CN1296712C - 基于细胞的荧光共振能量传递(fret)检测梭菌毒素 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种测定梭菌毒素活性的方法，所述方法包括(a)将含有梭菌毒素底物的细胞与样品接触，所述梭菌毒素底物包括一种供体荧光团；一种吸收光谱与供体荧光团的发射光谱有重叠的受体；一种含有切割位点的梭菌毒素识别序列，其中所述切割位点介于供体荧光团和受体之间，并且其中共振能量传递在适当条件下表现于供体荧光团和受体之间；(b)激活供体荧光团；并(c)测定接触过的细胞相对于对照细胞的共振能量传递，其中与对照细胞相比，接触过的细胞共振能量传递的变化表示梭菌毒素的活性。

Description

基于细胞的荧光共振能量传递(FRET)检测梭菌毒素
                        发明背景
                        发明领域
本发明总体涉及荧光共振能量传递和蛋白酶检测，具体而言，涉及一种用于检测梭菌毒素活性的基于细胞的方法。
                        背景技术
破伤风神经性麻痹综合征和一种罕见但可能致命的疾病，肉毒中毒是由梭状芽胞杆菌属细菌产生的神经毒素引起的。上述梭菌神经毒素是神经细胞的高效特异性毒剂，肉毒梭菌毒素对人类的致命剂量仅为毫微克级。因此，即使仅有微量水平的肉毒梭菌毒素存在于食品中，也是对公共卫生的危害，必须通过严格的测试避免。
然而，尽管肉毒梭菌毒素可能存在有害作用，其经控制的剂量已成功用作治疗剂并用于某些化妆品中。特别地，肉毒梭菌毒素已用于多种局部和段肌张力异常、斜视和其它需要可逆地降低胆碱能神经末梢活性的症状的治疗中。肉毒梭菌神经毒素已确定的在人类中的治疗用途包括，但不限于眼睑痉挛、偏侧面肌痉挛、喉发声困难(laringealdysphonia)、局部多汗、唾液分泌过多、口-颌肌张力异常、颈肌张力异常、斜颈、斜视、四肢肌张力异常、职业性痉挛和肌纤维颤搐(Rossetto等，Toxincon 39：27～41(2001))。作为一个实例，用少量肉毒梭菌神经毒素A肌肉注射痉挛组织已有效用于治疗由脑损伤、脊髓损伤、中风、多发性硬化和大脑性瘫痪引起的痉挛。目前正在研究梭菌神经毒素的其它可能的临床应用。
鉴于食品中少量肉毒梭菌毒素可能伴随的危害以及对制备精确的药用制剂的需求，目前在食品和药品工业中要进行肉毒梭菌神经毒素的检测。食品工业需要检测肉毒梭菌神经毒素以验证新的食品包装法并确保食物的安全性。肉毒梭菌毒素日益增长的临床应用需要为产品制剂精确检测肉毒梭菌神经毒素的活性并进行质量控制。在上述两工业中，仅有小鼠致死(mouse lethality)试验是目前公认的检测肉毒梭菌神经毒素活性的方法。
遗憾的是，小鼠致死试验具有以下几个缺陷：由于需要大量实验室动物而导致的高成本；特异性的缺乏；除非使用大的动物群否则有可能不准确；以及动物生命的必要牺牲。因此，需要一种能补充小鼠致死试验并减少对其需求的新方法。除了测量毒素的蛋白酶解活性，该替代方法还需要细胞吸收毒素并将毒素轻链释放到细胞溶质中。本发明通过提供新的基于细胞的检测梭菌毒素活性的方法满足了上述需求，并具有相应的优势。
                        发明内容
本发明提供一种底物组合物，该底物组合物包括释放剂和含有供体荧光团的梭菌毒素底物；一种受体，该受体的吸收光谱与供体荧光团的发射光谱有重叠；一种梭菌毒素识别序列，该梭菌毒素识别序列包括介于供体荧光团和受体之间的切割位点，其中共振能量传递在适当条件下表现于供体荧光团和受体之间。在本发明的底物组合物中，释放剂可与，例如梭菌毒素底物共价键合，并且还可为，例如，蛋白质、肽或肽模拟物(peptidomimetic)。在一例实施方案中，底物组合物是嵌合蛋白、肽或肽模拟物，其中释放剂与梭菌毒素底物有效融合。上述嵌合底物组合物可为，例如长度不超过50或100残基的肽或肽模拟物。
多种释放剂可在本发明的底物组合物中与梭菌毒素底物共价键合，包括但不限于，触角足蛋白或其活性片断，例如氨基酸序列为RQIKIWFQNRRMKWKK(序列号：1)的活性片断；HIV TAT蛋白或其活性片断，例如氨基酸序列为YGRKKRRQRRR(序列号：2)的活性片断；以及单纯疱疹病毒VP22蛋白或其活性片断，例如氨基酸序列号为3的单纯疱疹病毒VP22蛋白或其活性片断。
本发明还提供释放剂与梭菌毒素底物非共价键合的底物组合物。可与梭菌毒素底物非共价键合的示例性释放剂包括，但不限于ChariotTM和MPG肽。
多种梭菌毒素底物可用于本发明的底物组合物中。所述梭菌毒素底物可为，例如含有肉毒梭菌毒素识别序列的肉毒梭菌毒素底物或含有破伤风毒素识别序列的破伤风毒素底物。在一例实施方案中，本发明提供的底物组合物含有部分包括BoNT/A识别序列的BoNT/A底物。所述BoNT/A底物可包括，例如，至少六个相连的SNAP-25残基、六个相连的含有Gln-Arg的残基、或其肽模拟物。在另一例实施方案中，本发明提供的底物组合物含有包括BoNT/B识别序列的BoNT/B底物。用于本发明底物组合物的BoNT/B底物包括，但不限于那些具有至少六个相连的VAMP残基、六个相连的含有Gln-Phe的残基、或其肽模拟物的底物。在另一例实施方案中，本发明提供的BoNT/C1底物含有BoNT/C1识别序列；用于本发明的BoNT/C1底物包括那些具有至少六个相连的突触融合蛋白残基、六个相连的含有Lys-Ala的残基、或其肽模拟物的底物，以及那些包括至少六个相连的SNAP-25残基、六个相连的含有Arg-Ala的残基、或其肽模拟物的底物。在另一例实施方案中，本发明提供的BoNT/D底物含有BoNT/D识别序列。多种BoNT/D底物可用于本发明的底物组合物中，包括但不限于，含有至少六个相连的VAMP残基、六个相连的含有Lys-Leu的残基或其肽模拟物的BoNT/D底物。
在另一例实施方案中，本发明提供的底物组合物部分含有包括BoNT/E识别序列的BoNT/E底物。所述BoNT/E底物可具有，例如，至少六个相连的SNAP-25残基、六个相连的含有Arg-Ile的残基、或其肽模拟物。在另一例实施方案中，提供的底物组合物含有包括BoNT/F识别序列的BoNT/F底物。用于本发明组合物的BoNT/F底物可具有，例如至少六个相连的VAMP残基、六个相连的含有Gln-Lys的残基、或其肽模拟物。在另一例实施方案中，本发明提供的底物组合物部分含有包括BoNT/G识别序列的BoNT/G底物。可用的BoNT/G底物包括，但不限于那些具有至少六个相连的VAMP残基、六个相连的含有Ala-Ala的残基、或其肽模拟物。在另一例实施方案中，本发明提供的底物组合物部分含有包括TeNT识别序列的TeNT底物。多种TeNT底物可用于本发明，包括那些具有至少六个相连的VAMP残基、六个相连的含有Gln-Phe的残基、或其肽模拟物。
多种供体荧光团和受体可用于本发明的底物组合物中。作为非限制性的实例，可用于本发明的供体荧光团包括Alexa Fluor488、DABCYL和BODIPY。可用于本发明的受体包括非荧光受体及受体荧光团；在一例实施方案中，受体是荧光寿命为至少1微秒的受体荧光团。在另一例实施方案中，本发明提供的底物组合物中受体是EDANS、QSY7、或四甲基若丹明。
本发明还提供细胞，该细胞含有梭菌毒素底物，所述梭菌毒素底物包括一种供体荧光团；一种受体，该受体的吸收光谱与供体荧光团的发射光谱有重叠；一种梭菌毒素识别序列，该梭菌毒素识别序列包括介于供体荧光团和受体之间的切割位点，其中共振能量传递在适当条件下表现于供体荧光团和受体之间。在一例实施方案中，细胞是转染细胞。在另一例实施方案中，细胞是稳定转染细胞。多种细胞可用于本发明中，包括但不限于原代细胞；传代细胞；人类细胞；神经元细胞，例如原代神经元、传代神经元和人类神经元；以及诸如胰腺腺泡细胞的非神经元细胞。可用于本发明的神经元包括中枢神经系统(CNS)神经元和外周神经元；作为非限制性实例，用于本发明的神经元可为神经母细胞瘤、脊髓神经元、背根神经节神经元、大脑皮层神经元、小脑神经元、海马神经元或运动神经元。
本发明还提供细胞，该细胞包括编码梭菌毒素底物的核酸分子，所述梭菌毒素底物含有一种供体荧光团；一种受体，该受体的吸收光谱与供体荧光团的发射光谱有重叠；一种梭菌毒素识别序列，该梭菌毒素识别序列包括介于供体荧光团和受体之间的切割位点，其中共振能量传递在适当条件下表现于供体荧光团和受体之间。可使用多种细胞，包括但不限于人类细胞、神经元细胞和非神经元细胞。所述细胞可通过，例如稳定转染的编码梭菌毒素底物的核酸分子制备。编码梭菌毒素底物的核酸分子可与，例如，诸如组成型调节元件或诱导型调节元件等调节元件连接。多种诱导型调节元件可用于本发明，包括但不限于，四环素调节元件和蜕皮素诱导调节元件。可用于本发明的基因编码的供体荧光团和受体包括绿色荧光蛋白(GFP)和那些将在下面公开并在本领域已知的。
本发明还提供一种测定梭菌毒素活性的方法，该方法包括(a)将样品与细胞接触，所述细胞包括一种含有供体荧光团的梭菌毒素底物；一种受体，该受体的吸收光谱与供体荧光团的发射光谱有重叠；一种梭菌毒素识别序列，该梭菌毒素识别序列包括介于供体荧光团和受体之间的切割位点，其中共振能量传递在适当条件下表现于供体荧光团和受体之间；(b)激发供体荧光团；(c)测定接触过的细胞相对于对照细胞的共振能量传递，其中接触过的细胞与对照细胞相比，其共振能量传递的差异即表示梭菌毒素活性。
用于本发明方法的梭菌毒素底物可为任何血清型的肉毒梭菌毒素底物或破伤风毒素底物。因此，本发明方法的实施可通过采用，例如含有BoNT/A识别序列的BoNT/A底物；含有BoNT/B识别序列的BoNT/B底物；含有BoNT/C1识别序列的BoNT/C1底物；含有BoNT/D识别序列的BoNT/D底物；含有BoNT/E识别序列的BoNT/E底物；含有BoNT/F识别序列的BoNT/F底物；含有BoNT/G识别序列的BoNT/G底物；或含有TeNT识别序列的TeNT毒素底物。
根据本发明方法可检测多种样品的梭菌毒素活性。所述样品包括但不限于，粗的细胞溶胞产物；分离出的梭菌毒素；诸如BOTOX的合成(formulated)梭菌毒素产品；以及食品。
在本发明方法中可使用多种途径测定共振能量传递。在一例实施方案中，本发明方法包括检测接触过的细胞的供体荧光强度，其中与对照细胞相比接触过的细胞供体荧光强度的增大表示梭菌毒素活性。在另一例实施方案中，本发明方法包括检测接触过的细胞的受体荧光强度，其中与对照细胞相比，受体荧光强度的降低表示梭菌毒素活性。在另一例实施方案中，本发明方法包括检测接触过的细胞的受体发射最大波长(emission maximum)和供体荧光团发射最大波长，其中从受体发射最大波长附近到供体荧光团发射最大波长附近的位移(shift)表示梭菌毒素活性。在另一例实施方案中，本发明方法包括检测接触过的细胞的受体发射最大波长附近的荧光振幅与供体荧光团发射最大波长附近的荧光振幅的比值，其中与对照细胞相比，接触过的细胞比值的降低表示梭菌毒素活性。在另一例实施方案中，本发明方法包括检测接触过的细胞中供体荧光团的激发态寿命，其中与对照细胞相比，接触过的细胞中供体荧光团激发态寿命的增大表示梭菌毒素活性。如果需要，测定共振能量传递的步骤可在以后的一个或多个时间间隔内重复。此外，如果需要，可选择适用于检测梭菌毒素活性的条件，以使检测成线性。
                       附图说明
图1为表示梭菌神经毒素激活的推导结构和假设机理的示意图。生成的毒素可为150kDa的失活单一多肽链，由三个通过环相连的50kDa的结构域组成。选择性溶蛋白性裂解通过产生两条二硫键合的链激活毒素，所述两条链分别为50kDa的L链和由两个结构域HN和HC组成的100kDa的H链。三个结构域的作用如下：重链C端的结构域(HC)起细胞结合的作用，而重链N端的结构域(HN)使得物质可从内体转运到细胞质。细胞内的二硫键经还原后，L链的锌内肽酶活性即释放出来。
图2表示中枢神经元和外周神经元中破伤风和肉毒梭菌毒素活性所需的四个步骤的示意图。
图3表示SNAP-25、VAMP和突触融合蛋白在质膜上的亚细胞定位和切割位点。VAMP与突触小泡膜相连，而SNAP-25和突触融合蛋白与靶质膜相连。BoNT/A和/E在靠近羧基端切割SNAP-25，并分别释放9个或26个残基。BoNT/B、/D、/F、/G和TeNT作用于VAMP的保守中心部分(由点表示的部分)并将VAMP的氨基端部分释放到胞质溶胶中。BoNT/C1在靠近羧基端切割SNAP-25并在胞质膜表面附近的单位点切割突触融合蛋白。BoNT/B、/C1、/D、/F、/G和TeNT的作用导致VAMP或突触融合蛋白的大部分胞质结构域被释放，而仅有小部分SNAP-25通过BoNT/A、/C1或/E的选择性蛋白酶解释放。
图4表示VAMP、SNAP-25和突触融合蛋白的神经毒素识别基序。(A)阴影框表示三种靶梭菌神经毒素中常见基序的存在和位置。(B)识别基序由疏水残基(“h”)、带负电的Asp或Glu残基(“-”)和极性残基(“p”)以及代表任何氨基酸的“x”组成。基序包括在VAMP、SNAP-25和突触融合蛋白中预计将采用α螺旋构象的区内。(C)表示α螺旋构象中基序的俯视图。带负电的残基排列在一个表面，而疏水残基排列在第二表面。
图5表示多种SNAP-25蛋白及其BoNT/E、BoNT/A和BoNT/C1切割位点的排列。描述的有人类SNAP-25(序列号：4；GenBank登记号g4507099；以及相关人类SNAP-25序列g2135800)；小鼠SNAP-25(序列号：5；GenBank登记号G6755588)；果蝇SNAP-25(序列号：6；GenBank登记号g548941)；金鱼SNAP-25(序列号：7；GenBank登记号g2133923)；海胆SNAP-25(序列号：8；GenBank登记号g2707818)和小鸡SNAP-25(序列号：9；GenBank登记号g481202)。
图6表示多种VAMP蛋白及其BoNT/F、BoNT/D、BoNT/B、TeNT和BoNT/G切割位点的排列。描述的有人类VAMP-1(序列号：10；GenBank登记号g135093)；人类VAMP-2(序列号：11；GenBank登记号g135094)；小鼠VAMP-2(序列号：12；GenBank登记号g2501081)；牛VAMP(序列号：13；GenBank登记号g89782)；青蛙VAMP(序列号：14；GenBank登记号g6094391)和海胆VAMP(序列号：15；GenBank登记号g5031415)。
图7表示多种突触融合蛋白及其BoNT/C1切割位点的排列。描述的有人类突触融合蛋白1A(序列号：16；GenBank登记号g15079184)、人类突触融合蛋白1B2(序列号：17；GenBank登记号g15072437)、小鼠突触融合蛋白1A(序列号：18；GenBank登记号g15011853)、果蝇突触融合蛋白1A(序列号：19；GenBank登记号g2501095)；秀丽新小杆线虫突触融合蛋白A(序列号：20；GenBank登记号g7511662)和海胆突触融合蛋白(序列号：21；GenBank登记号g13310402)。
                      具体实施方式
本发明提供体内和体外的基于细胞的检测，包括测定样品中是否存在活性梭菌毒素或测定包括所有血清型肉毒梭菌毒素和破伤风毒素在内的任何梭菌毒素的活性。本发明新的底物组合物、细胞和检测方法降低了对动物毒性研究的需求，并可用于分析多重毒素功能，即毒素的结合与细胞吸收，转运到细胞胞质溶胶以及蛋白酶活性。所述新的组合物和方法可用于分析粗样品和大块样品以及高纯度的双链毒素产品或合成毒素产品，并可按照自动高产出检测的模式。
如下所讨论的，荧光共振能量传递(FRET)是两个分子的电子激发态之间根据距离确定的相互作用，其中激发在不发射光子的情况下从供体荧光团传递到受体。能量传递的过程导致荧光强度和供体荧光团激发态寿命的下降(淬灭)，并且当受体是荧光团时，可使受体发射光谱强度提高。当本发明的细胞与含有活性毒素的样品接触后，将切割细胞中的梭菌毒素底物，导致共振能量传递降低，从而使其通过如下变化被探测到，例如供体荧光发射的增强、受体荧光发射的降低或从受体发射最大波长附近到供体发射最大波长附近的发射光谱的位移。如果需要，样品中活性梭菌毒素的量可采用适当的标准作为FRET程度变化的函数计算。
本发明涉及的破伤风和肉毒梭菌神经毒素由梭菌产生。所述毒素导致破伤风和肉毒梭菌神经性麻痹综合征，其中破伤风毒素主要作用于中枢神经系统，而肉毒梭菌毒素主要作用于外周神经系统。各种梭菌神经毒素使细胞中毒的机理相似，即阻断神经递质的释放。在上述由两条二硫键合的多肽链组成的毒素中，较大的亚基负责神经特异性结合并将较小的亚基转运到细胞质中。在神经元中转运并还原后，较小的链即表现出对神经胞吐作用所涉及的蛋白质组分特异性的肽酶活性。梭菌毒素的“SNARE”蛋白质靶(protein target)常见于多种非神经型细胞的胞吐作用中；在上述细胞中，与神经元相同，轻链肽酶活性将阻止胞吐作用。
破伤风神经毒素和肉毒梭菌神经毒素B、D、F和G特异地识别VAMP(又称为小突触泡蛋白)，它是一种突触小泡膜的内在蛋白质。根据不同的神经毒素，VAMP将在不同的键上被切割。肉毒梭菌A和E神经毒素在蛋白质羧基端部分中的两个不同位点特异地识别并切割SNAP-25，一种突触前膜的蛋白质。肉毒梭菌神经毒素C除了切割SNAP-25外，还切割突触融合蛋白，一种神经质膜的蛋白质。虽然切割位点和毒素易感性不一定是保守的，但梭菌神经毒素的三种蛋白质靶对于酵母到人都是保守的(如下；也可参考Humeau等，Biochimie 82：427～446(2000)；Niemann等，Trends in Cell Biol.4：179～185(1994)；以及Pellizzari等，Phil.Trans.R.Soc.London 354：259～268(1999))。
天然出现的破伤风和肉毒神经毒素是以150kDa无前导序列的失活多肽链产生的。上述毒素可在暴露的蛋白酶敏感环上被细菌或组织蛋白酶切割，产生活性双链毒素。天然出现的梭菌毒素含有单个链间二硫键桥接的重链(H，100kDa)和轻链(L，50kDa)；上述桥接对细胞外所施加毒素的神经毒性很重要(Montecucco和Schiavo，QuarterlyRev.Biophysics 28：423～472(1995))。
梭菌毒素显现为折叠成三个不同的50kDa的结构域，如图1所示，各个结构域具有不同的功能作用。如图2所示的，梭菌毒素的细胞中毒机理由四个不同的步骤组成：(1)结合作用；(2)细胞内摄作用；(3)膜转运作用；以及(4)酶的靶修饰作用。重链羧基端部分(HC)的作用在于神经特异性结合，而H链氨基端部分(HN)的作用在于膜转运。L链负责细胞内的催化活性(Montecucco和Schiavo，supra，1995)。
八种人类梭菌神经毒素的氨基酸序列已从相应的基因中推导出来(Neimann，“Molecular Biology of Clostridial Neurotoxins”，Sourcebook of Bacterial Protein Toxin，Alouf和Freer(Eds.)303～348页，伦敦：Academic Press 1991)。L链和H链分别由大约439和843个残基组成。同源段由基本不同或完全不同的区隔开。L链最保守的区是氨基端部分(100个残基)和中心区(对应于TeNT的216～244残基)以及形成链间二硫键的两个半胱氨酸。216～244区含有锌内肽酶特有的His-Glu-X-X-His键合基序。
梭菌毒素的重链不如轻链保守，并且HC的羧基端部分(对应于TeNT的1140～1315残基)最易变化。这符合HC结构域参与对神经末梢的结合并且不同的神经毒素与不同受体相结合的事实。
比较梭菌毒素的核苷酸序列和氨基酸序列表明它们是从共同的始祖基因衍生出来的。所述基因的播散可能由于梭菌毒素基因位于易变的遗传元件上而更加容易。如下的进一步讨论，本领域已知七种肉毒梭菌毒素的序列变体。例如，参考图5～7以及Humeau等，supra，2000。
如上所述，梭菌神经毒素的天然靶包括VAMP、SNAP-25和突触融合蛋白。VAMP与突触小泡膜相连，而SNAP-25和突触融合蛋白与靶膜相连(如图3所示)。BoNT/A和BoNT/E在羧基端区切割SNAP-25，并分别释放9个或26个氨基酸残基，而BoNT/C1也在羧基端附近切割SNAP-25。肉毒梭菌血清型BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F、BoNT/G和破伤风毒素作用于VAMP的保守中心部分，并将VAMP的氨基端部分释放到胞质溶胶中。BoNT/C1在胞质膜表面附近的单位点切割突触融合蛋白。因此，BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/F、BoNT/G或TeNT的蛋白酶解导致VAMP或突触融合蛋白的大部分胞质结构域被释放，而仅有小部分SNAP-25通过BoNT/A、BoNT/C1或BoNT/E的切割被释放(Montecucco和Schiavo，supra，1995)。
天然出现的SNAP-25是一种缺乏跨膜段的约206个残基的蛋白质，它与神经质膜的胞质表面相连(图3；还可参考Hodel等，Int.J.Biochemstry and Cell Biology 30：1069～1073(1998))。除了从果蝇到哺乳动物的高度保守同系物之外，SNAP-25相关蛋白质已从酵母中克隆。在发育过程中，轴突生长需要有SNAP-25，此外，在成熟的神经系统中神经末端的塑性也可能需要SNAP-25。在人类中，两个同工型在发育中的表达是有差异的；同工型a在胎儿发育期是组成型表达的，而同工型b在出生时出现，并在成年期占主导地位。诸如SNAP-23等SNAP-25的类似物也在神经系统外表达，例如，胰腺细胞中。
天然出现的VAMP是一种约120个残基的蛋白质，其精确的长度依物种和同种型而定。如图3所示，VAMP含有在小泡腔内短的羧基端段，而分子的大部分暴露在胞质溶胶中。富有脯氨酸的氨基端的前三十个残基在物种和同工型中是不同的，而VAMP的中心部分(残基30～96)，富有电荷和亲水残基并包括已知的切割位点，是非常保守的。VAMP与突触小泡蛋白在突触小泡膜上共定位。
本领域已知有多种VAMP的物种同系物，包括人类、大鼠、牛、电鳐、果蝇、酵母、乌贼和海兔的同系物。此外，VAMP的多种同工型已证实包括VAMP-1、VAMP-2和小细胞泡蛋白，并且不灵敏的形式已在非神经细胞中得到证实。虽然VAMP-1和VAMP-2的分布在不同细胞类型中是不同的，但VAMP似乎存在于所有的脊椎动物组织中。鸡和大鼠VAMP-1不能用TeNT或BoNT/B切割。上述VAMP-1的同系物用缬氨酸代替存在于TeNT或BoNT/B切割位点处的人类或小鼠VAMP-1中的谷氨酰胺。上述取代并不影响以相似速度切割VAMP-1和VAMP-2的BoNT/D、/F或/G。
突触融合蛋白位于神经质膜的胞质表面并通过羧基端段锚定于膜上，其大部分蛋白质暴露于胞质溶胶中。突触融合蛋白在发生神经递质释放的突触前膜的活化区与钙通道共定位。此外，突触融合蛋白与SSV膜的一种蛋白，即突触结合蛋白相互作用，在质膜和小泡之间形成功能性桥接。多种突触融合蛋白的同工型已得到证实。两种长度(285和288)略有不同的同工型(同工型1A和1B)已在神经细胞中得到证实，其同工型2、3、4和5表达于其它组织中。不同的同工型对BoNT/C1的灵敏度也不同，其1A、1B、2和3突触融合蛋白的同工型被上述毒素分割。
本发明提供一种底物组合物，该底物组合物包括释放剂和含有供体荧光团的梭菌毒素底物；一种受体，该受体的吸收光谱与供体荧光团的发射光谱有重叠；一种梭菌毒素识别序列，该梭菌毒素识别序列包括介于供体荧光团和受体之间的切割位点，其中共振能量传递在适当条件下表现于供体荧光团和受体之间。在本发明的底物组合物中，释放剂可与，例如梭菌毒素底物共价键合，并且还可为，例如，蛋白质、肽或肽模拟物(peptidomimetic)。在一例实施方案中，底物组合物是嵌合蛋白、肽或肽模拟物，其中释放剂与梭菌毒素底物有效熔合。上述嵌合底物组合物可为，例如长度不超过50或100残基的肽或肽模拟物。
多种释放剂可在本发明的底物组合物中与梭菌毒素底物共价键合，包括但不限于，触角足蛋白或其活性片断，例如氨基酸序列为RQIKIWFQNRRMKWKK(序列号：1)的活性片断；HIV TAT蛋白或其活性片断，例如氨基酸序列为YGRKKRRQRRR(序列号：2)的活性片断；或单纯疱疹病毒VP22蛋白或其活性片断，例如氨基酸序列号为3的单纯疱疹病毒VP22蛋白或其活性片断。
本发明还提供释放剂与梭菌毒素底物非共价键合的底物组合物。可与梭菌毒素底物非共价键合的示例性释放剂包括，但不限于ChariotTM和MPG肽。
多种供体荧光团和受体可用于本发明的底物组合物中。作为非限制性的实例，可用于本发明的供体荧光团包括Alexa Fluor488、DABCYL和BODIPY。可用于本发明的受体包括非荧光受体及受体荧光团；在一例实施方案中，受体是荧光寿命为至少1微秒的受体荧光团。在另一例实施方案中，本发明提供的底物组合物中受体是四甲基若丹明、EDANS、或QSY7。可用于本发明底物组合物中的示例性的供体荧光团-受体对包括但不限于，荧光素-四甲基若丹明、Alexa Fluor488-四甲基若丹明、DABCYL-EDANS、荧光素-QSY7和AlexaFluor488-QSY7。
多种梭菌毒素底物可用于本发明的底物组合物中。所述梭菌毒素底物包括含有肉毒梭菌毒素识别序列的肉毒梭菌毒素底物和含有破伤风毒素识别序列的破伤风毒素底物。因此，在一例实施方案中，本发明提供的BoNT/A底物组合物含有释放剂和BoNT/A底物，其中底物包括一种供体荧光团；一种受体，该受体的吸收光谱与供体荧光团的发射光谱有重叠；一种BoNT/A的识别序列，该识别序列包括介于供体荧光团和受体之间的切割位点，其中共振能量传递在适当条件下表现于供体荧光团和受体之间。所述BoNT/A底物可包括，例如，至少六个相连的SNAP-25残基、六个相连的含有Gln-Arg的残基、或其肽模拟物。本发明的一种BoNT/A底物组合物可为，例如，具有最多20、30、40、50或100个残基的肽或肽模拟物，并且可包括任何供体荧光团-受体组合，例如但不限于荧光素-四甲基若丹明、DABCYL-EDANS和AlexaFluor488-QSY7。
本发明还提供含有释放剂和BoNT/B底物的BoNT/B底物组合物，其中底物包括一种供体荧光团；一种受体，该受体的吸收光谱与供体荧光团的发射光谱有重叠；一种BoNT/B的识别序列，该识别序列包括介于供体荧光团和受体之间的切割位点，其中共振能量传递在适当条件下表现于供体荧光团和受体之间。可用于本发明的BoNT/B底物可包括，例如，至少六个相连的VAMP残基、六个相连的含有Gln-Phe的残基、或其肽模拟物。本发明的一种BoNT/B底物组合物可为，例如，具有最多20、30、40、50或100个残基的肽或肽模拟物。应理解多种供体荧光团-受体组合可用于本发明的BoNT/B底物组合物中；所述供体荧光团-受体对包括但不限于荧光素-四甲基若丹明、DABCYL-EDANS和Alexa Fluor488-QSY7。
这里还提供含有释放剂和BoNT/C1底物的BoNT/C1底物组合物，其中底物包括一种供体荧光团；一种受体，该受体的吸收光谱与供体荧光团的发射光谱有重叠；一种BoNT/C1的识别序列，该识别序列包括介于供体荧光团和受体之间的切割位点，其中共振能量传递在适当条件下表现于供体荧光团和受体之间。可用于本发明底物组合物中的BoNT/C1底物包括那些具有至少六个相连的突触融合蛋白残基、六个相连的含有Lys-Ala的残基、或其肽模拟物的底物，以及那些包括至少六个相连的SNAP-25残基、六个相连的含有Arg-Ala的残基、或其肽模拟物的底物。本发明的一种BoNT/C1底物组合物可为，例如，具有多种长度的肽或肽模拟物，其长度可为，例如不超过20、30、40、50或100个残基。多种供体荧光团-受体组合可用于本发明的BoNT/C1底物组合物中，包括但不限于荧光素-四甲基若丹明、DABCYL-EDANS和Alexa Fluor488-QSY7。
本发明还提供含有释放剂和BoNT/D底物的BoNT/D底物组合物，其中底物包括一种供体荧光团；一种受体，该受体的吸收光谱与供体荧光团的发射光谱有重叠；一种BoNT/D的识别序列，该识别序列包括介于供体荧光团和受体之间的切割位点，其中共振能量传递在适当条件下表现于供体荧光团和受体之间。多种BoNT/D底物可用于本发明的底物组合物中，包括但不限于如下BoNT/D底物：含有至少六个相连的VAMP残基、六个相连的含有Lys-Leu的残基、或其肽模拟物。如上讨论的其它底物组合物，BoNT/D底物组合物可为，例如，具有最多20、30、40、50或100个残基的肽或肽模拟物并且可包括多种供体荧光团-受体组合，例如荧光素-四甲基若丹明、DABCYL-EDANS或AlexaFluor488-QSY7。
本发明还提供含有释放剂和BoNT/E底物的BoNT/E底物组合物，其中底物包括一种供体荧光团；一种受体，该受体的吸收光谱与供体荧光团的发射光谱有重叠；一种BoNT/E的识别序列，该识别序列包括介于供体荧光团和受体之间的切割位点，其中共振能量传递在适当条件下表现于供体荧光团和受体之间。可用于本发明的BoNT/E底物可具有，例如，至少六个相连的SNAP-25残基、六个相连的含有Arg-Ile的残基、或其肽模拟物。本发明的一种BoNT/E底物组合物可为，例如，具有最多20、30、40、50或100个残基的肽或肽模拟物。所述底物组合物还可包括，例如供体荧光团-受体组合，如荧光素-四甲基若丹明、DABCYL-EDANS和Alexa Fluor488-QSY7。
本发明还提供含有释放剂和BoNT/F底物的BoNT/F底物组合物，其中底物包括一种供体荧光团；一种受体，该受体的吸收光谱与供体荧光团的发射光谱有重叠；一种BoNT/F的识别序列，该识别序列包括介于供体荧光团和受体之间的切割位点，其中共振能量传递在适当条件下表现于供体荧光团和受体之间。可用于本发明底物组合物中的BoNT/F底物可具有，例如，至少六个相连的VAMP残基、六个相连的含有Gln-Lys的残基、或其肽模拟物。此外，本发明的一种BoNT/F底物组合物可为，例如，具有最多20、30、40、50或100个残基的肽或肽模拟物。本领域的技术人员应理解多种供体荧光团-受体组合可用于BoNT/F底物组合物中；非限制性的实例包括荧光素-四甲基若丹明、DABCYL-EDANS和Alexa Fluor488-QSY7。
本发明还提供含有释放剂和BoNT/G底物的BoNT/G底物组合物，其中底物包括一种供体荧光团；一种受体，该受体的吸收光谱与供体荧光团的发射光谱有重叠；一种BoNT/G的识别序列，该识别序列包括介于供体荧光团和受体之间的切割位点，其中共振能量传递在适当条件下表现于供体荧光团和受体之间。可用的BoNT/G底物包括，但不限于那些具有至少六个相连的VAMP残基、六个相连的含有Ala-Ala的残基、或其肽模拟物的底物。本发明的一种BoNT/G底物组合物可为，例如，具有最多20、30、40、50或100个残基的肽或肽模拟物并且可包括，例如，供体荧光团-受体组合，如荧光素-四甲基若丹明、DABCYL-EDANS和Alexa Fluor488-QSY7。
本发明还提供含有释放剂和TeNT底物的TeNT底物组合物，其中底物包括一种供体荧光团；一种受体，该受体的吸收光谱与供体荧光团的发射光谱有重叠；一种TeNT的识别序列，该识别序列包括介于供体荧光团和受体之间的切割位点，其中共振能量传递在适当条件下表现于供体荧光团和受体之间。多种TeNT底物可用于本发明的底物中，包括那些具有至少六个相连的VAMP残基、六个相连的含有Gln-Phe的残基、或其肽模拟物的底物。本发明的一种TeNT底物组合物可为，例如，具有最多20、30、40、50或100个残基的肽或肽模拟物。此外，多种供体荧光团-受体组合可用于本发明的TeNT底物组合物中；所述组合包括但不限于荧光素-四甲基若丹明、DABCYL-EDANS和AlexaFluor488-QSY7。
在本发明的底物组合物中，释放剂有助于将梭菌毒素底物吸收到细胞中，所述细胞包括，例如神经元或诸如胰腺腺泡细胞等腺细胞。释放剂可与梭菌毒素底物共价键合或与梭菌毒素底物通过非共价键结合。作为非限制性实例，可用于本发明底物组合物的释放剂包括触角足蛋白、HIV TAT蛋白、单纯疱疹病毒VP22蛋白、及其活性片断以及诸如ChariotTM和其它MPG肽等释放剂，上述各种释放剂将在下面进一步讨论。
这是所用的术语“释放剂”指任何可使相连或键合的梭菌毒素底物内摄到细胞中或增强所述细胞内摄作用的分子。本领域已知有释放剂并且所述释放剂包括但不限于蛋白转导肽和肽模拟物以及细胞渗透性肽和肽模拟物。术语释放剂包括，但不限于蛋白质、肽、肽模拟物、小分子、核酸分子、脂质体、脂质、病毒、逆转录酶病毒和细胞。应理解含有可用于本发明的释放剂的底物组合物经细胞内摄作用后通常并不残留在细胞内的小泡中，而是最终释放到，例如，细胞质中。因此，术语释放剂包括，但不限于将相连或键合的底物转运到细胞质或细胞核中的分子。应进一步理解术语“释放剂”涵盖通过任何机理纳入的分子，包括通过受体介导的胞吞作用起作用的释放剂和那些不需要受体介导的胞吞作用的释放剂。
多种释放剂可在本发明的组合物中与梭菌毒素底物共价键合，包括但不限于，蛋白转导肽、细胞渗透性肽、磷酸肽、含有D-氨基酸的肽和其它变性或折叠的、经修饰的或未经修饰的，以及天然出现的或合成的蛋白质、肽和肽模拟物。所述释放剂包括，但不限于，核蛋白质和分泌性蛋白质及其活性片断和类似物。在具体的实施方案中，可用于本发明的释放剂是长度小于50个残基、长度小于40个残基、长度小于30个残基、长度小于20个残基或长度小于15个残基的肽或肽模拟物。在另一例实施方案中，可用于本发明的释放剂是疏水性占优的肽或肽模拟物。在另一例实施方案中，可用于本发明的释放剂是碱性占优的肽或肽模拟物。在另一实施方案中，可用于本发明的释放剂是α螺旋状的肽或肽模拟物，例如两亲α螺旋肽或肽模拟物。在另一例实施方案中，可用于本发明的释放剂是两亲肽或肽模拟物，例如碱性两亲肽或肽模拟物。而在另一例实施方案中，可用于本发明的释放剂是与变性或折叠的梭菌毒素底物键合的变性肽或肽模拟物；变性显示出有助于细胞内摄作用，例如，如WO 99/55899所述的。
作为非限制性实例，当与梭菌毒素底物共价键合时，适用于本发明的释放剂包括睫状神经营养因子(CNTF)或其活性片断；窖蛋白或其活性片断；白细胞介素-1β(IL-1β)或其活性片断；硫氧还蛋白或其活性片断；触角足蛋白或其活性片断，例如穿透多肽(penetratin)-1(序列号：1)；成纤维细胞生长因子-1(FGF-1)或其活性片断；Engrailed或其活性片断；Hoxa-5或其活性片断；卡波西成纤维细胞生长因子(kFGF)或其活性片断，例如，AAVALLPAVLLALLAP(序列号：22)；人类β3整联蛋白或其活性片断，例如疏水信号序列；核定位序列(NLS)，例如TPPKKKRKVEDP(序列号：23)；FGF-2或其活性片断；transportan或其活性片断，例如GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(序列号：24)；乳铁蛋白或其活性片断；VP22或其活性片断；HIV型I反式激活蛋白(HIV TAT)或其活性片断，例如YGRKKRRQRRR(序列号：2)；或诸如HSP70的热激蛋白或其活性片断。所述释放剂和其它释放剂已熟知于本领域，例如在Ho，Cancer Res.61：474～477(2001)；Schwarze和Dowdy，Trends Pharmacol.Sci.21：45～48(2000)；Prochiantz，Curr.Opin.Cell Biol.12：400～406(2000)；Ford等，Gene Therapy 8：1～4(2001)；Dunican和Doherty，BiopolymersPeptide Sci.60：45～60(2001)；以及Schwartz和Zhang，Curr.Opin.Mol.Ther.2：162～167(2000)中已有描述。
在一例实施方案中，本发明采用的释放剂是同源异型蛋白或其活性片断，例如，同源异型域或其活性片断。同源异型蛋白是螺旋-转角-螺旋形蛋白，含有称为同源异型域的由DNA结合的约60个残基的结构域。多种同源异型蛋白、同源异型域及其活性片断可作为用于本发明的释放剂，包括但不限于，触角足蛋白、Engrailed1(En1)、Engrailed2(En2)、Hoxa-5、Hoxc-8、Hoxb-4和Knotted-1(KN1)。作为一个实例，En1和En1表达于COS7细胞中，它们首先被分泌出来，然后纳入到其它细胞中。可参考，例如Prochiantz，supra，2000。
在另一例实施方案中，本发明的底物组合物包括释放剂，所述释放剂为同源异型域蛋白、触角足蛋白或其活性片断。触角足蛋白是发育上重要的果蝇同源异型蛋白族成员，它可在神经元膜中转运。触角足蛋白同源异型域的第三螺旋，即16个残基的肽“穿透多肽-1”(序列号：1)纳入活细胞中。细胞内摄作用发生在37℃和4℃，表明释放过程既不是受体介导的，也不是能量依赖的。其它的释放剂包括肽和肽模拟物，所述肽和肽模拟物序列上与穿透多肽-1相关，例如，但不限于，如下表A所示的肽之一或另一种穿透多肽衍生的肽或肽模拟物，包括一种逆向反转(retroinverse)或全D氨基酸肽或肽模拟物，或相关的但非α螺旋形的肽或肽模拟物(可参考例如Prochiantz，supra，2000)。在一例实施方案中，所述穿透多肽衍生的肽保留了穿透多肽-1(序列号：1)的色氨酸、苯基丙氨酸和谷氨酰胺残基。
  表A可用作释放剂的穿透多肽衍生的肽
  肽   序列   序列号：
  43-58   RQIKIWFQNRRMFKWKK   1
  58-43   KKWKMRRNQFWIKIQR   25
  43-58   RQIKIWFQNRRMKWKK   26
  Pro50   RQIKIWFPNRRMKWKK   27
  3Pro   RQPKIWFPNRRMPWKK   28
  Met-Arg   RQIKIWFQNMRRKWKK   29
  7Arg   RQIRIWFQNRRMRWRR   30
  W/R   RRWRRWWRRWWRRWRR   31
在另一例实施方案中，本发明的底物组合物包括释放剂，所述释放剂是HIV反式激活(TAT)蛋白或其活性片断。所述释放剂可包括，例如，与HIV TAT的残基47～57或47～59相同或相似的序列(Schwartz等，Science 285：1569～1572(1999)；以及Ho等，supra，2001)。作为一个实例，包括HIV TAT(YGRKKRRQRRR；序列号：2)残基47～57的融合蛋白，在体外和体内穿过例如人类和鼠科细胞的质膜(Schwartz和Zhang，supra，2000)；15～120kDA的多种蛋白质表现出在与HIVTAT释放剂融合时保留了其生物活性。HIV TAT释放剂可带正电荷并可以，例如不依赖能量、受体、转运蛋白和胞吞作用的方式起作用，将共价键合的梭菌毒素底物释放到，例如90～100％的靶细胞中。
本发明的底物组合物还可包括单纯疱疹病毒VP22蛋白或其活性片断作为释放剂。在一例实施方案中，本发明的底物组合物包括HSV 1型(HSV-1)VP22蛋白或其活性片断。HSV VP22，一种核转录因子，可通过非典型胞吞作用穿过质膜并且可在不依赖GAP连接和物理接触的情况下进入细胞中。HSV VP22与多种不同的蛋白质融合后，可摄入到包括终末分化细胞(terminally differentiated cell)(Ford等，supra，2001；Schwartz和Zhang，supra，2000)在内的不同类型的细胞中并可将键合的梭菌毒素底物释放到，例如，90～100％的培养细胞中。
在另一例实施方案中，可用于本发明的释放剂对应于或衍生自疏水信号序列。所述释放剂可为，例如，卡波西成纤维细胞生长因子(kFGF)或其活性片断，例如，AAVALLPAVLLALLAP(序列号：22)；人类β3整联蛋白或其活性片断；或另一种如Dunican和Doherty，supra，2001所述的疏水性释放剂。
可用于本发明的释放剂还可以是合成序列，所述合成序列具有诸如蛋白转导域(PTD)等天然出现的释放剂的一个或多个特征。所述释放剂，包括但不限于，L-和D-精氨酸低聚物，例如九个L-或D-精氨酸单体的低聚物和相关肽(Wender等，Proc.Nati.Acad.Sci.，USA97：13003～13008(2000))。所述释放剂还包括碱性肽或肽模拟物；碱性α螺旋肽和肽模拟物；以及与诸如HIV TAT的残基47～57等天然出现的蛋白转导域相比，具有最优精氨酸排列或最优α螺旋特征的肽和肽模拟物。可参考，例如，Ho等，supra，2001和WO 99/29721。可用于本发明的释放剂的其它非限制性实例包括SCWKn(序列号：32)；(LARL)n(序列号：33)；HA2；RGD；K16RGD(序列号：34)；loligomer；AlkCWK18(序列号：35)；DiCWK18(序列号：36)；DipaLytic；Plae(序列号：37)；Kplae(序列号：38)和其它已知于本领域的释放剂或可通过常规方法制备的释放剂(参考，例如，Schwartz和Zhang，supra，2000)。本领域的技术人员应理解所述释放剂和其它天然出现和合成的释放剂可用于本发明的底物组合物中。
可用于本发明的释放剂还可以是能促使或促进通过非共价键相连的梭菌毒素底物的细胞内摄入的试剂。在一例实施方案中，所述释放剂是含有两个独立结构域的肽，上述两个独立结构域分别为：疏水性结构域和亲水性结构域。在另一例实施方案中，所述释放剂是由SV40大T抗原的核定位序列(NLS)和HIV-1gp41的融合肽域衍生的MPG肽。在另一例实施方案中，所述释放剂是氨基酸序列为GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV(序列号：39)的MPG肽。在另一例实施方案中，所述释放剂为诸如Pep-1的两亲肽。本领域已知有上述释放剂和相关释放剂，它们在没有共价键的情况下起作用，有时又称为“蛋白转染产物”，例如，如Morris等，Nucl.Acids Res.27：3510～3517(1999)；Morris等，J.Biol.Chem.274：24941～24946(1999)；以及Morris等，Nature Biotech.19：1173～1176(2001)中所描述的。所述肽释放剂可通过常规方法制备并且有市售；作为实例，可从Active Motif(Carlsbad，CA)购得产品ChariotTM。
可用于本发明的梭菌毒素底物包括一部分供体荧光团。这里所用的术语“供体荧光团”表示一种分子，当其用某种波长的光照射时，发出一种不同波长的光，又称为荧光。本领域中，术语荧光团与术语“荧光染料”是同义词。
可用于本发明的梭菌毒素底物还包括一部分受体。这里所用的术语“受体”表示一种可在供体荧光团激发后，从中吸收能量的分子，并且该术语包括荧光团以及非荧光分子。可用于梭菌毒素底物的受体，其吸收光谱与底物所包括的供体荧光团的发射光谱有重叠。可用于本发明的受体在激发供体荧光团的适宜波长下，通常吸收很低。
如上所述，受体的吸收光谱与供体荧光团的发射光谱有重叠。这里在提到受体的吸收光谱和供体荧光团的发射光谱时所用的术语“重叠”表示吸收光谱和发射光谱部分或完全共享。因此，在所述重叠光谱中，供体荧光团发射光谱所覆盖范围的高端高于受体吸收光谱所覆盖范围的低端。
可用于本发明的梭菌毒素底物含有“介于”供体荧光团和受体之间的切割位点，其中受体的吸收光谱与供体荧光团的发射光谱有重叠。因此，切割位点位于荧光团和受体之间，从而在位点的切割将导致第一分子含有荧光团，而第二分子含有受体。应理解所有或仅有部分梭菌毒素识别序列可介于供体荧光团和受体之间。
可用于本发明的梭菌毒素底物含有一部分包括切割位点的梭菌毒素识别序列。在适宜于梭菌毒素蛋白酶活性的条件下，所述梭菌毒素底物容易受到至少一种梭菌毒素切割。
这里所用的术语“梭菌毒素识别序列”表示一种易断裂的键及其相邻或不相邻的识别元件，所述识别元件在适宜于梭菌毒素蛋白酶活性的条件下可通过梭菌毒素在易断裂的键上引起可探测到的蛋白酶解。多种可用的梭菌毒素识别序列将在下面讨论。
在具体实施方案中，本发明的底物组合物是嵌合蛋白、肽或肽模拟物。本发明的底物组合物可为，例如，具有最多20个残基、最多40个残基、最多50个残基、最多100个残基、最多150个残基、最多200个残基、最多250个残基、最多300个残基、最多350个残基、或最多400个残基的嵌合肽或肽模拟物。
这里所用的术语“肽模拟物”用于广义描述类似肽的分子，所述类似肽的分子被相同梭菌毒素作为其结构基础的肽底物切割。所述肽模拟物包括化学修饰的肽、含有非天然氨基酸的类似肽的分子、以及拟肽，所述拟肽是由N取代的甘氨酸通过低聚组合得到的类似肽的分子，并被相同梭菌毒素作为其衍生基础的肽底物切割(参考，例如Goodman和Ro，Peptidomimetics for Drug Design，“Burger’sMedicinal Chemistry and Drug Discovery”第一卷(ed.M.E.Wolff；John Wiley & Sons 1995)，803～861页)。
本领域已知多种肽模拟物包括，例如含有约束性氨基酸的类似肽的分子、模拟肽二级结构的非肽组件、或酰胺键等构物。含有约束性、非天然氨基酸的肽模拟物可包括，例如α甲基化氨基酸；α、α-二烷基-甘氨酸或α-氨基环烷羧酸；Nα-Cαcyclized氨基酸；Nα-甲基化氨基酸；β-或γ-氨基环烷羧酸；α，β-不饱和氨基酸；β，β-二甲基或β-甲基氨基酸；β-取代-2，3-甲烷(methano)氨基酸；NCδ或Cα-Cδ cyclized氨基酸；或取代的脯氨酸或其它氨基酸模拟物。此外，模拟肽二级结构的肽模拟物可含有，例如，非肽β-转角模拟物；γ-转角模拟物；β-片状结构的模拟物；或螺旋结构的模拟物，上述各种已知于本领域中。肽模拟物还可为类似肽的分子，含有例如，诸如逆转录-反向(retro-inverso)修饰等酰胺键等构物；还原的酰胺键；亚甲基硫醚或亚甲基亚砜键；亚甲基醚键；乙烯键；硫代酰胺键；反式烯烃键或氟化烯烃键；1，5-二取代四唑环；酮基亚甲基或氟化酮基亚甲基键或其它酰胺等构物。本领域的技术人员应理解上述肽模拟物和其它肽模拟物包括在这里所用的术语“肽模拟物”中。
这里还提供细胞，该细胞含有一种包括供体荧光团的梭菌毒素底物；一种受体，该受体的吸收光谱与供体荧光团的发射光谱有重叠；一种梭菌毒素识别序列，该梭菌毒素识别序列包括介于供体荧光团和受体之间的切割位点，其中共振能量传递在适当条件下表现于供体荧光团和受体之间。在一例实施方案中，细胞是转染细胞。在另一例实施方案中，细胞是稳定转染细胞。多种细胞可用于本发明中，包括但不限于原代细胞；传代细胞；人类细胞；神经元细胞，例如原代神经元、传代神经元和人类神经元；以及非神经元细胞，例如可为诸如胰腺腺泡细胞的腺细胞。可用于本发明的神经元包括CNS神经元和外周神经元；作为非限制性实例，所述神经元包括神经母细胞瘤、脊髓神经元、背根神经节神经元、大脑皮层神经元、小脑神经元、海马神经元和运动神经元。
在本发明的细胞中，梭菌毒素底物可任选地与释放剂共价键合。所述释放剂可为，例如，蛋白质、肽或肽模拟物。多种释放剂可用于本发明的细胞中，包括但不限于，触角足蛋白或其活性片断，例如氨基酸序列为RQIKIWFQNRRMKWKK(序列号：1)的活性片断；HIV TAT蛋白或其活性片断，例如氨基酸序列为YGRKKRRQRRR(序列号：2)的活性片断；或单纯疱疹病毒VP22蛋白或其活性片断，例如氨基酸序列号为3的单纯疱疹病毒VP22蛋白或其活性片断。在一例实施方案中，本发明提供含有嵌合蛋白、肽或肽模拟物的细胞，所述细胞包括梭菌毒素底物和与底物有效融合的释放剂。上述嵌合蛋白质、肽或肽模拟物的长度可为，例如不超过50或100个残基。
多种梭菌毒素底物可包括在本发明的细胞中。所述梭菌毒素底物包括所有血清型肉毒梭菌毒素底物和破伤风毒素底物。在一例实施方案中，本发明提供的细胞含有包括部分BoNT/A识别序列的BoNT/A底物。所述BoNT/A底物可包括，例如，至少六个相连的SNAP-25残基、六个相连的含有Gln-Arg的残基、或其肽模拟物。在另一例实施方案中，本发明提供的细胞含有包括部分BoNT/B识别序列的BoNT/B底物。可用于本发明细胞的BoNT/B底物包括，但不限于那些具有至少六个相连的VAMP残基、六个相连的含有Gln-Phe的残基、或其肽模拟物的底物。在另一例实施方案中，本发明提供的细胞含有包括部分BoNT/C1识别序列的BoNT/C1底物；可用于本发明细胞的BoNT/C1底物包括那些具有至少六个相连的突触融合蛋白残基、六个相连的含有Lys-Ala的残基、或其肽模拟物的底物，以及那些包括至少六个相连的SNAP-25残基、六个相连的含有Arg-Ala的残基、或其肽模拟物的底物。在另一例实施方案中，本发明提供的细胞含有包括部分BoNT/D识别序列的BoNT/D底物。多种BoNT/D底物可用于本发明的细胞中，包括但不限于，含有至少六个相连的VAMP残基、六个相连的含有Lys-Leu的残基或其肽模拟物的BoNT/D底物。
在另一例实施方案中，本发明提供的细胞含有包括部分BoNT/E识别序列的BoNT/E底物。所述BoNT/E底物可具有，例如，至少六个相连的SNAP-25残基、六个相连的含有Arg-Ile的残基、或其肽模拟物。在另一例实施方案中，提供的细胞含有包括部分BoNT/F识别序列的BoNT/F底物。可用于本发明细胞的BoNT/F底物可具有，例如至少六个相连的VAMP残基、六个相连的含有Gln-Lys的残基、或其肽模拟物。在另一例实施方案中，本发明提供的细胞含有包括部分BoNT/G识别序列的BoNT/G底物。可用的BoNT/G底物包括，但不限于那些具有至少六个相连的VAMP残基、六个相连的含有Ala-Ala的残基、或其肽模拟物的底物。在另一例实施方案中，本发明提供的细胞含有包括部分TeNT识别序列的TeNT底物。多种TeNT底物可用于本发明中，包括那些具有至少六个相连的VAMP残基、六个相连的含有Gln-Phe的残基、或其肽模拟物的底物。
如这里进一步所述的，多种供体荧光团和受体可用于本发明的细胞中。可用于本发明的供体荧光团包括但不限于，Alexa Fluor488、DABCYL和BODIPY。可用于本发明的受体包括非荧光受体和受体荧光团，所述受体荧光团包括荧光寿命为至少1微秒的受体荧光团。可用于本发明细胞的受体还包括四甲基若丹明、EDANS和QSY7。
这里所用的术语“细胞”表示任何真核细胞，所述真核细胞表达或可改变为表达至少一个结合梭菌毒素的受体。术语细胞包括但不限于，原代细胞；培养细胞、传代细胞、正常细胞、转化细胞、肿瘤细胞、受感染细胞、包括稳定和暂时转染的细胞在内的稳定或暂时转染细胞、增生细胞和终末分化细胞以及多种物种和细胞类型的细胞。因此，术语细胞包括但不限于，哺乳动物细胞，例如鼠科动物、大鼠、猪、牛、马、灵长类动物和人类细胞。应理解可用于本发明的细胞可为任何状态的，例如增生或休眠的、完整的或通过诸如电穿孔法或用洋地黄皂苷处理的方法使其具有渗透性；可用于本发明的细胞还可为分离形式的或异质细胞群、组织或有机体的一部分。还应理解可用于本发明的细胞包括那些在组成型或诱导型启动子的控制下表达梭菌毒素底物的细胞，并且所述细胞和可用于本发明的其它细胞能表达一种或多种内源性梭菌毒素靶蛋白或能表达低水平的或无法探测到的一种或所有诸如SNAP-25、VAMP和突触融合蛋白的靶蛋白质。
可用于本发明的细胞包括下述细胞：表达一种或多种内源性低亲和力或高亲和力梭菌毒素受体的细胞；表达低水平或其水平无法探测到的内源性受体并经转染或改变为表达一种或多种外源核酸分子编码的一种或多种梭菌毒素受体的细胞；以及表达针对一种或多种梭菌毒素血清型的内源性和外源性毒素受体结合的细胞。应理解对细胞的选择部分依赖于受测梭菌毒素的种类。作为一个实例，对于检测BoNT/A活性，可选择表达或经改变表达针对BoNT/A的低亲和力或高亲和力受体的细胞。
在一例实施方案中，本发明提供含有梭菌毒素底物的神经元，所述梭菌毒素底物包括一种供体荧光团；一种受体，该受体的吸收光谱与供体荧光团的发射光谱有重叠；一种梭菌毒素识别序列，该识别序列包括介于供体荧光团和受体之间的切割位点，其中共振能量传递在适当条件下表现于供体荧光团和受体之间。
多种神经元可用于本发明中。作为非限制性实例，可用于本发明的神经元可为原代神经元、传代神经元、转化神经元、稳定转染的神经元、运动神经元或感觉神经元；并且还可为，例如哺乳动物、鼠科动物、大鼠、灵长类或人类的神经元。可用于本发明的神经元可为外周神经元或CNS神经元；作为非限制性实例，可用于本发明的神经元如下所述可为脊髓神经元，例如胚胎脊髓神经元、背根神经节(DRG)神经元、大脑皮层神经元、小脑神经元、海马神经元和运动神经元。
可用于本发明的示例性神经元包括但不限于胚胎DRG神经元的原代培养物，例如，如Welch等，Toxicon 38：245～258(2000)所述的胚胎大鼠DRG神经元的原代培养物；以及胎儿脊髓神经元的原代培养物，例如，如Neale等，J.Cell Biol.147：1249～1260(1999)，或Chaddock等，Infect.Immun.68：2587～2593(2000)所述的鼠科动物胎儿脊髓神经元的原代培养物。
可用于本发明的示例性的神经元细胞系包括但不限于，诸如LA-N-2、SH-SY5Y、N2a、NS-20Y和NIE-115等神经母细胞瘤细胞系；包括诸如NG108-C15等神经母细胞瘤/神经胶质瘤在内的杂合细胞系；诸如NSC-34和NSC-19的运动神经细胞系；诸如M4b的脊髓细胞系；CNS细胞系；诸如CNh的大脑皮层细胞系；诸如G4b的背根神经节细胞系；诸如HT-22的海马细胞系；以及诸如PC12的嗜铬细胞瘤细胞系。
可用于本发明的神经元细胞系可为，例如，神经母细胞瘤细胞系，如鼠科动物、灵长类或人类的神经母细胞瘤细胞系。可用于本发明的示例性的神经母细胞瘤细胞系包括但不限于LA-N-2、SH-SY5Y、N2a、NS-20Y和NIE-115。作为一个实例，本发明的实施可采用LA-N-2人类神经母细胞瘤细胞系，该细胞系具有胆碱能神经元的性能并表达具有明显特征的胆碱能标记(Rylett等，J.Neurochem.61：1388～1397(1993)；Singh et等，J.Neurosci.Res.25：476～485(1990)；以及Yeh等，Neuroscience 27：309～315(1988))。作为另一个实例，本发明的实施可采用SH-SY5Y人类神经母细胞瘤细胞系，该细胞系暴露于肉毒梭菌毒素时，表现出对由K+/Ca2+引起的[3H]去甲肾上腺素释放的抑制(Purkiss等，Neurotoxicology 22：447-453(2001))。
诸如鼠科动物、灵长类和人类杂合神经元细胞系的杂合神经元细胞系也可用于本发明中。所述杂合细胞系包括诸如神经母细胞瘤/神经胶质瘤杂合体的神经母细胞瘤杂合体。作为一个实例，NG108-C15细胞系是一种可用于本发明的小鼠神经母细胞瘤和大鼠神经胶质瘤的杂合体(Yokosawa等，Infect.Immun.57：272～277(1989))。NG108-C15细胞系可改变为包括，例如，BoNT/C1底物以检测BoNT/C1活性。其它的杂合细胞系包括NSC细胞系，该细胞系是神经母细胞瘤与类似于发育中运动神经元的脊髓神经元的杂合体(Cashman等，Dev.Dyn.194：209～221(1992))。
可用于本发明的神经元细胞系还可为运动神经元细胞系，例如鼠科动物、灵长类或人类运动神经元细胞系。NSC-34和NSC-19是可用于本发明的示例性的运动神经元细胞系；所述细胞系是小鼠神经母细胞瘤(N18TG2)和分离的胚胎(12～14天)小鼠脊髓运动神经元的克隆杂合体，该细胞系表达运动神经元特征并表现类似多极神经元的显型(Eggett等，J.Neurochem.74：1895～1902(2000))。NSC-34和NSC-19细胞表达高水平的胆碱乙酰转移酶(CHAT)，一种运动神经元的标记。所述细胞还产生动作电位；表达神经丝三联蛋白；并合成、储存和释放乙酰胆碱。
可用于本发明的神经元细胞系还可为脊髓细胞系，例如鼠科动物、灵长类或人类的脊髓细胞系。作为一个实例，人类的脊髓细胞系可从经四环素阻抑型v-myc致癌基因永生化的人类胚胎脊髓细胞(前三个月的胚胎)的前体中产生，如J.Neurosci.Res.59：342～352(2000)所述。所述细胞可在迅速分化(4～7天)为功能性神经元以前，于增生生长条件下无限扩展，上述功能性神经元表达诸如胆碱乙酰转移酶的神经元表型标记。作为另一个实例，鼠科动物脊髓细胞系可通过用转化介质永生化胚胎脊髓培养物制备。所述脊髓细胞系可为，例如，鼠科M4b系并可表达神经元标记，如NSE、突触小泡蛋白、MAP-2以及胆碱乙酰转移酶，并且可在适当刺激下释放乙酰胆碱(Cardenas等，J.Neurosci.Res.68：46～58(2002))。
包括鼠科动物、灵长类和人类CNS细胞系在内的人类中枢神经系统(CNS)细胞系也可用于本发明中。可用的CNS细胞系可为，例如，用四环素阻抑型v-myc致癌基因永生化的人类CNS细胞系，如Sah等，Nature Biotechnol 15：574～580(1997)所述。致癌基因阻抑后，细胞将分化为神经元。
大脑皮层(CNh)细胞系也是可用于本发明的神经元。可用的大脑皮层细胞系包括但不限于，鼠科动物、灵长类和人类细胞系。作为一个实例，从12～16天的胚胎中提取的鼠科动物大脑原代培养物可通过，例如，在条件化介质中培养细胞以永生化，所述条件化介质源自引起体外转化的大鼠甲状腺细胞系。永生化的细胞可分化为使用适当介质表达神经元标记的神经元；所述分化细胞表达胆碱乙酰转移酶并分泌乙酰胆碱和谷氨酸以响应去极化作用和烟碱刺激(Allen等，Eur.J.Neurosci.12：3259～3264(2000))。
包括鼠科、灵长类和人类背根神经节细胞系在内的背根神经节细胞系也可用于本发明中。胚胎背根神经节原代培养物可采用如上所述的转化条件化介质永生化。细胞系经分化后通过免疫组织化学表现出神经元性状并失去胶质标记。对钾和烟碱的响应可引起诸如乙酰胆碱等神经递质的释放(Allen等，NeurorePort 13：491～496(2002))。可用于本发明的示例性的DRG细胞系有鼠科DRG细胞系G4b。
本发明的实施还可采用海马细胞系，包括鼠科动物、灵长类和人类的海马系。作为非限制性实例，鼠科动物海马细胞系HT-22可用于本发明中。技术人员应理解所述细胞系和其它的原代及传代神经元均可用于本发明的组合物和方法中。
应理解本发明可通过完整的和渗透性的细胞实施。在一例实施方案中，本发明细胞通过，例如，电穿孔法或暴露于洋地黄皂苷或低离子强度的缓冲液中而具有渗透性。在另一例实施方案中，本发明细胞是渗透性的PC12细胞。
如上所述，应理解可用于本发明的神经元对一种或多种梭菌毒素表达内源性或外源性低亲和力或高亲和力的受体。所述神经元在暴露于梭菌毒素时，通常还表现出对胞吐作用的抑制，其IC50为，例如，低于50nM、低于5nM、低于0.5nM、低于0.05nM、低于0.005nM、低于0.0005nM、低于0.00005nM或低于0.000005nM。在具体实施方案中，本发明提供的含有BoNT/A底物的神经元在暴露于BoNT/A时，表现出对胞吐作用的抑制，其IC50为低于50nM、低于5nM、低于0.5nM、低于0.05nM、低于0.005nM、低于0.0005nM、低于0.00005nM或低于0.000005nM。在具体实施方案中，本发明提供的含有BoNT/B底物的神经元在暴露于BoNT/B时，表现出对胞吐作用的抑制，其IC50为低于50nM、低于5nM、低于0.5nM、低于0.05nM、低于0.005nM、低于0.0005nM、低于0.00005nM或低于0.000005nM。在其它的实施方案中，本发明提供的含有BoNT/C1底物的神经元在暴露于BoNT/C1时，表现出对胞吐作用的抑制，其IC50为低于50nM、低于5nM、低于0.5nM、低于0.05nM、低于0.005nM、低于0.0005nM、低于0.00005nM或低于0.000005nM。在另一例实施方案中，本发明提供的含有BoNT/D底物的神经元在暴露于BoNT/D时，表现出对胞吐作用的抑制，其IC50为低于50nM、低于5nM、低于0.5nM、低于0.05nM、低于0.005nM、低于0.0005nM、低于0.00005nM或低于0.000005nM。在其它的实施方案中，本发明提供的含有BoNT/E底物的神经元在暴露于BoNT/E时，表现出对胞吐作用的抑制，其IC50为低于50nM、低于5nM、低于0.5nM、低于0.05nM、低于0.005nM、低于0.0005nM、低于0.00005nM或低于0.000005nM。在另一例实施方案中，本发明提供的含有BoNT/F底物的神经元在暴露于BoNT/F时，表现出对胞吐作用的抑制，其IC50为低于50nM、低于5nM、低于0.5nM、低于0.05nM、低于0.005nM、低于0.0005nM、低于0.00005nM或低于0.000005nM。在其它实施方案中，本发明提供的含有BoNT/G底物的神经元在暴露于BoNT/G时，表现出对胞吐作用的抑制，其IC50为低于50nM、低于5nM、低于0.5nM、低于0.05nM、低于0.005nM、低于0.0005nM、低于0.00005nM或低于0.000005nM。在其它实施方案中，本发明提供的含有TeNT底物的神经元在暴露于TeNT时，表现出对胞吐作用的抑制，其IC50为低于50nM、低于5nM、低于0.5nM、低于0.05nM、低于0.005nM、低于0.0005nM、低于0.00005nM或低于0.000005nM。应理解相同的神经元可表达两个或多个针对不同梭菌毒素血清型的受体，其对于各个毒素血清型具有相同或不同的IC50。
包括原代和传代细胞在内的多种非神经元细胞也可用于本发明中。所述非神经元细胞包括原代细胞、传代细胞、稳定和暂时转染的细胞以及肿瘤细胞和所有物种的起源细胞，包括哺乳动物、鼠科动物、大鼠、灵长类和人类细胞。作为非限制性实例，可用于本发明的非神经元细胞包括腺细胞，例如胰腺腺泡细胞、胰腺β-腺岛细胞和胰岛素瘤HIT或INS-1细胞；成纤维细胞；肌肉细胞和肝细胞。
可用于本发明的非神经元细胞还可以包括(但不限于)以下任何原代或传代细胞：垂体前叶细胞、肾上腺髓质嗜铬细胞等肾上腺细胞、肠嗜铬状细胞等胃细胞、胰腺β-腺岛细胞等胰腺细胞、诸如类固醇生成的卵巢细胞等卵巢细胞、诸如髓质内层集合管(IMCD)细胞的肾细胞、胰腺腺泡细胞、血小板、嗜中性白细胞、嗜伊红粒细胞、肥大细胞、诸如顶端质膜上皮细胞的上皮细胞；以及转运葡糖转运蛋白(GLUT4)所涉及的细胞。作为非限制性实例，可用于本发明的非神经元细胞可包括具有SNAP-25识别序列的梭菌毒素底物；所述非神经元细胞可为，例如，原代或传代垂体前叶细胞；肾上腺细胞，如肾上腺髓质的嗜铬细胞；胃细胞，如肠嗜铬状细胞；胰腺细胞，如胰腺腺岛β细胞；或卵巢细胞，如类固醇生成的卵巢细胞。可用于本发明的非神经元细胞的其它非限制性实例还包括具有SNAP-23识别序列的梭菌毒素底物；所述非神经元细胞可为，例如，诸如髓质内层集合管(IMCD)细胞的肾细胞、胰腺腺泡细胞、血小板、嗜中性白细胞、嗜伊红粒细胞、肥大细胞、诸如顶端质膜上皮细胞的上皮细胞；或转运葡糖转运蛋白(GLUT4)所涉及的细胞。应理解所述非神经元细胞以及多种其它原代和传代非神经元细胞可用于本发明中。
在一例实施方案中，本发明提供的传代非神经元细胞包括编码梭菌毒素底物的核酸分子，该梭菌毒素底物含有一种供体荧光团；一种受体，该受体的吸收光谱与供体荧光团的发射光谱有重叠；一种梭菌毒素识别序列，该识别序列包括介于供体荧光团和受体之间的切割位点，其中共振能量传递在适当条件下表现于供体荧光团和受体之间。所述传代非神经元细胞可为，例如用编码梭菌毒素底物的核酸分子稳定转染的细胞。
应理解表达内源性或转染梭菌毒素受体的细胞可通过包括对毒素摄入进行直接和非直接检测在内的常规方法鉴定。所述方法可依赖于，例如标记的毒素，如荧光标记的或放射性标记的毒素。所述方法还可采用，例如抗毒素抗体进行，所述抗体可通过，例如，免疫组织化学或蛋白质印迹用于检测细胞内毒素。此外，表达梭菌毒素受体并因此摄入一种或多种梭菌毒素的细胞还可通过检测切割靶蛋白进行鉴定。作为一个实例，蛋白质印迹法采用的抗体特异性识别SNAP-25197，即BonT/A切割产物，因此可用于检测对BoNT/A的摄入。另一种已熟知的检测方法包括探测3H-去甲肾上腺素或其它神经递质的分泌以衡量神经元中胞吐作用的抑制，或由诸如垂体前叶细胞或卵巢细胞等内分泌细胞所释放的荷尔蒙。应理解所述的及相似的检测细胞内毒素、毒素切割产物或毒素功能的方法可用于选择适用于本发明组合物和方法的神经元或其它细胞。
本发明还提供一种掺有“复合”梭菌毒素底物的细胞。所述复合梭菌毒素底物含有(a)与亲和偶联对的第一伙伴键合的供体荧光团-受体对的第一成员；以及(b)含有切割位点的梭菌毒素识别序列，其中识别序列与供体荧光团-受体对的第二成员以及亲和偶联对的第二伙伴键合，并且切割位点介于供体荧光团-受体对的第二成员与亲和偶联对的第二伙伴之间，并且其中(a)和(b)是稳定结合的，从而在适当条件下，共振能量传递表现于供体荧光团-受体对的第一和第二成员之间。因此，复合梭菌毒素底物实际上是一种二分梭菌毒素底物，其中两部分通过亲和偶联稳定连接。对于其它的梭菌毒素底物，共振能量传递根据复合底物的切割改变。应理解这里所述的以及本领域所熟知的梭菌毒素识别序列和切割位点可用于复合梭菌毒素底物。
这里所用的术语“供体荧光团-受体对”表示供体荧光团和受体，其中受体的吸收光谱和供体荧光团的发射光谱有重叠。当所述对的第一成员是供体荧光团时，所述对的第二成员即指受体。当所述对的第一成员是受体时，所述对的第二成员即指供体荧光团。
在一例实施方案中，供体荧光团-受体对的第一成员是供体荧光团，而第二成员是受体。在另一例实施方案中，供体荧光团-受体对的第一成员是受体，而第二成员是供体荧光团。多种供体荧光团和受体可掺入本发明细胞或方法所用的复合梭菌毒素底物中，包括下述的供体荧光团和受体。在一例实施方案中，供体荧光团是荧光蛋白。在另一例实施方案中，供体荧光团和受体均为荧光蛋白。可用的荧光蛋白包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和红色荧光蛋白(RFP)。
这里所用的术语“亲和偶联对”表示能形成稳定的、非共价连接的两个分子。可用于复合底物的亲和偶联对包括但不限于SNAP-25-突触融合蛋白、VAMP-突触结合蛋白、链霉抗生物素蛋白-生物素、S肽-S蛋白、受体-配体、二聚受体或其它相互作用的蛋白质。在一例实施方案中，亲和偶联对是SNAP-25-突触融合蛋白。在另一例实施方案中，亲和偶联对是VAMP-突触结合蛋白。
本发明还提供一种编码梭菌毒素底物的核酸分子，所述梭菌毒素底物包括一种供体荧光团；一种受体，该受体的吸收光谱与供体荧光团的发射光谱有重叠；一种梭菌毒素识别序列，该识别序列包括介于供体荧光团和受体之间的切割位点，其中共振能量传递在适当条件下表现于供体荧光团和受体之间。编码梭菌毒素底物的核酸分子，可与例如调节元件连接，所述调节元件例如有组成型调节元件或诱导型调节元件，例如但不限于，四环素调节的调节元件或蜕皮素诱导的调节元件。可用于本发明基因编码的梭菌毒素底物中的基因编码的供体荧光团和受体包括绿色荧光蛋白(GFP)和其它下述的以及本领域所熟知的荧光蛋白。
在一例实施方案中，编码的梭菌毒素识别序列是人类SNAP-25(序列号：4)的残基34～206。在另一例实施方案中，编码的梭菌毒素识别序列是人类SNAP-25(序列号：4)的残基34～206，而供体荧光团或受体是绿色荧光蛋白。在另一例实施方案中，编码的梭菌毒素识别序列是人类SNAP-25(序列号：4)的残基34～206，而供体荧光团和受体均为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白或红色荧光蛋白。
本发明的核酸分子还可任选地包括诸如启动子或增强子等多种组成型或诱导型调节元件。诱导型表达系统的优势在于可产生可控制的细胞内水平底物。可用于本发明的组成型调节元件包括但不限于，巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV TK)、猴病毒40(SV40)早期、5’长末端重复序列(LTR)、延伸因子-1α(EF-1α)和polybiquitin(UbC)调节元件。可用于本发明的诱导型调节元件包括四环素诱导型和四环素阻抑型元件，如Tet-OnTM和Tet-offTM(BDBiosciences)；蜕皮素-诱导型元件和GAL4调节元件，如GeneSwitchTM系统(Invitrogen)。技术人员应理解所述的和其它组成型及诱导型调节元件可包括在本发明的核酸分子中。
多种基因编码的供体荧光团和受体可用于本发明的核酸分子及细胞中。所述供体荧光团和受体包括基因编码染料，如绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)或诸如dsRed(BD Biosciences Clontech；帕拉阿图，加利福尼亚)的红色荧光蛋白。所述基因编码的供体荧光团和受体已为本领域所熟知，例如，如Selvin，supra，2000和Mahajan等，Chemistryand Biology 6：401～409(1999)所述的。作为一个实例，在433nm有激发最大波长，在476nm有发射最大波长的CFP可用作供体荧光团，并与作为受体的YFP(在527nm有发射最大波长)相结合。如果需要，BFP可用作供体荧光团，并与作为受体的GFP相结合，或采用CFP作为供体荧光团并与作为受体的YFP相结合。包括Aequorea相关荧光蛋白在内的其它基因编码的供体荧光团和受体已熟知于本领域，例如，如美国专利No.5,981,200所述。
本发明还提供一种包括基因编码的梭菌毒素底物的细胞。因此，本发明提供的细胞包括编码梭菌毒素底物的核酸分子，所述梭菌毒素底物包括一种供体荧光团；一种受体，该受体的吸收光谱与供体荧光团的发射光谱有重叠；一种梭菌毒素识别序列，该识别序列包括介于供体荧光团和受体之间的切割位点，其中共振能量传递在适当条件下表现于供体荧光团和受体之间。所述核酸分子可编码，例如人类SNAP-25(序列号：4)的残基34～206，并且还可包括，例如供体荧光团，如绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白或红色荧光蛋白，以及受体，如绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白或红色荧光蛋白。
多种细胞可改变为包括编码梭菌毒素底物的核酸分子，包括但不限于人类细胞、神经元细胞和非神经元细胞。在一例实施方案中，对梭菌毒素底物进行编码的核酸分子稳定转染到细胞中。在另一例实施方案中，编码梭菌毒素底物的核酸分子与诸如组成型调节元件或诱导型调节元件等调节元件连接。多种诱导型调节元件可用于本发明中，包括但不限于四环素调节的调节元件和蜕皮素诱导的调节元件。本发明的基因编码的梭菌毒素底物可包括多种基因编码的供体荧光团或受体，如GFP。
含有编码梭菌毒素底物的核酸分子的细胞可通过多种常规方法制备，包括熟知的暂时和稳定转染法。作为非限制性实例，将核酸分子引入包括神经元或非神经元细胞在内的细胞的常规技术包括微注射法、电穿孔法、脂转染法、磷酸钙介导的转染法、DEAE-Dextran介导的转染法、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物或聚赖氨酸介导的转染法，以及接合到抗体、短杆菌肽(gramacidin)S、人造病毒包膜或其它细胞内载体，如TAT。参考Cibelli等，Nat.Biotech.16：642～646(1998)；Lamb和Gearhart，Cur.Opin.Gen.Dev.5：342～348(1995)；Choi(美国专利6,069,010)；以及Current Protocolsin Molecular Biolociv，John Wiley和Son，9.16.4～9.16.11页(2000)。
本发明还提供用于测定样品中梭菌毒素活性的试剂盒。所述试剂盒含有置于小瓶或其它容器中的本发明的底物组合物或细胞，并且通常还包括使用说明书。在一例实施方案中，本发明的试剂盒还包括已知量的能切割梭菌毒素底物的肉毒梭菌毒素或破伤风毒素作为阳性对照，其中毒素掺入到试剂盒所包括的底物组合物或细胞中。在另一例实施方案中，试剂盒含有本发明的底物组合物并且还包括两种切割产物中的一种或两种作为阳性对照。所述试剂盒可包括，例如，本发明的底物组合物以及含有供体荧光团的相应切割产物作为阳性对照。当本发明提供的试剂盒含有本发明细胞和阳性对照时，阳性对照应理解为相同细胞类型的细胞，所述细胞用两种相应切割产物中的一种或两种代替未切割的梭菌毒素底物。所述阳性对照细胞可含有，例如，包括供体荧光团的切割产物。
如下所述，同类或不同类的含有不同梭菌毒素底物的细胞的结合可用于检测两种或多种梭菌毒素的活性。因此，在一例实施方案中，本发明提供的用于测定梭菌毒素活性的试剂盒包括至少两种本发明的底物组合物，所述底物组合物具有对两种不同梭菌毒素的识别序列。在另一例实施方案中，本发明提供的用于测定梭菌毒素活性的试剂盒包括至少两种含有两种不同梭菌毒素底物的本发明细胞，所述梭菌毒素底物具有对两种不同梭菌毒素的识别序列。
本发明还提供一种测定梭菌毒素活性的方法，该方法包括(a)将样品与含梭菌毒素底物的细胞接触，所述梭菌毒素底物包括一种供体荧光团；一种受体，该受体的吸收光谱与供体荧光团的发射光谱有重叠；一种梭菌毒素的识别序列，该识别序列包括介于供体荧光团和受体之间的切割位点，其中共振能量传递在适当条件下表现于供体荧光团和受体之间；(b)激活供体荧光团；以及(c)测定接触过的细胞相对于对照细胞的共振能量传递，其中与对照细胞相比，接触过的细胞共振能量传递的变化表示梭菌毒素的活性。
有效实施本发明方法可对于毒素活性所需的几个不同步骤检测梭菌毒素。因此，本发明方法可用于测定梭菌毒素是否具有下列结构域：细胞内摄入的功能性结合域、将轻链释放到细胞胞质溶胶的功能性转运域以及功能性细胞酶解域。在缺少上述三种功能的任何一项时，本发明方法通常会出现阴性结果。
在本发明方法中，梭菌毒素底物任选地可与释放剂共价连接，所述释放剂可为，例如，蛋白质、肽或肽模拟物。可用的释放剂包括，例如，触角足蛋白或其活性片断，例如氨基酸序列为RQIKIWFQNRRMKWKK(序列号：1)的活性片断；HIV TAT蛋白或其活性片断，例如氨基酸序列为YGRKKRRQRRR(序列号：2)的活性片断；以及单纯疱疹病毒VP22蛋白或其活性片断，例如氨基酸序列号为3的单纯疱疹病毒VP22蛋白或其活性片断。在一例实施方案中，实施本发明方法所采用的含有嵌合蛋白、肽或肽模拟物的细胞包括梭菌毒素底物和与底物有效融合的释放剂。所述嵌合蛋白、肽或肽模拟物可具有，例如，不超过50或100个残基的长度。
可用于本发明方法的梭菌毒素底物可为任何血清型的肉毒梭菌毒素底物或破伤风毒素底物。因此，本发明方法的实施可使用含有包括BoNT/A识别序列的BoNT/A底物的细胞、含有包括BoNT/B识别序列的BoNT/B底物的细胞、含有包括BoNT/C1识别序列的BoNT/C1底物的细胞、含有包括BoNT/D识别序列的BoNT/D底物的细胞、含有包括BoNT/E识别序列的BoNT/E底物的细胞、含有包括BoNT/F识别序列的BoNT/F底物的细胞、含有包括BoNT/G识别序列的BoNT/G底物的细胞或含有包括TeNT识别序列的TeNT毒素底物的细胞。应理解多种供体荧光团和受体可掺入用于本发明方法的梭菌毒素底物中。作为非限制性实例，可用的供体荧光团包括Alexa Fluor488、DABCYL和BODIPY，而可用的受体包括EDANS、QSY7和四甲基若丹明。如这里所述的，可用于本发明方法的受体包括非荧光受体和受体荧光团，所述受体荧光团包括荧光寿命相对较长，为至少1微秒的受体荧光团。
多种细胞可用于本发明方法中，包括但不限于原代细胞；传代细胞；人类细胞；神经元，例如原代神经元、传代神经元和人类神经元；以及诸如胰腺腺泡细胞的非神经元细胞。根据本发明方法，用于测定梭菌毒素活性的神经元包括中枢神经系统(CNS)神经元和外周神经元；作为非限制性实例，所述神经元可为神经母细胞瘤细胞、脊髓神经元、背根神经节神经元、大脑皮层神经元、小脑神经元、海马神经元或运动神经元。
本领域的技术人员应理解根据本发明方法可检测多种样品的梭菌毒素活性。所述样品包括但不限于，粗的细胞溶胞产物；分离出的梭菌毒素；诸如BOTOX的合成梭菌毒素产品；以及食品。
多种途径可用于在本发明方法中测定供体荧光团激发后的共振能量传递。在一例实施方案中，本发明方法包括探测接触过的细胞相对于对照细胞的供体荧光强度，其中与对照细胞相比，接触过的细胞供体荧光强度的提高表示梭菌毒素的活性。在另一例实施方案中，本发明方法包括探测接触过的细胞相对于对照细胞的受体荧光强度，其中与对照细胞相比，接触过的细胞受体荧光强度的降低表示梭菌毒素活性。在另一例实施方案中，本发明方法包括探测接触过的细胞相对于对照细胞的受体发射最大波长和供体荧光团发射最大波长，其中从受体发射最大波长附近到供体荧光团发射最大波长附近的发射最大波长的位移表示梭菌毒素活性。在另一例实施方案中，本发明方法包括探测接触过的细胞相对于对照细胞的受体发射最大波长附近的荧光振幅与供体荧光团发射最大波长附近的荧光振幅的比值，其中与对照细胞相比，接触过的细胞比值的降低表示梭菌毒素活性。在另一例实施方案中，本发明方法包括探测相对于对照细胞，接触过的细胞中供体荧光团的激发态寿命，其中与对照细胞相比，接触过的细胞中供体荧光团激发态寿命的增大表示梭菌毒素活性。如果需要，测定共振能量传递的步骤可在以后的一个或多个时间间隔内重复。此外，可任选地选择适用于梭菌毒素活性的条件，以使检测成线性。
如下所述，应理解本发明方法适用于粗样品以及高纯度的双链毒素。作为非限制性实例，本发明方法可用于检测食品或饮料样品中的梭菌毒素活性；检测取自人类或动物的样品，例如，所述人或动物暴露于梭菌毒素或具有一种或多种梭菌毒素症状；在梭菌毒素的生产和纯化过程中跟踪探测其活性，并检测包括药品和化妆品在内的合成梭菌毒素产品。
本发明方法可用于测定任何梭菌毒素的活性。在一例实施方案中，本发明方法依赖于含有BoNT/A底物的细胞以测定BoNT/A活性。所述BoNT/A底物可为这里描述的任何BoNT/A底物，例如，含有至少六个相连的SNAP-25残基的BoNT/A底物，其中六个相连的残基包括Gln-Arg。在另一例实施方案中，本发明方法依赖于含有BoNT/B底物的细胞以测定BoNT/B活性。所述BoNT/B底物可为这里描述的任何BoNT/B底物，例如，含有至少六个相连的VAMP残基的BoNT/B底物，其中六个相连的残基包括Gln-Phe。本发明方法还可采用含有BoNT/C1底物的细胞以测定BoNT/C1活性。本发明方法所用的BoNT/C1底物可为这里描述的任何BoNT/C1底物，例如，含有至少六个相连的突触融合蛋白残基的BoNT/C1底物，其中六个相连的残基包括Lys-Ala，或含有至少六个相连的SNAP-25残基，其中六个相连的残基包括Arg-Ala。
在另一实施方案中，本发明方法依赖于含有BoNT/D底物的细胞以测定BoNT/D活性。所述BoNT/D底物可为这里描述的任何BoNT/D底物，例如，含有至少六个相连的VAMP残基的BoNT/D底物，其中六个相连的残基包括Lys-Leu。在另一例实施方案中，本发明方法的实施采用含有BoNT/E底物的细胞以测定BoNT/E活性。可用于本发明方法的BoNT/E底物可为这里描述的任何BoNT/E底物，例如，含有至少六个相连的SNAP-25残基的BoNT/E底物，其中六个相连的残基包括Arg-Ile。在另一例实施方案中，本发明方法依赖于含有BoNT/F底物的细胞以测定BoNT/F活性。可用于本发明方法的BoNT/F底物可为这里描述的任何BoNT/F底物，例如，含有至少六个相连的VAMP残基的BoNT/F底物，其中六个相连的残基包括Gln-Lys。
本发明方法还可采用含有BoNT/G底物的细胞以测定BoNT/G活性。可用于本发明方法的BoNT/G底物可为这里描述的任何BoNT/G底物，例如，含有至少六个相连的VAMP残基的BoNT/G底物，其中六个相连的残基包括Ala-Ala。本发明方法还可用于测定TeNT蛋白酶活性，并且在这种情况下，依赖于含有TeNT底物的细胞。这里所描述的任何TeNT底物均可用于本发明方法中，例如，含有至少六个相连的VAMP残基的TeNT底物，其中六个相连的残基包括Gln-Phe。
多种样品可用于本发明方法中。这里所用的术语“样品”表示任何含有或可能含有活性梭菌毒素的生物物质。因此，术语样品包括担不限于纯化的或部分纯化的梭菌毒素；具有天然或非天然序列的重组单链或双链毒素；具有修饰蛋白酶特异性的重组梭菌毒素；具有已改变的细胞特异性的重组梭菌毒素；含有来自多个梭菌毒素种类或亚类的结构元件的嵌合毒素；大块毒素(bulk toxin)；合成产品；细胞或粗的、分级或部分纯化的细胞溶胞产物，例如，改变为包括对梭菌毒素进行编码的重组核酸；细菌、杆状病毒和酵母的溶胞产物；生的、经烹饪的、部分烹饪的或加工过的食品；饮料；动物饲料；土壤样品；水样品；池塘沉积物；洗液；化妆品；和临床制剂。还应理解术语样品包括组织样品，包括但不限于，哺乳动物组织样品；家畜组织样品，如羊、牛和猪的组织样品；灵长类组织样品；以及人类组织样品。所述样品包括但不限于肠样品，例如婴儿的肠样品以及取自伤员的组织样品。
本发明方法所检测的纯化或部分纯化的梭菌毒素的浓度通常在约0.0001～5000ng/ml毒素的范围内，例如为约0.001～5000ng/ml、0.01～5000ng/ml、0.1～5000ng/ml、1～5000ng/ml或10～5000ng/ml毒素，并可为，例如，纯化的重组双链毒素或含有人类血清白蛋白和赋形剂的合成梭菌毒素产品。通常，本发明方法所检测的纯化毒素的量在0.1pg～10μg的范围内。应理解纯化、部分纯化或粗样品可通过稀释使其浓度落在方便根据标准曲线检测梭菌毒素活性的范围内。类似地，本领域的技术人员应理解既然在毒素浓度很高时，会牺牲检测的线性，因此样品可以被稀释或限制样品的量，以使检测成线性。
本领域的技术人员应理解在本发明方法中，细胞可与梭菌毒素接触任意长的时间，这部分依赖于所使用的细胞的种类、所表达的毒素受体的亲和力以及所检测的毒素的量和类型。作为非限制性实例，细胞可与毒素接触最多1小时、2小时、4小时、8小时、16小时、24小时、48小时或72小时。
在本发明方法中，共振能量传递可通过多种途径检测。在一例实施方案中，测定共振能量传递的步骤包括探测接触过的细胞的供体荧光强度，其中与对照细胞相比，接触过的细胞供体荧光强度的提高表示梭菌毒素活性。在另一例实施方案中，测定共振能量传递的步骤包括探测接触过的细胞的受体荧光强度，其中与对照细胞相比，受体荧光强度的降低表示梭菌毒素活性。在另一例实施方案中，测定共振能量传递的步骤包括探测受体发射最大波长和供体荧光团发射最大波长，其中从受体发射最大波长附近到供体荧光团发射最大波长附近的发射最大波长的位移表示梭菌毒素活性。在另一例实施方案中，测定共振能量传递的步骤包括探测受体发射最大波长附近的荧光振幅与供体荧光团发射最大波长附近的荧光振幅的比值，其中与对照细胞相比，接触过的细胞中比值的降低表示梭菌毒素活性。在另一例实施方案中，测定共振能量传递的步骤通过探测接触过的细胞中供体荧光团的激发态寿命实施，其中与对照细胞相比，接触过的细胞中供体荧光团激发态寿命的增大表示梭菌毒素活性。
在本发明测定梭菌毒素活性的方法中，含有梭菌毒素底物的细胞与样品接触，所述梭菌毒素底物包括第一供体荧光团；第一受体，该受体的吸收光谱与供体荧光团的发射光谱有重叠；第一梭菌毒素识别序列，该识别序列包括介于供体荧光团和受体之间的切割位点，其中共振能量传递在适当条件下表现于供体荧光团和受体之间。如果需要，第二梭菌毒素底物可包括在相同的细胞中；所述第二底物包括第二供体荧光团，吸收光谱与第二供体荧光团的发射光谱有重叠的第二受体以及第二梭菌毒素识别序列，切割该识别序列的梭菌毒素不同于切割第一梭菌毒素识别序列的毒素。第二底物中的供体荧光团-受体对可与第一底物中的供体荧光团-受体对相同或不同。在所述方式下，可方便地检测单个样品中一种以上梭菌毒素的存在。
应理解可检测梭菌毒素的任意结合，例如，两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或更多梭菌毒素。可检测，例如BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G和TeNT中任意两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种的结合。作为一个实例，如上所述选择的七种相同或不同类型的细胞含有七种底物，各底物包括荧光素和四甲基若丹明，位于BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F或BoNT/G识别序列及切割位点侧翼。在适宜于肉毒梭菌毒素活性的条件下，将各细胞与样品接触，然后在约488nm的吸收波长激发供体荧光素并测定能量传递。受体即四甲基若丹明的发射最大波长(585nm)相对于荧光素的发射最大波长(520nm)的位移表示至少有一种肉毒梭菌毒素的活性。所述检测可用于，例如，检测食品样品或组织样品中是否存在有任何肉毒梭菌或其它梭菌毒素并且如果需要，所述检测可与随后检测个别梭菌毒素或梭菌毒素特定组合的一种或多种方法相结合。
在另一例实施方案中，采用两种或多种包括在诸如神经元等相同或不同细胞中的不同梭菌毒素底物检测单个样品中两种或多种不同的梭菌毒素，其中各底物含有不同的供体荧光团-受体对。使用多种底物可用于扩展检测的动力学范围，例如，如美国专利No.6,180,340所述。作为使用多种梭菌毒素底物的一个实例，可使用含有第一和第二梭菌毒素底物的细胞检测单个样品的BoNT/A和BoNT/B活性：第一梭菌毒素底物含有包括间插BoNT/A识别序列和切割位点的供体荧光团荧光素和受体四甲基若丹明，而第二梭菌毒素底物含有包括间插BoNT/B识别序列和切割位点的供体荧光团EDANS和受体DABCYL。第一供体荧光团即荧光素在约488nm激发，并且根据荧光素荧光强度的提高(在约520nm)所测得的能量传递表明存在有BoNT/A活性。第二供体荧光团即EDANS在约340nm的吸收波长激发，其EDANS荧光强度的提高(在约490nm)表明存在有BoNT/B活性。类似地，当使用两种或多种不同的供体荧光团一起检测单个样品时，可将例如下列任意镧系元素结合起来：铽、镝、铕和钐(EG&GWallac)。所述镧系元素的光谱可根据衰变时间和波长清楚辨别。本领域的技术人员应理解可在第二供体荧光团激发之前，同时或之后激发第一供体荧光团，并且可在测定第二底物的能量传递之前、同时或之后测定第一底物的能量传递。
本发明方法涉及激发掺入细胞中梭菌毒素底物内的供体荧光团。本领域的技术人员应理解通常在供体荧光团的最佳吸收波长(激发波长)或其附近激发供体荧光团。作为一个实例，当供体荧光团是荧光素时，可在例如，488nm的最佳吸收波长或其附近激发供体。
梭菌毒素底物的蛋白酶解以及由此引起的梭菌毒素活性可通过多种途径探测，例如，通过探测供体荧光强度的提高、受体荧光强度的降低、从受体发射最大波长附近到供体荧光团发射最大波长附近的发射最大波长的位移、受体发射最大波长附近的荧光振幅与供体荧光团发射最大波长附近的荧光振幅的比值的降低、或供体荧光团激发态寿命的增大。应理解须在适宜的波长或波长范围内探测相应的荧光强度或激发态寿命。作为一个实例，当探测供体荧光强度时，适宜的波长为供体荧光团发射最大波长或其附近，或包括或接近供体荧光团发射最大波长的波长范围。
已经意识到，改变细胞中梭菌毒素底物的绝对量、激发强度以及激发波长处的浊度或其它背景吸收将大致平行地影响供体和受体荧光团的荧光强度。因此，应理解发射强度的比值不依赖于底物的绝对量、激发强度以及浊度或其它背景吸收，可成为梭菌毒素活性的有效指标。类似地，本领域的技术人员应理解供体荧光团的激发态寿命不依赖于底物的绝对量、激发强度以及浊度或其它背景吸收，可用于本发明的方法中。
在一例实施方案中，本发明方法通过探测供体荧光的强度实施，其中供体荧光强度的提高表示梭菌毒素活性。所述提高的强度可为，例如，未与样品接触的相同或相似细胞在相同波长下的荧光强度的至少两倍、三倍、五倍、十倍、二十倍或更多倍。
当探测供体荧光强度时，激发设在供体荧光团的吸收波长处，并对供体荧光团的发射光谱进行监控。通常会对供体荧光团的发射波长进行选择，观察到的受体荧光的贡献非常小或没有。受体的存在导致供体荧光淬灭。能量传递效率E由E＝1-IDA/ID计算，其中IDA和ID为有受体存在和无受体存在下的供体强度。两者均标准化为相同的供体荧光团浓度。如果需要，可进行不需要供体荧光团浓度的时间分辩测量(time resolved measurement)，采用E＝E＝1-{τDA}/τD，其中{τDA}和{τD}是供体荧光团在有受体存在和无受体存在下的振幅平均的寿命。
在一例实施方案中，本发明的实施通过探测从受体发射最大波长附近到供体荧光团发射最大波长附近的发射最大波长的位移作为共振能量传递的测定结果。作为一个实例，当四甲基若丹明受体与供体荧光团荧光素结合时，可探测从占优的红光发射谱线(predominantlyred emission)到占优的绿光发射谱线(predominantly greenemission)的位移作为共振能量传递降低的指标，从而测得梭菌毒素活性。应理解所观察到的发射最大波长的位移通常不是完整的位移，而仅有部分发射强度转移到供体荧光团发射最大波长附近。
在本发明的几种方法中，接触过的细胞的共振能量传递是相对于对照细胞测定的。所述对照细胞通常是与接触过的细胞相同或相似种类的细胞并在相同条件下生长但不与任何样品接触或与限定的阴性样品或限定的阳性样品接触。本领域的技术人员应理解多种对照细胞可用于本发明方法中，并且对照细胞可为阳性对照细胞或阴性对照细胞。对照细胞可为，例如，阴性对照细胞，如相似或相同的含有相同或相似梭菌毒素底物的细胞，所述细胞与已知缺乏活性梭菌毒素的相似的限定阴性样品接触或不与任何样品接触。对照细胞还可为，例如，阳性对照细胞，如含有梭菌毒素底物在切割位点蛋白酶解得到的两种切割产物中的一种或两种的细胞或含有相同或相似底物的细胞，所述细胞与已知包括活性梭菌毒素的限定阳性样品接触。阳性对照细胞包括含有供体荧光团的细胞，所述供体荧光团含有一种切割产物；含有受体的细胞，所述受体含有一种切割产物；以及含有两种切割产物的细胞。
本发明测定梭菌毒素活性的方法涉及含有梭菌毒素底物的细胞在与样品接触后，测定其相对于对照细胞的共振能量传递并且其实施可采用“固定时间”检测或连续时间检测。因此，在一例实施方案中，FRET检测在其后的一个或多个时间间隔内重复。荧光共振能量传递可在，例如，两个或以上、五个或以上、十个或以上、二十个或以上的不同时间测量。荧光强度和其它FRET的指标也可通过已熟知的方法连续探测(参考，例如，Wang等，supra，1993；Holskin等，supra，1995；以及Kakiuchi等，supra，1999)。
在本发明方法中，通常采用荧光计测量接触过的细胞的荧光。一般而言，激发源发出的具有第一波长的激发辐射穿过激发光学装置。激发光学装置使激发辐射激发细胞中的底物。作为响应，底物中的荧光团发出波长不同于激发波长的辐射。然后由光学采集装置采集发射光谱；如果需要，所述装置将包括温度控制器以在扫描时将细胞维持在特定温度。如果需要，多轴平移台可移动含有大量样品的微量滴定板以使不同的加样孔暴露出来。应理解可通过适宜的数字计算机管理多轴平移台、温度控制器、自动调焦特征，以及与成像和数据采集关联的电子装置。
还应理解本发明方法可为自动的或可设置为高通量或超高通量的模式，使用但不限于，96-孔、384-孔或1536-孔的加样板。作为一个实例，探测荧光发射可采用为96-孔的加样板检测(Schroeder等，J.Biomol.Screening，1：75～80(1996))所设计的Molecular DevicesFLIPR检测仪表系统(Molecular Devices；桑尼维尔，加利福尼亚)。FLIPR采用水冷却的488nm的氩离子激光(5瓦特)或氙弧光灯以及带有电荷耦合器件(CCD)照相机的半共焦最优系统为整个加样板照明并成像。FPM-2型96-孔加样板读出器(Folley Consulting and Research；Round Lake，伊利诺斯)也可在本发明方法中用于探测荧光发射。本领域的技术人员应理解所述的和其它具有适宜光谱兼容性的自动系统，例如ECLIPSE试管读出器(cuvette reader)(Varian-Cary；核桃溪市，加利福尼亚)和SPECTRAmax GEMINI XS(Molecular Devices)以及其它，如购自Perkin Elmer的系统均可用于本发明方法中。
本发明方法的实施，如果需要，可在体内进行；作为非限制性实例，本发明方法可在小鼠、大鼠、蠕虫或鱼的体内实施。在体内实施本发明方法测定梭菌毒素活性可通过(a)向动物给药含有释放剂和梭菌毒素底物的底物组合物，所述梭菌毒素底物包括一种供体荧光团；一种受体，该受体的吸收光谱与供体荧光团的发射光谱有重叠；一种梭菌毒素识别序列，该识别序列包括介于供体荧光团和受体之间的切割位点，其中共振能量传递在适当条件下表现于供体荧光团和受体之间；(b)用样品治疗动物；(c)激发供体荧光团；并(d)测定受治疗动物相对于对照动物的共振能量传递，其中与对照动物相比，受治疗动物共振能量传递的变化表示梭菌毒素活性。作为一个实例，基于HIVTAT的释放剂在体内表现出有效释放靶蛋白(Schwartz等，Science285：1.569～1572(1999))。在一例实施方案中，本发明的体内方法采用包括HIV TAT衍生释放剂的底物组合物实施。在另一例实施方案中，底物组合物给药到动物的脊髓中。在另一例实施方案中，通过两次或多次测定共振能量传递检测毒素活性的时间持久性。
本发明部分依赖于一种物理过程即FRET，能量由所述FRET从激发的供体荧光团通过分子内的远程偶极-偶极偶联作用非辐射地传递到可为另一种荧光团的受体。FRET依赖于供体荧光团和受体分子内间距的负六次幂，并且为了共振能量的有效传递，供体荧光团和受体应非常接近，例如，相距约10～约100。有效的能量传递依赖于供体荧光团和受体的光谱特征及其相对取向。对于10～100的有效传递，供体荧光团的量子产额通常为至少0.1，而受体的吸收系数通常为至少1000(参考Clegg，Current Opinion in Biotech.6：103～110(1995)；以及Selvin，Nature Structural Biol.7：730～734(2000))。
在可用于本发明的梭菌毒素底物中，经选择的供体荧光团和受体可在供体荧光团被激发时，使供体荧光团和受体表现出共振能量传递。选择供体荧光团/受体对时应考虑的一个因素是供体荧光团和受体之间的FRET效率。在一例实施方案中，在本发明所依赖的梭菌毒素底物中，供体荧光团和受体之间的FRET效率在最佳条件下为至少10％。在另一例实施方案中，在本发明所依赖的梭菌毒素底物中，供体荧光团和受体之间的FRET效率在最佳条件下为至少20％。在另一例实施方案中，在本发明所依赖的梭菌毒素底物中，供体荧光团和受体之间的FRET效率在最佳条件下为至少30％、40％、50％、60％、70％或80％。
如本领域中所熟知的，FRET效率依赖于供体荧光团和受体的间距及取向，如Frster方程所述，以及供体荧光团的荧光量子产额和与受体的高能重叠。具体而言，FRET效率的测定如下：
E＝1-FDA/FD＝1/(1+(R/R0)6)
其中FDA和FD分别是有受体存在和无受体存在下的供体荧光团的荧光强度，R是供体荧光团和受体之间的距离。
Frster半径(R0)表示共振能量传递为50％有效时的距离，即50％的激发供体荧光团通过FRET失活。Frster半径的大小依赖于供体荧光团的量子产额、受体的消光系数以及供体荧光团发射光谱与受体激发光谱的重叠程度。
R0＝[8.8×1023·κ2·n-4·QYD·J(λ)]1/6
其中，κ2＝偶极取向因子(范围为0～4；对于无规取向的供体和受体，κ2＝2/3)
QYD＝无受体存在时，供体的荧光量子产额
n＝折射率
J(λ)＝光谱重叠积分
     ＝∫εA(λ)·FD(λ)·λ4dλcm3M-1
其中εA＝受体的消光系数
FD＝供体的荧光发射强度作为总积分强度的分数(Frster，Ann.Physik 2：55～75(1948))。
各种供体荧光团/受体对的典型Frster半径值如下表B所示(还可参考，Wu和Brand，Analytical Biochem.218：1～13(1994))。本领域也已知有Frster半径的详尽列表(参考，例如，Berlman，Energy Transfer Parameters of Aromatic Compounds Academic Press，纽约1973)。此外，本领域的技术人员意识到Frster半径(R0)的分量因子依赖于环境，因此实际观察到的值可与所列值有偏差。
大量以多种方式组合的供体荧光团和受体可包括在本发明所用的梭菌毒素底物中。通常经选择的供体荧光团使得供体荧光团的发射光谱和受体的激发光谱之间基本有光谱重叠。此外，由于激光是一种激发供体荧光团的方便有效的途径，因此，应对供体荧光团进行选择，例如，使其发射最大波长落在方便使用的激光频率附近，如氦-镉442nm或氩气488nm。在一例实施方案中，受体部分发射光谱的波长最大值比供体荧光团激发光谱的波长最大值大至少10nm。在另一例实施方案中，受体是发射光谱落在可见光的红光部分中的荧光团。在另一例实施方案中，受体是发射光谱落在红外光谱区的荧光团。表B和C提供了多种供体荧光团-受体对及其Frster半径。还可参考，例如，Haugland，Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals第六版，Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon，1996。
表B
                 示例性的供体荧光团和受体
  供体荧光团   受体   R0()   参考文献
  荧光素   TMR   49～54   Johnson等， Biochemistry
荧光素EDANS萘IANBDIAEDANSDNSMIAEDANSε-A芘ANAIIAANSε-Aε-A QSY7DABCYL丹酰DDPMDDPMLYIANBDF2DNBBimaneIPMIAFF2DPSDDPM 6133222525～2926～3227～51293030313131   32：6402 6410(1993)；Odom等，Biochemistry 23：5069～5076(1984)--------Haas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72：1807～1811(1975)Kasprzyk等， Biochemistry 22：1877～1882(1983)Dalbey等， Biochemistry 22：4696～4706(1983)；Cheung等，Biophys.Che m.40：1～17(1991)Nalin等， Biochemistry 28：2318～2324(1985)Franzen等， Biochemistry19：6080～6089(1980)；First等， Biochemistr y 28：3606～3613(1989)Perkins等，J.Biol.Chem.259：8786～8793(1984)Borochov-Neori和MontalBiochemistry 28：1711～1718(1989)Peerce和Wright， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8092～8096(1986)Grossman， Biochim.Biophy s. Acta 1040：276～280(1990)Perkins等，supra，1984Miki和Mihashi， Biochim.Biophy.Act a.533：163～172(1978)
IAEDANSMNAPMFITCDANZNCPNAALYIAFIAFFMAPMmBBRmBBRεA芘 TNPDACMNBDTNP-ATPDABMCPMDNPTNP-ATPdiI-C18TMRFMADMAMSFITCDABMNBD香豆素 31～40323232343433～37353537373838383839   Takashi等，Biochemistry 21：5661～5668(1982)；dosRemedios和Cooke， Biochim.Biophys.Acta 788：193～205(1984)Amir和Haas，Biochemistr y 26：2162～2175(1987)Snyder和Hammes，Biochemistry24：2324～2331(1985)Amler等，Biophys.J.61：553～568(1992)Albaugh和Steiner，J.Phys.Chem.93：8013～8016(1989)Mitra和Hammes， Biochemistry28：3063～3069(1989)McWherter等，Biochemistry 25：1951～1963(1986)Nalin，supra，1985Shahrokh等， J.Biol.Chem.266：12082～12089(1991)Taylor等，J.Cell Biol.89：362～367(1981)Dissing等， Biochim.Biophy s.Acta 553：66～83(1979)Lin和Dowben， J.Biol.Che m.258：5142～5150(1983)Tompa和Batke， Biochem.In t.20：487～494(1990)Kasprzak等，Biochemistry 27：4512～4523(1988)Miki和Iio， Biochim.Biophy s. Act a 790：201～207(1984)Borochov-Neori和Montal，
IPMIAEDANSIAEDANSε-ANBDISA丹酰DANZFNAINBDIAFFITC原黄素CPMIAEDANSCPMIAEDANSIAF FNAIDABMTNP-ATPIANBDSRHTNPODRIAFEITCLRHEIAENAIETSCTNP-ATPIAF荧光素FITCTMR 3940404040～74424344～494545～704646464646～56474950   supra，1989Peerce和Wright，supra，1986Tao等， Biochemist ry 22：3059～3066(1983)Tao等，supra，1983Miki和Wahl， Biochim.Bioph ys. Acta 786：188～196(1984)Wolf等， Biochemistr y 31：2865～2873(1992)Jacobson和Colman，Biochemis try 23：3789～3799(1984)Lu等， J.Biol.Che m.264：12956～12962(1989)Cheung等， Biochemistry 21：5135～5142(1983)Peerce和Wright，supra，1986Wolf等，supra，1992Taylor等，supra，1981Peerce和Wright，supra，1986Robbins等，Biochemistry 20：5301～5309(1981)Snyder和Hammes，supra，1985Franzen，supra，1985；Grossman，supra，1990Thielen等，Biochemistry 23：6668～6674(1984)Jona等，Biochim.Biophys.A cta1028：183～199(1990)；Birmachu等，Biochemistry 28：3940～3947(1989)Shahrokh等，J.Biol.Chem .266：
CFCPMε-ACPMLYFITCIAEDANSIAFFITCFITCFITCBPE荧光素BODIBY FL TRTRSTNP-ATPFMEMEITCDiO-C14ErITCEMETSCErITCCY5荧光素BODIPY FL 51515152535457586061～64627244   12082～12089(1991)Johnson等，supra，1993Odom等，supra，1984dos Remedios和Cooke，supra，1984Odom等，supra，1984Shapiro等， J.Biol.Chem.266：17276～17285(1991)Carraway等， J.Biol.Chem.264：8699～8707(1989)Shahrokh等，supra，1991Amler等，supra，1992Kosk-Kosicka等， J.Biol.Chem.264：19495～19499(1989)Robbins等，supra，1981Amler等，supra，1992Ozinskas等， Anal.Bioche m.213：264～270(1993)--------
ANAI：2-蒽N-乙酰咪唑；
BPE：B-藻红蛋白；
CF：荧光素羧酸琥珀酰亚胺酯；
CPM：7-二甲氨基-3-(4’-马来酰亚胺苯基)-4-甲基香豆素；
CY5：羧甲基靛青-N-羟基琥珀酰亚胺酯；
diI-C18：1，1’-双十八烷基-3-3，3，3’，3’-四甲基-靛羰花青(indocarbocyanine)
diO-C14：3，3’-双十四烷基氧羰花青；
DABM：4-二甲氨基苯偶氮基-苯基-4’-马来酰亚胺；
DACM：(7-(二甲氨基)香豆素-4-基)-乙酰；
DANZ：丹酰氮丙叮；
DDPM：N-(4-二甲氨基-3，5-二硝基苯基)马来酰亚胺；
DMAMS：二甲氨基-4-马来酰亚胺芪；
DSMN：N-(2，5’-二甲氧基芪-4-基)-马来酰亚胺；
DNP：2，4-二硝基苯；
Figure C0382286200541
ε-A：1，N6-桥亚乙基腺苷；
EIA：5-(碘代乙酰胺基)伊红；
EITC：伊红-5-异硫氰酸盐；
ENAI：伊红N-乙酰咪唑；
EM：伊红马来酰亚胺；
ErITC：四碘荧光素-5’-异硫氰酸盐；
ETSC：伊红氨基硫脲；
F2DNB：1，5-二氟-2，4’-二硝基苯；
F2DPS：4，4’-二氟-3，3’-二硝基苯砜
FITC：荧光素氨基硫脲；
IAANS：2-(4’-碘代乙酰胺基)苯胺基)萘-6-磺酸
IAEDANS：5-(2-((碘代乙酰)氨基)乙基)氨基)-萘-1-磺酸；
IAF：5-碘代乙酰胺基荧光素；
IANBD：N-((2-(碘代乙酰氧基)乙基)-N-甲基)氨基-7-硝基苯基-2-氧-1，3-二唑；
IPM：3(4-异硫氰酸苯基)7-二乙基-4-氨基-4-甲基香豆素；
ISA：4-(碘代乙酰胺基)水杨酸；
LRH：丽丝胺若丹明；
LY：荧光黄；
mBBR：一溴代biamane
MNA：(2-甲氧基-1-萘基)-甲基；
NAA：2-萘氧基乙酸；
NBD：7-硝基-2，1，3-苯并噁二唑-4-基；
NCP：N-环己基-N’-(1-芘基)碳二亚胺；
ODR：十八烷基若丹明；
PM：N-(1-芘)-马来酰亚胺；
SRH：磺基若丹明；
TMR：四甲基若丹明；
TNP：三硝基苯；
TR：德克萨斯红。
诸如色氨酸或酪氨酸等芳族氨基酸也可作为供体荧光团用于本发明所述梭菌毒素底物、组合物和方法中。采用色氨酸或酪氨酸作为供体荧光团的示例性供体荧光团-受体对及其相应的Frster距离如下表C所示。经修饰的氨基酸也可用作本发明所使用的梭菌毒素底物中的供体荧光团或受体。所述荧光或淬灭修饰的氨基酸已知于本领域并包括，例如，荧光氨基酸L-芘基丙胺酸(Pya)和非荧光受体对硝基苯基丙胺酸(Nop)，例如，如Anne等，Analytical Biochem.291：253～261(2001)所述。
                   表C使用TRP作为供体的Frster距离
  供体   受体   R0()   参考文献
TrpTrpTrpTrpTrpTrpTrpTrpTrpTrpTrp Ru(III)(NH3)5硝基苯甲酰丹酰IAEDANSANS蒽氧(anthroyloxy)TNB蒽(anthroyl)Tyr-NO2芘血红素 12～1616212223242425262829   Recchia等， Biochim.Bioph ys. Acta 702：105～111(1982)Wiczk等， J.F luo 1：273～286(1991)Steinberg， Annu. Rev.Bio chem.40：83～114(1971)Matsumoto和Hammes，Biochemistry 14：214～224(1975)Conrad和Brand， Biochemistr y 7：777～787(1968)Wiczk等，supra，1991Wu和Brand， Biochemistr y 31：7939～7947(1992)Burgun等， Arch.Bioch em. Biophy s.286：394～401(1991)Steiner等， J.Fluo.1：15～22(1991)Vekshin， Mol.Biol.17：827～832(1983)Ladokhin等， Proc.SPIE 1640：
TrpTrpTrp NBSDNBSDPH 303340   562～569(1992)Wiczk等，supra，1991Wiczk等，supra，1991Le Doan等， Biochim.Biophy s. Acta 735：259～270(1983)
如上所述，应理解多种供体荧光团/受体对可包括在用于本发明的梭菌毒素底物中。可用于梭菌毒素底物中的供体荧光团-受体对可为，例如，与供体荧光团荧光素相结合的若丹明、德克萨斯红、伊红、ROX(6-羧基-X-若丹明，Applied Biosystems Division of Perkin-ElmerCorporation，福斯特，加利福尼亚)、或TAMRA(N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基-若丹明，Applied Biosystems)。可用于本发明的供体荧光团-受体对还可为，例如，供体荧光团卡斯卡特蓝与受体荧光素、供体荧光团BODIPY530/550(4，4-二氟-5，7-二苯基-4-硼-3a，4a-二氮-左旋-茚(indacene))与受体BODIPY542/563(4，4-二氟-5-对甲氧苯基-4-硼-3a，4a-二氮-左旋-茚)、或BODIPY542/563与受体BODIPY564/570(4，4-二氟-5-苯乙烯基-4-硼-3a，4a-二氮-左旋-茚)。应理解名称BODIPY后面的数字放映了分子的激发最大波长和发射最大波长；BODIPY化合物是从Molecular Probes(尤金市，俄勒冈州)购得的。
可用于本发明的梭菌毒素底物包括那些其中的供体荧光团是荧光素的。在一例实施方案中，梭菌毒素底物包括荧光素作为供体荧光团，而四甲基若丹明作为受体。所述底物可在480～505nm的范围内，如488或492nm处激发，并在520nm(荧光素的λem)、585nm(四甲基若丹明的λem)或上述两波长探测到发射光谱。在底物于梭菌毒素切割位点处被切割以前，四甲基若丹明的发射强度大于荧光素的发射强度；底物切割将改变荧光素与四甲基若丹明强度的比值。切割通常使荧光素成为占主导地位的发射荧光团。制备含有荧光素和四甲基若丹明的蛋白质和肽的方法已为本领域所熟知(参考，例如，Matsumoto等，Bioorg.Med.Chem.Letters 10：1857～1861(2000))。
可用于梭菌毒素底物的供体荧光团还可为，例如，EDANS(λAb为340nm，λEm为490nm)，它可与诸如DABCYL的受体结合。当梭菌毒素底物中结合的是DABCYL和EDANS时，能量在完整的底物中从EDANS供体荧光团传递到DABCYL受体，导致EDANS发射荧光淬灭。在毒素的切割位点切割后，切割的EDANS产物的荧光将增强，并可恢复到，例如，自由的供体荧光团水平。引起完整底物中有效荧光淬灭的原因在于EDANS发射光谱和DABCYL吸收光谱良好的高能重叠以及EDANS供体荧光团较长的激发态寿命(Wang等，Tetrahedron Lett.31：6493～6496(1991)；Holskin等， Anal.Biochem.226：148～155(1995)；以及Wang等， Anal.Biochem.210：351～359(1993))。
丹酰(DNS或5-二甲氨基萘-1-磺酰)也可用作梭菌毒素底物中的供体荧光团或受体。在一例实施方案中，梭菌毒素底物包括丹酰作为供体荧光团；丹酰供体可与，例如，硝基苯残基受体，如Phe(pNO2)结合，所述受体在邻近丹酰供体荧光团时作为淬灭剂。含有与例如硝基苯残基结合的丹酰供体荧光团的底物可按照，例如，如Florentin等，Anal.Biochem.141：62～69(1984)，或Goudreau等， Anal. Biochem.219：87～95(1994)所述的方法制备。在另一例实施方案中，梭菌毒素底物含有丹酰作为受体。丹酰受体当与，例如，诸如Trp(λex为290nm，λem为360nm)的供体荧光团结合时可作为淬灭剂。在含有Trp和丹酰的梭菌毒素底物中，60％的Trp荧光可通过能量传递淬灭到丹酰基，并且当毒素切割位点存在有毒素蛋白酶活性时，所述淬灭可显著降低或完全破坏(参考，例如，Geoghegan等， FEBS Letters262：119～122(1990))。
应理解具有充分分离的发射最大波长的供体-受体对可用于本发明的梭菌毒素底物中，并因此可用于本发明的底物组合物、细胞和方法中。充分分离的发射最大波长使得受体发射的改变可在无供体发射污染的情况下探测到。供体荧光团、或受体、或所述两者可在远红光区，例如，大于650nm发射。所述远红光发射的供体荧光团和受体包括青色素染料，如Cy5、Cy5.5和Cy7(Selvin，supra，2000)。在一例实施方案中，梭菌毒素底物包括Cy3和Cy5作为供体荧光团-受体对；Cy3最大发射在570nm，而Cy5最大发射在670nm。所述青色素染料可通过直接合成制备，例如，如Gruber等， Bioconj.Chem.11：161～166(2000)。
可用于梭菌毒素底物中的供体荧光团还可为，例如，镧系元素，又称为稀土元素的原子。诸如铽(Tb)、铕(Eu)、镝(Dy)和钐(Sm)等镧系元素具有非常尖(spiked)的波长，经激发脉冲后寿命可达毫秒，并且不极化，量子产额也高。镧系元素供体荧光团，如铽或铕鳌合物可与包括有机染料受体在内的多种受体结合。Eu鳌合物供体荧光团可与，例如别藻蓝素(APC)结合，而Tb鳌合物供体荧光团可与，例如四甲基若丹明结合。由直接激发引起的背景荧光可临时消除；有机受体的寿命通常仅在纳秒级，而敏化发射由供体荧光团的寿命而定并且在微秒级或毫秒级(参考Selvin，supra，2000)。因此，测定共振能量传递可在激发后较晚时间进行，即不确定的干扰荧光已逐渐消失后。镧系元素的鳌合物已为本领域所熟知并有市售，例如从EG&GWallc(土尔库，芬兰)购得。
可用于本发明的供体荧光团还可为已熟知的荧光团(7-甲氧香豆素-4-基)乙酰(Mca)，它可与诸如淬灭剂2，4-二硝基苯(Dnp)的受体结合。参考，例如，Kakiuchi等， J.Virol.Methods 80：77～84(1999)。当Mca与适宜的淬灭剂，如Dnp在梭菌毒素底物中结合时，经在梭菌毒素切割位点切割后，可探测到Mca(λem为393nm)发出的增强的供体发射荧光，并且该增强的供体发射荧光表示毒素的活性。
可用于本发明的供体荧光还可为，例如，2-氨苄基(Abz)，如果需要，它可与淬灭剂，如2，4-二硝基苯(Dnp)结合。在完整的梭菌毒素底物中，Dnp基通过共振能量传递使Abz基的荧光淬灭；底物的蛋白酶解切割使淬灭减缓并导致荧光与所释放的Abz片断的浓度成比例地提高。梭菌毒素底物在氨基端含有，例如Abz并且Dnp衍生的残基，如赖氨酸可通过常规方法制备，例如，如Le Bonniec等，Biochemistry 35：7114～7122(1996)所述。
可用于本发明的供体荧光团或受体还可为从Molecular Probes(尤金市，俄勒冈州)购得的Alexa Fluor染料。可用于本发明底物组合物、细胞和方法中的Alexa Fluor染料包括，例如，Alexa Fluor350、Alexa Fluor430、Alexa Fluor488、Alexa Fluor532、AlexaFluor546、Alexa Fluor568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor633、Alexa Fluor647、Alexa Fluor660和Alexa Fluor680。
可用于本发明的供体荧光团或受体还可为基因编码的染料(如上所示)。应理解基因编码的染料，如GFP、BFP、CFP或YFP相互之间，或可与其它适宜的供体荧光团或受体结合形成FRET对。在一例实施方案中，梭菌毒素底物包括基因编码的供体荧光团和基因编码的受体。
在另一例实施方案中，梭菌毒素底物包括的荧光团，其荧光寿命较长，为至少1微秒。由于杂质的荧光寿命相对较短，所述受体允许进行荧光发射的时间分辩测量并可提高信噪比。对于时间分辩的荧光，可用的供体荧光团/受体对可为，例如，铕穴合物供体荧光团，如铕-三联吡啶穴合物(TBP-EU3+，λEx为337nm)与105kDa的藻胆蛋白受体荧光团，别藻蓝蛋白结合(Sittampalam等， Curr.Opin.Chem.Biol.1：384～391(1997))。铕-三联吡啶穴合物具有两个联吡啶基团，所述基团捕捉光并将其引到位于笼状结构中的EU3+；上述供体荧光团的荧光寿命长，并在临近受体时，将能量非辐射地传递到别藻蓝蛋白，其在供体荧光团-受体距离大于9.5nm时，表现出大于50％的传递效率。TBP-EU3+和别藻蓝蛋白及其光谱特征在生物介质中非常稳定，并且别藻蓝蛋白在供体寿命较长时发射，从而可进行时间分辩的探测(Kolb等， J.BiomoJ.Screening 1：203～210(1996))。含有所述供体荧光团-受体对的底物的制备方法已为本领域所熟知，例如，如Kolb等，supra，1996和Sittampalam等，supra，1997所述。
在另一例实施方案中，本发明依赖于含有非荧光受体，某些情况下又称为“纯正淬灭剂”的梭菌毒素底物。非荧光受体可用于，例如，消除由受体直接(非敏化)激发引起的背景荧光。多种非荧光受体已为本领域所熟知包括，例如，DABCYL和QSY7染料(参考MolecularProbes，supra，1996)。
可用于本发明的梭菌毒素底物含有位于供体荧光团和受体之间的梭菌毒素切割位点。在一例实施方案中，供体荧光团位于切割位点的氨基端，而受体位于切割位点的羧基端。在另一例实施方案中，供体荧光团位于切割位点的羧基端，而受体位于切割位点的氨基端。
本领域的技术人员应理解有关本发明梭菌毒素底物中供体荧光团和受体的选择及其位置有几点需要考虑。供体荧光团和受体通常位于与底物干扰最小的位置，所述底物与梭菌毒素连接或被其酶解。因此，供体荧光团和受体的选择或位置可使，例如，对结合非常重要的键合或非键合作用的破坏最小，并同时使空间位阻最低。此外，受体和供体荧光团之间的空间距离通常是有限制的，以使能量从供体荧光团有效传递至受体。
在标准命名法中，梭菌毒素切割位点周围的序列被称为P5-P4-P3-P2-P1-P1’-P2’-P3’-P4’-P5’，其中P1-P1’代表易断裂的键。在具体的实施方案中，在本发明提供的底物组合物、细胞或方法所包括的梭菌毒素底物中，位于P1、P2、P3、P4、P5或P＞5的残基由与供体荧光团或受体共轭的氨基酸取代，而位于P1’、P2’、P3’、P4’、P5’或P＞5’的残基由与供体荧光团或受体共轭的氨基酸取代。在其它实施方案中，在本发明提供的底物组合物、细胞或方法所包括的梭菌毒素底物中，位于P1、P3、P4或P＞5的残基由与供体荧光团或受体共轭的氨基酸取代，而位于P2’、P3’、P5’或P＞5’的残基由与供体荧光团或受体共轭的氨基酸取代。还应理解与供体荧光团或受体共轭的残基的氨基酸侧链可与天然靶蛋白相应位置存在的残基相同，或含有，例如，不同的侧链。在本发明提供的另一种底物组合物、细胞或方法所包括的梭菌毒素底物中，位于P3、P4或P＞5的残基由与供体荧光团或受体共轭的氨基酸取代，而位于P2’、P3’、P5’或P＞5’的残基由与供体荧光团或受体共轭的氨基酸取代。同样的，与供体荧光团或受体共轭的残基的氨基酸侧链可与天然靶蛋白相应位置存在的残基相同，或含有，例如，不同的侧链。
如上所述，能量从供体荧光团传递至受体的效率部分依赖于，供体荧光团和受体分子的空间距离。随着供体荧光团和受体之间的距离增大，传递到受体的能量将降低，从而甚至在切割前增强供体的荧光信号。底物切割后，供体荧光团荧光产额总的提高依赖于多个因素，包括底物中供体荧光团和受体之间分开的距离、供体荧光团和受体的光谱重叠以及底物浓度。本领域的技术人员应理解，随着底物浓度的提高，即使发生蛋白酶解切割后，供体的分子内淬灭也可成为一个影响因素。上述现象称为“内滤光效应”(inner filter effect)。本领域的技术人员还应理解可对底物的细胞内浓度进行控制，例如，通过采用诱导型启动子或通过细胞所暴露底物的外部浓度。
Frster距离，即50％能量传递时供体荧光团和受体之间的距离，它代表了供体荧光团和受体之间的空间距离，并具有良好的敏感度。对于肽底物，在最舒展构象中，相邻残基之间相距约3.6。例如，计算出的荧光素/四甲基若丹明对的Frster距离为55，即表示荧光素和四甲基若丹明之间的空间距离在最舒展构象中为约15个残基。由于溶液中的肽和肽模拟物很少具有完全舒展的构象，因此供体荧光团和受体之间的距离大于根据每个残基3.6所计算出的结果，且仍保持在Frster距离之内，例如，在相距约50个氨基酸的供体-受体对之间发生FRET即说明了上述结果(Graham等， Analyt.Biochem.296：208～217(2001))。
Frster理论基于如下原则：供体荧光团和受体之间的作用非常微弱；光谱性质，如一种荧光团的吸收不因其它荧光团的存在而改变，并定义了理论有效的最短距离范围。应理解，对于很多供体荧光团-受体对，当供体荧光团和受体相距约10～100时，Frster理论都是有效的。然而，对于特殊的供体荧光团-受体对，Frster理论在10以下也是有效的，如亚皮秒技术所测定的(Kaschke和Ernsting，Ultrafast Phenomenon in Spectroscopy(Klose和Wilhelmi(Eds.))施普林格，柏林1990。
因此，在具体的实施方案中，在本发明提供的底物组合物、细胞或方法所包括的梭菌毒素底物中，供体荧光团和受体之间相距不超过100。在其它实施方案中，在本发明提供的底物组合物、细胞或方法所包括的梭菌毒素底物中，供体荧光团和受体之间相距不超过90、80、70、60、50、40、30或20。在其它的实施方案中，在本发明提供的底物组合物、细胞或方法所包括的梭菌毒素底物中，供体荧光团和受体之间相距10～100、10～80、10～60、10～40、10～20、20～100、20～80、20～60、20～40、40～100、40～80或40～60。在其它实施方案中，在本发明提供的底物组合物、细胞或方法所包括的梭菌毒素底物中，供体荧光团和受体相距最多6个残基、最多8个残基、最多10个残基、最多12个残基、最多15个残基、最多20个残基、最多25个残基、最多30个残基、最多35个残基、最多40个残基、最多45个残基、最多50个残基、最多60个残基、最多70个残基、最多80个残基、最多90个残基、最多100个残基、最多150个残基、最多200个残基或不超过天然梭菌毒素靶蛋白的完整长度。
本领域的技术人员应理解可用于本发明的梭菌毒素底物可设计为使FRET的效率以及探测蛋白酶活性的能力最优。本领域的技术人员应理解，如果需要可选择具有高量子产额的供体荧光团，并且如果需要，可选择具有高消光系数的受体以使Frster距离最大。本领域的技术人员还应理解直接激发受体产生的荧光很难与共振能量传递引起的荧光区分。因此，已意识到可选择激发光谱重叠较少的供体荧光团和受体，使供体在不引起受体直接激发的波长下激发。此外，还意识到可对用于本发明的梭菌毒素底物进行设计，使供体荧光团和受体发射光谱的重叠较小，从而易于区分所述两种发射光谱。如果需要，可选择具有高荧光量子产额的受体，所述受体方便用于将测得的受体荧光发射作为上述梭菌毒素活性的唯一指标或作为上述发射比率的一部分的情况。
应理解供体荧光团、受体或所述两者可位于肉毒梭菌或破伤风毒素全酶的活性部位腔中。本领域的技术人员应理解，如果需要，可对用于本发明的梭菌毒素底物进行设计，使供体荧光团、受体或所述两者在通过毒素结合时，排除在毒素全酶的活性部位腔外。作为一个实例，在梭菌毒素底物所包括的肉毒梭菌毒素底物或破伤风毒素底物中，供体荧光团、受体或所述两者在通过毒素结合时，被排除在毒素全酶的活性部位腔外。在本发明提供的，例如，底物组合物、细胞或方法所包括的BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G或TeNT底物中，供体荧光团、受体或所述两者在通过毒素结合时，被排除在毒素全酶的活性部位腔外。在一例实施方案中，BoNT/A底物含有至少六个包括Gln197-Arg198的人类SNAP-25残基，并且还包括位于残基Arg191-Met202外的供体荧光团、受体或所述两者，而上述残基Arg191-Met202可位于BoNT/A全酶的活性部位腔内。在另一例实施方案中，BoNT/B底物含有至少六个包括Gln76-Phe77的VAMP-2残基，并且还包括位于残基Leu70-Ala81外的供体荧光团、受体或所述两者，而上述残基Leu70-Ala81可位于BoNT/B全酶的活性部位腔内。
在VAMP底物与BoNT/B轻链(LC/B)的络合物中，几乎所有带侧链并含有氢键受体或供体的VAMP残基均与LC/B通过氢键键合。因此，应理解可用于本发明的梭菌毒素底物，如果需要，在其制备中，与对毒素切割敏感的天然蛋白相比，不应减小梭菌毒素底物中通过，例如，Ser、Thr、Tyr、Asp、Glu、Asn或Gln残基氢键键合的可能性。在具体的实施方案中，在本发明提供的底物组合物、细胞或方法所包括的梭菌毒素底物中，与对相应的梭菌毒素切割敏感的天然蛋白相比，未减小底物中氢键键合的可能性。
还应理解，除了供体荧光团、受体和梭菌毒素识别序列，可用于本发明的梭菌毒素底物还可任选地包括一种或多种其它组件。作为一个实例，柔性间隔序列，如GGGGS(序列号：40)可包括在用于本发明的梭菌毒素底物中。可用的梭菌毒素底物还可包括，但不限于，一种或多种下列组件：亲和标记物，如HIS6、生物素，或表位，如FLAG、血凝素(HA)、c-myc、或AU1；免疫球蛋白铰链区；N-羟基琥珀酰亚胺接头；肽或肽模拟物发夹转角(hairpin turn)；或亲水序列、或提高梭菌毒素底物溶解度或稳定性的其它组件或序列。
修饰蛋白质、肽或肽模拟物使其含有供体荧光团或受体的方法已为本领域所熟知(Fairclough和Cantor， Methods Enzymol.48：347～379(1978)；Glaser等， Chemical Modification of Proteins ElsevierBiochemical Press，阿姆斯特丹(1975)；Haugland， Excited States of Biopolymers(Steiner Ed.)29～58页，Plenum Press，纽约(1983)；Means and Feeney， Bioconjugate Chem.1：2～12(1990)；Matthews等， Methods Enzymol.208：468～496(1991)；Lundblad，Chemical Reagents for Protein Modification第二版，CRC Press，Boca Ratan，佛罗里达(1991)；Haugland，supra，1996)。多种基团可用于将供体荧光团或受体偶联到，例如，含有梭菌毒素识别序列肽或肽模拟物。例如硫醇基团即可用于将供体荧光团或受体偶联到肽或肽模拟物中的所需位置以制造可用于本发明底物组合物、细胞和方法中的梭菌毒素底物。在用于本发明的梭菌毒素底物的制备过程中，卤代乙酰和马来酰亚胺标记试剂也可用于偶联供体荧光团或受体(参考，例如，Wu和Brand，supra，1994)。
包括诸如GFP和别藻蓝蛋白等蛋白质的供体荧光团和受体可通过多种途径附着到梭菌毒素识别序列上。供体荧光团或受体可通过化学途径附着，例如，采用交联剂部分。交联剂已为本领域所熟知，包括同基和异基双官能交联剂，如BMH和SPDP。本领域的技术人员应理解仅含有供体荧光团的污染底物可产生高荧光背景。通过例如在梭菌毒素底物的制备过程中，使用比供体荧光团相对过量的受体可降低或消除上述背景。当供体荧光团或受体是蛋白质时，可采用本领域熟知的化学方法将分子特异性连接到蛋白质的氨基端或羧基端。参考，例如，Rees等， Protein Engineering：A Practical Approach(Eds)OxfordUniversity Press，1992中的“Chemical Approaches to ProteinEngineering”。
本领域已熟知梭菌毒素具有专一及独特的切割位点。BoNT/A切割Gln-Arg键；BoNT/B和TeNT切割Gln-Phe键；BoNT/C1切割Lys-Ala或Arg-Ala键；BoNT/D切割Lys-Leu键；BoNT/E切割Arg-Ile键；BoNT/F切割Gln-Lys键；而BoNT/G切割Ala-Ala键(参考表D)。在标准命名法中，梭菌毒素切割位点周围的序列被称为P5-P4-P3-P2-P1-P1’-P2’-P3’-P4’-P5’，其中P1-P1’代表易断裂的键。应理解P1或P1’位点或所述两者可由代替天然残基的其它氨基酸或氨基酸模拟物取代。作为一个实例，在制备BoNT/A底物的过程中，P1位置(Gln)修饰为丙氨酸、2-氨基丁酸或天冬酰胺残基；所述残基在P1-Arg键由BoNT/A水解(Schmidt和Bostian， J.Protein Chem.16：19～26(1997))。虽然已意识到可在易断裂的键即P1位置，如BoNT/A易断裂的键上引入取代，但同时还意识到P1残基的保守可能也是有利的(Vaidyanathan等， J.Neurochem.72：327～337(1999))。因此，在具体的实施方案中，本发明提供的底物组合物、细胞或方法依赖于具有梭菌毒素识别序列的梭菌毒素底物，在所述梭菌毒素识别序列中，相对于梭菌毒素切割的靶蛋白中的天然残基，P1’残基未经修饰或取代。在其它实施方案中，本发明提供的底物组合物、细胞或方法依赖于具有识别序列的梭菌毒素底物，在所述识别序列中，相对于梭菌毒素切割的靶蛋白中的天然残基，P1残基是经修饰或取代过的；上述梭菌毒素底物保留了对P1和P1’残基之间肽键切割的易感性。
                                表D
              人VAMP-2、SNAP-25或突触融合蛋白中切割的键
  毒素   靶   P4-P3-P2-P1-P1’-P2’-P3’-P4’
BoNT/ABoNT/BBoNT/C1BoNT/D SNAP-25VAMP-2突触融合蛋白VAMP-2   Glu-Ala-Asn-Gln-Arg*-Ala-Thr-Lys序列号：41Gly-Ala-Ser-Gln-Phe*-Glu-Thr-Ser序列号：42Asp-Thr-Lys-Lys-Ala*-Val-Lys-Tyr序列号：43Arg-Asp-Gln-Lys-Leu*-Ser-Glu-Leu
BoNT/EBoNT/FBoNT/GTeNT SNAP-25VAMP-2VAMP-2VAMP-2   序列号：44Gln-Ile-Asp-Arg-Ile*-Met-Glu-Lys序列号：45Glu-Arg-Asp-Gln-Lys*-Leu-Ser-Glu序列号：46Glu-Thr-Ser-Ala-Ala*-Lys-Leu-Lys序列号：47Gly-Ala-Ser-Gln-Phe*-Glu-Thr-Ser序列号：48
*易断裂的键用斜体表示
SNAP-25、VAMP和突触融合蛋白共享一个短基序，所述短基序位于预计将采用α螺旋构象的区中(参考图4)。所述基序存在于某些SNAP-25、VAMP和突触融合蛋白同工型中，上述同工型表达于对神经毒素敏感的动物中。相反的，对所述神经毒素具有耐受性的果蝇和酵母同系物以及胞吐作用不涉及的突触融合蛋白的同工型则在上述VAMP和突触融合蛋白的α螺旋基序区中含有序列变异。
α螺旋基序的多次重叠存在于对梭菌毒素切割敏感的蛋白质中：SNAP-25中天然存在有四个拷贝；VAMP中天然存在有两个拷贝；突触融合蛋白中天然存在有两个拷贝(如图4A所示)。并且，与α螺旋基序的特异序列相对应的肽可在体外和体内抑制神经毒素活性，并且所述肽可交叉抑制不同的神经毒素。此外，由所述肽引起的抗体可在三种靶蛋白之间交叉反应，这表明所述α螺旋基序是暴露在细胞表面上的，并且其在三种靶蛋白中采用的构象相似。与上述发现一致的是，SNAP-25特异性的、VAMP特异性的以及突触融合蛋白特异性的神经毒素虽然不会非特异性地切割靶，但它们相互之间通过竞争相同的结合部位交叉抑制。上述结果表明梭菌毒素识别序列如果需要，可包括，至少一种α螺旋基序。已意识到α螺旋基序对于梭菌毒素的切割并不是必须的，这已为下述的BoNT/A的十六聚体和十七聚体底物所证实。
虽然在天然SNAP-25、VAMP和突触融合蛋白的靶蛋白中发现了多重α螺旋基序，但可用于本发明底物组合物、细胞和方法的梭菌毒素识别序列可具有单个α螺旋基序。在具体的实施方案中，本发明所依赖的梭菌毒素识别序列包括两个或多个α螺旋基序。BoNT/A或BoNT/E识别序列可包括，例如，单独的S4α螺旋基序或与一个或多个其它的α螺旋基序相结合的S4α螺旋基序；BoNT/B、BoNT/G或TeNT识别序列可包括，例如，单独的V2α螺旋基序或与一个或多个其它的α螺旋基序相结合的V2α螺旋基序；BoNT/C1识别序列可包括，例如，单独的S4α螺旋基序或与一个或多个其它的α螺旋基序相结合的S4α螺旋基序，或单独的X2α螺旋基序或与一个或多个其它的α螺旋基序相结合的X2α螺旋基序；以及BoNT/D或BoNT/F识别序列可包括，例如，单独的V1α螺旋基序或与一个或多个其它的α螺旋基序相结合的V1α螺旋基序(如图4A所示)。
多种BoNT/A底物可用于本发明中。可用于本发明底物组合物、细胞和方法中的BoNT/A底物可包括，例如，至少六个相连的SNAP-25残基或其肽模拟物，其中六个相连的残基包括Gln-Arg。所述BoNT/A底物可具有，例如，至少六个相连的人类SNAP-25残基或其肽模拟物，其中六个相连的残基包括Gln197-Arg198。所述BoNT/A底物可包括，例如，氨基酸序列Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys(序列号：41)或，例如，人类SNAP-25的残基187～203(序列号：4)。BoNT/A底物如果需要还可包括羧基端酰胺。
这里所用的术语“肉毒梭菌毒素血清型A识别序列”与“BoNT/A识别序列”同义，表示一种易断裂的键及其相邻或不相邻的识别元件，所述键及识别元件在适宜于梭菌毒素蛋白酶活性的条件下可通过BoNT/A在易断裂的键上引起可探测到的蛋白酶解。BoNT/A切割的易断裂的键可为，例如Gln-Ala。
多种BoNT/A识别序列已为本领域所熟知并可用于本发明。BoNT/A识别序列可具有，例如，人类SNAP-25的残基134～206或残基137～206(Ekong等，supra，1997；美国专利No.5,962,637)。BoNT/A识别序列还可包括，但不限于，与人类SNAP-25的残基190～202相对应的序列Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met(序列号：49)或其肽模拟物；与人类SNAP-25的残基187～201相对应的序列Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys(序列号：50)或其肽模拟物；与人类SNAP-25的残基187～202相对应的序列Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met(序列号：51)或其肽模拟物；与人类SNAP-25的残基187～203相对应的序列Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met-Leu(序列号：52)或其肽模拟物；与人类SNAP-25的残基186～202相对应的序列Asp-Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met(序列号：53)或其肽模拟物；或与人类SNAP-25的残基186～203相对应的序列Asp-Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met-Leu(序列号：54)或其肽模拟物。参考，例如，Schmidt和Bostian， J.Protein.Chem.14：703～708(1995)；Schmidt和Bostian，Supra，1997；Schmidt等， FEBS Letters 435：61～64(1998)；以及Schmidt和Bostian，美国专利No.5,965,699。如果需要，类似的BoNT/A识别序列可由另一种对BoNT/A敏感的SNAP-25同工型或同系物的相应(同源)片断制备，例如，鼠科、大鼠、金鱼或纹斑鱼的SNAP-25或可为所述的或如美国专利No.5,965,699中的本领域已知的任何肽。
可用于本发明的BoNT/A识别序列可与对肉毒梭菌毒素血清型A切割敏感的蛋白质片断相应或基本与对BoNT/A敏感的蛋白质的片断相似。如表E所示，多种对BoNT/A切割敏感的天然蛋白质已为本领域所知晓并且包括，例如，人类、小鼠和大鼠的SNAP-25以及金鱼的SNAP-25A和SNAP-25B。因此，可用于本发明的BoNT/A识别序列可相应于，例如，人类的SNAP-25、小鼠的SNAP-25、大鼠的SNAP-25、金鱼的SNAP-25A或25B的片断，或对BoNT/A切割敏感的其它天然蛋白的片断。并且，比较由BoNT/A切割的天然SNAP-25氨基酸序列发现所述序列不是绝对保守的(如表E和图5所示)，这表明相对于对BoNT/A敏感的天然SNAP-25序列，可允许多种氨基酸取代和修饰存在于用于本发明的BoNT/A识别序列中。
                           表E
             SNAP-25及相关蛋白质的切割a、b、c、d
                            表E
              SNAP-25及相关蛋白质的切割a、b、c、d
a：SNAP-25的体外切割需要BoNT/C的浓度比BoNT/A或/E高100倍。
b：取代p182r或k185dd(黑框中的)引起对BoNT/E的易感性。
c：对BoNT/A的耐受性可能由v189(黑框中的)所取代的d189或e189引起。
d：注，电鳐对BoNT/A有易感性。
e：注，在假定的切割位点周围存在几种非保守突变。
与由相应梭菌毒素切割的天然序列相比，诸如BoNT/A底物的梭菌毒素底物可具有一种或多种修饰。作为一个实例，对应于人类SNAP-25的残基187～203的十七聚体，在BoNT/A底物中用Asn取代Asp193导致蛋白酶解的相对速度为0.23；用Gln取代Glu194导致相对速度为2.08；用2-氨基丁酸取代Ala195导致相对速度为0.38；用Asn、2-氨基丁酸或Ala取代Gln197导致相对速度分别为0.66、0.25或0.19(如表F所示)。此外，用2-氨基丁酸取代Ala199导致相对速度为0.79；用Ser或2-氨基丁酸取代Thr200导致相对速度分别为0.26或1.20；用Ala取代Lys201导致相对速度为0.12；以及用Ala或正亮氨酸取代Met202导致相对速度分别为0.38或1.20。参考Schmidt和Bostian，supra，1997。上述结果表明，与对毒素敏感的天然序列相比，梭菌毒素底物中的多种残基可被取代。对于BoNT/A而言，上述结果表明残基包括但不限于Glu194、Ala195、Gln197、Ala199、Thr200和Met202、Leu203、Gly204、Ser205和Gly206以及在易断裂的键Gln-Arg较远侧的残基可被取代或与本发明BoNT/A底物中的供体荧光团或受体共轭。在适宜于梭菌毒素蛋白酶活性的条件下，所述BoNT/A底物可通过BoNT/A在易断裂的键上引起可探测到的蛋白酶解。因此，相对于天然SANP-25序列，BoNT/A底物如果需要，可包括一种或多种氨基酸取代、加成或缺失。
                                表F
                    BoNT/A合成肽底物的动力学参数
  肽   序列a   序列号：   相对速度b
  [1-15][1-16][1-17]M16AM16XK15AT14ST14BA13BQ11A   SNKTRIDEANQRATKSNKTRIDEANQRATKMSNKTRIDEANQRATKMLSNKTRIDEANQRATK ALSNKTRIDEANQRATK XLSNKTRIDEANQRAT AMLSNKTRIDEANQRA SKMLSNKTRIDEANQRA BKMLSNKTRIDEANQR BTKMLSNKTRIDEAN ARATKML   66676869707172737475   0.031.171.000.381.200.120.261.200.790.19
  Q11BQ11NN10AA9BE8QD7N   SNKTRIDEAN BRATKMLSNKTRIDEAN NRATKMLSNKTRIDEA AQRATKMLSNKTRIDE BNQRATKMLSNKTRID QANQRATKMLSNKTRI NEANQRATKML   767778798081   0.250.660.060.382.080.23
a非标准氨基酸缩写有： B，2-氨基丁酸； X，2-氨基己酸(正亮氨酸)
b最初的水解速度相对于肽[1-17]。肽的浓度为1.0mM。
多种BoNT/B底物可用于本发明中。可用于本发明的BoNT/B底物可具有，例如，至少六个相连的VAMP残基或其肽模拟物，其中六个相连的残基包括Gln-Phe。作为一个实例，BoNT/B底物可含有至少六个相连的人类VAMP-2残基或其肽模拟物，所述六个相连的残基包括Gln76-Phe77。在一例实施方案中，所述BoNT/B底物包括，例如，氨基酸序列Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser(序列号：42)或其肽模拟物。在另一例实施方案中，BoNT/B底物包括人类VAMP-2(序列号：11)的残基55～94；人类VAMP-2(序列号：11)的残基60～94；或人类VAMP-2(序列号：11)的残基60～88或上述任一序列的肽模拟物。
这里所用的术语“肉毒梭菌毒素血清型B识别序列”与“BoNT/B识别序列”同义，表示一种易断裂的键及其相邻或不相邻的识别元件，所述键及识别元件在适宜条件下可通过BoNT/B在易断裂的键上引起可探测到的蛋白酶解。BoNT/B切割的易断裂的键可为，例如Gln-Phe。
多种BoNT/B识别序列已为本领域所熟知或可通过常规方法定义。所述BoNT/B识别序列可包括，例如，相应于诸如人类VAMP-1或人类VAMP-2等VAMP蛋白的某些或全部亲水核心的序列。BoNT/B识别序列包括但不限于，人类VAMP-2(序列号：11)的残基33～94、残基45～94、残基55～94、残基60～94、残基65～94、残基60～88或残基65～88或人类VAMP-1(序列号：10)的残基60～94。参考，例如， Eur.J. Biochem.217：965～971(1993)以及美国专利No.5,962,637。如果需要，类似的BoNT/B识别序列可由另一种对BoNT/B敏感的VAMP同工型或同系物的相应(同源)片断制备，例如人类VAMP-1或大鼠或小鸡的VAMP-2。
因此，应理解BoNT/B识别序列可相应于对肉毒梭菌毒素血清型B切割敏感的蛋白质片断或基本与对BoNT/B敏感的蛋白质的片断相似。如表G所示，多种对BoNT/B切割敏感的天然蛋白质已为本领域所知晓并且包括，例如，人类、小鼠和牛的VAMP-1和VAMP-2；大鼠的VAMP-2；大鼠的小细胞泡蛋白；小鸡的VAMP-2；电鳐的VAMP-1；海胆的VAMP；海兔的VAMP；乌贼的VAMP；秀丽新小杆线虫的VAMP；果蝇的n-syb；以及水蛭的VAMP。因此，包括在BoNT/B底物中的BoNT/B识别序列可相应于，例如，人类的VAMP-1或VAMP-2、小鼠的VAMP-1或VAMP-2、牛的VAMP-1或VAMP-2、大鼠的VAMP-2、大鼠的小细胞泡蛋白、小鸡的VAMP-2、电鳐的VAMP-1、海胆的VAMP、海兔的VAMP、乌贼的VAMP、秀丽新小杆线虫的VAMP、果蝇的n-syb、水蛭的VAMP片断或对BoNT/B切割敏感的其它天然蛋白质的片断。并且，如表G所示，比较由BoNT/B切割的天然VAMP氨基酸序列发现所述序列不是绝对保守的(如图6所示)，这表明可允许相对于天然VAMP序列的多种氨基酸取代和修饰存在于BoNT/B底物中，所述BoNT/B底物可用于，例如，本发明的BoNT/B底物组合物中。
多种BoNT/C1底物可用于本发明中。可用于本发明的BoNT/C1底物可具有，例如，至少六个相连的突触融合蛋白残基或其肽模拟物，其中六个相连的残基包括Lys-Ala。作为一个实例，BoNT/C1底物可具有至少六个相连的人类突触融合蛋白残基或其肽模拟物，所述六个相连的残基包括Lys253-Ala254。在一例实施方案中，所述BoNT/C1底物含有氨基酸序列Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Tyr(序列号：43)或其肽模拟物。
BoNT/C1底物还可含有，例如，至少六个相连的SNAP-25残基或其肽模拟物，其中六个相连的残基包括Arg-Ala。所述BoNT/C1底物可具有，例如，至少六个相连的人类SNAP-25残基或其肽模拟物，所述六个相连的残基包括Arg198-Ala199。在一例实施方案中，所述BoNT/C1底物含有人类SNAP-25(序列号：4)的残基93～202或其肽模拟物。
这里所用的术语“肉毒梭菌毒素血清型C1识别序列”与“BoNT/C1识别序列”同义，表示一种易断裂的键及其相邻或不相邻的识别元件，所述键及识别元件在适宜条件下可通过BoNT/C1在易断裂的键上引起可探测到的蛋白酶解。BoNT/C1切割的易断裂的键可为，例如Lys-Ala或Arg-Ala。
                             表G
                         VAMP的切割a、b
Figure C0382286200731
                            表G
                        VAMP的切割a、b
Figure C0382286200741
                           表G
                      VAMP的切割a、b
Figure C0382286200751
a：序列在位置93校正(f＞s)。
b：序列在位置68校正(t＞s)。
应理解BoNT/C1识别序列可相应于对肉毒梭菌毒素血清型C1切割敏感的蛋白质片断或基本与对BoNT/C1敏感的蛋白质的片断相似。如表H所示，多种对BoNT/C1切割敏感的天然蛋白质已为本领域所知晓并且包括，例如，人类、大鼠、小鼠和牛的突触融合蛋白1A和1B；大鼠的突触融合蛋白2和3；海胆的突触融合蛋白；海兔的突触融合蛋白1；乌贼的突触融合蛋白；果蝇的Dsynt1；以及水蛭的突触融合蛋白1。因此，可用于BoNT/C1底物中的BoNT/C1识别序列可相应于，例如，人类、大鼠、小鼠或牛的突触融合蛋白1A和1B、大鼠的突触融合蛋白2、大鼠的突触融合蛋白3、海胆的的突触融合蛋白、海兔的突触融合蛋白1、乌贼的突触融合蛋白、果蝇的Dsynt1、水蛭的突触融合蛋白1的片断或对BoNT/C1切割敏感的其它天然蛋白质的片断。并且，比较由BoNT/C1切割的天然突触融合蛋白的氨基酸序列发现所述序列不是绝对保守的(如表H和图7所示)，这表明相对于对BoNT/C1敏感的天然突触融合蛋白序列，可允许多种氨基酸取代和修饰存在于用于本发明的BoNT/C1底物中。
多种天然SNAP-25蛋白质也对BoNT/C1切割敏感，包括人类、小鼠和大鼠的SNAP-25；金鱼的SNAP-25A和SNAP-25B；果蝇和水蛭的SNAP-25。因此，可用于BoNT/C1底物中的BoNT/C1识别序列可相应于，例如，人类、小鼠和大鼠的SNAP-25、金鱼的SNAP-25A或SNAP-25B、电鳐的SNAP-25、纹斑鱼SNAP-25、果蝇的SNAP-25、水蛭的SNAP-25的片断，或对BoNT/C1切割敏感的其它天然蛋白的片断。如上所述，对于天然突触融合蛋白序列的变体，比较由BoNT/C1切割的天然SNAP-25氨基酸序列发现有显著的序列变异性(如上表E和图5所示)，这表明相对于对BoNT/C1敏感的天然SNAP-25序列，可允许多种氨基酸取代和修饰存在于用于本发明的BoNT/C1底物中。
本领域的技术人员应理解多种BoNT/D底物可用于本发明中。可用于本发明的BoNT/D底物可具有，例如，至少六个相连的VAMP残基或其肽模拟物，所述六个相连的残基包括Lys-Leu。在一例实施方案中，BoNT/D底物含有至少六个相连的人类VAMP残基或其肽模拟物，所述六个相连的残基包括Lys59-Leu60。在另一例实施方案中，BoNT/D底物含有氨基酸序列Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu(序列号：44)或其肽模拟物。在另一例实施方案中，BoNT/D底物包括大鼠VAMP-2(序列号：109)的残基27～116或其肽模拟物。
术语“肉毒梭菌毒素血清型D识别序列”与“BoNT/D识别序列”同义，表示一种易断裂的键及其相邻或不相邻的识别元件，所述键及识别元件在适宜条件下可通过BoNT/D在易断裂的键上引起可探测到的蛋白酶解。BoNT/D切割的易断裂的键可为，例如Lys-Leu。
                          表H
                  突触融合蛋白的切割
多种BoNT/D识别序列已为本领域所熟知或可通过常规方法定义。所述BoNT/D识别序列可包括，例如，大鼠VAMP-2(序列号：109；Yamasaki等， J.Biol.Chem.269：12764～12772(1994))的残基27～116、残基37～116、残基1～86、残基1～76或残基1～69。因此，BoNT/D识别序列可包括，例如，大鼠VAMP-2(序列号：109)的残基27～69或残基37～69。如果需要，类似的BoNT/D识别序列可由另一种对BoNT/D敏感的VAMP同工型或同系物的相应(同源)片断制备，例如人类VAMP-1或人类VAMP-2。
BoNT/D识别序列可相应于对肉毒梭菌毒素血清型D切割敏感的蛋白质片断或基本与对BoNT/D敏感的蛋白质的片断相似。如表H所示，多种对BoNT/D切割敏感的天然蛋白质已为本领域所知晓并且包括，例如，人类、小鼠和牛的VAMP-1和VAMP-2；大鼠的VAMP-1和VAMP-2；大鼠的小细胞泡蛋白；小鸡的VAMP-1和VAMP-2；电鳐的VAMP-1；海兔的VAMP；乌贼的VAMP；果蝇的syb和n-syb；以及水蛭的VAMP。因此，BoNT/D识别序列可相应于，例如，人类的VAMP-1或VAMP-2、小鼠的VAMP-1或VAMP-2、牛的VAMP-1或VAMP-2、大鼠的VAMP-1或VAMP-2、大鼠的小细胞泡蛋白、小鸡的VAMP-1或VAMP-2、电鳐的VAMP-1、海兔的VAMP、乌贼的VAMP、果蝇的syb或n-syb、水蛭的VAMP片断或对BoNT/D切割敏感的其它天然蛋白质的片断。并且，如上表H所示，比较由BoNT/D切割的天然VAMP氨基酸序列发现有显著的序列变异性(如图6所示)，这表明相对于对BoNT/D敏感的天然VAMP序列，可允许多种氨基酸取代和修饰存在于用于本发明的BoNT/D底物中。
多种BoNT/E底物可用于本发明中。BoNT/E底物可含有，例如，至少六个相连的SNAP-25残基或其肽模拟物，所述六个相连的残基包括Arg-Ile。所述BoNT/E底物可具有，例如，至少六个相连的人类SNAP-25残基或其肽模拟物，所述六个相连的残基包括Arg180-Ile181。在具体实施方案中，BoNT/E底物包括氨基酸序列Gln-Ile-Asp-Arg-Ile-Met-Glu-Lys(序列号：45)或其肽模拟物。在另一例实施方案中，BoNT/E底物包人类SNAP-25(序列号：4)的残基156～186或其肽模拟物。
这里所用的术语“肉毒梭菌毒素血清型E识别序列”与“BoNT/E识别序列”同义，表示一种易断裂的键及其相邻或不相邻的识别元件，所述键及识别元件在适宜条件下可通过BoNT/E在易断裂的键上引起可探测到的蛋白酶解。BoNT/E切割的易断裂的键可为，例如Arg-Ile。
本领域的技术人员应理解BoNT/E识别序列可相应于对肉毒梭菌毒素血清型E切割敏感的蛋白质片断或基本与对BoNT/E敏感的蛋白质的片断相似。多种对BoNT/E切割敏感的天然蛋白质已为本领域所知晓并且包括，例如，人类、小鼠和大鼠的SNAP-25；小鼠的SNAP-23；小鸡的SNAP-25；金鱼的SNAP-25A和SNAP-25B；纹斑鱼的SNAP-25；秀丽新小杆线虫的SNAP-25；以及水蛭的SNAP-25(参考表E)。因此，BoNT/E识别序列可相应于，例如，人类的SNAP-25、小鼠的SNAP-25、大鼠的SNAP-25、小鼠的SNAP-23、小鸡的SNAP-25、金鱼的SNAP-25A或25B、秀丽新小杆线虫的SNAP-25、以及水蛭的SNAP-25的片断或对BoNT/E切割敏感的其它天然蛋白质的片断。并且，如上表E和图5所示，比较由BoNT/E切割的天然SNAP-23和SNAP-25氨基酸序列发现所述序列不是绝对保守的，这表明相对于对BoNT/E敏感的天然SNAP-23和SNAP-25序列，可允许多种氨基酸取代和修饰存在于用于本发明的BoNT/E底物中。
多种BoNT/F底物可用于本发明中。所述BoNT/F底物可包括，例如，至少六个相连的VAMP残基或其肽模拟物，所述六个相连的残基包括Gln-Lys。在一例实施方案中，BoNT/F底物具有至少六个相连的人类VAMP残基或其肽模拟物，所述六个相连的残基包括Gln58-Lys59。在另一例实施方案中，BoNT/F底物包括大鼠VAMP-2(序列号：109)的残基27～116或其肽模拟物。在另一例实施方案中，BoNT/F底物包括氨基酸序列Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu(序列号：46)或其肽模拟物。
这里所用的术语“肉毒梭菌毒素血清型F识别序列”与“BoNT/F识别序列”同义，表示一种易断裂的键及其相邻或不相邻的识别元件，所述键及识别元件在适宜条件下可通过BoNT/F在易断裂的键上引起可探测到的蛋白酶解。BoNT/F切割的易断裂的键可为，例如Gln-Lys。
多种BoNT/F识别序列已为本领域所熟知或可通过常规方法定义。所述BoNT/F识别序列可包括，例如，大鼠VAMP-2(序列号：109；Yamasaki等，supra，1994)的残基27～116、残基37～116、残基1～86、残基1～76或残基1～69。BoNT/F识别序列还可包括，例如，大鼠VAMP-2(序列号：109)的残基27～69或残基37～69。应理解如果需要，类似的BoNT/F识别序列可由另一种对BoNT/F敏感的VAMP同工型或同系物的相应(同源)片断制备，例如人类VAMP-1或人类VAMP-2。
BoNT/F识别序列可相应于对肉毒梭菌毒素血清型F切割敏感的蛋白质片断或基本与对BoNT/F敏感的蛋白质片断相似。多种对BoNT/F切割敏感的天然蛋白质已为本领域所知晓并且包括，例如，人类、小鼠和牛的VAMP-1和VAMP-2；大鼠的VAMP-1和VAMP-2；大鼠的小细胞泡蛋白；小鸡的VAMP-1和VAMP-2；电鳐的VAMP-1；海兔的VAMP；果蝇的syb；以及水蛭的VAMP(如表H所示)。因此，BoNT/F识别序列可相应于，例如，人类的VAMP-1或VAMP-2、小鼠的VAMP-1或VAMP-2、牛的VAMP-1或VAMP-2、大鼠的VAMP-1或VAMP-2、大鼠的小细胞泡蛋白、小鸡的VAMP-1或VAMP-2、电鳐的VAMP-1、海兔的VAMP、果蝇的syb、水蛭的VAMP片断或对BoNT/F切割敏感的其它天然蛋白质的片断。并且，如上表H所示，比较由BoNT/F切割的天然VAMP氨基酸序列发现所述序列不是绝对保守的(如图6所示)，这表明相对于对BoNT/F敏感的天然VAMP序列，可允许多种氨基酸取代和修饰存在于用于本发明的BoNT/F底物中。
对于其它梭菌毒素底物，多种BoNT/G底物可用于本发明中。可用于本发明的BoNT/G底物可具有，例如，至少六个相连的VAMP残基或其肽模拟物，所述六个相连的残基包括Ala-Ala。所述BoNT/G底物可具有，例如，至少六个相连的人类VAMP残基或其肽模拟物，所述六个相连的残基包括Ala83-Ala84。在另一例实施方案中，BoNT/G底物含有氨基酸序列Glu-Thr-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys(序列号：47)或其肽模拟物。
这里所用的术语“肉毒梭菌毒素血清型G识别序列”与“BoNT/G识别序列”同义，表示一种易断裂的键及其相邻或不相邻的识别元件，所述键及识别元件在适宜条件下可通过BoNT/G在易断裂的键上引起可探测到的蛋白酶解。BoNT/G切割的易断裂的键可为，例如Ala-Ala。
BoNT/G识别序列可相应于对肉毒梭菌毒素血清型G切割敏感的蛋白质片断或基本与对BoNT/G敏感的蛋白质片断相似。如上表H所示，多种对BoNT/G切割敏感的天然蛋白质已为本领域所知晓并且包括，例如，人类、小鼠和牛的VAMP-1和VAMP-2；大鼠的VAMP-1和VAMP-2；大鼠的小细胞泡蛋白；小鸡的VAMP-1和VAMP-2；电鳐的VAMP-1。因此，BoNT/G识别序列可相应于，例如，人类的VAMP-1或VAMP-2、小鼠的VAMP-1或VAMP-2、牛的VAMP-1或VAMP-2、大鼠的VAMP-1或VAMP-2、大鼠的小细胞泡蛋白、小鸡的VAMP-1或VAMP-2、电鳐的VAMP-1片断或对BoNT/G切割敏感的其它天然蛋白质的片断。并且，如上表H所示，比较由BoNT/G切割的天然VAMP氨基酸序列发现所述序列不是绝对保守的(如图6所示)，这表明相对于对BoNT/G敏感的天然VAMP序列，可允许多种氨基酸取代和修饰存在于用于本发明的BoNT/G底物中。
多种TeNT底物可用于这里公开的组合物和方法中。可用于本发明的TeNT底物可具有，例如，至少六个相连的VAMP残基或其肽模拟物，所述六个相连的残基包括Gln-Phe。作为一个实例，TeNT底物可具有至少六个相连的人类VAMP-2残基或其肽模拟物，所述六个相连的残基包括Gln76-Phe77。在一例实施方案中，TeNT底物含有，例如，氨基酸序列Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser(序列号：48)或其肽模拟物。在另一例实施方案中，TeNT底物含有人类VAMP-2(序列号：11)的残基33～94；人类VAMP-2(序列号：11)的残基25～93；或大鼠VAMP-2(序列号：109)的残基27～116或上述任一序列的肽模拟物。
这里所用的术语“肉毒梭菌毒素识别序列”表示一种易断裂的键及其相邻或不相邻的识别元件，所述键及识别元件在适宜条件下可通过肉毒梭菌毒素在易断裂的键上引起可探测到的蛋白酶解。TeNT切割的易断裂的键可为，例如Gln-Phe。
多种TeNT识别序列已为本领域所熟知或可通过常规方法定义并且包括对诸如人类VAMP-1或人类VAMP-2等VAMP蛋白的某些或全部亲水核心有响应的序列。TeNT识别序列可包括，例如，人类VAMP-2(序列号：11；Cornille等， Eur.J.Biochem.222：173～181(1994)；Foran等， Biochem.33：15365～15374(1994))的残基25～93或残基33～94；或大鼠VAMP-2(序列号：109；Yamasaki等，supra，1994)的残基51～93或残基1～86；或人类VAMP-1(序列号：10)的残基33～94。TeNT识别序列还可包括，例如，人类VAMP-2(序列号：11)或大鼠VAMP-2(序列号：109)的残基25～86、残基33～86或残基51～86。应理解如果需要，类似的TeNT识别序列可由另一种对TeNT敏感的VAMP同工型或物种同系物的相应(同源)片断制备，例如人类VAMP-1或海胆或海兔的VAMP。
因此，TeNT识别序列可相应于对肉毒梭菌毒素切割敏感的蛋白质片断或基本与对TeNT敏感的蛋白质片断相似。如上表H所示，多种对TeNT切割敏感的天然蛋白质已为本领域所知晓并且包括，例如，人类、小鼠和牛的VAMP-1和VAMP-2；大鼠的VAMP-2；大鼠的小细胞泡蛋白；小鸡的VAMP-2；电鳐的VAMP-1；海胆的VAMP；海兔的VAMP；乌贼的VAMP；秀丽新小杆线虫的VAMP；果蝇的n-syb；以及水蛭的VAMP。因此，TeNT识别序列可相应于，例如，人类的VAMP-1或VAMP-2、小鼠的VAMP-1或VAMP-2、牛的VAMP-1或VAMP-2、大鼠的VAMP-2、大鼠的小细胞泡蛋白、小鸡的VAMP-2、电鳐的VAMP-1、海胆的VAMP、海兔的VAMP、乌贼的VAMP、秀丽新小杆线虫的VAMP、果蝇的n-syb、水蛭的VAMP片断或对TeNT切割敏感的其它天然蛋白质的片断。并且，比较由TeNT切割的天然VAMP氨基酸序列发现所述序列不是绝对保守的(如表H和图6所示)，这表明相对于对TeNT敏感的天然VAMP序列，可允许多种氨基酸取代和修饰存在于用于本发明的TeNT底物中。
可用于本发明底物组合物、细胞或方法中的梭菌毒素底物可包括一个或多个针对相同或不同的梭菌毒素的梭菌毒素切割位点。在具体的实施方案中，本发明提供的底物组合物、细胞或方法中的梭菌毒素底物含有单个梭菌毒素切割位点。在其它实施方案中，本发明提供的底物组合物、细胞或方法中的梭菌毒素底物含有多个针对相同梭菌毒素的切割位点。所述切割位点可伴有相同或不同的梭菌毒素识别序列。作为一个实例，本发明底物组合物所包括的梭菌毒素底物具有多个针对相同梭菌毒素的介于相同的供体荧光团和受体之间的切割位点。可用于本发明底物组合物、细胞或方法中的梭菌毒素底物可含有针对相同梭菌毒素的，例如，两个或以上、三个或以上、五个或以上、或十个或以上的切割位点。可用于本发明的梭菌毒素底物可含有针对相同梭菌毒素的，例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个切割位点；多个切割位点可介于相同或不同的供体荧光团-受体对之间。
可用于本发明底物组合物、细胞或方法中的梭菌毒素底物可含有针对不同梭菌毒素的切割位点和识别序列。在具体的实施方案中，本发明提供的底物组合物、细胞或方法中的梭菌毒素底物包括针对不同梭菌毒素的多个均介于相同供体荧光团-受体对之间的切割位点。本发明底物组合物、细胞或方法所包括的梭菌毒素底物对于两个或以上、三个或以上、或五个或以上的不同梭菌毒素均具有，例如，介于相同供体荧光团-受体对之间的切割位点。本发明底物组合物、细胞或方法所包括的梭菌毒素底物对于两个或以上、三个或以上、或五个或上的不同梭菌毒素的切割位点介于，例如，至少两个供体荧光团-受体对之间。在具体的实施方案中，本发明提供的底物组合物、细胞或方法所包括的梭菌毒素底物对于两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个不同的梭菌毒素具有切割位点，其中所述切割位点介于相同或不同的供体荧光团-受体对之间。在其它实施方案中，本发明提供的底物组合物、细胞或方法中的梭菌毒素底物对于下列梭菌毒素的任意组合具有，例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个切割位点的任意组合：BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G和TeNT。
上面以圆括号或其它方式提供的所有期刊文章、参考文献和专利引用，不论先前申明与否，均以援引方式完整纳入本申请。
虽然已结合上面提供的实施例描述了本发明，但应理解在不偏离本发明精神的情况下，可对其进行各种改进。相应地，本发明仅受权利要求的限制。
                               序列表
<110>E.费尔南德斯-萨拉斯
     L.E.斯图尔德
     K.R.奥基
<120>基于细胞的荧光共振能量传递(FRET)检测梭菌毒素
<130>P-AR 4804
<160>109
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>1
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
 1               5                  10                  15
<210>2
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>2
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
 1               5                  10
<210>3
<211>301
<212>PRT
<213>人类疱疹病毒1
<400>3
Met Thr Ser Arg Arg Ser Val Lys Ser Gly Pro Arg Glu Val Pro Arg
 1               5                  10                  15
Asp Glu Tyr Glu Asp Leu Tyr Tyr Thr Pro Ser Ser Gly Met Ala Ser
            20                  25                  30
Pro Asp Ser Pro Pro Asp Thr Ser Arg Arg Gly Ala Leu Gln Thr Arg
        35                  40                  45
Ser Arg Gln Arg Gly Glu Val Arg Phe Val Gln Tyr Asp Glu Ser Asp
    50                  55                  60
Tyr Ala Leu Tyr Gly Gly Ser Ser Ser Glu Asp Asp Glu His Pro Glu
65                  70                  75                  80
Val Pro Arg Thr Arg Arg Pro Val Ser Gly Ala Val Leu Ser Gly Pro
                85                  90                  95
Gly Pro Ala Arg Ala Pro Pro Pro Pro Ala Gly Ser Gly Gly Ala Gly
            100                 105                 110
Arg Thr Pro Thr Thr Ala Pro Arg Ala Pro Arg Thr Gln Arg Val Ala
        115                 120                 125
Thr Lys Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Thr Thr Arg Gly Arg Lys
    130                 135                 140
Ser Ala Gln Pro Glu Ser Ala Ala Leu Pro Asp Ala Pro Ala Ser Thr
145                 150                 155                 160
Ala Pro Thr Arg Ser Lys Thr Pro Ala Gln Gly Leu Ala Arg Lys Leu
                165                 170                 175
His Phe Ser Thr Ala Pro Pro Asn Pro Asp Ala Pro Trp Thr Pro Arg
            180                 185                 190
Val Ala Gly Phe Asn Lys Arg Val Phe Cys Ala Ala Val Gly Arg Leu
        195                 200                 205
Ala Ala Met His Ala Arg Met Ala Ala Val Gln Leu Trp Asp Met Ser
    210                 215                 220
Arg Pro Arg Thr Asp Glu Asp Leu Asn Glu Leu Leu Gly Ile Thr Thr
225                 230                 235                 240
Ile Arg Val Thr Val Cys Glu Gly Lys Asn Leu Leu Gln Arg Ala Asn
                245                 250                 255
Glu Leu Val Asn Pro Asp Val Val Gln Asp Val Asp Ala Ala Thr Ala
            260                 265                 270
Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr Glu Arg Pro Arg Ala
        275                 280                 285
Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro Val Glu
    290                 295                 300
<210>4
<211>206
<212>PRT
<213>人类
<400>4
Met Ala Glu Asp Ala Asp Met Arg Asn Glu Leu Glu Glu Met Gln Arg
 1               5                  10                  15
Arg Ala Asp Gln Leu Ala Asp Glu Ser Leu Glu Ser Thr Arg Arg Met
            20                  25                  30
Leu Gln Leu Val Glu Glu Ser Lys Asp Ala Gly Ile Arg Thr Leu Val
        35                  40                  45
Met Leu Asp Glu Gln Gly Glu Gln Leu Glu Arg Ile Glu Glu Gly Met
    50                  55                  60
Asp Gln Ile Asn Lys Asp Met Lys Glu Ala Glu Lys Asn Leu Thr Asp
65                  70                  75                  80
Leu Gly Lys Phe Cys Gly Leu Cys Val Cys Pro Cys Asn Lys Leu Lys
                85                  90                  95
Ser Ser Asp Ala Tyr Lys Lys Ala Trp Gly Asn Asn Gln Asp Gly Val
            100                 105                 110
Val Ala Ser Gln Pro Ala Arg Val Val Asp Glu Arg Glu Gln Met Ala
        115                 120                 125
Ile Ser Gly Gly Phe Ile Arg Arg Val Thr Asn Asp Ala Arg Glu Asn
    130                 135                 140
Glu Met Asp Glu Asn Leu Glu Gln Val Ser Gly Ile Ile Gly Asn Leu
145                 150                 155                 160
Arg His Met Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg
                165                 170                 175
Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp Ser Asn Lys Thr Arg Ile
            180                 185                 190
Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser Gly
        195                 200                 205
<210>5
<211>206
<212>PRT
<213>小鼠
<400>5
Met Ala Glu Asp Ala Asp Met Arg Asn Glu Leu Glu Glu Met Gln Arg
 1               5                  10                  15
Arg Ala Asp Gln Leu Ala Asp Glu Ser Leu Glu Ser Thr Arg Arg Met
            20                  25                  30
Leu Gln Leu Val Glu Glu Ser Lys Asp Ala Gly Ile Arg Thr Leu Val
        35                  40                  45
Met Leu Asp Glu Gln Gly Glu Gln Leu Glu Arg Ile Glu Glu Gly Met
    50                  55                  60
Asp Gln Ile Asn Lys Asp Met Lys Glu Ala Glu Lys Asn Leu Thr Asp
65                  70                  75                  80
Leu Gly Lys Phe Cys Gly Leu Cys Val Cys Pro Cys Asn Lys Leu Lys
                85                  90                  95
Ser Ser Asp Ala Tyr Lys Lys Ala Trp Gly Asn Asn Gln Asp Gly Val
            100                 105                 110
Val Ala Ser Gln Pro Ala Arg Val Val Asp Glu Arg Glu Gln Met Ala
        115                 120                 125
Ile Ser Gly Gly Phe Ile Arg Arg Val Thr Asn Asp Ala Arg Glu Asn
    130                 135                 140
Glu Met Asp Glu Asn Leu Glu Gln Val Ser Gly Ile Ile Gly Asn Leu
145                 150                 155                 160
Arg His Met Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg
                165                 170                 175
Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp Ser Asn Lys Thr Arg Ile
            180                 185                 190
Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser Gly
        195                 200                 205
<210>6
<211>212
<212>PRT
<213>果蝇
<400>6
Met Pro Ala Asp Pro Ser Glu Glu Val Ala Pro Gln Val Pro Lys Thr
 1               5                  10                  15
Glu Leu Glu Glu Leu Gln Ile Asn Ala Gln Gly Val Ala Asp Glu Ser
            20                  25                  30
Leu Glu Ser Thr Arg Arg Met Leu Ala Leu Cys Glu Glu Ser Lys Glu
        35                  40                  45
Ala Gly Ile Arg Thr Leu Val Ala Leu Asp Asp Gln Gly Glu Gln Leu
    50                  55                  60
Asp Arg Ile Glu Glu Gly Met Asp Gln Ile Asn Ala Asp Met Arg Glu
65                  70                  75                  80
Ala Glu Lys Asn Leu Ser Gly Met Glu Lys Cys Cys Gly Ile Cys Val
                85                  90                  95
Leu Pro Cys Asn Lys Ser Gln Ser Phe Lys Glu Asp Asp Gly Thr Trp
            100                 105                 110
Lys Gly Asn Asp Asp Gly Lys Val Val Asn Asn Gln Pro Gln Arg Val
        115                 120                 125
Met Asp Asp Arg Asn Gly Met Met Ala Gln Ala Gly Tyr Ile Gly Arg
    130                 135                 140
Ile Thr Asn Asp Ala Arg Glu Asp Glu Met Glu Glu Asn Met Gly Gln
145                 150                 155                 160
Val Asn Thr Met Ile Gly Asn Leu Arg Asn Met Ala Leu Asp Met Gly
                165                 170                 175
Ser Glu Leu Glu Asn Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Asn Arg Lys
            180                 185                 190
Gly Glu Ser Asn Glu Ala Arg Ile Ala Val Ala Asn Gln Arg Ala His
        195                 200                 205
Gln Leu Leu Lys
    210
<210>7
<211>203
<212>PRT
<213>金鱼
<400>7
Met Ala Asp Glu Ala Asp Met Arg Asn Glu Leu Thr Asp Met Gln Ala
 1               5                  10                  15
Arg Ala Asp Gln Leu Gly Asp Glu Ser Leu Glu Ser Thr Arg Arg Met
            20                  25                  30
Leu Gln Leu Val Glu Glu Ser Lys Asp Ala Gly Ile Arg Thr Leu Val
        35                  40                  45
Met Leu Asp Glu Gln Gly Glu Gln Leu Glu Arg Ile Glu Glu Gly Met
    50                  55                  60
Asp Gln Ile Asn Lys Asp Met Lys Glu Ala Glu Lys Asn Leu Thr Asp
65                  70                  75                  80
Leu Gly Asn Leu Cys Gly Leu Cys Pro Cys Pro Cys Asn Lys Leu Lys
                85                  90                  95
Gly Gly Gly Gln Ser Trp Gly Asn Asn Gln Asp Gly Val Val Ser Ser
            100                 105                 110
Gln Pro Ala Arg Val Val Asp Glu Arg Glu Gln Met Ala Ile Ser Gly
        115                 120                 125
Gly Phe Ile Arg Arg Val Thr Asn Asp Ala Arg Glu Asn Glu Met Asp
    130                 135                 140
Glu Asn Leu Glu Gln Val Gly Ser Ile Ile Gly Asn Leu Arg His Met
145                 150                 155                 160
Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg Gln Ile Asp
                165                 170                 175
Arg Ile Met Asp Met Ala Asp Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala
            180                 185                 190
Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser Gly
        195                 200
<210>8
<211>212
<212>PRT
<213>海胆
<400>8
Met Glu Asp Gln Asn Asp Met Asn Met Arg Ser Glu Leu Glu Glu Ile
 1               5                  10                  15
Gln Met Gln Ser Asn Met Gln Thr Asp Glu Ser Leu Glu Ser Thr Arg
            20                  25                  30
Arg Met Leu Gln Met Ala Glu Glu Ser Gln Asp Met Gly Ile Lys Thr
        35                  40                  45
Leu Val Met Leu Asp Glu Gln Gly Glu Gln Leu Asp Arg Ile Glu Glu
    50                  55                  60
Gly Met Asp Gln Ile Asn Thr Asp Met Arg Glu Ala Glu Lys Asn Leu
65                  70                  75                  80
Thr Gly Leu Glu Lys Cys Cys Gly Ile Cys Val Cys Pro Trp Lys Lys
                85                  90                  95
Leu Gly Asn Phe Glu Lys Gly Asp Asp Tyr Lys Lys Thr Trp Lys Gly
            100                 105                 110
Asn Asp Asp Gly Lys Val Asn Ser His Gln Pro Met Arg Met Glu Asp
        115                 120                 125
Asp Arg Asp Gly Cys Gly Gly Asn Ala Ser Met Ile Thr Arg Ile Thr
    130                 135                 140
Asn Asp Ala Arg Glu Asp Glu Met Asp Glu Asn Leu Thr Gln Val Ser
145                 150                 155                 160
Ser Ile Val Gly Asn Leu Arg His Met Ala Ile Asp Met Gln Ser Glu
                165                 170                 175
Ile Gly Ala Gln Asn Ser Gln Val Gly Arg Ile Thr Ser Lys Ala Glu
            180                 185                 190
Ser Asn Glu Gly Arg Ile Asn Ser Ala Asp Lys Arg Ala Lys Asn Ile
        195                 200                 205
Leu Arg Asn Lys
    210
<210>9
<211>249
<212>PRT
<213>鸡
<400>9
Met Ala Glu Asp Ala Asp Met Arg Asn Glu Leu Glu Glu Met Gln Arg
 1               5                  10                  15
Arg Ala Asp Gln Leu Ala Asp Glu Ser Leu Glu Ser Thr Arg Arg Met
            20                  25                  30
Leu Gln Leu Val Glu Glu Ser Lys Asp Ala Gly Ile Arg Thr Leu Val
        35                  40                  45
Met Leu Asp Glu Gln Gly Glu Gln Leu Asp Arg Val Glu Glu Gly Met
    50                  55                  60
Asn His Ile Asn Gln Asp Met Lys Glu Ala Glu Lys Asn Leu Lys Asp
65                  70                  75                  80
Leu Gly Lys Cys Cys Gly Leu Phe Ile Cys Pro Cys Asn Lys Leu Lys
                85                  90                  95
Ser Ser Asp Ala Tyr Lys Lys Ala Trp Gly Asn Asn Gln Asp Gly Val
            100                 105                 110
Val Ala Ser Gln Pro Ala Arg Val Val Asp Glu Arg Glu Gln Met Ala
        115                 120                 125
Ile Ser Gly Gly Phe Ile Arg Arg Val Thr Asn Asp Ala Arg Glu Asn
    130                 135                 140
Glu Met Asp Glu Asn Leu Glu Gln Val Ser Gly Ile Ile Gly Asn Leu
145                 150                 155                 160
Arg His Met Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg
                165                 170                 175
Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Leu Ile Pro Ile Lys Pro Gly Leu
            180                 185                 190
Met Lys Pro Thr Ser Val Gln Gln Arg Cys Ser Ala Val Val Lys Cys
        195                 200                 205
Ser Lys Val His Phe Leu Leu Met Leu Ser Gln Arg Ala Val Pro Ser
    210                 215                 220
Cys Phe Tyr His Gly Ile Tyr Leu Leu Gly Leu His Thr Cys Thr Tyr
225                 230                 235                 240
Gln Pro His Cys Lys Cys Cys Pro Val
                245
<210>10
<211>118
<212>PRT
<213>人类
<400>10
Met Ser Ala Pro Ala Gln Pro Pro Ala Glu Gly Thr Glu Gly Thr Ala
 1               5                  10                  15
Pro Gly Gly Gly Pro Pro Gly Pro Pro Pro Asn Met Thr Ser Asn Arg
            20                  25                  30
Arg Leu Gln Gln Thr Gln Ala Gln Val Glu Glu Val Val Asp Ile Ile
        35                  40                  45
Arg Val Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu
    50                  55                  60
Leu Asp Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu
65                  70                  75                  80
Ser Ser Ala Ala Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Cys Lys
                85                  90                  95
Met Met Ile Met Leu Gly Ala Ile Cys Ala Ile Ile Val Val Val Ile
            100                 105                 110
Val Ile Tyr Phe Phe Thr
        115
<210>11
<211>116
<212>PRT
<213>人类
<400>11
Met Ser Ala Thr Ala Ala Thr Ala Pro Pro Ala Ala Pro Ala Gly Glu
 1               5                  10                  15
Gly Gly Pro Pro Ala Pro Pro Pro Asn Leu Thr Ser Asn Arg Arg Leu
            20                  25                  30
Gln Gln Thr Gln Ala Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met Arg Val
        35                  40                  45
Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp
    50                  55                  60
Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser
65                  70                  75                  80
Ala Ala Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Leu Lys Met Met
                85                  90                  95
Ile Ile Leu Gly Val Ile Cys Ala Ile Ile Leu Ile Ile Ile Ile Val
            100                 105                 110
Tyr Phe Ser Ser
        115
<210>12
<211>116
<212>PRT
<213>小鼠
<400>12
Met Ser Ala Thr Ala Ala Thr Val Pro Pro Ala Ala Pro Ala Gly Glu
 1               5                  10                  15
Gly Gly Pro Pro Ala Pro Pro Pro Asn Leu Thr Ser Asn Arg Arg Leu
            20                  25                  30
Gln Gln Thr Gln Ala Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met Arg Val
        35                  40                  45
Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp
    50                  55                  60
Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser
65                  70                  75                  80
Ala Ala Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Leu Lys Met Met
                85                  90                  95
Ile Ile Leu Gly Val Ile Cys Ala Ile Ile Leu Ile Ile Ile Ile Val
            100                 105                 110
Tyr Phe Ser Thr
        115
<210>13
<211>116
<212>PRT
<213>牛
<400>13
Met Ser Ala Thr Ala Ala Thr Ala Pro Pro Ala Ala Pro Ala Gly Glu
 1               5                  10                  15
Gly Gly Pro Pro Ala Pro Pro Pro Asn Leu Thr Ser Asn Arg Arg Leu
            20                  25                  30
Gln Gln Thr Gln Ala Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met Arg Val
        35                  40                  45
Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp
    50                  55                  60
Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser
65                  70                  75                  80
Ala Ala Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Leu Lys Met Met
                85                  90                  95
Ile Ile Leu Gly Val Ile Cys Ala Ile Ile Leu Ile Ile Ile Ile Val
            100                 105                 110
Tyr Phe Ser Ser
        115
<210>14
<211>114
<212>PRT
<213>光滑爪蟾
<400>14
Met Ser Ala Pro Ala Ala Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly Asp Gly
 1               5                  10                  15
Ala Pro Gln Gly Pro Pro Asn Leu Thr Ser Asn Arg Arg Leu Gln Gln
            20                  25                  30
Thr Gln Ala Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met Arg Val Asn Val
        35                  40                  45
Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Thr Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg
    50                  55                  60
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser Ala Ala
65                  70                  75                  80
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Met Lys Met Met Ile Ile
                85                  90                  95
Met Gly Val Ile Cys Ala Ile Ile Leu Ile Ile Ile Ile Val Tyr Phe
            100                 105                 110
Ser Thr
<210>15
<211>104
<212>PRT
<213>海胆
<400>15
Met Ala Ala Pro Pro Pro Pro Gln Pro Ala Pro Ser Asn Lys Arg Leu
 1               5                  10                  15
Gln Gln Thr Gln Ala Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met Arg Val
            20                  25                  30
Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Ala Leu Ser Val Leu Asp
        35                  40                  45
Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Gln Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Asn
    50                  55                  60
Ala Gly Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Cys Lys Met Met
65                  70                  75                  80
Ile Ile Leu Ala Ile Ile Ile Ile Val Ile Leu Ile Ile Ile Ile Val
                85                  90                  95
Ala Ile Val Gln Ser Gln Lys Lys
            100
<210>16
<211>288
<212>PRT
<213>人类
<400>16
Met Lys Asp Arg Thr Gln Glu Leu Arg Thr Ala Lys Asp Ser Asp Asp
 1               5                  10                  15
Asp Asp Asp Val Ala Val Thr Val Asp Arg Asp Arg Phe Met Asp Glu
            20                  25                  30
Phe Phe Glu Gln Val Glu Glu Ile Arg Gly Phe Ile Asp Lys Ile Ala
        35                  40                  45
Glu Asn Val Glu Glu Val Lys Arg Lys His Ser Ala Ile Leu Ala Ser
    50                  55                  60
Pro Asn Pro Asp Glu Lys Thr Lys Glu Glu Leu Glu Glu Leu Met Ser
65                  70                  75                  80
Asp Ile Lys Lys Thr Ala Asn Lys Val Arg Ser Lys Leu Lys Ser Ile
                85                  90                  95
Glu Gln Ser Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser Ser Ala Asp
            100                 105                 110
Leu Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg Lys Phe Val
        115                 120                 125
Glu Val Met Ser Glu Tyr Asn Ala Thr Gln Ser Asp Tyr Arg Glu Arg
    130                 135                 140
Cys Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly Arg Thr Thr
145                 150                 155                 160
Thr Ser Glu Glu Leu Glu Asp Met Leu Glu Ser Gly Asn Pro Ala Ile
                165                 170                 175
Phe Ala Ser Gly Ile Ile Met Asp Ser Ser Ile Ser Lys Gln Ala Leu
            180                 185                 190
Ser Glu Ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu Asn Ser
        195                 200                 205
Ile Arg Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val Glu
    210                 215                 220
Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ala
225                 230                 235                 240
Val Asp Tyr Val Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys
                245                 250                 255
Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ile Met Ile Ile Ile Cys Cys
            260                 265                 270
Val Ile Leu Gly Ile Val Ile Ala Ser Thr Val Gly Gly Ile Phe Ala
        275                 280                 285
<210>17
<211>288
<212>PRT
<213>人类
<400>17
Met Lys Asp Arg Thr Gln Glu Leu Arg Ser Ala Lys Asp Ser Asp Asp
 1               5                  10                  15
Glu Glu Glu Val Val His Val Asp Arg Asp His Phe Met Asp Glu Phe
            20                  25                  30
Phe Glu Gln Val Glu Glu Ile Arg Gly Cys Ile Glu Lys Leu Ser Glu
        35                  40                  45
Asp Val Glu Gln Val Lys Lys Gln His Ser Ala Ile Leu Ala Ala Pro
    50                  55                  60
Asn Pro Asp Glu Lys Thr Lys Gln Glu Leu Glu Asp Leu Thr Ala Asp
65                  70                  75                  80
Ile Lys Lys Thr Ala Asn Lys Val Arg Ser Lys Leu Lys Ala Ile Glu
                85                  90                  95
Gln Ser Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser Ser Ala Asp Leu
            100                 105                 110
Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg Lys Phe Val Glu
        115                 120                 125
Val Met Thr Glu Tyr Asn Ala Thr Gln Ser Lys Tyr Arg Asp Arg Cys
    130                 135                 140
Lys Asp Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly Arg Thr Thr Thr
145                 150                 155                 160
Asn Glu Glu Leu Glu Asp Met Leu Glu Ser Gly Lys Leu Ala Ile Phe
                165                 170                 175
Thr Asp Asp Ile Lys Met Asp Ser Gln Met Thr Lys Gln Ala Leu Asn
            180                 185                 190
Glu Ile Glu Thr Arg His Asn Glu Ile Ile Lys Leu Glu Thr Ser Ile
        195                 200                 205
Arg Glu Leu His Asp Met Phe Val Asp Met Ala Met Leu Val Glu Ser
    210                 215                 220
Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ser Val
225                 230                 235                 240
Asp Tyr Val Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys Tyr
                245                 250                 255
Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ile Met Ile Ile Ile Cys Cys Val
            260                 265                 270
Val Leu Gly Val Val Leu Ala Ser Ser Ile Gly Gly Thr Leu Gly Leu
        275                 280                 285
<210>18
<211>288
<212>PRT
<213>小鼠
<400>18
Met Lys Asp Arg Thr Gln Glu Leu Arg Thr Ala Lys Asp Ser Asp Asp
 1               5                  10                  15
Asp Asp Asp Val Thr Val Thr Val Asp Arg Asp Arg Phe Met Asp Glu
            20                  25                  30
Phe Phe Glu Gln Val Glu Glu Ile Arg Gly Phe Ile Asp Lys Ile Ala
        35                  40                  45
Glu Asn Val Glu Glu Val Lys Arg Lys His Ser Ala Ile Leu Ala Ser
    50                  55                  60
Pro Asn Pro Asp Glu Lys Thr Lys Glu Glu Leu Glu Glu Leu Met Ser
65                  70                  75                  80
Asp Ile Lys Lys Thr Ala Asn Lys Val Arg Ser Lys Leu Lys Ser Ile
                85                  90                  95
Glu Gln Ser Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser Ser Ala Asp
            100                 105                 110
Leu Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg Lys Phe Val
        115                 120                 125
Glu Val Met Ser Glu Tyr Asn Ala Thr Gln Ser Asp Tyr Arg Glu Arg
    130                 135                 140
Cys Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly Arg Thr Thr
145                 150                 155                 160
Thr Ser Glu Glu Leu Glu Asp Met Leu Glu Ser Gly Asn Pro Ala Ile
                165                 170                 175
Phe Ala Ser Gly Ile Ile Met Asp Ser Ser Ile Ser Lys Gln Ala Leu
            180                 185                 190
Ser Glu Ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu Thr Ser
        195                 200                 205
Ile Arg Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val Glu
    210                 215                 220
Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ala
225                 230                 235                 240
Val Asp Tyr Val Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys
                245                 250                 255
Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ile Met Ile Ile Ile Cys Cys
            260                 265                 270
Val Ile Leu Gly Ile Ile Ile Ala Ser Thr Ile Gly Gly Ile Phe Gly
        275                 280                 285
<210>19
<211>291
<212>PRT
<213>果蝇
<400>19
Met Thr Lys Asp Arg Leu Ala Ala Leu His Ala Ala Gln Ser Asp Asp
 1               5                  10                  15
Glu Glu Glu Thr Glu Val Ala Val Asn Val Asp Gly His Asp Ser Tyr
            20                  25                  30
Met Asp Asp Phe Phe Ala Gln Val Glu Glu Ile Arg Gly Met Ile Asp
        35                  40                  45
Lys Val Gln Asp Asn Val Glu Glu Val Lys Lys Lys His Ser Ala Ile
    50                  55                  60
Leu Ser Ala Pro Gln Thr Asp Glu Lys Thr Lys Gln Glu Leu Glu Asp
65                  70                  75                  80
Leu Met Ala Asp Ile Lys Lys Asn Ala Asn Arg Val Arg Gly Lys Leu
                85                  90                  95
Lys Gly Ile Glu Gln Asn Ile Glu Gln Glu Glu Gln Gln Asn Lys Ser
            100                 105                 110
Ser Ala Asp Leu Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg
        115                 120                 125
Lys Phe Val Glu Val Met Thr Glu Tyr Asn Arg Thr Gln Thr Asp Tyr
    130                 135                 140
Arg Glu Arg Cys Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly
145                 150                 155                 160
Arg Pro Thr Asn Asp Asp Glu Leu Glu Lys Met Leu Glu Glu Gly Asn
                165                 170                 175
Ser Ser Val Phe Thr Gln Gly Ile Ile Met Glu Thr Gln Gln Ala Lys
            180                 185                 190
Gln Thr Leu Ala Asp Ile Glu Ala Arg His Gln Asp Ile Met Lys Leu
        195                 200                 205
Glu Thr Ser Ile Lys Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met
    210                 215                 220
Leu Val Glu Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr His Val
225                 230                 235                 240
Glu His Ala Met Asp Tyr Val Gln Thr Ala Thr Gln Asp Thr Lys Lys
                245                 250                 255
Ala Leu Lys Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ile Met Ile Leu
            260                 265                 270
Ile Cys Leu Thr Val Leu Gly Ile Leu Ala Ala Ser Tyr Val Ser Ser
        275                 280                 285
Tyr Phe Met
    290
<210>20
<211>291
<212>PRT
<213>秀丽新小杆线虫
<400>20
Met Thr Lys Asp Arg Leu Ser Ala Leu Lys Ala Ala Gln Ser Glu Asp
 1               5                  10                  15
Glu Gln Asp Asp Asp Met His Met Asp Thr Gly Asn Ala Gln Tyr Met
            20                  25                  30
Glu Glu Phe Phe Glu Gln Val Glu Glu Ile Arg Gly Ser Val Asp Ile
        35                  40                  45
Ile Ala Asn Asn Val Glu Glu Val Lys Lys Lys His Ser Ala Ile Leu
    50                  55                  60
Ser Asn Pro Val Asn Asp Gln Lys Thr Lys Glu Glu Leu Asp Glu Leu
65                  70                  75                  80
Met Ala Val Ile Lys Arg Ala Ala Asn Lys Val Arg Gly Lys Leu Lys
                85                  90                  95
Leu Ile Glu Asn Ala Ile Asp His Asp Glu Gln Gly Ala Gly Asn Ala
            100                 105                 110
Asp Leu Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg Arg Phe
        115                 120                 125
Val Glu Val Met Thr Asp Tyr Asn Lys Thr Gln Thr Asp Tyr Arg Glu
    130                 135                 140
Arg Cys Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Asp Ile Ala Gly Lys Gln
145                 150                 155                 160
Val Gly Asp Glu Asp Leu Glu Glu Met Ile Glu Ser Gly Asn Pro Gly
                165                 170                 175
Val Phe Thr Gln Gly Ile Ile Thr Asp Thr Gln Gln Ala Lys Gln Thr
            180                 185                 190
Leu Ala Asp Ile Glu Ala Arg His Asn Asp Ile Met Lys Leu Glu Ser
        195                 200                 205
Ser Ile Arg Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val
    210                 215                 220
Glu Ser Gln Gly Glu Met Val Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His
225                 230                 235                 240
Ala Lys Glu Phe Val Asp Arg Ala Val Ala Asp Thr Lys Lys Ala Val
                245                 250                 255
Gln Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ile Cys Ile Leu Val Thr
            260                 265                 270
Gly Val Ile Leu Ile Thr Gly Leu Ile Ile Phe Ile Leu Phe Tyr Ala
        275                 280                 285
Lys Val Leu
    290
<210>21
<211>288
<212>PRT
<213>海胆
<400>21
Met Arg Asp Arg Leu Gly Ser Leu Lys Arg Asn Glu Glu Asp Asp Val
 1               5                  10                  15
Gly Pro Glu Val Ala Val Asn Val Glu Ser Glu Lys Phe Met Glu Glu
            20                  25                  30
Phe Phe Glu Gln Val Glu Glu Val Arg Asn Asn Ile Asp Lys Ile Ser
        35                  40                  45
Lys Asn Val Asp Glu Val Lys Lys Lys His Ser Asp Ile Leu Ser Ala
    50                  55                  60
Pro Gln Ala Asp Glu Lys Val Lys Asp Glu Leu Glu Glu Leu Met Ser
65                  70                  75                  80
Asp Ile Lys Lys Thr Ala Asn Lys Val Arg Ala Lys Leu Lys Met Met
                85                  90                  95
Glu Gln Ser Ile Glu Gln Glu Glu Ser Ala Lys Met Asn Ser Ala Asp
            100                 105                 110
Val Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg Lys Phe Val
        115                 120                 125
Glu Val Met Thr Asp Tyr Asn Ser Thr Gln Thr Asp Tyr Arg Glu Arg
    130                 135                 140
Cys Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly Lys Ser Thr
145                 150                 155                 160
Thr Asp Ala Glu Leu Glu Asp Met Leu Glu Ser Gly Asn Pro Ala Ile
                165                 170                 175
Phe Thr Ser Gly Ile Ile Met Asp Thr Gln Gln Ala Lys Gln Thr Leu
            180                 185                 190
Arg Asp Ile Glu Ala Arg His Asn Asp Ile Ile Lys Leu Glu Ser Ser
        195                 200                 205
Ile Arg Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val Glu
    210                 215                 220
Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu Gln Ser
225                 230                 235                 240
Val Asp Tyr Val Glu Thr Ala Lys Met Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys
                245                 250                 255
Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Phe Tyr Ile Ala Ile Cys Cys
            260                 265                 270
Gly Val Ala Leu Gly Ile Leu Val Leu Val Leu Ile Ile Val Leu Ala
        275                 280                 285
<210>22
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>22
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
 1               5                  10                  15
<210>23
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>23
Thr Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Asp Pro
 1               5                  10
<210>24
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>24
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu
 1               5                  10                  15
Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
            20                  25
<210>25
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>25
Lys Lys Trp Lys Met Arg Arg Asn Gln Phe Trp Ile Lys Ile Gln Arg
 1               5                  10                  15
<210>26
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>26
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
 1               5                  10                  15
<210>27
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>27
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
 1               5                  10                  15
<210>28
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>28
Arg Gln Pro Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Met Pro Trp Lys Lys
 1               5                  10                  15
<210>29
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>29
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Met Arg Arg Lys Trp Lys Lys
 1               5                  10                  15
<210>30
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>30
Arg Gln Ile Arg Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Arg Trp Arg Arg
 1               5                  10                  15
<210>31
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>31
Arg Arg Trp Arg Arg Trp Trp Arg Arg Trp Trp Arg Arg Trp Arg Arg
 1               5                  10                  15
<210>32
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<221>重复
<222>4
<223>未知的赖氨酸重复的长度
<400>32
Ser Cys Trp Lys
 1
<210>33
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<221>重复
<222>(1)...(4)
<223>未知重复的长度
<400>33
Leu Ala Arg Leu
 1
<210>34
<211>46
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>34
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
 1               5                  10                  15
Gly Gly Cys Arg Gly Asp Met Phe Gly Cys Ala Lys Lys Lys Lys Lys
            20                  25                  30
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Gly Asp
        35                  40                  45
<210>35
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>35
Cys Trp Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
 1               5                  10                  15
Lys Lys Lys Lys
            20
<210>36
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>36
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
 1               5                  10                  15
Lys Lys Trp Cys Cys Trp Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
            20                  25                  30
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
        35                  40
<210>37
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>37
Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly Ile Glu Leu Thr Tyr
 1               5                  10
<210>38
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>38
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
 1               5                  10                  15
Lys Lys Gly Gly Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly Ile Glu Leu Gly Ala
            20                  25                  30
<210>39
<211>27
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>39
Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
 1               5                  10                  15
Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val
            20                  25
<210>40
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>40
Gly Gly Gly Gly Ser
 1               5
<210>41
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>41
Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys
 1               5
<210>42
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>42
Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser
 1               5
<210>43
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>43
Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys Trp
 1               5
<210>44
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>44
Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu
 1               5
<210>45
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>45
Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys
 1               5
<210>46
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>46
Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu
 1               5
<210>47
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>47
Glu Thr Ser Ala Ala Lys Leu Lys
 1               5
<210>48
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>48
Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser
 1               5
<210>49
<211>13
<212>PRT
<213>人类
<400>49
Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met
 1               5                  10
<210>50
<211>15
<212>PRT
<213>人类
<400>50
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys
 1               5                  10                  15
<210>51
<211>16
<212>PRT
<213>人类
<400>51
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met
 1               5                  10                  15
<210>52
<211>17
<212>PRT
<213>人类
<400>52
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met
 1               5                  10                  15
Leu
<210>53
<211>17
<212>PRT
<213>人类
<400>53
Asp Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys
 1               5                  10                  15
Met
<210>54
<211>18
<212>PRT
<213>人类
<400>54
Asp Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys
 1               5                  10                  15
Met Leu
<210>55
<211>33
<212>PRT
<213>小鼠
<400>55
Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp Ser Asn Lys
 1               5                  10                  15
Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser
            20                  25                  30
Gly
<210>56
<211>32
<212>PRT
<213>人类
<400>56
Gln Asn Pro Gln Ile Lys Arg Ile Thr Asp Lys Ala Asp Thr Asn Arg
 1               5                  10                  15
Asp Arg Ile Asp Ile Ala Asn Ala Arg Ala Lys Lys Leu Ile Asp Ser
            20                  25                  30
<210>57
<211>32
<212>PRT
<213>小鼠
<400>57
Gln Asn Gln Gln Ile Gln Lys Ile Thr Glu Lys Ala Asp Thr Asn Lys
 1               5                  10                  15
Asn Arg Ile Asp Ile Ala Asn Thr Arg Ala Lys Lys Leu Ile Asp Ser
            20                  25                  30
<210>58
<211>34
<212>PRT
<213>鸡
<400>58
Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Leu Ile Pro Ile Lys
 1               5                  10                  15
Pro Gly Leu Met Lys Pro Thr Ser Val Gln Gln Arg Cys Ser Ala Val
            20                  25                  30
Val Lys
<210>59
<211>33
<212>PRT
<213>金鱼
<400>59
Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Met Asp Met Ala Asp Ser Asn Lys
 1               5                  10                  15
Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser
            20                  25                  30
Gly
<210>60
<211>33
<212>PRT
<213>金鱼
<400>60
Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp Ser Asn Lys
 1               5                  10                  15
Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser
            20                  25                  30
Gly
<210>61
<211>30
<212>PRT
<213>电鳐
<400>61
Gln Asn Ala Gln Val Asp Arg Ile Val Val Lys Gly Asp Met Asn Lys
 1               5                  10                  15
Ala Arg Ile Asp Glu Ala Asn Lys His Ala Thr Lys Met Leu
            20                  25                  30
<210>62
<211>33
<212>PRT
<213>海胆
<400>62
Gln Asn Ser Gln Val Gly Arg Ile Thr Ser Lys Ala Glu Ser Asn Glu
 1               5                  10                  15
Gly Arg Ile Asn Ser Ala Asp Lys Arg Ala Lys Asn Ile Leu Arg Asn
            20                  25                  30
Lys
<210>63
<211>31
<212>PRT
<213>秀丽新小杆线虫
<400>63
Gln Asn Arg Gln Leu Asp Arg Ile His Asp Lys Gln Ser Asn Glu Val
 1               5                  10                  15
Arg Val Glu Ser Ala Asn Lys Arg Ala Lys Asn Leu Ile Thr Lys
            20                  25                  30
<210>64
<211>31
<212>PRT
<213>果蝇
<400>64
Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Asn Arg Lys Gly Glu Ser Asn Glu
 1               5                  10                  15
Ala Arg Ile Ala Val Ala Asn Gln Arg Ala His Gln Leu Leu Lys
            20                  25                  30
<210>65
<211>32
<212>PRT
<213>水蛭
<400>65
Gln Asn Arg Gln Val Asp Arg Ile Asn Asn Lys Met Thr Ser Asn Gln
 1               5                  10                  15
Leu Arg Ile Ser Asp Ala Asn Lys Arg Ala Ser Lys Leu Leu Lys Glu
            20                  25                  30
<210>66
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>66
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys
 1               5                  10                  15
<210>67
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>67
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met
 1               5                  10                  15
<210>68
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>68
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met
 1               5                  10                  15
Leu
<210>69
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>69
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Ala
 1               5                  10                  15
Leu
<210>70
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<221>MOD_RES
<222>16
<223>Xaa＝Nle
<400>70
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Xaa
 1               5                  10                  15
Leu
<210>71
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>71
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Ala Met
 1               5                  10                  15
Leu
<210>72
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>72
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Ser Lys Met
 1               5                  10                  15
Leu
<210>73
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<221>MOD_RES
<222>14
<223>Xaa＝Abu
<400>73
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Xaa Lys Met
 1               5                  10                  15
Leu
<210>74
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<221>MOD_RES
<222>13
<223>Xaa＝Abu
<400>74
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Xaa Thr Lys Met
 1               5                  10                  15
Leu
<210>75
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>75
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Ala Arg Ala Thr Lys Met
 1               5                  10                  15
Leu
<210>76
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<221>MOD_RES
<222>11
<223>Xaa＝Abu
<400>76
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Xaa Arg Ala Thr Lys Met
 1               5                  10                  15
Leu
<210>77
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>77
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Asn Arg Ala Thr Lys Met
 1               5                  10                  15
Leu
<210>78
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>78
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Ala Gln Arg Ala Thr Lys Met
 1               5                  10                  15
Leu
<210>79
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<221>MOD_RES
<222>9
<223>Xaa＝Abu
<400>79
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Xaa Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met
 1               5                  10                  15
Leu
<210>80
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>80
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Gln Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met
 1               5                  10                  15
Leu
<210>81
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>81
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asn Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met
 1               5                  10                  15
Leu
<210>82
<211>40
<212>PRT
<213>人类
<400>82
Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg
 1               5                  10                  15
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Ser Ser Ala Ala
            20                  25                  30
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
        35                  40
<210>83
<211>40
<212>PRT
<213>牛
<400>83
Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg
 1               5                  10                  15
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser Ala Ala
            20                  25                  30
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
        35                  40
<210>84
<211>40
<212>PRT
<213>大鼠
<400>84
Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg
 1               5                  10                  15
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Val Phe Glu Ser Ser Ala Ala
            20                  25                  30
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
        35                  40
<210>85
<211>40
<212>PRT
<213>大鼠
<400>85
Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg
 1               5                  10                  15
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser Ala Ala
            20                  25                  30
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
        35                  40
<210>86
<211>40
<212>PRT
<213>大鼠
<400>86
Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg
 1               5                  10                  15
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser Ala Ala
            20                  25                  30
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
        35                  40
<210>87
<211>40
<212>PRT
<213>大鼠
<400>87
Asp Leu Val Ala Gln Arg Gly Glu Arg Leu Glu Leu Leu Ile Asp Lys
 1               5                  10                  15
Thr Glu Asn Leu Val Asp Ser Ser Val Thr Phe Lys Thr Thr Ser Arg
            20                  25                  30
Asn Leu Ala Arg Ala Met Cys Met
        35                  40
<210>88
<211>32
<212>PRT
<213>鸡
<400>88
Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg Ala Asp Ala Leu
 1               5                  10                  15
Gln Ala Gly Ala Ser Val Phe Glu Ser Ser Ala Ala Lys Leu Lys Arg
            20                  25                  30
<210>89
<211>32
<212>PRT
<213>鸡
<400>89
Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg Ala Asp Ala Leu
 1               5                  10                  15
Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser Ala Ala Lys Leu Lys Arg
            20                  25                  30
<210>90
<211>40
<212>PRT
<213>电鳐
<400>90
Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg
 1               5                  10                  15
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Ser Ser Ala Ala
            20                  25                  30
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
        35                  40
<210>91
<211>40
<212>PRT
<213>海胆
<400>91
Asp Lys Val Leu Asp Arg Asp Gln Ala Leu Ser Val Leu Asp Asp Arg
 1               5                  10                  15
Ala Asp Ala Leu Gln Gln Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Asn Ala Gly
            20                  25                  30
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
        35                  40
<210>92
<211>40
<212>PRT
<213>海兔
<400>92
Glu Lys Val Leu Asp Arg Asp Gln Lys Ile Ser Gln Leu Asp Asp Arg
 1               5                  10                  15
Ala Glu Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Ala Ser Ala Gly
            20                  25                  30
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
        35                  40
<210>93
<211>40
<212>PRT
<213>Teuthoida
<400>93
Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Ser Lys Ile Ser Glu Leu Asp Asp Arg
 1               5                  10                  15
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Ala Ser Ala Gly
            20                  25                  30
Lys Leu Lys Arg Lys Phe Trp Trp
        35                  40
<210>94
<211>40
<212>PRT
<213>秀丽新小杆线虫
<400>94
Asn Lys Val Met Glu Arg Asp Val Gln Leu Asn Ser Leu Asp His Arg
 1               5                  10                  15
Ala Glu Val Leu Gln Asn Gly Ala Ser Gln Phe Gln Gln Ser Ser Arg
            20                  25                  30
Glu Leu Lys Arg Gln Tyr Trp Trp
        35                  40
<210>95
<211>40
<212>PRT
<213>果蝇
<400>95
Glu Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Gly Glu Arg
 1               5                  10                  15
Ala Asp Gln Leu Glu Gln Gly Ala Ser Gln Ser Glu Gln Gln Ala Gly
            20                  25                  30
Lys Leu Lys Arg Lys Gln Trp Trp
        35                  40
<210>96
<211>40
<212>PRT
<213>果蝇
<400>96
Glu Lys Val Leu Glu Arg Asp Ser Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg
 1               5                  10                  15
Ala Asp Ala Leu Gln Gln Gly Ala Ser Gln Phe Glu Gln Gln Ala Gly
            20                  25                  30
Lys Leu Lys Arg Lys Phe Trp Leu
        35                  40
<210>97
<211>40
<212>PRT
<213>水蛭
<400>97
Asp Lys Val Leu Glu Lys Asp Gln Lys Leu Ala Glu Leu Asp Gly Arg
 1               5                  10                  15
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Ala Ser Ala Gly
            20                  25                  30
Lys Leu Lys Arg Lys Phe Trp Trp
        35                  40
<210>98
<211>18
<212>PRT
<213>人类
<400>98
Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys Tyr Gln Ser Lys
 1               5                  10                  15
Ala Arg
<210>99
<211>18
<212>PRT
<213>牛
<400>99
Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys Tyr Gln Ser Lys
 1               5                  10                  15
Ala Arg
<210>100
<211>18
<212>PRT
<213>大鼠
<400>100
Glu His Ala Lys Glu Glu Thr Lys Lys Ala Ile Lys Tyr Gln Ser Lys
 1               5                  10                  15
Ala Arg
<210>101
<211>18
<212>PRT
<213>大鼠
<400>101
Glu Lys Ala Arg Asp Glu Thr Arg Lys Ala Met Lys Tyr Gln Gly Gln
 1               5                  10                  15
Ala Arg
<210>102
<211>18
<212>PRT
<213>大鼠
<400>102
Glu Arg Gly Gln Glu His Val Lys Ile Ala Leu Glu Asn Gln Lys Lys
 1               5                  10                  15
Ala Arg
<210>103
<211>18
<212>PRT
<213>鸡
<400>103
Val Pro Glu Val Phe Val Thr Lys Ser Ala Val Met Tyr Gln Cys Lys
 1               5                  10                  15
Ser Arg
<210>104
<211>18
<212>PRT
<213>海胆
<400>104
Val Arg Arg Gln Asn Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys Tyr Gln Ser Lys
 1               5                  10                  15
Ala Arg
<210>105
<211>18
<212>PRT
<213>海兔
<400>105
Glu Thr Ala Lys Met Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys Tyr Gln Ser Lys
 1               5                  10                  15
Ala Arg
<210>106
<211>18
<212>PRT
<213>Teuthoida sp.
<400>106
Glu Thr Ala Lys Val Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys Tyr Gln Ser Lys
 1               5                  10                  15
Ala Arg
<210>107
<211>18
<212>PRT
<213>果蝇
<400>107
Gln Thr Ala Thr Gln Asp Thr Lys Lys Ala Leu Lys Tyr Gln Ser Lys
 1               5                  10                  15
Ala Arg
<210>108
<211>18
<212>PRT
<213>水蛭
<400>108
Glu Thr Ala Ala Ala Asp Thr Lys Lys Ala Met Lys Tyr Gln Ser Ala
 1               5                  10                  15
Ala Arg
<210>109
<211>206
<212>PRT
<213>大鼠
<400>109
Met Ala Glu Asp Ala Asp Met Arg Asn Glu Leu Glu Glu Met Gln Arg
 1               5                  10                  15
Arg Ala Asp Gln Leu Ala Asp Glu Ser Leu Glu Ser Thr Arg Arg Met
            20                  25                  30
Leu Gln Leu Val Glu Glu Ser Lys Asp Ala Gly Ile Arg Thr Leu Val
        35                  40                  45
Met Leu Asp Glu Gln Gly Glu Gln Leu Glu Arg Ile Glu Glu Gly Met
    50                  55                  60
Asp Gln Ile Asn Lys Asp Met Lys Glu Ala Glu Lys Asn Leu Thr Asp
65                  70                  75                  80
Leu Gly Lys Phe Cys Gly Leu Cys Val Cys Pro Cys Asn Lys Leu Lys
                85                  90                  95
Ser Ser Asp Ala Tyr Lys Lys Ala Trp Gly Asn Asn Gln Asp Gly Val
            100                 105                 110
Val Ala Ser Gln Pro Ala Arg Val Val Asp Glu Arg Glu Gln Met Ala
        115                 120                 125
Ile Ser Gly Gly Phe Ile Arg Arg Val Thr Asn Asp Ala Arg Glu Asn
    130                 135                 140
Glu Met Asp Glu Asn Leu Glu Gln Val Ser Gly Ile Ile Gly Asn Leu
145                 150                 155                 160
Arg His Met Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg
                165                 170                 175
Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp Ser Asn Lys Thr Arg Ile
            180                 185                 190
Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser Gly
        195                 200                 205

Claims (82)

1.一种底物组合物，包括释放剂和梭菌毒素底物，所述梭菌毒素底物包括：
(a)一种供体荧光团；
(b)一种吸收光谱与所述供体荧光团的发射光谱有重叠的受体；
(c)一种含有切割位点的梭菌毒素识别序列，其中所述切割位点介于所述供体荧光团和所述受体之间，并且其中共振能量传递在适当条件下表现于所述供体荧光团和所述受体之间。
2.权利要求1的底物组合物，其特征在于所述释放剂与所述梭菌毒素底物共价键合。
3.权利要求2的底物组合物，其特征在于所述释放剂是蛋白质、肽或肽模拟物。
4.权利要求3的底物组合物，其特征在于所述底物组合物是含有与所述梭菌毒素底物有效融合的释放剂的嵌合蛋白、肽或肽模拟物。
5.权利要求3的底物组合物，其特征在于所述释放剂是触角足蛋白或其活性片断。
6.权利要求5的底物组合物，其特征在于所述触角足蛋白或其活性片断的氨基酸序列为RQIKIWFQNRRMKWKK(序列号：1)。
7.权利要求3的底物组合物，其特征在于所述释放剂是HIV TAT蛋白或其活性片断。
8.权利要求7的底物组合物，其特征在于所述HIV TAT蛋白或其活性片断的氨基酸序列为YGRKKRRQRRR(序列号：2)。
9.权利要求3的底物组合物，其特征在于所述释放剂是单纯疱疹病毒VP22蛋白或其活性片断。
10.权利要求9的底物组合物，其特征在于单纯疱疹病毒VP22蛋白是序列号为3的氨基酸序列。
11.权利要求1的底物组合物，其特征在于所述释放剂与所述梭菌毒素底物通过非共价键相连。
12.权利要求11的底物组合物，其特征在于所述释放剂选自ChariotTM和MPG肽。
13.权利要求11的底物组合物，其特征在于包括含有肉毒梭菌毒素识别序列的肉毒梭菌毒素底物。
14.权利要求13的底物组合物，其特征在于包括含有BoNT/A识别序列的BoNT/A底物。
15.权利要求14的底物组合物，其特征在于所述BoNT/A底物包括至少六个相连的SNAP-25残基或其肽模拟物，所述六个相连的残基含有Gln-Arg。
16.权利要求13的底物组合物，其特征在于包括含有BoNT/B识别序列的BoNT/B底物。
17.权利要求16的底物组合物，其特征在于所述BoNT/B底物包括至少六个相连的VAMP残基或其肽模拟物，所述六个相连的残基含有Gln-Phe。
18.权利要求13的底物组合物，其特征在于包括含有BoNT/C1识别序列的BoNT/C1底物。
19.权利要求18的底物组合物，其特征在于所述BoNT/C1底物包括至少六个相连的突触融合蛋白残基或其肽模拟物，所述六个相连的残基含有Lys-Ala。
20.权利要求18的底物组合物，其特征在于所述BoNT/C1底物包括至少六个相连的SNAP-25残基或其肽模拟物，所述六个相连的残基含有Arg-Ala。
21.权利要求13的底物组合物，其特征在于包括含有BoNT/D识别序列的BoNT/D底物。
22.权利要求21的底物组合物，其特征在于所述BoNT/D底物包括至少六个相连的VAMP残基或其肽模拟物，所述六个相连的残基含有Lys-Leu。
23.权利要求13的底物组合物，其特征在于包括含有BoNT/E识别序列的BoNT/E底物。
24.权利要求23的底物组合物，其特征在于所述BoNT/E底物包括至少六个相连的SNAP-25残基或其肽模拟物，所述六个相连的残基含有Arg-Ile。
25.权利要求13的底物组合物，其特征在于包括含有BoNT/F识别序列的BoNT/F底物。
26.权利要求25的底物组合物，其特征在于所述BoNT/F底物包括至少六个相连的VAMP残基或其肽模拟物，所述六个相连的残基含有Gln-Lys。
27.权利要求13的底物组合物，其特征在于包括含有BoNT/G识别序列的BoNT/G底物。
28.权利要求27的底物组合物，其特征在于所述BoNT/G底物包括至少六个相连的VAMP残基或其肽模拟物，所述六个相连的残基含有Ala-Ala。
29.权利要求1的底物组合物，其特征在于包括含有TeNT识别序列的TeNT底物。
30.权利要求29的底物组合物，其特征在于所述TeNT底物包括至少六个相连的VAMP残基或其肽模拟物，所述六个相连的残基含有Gln-Phe。
31.权利要求1的底物组合物，其特征在于所述供体荧光团选自荧光素、Alexa Fluor488、DABCYL和BODIPY。
32.权利要求1的底物组合物，其特征在于所述受体是受体荧光团。
33.权利要求32的底物组合物，其特征在于所述受体荧光团的荧光寿命为至少1微秒。
34.权利要求1的底物组合物，其特征在于所述受体选自四甲基若丹明、EDANS和QSY7。
35.权利要求1的底物组合物，其特征在于所述受体是非荧光性的。
36.权利要求4的底物组合物，其特征在于所述底物组合物是具有最多100个残基的肽或肽模拟物。
37.权利要求4的底物组合物，其特征在于所述底物组合物是具有最多50个残基的肽或肽模拟物。
38.一种细胞，含有梭菌毒素底物，所述梭菌毒素底物包括：
(a)一种供体荧光团；
(b)一种吸收光谱与所述供体荧光团的发射光谱有重叠的受体；
(c)一种含有切割位点的梭菌毒素识别序列，其中所述切割位点介于所述供体荧光团和所述受体之间，并且其中共振能量传递在适当条件下表现于所述供体荧光团和所述受体之间。
39.权利要求38的细胞，其特征在于所述细胞是转染细胞。
40.权利要求38的细胞，其特征在于所述细胞是稳定转染的细胞。
41.权利要求38的细胞，其特征在于所述细胞是原代细胞。
42.权利要求38的细胞，其特征在于所述细胞是传代细胞。
43.权利要求38的细胞，其特征在于所述细胞是人类细胞。
44.权利要求38～41任一项的细胞，其特征在于所述细胞是神经元。
45.权利要求38的细胞，其特征在于所述细胞是中枢神经系统(CNS)神经元。
46.权利要求38的细胞，其特征在于所述细胞是外周神经元。
47.权利要求39或40的细胞，其特征在于所述细胞选自神经母细胞瘤、脊髓神经元、背根神经节神经元、大脑皮层神经元、小脑神经元、海马神经元和运动神经元。
48.权利要求45的细胞，其特征在于所述细胞是神经母细胞瘤细胞。
49.权利要求38的细胞，其特征在于所述细胞是非神经元细胞。
50.权利要求47的细胞，其特征在于所述细胞是胰腺腺泡细胞。
51.一种细胞，含有编码梭菌毒素底物的核酸分子，所述梭菌毒素底物包括：
(a)一种供体荧光团；
(b)一种吸收光谱与所述供体荧光团的发射光谱有重叠的受体；
(c)一种含有切割位点的梭菌毒素识别序列，其中所述切割位点介于所述供体荧光团和所述受体之间，并且其中共振能量传递在适当条件下表现于所述供体荧光团和所述受体之间。
52.权利要求51的细胞，其特征在于所述核酸分子是稳定转染的。
53.权利要求51的细胞，其特征在于所述细胞是人类细胞。
54.权利要求51的细胞，其特征在于所述细胞是神经元细胞。
55.权利要求51的细胞，其特征在于所述细胞是非神经元细胞。
56.权利要求51的细胞，其特征在于所述核酸分子与组成型调节元件连接。
57.权利要求51的细胞，其特征在于所述核酸分子与诱导型调节元件连接。
58.权利要求57的细胞，其特征在于所述诱导型启动子是四环素调节的调节元件。
59.权利要求57的细胞，其特征在于所述诱导型启动子是蜕皮素诱导的调节元件。
60.权利要求51、52、56或57的细胞，其特征在于所述梭菌毒素底物包括绿色荧光蛋白(GFP)。
61.一种测定梭菌毒素活性的方法，包括以下步骤：
(a)将细胞与样品接触，所述细胞所含有的梭菌毒素底物包括
(i)一种供体荧光团；
(ii)一种吸收光谱与所述供体荧光团的发射光谱有重叠的受体；
(iii)一种含有切割位点的梭菌毒素识别序列，其中所述切割位点介于所述供体荧光团和所述受体之间，并且其中共振能量传递在适当条件下表现于所述供体荧光团和所述受体之间，
(b)激活所述供体荧光团；并
(c)测定所述接触过的细胞相对于对照细胞的共振能量传递，其中与所述对照细胞相比，所述接触过的细胞共振能量传递的差异表示梭菌毒素的活性。
62.权利要求61的方法，其特征在于所述梭菌毒素底物是肉毒梭菌毒素底物。
63.权利要求62的方法，其特征在于所述肉毒梭菌毒素底物是含有BoNT/A识别序列的BoNT/A底物。
64.权利要求62的方法，其特征在于所述肉毒梭菌毒素底物是含有BoNT/B识别序列的BoNT/B底物。
65.权利要求62的方法，其特征在于所述肉毒梭菌毒素底物是含有BoNT/C1识别序列的BoNT/C1底物。
66.权利要求62的方法，其特征在于所述肉毒梭菌毒素底物是含有BoNT/D识别序列的BoNT/D底物。
67.权利要求62的方法，其特征在于所述肉毒梭菌毒素底物是含有BoNT/E识别序列的BoNT/E底物。
68.权利要求62的方法，其特征在于所述肉毒梭菌毒素底物是含有BoNT/F识别序列的BoNT/F底物。
69.权利要求62的方法，其特征在于所述肉毒梭菌毒素底物是含有BoNT/G识别序列的BoNT/G底物。
70.权利要求61的方法，其特征在于所述肉毒梭菌毒素底物是含有TeNT识别序列的TeNT毒素底物。
71.权利要求61的方法，其特征在于所述样品是粗的细胞溶胞产物。
72.权利要求61的方法，其特征在于所述样品是分离出的梭菌毒素。
73.权利要求61的方法，其特征在于所述样品是合成梭菌毒素产品。
74.权利要求61的方法，其特征在于所述样品是BOTOX。
75.权利要求61的方法，其特征在于所述样品是食品。
76.权利要求61的方法，其特征在于步骤(c)包括探测所述接触过的细胞的供体荧光强度，其中与所述对照细胞相比，所述接触过的细胞供体荧光强度的提高表示梭菌毒素的活性。
77.权利要求61的方法，其特征在于步骤(c)包括探测所述接触过的细胞的受体荧光强度，其中与所述对照细胞相比，所述接触过的细胞受体荧光强度的降低表示梭菌毒素的活性。
78.权利要求61的方法，其特征在于步骤(c)包括探测所述接触过的细胞的受体发射最大波长和供体荧光团发射最大波长，其中从所述受体发射最大波长附近到所述供体荧光团发射最大波长附近的发射最大波长的位移表示梭菌毒素的活性。
79.权利要求61的方法，其特征在于步骤(c)包括探测受体发射最大波长附近的荧光振幅与供体荧光团发射最大波长附近的荧光振幅的比值，其中与对照细胞相比，所述接触过的细胞比值的降低表示梭菌毒素的活性。
80.权利要求61的方法，其特征在于步骤(c)包括探测所述接触过的细胞中供体荧光团的激发态寿命，其中与所述对照细胞相比，所述接触过的细胞中供体荧光团激发态寿命的增大表示梭菌毒素的活性。
81.权利要求61的方法，其特征在于还包括在以后的一个或多个时间间隔内重复步骤(c)。
82.权利要求61的方法，其特征在于选择适宜于梭菌毒素活性的条件以使检测成线性。
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