KR20050071506A - 클로스트리디움계 독소에 대한 세포계 형광 공명 에너지전이(ｆｒｅｔ) 에세이 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 (a) 도너 플루오로포어; 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는 클로스트리디움계 독소 기질을 포함하는 세포에 시료를 접촉시키고; (b) 도너 플루오로포어를 여기(exciting)하고; (c) 대조구 세포와 비교하여 접촉된 세포의 공명 에너지 전이를 결정하고, 접촉된 세포의 공명 에너지 전이를 대조구 세포와 비교하여 클로스트리디움계 독소 활성을 표시함으로써, 클로스트리디움계 독소 활성을 결정하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 개괄적으로 형광 공명 에너지 전이에 관한 것으로, 특히, 클로스트리디움계 독소 활성을 검정하기 위한 세포계 방법에 관한 것이다.
파상풍의 신경마비 증후군 및 드물지만 잠재적으로 치명적인 질환인 보툴리즘은 클로스트리디움 속 세균에 의해 생성된 신경독에 의한 것이다. 클로스트리디움계 신경독은 매우 강력하며, 신경세포에 특이적인 독으로, 보툴리눔 독소의 치사량은 나노그램 수준이다. 따라서, 식료품에 단지 미소한 정도의 보툴리눔 독소만 존재해도, 공중의 건강에 위험을 초래하므로 엄격한 테스트를 통해 막아야만 한다.
그러나, 잠재적으로 해로운 효과에도 불구하고, 낮은 제어된 투여량의 보툴리눔 신경독은 몇가지 미용 목적을 위한 치료제로서 성공적으로 사용된다. 특히, 보툴리눔 독소는 콜린성 신경 말단 활성의 가역적인 억제가 필요한 다양한 안면 및 부분 디스토니아, 사시 및 다른 질환의 치료적 관리에 사용되어 왔다. 사람에 대한 보툴리눔 독소 신경독의 확립된 치료학적 용도는 안검경련, 반측안면 경련, 인후부 디스토니아, 안면 다한증, 유연증, 근긴장성 디스토니아(oromasibylar dystonia), 경부 디스토니아, 사경, 사시, 사지 티스토니아, 직업상 경련(occupational cramp) 및 근육잔떨림을 포함하나 이에 제한되지는 않는다(Rossetto 등 , Toxicon 39: 27-41 (2001)). 예를 들어, 경련 조직에 적은 양의 보툴리눔 신경독 A를 근육내 주사하여 뇌 손상, 척수 손상, 발작, 다발성 경화증 및 대뇌 마비로 인한 경련을 효과적으로 처치하였다. 클로스트리디움 신경독의 추가적으로 가능한 임상 용도가 조사되고 있다.
식품중 소량의 보툴리눔 독소와 관련된 잠재적인 위험이 있고, 정확한 약제학적 조성을 준비할 필요가 있으므로, 식품 및 약제 산업에서 보툴리눔 신경독에 대한 에세이를 사용한다. 식품 산업은 새로운 식품 포장 방법을 허가하고, 식품 안정성을 확인하기 위해서 보툴리눔 독소에 대한 에세이가 필요하다. 보툴리눔 독소의 증대되는 임상적 용도로 인해 제품 조성뿐아니라 질적 컨트롤을 위해 보툴리눔 신경독 활성에 대한 정확한 에세이를 필요하다. 두가지 산업 모두에서, 마우스 치사 테스트가 현재 유일한 보툴리눔 신경독 활성에 대한 허용가능한 에세이이다.
불행히도, 마우스 치사 에세이는 몇가지 문제점이 있다: 많은 수의 실험동물이 필요하므로 비용이 많이 들고; 특이성이 부족하며; 많은 동물 그룹을 사용하지 않는 경우 부정확할 가능성이 있고; 동물을 희생시켜야만 한다. 따라서, 마우스 치사 에세이를 보완할 수 있고, 단점을 감소시키는 새로운 방법이 요구된다. 독소 단백가수분해 활성을 측정하는 것 외에, 이러한 대체방법에도 독소의 세포 흡수(uptake) 및 세포 시토졸로의 독소 경쇄의 수송이 또한 필요하다. 본 발명은 클로스트리디움 독소 활성에 대한 신규한 세포계 에세이를 제공함으로써 이러한 요구를 충족시키면서, 관련된 장점을 또한 제공한다.
도 1은 클로스트리디움계 신경독 활성화에 대한 추론되는 구조의 개략도 및 가정되는 메카니즘을 나타낸다. 독소는 루프로 연결된 3개의 50kDa 도메인으로 구성된, 150kDa의 비활성 단일 폴리펩티드 사슬로서 제공될 수 있다. 선택적인 단백가수분해성 절단로 두개의 디설파이드-결합 사슬: 50kDa L 사슬, 및 HN과 HC로 칭하는 2개의 도메인으로 구성되는 100kDa H 사슬을 생성하여, 독소를 활성화시킨다. 3개의 도메인은 별개의 역할을 수행한다: 중쇄의 C-말단 도메인(HC)은 세포 결합시 기능하는 반면, 중쇄의 N-말단 도메인(HN)이 엔도솜으로부 세포 세포질로 전위하도록 하는 기능을 한다. 세포 내의 디설파이드 결합이 환원된 후, L 사슬의 아연-엔도펩티다아제 활성기를 유리시킨다.
도 2는 중추 및 말초 뉴런의 파상풍 및 보툴리눔 독소 활성에 필요한 4가지 단계의 개략도를 나타낸다.
도 3은 원형질 막에서의 세포 이하의 배치 및 SNAP-25, VAMP 및 신택신의 절단부위를 나타낸다. SNAP-25 및 신택신이 표적 원형질막에 결합하는 반면, VAMP는 스냅스 소포 막에 결합된다. BoNT/A 및 /E는 카르복시-테타니에 가까운 SNAP-25을 절단하여, 각각 9개 또는 26개 잔기를 떼어 놓는다. BoNT/B, /D, /F, /G 및 TeNT는 VAMP의 보존된 중앙 부분(점선표시)에 작용하여, VAMP의 아미노-말단 부분을 시토졸로 방출한다. BoNT/C1은 카르복시-말단에 가까운 SNAP-25를 절단할 뿐아니라, 시토졸 막 표면에 가까운 단일 부위에서 신택신을 절단한다. BoNT/B, /C1, /D, /F, /G 및 TeNT이 작용하면, VAMP 또는 신택신의 시토졸 도메인의 큰 부분은 떼어 놓는 반면, SNPA-25의 작은 부분은 BoNT/A, /C1 또는 /E만 떼어 놓는다.
도 4는 VAMP, SNAP-25 및 신택신의 신경독 인식 모체(motif)를 나타낸다. (A) 빗금 네모는 클로스트리디움계 신경독의 3개의 표적에 공통적인 모체의 존재 및 위치를 나타낸다. (B) 인식 모체는 소수성 잔기("h"); 음으로 하전된 Asp 또는 Glu 잔기("-") 및 극성 잔기("P")로 구성되며; "x"는 임의 아미노산을 의미한다. 모체는 -나선형 구조를 가지는 것으로 예견되는 VAMP, SNAP-25 및 신택신의 영역에 포함된다. (C) -나선형 구조 모체의 정면도를 나타내었다. 음으로 하전된 잔기는 제 1 면에 배열되는 반면, 소수성 잔기는 제 2 면에 배열된다.
도 5는 다양한 SNAP-25 단백질 및 이의 BoNT/E, BoNT/A 및 BoNT/C1 절단 부위의 배열을 나타낸다. 사람 SNAP-25(SEQ ID NO: 4; GenBank accession g4507099; 또한 관련된 사람 SNAP-25 서열 G2135800 참조) ; 마우스 SNAP-25(SEQ ID NO:5; GenBank accession G6755588) ; 초파리 SNAP-25(SEQ ID NO:6; GenBank accession g548941); 금붕어 SNAP-25(SEQ ID NO:7; GenBank accession G2133923); 성게 SNAP-25(SEQ ID NO:8 ; GenBank accession g2707818) 및 닭 SNAP-25 (SEQ ID NO:9; GenBank accession G481202)을 도시하였다.
도 6은 다양한 VAMP 단백질 및 BoNT/F, BoNT/D, BoNT/B, TeNT 및 BoNT/G 절단 부위의 배열을 나타낸다. 사람 VAMP-1(SEQ ID NO:10 ; GenBank accession GL35093) ; 사람 VAMP-2 (SEQ ID NO:11; GenBank accession gl35094) ; 마우스 VAMP-2 (SEQ ID NO:12; GenBank accession g2501081); 소 VAMP (SEQ ID NO:13; GenBank accession g89782); 개구리 VAMP (SEQ ID NO:14; GenBank accession g6094391); 및 성게 VAMP(SEQ ID NO: 15; GenBank accession G5031415)을 나타낸다.
도 7은 다양한 신택신 단백질 및 이의 BoNT/C1 절단 부위의 배열을 나타낸다. 사람 신택신 1A (SEQ ID NO:16; GenBank accession GL5079184), 사람 신택신 1B2 (SEQ ID NO:17; GenBank accession GL5072437), 마우스 신택신 1A (SEQ ID NO:18; GenBank accession GL5011853), 초파리 신택신 1A (SEQ ID NO:19; GenBank accession G2501095); 예쁜꼬마선충 신택신 A (SEQ ID NO:20; GenBank accession g7511662) 및 성게 신택신 (SEQ ID NO:21 ; GenBank accession gl3310402)을 나타낸다.
발명의 개요
본 발명은 수송제를 포함하며, 도너 플루오로포어(donor fluorophore); 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질을 포함하고, 알맞은 조건하에서 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는 기질 조성물을 제공한다. 본 발명의 기질 조성물에서, 수송제(delivery agent)는 예를 들어, 클로스트리디움계 독소 기질에 공유결합될 수 있으며, 또한, 예를 들어, 단백질, 펩티드 또는 펩티도미메틱일 수 있다. 일 실시형태에서, 기질 조성물은 키메라 단백질, 펩티드 또는 펩티도미메틱이고, 수송제는 작용가능하게 클로스트리디움계 독소 기질에 융합된다. 이러한 키메라 기질 조성물은, 예를 들어, 많아야 50 또는 100개의 잔기 길이의 펩티드 또는 펩티도미메틱일 수 있다.
안테나페디아 단백질, 또는 아미노산 서열 RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:1) 을 가지는 활성단편과 같은 이의 활성 단편; HIV TAT 단백질, 또는 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:2)을 가지는 활성 단편과 같은, 이의 활성 단편; 및 단백질 또는 아미노산 서열(SEQ ID NO:3)을 가지는 단순 포진성 바이러스 VP22 단백질과 같은, 단순 포진성 바이러스 VP22 단백질 또는 이의 활성단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다양한 수송제가, 본 발명의 기질 조성물의 클로스트리디움계 독소 기질에 공유 결합할 수 있다.
본 발명은 또한 수송제가 비-공유적으로 클로스트리디움계 독소 기질과 연관된 기질 조성물을 제공한다. 비-공유적으로 클로스트리디움계 독소 기질과 연관될 수 있는 수송제의 예로는 Chariot™ 및 MPG 펩티드가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
다양한 클로스트리디움계 독소 기질을 본 발명의 기질 조성물에 사용할 수 있다. 이러한 클로스트리디움계 독소 기질은, 예를 들어, 보툴리눔 독소 인식 서열을 포함하는 보툴리눔 독소 기질 또는 파상풍 독소 인식 서열을 포함하는 테나니계 독소기질이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 BoNT/A 인식 서열을 포함하는 BoNT/A 기질을 일부 포함하는 기질 조성물을 제공한다. 이러한 BoNT/A 기질은 예를 들어, 적어도 6개의 연속된 SNAP-25 잔기, Gln-Arg를 포함하는 6개의 연속된 잔기 또는 이의 펩티도미메틱을를 포함할 수 있다. 또다른 실시형태에서, 본 발명은 BoNT/B 인식 서열을 함유하는 BoNT/B 기질을 포함하는 기질 조성물을 제공한다. 본 발명의 기질 조성물에 유용한 BoNT/B 기질은 적어도 6개의 연속된 VAMP 잔기, Gln-Phe를 포함하는 6개의 연속된 잔기,또는 이의 펩티도미메틱을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또다른 실시형태에서, 본 발명은 BoNT/C1 인식 서열을 포함하는 BoNT/C1 기질을 제공한다. 본 발명에 유용한 BoNT/C1 기질은 적어도 6개의 연속되는 신택신 잔기, Lys-Ala을 포함하는 6개의 연속되는 잔기, 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하며, 또한 적어도 6개의 연속된 SNAP-25 잔기, Arg-Ala을 포함하는 6개의 연속된 잔기, 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명은 BoNT/D 인식 서열을 포함하는 BoNT/D 기질을 제공한다. 적어도 6개의 연속하는 VAMP 잔기, Lys-Leu를 포함하는 6개의 연속된 잔기, 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하는, 다양한 BoNT/D 기질이 본 발명의 기질 조성물에 유용하다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 BoNT/E 인식 서열을 함유하는 BoNT/E를 일부 포함하는 기질 조성물을 제공한다. 이러한 BoNT/E 기질은 예를 들어, 적어도 6개의 연속하는 SNAP-25 잔기, Arg-Ile를 포함하는 6개의 연속된 잔기, 또는 이의 펩티도미메틱을 가질 수 있다. 추가적인 실시형태에서, BoNT/F 인식 서열을 함유하는 BoNT/F 기질을 포함하는 기질 조성물이 제공된다. 본 발명의 조성물에 유용한 BoNT/F 기질은 예를 들어, 적어도 6개의 연속된 VAMP 잔기, Gln-Lys을 포함하는 6개의 연속된 잔기, 또는 이의 펩티도미메틱을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 BoNT/G 인식 서열을 가지는 BoNT/G 기질을 일부 포함하는 기질 조성물을 제공한다. 유용한 BoNT/G 기질은 적어도 6개의 연속된 VAMP 잔기, Ala-Ala을 포함하는 6개의 연속된 잔기, 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또다른 실시형태에서, 본 발명은 TeNT 인식 서열을 가지는 TeNT 기질을 일부 포함하는 기질 조성물을 제공한다. 적어도 6개의 연속된 VAMP 잔기, Gln-Phe을 포함하는 6개의 연속된 잔기, 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하는, 다양한 TeNT 기질이 본 발명에 유용하다.
다양한 도너 플루오로포어 및 억셉터가 본 발명의 기질 조성물에 유용하다. 제한되지 않는 예로서, 본 발명에 유용한 도너 플루오로포어는 Alexa FLUOR®488, DABCYL 및 BODIPY을 포함한다. 본 발명에 유용한 억셉터는 비-형광 억셉터뿐아니라 억셉터 플루오로포어를 포함하며, 일 실시형태에서, 억셉터는 형광 수명이 적어도 1 마이크로초인 억셉터 플루오로포어이다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 억셉터가 EDANS, QSY® 7 또는 테트라메틸로다민인 기질 조성물을 제공한다.
도너 플루오로포어; 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는 클로스트리디움계 독소 기질을 함유하는 세포가 본 발명에 더욱 제공된다. 일 실시형태에서, 세포는 트랜스펙션된 세포이다. 다른 실시형태에서, 세포는 안정하게 트랜스펙션된 세포이다. 본 발명에 유용한 다양한 세포에는 일차 세포; 확립된 세포(established cell); 사람 세포; 일차 뉴런, 확립된 뉴런 및 사람 뉴런과 같은 뉴런성 세포; 및 췌장 선방 세포와 같은 비-뉴런성 세포가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 유용한 뉴런은 중추 신경계(CNS) 뉴런 및 말초 뉴런을 포함하며, 제한되지 않는 예로서, 본 발명에 유용한 뉴런은 신경아세포종 세포, 척수 뉴런, 배측 신경근 신경절 뉴런, 대뇌 피질 뉴런, 소뇌 뉴런, 해마 뉴런 또는 운동 뉴런일 수 있다.
도너 플루오로포어; 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는 클로스트리디움계 독소 기질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 세포가 본 발명에 더욱 제공된다. 사람 세포, 뉴런성 세포 및 비- 뉴런성 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 다양한 세포가 유용할 수 있다. 이러한 세포는 예를 들어, 클로스트리디움계 독소 기질을 암호화하는 안정한 핵산 분자의 트랜스펙션을 통해 준비할 수 있다. 클로스트리디움계 독소 기질을 암호화하는 안정한 핵산 분자는 예를 들어, 연속되는 조절요소 또는 유도성 조절요소와 같은 조절 요소(regulatory elelement)에 결합될 수 있다. 테트라사이클린 조절된 조절 요소 및 엑디손(ecdysone) 유도성 조절 요소를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다양한 유도성 조절 요소(inducible regulatory elelement)가 본 발명에 유용하다. 본 발명에 유용한, 유전학적으로 암호화된 도너 플루오로포어 및 억셉터는 녹색 형광 단백질(GFP) 및 하기에 설명하거나 종래 기술의 다른 것들을 포함한다.
본 발명은 또한 (a) 도너 플루오로포어; 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는 클로스트리디움계 독소 기질을 포함하는 세포에 시료를 접촉시키고; (b) 도너 플루오로포어를 여기(exciting)하고; (c) 대조구 세포와 비교하여 접촉된 세포의 공명 에너지 전이를 결정하고, 접촉된 세포의 공명 에너지 전이를 대조구 세포와 비교하여 클로스트리디움계 독소 활성을 표시함으로써, 클로스트리디움계 독소 활성을 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질은 모든 세로타입의 보툴리눔 독소 기질 또는 파상풍 독소 기질일 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 예를 들어, BoNT/A 인식 서열을 포함하는 BoNT/A 기질; BoNT/B 인식 서열을 포함하는 BoNT/B 기질; BoNT/C1 인식 서열을 포함하는 BoNT/C1 기질; BoNT/D 인식 서열을 포함하는 BoNT/D 기질; BoNT/E 인식 서열을 포함하는 BoNT/E 기질; BoNT/F 인식 서열을 포함하는 BoNT/F 기질; BoNT/G 인식 서열을 포함하는 BoNT/G 기질 또는 TeNT 인식 서열을 포함하는 TeNT 기질을 사용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 클로스트리디움계 독소 활성에 대하여 다양한 시료를 검정할 수 있다. 이러한 시료의 예로는 조 세포 용해물(crud cell lysates); 분리된 클로스트리디움계 독소; BOTOX®와 같은 조제된 클로스트리디움계 독소 제품, 및 식품을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 방법에서 공명 에너지 전이를 결정하는 데는 다양한 방법을 사용할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 접촉된 세포의 도너 형광 세기를 검출하여, 접촉된 세포의 증가된 도너 형광 세기를 대조구 세포와 비교하여 클로스트리디움계 독소 활성을 나타내는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 접촉된 세포의 억셉터 형광 세기를 검출하여, 접촉된 세포의 감소된 억셉터 형광 세기를 대조구 세포와 비교하여 클로스트리디움계 독소 활성을 나타내는 단계를 포함한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 접촉된 세포의 억셉터 방출 최대치 및 도너 플루오로포어 방출 최대치를 검출하여, 가까운 억셉터 방출 최대치로부터 가까운 도너 플루오로포어 방출 최대치까지의 방출 최대치들의 이동으로 클로스트리디움계 독소 활성을 나타내는 단계를 포함한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 접촉된 세포의 도너 플루오로포어 방출 최대치 근처의 형광 진폭에 대한 억셉터 방출 최대치 근처 형광 진폭의 비율을 검출하여, 접촉된 세포에서 감소된 비율을 대조구 세포와 비교하여 클로스트리디움계 독소 활성을 나타내는 단계를 포함한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 도너 플루오로포어의 여기 상태 수명을 검출하여, 접촉된 세포에서 증가된 도너 플루오로포어 여기 상태 수명을 대조구 세포와 비교하여 클로스트리디움계 독소 활성을 나타내는 단계를 포함한다. 필요한 경우, 공명 에너지 전이를 결정하는 단계는 1회이상 시간 간격을 두고 실시될 수 있다. 또한, 필요한 경우, 선형으로 되는 에세이와 같이, 클로스트리디움계 독소 활성에 적합한 조건을 선택할 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 모든 세로타입의 보툴리눔 독소 및 파상풍 독소를 포함하여, 시료 내에 활성 클로스트리디움계 독소가 존재하는지 또는 부재하는 지를 결정하기 위한, 그리고, 클로스트리디움계 독소의 활성을 결정하기 위한 in vivo 및 in vitro 세포계 에세이를 제공한다. 본 발명의 신규한 기질 조성물, 세포 및 어세이는 동물 독성 연구의 필요성을 감소시키면서, 다중 독소 기능, 즉, 결합 및 독소의 세포 흡수, 시토졸로의 전위(translocation) 및 프로테아제 활성을 분석한다. 이러한 신규 조성물 및 방법은 고도로 정제된 이중사슬 독소 또는 조제된 독소 제품뿐아니라 조 시료 및 벌크 시료를 분석하는 데 사용할 수 있으며, 또한 자동화된 처리량이 큰 에세이 포맷에 적용할 수 있다.
하기에 설명하는 바와 같이, 형광 공명 에너지 전이(FRET)는, 여기(excitation)가 광자의 방출없이 도너 플루오로포어로부터 억셉터로 전이하는, 두개의 분자의 전자 여기 상태들 사이의 거리에 의존하는 작용이다. 에너지 전이 프로세스는 형광 세기 및 도너 플루오로포어의 여기 상태 수명을 감소(퀀칭)시키며, 억셉터가 플루오로포어인 경우, 억셉터의 방출 세기의 증가를 가져올 수 있다.
활성 독소를 포함하는 시료와 접촉한 후 본 발명의 세포 내에서 클로스트리디움계 독소 기질이 절단될 때, 공명 에너지 전이가 감소되며, 이는 예를 들어, 증가된 도너 플루오로포어 방출, 감소된 억셉터 플루오로포어 방출에 의해서, 또는 억셉터 방출 최대치들 근처로부터 도너 방출 최대치들 근처로의 방출 최대치들 사이의 이동에 의해서 검출할 수 있다. 필요한 경우, 알맞은 표준을 사용하여 FRET 정도의 차이에 대한 함수로서, 시료 내의 활성 클로스트리디움계 독소의 양을 계산할 수 있다.
본 발명과 관련된 파상풍 및 보툴리눔 신경독은 클로스트리디아에 의해 생성된다. 이러한 독소는 파상풍 및 보툴리즘의 신경마비 증후군을 야기하며, 파상풍 독소는 주로 중추 신경계에 작용하고, 보툴리눔 독소는 말초 신경계에 작용한다. 클로스트리디움계 독소는 신경전달 물질의 방출이 억제되는 세포 중독(cell intoxication)과 유사한 메카니즘을 공유한다. 두개의 디설파이드-결합된 폴리펩티드 사슬로 구성되는 이러한 독소에서, 더 큰 서브유닛은 신경특이적인 결합 및 더 작은 서브유닛의 세포질로의 전위(translocation)의 원인이 된다. 뉴런의 전위 및 환원시에, 더 작은 사슬은 뉴로엑소사이토시스(neuroexocytosis)를 포함하는, 단백질 구성 요소에 특이적인 펩티다아제 활성을 나타낸다. 클로스트리디움계 독소의 "SNARE" 단백질 표적은 다양한 비-뉴런 타입에서의 엑소사이토시스와 공통되며; 이러한 세포에서는, 뉴런에서와 같이, 경쇄 펩티다아제 활성이 엑소사이토시스를 억제한다.
파상풍 신경독 및 보툴리눔 신경독 B,D,F 및 G는 특이적으로 VAMP(시냅토브레빈으로도 알려진), 시냅스 소포막의 내재성 단백질(integral protein)을 인식한다. VAMP는 신경독에 따라 별개의 결합을 절단한다. 보툴리눔 A 및 E 신경독은 SNAP-25, 시냅스전 막의 단백질을, 단백질 카르복시-말단 부분의 두가지 상이한 부위에서 특이적으로 인식 및 절단한다. 보툴리눔 신경독 C는 SNAP-25 외에도, 신택신, 신경 원형질막의 단백질을 절단한다. 절단 부위 및 독소 감수성은 반드시 보존되지는 않지만, 클로스트리디움계 신경독의 3가지 단백질 표적은 효모로부터 사람에 이르기까지 보존된다(하기 참조, Humeau et al. , Biochimie 82: 427-446 (2000); Niemann et al., Trends in Cell Biol. 4 : 179-185 (1994); 및 Pellizzari et al. , Phil. Trans. R. Soc. London 354: 259-268 (1999)도 참조) .
천연 파상풍 및 보툴리눔 신경독은 리더 서열이 없는 150kDa의 비활성 폴리펩티드 사슬로서 제공된다. 이러한 독소는 노출된 프로테아제-감응성 루프가 박테리아 또는 조직 프로테이나아제에 의해 절단되어 활성 이중사슬 독소를 생성할 수 있다. 천연 클로스트리디움계 독소는 중쇄(H, 100kDa)와 경쇄(L, 50kDa)를 다리연결하는 단일 사슬간 디설파이드 결합을 포함한다; 세포밖에서 가해진 독소의 신경독성에 있어서 이러한 다리연결은 중요하다(Montecucco and Schiavo, Quarterly Rev. Biophysics 28: 423-472 (1995)).
도 1에 나타낸 바와 같이, 클로스트리디움계 독소는 별개의 50kDa 도메인 3개로 접혀져 있는 것으로 나타나며, 각 도메인은 별도의 기능을 한다. 도2에 도시한 바와 같이, 클로스트리디움계 독소의 세포 중독 메카니즘은 4가지 개별적인 단계로 구성된다:(1) 결합; (2) 내재화(internalization); (3) 막 전위; 및 (4) 효소적 표적 변형. 중쇄(HC)의 카르복시-말단부는 신경특이적인 결합시에 기능하며, H 사슬(HN)의 아미노-말단부는 막 전위시에 기능한다. L 사슬은 세포내 촉매 활성에 원인이 된다(Montecucco and Schiavo, supra, 1995).
8가지 사람 클로스트리디움계 신경독의 아미노산 서열을 해당 유전자로부터 유도하였다(Neimann, "Molecular Biology of Clostridial Neurotoxins"in Sourcebook of Bacterial Protein Toxins Alouf and Freer (Eds.) PP. 303-348 London: Academic Press 1991). L 사슬 및 H 사슬은 각각 대략 439 및 843개의 잔기로 구성된다. 유사성이 거의 없거나 전혀 없는 영역에 의해 상동 부분(homologous segment)을 절단한다. L 사슬의 가장 잘 보존된 영역은 아미노-말단부(100개의 잔기) 및 중앙 영역(TeNT의 잔기 216 내지 244에 해당)뿐아니라, 사슬간 디설파이드 결합을 형성하는 2개의 시스테인이다. 216 내지 244 잔기는 아연-엔도펩티다아제의 His-Glu-X-X-His 결합 모체 특성을 포함한다.
클로스트리디움계 독소 중쇄는 경쇄보다 덜 보존되며, HC의 카르복시-말단부(TeNT의 잔기 1140 내지 1315에 해당)가 가장 변하기 쉽다. HC 도메인이 신경 말단에 결합에 연관되고, 상이한 신경독이 상이한 수용체와 결합하는 것을 보이는 사실과 일치한다.
클로스트리디움계 독소의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 비교하면, 공통된 조상 유전자로부터 유도된 것으로 나타난다. 클로스트리디움계 신경독 유전자가 이동가능한 유전자 요소에 위치하기 때문에, 이러한 유전자가 널리 퍼지는 것이 쉬워졌다. 하기에 더욱 설명한 바와 같이, 7가지 보툴리눔 독소의 서열 변형이 공지되어 있다. 예를 들어, 도 5 내지 도 7을 참조하고, Humeau et al. , supra, 2000를 참조한다.
상기한 바와 같이, 클로스트리디움계 신경독의 자연적인 표적은 VAMP, SNAP-25 및 신택신을 포함한다. VAMP는 시냅스 소포체 막에 결합하며, SNAP-25 및 신택신은 표적 막(도 3 참조)에 결합한다. BoNT/A 및 BoNT/E는 카르복시-말단 영역에서 SNAP-25를 절단하여, 각각 9개 또는 26개의 아미노산 잔기를 떼어내고, BoNT/C1은 또한 카르복시-말단 근처의 SNAP-25를 절단한다. 보툴리눔 세로타입 BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F 및 BoNT/G 및 파상풍 독소는 VAMP의 보존된 중앙부에 작용하여, VAMP의 아미노-말단부를 시토졸로 방출한다.
BoNT/C1은 시토졸 막 표면 근처의 단일 부위에서 신택신을 절단한다. 따라서, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G 또는 TeNT 단백가수분해는 VAMP 또는 신택신의 시토졸 도메인의 큰 부분을 떼어 내고, 반면에 SNAP-25의 작은 부분은 BoNT/A, BoNT/C1 또는 BoNT/E 절단에 의해 떼어 내어진다(Montecucco and Schiavo, supra, 1995).
막관통 세그멘트가 없는 약 206개 잔기의 단백질인 천연 SNAP-25은 신경 원형질막(plasmalemma)의 시토졸 표면과 연관된다(도 3 참조, Hodel et al., INT. J. Biochemistry and Cell Biology 30: 1069-1073 (1998)도 참조). 또한, 초파리로부터 표유류에 이르기까지 고도로 보존된 상동체일 뿐아니라, SNAP-25-관련 단백질은 또한 효모로부터 클로닝되었다. SNAP-25는 발생 과정에서 엑손 성장에 필요하며, 성숙 신경 시스템에서는 신경 말단 가소성을 위해 필요할 것이다. 사람에서는, 발생과정에서 두가지 이소폼(isoform)이 차별적으로 발현되며; 이소폼 a는 태아 발생 과정동안 구성성분으로 발현되고, 반면에 이소폼 b는 출생시 보여지며, 성인의 삶에서 우세하다. 또한, SNAP-23과 같은 NAP-25 유사체가 신경계 밖, 예를 들어, 췌장 세포에서 발현된다.
천연 VAMP는 종 및 이소타입에 따라 정확한 길이를 가지는, 약 120개 잔기의 단백질이다. 도 3에 도시한 바와 같이, 대부분의 분자는 시토졸에 노출되는 반면, VAMP는 소포 내강 안쪽에 짧은 카르복시-말단 세그먼트를 포함한다. 프롤린-풍부 아미노-말단의 30개 잔기는 종 및 이소폼에 따라 달라지며, 반면에 하전된 잔기 및 소수성 잔기가 풍부하고 공지의 절단 부위를 가지는, VAMP의 중앙부(잔기 30 내지 96)는 고도로 보존된다. VAMP는 시냅토피신(synaptophysin)과 함께 시냅스 소포 막에서 모인다.
사람, 래트, 소, 토르피도, 초파리, 효모, 오징어 및 아프리시아 상동체를 포함하는 VAMP의 다양한 종 상동체(specise homologs)가 공지되어 있다. 또한, 다중 이소폼의 VAMP는 VAMP-1, VAMP-2 및 셀루브레빈을 포함하여 동정되었고, 반응하지 않는 형태는 비-뉴런성 세포로 동정되었다. VAMP-1 및 VAMP-2의 분포는 세포 형태에 따라 다르지만, VAMP는 모든 척추동물 조직에 존재하는 것으로 보인다. 닭 및 래트 VAMP-1는 TeNT 또는 BoNT/B에 의해 절단되지 않는다. 이러한 VAMP-1 상동체는 TeNT 또는 BoNT/B 절단 부위에서, 사람 및 마우스 VAMP-1에 존재하는 글루타민 대신에 발린을 가진다. 이러한 치환은 유사한 비율로 VAMP-1 및 VAMP-2 모두를 절단하는 BoNT/D, /F 또는 /G에는 나타나지 않는다.
신택신은 신경 원형질막의 시토졸 표면에 위치하며, 대부분의 단백질 부분은 시토졸에 노출된 채로, 카르복시-말단 세그먼트가 막에 박혀서 고정된다(membrane-anchored). 신택신은 칼슘 채널가 함께 시냅스전 막의 활성 지대에 모이며(colocalize), 여기서 신경전달물질 방출이 일어난다. 또한, 신택신은 시냅토타그민(synaptotagmin), 및 SSV 막의 단백질과 상호작용하여, 원형질막과 소포 사이에 기능성 다리를 형성한다. 다양한 신택신 이소폼을 확인하였다. 다른 조직에서 발현된 이소폼 2, 3, 4 및 5와 함께, 신경 세포에서 길이가 약간 다른 두가지 이소폼(285개 및 288개 잔기)을 확인하였다(이소폼 1A 및 1B). 상이한 이소폼은 BoNT/C1에 대한 감수성이 다르며, 1A, 1B, 2 및 3 신택신 이소폼은 이 독소에 의해 분리된다.
본 발명은 수송제, 및 도너 플루오로포어; 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는 클로스트리디움계 독소 기질을 포함하는 기질 조성물을 제공한다. 본 발명의 기질 조성물에서, 수송제는, 예를 들어, 클로스트리디움계 독소 기질에 공유결합될 수 있으며, 또한, 예를 들어, 단백질, 펩티드 또는 펩티도미메틱일 수 있다. 일 실시형태에서, 기질 조성물은 키메라 단백질, 펩티드 또는 펩티도미메틱이고, 수송제는 작용가능하게 클로스트리디움계 독소 기질에 융합된다. 이러한 키메라 기질 조성물은, 예를 들어, 많아야 50 또는 100개의 잔기 길이의 펩티드 또는 펩티도미메틱일 수 있다.
안테나페디아 단백질, 또는 아미노산 서열 RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:1) 을 가지는 활성단편과 같은 이의 활성 단편; HIV TAT 단백질, 또는 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:2)을 가지는 활성 단편과 같은 이의 활성 단편; 또는 아미노산 서열(SEQ ID NO:3)을 가지는 단순 포진성 바이러스 VP22 단백질과 같은, 단순 포진성 바이러스 VP22 단백질 또는 이의 활성단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다양한 수송제가, 본 발명의 기질 조성물의 클로스트리디움계 독소 기질에 공유 결합할 수 있다.
본 발명은 또한 수송제가 비-공유적으로 클로스트리디움계 독소 기질과 연관된 기질 조성물을 제공한다. 비-공유적으로 클로스트리디움계 독소 기질과 연관될 수 있는 수송제의 예로는 Chariot™ 및 MPG 펩티드가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
다양한 도너 플루오로포어 및 억셉터가 본 발명의 기질 조성물에 유용하다. 제한되지 않는 예로서, 본 발명에 유용한 도너 플루오로포어는 Alexa FLUOR®488, DABCYL 및 BODIPY을 포함한다. 본 발명에 유용한 억셉터는 비-형광 억셉터뿐아니라 억셉터 플루오로포어를 포함하며; 일 실시형태에서, 억셉터는 형광 수명이 적어도 1 마이크로초인 억셉터 플루오로포어이다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 억셉터가 테트라메틸로다민, EDANS 또는 QSY® 7인 기질 조성물을 제공한다. 본 발명의 기질 조성물에 유용한 도너 플루오로포어-억셉터 쌍의 예로는 플루오레세인-테트라메틸로다민, Alexa FLUOR®488-테트라메틸로다민, DABCYL-EDANS, 플루오레세인-QSY® 7 및 Alexa FLUOR®488-QSY® 7이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 기질 조성물로서 다양한 클로스트리디움계 독소 기질이 유용하다. 이러한 클로스트리디움계 독소 기질은 보툴리눔 독소 인식 서열이 있는 보툴리눔 독소 기질 및 파상풍 독소 인식 서열이 있는 파상풍 독소 기질을 포함한다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 수송제 및 BoNT/A 기질을 포함하는 BoNT/A 기질 조성물을 제공하며, 여기서, 기질은 도너 플루오로포어; 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 BoNT/A 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타난다. BoNT/A 기질은 예를 들어 포함할 수 있다. BoNT/A 기질은 적어도 6개의 연속하는 SNAP-25 잔기, Gln-Arg을 포함하는 6개의 연속된 잔기, 또는 이의 펩티도미메틱을 포함할 수 있다. 본 발명의 BoNT/A 기질 조성물은 예를 들어, 최대 20, 30, 40, 50 또는 100개의 잔기를 가지는 펩티드 또는 펩티도미메틱일 수 있으며, 플루오레세인-테트라메틸로다민, DABCYL-EDANS 및 Alexa FLUOR®488-QSY® 7과 같은 다양한 임의의 도너 플루오로포어-억셉터 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 또한 수송제 및 BoNT/B 기질을 포함하는 BoNT/B 기질 조성물을 제공하며, 여기서, 기질은 도너 플루오로포어; 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 BoNT/B 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타난다. 본 발명에 유용한 BoNT/B 기질은 예를 들어, 적어도 6개의 연속된 VAMP 잔기, Gln-Phe을 포함하는 6개의 연속된 잔기, 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다. 본 발명의 BoNT/B 기질 조성물은 예를 들어, 최대 20, 30, 40, 50 또는 100개의 잔기를 가지는 펩티드 또는 펩티도미메틱일 수 있다. 다양한 도너 플루오로포어-억셉터 조합이 본 발명의 BoNT/B 기질 조성물에 유용할 것으로 이해되며, 이러한 도너 플루오로포어-억셉터 쌍은 플루오레세인-테트라메틸로다민, DABCYL-EDANS 및 Alexa FLUOR®488-QSY® 7을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 또한 수송제 및 BoNT/C1 기질을 포함하는 BoNT/C1 기질 조성물을 제공하며, 여기서, 기질은 도너 플루오로포어; 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 BoNT/C1 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타난다. 본 발명의 기질 조성물에 유용한 BoNT/C1 기질은 적어도 6개의 연속된 신택신 잔기, Lys-Ala을 포함하는 6개의 연속된 잔기, 또는 이의 펩티도미메틱을 가지는 것, 및 적어도 6개의 연속하는 SNAP-25 잔기, Arg-Ala을 포함하는 6개의 연속된 잔기, 또는 이의 펩티도미메틱을 가지는 것을 포함한다. 본 발명의 BoNT/C1 기질 조성물은 예를 들어, 최대 20, 30, 40, 50 또는 100개의 잔기를 가지는 다양한 길이의 펩티드 또는 펩티도미메틱일 수 있다. 플루오레세인-테트라메틸로다민, DABCYL-EDANS 및 Alexa FLUOR®488-QSY® 7을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다양한 도너 플루오로포어-억셉터 조합이 본 발명의 BoNT/C1 기질 조성물에 유용하다.
본 발명은 또한 수송제 및 BoNT/D 기질을 포함하는 BoNT/D 기질 조성물을 제공하며, 여기서, 기질은 도너 플루오로포어; 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 BoNT/D 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타난다. 본 발명의 기질 조성물에 유용한 다양한 BoNT/D 기질은 적어도 6개의 연속된 VAMP 잔기, Lys-Leu을 포함하는 6개의 연속된 잔기, 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하는 BoNT/D 기질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 상기한 다른 기질 조성물에서와 같이, BoNT/D 기질 조성물은 예를 들어, 최대 20, 30, 40, 50 또는 100개의 잔기를 가지는 펩티드 또는 펩티도미메틱일 수 있으며, 예를 들어, 플루오레세인-테트라메틸로다민, DABCYL-EDANS 또는 Alexa FLUOR®488-QSY® 7와 같은 다양한 도너 플루오로포어-억셉터 조합을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 수송제 및 BoNT/E 기질을 포함하는 BoNT/E 기질 조성물을 제공하며, 여기서, 기질은 도너 플루오로포어; 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 BoNT/E 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타난다. 본 발명에 유용한 BoNT/E 기질은 예를 들어, 적어도 6개의 연속된 SNAP-25 잔기, Arg-Ile을 포함하는 6개의 연속된 잔기, 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다. 본 발명의 BoNT/E 기질 조성물은 예를 들어, 최대 20, 30, 40, 50 또는 100개의 잔기를 가지는 펩티드 또는 펩티도미메틱일 수 있다. 이러한 기질 조성물은 또한, 예를 들어, 플루오레세인-테트라메틸로다민, DABCYL-EDANS 및 Alexa FLUOR®488-QSY® 7과 같은 도너 플루오로포어-억셉터 조합을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 수송제 및 BoNT/F 기질을 포함하는 BoNT/F 기질 조성물을 제공하며, 여기서, 기질은 도너 플루오로포어; 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 BoNT/F 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타난다. 본 발명에 유용한 BoNT/F 기질은 예를 들어, 적어도 6개의 연속된 VAMP 잔기, Gln-Lys을 포함하는 6개의 연속된 잔기, 또는 이의 펩티도미메틱을 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 BoNT/F 기질 조성물은 예를 들어, 최대 20, 30, 40, 50 또는 100개의 잔기를 가지는 펩티드 또는 펩티도미메틱일 수 있다. 당업자라면 다양한 도너 플루오로포어-억셉터 조합이 본 발명의 BoNT/F 기질 조성물에 유용할 것으로 이해할 것이며, 이들은 예를 들어, 플루오레세인-테트라메틸로다민, DABCYL-EDANS 및 Alexa FLUOR®488-QSY® 7을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 또한 수송제 및 BoNT/G 기질을 포함하는 BoNT/G 기질 조성물을 제공하며, 여기서, 기질은 도너 플루오로포어; 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 BoNT/G 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타난다. 유용한 BoNT/G 기질은 적어도 6개의 연속된 VAMP 잔기, Ala-Ala을 포함하는 6개의 연속된 잔기, 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 BoNT/G 기질 조성물은 예를 들어, 최대 20, 30, 40, 50 또는 100개의 잔기를 가지는 펩티드 또는 펩티도미메틱일 수 있고, 예를 들어, 플루오레세인-테트라메틸로다민, DABCYL-EDANS 및 Alexa FLUOR®488-QSY® 7과 같은 도너 플루오로포어-억셉터 조합을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 수송제 및 TeNT 기질을 포함하는 TeNT 기질 조성물을 제공하며, 여기서, 기질은 도너 플루오로포어; 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 TeNT 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타난다. 적어도 6개의 연속된 VAMP 잔기, Gln-Phe을 포함하는 6개의 연속된 잔기, 또는 이의 펩티도미메틱을 가지는 것을 포함하여, 다양한 TeNT 기질이 본 발명의 기질 조성물에 유용하다. 본 발명의 이러한 TeNT 기질 조성물은 예를 들어, 최대 20, 30, 40, 50 또는 100개의 잔기를 가지는 펩티드 또는 펩티도미메틱일 수 있다. 또한, 다양한 도너 플루오로포어-억셉터 조합이 본 발명의 TeNT 기질 조성물에 유용하며; 이들 조합은 플루오레세인-테트라메틸로다민, DABCYL-EDANS 및 Alexa FLUOR®488-QSY® 7을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 기질 조성물에서, 수송제는 클로스트리디움계 독소가, 뉴런과 같은 세포 또는 췌장 선방 세포와 같은 선세포로 흡수되는 것을 용이하게 한다. 수송제는 클로스트리디움계 독소와 공유결합하거나, 비-공유적으로 클로스트리디움계 독소 기질에 연관될 수 있다. 제한되지 않는 예로서, 본 발명의 기질 조성물에 유용한 수송제는 안테나페디아 단백질, HIV TAT 단백질, 단순 포진성 바이러스 VP22 단백질, 및 이들의 활성 단편이 포함되며, 또한 Chariot™ 및 다른 MPG 펩티드와 같은 수송제가 포함되며, 각각 하기에 논의한다.
본 명세서에서 사용된, "수송제(deliverty agent)"라는 용어는 연관되거나 결합된 클로스트리디움계 독소 기질이 세포 안으로 내재화(internalization)되는 것을 가능하게 하거나, 향상시키는 임의의 분자를 의미한다. 수송제는 공지되어 있으며, 단백질 도입 펩티드(protein transduction peptides)와 펩티도미메틱 및 세포-투과 펩티드(cell-permeant peptides)와 펩티도미메틱을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 수송제는, 단백질, 펩티드, 펩티도미메틱, 작은 분자, 핵산 분자, 리포좀, 지질, 바이러스, 레트로바이러스 및 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 유용한 수송제를 포함하는 기질 조성물은 일반적으로 내재화할때 세포내 소포에 들어있지 않고, 오히려 결국에는 예를 들어, 세포질로 수송되는 것으로 이해된다. 따라서, 수송제는 연관되거나 결합된 기질을 세포 세포질 또는 핵으로 운송하는 분자들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한, "수송제"라는 용어는 수용체-매개 엔도사이토시스를 통하여 기능하는 수송제 및 수용체-매개 엔도사이토시스에 의존적인 수송제를 포함하여, 어떤 메카니즘에 의해 내재화되는 분자들을 포함하는 것으로 이해된다.
단백질 도입 펩티드, 세포 투과 펩티드, 포스포펩티드, D-아미노산을 포함하는 펩티드, 및 다른 변성 또는 접힌, 변형 또는 비변형, 그리고, 천연 또는 합성 단백질, 펩티드 및 펩티도미메틱을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다양한 수송제가, 본 발명의 조성물 중의 클로스트리디움계 독소 기질과 공유결합될 수 있다. 이러한 수송제는 핵 또는 분비 단백질 및 이의 활성 단편 및 이의 유사체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 유용한 수송제는 50개 잔기 이하의 길이, 40개 잔기 이하의 길이, 30개 잔기 이하의 길이, 20개 잔기 이하의 길이, 또는 15개 잔기 이하의 길이를 가지는 펩티드 또는 펩티도미메틱이다. 또다른 실시형태에서, 본 발명에 유용한 수송제는 주로 소수성 펩티드 또는 펩티도미메틱이다. 또다른 실시형태에서, 본 발명에 유용한 수송제는 주로 염기성 펩티드 또는 펩티도미메틱이다. 다른 실시형태에서, 본 발명에 유용한 수송제는 양쪽성(amphipathic) -나선형 펩티드 또는 펩티도미메틱과 같은 -나선형 펩티드 또는 펩티도미메틱이다. 다른 실시형태에서, 본 발명에 유용한 수송제는 염기성 양쪽성 펩티드 또는 펩티도미메틱과 같은 양쪽성 펩티드 또는 펩티도미메틱이다. 그리고, 다른 실시형태에서, 본 발명에 유용한 수송제는 변성 또는 접힌 클로스트리디움계 독소 기질에 결합된, 변성 펩티드 또는 펩티도미메틱이며, 변성은 예를 들어, WO 99/55899에 개시된 바와 같이, 내재화를 용이하게 하는 것으로 나타났다.
제한되지 않은 예로서, 본 발명에 사용하기 위한, 클로스트리디움계 독소 기질에 공유결합시 안정한 수송제는 모양체 신경영양성 인자(CNTF) 또는 이의 활성 단편; 카베올린 또는 이의 활성 단편; 인터류킨-1(IL-1) 또는 이의 활성 단편; 티오레독신 또는 이의 활성단편; 안테나페디아 또는 페네트라틴-1(SEQ ID NO:1)과 같은 이의 활성단편; 섬유아세포 성장 인자-1(FGF-1) 또는 이의 활성 단편; 인그레일드(engrailed) 또는 이의 단편; Hoxa-5 또는 이의 활성단편; 카포시 섬유아세포 성장 인자(kFGF) 또는 이의 활성단편, 예를 들어, AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 22); 사람 3 인테그린 또는 소수성 신호 서열과 같은 이의 활성단편; TPPKKKRKVEDP (SEQ ID NO:23)와 같은 핵 로칼리제이션 서열(NLS); FGF-2 또는 이의 활성 단편; 트랜스포르탄(transportan) 또는 GWTLNSAGYLLGXINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO:24)과 같은 이의 활성단편; 락토페린 또는 이의 활성단편; VP22 또는 이의 활성 단편; HIV 타입 I 트랜스액티베이터(HIV TAT) 또는 YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2)와 같은 이의 활성 단편; 또는 HSP70과 같은 열 쇼크 단백질 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 이들 및 추가적인 수송제들이 예를 들어, in Ho, Cancer Res. 61: 474-477 (2001); Schwarze and Dowdy, Trends Pharmacol. Sci. 21 : 45-48 (2000); PROCHIANTZ, Curr. Opin. Cell Biol. 12: 400-406 (2000) ; Ford et al., Gene Therapy 8: 1-4 (2001) ; Dunican and Doherty, Biopolymers Peptide Sci. 60: 45-60 (2001); 및 Schwartz and Zhang, Curr. OPIN. Mol. Ther. 2: 162-167 (2000)에 기재된 바와 같이 공지되어 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 호메오프로테인(homeoprotein) 또는 이의 활성 단편, 예를 들어, 호메오도메인 또는 이의 활성 단편인 수송제를 사용하여 실행한다. 호메오프로테인은 호메오도메인이라 칭하는, 약 60개 잔기의 DNA- 결합 도메인을 포함하는 나선-턴-나선 단백질이다. 안테나페디아, 인그레일드1(En1), 인그레일드2(En2), Hoxa-5, Hoxc-8, Hoxb-4 및 Knotted-1(KN1)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는, 다양한 호메오프로테인, 호메오도메인 및 이의 활성 단편이 본 발명의 수송제로서 유용할 수 있다. 예를 들어, En1 및 En1은 COS7 세포에서 발현되었고, 이들은 일차로 분비된 후, 다른 세포에 의해서 내재화된다. 예를 들어, Prochiantz, supra, 2000를 참조한다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 기질 조성물은 호메오도메인 단백질, 안테나페디아, 또는 이의 활성단편인 수송제를 포함한다. 안테나페디아는 뉴런 막을 가로질러 전위하는, 발생상 중요한 초파리 호메오프로테인에 속한다. 안테나페디아 호메오도메인의 제 3 나선, 16 잔기 펩티드 "페네드라틴-1"(SEQ ID NO:1)은 살아있는 세포 안으로 내재화된다. 내재화는 37℃ 및 4℃ 모두에서 일어나며, 이는 수송이 수용체-매개되는것이 아니라 에너지-의존성이라는 것을 나타낸다. 추가적으로 수송제는 하기 표 A에 나타낸 펩티드와 같이 페네트라틴-1 서열과 연관된 펩티드 및 펩티도미메틱, 또는 레트로인버스 또는 모든 D-아미노산 펩티드 또는 펩티도미메틱을 포함하는 다른 페네트라틴-유도 펩티드 또는 펩티도미메틱, 또는 관련 비--나선형 펩티드 또는 펩티도미메틱을 포함하나 이에 제한되지는 않는다(예를 들어, Prochiantz, supra, 2000참조). 일 실시형태에서, 이러한 페네트라틴-유도 펩티드는 페네트라틴-1의 트립토판, 페닐알라닌 및 글루타민 잔기를 갖는다(SEQ ID NO:1).
| 수송제로서 유용한 페네트라틴-유도 펩티드 | ||
| 펩티드 | 서열 | SEQ ID NO: |
| 43-58 | RQIKIWFQNRRMKWKK | 1 |
| 58-43 | KKWKMRRNQFWIKIQR | 25 |
| 43-58 | RQIKIWFQNRRMKWKK | 26 |
| Pro 50 | RQIKIWFPNRRMKWKK | 27 |
| 3Pro | RQPKIWFPNRRMPWKK | 28 |
| Met-Arg | RQIKIWFQNMRRKWKK | 29 |
| 7Arg | RQIRIWFQNRRMRWRR | 30 |
| W/R | RRWRRWWRRWWRRWRR | 31 |
또다른 실시형태에서, 본 발명의 기질 조성물은 HIV 트랜스-액티베이터(TAT) 단백질 또는 이의 활성단편인 수송제를 포함한다. 이러한 수송제는 예를 들어, HIV TAT의 잔기 47-57 또는 47-59에 유사하거나 동일한 서열을 포함할 수 있다(Schwartz et al., Science 285: 1569-1572 (1999); 및 Ho et al., supra, 2001). 예를 들어, HIV TAT의 잔기 47-57(YGRKKRRQRRR ; SEQ ID NO:2)을 포함하는 융합 단백질은 in vitro 및 in vivo에서 예를 들어, 사람 및 쥐 세포의 원형질 막을 가로지르며(Schwartz and Zhang, supra, 2000); HIV TAT 수송제에 융합될 때, 15 내지 120KDa의 다양한 단백질이 생물학적 활성을 유지하는 것으로 나타났다. HIV TAT 수송제는 양으로 하전될 수 있으며, 예를 들어, 공유결합된 클로스트리디움계 독소 기질을 예를 들어, 90-100%의 표적 세포로 수송하는, 에너지-, 수용체-, 운반체- 및 엔도사이토시스-의존성 방법에서 기능할 수 있다.
본 발명의 기질 조성물은 또한 수송제로서 단순 포진성 바이러스 VP22 단백질 또는 이의 활성 단편을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 기질 조성물은 HSV 타입 1 (HSV-1) VP22 단백질 또는 이의 활성 단편을 포함한다. HSV VP22, 핵 전사 인자는 비-고전적인 엔도사이토시스를 통해 원형질막을 가로지를 수 있으며, GAP 접합부 및 물리적 접촉에 의존하여 세포로 들어갈 수 있다. 여러가지 상이한 단백질과 융합하여, HSV VP22는 말단 분화된 세포를 포함하는 상이한 타입의 세포로 흡수되며(Ford et al., supra, 2001; Schwartz and Zhang, supra, 2000), 결합된 클로스트리디움계 독소 기질을 예를 들어, 90-100%의 배양된 세포로 수송하는 기능을 할 수 있다.
또다른 실시형태에서, 본 발명에 유용한 수송제는 소수성 신호 서열에 해당하거나, 그로부터 유도된다. 이러한 수송제는, 예를 들어, AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO:22)와 같은 카포시 섬유아세포 성장 인자(kFGF) 또는 이의 활성 단편; 사람 3 인테그린 또는 이의 활성 단편; 또는 Dunican and Doherty, supra, 2001에 설명된 것과 같은 다른 소수성 수송제일 수 있다.
본 발명에 유용한 수송제는 또한 단백질 도입 도메인(PTD)과 같은 천연 수송제의 하나 이상의 특징을 공유하는 합성 서열일 수 있다. 이러한 수송제는 L- 및 D-아르기닌 올리고머, 예를 들어, L- 또는 D-아르기닌의 9-머 및 관련 펩티드(Wender et al. , Proc. Natl. Acad. SCI., USA 97: 13003-13008 (2000))를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 수송제는 또한 염기성 펩티드 및 펩티도미메틱; 염기성 -나선형 펩티드 및 펩티도미메틱; 및 HIV TAT의 잔기 47-57과 같은 천연 단백질 도입 도메인과 비교할 때, 최적화된 아르기닌 배열 또는 최적화된 -나선형 특성을 가지는 펩티드 및 펩티도미메틱을 포함한다. 예를 들어, Ho et al., supra, 2001, 및 WO 99/29721를 참조한다. 본 발명에 유용한, 추가의 제한되지 않는 예로는 SCWKn (SEQ ID NO:32); (LARL)n (SEQ ID NO:33); HA2; RGD; K16RGD (SEQ ID NO:34); 롤리고머; AlkCWK18 (SEQ ID NO:35); DICWK18 (SEQ ID NO:36); 디파리틱(DipaLytic); Plae (SEQ ID NO : 37); Kplae (SEQ ID NO : 38) 및 공지되거나 통상의 방법으로 제조될 수 있는 다른 수송제가 포함된다(Schwartz and Zhang, supra, 2000 참조). 당업자는 이러한 그리고, 다른 천연 및 합성 수송제가 본 발명의 기질 조성물에 유용할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명에 유용한 수송제는 또한 비-공유적으로 클로스트리디움계 독소 기질과 연관된 세포 흡수을 가능하게 하거나 향상시키는 작용제일 수 있다. 일 실시형태에서, 이러한 수송제는 2가지 독립적인 도메인: 소수성 도메인 및 친수성 도메인을 포함하는 펩티드이다. 다른 실시형태에서, 이러한 수송제는 SV40 거대 T 항원의 핵 로칼리제이션 서열(NLS) 및 HIV-1 gp41의 융합 단백질 도메인으로부터 유도된 펩티드인 MPG 펩티드이다. 다른 실시형태에서, 수송제는 아미노산 서열 GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV (SEQ ID NO: 39)을 가지는 MPG 펩티드이다. 또다른 실시형태에서, 이러한 수송제는 Pep-1과 같은 양쪽성 펩티드이다. 이러한, 그리고, 관련된 수송제는 공유 결합이 없이 기능하며, 때때로 "단백질 트랜스펙션 생성물"로 알려져 있고, 예를 들어, Morris et al. , Nucl. Acids RES. 27 : 3510-3517 (1999); Morris et al. , J. Biol. Chem. 274: 24941-24946 (1999); 및 Morris et AL., \NATURE Biotech. 19: 1173-1176 (2001)에 기재된 바와 같이 해당 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 펩티드 수송제는 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 상업적으로 입수 가능하다; 예를 들어, Chariot™ 제품은 Active Motif사(Carlsbad, CA)로부터 입수가능하다.
본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질은 도너 플루오로포어를 일부 포함한다. 본 명세서에 사용할 때, "도너 플루오로포어"란 용어는 특정 파장의 빛을 조사하면, 상이한 파장의 빛을 형광으로 방출하는 분자를 의미한다. 플루오로포어란 용어는 당해 기술분야에서 "플루오로크롬"이란 용어와 동의어이다.
본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질은 또한 억셉터를 일부 포함한다. 본 명세서에서 사용할 때, "억셉터"란 용어는 도너 플루오로포어가 여기할 때, 그로부터 에너지를 흡수하는 분자를 의미하며, 형광분자뿐아니라 비-형광 분자도 포함하는 용어이다. 클로스트리디움계 독소 기질에 유용한 억셉터는, 기질에 포함된 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가진다. 본 발명에 유용한 억셉터는 일반적으로 도너 플루오로포어의 여기(excitation)에 적합한 파장에서는 오히려 흡수를 적게 한다.
상기한 바와 같이, 억셉터는 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가진다. 본 명세서에서 사용할 때, "겹치는"이란 용어는, 억셉터의 흡수 스펙트럼과 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼을 참고하여, 흡수 스펙트럼 및 방출 스펙트럼이 일부 또는 전부 공유되는 것을 의미한다. 따라서, 이러한 겹치는 스펙트럼들에서, 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼 범위의 상단은 억셉터의 흡수 스펙트럼 범위의 하단보다 높다.
본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질은 도너 플루오로포어와, 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터 "사이에 있는" 절단 부위를 포함한다. 따라서, 절단 부위는 플루오로포어와 억셉터 사이에 위치하여, 부위를 절단하면 플루오로포어를 포함하는 제 1 분자와, 억셉터를 포함하는 제 2 분자를 얻게 된다. 클로스트리디움계 독소 인식 서열의 모든 또는 임의의 부분이 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 있을 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질은 절단 부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 일부 포함한다. 이러한 클로스트리디움계 독소 기질은, 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서, 적어도 하나의 클로스트리디움계 독소에 의한 절단에 민감하다.
본 명세서에서 사용될 때, "클로스트리디움계 독소 인식 서열"이란 용어는 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서, 클로스트리디움계 독소에 의해서 절단된 결합에서, 단백가수분해를 검출하기에 충분한 인접 또는 비-인접 인식 요소와 함께 분리하기 쉬운 결합을 의미한다. 여러가지 유용한 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 하기에 논의한다.
특정 실시예에 있어서, 본 발명의 기질 조성물은 키메라 단백질, 펩티드 또는 펩티도미메틱이다. 본 발명의 기질 조성물은 예를 들어, 최대 20개의 잔기, 최대 40개의 잔기, 최대 50개의 잔기, 최대 100개의 잔기, 최대 150개의 잔기, 최대 200개의 잔기, 최대 250개의 잔기, 최대 300개의 잔기, 최대 350개의 잔기 또는 최대 400개의 잔기를 가지는 키메라 펩티드 또는 펩티도미메틱일 수 있다.
본 명세서에서 사용할 때, "펩티도미메틱(peptidomimetic)"이란 용어는 구조를 기본으로 할때, 펩티드 기질과 동일한 클로스트리디움계 독소에 의해 절단되는 펩티드-유사 분자를 의미하는 넓은 의미로 사용된다. 이러한 펩티도미메틱는 화학적으로 변형된 펩티드, 비-천연 아미노산을 포함하는 펩티드-유사 분자, 및 N-치환된 글리신의 올리고머 어셉블리로부터 얻은 펩티드-유사 분자인 펩토이드를 포함하며, 펩티도미메틱이 유도될 때, 펩티드 기질과 동일한 클로스트리디움계 독소에 의해서 절단된다(예를 들어, Goodman and Ro, PEPTIDOMIMETICS for Drug DESIAN, in "Burger's Medicinal Chemistry and Drug DISCOVERY" VOL. 1 (ed. M. E. Wolff; John Wiley & Sons 1995), pages 803-861참조).
예를 들어, 속박된(constrained) 아미노산을 포함하는 펩티드-유사 분자, 펩티드 2차 구조 또는 아미드 결합 등입체성계(isostere)를 모방한 비-펩티드 구성요소를 포함하는, 다양한 펩티도미메틱이 공지되어 있다. 속박된, 비-천연 아미노산을 포함하는 펩티도미메틱은 예를 들어, -메틸화된 아미노산; ,-디알킬-글리신 또는 -아미노시클로알칸 카르복시산; N -C 고리화된 아미노산; N -메틸화된 아미노산; - 또는 γ-아미노 시클로알칸 카르복시산; ,-불포화 아미노산; ,-디메틸 또는 -메틸 아미노산; -포화된-2,3-메타노 아미노산; NCδ 또는 Cδ-Cδ 고리화된 아미노산; 또는 포화된 프롤린 또는 다른 아미노산 모방체(mimetic)를 포함할 수 있다. 또한, 펩티드 2차 구조를 모방한 펩티도미메틱은예를 들어, 비-펩티드성 -턴 모방; γ-턴 모방; -시트 구조의 모방; 또는 나선형 구조의 모방을 포함할 수 있으며, 각각은 공지되어 있다. 펩티도미메틱은 또한 예를 들어, 레트로-인베르소 변형과 같은 아미드 결합 등입체성계; 감소된 아미산 결합; 메틸렌티오에테르 또는 메틸렌술폭사이드 결합; 메틸렌 에테르 결합; 에틸렌 결합; 티오아미드 결합; 트랜스-올레핀 또는 플루오로올레핀 결합; 1,5-이치환된 테트라졸 링; 케노메틸렌 또는 플루오로케토메틸렌 결합 또는 다른 아미드 등입체성계를 포함하는 펩티드-유사 분자일 수 있다. 당업자는 이러한, 그리고, 다른 펩가 본 명세서에 사용된 "펩티도미메틱"라는 용어에 포함된다는 것을 이해할 것이다.
또한, 본 발명에는 도너 플루오로포어; 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는 클로스트리디움계 독소 기질을 포함하는 세포가 제공된다. 일 실시형태에서, 세포는 트랜스펙션된 세포이다. 다른 실시형태에서, 세포는 안정하게 트랜스펙션된 세포이다. 일차 세포; 확립된 세포(established cell); 사람 세포; 일차 뉴런, 확립된 뉴런 및 사람 뉴런과 같은 뉴런성 세포; 및 예를 들어, 췌장 선방 세포와 같은 선세포일 수 있는 비-뉴런성 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다양한 세포가 본 발명에 유용하다. 본 발명에 유용한 뉴런은 CNS 뉴런 및 말초 뉴런을 포함하며, 제한되지 않는 예로서, 이러한 뉴런은 신경아세포종 세포, 척수 뉴런, 배측 신경근 신경절 뉴런, 대뇌 피질 뉴런, 소뇌 뉴런, 해마 뉴런 또는 운동 뉴런을 포함한다.
본 발명의 세포에서, 클로스트리디움계 독소 기질은 선택적으로 수송제에 공유결합될 수 있다. 이러한 수송제는 예를 들어, 단백질, 펩티드 또는 펩티도미메틱일 수 있다. 안테나페디아 단백질, 또는 아미노산 서열 RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:1) 을 가지는 활성단편과 같은 이의 활성 단편; HIV TAT 단백질, 또는 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:2)을 가지는 활성 단편과 같은 이의 활성 단편; 또는 아미노산 서열(SEQ ID NO:3)을 가지는 단순 포진성 바이러스 VP22 단백질과 같은, 단순 포진성 바이러스 VP22 단백질 또는 이의 활성단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다양한 수송제가 본 발명의 세포에 유용하다. 일 실시형태에서, 본 발명은 클로스트리디움계 독소를 포함하는 키메라 단백질, 펩티드 또는 펩티도미메틱 및 기질에 작용가능하게 융합되는 수송제를 포함하는 세포를 제공한다. 이러한 키메라 단백질, 펩티드 또는 펩티도미메틱은 예를 들어, 최대 50 또는 100개의 잔기를 가지는 길이일 수 있다.
다양한 클로스트리디움계 독소 기질이 본 발명의 세포에 포함된다. 이러한 기질은 모든 세포타입의 보툴리눔 독소 기질뿐아니라 파상풍 독소 기질도 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 BoNT/A 인식 서열을 일부 포함하는 BoNT/A 기질을 포함하는 세포를 제공한다. 이러한 BoNT/A 기질은 예를 들어, 적어도 6개의 연속된 SNAP-25 잔기, Gln-Arg를 포함하는 6개의 연속된 잔기 또는 이의 펩티도미메틱을를 포함할 수 있다. 또다른 실시형태에서, 본 발명은 BoNT/B 인식 서열을 일부 함유하는 BoNT/B 기질을 포함하는 세포를 제공한다. 본 발명의 세포에 유용한 BoNT/B 기질은 적어도 6개의 연속된 VAMP 잔기, Gln-Phe를 포함하는 6개의 연속된 잔기, 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또다른 실시형태에서, 본 발명은 BoNT/C1 인식 서열을 일부 포함하는 BoNT/C1 기질을 포함하는 세포를 제공한다. 본 발명의 세포에 유용한 BoNT/C1 기질은 적어도 6개의 연속되는 신택신 잔기, Lys-Ala을 포함하는 6개의 연속되는 잔기, 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하며, 또한 적어도 6개의 연속된 SNAP-25 잔기, Arg-Ala을 포함하는 6개의 연속된 잔기, 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명은 BoNT/D 인식 서열을 일부 포함하는 BoNT/D 기질을 포함하는 세포를 제공한다. 적어도 6개의 연속하는 VAMP 잔기, Lys-Leu를 포함하는 6개의 연속된 잔기, 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다양한 BoNT/D 기질이 본 발명의 세포에 유용하다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 BoNT/E 인식 서열을 일부 함유하는 BoNT/E를 포함하는 세포를 제공한다. 이러한 BoNT/E 기질은 예를 들어, 적어도 6개의 연속하는 SNAP-25 잔기, Arg-Ile를 포함하는 6개의 연속된 잔기, 또는 이의 펩티도미메틱을 가질 수 있다. 추가적인 실시형태에서, BoNT/F 인식 서열을 일부 함유하는 BoNT/F 기질을 포함하는 세포가 제공된다. 본 발명의 세포에 유용한 BoNT/F 기질은 예를 들어, 적어도 6개의 연속된 VAMP 잔기, Gln-Lys을 포함하는 6개의 연속된 잔기, 또는 이의 펩티도미메틱을 가질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 BoNT/G 인식 서열을 일부 포함하는 BoNT/G 기질을 포함하는 세포를 제공한다. 유용한 BoNT/G 기질은 적어도 6개의 연속된 VAMP 잔기, Ala-Ala을 포함하는 6개의 연속된 잔기, 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또다른 실시형태에서, 본 발명은 TeNT 인식 서열을 일부 포함하는 TeNT 기질을 포함하는 세포를 제공한다. 적어도 6개의 연속된 VAMP 잔기, Gln-Phe을 포함하는 6개의 연속된 잔기, 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하는, 다양한 TeNT 기질이 본 발명에 유용하다.
상기한 바와 같이, 다양한 도너 플루오로포어 및 억셉터가 본 발명에 유용하다. 본 발명에 유용한 도너 플루오로포어는 Alexa FLUOR®488, DABCYL 및 BODIPY을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 유용한 억셉터는 비-형광 억셉터뿐아니라 억셉터 플루오로포어를 포함하며, 형광 수명이 적어도 1 마이크로초인 억셉터 플루오로포어를 포함한다. 본 발명의 세포에 유용한 억셉터는 테트라메틸로다민, EDANS 및 QSY® 7이다.
본 명세서에서 사용될 때, "세포"라는 용어는 클로스트리디움계 독소와 결합하는 적어도 하나의 수용체를 발현하거나, 발현하도록 조작될 수 있는 임의의 진핵세포를 의미한다. 세포라는 용어에는 일차 세포; 배양된 세포; 확립된 세포(established cell); 정상 세포; 변형 세포; 종양 세포; 감염 세포; 안정하게 및 일시적으로 트랜스펙션된 세포를 포함하는, 안정하게 또는 일시적으로 트랜스펙션된 세포; 및 증식 및 말단 분화된 세포뿐아니라 다양한 종 및 세포 타입의 세포가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 세포라는 용어에는 쥐, 래트, 돼지, 소, 말, 영장류 및 사람 세포와 같은 포유류 세포가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 유용한 세포는 증식 또는 정지와 같은 임의의 상태일 수 있으며;고유 것이거나, 또는 일렉트로포레이션을 통해 또는 디지토닌으로 처치하여 투과가능하게 될 수 있고; 분리된 형태이거나, 또는 이종혼합된 세포 팝퓰레이션, 조직 또는 기관의 일부일 수 있다. 본 발명에 유용한 세포는 연속적이거나 유도가능한 프로모터를 제어하여 클로스트리디움계 독소 기질을 발현하는 것을 포함하며, 본 발명에 유용한 이러한, 그리고 다른 세포들은 하나이상의 내생적인 클로스트리디움계 독소 표적 단백질을 발현할 수 있거나, 낮거나 검출불가능한 수준의 하나 또는 모든 표적 단백질(SNAP-25, VAMP 및 신택신과 같은)을 발현할 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명에 유용한 세포는 하나 이상의 내생성 저친화도 또는 고친화도 클로스트리디움계 독소 수용체를 발현하는 세포; 낮은 또는 검출할 수 없는 수준의 내생성 수용체를 발현하고, 하나 이상의 클로스트리디움계 독소 수용체를 암호화하는 하나 이상의 외생성 핵산 분자로 트랜스펙션되었거나 아니면 이를 발현하도록 조작된 세포; 및 하나이상의 클로스트리디움계 독소 세포타입을 위한 내생성 및 외생성 독소 수용체의 조합을 발현하는 세포를 포함한다. 세포의 선택은 어떤 클로스트리디움계 독소가 에세이되느냐에 따라 일부 달라지는 것으로 이해된다. 예를 들어, BoNT/A 활성을 에세이하기 위해서는, BoNT/A에 대한 낮은 또는 높은 친화도의 수용체를 발현하거나 발현하도록 조작될 수 있는 세포를 선택한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 도너 플루오로포어, 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터, 및 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타는 클로스트리디움계 독소 기질을 포함하는 뉴런을 제공한다.
다양한 뉴런이 본 발명에 유용할 수 있다. 제한되지 않는 예로서, 본 발명에 유용한 뉴런은 일차 뉴런; 확립된 뉴런; 변형 뉴런; 안정하게 트랜스펙션된 뉴런; 또는 운동 또는 감각 뉴런일 수 있으며, 또한, 예를 들어, 포유류, 쥐, 래트, 영장류 또는 사람 뉴런일 수 있다. 본 발명에 유용한 뉴런은 말초뉴런 또는 CNS 뉴런일 수 있으며; 제한되지 않는 예로서, 태아 척수 뉴런과 같은 척수 뉴런, 배측 근 신경절(DRG) 뉴런, 대뇌 피질 뉴런, 소뇌 뉴런, 해마 뉴런 및 운동 뉴런이 하기에 설명한 바와 같이 본 발명에 유용할 수 있다.
본 발명에 유용한 뉴런의 예로는, 태아 DRG 뉴런의 일차 배양물, 예를 들어, Welch et al., Toxicon 38: 245-258 (2000)에 기재된 태아 래트 DRG 뉴런의 일차 배양물; 태아 척수 뉴런의 일차배양물, 예를 들어, Neale et al. , J. Cell Biol. 147: 1249-1260 (1999), 또는 Chaddock et al., Infect. Immun. 68 : 2587-2593 (2000)에 기재된 쥐 태아 척수 뉴런의 일차 배양물이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 유용한 뉴런성 세포라인의 예로는, LA-N-2, SH-SY5Y, N2a, NS-20Y 및 NIE-115와 같은 신경아세포종 세포 라인; NG108-C15와 같은 신경아세포종/신경교종 하이브리드를 포함하는 하이브리드 세포라인; NSC-34 및 NSC-19과 같은 운동 뉴런 세포라인; M4b와 같은 척수 세포라인; CNS 세포라인; CNh와 같은 대뇌 피질 세포라인; G4b와 같은 배측 근 신경절 세포라인; HT-22와 같은 해마 세포라인; 및 PC12와 같은 크롬친화성세포종 세포라인이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 유용한 뉴런성 세포 라인은 예를 들어, 쥐, 영장류 또는 사람 신경아세포종 세포라인과 같은 신경아세포종 세포라인을 포함할 수 있다. 본 발명에 유용한 신경아세포종 세포라인의 예로는 LA-N-2, SH-SY5Y, N2a, NS-20Y 및 NIE-115가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 본 발명은 콜린성 뉴런의 성질을 가지며, 잘 특징지워진 콜린성 마커를 발현하는 LA-N-2 사람 신경아세포종 세포라인을 사용하여 실시할 수 있다(Rylett et al., Neurochem. 61: 1388-1397 (1993); Singh et al. , J. Neurosci. Res. 25: 476-485 (1990); 및 Yeh et al. , Neuroscience 27: 309-315 (1988)). 또다른 예로서, 본 발명은 보툴리눔 독소에 노출시 K+/Ca+에 의해 유도된 [3H]-노르아드레날린 방출을 억제하는 SH-SY5Y 사람 신경아세포종 세포라인을 사용하여 실시할 수 있다(Purkiss et al., NEUROTOXICOLOGY 22: 447-453 (2001))
쥐, 영장류 및 사람 하이브리드 뉴런성 세포 라인과 같은 하이브리드 뉴런성 세포라인이 또한 본 발명에 유용하다. 이러한 하이브리드 세포 라인은 신경아세포종/신경교종 하이브리드 와 같은 신경아세포종 하이브리드를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 유용한 NG108-C15 세포 라인은 마우스 신경아세포종 및 래트 신경교종 세포의 하이브리드이다(Yokosawa et al., Infect. Immun. 57: 272-277 (1989); Yokosawa et al. , Toxicon 29: 261-264 (1991)). NG108-C15 세포 라인은 예를 들어, BoNT/C1 활성을 에세이하기 위하여 BoNT/C1 기질을 포함하도록 조작될 수 있다. 추가로, 하이브리드 세포라인은, 발달 운동 뉴런을 닮은, 척수 뉴런과 신경아세포종의 하이브리드인 NSC 세포라인을 포함할 수 있다Cashman et al., Dev. DYN. 194: 209-221 (1992)).
본 발명에 유용한 뉴런성 세포 라인은 또한 쥐, 영장류 또는 사람 운동 뉴런 세포 라인과 같은 운동 뉴런 세포라인일 수 있다. 본 발명에 융용한 운동 뉴런 세포 라인의 예로는 NSC-34 및 NSC-19이 있으며; 마우스 신경아세포종(N18TG2)과 분리된 태아(12-14일) 마우스 척수 운동 뉴런의 클론 하이브리드인 이들 세포 라인은 운동 뉴런 특성을 발현하며, 다극성 뉴런-유사 표현형을 나타낸다(Eggett et al., J. Neurochem. 74: 1895-1902 (2000)). NSC-34 및 NSC-19 세포는 높은 수준의 콜린 아세틸트랜스페라아제(CHAT), 운동 뉴런의 마커를 발현한다. 이들 세포는 또한 작용 포텐셜을 발생시키고; 신경미세섬유 3중 단백질(neurofilament triplet proteins)을 발현하고; 아세틸콜린을 합성, 저장 및 방출한다.
본 발명에 유용한 뉴런성 세포 라인은 또한, 쥐, 영장류 또는 사람 척수 세포라인과 같은 척수 세포라인일 수 있다. 예를 들어, 사람 척수 세포라인은, Li et al., J. Neurosci. Res. 59: 342-352 (2000)에 기재된 테트라시클린 억제가능 v-myc 종양유전자로 불멸화된(immortalize) 사람 태아 척수 세포로부터 생성될 수 있다(최초 3개월 태아). 이러한 세포는 콜린 아세틸트랜스페라아제와 같은 뉴런성 표현형 마커를 발현하는 기능성 뉴런으로 급속 분화(4-7일)하기 전에 증식 성장 조건에서 무기한으로 팽창될 수 있다. 다른 예로서, 쥐 척수 세포 라인은 변형 배지를 사용하여 태아 척수 배양물을 불멸화하여 제조될 수 있다. 이러한 척수 세포 라인은, 예를 들어, 쥐 M1b 라인일 수 있으며, NSE, 시냅토피신, MAP-2 및 콜린 아세틸트랜스페라아제와 같은 뉴런성 마커를 발현하고, 적절한 자극을 받으면 아세틸콜린을 방출할 수 있다(Cardenas et al., Neurosci. Res. 68: 46-58 (2002)).
쥐, 영장류 및 사람 CNS 세포 라인을 포함하는 사람 중추 신경계(CNS) 세포 라인이 또한 본 발명에 유용할 수 있다. 유용한 CNS 세포 라인은 예를 들어, Sah et al., Nature Biotechnol. 15: 574-580 (1997)에 기재된 테트라시클린 억제가능 v-myc 종양유전자로 불멸화된 사람 CNS 세포 라인일 수 있다. 종양유전자의 억제시, 세포는 뉴런으로 분화된다.
대뇌 피징(CNh) 세포 라인이 또한 본 발명에 유용한 뉴런이다. 유용한 대뇌 피질 세포라인은 쥐, 영장류 및 사람 세포라인을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 12-16일된 태아로부터의 쥐 피질 일차 배양물을 예를 들어, 세포를 in vitro에서 변형을 유도하는 래트 티로이드(thyroid) 세포라인으로부터, 조절된 배지에서 배양함으로써 불멸화할 수 있다. 불멸화된 세포는 적절한 배지를 사용하여 뉴런성 마커를 발현하는 뉴런으로 분화될 수 있고; 이러한 분화된 세포는 콜린 아세틸트랜스페라아제를 발현하며, 분극화 및 니코틴 자극에 반응하여 아세틸콜린 및 글루타메이트를 분비한다(Allen et al., Eur. J. Neurosci. 12: 3259-3264 (2000)).
쥐, 영장류 및 사람 배측 근 신경절 세포라인을 포함하는 배측 근 신경절 세포라인이 또한 본 발명에 유용할 수 있다. 상기한 바와 같이 변형 조절된 배지로 태아 배측 근 신경절 일차 배양물을 불멸화시킬 수 있다. 분화시, 세포라인은 뉴런의 특성을 나타내며, 면역조직화학에 의한 신경교세포 마커가 없다. 칼륨 및 니코틴에 반응하여 아세틸콜린과 같은 신경전달물질의 방출이 유도될 수 있다(Allen et al., NEUROREPORT 13: 491-496 (2002)). 본 발명에 유용한 DRG 세포라인의 예로는 쥐 DRG 세포 라인 G4b가 있다.
본 발명은 또한 쥐, 영장류 및 사람 해마 세포 라인과 같은 해마 세포 라인을 사용하여 실시할 수 있다. 제한되지 않은 예로서, 쥐 해마 세포 라인 HT-22가 본 발명에 유용하다. 당업자는 이러한, 그리고, 추가적인 일차 및 확립된 뉴런이 본 발명의 방법 및 조성물에 유용할 수 있을 것으로 이해할 것이다.
본 발명은 고유의 세포 및 투과가능하게된 세포를 사용하여 모두 실시될 수 있을 것으로 이해된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 세포는 예를 들어, 일렉트로포레이션에 의해서 또는 디지토닌 또는 낮은 이온세기 버퍼에 노출심으로써 투과가능하게 된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 세포는 투과가능하게 된 PC12 세포이다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 유용한 뉴런은 하나 이상의 클로스트리디움계 독소을 위한, 내재성 또는 외재성 낮은 또는 높은 친화도 수용체를 발현하는 것으로 이해된다. 일반적으로 이러한 뉴런은 또한 예를 들어, 50nM 이하, 5nM 이하, 0.5nM 이하, 0.05nM 이하, 0.005nM 이하, 0.0005nM 이하, 0.00005nM 이하 또는 0.000005nM 이하의 IC50을 가지는 클로스트리디움계 독소에 노출될 때, 엑소사이토시스를 억제한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 50nM 이하, 5nM 이하, 0.5nM 이하, 0.05nM 이하, 0.005nM 이하, 0.0005nM 이하, 0.00005nM 이하 또는 0.000005nM 이하의 IC50을 가지는 BoNT/A에 노출될 때, 엑소사이토시스를 억제하는 BoNT/A 기질을 포함하는 뉴런을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 50nM 이하, 5nM 이하, 0.5nM 이하, 0.05nM 이하, 0.005nM 이하, 0.0005nM 이하, 0.00005nM 이하 또는 0.000005nM 이하의 IC50을 가지는 BoNT/B에 노출될 때, 엑소사이토시스를 억제하는 BoNT/B 기질을 포함하는 뉴런을 제공한다. 본 발명은 50nM 이하, 5nM 이하, 0.5nM 이하, 0.05nM 이하, 0.005nM 이하, 0.0005nM 이하, 0.00005nM 이하 또는 0.000005nM 이하의 IC50을 가지는 BoNT/C1에 노출될 때, 엑소사이토시스를 억제하는 BoNT/C1 기질을 포함하는 뉴런을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 50nM 이하, 5nM 이하, 0.5nM 이하, 0.05nM 이하, 0.005nM 이하, 0.0005nM 이하, 0.00005nM 이하 또는 0.000005nM 이하의 IC50을 가지는 BoNT/D에 노출될 때, 엑소사이토시스를 억제하는 BoNT/D 기질을 포함하는 뉴런을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 50nM 이하, 5nM 이하, 0.5nM 이하, 0.05nM 이하, 0.005nM 이하, 0.0005nM 이하, 0.00005nM 이하 또는 0.000005nM 이하의 IC50을 가지는 BoNT/E에 노출될 때, 엑소사이토시스를 억제하는 BoNT/E 기질을 포함하는 뉴런을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 50nM 이하, 5nM 이하, 0.5nM 이하, 0.05nM 이하, 0.005nM 이하, 0.0005nM 이하, 0.00005nM 이하 또는 0.000005nM 이하의 IC50을 가지는 BoNT/F에 노출될 때, 엑소사이토시스를 억제하는 BoNT/F 기질을 포함하는 뉴런을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 50nM 이하, 5nM 이하, 0.5nM 이하, 0.05nM 이하, 0.005nM 이하, 0.0005nM 이하, 0.00005nM 이하 또는 0.000005nM 이하의 IC50을 가지는 BoNT/G에 노출될 때, 엑소사이토시스를 억제하는 BoNT/G 기질을 포함하는 뉴런을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 50nM 이하, 5nM 이하, 0.5nM 이하, 0.05nM 이하, 0.005nM 이하, 0.0005nM 이하, 0.00005nM 이하 또는 0.000005nM 이하의 IC50을 가지는 TeNT에 노출될 때, 엑소사이토시스를 억제하는 TeNT 기질을 포함하는 뉴런을 제공한다. 동일한 뉴런이, 각각의 개별적인 독소 세포타입에 대해 동일하거나 상이한 IC50을 가지는 상이한 클로스트리디움계 독소 세로타입을 위한 둘 이상의 수용체를 발현할 수 있는 것으로 이해된다.
일차 세포 및 확립된 세포를 포함하는 다양한 비-뉴런성 세포가 또한 본 발명에 유용하다. 이러한 비-뉴런성 세포는 일차세포; 확립된 세포; 안정하게 및 일시적으로 트랜스펙션된 세포; 및 종양 세포 뿐아니라, 포유류, 쥐, 래트, 영장류 및 사람 세포를 포함하는 모든 종의 기원(origin) 세포를 포함한다. 제한되지 않는 예로서, 본 발명에 유용한 비-뉴런성 세포는 췌장 선방 세포, 췌장 -섬 세포, 및 인슐린종 HIT 또는 INS-1 세포; 섬유아세포; 근육세포; 및 간세포와 같은 선세포를 포함한다.
본 발명에 유용한 비-뉴런성 세포는 또한 임의의 하기 일차 또는 확립된 세포: 전방 뇌하수체 세포; 부신 수질의 크로마핀 세포와 같은 부신 세포; 엔테로크로마핀-유사 세포와 같은 위 세포; 췌장 섬 -세포와 같은 췌장 세포; 스테로이드-생성 난소 세포와 같은 난소 세포; 내측 수질 수집 덕트(IMCD) 세포와 같은 신장세포; 췌장 선방 세포; 혈소판; 호중구; 호산구; 비만 세포; 혀끝 원형질막의 상피 세포와 같은 상피 세포; 및 글루코오즈 운송 (GLUT4) 전위에 관련된 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 제한되지 않은 예로서, 본 발명에 유용한 비-뉴런성 세포는 SNAP-25 인식 서열을 가지는 클로스트리디움계 독소 기질을 포함할 수 있으며; 이러한 비-뉴런성 세포는 예를 들어, 일차 또는 확립된 전방 뇌하수체 세포; 부신수질의 크로마핀 세포와 같은 부신 세포; 엔테로크로마핀-유사 세포와 같은 위 세포; 췌장 섬 -세포와 같은 췌장 세포; 스테로이드-생성 난소 세포와 같은 난소 세포일 수 있다. 또한, 제한되지 않는 예로서, 본 발명에 유용한 비-뉴런성 세포는 SNAP-23 인식 서열을 가지는 클로스트리디움계 독소 기질을 포함할 수 있으며; 이러한 비-뉴런성 세포는 예를 들어, 내측 수질 수집 덕트(IMCD) 세포와 같은 신장세포; 췌장 선방 세포; 혈소판; 호중구; 호산구; 비만 세포; 혀끝 원형질막의 상피 세포와 같은 상피 세포; 또는 글루코오즈 운송 (GLUT4) 전위에 관련된 세포일 수 있다. 이러한, 그리고 다양한 다른 일차 및 확립된 비-뉴런성 세포가 본 발명에 유용할 것으로 이해된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 도너 플루오로포어; 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는 클로스트리디움계 독소기질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 확립된 비-뉴런성 세포를 제공한다. 이러한 확립된 비-뉴런성 세포는 예를 들어, 클로스트리디움계 독소 기질을 암호화하는 핵산 분자를 사용하여 안정하게 트랜스펙션될 수 있다.
내재성 및 트랜스펙션된 클로스트리디움계 독소 수용체를 발현하는 세포는, 독소 흡수에 대한 직접 및 간접 에세이를 포함하는 통상의 방법으로 확인할 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 방법은 예를 들어, 형광 표지되거나 방사표지된 독소와 같은 표지된 독소따라 달라질 수 있다. 이러한 방법은 또한 예를 들어, 면역세포화학 또는 웨스턴 블럿에 의해서 세포내 독소를 검출하는 데 사용될 수 있는, 예를 들어, 항-독소 항체를 사용하여 실시될 수 있다. 또한, 클로스트리디움계 독소 수용체를 발현하여, 하나이상의 클로스트리디움계 독소를 흡수하는 세포는 또한 절단된 표적 단백질에 대한 에세이에 의해서 확인될 수 있다. 예를 들어, SNAP-25197, BoNT/A의 절단 생성물을 특이적으로 인식하는 항체를 사용하는 웨스턴 블럿 은 BoNT/A 흡수를 검정하는 데 사용될 수 있다. 또한, 공지의 에세이들이 뉴런에서의 엑소사이토시스의 억제를 측정하여 3H-노르아드레날린 또는 다른 신경전달물질 분비, 또는 전방 뇌하수체 세포 또는 난소 세포와 같은 내분비 세포로부터의 호르몬의 방출을 검출하는 것을 포함한다. 세포내 독소, 독소 절단 생성물, 또는 독소 기능에 대한 이러한, 그리고, 유사한 에세이가, 본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 뉴런 또는 다른 세포를 선택하는 데 유용할 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명은 또한 "복합(composite)" 클로스트리디움계 독소 기질이 병합된 세포를 제공한다. 이러한 복합 클로스트리디움계 독소 기질은 (a) 친화도 커플의 제 1 파트너에 결합된 도너 플루오로포어-억셉터 쌍의 제 1 멤버, 및 (b) 절단 부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하며, 여기서, 인식 서열은 도너 플루오로포어-억셉터 쌍의 제 2 구성요소 및 친화도 커플의 제 2 파트너에 결합하고, 여기서, 절단 부위는 도너 플루오로포어-억셉터 쌍의 제 2 멤버와 친화도 커플의 제 2 파트너 사이에 있고, (a) 및 (b)는 안정하게 결합되어서, 알맞은 조건 하에서, 도너 플루오로포어-억셉터 쌍의 제 1 및 제 2 멤버 사이에서, 공명 에너지 전이가 나타난다. 따라서, 복합 클로스트리디움계 독소 기질은, 사실상, 두부분으로 된 클로스트리디움계 독소이며, 두 부분이 친화도 커플을 통하여 안정하게 결합된다. 다른 클로스트리디움계 독소 기질에서와 같이, 복합 기질이 분리되면, 공명 에너지 전이가 변경된다. 본 명세서에 기재된, 그리고, 공지된 클로스트리디움계 독소 인식 서열 및 절단 부위가 복합 클로스트리디움계 독소 기질에 유용할 것으로 이해된다.
본 명세서에서 사용될 때, "도너 플루오로포어-억셉터 페어"라는 용어는 도너 플루오로포어, 및 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터를 의미한다. 쌍의 제 1 멤버는 도너 플루오로포어이면, 쌍의 제 2 멤버는 억셉터일 것이다. 쌍의 제 1 멤버가 억셉터이면, 상의 제 2 멤버가 도너 플루오로포어일 것이다.
일 실시형태에서, 도너 플루오로포어-억셉터 쌍의 제 1 멤버가 도너 플루오로포어이고, 제 2 멤버는 억셉터이다. 다른 실시형태에서, 도너 플루오로포어-억셉터 쌍의 제 1 멤버가 억셉터이고, 제 2 멤버는 도너 플루오로포어이다. 하기에 기재한 도너 플루오로포어 및 억셉터를 포함하여, 다양한 도너 플루오로포어 및 억셉터가 본 발명의 세포 또는 방법에 유용한 복합 클로스트리디움계 독소 기질에 병합될 수 있다. 일 실시형태에서, 도너 플루오로포어는 형광 단백질이다. 다른 실시형태에서, 도너 플루오로포어 및 억셉터 각각이 형광 단백질이다. 유용한 형광 단백질로는 녹색 형광 단백질(GFP), 청색 형광 단백질(BFP), 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP) 및 적색 형광 단백질(RFP)이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에 사용될 때, "친화도 커플"이라는 용어는 안정한, 비-공유결합을 형성할 수 있는 두개의 분자를 의미한다. 복합 기질에 유용한 친화도 커플은 SNAP-25-신택신; VAMP-시냅토타그민; 스트렙타비딘-바이오틴; S 펩티드-S 단백질; 수용체-리간드; 이합체 수용체 또는 다른 상호작용하는 단백질를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, 친화도 커플은 SNAP-25-신택신이다. 다른 실시형태에서, 친화되 커플은 VAMP-시냅토타그민이다.
본 발명은 또한 도너 플루오로포어; 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는 클로스트리디움계 독소 기질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 클로스트리디움계 독소 기질을 암호화하는 핵산 분자는 예를 들어, 테트라사이클린 조절된 조절 요소 또는 엑디손 유도성 조절 요소와 같은(이에 제한되지는 않는다), 구조성 조절요소 또는 유도성 조절요소와 같은 조절 요소(regulatory element)에 결합될 수 있다. 유전학적으로 암호화된 본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질에 유용한 유전학적으로 암호화된 도너 플루오로포어 및 억셉터는 녹색 형광 단백질(GFP) 및 하기에 설명되거나 공지된 다른 형광 단백질들을 포함한다.
일 실시형태에서, 암호화된 클로스트리디움계 독소 인식 서열은 사람 SNAP-25(SEQ ID NO:4)의 잔기 34 내지 206이다. 다른 실시형태에서, 암호화된 클로스트리디움계 독소 인식 서열은 사람 SNAP-25(SEQ ID NO:4)의 잔기 34 내지 206이고, 도너 플루오로포어 또는 억셉터가 녹색 형광 단백질이다. 다른 실시형태에서, 암호화된 클로스트리디움계 독소 인식 서열은 사람 SNAP-25(SEQ ID NO:4)의 잔기 34 내지 206이고, 도너 플루오로포어 및 억셉터가 각각 녹색 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 청록색 형광 단백질, 황색 형광 단백질 또는 적색 형광 단백질이다.
본 발명의 핵산 분자는 또한 선택적으로, 프로모터 또는 인헨서와 같은, 임의의 다양한 구조성(constitutive) 또는 유도성(inducible) 조절요소를 포함한다. 유도성 발현 시스템은 기질의 제어된 세포내 레벨을 제공할 수 있다는 장점을 가진다. 본 발명에 유용한 구조성 조절요소는 시토메갈로바이러스(CMV), 단순 포진성 바이러스 티미딘 키나아제(HSV TK), 시미안 바이러스 40(SV40) 얼리, 5'롱 터미널 리피트(LTR), 연장 인자-1(EF-1) 및 폴리비퀴틴(UBc) 조절요소를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 유용한 유도성 조절요소는 Tet-ON™ 및 Tet-Off™(BD Biosciences)와 같은 테트라사이클린 유도성 및 테트라사이클린 억제성 요소; GeneSwitch™ 시스템(Invitrogen)과 같은 엑디손-유도성 요소 및 GAL4 조절된 요소를 포함한다. 당업자에게는, 이러한, 그리고, 다른 구조성 및 유도성 조절 요소가 본 발명의 핵산 분자에 포함된다는 것으로 이해될 것이다.
임의의 다양한 유전학적으로 암호화된 도너 플루오로포어 및 억셉터가 본 발명의 핵산 분자 및 세포에 유용하다. 이러한 도너 플루오로포어 및 억셉터는 녹색 형광 단백질(GFP), 청색 형광 단백질(BFP), 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP), 또는 dsRed(BD Biosciences Clontech; Palo Alto, CA)와 같은 적색 형광 단백질과 같은 유전적으로 암호화된 염료를 포함한다. 이러한 유전적으로 암호화된 도너 플루오로포어 및 억셉터는, Selvin, supra, 2000, and Mahajan et al., Chemistry and Biology 6: 401-409 (1999)에 기재된 바와 같이 공지되어 있다. 예를 들어, CFP는 433nm에서 여기 최대치를, 476nm에서 방출 최대치를 가지며, 엑셉터로 YFP(527nm에서 방출 최대치)와 조합하여 도너 플루오로포어로 사용될 수 있다. 필요한 경우, 억셉터로 GFP와 조합하여 BFP를 도너 플루오로포어로서 사용하거나, 억셉터로 YFP와 조합하여 CFP를 도너 플루오로포어로서 사용할 수 있다. 형광 단백질과 관련된 Aequorea를 포함하는 추가적인 유전학적으로 암호화된 도너 플루오로포어 및 억셉터가 미국 특허 제 5,981, 200호에 기재된 바와 같이, 공지되어 있다.
또한, 본 발명은 유전학적으로 암호화된 클로스트리디움계 독소기질을 포함하는 세포를 제공한다. 따라서, 본 발명은 도너 플루오로포어; 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는 클로스트리디움계 독소 기질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 세포를 제공한다. 핵산 분자는 예를 들어, 사람 SNAP-25(SEQ ID NO:4)의 잔기 34 내지 206를 암호화할 수 있으며, 또한 예를 들어, 녹색 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 청록색 형광 단백질, 황색 형광 단백질 또는 적색 형광 단백질과 같은 도너 플루오로포어뿐아니라, 녹색 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 청록색 형광 단백질, 황색 형광 단백질 또는 적색 형광 단백질과 같은 억셉터를 포함할 수 있다.
클로스트리디움계 독소 기질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하도록, 사람 세포, 뉴런성 세포 및 비-뉴런성 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는, 임의의 다양한 세포를 조작할 수 있다. 일 실시형태에서, 클로스트리디움계 독소 기질을 암호화하는 핵산 분자는 안정하게 세포 내로 트랜스펙션된다. 다른 실시형태에서, 클로스트리디움계 독소 기질을 암호화하는 핵산 분자는 구조성 조절 요소 또는 유도성 조절요소와 같은 조절 요소에 결합된다. 테트라사이클린 조절된 조절 요소 또는 엑디손 유도성 조절 요소를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 유도성 조절 요소가 본 발명에 유용하다. 본 발명의 유전학적으로 암호화된 클로스트리디움계 독소 기질은 GFP와 같이, 임의의 다양한 유전학적으로 암호화된 도너 플루오로포어 또는 억셉터를 포함할 수 있다.
공지된 일시적인 및 안정한 트랜스 펙션 방법을 포함하는 임의의 다양한 통상의 방법을 사용하여, 클로스트리디움계 독소 기질을 암호화는 핵산 분자를 포함하는 세포를 제조할 수 있다. 제한되지 않는 예로서, 뉴런성 또는 비-뉴런성 세포를 포함하는 세포로 핵산 분자를 도입시키기 위한 통상의 기술은 마이크로인젝션, 일렉트로포레이션, 리포펙션, 칼슘-인산염 매개 트랜스펙션, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션, 폴리브렌- 또는 폴리리신-매개된 트랜스펙션, 및 항체, 그라마시딘 S, 인공 바이러스성 인벨로프 또는 TAT와 같은 다른 세포내 캐리어로의 컨쥬게이션을 포함한다. Cibelli et al., Nat. 16: 642-646 (1998); Lamb and Gearhart, Cur. Opin. Gen. Dev. 5: 342-348 (1995) ; Choi (U. S. Pat 6,069, 010); 및 Current Protocols in Molecular Biology, John WILEY and Sons, pp 9.16. 4-9. 16. 11 (2000)를 참조한다.
본 발명은 또한 시료의 클로스트리디움계 독소 활성을 결정하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 바이알 또는 다른 용기 내에 본 발명의 기질 조성물 또는 세포를 포함하며, 또한 일반적으로 사용설명서를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 키트는 또한 양성 대조구로서 키트에 포함된 기질 조성물 또는 세포에 병합된 클로스트리디움계 독소 기질을 절단할 수 있는 기지량(known amount)의 보툴리눔 또는 파상풍 독소를 포함한다. 다른 실시형태에서, 키트는 본 발명의 기질 조성물을 포함하며, 또한 양성 대조구로서 절단 생성물을 하나 또는 두가지 모두 포함한다. 이러한 키트는 예를 들어, 본 발명의 기질 조성물, 및 양성 대조구로서 도너 플루오로포어를 포함하는 해당 절단 생성물을 포함할 수 있다. 본 발명이 본 발명의 세포 및 양성 대조구를 포함하는 키트를 제공하는 경우, 양성 대조구는 절단되지 않은 클로스트리디움계 독소 기질 대신에 해당 절단 생성물을 하나 또는 두가지 모두 가지는 동일한 세포타입의 세포가 될 것으로 이해된다. 이러한 양성 대조구 세포는 예를 들어, 도너 플루오로포어를 포함하는 절단 생성물을 포함할 수 있다.
하기에 설명하는 바와 같이, 상이한 클로스트리디움계 독소 기질을 포함하는, 동일한 또는 상이한 타입의 세포의 조합이 둘 이상의 클로스트리디움계 독소 활성을 검출하는 데 유용할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명은 두가지 상이한 클로스트리디움계 독소에 대한 인식서열을 가지는 본 발명의 기질 조성물을 적어도 2가지 포함하는, 클로스트리디움계 독소 활성 결정용 키트를 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 두가지 상이한 클로스트리디움계 독소에 대한 인식서열을 가지는 두가지 상이한 클로스트리디움계 독소 기질을 포함하는 본 발명의 세포를 적어도 2가지 포함하는 클로스트리디움계 독소 활성 결정용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 도너 플루오로포어; 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는 클로스트리디움계 독소 기질을 포함하는 세포에 시료를 접촉시키고; (b) 도너 플루오로포어를 여기(exciting)하고; (c) 대조구 세포와 비교하여 접촉된 세포의 공명 에너지 전이를 결정하고, 접촉된 세포의 공명 에너지 전이를 대조구 세포와 비교하여 클로스트리디움계 독소 활성을 표시함으로써, 클로스트리디움계 독소 활성을 결정하는 방법을 제공한다.
독소 활성에 필요한 몇개의 상이한 단계에 대하여 클로스트리디움계 독소를 검정하도록, 본 발명의 방법은 유리하게 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 클로스트리디움계 독소가 세포 흡수에 대한 기능성 결합 도메인; 세포 시토졸로의 경쇄 운송에 대한 기능성 전위 도메인; 및 기능성 단백질가수분해 도메인을 가지는 지 결정하는 데 사용할 수 있다. 이들 세가지 기능 중 어느 하나가 없는 경우, 본 발명의 방법은 일반적으로 음성 반응결과를 얻는다.
본 발명의 방법에서, 클로스트리디움계 독소 기질은 예를 들어, 단백질, 펩티드 또는 펩티도미메틱일 수 있는 수송제에 선택적으로 공유결합될 수 있다. 유용한 수송제는 예를 들어, 안테나페디아 단백질, 또는 아미노산 서열 RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO:1)을 가지는 활성단편과 같은 이의 활성 단편; HIV TAT 단백질, 또는 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO:2)을 가지는 활성 단편과 같은 이의 활성 단편; 또는 아미노산 서열(SEQ ID NO:3)을 가지는 단순 포진성 바이러스 VP22 단백질과 같은, 단순 포진성 바이러스 VP22 단백질 또는 이의 활성단편을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 클로스트리디움계 독소를 포함하는 키메라 단백질, 펩티드 또는 펩티도미메틱 및 기질에 작용가능하게 융합되는 수송제를 포함하는 세포를 사용하여 실시된다. 이러한 키메라 단백질, 펩티드 또는 펩티도미메틱은 예를 들어, 최대 50 또는 100개의 잔기를 가지는 길이일 수 있다.
본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질은 임의 세포타입의 보툴리눔 독소 기질 또는 파상풍 독소 기질일 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 BoNT/A 인식 서열을 포함하는 BoNT/A 기질을 포함하는 세포; BoNT/B 인식 서열을 포함하는 BoNT/B 기질을 포함하는 세포; BoNT/C1 인식 서열을 포함하는 BoNT/C1 기질을 포함하는 세포; BoNT/D 인식 서열을 포함하는 BoNT/D 기질을 포함하는 세포; BoNT/E 인식 서열을 포함하는 BoNT/E 기질을 포함하는 세포; BoNT/F 인식 서열을 포함하는 BoNT/F 기질을 포함하는 세포; BoNT/G 인식 서열을 포함하는 BoNT/G 기질을 포함하는 세포; 또는 TeNT 인식 서열을 포함하는 TeNT 기질을 포함하는 세포를 사용하여 실시될 수 있다. 다양한 도너 플루오로포어 및 억셉터가 본 발명의 방법에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질에 병합될 수 있는 것으로 이해된다. 제한되지 않는 예로서, 유용한 도너 플루오로포어는 Alexa FLUOR®488, DABCYL 및 BODIPY를 포함하며, 유용한 억셉터는 EDANS, QSY® 7 및 테트라메틸로다민을 포함한다. 본 명세서에 더욱 설명하는 바와 같이, 본 발명의 방법에 유용한 억셉터는 비-형광 억셉터뿐아니라, 적어도 1 마이크로초의 비교적 긴 형광 수명을 가지는 억셉터 플루오로포어를 포함하는, 억셉터 플루오로포어를 포함한다.
일차 세포; 확립된 세포(established cell); 사람 세포; 일차 뉴런, 확립된 뉴런 및 사람 뉴런과 같은 뉴런; 및 췌장 선방 세포와 같은 비-뉴런성 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다양한 세포가 본 발명의 방법에 유용하다. 본 발명의 방법에 따른 클로스트리디움계 독소 활성을 결정하기에 유용한 뉴런은 중추 신경계 뉴런 및 말초 뉴런을 포함하며; 제한되지 않는 예로서, 이러한 뉴런은 신경아세포종 세포, 척수 뉴런, 배측 근 신경절 뉴런, 대뇌 피질 뉴런, 소뇌 뉴런, 해마 뉴런 또는 운동 뉴런일 수 있다.
당업자는 본 발명의 방법에 따라 클로스트리디움계 독소 활성에 대하여 다양한 시료를 검정할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 시료는 조 세포 용해물(crud cell lysates); 분리된 클로스트리디움계 독소; BOTOX®와 같은 조제된 클로스트리디움계 독소 제품, 및 식품을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 방법에서 도너 플루오로포어의 여기에 이어지는 공명 에너지 전이를 결정하기 위한 다양한 방법을 사용할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 대조구 세포에 대하여 접촉된 세포의 도너 형광 세기를 검출하여, 접촉된 세포의 증가된 도너 형광 세기를 대조구 세포와 비교하여 클로스트리디움계 독소 활성을 나타내는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 대조구 세포에 대하여 접촉된 세포의 억셉터 형광 세기를 검출하여, 접촉된 세포의 감소된 억셉터 형광 세기를 대조구 세포와 비교하여 클로스트리디움계 독소 활성을 나타내는 단계를 포함한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 대조구 세포에 대하여 접촉된 세포의 억셉터 방출 최대치 및 도너 플루오로포어 방출 최대치를 검출하여, 가까운 억셉터 방출 최대치로부터 가까운 도너 플루오로포어 방출 최대치까지의 방출 최대치들의 이동으로 클로스트리디움계 독소 활성을 나타내는 단계를 포함한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 대조구 세포에 대하여 접촉된 세포의 도너 플루오로포어 방출 최대치 근처의 형광 진폭에 대한 억셉터 방출 최대치 근처 형광 진폭의 비율을 검출하여, 접촉된 세포에서 감소된 비율을 대조구 세포와 비교하여 클로스트리디움계 독소 활성을 나타내는 단계를 포함한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 대조구 세포에 대하여 접촉된 세포에서 도너 플루오로포어의 여기 상태 수명을 검출하여, 접촉된 세포에서 증가된 도너 플루오로포어 여기 상태 수명을 대조구 세포와 비교하여 클로스트리디움계 독소 활성을 나타내는 단계를 포함한다. 필요한 경우, 공명 에너지 전이를 결정하는 단계는 1회이상 시간 간격을 두고 실시될 수 있다. 또한, 선형으로 되는 에세이와 같이, 클로스트리디움계 독소 활성에 적합한 조건을 임의로 선택할 수 있다.
하기에 더욱 논의하는 바와 같이, 본 발명의 방법은 고도로 정제된 이중사슬 독소뿐아니라 조 시료(crude sample)에 적용할 수 있는 것으로 이해된다. 제한되지 않는 실시예로서, 본 발명의 방법은 식품 또는 음료 시료에서 클로스트리디움계 독소 활성에 대해 검정하는 데; 예를 들어, 클로스트리디움계 독소에 노출되거나, 클로스트리디움계 독소의 하나 이상의 증상을 나타내는 사람 또는 동물로부터의 시료를 검정하는 데; 클로스트리디움계 독소를 제조 또는 정제하는 동안 활성을 추적하는 데, 및 약품 및 화장품을 포함하는, 조제된 클로스트리디움계 독소 제품을 검정하는 데 유용할 수 있다.
본 발명의 방법은 클로스트리디움계 독소의 활성을 결정하는 데 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 BoNT/A 활성을 결정하기 위한 BoNT/A 기질을 포함하는 세포에 의존한다. 이러한 BoNT/A 기질은 본 명세서에 설명된 임의의 BoNT/A 기질일 수 있으며, 예를 들어, 6개의 연속된 잔기가 Gln-Arg를 포함하는, 적어도 6개의 연속된 SNAP-25 잔기를 포함하는 BoNT/A 기질일 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 BoNT/B 활성을 결정하기 위한 BoNT/B 기질을 포함하는 세포에 의존한다. 이러한 BoNT/B 기질은 본 명세서에 설명된 임의의 BoNT/B 기질일 수 있으며, 예를 들어, 6개의 연속된 잔기가 Gln-Phe를 포함하는, 적어도 6개의 연속된 VAMP 잔기를 포함하는 BoNT/B 기질일 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 BoNT/C1 활성을 결정하기 위한 BoNT/C1 기질을 포함하는 세포를 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 BoNT/C1 기질은 본 명세서에 설명된 임의의 BoNT/C1 기질일 수 있으며, 예를 들어, 6개의 연속된 잔기가 Lys-Ala를 포함하는, 적어도 6개의 연속된 신택신 잔기 또는 6개의 연속된 잔기가 Arg-Ala를 포함하는, 적어도 6개의 연속된 SNAP-25 잔기를 포함하는 BoNT/C1 기질일 수 있다.
또다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 BoNT/D 활성을 결정하기 위한 BoNT/D 기질을 포함하는 세포에 의존한다. 이러한 BoNT/D 기질은 본 명세서에 설명된 임의의 BoNT/D 기질일 수 있으며, 예를 들어, 6개의 연속된 잔기가 Lys-Leu를 포함하는, 적어도 6개의 연속된 VAMP 잔기를 포함하는 BoNT/D 기질일 수 있다. 또다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 BoNT/E 활성을 결정하기 위한 BoNT/E 기질을 포함하는 세포를 사용하여 실시된다. 본 발명의 방법에 유용한 BoNT/E 기질은 본 명세서에 설명된 임의의 BoNT/E 기질일 수 있으며, 예를 들어, 6개의 연속된 잔기가 Arg-Ile를 포함하는, 적어도 6개의 연속된 SNAP-25 잔기를 포함하는 BoNT/E 기질일 수 있다. 또다른, 실시형태에서, 본 발명의 방법은 BoNT/F 활성을 결정하기 위한 BoNT/F 기질을 포함하는 세포에 의존한다. 본 발명의 방법에 유용한 BoNT/F 기질은 본 명세서에 설명된 임의의 BoNT/F 기질일 수 있으며, 예를 들어, 6개의 연속된 잔기가 Gln-Lys를 포함하는, 적어도 6개의 연속된 VAMP 잔기를 포함하는 BoNT/F 기질일 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 BoNT/G 활성을 결정하기 위한 BoNT/G 기질을 포함하는 세포를 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에 유용한 BoNT/G 기질은 본 명세서에 설명된 임의의 BoNT/G 기질일 수 있으며, 예를 들어, 6개의 연속된 잔기가 Ala-Ala를 포함하는, 적어도 6개의 연속된 VAMP 잔기를 포함하는 BoNT/G 기질일 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 TeNT 프로테아제 활성을 결정하는 데 유용할 수 있으며, 이러한 경우, TeNT 기질을 포함하는 세포에 의존한다. 본 명세서에 설명된 임의의 TeNT 기질이 본 발명의 방법에 유용할 수 있으며, 예를 들어, 6개의 연속된 잔기가 Gln-Phe를 포함하는, 적어도 6개의 연속된 VAMP 잔기를 포함하는 TeNT 기질일 수 있다.
다양한 시료가 본 발명의 방법에 유용하다. 본 명세서에서 사용될 때, "시료(sample)"라는 용어는 활성 클로스트리디움계 독소를 함유하거나, 잠재적으로 함유하는 생물학적 물질을 의미한다. 그러므로, 시료라는 용어는 정제된 또는 부분적으로 정제된 클로스트리디움계 독소; 천연 또는 비-천연 서열을 가지는 재조합 단일 사슬 또는 이중사슬 독소; 변형 프로테아제 특이성을 가지는 재조합 클로스트리디움계 독소; 다중 클로스트리디움계 독소 종 또는 서브타입으로부터의 구조성 요소를 포함하는 키메라 독소; 벌크 독소; 조제된 제품; 세포 또는 원료(crude), 분류하거나 부분적으로 정제한 세포 용해물, 예를 들어, 클로스트리디움계 독소을 암호화하는 재조합 핵산을 포함하도록 가공된 것; 박테리아, 바큘로바이러스 및 효모 용해물; 날것이거나, 조리되거나, 일부 조리되거나 가공된 식품; 음료; 동물 먹이; 토양 시료; 물 시료; 연못 침전물; 로션; 화장품; 및 임상적 조제물(formulation)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 시료라는 용어는 포유류 조직 시료, 양, 소 및 되지 조직 시료와 같은 가축 조직 시료; 영장류 조직 시료; 및 사람 조직 시료를 포함하나 이에 제한되지 않는, 조직 샘플을 포함하는 것으로 또한 이해된다. 이러한 시료는 유아 장관 시료와 같은 장관 시료, 및 상처로부터 얻은 조직 시료를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에서 검정되는 정제된 또는 부분 정제된 클로스트리디움계 독소의 농도는 일반적으로 약 0.0001 내지 5000ng/ml 독소, 예를 들어 약 0.001 내지 5000ng, 0.01 내지 5000ng/ml, 0.1 내지 500ng/ml, 1 내지 5000ng/ml, 또는 10 내지 5000ng/ml 독소 범위이며, 예를 들어, 정제된 재조합 이중 사슬 독소 또는 사람 혈청 알부민 및 부형제를 포함하는 조제된 클로스트리디움계 독소 제품일 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 방법에서 검정되는 정제된 독소의 양은 0.1pg 내지 10㎍의 범위이다. 표준 곡선에 대하여 클로스트리디움계 독소 활성을 검정하는 데 편리한 범위로 되도록, 정제된, 일부 정제된 또는 조 시료를 희석할 수 있을 것으로 이해된다. 유사하게, 당업자는 독소의 농도가 점점 커질 때, 에세이의 선형성(linearity)이 만족될 수 있기 때문에, 에세이가 선형이 되도록 시료를 희석하거나, 아니면, 시료의 양을 제한할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
당업자는 본 발명의 발명에서, 사용되는 세포의 타입, 발현되는 독소 수용체의 친화도 및 검정되는 독소의 타입에 일부 의존하는 임의의 다양한 시간 동안 세포가 클로스트리디움계 독소와 접촉될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 제한되지 않는 예로서, 세포는 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 16시간, 24시간, 48시간 또는 72시간까지 독소와 접촉할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 공명 에너지 전이를 다양한 방법으로 결정할 수 있다. 일 실시형태에서, 공명 에너지 전이를 결정하는 단계는 접촉된 세포의 도너 형광 세기를 검출하여, 접촉된 세포의 증가된 도너 형광 세기를 대조구 세포와 비교하여 클로스트리디움계 독소 활성을 나타내는 것을 포함한다. 다른 실시형태에서, 공명 에너지 전이를 결정하는 단계는 접촉된 세포의 억셉터 형광 세기를 검출하여, 접촉된 세포의 감소된 억셉터 형광 세기를 대조구 세포와 비교하여 클로스트리디움계 독소 활성을 나타내는 것을 포함한다. 또다른 실시형태에서, 공명 에너지 전이를 결정하는 단계는 억셉터 방출 최대치 및 도너 플루오로포어 방출 최대치를 검출하여, 가까운 억셉터 방출 최대치로부터 가까운 도너 플루오로포어 방출 최대치까지의 방출 최대치들의 이동으로 클로스트리디움계 독소 활성을 나타내는 것을 포함한다. 또다른 실시형태에서, 공명 에너지 전이를 결정하는 단계는 접촉된 세포의 도너 플루오로포어 방출 최대치 근처의 형광 진폭에 대한 억셉터 방출 최대치 근처 형광 진폭의 비율을 검출하여, 접촉된 세포에서 감소된 비율을 대조구 세포와 비교하여 클로스트리디움계 독소 활성을 나타내는 것을 포함한다. 또다른 실시형태에서, 공명 에너지 전이를 결정하는 단계는 접촉된 세포에서 도너 플루오로포어의 여기 상태 수명을 검출하여, 접촉된 세포에서 증가된 도너 플루오로포어 여기 상태 수명을 대조구 세포와 비교하여 클로스트리디움계 독소 활성을 나타냄으로써 실시된다.
클로스트리디움계 독소 활성을 결정하기 위한 본 발명의 방법에서, 세포는 시료와 접촉되며, 세포는, 도너 플루오로포어, 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 제 1 억셉터, 및 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 제 1 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는 클로스트리디움계 독소 기질을 포함한다. 필요시, 동일한 세포 내에 제 2 클로스트리디움계 독소 기질을 포함할 수 있으며; 이 제 2 기질은 제 2 도너 플루오로포어, 제 2 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 제 2 억셉터, 및 제 1 클로스트리디움계 독소 인식서열을 분리하는 독소와 상이한 클로스트리디움계 독소에 의해서 절단되는 제 2 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함한다. 제 2 기질의 도너 플루오로포어-억셉터 쌍은 제 1 기질의 도너 플루오로포어-억셉터 쌍과 동일하거나 상이할 수 있다. 이러한 경우, 단일 시료를 하나 이상의 클로스트리디움계 독소의 존재여부에 대하여 편리하게 검정할 수 있다.
임의의 클로스트리디움계 독소들의 조합, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 그 이상의 클로스트리디움계 독소들에 대하여 검정할 수 있을 것으로 이해된다. 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 BONT/A, BONT/B, C1, BONT/D, BONT/E, BONT/F, BONT/G 및 TeNT의 임의의 조합을 검정할 수 있다. 예를 들어, 동일하거나 상이한 타입의 7개 세포는 상기한 바와 같이 선택되며, 각각 BONT/A, BONT/B, C1, BONT/D, BONT/E, BONT/F 또는 BONT/G 인식 서열 및 절단 부위 측면에 있는 플루오레세인 및 테트라메틸로다민을 포함하는, 7개의 기질을 포함한다. 약 488nm의 흡수 파장에서 도너 플루오로포어를 여기시키고, 에너지 전이를 결정하기 전에, 보툴리눔 독소 활성에 적합한 조건하에서 이들 세포 각각을 시료와 접촉시킨다. 테트라메틸로다민(585nm)에서 플루오레세인(520nm)로 억셉터 방출 최대치의 이동은 적어도 하나의 보툴리눔 독소의 활성을 나타낸다. 이러한 에세이는 예를 들어, 보툴리눔 또는 다른 클로스트리디움계 독소 독소의 존재여부에 대하여, 식품시료 또는 조직 시료를 검정하는 데 유용할 수 있으며, 필요시, 개별적인 클로스트리디움계 독소 또는 특정 조합의 클로스트리디움계 독소들에 대한 하나 이상의 이어지는 에세이와 조합하여 사용할 수 있다.
다른 실시형태에서는, 뉴런과 같은, 동일하거나 상이한 세포들에 포함된 둘 이상의 상이한 클로스트리디움계 독소 기질을 사용하고, 각각의 기질은 상이한 도너 플루오로포어-억셉터 쌍을 포함하도록 하여, 둘 이상의 상이한 클로스트리디움계 독소에 대하여 단일 시료를 검정한다. 미국 특허 6,180,340에 기재된 바와 같이, 다중 기질의 사용은 에세이의 다이내믹한 범위를 넓히는데 유용할 수 있다. 다중 클로스트리디움계 독소 기질을 사용하는 예로서, 제 1 및 제 2 클로스트리디움계 독소 기질을 포함하는 세포를 사용하여 단일 시료를 BoNT/A 및 BoNT/B 활성에 대해 검정할 수 있다: 여기서, 제 1 클로스트리디움계 독소 기질은 도너 플루오로포어 플루오레세인 및 억셉터 테트라메틸로다민과 그 사이에 있는 BoNT/A 인식서열 및 절단부위를 포함하고, 제 2 클로스트리디움계 독소 기질은 도너 플루오로포어 EDANS 및 억셉터 DABCYL과 그 사이에 있는 BoNT/B 인식서열 및 절단부위를 포함한다. 제 1 도너 플루오로포어, 플루오레세인을 약 488nm에서 여기시키고, BoNT/A 활성을 나타내는 플루오레세인의 형광 세기(약 520nm)의 증가를 통해 에너지 전이를 결정한다. 제 2 도너 플루오로포어, EDANS를 약 340nm 흡수 파장에서 여기시키고, BoNT/B 활성을 나타내는 EDANS의 형광 세기(약 490nm)의 증가를 통해 에너지 전이를 결정한다. 유사하게, 단일 시룔를 검정하기 위하여, 둘 이상의 상이한 도너 플루오로포어를 함께 사용하는 경우, 예를 들어, 하기 란탄계열원소의 임의의 조합 또는 모두를 사용할 수 있다: 테르븀, 디스프로슘, 유러퓸 및 사마륨(EG&G® Wallac). 이러한 란탄계열원소들은 붕괴시간 및 파장에 기초하여 선명하게 구별될 수 있는 스펙트럼을 가진다. 당업자는 제 2 도너 플루오로포어가 여기시키기 전에, 동시에, 또는 후에 제 1 도너 플루오로포어가 여기될 수 있으며, 제 1 기질의 에너지 전이가 제 2 기질의 에너지 전이를 결정하기 전에, 동시에 또는 후에 결정될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 방법은 세포 내의 클로스트리디움계 독소 기질에 병합되어 있는 도너 플루오로포어를 여기시키는 것을 포함한다. 당업자는 도너 플루오로포어가 일반적으로 도너 플루오로포어의 최적의 흡수 파장(여기 파장)에서 또는 그 근처에서 여기한다는 것을 이해할 것이다. 예로서, 도너 플루오로포어가 플루오레세인인 경우, 도너는 예를 들어, 488nm의 최적 흡수 파장에서 또는 그 근처에서 여기할 수 있다.
클로스트리디움계 독소 기질의 단백가수분해 및 그에 따른 클로스트리디움계 독소 활성을, 예를 들어, 증가된 도너 형광 세기를 검출하거나; 감소된 억셉터 형광 세기를 검출하거나; 억셉터 방출 최대치 근처로부터 도너 플루오로포어 방출 최대치 근처로의 방출 최대치의 이동을 검출하거나, 도너 플루오로포어 방출 최대치 근처 형광 진폭에 대한 억셉터 방출 최대치 근처의 형광 진폭의 감소된 비율을 검출하거나; 증가된 도너 플루오로포어 여기상태 수명을 검출하는 다양한 방법으로 검출할 수 있다. 상대적인 형광 세기 도는 여기상태 수명은 적절한 파장 또는 파장 범위에서 검출하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 도너 형광 세기를 검출하는 경우, 적절한 파장은 도너 플루오로포어의 방출 최대치이거나 그 근처이고, 또는 도너 플루오로포어의 방출 최대치를 포함하거나 그 근처의 파장 범위이다.
세포내 클로스트리디움계 독소 기질의 절대적인 양, 여기 세기 및 탁도(turbidity) 또는 여기 파장에서의 다른 배경 흡수의 변화가 도너 및 억셉터 플루오로포어의 형광 세기에 대략 동시에 영향을 주는 것으로 인식된다. 따라서, 방출 세기의 비율은 기질의 절대량, 여기 세기 및 탁도(turbidity) 또는 다른 배경 흡수에 의존하지 않아서, 클로스트리디움계 독소 활성을 나타내는 데 유용할 것으로 이해된다. 유사하게, 당업자는 도너 플루오로포어의 여기상태 수명이 기질의 절대량, 여기 세기 및 탁도(turbidity) 또는 다른 배경 흡수에 의존하지 않아서, 본 발명의 방법에 유용하다는 것을 이해할 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 도너 형광 세기를 측정하고, 증가된 도너 형광 세기로 클로스트리디움계 독소를 나타내어 실시된다. 이러한 증가된 세기는 시료와 접촉하지 않은 동일한 또는 유사한 세포의 동일파장에서의 형광 세기와 비교할 때, 예를 들어, 적어도 2배, 3배, 5배, 10배, 20배 또는 그 이상일 수 있다.
도너 플루오로포어 세기를 검출하기 위하여, 도너 플루오로포어를 흡수 파장에서 여기시키고, 도너 플루오로포어의 방출을 모니터한다. 도너 플루오로포어의 방출 파장은 일반적으로 억셉터 형광으로부터의 관찰되는 기여도가 거의 없거나 전혀 없도록 선택된다. 억셉터의 존재는 도너 형광을 소멸하게 하다. 에너지 전이 효율, E는, E = 1 - IDA / ID로부터 계산하며, 여기서, IDA및 ID는 억셉터의 존재 및 부재시의 도너 형광이다. 둘다 동일한 도너 플루오로포어 농도로 표준화되었다. 필요시, E = 1 - {τDA} / {τD}(여기서, {τDA} 및 {τD} 는 억셉터의 존재 또는 부재시 도너 플루오로포어의 진폭-평균 수명이다)를 사용하여, 도너 플루오로포어 농도가 필요하지 않은, 시간 분해 측정을 실시할 수 있다.
일 실시형태에서, 억셉터 방출 최대치 근처로부터 도너 플루오로포어 방출 최대치 근처로의 방출 최대치의 이동을 검출함으로써 본 발명은 공명 에너지 전이를 결정하여 실시한다. 예를 들어, 테트라메틸로다민 억셉터가 도너 플루오로포어 플루오레세인과 조합되는 경우, 공명 에너지 전이의 감소, 즉, 클로스트리디움계 독소 활성을 나타내는, 주된 적색 방출로부터 주된 녹색 방출로의 이동을 검출할 수 있다. 관찰되는 방출 최대치의 이동은 일반적으로 완전한 이동이 아닐 것이며, 방출 세기의 단지 일부만 도너 플루오로포어 방출 최대치 근처로 이동할 것이라고 이해된다.
본 발명의 몇가지 방법에서, 접촉된 세포의 공명 에너지 전이는 대조구 세포와 비교하여 결정한다. 이러한 대조구 세포는 일반적으로 접촉된 세포와 동일하거나 유사한 타입의 세포로서, 동일한 조건하에 배양되나, 어떤 시료와도 접촉하지 않거나, 한정된 음성 시료 또는 한정된 양성 시료와 접촉한다. 당업자는 다양한 대조구 세포가 본 발명의 방법에 유사하며, 대조구 세포는 양성 대조구 세포 또는 음성 대조구 세포일 수 있다는 것을 이해할 것이다. 대조구 세포는, 예를 들어, 활성 클로스트리디움계 독소가 없는 것으로 알려진 유사한, 한정된 음성 시료와 접촉되거나, 어떤 시료와도 접촉되지 않은, 동일한 또는 유사한 클로스트리디움계 독소 기질을 포함하는 유사한 또는 동일한 세포와 같은, 음성 대조구 세포일 수 있다. 대조구 세포는 또한, 클로스트리디움계 독소 기질을 절단 부위에서 단백가수분해하여 얻은 절단 생성물을 하나 또는 두개 모두 포함하는 세포, 또는 활성 클로스트리디움계 독소를 포함하는 것으로 알려진, 한정된 양성 시료와 접촉된 동일한 또는 유사한 기질을 포함하는 세포와 같은, 양성 대조구 세포일 수 있다. 양성 대조구 세포는 도너 플루오로포어-함유 절단 생성물을 포함하는 세포, 억셉터-함유 절단 생성물을 포함하는 세포, 및 절단 생성물을 두개 모두 포함하는 세포를 포함한다.
클로스트리디움계 독소 활성을 결정하기 위한 본 발명의 방법은, 대조구 세포와 비교하여, 시료와 접촉된 클로스트리디움계 독소 기질을 포함하는 세포의 공명 에너지 전이를 결정하는 것을 포함하며, "고정-시간(fixed-time)" 에세이로서 또는 연속 시간 에세이로서 실시될 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, FRET 결정이 1회 이상 시간 간격을 두고 반복된다. 형광 공명 에너지 전이는, 예를 들어, 1회 이상, 2회 이상, 5회 이상, 10회 이상 또는 20회 이상 결정될 수 있다. 형광 세기 및 다른 FRET 표지는 또한 공지의 방법으로 연속적으로 검출될 수 있다(예를 들어, Wang et al., supra, 1993; Holskin et al. , supra, 1995; 및 Kakiuchi et al., supra, 1999참조).
본 발명의 방법에서, 접촉된 세포의 형광은 전형적으로 형광계를 사용하여 결정한다. 일반적으로, 제 1 파장을 가지는 여기 소스로부터의 여기 방사는 여기 옵틱(excitation optics)을 통과한다. 여기 옵틱은 여기 방사가 세포 내의 기질을 여기시키게 한다. 반응하여, 기질 내의 플루오로포어가, 여기 파장과는 상이한 파장을 가지는 방사를 방출한다. 그리고 나서, 수집 옵틱이 방출을 수집한다; 필요시, 장치는 스캔하는 동안 세포를 특정 온도로 유지하기 위한 온도 조절기를 포함한다. 필요시, 상이한 웰들이 노출되도록 배치하기 위하여, 다중-축 트랜슬레이션 스테이지가 다수의 시료를 포함하는 마이크로티터 플래이트를 움직인다. 다중-축 트랜슬레이션 스테이지, 온도 조절기, 자동-포커싱 기능, 및 이미징 및 데이타 수집과 관련된 전자기기를 적합한 디지탈 컴퓨터로 관리할 수 있는 것으로 이해된다.
또한, 본 발명의 방법은 자동화될 수 있으며, 96-웰, 384-웰 또는 1536 웰 플레이트를 사용하여, 이에 제한되지는 않지만, 고-처리량 또는 초고-처리량 포맷으로 구성될 수 있는 것으로 이해된다. 일례로서, 형광 방출은 96-웰 플레이트 에세이를 위해 디자인된, Molecular Devices FLIPR® 계장 시스템(Molecular Devices; Sunnyvale, CA)를 사용하여 검출할 수 있다(Schroeder et al., J. Biomol. Screenina 1: 75-80 (1996)). FLIPR은 전체 플레이트를 조사하고 이미징하기 위하여, 수냉 488nm 아르곤 이온 레이저(5와트) 또는 크세논 아크 램프, 및 전하결합소자(CCD) 카메라를 가지는 반초점공유 최적 시스템(semiconfocal optimal system)을 이용한다. FPM-2 96-웰 플래이드 리더(Folley Consulting and Research; Round Lake, Illinois)가 또한 본 발명의 방법에서 형광 방출을 검출하는 데 유용하다. 당업자는 ECLIPSE 쿠벳 리더(Varian-Cary; Walnut Creek, CA), SPECTRAMAX GEMINI XS (Molecular Devices) 및 예를 들어, Perkin Elmer로부터의 다른 시스템과 같은 적합한 분광학 호환성을 가지는, 이러한, 그리고 다른 자동화 시스템이 본 발명에 유용할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 방법은, 필요시, in vivo로 실시될 수 있으며; 제한되지 않는 예로서, 본 발명은 마우스, 래트, 연충 또는 어류에서 실시될 수 있다. 클로스트리디움계 독소 활성을 결정하기 위한 본 발명의 in vivo 방법은 (a) 수송제; 및 도너 플루오로포어; 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고, 알맞은 조건하에서 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는 클로스트리디움계 독소 기질을 포함하는 기질 조성물을 동물에 투여하고; (b) 동물을 시료로 처치하고; (c) 도너 플루오로포어를 여기시키고; 및 (d) 대조구 동물과 비교하여 처치된 동물의 공명 에너지 전이를 결정하여, 대조구 동물과 비교한 처치된 동물의 공명 에너지 전이의 차이로 클로스트리디움계 독소 활성을 나타냄으로써 실시할 수 있다. 예를 들어, HIV TAT계 수송제는 in vivo에서 표적 단백질을 효과적으로 수송하는 것으로 나타났다(Schwartz et al., Science 285: 1. 569-1572 (1999)). 일 실시형태에서, 본 발명의 in vivo 방법은 HIV TAT 유래 수송제를 포함하는 기질 조성물을 사용하여 실시된다. 또다른 실시형태에서, 기질 조성물은 동물의 척수로 투여된다. 또다른 실시형태에서는, 2회 이상 공명 에너지 전이를 결정하여, 시간에 따른 독소 활성의 존속성을 검정한다.
본 발명은, 분자내 원거리 쌍극자-쌍극자 커플링을 통하여, 여기된 도너 플루오로포어로부터, 또다른 플루오로포어일 수 있는 억셉터로 에너지가 비-방사적으로 전이되는 FRET에 일부 의존한다. FRET는 도너 플루오로포어 및 억셉터의 분자내 분리(separation)의 인버스 제 6의 힘(inverse sixth power)에 의존하고, 효과적인 전이를 위하여, 도너 플루오로포어 및 엑셉터는 예를 들어, 약 10Å 내지 약 100Å으로 가깝게 인접하여 분리된다. 효과적인 에너지 전이는 도너 플루오로포어 및 억셉터의 스펙트럼의 특성뿐아니라, 상대적인 배향(orientation)에 의존한다. 10 내지 100Å에 걸친 효과적인 전이를 위하여, 도너 플루오로포어의 양자 수득률은 일반적으로 적어도 0.1이고 억셉터의 흡수 계수는 적어도 1000이다(Clegg, Current Opinion in Biotech. 6: 103-110 (1995); 및 Selvin, Nature Structural Biol. 7: 730-734 (2000)참조).
본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질에서, 도너 플루오로포어 및 억셉터는, 도너 플루오로포어가 여기할때, 도너 플루오로포어 및 억셉터가 공명 에너지 전이를 나타내도록 선택된다. 도너 플루오로포어/억셉터 쌍을 선택할 때 고려되는 점 하나는 도너 플루오로포어와 억셉터 사이의 FRET의 효율이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 최적의 조건하에서, 도너 플루오로포어와 억셉터 사이의 FRET의 효율이 적어도 10%인 클로스트리디움계 독소 기질에 의존한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명은 최적의 조건 하에서, 도너 플루오로포어와 억셉터 사이의 FRET의 효율이 적어도 20%인 클로스트리디움계 독소 기질에 의존한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명은 최적의 조건 하에서, 도너 플루오로포어와 억셉터 사이의 FRET의 효율이 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%인 클로스트리디움계 독소 기질에 의존한다.
공지된 바와 같이, FRET의 효율은 푀르스터(Foerster) 방정식으로 나타내어지는 바와 같이, 분리 거리 및 도너 플루오로포어 및 억셉터의 배향에 의존할 뿐아니라, 도너 플루오로포어의 형광 양자 수득률 및 억셉터와의 강력한 오버랩에 의존한다. 특히, FRET의 효율(E)는 하기와 같이 결정될 수 있다:
E = 1- FDA /FD = 1 / (1 + (R/R0)6)
여기서, FDA 및 FD는 각각 억셉터의 존재 및 부재시 도너 플루오로포어의 형광 세기이고, R은 도너 플루오로포어와 억셉터 사이의 거리이다.
푀르스터 반경(R0)은 공명 에너지 전이가 50% 효과적인 거리, 즉, 50%의 여기된 도너 플루오로포어가 FRET에 의해 비활성화되는 거리이다. 푀르스터 반경의 크기는 도너 플루오로포어의 양자 수득률; 억셉터의 흡광 계수; 및 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 억셉터의 여기 스펙트럼 사이의 오버랩에 의존한다
R0 = [8.8 x 1023 ㆍK2 ㆍn-4 ㆍQYDㆍJ(λ)]1/6Å
여기서,
K2 = 쌍극자 배향 인자(범위 0 내지 4; K2= 랜덤하게 배향된 도너 및 억셉터에 대하여 2/3)
QYD = 억셉터 부재시 도너의 형광 양자 수득률
n = 굴절율
J(λ) = 스펙트럼 오버랩 적분
= ∫εA(λ) ㆍFD(λ)ㆍλ4dλ㎤M-1
여기서, εA = 억셉터의 흡광계수
FD = 전체 적분된 세기의 분수로서 도너의 형광 방출 세기
(FOERSTER, Ann. Phvsik 2: 55-75 (1948)).
다양한 도너 플루오로포어/억셉터 쌍에 대한 전형적인 푀르스터 반경치를 하기 표 B에 나타내었다(또한, Wu and Brand, Analytical Biochem. 218: 1-13 (1994) 참조). 푀르스터 반경의 종합적인 리스트가 또한 공지되어 있다(예를 들어, Berlman, Energy Transfer Parameters of Aromatic Compounds Academic Press, New York 1973 참조). 또한, 당업자라면 푀르스터 반경(R0)의 구성인자가 환경에 의존적이므로, 관찰된 실제값이 리스트의 값과 달라질수 있다는 것을 알고 있을 것이다.
다양한 조합의, 많은 도너 플루오로포어 및 억셉터가 본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질에 함될 수 있다. 도너 플루오로포어는 일반적으로 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 억셉터의 여기 스펙트럼 사이에 상당한 스펙트럼 오버랩이 있도록 선택된다. 또한, 레이저 광이 도너 플루오로포어를 여기하는 편리하고, 효과적인 수단으로서 제공되기 때문에, 도너 플루오로포어는 예를 들어, 헬륨-카드뮴 442nm 또는 아르곤 488nm와 같이 편리한 레이저 주파수 근처에 여기 최대치를 가지도록 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, 억셉터 잔기의 방출 스펙트럼의 파장 최대치는 도너 플루오로포어의 여기 스펙트럼의 파장 최대치보다 적어도 10nm 더 크다. 또다른 실시형태에서, 억셉터는 가시광선 스펙트럼의 적색 부분에서 방출 스펙트럼을 가지는 플루오로포어이다. 추가적인 실시형태에서, 억셉터는 스펙트럼의 적외선 영역에서 방출 스펙트럼을 가지는 플루오로포어이다. 다양한 도너 플루오로포어-억셉터 쌍, 및 그의 푀르스터 반경을 하기 표 B 및 C에 제공한다. 또한, Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and RESEARCH CHEMICALS 6TH EDITION, Molecular Probes, Inc. , Eugene, Oregon, 1996를 참조한다.
ANAI, 2-안트라센 N-아세틸이미다졸;
BPE, B-피코에리스린;
CF, 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르;
CPM, 7-디에틸아미노-3-(4'-말레이미딜페닐)-4-메틸쿠마린;
CY5, 카르복시메틸인도시아닌-N-히드록시숙신이미딜 에스테르;
diI-C18, 1,1'-디옥타데실-3-3,3,3',3'-테트라메틸-인도카르보시아닌;
diO-C14, 3,3'-디테트라데실옥사카르보시아닌;
DABM, 4-디메틸아미노페닐아조-페닐-4'-말레이미드;
DACM, (7-(디메틸아미노)쿠마린-4-일)-아세틸;
DANZ, 댄실아지리딘;
DDPM, N-(4-디메틸아미노-3,5-디니트로페닐)말레이미드;
DMAMS, 디메틸아미노-4-말레이미도스틸벤;
DSMN, N-(2,5'-디메톡시스티벤-4-일)-말레이미드;
DNP, 2,4-디니트로페닐;
ε-A, 1,N6-에테노아데노신;
EIA, 5-(요오도아세테트아미도)에오신;
EITC, 에오신-5-이소티오시아네이트;
ENAI, 에오신 N-아세틸이미다졸;
EM, 에오신 말레이미드;
ErITC, 에리스로신-5'-이소티오시아네이트;
ETSC, 에오신 티오세미카라자이드;
F2DNB, 1,5-디플루오로-2,4'-디니트로벤젠;
F2DPS, 4,4'-디플루오로-3,3'-디니트로페닐술폰;
FITC, 플루오레세인 티오세미카르바자이드;
IAANS, 2-(4'-요오도아세트아미도)아닐리노)나프탈렌-6-술폰산;
IAEDANS, 5-(2-((요오도아세틸)아미노)에틸)아미노)-나프탈렌-1-술폰산;
IAF, 5-요오도아세트아미도플루오레세인;
IANBD, N-((2-(요오도아세톡시)에틸)-N-메틸)아미노-7-니트로벤즈-2-옥사-1, 3-디아졸;
IPM, 3(4-이소티오시아네이토페닐)7-디에틸-4-아미노-4-메틸쿠마린;
ISA, 4-(요오도아세트아미도)살리실산;
LRH, 리사민로다민;
LY, 루시퍼 옐로우;
mBBR, 모노브로모비아만;
MNA, (2-메톡시-1-나프틸)-메틸;
NAA, 2-나프톡시아세트산;
NBD, 7-니트로-2,1,3-벤즈옥사디아졸-4-일;
NCP, N-시클로헥실-N'-(1-피레닐)카르보디이미드;
ODR, 옥타데실로다민;
PM, N- (1-피렌)-말레이미드;
SRH, 술포로다민;
TMR, 테트라메틸로다민;
TNP, 트리니트로페닐; 및
TR, 텍사스 레드
트립토판 또는 티로신과 같은 방향족 아미노산이 또한 본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질, 조성물 및 방법에 유용한 도너 플루오로포어일 수 있다. 트립토판이나 티로신이 도너 플루오로포어인, 도너 플루오로포어-억셉터의 예 및 상응하는 푀르스터 거리를 하기 표 C에 나타내었다. 변형된 아미노산이 또한 본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질 중의 도너 플루오로포어 또는 억셉터로서 유용할 수 있다. 예를 들어, Anne et al., Analytical Biochem. 291: 253-261 (2001)에 기재된 바와 같이, 이러한 형광 또는 소광 변형 아미노산은 공지되어 있으며, 예를 들어, 형광 아미노산 L-피레닐아라라닌(Pya) 및 비-형광 억셉터 p-니트로페닐알라닌(Nop)을 포함한다.
상기한 관점에서, 다양한 도너 플루오로포어/억셉터 쌍이 본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질에 포함될 수 있을 것으로 이해된다. 클로스트리디움계 독소 기질에 유용한 도너 플루오로포어-억셉터 쌍은 예를 들어, 로다민과 조합된 도너 플루오로포어 플루오레세인; 텍사스 레드; 에오신; ROX(6-카르복시-X-로다민; Perkin-Elmer Corporation, Foster City, CA의 Applied Biosystems Division); 또는 TAMRA(N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시-로다민; Applied Biosystems)일 수 있다. 본 발명에 유용한 도너 플루오로포어-억셉터 쌍은 또한, 예를 들어, 억셉터로서 플루오레세인을 가지는 도너 플루오로포어 캐스케이드 블루; 억셉터로서 BODIPY® 542/563 (4,4-디플루오로-5-p-메톡시페닐-4-보라-3a,4a-디아자-S-인다센)과 조합된 도너 플루오로포어 BODIPY® 530/550(4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-S-인다센); 또는 억셉터로서 BODIPY® 564/570 (4,4-디플루오로-5-스티릴-4-보라-3a,4a-디아자-S-인다센)과 조합된 BODIPY® 542/563일 수 있다. BODIPY® 뒤에 붙는 숫자는 분자의 여기 및 발광 최대치를 나타내는 것이며, BODIPY® 분자는 Molecular Probes (Eugene, Oregon)로부터 상업적으로 입수가능하다.
본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질은, 도너 플루오로포어가 플루오레세인 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 클로스트리디움계 독소 기질은, 도너 플루오로포어로서 플루오레세인을, 억셉터로서 테트라메닐로다민을 포함한다. 이러한 기질은 480 내지 505 nm의 범위, 예를 들어, 488nm 또는 492nm에서 여기할 수 있고, 방출은 520nm(λem 플루오레세인), 585nm(λem 테트라메닐로다민), 또는 둘 모두에서 검출된다. 클로스트리디움계 독소 절단 부위에서 기질을 절단하기 전에는, 테트라메틸로다민 방출 세기가 플루오레세인에서보다 더 크다; 기질 절단으로 인해 플루오레세인 대 테트라메틸로다민 세기의 비율이 변화된다. 절단으로 인해 일반적으로 플루오레세인이 주된 방출 플루오로포어가 된다. 플루오레세인 및 테트라메틸로다민을 포함하는 단백질 및 펩티드 제조 방법은 공지되어 있다(예를 들어, Matsumoto et al., Bioorg. Med. Chem. Letters 10: 1857-1861 (2000) 참조).
클로스트리디움계 독소 기질에 유용한 도너 플루오로포어는 예를 들어, DABCYL과 같은 억셉터와 조합할 수 있는, EDANS(λAb 340nm, λEm 490nm)일 수 있다. DABCYL과 EDANS가 클로스트리디움계 독소 기질 중에 조합되는 경우, 본래의 기질에서는 에너지는 EDANS 도너 플루오로포어로부터 DABCYL 억셉터로 전이되어, EDANS 방출 형광이 소멸된다. 독소 절단 부위에서 절단되는 경우, 절단된 EDANS 생성물의 형광이 증가하고, 예를 들어, 자유 도너 플루오로포어 레벨로 복구될 수 있다. 본래의 기질에서 효과적인 형광 소멸은, EDANS 방출 스펙트럼과 DABCYL 흡수 스펙트럼의 유리한 강력한 오버랩, 및 EDANS 도너 플루오로포어의 상대적으로 긴 여기상태 수명의 결과로서 나타난다(Wang et al., Tetrahedron Lett. 31: 6493-6496 (1991) ; Holskin et al. , Anal. Biochem. 226: 148-155 (1995) ; 및 Wang et al. , Anal. Biochem. 210: 351-359 (1993)).
댄실(DNS 또는 5-디메틸아미노나프탈렌-1-술포닐)이 또한 클로스트리디움계 독소 기질의 도너 플루오로포어 또는 억셉터로서 유용할 수 있다. 일 실시형태에서, 클로스트리디움계 독소 기질은 도너 플루오로포어로서 댄실(Dansyl)을 포함하며; 댄실 도너는, 댄실 도너 플루오로포어에 인접할 때, 소광제(quencher)로서 작용하는, 예를 들어, Phe(pNO2)와 같은 니트로페닐 잔기 수용체와 조합될 수 있다. 예를 들어, 니트로페닐 잔기와 조합된, 댄실 도너 플루오로포어를 포함하는 기질은 예를 들어, Florentin et al., Anal. Biochem. 141: 62-69 (1984), 또는 Goudreau et al., Anal. Biochem. 219: 87-95 (1994)에 기재된 방법으로 제조할 수 있다. 또다른 실시형태에서, 클로스트리디움계 독소 기질은 억셉터로서 댄실을 포함한다. 댄실 억셉터는, 예를 들어, Trp(λex 290nm, λem 360nm)과 같은 도너 플루오로포어와 조합될 때, 소광제로서 작용할 수 있다. Trp 및 댄실을 포함하는 클로스트리디움계 독소에서, 댄실 그룹으로의 에너지 전이로 인하여 형광이 60% 소멸될 수 있으며, 이러한 소광은 독소 절단 부위에서 독소 프로테아제 활성이 존재할 때 상당히 감소되거나 없어진다(예를 들어, Geoghegan et al. , FEBS Letters 262: 119-122 (1990)참조).
잘-분리된 방출 최대치를 가지는 도너-억셉터 쌍이, 본 발명의 클로스트리디움계 독소 기질, 기질 조성물, 세포 및 방법에 유용할 수 있을 것으로 이해된다. 잘-분리된 방출 최대치로 인해 변경된 억셉터 방출이 도너 방출 오염없이 검출될 수 있다. 도너 플루오로포어, 또는 억셉터, 또는 두가지 모두는 예를 들어, 원적색(far-red), 예를 들어, 650nm 이상에서 방출될 수 있다. 이러한 원적색 방출 도너 플루오로포어 및 억셉터는 Cy5, Cy5.5 및 Cy7(Selvin, supra, 2000)과 같은 시아닌 염료를 포함한다. 일 실시형태에서, 클로스트리디움계 독소 기질은 Cy3 및 Cy5를 도너 플루오로포어-억셉터 쌍으로서 포함하며; Cy3는 570nm에서 최대로 방출하고, Cy5는 670nm에서 최대로 방출한다. 이러한 시아닌 염료는, 예를 들어, Gruber et al., BIOCOM. Chem. 11: 161-166 (2000)에 기재된 바와 같이, 간단한 합성에 의해 제조될 수 있다.
클로스트리디움계 독소 기질에 유용한 도너 플루오로포어는 또한 예를 들어, 희토류 원소로 알려진, 란탄계열 원자일 수 있다. 테르븀(Tb), 유러퓸(Eu), 디스프로슘(Dy) 및 사마륨(Sm)과 같은 란탄계열은 뾰족한 피크의 파장, 여기 펄스후 밀리초의 수명을 가지며, 비편광이고, 양자 수득률이 크다. 테르븀 또는 유러퓸 킬레이트와 같은 란탄계열 도너 플루오로포어는, 유기 염료 억셉터를 포함하는 다양한 억셉터와 조합될 수 있다. Eu-킬레이트 도너 플루오로포어는 예를 들어, 알로피코시아닌(APC)과 조합될 수 있으며, Tb-킬레이트 도너 플루오로포어는 예를 들어, 테트라메틸로다민과 조합될 수 있다. 직접 여기로 인한 배경 형광은 일시적으로 제거된다; 감광 방출은 도너 플루오로포어 수명 이후이고, 마이크로초 내지 밀리초 단위인 반면에, 유기 억셉터의 수명은 일반적으로 나노초 범위이다(Selvin, supra, 2000 참조). 따라서, 여기 후 공명 에너지 전이의 결정은, 비-특이적인 형광 방해가 사라진 후에, 비교적 늦게 시작할 수 있다. 란탄계열 킬레이트는 공지되어 있으며, 예를 들어, EG&G® Wallac (Turku, Finland)로부터 상업적으로 입수가능하다.
본 발명에 유용한 도너 플루오로포어는 또한, 소광제 2,4-디니트로페닐(Dnp)과 같은 억셉터와 조합될 수 있는, 공지된 플루오로포어 (7-메톡시쿠마린-4-일)아세틸(Mca)일 수 있다. 예를 들어, Kakiuchi et al. , J. Virol. Methods 80: 77-84 (1999)를 참조한다. 클로스트리디움계 독소 기질에서 Mca는 Dnp와 같은 적합한 소광제와 조합되며, 클로스트리디움계 독소 절단 부위에서 절단시 Mca(λEm 393nm)로부터 증가된 도너 방출 형광이 검출되어, 독소 활성을 나타낸다.
본 발명에 유용한 도너 플루오로포어는 또한 필요시, 2,4-디니트로페닐(Dnp)과 같은 소광제과 조합될 수 있는, 예를 들어, 2-아미노벤조일(Abz) 그룹일 수 있다. 본래의 클로스트리디움계 독소 기질에서, Dnp 그룹은, 공명 에너지 전이에 의해서, Abz 그룹의 형광을 소멸시킨다; 기질의 단백가수분해 절단은 소광을 경감시키고, 그 결과, 유리된 Abz 단편의 농도에 대한 형광비율이 증가된다. 아미노-말단 및 리신과 같이 Dnp-유도체화 잔기에서 예를 들어, Abz를 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질은 예를 들어, Le Bonniec et al., Biochemistry 35: 7114-7122 (1996))에 기재된 통상의 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명에 유용한 도너 플루오로포어 또는 억셉터는 또한 Molecular Probes (Eugene, OR)로부터 상업적으로 입수 가능한, Alexa Fluor® 염료일 수 있다. 본 발명의 기질 조성물, 세포 및 방법에 유용한 Alexa Fluor® 염료는 예를 들어, Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 430, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 633, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660 및 Alexa Fluor® 680을 포함한다.
본 발명에 유용한 도너 플루오로포어 또는 억셉터는 또한 유전학적으로 암호화된 염료일 수 있다(상기 참조). GFP, BFP, CFP 또는 YFP와 같이 유전학적으로 암호화된 염료는 서로 FRET 쌍을 형성하거나, 다른 적합한 도너 플루오로포어 또는 억셉터와 조합될 수 있는 것으로 이해된다. 일 실시형태에서, 클로스트리디움계 독소 기질은 유전학적으로 암호화된 도너 플루오로포어 및 유전학적으로 암호화된 억셉터를 포함한다.
또다른 실시형태에서, 클로스트리디움계 독소 기질은 적어도 마이크로초의 비교적 긴 형광 수명을 가지는 플루오로포어를 포함한다. 불순물의 형광 수명이 더 짧으므로, 이러한 억셉터는 형광 방출의 시간-분해 측정을 가능하게 하며, 신호 대 노이즈 비율이 향상될 수 있다. 시간-분해 형광을 위해 유용한 도너 플루오로포어/억셉터 쌍은 예를 들어, 105kDa 피코빌리프로테인 억셉터 플루오로포어, 알로피코시아닌과 조합된 Eu-트리스비피리딘 크립테이트(TBP-EU3+, λEx 337nm)와 같은 유러퓸 크립테이트 도너 플루오로포어일 수 있다(Sittampalam et al., Curr.Opin. Chem. Biol. 1: 384-391 (1997)). Eu-크리스비피리딘 크립테이트는, 광을 거두어들여, 하전된 EU3+로 전달하는 2개의 비피리딜 그룹을 가진다; 이러한 도너 플루오로포어는 긴 형광 수명을 가지며, 억셉터와 인접하여 가까워지면 비방사적으로 에너지를 알로피코시아닌으로 전이시키며, 9.5nm의 도너 플루오로포어-억셉터 거리에서 50% 이상의 전이 효율을 나타낸다. TBP-EU3+ 및 알로피코시아닌 모두와 이들의 분광학 특성은 생물학적 배지에서 매우 안정하며, 알로피코시아닌은 긴 수명의 도너를 가지고 방출하여(λEm=665nm), 시간-분해 검출을 가능하게 한다(Kolb et al. , J. Biomol. Screening 1: 203-210 (1996)). 이러한 도너 플루오로포어-억셉터 쌍을 포함하는 기질을 제조하는 방법은 예를 들어, Kolb et al., supra, 1996, 및 Sittampalam et al., supra, 1997. 에 기재된 바와 같이 공지되어 있다.
또다른 실시형태에서, 본 발명은 때때로 "진정한 소광제(true quencher)"라고 일컫는 비-형광 억셉터를 포함하는 클로스트리디움계 독소 기질에 의존한다. 비-형광 억셉터는 예를 들어, 직접적인 (감광되지않은) 억셉터 여기로 인한 배경 형광을 제거하는 데에 유용할 수 있다. 예를 들어, DABCYL 및 QSY®7 염료를 포함하여, 다양한 비-형광 억셉터가 공지되어 있다(Molecular Probes, supra, 1996 참조).
본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질은, 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 위치하는 클로스트리디움계 독소 절단 부위를 포함한다. 일 실시형태에서, 도너 플루오로포어는 절단부위의 아미노-말단에 위치하는 반면, 억셉터는 절단부위의 카르복시-말단에 위치한다. 또다른 실시형태에서, 도너 플루오로포어는 절단부위의 카르복시-말단에 위치하는 반면, 억셉터는 절단부위의 아미노-말단에 위치한다.
당업자라면 본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질에서 도너 플루오로포어 및 억셉터를 선택 및 위치시키는 데 몇가지를 고려해야 한다는 것을 이해할 것이다. 도너 플루오로포어 및 억셉터는 일반적으로, 기질이 클로스트리디움계 독소에 결합하거나 독소에 의해 단백가수분해되는 것을 방해하는 것을 최소화하도록 위치한다. 따라서, 예를 들어, 결합에 중요한, 결합 및 비-결합 상호작용의 분열을 최소화하고, 입체장애를 최소화하도록, 도너 플루오로포어 및 억셉터를 선택 및 위치시킨다. 또한, 억셉터와 도너 플루오로포어 사이의 공간적 거리는 일반적으로, 도너 플루오로포어로부터 억셉터로효과적인 에너지 전이를 달성하도록 제한된다.
표준 명명법에서, 클로스트리디움계 독소 절단 부위를 둘러싼 서열은, 분리가능 결합을 나타내는 P1-P1'을 가지는, P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'로 나타낸다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 위치 P1, P2, P3, P4, P5 또는 P>5에서의 잔기가 도너 플루오로포어 또는 억셉터와 컨쥬게이트된 아미노산으로 치환되고, 위치 P1', P2', P3', P4', P5' 또는 P>5'에서의 잔기가 도너 플루오로포어 또는 억셉터와 컨쥬게이트된 아미노산으로 치환된 클로스트리디움계 독소 기질을 포함하는 기질 조성물, 세포 또는 방법을 제공한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명은 위치 P1, P3, P4 또는 P>5에서의 잔기가 도너 플루오로포어 또는 억셉터와 컨쥬게이트된 아미노산으로 치환되고, 위치 P2', P3', P5' 또는 P>5'에서의 잔기가 도너 플루오로포어 또는 억셉터와 컨쥬게이트된 아미노산으로 치환된클로스트리디움계 독소 기질을 병합하는 기질 조성물, 세포 또는 방법을 제공한다. 또한, 도너 플루오로포어 또는 억셉터와 컨쥬게이트된 잔기의 아미노산 측쇄는, 천연 표적 단백질의 해당 위치에 존재하는 잔기와 일치하거나 예를 들어, 상이한 측쇄를 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 본 발명은 위치 P3, P4 또는 P>5에서의 잔기가 도너 플루오로포어 또는 억셉터와 컨쥬게이트된 아미노산으로 치환되고, 위치 P2', P3', P5' 또는 P>5'에서의 잔기가 도너 플루오로포어 또는 억셉터와 컨쥬게이트된 아미노산으로 치환된클로스트리디움계 독소 기질을 병합하는 기질 조성물, 세포 또는 방법을 제공한다. 역시, 도너 플루오로포어 또는 억셉터와 컨쥬게이트된 잔기의 아미노산 측쇄는, 천연 표적 단백질의 해당 위치에 존재하는 잔기와 일치하거나 예를 들어, 상이한 측쇄를 포함할 수 있다.
상기한 바와 같이, 도너 플루오로포어로부터 억셉터로의 에너지 전이 효율은, 일부, 도너 플루오로포어와 억셉터 분자의 공간적 분리에 의존한다. 도너 플루오로포어와 억셉터 사이의 거리가 증가할 수록, 억셉터로의 에너지 전이가 감소하며, 따라서, 절단 이전이라도 도너 플루오로포어 신호가 증가한다. 기질의 절단시, 도너 플루오로포어 형광 수율의 전체 증가는, 기질내 도너 플루오로포어와 억셉터 사이의 분리 거리, 도너 플루오로포어와 억셉터 사이의 스펙트럼 오버랩, 및 기질 농도를 포함하는 많은 인자들에 의존한다. 당업자라면 단백가수분해 절단 이후라도 기질의 농도가 증가하면, 도너의 분자간 소광이 의존 인자가 될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 현상은 "내부 필터 효과(inner filter effect)"라 한다. 당업자라면 예를 들어, 유도성 프로모터를 사용하여 기질의 세포내 농도를 제어하거나, 세포가 노출되는 기질의 외부 농도를 제어할 수 있음을 이해할 것이다.
50% 에너지 전이를 위한 도너 플루오로포어와 억셉터 사이의 간격인 푀르스터 거리는, 도너 플루오로포어와 억셉터의 공간적 분리를 나타내며, 민감성이 좋다. 펩티드 기질에 있어서, 인접 잔기는 최대로 연장된 구조에서 약 3.6Å의 거리로 떨어져 있다. 예를 들어, 플루오레세인/테트라메틸로다민 쌍에 대해 계산된 푀르스터 거리는 55Å으로, 이는 플루오레세인과 테트라메틸로다민 사이의 공간적 분리가, 최대로 연장된 구조에서, 약 15개의 잔기임을 나타낸다. 용액 중의 펩티드 및 펩티도미메틱은 완전히 연장된 구조는 거의 갖지 않기 때문에, 도너 플루오로포어 및 억셉터는, 잔기당 3.6Å으로 계산하여 예상한 것보다 더욱 멀리 분리될 수 있으나, 예를 들어, 약 50개 아미노산에 의해 떨어져 있는 도너-억셉터 쌍 사이의 FRET의 발생에 의해 나타나는 바와 같이, 여전히 푀르스터 거리내에 있다(GRAHAM et al., ANALYT. BIOCHEM. 296: 208-217 (2001)).
푀르스터 이론은 도너 플루오로포어와 억셉터 사이의 매우 약한 상호작용에 기초한다; 한 플루오로포어의 흡광과 같은 분광학적 특성은, 나머지 하나의 플루오로포어의 존재시, 변경되지 않을 것이며, 이론이 유효한 가장 짧은 거리 범위를 정의한다. 많은 도너 플루오로포어-억셉터 쌍에서, 도너 플루오로포어와 억셉터가 약 10Å 내지 100Å 떨어져 있는 경우, 푀르스터 이론이 유효할 것으로 이해된다. 그러나, 특정한 도너 플루오로포어-억셉터 쌍에서는, 피코초 이하의 기술로 결정되는 바와 같이, 10Å이하에서 푀르스터 이론이 유효하다(Kaschke and Ernsting, Ultrafast Phenomenon in Spectroscopy (Klose and Wilhelmi (Eds.)) Springer-Verlag, Berlin 1990.
특정 실시형태에서, 본 발명은 도너 플루오로포어가 억셉터와 최대 100Å 거리로 떨어져 있는 클로스트리디움계 독소 기질을 병합한 기질 조성물, 세포 또는 방법을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 도너 플루오로포어가 억셉터와 최대 90Å, 80Å, 70Å, 60Å, 50Å, 40Å, 30Å 또는 20Å 거리로 떨어져 있는 클로스트리디움계 독소 기질을 병합한 기질 조성물, 세포 또는 방법을 제공한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명은 도너 플루오로포어가 억셉터와 10Å 내지 100Å, 10Å 내지 80Å, 10Å 내지 60Å, 10Å 내지 40Å, 10Å 내지 20Å, 20Å 내지 100Å, 20Å 내지 80Å, 20Å 내지 60Å, 20Å 내지 40Å, 40Å 내지 100Å, 40Å 내지 80Å 또는 40Å 내지 60Å,거리로 떨어져 있는 클로스트리디움계 독소 기질을 병합한 기질 조성물, 세포 또는 방법을 제공한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명은 도너 플루오로포어가 억셉터와 최대 6개 잔기, 최대 8개 잔기, 최대 10개 잔기, 최대 12개 잔기, 최대 15개 잔기, 최대 20개 잔기, 최대 25개 잔기, 최대 30개 잔기, 최대 35개 잔기, 최대 40개 잔기, 최대 45개 잔기, 최대 50개 잔기, 최대 60개 잔기, 최대 70개 잔기, 최대 80개 잔기, 최대 90개 잔기, 최대 100개 잔기, 최대 150개 잔기, 최대 200개 잔기 또는 천연 클로스트리디움계 독소 표적 단백질의 전체 길이까지의 거리로 떨어져 있는 클로스트리디움계 독소 기질을 병합한 기질 조성물, 세포 또는 방법을 제공한다.
당업자는 본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질이 FRET의 효율뿐아니라, 프로테아제 활성을 검출하는 능력을 최적화시키도록 디자인될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 당업자는 필요시, 높은 양자 수득률을 가지는 도너 플루오로포어를 선택하고, 필요시, 푀르스터 거리를 최대화하도록 높은 흡광 계수를 가지는 억셉터를 선택할 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는 또한, 억셉터의 직접 여기로부터 나온 형광을 공명 에너지 전이로부터 얻어지는 형광과 구별하기 어려울 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 억셉터의 직접 여기를 일으키지 않는 파장에서 도너가 여기될 수 있도록, 여기 스펙트럼의 오버랩이 비교적 작은 도너 플루오로포어 및 억셉터를 선택할 수 있다는 것을 알 수 있다. 본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질은, 두가지 방출이 쉽게 구별되도록 도너 플루오로포어와 억셉터의 방출 스펙트럼이 비교적 적게 겹쳐질 수 있게 디자인될 수 있다는 것을 또한 알 수 있다. 필요시, 높른 형광 양자 수득률을 가지는 억셉터를 선택할 수 있다; 이러한 억셉터는, 억셉터 형광 방출이 클로스트리디움계 독소 활성의 유일한 지표로서 또는 상기한 바와 같이 방출 비율의 부분으로서 검출되는 경우, 유리하게 사용될 수 있다.
도너 플루오로포어, 억셉터, 또는 두가지 모두가 보툴리눔 또는 파상풍 독소 홀로효소(holoenzyme)의 활성 부위 캐비티 내에 위치할 수 있을 것으로 이해된다. 당업자는 필요시, 본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질이, 독소에 의해 결합시, 도너 플루오로포어, 억셉터, 또는 두가지 모두가 독소 홀로효소의 활성 부위 캐비티에 포함되지 않도록 디자인될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 클로스트리디움계 독소 기질은, 독소에 의해 결합시, 도너 플루오로포어, 억셉터, 또는 두가지 모두가 독소 홀로효소의 활성 부위 캐비티에 포함되지 않는 보툴리눔 독소 기질 또는 파상풍 독소 기질을 포함할 수 있다. 본 발명은 예를 들어, 독소에 의해 결합시, 도너 플루오로포어, 억셉터, 또는 두가지 모두가 독소 홀로효소의 활성 부위 캐비티에 포함되지 않는 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G 또는 TeNT 기질을 병합한 기질 조성물, 세포 또는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, BoNT/A 기질은 6개의 잔기가 Gln197-Arg198를 포함하는, 적어도 6개의 사람 SNAP-25 잔기를 포함하며, 또한, 잔기 Arg191 내지 Met202의 바깥쪽에 위치하고, BoNT/A 홀로효소의 활성 부위 캐비티 내에 있을 수 있는 도너 플루오로포어, 억셉터 또는 두가지 모두를 포함한다. 또다른 실시형태에서, BoNT/B 기질은 6개의 잔기가 Gln76-Phe77를 포함하는, 적어도 6개의 VAMP-25 잔기를 포함하며, 또한, VAMP-2의 잔기 Leu70 내지 Ala81의 바깥쪽에 위치하고, BoNT/B 홀로효소의 활성 부위 캐비티 내에 있을 수 있는 도너 플루오로포어, 억셉터 또는 두가지 모두를 포함한다.
VAMP 기질과 BoNT/B의 경쇄(LC/B)의 복합체에서, 수소 결합 억셉터 또는 도너를 포함하여 측쇄를 가지는 거의 모든 VAMP 잔기가 LC/B와 수소 결합하였다. 따라서, 필요시, 예를 들어, Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu, Asn 또는 Gln 잔기에 의한 수소 결합의 포텐셜이, 독소에 의해 절단되기 쉬운 본래의 단백질과 비교할때, 클로스트리디움계 독소 기질에서 감소되지 않게, 본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 잔기를 제조할 수 있을 것으로 이해된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은, 기질에서의 수소-결합의 포텐셜이, 해당 독소에 의해 절단되기 쉬운 본래의 단백질과 비교할때, 감소되지 않은 클로스트리디움계 독소 기질을 포함하는 기질 조성물, 세포 또는 방법을 제공한다.
도너 플루오로포어, 억셉터 및 클로스트리디움계 독소 인식 서열 외에도, 본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질은 선택적으로 하나 이상의 추가적인 구성요소를 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, GGGGS(SEQ ID NO: 40)와 같은 탄력적인 스페이서 서열이 본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질에 포함될 수 있다. 유용한 클로스트리디움계 독소 서열은 또한 하기의 것을 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: HIS6와 같은 친화도 태그, 바이오틴 또는 FLAG와 같은 에피토프, 헤마글루티닌(HA), c-myc, 또는 AU1; 면역글로불린 힌지 영역; N-히드록시숙신이미드 링커; 펩티드 또는 펩티도미메틱 헤어핀 턴; 또는 친수성 서열, 또는 클로스트리디움계 독소 기질의 용해성 또는 안정성을 향상시키는 다른 구성요소 또는 서열.
도너 플루오로포어 또는 억셉터를 포함하도록 단백질, 펩티드 및 펩티도미메틱을 변형하는 방법이 공지되어 있다(Fairclough and Cantor, Methods Enzymol. 48: 347-379 (1978) ; Glaser et al., Chemical Modification of Proteins Elsevier Biochemical Press, Amsterdam (1975) ; Haugland, EXCITED STATES OF BIOPOLYMERS (STEINER ED.) PP. 29-58, PLENUM Press, New York (1983); Means and Feeney, BIOCONJUGATE CHEM. 1: 2-12 (1990); MATTHEWS et al., METHODS ENZYMOL. 208: 468-496 (1991); LUNDBLAD, Chemical Reagents for Protein Modification 2nd Ed., CRC Press, Boca Ratan, Florida (1991); Haugland, supra, 1996). 다양한 그룹이 도너 플루오로포어 또는 억셉터를 예를 들어, 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하는 펩티드 또는 펩티도미메틱에 커플링하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 기질 조성물, 세포 및 방법에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질을 제조하기 위하여, 예를 들어, 티올 그룹을 도너 플루오로포어 또는 억셉터를 펩티드 또는 펩티도미메틱의 원하는 위치에 커플링하는데 사용할 수 있다. 본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질을 제조하는데 있어서, 도너 플루오로포어 또는 억셉터를 커플링하기 위하여 할로아세틸 및 말레이미드 표지 시약을 또한 사용할 수 있다(예를 들어, Wu and Brand, supra, 1994 참조).
GFP 및 알로피코시아닌(APC)과 같은 단백질을 포함하는 도너 플루오로포어 및 억셉터가 다양한 방법으로 클로스트리디움계 독소 인식 서열에 부착될 수 있다. 도너 플루오로포어 또는 억셉터는 화학적 방법, 예를 들어, 교차-링커 잔기를 사용하여 부착될 수 있다. 교차-링커는 공지되어 있으며, BMH 및 SPDP와 같은 호모- 및 헤테로-2 기능성 교차-링커를 포함한다. 당업자라면 도너 플루오로포어만을 포함하는 기질이 오염되면 형광 배경이 커질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 배경은 예를 들어, 클로스트리디움계 독소 기질의 제조시, 도너 플루오로포어에 비하여 비교적 과도한 억셉터를 사용하여 감소 또는 방지할 수 있다. 도너 플루오로포어 또는 억셉터가 단백질인 경우, 단백질의 아미노- 또는 카르복시-말단에 분자를 특이적으로 결합하기 위해 공지의 화학적 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, "Chemical Approaches to PROTEIN ENGINEERING" in Protein Engineering : A Practical Rees et al. (Eds) Oxford University Press, 1992를 참조한다.
클로스트리디움계 독소가 특이적이고 구별되는 절단 부위를 가진다는 것이 공지되어 있다. BoNT/A는 Gln-Arg 결합을 절단하고, BoNT 및 TeNT는 Gln-Phe 결합을 절단하고; BoNT/C1은 Lys-Ala 결합 또는 Arg-Ala 결합을 절단하고; BoNT/D는 Lys-Leu 결합을 절단하고; BoNT/E는 Arg-Ile 결합을 절단하고; BoNT/F는 Gln-Lys 결합을 절단하고; BoNt/G는 Ala-Ala 결합을 절단한다(표 D 참조). 표준 명명법에서, 클로스트리디움계 독소 절단 부위를 둘러싼 서열은 분리가능 결합을 나타내는 P1-P1'을 가지는, P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-P5'로 나타낸다. P1 또는 P1' 부위, 또는 두가지 모두가, 천연 잔기 대신에 다른 아미노산 또는 아미노산미메틱으로 치환될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, BoNT/A 기질은 P1 위치(Gln)이 알라닌, 2-아미노부티르산 또는 아스파라긴 잔기로 변형되어 제조될 수 있다; 이러한 기질은 BoNT/A에 의해서 P1 -Arg 결합에서 가수분해된다(Schmidt and Bostian, J. Protein Chem. 16: 19- 26 (1997)). 분리가능 결합의 P1 위치, 예를 들어, BoNT/A분리가능 위치를 치환하는 반면에, P1' 잔기는 보존하는 것이 유리할 수 있다는 것을 알 수 있다(Vaidyanathan et al., J. Neurochem.72: 327-337 (1999)). 따라서, 특정 실시형태에서, 본 발명은, 클로스트리디움계 독소에 의해 절단되는 표적 단백질의 천연 잔기와 비교하여 P1' 잔기가 변형이나 치환되지 않은 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 가지는 클로스트리디움계 독소 기질에 의존하는, 기질 조성물, 세포 또는 방법을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은, 클로스트리디움계 독소에 의해 절단되는 표적 단백질의 천연 잔기와 비교하여 P1 잔기가 변형이나 치환된 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 가지는 클로스트리디움계 독소 기질에 의존하는, 기질 조성물, 세포 또는 방법을 제공한다; 이러한 클로스트리디움계 독소 기질은 P1과 P1' 잔기 사이의 펩티드 결합 절단에 대한 민감성을 유지한다.
SNAP-25, VAMP 및 신택신은 -나선형 구조(도 4 참조)를 취할 것으로 예상되는 영역 내에 위치하는 짧은 모체를 공유한다. 이러한 모체는 신경독에 민감한 동물에서 발현되는 SNAP-25, VAMP 및 신택신 이소폼에 존재한다. 이와 대조적으로, 이러한 신경독에 내성이 있는 초파리 및 효모 상동체 및 엑소사이토시스에 관여하지 않는 신택신 이소폼은 이러한 VAMP 및 신택신 단백질의 -나선형 모체 영역에서의 서열 변화를 포함한다.
-나선형 모체는 여러번 반복되어 클로스트리디움계 독소에 의해 절단되기 쉬운 단백질에 존재한다: 4 카피가 천연 SNAP-25에 존재하고; 2카피가 천연 VAMP에 존재하고; 2 카피가 천연 신택신에 존재한다(도 4A 참조). 또한, -나선형 모체의 특이 서열에 상응하는 펩티드는 in vitro 및 in vivo에서 신경독 활성을 억제할 수 있고, 이러한 펩티드는 상이한 신경독을 교차-억제할 수 있다. 또한, 이러한 펩티드에 대하여 생성된 항체는 3가지 표적 단백질 중에서 교차-반응할 수 있으며, 이는 이러한 -나선형 모체가 세포 표면에 노출되어, 세가지 표적 단백질 각각에서 유사한 구조를 취하는 것을 나타낸다. 이러한 점과 일관되게, SANP-25-특이적, VAMP-특이적 및 신택신-특이적인 신경독은, 표적을 비-특이적으로 절단하지는 않지만, 동일한 결합 부위에 대하여 경쟁하여, 서로 교차-억제한다. 이러한 결과는 클로스트리디움계 독소 인식 서열이 필요시 적어도 하나의 -나선형 모체를 포함할 수 있다는 것을 나타낸다. 하기에 논의하는, BoNT/A에 대한 16-머 및 17-머 기질에 의해 증명된 바와 같이, -나선형 모체는 클로스트리디움계 독소에 의한 절단에는 필요하지 않다는 것을 알 수 있다.
다중 -나선형 모체가 천연 SANP-25, VAMP 및 신택신 표적 단백질에서 발견되었지만, 본 발명의 기질 조성물, 세포 및 방법에 유용한 클로스트리디움계 독소 인식 서열은 단일 -나선형 모체를 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 둘 이상의 -나선형 모체를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열에 의존한다. BoNT/A 또느 BoNT/E 인식 서열은 예를 들어, S4 -나선형 모체를 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 -나선형 모체와 조합하여 포함할 수 있다; BoNT/B, BoNT/G 또는 TeNT 인식 서열은 예를 들어, V2 -나선형 모체를 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 -나선형 모체와 조합하여 포함할 수 있다; BoNT/C1 인식 서열은 예를 들어, S4 -나선형 모체를 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 -나선형 모체와 조합하여 포함하거나, X2 -나선형 모체를 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 -나선형 모체와 조합하여 포함할 수 있다; 그리고, BoNT/D 또는 BoNT/F 인식 서열은 예를 들어, V1 -나선형 모체를 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 -나선형 모체와 조합하여 포함할 수 있다(도 4A 참조).
다양한 BoNT/A 기질이 본 발명에 유용하다. 본 발명의 기질 조성물, 세포 및 방법에 유용한 BoNT/A 기질은 예를 들어, 6개의 연속된 잔기가 Gln-Arg을 포함하는 적어도 6개의 연속하는 SNAP-25 잔기 또는 이의 펩티도미메틱을 포함할 수 있다. 이러한 BoNT/A 기질은 예를 들어, 6개의 연속하는 잔기가 Gln197-Arg198을 포함하는 적어도 6개의 연속하는 사람 SNAP-25 잔기 또는 이의 펩티도미메틱을 가질 수 있다. 이러한 BoNT/A 기질은 예를 들어, 아미노산 서열 Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys (SEQ ID NO : 41), 또는 예를 들어, 사람 SNAP-25의 잔기 187 내지 203 (SEQ ID NO : 4)를 포함할 수 있다. BoNT/A 기질은 또한 필요시, 카르복시-말단 아미드를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용시, "보툴리눔 독소 세로타입 A 인식 서열"이란 용어는 "BoNT/A 인식 서열"과 동의어이며, 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건하에서 BoNT/A에 의해 분리 가능한 결합에서 단백가수분해를 검출하기에 충분한, 인접 또는 비-인접 인식 요소와 함께 분리 가능한 결합을 의미한다. BoNT/A에 의해 분리되는, 분리가능 결합은 예를 들어, Gln-Ala이다.
다양한 BoNT/A 인식 서열이 공지되어 있으며, 본 발명에 유용하다. BoNT/A 인식 서열은 예를 들어, 사람 SNAP-25의 잔기 136 내지 206 또는 잔기 137 내지 206을 가질 수 있다(Ekong et al., supra, 1997 ; U. S. Patent No. 5,962, 637). BoNT/A 인식 서열은 또한 사람 SNAP-25의 잔기 190 내지 202에 해당하는 서열 Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (SEQ ID NO : 49) 또는 이의 펩티도미메틱; 사람 SNAP-25의 잔기 187 내지 201에 해당하는 서열 Ser-Asn-Lys-Thr- Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys (SEQ ID NO : 50) 또는 이의 펩티도미메틱; 사람 SNAP-25의 잔기 187 내지 202에 해당하는 서열 Ser-Asn-Lys-Thr- Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (SEQ ID NO: 51) 또는 이의 펩티도미메틱; 사람 SNAP-25의 잔기 187 내지 203에 해당하는 서열 Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met-Leu (SEQ ID NO : 52) 또는 이의 펩티도미메틱; 사람 SNAP-25의 잔기 186 내지 202에 해당하는 서열 Asp-Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg- Ala-Thr-Lys-Met (SEQ ID NO : 53)또는 이의 펩티도미메틱; 사람 SNAP-25의 잔기 186 내지 203에 해당하는 서열 Asp-Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met-Leu (SEQ ID NO: 54) 또는 이의 펩티도미메틱;을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, Schmidt and Bostian, J. Protein Chem. 14: 703-708 (1995); Schmidt and Bostian, supra, 1997; Schmidt et al., FEBS Letters 435: 61-64 (1998); and Schmidt and Bostian, U. S. Patent No. 5,965, 699)를 참조한다. 유사한 BoNT/A 인식 서열은, 필요시, 또다른 BoNT/A-민감성 SNAP-25 이소폼의 상응하는 (상동체) 단편 또는 예를 들어, 쥐, 래트, 금붕어 또는 제브라피쉬 SNAP-25와 같은 상동체로부터 제조하거나, 본 명세서에 기재하거나 예를 들어, 미국 특허 5,965,699에 공지된 임의의 펩티드일 수 있다.
본 발명에 유용한 BoNT/A 인식 서열은, 보툴리눔 독소 세포타입 A에 의해 절단되기 쉬운 단백질의 단편에 상응하거나, 또는 BoNT/A-민감성 단백질의 단편과 실질적으로 유사할 수 있다. 표 E에 나타낸 바와 같이, BoNT/A에 의해 절단되기 쉬운 다양한 천연 단백질이 공지되어 있으며, 예를 들어, 사람, 마우스 및 래트 SNAP-25; 및 금붕어 SNAP-25A 및 SANP-25B를 포함한다. 따라서, 본 발명에 유용한 BoNT/A 인식서열은 예를 들어, 사람 SNAP-25, 마우스 SNAP-25, 래트 SNAP-25, 금붕어 SNAP-25A 또는 SNAP-25B, 또는 BoNT/A에 의해서 절단되기 쉬운 또다른 천연 단백질에 상응할 수 있다. 또한, BoNT/A에 의해 절단되는 본래의 SNAP-25 아미노산 서열과 비교할 때, 이러한 서열은 완전하게 보존되지는 않으며(표 E 및 도 5 참조), 천연 BoNT/A-민감성 SNAP-25 서열에 대한 다양한 아미노산 치환 및 변형이 본 발명에 유용한 BoNT/A 인식 서열에서 허용될 수 있다.
BoNT/A와 같은 클로스트리디움계 독소 기질은, 상응하는 클로스트리디움계 독소에 의해 절단되는 천연 서열과 비교할 때, 하나 또는 다중의 변형을 가질 수 있다. 예를 들어, 사람 SNAP-25의 잔기 187 내지 203에 상응하는 17-머와 비교할때, BoNT/A 기질에서 Asp193이 Asn으로 치환되면 단백가수분해의 비율이 0.23이 되며; Glu194가 Gln으로 치환되면 비율이 2.08이 되고; Ala195가 2-아미노부티르산으로 치환되면 비율이 0.38이 되고; Gln197이 Asn, 2-아미노부티르산 또는 Ala으로 치환되면 비율이 각각 0.66, 0.25 또는 0.19가 된다(표 F 참조). 또한, Ala199를 2-아미노부티르산으로 치환하면 비율이 0.79가 되고; Thr200을 Ser 또는 2-아미노부티르산으로 치환하면 비율이 각각 0.26 또는 1.20이 되고; Lys201을 Ala으로 치환하면 비율이 0.12가 되고; Met202을 Ala 또는 노르류신으로 치환하면 비율이 각각 0.38 또는 1.20이 된다. Schmidt and Bostian, supra, 1997 참조. 이러한 결과는 천연 독소-민감성 서열과 비교하여 클로스트리디움계 독소에서 다양한 잔기가 치환될 수 있음을 나타낸다. BoNT/A의 경우, 이러한 결과는, Glu194, Ala195, Gln197, Ala199, Thr200 및 Met202, Leu203, Gly204, Ser205 및 Gly206을 포함하나, 이에 제한되지 않는 잔기뿐아니라 Gln-Arg 분리가능 결합으로부터 더 끝쪽에 있는 잔기도 치환되거나, 본 발명에 유용한 BoNT/A 기질의 도너 플루오로포어 또는 억셉터에 컨쥬게이트될 수 있음을 나타낸다. 이러한 BoNT/A 기질은, 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건하에서, BoNT/A에 의해 분리가능한 결합에서 검출가능하게 단백가수분해될 수 있다. 따라서, BoNT/A 기질은 필요시, 천연 SNAP-25 서열과 비교하여, 하나 또는 몇개의 아미노산 치환, 추가 또는 삭제를 포함할 수 있다.
다양한 BoNT/B 기질이 본 발명에 유용하다. 본 발명에 유용한 BoNT/B 기질은 예를 들어, 6개의 연속된 잔기가 Gln-Phe을 포함하는 적어도 6개의 연속하는 VAMP 잔기 또는 이의 펩티도미메틱을 가질 수 있다. BoNT/B 기질은 예를 들어, 6개의 연속하는 잔기가 Gln76-Phe77을 포함하는 적어도 6개의 연속하는 사람 VAMP-2 잔기 또는 이의 펩티도미메틱을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, BoNT/B 기질은 아미노산 서열 Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser (SEQ ID NO : 42), 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다. 다른 실시형태에서, BoNT/B 기질은 사람 VAMP-2의 잔기 55 내지 94 (SEQ ID NO : 11); 사람 VAMP-2의 잔기 60 내지 94 (SEQ ID NO : 11); 또는 사람 VAMP-2의 잔기 60 내지 88 (SEQ ID NO : 11) 또는 이들 서열중 하나의 펩티도미메틱을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용시, "보툴리눔 독소 세로타입 B 인식 서열"이란 용어는 "BoNT/B 인식 서열"과 동의어이며, 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건하에서 BoNT/B에 의해 분리 가능한 결합에서 단백가수분해를 검출하기에 충분한, 인접 또는 비-인접 인식 요소와 함께 분리 가능한 결합을 의미한다. BoNT/B에 의해 분리되는, 분리가능 결합은 예를 들어, Gln-Phe이다.
다양한 BoNT/B 인식 서열이 공지되어 있으며, 통상의 방법으로 정의될 수 있다. 이러한 BoNT/B 인식 서열은, 예를 들어, 사람 VAMP-1 또는 사람 VAMP-2와 같은 VAMP 단백질의 친수성 코어 전체 또는 일부에 상응하는 서열을 포함할 수 있다. BoNT/B 인식 서열은 사람 VAMP-2(SEQ ID NO : 11)의 잔기 33 내지 94, 잔기 45 내지 94, 잔기 55 내지 94, 잔기 60 내지 94, 잔기 64 내지 94, 잔기 60 내지 88, 또는 사람 VAMP-1(SEQ ID NO : 10)의 잔기 60 내지 94를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. Shone et al. , Eur. J. Biochem. 217: 965-971 (1993) 및 U. S. Patent No. 5,962, 637를 참조한다. 유사한 BoNT/B 인식 서열은 필요시, 또다른 BoNT/B-민감성 VAMP 이소폼의 상응하는 (상동체) 단편 또는 사람 VAMP-1 또는 래트 또는 닭 VAMP-2와 같은 상동체로부터 제조할 수 있다.
따라서, BoNT/B 인식 서열은, 보툴리눔 독소 세포타입 B에 의해 절단되기 쉬운 단백질의 단편에 상응하거나, 또는 BoNT/B-민감성 단백질의 단편과 실질적으로 유사할 수 있다. 표 G에 나타낸 바와 같이, BoNT/B에 의해 절단되기 쉬운 다양한 천연 단백질이 공지되어 있으며, 예를 들어, 사람, 마우스 및 소 VAMP-1 및 VAMP-2; 래트 VAMP-2; 래트 셀루브레빈; 닭 VAMP-2; 토르페도 VAMP-1; 성게 VAMP; 군소 VAMP; 오징어 VAMP; 예쁜꼬마선충 VAMP; 초파리 n-syb; 및 거머리 VAMP를 포함한다. 따라서, BoNT/B 기질에 포함되는 BoNT/B 인식 서열은 예를 들어, 사람 VAMP-1 또는 VAMP-2, 마우스 VAMP-1 또는 VAMP-2, 소 VAMP-1 또는 VAMP-2, 래트 VAMP-2, 래트 셀루브레빈, 닭 VAMP-2, 토르페도 VAMP-1, 성게 VAMP, 군소 VAMP, 오징어 VAMP, 예쁜꼬마선충 VAMP, 초파리 n-syb, 거머리 VAMP 또는 BoNT/B에 의해 절단되기 쉬운 또다른 천연 단백질의 단편에 상응할 수 있다. 또한, 표 G에 나타낸 바와 같이, BoNT/B에 의해 절단되는 본래의 VAMP 아미노산 서열과 비교할때, 이러한 서열은 완전하게 보존되지는 않으며(도 6 참조), 천연 VAMP 서열에 대한 다양한 아미노산 치환 및 변형이, 예를 들어, 본 발명의 BoNT/B 기질 조성물에 유용한 BoNT/B 인식 서열에서 허용될 수 있다.
다양한 BoNT/C1 기질이 본 발명에 유용하다. 본 발명에 유용한 BoNT/C1 기질은 예를 들어, 6개의 연속된 잔기가 Lys-Ala을 포함하는 적어도 6개의 연속하는 신택신 잔기 또는 이의 펩티도미메틱을 가질 수 있다. BoNT/C1 기질은 예를 들어, 6개의 연속하는 잔기가 Lys253-Ala254을 포함하는 적어도 6개의 연속하는 사람 신택신 잔기 또는 이의 펩티도미메틱을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, BoNT/C1 기질은 아미노산 서열 Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Tyr (SEQ ID NO : 43), 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다.
BoNT/C1 기질은 또한 예를 들어, 6개의 연속된 잔기가 Arg-Ala을 포함하는 적어도 6개의 연속하는 SNAP-25 잔기 또는 이의 펩티도미메틱을 가질 수 있다. 이러한 BoNT/C1 기질은 예를 들어, 6개의 연속된 잔기가 Arg198-Ala199을 포함하는 적어도 6개의 연속하는 사람 SNAP-25 잔기 또는 이의 펩티도미메틱을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, BoNT/C1 기질은 사람 SANP-25의 잔기 93 내지 202(SEQ ID NO : 4) 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다.
본 명세서에서 사용시, "보툴리눔 독소 세로타입 C1 인식 서열"이란 용어는 "BoNT/C1 인식 서열"과 동의어이며, 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건하에서 BoNT/C1에 의해 분리 가능한 결합에서 단백가수분해를 검출하기에 충분한, 인접 또는 비-인접 인식 요소와 함께 분리 가능한 결합을 의미한다. BoNT/C1에 의해 분리되는, 분리가능 결합은 예를 들어, Lys-Ala 또는 Arg-Ala이다.
BoNT/C1 인식 서열은, 보툴리눔 독소 세포타입 C1에 의해 절단되기 쉬운 단백질의 단편에 상응하거나, 또는 BoNT/C1-민감성 단백질의 단편과 실질적으로 유사할 수 있는 것으로 이해된다. 표 H에 나타낸 바와 같이, BoNT/C1에 의해 절단되기 쉬운 다양한 천연 단백질이 공지되어 있으며, 예를 들어, 사람, 래트, 마우스 및 소 신택신 1A 및 1B; 래트 신택신 2 및 3; 성게 신택신; 군소 신택신 1; 오징어 신택신; 초파리 Dsynt1; 및 거머리 신택신 1이 포함된다. 따라서, BoNT/C1 기질에 유용한 BoNT/C1 인식 서열은 예를 들어, 사람, 래트, 마우스 또는 소 신택신 1A 또는 1B; 래트 신택신 2, 래트 신택신 3, 성게 신택신, 군소 신택신 1, 오징어 신택신, 초파리 Dsynt1, 거머리 신택신 1 또는 BoNT/C1에 의해 절단되기 쉬운 또다른 천연 단백질의 단편에 상응할 수 있다. 또한, BoNT/C1에 의해 절단되는 본래의 신택신 아미노산 서열과 비교할때, 이러한 서열은 완전하게 보존되지는 않으며(표 H 및 도 7 참조), 천연 BoNT/C1-민감성 신택신 서열에 대한 다양한 아미노산 치환 및 변형이, 예를 들어, 본 발명에 유용한 BoNT/C1 기질에서 허용될 수 있다.
다양한 천연 SNAP-25 단백질이 또한 BoNT/C1에 의해 절단되기 쉬우며, 사람, 마우스 및 래트 SNAP-25; 금붕어 SNAP-25A 및 SNAP-25B; 및 초파리 및 거머리 SNAP-25를 포함한다. 따라서, BoNT/C1 기질에 유용한 BoNT/C1 인식 서열은 예를 들어, 사람, 마우스 또는 래트 SNAP-25, 금붕어 SNAP-25A 또는 SNAP-25B, 초파리 SNAP-25, 거머리 SNAP-25 또는 BoNT/C1에 의해 절단되기 쉬운 또다른 천연 단백질의 단편에 상응할 수 있다. 다양한 천연 신택신 서열에 대하여 상기한 바와 같이, BoNT/C1에 의해 절단되는 본래의 SNAP-25 아미노산 서열과 비교할때, 상당한 서열 변화가 나타나며(표 E 및 도 5 참조), 천연 BoNT/C1-민감성 SNAP-25 서열에 대한 다양한 아미노산 치환 및 변형이 본 발명에 유용한 BoNT/C1 기질에서 허용될 수 있는 것으로 나타났다.
당업자에게는 다양한 BoNT/D 서열이 본 발명에 유용하다는 것이 명백할 것이다. 본 발명에 유용한 BoNT/D 기질은 예를 들어, 6개의 연속된 잔기가 Lys-Leu을 포함하는 적어도 6개의 연속하는 VAMP 잔기 또는 이의 펩티도미메틱을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, BoNT/D 기질은 6개의 연속하는 잔기가 Lys59-Leu60을 포함하는 적어도 6개의 연속하는 사람 VAMP 잔기 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다. 일 실시형태에서, BoNT/D 기질은 아미노산 서열 Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu-Leu (SEQ ID NO : 44), 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다. 또다른 실시형태에서, BoNT/D 기질은 래트 VAMP-2의 잔기 27 내지 116(SEQ ID NO : 109), 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다.
본 명세서에서 사용시, "보툴리눔 독소 세로타입 D 인식 서열"이란 용어는 "BoNT/D 인식 서열"과 동의어이며, 클로스트리디움계 독소 프로테아제 활성에 적합한 조건하에서 BoNT/D에 의해 분리 가능한 결합에서 단백가수분해를 검출하기에 충분한, 인접 또는 비-인접 인식 요소와 함께 분리 가능한 결합을 의미한다. BoNT/D에 의해 분리되는, 분리가능 결합은 예를 들어, Lys-Leu이다.
다양한 BoNT/D 인식 서열이 공지되어 있으며, 통상의 방법으로 정의될 수 있다. 이러한 BoNT/D 인식 서열은, 예를 들어, 쥐 VAMP-2의 잔기 27 내지 116; 잔기 37 내지 116; 잔기 1 내지 86; 잔기 1 내지 76; 또는 잔기 1 내지 69를 포함할 수 있다(SEQ ID NO : 109 ; Yamasaki et al., J. Biol. Chem. 269 : 12764-12772 (1994)). 따라서, BoNT/D 인식 서열은 예를 들어, 쥐 VAMP-2의 잔기 27 내지 69 또는 잔기 37 내지 69를 포함할 수 있다.(SEQ ID NO : 109). 유사한 BoNT/D 인식 서열은 필요시, 또다른 BoNT/D-민감성 VAMP 이소폼의 상응하는 (상동체) 단편 또는 사람 VAMP-1 또는 사람 VAMP-2와 같은 상동체로부터 제조할 수 있다.
BoNT/D 인식 서열은, 보툴리눔 독소 세포타입 D에 의해 절단되기 쉬운 단백질의 단편에 상응하거나, 또는 BoNT/D-민감성 단백질의 단편과 실질적으로 유사할 수 있다. 표 H에 나타낸 바와 같이, BoNT/D에 의해 절단되기 쉬운 다양한 천연 단백질이 공지되어 있으며, 예를 들어, 사람, 마우스 및 소 VAMP-1 및 VAMP-2; 래트 VAMP-1 및 VAMP-2; 래트 셀루브레빈; 닭 VAMP-1 및 VAMP-2; 토르페도 VAMP-1; 군소 VAMP; 오징어 VAMP; 초파리 syb 및 n-syb; 및 거머리 VAMP를 포함한다. 따라서, BoNT/D 인식 서열은 예를 들어, 사람 VAMP-1 또는 VAMP-2, 마우스 VAMP-1 또는 VAMP-2, 소 VAMP-1 또는 VAMP-2, 래트 VAMP-1 또는 VAMP-2, 래트 셀루브레빈, 닭 VAMP-1 또는 VAMP-2, 토르페도 VAMP-1, 군소 VAMP, 오징어 VAMP, 초파리 syb 또는 n-syb, 거머리 VAMP 또는 BoNT/D에 의해 절단되기 쉬운 또다른 천연 단백질의 단편에 상응할 수 있다. 또한, 상기 표 H에 나타낸 바와 같이, BoNT/D에 의해 절단되는 본래의 VAMP 아미노산 서열과 비교할때, 상당한 서열변화가 나타났으며(도 6 참조), 천연 BoNT/D-민감성 VAMP 서열에 대한 다양한 아미노산 치환 및 변형이 본 발명에 유용한 BoNT/D 기질에서 허용될 수 있다.
다양한 BoNT/E 기질이 본 발명에 유용하다. BoNT/E 기질은 예를 들어, 6개의 연속된 잔기가 Arg-Ile을 포함하는 적어도 6개의 연속하는 SNAP-25 잔기 또는 이의 펩티도미메틱을 가질 수 있다. BoNT/E 기질은 예를 들어, 6개의 연속하는 잔기가 Arg180-Ile181을 포함하는 적어도 6개의 연속하는 사람 SNAP-25 잔기 또는 이의 펩티도미메틱을 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, BoNT/E 기질은 아미노산 서열 Gln-Ile-Asp-Arg-Ile-Met-Glu-Lys (SEQ ID NO : 45), 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다. 다른 실시형태에서, BoNT/E 기질은 사람 SNAP-25의 잔기 156 내지 186 (SEQ ID NO : 4) 또는 이의 펩티도미메틱을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용시, "보툴리눔 독소 세로타입 E 인식 서열"이란 용어는 "BoNT/E 인식 서열"과 동의어이며, 적절한 조건하에서 BoNT/E에 의해 분리 가능한 결합에서 단백가수분해를 검출하기에 충분한, 인접 또는 비-인접 인식 요소와 함께 분리 가능한 결합을 의미한다. BoNT/E에 의해 절단되는, 분리가능 결합은 예를 들어, Arg-Ile이다.
BoNT/E 인식 서열은, 보툴리눔 독소 세포타입 E에 의해 절단되기 쉬운 단백질의 단편에 상응하거나, 또는 BoNT/E-민감성 단백질의 단편과 실질적으로 유사할 수 있다는 것이 당업자에게는 명백하다. BoNT/E에 의해 절단되기 쉬운 다양한 천연 단백질이 공지되어 있으며, 예를 들어, 사람, 마우스 및 래트 SNAP-25; 마우스 SNAP-23; 닭 SNAP-25; 금붕어 SNAP-25A 및 SNAP-25B; 제브라피쉬 SNAP-25; 예쁜꼬마선충 SNAP-25 및 거머리 SNAP-25를 포함한다(표 E 참조). 따라서, BoNT/E 인식 서열은 예를 들어, 사람 SNAP-25, 마우스 SNAP-25, 래트 SNAP-25; 마우스 SNAP-23; 닭 SNAP-25; 금붕어 SNAP-25A 또는 SNAP-25B; 예쁜꼬마선충 SNAP-25, 거머리 SNAP-25 또는 BoNT/E에 의해 절단되기 쉬운 또다른 천연 단백질의 단편에 상응할 수 있다. 또한, 표 E 및 도 5에 나타낸 바와 같이, BoNT/E에 의해 절단되는 본래의 SNAP-23 및 SNAP-25 아미노산 서열과 비교할때, 이러한 서열은 완전하게 보존되지는 않으며, 천연 BoNT/E-민감성 SNAP-23 또는 SNAP-25 서열에 대한 다양한 아미노산 치환 및 변형이, 예를 들어, 본 발명에 유용한 BoNT/E 기질에서 허용될 수 있다.
다양한 BoNT/F 기질이 본 발명에 유용하다. 이러한 BoNT/F 기질은 예를 들어, 6개의 연속된 잔기가 Gln-Lys을 포함하는 적어도 6개의 연속하는 VAMP 잔기 또는 이의 펩티도미메틱을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, BoNT/F 기질은 예를 들어, 6개의 연속하는 잔기가 Gln58-Lys59을 포함하는 적어도 6개의 연속하는 사람 VAMP 잔기 또는 이의 펩티도미메틱을 가질 수 있다. 또다른 실시형태에서, BoNT/F 기질은 래트 VAMP-2의 잔기 27 내지 116(SEQ ID NO : 109) 또는 이의 펩티도미메틱을 포함한다. 다른 실시형태에서, BoNT/F 기질은 아미노산 서열 Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu (SEQ ID NO : 46) 또는 이의 펩티도미메틱을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용시, "보툴리눔 독소 세로타입 F 인식 서열"이란 용어는 "BoNT/F 인식 서열"과 동의어이며, 적절한 조건하에서 BoNT/F에 의해 분리 가능한 결합에서 단백가수분해를 검출하기에 충분한, 인접 또는 비-인접 인식 요소와 함께 분리 가능한 결합을 의미한다. BoNT/F에 의해 절단되는, 분리가능 결합은 예를 들어, Gln-Lys이다.
다양한 BoNT/F 인식 서열이 공지되어 있으며, 통상의 방법으로 정의될 수 있다. 이러한 BoNT/F 인식 서열은, 예를 들어, 쥐 VAMP-2의 잔기 27 내지 116; 잔기 37 내지 116; 잔기 1 내지 86; 잔기 1 내지 76; 또는 잔기 1 내지 69를 포함할 수 있다(SEQ ID NO : 109 ; Yamasaki et al., supra, 1994). BoNT/F 인식 서열은 또한 예를 들어, 쥐 VAMP-2의 잔기 27 내지 69 또는 잔기 37 내지 69를 포함할 수 있다(SEQ ID NO : 109). 유사한 BoNT/F 인식 서열은 필요시, 또다른 BoNT/F-민감성 VAMP 이소폼의 상응하는 (상동체) 단편 또는 사람 VAMP-1 또는 사람 VAMP-2와 같은 상동체로부터 제조할 수 있는 것으로 이해된다.
BoNT/F 인식 서열은, 보툴리눔 독소 세포타입 F에 의해 절단되기 쉬운 단백질의 단편에 상응하거나, 또는 BoNT/F-민감성 단백질의 단편과 실질적으로 유사할 수 있다. BoNT/F에 의해 절단되기 쉬운 다양한 천연 단백질이 공지되어 있으며, 예를 들어, 사람, 마우스 및 소 VAMP-1 및 VAMP-2; 래트 VAMP-1 및 VAMP-2; 래트 셀루브레빈; 닭 VAMP-1 및 VAMP-2; 토르페도 VAMP-1; 군소 VAMP; 초파리 syb; 및 거머리 VAMP를 포함한다(표 H 참조). 따라서, BoNT/F 인식 서열은 예를 들어, 사람 VAMP-1 또는 VAMP-2, 마우스 VAMP-1 또는 VAMP-2, 소 VAMP-1 또는 VAMP-2, 래트 VAMP-1 또는 VAMP-2, 래트 셀루브레빈, 닭 VAMP-1 또는 VAMP-2, 토르페도 VAMP-1, 군소 VAMP, 초파리 syb, 거머리 VAMP 또는 BoNT/F에 의해 절단되기 쉬운 또다른 천연 단백질의 단편에 상응할 수 있다. 또한, 상기 표 H에 나타낸 바와 같이, BoNT/F에 의해 절단되는 본래의 VAMP 아미노산 서열과 비교할때, 이러한 서열은 완전하게 보존되지는 않으며(도 6 참조), 천연 BoNT/F-민감성 VAMP 서열에 대한 다양한 아미노산 치환 및 변형이, 예를 들어, 본 발명에 유용한 BoNT/F 기질에서 허용될 수 있다.
다른 클로스트리디움계 독소 기질로서, 다양한 BoNT/G 기질이 본 발명에 유용하다. BoNT/G 기질은 예를 들어, 6개의 연속된 잔기가 Ala-Ala을 포함하는 적어도 6개의 연속하는 VAMP 잔기 또는 이의 펩티도미메틱을 가질 수 있다. 이러한 BoNT/G 기질은 예를 들어, 6개의 연속하는 잔기가 Ala83-Ala84을 포함하는 적어도 6개의 연속하는 사람 VAMP 잔기 또는 이의 펩티도미메틱을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, BoNT/G 기질은 아미노산 서열 Glu-Thr-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys (SEQ ID NO : 47) 또는 이의 펩티도미메틱을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용시, "보툴리눔 독소 세로타입 G 인식 서열"이란 용어는 "BoNT/G 인식 서열"과 동의어이며, 적절한 조건하에서 BoNT/G에 의해 분리 가능한 결합에서 단백가수분해를 검출하기에 충분한, 인접 또는 비-인접 인식 요소와 함께 분리 가능한 결합을 의미한다. BoNT/G에 의해 절단되는, 분리가능 결합은 예를 들어, Ala-Ala이다.
BoNT/G 인식 서열은, 보툴리눔 독소 세포타입 G에 의해 절단되기 쉬운 단백질의 단편에 상응하거나, 또는 이러한 BoNT/G-민감성 단편과 실질적으로 유사할 수 있다. 표 H에 나타낸 바와 같이, BoNT/G에 의해 절단되기 쉬운 다양한 천연 단백질이 공지되어 있으며, 예를 들어, 사람, 마우스 및 소 VAMP-1 및 VAMP-2; 래트 VAMP-1 및 VAMP-2; 래트 셀루브레빈; 닭 VAMP-1 및 VAMP-2; 및 토르페도 VAMP-1를 포함한다. 따라서, BoNT/G 인식 서열은 예를 들어, 사람 VAMP-1 또는 VAMP-2, 마우스 VAMP-1 또는 VAMP-2, 소 VAMP-1 또는 VAMP-2, 래트 VAMP-1 또는 VAMP-2, 래트 셀루브레빈, 닭 VAMP-1 또는 VAMP-2, 토르페도 VAMP-1 또는 BoNT/G에 의해 절단되기 쉬운 또다른 천연 단백질의 단편에 상응할 수 있다. 또한, 상기 표 H에 나타낸 바와 같이, BoNT/G에 의해 절단되는 본래의 VAMP 아미노산 서열과 비교할때, 이러한 서열은 완전하게 보존되지는 않으며(도 6 참조), 천연 BoNT/G-민감성 VAMP 서열에 대한 다양한 아미노산 치환 및 변형이 본 발명에 유용한 BoNT/G 기질에서 허용될 수 있다.
다양한 TeNT 기질이 본 명세서에 기재한 조성물 및 방법에 유용할 수 있다. 본 발명에 유용한 TeNT 기질은 예를 들어, 6개의 연속된 잔기가 Gln-Phe을 포함하는 적어도 6개의 연속하는 VAMP 잔기 또는 이의 펩티도미메틱을 가질 수 있다. 이러한 TeNT 기질은 예를 들어, 6개의 연속하는 잔기가 Gln76-Phe77을 포함하는 적어도 6개의 연속하는 사람 VAMP-2 잔기 또는 이의 펩티도미메틱을 가질 수 있다. 일 실시형태에서, TeNT 기질은 아미노산 서열 Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Gln-Thr-Ser (SEQ ID NO : 48) 또는 이의 펩티도미메틱을 포함할 수 있다. 또다른 실시형태에서, TeNT 기질은 사람 VAMP-2의 잔기 33 내지 94(SEQ ID NO : 11); 사람 VAMP-2의 잔기 25 내지 93(SEQ ID NO : 11); 또는 래트 VAMP-2의 잔기 27 내지 116(SEQ ID NO : 109) 또는 이의 펩티도미메틱을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용시, "파상풍 독소 인식 서열"이란 용어는, 적절한 조건하에서 파상풍 독소에 의해 분리 가능한 결합에서 단백가수분해를 검출하기에 충분한, 인접 또는 비-인접 인식 요소와 함께 분리 가능한 결합을 의미한다. TeNT에 의해 절단되는, 분리가능 결합은 예를 들어, Gln-Phe이다.
다양한 TeNT 인식 서열이 공지되어 있으며, 통상의 방법으로 정의될 수 있고, 사람 VAMP-1 또는 사람 VAMP-2와 같은 VAMP 단백질의 친수성 코어 전체 또는 일부에 상응하는 서열을 포함할 수 있다. TeNT 인식 서열은 사람 VAMP-2(SEQ ID NO : 11; Cornille et al. , Eur. J. Biochem. 222: 173-181 (1994); Foran et al. , Biochem. 33: 15365-15374 (1994))의 잔기 25 내지 93 또는 잔기 33 내지 94; 래트 VAMP-2(SEQ ID NO : 109; Yamasaki et al. , supra, 1994)의 잔기 51 내지 93 또는 잔기 1 내지 86; 또는 사람 VAMP-1(SEQ ID NO : 10)의 잔기 33 내지 94를 포함할 수 있다. TeNT 인식 서열은 또한 예를 들어, 사람 VAMP-2(SEQ ID NO : 11) 또는 래트 VAMP-2(SEQ ID NO : 109)의 잔기 25 내지 86, 잔기 33 내지 86 또는 잔기 51 내지 86을 포함할 수 있다. 유사한 TeNT 인식 서열은 필요시, 또다른 TeNT-민감성 VAMP 이소폼의 상응하는 (상동체) 단편 또는 사람 VAMP-1 또는 성게 또는 군소 VAMP와 같은 종 상동체로부터 제조할 수 있다고 이해된다.
따라서, TeNT 인식 서열은, 파상풍 독소에 의해 절단되기 쉬운 단백질의 단편에 상응하거나, 또는 이러한 TeNT-민감성 단편과 실질적으로 유사할 수 있다. 표 H에 나타낸 바와 같이, TeNT에 의해 절단되기 쉬운 다양한 천연 단백질이 공지되어 있으며, 예를 들어, 사람, 마우스 및 소 VAMP-1 및 VAMP-2; 래트 VAMP-2; 래트 셀루브레빈; 닭 VAMP-2; 토르페도 VAMP-1; 성게 VAMP; 군소 VAMP; 오징어 VAMP; 예쁜꼬마선충 VAMP; 초파리 n-syb; 및 거머리 VAMP를 포함한다. 따라서, TeNT 인식 서열은 예를 들어, 사람 VAMP-1 또는 VAMP-2, 마우스 VAMP-1 또는 VAMP-2, 소 VAMP-1 또는 VAMP-2, 래트 VAMP-2, 래트 셀루브레빈, 닭 VAMP-2, 토르페도 VAMP-1, 성게 VAMP, 군소 VAMP, 오징어 VAMP, 예쁜꼬마선충 VAMP, 초파리 n-syb, 거머리 VAMP 또는 TeNT에 의해 절단되기 쉬운 또다른 천연 단백질의 단편에 상응할 수 있다. 또한, TeNT에 의해 절단되는 본래의 VAMP 아미노산 서열과 비교할때, 이러한 서열은 완전하게 보존되지는 않으며(표 H 및 도 6 참조), 천연 TeNT-민감성 VAMP 서열에 대한 다양한 아미노산 치환 및 변형이 본 발명에 유용한 TeNT 기질에서 허용될 수 있다.
본 발명의 기질 조성물, 세포 또는 방법에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질은 동일한 또는 상이한 클로스트리디움계 독소에 대한, 하나 또는 다중 클로스트리디움계 독소 절단 부위를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 클로스트리디움계 독소 기질이 단일 클로스트리디움계 독소 절단 부위를 포함하는 기질 조성물, 세포 또는 방법을 제공한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 클로스트리디움계 독소 기질이 동일한 클로스트리디움계 독소에 대한 다중 절단 부위를 포함하는 기질 조성물, 세포 또는 방법을 제공한다. 이러한 절단 부위는 동일하거나 상이한 클로스트리디움계 독소 인식 서열에 수반된다. 예를 들어, 본 발명의 기질 조성물은 동일한 도너 플루오로포어 및 억셉터 사이에 있는, 동일한 클로스트리디움계 독소에 대한, 다중 절단 부위를 가지는 클로스트리디움계 독소 기질을 포함할 수 있다. 본 발명의 기질 조성물, 세포 또는 방법에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질은 동일한 클로스트리디움계 독소에 대하여 예를 들어, 2 이상, 3 이상, 5 이상 또는 10 이상의 절단 부위를 포함할 수 있다. 본 발명에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질은 또한 동일한 클로스트리디움계 독소에 대하여 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10개의 절단 부위를 가질 수 있다; 다중 절단 부위는 동일하거나 상이한 도너 플루오로포어-억셉터 쌍 사이에 있을 수 있다.
본 발명의 기질 조성물, 세포 또는 방법에 유용한 클로스트리디움계 독소 기질은 또한 상이한 클로스트리디움계 독소에 대한 절단 부위 및 인식 서열을 포함할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 본 발명은, 클로스트리디움계 독소 기질이, 상이한 클로스트리디움계 독소에 대한 다중 절단부위를 모두 동일한 도너 플루오로포어-억셉터 쌍 사이에 있도록 포함하는 기질 조성물, 세포 또는 방법을 제공한다. 본 발명의 기질 조성물, 세포 또는 방법은, 예를 들어, 2이상, 3이상 또는 5이상의 상이한 클로스트리디움계 독소에 대한 절단부위를 모두 동일한 도너 플루오로포어-억셉터 쌍 사이에 있도록 포함하는 가지는 클로스트리디움계 독소 기질을 포함할 수 있다. 본 발명의 기질 조성물, 세포 또는 방법은 또한, 예를 들어, 2이상, 3이상 또는 5이상의 상이한 클로스트리디움계 독소에 대한 절단부위가 적어도 2개의 도너 플루오로포어-억셉터 쌍 사이에 있는, 클로스트리디움계 독소 기질을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명은, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 상이한 클로스트리디움계 독소에 대한 절단부위를 가지는 클로스트리디움계 독소 기질을 포함하며, 절단 부위가 동일하거나 상이한 도너 플루오로포어-억셉터 쌍 사이에 있는, 기질 조성물, 세포 또는 방법을 제공한다. 또다른 실시형태에서, 본 발명은, 클로스트리디움계 독소 기질이, 예를 들어, 하기 클로스트리디움계 독소의 임의의 조합에 대한 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 절단부위의 임의의 조합을 가지는 기질 조성물, 세포 또는 방법을 제공한다: BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G 및 TeNT.
괄호로 덧붙여 제공되거나, 그렇지 않은, 상기에 제공된, 모든 저널 기사, 참조문헌 및 특허 인용참증이, 앞서 기재되거나 그렇지 않던 간에, 본 명세서에 완전히 참조로 병합되어 있다.
본 발명을 상기에 제공된 실시예를 참조하여 설명하였으나, 본 발명의 정신을 벗어나지 않으면서 다양한 변형이 있을 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 하기 청구의 범위에 의해서만 제한된다.
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
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Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
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<212> PRT
<213> human herpesvirus 1
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<213> Homo sapiens
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<213> Strongylocentrotus purpuratus
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245
<210> 10
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Met Ser Ala Pro Ala Gln Pro Pro Ala Glu Gly Thr Glu Gly Thr Ala
1 5 10 15
Pro Gly Gly Gly Pro Pro Gly Pro Pro Pro Asn Met Thr Ser Asn Arg
20 25 30
Arg Leu Gln Gln Thr Gln Ala Gln Val Glu Glu Val Val Asp Ile Ile
35 40 45
Arg Val Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu
50 55 60
Leu Asp Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu
65 70 75 80
Ser Ser Ala Ala Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Cys Lys
85 90 95
Met Met Ile Met Leu Gly Ala Ile Cys Ala Ile Ile Val Val Val Ile
100 105 110
Val Ile Tyr Phe Phe Thr
115
<210> 11
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Met Ser Ala Thr Ala Ala Thr Ala Pro Pro Ala Ala Pro Ala Gly Glu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Pro Ala Pro Pro Pro Asn Leu Thr Ser Asn Arg Arg Leu
20 25 30
Gln Gln Thr Gln Ala Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met Arg Val
35 40 45
Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp
50 55 60
Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser
65 70 75 80
Ala Ala Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Leu Lys Met Met
85 90 95
Ile Ile Leu Gly Val Ile Cys Ala Ile Ile Leu Ile Ile Ile Ile Val
100 105 110
Tyr Phe Ser Ser
115
<210> 12
<211> 116
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 12
Met Ser Ala Thr Ala Ala Thr Val Pro Pro Ala Ala Pro Ala Gly Glu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Pro Ala Pro Pro Pro Asn Leu Thr Ser Asn Arg Arg Leu
20 25 30
Gln Gln Thr Gln Ala Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met Arg Val
35 40 45
Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp
50 55 60
Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser
65 70 75 80
Ala Ala Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Leu Lys Met Met
85 90 95
Ile Ile Leu Gly Val Ile Cys Ala Ile Ile Leu Ile Ile Ile Ile Val
100 105 110
Tyr Phe Ser Thr
115
<210> 13
<211> 116
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 13
Met Ser Ala Thr Ala Ala Thr Ala Pro Pro Ala Ala Pro Ala Gly Glu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Pro Ala Pro Pro Pro Asn Leu Thr Ser Asn Arg Arg Leu
20 25 30
Gln Gln Thr Gln Ala Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met Arg Val
35 40 45
Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp
50 55 60
Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser
65 70 75 80
Ala Ala Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Leu Lys Met Met
85 90 95
Ile Ile Leu Gly Val Ile Cys Ala Ile Ile Leu Ile Ile Ile Ile Val
100 105 110
Tyr Phe Ser Ser
115
<210> 14
<211> 114
<212> PRT
<213> Xenopus laevis
<400> 14
Met Ser Ala Pro Ala Ala Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro Gly Asp Gly
1 5 10 15
Ala Pro Gln Gly Pro Pro Asn Leu Thr Ser Asn Arg Arg Leu Gln Gln
20 25 30
Thr Gln Ala Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met Arg Val Asn Val
35 40 45
Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Thr Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg
50 55 60
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser Ala Ala
65 70 75 80
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Met Lys Met Met Ile Ile
85 90 95
Met Gly Val Ile Cys Ala Ile Ile Leu Ile Ile Ile Ile Val Tyr Phe
100 105 110
Ser Thr
<210> 15
<211> 104
<212> PRT
<213> Strongylocentrotus purpuratus
<400> 15
Met Ala Ala Pro Pro Pro Pro Gln Pro Ala Pro Ser Asn Lys Arg Leu
1 5 10 15
Gln Gln Thr Gln Ala Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met Arg Val
20 25 30
Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Ala Leu Ser Val Leu Asp
35 40 45
Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Gln Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Asn
50 55 60
Ala Gly Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Cys Lys Met Met
65 70 75 80
Ile Ile Leu Ala Ile Ile Ile Ile Val Ile Leu Ile Ile Ile Ile Val
85 90 95
Ala Ile Val Gln Ser Gln Lys Lys
100
<210> 16
<211> 288
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Met Lys Asp Arg Thr Gln Glu Leu Arg Thr Ala Lys Asp Ser Asp Asp
1 5 10 15
Asp Asp Asp Val Ala Val Thr Val Asp Arg Asp Arg Phe Met Asp Glu
20 25 30
Phe Phe Glu Gln Val Glu Glu Ile Arg Gly Phe Ile Asp Lys Ile Ala
35 40 45
Glu Asn Val Glu Glu Val Lys Arg Lys His Ser Ala Ile Leu Ala Ser
50 55 60
Pro Asn Pro Asp Glu Lys Thr Lys Glu Glu Leu Glu Glu Leu Met Ser
65 70 75 80
Asp Ile Lys Lys Thr Ala Asn Lys Val Arg Ser Lys Leu Lys Ser Ile
85 90 95
Glu Gln Ser Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser Ser Ala Asp
100 105 110
Leu Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg Lys Phe Val
115 120 125
Glu Val Met Ser Glu Tyr Asn Ala Thr Gln Ser Asp Tyr Arg Glu Arg
130 135 140
Cys Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly Arg Thr Thr
145 150 155 160
Thr Ser Glu Glu Leu Glu Asp Met Leu Glu Ser Gly Asn Pro Ala Ile
165 170 175
Phe Ala Ser Gly Ile Ile Met Asp Ser Ser Ile Ser Lys Gln Ala Leu
180 185 190
Ser Glu Ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu Asn Ser
195 200 205
Ile Arg Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val Glu
210 215 220
Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ala
225 230 235 240
Val Asp Tyr Val Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys
245 250 255
Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ile Met Ile Ile Ile Cys Cys
260 265 270
Val Ile Leu Gly Ile Val Ile Ala Ser Thr Val Gly Gly Ile Phe Ala
275 280 285
<210> 17
<211> 288
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Met Lys Asp Arg Thr Gln Glu Leu Arg Ser Ala Lys Asp Ser Asp Asp
1 5 10 15
Glu Glu Glu Val Val His Val Asp Arg Asp His Phe Met Asp Glu Phe
20 25 30
Phe Glu Gln Val Glu Glu Ile Arg Gly Cys Ile Glu Lys Leu Ser Glu
35 40 45
Asp Val Glu Gln Val Lys Lys Gln His Ser Ala Ile Leu Ala Ala Pro
50 55 60
Asn Pro Asp Glu Lys Thr Lys Gln Glu Leu Glu Asp Leu Thr Ala Asp
65 70 75 80
Ile Lys Lys Thr Ala Asn Lys Val Arg Ser Lys Leu Lys Ala Ile Glu
85 90 95
Gln Ser Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser Ser Ala Asp Leu
100 105 110
Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg Lys Phe Val Glu
115 120 125
Val Met Thr Glu Tyr Asn Ala Thr Gln Ser Lys Tyr Arg Asp Arg Cys
130 135 140
Lys Asp Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly Arg Thr Thr Thr
145 150 155 160
Asn Glu Glu Leu Glu Asp Met Leu Glu Ser Gly Lys Leu Ala Ile Phe
165 170 175
Thr Asp Asp Ile Lys Met Asp Ser Gln Met Thr Lys Gln Ala Leu Asn
180 185 190
Glu Ile Glu Thr Arg His Asn Glu Ile Ile Lys Leu Glu Thr Ser Ile
195 200 205
Arg Glu Leu His Asp Met Phe Val Asp Met Ala Met Leu Val Glu Ser
210 215 220
Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ser Val
225 230 235 240
Asp Tyr Val Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys Tyr
245 250 255
Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ile Met Ile Ile Ile Cys Cys Val
260 265 270
Val Leu Gly Val Val Leu Ala Ser Ser Ile Gly Gly Thr Leu Gly Leu
275 280 285
<210> 18
<211> 288
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 18
Met Lys Asp Arg Thr Gln Glu Leu Arg Thr Ala Lys Asp Ser Asp Asp
1 5 10 15
Asp Asp Asp Val Thr Val Thr Val Asp Arg Asp Arg Phe Met Asp Glu
20 25 30
Phe Phe Glu Gln Val Glu Glu Ile Arg Gly Phe Ile Asp Lys Ile Ala
35 40 45
Glu Asn Val Glu Glu Val Lys Arg Lys His Ser Ala Ile Leu Ala Ser
50 55 60
Pro Asn Pro Asp Glu Lys Thr Lys Glu Glu Leu Glu Glu Leu Met Ser
65 70 75 80
Asp Ile Lys Lys Thr Ala Asn Lys Val Arg Ser Lys Leu Lys Ser Ile
85 90 95
Glu Gln Ser Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser Ser Ala Asp
100 105 110
Leu Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg Lys Phe Val
115 120 125
Glu Val Met Ser Glu Tyr Asn Ala Thr Gln Ser Asp Tyr Arg Glu Arg
130 135 140
Cys Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly Arg Thr Thr
145 150 155 160
Thr Ser Glu Glu Leu Glu Asp Met Leu Glu Ser Gly Asn Pro Ala Ile
165 170 175
Phe Ala Ser Gly Ile Ile Met Asp Ser Ser Ile Ser Lys Gln Ala Leu
180 185 190
Ser Glu Ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu Thr Ser
195 200 205
Ile Arg Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val Glu
210 215 220
Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ala
225 230 235 240
Val Asp Tyr Val Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys
245 250 255
Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ile Met Ile Ile Ile Cys Cys
260 265 270
Val Ile Leu Gly Ile Ile Ile Ala Ser Thr Ile Gly Gly Ile Phe Gly
275 280 285
<210> 19
<211> 291
<212> PRT
<213> Drosophila melanogaster
<400> 19
Met Thr Lys Asp Arg Leu Ala Ala Leu His Ala Ala Gln Ser Asp Asp
1 5 10 15
Glu Glu Glu Thr Glu Val Ala Val Asn Val Asp Gly His Asp Ser Tyr
20 25 30
Met Asp Asp Phe Phe Ala Gln Val Glu Glu Ile Arg Gly Met Ile Asp
35 40 45
Lys Val Gln Asp Asn Val Glu Glu Val Lys Lys Lys His Ser Ala Ile
50 55 60
Leu Ser Ala Pro Gln Thr Asp Glu Lys Thr Lys Gln Glu Leu Glu Asp
65 70 75 80
Leu Met Ala Asp Ile Lys Lys Asn Ala Asn Arg Val Arg Gly Lys Leu
85 90 95
Lys Gly Ile Glu Gln Asn Ile Glu Gln Glu Glu Gln Gln Asn Lys Ser
100 105 110
Ser Ala Asp Leu Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg
115 120 125
Lys Phe Val Glu Val Met Thr Glu Tyr Asn Arg Thr Gln Thr Asp Tyr
130 135 140
Arg Glu Arg Cys Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly
145 150 155 160
Arg Pro Thr Asn Asp Asp Glu Leu Glu Lys Met Leu Glu Glu Gly Asn
165 170 175
Ser Ser Val Phe Thr Gln Gly Ile Ile Met Glu Thr Gln Gln Ala Lys
180 185 190
Gln Thr Leu Ala Asp Ile Glu Ala Arg His Gln Asp Ile Met Lys Leu
195 200 205
Glu Thr Ser Ile Lys Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met
210 215 220
Leu Val Glu Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr His Val
225 230 235 240
Glu His Ala Met Asp Tyr Val Gln Thr Ala Thr Gln Asp Thr Lys Lys
245 250 255
Ala Leu Lys Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ile Met Ile Leu
260 265 270
Ile Cys Leu Thr Val Leu Gly Ile Leu Ala Ala Ser Tyr Val Ser Ser
275 280 285
Tyr Phe Met
290
<210> 20
<211> 291
<212> PRT
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 20
Met Thr Lys Asp Arg Leu Ser Ala Leu Lys Ala Ala Gln Ser Glu Asp
1 5 10 15
Glu Gln Asp Asp Asp Met His Met Asp Thr Gly Asn Ala Gln Tyr Met
20 25 30
Glu Glu Phe Phe Glu Gln Val Glu Glu Ile Arg Gly Ser Val Asp Ile
35 40 45
Ile Ala Asn Asn Val Glu Glu Val Lys Lys Lys His Ser Ala Ile Leu
50 55 60
Ser Asn Pro Val Asn Asp Gln Lys Thr Lys Glu Glu Leu Asp Glu Leu
65 70 75 80
Met Ala Val Ile Lys Arg Ala Ala Asn Lys Val Arg Gly Lys Leu Lys
85 90 95
Leu Ile Glu Asn Ala Ile Asp His Asp Glu Gln Gly Ala Gly Asn Ala
100 105 110
Asp Leu Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg Arg Phe
115 120 125
Val Glu Val Met Thr Asp Tyr Asn Lys Thr Gln Thr Asp Tyr Arg Glu
130 135 140
Arg Cys Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Asp Ile Ala Gly Lys Gln
145 150 155 160
Val Gly Asp Glu Asp Leu Glu Glu Met Ile Glu Ser Gly Asn Pro Gly
165 170 175
Val Phe Thr Gln Gly Ile Ile Thr Asp Thr Gln Gln Ala Lys Gln Thr
180 185 190
Leu Ala Asp Ile Glu Ala Arg His Asn Asp Ile Met Lys Leu Glu Ser
195 200 205
Ser Ile Arg Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val
210 215 220
Glu Ser Gln Gly Glu Met Val Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His
225 230 235 240
Ala Lys Glu Phe Val Asp Arg Ala Val Ala Asp Thr Lys Lys Ala Val
245 250 255
Gln Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ile Cys Ile Leu Val Thr
260 265 270
Gly Val Ile Leu Ile Thr Gly Leu Ile Ile Phe Ile Leu Phe Tyr Ala
275 280 285
Lys Val Leu
290
<210> 21
<211> 288
<212> PRT
<213> Strongylocentrotus purpuratus
<400> 21
Met Arg Asp Arg Leu Gly Ser Leu Lys Arg Asn Glu Glu Asp Asp Val
1 5 10 15
Gly Pro Glu Val Ala Val Asn Val Glu Ser Glu Lys Phe Met Glu Glu
20 25 30
Phe Phe Glu Gln Val Glu Glu Val Arg Asn Asn Ile Asp Lys Ile Ser
35 40 45
Lys Asn Val Asp Glu Val Lys Lys Lys His Ser Asp Ile Leu Ser Ala
50 55 60
Pro Gln Ala Asp Glu Lys Val Lys Asp Glu Leu Glu Glu Leu Met Ser
65 70 75 80
Asp Ile Lys Lys Thr Ala Asn Lys Val Arg Ala Lys Leu Lys Met Met
85 90 95
Glu Gln Ser Ile Glu Gln Glu Glu Ser Ala Lys Met Asn Ser Ala Asp
100 105 110
Val Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg Lys Phe Val
115 120 125
Glu Val Met Thr Asp Tyr Asn Ser Thr Gln Thr Asp Tyr Arg Glu Arg
130 135 140
Cys Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly Lys Ser Thr
145 150 155 160
Thr Asp Ala Glu Leu Glu Asp Met Leu Glu Ser Gly Asn Pro Ala Ile
165 170 175
Phe Thr Ser Gly Ile Ile Met Asp Thr Gln Gln Ala Lys Gln Thr Leu
180 185 190
Arg Asp Ile Glu Ala Arg His Asn Asp Ile Ile Lys Leu Glu Ser Ser
195 200 205
Ile Arg Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val Glu
210 215 220
Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu Gln Ser
225 230 235 240
Val Asp Tyr Val Glu Thr Ala Lys Met Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys
245 250 255
Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Phe Tyr Ile Ala Ile Cys Cys
260 265 270
Gly Val Ala Leu Gly Ile Leu Val Leu Val Leu Ile Ile Val Leu Ala
275 280 285
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 22
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
1 5 10 15
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 23
Thr Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Asp Pro
1 5 10
<210> 24
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 24
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu
1 5 10 15
Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
20 25
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 25
Lys Lys Trp Lys Met Arg Arg Asn Gln Phe Trp Ile Lys Ile Gln Arg
1 5 10 15
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 26
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 27
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 27
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 28
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 28
Arg Gln Pro Lys Ile Trp Phe Pro Asn Arg Arg Met Pro Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 29
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 29
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Met Arg Arg Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 30
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 30
Arg Gln Ile Arg Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Arg Trp Arg Arg
1 5 10 15
<210> 31
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 31
Arg Arg Trp Arg Arg Trp Trp Arg Arg Trp Trp Arg Arg Trp Arg Arg
1 5 10 15
<210> 32
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<221> REPEAT
<222> 4
<223> Extent of lysine repetition unknown.
<400> 32
Ser Cys Trp Lys
1
<210> 33
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<221> REPEAT
<222> (1)...(4)
<223> extent of repetition unknown.
<400> 33
Leu Ala Arg Leu
1
<210> 34
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 34
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
Gly Gly Cys Arg Gly Asp Met Phe Gly Cys Ala Lys Lys Lys Lys Lys
20 25 30
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Gly Asp
35 40 45
<210> 35
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 35
Cys Trp Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
Lys Lys Lys Lys
20
<210> 36
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 36
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
Lys Lys Trp Cys Cys Trp Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
20 25 30
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
35 40
<210> 37
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 37
Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly Ile Glu Leu Thr Tyr
1 5 10
<210> 38
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 38
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
Lys Lys Gly Gly Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly Ile Glu Leu Gly Ala
20 25 30
<210> 39
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 39
Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
1 5 10 15
Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val
20 25
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 40
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 41
Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys
1 5
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 42
Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser
1 5
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 43
Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys Trp
1 5
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 44
Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu
1 5
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 45
Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys
1 5
<210> 46
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 46
Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu
1 5
<210> 47
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 47
Glu Thr Ser Ala Ala Lys Leu Lys
1 5
<210> 48
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 48
Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser
1 5
<210> 49
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met
1 5 10
<210> 50
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys
1 5 10 15
<210> 51
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met
1 5 10 15
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met
1 5 10 15
Leu
<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
Asp Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys
1 5 10 15
Met
<210> 54
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
Asp Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys
1 5 10 15
Met Leu
<210> 55
<211> 33
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 55
Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp Ser Asn Lys
1 5 10 15
Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser
20 25 30
Gly
<210> 56
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
Gln Asn Pro Gln Ile Lys Arg Ile Thr Asp Lys Ala Asp Thr Asn Arg
1 5 10 15
Asp Arg Ile Asp Ile Ala Asn Ala Arg Ala Lys Lys Leu Ile Asp Ser
20 25 30
<210> 57
<211> 32
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 57
Gln Asn Gln Gln Ile Gln Lys Ile Thr Glu Lys Ala Asp Thr Asn Lys
1 5 10 15
Asn Arg Ile Asp Ile Ala Asn Thr Arg Ala Lys Lys Leu Ile Asp Ser
20 25 30
<210> 58
<211> 34
<212> PRT
<213> Gallus gallus
<400> 58
Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Leu Ile Pro Ile Lys
1 5 10 15
Pro Gly Leu Met Lys Pro Thr Ser Val Gln Gln Arg Cys Ser Ala Val
20 25 30
Val Lys
<210> 59
<211> 33
<212> PRT
<213> Carassius auratus
<400> 59
Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Met Asp Met Ala Asp Ser Asn Lys
1 5 10 15
Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser
20 25 30
Gly
<210> 60
<211> 33
<212> PRT
<213> Carassius auratus
<400> 60
Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp Ser Asn Lys
1 5 10 15
Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser
20 25 30
Gly
<210> 61
<211> 30
<212> PRT
<213> Torpedo sp.
<400> 61
Gln Asn Ala Gln Val Asp Arg Ile Val Val Lys Gly Asp Met Asn Lys
1 5 10 15
Ala Arg Ile Asp Glu Ala Asn Lys His Ala Thr Lys Met Leu
20 25 30
<210> 62
<211> 33
<212> PRT
<213> Strongylocentrotus purpuratus
<400> 62
Gln Asn Ser Gln Val Gly Arg Ile Thr Ser Lys Ala Glu Ser Asn Glu
1 5 10 15
Gly Arg Ile Asn Ser Ala Asp Lys Arg Ala Lys Asn Ile Leu Arg Asn
20 25 30
Lys
<210> 63
<211> 31
<212> PRT
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 63
Gln Asn Arg Gln Leu Asp Arg Ile His Asp Lys Gln Ser Asn Glu Val
1 5 10 15
Arg Val Glu Ser Ala Asn Lys Arg Ala Lys Asn Leu Ile Thr Lys
20 25 30
<210> 64
<211> 31
<212> PRT
<213> Drosophila melanogaster
<400> 64
Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Asn Arg Lys Gly Glu Ser Asn Glu
1 5 10 15
Ala Arg Ile Ala Val Ala Asn Gln Arg Ala His Gln Leu Leu Lys
20 25 30
<210> 65
<211> 32
<212> PRT
<213> Hirudinida sp.
<400> 65
Gln Asn Arg Gln Val Asp Arg Ile Asn Asn Lys Met Thr Ser Asn Gln
1 5 10 15
Leu Arg Ile Ser Asp Ala Asn Lys Arg Ala Ser Lys Leu Leu Lys Glu
20 25 30
<210> 66
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 66
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys
1 5 10 15
<210> 67
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 67
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met
1 5 10 15
<210> 68
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 68
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met
1 5 10 15
Leu
<210> 69
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 69
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Ala
1 5 10 15
Leu
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<221> MOD_RES
<222> 16
<223> Xaa = Nle
<400> 70
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Xaa
1 5 10 15
Leu
<210> 71
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 71
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Ala Met
1 5 10 15
Leu
<210> 72
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 72
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Ser Lys Met
1 5 10 15
Leu
<210> 73
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<221> MOD_RES
<222> 14
<223> Xaa = Abu
<400> 73
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Xaa Lys Met
1 5 10 15
Leu
<210> 74
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<221> MOD_RES
<222> 13
<223> Xaa = Abu
<400> 74
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Xaa Thr Lys Met
1 5 10 15
Leu
<210> 75
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 75
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Ala Arg Ala Thr Lys Met
1 5 10 15
Leu
<210> 76
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<221> MOD_RES
<222> 11
<223> Xaa = Abu
<400> 76
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Xaa Arg Ala Thr Lys Met
1 5 10 15
Leu
<210> 77
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 77
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Asn Arg Ala Thr Lys Met
1 5 10 15
Leu
<210> 78
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 78
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Ala Gln Arg Ala Thr Lys Met
1 5 10 15
Leu
<210> 79
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<221> MOD_RES
<222> 9
<223> Xaa = Abu
<400> 79
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Xaa Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met
1 5 10 15
Leu
<210> 80
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 80
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Gln Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met
1 5 10 15
Leu
<210> 81
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic construct
<400> 81
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asn Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met
1 5 10 15
Leu
<210> 82
<211> 40
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 82
Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Ser Ser Ala Ala
20 25 30
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
35 40
<210> 83
<211> 40
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 83
Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser Ala Ala
20 25 30
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
35 40
<210> 84
<211> 40
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 84
Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Val Phe Glu Ser Ser Ala Ala
20 25 30
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
35 40
<210> 85
<211> 40
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 85
Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser Ala Ala
20 25 30
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
35 40
<210> 86
<211> 40
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 86
Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser Ala Ala
20 25 30
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
35 40
<210> 87
<211> 40
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 87
Asp Leu Val Ala Gln Arg Gly Glu Arg Leu Glu Leu Leu Ile Asp Lys
1 5 10 15
Thr Glu Asn Leu Val Asp Ser Ser Val Thr Phe Lys Thr Thr Ser Arg
20 25 30
Asn Leu Ala Arg Ala Met Cys Met
35 40
<210> 88
<211> 32
<212> PRT
<213> Gallus gallus
<400> 88
Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg Ala Asp Ala Leu
1 5 10 15
Gln Ala Gly Ala Ser Val Phe Glu Ser Ser Ala Ala Lys Leu Lys Arg
20 25 30
<210> 89
<211> 32
<212> PRT
<213> Gallus gallus
<400> 89
Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg Ala Asp Ala Leu
1 5 10 15
Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser Ala Ala Lys Leu Lys Arg
20 25 30
<210> 90
<211> 40
<212> PRT
<213> Torpedo sp.
<400> 90
Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Ser Ser Ala Ala
20 25 30
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
35 40
<210> 91
<211> 40
<212> PRT
<213> Strongylocentrotus purpuratus
<400> 91
Asp Lys Val Leu Asp Arg Asp Gln Ala Leu Ser Val Leu Asp Asp Arg
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Gln Gln Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Asn Ala Gly
20 25 30
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
35 40
<210> 92
<211> 40
<212> PRT
<213> Aplysia sp.
<400> 92
Glu Lys Val Leu Asp Arg Asp Gln Lys Ile Ser Gln Leu Asp Asp Arg
1 5 10 15
Ala Glu Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Ala Ser Ala Gly
20 25 30
Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp
35 40
<210> 93
<211> 40
<212> PRT
<213> Teuthoida
<400> 93
Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Ser Lys Ile Ser Glu Leu Asp Asp Arg
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Ala Ser Ala Gly
20 25 30
Lys Leu Lys Arg Lys Phe Trp Trp
35 40
<210> 94
<211> 40
<212> PRT
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 94
Asn Lys Val Met Glu Arg Asp Val Gln Leu Asn Ser Leu Asp His Arg
1 5 10 15
Ala Glu Val Leu Gln Asn Gly Ala Ser Gln Phe Gln Gln Ser Ser Arg
20 25 30
Glu Leu Lys Arg Gln Tyr Trp Trp
35 40
<210> 95
<211> 40
<212> PRT
<213> Drosophila melanogaster
<400> 95
Glu Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Gly Glu Arg
1 5 10 15
Ala Asp Gln Leu Glu Gln Gly Ala Ser Gln Ser Glu Gln Gln Ala Gly
20 25 30
Lys Leu Lys Arg Lys Gln Trp Trp
35 40
<210> 96
<211> 40
<212> PRT
<213> Drosophila melanogaster
<400> 96
Glu Lys Val Leu Glu Arg Asp Ser Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Gln Gln Gly Ala Ser Gln Phe Glu Gln Gln Ala Gly
20 25 30
Lys Leu Lys Arg Lys Phe Trp Leu
35 40
<210> 97
<211> 40
<212> PRT
<213> Hirudinida
<400> 97
Asp Lys Val Leu Glu Lys Asp Gln Lys Leu Ala Glu Leu Asp Gly Arg
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Ala Ser Ala Gly
20 25 30
Lys Leu Lys Arg Lys Phe Trp Trp
35 40
<210> 98
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 98
Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys Tyr Gln Ser Lys
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 99
<211> 18
<212> PRT
<213> Bos taurus
<400> 99
Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys Tyr Gln Ser Lys
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 100
<211> 18
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 100
Glu His Ala Lys Glu Glu Thr Lys Lys Ala Ile Lys Tyr Gln Ser Lys
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 101
<211> 18
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 101
Glu Lys Ala Arg Asp Glu Thr Arg Lys Ala Met Lys Tyr Gln Gly Gln
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 102
<211> 18
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 102
Glu Arg Gly Gln Glu His Val Lys Ile Ala Leu Glu Asn Gln Lys Lys
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 103
<211> 18
<212> PRT
<213> Gallus gallus
<400> 103
Val Pro Glu Val Phe Val Thr Lys Ser Ala Val Met Tyr Gln Cys Lys
1 5 10 15
Ser Arg
<210> 104
<211> 18
<212> PRT
<213> Strongylocentrotus purpuratus
<400> 104
Val Arg Arg Gln Asn Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys Tyr Gln Ser Lys
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 105
<211> 18
<212> PRT
<213> Aplysia sp.
<400> 105
Glu Thr Ala Lys Met Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys Tyr Gln Ser Lys
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 106
<211> 18
<212> PRT
<213> Teuthoida sp.
<400> 106
Glu Thr Ala Lys Val Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys Tyr Gln Ser Lys
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 107
<211> 18
<212> PRT
<213> Drosophila melanogaster
<400> 107
Gln Thr Ala Thr Gln Asp Thr Lys Lys Ala Leu Lys Tyr Gln Ser Lys
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 108
<211> 18
<212> PRT
<213> Hirudinida
<400> 108
Glu Thr Ala Ala Ala Asp Thr Lys Lys Ala Met Lys Tyr Gln Ser Ala
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 109
<211> 206
<212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 109
Met Ala Glu Asp Ala Asp Met Arg Asn Glu Leu Glu Glu Met Gln Arg
1 5 10 15
Arg Ala Asp Gln Leu Ala Asp Glu Ser Leu Glu Ser Thr Arg Arg Met
20 25 30
Leu Gln Leu Val Glu Glu Ser Lys Asp Ala Gly Ile Arg Thr Leu Val
35 40 45
Met Leu Asp Glu Gln Gly Glu Gln Leu Glu Arg Ile Glu Glu Gly Met
50 55 60
Asp Gln Ile Asn Lys Asp Met Lys Glu Ala Glu Lys Asn Leu Thr Asp
65 70 75 80
Leu Gly Lys Phe Cys Gly Leu Cys Val Cys Pro Cys Asn Lys Leu Lys
85 90 95
Ser Ser Asp Ala Tyr Lys Lys Ala Trp Gly Asn Asn Gln Asp Gly Val
100 105 110
Val Ala Ser Gln Pro Ala Arg Val Val Asp Glu Arg Glu Gln Met Ala
115 120 125
Ile Ser Gly Gly Phe Ile Arg Arg Val Thr Asn Asp Ala Arg Glu Asn
130 135 140
Glu Met Asp Glu Asn Leu Glu Gln Val Ser Gly Ile Ile Gly Asn Leu
145 150 155 160
Arg His Met Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg
165 170 175
Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp Ser Asn Lys Thr Arg Ile
180 185 190
Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser Gly
195 200 205
Claims (82)
- 수송제 및 클로스트리디움계 독소 기질을 포함하여 이루어지며, 상기 클로스트리디움계 독소 기질이:(a) 도너 플루오로포어;(b) 상기 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터;(c) 절단 부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고,상기 절단 부위는 상기 도너 플루오로포어와 상기 억셉터 사이에 있고, 적합한 조건하에서, 상기 도너 플루오로포어와 상기 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 수송제가 상기 클로스트리디움계 독소 기질에 공유결합되는 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 2 항에 있어서, 상기 수송제가 단백질, 펩티드 또는 펩티도미메틱인 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 3 항에 있어서, 상기 클로스트리디움계 독소 기질에 작용가능하게 융합된 상기 수송제를 포함하는 키메라 단백질, 펩티드 또는 펩티도미메틱인 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 3 항에 있어서, 상기 수송제가 안테나페디아 단백질 또는 이의 활성 단편인 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 5 항에 있어서, 상기 안테나페디아 단백질 또는 이의 활성 단편이 아미노산 서열 RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO : 1)을 가지는 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 3 항에 있어서, 상기 수송제가 HIV TAT 단백질 또는 이의 활성 단편인 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 7 항에 있어서, 상기 HIV TAT 단백질 또는 이의 활성 단편이 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO : 2)을 가지는 것을 특징으로 하는 기질 단백질.
- 제 3 항에 있어서, 상기 수송제가 단순 포진성 바이러스 VP22 단백질 또는 이의 활성 단편인 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 9 항에 있어서, 단순 포진성 바이러스 VP22 단백질이 아미노산 서열 SEQ ID NO : 23을 가지는 것을 특징으로 하는 기질 단백질.
- 제 1 항에 있어서, 상기 수송제가 상기 클로스트리디움계 독소 기질에 비-공유적으로 연관되어 있는 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 11 항에 있어서, 상기 수송제가 Chariot™ 및 MPG 펩티드로 구성된 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 11 항에 있어서, 보툴리눔 독소 인식 서열을 포함하는 보툴리눔 독소 기질을 포함하는 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 13 항에 있어서, BoNT/A 인식 서열을 포함하는 BoNT/A 기질을 포함하는 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 14 항에 있어서, 상기 BoNT/A 기질은, 적어도 6개의 연속하는 SNAP-25 잔기(상기 6개의 연속하는 잔기는 Gln-Arg를 포함) 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 13 항에 있어서, BoNT/B 인식 서열을 포함하는 BoNT/B 기질을 포함하는 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 16 항에 있어서, 상기 BoNT/B 기질은, 적어도 6개의 연속하는 VAMP 잔기(상기 6개의 연속하는 잔기는 Gln-Phe를 포함) 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 13 항에 있어서, BoNT/C1 인식 서열을 포함하는 BoNT/C1 기질을 포함하는 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 18 항에 있어서, 상기 BoNT/C1 기질은, 적어도 6개의 연속하는 신택신 잔기(상기 6개의 연속하는 잔기는 Lys-Ala를 포함) 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 18 항에 있어서, 상기 BoNT/C1 기질은, 적어도 6개의 연속하는 SNAP-25 잔기(상기 6개의 연속하는 잔기는 Arg-Ala를 포함) 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 13 항에 있어서, BoNT/D 인식 서열을 포함하는 BoNT/D 기질을 포함하는 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 21 항에 있어서, 상기 BoNT/D 기질은, 적어도 6개의 연속하는 VAMP 잔기(상기 6개의 연속하는 잔기는 Lys-Leu를 포함) 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 13 항에 있어서, BoNT/E 인식 서열을 포함하는 BoNT/E 기질을 포함하는 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 23 항에 있어서, 상기 BoNT/E 기질은, 적어도 6개의 연속하는 SNAP-25 잔기(상기 6개의 연속하는 잔기는 Arg-Ile를 포함) 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 13 항에 있어서, BoNT/F 인식 서열을 포함하는 BoNT/F 기질을 포함하는 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 25 항에 있어서, 상기 BoNT/F 기질은, 적어도 6개의 연속하는 VAMP 잔기(상기 6개의 연속하는 잔기는 Gln-Lys를 포함) 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 13 항에 있어서, BoNT/G 인식 서열을 포함하는 BoNT/G 기질을 포함하는 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 27 항에 있어서, 상기 BoNT/G 기질은, 적어도 6개의 연속하는 VAMP 잔기(상기 6개의 연속하는 잔기는 Ala-Ala를 포함) 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 1 항에 있어서, TeNT 인식 서열을 포함하는 TeNT 기질을 포함하는 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 29 항에 있어서, 상기 TeNT 기질은, 적어도 6개의 연속하는 VAMP 잔기(상기 6개의 연속하는 잔기는 Gln-Phe를 포함) 또는 이의 펩티도미메틱을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 도너 플루오로포어가 플루오레세인, Alexa Fluor®488, DABCYL 및 BODIPY로 구성된 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 억셉터가 억셉터 플루오로포어인 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 32 항에 있어서, 상기 억셉터 플루오로포어가 적어도 1 마이크로초의 형광 수명을 가지는 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 억셉터가 테트라메틸로다민, EDANS 및 QSY®7으로 구성된 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 억셉터가 비-형광성인 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 4 항에 있어서, 최대 100개의 잔기를 가지는 펩티드 또는 펩티도미메틱인 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 제 4 항에 있어서, 최대 50개의 잔기를 가지는 펩티드 또는 펩티도미메틱인 것을 특징으로 하는 기질 조성물.
- 클로스트리디움계 독소 기질을 포함하여 이루어지며, 상기 클로스트리디움계 독소 기질이:(a) 도너 플루오로포어;(b) 상기 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터;(c) 절단 부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고,상기 절단 부위는 상기 도너 플루오로포어와 상기 억셉터 사이에 있고, 적합한 조건하에서, 상기 도너 플루오로포어와 상기 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 38 항에 있어서, 트랜스펙션된 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 38 항에 있어서, 안정하게 트랜스펙션된 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 38 항에 있어서, 일차 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 38 항에 있어서, 확립된 세포(established cell)인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 38 항에 있어서, 사람 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 38 항 내지 제 41 항 중의 어느 한 항에 있어서, 뉴런인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 38 항에 있어서, 중추신경계(CNS) 뉴런인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 38 항에 있어서, 말초 뉴런인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 39 항 또는 제 40 항에 있어서, 신경아세포종 세포, 척수 뉴런, 배측 근 신경절 뉴런, 대뇌 피질 뉴런, 소뇌 뉴런, 해마 뉴런 및 운동 뉴런로 구성된 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 세포.
- 제 45 항에 있어서, 신경아세포종 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 38 항에 있어서, 비-뉴런성 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 47 항에 있어서, 췌장 선방 세포(pancreatic acinar cell)인 것을 특징으로 하는 세포.
- 클로스트리디움계 독소 기질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하여 이루어지며, 상기 클로스트리디움계 독소 기질이:(a) 도너 플루오로포어;(b) 상기 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터;(c) 절단 부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고,상기 절단 부위는 상기 도너 플루오로포어와 상기 억셉터 사이에 있고, 적합한 조건하에서, 상기 도너 플루오로포어와 상기 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나는 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 51 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 안정하게 트랜스펙션되는 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 51 항에 있어서, 사람 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 51 항에 있어서, 뉴런성 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 51 항에 있어서, 비-뉴런성 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 51 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 구조성 조절 요소(constitutive regulatory element)에 결합되는 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 51 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 유도성 조절 요소(inducible regulatory element)에 결합되는 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 57 항에 있어서, 상기 유도성 프로모터가 테트라시클린 조절된 조절요소인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 57 항에 있어서, 상기 유도성 프로모터가 엑디손 유도성 조절 요소인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제 51 항 ,제 52 항, 제 56 항 또는 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클로스트리디움계 독소 기질이 녹색 형광 단백질(GFP)을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
- (a) 세포를 시료와 접촉시키는 단계,상기 세포는 클로스트리디움계 독소 기질을 포함하며,상기 클로스트리디움계 독소 기질은 (i)도너 플루오로포어;(ii) 상기 도너 플루오로포어의 방출 스펙트럼과 겹치는 흡수 스펙트럼을 가지는 억셉터; 및(iii) 상기 도너 플루오로포어와 상기 억셉터 사이에 있는 절단부위를 포함하는 클로스트리디움계 독소 인식 서열을 포함하고,알맞은 조건하에서 상기 도너 플루오로포어와 억셉터 사이에 공명 에너지 전이가 나타나고;(b) 상기 도너 플루오로포어를 여기(exciting)시키는 단계;(c) 대조구 세포와 비교하여 상기 접촉된 세포의 공명 에너지 전이를 결정하고, 상기 대조구 세포와 비교한 상기 접촉된 세포의 공명 에너지 전이의 차이로서 클로스트리디움계 독소 활성을 표시하는 단계를 포함하여 이루어지는, 클로스트리디움계 독소 활성을 결정하는 방법.
- 재 61 항에 있어서, 상기 클로스트리디움계 독소 기질이 보툴리눔 독소 기질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 62 항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소 기질이 BoNT/A 인식 서열을 포함하는 BoNT/A 기질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 62 항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소 기질이 BoNT/B 인식 서열을 포함하는 BoNT/B 기질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 62 항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소 기질이 BoNT/C1 인식 서열을 포함하는 BoNT/C1 기질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 62 항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소 기질이 BoNT/D 인식 서열을 포함하는 BoNT/D 기질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 62 항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소 기질이 BoNT/E 인식 서열을 포함하는 BoNT/E 기질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 62 항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소 기질이 BoNT/F 인식 서열을 포함하는 BoNT/F 기질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 62 항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소 기질이 BoNT/G 인식 서열을 포함하는 BoNT/G 기질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 61 항에 있어서, 상기 보툴리눔 독소 기질이 TeNT 인식 서열을 포함하는 TeNT 기질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 61 항에 있어서, 상기 시료가 조 세포 용해물(crude cell lysate)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 61 항에 있어서, 상기 시료가 분리된 클로스트리디움계 독소인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 61 항에 있어서, 상기 시료가 조제된 클로스트리디움계 독소 제품인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 61 항에 있어서, 상기 시료가 BOTOX®인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 61 항에 있어서, 상기 시료가 식품인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 61 항에 있어서, (c) 단계가 상기 접촉된 세포의 도너 형광 세기를 검출하고, 상기 대조구 세포와 비교하여 상기 접촉된 세포의 증가된 도너 형광 세기로서 클로스트리디움계 독소 활성을 나타내는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 61 항에 있어서, (c) 단계가 상기 접촉된 세포의 억셉터 형광 세기를 검출하고, 상기 대조구 세포와 비교하여 상기 접촉된 세포의 감소된 억셉터 형광 세기로서 클로스트리디움계 독소 활성을 나타내는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 61 항에 있어서, (c) 단계가 상기 접촉된 세포의 억셉터 방출 최대치 및 도너 플루오로포어 방출 최대치를 검출하고, 상기 억셉터 방출 최대치 근처로부터 상기 도너 플루오로포어 방출 최대치 근처로의 이동으로서 클로스트리디움계 독소 활성을 나타내는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 61 항에 있어서, (c) 단계가 도너 플루오로포어 방출 최대치 근처 형광 진폭에 대한 억셉터 방출 최대치 근처 형광 진폭의 비율을 검출하고, 대조구 세포와 비교하여 상기 접촉된 세포에서의 감소된 비율로서 클로스트리디움계 독소 활성을 나타내는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 61 항에 있어서, (c) 단계가 상기 접촉된 세포에서 도너 플루오로포어의 여기 상태 수명을 측정하고, 상기 대조구 세포에서와 비교하여 상기 접촉된 세포에서의 증가된 여기 상태 수명으로서 클로스트리디움계 독소 활성을 나타내는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 61 항에 있어서, (c) 단계를 1회 이상 시간간격을 두고 반복하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 61 항에 있어서, 에세이가 선형(linear)이 되도록 클로스트리디움계 독소 활성에 적합한 조건을 선택하는 것을 특징으로 하는 방법.
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