KR20200128649A

KR20200128649A - 세포내 atp의 생세포 분석을 위한 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20200128649A
Application number: KR1020207009843A
Authority: KR
Inventors: 다니엘 애플던; 시슬리 스크램; 그리고리 필로노브; 커크 슈뢰더
Original assignee: 에센 인스트루먼츠, 인크. 디/비/에이/ 에센 바이오사이언스, 인크.
Priority date: 2018-03-09
Filing date: 2019-03-07
Publication date: 2020-11-16
Also published as: CN111183219B; US20200400670A1; CN111183219A; JP2021514603A; JP7316266B2; WO2019173604A1; EP3762489B1; EP3762489A1

Abstract

ATP 바이오센서 융합 단백질 및 세포에서 ATP의 수준을 분석하기 위한 그것의 용도가 본원에 개시된다.

Description

세포내 ATP의 생세포 분석을 위한 방법 및 조성물

상호 참조

본 출원은 2018년 3월 9일자로 출원된 미국 가출원 제62/640983호를 우선권으로 주장하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

약물 유발 대사 동요(perturbation)를 모니터링하기 위한 표준 접근법은 모집단 기반 측정 및 제한된 운동 정보를 제공하는 종말점 분석으로 제한된다. 본 발명의 양태에 따르면, 세포 ATP 수준의 직접적이고 자동화된 생세포 분석을 가능하게 하는 유전적으로 인코딩된 ATP 센서가 사용 방법과 함께 제공된다.

한 양태에서, X1-X2-X3-X4-X5 속의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질이 개시되며, 여기서:

X1과 X5 중 하나는 수용체 여기 파장 및 FRET 방출 파장을 갖는 형광 공명 에너지 전이(FRET) 수용체 폴리펩타이드를 포함하고, X1과 X5 중 다른 하나는 공여체 여기 파장 및 공여체 방출 파장을 갖는 FRET 공여체 폴리펩타이드를 포함하고;

X2 및 X4는 독립적으로 선택적 아미노산 링커이고; 그리고

X3은 ATP 결합 단백질을 포함하되;

ATP 결합 단백질에 의한 ATP의 결합이 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드와 FRET 공여체 폴리펩타이드의 상호 작용을 야기한다.

일 구현예에서, X1은 FRET 수용체 폴리펩타이드를 포함하고 X5는 FRET 공여체 폴리펩타이드를 포함하고; 또 다른 구현예에서, X1은 FRET 공여체 폴리펩타이드를 포함하고 X5는 FRET 수용체 폴리펩타이드를 포함한다. 다양한 일 구현예에서, X2는 1~2개 아미노산 길이의 아미노산 링커이거나 또는 존재하지 않는다. 다른 구현예에서, X2는 A, S, P, V, T, TS, ID로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 링커이거나, 또는 X2는 존재하지 않는다. 추가의 구현예에서, X4는 1~5 개 아미노산 길이의 아미노산 링커이거나, 또는 여기서 X4는 존재하지 않는다. 다른 구현예에서, X4는 AT, A, SA, GA, FF, PPPP(서열 번호: 20), FL, GTSG(서열 번호: 21), P, S, ANEFM(서열 번호: 22)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 링커이거나, 또는 X4는 존재하지 않는다. 다양한 구현예에서, X2 및 X4는 둘 다 A이거나; X2는 S이고 X4는 A이거나;

X2는 존재하지 않고 X4는 FF이거나; X2는 V이고 X4는 FL이거나; X2는 T이고 X4는 GTSG(서열 번호: 21)이거나; 또는 X2는 S이고 X4는 SA이다. 다른 구현예에서, X2 및 X4는 임의의 프롤린 잔기를 포함하지 않는다. 다른 구현 예에서, 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드는 500 내지 560nm 범위의 최대 수용체 여기 파장 및 530 내지 580nm 범위의 수용체 최대 방출 파장을 갖는다. 추가의 구현예에서, 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드는 서열 번호 1 내지 3중 하나 이상의 아미노산 서열의 길이를 따라 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 발색단에서 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 FRET 수용체 폴리 펩타이드에 모든 선택적 아미노산 잔기가 존재한다. 일 구현예에서, 상기 FRET 공여체 폴리펩타이드는 450 내지 500nm 범위의 최대 공여체 여기 파장 및 480 내지 515nm 범위의 최대 공여체 방출 파장을 갖는다. 다른 구현예에서, 상기 FRET 공여체 폴리펩타이드는 서열 번호 4의 아미노산 서열의 길이를 따라 적어도 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고, 발색단에서 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, X3은 서열 번호 5~6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열의 길이를 따라 적어도 65%, 67%, 68%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 ATP 결합 단백질을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 7~11로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열의 길이를 따라 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 양태에서, X3이 ATP에 결합하지 않는 대조군 단백질을 포함하는 것을 제외하고, 본 명세서에 개시된 융합 단백질 및 그것의 구성 요소의 모든 구현예 및 구현예들의 조합을 포함하는 대조군 융합 단백질이 개시된다. 일 구현예에서, X3은 서열 번호 12의 아미노산 서열의 길이를 따라 적어도 65%, 67%, 68%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하되, 서열 번호 12 중 밑줄 치고 굵은 글꼴 잔기는 K이어야 한다. 다른 구현예에서, 대조군 융합 단백질은 서열 번호: 13의 아미노산 서열의 길이를 따라 적어도 65%, 67%, 68%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하되, 서열 번호: 13중 밑줄치고 굵은 글꼴 잔기는 K이어야 한다.

추가적 양태에서, 본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 융합 단백질 또는 대조군 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 개시된다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하는 발현 벡터를 제공하되, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 지시할 수 있는 프로모터 서열, 및 본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포에 작동 가능하게 연결된다. 일 구현예에서, 상기 숙주 세포는 안정한 형질 전환 세포주의 세포이다.

추가적 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 하나 이상의 융합 단백질 또는 하나 이상의 대조군 융합 단백질을 포함하는 키트를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시내용은 관심있는 세포에서 ATP의 수준을 결정하기 위한 융합 단백질의 사용 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기의 ATP 분석 방법은 하기를 포함한다:

(a) 하나 이상의 제1 세포에서 본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 융합 단백질을 발현하고, 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 이미지를 생성하는 단계:

(i) 상기 하나 이상의 제1 세포를 FRET 공여체 폴리펩타이드 여기 파장을 갖는 빛에 노출시켰을 때, 상기 하나 이상의 제1 세포에서 방출된 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드 발광 파장을 갖는 빛에 의해 생산된 형광 신호를 검출함으로써 생성된 제1 형광 이미지; 및/또는

(ii) 상기 하나 이상의 제1 세포를 FRET 수용체 폴리펩타이드 여기 파장을 갖는 빛에 노출시켰을 때, 상기 하나 이상의 제1 세포에서 방출된 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드 발광 파장을 갖는 빛에 의해 생산된 형광 신호를 검출함으로써 생성된 제2 형광 이미지; 및/또는

(iii) 상기 하나 이상의 제1 세포를 FRET 공여체 폴리펩타이드 여기 파장을 갖는 빛에 노출시켰을 때, 상기 하나 이상의 제1 세포에서 방출된 상기 FRET 공여체 폴리펩타이드 발광 파장을 갖는 빛에 의해 생산된 형광 신호를 검출함으로써 생성된 제3 형광 이미지; 및

(b) 상기 제1 형광 이미지, 제2 형광 이미지 및/또는 제3 형광 이미지에서 형광 신호의 출력을 비교함으로써, 상기 하나 이상의 제1 세포에서의 FRET 비를 결정하는 단계;

여기서 상기 하나 이상의 제1 세포에서 ATP의 수준은 상기 결정된 FRET 비율에 비례하는 것을 특징으로 한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 하나 이상의 제1 세포에서 본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 대조군 융합 단백질을 발현시키는 단계, 및 상기 하나 이상의 제1 세포에서 방출된 상기 수용체 방출 파장을 갖는 빛에 의해 생성된 대조군 신호를 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 상기 대조군 신호를 검출하는 단계는 하기를 포함한다:

(c) 하나 이상의 대조군 세포(예컨대, 제1 세포 또는 제2 세포)에서 본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예의 조합의 상기 대조군 융합 단백질을 발현하고, 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 이미지를 생성하는 단계:

(i) 상기 하나 이상의 대조군 세포를 FRET 공여체 폴리펩타이드 여기 파장을 갖는 빛에 노출시켰을 때, 상기 하나 이상의 대조군 세포에서 방출된 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드 발광 파장을 갖는 빛에 의해 생산된 형광 신호를 검출함으로써 생성된 제4 형광 이미지; 및/또는

(ii) 상기 하나 이상의 대조군 세포를 FRET 수용체 폴리펩타이드 여기 파장을 갖는 빛에 노출시켰을 때, 상기 하나 이상의 대조군 세포에서 방출된 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드 발광 파장을 갖는 빛에 의해 생산된 형광 신호를 검출함으로써 생성된 제5 형광 이미지; 및/또는

(iii) 상기 하나 이상의 대조군 세포를 FRET 공여체 폴리펩타이드 여기 파장을 갖는 빛에 노출시켰을 때, 상기 하나 이상의 대조군 세포에서 방출된 상기 FRET 공여체 폴리펩타이드 발광 파장을 갖는 빛에 의해 생산된 형광 신호를 검출함으로써 생성된 제6 형광 이미지; 및

(d) 상기 제4 형광 이미지, 제5 형광 이미지 및/또는 제6 형광 이미지에서 형광 신호의 출력을 비교함으로써 하나 이상의 대조군 세포에서의 대조군 융합 FRET 비율을 결정하는 단계;

여기서 상기 대조군 융합 FRET 비율의 변동은 ATP 결합과 무관한 실험 조건의 결과인 것으로 판단되고, 상기 결정된 FRET 비율은 대조군 융합 FRET 비율의 변동에 기초하여 수정된다.

추가적 구현예에서, 상기 하나 이상의 제1 세포는 배양기의 배양물에 존재하되, 모든 이미징 단계는 상기 배양기에서 상기 하나 이상의 제1 세포를 분리하지 않고 수행된다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 상기 하나 이상의 제1 세포를 하나 이상의 시험 물질과 접촉시키는 단계 및 상기 하나 이상의 제1 세포에서 ATP의 존재에 대한 시험 물질의 효과를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 하나 이상의 제1 세포에서 ATP의 존재에 대한 하나 이상의 시험 물질의 효과는 1 분 내지 3 개월의 기간에 걸쳐 연속적으로 또는 간헐적으로 결정된다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 융합 단백질 자체 뿐만 아니라 상기 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는데, 상기 융합 단백질은 하기를 포함한다: 수용체 여기 파장 및 FRET 방출 파장을 갖는 FRET 수용체인 제1 형광단(상기 제1 형광단은 N-말단 및 C-말단을 가짐); N-말단 및 C-말단을 갖는 ATP 결합 단백질; 및 공여체 여기 파장 및 공여체 방출 파장을 갖는 FRET 공여체인 제2 형광단(상기 제2 형광단은 N-말단 및 C-말단을 가짐), 여기서 제1 링커가 상기 제1 형광단의 C-말단과 상기 ATP 결합 단백질의 N-말단 사이에 배치되고, 제2 링커가 상기 ATP 결합 단백질의 C-말단과 상기 제2 형광단의 N-말단 사이에 배치되며, ATP 결합 단백질에 의한 ATP의 결합이 공여체 여기 파장을 갖는 빛에 노출될 때 상기 제1 형광단 및 제2 형광단의 상호 작용을 야기하여 FRET 방출 신호를 생성하도록 하기 위해, 상기 제1 형광단, ATP 결합 단백질 및 제2 형광단이 작동 가능하게 연결된다. 다른 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 작동 가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하고; 상기 폴리뉴클레오타이드는 발현 벡터에 포함되며; 및 상기 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 개시되어 있다.

도 1 은 처리 2 시간 후 비히클 처리 세포의 FRET 비율에서 약물 처리 세포의 FRET 비율을 빼서 본 개시내용의 예시적인 융합 단백질에 대해 계산된 신호창의 그래프 표현이다.
도 2a~b는 각 센서의 안정적인 발현을 갖는 세포주에서 본 개시내용의 예시적인 융합 단백질((A) GO-ATeam1); 및 (B) A1)을 사용하여 관찰된 FRET 비율의 그래프 비교이다.
도 3a~b는 10mM의 ATP 존재 및 부재 하에 배양된 본 개시내용의 예시적 융합 단백질을 이용하여 관찰된 여기 스펙트럼의 그래프 비교이다. 센서 A1(GO-ATeam-A1)의 성능(도 3a)은, GO-Ateam1 센서의 성능(도 3b)과 비교할 때, 신호 창에서 2 배 이상의 증가를 보여준다(ATP 결합(실선)과 ATP 비결합 상태(점선)의 비교). 　
도 4 표준 배지에서 성장한 세포에서 각각 2DG 및 KCN에 의한 당분해 및 OXPHOS의 동시 억제를 통한 ATP 고갈(도 4a). 데이터는 동시 2DG 및 KCN 처리의 ATP 고갈 및 농도 의존성의 시간 경과를 입증한다. 글루코오스 또는 갈락토오스 배지에서 성장한 세포에서 세포 독성(클로르프로마진, 도 4b) 및 미토독성(mitotoxic)(로테논, 도 4c) 화합물의 비교. 처음 2 개의 패널은 지시된 바와 같이 글루코오스 또는 갈락토오스에서 성장한 세포에서 24시간 시간 경과에 따른 각 화합물의 효과를 도시한다. 세 번째 패널은 24 시간 시점에서 각 화합물의 농도-반응 곡선을 나타낸다. 세포독성 화합물은 두 배지 조건 하에서 유사한 효과를 나타내는 반면, 미토독성 화합물은 갈락토오스에서 성장한 세포에서 더 큰 ATP 고갈을 유도한다.
도 5a~b. 섬유 아세포가 있는 단일 배양물 또는 공동 배양물 중 유방암 세포주에서 CB-839의 효과. 대표적인 데이터는 삼중 음성 유방암(TNBC) 세포에서 연장된 ATP 고갈을 입증하는데, 이것은 CCD-1068Sk 섬유 아세포가 있는 공동 배양물에 의해 약화된다(도 5a). 대조적으로, 수용체 양성 세포는 48 시간 내에 CB-839 처리에서의 회복을 입증하였고, 상기 반응은 섬유 아세포의 존재에 의해 영향을 받지 않았다(도 5b).

본원에 사용된 과학 및 기술 용어는 일반적으로 당업자에 의해 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 이러한 용어는 예시적으로 하기를 비롯한 다양한 표준 참조문헌의 문맥에서 발견, 정의 및 사용된다: J. Sambrook and D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd Ed., 2001; F.M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5th Ed., 2002; B. Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 4th Ed., Garland, 2002; D.L. Nelson and M.M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 4th Ed., W.H. Freeman & Company, 2004; and Herdewijn, P. (Ed.), Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications, Methods in Molecular Biology, Humana Press, 2004.

단수 용어 "a", "an"및 "the"는 제한적인 것으로 의도되지 않으며, 명시적으로 달리 언급되지 않는 한, 또는 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 지시물을 포함한다.

본원에 개시된 모든 구현예는 문맥 상 명백하게 달리 지시되지 않는 한 조합될 수 있다.

제1 양태에서, 본 개시내용은 속 X1-X2-X3-X4-X5의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 제공하는데, 여기서:

X1 및 X5 중 하나는 수용체 여기 파장 및 FRET 방출 파장을 갖는 형광 공명 에너지 전이(FRET) 수용체 폴리펩타이드를 포함하고, X1 및 X5 중 다른 하나는 공여체 여기 파장 및 공여체 방출 파장을 갖는 FRET 공여체 폴리펩타이드를 포함하고;

X2 및 X4는 독립적으로 선택적인 아미노산 링커이고; 및

X3은 ATP 결합 단백질이되;

상기 ATP 결합 단백질에 의한 ATP의 결합이 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드와 FRET 공여체 폴리펩타이드의 상호 작용을 야기한다.

이와 같은 제1 양태의 융합 단백질은, 예를 들어, 다음의 예에서 자세히 설명되는 바와 같이, 생세포에서 ATP를 감지하고 측정하는 데 사용될 수 있다.

형광 공명 에너지 전이(FRET)는 여기된 공여체 형광단에서 상기 공여체에 근접한 적합한 수용체 형광단으로의 에너지의 비방사적 전이이다. 본 개시내용의 융합 단백질에 사용하기 위한 FRET 형광단 공여체/수용체 폴리펩타이드 쌍의 선택을 위해, 각각의 흡수 및 방출 파장이 고려된다. 본원의 교시에 기초하여, 당업자는 특정 적용에서 다양한 형광단 중 어느 것이 FRET 공여체/수용체 폴리펩타이드 쌍으로서 사용될 수 있을지 용이하게 결정할 수 있다.

일 구현예에서, X1은 FRET 수용체 폴리펩타이드를 포함하고 X5는 FRET 공여체 폴리펩타이드를 포함하며; 또 다른 구현예에서, X1은 FRET 공여체 폴리펩타이드를 포함하고 X5는 FRET 수용체 폴리펩타이드를 포함한다.

임의의 적합한 폴리펩타이드 형광단은, 예컨대 비제한적으로, 녹색 형광단백질 및 BFP, EBFP, EBFP2, ECFP, RFP 및 YFP 등의 유도체 및, 본원에 기술된 기타 폴리펩타이드 형광단으로 사용될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드는 최대 수용체 여기 파장이 500~560nm의 범위에 속하고, 수용체 최대 방출 파장이 530~580nm의 범위에 속한다. 하기 실시예에 기재된 바와 같은 또 다른 구현예에서, 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드는 서열 번호 1 내지 3 중 하나 이상의 아미노산 서열의 길이를 따라 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 상기 발색단에서 동일한(강조된 잔기로 표시됨) 아미노산 서열을 포함한다. 괄호 안의 잔기는 처음부터 끝까지 선택 사항이다.

mKOk (서열 번호 1)

(MVSVI)KPEMKMRYYMDGSVNGHEFTIEGEGTGRPYEGHQEMTLRVTMAEGGPMPFAFDLVSHVF CYG HRVFTKYPEEIPDYFKQAFPEGLSWERSLEFEDGGSASVSAHISLRGNTFYHKSKFTGVNFPADGPIMQNQSVDWEPSTEKITASDGVLKGDVTMYLKLEGGGNHKCQFKTTYKAAKEILEMPGDHYIGHRLVRKTEGNITEQVEDAVA(HS)

mKO (서열 번호: 2)

(MSVIK)PEMKMRYYMDGSVNGHEFTIEGEGTGRPYEGHQEMTLRVTMA K GGPMPFAFDLVSHVF CYG HR P FTKYPEEIPDYFKQAFPEGLSWERSLEFEDGGSASVSAHISLRGNTFYHKSKFTGVNFPADGPIMQNQSVDWEPSTEKITASDGVLKGDVTMYLKLEGGGNHKCQFKTTYKAAK K IL K MPG S HYI S HRLVRKTEGNITE L VEDAVA(HS)

mKO2 (서열 번호: 3)

(MVSVI)KPEMKMRYYMDGSVNGHEFTIEGEGTGRPYEGHQEMTLRVTMAEGGPMPFAFDLVSHVF CYG HRVFTKYPEEIPDYFKQAFPEGLSWERSLEFEDGGSASVSAHISLRGNTFYHKSKFTGVNFPADGPIMQNQSVDWEPSTEKITASDGVLKGDVTMYLKLEGGGNHKCQMKTTYKAAKEILEMPGDHYIGHRLVRKTEGNITEQVEDAVA(HS)

일 구현예에서, 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드에 모든 선택적 아미노산 잔기가 존재한다.

또 다른 구현예에서, 상기 FRET 공여체 폴리펩타이드는 최대 공여체 여기 파장이 450 내지 500nm 범위에 속하고, 최대 공여체 방출 파장이 480 내지 515nm 범위에 속한다. 하기 실시예에 기재된 또 다른 구현에서, 상기 FRET 공여체 폴리펩타이드는 서열 번호 4의 아미노산 서열의 길이를 따라 적어도 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나 또는 발색단(강조된 잔기)에서 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

순환순열로 배치된(cpm) EGFP: 서열 번호: 4

(DG)SVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQS(A/K)LSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGGSGGMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTL TYG VQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIE(EA)

서열 번호 4와 필수 아미노산 서열 동일성을 갖고, 본 개시내용의 융합 단백질에 사용될 수 있는 예시적인 FRET 공여체 폴리펩타이드가 아래 표 1에 나열되어 있다.

표 1

의도한 사용에 적합한 것으로 간주되는 융합 단백질에 임의의 적절한 ATP 결합 단백질이 사용될 수 있다(예: 분석 대상의 세포 유형에서 발현될 수 있음). 하기 실시예에 기재된 바와 같이 하나의 비제한적인 구현예에서, X3은 서열 번호: 5~6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열(괄호 안의 잔기는 선택적임)의 길이를 따라 적어도 65%, 67%, 68%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 ATP 결합 단백질을 포함한다.

서열 번호 5 : 바실러스 서브틸리스 F_oF₁ -ATP 신타아제의 변형된 ε하위단위

(M)KTVKVNITTPDGPVYDADIEMVSVRAESGDLGILPGHIPTKAPLKIGAVRLKKDGQTEMVAVSGGTVEVRPDHVTINAQAAETAEGIDKERAEAARQRAQERLNSQSDDTDIRRAELALQRALNRLDVAGK

서열 번호 6 바실러스 속 PS3 F_oF₁-ATP 신타아제의 ε하위단위에서 유래된 두 요소, M-Y 돌연변이 및 GK-EMK 치환(굵은 글씨)을 갖는 바실러스 서브틸리스 F_oF₁ -ATP 신타아제의 변형된 ε하위단위

(M)KTVKVNITTPDGPVYDADIEMVSVRAESGDLGILPGHIPTKAPLKIGAVRLKKDGQTEYVAVSGGTVEVRPDHVTINAQAAETAEGIDKERAEAARQRAQERLNSQSDDTDIRRAELALQRALNRLDVAEMK

서열번호 5~6과 아미노산 서열 동일성을 갖고, 본 개시내용의 융합 단백질에 사용될 수 있는 예시적 ATP 결합 단백질이 표 2에 나열되어 있다.

표 2

일 구현예에서, 아미노산 링커(X2)는 X1과 X3 사이에 존재하고, 아미노산 링커 (X4)는 X3과 X5 사이에 존재한다. 임의의 적합한 아미노산 링커가 사용될 수 있으며; 하기 실시예에서 광범위한 지침이 제공된다. 다양일 구현예에서, X2는 길이가 0~2, 1~2, 0, 1 또는 2개의 아미노산인 아미노산 링커이다. 다양한 추가의 구현예에서:

· X2는 A, S, P, V, T, TS, ID로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 링커이거나, 또는 X2는 존재하지 않거나;

· X2는 A, S, V, T, TS 및 ID로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 링커이거나; 또는

· X2는 A, S, V 및 T로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 링커이다.

다른 구현예에서, X4는 길이가 1~5, 1~4, 1~3, 1~2, 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산인 아미노산 링커이거나, 또는 X4가 존재하지 않는다. 다양한 추가의 구현예에서:

· X4는 AT, A, SA, GA, FF, PPPP(서열 번호: 20), FL, GTSG(서열 번호: 21), P, S, ANEFM(서열 번호:22)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 링커이거나, 또는 X4는 존재하지 않거나;

· X4는 AT, A, SA, GA, FF, FL, P 및 S로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 링커이거나; 또는

· X4는 A, FF, FL 및 GTSG(서열 번호: 21)로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 링커이다.

추가적인 특정 구현예에서:

· X2 및 X4가 모두 A이거나;

· X2가 S이고 X4가 A이거나;

· X2가 존재하지 않고 X4가 FF이거나;

· X2가 V이고 X4가 FL이거나;

· X2가 T이고 X4가 GTSG (서열 번호: 21)이거나; 또는

· X2가 S이고 X4가 SA이다.

또 다른 구현예에서, X2 및 X4는 상기 링커를 유연하게 유지하기 위해, 프롤린 잔기를 포함하지 않는다.

추가적 구현예에서, 상기 융합 단백질은 서열 번호: 7~11(이하 실시예에서 사용된 명칭을 지칭하는 명칭)로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열의 길이를 따라 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하거나, 또는 하기 서열과 동일하지만 하기에 나타낸 링커 (X2 및 X4)(강조됨)가 하기 실시 예에서 표 3에 나타낸 다른 작제물을 위한 링커로 치환된 아미노산 서열을 포함한다:

서열 번호: 7 GO-ATeam-A1

mKOk 형광단백질(아미노산 1~218), 제1 알라닌 링커(아미노산 219), ATP 결합 단백질(아미노산 220~351), 제2 알라닌 링커(아미노산 352) 및 cpmEGFP 형광 단백질(아미노산 353-598)을 포함하는 융합 단백질

(M)VSVIKPEMKMRYYMDGSVNGHEFTIEGEGTGRPYEGHQEMTLRVTMAEGGPMPFAFDLVSHVFCYGHRVFTKYPEEIPDYFKQAFPEGLSWERSLEFEDGGSASVSAHISLRGNTFYHKSKFTGVNFPADGPIMQNQSVDWEPSTEKITASDGVLKGDVTMYLKLEGGGNHKCQFKTTYKAAKEILEMPGDHYIGHRLVRKTEGNITEQVEDAVAHS A (M)KTVKVNITTPDGPVYDADIEMVSVRAESGDLGILPGHIPTKAPLKIGAVRLKKDGQTEMVAVSGGTVEVRPDHVTINAQAAETAEGIDKERAEAARQRAQERLNSQSDDTDIRRAELALQRALNRLDVAGK A

DGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGGSGGMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEEA

서열 번호: 8 D5

(M)VSVIKPEMKMRYYMDGSVNGHEFTIEGEGTGRPYEGHQEMTLRVTMAEGGPMPFAFDLVSHVFCYGHRVFTKYPEEIPDYFKQAFPEGLSWERSLEFEDGGSASVSAHISLRGNTFYHKSKFTGVNFPADGPIMQNQSVDWEPSTEKITASDGVLKGDVTMYLKLEGGGNHKCQFKTTYKAAKEILEMPGDHYIGHRLVRKTEGNITEQVEDAVAHS S (M)KTVKVNITTPDGPVYDADIEMVSVRAESGDLGILPGHIPTKAPLKIGAVRLKKDGQTEMVAVSGGTVEVRPDHVTINAQAAETAEGIDKERAEAARQRAQERLNSQSDDTDIRRAELALQRALNRLDVAGK A

서열 번호: 9 F1

(M)VSVIKPEMKMRYYMDGSVNGHEFTIEGEGTGRPYEGHQEMTLRVTMAEGGPMPFAFDLVSHVFCYGHRVFTKYPEEIPDYFKQAFPEGLSWERSLEFEDGGSASVSAHISLRGNTFYHKSKFTGVNFPADGPIMQNQSVDWEPSTEKITASDGVLKGDVTMYLKLEGGGNHKCQFKTTYKAAKEILEMPGDHYIGHRLVRKTEGNITEQVEDAVAHS (링커 없음)

(M)KTVKVNITTPDGPVYDADIEMVSVRAESGDLGILPGHIPTKAPLKIGAVRLKKDGQTEMVAVSGGTVEVRPDHVTINAQAAETAEGIDKERAEAARQRAQERLNSQSDDTDIRRAELALQRALNRLDVAGK FF

서열 번호: 10 G1

(M)VSVIKPEMKMRYYMDGSVNGHEFTIEGEGTGRPYEGHQEMTLRVTMAEGGPMPFAFDLVSHVFCYGHRVFTKYPEEIPDYFKQAFPEGLSWERSLEFEDGGSASVSAHISLRGNTFYHKSKFTGVNFPADGPIMQNQSVDWEPSTEKITASDGVLKGDVTMYLKLEGGGNHKCQFKTTYKAAKEILEMPGDHYIGHRLVRKTEGNITEQVEDAVAHS V

(M)KTVKVNITTPDGPVYDADIEMVSVRAESGDLGILPGHIPTKAPLKIGAVRLKKDGQTEMVAVSGGTVEVRPDHVTINAQAAETAEGIDKERAEAARQRAQERLNSQSDDTDIRRAELALQRALNRLDVAGK FL

서열 번호: 11 G9

M)VSVIKPEMKMRYYMDGSVNGHEFTIEGEGTGRPYEGHQEMTLRVTMAEGGPMPFAFDLVSHVFCYGHRVFTKYPEEIPDYFKQAFPEGLSWERSLEFEDGGSASVSAHISLRGNTFYHKSKFTGVNFPADGPIMQNQSVDWEPSTEKITASDGVLKGDVTMYLKLEGGGNHKCQFKTTYKAAKEILEMPGDHYIGHRLVRKTEGNITEQVEDAVAHS T (M)KTVKVNITTPDGPVYDADIEMVSVRAESGDLGILPGHIPTKAPLKIGAVRLKKDGQTEMVAVSGGTVEVRPDHVTINAQAAETAEGIDKERAEAARQRAQERLNSQSDDTDIRRAELALQRALNRLDVAGK GTSG

제2 양태에서, 본 개시내용은 예를 들어 생세포에서 ATP를 검출 및 측정하기 위한 분석에서 대조군으로서, 본 개시내용의 제1 양태의 활성 융합 단백질과 함께 사용될 수 있는 대조군 융합 단백질을 제공한다. 상기 대조군 융합 단백질은 본 발명의 제1 양태의 융합 단백질과 동일한 화학식(X1-X2-X3-X4-X5)을 갖는다. 제1 양태에 대해 개시된 X1, X2, X4 및 X5 도메인의 모든 구현예가 상기 대조군 융합 단백질에 동일하게 적용 가능하다. 상기 X3 도메인은 ATP에 결합하지 않는 대조군 단백질을 포함함으로써 대조군 융합 단백질에서 상이하다. 임의의 적합한 대조군 단백질이 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 대조군 단백질은 서열 번호 12의 아미노산 서열의 길이를 따라 적어도 65%, 67%, 68%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하되, 밑줄치고 굵은 글꼴 잔기는 K여야 한다:

서열 번호: 12

(M)KTVKVNITTPDGPVYDADIEMVSVRAESGDLGILPGHIPTKAPLKIGAVRLKKDGQTEMVAVSGGTVEVRPDHVTINAQAAETAEGIDKERAEAARQRAQERLNSQSDDTDIRRAELALQ K ALN K LDVAGK

본 구현예의 대조군 단백질은 상기 언급된 ATP 결합 단백질과 밀접한 관련이 있으며, 위에서 언급된 필요한 라이신 잔기를 갖는 것에서 상이한데, 이것이 ATP 결합 활성을 없앤다.

특정한 일 구현예에서, 상기 대조군 융합 단백질은 서열 번호 13의 아미노산 서열의 길이를 따라 적어도 65%, 67%, 68%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하되, 밑줄친 및 굵은 글꼴 잔기는 K여야 한다:

서열 번호: 13

MVSVIKPEMKMRYYMDGSVNGHEFTIEGEGTGRPYEGHQEMTLRVTMAEGGPMPFAFDLVSHVFCYGHRVFTKYPEEIPDYFKQAFPEGLSWERSLEFEDGGSASVSAHISLRGNTFYHKSKFTGVNFPADGPIMQNQSVDWEPSTEKITASDGVLKGDVTMYLKLEGGGNHKCQFKTTYKAAKEILEMPGDHYIGHRLVRKTEGNITEQVEDAVAHS A

MKTVKVNITTPDGPVYDADIEMVSVRAESGDLGILPGHIPTKAPLKIGAVRLKKDGQTEMVAVSGGTVEVRPDHVTINAQAAETAEGIDKERAEAARQRAQERLNSQSDDTDIRRAELALQ K ALN K LDVAGK A DGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGGSGGMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEEA

본 구현예에서, 이탤릭체화 및 밑줄친 링커 잔기는 실시예의 표 3에 열거된 것들을 비제한적으로 포함하는 임의의 적합한 링커 잔기로 변형될 수 있다.

본 출원 전반에 걸쳐 사용된 용어 "단백질"은 가장 넓은 의미로 하위단위 아미노산 서열을 지칭하기 위해 사용된다. 본원에 기재된 폴리펩타이드는 화학적으로 합성되거나 재조합적으로 발현될 수 있다.

당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 개시내용의 융합 단백질은 기재된 융합 단백질에 존재하지 않는 N-말단, C 말단, 또는 양쪽 모두에 있는 추가적인 잔기를 포함할 수 있고; 이들 추가의 잔기는 기준 폴리펩타이드에 대한 본 개시내용의 폴리펩타이드의 백분율 동일성을 결정하는데 포함되지 않는다. 이러한 잔기는, 비제한적으로, 정제 목적에 적합한 리간드(His 태그 등) 및, 폴리펩타이드에 기능성을 추가하는 추가의 펩타이드 도메인을 비롯하여, 의도된 용도에 적합한 임의의 잔기일 수 있다.

일 구현예에서, 기준 융합 단백질에 대한 변화는 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 본원에 사용된 "보존적 아미노산 치환"은 융합 단백질 또는 도메인 기능 또는 다른 특성을 변경 또는 실질적으로 변경시키지 않는 아미노산 또는 핵산 치환을 의미한다. 주어진 아미노산은 유사한 물리 화학적 특성, 예를 들어 하나의 지방족 잔기로 다른 것을 치환하거나(예를 들어, Ile, Val, Leu 또는 Ala로 서로를 대체), 또는 하나의 극성 잔기로 다른 것을 치환하는 것(예 : Lys와 Arg; Glu와 Asp; 또는 Gln과 Asn)을 특성으로 갖는 잔기에 의해 대체될 수 있다. 다른 이러한 보존적 치환, 예를 들어, 유사한 소수성 특성을 갖는 전체 영역의 치환이 공지되어 있다. 보존적 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드가, 원하는 활성이 유지되는지 확인하기 위해, 본원에 기술된 분석에서 시험될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 융합 단백질 또는 대조군 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 폴리뉴클레오타이드는 RNA 또는 DNA를 포함할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 상기 인코딩된 단백질의 발현 및/또는 정제를 촉진하는 데 유용한 추가 서열, 예컨대 비제한적으로 폴리A 서열, 변형된 코작 서열, 및 에피토프 태그, 수출 신호 및 분비 신호, 핵 위치 신호 및 혈장 막 위치 신호를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 본원의 교시에 기초하여, 어떤 폴리뉴클레오타이드가 본 개시내용의 융합 단백질을 인코딩할 것인지가 당업자에게 명백할 것이다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 폴리뉴클레오타이드의 발현을 지시할 수 있는 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된, 본 개시내용의 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. "재조합 발현 벡터"는 폴리뉴클레오타이드를 융합 단백질의 발현을 야기할 수 있는 임의의 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결시키는 벡터를 포함한다. 본 개시내용의 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 "프로모터 서열"은 폴리뉴클레오타이드의 발현을 야기할 수 있는 핵산 서열이다. 상기 프로모터는, 폴리뉴클레오타이드 발현을 지시하는 기능을 하는 한, 상기 폴리뉴클레오타이드와 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 개재된 번역되지 않은, 전사된 서열이 프로모터 서열과 폴리뉴클레오타이드 사이에 존재할 수 있으며, 상기 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된"것으로 간주될 수 있다. 이러한 발현 벡터는 비제한적으로, 플라스미드 및 바이러스-기반 발현 벡터를 비롯하여, 당업계에 공지된 임의의 유형일 수 있다. 상기 프로모터는 항시성(constitutive)(비제한적으로, CMV, SV40, RSV, 액틴, EF를 비롯한 임의의 수많은 프로모터에 의해 구동됨) 또는 유도성(비제한적으로, 테트라사이클린, 엑디손, 스테로이드 반응성을 비롯한 다수의 유도성 프로모터에 의해 구동됨)일 수 있다. 다양한 구현예에서, 상기 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 기반 벡터 또는 임의의 다른 적합한 발현 벡터를 포함할 수 있다.

추가적 양태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하되, 상기 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 상기 세포는 본 개시내용의 발현 벡터를 편입시키기 위해 일시적으로 또는 안정적으로 조작될 수 있다. 본 개시내용에 따른 융합 단백질을 생성하는 방법은 본 개시내용의 추가적인 부분이다. 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다: (a) 상기 융합 단백질의 발현에 도움이 되는 조건 하에 본 개시내용의 이러한 양태에 따른 숙주를 배양하는 단계; 및 (b) 선택적으로, 상기 발현된 융합 단백질을 회수하는 단계. 상기 발현된 융합 단백질은 상기 무세포 추출물 또는 세포 배양 배지에서 회수될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 개시는 하기를 포함하는 키트를 제공한다:

(a) 본 개시내용의 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및/또는 상기 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포;

(b) 본 개시내용의 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 대조군 융합 단백질, 상기 대조군 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 대조군 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및/또는 상기 대조군 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.

본 양태의 키트는 예를 들어,하기 실시예에 상세히 기재된 바와 같이, 생세포에서 ATP를 검출 및 측정하기 위해 사용될 수 있다.

ATP 결합 융합 단백질

ATP 결합 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 본 개시내용의 양태에 따라 제공되되, 상기 ATP 결합 융합 단백질은 하기를 포함한다: 수용체 여기 파장 및 FRET 방출 파장을 갖는 FRET 수용체인 제1 형광단(상기 제1 형광단은 N-말단 및 C-말단을 가짐); N-말단 및 C-말단을 갖는 ATP 결합 단백질; 및 공여체 여기 파장 및 공여체 방출 파장을 갖는 FRET 공여체인 제2 형광단(상기 제2 형광단은 N-말단 및 C-말단을 가짐), 여기서 제1 링커가 상기 제1 형광단의 C-말단과 상기 ATP 결합 단백질의 N-말단 사이에 배치되고, 제2 링커가 상기 ATP 결합 단백질의 C-말단과 상기 제2 형광단의 N-말단 사이에 배치되며, 상기 ATP 결합 단백질에 의한 ATP의 결합이 공여체 여기 파장을 갖는 빛에 노출될 때 상기 제1 형광단 및 제2 형광단의 상호 작용을 야기하여 FRET 방출 신호를 생성하도록 하기 위해, 상기 제1 형광단, ATP 결합 단백질 및 제2 형광단은 작동 가능하게 연결된다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 상기 ATP 결합 융합 단백질의 제1 링커는 알라닌 잔기이고 상기 제2 링커는 알라닌 잔기이다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 상기 ATP 결합 융합 단백질의 제1 링커는 세린 잔기이고 제2 링커는 알라닌 잔기이다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 상기 ATP 결합 융합 단백질의 제1 링커는 무효(nullity)이고, 제2 링커는 페닐알라닌-페닐알라닌 디펩타이드 잔기이다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 상기 ATP 결합 융합 단백질의 제1 링커는 발린 잔기이고, 상기 제2 링커는 페닐알라닌-류신 디펩타이드 잔기이다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 상기 ATP 결합 융합 단백질의 제1 링커는 트레오닌 잔기이고, 상기 제2 링커는 글리신-트레오닌-세린-글리신 펩타이드 잔기이다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 상기 ATP 결합 융합 단백질의 제1 링커는 세린 잔기이고, 상기 제2 링커는 세린-알라닌 디펩타이드 잔기이다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 상기 ATP 결합 융합 단백질의 제2 링커는 아스파라긴 잔기가 아니거나 및/또는 아스파라긴 잔기를 포함하지 않는다.

본 개시내용의 양태에 따른 융합 단백질이 제공되되, 상기 융합 단백질은 하기를 포함한다: 수용체 여기 파장 및 FRET 발광 파장을 갖는 FRET 수용체인 제1 형광단(상기 제1 형광단은 N 말단 및 C 말단을 가짐); N-말단 및 C-말단을 갖는 ATP 결합 단백질; 및 공여체 여기 파장 및 공여체 방출 파장을 갖는 FRET 공여체인 제2 형광단(상기 제2 형광단은 N-말단 및 C-말단을 가짐), 여기서 상기 제1 링커가 상기 제1 형광단의 C-말단과 상기 ATP 결합 단백질의 N-말단 사이에 배치되고, 제2 링커가 상기 ATP 결합 단백질의 C-말단과 상기 제2 형광단의 N-말단 사이에 배치되며, ATP 결합 단백질에 의한 ATP의 결합이 공여체 여기 파장을 갖는 빛에 노출될 때 상기 제1 형광단 및 제2 형광단의 상호 작용을 야기하여 FRET 방출 신호를 생성하도록 하기 위해, 상기 제1 형광단, ATP 결합 단백질 및 제2 형광단은 작동 가능하게 연결된다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 융합 단백질을 포함하는 ATP 결합 단백질은 서열 번호: 14에 의해 인코딩된 서열 번호: 5의 ATP 결합 단백질이다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 융합 단백질을 포함하는 ATP 결합 단백질은 ATP와 결합하고 서열 번호: 5와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 치환 돌연변이, 첨가 또는 결실을 갖는 서열 번호 5의 변이체이다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 융합 단백질을 포함하는 ATP 결합 단백질은 ATP와 결합하고 높은 엄격도 혼성화 조건 하에서 서열 번호: 14에 결합하는 서열 번호 14의 변이체에 의해 인코딩되는 서열번호: 5의변이체이다.

대조군 융합 단백질

본 개시내용의 양태에 따른 대조군 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 제공되되, 상기 대조군 융합 단백질은 하기를 포함한다: 수용체 여기 파장 및 수용체 발광 파장을 갖는 FRET 수용체인 제1 형광단(상기 제1 형광단은 N-말단 및 C-말단을 가짐); N-말단 및 C-말단을 갖는 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질(상기 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질은 그것이 ATP와 결합하지 않도록 돌연변이됨); 및 공여체 여기 파장 및 공여체 방출 파장을 갖는 FRET 공여체인 제2 형광단(상기 제2 형광단은 N-말단 및 C-말단을 가짐), 여기서 제1 링커가 상기 제1 형광단의 C-말단과 상기 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질의 N-말단 사이에 배치되고, 제2 링커가 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질의 C-말단과 제2 형광단의 N-말단 사이에 배치되며, 상기 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질이 ATP와 결합하지 않기 때문에, 공여체 여기 파장을 갖는 빛에 노출될 때 상기 제1 형광단과 제2 형광단이 상호작용하여 FRET 방출 신호를 생성하는 것이 ATP의 존재와 무관한 비-특이적 배경 신호를 나타내어 대조군으로서 기능하도록 상기 제1 형광단, 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질 및 제2 형광단이 작동 가능하게 연결된다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 상기 대조군 융합 단백질의 제1 링커는 알라닌 잔기이고 제2 링커는 알라닌 잔기이다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 상기 대조군 융합 단백질의 제1 링커는 세린 잔기이고 제2 링커는 알라닌 잔기이다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 상기 대조군 융합 단백질의 제1 링커는 무효이고 제2 링커는 페닐알라닌-페닐알라닌 디펩타이드 잔기이다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 상기 대조군 융합 단백질의 제1 링커는 발린 잔기이고, 제2 링커는 페닐알라닌-류신 디펩타이드 잔기이다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 상기 대조군 융합 단백질의 제1 링커는 트레오닌 잔기이고, 제2 링커는 글리신-트레오닌-세린-글리신 펩타이드 잔기이다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 상기 대조군 융합 단백질의 제1 링커는 세린 잔기이고, 제2 링커는 세린-알라닌 디펩타이드 잔기이다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 상기 대조군 융합 단백질의 제2 링커는 아스파라긴 잔기가 아니거나 그것을 포함하지 않는다.

대조군 융합 단백질은 하기를 포함한다: 수용체 여기 파장 및 FRET 방출 파장을 갖는 FRET 수용체인 제1 형광단(상기 제1 형광단은 N-말단 및 C-말단을 가짐); N-말단 및 C-말단을 갖는 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질; 및 공여체 여기 파장 및 공여체 방출 파장을 갖는 FRET 공여체인 제2 형광단(상기 제2 형광단은 N-말단 및 C-말단을 가짐), 여기서 제1 링커가 상기 제1 형광단의 C-말단과 상기 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질의 N-말단 사이에 배치되고, 제2 링커가 상기 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질의 C-말단과 상기 제2 형광단의 N-말단 사이에 배치되며, 상기 제1 형광단, 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질 및 제2 형광단은, 상기 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질이 ATP와 결합하지 않으므로 공여체 여기 파장을 갖는 빛에 노출될 때 제1 형광단과 제2 형광단이 상호 작용하여 FRET 방출 신호를 생성하는 것이 ATP의 존재와 무관한 비특이적 배경 신호를 나타내기 때문에 대조군으로서 기능하도록, 작동 가능하게 연결된다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 대조군 융합 단백질을 포함하는 ATP 결합 단백질은 서열 번호: 16에 의해 인코딩된 서열 번호: 15의 ATP 결합 단백질이다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 대조군 융합 단백질을 포함하고 ATP와 결합하지 않는 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질은 ATP와 결합하지 않고 서열 번호 15와 비교하여,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 치환 돌연변이, 첨가 또는 결실을 갖는 서열 번호 15의 변이체이다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 융합 단백질을 포함하는 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질은 ATP와 결합하지 않고, 높은 엄격도 혼성화 조건 하에서 서열 번호: 16에 결합하는 서열 번호: 16의 변이체에 의해 인코딩되는 서열 번호: 15의 변이체이다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 본 개시내용의 양태에 따르면, 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드는 발현 벡터에 포함된다. 본 개시내용의 양태에 따르면, 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 및/또는 발현 벡터는 숙주 세포, 예컨대 비제한적으로,폴리뉴클레오타이드와 그것의 인코딩된 융합 단백질을 발현하는 안정한 형질 전환 세포주에 존재한다.

본 개시내용의 양태에 따르면, 상기 공여 형광단은 cpmEGFP이다. 본 개시내용의 양태에 따르면, 상기 수용체 형광단은 mKOk이다.

상기 FRET 공여체 형광단이 상기 ATP 결합 단백질 또는 대조군 돌연변이체 결합 단백질의 C-말단에 위치하고(ATP 결합 단백질 또는 대조군 돌연변이체 결합 단백질의 C-말단과 FRET 공여체 형광단 사이에 링커가 배치됨), 상기 FRET 수용체 형광단이 ATP 결합 단백질 또는 대조군 돌연변이체 결합 단백질의 N-말단에 위치(ATP 결합 단백질, 또는 제어 돌연변이체 결합 단백질의 N-말단과 상기 FRET 수용체 형광단 사이에 링커가 배치됨)하는 본 개시내용의 구현예가 본원에 기재되어 있지만, 상기 형광단들의 상대적 위치는, 본원에 기재된 융합 단백질이 상기 ATP 결합 단백질 또는 상기 대조군 돌연변이체 결합 단백질의 N-말단에 위치 된 FRET 공여체 형광단(상기 ATP 결합 단백질 또는 상기 대조군 돌연변이체 결합 단백질의 N-말단과 상기 FRET 공여체 형광단 사이에 링커가 배치됨)을 갖고 상기 FRET 수용체 형광단이 상기 ATP 결합 단백질 또는 대조군 돌연변이체 결합 단백질의 C-말단에 위치(상기 ATP 결합 단백질 또는 상기 대조군 돌연변이체 결합 단백질의 C-말단과 상기 FRET 수용체 형광단 사이에 링커가 배치됨)되도록 선택적으로 전환됨이 이해되어야 한다.

형광단

일반적으로, FRET 공여체/수용체 쌍의 예는, 비제한적으로, 시안 형광단백질/황색 형광단백질(CFP-YFP) FRET 쌍, 녹색 형광단백질/적색 형광단백질 (GFP-RFP) FRET 쌍, 및 다른 조합을 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 융합 단백질을 사용하여 관심대상의 세포에서 ATP의 수준을 결정하기 위한 방법을 제공한다. 상기 융합 단백질은 상기 융합 단백질에서 상기 ATP 결합 단백질에 의한 ATP의 결합이 FRET 수용체 폴리펩타이드 및 FRET 공여체 폴리펩타이드의 상호 작용을 유발하여 검출될 수 있는 빛의 방출을 야기한다는 점에서 ATP를 검출한다. 방출된 빛의 검출은 임의의 적합한 분석 또는 이미징 포맷을 통해 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 방법은 하기를 포함한다:

(i) 상기 하나 이상의 제1 세포를 상기 FRET 공여체 폴리펩타이드 여기 파장을 갖는 빛에 노출시켰을 때, 상기 하나 이상의 제1 세포에서 방출된 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드 발광 파장을 갖는 빛에 의해 생산된 형광 신호를 검출함으로써 생성된 제1 형광 이미지; 및/또는

(ii) 상기 하나 이상의 제1 세포를 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드 여기 파장을 갖는 빛에 노출시켰을 때, 상기 하나 이상의 제1 세포에서 방출된 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드 발광 파장을 갖는 빛에 의해 생산된 형광 신호를 검출함으로써 생성된 제2 형광 이미지; 및/또는

(iii) 상기 하나 이상의 제1 세포를 상기 FRET 공여체 폴리펩타이드 여기 파장을 갖는 빛에 노출시켰을 때, 상기 하나 이상의 제1 세포에서 방출된 상기 FRET 공여체 폴리펩타이드 발광 파장을 갖는 빛에 의해 생산된 형광 신호를 검출함으로써 생성된 제3 형광 이미지; 및

(b) 상기 제1 형광 이미지, 제2 형광 이미지 및/또는 제3 형광 이미지의 형광 신호의 출력을 비교함으로써 상기 하나 이상의 제1 세포에서 FRET 비율을 결정하는 단계;

여기서 상기 하나 이상의 제1 세포에서의 ATP의 수준은 결정된 FRET 비율에 비례한다.

본 구현예에서, 형광 신호의 출력을 "비교하는 것"은 하나의 이미지에서 형광 신호의 출력을 다른 이미지에서 형광 신호의 출력으로 나누는 것을 의미한다. 예를 들면 다음과 같다.

· 상기 제1 형광 이미지에서 형광 신호의 출력은 상기 제2 형광 이미지에서 형광 신호의 출력으로 나눌 수 있고;

· 상기 제1 형광 이미지에서 형광 신호의 출력은 상기 제3 형광 이미지에서 형광 신호의 출력으로 나눌 수 있고;

· 상기 제2 형광 이미지에서 형광 신호의 출력은 상기 제1 형광 이미지에서 형광 신호의 출력으로 나눌 수 있고;

· 상기 제2 형광 이미지에서 형광 신호의 출력은 상기 제3 형광 이미지에서 형광 신호의 출력으로 나눌 수 있고;

· 상기 제3 형광 이미지에서 형광 신호의 출력은 상기 제1 형광 이미지에서 형광 신호의 출력으로 나눌 수 있고; 또는

· 상기 제3 형광 이미지에서의 형광 신호의 출력은 상기 제2 형광 이미지에서 형광 신호의 출력으로 나눌 수 있다.

형광 신호의 "출력"은 임의의 적절한 기준, 예컨대 비제한적으로, 전체 영상 기준, 세포 기준당, 화소 당 기준으로, 또는 임의의 대안적인 강도 측정을 사용하여 결정될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 제1 세포에서 본 개시내용의 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 대조군 융합 단백질을 발현하는 단계 및 상기 하나 이상의 제1 세포에서 방출된 수용체 발광 파장을 갖는 빛에 의해 생성된 대조군 신호를 검출하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 결정된 FRET 비율을 보정하기 위해 대조군 신호를 사용하는 임의의 적절한 방법이 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 대조군 신호를 검출하는 단계는 하기를 포함한다:

(c) 하나 이상의 대조군 세포(예를 들어, 제1 세포 또는 제2 세포)에서 본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합의 융합 단백질을 발현하는 단계 및 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 이미지를 생성하는 단계:

(i) 상기 하나 이상의 대조군 세포를 상기 FRET 공여체 폴리펩타이드 여기 파장을 갖는 빛에 노출시켰을 때, 상기 하나 이상의 대조군 세포에서 방출된 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드 발광 파장을 갖는 빛에 의해 생산된 형광 신호를 검출함으로써 생성된 제4 형광 이미지; 및/또는

(ii) 상기 하나 이상의 대조군 세포를 상기 FRET 수용여체 폴리펩타이드 여기 파장을 갖는 빛에 노출시켰을 때, 상기 하나 이상의 대조군 세포에서 방출된 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드 발광 파장을 갖는 빛에 의해 생산된 형광 신호를 검출함으로써 생성된 제5 형광 이미지; 및/또는

(iii) 상기 하나 이상의 대조군 세포를 상기 FRET 공여체 폴리펩타이드 여기 파장을 갖는 빛에 노출시켰을 때, 상기 하나 이상의 대조군 세포에서 방출된 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드 발광 파장을 갖는 빛에 의해 생산된 형광 신호를 검출함으로써 생성된 제6 형광 이미지; 및

(d) 상기 제4 형광 이미지, 제5 형광 이미지 및/또는 제6 형광 이미지에서 형광 신호의 출력을 비교함으로써 상기 하나 이상의 대조군 세포에서 대조군 융합 FRET 비율을 결정하는 단계;

여기서 대조군 융합 FRET 비율의 변화는 ATP 결합에 무관한 실험 조건의 결과인 것으로 판단되고, 상기 결정된 FRET 비율은 상기 대조군 융합 FRET 비율의 변화에 기초하여 수정된다.

상기 하나 이상의 세포는 ATP 수준을 결정하는 것이 관심대상인 임의의 세포 또는 세포 집단일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 하나 이상의 제1 세포는 배양기의 배양물에 존재한다. 또 다른 구현예에서, 모든 이미징 단계는 배양기에서 상기 하나 이상의 제1 세포를 제거하지 않고 수행된다. 본 구현예에서, 상기 세포는 배양기 내의 적합한 세포 배양 배지에서 배양되고, 상기 배양기는 분석될 세포가 세포와 시험 물질의 접촉으로 인한 ATP의 변화 등, ATP를 검출하기 위한 분석의 관찰 및/또는 기록 동안 배양기에서 제거될 필요가 없도록 구성된다.

상기 분석은 예를 들어, 하나 이상의 시험 화합물이 관심대상 세포에서의 ATP의 수준에 미치는 영향을 검사하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 하나 이상의 제1 세포를 하나 이상의 시험 물질과 접촉시키는 단계 및 상기 하나 이상의 제1 세포에서 하나 이상의 시험 물질이 ATP의 존재에 미치는 영향을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 하나 이상의 제1 세포에서 하나 이상의 시험 물질이 ATP의 존재에 미치는 영향은 임의의 관심 시간에 걸쳐, 예컨대 비제한적으로, 1 분 내지 3개월의 범위의 시간에 걸쳐 연속적으로 또는 간헐적으로 결정될 수 있다.

세포내 ATP의 생세포 분석을 위한 신진 대사 시스템을 위한 IncuCyte^® S3 생세포 분석

본 개시의 임의의 방법에 사용될 수 있는 IncuCyte^®S3 하드웨어는 2가지 구성성분으로 구성된다: 1) 갠트리 및 2) 제어기. 상기 갠트리는 생세포 배양의 자동 이미지 획득을 가능하게 하는 현미경, 카메라 및 소모품 트레이를 수용하며 표준 조직 배양 배양기 내부에 설치된다. ATP 적용에서, 현미경 시스템은 원하는 스펙트럼(또는 여러 스펙트럼)에서 형광 이미지를 수집하도록 맞춤화된 필터 모듈을 포함한다. 상기 제어기는 이미지 저장, 데이터 처리, 데이터베이스 저장, 파일 시스템, 자동화된 이미지 처리, 그래픽 및 GUI(그래픽 사용자 인터페이스)를 통한 클라이언트 컴퓨터의 네트워크 간 상호 작용을 가능하게 하는 프로세서, 메모리 및 데이터 저장 드라이브를 포함한다. 제어기의 소프트웨어는 하기의 두 가지 용도로 사용된다: 1) 서버 상호 작용 및 2) 기기 제어.

상기 갠트리는 배양기에 설치되며 현미경과 카메라를 수용한다. 상기 제어기는 현미경 시스템을 제어하고 서버로 작동한다. 상기 제어기는 통신 포트, 예컨대 비제한적으로, 이더넷 포트에 연결된다. 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)는 컴퓨터에 로드되어 상기 제어기(즉, 서버)와 상호 작용하여 현미경 시스템을 제어하고 데이터와 상호 작용한다. 모든 자동화된 이미지 처리가 본 발명의 양태에 따른 제어기 상에서 완료된다.

자동화된 이미지 캡처

Incucyte^® S3 현미경은 비제한적으로 96-웰 플레이트와 같은 세포 배양 용기의 사용자 지정 위치로 이동하고, 적절한 LED를 켜고 원하는 현미경 대물 렌즈를 사용하여 원하는 노출 시간에(예컨대 10x 대물렌즈을 사용하여 700ms에) 이미지를 캡처한다.

하기 데이터는 대상체, 예를 들어 세포, ATP 존재 및/또는 수준, 및/또는 하나 이상의 추가적인 측정항목(단독으로 또는 조합하여)의 영상화에서 도출되고, 각각의 대상물, 각각의 웰 또는 각각의 웰 세트에 대해 계산되고, 데이터베이스에 저장되고, 그래픽 사용자 인터페이스를 통해 클라이언트 컴퓨터에서 데이터를 수집 한 직후 사용자에게 표시된다.

전형적으로 웰은 2 시간마다 스캔되지만, 더 많거나 더 적은 스캔은 선택사항이다. 각 스캔 후에는, 해당 시점에 측정항목(metrics)이 계산되어, 예를 들어 데이터베이스에 저장된다. 예를 들어, 3 일 동안의 실험 과정에서, 각 측정 항목에 대해 36 개의 시점이 수집되고, 시계열로 연결되며, 전체 실험 시간 프레임, 즉 분, 시간, 일, 주, 개월의 과정에 걸쳐 그래프로 그려질 수 있다.

본원에 기술된 바와 같이, 본 개시내용의 시스템 및 방법을 통해 사용자는 자동화된 적당한 처리량 방법으로 장기간에 걸쳐 ATP의 존재 및/또는 수준의 변화를 모니터링할 수 있다. 대조적으로, 이전의 방법들은 다음과 같다: 1) 종말점 방법(다양한 측정된 매개 변수들 중 하나 또는 제한된 판독 값만 얻을 수 있음), 2) 극도로 파괴적인 방법, 3) 분석/시각화를 위해 사용자가 세포를 배양기 밖으로 이동시켜야 함, 4) 세포 수에 의존, 5) ATP 생산의 간접 측정, 및/또는 6) 낮은 처리량(한 번에 웰 하나, 수동).

본 개시내용의 조성물 및 방법의 구현예가 하기 실시예에 묘사되어 있다. 이러한 실시예들은 예시적인 목적을 위해 제공되며, 청구된 조성물 및 방법의 범위를 제한하는 것으로 간주되지 않는다.

실시예 1.

링커 스크리닝

링커 영역의 최적화를 위해 약 14,000 개의 다양하고 독특한 돌연변이체가 있는 라이브러리를 선별했다. 간략하게, 상기 선별은 특정 돌연변이가 발현된 박테리아 세포에서 완료하였다. 광학적 방법을 사용하여 15,000개가 넘는 개별 콜로니의 밝기 및 FRET 비율을 평가했다. 이들 15,000 개 이상의 콜로니 중, ATP 결합 상태 및 미결합 상태 둘 다에서 측정이 이루어질 수 있도록 단백질 용해물을 사용한 추가적인 평가를 위해 400개를 선별하였다. 유전자 시퀀싱을 위해 12 개의 잠재적 콜로니를 선택하여, 포유 동물 발현 벡터로 클로닝하고 일시적 형질 감염 실험에 사용하였다. 이들 작제물을 발현하는 세포를 세포내 ATP의 양을 감소시키는 것으로 알려진 약물로 처리하였다. 처리 후 2 시간에 비히클-처리 세포의 FRET 비율에서 약물-처리 세포의 FRET 비율을 차감하여 신호창을 계산하였다. 결과를 도 1에 나타내었다. 오차 막대는 SEM, n = 3이다. A1 및 GO-ATeam1의 양측 P 값은 0.0084 (무쌍 t 검정)와 같다.

검사된 링커 서열은 하기 표 3에 나타내었다:

작제물 A1 및 Go-ATeam1을 안정적으로 발현하는 세포주를 생성하였다. 즉, 세포를 렌티바이러스 형질 도입을 통해 감염시키고 항생제 선별 마커를 사용하여 선택하여 안정한 세포주를 생성하였다. 세포를 2.5μM 스타우로스포린으로 처리하여 ATP를 증가시키고 40mM 2-데옥시-D-글루코오스(2-DG) 및 4mM 시안화 칼륨(KCN)을 조합하여 ATP를 고갈시켰다. 센서 A1을 발현하는 세포에서의 신호창은 Go-ATeam1- 발현 세포주에서의 신호창의 대략 2 배였다(도 2a~b).

정제된 단백질을 10mM ATP의 존재 또는 부재 하에 배양하고, 여기 스펙트럼을 수집하였다(도 3a 및 3b). ATP-처리 단백질과 미처리 단백질의 스펙트럼의 차이는 신호 창을 나타낸다. 센서 A1 (GO-ATeam-A1)의 성능(도 3a)은 GO-ATeam1 센서의 성능(도 3b)와 비교할 때, 신호창에서 2 배 이상의 증가를 묘사한다(ATP 결합 상태(실선)를 ATP 미결합 상태(점선)와 비교함).　

실시예 2

글루코오스/갈락토오스 스위치 모델을 이용하여 시험 물질을 비독성, 세포 독성, 또는 미토독성으로 분류하는 생세포 이미징 방법은 생세포에서 ATP를 분석하는 본 개시내용의 양태에 따른 방법 및 조성물을 사용하여 평가 하였다. 성장 배지에서 글루코오스를 갈락토오스로 대체하면 세포가 당분해를 통해 ATP를 생성하는 능력을 차단되어, ATP를 생성하기 위한 미토콘드리아 산화 인산화에 대한 의존성을 부여하고 미토콘드리아에 의한 독성에 대한 민감성을 증진시킨다(L.D. Marroquin et al., Toxicol Sci 97(2), 539-547 (2007)). 검사 물질 처리 후 최대 24 시간까지 세포질 ATP 수준을 측정하였다. 무독성 시험 물질은 ATP에서 거의 또는 전혀 변화를 일으키지 않았으며, 세포 독성 시험 물질은 글루코오스 및 갈락토오스 조건 모두에서 ATP의 감소를 부여했으며, 미토독성 시험 물질은 갈락토오스 조건 하에서 효능의 왼쪽 이동을 나타내었다. ATP의 감소는 몇 분 내에 관찰될 수 있고, 일시적인 감소에 이어 회복은 하기에 보다 상세히 기술되는 바와 같이 본 개시내용의 양태에 따른 조성물 및 방법을 사용하는 생세포 이미징 접근법을 사용하여 운동 데이터의 감도 및 값을 강조한다.

ATP 센서 발현 세포주의 생성

렌티 바이러스 형질 도입에 의해 사이토ATP(ATP-결합) 및 대조군(돌연변이 ATP-결합 도메인) 센서를 안정적으로 발현하는 세포주를 생성하였다. 바이시스트론(bicistronic) 발현 카세트를 포함하는 제3세대 시스템을 사용하여 상기 센서를 발현하였다. 구체적으로, EF-1 알파 프로모터를 사용하여 상기 센서 및, 개재 IRES 서열을 사용하는 푸로마이신 선택 마커의 발현을 유도하였다. 렌티 바이러스 감염 전날, 6-웰 플레이트에 세포를 50,000세포/웰로 시딩하였다. 8㎍/mL 폴리브렌의 존재 하에, 세포를 사이토ATP 또는 대조군 렌티 바이러스에 노출시켰다. 24 시간 후, 배지를 폴리브렌이 없는 배지로 교체 하였다. 세포를 한 번 계대시킨 후, 푸로마이신 선택을 수행하여 사이토ATP 또는 대조군 센서를 발현하는 안정된, 균질한 세포 집단을 생성하였다.

세포 배양물

ATCC^®　(CRL-1658™)에서 세포를 구입하여 37℃의 습도 5% CO₂ 대기 하에 보관하였다. 세포를 글루코오스 없는 DMEM(Gibco)에 25mM의 글루코오스, 1 mM 피루브산 나트륨, 5 mM HEPES, 10% FBS, 1% GlutaMax 및 1% Pen/Strep을 보충하여 배양하였다. 전술한 바와 같이 갈락토오스 배지를 준비하였다(단, 글루코오스를 10mM 갈락토오스로 대체함). 갈락토오스 적응을 위해, 세포를 글루코오스-함유 DMEM으로 분할하고, 계대배양 후 2 일차에 갈락토오스 배지로 옮긴 다음, 실험이 시작되기 전에 갈락토오스 배지에서 2회 더 계대배양하였다.

ATP 분석

특수 FRET 기반 필터 세트 및 데이터 수집 모듈이 장착된 IncuCyte® S3으로 ATP의 측정을 수행하였다. 상기 세포ATP 센서는 ATP-결합 도메인에 의해 연결된 FRET 공여체(cpmEGFP) 및 FRET 수용체(mKOk)로 구성된 유전적으로 인코딩된 지표이다. ATP 결합 시, FRET의 증가가 유도되었다. 상기 대조군 센서는 돌연변이체 ATP 바인딩 도메인을 함유하였고, 정규화를 위한 영점을 제공하고 FRET 신호 판독에 영향을 미치는 모든 물품(artifact)을 모니터링하고 수정하는 데 사용하였다. 이중 여기 비율 이미징을 사용하여 센서 측정을 수행하였다. 특정 예에서, 상기 수용체 형광단 mKOk(567~589nm)의 형광 방출을 공여체 형광단 cpmEGFP (475~495nm, FRET 측정)의 여기 또는 상기 수용체 형광단 mKOk(524~546nm, 총 단백질의 측정)의 직접 여기 후에 수집하였다. 직접 mKOk 여기에서 수집한 형광 이미지의 임계 값으로 세포 분석 마스크를 생성하였다. 이 마스크는 또한 상기 FRET 채널에서 수집한 보완 이미지에도 적용하였다. 상대적 ATP 수준을, cpmEGFP 여기로 수집한 이미지에서 측정한 총 통합 강도를 mKOk 여기로 수집한 이미지에서 측정한 이미지로 나눈 값으로 계산하여, cpmEGFP/mKOk 여기 비율로 보고하였다.

농도-반응 곡선을 생성하기 위해, 각 처리에 대한 데이터를 수정하고 다음 방정식을 사용하여 주어진 시점에서 비히클 대조군으로 정규화했다:

도 4a: 표준 배지에서 성장한 세포에서, 각각 2DG 및 KCN에 의한 당분해 및 OXPHOS의 동시 억제를 통한 ATP 고갈. 데이터는 2DG 및 KCN 동시 처리의 ATP 고갈의 시간 경과 및 농도 의존성을 입증한다. 도 4b 및 4c는 글루코오스 또는 갈락토오스 배지에서 성장한 세포에서 세포 독성(클로르프로마진,도 4b) 및 미토독성(로테논,도 4c) 화합물의 비교를 보여준다. 처음 2 개의 패널은 표시된 바와 같이, 글루코오스 또는 갈락토오스에서 성장한 세포에 24 시간 시간 경과에 따른 각 화합물이 미치는 효과를 도시한다. 세 번째 패널은 24 시간 시점에서 각 화합물의 농도-반응 곡선을 나타낸다. 세포 독성 화합물은 두 가지 배지 조건 하에서 유사한 효과를 나타내는 반면, 미토 독성 화합물은 갈락토오스에서 성장한 세포에서 더 큰 ATP 고갈을 유도한다.

실시예 3

재료 및 방법

유전적으로 암호화된 형광 ATP 센서 또는 대조군(비-ATP 결합) 센서를 안정적으로 발현하는 암 세포주를 생성하였다. 세포가 실험 전에 10% FBS가 보충 된 RPMI에 적응된 권장 배지 조건(단, 글루타미나제-1(GLS1) 억제제 CB-839의 효과를 평가하는 연구를 제외)에서 배양하였다. 특수 필터 세트 및 데이터 수집 모듈이 장착된 IncuCyte® S3를 사용하여 ATP 수준을 모니터링하고 분석했다. 세포 ATP 수준은 화합물 처리 후 수 시간 내지 수일에 걸쳐 측정되었다.

데이터 요약

이어서, 생세포 이미징 접근법을 이용하여 주로 대사성 취약성을 표적으로 하는 화합물에 중점을 둔, 종양 세포주에서 암 치료제가 ATP 수준에 미치는 효과를 평가했다. 예를 들어, 삼중음성 유방암(TNBC) 세포주는, 수용체-양성 상대보다, GLS1의 활성에 더 의존적인 것(이것이 미토콘드리아 대사에 연료를 공급하기 위한 글루타민 활용의 첫 번째 단계를 촉진함)으로 나타났다. 상기 생세포 분석 접근법을 사용하여, TNBC 세포주에서 CB-839에 의한 글루타민 박탈 또는 GLS1의 억제 시 ATP의 급격한 감소가 관찰되었다. ATP 수준은 3일이라는 기간 동안 비히클-처리된 세포의 값보다 낮게 유지되었다. 대조적으로, 수용체-양성 세포주의 반응은 48 시간 이내에 ATP의 변화 없음에서 ATP의 좀 더 완만한 감소 및 완전한 회복에 이르렀다. 상 합류(phase confluence)의 정량화는, ATP 수준의 회복이 관찰된 조건과 비교하여 ATP의 지속적인 감소가 향상된 항증식 효능과 관련이 있음을 확인시켜 주었다. 기질 세포와 공동 배양된 종양 세포에서 시간경과에 따른 대사 동요를 측정하는 ATP 센서의 능력을 입증하는 추가 데이터를 획득하였다. CCD-1068Sk 섬유 아세포로 단층에서 배양된 TNBC는, ATP 수준에 대한 감소된 효과에 의해 측정된 바와 같이, CB-839 처리에 대한 저항성을 나타냈다(도 5a). 대조적으로, CB-839 처리 후 ATP 수준의 일시적 감소를 나타낸 수용체-양성 유방암 세포주의 결과는 CCD-1068Sk 섬유 아세포의 존재에 의해 영향을 받지 않았다(도 5b).

실시예 4

렌티바이러스 형질 도입을 사용하여 Go-ATeamA1을 발현하는 원발성 및 iPSC-유도 뉴런을 생성하였다. 시냅신 프로모터로 발현을 유도하였고, 상기 발현은 렌티 바이러스가 뉴런 및 성상 세포 공동 배양물로 전이되자 뉴런으로 제한되었다. 조합된 2DG 및 KCN으로 처리된 뉴런은 FRET 비율의 감소에 의해 나타난 바와 같이 ATP에서 농도-의존적 고갈로 반응하였다. 이들 반응은 다른 포유 동물 세포(예: 암 세포주,도 4a)에서의 2DG 및 KCN 조합 처리 후 관찰된 것과 비교할 만하였다.

서열

서열 번호: 5-ATP 결합 단백질

MKTVKVNITTPDGPVYDADIEMVSVRAESGDLGILPGHIPTKAPLKIGAVRLKKDGQTEMVAVSGGTVEVRPDHVTINAQAAETAEGIDKERAEAARQRAQERLNSQSDDTDIRRAELALQRALNRLDVAGK

서열 번호 14 : 서열 번호: 1의 ATP 결합 단백질을 인코딩하는 DNA 서열

ATGAAAACTGTGAAAGTGAATATAACAACCCCTGATGGGCCAGTCTACGACGCTGATATCGAGATGGTGTCCGTGCGGGCCGAGAGTGGTGATCTCGGCATCCTCCCCGGTCACATTCCCACAAAGGCCCCACTGAAGATCGGAGCTGTGCGGCTGAAGAAGGACGGCCAAACCGAGATGGTCGCAGTCTCAGGCGGCACTGTTGAAGTGCGGCCTGACCACGTTACCATTAATGCTCAAGCCGCTGAAACAGCCGAAGGAATCGACAAAGAGAGAGCAGAAGCCGCAAGACAGAGGGCCCAGGAGCGGCTGAACTCTCAATCCGATGACACCGATATTCGCCGGGCCGAGCTGGCACTGCAGAGGGCCCTGAACAGACTGGACGTGGCTGGGAAG

서열 번호 15 : ATP와 결합하지 않는 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질

MKTVKVNITTPDGPVYDADIEMVSVRAESGDLGILPGHIPTKAPLKIGAVRLKKDGQTEMVAVSGGTVEVRPDHVTINAQAAETAEGIDKERAEAARQRAQERLNSQSDDTDIRRAELALQKALNKLDVAGK

서열 번호: 16 - 서열 번호: 3의 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질을 인코딩하는 DNA 서열

ATGAAAACTGTGAAAGTGAATATAACAACCCCTGATGGGCCAGTCTACGACGCTGATATCGAGATGGTGTCCGTGCGGGCCGAGAGTGGTGATCTCGGCATCCTCCCCGGTCACATTCCCACAAAGGCCCCACTGAAGATCGGAGCTGTGCGGCTGAAGAAGGACGGCCAAACCGAGATGGTCGCAGTCTCAGGCGGCACTGTTGAAGTGCGGCCTGACCACGTTACCATTAATGCTCAAGCCGCTGAAACAGCCGAAGGAATCGACAAAGAGAGAGCAGAAGCCGCAAGACAGAGGGCCCAGGAGCGGCTGAACTCTCAATCCGATGACACCGATATTCGCCGGGCCGAGCTGGCACTGCAGAAGGCCCTGAACAAGCTGGACGTGGCTGGGAAG

GO-ATeam-A1

서열 번호: 17- mKOk 형광단백질(뉴클레오타이드 1~654), 제1 알라닌 링커(뉴클레오타이드 655~657), ATP 결합 단백질(뉴클레오타이드 658~1053), 제2 알라닌 링커(뉴클레오타이드 1054~1056) 및 cpmEGFP 형광단백질(뉴클레오타이드 1057-1794)을 인코딩하는 DNA 서열

ATGGTGAGTGTGATTAAACCAGAGATGAAGATGAGGTACTACATGGACGGCTCCGTCAATGGGCATGAGTTCACAATTGAAGGTGAAGGCACAGGCAGACCTTACGAGGGACATCAAGAGATGACACTACGCGTCACAATGGCCGAGGGCGGGCCAATGCCTTTCGCGTTTGACTTAGTGTCACACGTGTTCTGTTACGGCCACAGAGTATTTACTAAATATCCAGAAGAGATACCAGACTATTTCAAACAAGCATTTCCTGAAGGCCTGTCATGGGAAAGGTCGTTGGAGTTCGAAGATGGTGGGTCCGCTTCAGTCAGTGCGCATATAAGCCTTAGAGGAAACACCTTCTACCACAAATCCAAATTTACTGGGGTTAACTTTCCTGCCGATGGTCCTATCATGCAAAACCAAAGTGTTGATTGGGAGCCATCAACCGAGAAAATTACTGCCAGCGACGGAGTTCTGAAGGGTGATGTTACGATGTACCTAAAACTTGAAGGAGGCGGCAATCACAAATGCCAATTCAAGACTACTTACAAGGCGGCAAAAGAGATTCTTGAAATGCCAGGAGACCATTACATCGGCCATCGCCTCGTCAGGAAAACCGAAGGCAACATTACTGAGCAGGTAGAAGATGCAGTAGCTCATTCCGCTATGAAAACTGTGAAAGTGAATATAACAACCCCTGATGGGCCAGTCTACGACGCTGATATCGAGATGGTGTCCGTGCGGGCCGAGAGTGGTGATCTCGGCATCCTCCCCGGTCACATTCCCACAAAGGCCCCACTGAAGATCGGAGCTGTGCGGCTGAAGAAGGACGGCCAAACCGAGATGGTCGCAGTCTCAGGCGGCACTGTTGAAGTGCGGCCTGACCACGTTACCATTAATGCTCAAGCCGCTGAAACAGCCGAAGGAATCGACAAAGAGAGAGCAGAAGCCGCAAGACAGAGGGCCCAGGAGCGGCTGAACTCTCAATCCGATGACACCGATATTCGCCGGGCCGAGCTGGCACTGCAGAGGGCCCTGAACAGACTGGACGTGGCTGGGAAGGCTGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCAAGCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGTGGCAGCGGTGGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGAAGCT

서열 번호: 7 - 서열 번호: 17에 의해 인코딩된 융합 단백질, 예컨대 mKOk 형광단백질(아미노산 1~218), 제1 알라닌 링커(아미노산 219), ATP 결합 단백질(아미노산 220~351), 제2 알라닌 링커(아미노산 352) 및 cpmEGFP 형광단백질 (아미노산 352~598)

MVSVIKPEMKMRYYMDGSVNGHEFTIEGEGTGRPYEGHQEMTLRVTMAEGGPMPFAFDLVSHVFCYGHRVFTKYPEEIPDYFKQAFPEGLSWERSLEFEDGGSASVSAHISLRGNTFYHKSKFTGVNFPADGPIMQNQSVDWEPSTEKITASDGVLKGDVTMYLKLEGGGNHKCQFKTTYKAAKEILEMPGDHYIGHRLVRKTEGNITEQVEDAVAHSAMKTVKVNITTPDGPVYDADIEMVSVRAESGDLGILPGHIPTKAPLKIGAVRLKKDGQTEMVAVSGGTVEVRPDHVTINAQAAETAEGIDKERAEAARQRAQERLNSQSDDTDIRRAELALQRALNRLDVAGKADGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGGSGGMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEEA

GO-ATeam-A1 대조군

서열 번호: 18 - mKOk 형광단백질(뉴클레오타이드 1~654), 제1 알라닌 링커 (뉴클레오타이드 655~657), ATP와 결합하지 않도록 돌연변이된 대조군 ATP 결합 단백질(뉴클레오타이드 658~1053), 제2 알라닌 링커(뉴클레오타이드 1054~1056) 및 cpmEGFP 형광단백질(뉴클레오타이드 1057~1794)을 인코딩하는 DNA

ATGGTGAGTGTGATTAAACCAGAGATGAAGATGAGGTACTACATGGACGGCTCCGTCAATGGGCATGAGTTCACAATTGAAGGTGAAGGCACAGGCAGACCTTACGAGGGACATCAAGAGATGACACTACGCGTCACAATGGCCGAGGGCGGGCCAATGCCTTTCGCGTTTGACTTAGTGTCACACGTGTTCTGTTACGGCCACAGAGTATTTACTAAATATCCAGAAGAGATACCAGACTATTTCAAACAAGCATTTCCTGAAGGCCTGTCATGGGAAAGGTCGTTGGAGTTCGAAGATGGTGGGTCCGCTTCAGTCAGTGCGCATATAAGCCTTAGAGGAAACACCTTCTACCACAAATCCAAATTTACTGGGGTTAACTTTCCTGCCGATGGTCCTATCATGCAAAACCAAAGTGTTGATTGGGAGCCATCAACCGAGAAAATTACTGCCAGCGACGGAGTTCTGAAGGGTGATGTTACGATGTACCTAAAACTTGAAGGAGGCGGCAATCACAAATGCCAATTCAAGACTACTTACAAGGCGGCAAAAGAGATTCTTGAAATGCCAGGAGACCATTACATCGGCCATCGCCTCGTCAGGAAAACCGAAGGCAACATTACTGAGCAGGTAGAAGATGCAGTAGCTCATTCCGCTATGAAAACTGTGAAAGTGAATATAACAACCCCTGATGGGCCAGTCTACGACGCTGATATCGAGATGGTGTCCGTGCGGGCCGAGAGTGGTGATCTCGGCATCCTCCCCGGTCACATTCCCACAAAGGCCCCACTGAAGATCGGAGCTGTGCGGCTGAAGAAGGACGGCCAAACCGAGATGGTCGCAGTCTCAGGCGGCACTGTTGAAGTGCGGCCTGACCACGTTACCATTAATGCTCAAGCCGCTGAAACAGCCGAAGGAATCGACAAAGAGAGAGCAGAAGCCGCAAGACAGAGGGCCCAGGAGCGGCTGAACTCTCAATCCGATGACACCGATATTCGCCGGGCCGAGCTGGCACTGCAGAAGGCCCTGAACAAGCTGGACGTGGCTGGGAAGGCTGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCAAGCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGTGGCAGCGGTGGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGAAGCT

서열 번호: 19-서열 번호: 18에 의해 인코딩된 융합 단백질, 예컨대 mKOk 형광단백질(아미노산 1~218), 제1 알라닌 링커(아미노산 219), ATP와 결합하지 않는 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질(아미노산 220~351), 제2 알라닌 링커(아미노산 352) 및 cpmEGFP 형광단백질(아미노산 352~598)

MVSVIKPEMKMRYYMDGSVNGHEFTIEGEGTGRPYEGHQEMTLRVTMAEGGPMPFAFDLVSHVFCYGHRVFTKYPEEIPDYFKQAFPEGLSWERSLEFEDGGSASVSAHISLRGNTFYHKSKFTGVNFPADGPIMQNQSVDWEPSTEKITASDGVLKGDVTMYLKLEGGGNHKCQFKTTYKAAKEILEMPGDHYIGHRLVRKTEGNITEQVEDAVAHSAMKTVKVNITTPDGPVYDADIEMVSVRAESGDLGILPGHIPTKAPLKIGAVRLKKDGQTEMVAVSGGTVEVRPDHVTINAQAAETAEGIDKERAEAARQRAQERLNSQSDDTDIRRAELALQKALNKLDVAGKADGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGGSGGMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEEA

각 개별 공보가 구체적으로 및 개별적으로 참고로 인용되었음이 표시된 것과 마찬가지로, 본 명세서에서 언급된 모든 특허 또는 공보가 동일한 정도로 본원에 참고로 인용되었다.

본원에 기재된 조성물 및 방법은 현재 바람직한 구현예를 나타내는 예시로, 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 그것의 변경 및 다른 용도가 당업자에게 발생할 것이다. 이러한 변경 및 다른 용도는 청구 범위에 명시된 본 개시내용의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다.

<110> Essen BioScience, Inc. d/b/a Essen BioScience, Inc. Appledorn, Daniel Schramm, Cicely Filonov, Grigory Schroeder, Kirk S. <120> Methods and Compositions for Live Cell Analysis of Intracellular ATP <130> 18-1221-PCT <150> 62/640983 <151> 2018-03-09 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (217)..(218) <223> optionally absent <400> 1 Met Val Ser Val Ile Lys Pro Glu Met Lys Met Arg Tyr Tyr Met Asp 1 5 10 15 Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Thr Ile Glu Gly Glu Gly Thr Gly 20 25 30 Arg Pro Tyr Glu Gly His Gln Glu Met Thr Leu Arg Val Thr Met Ala 35 40 45 Glu Gly Gly Pro Met Pro Phe Ala Phe Asp Leu Val Ser His Val Phe 50 55 60 Cys Tyr Gly His Arg Val Phe Thr Lys Tyr Pro Glu Glu Ile Pro Asp 65 70 75 80 Tyr Phe Lys Gln Ala Phe Pro Glu Gly Leu Ser Trp Glu Arg Ser Leu 85 90 95 Glu Phe Glu Asp Gly Gly Ser Ala Ser Val Ser Ala His Ile Ser Leu 100 105 110 Arg Gly Asn Thr Phe Tyr His Lys Ser Lys Phe Thr Gly Val Asn Phe 115 120 125 Pro Ala Asp Gly Pro Ile Met Gln Asn Gln Ser Val Asp Trp Glu Pro 130 135 140 Ser Thr Glu Lys Ile Thr Ala Ser Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Val 145 150 155 160 Thr Met Tyr Leu Lys Leu Glu Gly Gly Gly Asn His Lys Cys Gln Phe 165 170 175 Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Ala Lys Glu Ile Leu Glu Met Pro Gly Asp 180 185 190 His Tyr Ile Gly His Arg Leu Val Arg Lys Thr Glu Gly Asn Ile Thr 195 200 205 Glu Gln Val Glu Asp Ala Val Ala His Ser 210 215 <210> 2 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (216)..(217) <223> optionally absent <400> 2 Met Ser Val Ile Lys Pro Glu Met Lys Met Arg Tyr Tyr Met Asp Gly 1 5 10 15 Ser Val Asn Gly His Glu Phe Thr Ile Glu Gly Glu Gly Thr Gly Arg 20 25 30 Pro Tyr Glu Gly His Gln Glu Met Thr Leu Arg Val Thr Met Ala Lys 35 40 45 Gly Gly Pro Met Pro Phe Ala Phe Asp Leu Val Ser His Val Phe Cys 50 55 60 Tyr Gly His Arg Pro Phe Thr Lys Tyr Pro Glu Glu Ile Pro Asp Tyr 65 70 75 80 Phe Lys Gln Ala Phe Pro Glu Gly Leu Ser Trp Glu Arg Ser Leu Glu 85 90 95 Phe Glu Asp Gly Gly Ser Ala Ser Val Ser Ala His Ile Ser Leu Arg 100 105 110 Gly Asn Thr Phe Tyr His Lys Ser Lys Phe Thr Gly Val Asn Phe Pro 115 120 125 Ala Asp Gly Pro Ile Met Gln Asn Gln Ser Val Asp Trp Glu Pro Ser 130 135 140 Thr Glu Lys Ile Thr Ala Ser Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Val Thr 145 150 155 160 Met Tyr Leu Lys Leu Glu Gly Gly Gly Asn His Lys Cys Gln Phe Lys 165 170 175 Thr Thr Tyr Lys Ala Ala Lys Lys Ile Leu Lys Met Pro Gly Ser His 180 185 190 Tyr Ile Ser His Arg Leu Val Arg Lys Thr Glu Gly Asn Ile Thr Glu 195 200 205 Leu Val Glu Asp Ala Val Ala His Ser 210 215 <210> 3 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(5) <223> optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (217)..(218) <223> optionally absent <400> 3 Met Val Ser Val Ile Lys Pro Glu Met Lys Met Arg Tyr Tyr Met Asp 1 5 10 15 Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Thr Ile Glu Gly Glu Gly Thr Gly 20 25 30 Arg Pro Tyr Glu Gly His Gln Glu Met Thr Leu Arg Val Thr Met Ala 35 40 45 Glu Gly Gly Pro Met Pro Phe Ala Phe Asp Leu Val Ser His Val Phe 50 55 60 Cys Tyr Gly His Arg Val Phe Thr Lys Tyr Pro Glu Glu Ile Pro Asp 65 70 75 80 Tyr Phe Lys Gln Ala Phe Pro Glu Gly Leu Ser Trp Glu Arg Ser Leu 85 90 95 Glu Phe Glu Asp Gly Gly Ser Ala Ser Val Ser Ala His Ile Ser Leu 100 105 110 Arg Gly Asn Thr Phe Tyr His Lys Ser Lys Phe Thr Gly Val Asn Phe 115 120 125 Pro Ala Asp Gly Pro Ile Met Gln Asn Gln Ser Val Asp Trp Glu Pro 130 135 140 Ser Thr Glu Lys Ile Thr Ala Ser Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Val 145 150 155 160 Thr Met Tyr Leu Lys Leu Glu Gly Gly Gly Asn His Lys Cys Gln Met 165 170 175 Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Ala Lys Glu Ile Leu Glu Met Pro Gly Asp 180 185 190 His Tyr Ile Gly His Arg Leu Val Arg Lys Thr Glu Gly Asn Ile Thr 195 200 205 Glu Gln Val Glu Asp Ala Val Ala His Ser 210 215 <210> 4 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(2) <223> optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (34) <223> Xaa is A or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (245)..(246) <223> optionally absent <400> 4 Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile 1 5 10 15 Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln 20 25 30 Ser Xaa Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu 35 40 45 Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu 50 55 60 Tyr Lys Gly Gly Ser Gly Gly Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe 65 70 75 80 Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly 85 90 95 His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly 100 105 110 Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro 115 120 125 Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser 130 135 140 Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met 145 150 155 160 Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly 165 170 175 Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val 180 185 190 Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile 195 200 205 Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile 210 215 220 Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg 225 230 235 240 His Asn Ile Glu Glu Ala 245 <210> 5 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> optionally absent <400> 5 Met Lys Thr Val Lys Val Asn Ile Thr Thr Pro Asp Gly Pro Val Tyr 1 5 10 15 Asp Ala Asp Ile Glu Met Val Ser Val Arg Ala Glu Ser Gly Asp Leu 20 25 30 Gly Ile Leu Pro Gly His Ile Pro Thr Lys Ala Pro Leu Lys Ile Gly 35 40 45 Ala Val Arg Leu Lys Lys Asp Gly Gln Thr Glu Met Val Ala Val Ser 50 55 60 Gly Gly Thr Val Glu Val Arg Pro Asp His Val Thr Ile Asn Ala Gln 65 70 75 80 Ala Ala Glu Thr Ala Glu Gly Ile Asp Lys Glu Arg Ala Glu Ala Ala 85 90 95 Arg Gln Arg Ala Gln Glu Arg Leu Asn Ser Gln Ser Asp Asp Thr Asp 100 105 110 Ile Arg Arg Ala Glu Leu Ala Leu Gln Arg Ala Leu Asn Arg Leu Asp 115 120 125 Val Ala Gly Lys 130 <210> 6 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> optionally absent <400> 6 Met Lys Thr Val Lys Val Asn Ile Thr Thr Pro Asp Gly Pro Val Tyr 1 5 10 15 Asp Ala Asp Ile Glu Met Val Ser Val Arg Ala Glu Ser Gly Asp Leu 20 25 30 Gly Ile Leu Pro Gly His Ile Pro Thr Lys Ala Pro Leu Lys Ile Gly 35 40 45 Ala Val Arg Leu Lys Lys Asp Gly Gln Thr Glu Tyr Val Ala Val Ser 50 55 60 Gly Gly Thr Val Glu Val Arg Pro Asp His Val Thr Ile Asn Ala Gln 65 70 75 80 Ala Ala Glu Thr Ala Glu Gly Ile Asp Lys Glu Arg Ala Glu Ala Ala 85 90 95 Arg Gln Arg Ala Gln Glu Arg Leu Asn Ser Gln Ser Asp Asp Thr Asp 100 105 110 Ile Arg Arg Ala Glu Leu Ala Leu Gln Arg Ala Leu Asn Arg Leu Asp 115 120 125 Val Ala Glu Met Lys 130 <210> 7 <211> 598 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> 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Gly Asp 180 185 190 His Tyr Ile Gly His Arg Leu Val Arg Lys Thr Glu Gly Asn Ile Thr 195 200 205 Glu Gln Val Glu Asp Ala Val Ala His Ser Ala Met Lys Thr Val Lys 210 215 220 Val Asn Ile Thr Thr Pro Asp Gly Pro Val Tyr Asp Ala Asp Ile Glu 225 230 235 240 Met Val Ser Val Arg Ala Glu Ser Gly Asp Leu Gly Ile Leu Pro Gly 245 250 255 His Ile Pro Thr Lys Ala Pro Leu Lys Ile Gly Ala Val Arg Leu Lys 260 265 270 Lys Asp Gly Gln Thr Glu Met Val Ala Val Ser Gly Gly Thr Val Glu 275 280 285 Val Arg Pro Asp His Val Thr Ile Asn Ala Gln Ala Ala Glu Thr Ala 290 295 300 Glu Gly Ile Asp Lys Glu Arg Ala Glu Ala Ala Arg Gln Arg Ala Gln 305 310 315 320 Glu Arg Leu Asn Ser Gln Ser Asp Asp Thr Asp Ile Arg Arg Ala Glu 325 330 335 Leu Ala Leu Gln Arg Ala Leu Asn Arg Leu Asp Val Ala Gly Lys Ala 340 345 350 Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile 355 360 365 Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln 370 375 380 Ser Lys Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu 385 390 395 400 Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu 405 410 415 Tyr Lys Gly Gly Ser Gly Gly Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe 420 425 430 Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly 435 440 445 His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly 450 455 460 Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro 465 470 475 480 Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser 485 490 495 Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met 500 505 510 Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly 515 520 525 Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val 530 535 540 Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile 545 550 555 560 Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile 565 570 575 Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg 580 585 590 His Asn Ile Glu Glu Ala 595 <210> 8 <211> 598 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> optionally absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (220) <223> optionally absent <400> 8 Met Val Ser Val Ile Lys Pro Glu Met Lys Met Arg Tyr Tyr Met Asp 1 5 10 15 Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Thr Ile Glu Gly Glu Gly Thr Gly 20 25 30 Arg Pro Tyr Glu Gly His Gln Glu Met Thr Leu Arg Val Thr Met Ala 35 40 45 Glu Gly Gly Pro Met Pro Phe Ala Phe Asp Leu Val Ser His Val Phe 50 55 60 Cys Tyr Gly His Arg Val Phe Thr Lys Tyr Pro Glu Glu Ile Pro Asp 65 70 75 80 Tyr Phe Lys Gln Ala Phe Pro Glu Gly Leu Ser Trp Glu Arg Ser Leu 85 90 95 Glu Phe Glu Asp Gly Gly Ser Ala Ser Val Ser Ala His Ile Ser Leu 100 105 110 Arg Gly Asn Thr Phe Tyr His Lys Ser Lys Phe Thr Gly Val Asn Phe 115 120 125 Pro Ala Asp Gly Pro Ile Met Gln Asn Gln Ser Val Asp Trp Glu Pro 130 135 140 Ser Thr Glu Lys Ile Thr Ala Ser Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Val 145 150 155 160 Thr Met Tyr Leu Lys Leu Glu Gly Gly Gly Asn His Lys Cys Gln Phe 165 170 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agggccctga acagactgga cgtggctggg aaggctgacg gcagcgtgca gctcgccgac 1080 cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 1140 ctgagcaccc agtccaagct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 1200 ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagggtggc 1260 agcggtggca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc 1320 gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat 1380 gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc 1440 tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac 1500 cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc 1560 accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc 1620 gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc 1680 ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag 1740 cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga agct 1794 <210> 18 <211> 1794 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 atggtgagtg tgattaaacc agagatgaag atgaggtact acatggacgg ctccgtcaat 60 gggcatgagt tcacaattga aggtgaaggc acaggcagac cttacgaggg acatcaagag 120 atgacactac gcgtcacaat ggccgagggc gggccaatgc ctttcgcgtt tgacttagtg 180 tcacacgtgt tctgttacgg ccacagagta tttactaaat atccagaaga gataccagac 240 tatttcaaac aagcatttcc tgaaggcctg tcatgggaaa ggtcgttgga gttcgaagat 300 ggtgggtccg cttcagtcag tgcgcatata agccttagag gaaacacctt ctaccacaaa 360 tccaaattta ctggggttaa ctttcctgcc gatggtccta tcatgcaaaa ccaaagtgtt 420 gattgggagc catcaaccga gaaaattact gccagcgacg gagttctgaa gggtgatgtt 480 acgatgtacc taaaacttga aggaggcggc aatcacaaat gccaattcaa gactacttac 540 aaggcggcaa aagagattct tgaaatgcca ggagaccatt acatcggcca tcgcctcgtc 600 aggaaaaccg aaggcaacat tactgagcag gtagaagatg cagtagctca ttccgctatg 660 aaaactgtga aagtgaatat aacaacccct gatgggccag tctacgacgc tgatatcgag 720 atggtgtccg tgcgggccga gagtggtgat ctcggcatcc tccccggtca cattcccaca 780 aaggccccac tgaagatcgg agctgtgcgg ctgaagaagg acggccaaac cgagatggtc 840 gcagtctcag gcggcactgt tgaagtgcgg cctgaccacg ttaccattaa tgctcaagcc 900 gctgaaacag ccgaaggaat cgacaaagag agagcagaag ccgcaagaca gagggcccag 960 gagcggctga actctcaatc cgatgacacc gatattcgcc gggccgagct ggcactgcag 1020 aaggccctga acaagctgga cgtggctggg aaggctgacg gcagcgtgca gctcgccgac 1080 cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 1140 ctgagcaccc agtccaagct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 1200 ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagggtggc 1260 agcggtggca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc 1320 gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat 1380 gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc 1440 tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac 1500 cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc 1560 accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc 1620 gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc 1680 ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag 1740 cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga agct 1794 <210> 19 <211> 598 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 Met Val Ser Val Ile Lys Pro Glu Met Lys Met Arg Tyr Tyr Met Asp 1 5 10 15 Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Thr Ile Glu Gly Glu Gly Thr Gly 20 25 30 Arg Pro Tyr Glu Gly His Gln Glu Met Thr Leu Arg Val Thr Met Ala 35 40 45 Glu Gly Gly Pro Met Pro Phe Ala Phe Asp Leu Val Ser His Val Phe 50 55 60 Cys Tyr Gly His Arg Val Phe Thr Lys Tyr Pro Glu Glu Ile Pro Asp 65 70 75 80 Tyr Phe Lys Gln Ala Phe Pro Glu Gly Leu Ser Trp Glu Arg Ser Leu 85 90 95 Glu Phe Glu Asp Gly Gly Ser Ala Ser Val Ser Ala His Ile Ser Leu 100 105 110 Arg Gly Asn Thr Phe Tyr His Lys Ser Lys Phe Thr Gly Val Asn Phe 115 120 125 Pro Ala Asp Gly Pro Ile Met Gln Asn Gln Ser Val Asp Trp Glu Pro 130 135 140 Ser Thr Glu Lys Ile Thr Ala Ser Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp Val 145 150 155 160 Thr Met Tyr Leu Lys Leu Glu Gly Gly Gly Asn His Lys Cys Gln Phe 165 170 175 Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Ala Lys Glu Ile Leu Glu Met Pro Gly Asp 180 185 190 His Tyr Ile Gly His Arg Leu Val Arg Lys Thr Glu Gly Asn Ile Thr 195 200 205 Glu Gln Val Glu Asp Ala Val Ala His Ser Ala Met Lys Thr Val Lys 210 215 220 Val Asn Ile Thr Thr Pro Asp Gly Pro Val Tyr Asp Ala Asp Ile Glu 225 230 235 240 Met Val Ser Val Arg Ala Glu Ser Gly Asp Leu Gly Ile Leu Pro Gly 245 250 255 His Ile Pro Thr Lys Ala Pro Leu Lys Ile Gly Ala Val Arg Leu Lys 260 265 270 Lys Asp Gly Gln Thr Glu Met Val Ala Val Ser Gly Gly Thr Val Glu 275 280 285 Val Arg Pro Asp His Val Thr Ile Asn Ala Gln Ala Ala Glu Thr Ala 290 295 300 Glu Gly Ile Asp Lys Glu Arg Ala Glu Ala Ala Arg Gln Arg Ala Gln 305 310 315 320 Glu Arg Leu Asn Ser Gln Ser Asp Asp Thr Asp Ile Arg Arg Ala Glu 325 330 335 Leu Ala Leu Gln Lys Ala Leu Asn Lys Leu Asp Val Ala Gly Lys Ala 340 345 350 Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile 355 360 365 Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln 370 375 380 Ser Lys Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu 385 390 395 400 Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu 405 410 415 Tyr Lys Gly Gly Ser Gly Gly Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe 420 425 430 Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly 435 440 445 His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly 450 455 460 Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro 465 470 475 480 Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser 485 490 495 Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met 500 505 510 Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly 515 520 525 Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val 530 535 540 Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile 545 550 555 560 Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile 565 570 575 Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg 580 585 590 His Asn Ile Glu Glu Ala 595 <210> 20 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 20 Pro Pro Pro Pro 1 <210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 21 Gly Thr Ser Gly 1 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 22 Ala Asn Glu Phe Met 1 5

Claims

융합 단백질로서,
X1-X2-X3-X4-X5 속의 폴리펩타이드를 포함하되,
여기서, X1 및 X5 중 하나가 수용체 여기 파장 및 FRET 방출 파장을 갖는 형광 공명 에너지 전이(FRET) 수용체 폴리펩타이드를 포함하고, X1 및 X5 중 다른 하나가 공여체 여기 파장 및 공여체 방출 파장을 갖는 FRET 공여체 폴리펩타이드를 포함하고;
X2 및 X4가 독립적으로 선택적 아미노산 링커이고; 그리고
X3이 ATP 결합 단백질을 포함하되;
여기서 ATP 결합 단백질에 의한 ATP의 결합이 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드와 FRET 공여체 폴리펩타이드의 상호 작용을 야기하는, 융합 단백질.
청구항 1에 있어서, X1이 FRET 수용체 폴리펩타이드를 포함하고, X5가 FRET 공여체 폴리펩타이드를 포함하는 것인 융합 단백질.
청구항 1에 있어서, X1이 FRET 공여체 폴리펩타이드를 포함하고, X5가 FRET 수용체 폴리 펩타이드를 포함하는 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, X2가 1~2개 아미노산 길이의 아미노산 링커이거나, 또는 존재하지 않는 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, X2가 1개 아미노산 길이의 아미노산 링커이거나, 또는 존재하지 않는 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, X2가 1개 아미노산 길이의 아미노산인 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, X2가 A, S, P, V, T, TS, ID로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 링커이거나, 또는 X2가 존재하지 않는 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, X2가 A, S, V, T, TS 및 ID로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 링커인 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, X2가 A, S, V 및 T로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 링커인 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, X4가 1~5개 아미노산 길이의 아미노산 링커이거나, 또는 상기 X4가 존재하지 않는 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, X4가 1~4개 아미노산 길이의 아미노산 링커이거나, 또는 X4가 존재하지 않는 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, X4가 1~2개 아미노산 길이의 아미노산 링커인 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, X4가 AT, A, SA, GA, FF, PPPP(서열 번호: 20), FL, GTSG(서열 번호: 21), P, S, ANEFM(서열 번호: 22)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 링커이거나, 또는 X4가 존재하지 않는 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, X4가 AT, A, SA, GA, FF, FL, P 및 S로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 링커인 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, X4가 A, FF, FL 및 GTSG(서열 번호: 21)로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 링커인 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, X2 및 X4가 둘 다 A인 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, X2가 S이고 X4가 A인 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, X2가 존재하지 않고, X4가 FF인 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, X2가 V이고 X4가 FL인 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, X2가 T이고 X4가 GTSG(서열 번호: 21)인 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, X2가 S이고 X4가 SA인 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, X2 및 X4가 임의의 프롤린 잔기를 포함하지 않는 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드는 최대 수용체 여기 파장이 500~560nm의 범위를 가지고, 수용체 최대 발광 파장이 530~580nm의 범위를 갖는 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드가 서열 번호 1 내지 3 중 하나 이상의 아미노산 서열의 길이를 따라 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고, 발색단에서 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
청구항 23에 있어서, 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드 중 모든 선택적 아미노산 잔기가 존재하는 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FRET 공여체 폴리펩타이드는 최대 공여체 여기 파장이 450 내지 500nm의 범위를 가지고, 최대 공여체 발광 파장이 480 내지 515nm의 범위를 갖는 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FRET 공여체 폴리펩타이드가 서열 번호 4의 아미노산 서열의 길이를 따라 적어도 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고 발색단에서 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, X3이 서열 번호: 5~6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열의 길이를 따라 적어도 65%, 67%, 68%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 ATP 결합 단백질을 포함하는 것인 융합 단백질.
청구항 1 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호 7~11로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열의 길이를 따라 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
대조군 융합 단백질로서,
속 X1-X2-X3-X4-X5의 폴리펩타이드를 포함하되,
X1 및 X5 중 하나가 수용체 여기 파장 및 FRET 방출 파장을 갖는 형광 공명 에너지 전이(FRET) 수용체 폴리펩타이드를 포함하고, X1 및 X5 중 다른 하나가 공여체 여기 파장 및 공여체 방출 파장을 갖는 FRET 공여체 폴리펩타이드를 포함하고;
X2 및 X4가 독립적으로 선택적인 아미노산 링커이고; 그리고
X3이 ATP에 결합하지 않는 대조군 단백질을 포함하는 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30에 있어서, X1이 FRET 수용체 폴리 펩타이드를 포함하고, X5가 FRET 공여체 폴리펩타이드를 포함하는 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30에 있어서, X1가 FRET 공여체 폴리펩타이드를 포함하고, X5가 FRET 수용체 폴리펩타이드를 포함하는 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, X2가 1~2개 아미노산 길이의 아미노산 링커이거나 또는 존재하지 않는 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 32 중 중 어느 한 항에 있어서, X2가 1개 아미노산 길이의 아미노산 링커이거나, 또는 존재하지 않는 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, X2가 1개 아미노산 길이의 아미노산 링커인 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, X2가 A, S, P, V, T, TS, ID로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 링커이거나 또는 X2가 존재하지 않는 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, X2가 A, S, V, T, TS 및 ID로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 링커인 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, X2가 A, S, V, 및 T로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 링커인 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 38 중 어느 한 항에 있어서, X4가 1~5개 아미노산 길이의 아미노산 링커이거나, 또는 X4가 존재하지 않는 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 38 중 어느 한 항에 있어서, X4가 1~4개 아미노산 길이의 아미노산 링커이거나, 또는 X4가 존재하지 않는 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 40 중 어느 한 항에 있어서, X4가 1~2개 아미노산 길이의 아미노산 링커인 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 41 중 어느 한 항에 있어서, X4가 AT, A, SA, GA, FF, PPPP (서열 번호: 20), FL, GTSG(서열 번호: 21), P, S, ANEFM(서열 번호: 22)로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 링커이거나, X4가 존재하지 않는 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 41 중 어느 한 항에 있어서, X4가 AT, A, SA, GA, FF, FL, P 및 S로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 링커인 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 41 중 어느 한 항에 있어서, X4가 A, FF, FL 및 GTSG(서열 번호: 21)로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 링커인 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, X2 및 X4가 둘 다 A인 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, X2가 S이고 X4가 A인 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, X2가 존재하지 않고, X4가 FF인 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, X2가 V이고 X4가 FL인 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, X2가 T이고 X4가 GTSG(서열 번호: 21)인 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, X2가 S이고 X4가 SA인 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 50 중 어느 한 항에 있어서, X2 및 X4가 임의의 프롤린 잔기를 포함하지 않는 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 51 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FRET 수용체 폴리 펩타이드는 최대 수용체 여기 파장이 500 내지 560nm 범위를 가지고, FRET 최대 방출 파장이 530 내지 580nm 범위를 갖는 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 52 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드가 서열 번호: 1 내지 3의 아미노산 서열의 길이를 따라 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고, 발색단에서 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 53에 있어서, 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드에 모든 선택적 아미노산 잔기가 존재하는 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 54 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FRET 공여체 폴리펩타이드는 최대 공여체 여기 파장이 450 내지 500 nm 범위를 가지고, 최대 공여체 발광 파장이 480 내지 515nm범위를 갖는 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FRET 공여체 폴리펩타이드는 서열 번호: 4의 아미노산 서열의 길이를 따라 적어도 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고 발색단에서 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 56 중 어느 한 항에 있어서, X3이 서열 번호: 12의 아미노산 서열의 길이를 따라 적어도 65%, 67%, 68%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 밑줄치고 굵은 글꼴 잔기가 K여야하는 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 30 내지 57 중 어느 한 항에 있어서, 서열 번호: 13의 아미노산 서열의 길이를 따라 적어도 65%, 67%, 68%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 밑줄치고 굵은 글꼴 잔기가 K여야 하는 것인 대조군 융합 단백질.
청구항 1 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
청구항 59의 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하는 발현 벡터로서,
상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 유도할 수 있는 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결되는 것인 발현 벡터.
청구항 59의 폴리뉴클레오타이드 또는 청구항 60항의 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
청구항 61에 있어서, 상기 숙주 세포가 안정한 형질 전환 세포주의 세포인 것인 재조합 숙주 세포.
청구항 30 내지 58 중 어느 한 항의 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
청구항 63의 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하는 발현 벡터로서,
상기 폴리뉴클레오타이드가 상기 폴리뉴클레오타이드의 발현을 유도할 수 있는 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결되는 것인 발현 벡터.
청구항 63의 폴리뉴클레오타이드 또는 청구항 64항의 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
청구항 65에 있어서, 상기 숙주 세포가 안정한 형질 전환 세포주의 세포인 것인 재조합 숙주 세포.
키트로서,
(a) 청구항 1 내지 29 중 어느 한 항의 융합 단백질, 청구항 59의 폴리뉴클레오타이드, 청구항 60의 발현 벡터 및/또는 청구항 61 또는 청구항 62의 재조합 숙주 세포; 및
(b) 청구항 30 내지 58 중 어느 한 항의 대조군 융합 단백질, 청구항 63의 폴리뉴클레오타이드, 청구항 64의 발현 벡터 및/또는 청구항 65 또는 66의 재조합 숙주 세포를 포함하는, 키트.
관심 대상 세포에서 ATP의 수준을 결정하기 위한 청구항 1 내지 청구항 29 중 어느 한 항의 융합 단백질의 용도.
ATP 분석 방법으로서,
(a) 하나 이상의 제1 세포에서 청구항 1 내지 청구항 29 중 어느 한 항의 융합 단백질을 발현하는 단계 및 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 이미지를 생성하는 단계:
(i) 상기 하나 이상의 제1 세포를 상기 FRET 공여체 폴리펩타이드 여기 파장을 갖는 빛에 노출시켰을 때, 상기 하나 이상의 제1 세포에서 방출된 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드 발광 파장을 갖는 빛에 의해 생산된 형광 신호를 검출함으로써 생성된 제1 형광 이미지; 및/또는
(ii) 상기 하나 이상의 제1 세포를 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드 여기 파장을 갖는 빛에 노출시켰을 때, 상기 하나 이상의 제1 세포에서 방출된 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드 발광 파장을 갖는 빛에 의해 생산된 형광 신호를 검출함으로써 생성된 제2 형광 이미지; 및/또는
(iii) 상기 하나 이상의 제1 세포를 상기 FRET 공여체 폴리펩타이드 여기 파장을 갖는 빛에 노출시켰을 때, 상기 하나 이상의 제1 세포에서 방출된 상기 FRET 공여체 폴리펩타이드 발광 파장을 갖는 빛에 의해 생산된 형광 신호를 검출함으로써 생성된 제3 형광 이미지; 및
(b) 상기 제1 형광 이미지, 제2 형광 이미지 및/또는 제3 형광 이미지에서 형광 신호의 출력을 비교함으로써, 상기 하나 이상의 제1 세포에서의 FRET 비를 결정하는 단계를 포함하되,
여기서 상기 하나 이상의 제1 세포에서 ATP의 수준이 상기 결정된 FRET 비율에 비례하는 것인 ATP 분석 방법.
청구항 69에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 세포에서 청구항 30 내지 청구항 58 중 어느 한 항의 대조군 융합 단백질을 발현하는 단계 및 상기 하나 이상의 제1 세포에서 방출된 수용체 발광 파장을 갖는 빛에 의해 생성된 대조군 신호를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
청구항 70에 있어서, 상기 대조군 신호를 검출하는 단계는,
(c) 하나 이상의 대조군 세포(예를 들어, 제1 세포 또는 제2 세포)에서 본원에 개시된 임의의 구현예 또는 구현예의 조합의 대조군 융합 단백질을 발현하는 단계 및 하기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 이미지를 생성하는 단계:
(i) 상기 하나 이상의 대조군 세포를 상기 FRET 공여체 폴리펩타이드 여기 파장을 갖는 빛에 노출시켰을 때, 상기 하나 이상의 대조군 세포에서 방출된 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드 발광 파장을 갖는 빛에 의해 생산된 형광 신호를 검출함으로써 생성된 제4 형광 이미지; 및/또는
(ii) 상기 하나 이상의 대조군 세포를 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드 여기 파장을 갖는 빛에 노출시켰을 때, 상기 하나 이상의 대조군 세포에서 방출된 상기 FRET 수용체 폴리펩타이드 발광 파장을 갖는 빛에 의해 생산된 형광 신호를 검출함으로써 생성된 제5 형광 이미지; 및/또는
(iii) 상기 하나 이상의 대조군 세포를 상기 FRET 공여체 폴리펩타이드 여기 파장을 갖는 빛에 노출시켰을 때, 상기 하나 이상의 대조군 세포에서 방출된 상기 FRET 공여체 폴리펩타이드 발광 파장을 갖는 빛에 의해 생산된 형광 신호를 검출함으로써 생성된 제6 형광 이미지; 및
(d) 상기 제4 형광 이미지, 제5 형광 이미지 및/또는 제6 형광 이미지에서 형광 신호의 출력을 비교함으로써 하나 이상의 대조군 세포에서의 대조군 융합 FRET 비율을 결정하는 단계를 포함하되,
여기서 상기 대조군 융합 FRET 비율의 변동은 ATP 결합과 무관한 실험 조건의 결과인 것으로 판단되고, 상기 결정된 FRET 비율은 대조군 융합 FRET 비율의 변동에 기초하여 수정되는 것인 방법.
청구항 69 내지 71 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 세포가 배양기의 배양물에 존재하되, 모든 영상화 단계가 배양기에서 상기 하나 이상의 제1 세포를 제거하지 않고 수행되는 것인 방법.
청구항 69 내지 72 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 세포를 하나 이상의 시험 물질과 접촉시키는 단계 및 상기 하나 이상의 제1 세포에서 상기 시험 물질이 ATP의 존재에 미치는 영향을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
청구항 73에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 세포에서 상기 시험 물질이 ATP의 존재에 미치는 영향이 1분 내지 3개월의 범위 내의 시간에 걸쳐 연속적으로 또는 간헐적으로 결정되는 것인 방법.
융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로서,
상기 융합 단백질은 수용체 여기 파장 및 FRET 발광 파장을 갖는 FRET 수용체인 제1 형광단(상기 제1 형광단은 N 말단 및 C 말단을 가짐); N-말단 및 C-말단을 갖는 ATP 결합 단백질; 및 공여체 여기 파장 및 공여체 방출 파장을 갖는 FRET 공여체인 제2 형광단(상기 제2 형광단은 N-말단 및 C-말단을 가짐)을 포함하되, 상기 제1 링커가 상기 제1 형광단의 C-말단과 상기 ATP 결합 단백질의 N-말단 사이에 배치되고, 제2 링커가 상기 ATP 결합 단백질의 C-말단과 상기 제2 형광단의 N-말단 사이에 배치되고, 상기 ATP 결합 단백질에 의한 ATP의 결합이 공여체 여기 파장을 갖는 빛에 노출될 때 상기 제1 형광단 및 제2 형광단의 상호 작용을 야기하여 FRET 방출 신호를 생성하도록 하기 위해, 상기 제1 형광단, ATP 결합 단백질 및 제2 형광단이 작동 가능하게 연결된 것인 폴리뉴클레오타이드.
청구항 75에 있어서, 상기 제1 링커가 알라닌 잔기이고 상기 제2 링커가 알라닌 잔기인 것인 폴리뉴클레오타이드.
청구항 75에 있어서, 상기 제1 링커가 세린 잔기이고 제2 링커가 알라닌 잔기인 것인 폴리뉴클레오타이드.
청구항 75에 있어서, 상기 제1 링커가 무효이고 상기 제2 링커가 페닐알라닌-페닐알라닌 디펩타이드 잔기인 것인 폴리뉴클레오타이드.
청구항 75에 있어서, 상기 제1 링커가 발린 잔기이고 상기 제2 링커가 페닐알라닌-루신 디펩타이드 잔기인 것인 폴리뉴클레오타이드.
청구항 75에 있어서,상기 제1 링커가 트레오닌 잔기이고 상기 제2 링커가 글리신- 세린-트레오닌-세린-글리신 펩타이드 잔기인 것인 폴리뉴클레오타이드.
청구항 75에 있어서, 제1 링커는 세린 잔기이고 제2 링커는 세린-알라닌 디펩타이드 잔기인 것인 폴리뉴클레오타이드.
청구항 75에 있어서, 상기 제2 링커가 아스파라긴 잔기를 포함하지 않는 것인 폴리뉴클레오타이드.
청구항 75 내지 82 중 어느 한 항에 있어서, 작동 가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
청구항 75 내지 83 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
청구항 75 내지 84 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드 또는 청구항 84의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
청구항 85에 있어서, 상기 숙주 세포가 안정한 형질 전환 세포주의 세포인 것인 숙주 세포.
융합 단백질로서,
상기 융합 단백질은 수용체 여기 파장 및 FRET 발광 파장을 갖는 FRET 수용체인 제1 형광단(상기 제1 형광단은 N 말단 및 C 말단을 가짐); N-말단 및 C-말단을 갖는 ATP 결합 단백질; 및 공여체 여기 파장 및 공여체 방출 파장을 갖는 FRET 공여체인 제2 형광단(상기 제2 형광단은 N-말단 및 C-말단을 가짐)을 포함하되, 제1 링커가 상기 제1 형광단의 C-말단과 상기 ATP 결합 단백질의 N-말단 사이에 배치되고, 제2 링커가 상기 ATP 결합 단백질의 C-말단과 상기 제2 형광단의 N-말단 사이에 배치되며, ATP 결합 단백질에 의한 ATP의 결합이 공여체 여기 파장을 갖는 빛에 노출될 때 상기 제1 형광단 및 제2 형광단의 상호 작용을 야기하여 FRET 방출 신호를 생성하도록 하기 위해, 상기 제1 형광단, ATP 결합 단백질 및 제2 형광단이 작동 가능하게 연결된 것인 융합 단백질.
청구항 75 내지 87 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ATP 결합 단백질이 서열 번호: 5의 단백질; ATP와 결합하고 서열 번호: 5와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 치환 돌연변이, 첨가 또는 결실을 갖는 서열 번호: 5의 변이체; 및 ATP와 결합하고 높은 엄격도 혼성화 조건 하에서 서열 번호: 14에 결합하는 서열 번호 14의 변이체에 의해 인코딩되는 서열 번호: 5의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 것인 폴리뉴클레오타이드, 방법, 발현 벡터, 숙주 세포 또는 융합 단백질.
대조군 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드로서,
상기 대조군 융합 단백질이 수용체 여기 파장 및 수용체 발광 파장을 갖는 FRET 수용체인 제1 형광단(상기 제1 형광단은 N-말단 및 C-말단을 가짐); N-말단 및 C-말단을 갖는 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질(상기 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질은 그것이 ATP와 결합하지 않도록 돌연변이됨); 및 공여체 여기 파장 및 공여체 방출 파장을 갖는 FRET 공여체인 제2 형광단(상기 제2 형광단은 N-말단 및 C-말단을 가짐)을 포함하되, 제1 링커가 상기 제1 형광단의 C-말단과 상기 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질의 N-말단 사이에 배치되고, 제2 링커가 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질의 C-말단과 제2 형광단의 N-말단 사이에 배치되며, 상기 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질이 ATP와 결합하지 않기 때문에, 공여체 여기 파장을 갖는 빛에 노출될 때 상기 제1 형광단과 제2 형광단이 상호작용하여 FRET 방출 신호를 생성하는 것이 ATP의 존재와 무관한 비-특이적 배경 신호를 나타내어 대조군으로서 기능하도록 상기 제1 형광단, 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질 및 제2 형광단이 작동 가능하게 연결된 것인 폴리뉴클레오타이드.
청구항 89에 있어서, 상기 제1 링커가 알라닌 잔기이고 제2 링커가 알라닌 잔기 인 것인 폴리뉴클레오타이드.
청구항 89에 있어서,상기 제1 링커가 세린 잔기이고 제2 링커가 알라닌 잔기인 것인 폴리뉴클레오타이드.
청구항 89에 있어서, 상기 제1 링커가 무효이고, 상기 제2 링커가 페닐알라닌-페닐알라닌 디펩타이드 잔기인 것인 폴리뉴클레오타이드.
청구항 89에 있어서, 상기 제1 링커가 발린 잔기이고 상기 제2 링커가 페닐알라닌-루신 디펩타이드 잔기인 것인 폴리뉴클레오타이드.
청구항 89에 있어서, 상기 제1 링커가 트레오닌 잔기이고 제2 링커가 글리신- 트레오닌-세린-글리신 펩타이드 잔기인 것인 폴리뉴클레오타이드.
청구항 89항에 있어서, 상기 제1 링커가 세린 잔기이고 제2 링커가 세린-알라닌 디펩타이드 잔기인 것인 폴리뉴클레오타이드.
청구항 89에 있어서, 상기 제2 링커가 아스파라긴 잔기를 포함하지 않는 것인 폴리뉴클레오타이드.
청구항 89 내지 96 중 어느 한 항에 있어서, 작동 가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
청구항 89 내지 97 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
청구항 89 내지 97 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드 또는 청구항 98의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
청구항 99항에 있어서, 상기 숙주 세포가 안정한 형질 전환 세포주의 세포인 것인 숙주 세포.
융합 단백질로서,
상기 융합 단백질이 수용체 여기 파장 및 FRET 발광 파장을 갖는 FRET 수용체인 제1 형광단(상기 제1 형광단은 N 말단 및 C 말단을 가짐); N-말단 및 C-말단을 갖는 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질; 및 공여체 여기 파장 및 공여체 방출 파장을 갖는 FRET 공여체인 제2 형광단(상기 제2 형광단은 N-말단 및 C-말단을 가짐)을 포함하되, 제1 링커가 상기 제1 형광단의 C-말단과 상기 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질의 N-말단 사이에 배치되고, 제2 링커가 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질의 C-말단과 제2 형광단의 N-말단 사이에 배치되며, 상기 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질이 ATP와 결합하지 않기 때문에, 공여체 여기 파장을 갖는 빛에 노출될 때 상기 제1 형광단과 제2 형광단이 상호작용하여 FRET 방출 신호를 생성하는 것이 ATP의 존재와 무관한 비-특이적 배경 신호를 나타내어 대조군으로서 기능하도록 상기 제1 형광단, 대조군 돌연변이체 ATP 결합 단백질 및 제2 형광단이 작동 가능하게 연결되는 것인 융합 단백질.
청구항 89 내지 101에 있어서, 상기 대조군 돌연변이 ATP 결합 단백질이 서열 번호: 15의 단백질; ATP와 결합하지 않고 서열 번호: 15와 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 치환 돌연변이, 첨가 또는 결실을 갖는 서열 번호: 15의 변이체; 및 ATP와 결합하지 않고 높은 엄격도 혼성화 조건 하에서 서열 번호: 16에 결합하는 서열 번호 16의 변이체에 의해 인코딩되는 서열 번호: 15의 변이체로 이루어진 군에서 선택되는 것인 폴리뉴클레오타이드, 방법, 발현 벡터, 숙주 세포 또는 융합 단백질.
[청구항 102]
청구항 1 내지 101 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FRET 공여체가 cpmEGFP인 것인 폴리뉴클레오타이드, 방법, 발현 벡터, 숙주 세포 또는 융합 단백질.
청구항 1 내지 102 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FRET 수용체가 mKOk인 것인 폴리뉴클레오타이드, 방법, 발현 벡터, 숙주 세포 또는 융합 단백질.