら全体が引用により本明細書に含まれる。
本発明は前述の実施例に関連して示されているが、本発明の精神から離れることなく様々に修飾できることは理解されるべきである。すなわち、本発明は、本特許請求の範囲のみに限定されるものではない。
図１は、クロストリジウム神経毒素の活性化の推定構造および仮定機序の図を示す。毒素は、ループによってつながった三つの５０ｋＤａドメインより成る、１５０ｋＤａの不活性単一ポリペプチド鎖として生産され得る。選択的タンパク分解切断が、ジスルフィド結合した二つの鎖：５０ｋＤａのＬ鎖および１００ｋＤａのＨ鎖（ＨＮおよびＨＣと示される二つのドメインより構成される）を生成することにより該毒素を活性化する。三つのドメインは別個の働きをする：重鎖のＣ末ドメイン（ＨＣ）は、細胞結合において機能し、一方重鎖のＮ末ドメイン（ＨＮ）は、エンドソームから細胞質へのトランスロケーションを可能にする。細胞内におけるジスルフィド結合の還元に続き、Ｌ鎖の亜鉛−エンドペプチダーゼ活性が発生する。 図２は、中枢ニューロンおよび末梢ニューロンにおける破傷風およびボツリヌス毒素活性に必要な４つの段階の図を示す。 図３は、SNAP-25、VAMPおよびシンタキシンの形質膜における細胞内局在および切断部位を示す。VAMPはシナプス小胞膜に結合し、一方SNAP-25およびシンタキシンは標的形質膜に結合している。BoNT/Aおよび／ＥはＳＡＮＰ−２５をカルボキシ末端付近で切断し、９または２６残基をそれぞれ放出する。BoNT/B、／Ｄ、／Ｆ、／ＧおよびTeNTは、VAMPの中心保存部分（点描部分）に作用し、VAMPのアミノ末端部分をサイトゾルに放出する。BoNT/C1は、カルボシキ末端付近でSNAP-25を切断し、同様にシンタキシンをサイトゾル膜表面近くの単一の部位で切断する。BoNT/B、／Ｃ１、／Ｄ、／Ｆ、／ＧおよびTeNTの作用により、VAMPまたはシンタキシンのサイトゾルドメインの大部分が放出されるが、一方BoNT/A、／Ｃ１、または／Ｅによる選択的タンパク分解によっては、SNAP-25のほんの小さな部分しか放出されない。 図４は、VAMP、SNAP-25およびシンタキシンの神経毒素認識モチーフを示す。（Ａ）斜線ボックスは、三つのクロストリジウム神経毒素の標的に共通するモチーフの存在および部分を示す。（Ｂ）認識モチーフは、疎水性残基（「ｈ」）；負に荷電したＡｓｐまたはＧｌｕ残基（「−」）および極性残基（「ｐ」）からなり、「ｘ」は任意のアミノ酸を示す。本モチーフは、VAMP、SNAP-25およびシンタキシンのαヘリックス構造をとると予想される領域に含まれる。（Ｃ）αヘリックス構造における本モチーフを上から見た図を示す。負に荷電した残基が一方の面にならび、一方疎水性残基は第二の面に並ぶ。 図５は、様々なSNAP-25タンパク質およびそれらのBoNT/E、BoNT/AおよびBoNT/C1切断部位のアラインメントを示す。ヒトSNAP-25（配列番号４、ＧenＢank受託番号g4507099、関連ヒトSNAP-25配列 g2135800も参照）；マウスSNAP-25（配列番号５、ＧenＢank受託番号G6755588）;ショウジョウバエSNAP-25 (配列番号６、ＧenＢank受託番号g548941）；ゴールドフィッシュＳＡＮＰ−２５（配列番号７、ＧenＢank受託番号g2133923)；キタムラサキウニSNAP-25（配列番号８、ＧenＢank受託番号g2707818）およびニワトリSNAP-25（配列番号９、ＧenＢank受託番号g481202）が描かれている。 図６は、様々なVAMPタンパク質およびそれらのBoNT/F、BoNT/D、BoNT/B、TeNTおよびBoNT/G切断部位のアラインメントを示す。ヒトVAMP-1 (配列番号１０；ＧenＢank受託番号g135093)；ヒトVAMP-2 (配列番号１１；ＧenＢank受託番号g135094)；マウスVAMP-2 (配列番号１２；ＧenＢank受託番号g2501081)；ウシVAMP (配列番号１３；ＧenＢank受託番号g89782)；カエルVAMP (配列番号１４；ＧenＢank受託番号g6094391)；およびキタムラサキウニVAMP (配列番号１５；ＧenＢank受託番号g5031415)が描かれている。 図７は、様々なシンタキシンタンパク質およびそれらのBoNT/C1切断部位のアラインメントを示す。ヒトシンタキシン１Ａ (配列番号１６；ＧenＢank受託番号g15079184)、ヒトシンタキシン１Ｂ２ (配列番号１７；ＧenＢank受託番号g15072437)、マウスシンタキシン１Ａ (配列番号１８；ＧenＢank受託番号g15011853)、ショウジョウバエシンタキシンＡ (配列番号１９；ＧenＢank受託番号g2501095)；C. elegansシンタキシンＡ (配列番号２０；ＧenＢank受託番号g7511662) およびキタムラサキウニシンタキシン(配列番号２１；ＧenＢank受託番号g13310402)が描かれている。
【配列表】
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Claims (82)

  1. 送達薬剤ならびに
    (a)ドナー・フルオロフォア；
    (b)該ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および、
    (c)切断部位を含むクロストリジウム毒素認識配列、
    を含み、該切断部位が該ドナー・フルオロフォアと該アクセプターの間にあり、適切な条件下、該ドナー・フルオロフォアと該アクセプターの間で共鳴エネルギー転移が示されるクロストリジウム毒素基質を含有する薬剤。
  2. 送達薬剤がクロストリジウム毒素基質に共有結合している、請求項１記載の基質。
  3. 送達薬剤がタンパク質、ペプチドまたはペプチド模倣物である、請求項２に記載の基質組成物。
  4. 送達薬剤を含むキメラタンパク質、ペプチドまたはペプチド模倣物がクロストリジウム毒素基質に動作可能に縮合している、請求項３に記載の基質組成物。
  5. 送達薬剤がアンテナペディアタンパク質またはその活性フラグメントである、請求項３に記載の基質組成物。
  6. アンテナペディアタンパク質またはその活性フラグメントがアミノ酸配列RQIKIWFQNRRMKWKK（配列番号１）を有する、請求項５に記載の基質組成物。
  7. 送達薬剤がHIV TATタンパク質またはその活性フラグメントである、請求項３に記載の基質組成物。
  8. HIV TATタンパク質またはその活性フラグメントがアミノ酸配列YGRKKRRQRRR（配列番号２）を有する、請求項７に記載の基質組成物。
  9. 送達薬剤が単純ヘルペスウィルスV22タンパク質またはその活性フラグメントである、請求項３に記載の基質組成物。
  10. 単純ヘルペスウィルスV22タンパク質が配列番号３のアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の基質組成物。
  11. 送達薬剤がクロストリジウム毒素基質と非共有結合している、請求項１に記載の基質組成物。
  12. 送達薬剤がChariotTMおよびMPGペプチドからなる群から選択される、請求項１１に記載の基質組成物。
  13. ボツリヌス毒素認識配列を含むボツリヌス毒素基質を含有する、請求項１１に記載の基質組成物。
  14. BoNT/A認識配列を含むBoNT/A基質を含有する、請求項１３に記載の基質組成物。
  15. Gln-Argを含むSNAP-25の少なくとも６つの連続残基またはそのペプチド模倣物をBoNT/A基質が含む、請求項１４記載の基質組成物。
  16. BoNT/B認識配列を有するBoNT/B基質を含有する、請求項１３に記載の基質組成物。
  17. Gln-Pheを含むVAMPの少なくとも６つの連続残基またはそのペプチド模倣物をBoNT/B基質が含む、請求項１６記載の基質組成物。
  18. BoNT/C1認識配列を有するBoNT/C1基質を含有する、請求項１３に記載の基質組成物。
  19. Lys-Alaを含むシンタキシンの少なくとも６つの連続残基またはそのペプチド模倣物をBoNT/C1基質が含む、請求項１８に記載の基質組成物。
  20. Arg-Alaを含むSNAP-25の少なくとも６つの連続残基またはそのペプチド模倣物をBoNT/C1基質が含む、請求項１８に記載の基質組成物。
  21. BoNT/D基質がBoNT/D認識配列を含む、請求項１３に記載の基質組成物。
  22. Lys-Leuを含むVAMPの少なくとも６つの連続残基またはそのペプチド模倣物をBoNT/D基質が含む、請求項２１に記載の基質組成物。
  23. BoNT/E基質がBoNT/E認識配列を含む、請求項１３に記載の基質組成物。
  24. Arg-Ileを含むSNAP-25の少なくとも６つの連続残基またはそのペプチド模倣物をBoNT/E基質が含む、請求項２３に記載の基質組成物。
  25. BoNT/F基質がBoNT/F認識配列を含む、請求項１３に記載の基質組成物。
  26. Gln-Lysを含むVAMPの少なくとも６つの連続残基またはそのペプチド模倣物をBoNT/F基質が含む、請求項２５に記載の基質組成物。
  27. BoNT/G基質がBoNT/G認識配列を含む、請求項１３に記載の基質組成物。
  28. Ala-Alaを含むVAMPの少なくとも６つの連続残基またはそのペプチド模倣物をBoNT/G基質が含む、請求項２７に記載の基質組成物。
  29. TeNT基質がTeNT認識配列を含む、請求項１に記載の基質組成物。
  30. Gln-Pheを含むVAMPの少なくとも６つの連続残基またはそのペプチド模倣物をTeNT基質が含む、請求項２９に記載の基質組成物。
  31. ドナー・フルオロフォアがフルオレセイン、Alexa Fluor（登録商標）488、DBCYLおよびBODIPYからなる群から選択される、請求項１に記載の基質組成物。
  32. アクセプターがアクセプター・フルオロフォアである、請求項１に記載の基質組成物。
  33. アセクセプター・フルオロフォアが少なくとも１マイクロ秒の蛍光寿命を有する、請求項２３に記載の基質組成物。
  34. アクセプターがテトラメチルローダミン、EDANSおよびQSY（登録商標）７からなる群から選択される、請求項１に記載の基質組成物。
  35. アクセプターが非蛍光である、請求項１に記載の基質組成物。
  36. ペプチドまたはペプチド模倣物が最大１００残基を有する、請求項４に記載の基質組成物。
  37. ペプチドまたはペプチド模倣物が最大５０残基を有する、請求項４に記載の基質組成物。
  38. (a)ドナー・フルオロフォア；
    (b)該ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および、
    (c)切断部位を含むクロストリジウム毒素認識配列、
    を含み、該切断部位が該ドナー・フルオロフォアと該アクセプターの間にあり、適切な条件下、該ドナー・フルオロフォアと該アクセプターの間で共鳴エネルギー転移が見られるクロストリジウム毒素基質を有する細胞。
  39. トランスフェクト細胞である、請求項３８に記載の細胞。
  40. 安定なトラスフェクト細胞である、請求項３８に記載の細胞。
  41. 初代培養細胞である、請求項３８に記載の細胞。
  42. 株化細胞である、請求項３８に記載の細胞。
  43. ヒト細胞である、請求項３８に記載の細胞。
  44. ニューロンである、請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の細胞。
  45. 中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンである、請求項３８に記載の細胞。
  46. 末梢ニューロンである、請求項３８に記載の細胞。
  47. 神経芽細胞腫、脊髄ニューロン、後根神経節ニューロン、大脳皮質ニューロン、小脳ニューロン、海馬ニューロンおよび運動ニューロンからなる群から選択される、請求項３９または４０に記載の細胞。
  48. 神経芽腫細胞である、請求項４５に記載の細胞。
  49. 非神経細胞である、請求項３８に記載の細胞。
  50. 膵腺房細胞である、請求項４７に記載の細胞。
  51. (a)ドナー・フルオロフォア；
    (b)該ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター；および、
    (c)切断部位を含むクロストリジウム毒素認識配列、
    を含み、該切断部位が該ドナー・フルオロフォアと該アクセプターの間にあり、適切な条件下、該ドナー・フルオロフォアと該アクセプターの間で共鳴エネルギー転移が見られるクロストリジウム毒素基質をコードする核酸分子を含む、細胞。
  52. 該核酸分子が安定にトランスフェクトされている、請求項５１に記載の細胞。
  53. ヒト細胞である、請求項５１に記載の細胞。
  54. 神経細胞である、請求項５１に記載の細胞。
  55. 非神経細胞である、請求項５１に記載の細胞。
  56. 核酸分子が構成性調節エレメントに連結されている、請求項５１記載の細胞。
  57. 核酸分子が誘導性調節エレメントに連結されている、請求項５１記載の細胞。
  58. 誘導性プロモーターがテトラサイクリン調節型調節エレメントである、請求項５７に記載の細胞。
  59. 誘導性プロモーターがエクジソン誘導性調節エレメントである、請求項５７に記載の細胞。
  60. クロストリジウム毒素基質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む、請求項５１、５２、５６または５７に記載の細胞。
  61. クロストリジウム毒素活性を測定する方法であって、
    (a)(i) ドナー・フルオロフォア;
    (ii) 該ドナー・フルオロフォアの発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有するアクセプター;および、
    (iii) 該ドナー・フルオロフォアと該アクセプターの間にある切断部位を含むクロストリジウム毒素認識配列、
    を含み、適切な条件下、該ドナー・フルオロフォアと該アクセプターの間で共鳴エネルギー転移が見られるクロストリジウム毒素基質を有する細胞を、試料と接触させること、
    (b)該ドナー・フルオロフォアを励起すること、および
    (c) 該接触させた細胞の共鳴エネルギー転移をコントロール細胞と比較して測定することを含み、
    該コントロール細胞と比較した場合の該接触細胞の共鳴エネルギー転移における差異がクロストリジウム毒素活性を示す方法。
  62. 該クロストリジウム毒素基質がボツリヌス毒素基質である、請求項６１に記載の方法。
  63. 該ボツリヌス毒素基質がBoNT/A認識配列を含むBoNT/A基質である、請求項６２に記載の方法。
  64. 該ボツリヌス毒素基質がBoNT/B認識配列を含むBoNT/B基質である、請求項６２に記載の方法。
  65. 該ボツリヌス毒素基質がBoNT/C1認識配列を含むBoNT/C1基質である、請求項６２に記載の方法。
  66. 該ボツリヌス毒素基質がBoNT/D認識配列を含むBoNT/D基質である、請求項６２に記載の方法。
  67. 該ボツリヌス毒素基質がBoNT/E認識配列を含むBoNT/E基質である、請求項６２に記載の方法。
  68. 該ボツリヌス毒素基質がBoNT/F認識配列を含むBoNT/F基質である、請求項６２に記載の方法。
  69. 該ボツリヌス毒素基質がBoNT/G認識配列を含むBoNT/G基質である、請求項６２に記載の方法。
  70. 該クロストリジウム毒素基質がTeNT認識配列を含むTeNT毒素基質である、請求項６１に記載の方法。
  71. 該試料が未精製の細胞溶解物である、請求項６１に記載の方法。
  72. 該試料が単離したクロストリジウム毒素である、請求項６１に記載の方法。
  73. 該試料が製剤化クロストリジウム毒素製品である、請求項６１に記載の方法。
  74. 該試料がＢＯＴＯＸ（登録商標）である、請求項６１に記載の方法。
  75. 該試料が食品である、請求項６１に記載の方法。
  76. 段階(c)が該接触細胞のドナー蛍光強度を検出することを含み、該コントロール細胞と比較した該接触細胞のドナー蛍光強度の増加がクロストリジウム毒素活性を示す、請求項６１に記載の方法。
  77. 段階(c)が該接触細胞のアクセプター蛍光強度を検出することを含み、該コントロール細胞と比較した該接触細胞のアクセプター蛍光強度の減少がクロストリジウム毒素活性を示す、請求項６１に記載の方法。
  78. 段階(c)が該接触細胞のアクセプター発光極大およびドナー・フルオロフォア発光極大を検出することを含み、該アクセプター発光極大付近から該ドナー・フルオロフォア発光極大付近への発光極大のシフトがクロストリジウム毒素活性を示す、請求項６１記載の方法。
  79. 段階(c)がアクセプター発光極大付近の蛍光振幅のドナー・フルオロフォア発光極大付近の蛍光振幅に対する比を検出することを含み、コントロール細胞と比較した該接触細胞の比の減少がクロストリジウム毒素活性を示す、請求項６１に記載の方法。
  80. 段階(c)が該接触細胞におけるドナー・フルオロフォアの励起状態寿命を検出することを含み、コントロール細胞と比較した該接触細胞のドナー・フルオロフォア励起状態寿命の増加がクロストリジウム毒素活性を示す、請求項６１に記載の方法。
  81. 段階(c)を時間間隔の後に１回以上反復することをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
  82. 該クロストリジウム毒素活性に適した条件を選択して、アッセイが線形であるようにする、請求項６１に記載の方法。
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