MXPA05003128A - Ensayos de transferencia de energia de resonancia fluorescente (fret) basados en celulas para toxinas clostridiales. - Google Patents

Ensayos de transferencia de energia de resonancia fluorescente (fret) basados en celulas para toxinas clostridiales.

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Abstract

La presente invencion proporciona un metodo para determinar la actividad de toxina clostridial por (a) poner en contacto una celula que contiene el substrato de toxina clostridial que incluye un fluoroforo donante; un receptor que tiene un espectro de absorbancia que traslapa el espectro de emision de fluoroforo donante; una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que contiene un sitio de desdoblamiento que interviene entre el fluoroforo donante y el receptor, donde la transferencia de energia de resonancia se exhibe entre el fluoroforo donante y aceptor bajo las condiciones apropiadas; (b) excitar el fluoroforo donante; y (c) determinar la transferencia de energia de resonancia de la celula puesta en contacto con relaciona la celula de control, donde una diferencia en la transferencia de energia de resonancia de la celula puesta en contacto como se compara con la celula de control indica una actividad de toxina clostridial.

Description

ENSAYOS DE TRANSFERENCIA DE ENERGIA DE RESONANCIA FLUORESCENTE (FRET) BASADOS EN CELULAS PARA TOXINAS CLOSTRIDIALES CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona generalmente a ensayos de transferencia de energía de resonancia fluorescente y de proteasa y, más específicamente, a métodos basados en células para ensayo de la actividad de toxinas clostridiales . ANTECEDENTES DE LA INVENCION El síndrome neuroparalítico de tétanos y la enfermedad rara pero potencialmente fatal de botulismo, son provocadas por neurotoxinas producidas por la bacteria del género Clostridium. Estas neurotoxinas clostridiales son altamente potentes y venenos específicos de células neurales, con la dosis letal humana de las toxinas de botulinum en el orden de nanogramos. Así, la presencia de niveles aún diminutos de toxinas de botulinum en comestibles representa un riesgo de salud pública que debe ser evitado a través de pruebas de rigurosas . Sin embargo, a pesar de sus efectos potencialmente per udiciales, las dosis controladas bajas de neurotoxinas de botulinum se han usado exitosamente como terapéuticos y para algunas aplicaciones cosméticas. En particular, las toxinas Ref . :162271 de botulinum se han usado en la administración terapéutica de una variedad de distonias focales y segméntales, estrabismo, y otras condiciones en las cuales se desea una depresión reversible de una actividad terminal del nervio colinérgico. Los usos terapéuticos establecidos de neurotoxinas de botulinum en humanos incluyen, sin limitación, blefaroespasmos , espasmo semifacial, disfonía laríngea, hiperhidrosis focal, hipersalivación, distonia oromandibular , distonia cervical, tortícolis, estrabismo, distonia de extremidades, calarrbres ocupacionales y mioquimia (Rossetto y colaboradores, Toxicon 39:27-41 (2001)) . Como un ejemplo, la inyección intramuscular de tejido espástico con cantidades pequeñas de neurotoxina A de botulinum se ha usado efectivamente para tratar espasticidad debida a lesión en el cerebro, lesión en la médula espinal, apoplejía, esclerosis múltiple y parálisis cerebral. Se están investigando actualmente usos clínicos posibles adicionales de neurotoxinas clostridiales . Dado el peligro potencial asociado con cantidades pequeñas de toxinas de botulinum en comestibles y la necesidad de preparar formulaciones f rmacéuticas exactas, los ensayos para las neurotoxinas de botulinum actualmente se emplean en las industrias de alimentos y farmacéutica. La industria de alimentos requiere ensayos para las neurotoxinas de botulinum para validar nuevos métodos de empacado de alimentos y para garantizar la seguridad de los alimentos. El crecimiento del uso clínico de las toxinas de botulinum necesita ensayos precisos de la actividad de la neurotoxina de botulinum para la formulación del producto además del control de calidad. En ambas industrias, actualmente la prueba de letalidad de ratón es el único ensayo aceptable para la actividad de neurotoxina de botulinum. Desafortunadamente, el ensayo de letalidad de ratón sufre de varios inconvenientes: costo debido al gran número de animales de laboratorio requerido; carece de especificidad; el potencial de inexactitud salvo que se usen grupos grandes de animales; y el sacrificio necesario de la vida animal. Así, existe una necesidad de un nuevo método que pueda complementar y reducir la necesidad del ensayo de letalidad de ratón. Además para medir la actividad proteolítica de la toxina, un método sustituto tal también debe requerir absorción celular de la toxina y suministro de la cadena ligera de toxina en el citosol de célula. La presente invención satisface esta necesidad proveyendo ensayos basados en célula novedosos de la actividad de la toxina clostridial y también provee ventajas relacionadas. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención provee una composición de substrato que incluye un agente de suministro y un substrato de toxina clostridial que contiene un fluoróforo donante; un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que traslapa el espectro de emisión del fluoróforo donante; y una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que contienen un sitio de desdoblamiento que interviene entre el fluoróforo donante y el aceptor, en donde la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoróforo donante y el aceptor bajo las condiciones apropiadas. En una composición de substrato de la invención, el agente de suministro puede ser, por ejemplo, enlazado covalentemente al substrato de toxina clostridial y además puede ser, por ejemplo, una proteína, péptido o peptidomimético . En una modalidad, la composición del substrato es una proteína, péptido o peptidomimético quimérico en el cual el agente de suministro operativamente está fusionado al substrato de toxina clostridial . Así una composición de substrato quimérica puede ser, por ejemplo, un péptido o peptidomimético que tiene una longitud como máximo de 50 a 100 residuos. Pueden ser enlazados covalentemente una variedad de agentes de suministro a un substrato de toxina clostridial en una composición de substrato de la invención que incluyen, sin limitación, una proteína antennapedia o fragmento activo de ésta, tal como un fragmento activo que tiene la secuencia de aminoácidos RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 1) ; una proteína TAT DE VIH o fragmento activo de ésta, así como un fragmento activo que tiene la secuencia de aminoácidos YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO : 2 ) ; y una proteína de virus de herpes simplex VP22 o fragmento activo de ésta, tal como una proteína de virus de herpes simplex VP22 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO : 3 , o fragmento activo de la misma. La invención también provee una composición de substrato en la cual el agente de suministro está asociado no covalentemente con el substrato de toxina clostridial. Los agentes de suministro ejemplares que pueden ser asociados no covalentemente con un substrato de toxina clostridial incluyen, sin limitación, Chariot™ Y péptidos MPG. Son útiles una variedad de substratos de toxina clostridial en las composiciones de substrato de la invención. Tal substrato de toxina clostridial puede ser, por ejemplo, un substrato de toxina de botulinum que contiene una secuencia de reconocimiento de toxina de botulinum o un substrato de toxina de tétanos que contiene una secuencia de reconocimiento de toxina de tétanos. En una modalidad, la invención provee una composición de substrato que contiene, en parte, un substrato BoNT/A que incluye una secuencia de reconocimiento BoNT/A. Así un substrato BoNT/A puede incluir, por ejemplo, por lo menos seis residuos consecutivos de SNAP-25, los seis residuos consecutivos que contienen Gln-Arg, o un peptidomimético de estos. En otra modalidad, la invención provee una composición de substrato que incluye un substrato BoNT/B que contiene una secuencia de reconocimiento BoNT/B.
Los substratos BoNT/B útiles en las composiciones de substrato de la invención incluyen, sin limitación, aquellos que tienen por lo menos seis residuos consecutivos de VAMP, los seis residuos consecutivos contienen Gln-Phe, o un peptidomimético de estos. En una modalidad más, la invención provee un substrato BoNT/Cl que contiene una secuencia de reconocimiento BoNT/Cl; los substratos BoNT/Cl útiles en la invención abarcan aquellos que tienen por lo menos seis residuos consecutivos de sintaxina, los seis residuos consecutivos que contienen Lys-Ala, o un peptidomimético de estos, y aquellos que incluyen por lo menos seis residuos consecutivos de SNAP-25, los seis residuos consecutivos que contienen Arg-Ala, o un peptidomimético de estos. En otra modalidad, la invención provee un substrato BoNT/D que contiene una secuencia de reconocimiento BoNT/D. Son útiles una variedad de substratos BoNT/D en las composiciones de substrato de la invención incluyendo, todavía no limitados a, substratos BoNT/D que contienen por lo menos seis residuos consecutivos de VAMP, los seis residuos consecutivos que contienen Lys-Leu, o un peptidomimético de estos. En una modalidad más, la invención provee una composición de substrato que incluye, en parte, un substrato BoNT/E que contiene una secuencia de reconocimiento BoNT/E. Tal substrato BoNT/E puede tener, por ejemplo, por lo menos seis residuos consecutivos de SNAP-25, los seis residuos consecutivos que contienen Arg-Ile, o un peptidomimético de estos. En una modalidad adicional, hay provista aquí una composición de substrato la cual incluye un substrato BoNT/F que contiene una secuencia de reconocimiento BoNT/F. Los substratos BoNT/F útiles en las composiciones de la invención pueden tener, por ejemplo, por lo menos seis residuos consecutivos de VA P, los seis residuos consecutivos que contienen Gln-Lys, o un peptidomimético de estos. En todavía una modalidad más, la invención provee una composición de substrato que contiene, en parte, un substrato BoNT/G que tiene una secuencia de reconocimiento BoNT/G. Los substratos BoNT/G útiles incluyen, aunque no están limitados a, aquellos que tienen por lo menos seis residuos consecutivos de VAMP, los seis residuos consecutivos que contienen Ala-Ala, o un peptidomimético de estos. En una modalidad más, la presente invención provee una composición de substrato que incluye, en parte, un substrato TeNT que contiene una secuencia de reconocimiento TeNT. Son útiles una variedad de substratos TeNT en la invención incluyendo aquellos que tienen por lo menos seis residuos consecutivos de VAMP, los seis residuos consecutivos que contienen Gln-Phe, o un peptidomimético de estos . Son útiles una variedad de fluoróforos donantees y aceptores en las composiciones de substratos de la invención. Como ejemplos sin limitación, los fluoróforos donantees útiles en la invención incluyen Alexa Fluorc 488, DABCYL y BODIPY. Los aceptores útiles en la invención incluyen aceptores no fluorescentes así como fluoróforos aceptores; en una modalidad, el aceptor es un fluoroforo aceptor que tiene un tiempo de vida de fluorescencia de por lo menos 1 microsegundo . En otras modalidades, la invención provee una composición de substrato en la cual el aceptor es EDANS, QSYC 7, o tetrametilrodamina . Además se provee aquí una célula que contiene un substrato de toxina clostridial que incluye un fluoroforo donante; un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que traslapa el espectro de emisión del fluoroforo donante; y una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que contiene un sitio de desdoblamiento que interviene entre el fluoroforo donante y el aceptor, en donde la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoroforo donante y el aceptor bajo las condiciones apropiadas. En una modalidad, la célula es una célula transfectada . En otra modalidad, la célula es una célula transfectada establemente. Son útiles una variedad de células en la invención incluyendo, sin limitación, células primarias; células establecidas; células humanas; células neuronales tales como neuronas primarias, neuronas establecidas y neuronas humanas; y células no neuronales tales como células acinar pancreáticas. Las neuronas útiles en la invención incluyen neuronas del sistema nervioso central (SNC) y neuronas periféricas; como ejemplos no limitantes, una neurona útil en la invención puede ser un neuroblastoma, neurona de la médula espinal, neurona de ganglio de raíz dorsal, neurona de corteza cerebral, neurona cerebelar, neurona hipocampal o neurona motora. Aquí además se provee una célula la cual incluye una molécula de ácido nucleico que codifica para un substrato de toxina clostridial que incluye un fluoróforo donante; un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que traslapa el espectro de emisión del fluoróforo donante; y una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que contiene un sitio de desdoblamiento que interviene entre el fluoróforo donante y el aceptor, en donde la trans erencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoróforo donante y el aceptor bajo las condiciones apropiadas. Puede ser útil cualquiera de una variedad de células, incluyendo, pero no limitadas a, células humanas, células neuronales y células no neuronales. Tal célula puede ser preparada, por ejemplo, por transfección estable de una molécula de ácido nucleico que codifica un substrato de toxina clostridial. La molécula de ácido nucleico que codifica un substrato de toxina clostridial puede estar enlazada, por ejemplo, a un elemento regulador tal como un elemento regulador constitutivo o elemento regulador inducible. Son útiles una variedad de elementos reguladores inducibles, incluyendo, sin limitación, elementos reguladores regulados de tetraciclina y elementos reguladores inducibles de ecdisona. Los fluoróforos donantees codificados genéticamente y los aceptores útiles en la invención incluyen proteína de fluorescencia verde (GFP, por sus siglas en inglés) y otros desglosados aquí posteriormente y conocidos en la técnica. La presente invención también provee un método de determinación de la actividad de la toxina clostridial mediante (a) contacto con una muestra de una célula que contiene un substrato de toxina clostridial que incluye un fluoróforo donante; un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que traslapa el espectro de emisión del fluoróforo donante; y una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que contiene un sitio de desdoblamiento que interviene entre el fluoróforo donante y el aceptor, en donde la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoróforo donante y el aceptor bajo las condiciones apropiadas; (b) excitación del fluoróforo donante; y (c) determinación de la transferencia de energía de resonancia de la célula contactada relativa a una célula de control, donde una diferencia en la transferencia de energía de resonancia de la célula contactada comparada con la célula de control es indicativa de la actividad de la toxina clostridial. Un substrato de toxina clostridial útil en un método de la invención puede ser un substrato de toxina botulinum de cualquier serotipo o un substrato de toxina de tétanos. Así, un método de la invención puede ser practicado, por ejemplo, con un substrato de BoNT/A que contiene una secuencia de reconocimiento de BoNT/A; un substrato de BoNT/B que contiene una secuencia de reconocimiento de BoNT/B; un substrato de BoNT/Cl que contiene una secuencia de reconocimiento de BoNT/Cl; un substrato de BoNT/D que contiene una secuencia de reconocimiento de BoNT/D; un substrato de BoNT/E que contiene una secuencia de reconocimiento de BoNT/E; un substrato de BoNT/F que contiene una secuencia de reconocimiento de BoNT/F; un substrato de BoNT/G que contiene una secuencia de reconocimiento de BoNT/G; o un substrato de toxina TeNT que contiene una secuencia de reconocimiento de TeNT. Puede ser ensayada una variedad de muestras de la actividad de la toxina clostridial de acuerdo con un método de la invención. Tales muestras incluyen, sin limitación, lisados de célula crudos toxinas clostridiales aisladas; productos de toxina clostridial formulados tales como BOTOXc; y comestibles. Pueden ser usados una variedad de medios para determinar la transferencia de energía de resonancia en un método de la invención. En una modalidad, un método de la invención incluye la etapa de determinación de la intensidad de la fluorescencia del donante de la célula contactada, donde la intensidad de fluorescencia del donante incrementada de la célula contactada comparada con la célula de control es indicativa de la actividad de la toxina clostridial . En otra modalidad, un método de la invención incluye la etapa de detección de la intensidad de fluorescencia del aceptor de detección de la célula contactada, donde la intensidad de fluorescencia del aceptor disminuida de la célula contactada comparada con la célula de control es indicativa de la actividad de la toxina clostridial. En una modalidad adicional, un método de la invención incluye la etapa de detección de un máximo de emisión del aceptor y un máximo de emisión de fluoróforo donante de la célula contactada, donde un cambio en la emisión máxima desde la cercanía del máximo de emisión del aceptor hasta la cercanía del máximo de emisión de fluoróforo donante es indicativo de la actividad de la toxina clostridial. En todavía una modalidad más, un método de la invención incluye la etapa de detección de la relación de amplitudes de fluorescencia cercanas a un máximo de emisión del aceptor a las amplitudes de fluorescencia "cercanas a un máximo de emisión de fluoróforo donante de la célula contactada, donde una relación disminuida en la célula contactada comparada con la célula de control es indicativa de la actividad de la toxina clostridial. En todavía otra modalidad, un método de la invención incluye la etapa de detección del tiempo de vida de estado excitado del fluoróforo donante en la célula contactada, donde un tiempo de vida de estado excitado de fluoróforo donante incrementado en la célula contactada comparado con la célula de control es indicativo de la actividad de la toxina clostridial. Si se desea, la etapa de determinación de transferencia de energía de resonancia puede ser repetido en uno o más intervalos de tiempo posteriores. Además, las condiciones apropiadas para actividad de toxina clostridial pueden ser seleccionadas, si se desea, de manera que el ensayo sea lineal. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra un esquema de la estructura deducida y del mecanismo postulado de activación de neurotoxinas clostridiales . Las toxinas pueden ser producidas como una cadena de polipéptido única inactiva de 150 kDa, compuesta de tres dominios de 50 kDa conectados por circuitos. El desdoblamiento proteolítico selectivo activa las toxinas por generación de dos cadenas enlazadas de bisulfuro: la cadena L de 50 kDa y la cadena H de 100 kDa, ia cual está hecha de dos dominios denotados HN y Hc. Los tres dominios juegan roles distintos: el dominio de Terminal C de la cadena pesada (Hc) funciona en células que unen mientras que el dominio de Terminal N de la cadena pesada (HN) permite la transubicación de endosoma al citoplasma de la célula. Siguiendo a la reducción del enlazamiento de bisulfuro dentro de la célula, se libera la actividad de la endopeptidasa de zinc de la cadena L.
La Figura 2 muestra un esquema de los cuatro pasos requeridos para actividad de toxina de botulinum y tétanos en neuronas centrales y periféricas . La Figura 3 muestra la localización subcelular en la membrana de plasma y sitios de desdoblamiento de SNAP-25, VAMP y sintaxina. El VAMP está unido a la membrana de vesícula sináptica, mientras que el SNAP-25 y la síntaxina están unidos a la membrana de plasma objetivo. Los BoNT/A y /E desdoblan SNAP-25 cerrado a la terminación carboxi , liberando nueve o 26 residuos, respectivamente. Los BoNT/B, /D, /F, /G y TeNT actúan sobre la porción central conservada de VAMP (esparcida) y libera la porción Terminal amino de VAMP en el citosol . El BoNT/Cl desdobla el SNAP-25 cerrado a la terminación carboxi además del desdoblamiento de sintaxina en un sitio único cercano a la superficie de la membrana citosólica. La acción de BoNT/B, /Cl , /D, /F, /G y TeNT resulta en liberación de una porción grande del dominio citosólico de VAMP o sintaxina, mientras que solamente una porción pequeña de SNAP-25 se libera por proteolisis selectiva mediante BoNT/A, /Cl o /E. Las Figux'as 4A-4C muestran la porción de reconocimiento de neurotoxina de VAMP , SNAP-25 y sintaxina. (Figura 4A) Los cuadros sombreados indican la presencia y posiciones de una porción común a los tres objetivos de las neurotoxinas clostridial . (Figura 4B) La porción de reconocimiento se compone de residuos hidrofóbicos ( "h" ) ; residuos Asp o Glu cargados negativamente ("-") y residuos polares ( "p" ) ; "x" representa cualquier aminoácido. La porción se incluye en regiones de VAMP, SNAP-25 y sintaxina predichos para adoptar una conformación helicoidal . (Figura 4C) Se muestra una vista superior de la porción en una conformación helicoidal a. Los residuos cargados negativamente alinean en una cara, mientras que los residuos hidrofóbicos alinean en una segunda cara. La Figura 5 muestra una alineación de varias proteínas SNAP-25 y sus sitios desdoblados BoNT/E, BoNT/A y BoNT/Cl. Se representan la SNAP-25 humana (SEQ ID NO: 4; adquisición de GenBank g4507099; ver, también, la secuencia SNAP-25 humana relacionada g2135800) ; la SNAP-25 de ratón (SEQ ID NO: 5 ; adquisición de GenBank G6755588) ; la SNAP-25 de Drosophila (SEQ ID NO: 6; adquisición de GenBank g548941); la SNAP-25 de pez dorado (SEQ ID NO: 7; adquisición de GenBank g2133923); la SNAP-25 de erizo de mar (SEQ ID NO: 8; adquisición de GenBank g2707818) y la SNAP-25 de pollo (SEQ ID NO: 9; adquisición de GenBank g481202) . La Figura. 6 muestra una alineación de varias proteínas VAMP y sus sitios desdoblados BoNT/F, BoNT/D, BoNT/B, TeNT y BoNT/G. Se representan la VAMP-1 humana (SEQ ID NO: 10; adquisición de GenBank gl35093) ; la VAMP-2 humana (SEQ ID NO: 11; adquisición de GenBank gl35094) ; la VAMP-2 de ratón (SEQ ID NO: 12; adquisición de GenBank G2501081); la VAMP bovino (SEQ ID NO: 13; adquisición de GenBank g89782); la VAMP de rana (SEQ ID NO: 14; adquisición de GenBank g6094391) y la VAMP de erizo de mar (SEQ ID NO: 15; adquisición de GenBank g5031415) . La Figura 7 muestra una alineación de varias proteínas de sintaxina y sus sitios desdoblados BoNT/Cl. Se representan la sintaxina 1A humana (SEQ ID NO: 16; adquisición de GenBank gl5079184; sintaxina 1B2 de humano (SEQ ID NO: 17; adquisición de GenBank gl5072437) ; la sintaxina 1A de ratón (SEQ ID NO: 18; adquisición de GenBank gl5011853); la sintaxina 1A de Drosophila (SEQ ID NO: 19; adquisición de GenBank g2501095) ; la sintaxina A de C . elegans (SEQ ID NO: 20; adquisición de GenBank g7511662) y la sintaxina de erizo de mar (SEQ ID NO: 21; adquisición de Gen3ank gl3310402) . DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La invención ' rovee ensayos basados en célula in vivo e in vitro para determinación de la presencia o ausencia de una toxina clostridial activa en una muestra o para determinación de la actividad de cualquier toxina clostridial, incluyendo toxinas botulinum de todas las toxinas serotipos y de tétanos. Las composiciones de substratos novedosas, células y ensayos de la invención reducen la necesidad de estudios de toxicidad animal, además sirven para analizar múltiples funciones de la toxina, principalmente, enlazamiento y absorción celular de la toxina, transubicación en el citosol de la célula, y actividad de la proteasa. Estas composiciones novedosas y los métodos pueden ser usados para analizar muestras crudas y voluminosas además de toxinas de doble cadena altamente purificadas o productos de toxina formulados y, además, son susceptibles para formatos de ensayo de alto rendimiento automatizados. Como se discutió abajo, la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET, por sus siglas en inglés) es una interacción dependiente de distancia entre los estados excitados electrónicos de dos moléculas en las cuales la excitación se transfiere desde un fluoróforo donante hasta un aceptor sin emisión de un fotón. El proceso de transferencia de energía resulta en una reducción (apagado) de la intensidad de la fluorescencia y el tiempo de vida del estado excitado del fluoróforo donante y, donde el aceptor es un fluoróforo, puede producir un incremento en la intensidad de emisión del aceptor. Sobre el desdoblamiento del substrato de toxina clostridial sin una célula de la invención después de ser contactada con una muestra que contiene toxina activa, la transferencia de energía de resonancia se reduce y puede ser detectada, por ejemplo, por emisión de fluorescencia del donante incrementada, emisión de fluorescencia del donante disminuida, o por un cambio en la emisión máxima desde cerca de la emisión del aceptor máxima hasta cerca de la emisión del donante máxima. Si se desea, la cantidad de toxina clostridial activa en una muestra puede ser calculada como una función de la diferencia en el grado de FRET usando los estándares apropiados. Las neurotoxinas de tétanos y botulinum a las cuales se relaciona la invención se producen por Clostridia. Estas toxinas provocan los síndromes neuroparalíticos de tétanos y botulismo, con toxina de tétanos que actúa principalmente dentro del sistema nervioso central y la toxina de botulinum que actúa en el sistema nervioso periférico. Las neurotoxinas clostridiales comparten un mecanismo similar de intoxicación de célula en el cual la liberación de neurotransmisores se bloquea. En estas toxinas, las cuales están compuestas de dos cadenas de polipéptidos enlazadas por bisulfuro, la subunidad más grande es responsable del enlazamiento y transubicación neuroespecí fico de la subunidad más pequeña en el citoplasma. Sobre la transubicación y reducción en las neuronas, la cadena más pequeña exhibe actividad de peptidasa específica para componentes de proteína involucrados en la neuroexocitosis . Los objetivos de la proteína "SNARE" de toxinas clostridiales son comunes a la exocitosis en una variedad de tipos no neurales; en estas células, como en neuronas, la actividad de peptidasa de cadena ligera inhibe la exocitosis. La neurotoxina de tétanos y neurotoxinas de botulinum B, D, F, y G específicamente reconocen VAMP (también se conoce como sinaptobrevina) , una proteína integral de la membrana de vesícula sináptica. La VAMP se desdobla en enlaces distintos que dependen de la neurotoxina. Las neurotoxinas de Botulinum A y E reconoce y desdobla específicamente la SNAP-25, una proteína de la membrana presináptica , en dos diferentes sitios en la porción Terminal carboxi de la proteína. La neurotoxina Botulinum C desdobla sintaxina, una proteína del plasmalema de nervio, además de la SNAP-25. Los tres objetivos de proteínas de las neurotoxinas Clostridiales se conservan desde levadura hasta humanos a pesar de que el desdoblamiento de sitios y la susceptibilidad de la toxina no son necesariamente conservados (ver abajo; ver, también, Humeau y colaboradores, Biochimie 82:427-446 (2000); Niemann y colaboradores, Trends in Cell Biol . 4:179-185 (1994); y Pellizzari y colaboradores, Phil. Trans . R. Soc . London 354 : 259-268 (1999) ) . Las neurotoxinas de tétanos y botulinum que se presentan naturalmente se producen como cadenas de polipéptido inactivo de 150 kDa sin una secuencia líder. Estas toxinas pueden ser desdobladas por proteinasas bacteriales o de tejido en un circuito sensitivo de proteasa expuesto, generando la toxina de doble cadena activa. Las toxinas clostridiales que se presentan naturalmente contienen una unión de bisulfuro entre cadena único que hacer un puente sobre la cadena pesada (H, 100 kDa) y la cadena ligera (L, 50 kDa) ; tal puente es importante para la neurotoxicidad de la toxina agregada extracelularmente (Montecucco y Schiavo, Quarterly Rev. Biophysics 28:423-472 (1995)). Las toxinas clostridiales aparentan ser plegadas en tres distintos dominios de 50 kDa, como se muestra en la Figura 1, con cada dominio que tiene un rol funcional distinto. Como se ilustra en la Figura 2, el mecanismo de intoxicación de la célula de las toxinas clostridiales consiste de cuatro pasos distintos: (1) unión; (2) internalización; (3) transubicación de membrana; y (4) modificación objetivo enzimática. La parte Terminal carboxi de la cadena pesada (Hc) funciona en unión neuroespecífica, mientras que la porción Terminal amino de la cadena H (HN) funciona en la transubicación de la membrana. La cadena L es responsable de la actividad catalítica intracelular (Montecucco y Schiavo, supra, 1995) . La secuencia de aminoácidos de ocho neurotoxinas clostridiales humanas se ha derivado del gen que corresponde (Neimann, "Molecular Biology of Clostridial Neurotoxins" en Sourcebook of Bacterial Protein Toxins, Alouf y Freer (Eds.) pp. 303-348 London: Academic Press 1991). Las cadenas L y las cadenas H se componen de aproximadamente 439 y 843 residuos, respectivamente. Los segmentos homólogos se separan por regiones de poca o ninguna similitud. Las regiones mejor conservadas de las cadenas L son la porción Terminal amino (100 residuos) y la región central (que corresponde a residuos 216 a 244 de TeNT) , además de las dos cisteínas que forman la unión de bisulfuro entre cadena. La región 216 a 244 contiene un His-Glu-X-X-His que une la porción característica de endopeptidasas de zinc. Las cadenas pesadas de toxina clostridial son menos conservadas que las cadenas ligeras, y la porción Terminal carboxi de Hc (que corresponde a residuos 1140 a 1315 de TeNT) es la más variable. Esto es consistente con el involucramiento del dominio Hc en unión con las terminales nerviosas y el hecho de que neurotoxinas diferentes aparentan unir receptores diferentes. La comparación de las secuencias de nucleótido y aminoácido de las toxinas clostridiales indica que se derivan de un gen ancestral común. La distribución de estos genes puede haber sido facilitada por el hecho de que los genes de neurotoxina clostridial están localizados en elementos genéticos móviles. Como se discutió más abajo, las variantes de secuencia de las siete toxinas de botulinum se conocen en la técnica. Ver, por ejemplo, Figuras 5 a 7 de Humeau y colaboradores, supra, 2000. Como se discutió arriba, los objetivos naturales de las neurotoxinas clostridiales incluyen VA P, SNAP-25, y sintaxina. El VAMP se une a la membrana de vesícula sináptica, mientras que el SNAP-25 y sintaxina se unen a la membrana objetivo (ver figura 3) . Los BoNT/A y BoNT/E desdoblan SNAP-25 en la región Terminal carboxi , liberando nueve o veintiséis residuos de aminoácido respectivamente, y el BoNT/Cl también desdobla el SNAP-25 cerca de la terminación carboxi. Los serotipos de botulinum BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G, y toxina de tétanos, actúan sobre la porción central conservada de VAMP, y libera la porción Terminal amino de VAMP en el citosol . El BoNT/Cl desdobla sintaxina en un sitio único cercano a la superficie de la membrana citosólica. Así, la proteolisis de BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G ó TeNT resulta en liberación de una porción grande del dominio citosólico de VAMP o sintaxina, mientras que solamente una porción pequeña de SNAP-25 se libera por desdoblamiento de BoNT/A, BoNT/Cl o BoNT/E (Montecucco y Schiavo, supra, 1995) . El SNAP-25 que ocurre naturalmente, una proteína de alrededor de 206 residuos que carece de un segmento de transmembrana, se asocia con la superficie citosólica del plasmalema del nervio (Figura 3; ver, también, Hotel y colaboradores, Int. J. Biochemistriy and Cell Biology 30:1069-1073 (1998)) . Además de los homólogos altamente conservados desde Drosophila hasta mamíferos, las proteínas relacionadas con SNAP-25 también se han clonado a partir de levadura. La SANP-25 se requiere para crecimiento axonal durante el desarrollo y puede ser requerido para plasticidad de la terminal del nervio en el sistema nervioso maduro. En humanos, se expresan diferencialmente dos isoformas durante el desarrollo; la isoforma a se expresa constitutivamente durante el desarrollo fetal, mientras que la isoforma b aparece en el nacimiento y predomina en la vida adulta. Los análogos de SANP-25 tales como SNAP-23 también se expresan fuera del sistema nervioso, por ejemplo, en las células pancreáticas . La VAMP que ocurre naturalmente es una proteína de alrededor de 120 residuos, con la longitud exacta que depende de las especies e isotipo. Como se muestra en la Figura 3, el VAMP contiene un segmento Terminal carboxi dentro del espacio de vesícula mientras que el resto de la molécula se expone al citosol . Los treinta residuos de la terminal amino ricos en prolina son divergentes entre especies e isoformas mientras que la porción central de VAMP (residuos 30 a 96) , la cual es rica en residuos cargados e hidrofílicos e incluye sitios de desdoblamiento conocidos, es altamente conservada. La VAMP se colocaliza con sinaptofisina en la membrana de vesícula sináptica . Se conocen una variedad de especies homologas de VAMP en la técnica que incluyen homólogos de humano, rata, bovino, Torpedo, Drosophila, levadura, calamar y Aplasia. Además, las isoformas múltiples de VAMP se han identificado incluyendo VAMP-1, VAMP-2 y celubrevina, y se han identificado formas insensibles en células no neuronales. La VAMP parece estar presente en todos los tejidos de vertebrados a pesar de que la distribución del VAMP-1 y VAMP-2 varía en diferentes tipos de célula. La VAMP-1 de pollo y rata no son desdoblados por TeNT o BoNT/B. Estos homólogos de VAMP-1 tienen una valina en lugar de la glutamina presente en la VAMP-1 de humanos y ratones en el sitio de desdoblamiento de TeNT o BoNT/B. La substitución no efectúa BoNT/D, /F o /G, los cuales desdoblan ambas VAMP-1 y VAMP-2 con grados similares. La sintaxina se localiza en la superficie citosólica del plasmalema del nervio y se ancla a la membrana mediante el segmento Terminal carboxi, con la mayor parte de la proteína expuesta al citosol . La sintaxina se colocaliza con canales de calcio en las zonas activas de la membrana presináptica, donde tiene lugar la liberación del neurotransmisor . Además, la sintaxina interactúa con la sinaptotagmina, una proteína de la membrana SSV, que forma un puente funcional entre el plasmalema y la vesícula. Se han identificado una variedad de isoformas de sintaxina. Se han identificado dos isoformas de longitud ligeramente diferente (285 y 288 residuos) en las células del nervio (las isoformas 1A y IB), con isoformas 2, 3, 4 y 5 expresadas en otros tejidos. Las isoformas diferentes tienen sensibilidades que varían para BoNT/Cl, con las isoformas de sintaxina 1A, IB, 2 y 3 desdobladas por esta toxina. La presente invención provee una composición de substrato que incluye un agente de suministro y un substrato de toxina clostridial que contiene un fluoroforo donante; un aceptor que tiene un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que traslapa el espectro de emisión del fluoroforo donante; y una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que contienen un sitio de desdoblamiento que interviene entre el fluoroforo donante y el aceptor, en donde la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoroforo donante y el aceptor bajo las condiciones apropiadas. En una composición de substrato de la invención, el agente de suministro puede ser, por ejemplo, enlazado covalentemente al substrato de toxina clostridial y además puede ser, por ejemplo, una proteína, péptido o peptidomimético . En una modalidad, la composición del substrato es una proteína, péptido o peptidomimético quimérico en el cual el agente de suministro operativamente está fusionado al substrato de toxina clostridial. Así una composición de substrato quimérica puede ser, por ejemplo, un péptido o peptidomimético que tiene una longitud como máximo de 50 a 100 residuos. Pueden ser enlazados covalentemente una variedad de agentes de suministro al substrato de toxina clostridial en una composición de substrato de la invención que incluyen, sin limitación, una proteína de antenapedia o fragmento activo de la misma, tal como un fragmento activo que tiene la secuencia de aminoácidos RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 1); una proteína TAT DE VIH o fragmento activo de la misma, así como un fragmento activo que tiene la secuencia de aminoácidos YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO : 2 ) ; y una proteína de virus de herpes simplex VP22 o fragmento activo de la misma, tal como una proteína de virus de herpes simplex VP22 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO : 3 , o fragmento activo de la misma. La invención también provee composiciones de substrato en la cual el agente de suministro está asociado no covalentemente con el substrato de toxina clostridial . Los agentes de suministro ejemplares que pueden ser asociados no covalentemente con un substrato de toxina clostridial incluyen, sin limitación, Chariot™ Y péptidos MPG. Son útiles una variedad de fluoróforos donantees y aceptores en las composiciones de substrato de la invención. Como ejemplos sin limitación, los fluoróforos donantees útiles en la invención incluyen Alexa Fluorc, DABCYL y BODIPY. Los aceptores útiles en la invención incluyen aceptores no fluorescentes además de aceptores de fluoróforo; en una modalidad, el aceptor es un fluoróforo aceptor que tiene un tiempo de vida de fluorescencia de por lo menos 1 microsegundo . En otras modalidades, la invención provee una composición de substrato en la cual el aceptor es tetrametilrodamina, EDANS o QSYC 7. Los pares fluoróforo donante-aceptor ejemplarmente útiles en una composición de substrato de la invención incluyen, sin limitación, fluoresceína- tetrametilrodamina, Alexa Fluorc 488-tetrametilrodamina, DABCYL-EDANS , fluoresceína-QSYc 7, y Alexa FLuorc 488-QSYc 7. En las composiciones de substrato de la invención son útiles una variedad de substratos de toxina clostridial . Tales substratos de toxina clostridial incluyen substratos de toxina botulinum que contienen una secuencia de reconocimiento de toxina botulinum y substratos de toxina de tétanos que contienen una secuencia de reconocimiento de toxina de tétanos. Así en una modalidad de la invención, la invención provee una composición de substrato BoNT/A que contiene un agente de susministro y un substrato BoNT/A, donde el substrato incluye un fluoróforo donante; un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que traslapa el espectro de emisión del fluoróforo donante; y una secuencia de reconocimiento BoNT/A que contiene un sitio de desdoblamiento que interviene entre el fluoróforo donante y el aceptor y donde, bajo las condiciones apropiadas, la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoróforo donante y el aceptor. El substrato BoNT/A puede incluir, por ejemplo, por lo menos seis residuos consecutivos de SNAP-25, los seis residuos consecutivos que contienen Gln-Arg, o un peptidomimético de estos. Una composición de substrato BoNT/A de la invención puede ser, por ejemplo, un péptido o peptidomimético que tiene como máximo veinte, treinta, cuarenta, cincuenta o 100 residuos y puede incluir cualquiera de una variedad de combinaciones fluoróforo donante-aceptor tales como, sin limitación, fluoresceína-tetrametilrodamina, DABCYL-EDA S , y Alexa Fluor0 488-QSYc 7. La presente invención también provee una composición de substrato BoNT/B que contiene un agente de suministro y un substrato BoNT/B, donde el substrato incluye un fluoróforo donante; un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que traslapa el espectro de emisión del fluoróforo donante; y una secuencia de reconocimiento BoNT/B que contienen un sitio de desdoblamiento que interviene entre el fluoróforo donante y el aceptor y donde, bajo las condiciones apropiadas, la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoróforo donante y el aceptor. Un substrato BoNT/B útil en la invención puede incluir, por ejemplo, por lo menos seis residuos consecutivos de VAMP, los seis residuos consecutivos que contienen Gln-Phe, o un peptidomimético de estos. Una composición de substrato BoNT/B de la invención puede ser, por ejemplo, un péptido o peptidomimético que tiene como máximo veinte, treinta, cuarenta, cincuenta o 100 residuos. Se entiende que una variedad de combinaciones fluoróforo donante-aceptor son útiles en una composición de substrato BoNT/B de la invención; tales pares fluoróforo donante-aceptor incluyen, pero no están limitados a, fluoresceína-tetrametilrodamina, DABCYL-EDANS , y Alexa Fluorc 488-QSYc 7.
Además se proporciona en la presente una composición de substrato BoNT/Cl que contiene un agente de suministro y un substrato BoNT/Cl, donde el substrato incluye un fluoróforo donante; un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que traslapa el espectro de emisión del fluoróforo donante; y una secuencia de reconocimiento BoNT/Cl que contiene un sitio de desdoblamiento que interviene entre el fluoróforo donante y el aceptor y donde, bajo las condiciones apropiadas, la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoróforo donante y el aceptor. Los substratos BoNT/Cl útiles en las composiciones del substrato de la invención abarcan aquellos que tienen por lo menos seis residuos consecutivos de sintaxina, los seis residuos consecutivos que contienen Lys-Ala, o un peptidomimetico de estos, y aquellos que incluyen por lo menos seis residuos consecutivos de SNAP-25, los seis residuos consecutivos que contienen Arg-Ala, o un peptidomimético de estos. Una composición de substrato BoNT/Cl de la invención puede ser, por ejemplo, un péptido o peptidomimético que tiene una variedad de longitudes, por ejemplo, como máximo veinte, treinta, cuarenta, cincuenta o 100 residuos. Son útiles una variedad de combinaciones fluoróforo donante-aceptor en una composición de substrato BoNT/Cl de la invención incluyendo, sin limitación, fluoresceína-tetrametilrodamina , DABCYL-EDANS, y Alexa Fluorc 488-QSYc 7.
La invención también provee una composición de substrato BoNT/D que contiene un agente de suministro y un substrato BoNT/D, donde el substrato incluye un fluoroforo donante; un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que traslapa el espectro de emisión del fluoroforo donante; y una secuencia de reconocimiento BoNT/D que contienen un sitio de desdoblamiento que interviene entre el fluoroforo donante y el aceptor y donde, bajo las condiciones apropiadas, la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoroforo donante y el aceptor. Son útiles una variedad de substratos BoNT/D en las composiciones del substrato de la invención que incluyen, todavía sin limitarlos, los substratos BoNT/D que contienen por lo menos seis residuos consecutivos de VAMP, los seis residuos consecutivos que contienen Lys-Leu, o un peptidomimetico de estos. Como para las otras composiciones de substrato discutidas arriba, una composición de substrato BoNT/D puede ser un péptido o peptidomimético que tiene, por ejemplo, como máximo veinte, treinta, cuarenta, cincuenta o 100 residuos y puede incluir cualquiera de una variedad de combinaciones fluoroforo donante-aceptor tales como, por ejemplo, fluoresceína-tetrametilrodamina, DABCYL-EDANS , y Alexa Fluorc 488-QSYc 7. La invención adicionalmente provee una composición de substrato BoNT/E que contiene un agente de suministro y un substrato BoNT/E, donde el substrato incluye un fluoroforo donante; un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que traslapa el espectro de emisión del fluoroforo donante y una secuencia de reconocimiento BoNT/E que contiene un sitio de desdoblamiento que interviene entre el fluoroforo donante y el aceptor y donde, bajo las condiciones apropiadas, la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoroforo donante y el aceptor. Un substrato BoNT/E útil en la invención puede tener, por ejemplo, por lo menos seis residuos consecutivos de SNAP-25, los seis residuos consecutivos que contienen Arg-Ile, o un peptidomimético de estos. Una composición de substrato BoNT/E de la invención puede ser, por ejemplo, un péptido o peptidomimético que tiene como máximo veinte, treinta, cuarenta, cincuenta o 100 residuos. Tal composición de substrato además puede incluir, por ejemplo, una combinación fluoroforo donante-aceptor tal como fluoresceína- tetrametilrodamina , DABCYL- EDANS , y Alexa Fluorc 488-QSYc 7. También se provee aquí una composición de substrato BoNT/F que contiene un agente de suministro y un substrato BoNT/F, donde el substrato incluye un fluoroforo donante; un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que traslapa el espectro de emisión del fluoroforo donante; y una secuencia de reconocimiento BoNT/F que contiene un sitio de desdoblamiento que interviene entre el fluoroforo donante y el aceptor y donde, bajo las condiciones apropiadas, la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoroforo donante y el aceptor. Los substratos BoNT/F útiles en las composiciones del substrato de la invención pueden tener, por ejemplo, por lo menos seis residuos consecutivos de VA P, los seis residuos consecutivos que contienen Gln-Lys, o un peptidomimético de estos. Además, una composición de substrato BoNT/F de la invención puede ser, por ejemplo, un péptido o peptidomimético que tiene como máximo veinte, treinta, cuarenta, cincuenta o 100 residuos. Un experto en la técnica entiende que cualquiera de una variedad de combinaciones fluoroforo donante-aceptor son útiles en una composición substrato BoNT/F; estas incluyen, como ejemplos sin limitación, fluoresceína-tetrametilrodamina, DABCYL-EDANS , y Alexa Fluorc 488-QSYc 7. La presente invención además provee una composición de substrato BoNT/G que contiene un agente de suministro y un substrato BoNT/G, donde el substrato incluye un fluoroforo donante; un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que traslapa el espectro de emisión del fluoroforo donante; y una secuencia de reconocimiento BoNT/G que contienen un sitio de desdoblamiento que interviene entre el fluoroforo donante y el aceptor y donde, bajo las condiciones apropiadas, la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoroforo donante y el aceptor. Los substratos BoNT/G útiles incluyen, todavía sin limitarlos, aquellos que contienen por lo menos seis residuos consecutivos de VAMP, los seis residuos consecutivos que contienen Ala-Ala, o un peptidomimético de estos. Una composición de substrato BoNT/G de la invención puede ser, por ejemplo, un péptido o peptidomimético que tiene como máximo veinte, treinta, cuarenta, cincuenta o 100 residuos y puede incluir, por ejemplo, una variedad combinación de fluoróforo donante -aceptor tal como fluoresceína-tetrametilrodamina, DABCYL-EDA S, y Alexa Fluorc 488-QSY0 7. La invención también provee una composición de substrato TeNT que contiene un agente de suministro y un substrato TeNT, donde el substrato incluye un fluoróforo donante; un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que traslapa el espectro de emisión del fluoróforo donante; y una secuencia de reconocimiento TeNT que contienen un sitio de desdoblamiento que interviene entre el fluoróforo donante y el aceptor y donde, bajo las condiciones apropiadas, la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoróforo donante y el aceptor. Son útiles una variedad de substratos TeNT en las composiciones del substrato de la invención que incluyen aquellos que tiene por lo menos seis residuos consecutivos de VAMP, los seis residuos consecutivos que contienen Gln-Phe, o un peptidomimético de estos. Una composición de substrato TeNT de la invención puede ser, por ejemplo, un péptido o peptidomimético que tiene como máximo veinte, treinta, cuarenta, cincuenta o 100 residuos. Además, son útiles una variedad de combinaciones fluoróforo donante-aceptor en una composición de substrato TeNT de la invención; estas combinaciones incluyen pero no están limitadas a fluoresceína- tetrametilrodamina, DABCYL-EDANS , y Alexa Fluorc 488-QSYc 7. En las composiciones de substrato de la invención, un agente de suministro facilita la absorción de un substrato de toxina clostridial en una célula como neurona o una célula glandular tal como una célula acinar pancreática. El agente de suministro puede estar enlazado covalentemente al substrato de toxina clostridial o puede estar asociado no covalentemente con el substrato de toxina clostridial . Como ejemplos sin limitación, los agentes de suministro útiles en las composiciones de substrato de la invención incluyen proteínas de antenapedia, proteínas TAT del VIH, proteínas de virus de herpes simplex VP22, y fragmentos activos de estas, además de agentes de suministro tales como Chariot™ y otros péptidos MPG, cada uno de los cuales se discute más aquí a continuación. Como se usa aquí, el término "agente de suministro" significa cualquier molécula que hace posible o mejora la internalización de un substrato de toxina clostridial asociado o enlazado dentro de una célula. Los agentes de suministro son conocidos en la técnica e incluyen pero no están limitados a péptidos y peptidomiméticos de transducción de proteína y péptidos y peptidomiméticos permeantes de célula. El término agente de suministro abarca, sin limitación, proteínas, péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas, moléculas de ácido nucleico, liposomas, lípidos, virus, retrovirus y células. Se entiende que una composición de substrato que contiene un agente de suministro útil en la invención generalmente no se retiene en las vesículas intracelulares en la internalización sino que además eventualmente se suministra, por ejemplo, al citoplasma. Así, el término agente de suministro abarca, sin limitación, moléculas que transportan substrato asociado o enlazado al citoplasma o núcleo de la célula. Además se entiende que el término "agente de suministro" abarca moléculas que se internalizan por cualquier mecanismo, incluyendo agentes de suministro cuya función vía endocitosis mediante receptor y aquellos que son independientes de endocitosis mediante receptor . Una variedad de agentes de suministro pueden ser enlazados covalentemente a un substrato de toxina clostridial en una composición de la invención, que incluye, sin limitación, péptidos de transducción de proteína, péptidos permeantes de célula, fosfopéptidos , péptidos que contienen aminoácidos -D , y otras proteínas, péptidos y peptidomiméticos desnaturalizados o plegados, modificados o no modificados, y que se presentan naturalmente o sintéticas. Tales agentes de suministro incluyen, sin limitación, proteínas y fragmentos activos nucleares y secretados y análogos de estos. En modalidades particulares, un agente de suministro útil en la invención es un péptido o peptidomimético que tiene una longitud de menos que 50 residuos, una longitud de menos que 40 residuos, una longitud de menos que 30 residuos, una longitud de menos que 20 residuos, o una longitud de menos que 15 residuos. En una modalidad más, un agente de suministro útil en la invención es un péptido o peptidomimético hidrofóbico predominantemente. En otra modalidad, un agente de suministro útil en la invención es un péptido o peptidomimético predominantemente básico. En todavía otra modalidad, un agente de suministro útil en la invención es un péptido o peptidomimético helicoidal-como un péptido o peptidomimético helicoidal-a amfipático. En una modalidad más, un agente de suministro útil en la invención es un péptido o peptidomimético amfipático como un péptido o peptidomimético amfipático básico. Y, en una modalidad más, un agente de suministro útil en la invención es un péptido o peptidomimético desnaturalizado, el cual está enlazado a un substrato de toxina clostridial desnaturalizado o plegado; la desnaturalización ha mostrado facilitar la internal i zación como se describe, por ejemplo, en WO 99/55899. Como ejemplos sin limitación, los agentes de suministro apropiados para uso en la invención cuando se enlazan covalentemente a un substrato de toxina clostridal incluyen el factor neurotrófico ciliar (CNTF, por sus siglas en inglés) o un fragmento activo de éste; caveolina o un fragmento activo de estos; interleucin- 1 ß (IL-?ß) o un fragmento activo de éste; tioredoxina o un fragmento activo de esta; Antennapedia o un fragmento activo de éste tal como penetratina- 1 (SEQ ID NO: 1) ; factor de crecimiento de fibroblastos - 1 (FGF-1) o un fragmento activo de éste; Engrailed o un fragmento activo de éste; Hoxa-5 o un fragmento activo de éste; factor de crecimiento de fibroblasto de kaposi (kFGF, por sus siglas en inglés) o un fragmento activo de éste, por ejemplo, AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO:22); integrina humana ß3 o un fragmento activo de éste tal como una secuencia de señal hidrofóbica; una secuencia de localización nuclear (NLS, por sus siglas en inglés) tal como un TPPKKKRKVEDP (SEQ ID NO: 23) ; FGF-2 o un fragmento activo de éste; transportan o un fragmento activo de éste como un GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 24) ; lactoferrina o un fragmento activo de ésta; VP22 o un fragmento activo de éste; transactivador VIH tipo I (TAT DE VIH) o un fragmento activo de éste como YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2) ; o una proteína de choque de calor tal como HSP70 o un fragmento activo de la misma. Estos y agentes de suministro adicionales son bien conocidos en la técnica como se describe, por ejemplo, en Ho, Cáncer Res. 61:474-477 (2001); Schwarze y Dowdy, Trends Pharmacol . Sci. 21:45-48 (2000); Prochiantz, Curr . Opin. Cell Biol . 12:400-406 (2000); Ford y colaboradores, Gene Therapy 8:1-4 (2001) ; Dunican y Doherty, Biopolymers Peptide Sci. 60:45-60 (2001); y Schwartz y Zhang, Curr. Opin. Mol. Ther. 2:162-167 (2000) . En una modalidad, la invención se practica con un agente de suministro el cual es una homeoproteína o un fragmento activo de éste, por ejemplo, un homeodominio o un fragmento activo de éste. Las homeoproteínas son proteínas de hélice-giro-hélice que contienen un dominio de que unen ADN de alrededor de 60 residuos, denotado el homeodominio. Pueden ser agentes de suministro útiles en la invención una variedad de homeoproteínas, homeodominios y fragmentos activos de estos incluyendo, sin limitación, Antennapedia, Engrailedl (Enl) , Engrailed2 (En2), Hoxa-5, Hoxc-8, Hoxb-4 y 1 de nudos (KN1) . Como un e emplo, el Enl y Enl se han expresado en células C0S7, donde se secretan primero y luego internalizadas por otras células. Ver, por ejemplo, Prochiantz, supra, 2000. En otra modalidad, una composición de substrato de la invención incluye un agente de suministro el cual es la proteína de homeodominio , Antennapedia , o un fragmento activo de estos. La Antennapedia es un miembro de una familia de homeoproteínas de Drosophila importantemente desarrollado el cual transubica membranas neuronales atravesadas. La tercera hélice del homeodominio de Antennapedia, el péptido de residuo 16 "penetratin- 1" (SEQ ID NO: 1), se internaliza en las células vivas. La internalización ocurre tanto a los 37°C como a los 4°C, indicando que el suministro no es ni mediado por el receptor ni dependiente de energía. Los agentes de suministro adicionales incluyen péptidos y peptidomiméticos relacionados en secuencia con el Penetratin-1 tal como, sin limitación, uno de los péptidos mostrados abajo en la Tabla A u otro péptido o peptidomimetico derivado de penetratin, que incluye un retroinverso o péptido o peptidomimético que es todo de aminoácido D, o un péptido o peptidomimético no helicoidal -o¡ pero relacionado (ver, por ejemplo, Prochiantz, supra, 2000) . En una modalidad, un péptido derivado de penetratina retiene los residuos de triptofano, fenilalanina y glutamina del penetratina- 1 (SEQ ID NO: 1) .
TABLA A PEPTIDOS DERIVADOS DE PENETRATINA UTILES COMO AGENTES DE SUMINISTRO Péptido Secuencia SEQ ID NO: 43-58 RQIKIWFQNRRMKWKK 1 58-43 KKWKMRRNQFWIKIQR 25 43-58 RQIKIWFQNRRMKWKK 26 Pro50 RQIKIWFPNRRMKWKK 27 3 Pro RQPKIWFPNRRMPWKK 28 Met-Arg RQIKIWFQNMRRKWKK 29 7Arg RQIRIWFQNRRMRWRR 30 W/R RRWRRWWRRWWRRWRR 31 En otra modalidad, una composición de substrato de la invención incluye un agente de suministro el cual es una proteína activadora trans de VIH (TAT) o un fragmento activo de la misma. Tal agente de suministro puede incluir, por ejemplo, una secuencia idéntica o similar para los residuos 47-57 ó 47-59 de TAT de VIH (Schwartz y colaboradores, Science 285:1569-1572 (1999); y Ho y colaboradores, supra, 2001) . Como un ejemplo, las proteínas de fusión que incluyen residuos 47-57 de TAT de VIH (YGRKKRRQRRR; SEQ ID NO: 2) que atraviesa la membrana de plasma de, por ejemplo, células humanas y de murino in vi tro e in vivo (Schwartz y Zhang, supra, 2000) ; se han mostrado una variedad de proteínas desde 15 hasta 120 KDa para retener la actividad biológica cuando se fusionan a un agente de suministro TAT de VIH. Un agente de suministro TAT de VIH puede ser cargado positivamente y puede puncionar, por ejemplo, de una manera independiente de energía, receptor, transportador y endocitosis para suministrar un substrato de toxina clostridial enlazado covalentemente , por ejemplo, a 90-100% de las células obj etivo . Una composición de substrato de la invención también puede incluir como un agente de suministro una proteína VP22 o un fragmento activo de la misma. En una modalidad, una composición de substrato de la invención incluye una proteína VP22 HSV tipo 1 (HSV-1) o fragmento activo de la misma. La HSV VP22, un factor de transcripción nuclear, puede atravesar la membrana de plasma a través de endocitosis no clásica y puede introducir células independientes de uniones GAP y contactos físicos. Como una fusión con una variedad de proteínas diferentes, la HSV VP22 resulta en absorción en células de tipos diferentes que incluyen células diferenciadas terminalmente (Ford y colaboradores, supra, 2001; Schwartz y Zhang, supra, 2000) y pueden funcionar para suministrar un substrato de toxina clostridial enlazado, por ejemplo, 90-100% de las células cultivadas. En otra modalidad, un agente de suministro útil en la invención corresponde a, o se deriva de, una secuencia de señal hidrofóbica. Tal agente de suministro puede ser, por ejemplo, el factor de crecimiento de fibroblasto Kaposi (KFGF) o un fragmento activo de éste tal como AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO: 22); la integrina humana ß3 o un fragmento activo de la misma; u otro agente de suministro hidrofóbico tal como uno de aquellos descritos en Dunican y Doherty, supra, 2001. Un agente de suministro útil en la invención también puede ser una secuencia sintética que comparte una o más características de un agente de suministro que ocurre naturalmente tal como un dominio de transducción de proteína (DTP) . Tales agentes de suministro incluyen, pero no están limitados a, oligómeros de arginina -L y -D, por ejemplo, o meros de argenina -L o -D y peptoides relacionados (Wender y colaboradores, Pro . Nati. Acad. Sci., USA 97:13003-13008 (2000) . Tales agentes de suministro además incluyen péptidos y petidomiméticos básicos; péptidos o peptidomiméticos helicoidales- oí básicos; y péptidos o peptidomiméticos con alineación de arginina optimizada o carácter helicoidal -a optimizado comparado con un dominio de transducción de proteína que ocurre naturalmente tal como residuos 47-57 o TAT DE VIH. Ver, por ejemplo, Ho y colaboradores, supra, 2001, y WO 99/29721. Ejemplos sin limitación adicionales de agentes de suministro útiles en la invención incluyen SC Kn (SEQ ID NO: 32) ; (LARL)n (SEQ ID NO: 33) ; HA2 ; RGD; K16RGD (SEQ ID NO: 34); oligómero; AlkCWK18 (SEQ ID NO: 35); DÍCWK18 (SEQ ID NO: 36); DIpaLytic; Plae (SEQ ID NO: 37); Kplae (SEQ ID NO: 38) y otros agentes de suministro conocidos en la técnica o los cuales pueden ser preparados por métodos de rutina (ver, por ejemplo, Schwartz y Zhang, supra, 2000) . La persona experta entiende que estos y otros agentes de suministro sintéticos y que se presentan naturalmente pueden ser útiles en las composiciones de substrato de la invención. Un agente de suministro útil en la invención también puede ser un agente que hace posible o mejora la absorción celular de un substrato de toxina clostridial asociado no covalentemente . En una modalidad, tal agente de suministro es un péptido que contiene dos dominios independientes: un dominio hidrofóbico y un dominio hidrofílico. En otra modalidad, tal agente de suministro es un péptido MPG, el cual es un péptido derivado tanto de la secuencia de localización nuclear (NLS) de antígeno T grande SV40 y el dominio de péptido de fusión de VIH-1 gp41. En una modalidad más, tal agente de suministro es un péptido MPG que tiene la secuencia de aminoácidos GALFLGFLGAAGSTMGA SQPKSKRKV (SEQ ID NO: 39) . En todavía una modalidad más, tal gente de suministro es un péptido amfipático tal como Pep-1. Estos y agentes de suministro relacionados que funcionan en la ausencia de enlace covalente, a veces conocidos como "productos de transfección de proteína" , son bien conocidos en la técnica como se describió, por ejemplo, en Morris y colaboradores, Nucí. Acids Res. 27:3510-3517 (1999); Morris y colaboradores, J. Biol . Chem. 274:24941-24946 (1999); y Morris y colaboradores, Nature Biotech. 19:1173-1176 (2001). Tales agentes de suministro de péptido pueden ser preparados por métodos rutinarios y están disponibles comercialmente ; como un ejemplo, el producto Chariot™ está disponible de Active Motif (Carlsbad, CA) . Un substrato de toxina clostridial útil en la invención incluye, en parte, un fluoróforo donante. Como se usa en la presente, el término "fluoróforo donante" significa una molécula que, cuando se irradia con luz de una cierta longitud de onda, emite luz, también denota fluorescencia, de una longitud de onda diferente. El término fluoróforo es sinónimo en la técnica con el término "fluorocromo" . Un substrato de toxina clostridial útil en la invención también incluye, en parte, un aceptor. Como se usa en la presente, el término "aceptor" significa una molécula que puede absorber energía de, y en excitación de, un fluoróforo donante y es un término que abarca fluoróforos además de moléculas no fluorescentes. Un aceptor útil en un substrato de toxina clostridial tiene un espectro de absorbancia el cual traslapa el espectro de emisión de un fluoróforo donante incluido en el substrato. Un aceptor útil en la invención generalmente tiene mejor absorción baja en una longitud de onda apropiada para excitación del fluoróforo donante.
Como se estableció arriba, un aceptor tiene un espectro de absorbancia que traslapa el espectro de emisión del fluoroforo donante. El término "que traslapa", como se usa en la presente en referencia al espectro de absorbancia de un aceptor y el espectro de emisión de un fluoroforo donante, significa un espectro de absorbancia y espectro de emisión que están compartidos parcial o completamente. Así, en tales espectros que traslapan, la terminación alta del rango del espectro de emisión del fluoroforo donante es más alta que la terminación baja del rango del espectro de absorbancia del aceptor . Un substrato de toxina clostridial útil en la invención contiene un sitio de desdoblamiento que "interviene" entre un fluoroforo donante y un aceptor que tiene un espectro de absorbancia el cual traslapa el espectro de emisión del fluoroforo donante. Así, El sitio de desdoblamiento se posiciona entre el fluoroforo y el aceptor de manera que el desdoblamiento en el sitio resulta en una primera molécula que contiene un fluoroforo y una segunda molécula que contiene el aceptor. Se entiende que toda o solamente una porción de la secuencia de reconocimiento de la toxina clostridial puede intervenir entre el fluoroforo donante y el aceptor . Un substrato de toxina clostridial útil en la invención contiene, en parte, una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial la cual incluye un sitio de desdoblamiento. Tal substrato de toxina clostridial es susceptible para desdoblar mediante por lo menos una toxina clostridial bajo condiciones apropiadas para la actividad de proteasa de toxina clostridial . Como se usa aquí, el término "secuencia de reconocimiento de toxina clostridial" significa una unión hendible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes suficiente para proteolisis detectable en la unión hendible mediante una toxina clostridial bajo condiciones apropiadas para la actividad de proteasa de la toxina clostridial. Aquí posteriormente se discuten una variedad de secuencias de reconocimiento de toxina clostridial útiles. En unas modalidades particulares, una composición de substrato de la invención es una proteína, péptido o peptidomimético quimérico. Una composición de substrato de la invención puede ser, por ejemplo, un péptido o peptidomimético quimérico que tiene como máximo 20 residuos, como máximo 40 residuos, como máximo 50 residuos, como máximo 100 residuos, como máximo 150 residuos, como máximo 200 residuos, como máximo 250 residuos, como máximo 300 residuos, como máximo 3500 residuos o como máximo 400 residuos. Como se usa en la presente, el término "peptidomimético" se usa ampliamente para significar una molécula similar a un péptido que se desdobla mediante la misma toxina clostridial como el substrato de péptido en el- cual este está basado estructuralmente . Tales paptidomiméticos incluyen péptidos modificados químicamente, moléculas similares a péptidos que contienen aminoácidos que no se presentan naturalmente, y peptoides, los cuales son moléculas similares a péptidos que resultan de ensamble oligomérico de glicinas sustituidas-N, y están desdobladas por la misma toxina clostridial como el substrato de péptido en el cual el peptidomimético se deriva (ver, por ejemplo, Goodman y Ro, Peptidomimetics for Drug Design, en "Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery" Vol 1 (ed. M.E. Wolf; John Wiley & Sons 1995), páginas 803-861) . Se conocen en la técnica una variedad de peptidomiméticos incluyendo, por ejemplo, moléculas similares a péptidos que contienen un aminoácido restringido, un componente no péptido que imita la estructura secundaria de péptido, o una amina unida a un isóstero. Un peptidomimético que contiene un aminoácido que no ocurre naturalmente restringido puede incluir, por ejemplo, un aminoácido a-metilado; una glicina de dialquilo-a, a o un ácido carboxílico de a-aminocicloalcano ; un aminoácido ciclizado lf-Ca; un aminoácido metilado Na; un ácido carboxílico de ß o ?-aminocicloalcano ; un a, ß-aminoácido insaturado; un aminoácido de ß-metilo o ß , ß-dimetilo ; un aminoácido ß-sustituido-2 , 3 -metano; un aminoácido ciclizado NCS o Ca-C6; o una prolina sustituida u otro mimético de aminoácido. Además, un peptidomimético el cual imita estructura secundaria de péptido puede contener, por ejemplo, imitador de giro ß no peptídico; imitador de giro ?; imitador de estructura de lámina ß; o imitador de estructura helicoidal, cada uno de los cuales es bien conocido en la técnica. Un peptidomimético también puede ser una molécula similar al péptido la cual contiene, por ejemplo, una enlace de amida a isóstero tal como una modificación retro-inverso; enlace de amida reducida; enlace de metilenotioéter o metilensulfóxido ; enlace de éter de metileno; enlace de etileno; enlace de tioamida; enlace de transolefina o fluorolefina ; anillo de tetrazol 1 , 5 -disubstituido; enlace de cetometileno o fluorocetometileno u otro isóstero de amida. Un experto en la técnica entiende que estos y otros peptodomiméticos están comprendidos dentro del significado del término "peptidomimético" como se usa en la presente. Además se provee aquí una célula que contiene un substrato de toxina clostridial que incluye un fluoroforo donante; un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que traslapa el espectro de emisión del fluoroforo donante; y una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que contienen un sitio de desdoblamiento que interviene entre el fluoroforo donante y el aceptor, en donde la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoróforo donante y el aceptor bajo las condiciones apropiadas. En una modalidad, la célula es una célula transfectada . En otra modalidad, la célula es una célula transfectada establemente. Son útiles una variedad de células en la invención que incluyen, sin limitación, células primarias; células establecidas; células humanas; células neuronales tales como neuronas primarias, neuronas establecidas y neuronas humanas; y células no neuronales, las cuales pueden ser, por ejemplo, células glandulares tales como células acinar pancreáticas. Las neuronas útiles en la invención incluyen neuronas SNC y neuronas periféricas; como ejemplos no limitantes, tales neuronas incluyen células de neuroblastoma, neurona de la médula espinal, neuronas de ganglio de raíz dorsal, neuronas de corteza cerebral, neuronas cerebelares, neuronas hipocampales y neuronas motoras. En una célula de la invención, el substrato de toxina clostridial opcionalmente puede estar enlazado covalentemente a un agente de suministro. Tal agente de suministro puede ser, por ejemplo, una proteína, péptido o peptidomimético . Pueden ser útiles una variedad de agentes de suministro en una célula de la invención que incluyen, sin limitación, una proteína antennapedia o un fragmento activo de la misma, tal como un fragmento activo que tiene la secuencia de aminoácidos RQIKIWFQNRRMK KK (SEQ ID NO: 1) ; una proteína TAT de VIH o un fragmento activo de éste, tal como un fragmento activo que tiene la secuencia de aminoácidos YGRKK RQRRR (SEQ ID NO: 2) ; o una proteína VP22 de virus de herpes simplex o un fragmento activo de éste, tal como una proteína de virus de herpes simplex VP22 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO : 3 , o fragmento activo de la misma. En una modalidad, la invención provee una célula que contiene una proteína, péptido o peptidomimético quimérico que incluye un substrato de toxina clostridial y un agente de suministro fusionado operativamente al substrato. Tal proteína, péptido o peptidomimético quimérico puede tener, por ejemplo, una longitud de como máximo 50 ó 100 residuos. Pueden estar incluidos una variedad de substratos de toxina clostridial en una célula de la invención. Tales substratos de toxina clostridial incluyen substratos de toxina de botulinum de todos los serotipos además de substratos de toxina de tétanos. En una modalidad, la invención provee una célula que contiene un substrato BoNT/A que incluye, en parte una secuencia de reconocimiento BoNT/A. Tal substrato BoNT/A puede incluir, por ejemplo, por lo menos seis residuos consecutivos de SNAP-25, los seis residuos consecutivos que contienen Gln-Arg, o un peptidomimético de estos. En otra modalidad, la invención provee una célula que contiene un substrato BoNT/B el cual incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento BoNT/B . Los substratos BoNT/B útiles en las composiciones de substratos de la invención incluyen, sin limitación, aquellos que tiene por lo menos seis residuos consecutivos de VAMP, los seis residuos consecutivos que contienen Gln-Phe, o un peptidomimético de estos. En una modalidad más, la invención provee una célula que contiene un substrato BoNT/Cl que incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento BoNT/Cl; los substratos BoNT/Cl útiles en las células de la invención abarcan aquellos que tienen por lo menos seis residuos consecutivos de sintaxina, los seis residuos consecutivos que contienen Lys-Ala, o un peptidomimético de estos, y aquellos que incluyen por lo menos seis residuos consecutivos de SNAP-25, los seis residuos consecutivos que contienen Arg-Ala, o un peptidomimético de estos. En otra modalidad, la invención provee una célula que contiene un substrato BoNT/D que incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento BoNT/D. Son útiles una variedad de substratos BoNT/D en las células de la invención incluyendo, todavía no limitados a, substratos BoNT/D que tienen por lo menos seis residuos consecutivos de VAMP, los seis residuos consecutivos que contienen Lys-Leu, o un peptidomimético de estos. En una modalidad más, la invención provee una célula que contiene un substrato BoNT/E que incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento BoNT/E. Tal substrato BoNT/E puede tener, por ejemplo, por lo menos seis residuos consecutivos de SNAP-25, los seis residuos consecutivos que contienen Arg-Ile, o un peptidomimético de estos. En una modalidad adicional, hay provisto aquí una célula que contiene un substrato BoNT/F que incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento BoNT/F. Los substratos BoNT/F útiles en las células de la invención pueden tener, por ejemplo, por lo menos seis residuos consecutivos de VAMP, los seis residuos consecutivos que contienen Gln-Lys, o un peptidomimético de estos. En todavía una modalidad más, la invención provee una célula que contiene un substrato BoNT/G que incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento BoNT/G. Los substratos BoNT/G útiles incluyen, todavía no están limitados, aquellos que tiene por lo menos seis residuos consecutivos de VAMP, los seis residuos consecutivos que contienen Ala-Ala, o un peptidomimético de estos. En una modalidad más, la presente invención provee una célula que contiene un substrato TeNT que incluye, en parte, una secuencia de reconocimiento TeNT. Son útiles una variedad de substratos TeNT en la invención incluyendo aquellos que tienen por lo menos seis residuos consecutivos de VAMP, los seis residuos consecutivos que contienen Gln-Phe, o un peptidomimético de estos. Además como se describió aquí, son útiles una variedad de fluoróforos donantees y aceptores en las células de la invención. Los fluoróforos donantees útiles en la invención incluyen, sin limitación, Alexa Fluorc 488, DABCYL y BODIPY. Los aceptores útiles en la invención incluyen aceptores no fluorescentes además de aceptores de fluoróforo, incluyendo aceptores de fluoróforo que tiene un tiempo de vida de fluorescencia de por lo menos 1 microsegundo . Los aceptores útiles en las células de la invención además incluyen tetrametilrodamina, EDANS y QSYC 7. El término "célula", como se usa en la presente, significa cualquier célula eucariótica que expresa, o puede ser diseñada para expresar, por lo menos un receptor que une una toxina clostridial. El término célula abarca, sin limitación, células primarias; células cultivadas; células establecidas; células normales; células transformadas; células de tumor; células infectadas; células transíectadas estable y transitoriamente, incluyendo células transíectadas estable y transitoriamente; y células diferenciadas de proliferación y terminalmente, además de células de una variedad de especies y tipos de células. Así, el término célula abarca, sin limitación, células mamíferas tales como células de murino, rata, porcino, bovino, equino, primate y humano. Se entiende que las células útiles en la invención pueden estar en cualquier estado tal como proliferación o quiescente; intactas o permeabilizadas como a través de electroporación o tratamiento con digitonina; y además pueden estar en forma aislada o parte de una población de células heterogéneas, tejido u organismo. Además se entiende que las células útiles en la invención incluyen aquellas que expresan un substrato de toxina clostridial bajo control de un promotor constitutivo o inducible y que estas y otras células útiles en la invención puedan expresar una o más proteínas objetivo de toxina clostridial endógenas o puedan expresar niveles bajos o indetectables de una o todas las proteínas objetivo tales como SNAP-25, VAMP y sintaxina. Las células útiles en la invención incluyen aquellas que expresan uno o más receptores de toxina clostridial de afinidad baja o alta; células que expresan niveles bajos o indetectables de receptor endógeno y que se han transfectado con, o diseñado de otra manera para expresar, una o más moléculas de ácido nucleico exógeno que codifican uno o más receptores de toxina clostridial; y células que expresan una combinación de receptores de toxina endógena y exógena para uno o más serotipos de toxina clostridial. Se entiende que la selección de una célula depende, en parte, de cuál toxina clostridial está para ser ensayada. Como un ejemplo, para ensayar para la actividad BoNT/A, uno selecciona una célula que expresa o puede ser diseñada para expresar un receptor de afinidad baja o alta para BoNT/A. En una modalidad, la invención provee una neurona que contiene un substrato de toxina clostridial que incluye un fluoróforo donante, un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que traslapa el espectro de emisión del fluoróforo donante, y una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que incluye un sitio de desdoblamiento, donde el sitio de desdoblamiento interviene entre el fluoróforo donante y el aceptor y donde la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoróforo donante y el aceptor bajo las condiciones apropiadas. Pueden ser útiles en la invención una variedad de neuronas. Como ejemplos sin limitación, una neurona útil en la invención puede ser una neurona primaria; neurona establecida; neurona transformada; neurona transfectada establemente; o neurona motora o sensorial, y además pueden ser, por ejemplo, una neurona de mamífero, murino, rata, primate o humano. Una neurona útil en la invención puede ser una neurona periférica o neurona del SNC; como ejemplos sin limitación, pueden ser útiles en la invención neuronas de médula espinal tales como neuronas de médula espinal embriónicas, neuronas de ganglio de raíz dorsal (DRG) , neuronas de corteza cerebral, neuronas cerebelar, neuronas hipocampal o neuronas motoras como se describió más adelante.
Las neuronas ejemplares útiles en la invención incluyen, pero no están limitadas a, cultivos primarios de neuronas embriónicas DRG, por ejemplo, cultivos primarios de neuronas de rata embriónicas DRG como se describe en Welch y colaboradores, Toxicon 38:245-258 (2000); y cultivos primarios de neuronas de médula espinal fetal, por ejemplo, cultivos primarios de neuronas de médula espinal fetales de murino como se describe en Nale y colaboradores, J. Cell Biol. 147:1249-1260 (1999), o Chaddock y colaboradores, Infect. Immun. 68:2587-2593 (2000). Las líneas de célula neuronal ejemplares útiles en la invención incluyen, sin limitación, líneas de célula de neuroblastoma tales como LA-N-2, SH-SY5Y , N2a, NS-20Y y NIE-115; líneas de célula híbridas, que incluyen híbridos de neuroblastoma/glioma tales como NG108-C15; líneas de célula de neurona motora tal como NSC-34 y NSC-19; líneas de célula de médula espinal tal como M4b; líneas de célula CNS; líneas de célula de corteza cerebral tal como CNh; líneas de célula de ganglio de raíz dorsal tal como G4b; líneas de célula hipocampal tal como HT-22; y líneas de célula de feocromocitoma tal como PC12. Una línea de célula neuronal útil en la invención puede ser, por ejemplo, una línea de célula de neuroblastoma tal como una línea de célula de neuroblastoma de murino, primate o humano. Las líneas de célula de neuroblastoma ejemplares útiles en la invención incluyen, sin limitación, LA-N-2, SH-SY5Y, N2A, NS-20Y y NIE-115. Como un ejemplo, la invención puede ser practicada con la línea de célula de neuroblastoma humana LA-N-2, la cual tiene propiedades de neuronas colinérgicas y expresa marcadores colinérgicos bien caracteri2ados (Rylett y colaboradores, J. Neurochem. 61:1388-1397 (1993); Singh y colaboradores, J. Neurosci. Res. 25:476-485 (1990); y Yeh y colaboradores, Neuroscience 27:309-315 (1988)). Como un ejemplo más, la invención puede ser practicada con la línea de célula de neuroblastoma humana SH-SY5Y, la cual exhibe inhibición de liberación de [3H] -noradrenalina inducida por K+/Ca2+ en la exposición a la toxina de botulinum (Purkiss y colaboradores, Neurotoxicology 22 :447-453 (2001) ) . Las líneas de célula neuronal híbrida tal como líneas de célula neuronal híbrida humana y de primate también pueden ser útiles en la invención. Tales líneas de célula híbrida incluyen híbridos de neuroblastoma tal como híbridos de neuroblastoma/glioma . Como un ejemplo, la línea de célula NG108-C15 es un híbrido de células de neuroblastoma de ratón y glioma de rata que puede ser útil en la invención (Yokosawa y colaboradores , Infect. Immun. 57:272-277 (1989) ; Yokosawa y colaboradores, Toxicon 29;261-264 (1991)). La línea de célula NG108-C15 puede ser preparada por ingeniería para incluir, por ejemplo, un substrato de BoNT/Cl para ensayar la actividad de BoNT/Cl . Las líneas de célula de híbrido adicionales incluyen líneas de célula NSC, las cuales son híbridos de neuroblastomas y neuronas de médula espinal que se asemeja a las neuronas motoras de desarrollo (Cashman y colaboradores, Dev. Dyn. 194:209-221 (1992)) .
Una línea de célula neuronal útil en la invención también puede ser una línea de célula de neurona motora tal como una línea de célula de neurona motora de murino, primate o humano. Las MSC-34 y NSC-19 son líneas de célula de neurona motora ejemplares útiles en la invención; estas líneas de célula, que son híbridos clónales de neuronas motoras de neuroblastoma de ratón (N18TG2) y de médula espinal de ratón embriónícas (de 12-14 días) aisladas, expresan características de neurona motora y exhiben un fenotipo similar a la neurona multipolar (Eggett y colaboradores, J. Neurochem. 74:1895-1902 (2000)). Las células NSC-34 y NSC-19 expresan niveles altos de acetiltransferasa de colina (CHAT) , un marcador de neuronas motoras. Estas células también generan potenciales de acción; expresan proteínas triplete de neurofilamento ; y sintetizan, almacenan y liberan aceti1colina . Una línea de célula neuronal útil en la invención también puede ser una línea de célula de médula espinal tal como una línea de célula de médula espinal de murino, primate o humano. Como un ejemplo, una línea de célula de médula espinal de humano puede ser generada desde precursores de células de médula espinal embriónícas humanas (embriones del primer trimestre) que son inmortalizadas con un oncógeno represible de tetraciclina v-myc como se describe en Li y colaboradores, J. Neurosci . Res. 59:342-352 (2000). Tales células pueden ser expandidas indefinidamente en condiciones de crecimiento proliferativo antes de diferenciación rápida (4-7 días) en neuronas funcionales que expresan marcadores fenotípicos neuronales tales como acetiltransferasa de colina. Como otro ejemplo, una línea de célula de médula espinal de murino puede ser preparada por inmortalización de un cultivo de médula espina embriónica que usa medio de transformación. Tal línea de célula de médula espinal puede ser, por ejemplo, la línea M4b de murino y puede expresar marcadores neuronales tales como NSE, sinaptofisina , AP-2, y acetiltransferesa de colina y libera acetilcolina con estimulación apropiada (Cárdenas y colaboradores, J. Neurosci . Res. 68:46-58 (2002)). Las líneas de célula del sistema nervioso central (SNC) humano, que incluyen líneas de células del SNC murino, primate y humano, también pueden ser útiles en la invención. Una línea de célula CNS útil puede ser, por ejemplo, una línea de célula CNS humana inmortalizada con un oncógeno represible de tetraciclina v-myd como se describe en Sah y colaboradores, NAture Biotechnol . 15:574-580 (1997) . Con la represión del oncógeno, las células se diferencian en neuronas . Las líneas de célula de corteza cerebral (CNh) también son neuronas útiles en la invención. Las líneas de célula de corteza cerebral útiles incluyen, pero no están limitadas a, líneas de célula de murino, primate y humano. Como un ejemplo, los cultivos primarios de corteza de murino de embriones de 12-16 días pueden ser inmortalizados, por ejemplo, por cultivo de células en medios acondicionados de una línea de célula de tiroides de rata que induce transformación in vitro. Las células inmortalizadas pueden ser diferenciadas en neuronas que expresan marcadores neuronales usando el medio apropiado; estas células diferenciadas expresan acetiltransferasa de colina y recetan acetilcolina y glutamato en respuesta a la despolarización y estimulación de nicotina (Alien y colaboradores, Eur. J. Neurosci. 12:3259-3264 (2000)). Las líneas de célula de ganglio de raíz dorsal que incluyen líneas de célula de ganglio de raíz dorsal de murino, primate y humano también pueden ser útiles en la invención. Los cultivos primarios de ganglio de raíz dorsal embriónicos pueden ser inmortalizados con medio acondicionado de transformación como se describió anteriormente. En diferenciación, la línea de célula exhibe rasgos neuronales y carece de marcadores gliales por inmunohistoquímica . La liberación de neurotransmisores tales como acetilcolina puede ser inducida en respuesta a potasio y nicotina (Alien y colaboradores, Neuroreport 13:492-496 (2002)) . Una línea de célula DRG ejemplar útil en la invención es la línea de célula DRG de murino G4b.
La invención también puede ser practicada con líneas de célula hipocampal, que incluyen líneas hipocampales de murino, primate y humano. Como un ejemplo sin limitación, la línea de célula hipocampal de murino HT-22 puede ser útil en la invención. La persona experta entenderá que estas y neuronas primarias y establecidas adicionales pueden ser útiles en la composición y métodos de la invención. Se entiende que la invención puede ser practicada con ambos tipos de células intactas y permeabilizadas . En una modalidad, una célula de la invención es permeabilizada, por ejemplo, a través de electroporación o exposición a digitonina o solución amortiguadora de resistencia iónica baja. En una modalidad más, una célula de la invención es una célula permeabilizada PC12. Como se discutió anteriormente, se entiende que una neurona útil en la invención expresa receptores de afinidad baja o alta, endógenos o exógenos, para una o más toxinas clostridiales . Tal neurona generalmente también exhibe inhibición de exocitosis en exposición a toxina clostridial con, por ejemplo, un IC50 de menos que 50 nM, menos que 5 nM, menos que 0.5 nM, menos que 0.05 nM, menos que 0.005 nM, menos que 0.0005 nM, menos que 0.00005 nM o menos que 0.000005 nM. En modalidades particulares, la invención provee una neurona que contiene un substrato BoNT/A el cual exhibe inhibición de exocitosis con un IC50 de menos que 50 nM, menos que 5 nM, menos que 0.5 nM, menos que 0.05 nM, menos que 0.005 nM, menos que 0.0005 nM, menos que 0.00005 nM o menos que 0.000005 nM en exposición a BoNT/A. En más modalidades, la invención provee una neurona que contiene un substrato BoNT/B el cual exhibe inhibición de exocitosis con un IC50 de menos que 50 nM, menos que 5 nM, menos que 0.5 nM, menos que 0.05 nM, menos que 0.005 nM, menos que 0.0005 nM, menos que 0.00005 nM o menos que 0.000005 nM en exposición a BoNT/B. En otras modalidades, la invención provee una neurona que contiene un substrato BoNT/Cl el cual exhibe inhibición de exocitosis con un IC50 de menos que 50 nM, menos que 5 nM, menos que 0.5 nM, menos que 0.05 nM, menos que 0.005 nM, menos que 0.0005 nM, menos que 0.00005 nM o menos que 0.000005 nM en exposición a BoNT/Cl. En todavía más modalidades, la invención provee una neurona que contiene un substrato BoNT/D el cual exhibe inhibición de exocitosis con un IC50 de menos que 50 nM, menos que 5 nM, menos que 0.5 nM, menos que 0.05 nM, menos que 0.005 nM, menos que 0.0005 nM, menos que 0.00005 nM o menos que 0.000005 nM en exposición a BoNT/D. En modalidades adicionales, la invención provee una neurona que contiene un substrato BoNT/E el cual exhibe inhibición de exocitosis con un IC50 de menos que 50 nM, menos que 5 nM, menos que 0.5 nM, menos que 0.05 nM, menos que 0.005 nM, menos que 0.0005 nM, menos que 0.00005 nM o menos que 0.000005 nM en exposición a BoNT/E. En todavía más modalidades, la invención provee una neurona que contiene un substrato BoNT/F el cual exhibe inhibición de exocitosis con un ICso de menos que 50 nM, menos que 5 nM, menos que 0.5 nM, menos que 0.05 nM, menos que 0.005 nM, menos que 0.0005 nM, menos que 0.00005 nM o menos que 0.000005 nM en exposición a BoNT/F. En más modalidades, la invención provee una neurona que contiene un substrato BoNT/G el cual exhibe inhibición de exocitosis con un ICS0 de menos que 50 nM, menos que 5 nM, menos que 0.5 nM, menos que 0.05 nM, menos que 0.005 nM, menos que 0.0005 nM, menos que 0.00005 nM o menos que 0.000005 nM en exposición a BoNT/G. En todavía más modalidades, la invención provee una neurona que contiene un substrato TeNT el cual exhibe inhibición de exocitosis con un IC50 de menos que 50 nM, menos que 5 nM, menos que 0.5 nM, menos que 0.05 nM, menos que 0.005 nM, menos que 0.0005 nM, menos que 0.00005 nM o menos que 0.000005 nM en exposición a TeNT. Se entiende que la misma neurona puede expresar dos o más receptores para diferentes serotipos de toxina clostridial con el mismo o diferente IC50 para cada serotipo de toxina clostridial. También pueden ser útiles en la invención una variedad de células no neuronales que incluyen células primarias y establecidas. Tales células no neuronales abarcan células primarias; células establecidas; células transíectadas estable y transitoriamente; y células de tumor además de células de todas las especies de origen que incluyen células de mamíferos, murino, rata, primate y humano. Como ejemplos sin limitación, las células no neuronales útiles en la invención incluyen células glandulares tales como células acinar pancreáticas, células pancreáticas ß de isleta, y células de insulinoma HIT o INS-1; fibroblastos, células de músculo; y hepatocitos. Las células no neuronales útiles en la invención además incluyen, sin limitación cualquiera de las células primarias o establecidas que siguen: células pituitarias anteriores; células adrenales tales como células de cromafin de la médula adrenal; células de estómago tales como células similares a enterocromaf in; células pancreáticas tales como células pancreáticas de isleta ß; células de ovario tales como células de ovario que producen esteroides; células de riñon tales como células de conducto de recolección medular interna (IMCD) ; células acinares pancreáticas; plaquetas; neutrófilos ; eosinófilos; células de mastocitos; células epiteliales tales como aquellas de la membrana de plasma apical; y células involucradas en la transubicación del transportador de glucosa (GLUT4) . Como ejemplos sin limitación, una célula no neuronal útil en la invención puede incluir un substrato de toxina clostridial el cual tiene una secuencia de reconocimiento SNAP-25; tal célula no neuronal puede ser, por ejemplo, una célula pituitaria anterior primaria o establecida; célula adrenal tal como una célula de cromafin de la médula adrenal; célula de estómago tal como una célula similar a enterocromafina ; célula pancreática tal como una célula ß de isleta pancreática; o célula de ovario tal como una célula de ovario que produce esteroides. Como ejemplos sin limitación, una célula no neuronal útil en la invención puede incluir un substrato de toxina clostridial el cual tiene una secuencia de reconocimiento SNAP-23; tal célula no neuronal puede ser, por ejemplo, una célula de riñon tal como célula de conducto de recolección medular interno (IMCD); célula acinar pancreática; una plaqueta; un neutrófilo; un eosinófilo; una célula de mastocito; una célula epitelial tal como una de la membrana de plasma apical; o una célula involucrada en la transubicación del transportador de glucosa (GLUT4) . Se entiende que estas y una variedad de otras células no neuronales primarias y establecidas pueden ser útiles en la invención. En una modalidad, la invención provee una célula no neuronal establecida que incluye una molécula de ácido nucleico que codifica un substrato de toxina clostridial que contiene un fluoróforo donante, un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que traslapa el espectro de emisión del fluoróforo donante y una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que contienen un sitio de desdoblamiento, donde el sitio de desdoblamiento interviene entre el fluoróforo donante y el aceptor y donde, bajo las condiciones apropiadas, la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoróforo donante y el aceptor. Tal célula no neuronal estabilizada puede ser por ejemplo, transfectada establemente con una molécula de ácido nucleico que codifica un substrato de toxina clostridial . Se entiende que las células que expresan receptor de toxina clostridial endógeno o transfectado pueden ser identificadas por métodos rutinarios que incluyen ensayos directos e indirectos para absorber la toxina. Tales métodos pueden depender, por ejemplo, de la toxina etiquetada tal como toxina etiquetada fluorescentemente o radioetiquetada . Tales métodos pueden ser realizados, por ejemplo, con anticuerpos anti -toxina, los cuales pueden ser usados para detectar toxina intracelular, por ejemplo, por inmunocitoquímica o inmunotransferencia western. Además, las células que expresan al receptor de toxina clostridial y, por lo tanto, toman una o más toxinas clostridiales también pueden ser identificadas por ensayo para proteína objetivo desdoblada. Como un ejemplo, una inmunotransferencia Western que usa un anticuerpo que reconoce específicamente SNAP-25i97, el producto desdoblado de BoNT/A, se puede usar para ensayar para absorber de BoNT/A. Más ensayos bien conocidos incluyen detección de secreción de 3H-noradrenalina y otro neurotransmisor como una medición de la inhibición de exocitosis en las neuronas, o la liberación de hormonas de células endocrinas tales como células pituitarias anteriores o células de ovario. Se entiende que estos y ensayos similares para toxina intracelular, producto de desdoblamiento de toxina, o función de toxina pueden ser útiles en la selección de una neurona u otra célula útil en las composiciones y métodos de la invención. La invención además provee una célula que incorpora un substrato de toxina clostridial "compuesto" . Tal substrato de toxina clostridial compuesto contiene (a) un primer miembro de un par de fluoróforo donante-aceptor enlazado a un primer patrón de una pareja de afinidad; y (b) una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que contiene un sitio de desdoblamiento, donde la secuencia de reconocimiento se enlaza a un segundo miembro del par de fluoróforo donante-aceptor y un segundo patrón de la pareja de afinidad, donde el sitio de desdoblamiento interviene entre el segundo miembro del par de fluoróforo donante-aceptor y el segundo patrón de la pareja de afinidad, y donde (a) y (b) están asociados establemente de manera que, bajo las condiciones apropiadas, la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el primero y segundo miembros del par de fluoróforo donante-aceptor. Así, un substrato de toxina clostridial compuesto es, en efecto, un substrato de toxina clostridial bipartita en el cual las dos partes están asociadas establemente a través de la pareja de afinidad. Como para otros substratos de toxina clostr dial, la transferencia de energía de resonancia se altera en el desdoblamiento del substrato compuesto. Se entiende que las secuencias de reconocimiento de toxina clostridial y los sitios de desdoblamiento descritos aquí y bien conocidos en la técnica pueden ser útiles en substratos de toxina clostridial. El término "par de fluoróforo donante -aceptor" como se usa en la presente, significa un fluoróforo donante y un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que traslapa el espectro de emisión del fluoróforo donante. Donde el primer miembro del par es un fluoróforo donante, el segundo miembro del par será un aceptor. Donde el primer miembro del par es un aceptor, el segundo miembro del par será un fluoróforo donante. En una modalidad, el primer miembro del par de fluoróforo donante-aceptor es un fluoróforo donante y el segundo miembro es un aceptor. En otra modalidad el primer miembro del par de fluoróforo donante-aceptor es un aceptor, y el segundo miembro es un fluoróforo donante. Pueden ser incorporados una variedad de fluoróforos donantees y aceptores en un substrato de toxina clostridial compuesto útil en una célula o método de la invención, que incluye los fluoróforos donantees y aceptores descritos aquí enseguida. En una modalidad, el fluoróforo donante es una proteína fluorescente. En otra modalidad el fluoróforo donante y aceptor es una proteína fluorescente. Las proteínas fluorescentes útiles incluyen pero no están limitadas a proteínas de fluorescencia verde (GFP, por sus siglas en inglés) , proteínas de fluorescencia azul (BFP, por sus siglas en inglés), proteínas de . fluorescencia ciano (CFP, por sus siglas en inglés) , proteínas de fluorescencia amarilla (YFP, por sus siglas en inglés) y proteínas de fluorescencia roja (RFP, por sus siglas en inglés) . El término "pareja de afinidad", como se usa en la presente, significa dos moléculas que son capaces de formar una asociación no covalente estable. Las parejas de afinidad útiles en un substrato de compuesto incluyen, sin limitación, SNAP-25-sintaxina; VA P-sinaptotagmina; estreptavidina-biotina; Péptido S-proteína S ; receptor- ligando; receptores diméricos y otras proteínas de interacción. En una modalidad, la pareja de afinidad es SNAP-25-sintaxina . En otra modalidad, la pareja de afinidad es VAMP-sinaptotagmina . La presente invención también provee una molécula de ácido nucleico que codifica un substrato de toxina clostridial que incluye un fluoróforo donante; un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que traslapa el espectro de emisión del fluoróforo donante; y una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que contienen un sitio de desdoblamiento que interviene entre el fluoróforo donante y el aceptor, en donde la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoróforo donante y el aceptor bajo las condiciones apropiadas. La molécula de ácido nucleico que codifica un substrato de toxina clostridial puede ser enlazado, por ejemplo, a un elemento regulador tal como un elemento regulador constitutivo o elemento regulador inducible tal como, sin limitación, un elemento regulador de tetraciclina regulada o elemento regulador inducible de ecdisona. El fluoróforo donante y aceptores codificados genéticamente útiles en un substrato de toxina clostridial codificado genéticamente de la invención incluyen proteína fluorescente verde (GFP) y otras proteínas fluorescentes desglosadas aquí a continuación y conocidas en la técnica. En una modalidad, la secuencia de reconocimiento de toxina clostridial codificada es residuos 34 a 206 de SNAP-25 humano (SEQ ID NO: 4) . En otra modalidad, la secuencia de reconocimiento de toxina clostridial codificada es residuos 34 a 206 de SNAP-25 humana (SEQ ID NO: 4) y el fluoróforo donante o aceptor es una proteína de fluorescencia verde. En otras modalidades, la secuencia de reconocimiento de toxina clostridial codificada es 34 a 206 de SNAP-25 humana (SEQ ID NO: 4) , y el fluoróforo donante o aceptor cada uno son una proteína de fluorescencia verde, proteína de fluorescencia azul, proteína de fluorescencia ciano, proteína de fluorescencia amarilla, o proteína de fluorescencia roja.
Una molécula de ácido nucleico de la invención puede además incluir opcionalmente cualquiera de una variedad de elementos reguladores constitutivos o inducibles tales como promotores o mejoradotes. Los sistemas de expresión inducible tienen la ventaja de que pueden producir niveles intracelulares controlados de substrato. Los elementos reguladores constitutivos útiles en la invención incluye, sin limitación, los citomegalovirus (CMV) , timidina cinasa de virus de herpes simplex (HSV TK) , virus de simio 40 (SV40) temprano, repetición de Terminal larga 5' (LTR) , factor de alargamiento la (EF-la) y elementos reguladores de polibiquitina (UbC) . Los elementos reguladores inducibles útiles en la invención incluyen elementos inducibles de tetraciclina y represibles de tetraciclina tales como Tet-On™ y Tet-Off™ (BD Biosciences) ; elementos inducibles de ecdisona y elementos reguladores de GAL4 tales como el sistema GeneSwitch™ (Invitrogen) . La persona experimentada entiende que estos y otros elementos reguladores constitutivos e inducibles pueden estar incluidos en una molécula de ácido nucleico de la invención. Son útiles cualquiera de una variedad fluoroforos donantees y aceptores codificados genéticamente en las moléculas de ácido nucleico de la invención. Tales fluoroforos donantees y aceptores incluyen tintas codificadas genéticamente como una proteína de fluorescencia verde (GFP) , proteína de fluorescencia azul (BFP) , proteína de fluorescencia ciano (CFP) , proteína de fluorescencia amarilla (YFP) o proteína de fluorescencia roja tal como dsRed (BD Biosciences Clontech; Palo Alto, CA) . Tales fluoróforos donantees y aceptores codificados genéticamente son bien conocidos en la técnica como se describe, por ejemplo, en Selvin, supra, 2000, y Mahajan y colaboradores, Chemistry and Biology 6:401-409 (1999). Como un ejemplo, la PFC tiene una excitación máxima en 433 nm y una emisión máxima en 476 nm y puede ser usada como un fluoróforo donante en combinación con YFP como un aceptor (emisión máxima en 527 nm) . Si se desea, la BFP puede ser usada como un fluoróforo donante en combinación con la PFG como el aceptor, o la CFP puede ser usada como el fluoróforo donante en combinación con la YFP como el aceptor. Los fluoróforos donantees y aceptores codificados genéticamente adicionales que incluyen proteínas fluorescentes relacionadas con Aequorea son bien conocidos en la técnica, como se describe, por ejemplo, en la Patente de EUA No. 5, 981,200. La invención provee además una célula que incluye un substrato de toxina clostridial codificado genéticamente. Así, la invención provee una célula que incluye una molécula de ácido nucleico que codifica un substrato de toxina clostridial que incluye un fluoróforo donante; un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que traslapa el espectro de emisión del fluoróforo donante; y una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que contienen un sitio de desdoblamiento que interviene entre el fluoróforo donante y el aceptor, en donde la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoróforo donante y el aceptor bajo las condiciones apropiadas. La molécula de ácido nucleico puede codificar, por ejemplo, residuos 34 a 206 de SNAP-25 humano (SEQ ID NO: 4) , y puede además incluir, por ejemplo, un fluoróforo donante tal como una proteína de fluorescencia verde, proteína de fluorescencia azul, proteína de fluorescencia cyan, proteína de fluorescencia amarilla, o proteína de fluorescencia roja, además de un aceptor tal como una proteína de fluorescencia verde, proteína de fluorescencia azul, proteína de fluorescencia ciano, proteína de fluorescencia amarilla, o proteína de fluorescencia roja.
Cualquiera de una variedad de células pueden ser preparadas por ingeniería para incluir una molécula de ácido nucleico que codifica un substrato de toxina clostridial, incluyendo, pero no limitado a, células humanas, células neuronales y células no neuronales . En una modalidad, la molécula de ácido nucleico que codifica el substrato de toxina clostridial es transfectado establemente en la célula. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico que codifica un substrato de toxina clostridial está enlazado a un elemento regulador tal como un elemento regulador constitutivo o elemento regulador inducible. Son útiles en la invención una variedad de elementos reguladores inducibles, incluyendo, sin limitación, elementos reguladores de tetraciclina regulada y elementos reguladores de ecdisona inducible. Un substrato de toxina clostridial codificado genéticamente de la invención puede incluir cualquiera de una variedad de fluoróforos donantees y aceptores codificados genéticamente tales como GFP. Una célula que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica un substrato de toxina clostridial puede ser preparada por cualquiera de una variedad de métodos de rutina que incluyen métodos de transfección transitoria y estable bien conocidos. Como ejemplos sin limitación, las técnicas de rutina para introducción de una molécula de ácido nucleico en una célula, que incluyen una célula neuronal o no neuronal , incluyen microinyección, electroporación, lipofección, transfección mediante fosfato de calcio, transfección mediante Dextrano-DEAE , transfección mediante polibreno- o polilisina-, y conjugación de un anticuerpo, gramacidina S, envolvente viral artificial u otro portador intracelular tal como TAT. Ver Cibelli y colaboradores, Nat . Biotech. 16:642-646 (1998); Lamb y Gearhart, Cur. Opin. Gen. Dev. 5:342-348 (1995); Choi (Patente de EUA No. 6,069,010); y Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, pp 9.16.4-9.16.11 (2000) .
La presente invención también provee kits para detección de actividad de toxina clostridial en una muestra. Los kits contienen una composición de substrato o célula de la invención en un contenedor de cristal u otro y generalmente también incluyen instrucciones para uso. En una modalidad, un kit de la invención además incluye como control positivo una cantidad conocida de la toxina de botulinum o tétanos capaz de desdoblar el substrato de toxina clostridial el cual está incorporado en la composición del substrato o célula incluida en el kit. En otra modalidad, el kit contiene una composición de substrato de la invención y además incluye uno o ambos productos de desdoblamiento como un control positivo. Tal kit puede incluir, por ejemplo, una composición de substrato de la invención y el producto de desdoblamiento que corresponde que contiene el fluoróforo donante como un control positivo. Cuando la invención provee un kit que contiene una célula de la invención y un control positivo, el control positivo se entiende que es una célula del mismo tipo de célula, que tiene uno o ambos productos de desdoblamiento que corresponden en lugar del substrato de toxina clostridial no desdoblado. Tal célula de control positivo puede contener, por ejemplo, el producto de desdoblamiento el cual incluye el fluoróforo donante. Como se describe más adelante, una combinación de células del mismo o diferente tipo que contienen substratos de toxina clostridial diferentes pueden ser útiles para la detección de la actividad de dos o más toxinas clostridial . Así, en una modalidad, la invención provee un kit para detección de actividad de la toxina clostridial que incluye por lo menos dos composiciones de substrato de la invención que tienen secuencias de reconocimiento para dos toxinas clostridial diferentes. En otra modalidad, la invención provee un kit para detección de actividad de toxina clostridial que incluye por lo menos dos células de la invención que contienen dos substratos de toxina clostridial diferentes que tiene secuencias de reconocimiento para dos toxinas clostridial diferentes. La presente invención también provee un método de determinación de actividad de toxina clostridial mediante (a) contacto con una muestra de una célula que contiene un substrato de toxina clostridial que incluye un fluoróforo donante; un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que traslapa el espectro de emisión del fluoróforo donante; y una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que contiene un sitio de desdoblamiento que interviene entre el fluoróforo donante y el aceptor, en donde la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoróforo donante y el aceptor bajo las condiciones apropiadas; (b) excitación del fluoróforo donante; y (c) determinación de la transferencia de energía de resonancia de la célula contactada relativa a una célula de control, donde una diferencia en la transferencia de energía de resonancia de la célula contactada como comparada con la célula de control es indicativa de la actividad de la toxina clostridial . Los métodos de la invención pueden ser practicados ventajosamente para ensayar una toxina clostridial para varios pasos diferentes requeridos para la actividad de la toxina. Así, un método de la invención se puede usar para determinar si una toxina clostridial tiene un dominio de unión funcional para absorción celular; un dominio de transubicación funcional para suministro de cadena ligera para el citosol de célula; y un dominio proteolítico funcional. En la ausencia de cualquiera de estas tras funciones, el método de la invención generalmente produce un resultado negativo. En los métodos de la invención, un substrato de toxina clostridial opcionalmente puede ser enlazado covalentemente a un agente de suministro, el cual puede ser, por ejemplo, una proteína, péptido o peptidomimético . Los agentes de suministro útiles incluyen, por ejemplo, proteínas antennapedia o fragmentos activos de estas, así como fragmentos activos que tienen la secuencia de aminoácidos RQIKIWFQNRRMK KK (SEQ ID NO: 1) ; proteínas de TAT de VIH O fragmentos activos de estas, tales como fragmentos activos que tienen la secuencia de aminoácidos YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2) ; y proteínas VP22 de virus de herpes simplex o fragmentos activos de estas, tal como proteínas de virus de herpes simplex VP22 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, o fragmentos activos de estas. En una modalidad, un método de la invención se practica con una célula que contiene una proteína, péptido o peptidomimético quimérico que incluye un substrato de toxina clostridial y un agente de suministro fusionado operativamente al substrato. Tal proteína, péptido o peptidomimético quimérico puede tener, por ejemplo, una longitud de cómo máxima de 50 ó 100 residuos . Un substrato de toxina clostridial útil en un método de la invención puede ser un substrato de toxina de botulinum de cualquier serotipo o un substrato de toxina de tétanos. Así, un método de la invención puede ser practicado con una célula que contiene un substrato BoNT/A el cual incluye una secuencia de reconocimiento BoNT/A; una célula que contiene un substrato BoNT/B que incluye una secuencia de reconocimiento BoNT/B; una célula que contiene un substrato BoNT/Cl que incluye una secuencia de reconocimiento BoNT/Cl; una célula que contiene un substrato BoNT/D el cual incluye una secuencia de reconocimiento BoNT/D; una célula que contiene un substrato BoNT/E que incluye una secuencia de reconocimiento BoNT/E; una célula que contiene un substrato BoNT/F el cual incluye una secuencia de reconocimiento BoNT/F una célula que contiene un substrato BoNT/G el cual incluye una secuencia de reconocimiento BoNT/G; o una célula que contiene un substrato de toxina TeNT que incluye una secuencia de reconocimiento TeNT. Se entiende que una variedad de fluoróforos donantees y aceptores pueden ser incorporados en un substrato de toxina clostridial útil en un método de la invención. Como ejemplos sin limitación, los fluoróforos donantees útiles incluyen Alexa Fluorc 488, DABCYL y BODIPY, y los aceptores útiles incluyen EDANS, QSYC 7 y tetrametilrodamina . Como además se describió aquí, los aceptores útiles en los métodos de la invención abarcan aceptores no fluorescentes además de aceptores de fluoroforo, que incluye aceptores de fluoroforo que tiene un tiempo de vida de fluorescencia relativamente grande de por lo menos 1 microsegundo . Son útiles una variedad de células en los métodos de la invención que incluyen, sin limitación, células primarias ,-células establecidas; células humanas; neuronas tales como neuronas primarias, neuronas establecidas y neuronas humanas; y células no neuronales tales como células acinar pancreáticas. Las neuronas útiles para la determinación de la actividad de la toxina clostridial de acuerdo con un método de la invención incluyen neuronas del sistema nervioso central y neuronas periféricas; como ejemplos sin limitación, tal neurona puede ser una célula del neuroblastoma, neurona de la médula espinal, neurona de ganglio de raíz dorsal, neurona de corteza cerebral, neurona cerebelar, neurona hipocampal o neurona motora. Un experto en la técnica entiende que una variedad de ejemplos pueden ser ensayados para la actividad de la toxina clostridial de acuerdo con un método de la invención. Tales muestras incluyen, sin limitación, lisados de célula cruda; toxinas clostridiales aisladas; productos de toxina clostridial formulados tales como BOTOX0 y comestibles. Pueden ser usados una variedad de medios para determinar la transferencia de energía de resonancia subsecuente a excitación de un fluoróforo donante en un método de la invención. En una modalidad, un método de la invención incluye la etapa de detección de la intensidad de fluorescencia del donante de la célula contactada relativa a una célula de control, donde la intensidad de fluorescencia del donante incrementada de la célala contactada comparada con la célula de control es indicativa de la actividad de la toxina clostridial. En otra modalidad, un método de la invención incluye la etapa de detección de la intensidad de la fluorescencia del aceptor de la célula contactada relativa a una célula de control, donde la intensidad de la fluorescencia del aceptor disminuye de la célula contactada comparada con la célula de control es indicativo de la actividad de la toxina clostridial. En una modalidad más, un método de la invención incluye la etapa de detección de un máximo de emisión del aceptor y un máximo de emisión del fluoróforo donante de la célula contactada relativo a una célula de control, donde un cambio en la emisión máxima de cerca del máximo de emisión del aceptor a cerca del máximo de emisión del fluoróforo donante es indicativo de la actividad de la toxina clostridial. En todavía una modalidad más, un método de la invención incluye la etapa de detección de la relación de las amplitudes de fluorescencia cerca de un máximo de emisión del aceptor a las amplitudes de fluorescencia cercanas a un máximo de emisión del fluoróforo donante de la célula contactada relativo a una célula de control, donde una relación disminuida en la célula contactada comparada con la célula de control es indicativo de la actividad de la toxina clostridial. En todavía otra modalidad, un método de la invención incluye la etapa de detección del tiempo de vida de estado excitado del fluoróforo donante en la célula contactada relativo a una célula de control, donde un tiempo de vida de estado excitado del fluoróforo donante incrementado en la célula contactada comparado con la célula de control es indicativo de la actividad de la toxina clostridial. Si se desea, la etapa de determinación de la transferencia de energía de resonancia se puede repetir en uno o más intervalos de tiempo posteriores. Además, las condiciones apropiadas para la actividad de la toxina clostridial pueden ser seleccionadas opcionalmente de manera que el ensayo sea lineal. Como se discute más adelante, se entiende que los métodos de la invención son aplicables a las muestras crudas además de toxinas de doble cadena altamente purificadas. Como ejemplos sin limitación, un método de la invención puede ser útil para ensayar la actividad de la toxina clostridial en una muestra de alimento o bebida; para ensayar una muestra de un humano o animal, por ejemplo, expuesto a una toxina clostridial o que tiene uno o más síntomas de una toxina clostridial; para seguir la actividad durante la producción y purificación de la toxina clostridial, y para ensayar los productos de toxina clostridial formulados, que incluyen farmacéuticos y cosméticos. Puede ser usado un método de la invención para determinar la actividad de cualquier toxina clostridial. En una modalidad, un método de la invención depende de una célula que contiene un substrato de BoNT/A para determinar la actividad BoNT/A. Tal substrato BoNT/A puede ser cualquiera de los substratos BoNT/A descritos aquí, por ejemplo, un substrato BoNT/A que contiene por lo menos seis residuos consecutivos de SNAP-25, los seis residuos consecutivos incluyen Gln-Arg. En otra modalidad, un método de la invención depende de una célula que contiene un substrato de BoNT/B para determinar la actividad BoNT/B. Tal substrato BoNT/B puede ser cualquiera de los substratos BoNT/B descritos aquí, por ejemplo, un substrato BoNT/B que contiene por lo menos seis residuos consecutivos de VAMP, donde los seis residuos consecutivos incluyen Gln-Phe. Un método de la invención también puede utilizar una célula que contiene un substrato de BoNT/Cl para determinar la actividad BoNT/Cl. Un substrato BoNT/Cl útil en un método de la invención puede ser cualquiera de los substratos BoNT/Cl descritos aquí, por ejemplo, un substrato BoNT/Cl que contiene por lo menos seis residuos consecutivos de sintaxina, donde los seis residuos consecutivos incluyen Lys-Ala, o que contienen por lo menos seis residuos consecutivos de SNAP-25, donde los seis residuos consecutivos incluyen Arg-Ala. En otra modalidad, un método de la invención depende de una célula que contiene un substrato de BoNT/D para determinar la actividad BoNT/D. Tal substrato BoNT/D puede ser cualquiera de los substratos BoNT/D descritos aquí, por ejemplo, un substrato BoNT/D que contiene por lo menos seis residuos consecutivos de VAMP, donde los seis residuos consecutivos incluyen Lys-Leu. En una modalidad más, un método de la invención se practica con una célula que contiene un substrato de BoNT/E para determinar la actividad BoNT/E. Un substrato BoNT/E útil en un método de la invención puede ser cualquiera de los substratos BoNT/E descritos aquí, por ejemplo, un substrato BoNT/E que contiene por lo menos seis residuos consecutivos de SNAP-25, donde los seis residuos consecutivos que contienen Arg-Ile. En todavía una modalidad más, un método de la invención depende de una célula que contiene un substrato de BoNT/F para determinar la actividad BoNT/F. Un substrato BoNT/F útil en un método de la invención puede ser cualquiera de los substratos BoNT/F descritos aquí, por ejemplo, un substrato BoNT/F que contiene por lo menos seis residuos consecutivos de VAMP, donde los seis residuos consecutivos incluyen Gln-Lys. Un método de la invención también puede utilizar una célula que contiene un substrato de BoNT/G para determinar la actividad BoNT/G. Un substrato BoNT/G útil en un método de la invención puede ser cualquiera de los substratos BoNT/G descritos aquí, por ejemplo, un substrato BoNT/G que contiene por lo menos seis residuos consecutivos de VAMP, donde los seis residuos consecutivos incluyen Ala-Ala. Un método de la invención también puede ser útil para determinar la actividad de la proteasa TeNT y, en este caso, depende de una célula que contiene un substrato de TeNT. Cualquiera de los substratos TeNT descritos aquí puede útil en un método de la invención, por ejemplo, un substrato TeNT que contiene por lo menos seis residuos consecutivos de VAMP, donde los seis residuos consecutivos incluyen Gln-Phe. Es útil una variedad de muestras en los métodos de la invención. Como se usa en la presente, el término "muestra" significa cualquier materia biológica que contiene o potencialmente contiene una toxina clostridial activa. Así, el término muestra abarca pero no está limitado a toxina clostridial purificada o parcialmente purificada; la toxina de cadena o de doble cadena única recombinante con una secuencia que ocurre natural o no naturalmente; la toxina clostridial recombinante con una especif cidad de proteasa modificada; la toxina clostridial recombinante con una especificidad de célula alterada; la toxina clostridial que contienen elementos estructurales de especies o subtipos de toxina clostridial múltiples; toxina de volumen; producto formulado; células o crudo, lisados de célula fraccionados o parcialmente purificados, por ejemplo, diseñados para incluir un ácido nucleico recombinante que codifica una toxina clostridial; lisatos bacteriales, baculovirales y de levadura; alimentos crudos, cocinados, parcialmente cocinados o procesados, bebidas; alimento animal; muestras de suelo; sedimientos de estanque; lociones; cosméticos; y formulaciones químicas. Además se entiende que el término muestra abarca muestras de tejido, que incluyen, sin limitación, muestras de tejido de mamífero, muestras de tejido ganado tal como muestras de tejido de oveja, vaca y cerdo; muestras de tejido de primate; y muestras de tejido humano. Tales muestras abarcan, sin limitación, muestras intestinales tales como muestras intestinales de infantes, y muestras de tejido obtenidas de una herida.
La concentración de toxina clostridial purificada o parcialmente purificada ensayada en un método de la invención generalmente está en el rango de alrededor de 0.0001 a 5000 ng/ml de toxina, por ejemplo, alrededor de 0.001 a 5000 ng/ml, alrededor de 0.01 a 5000 ng/ml, alrededor de 0.1 a 5000 ng/ml, alrededor de 1 a 5000 ng/ml, o 10 a 5000 ng/ml de toxina, la cual puede ser, por ejemplo, toxina de doble cadena recombinan e purificada o producto de toxina clostridial formulado que contienen albúmina de suero humano y excipientes. Generalmente, la cantidad de toxina purificada ensayada en un método de la invención está en el rango de 0.1 pg a 10 µg . Se entiende que las muestras purificadas, parcialmente purificadas o crudas pueden estar diluidas de manera que la muestra esté dentro de un rango conveniente para ensayo de la actividad de la toxina clostridial contra una curva estándar. Similarmente , un experto en la técnica entiende que una muestra se puede diluir o la cantidad de muestra limitada de otra manera, de manera que el ensayo es lineal puesto que, en concentraciones altas incrementadas de toxina, la linearidad del ensayo puede ser satisfecha. Un experto en la técnica entiende que, en un método de la invención, una célula se puede contactar con toxina clostridial durante cualquiera de una variedad de duraciones de tiempo dependiente, en parte, del tipo de célula usada, la afinidad del receptor de toxina expresado y la cantidad y tipo de toxina ensayada. Como ejemplos sin limitación, la célula puede ser contactada con toxina para hasta una hora, dos horas, cuatro horas, ocho horas, dieciséis horas, 24 horas, 48 horas ó 72 horas. En un método de la invención, la transferencia de energía de resonancia puede ser determinada por una variedad de medios. En una modalidad, la etapa de determinación de transferencia de energía de resonancia incluye la detección de la intensidad de fluorescencia del donante de la célula contactada, donde la intensidad de la fluorescencia del donante incrementada de la célula contactada comparada con la célula de control es indicativa de la actividad de la toxina clostridial. En otra modalidad, la etapa de determinación de la transferencia de energía de resonancia incluye la detección de la intensidad de fluorescencia del aceptor de la célula contactada, donde la intensidad de la fluorescencia del aceptor disminuida de la célula contactada comparada con la célula de control es indicativa de la actividad de la toxina clostridial. En una modalidad más, la etapa de determinación de la transferencia de energía de resonancia incluye la detección del máximo de emisión del aceptor y el máximo de emisión del fluoróforo donante, donde un cambio en la emisión máxima de cerca de un máximo de emisión del aceptor a cerca del máximo de emisión del fluoróforo donante es indicativo de la actividad de la toxina clostridial. En una modalidad adicional, la etapa de determinación de la transferencia de energía de resonancia incluye la detección de la relación de amplitudes de fluorescencia cercana a un máximo de emisión del aceptor a amplitudes de fluorescencia cercana a un máximo de emisión del fluoróforo donante, donde una relación disminuida en la célula contactada comparada con la célula de control es indicativa de la actividad de la toxina clostridial. En todavía una modalidad más, la etapa de determinación de la transferencia de energía de resonancia se practica por detección del tiempo de vida de estado excitado del fluoróforo donante en la célula contactada, donde un tiempo de vida en estado excitado del fluoróforo donante incrementado en la célula contactada comparada con la célula de control es indicativo de la actividad de la toxina clostridial. En un método de la invención para la determinación de la actividad de la toxina clostridial, una célula se contacta con una muestra, la célula que contiene un substrato de toxina clostridial que incluye un primer fluoróforo donante, un primer aceptor que tiene un espectro de absorbancia que traslapa el espectro de emisión del fluoróforo donante y una primera secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que contienen un sitio de desdoblamiento, donde el sitio de desdoblamiento interviene entre el fluoróforo donante y el aceptor y donde, bajo las condiciones apropiadas, la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoroforo donante y el aceptor. Si se desea, se puede incluir un segundo substrato de toxina clostridial en la misma célula; este segundo substrato contiene un segundo fluoroforo donante y un segundo aceptor que tiene un espectro de absorbancia el cual traslapa el espectro de emisión del segundo fluoroforo donante, y una segunda secuencia de reconocimiento de la toxina clostridial que se desdobla por una toxina clostridial diferente que la toxina que desdobla la primera secuencia de reconocimiento de la toxina clostridial. El par fluoroforo donante-aceptor en el segundo substrato puede ser el mismo o diferente del para fluoroforo donante-aceptor del primer substrato. En esta forma, una muestra única puede ser ensayada convenientemente para la presencia de más de una toxina clostridial. Se entiende que uno puede ensayar para cualquier combinación de toxinas clostridial, por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, o más toxinas clostridial. Uno puede ensayar, por ejemplo, cualquier combinación de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho de BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G y TeNT. Como un ejemplo, siete células de los mismos' o diferentes tipos, seleccionadas como se describió aquí anteriormente, las cuales contienen siete substratos, cada uno de los cuales incluye fluoresceína y tetrametirodamina que flanquean una secuencia de reconocimiento de BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F o BoNT/G y el sitio de desdoblamiento. Estas células cada una se contactan con una muestra bajo condiciones apropiadas para la actividad de la toxina botulinum antes de la excitación del donante de fluoresceína en una longitud de onda de absorción de alrededor de 488 nm y que determina la transferencia de energía. Un cambio en el máximo de emisión del aceptor, tetrametilrodamina (585 nm) a aquella de fluoresceína (520 nm) es indicativo de actividad de por lo menos una toxina de botulinum. Tal ensayo puede ser útil, por ejemplo, para ensayar muestras de alimentos o muestras de tejido para la presencia de cualquier toxina botulinum o otra clostridial y puede estar combinada, si se desea, con uno o más ensayos subsecuentes para toxinas clostridial individuales o combinaciones específicas de toxinas clostridial . En otra modalidad, una muestra única se ensaya para dos o más diferentes toxinas clostridiales que usan dos o más substratos de toxina clostridial diferentes contenidas en las mismas o diferentes células tales como neuronas, con cada substrato que contiene un par de fluoróforo donante-aceptor diferente. El uso de substratos múltiples puede ser útil para extender el rango dinámico de un ensayo, como se describe, por ejemplo, en la Patente de EUA No. 6,180,340. Como un ejemplo del uso de los substratos de toxina clostridial múltiple, una muestra única puede ser ensayada para la actividad de BoNT/A y BoNT/B que usan una célula que contiene el primero y segundo substrato de toxina clostridial : el primer substrato de toxina clostridial contiene la fluoresceína del fluoróforo donante y la tetrametilrodamina del aceptor con una secuencia de reconocimiento de BoNT/A que interviene y el sitio de desdoblamiento, y el segundo substrato de toxina clostridial contiene el EDANS del fluoróforo donante y el DABCYL del aceptor con una secuencia de reconocimiento de BoNT/B que interviene y el sitio de desdoblamiento. El primer fluoróforo donante, fluoresceína, se excita en alrededor de 488 nm, y la transferencia de energía se determina, con un incremento en la intensidad de fluorescencia de fluoresceína (de alrededor de 520 nm) indicativo de actividad BoNT/A. El segundo fluoróforo donante, EDANS, se excita en una longitud de onda de absorción de alrededor de 340 nm, con un incremento en la intensidad de la fluorescencia de EDANS (en alrededor de 490 nm) indicativo de actividad BoNT/B. Similarmente , donde dos o más donantees de fluoróforo diferentes están para ser usados juntos para ensayar una muestra única, uno puede combinar, por ejemplo, cualquier combinación o todos los siguientes lantánidos que siguen: terbio, disprosio, europio y samario (EG&GC Wallac) . Estos lantánidos tienen espectros que son claramente distinguibles en la base de tiempo de descomposición y longitud de onda. Aquellos expertos en la técnica entienden que el primer fluoróforo donante puede ser excitado antes, al mismo tiempo, o después de la excitación del segundo fluoróforo donante, y que la transferencia de energía del primer substrato puede ser determinada antes, al mismo tiempo, o después de la determinación de transferencia de energía del segundo substrato. Los métodos de la invención involucran la excitación de un fluoróforo donante el cual se incorpora en un substrato de toxina clostridial con una célula. Un experto en la técnica entiende que un fluoróforo donante generalmente se excita en o cerca de la longitud de onda de absorción óptima (la longitud de onda de excitación) del fluoróforo donante. Como un ejemplo, donde el fluoróforo donante es fluoresceína, el donante puede ser excitado, por ejemplo, en o cerca de la longitud de absorción óptima de 488 nm. La proteolisis del substrato de toxina clostridial, y de ahí la actividad de la toxina clostridial, puede ser detectada por una variedad de medios, por ejemplo, por detección de la intensidad de fluorescencia del donante incrementada; de la intensidad de fluorescencia del aceptor disminuida; un cambio en la emisión máxima de cerca del máximo de emisión del aceptor a cerca del máximo de emisión del fluoróforo donante; una relación disminuida de amplitudes de fluorescencia cercanas al máximo de emisión del aceptor a las amplitudes de fluorescencia cercanas al máximo de emisión del fluoróforo donante; o un tiempo de vida de estado excitado del fluoróforo donante incrementado. Se entiende que las intensidades de fluorescencia relevantes o los tiempos de vida de estado excitado se detectan en la longitud de onda o rango de longitudes de onda apropiados. Como un ejemplo, cuando se detecta la intensidad de fluorescencia del donante, la longitud de onda apropiada está en o cercana a la emisión máxima del fluoróforo donante, o está en un rango de longitudes de onda que abarcan o cercanas a la emisión máxima del fluoróforo donante. Se reconoce que cambios en la cantidad absoluta de substrato de toxina clostridial en la célula, en la intensidad de excitación, y en la turbiedad u otra absorbancia antecedente en la longitud de onda de excitación efectúa las intensidades de fluorescencia del donante y fluoróforo aceptor aproximadamente en paralelo. Así, se entiende que una relación de intensidades de emisión es independiente de la cantidad absoluta de substrato, intensidad de excitación, y turbiedad y otra absorbancia antecedente, y puede ser un indicador útil de la actividad de la toxina clostridial. Similarmente , un experto en la técnica entiende que el tiempo de vida del estado de excitación de un fluoróforo donante es independiente de la cantidad absoluta de substrato, la intensidad de excitación, y la turbiedad u otra absorbancia antecedente y puede ser útil en un método de la invención. En una modalidad, un método de la invención se practica por detección de la intensidad de fluorescencia del donante, con intensidad de fluorescencia del donante incrementada indicativa de la actividad de la toxina clostridial. Tal intensidad incrementada puede ser, por ejemplo, por lo menos de dos veces, tres veces, cinco veces, diez veces, veinte veces o más relativos a la intensidad de fluorescencia en la misma longitud de onda de la misma célula o similar no contactada con la muestra. Para detección de la intensidad del fluoróforo donante, la excitación se establece en la longitud de onda de absorción del fluoróforo donante, y se monitorea la emisión del fluoróforo donante. La longitud de onda de emisión del fluoróforo donante generalmente se selecciona de manera que se observa poca o ninguna contribución para la fluorescencia del aceptor. La presencia del aceptor apaga la fluorescencia del donante. La eficiencia de transferencia de energía, E, se calcula de E = 1 - IDA/D/ donde IDA e ID son intensidades del donante en la presencia y ausencia del aceptor. Ambos se normalizan a la misma concentración del fluoróforo donante. Si se desea, las mediciones resueltas en tiempo, para la cual la concentración de fluoróforo donante no se requiere, se puede realizar usando E = 1 - {tDA}/tD, donde {tDA} y {tD} son tiempos de vida de amplitud-promedio del fluoróforo donante en la presencia y ausencia del aceptor. En una modalidad, la invención se practica al detectar un cambio en los máximos de emisión desde cerca del máximo de emisión de aceptor hasta cerca del máximo de emisión de fluoróforo donante como una determinación de la transferencia de energía de resonancia. Como un ejemplo, donde se combina un aceptor de tetrametilrodamina con la fluoresceína del fluoróforo donante, se puede detectar un cambio desde la emisión predominantemente roja hasta la emisión predominantemente de verde como un indicador de la reducción de la transferencia de energía de resonancia y, por lo tanto de la actividad de toxina clostridial . Se entenderá que el cambio observado en los máximos de emisión generalmente no será un cambio completo, pero que solo parte de la intensidad de emisión se cambiará hasta cerca del máximo de emisión de fluoróforo donante. En varios métodos de la invención, la transferencia de energía de resonancia de las célula de contacto se determina con relación a la célula de control . Tal célula de control generalmente es una célula del mismo tipo o del tipo similar como la célula de contacto y se hace crecer bajo las mismas condiciones, pero la cual no se pone en contacto con cualquier muestra o se pone en contacto con una muestra negativa definida o una muestra positiva definida. Alguien de experiencia en la técnica entenderá que una variedad de células de control son útiles en los métodos de la invención y que una célula de control puede ser una célula de control positiva o una célula de control negativo. Una célula de control, puede ser por ejemplo, una célula de control negativo tal como una célula similar o idéntica que contiene la misma o un substrato de toxina clostridial similar, que se pone en contacto con una muestra negativa definida, similar, que se conoce que carece de la toxina clostridial activa, o que no se pone en contacto con ninguna muestra. Una célula de control también puede ser, por ejemplo, una célula de control positiva tal como una célula que contiene uno o ambos productos de desdoblamiento que resultan de la proteolisis del substrato de toxina clostridial en el sitio de desdoblamiento, o una célula que contiene el mismo substrato o un substrato similar que se pone en contacto con una muestra positiva definida, que se conoce que incluye la toxina clostridial activa. Las células de control positivo incluyen células que contienen el producto de desdoblamiento que contienen fluoróforo donante, células que contienen el producto de desdoblamiento que contiene el aceptor, y células que contienen ambos productos de desdoblamiento. Los métodos de la invención para determinar la actividad de toxina clostridial involucran determinar la transferencia de energía de resonancia de una célula que contiene un substrato de toxina clostridial en contacto con una muestra relativa a la célula de control y puede practicarse como ensayos de "tiempo fijo" o como ensayos de tiempo continuo. De esta manera, en una modalidad, la determinación FRET se repite en uno o más intervalos de tiempo posteriores. La transferencia de energía de resonancia fluorescente puede determinarse, por ejemplo, en dos o más, cinco o más, diez o más, o veinte o más tiempos diferentes. Las intensidades de fluorescencia y otros indicadores de FRET también pueden detectarse continuamente por métodos bien conocidos (Ver, por ejemplo, Wang et al., supra, 1993; Holskin et al., supra, 1995; and Kakiuchi et al., supra, 1999). En un método de la invención, la fluorescencia de una célula en contacto típicamente se determina usando un fluorímetro. En general, la radiación de excitación de una fuente de excitación que tiene una primera longitud de onda pasa a través de las ópticas de excitación. Las ópticas de excitación causan la radiación de excitación para excitar el substrato en las células. En respuesta, los fluoróforos en el substrato emiten radiación que tiene una longitud de onda que es diferente de la longitud de onda de excitación. Las ópticas de colección se conectan entonces la emisión; si se desea, el dispositivo incluye un controlador de temperatura para mantener la célula a una temperatura específica mientras se escanea. Si se desea, una etapa de traducción de eje múltiple mueve una placa microtitulada que contiene una pluralidad de muestras con objeto de posicionar diferentes pozos a exponerse. Se entenderá que la etapa de traducción de múltiples ejes, controlador de temperatura, características de autoenfoque, y electrónicas asociadas con las formación de imagen y la colección de datos, puede manejarse por una computadora digital apropiada. Se entenderá además que los métodos de la invención pueden automatizarse y pueden configurarse en un formato de alto desempeño o ultra alto desempeño usando, sin limitación, placas de 96 pozos, 384 pozos, o 1536 pozos. Como un ejemplo, la emisión de fluorescencia puede detectarse usando el sistema de instrumentación Molecular Devices FLIPR6 (Molecular Devices; Sunnyvale, CA) , que se designa para ensayos de placas de 96 pozos (Schroeder et al., J. Biomol. Screening 1:75-80 (1996)) . El FLIPR utiliza un láser de ión de argón con 488 nm enfriado con agua (5 voltios) o una lámpara de xenón are o un sistema óptimo semiconfocal con una cámara de dispositivo acoplado a la carga (CCD) para iluminar y formar la imagen de la placa completa. El lector de placa de 96 pozos FPM-2 (Foie Consulting and Research; Round Lake, Illinois) también puede ser útil para detectar la emisión de fluorescencia en los métodos de la invención. Alguien experto en la técnica entenderá que estos y otros sistemas automatizados con la compatibilidad de espectroscopia apropiada tal como el lector de cubeta ECLIPSE (Varian-Cary ; Walnut Creek, CA) , el SPECTRAmax GEMINI XS (Molecular Devices) y otros sistemas de por ejemplo, Perkin Elmer pueden ser útiles en los métodos de la invención. Los métodos de la invención pueden practicarse, si se desea, in vivo; como ejemplos no limitantes, los métodos de la invención, pueden practicarse en un ratón, rata, gusano o pez. Un método in vivo de la invención para determinar la actividad de toxina clostridial puede practicarse por (a) administrar a un animal una composición de substrato que contiene un agente de entrega y un toxina clostridial que incluye un fluoróforo donante; un aceptor que tiene un espectro de absorbancia que traslapa el espectro de emisión del fluoróforo donante; y una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que contiene un sitio de desdoblamiento que interviene entre el fluoróforo donante y el aceptor, donde la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoróforo donante y el aceptor bajo las condiciones apropiadas; (b) tratar al animal con una muestra; (c) excitar el fluoróforo donante; y (d) determinar la transferencia de energía de resonancia del animal tratado con relación al animal de control, donde la diferencia en la transferencia de energía de resonancia del animal tratado como se compara con el animal de control indica la actividad de toxina clostridial . Como un ejemplo, un agente de suministro basado en TAT de VIH, se ha mostrado para mostrar eficientemente una proteína objetivo in vivo (Schwartz et al., science 285: 1569-1572 (1999)) . En una modalidad, un método in vivo de la invención se practica con una composición de substrato que incluye un agente de suministro derivado de TAT de VIH. En una modalidad adicional, la composición de substrato se administra en la médula espinal del animal. Aun en una modalidad adicional, la persistencia de actividad de toxina durante el tiempo se evalúa para determinar la transferencia de energía de resonancia dos o más veces. La presente invención se refiere, en parte, en FRET, que es un proceso físico por el cual la energía se transfiere no radiactivamente en un fluoróforo donante excitado a un aceptor, que puede ser otro fluoróforo a través de un acoplamiento dipolo-dipolo de largo rango intramolecular. El FRET depende de la sexta potencia inversa de la separación intramolecular del fluoróforo donante y aceptor, y para una transferencia afectiva el fluoróforo donante y aceptor están en una proximidad cercana, separados, por ejemplo, por alrededor de 10 Á hasta alrededor de 100 Á. La transferencia de energía efectiva depende de las características espectrales del fluoróforo donante y aceptor así como su orientación relativa. Para una transferencia efectiva sobre 10 hasta 100 Á, el rendimiento cuantum del fluoróforo donante generalmente es de al menos 0.1, y el coeficiente de absorción del aceptor generalmente es al menos 1000 (Ver, Clegg, Current Opinión in Biotech, 6:103-110 (1995) ; y Selvin, Nature Structural Biol . 7: 730-734 (2000)) . En un substrato de toxina clostridial útil en la invención, el fluoróforo y aceptor donante se seleccionan de manera que el fluoróforo y aceptor donante exhiben una transferencia de energía de resonancia cuando el fluoróforo donante se excita. Un factor a considerarse en la elección del fluoróforo donante/par aceptor es la eficiencia de FRET entre el fluoróforo donante y aceptor. En una modalidad, la invención se refiere a un substrato de toxina clostridial en el cual, bajo condiciones óptimas, la eficiencia de FRET entre el fluoróforo donante y aceptor es al menos 10%. En otra modalidad, la invención se refiere a un substrato de toxina clostridial en el cual, bajo condiciones óptimas, la eficiencia de FRET entre el fluoróforo donante y aceptor es al menos 20%. Todavía en otras modalidades, la invención se refiere a un substrato de toxina clostridial en el cual, bajo condiciones óptimas, la eficiencia del F ET entre el fluoróforo donante y aceptor es al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ó 80%. Como es bien conocido en la técnica, la eficiencia de FRET depende de la distancia de separación y la orientación de fluoróforo donante y aceptor como se describe por la ecuación por Fórster, así como el rendimiento cuantum fluorescente del fluoróforo donante y el traslape energético con el aceptor. En particular, la eficiencia (E) de FRET puede determinarse como sigue: E = 1 - FDA/FD = 1/(1 + (R/R0)6) Donde FDA y FD son las intensidades de fluorescencia del fluoróforo donante en presencia y ausencia del aceptor, respectivamente, y R es la distancia entre el fluoróforo donante y el aceptor. El radio Fórster (R0) es la distancia a la cual la transferencia de energía de resonancia es 50% eficiente, esto es, 50% de los fluoróforos donantees excitados se desactivan por FRET. La magnitud del radio Fórster depende del rendimiento cuantum del fluoróforo donante; y el coeficiente de extinsión del aceptor; y el traslape entre el espectro de emisión del fluoróforo donante y el espectro de excitación del aceptor. R0 = [8.8 x 1023 · K2 · n"4 · QYD · J(k) ] l/6 Á Donde K2 = factor de orientación dipolo (rango 0 hasta 4; K2 = 2/3 para donantees aleatoriamente orientados y aceptores) QYD = rendimiento cuantum fluorescentes del donante en ausencia del aceptor n = índice refractario J (?) = integral del traslape espectral donde e? = coeficiente de extinción del aceptor FD = intensidad de emisión fluorescente del donante como una fracción de la intensidad integral total (Fórster, Ann. Physik 2: 55-75 (1948)). Los valores de radio Fórster típicos para varios pares f luoróforo/aceptor donante se dan en la tabla B abajo (Ver, también, Wu and Brand, Analytical Biochem. 218: 1-13 (1994)) . Listas detalladas de los radios Fórster también se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, Berlman, Energy Transfer Parameters of Aromatic Compounds Academic Press, New York 1973) . Adicionalmente , aquellos expertos en la técnica reconocerán que los factores de componentes del radio Fórster (R0) dependen del ambiente de tal manera que el valor actual observado puede variar del valor enlistado. Cualesquiera de un número de fluoróforos donantees y aceptores en varias combinaciones puede incluirse en un substrato de toxina clostridial útil en la invención. Un fluoróforo donante generalmente se selecciona tal que es traslapado en espectro substancial entre el espectro de emisión del fluoróforo donante y el espectro de excitación del aceptor. Además, el fluoróforo donante puede seleccionarse, por ejemplo, para tener un máximo de excitación cercano a una frecuencia láser conveniente tal como Helio-Cadmio 442 nrti o argón 488 nm, ya que la luz láser sirve como un medio conveniente y efectivo para excitar el fluoróforo donante. En una modalidad, la longitud de onda máxima del espectro de emisión de la porción aceptora es al menos 10 nm mayor que la longitud de onda máxima del espectro de excitación del fluoróforo donante. En una modalidad adicional, el aceptor es un fluoróforo que tiene un espectro de emisión en la porción roja del espectro visible. En una modalidad adicional, el aceptor es un fluoróforo que tiene un espectro de emisión en la región infrarroja del espectro. Una variedad de pares fluoróforo donante-aceptor y sus radios Fórster, se proporcionan en la presente en las tablas B y C. Ver, también, Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 6th Edition, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, 1996.
Tabla B Fluoróforos donantees y aceptores ejemplares Fluoróforo Aceptor Ro Referencia donante (Á) Fluoresceína TMR 49-54 Jonson et al . , Biochemistry 32: 6402- 6410 (1993) ; Odora et al. , Biochemistry 23: 5069- 5076 (1984) Fluoresceína QSY£ 7 61 EDANS DABCYL 33 Naftaleno Dansyl 22 Haas et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 72: 1807- 1811 (1975) Kasprzyk et al. , IANBD DDPM 25 Biochemistry 22: 1877- 1882 (1983) Dalbey et al. , IAEDANS DDPM 25-29 Biochemistry 22: 4696- 4706 (1983) ; Cheung et al., Biophys. Chem. 40:1- 17 (1991) Nalin et al . , DNSM LY 26-32 Biochemistry 28: 2318- 2324 (1985) Franzen et al. , IAEDANS IANBD 27-51 Biochemistry 19: 6080- 6089 (1980) ; First et al., Biochemistry 28: 3606-3613 (1989) Perkins et al . , e-? F2DNB 29 J. Biol. Chem. 259: 8786- 8793 (1984) Borochov- Neori y Pireno Bimane 30 Montal, Biochemistry 28: 1711-1718 (1989) Peerce y Wright , ANAI IP 30 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83 : 8092-8096 (1986) Grossman, Biochim. IAANS IAF 31 Biophys. Acta 1040:276- 280 (1990) Perkins et al. , e-? F2DPS 31 Perkins et al., supra, 1984 iki y Mihashi, e-? DDPM 31 Biochim. Biophys. Acta 533: 163-172 (1978) IAEDANS TNP 31-40 Takashi et al . , Biochemistry 21: 5661- 5668 (1982); dos Remedios y Cooke, Biochim. Biophys. Acta 788: 193- 205 (1984) Amir y Haas, NA DACM 32 Biochemistry 26: 2162- 2175 (1987) Zinder y Hammes , P NBD 32 Biochemistry 24: 2324- 2331 (1985) Amler et al . , FITC TNP-ATP 32 Biophys. J. 61: 553-568 (1992) Albaugh y Steiner, DA Z DABM 34 J. Phys. Chem. 93: 8013- 8016 (1989) Mitra y Hammes , NCP CP 34 Biochemistry 28: 3063- 3069 (1989) McWherter et al., NAA DNP 33-37 Biochemistry 25: 1951- 1963 (1986) LY TNP-ATP 35 Nalin, supra, 1985 Shahrokh et al . , IAF diI-Ci8 35 J. Biol . Chem. 266: 12082-12089 (1991) IAF TMR 37 Taylor et al., J. Cell. Biol. 89: 362-367 (1981) Dissing et al . , F A FMA 37 Biochim. Biophys. Acta 553: 66-83 (1979) Lin y Dowben, PM DMAMS 38 J. Biol. Chem. 258: 5142- 5150 (1983) Tompa y Batke , mBBR FITC 38 Biochem. Int. 20: 487-494 (1990) Kasprzak et al . , mBBR DABM 38 Biochemistry 27: 4512- 4523 (1988) Miki and lio, e? NBD 38 Biochim. Biophys . Acta 790: 201-207 (1984) Pireno Coumarin 39 Borochov-Neori y Montal, supra, 1989 Peerce y Wright , IPM FNAI 39 supra, 1986 Tao et al . , IAEDA S DAB 40 Biochemistry 22: 3059- 3066 (1983) IAEDA S TNP-ATP 40 Tao et al., supra, 1983 e-? IANBD 40 Miki y Wahl, Biochim. Biophys. Acta 786: 188- 196 (1984) NBD SRH 40-74 Wolf et al., Biochemistry 31: 2865-2873 (1992) Jacobson y Colman, ISA TNP 42 Biochemistry 23: 3789- 3799 (1984) Dansil ODR 43 Lu et al., J. Biol. Chem. 264: 12956-12962 (1989) DA Z IAF 44-49 Cheung et al . , Biochemistry 21: 5135- 5142 (1983) F AI EITC 45 Peerce y Wright, supra, 1986 NBD LRH 45-70 Wolf et al., supra, 1992 IAF EIA 46 Taylor et al., supra, 1981 FITC ENAI 46 Peerce y Wright, supra, 1986 Proflavina ETSC 46 Robbins et al . , Biochemistry 20: 5301- 5309 (1981) CPM TNP-ATP 46 Snyder y Hammes, supra, 1985 IAEDANS IAF 46-56 Franzen, supra, 1985; Grossman, supra, 1990 Thielen et al . , CPM Fluoresceina 47 Biochemistry 23: 6668- 6674 (1984) Joña et al. , Biochim. Biophys. Acta 1028: 183-199 (1990); IAEDANS FITC 49 Birmachu et al . , Biochemistry 28: 3940- 3947 (1989) IAF TMR 50 Shahrokh et al., J. Biol. Chem. 266: 12082-12089 (1991) CF TR 51 Johnson et al., supra, 1993 CPM TRS 51 Odom et al., supra, 1984 e-? TNP-ATP 51 dos Remedios y Cooke, supra, 1984 CPM FM 52 Odom et al., supra, 1984 LY EM 53 Shapiro et al., J. Biol. Chem. 266: 17276-17285 (1991) FITC EITC 54 Carraway et al., J. Biol. Chem. 264: 8699-8707 (1989) IAEDANS DiO-C1 57 Shahrokh et al., supra, 1991 IAF ErlTC 58 Amler et al., supra, 1992 Kosk-Kosicka et al., FITC EM 60 J. Biol. Chem. 264: 19495-19499 (1989) FITC ETSC 61-64 Robbins et al., supra, 1981 FITC ErlTC 62 Amler et al., supra, 1992 Ozinskas et al . , BPE CY5 72 Anal. Biochem. 213: 264- 270 (1993) Fluoresceína Fluoresceína 44 BODIBY FL BODIPY FL 57 ANAI , 2-antraceno N-acetilimidazol ; BPE, B-ficoeritrina; CF, éster de succinimidil carboxifluoresceína; CPM, 7 -dietilamino-3 - (4 ' -maleimidilfenil ) -4 -met ilcumarina ,- CY5 , éster carboximetil indocianina-N-hidroxisuccinimidilo ; dil -Cis, 1,1' -dioctadecil - 3-3,3,3' , 3 ' - tetrametil -indocarbocianina ; diO-C14 , 3,3' -ditetradeciloxacarbocianina ; DABM, 4-dimetilaminofenilazo-fenil-4 ' -maleimida; DACM, (7- (dimetilamino) cumarin-4-il) -acetilo; DANZ, dansilaziridina; DDPM, N- (4 -dimetilamino -3 , 5 -dinitrofenil ) maleimida ; DMAMS , dimetilamino-4 -maleimidostilbeno ; DSM , N- (2,5' -dimetoxistiben-4-il) -maleimida; DNP, 2 , 4 -dinitrofenil ; e-?, 1 , N6-etenoadenosina ; EIA, 5- (yodoacetetamido) eosina; EITC, eosin-5-isotiocianato; ENAI, eosin N-acetilimidazol ; EM, eosina maleimida; ErlTC, eritrosin-5 ' -isotiocianato; ETSC, eosin tiosemicarazida; F2DNB, 1 , 5-difluoro-2 , 4 ' -dinitrobenceno; F2DPS, 4,4' -difluoro-3 , 3 ' -dinitrofenilsulfona ; FITC, fluoresceína tiosemicarbazida; IAANS, ácido 2- (4' -yodoace amido) anilino) naftalen-6 sulfónico; IAEDANS, ácido 5- (2- ( (yodoacetil) amino) etil) amino) naftalen-1-sulfónico; IAF, 5-yodoacetamidofluoresceína ; IANBD, N- ( (2- (yodoacetoxi) etil) -N-metil) amino-7 nitrobenz-2 -oxa- 1 , 3-diazol ; IPM, 3 (4-isotiocianatofenil) 7-dietil-4-amino-4 metilcumarina ; ISA, ácido 4 - (yodoacetamido) salicílico ; LRH, lisaminorodamina; LY, amarillo lucifer, mBBR, monobromobiamano; MNA, (2-metoxi-l-naftil) metilo; NAA, ácido 2 -naf oxiacético ; NBD, 7-nitro-2 , 1 , 3-benzoxadiazol-4-il ; NCP, N-ciclohexil -N' - (1-pirenil) carbodiimida; ODR, octadecilrodamina ; PM, N- (1-pireno) -maleimida; SRH, sulforodamina; TMR, tetrametilrodamina; TNP, trinitrofenilo; y TR, rojo Texas. Un aminoácido aromático tal como triptofano o tirosina también puede ser un fluoróforo donante útil en el substrato de toxina clostridial y las composiciones y métodos descritos en la presente. Los pares fluoróforo donante -aceptor en los cuales el triptofano o tirosina es el fluoróforo y las distancias Fórster relevantes se muestran en la tabla C a continuación. Los aminoácidos modificados también pueden ser útiles como fluoróforos donantees y aceptores en un substrato de toxina clostridial útil en la invención. Tales aminoácidos modificados fluorescentes o apagados se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, el aminoácido fluorescente L-pirenilalanina (Pya) y el aceptor no fluorescente p-nitrofenilalanina ( op) , como se describe, por ejemplo, en Anne et al., Analytical Biochem. 291: 253-261 (2001) .
Tabla C DISTANCIAS FÓRSTER USANDO TRP COMO DONANTE Donante Aceptor R0 Referencia (?) Trp Ru (III) (NH3) 12-16 Recchia et al . , Biochim. Biophys. Acta 702 : 105-111 (1982) Trp Nitrobenzoilo 16 Wiczk et al . , J . Fluo 1:273-286 (1991) Trp Dansilo 21 Steinberg, Annu . Rev . Biochem. 40 : 83-114 (1971) Trp IAEDANS 22 Matsumoto and Hammes, Biochemistry 14 : 214 - 224 (1975) Trp ANS 23 Conrad and Brand, Biochemistry 7 : 777- 787 (1968) Trp Antroiloxi 24 Wiczk et al., supra, 1991 Trp TNB 24 Wu and Brand, Biochemistry 31: 7939- 7947 (1992) Trp Antroilo 25 Burgun et al . , Arch . Biochem. Biophys . 286: 394-401 (1991) Trp Tyr-N02 26 Steiner et al . , J.Fluo. 1:15-22 (1991) Trp Pireno 28 Vekshin, Mol. Biol . 17: 827-832 (1983) Trp Hemo 29 Ladokhin et al . , Proc. SPIE 1640: 562- 569 (1992) Trp NBS 30 Wiczk et al . , supra, 1991 Trp DNBS 33 Wiczk et al . , supra, 1991 Trp DPH 40 Le Doan et al . , Biochim. Biophys. Acta 735:259-270 (1983) En vista de los anterior se entenderá que una diversidad de pares fluoróforo donante/aceptor pueden incluirse en un substrato de toxina clostridial útil en la invención. El par fluoróforo/aceptor donante útil en el substrato de toxina clostridial puede ser por ejemplo, la fluoresceína de fluoróforo donante en combinación con rodamina; rojo texas, eosina ROX (6-carboxi-X-rodamina,- Applied Biosystems División of Perkin-Elmer Corporation; Foster City, CA) ; o TA RA (N, N, N' , N' -tetrametil - 6 -carboxi -rodamina ; Applied Biosystems) . Un par fluoróforo de un aceptor donante útil en la invención también puede ser por ejemplo, el azul de cascada de fluoróforo donante con fluoresceína como un aceptor; El fluoróforo donante BODIPY® 530/550 (4 , 4 -difluoro-5, 7-difenil-4-bora-3a, 4a-diaza-S-indaceno) en combinación con B0DIPYS 542/563 (4 , 4 -difluoro-5-p-metoxifenil-4 -bora-3a, 4a-diaza- S - indaceno) como un aceptor; o BODIPY 542/563 en combinación con BODIPY* 564/570 (4 , 4 -di fluoro- 5 -stiril - 4 -bora-3a, 4a-diaza-S-indaceno) como un aceptor. Se entenderá que los números que siguen al nombre BODIPY1 reflejan los máximos de excitación y emisión de molécula; los compuestos BODIPY° están comercialmente disponible de Molecular Probes (Eugene, Oregon) . Los substrato de toxina clostridial útiles en la invención incluyen aquellos en los cuales el fluoróforo donante es fluoresceína. En una modalidad, el substrato de toxina clostridial incluye fluoresceína como el fluoróforo donante y tetrametil rodamina como el aceptor. Tal substrato puede excitarse en el rango de 480 a 505 nm, por ejemplo, a 488 nm o 492 nm, y la emisión detectada de 520 nm { em fluoresceína), 585 nm (Xem tetrametilrodamina) , o ambos. Antes del desdoblamiento del substrato en el sitio de desdoblamiento de la toxina clostridial, la intensidad de emisión de tetrametilrodamina es mayor que la de la fluoresceína; el desdoblamiento del substrato resulta en un cambio en la relación de intensidad de fluoresceína a tetrametilrodamina. El desdoblamiento generalmente resulta en la fluoresceína que se vuelve el fluoróforo emisior dominante. Los métodos para preparar proteínas y péptidos que contiene fluoresceína y tetrametilrodamina son bien conocidos en la técnica (ver por ejemplo, Matsumoto et al., Bioorg . Med. Chem. Letters 10: 1857-1861 (20000)). Un fluoróforo donante útil en un substrato de toxina clostridial también puede ser por ejemplo, EDANS (?^ 340 nM, Xem 490 nm) , que puede combinarse como un aceptor tal como DABCYL. Donde DABCYL y EDANS se combina en un substrato de toxina clostridial, la energía se transfiere del fluoróforo donante EDANS al aceptor DABCYL en el substrato intacto, lo que resulta en el apagado de la fluorescencia se emisión. Durante el desdoblamiento en el sitio de desdoblamiento de toxina, la fluorescencia del producto EDANS desdoblado se incrementa y puede restaurarse, por ejemplo, para el nivel de fluoróforo donante libre. El apagado de fluorescencia eficiente en el substrato intacto se presenta como resultado de un traslape energético favorable del espectro de emisión EDANS y el espectro de absorbancia DABCYL, y el curso de vida en estado excitado relativamente larga del fluoróforo donante EDANS (Wang et al., Tetrahedron Lett. 31:6493-6496 (1991); Holskin et al; Anal. Biochem. 226:148-155 (1995); y Wang et al., Anal. Biochem. 210:351-359 (1993)). El Dansyl (DNS o 5-dimeteilaminonaftalen-l-sulfonil) también puede ser útil como un fluoróforo donante o aceptor de un substrato de toxina clostridial, En una. modalidad, el substrato de toxina clostridial incluye dansilo como el fluoróforo donante; el donante de dansilo puede combinarse, por ejemplo, con un residuo de nitrofenilo aceptor tal como Phe(pN02), que actúa como un apagador cuando está en proximidad al fluoróforo donante de dansilo. Los substratos que contiene el fluoróforo donante de dansilo, por ejemplo, en combinación de nitrofenilo, pueden prepararse como se describen por ejemplo en Florentin et al., Anal. Bicohem. 141: 62-69 (1984), o Goudreau et al., Anal. Biochem. 219: 87-95 (1994) . En otra modalidad el substrato de toxina clostridial contiene dansilo como aceptor. El aceptor dansilo puede actuar como un apagador cuando se combina, por ejemplo, con un fluoróforo donante tal como Trp (?e? 290 nm, ?ß?p 360 nm) . En un substrato de toxina clostridial que contiene Trp y dansilo, la fluorescencia Trp puede apagarse al 60% por la transferencia de energía al grupo dansilo, y este apagado puede reducir significativamente o abolirse en presencia de actividad de proteasa de toxina en el sitio de desdoblamiento de toxina (ver por ejemplo, Geoghegan et al., FEBS Letters 262 :119-122 (1990) ) . Se entenderá que los pares donante aceptor que tienen los máximos de emisión bien separados pueden ser útiles en los substratos de toxina clostridial y, por lo tanto, en las composiciones de substrato, células y métodos de la invención. Los máximos de emisión bien separados permiten alterar la emisión del aceptor al detectarse sin la contaminación de la emisión del donante. Un fluoróforo donante o aceptor, o ambos, pueden emitir por ejemplo, en el infrarrojo, por ejemplo, más de 650 nm. Tales fluoróforos de donante que emiten rojo alejado y aceptores incluyen pigmentos de cianuro tales como Cy5, Cy5.5 y Cy7 (Selvin, supra, 200) . En una modalidad, el substrato de toxina clostridial incluye Cy3 y Cy5 como el par fluoróforo-aceptor donante; Cy3 emite máximamente a 570 nm, y Cy5 emite máximamente a 670 nm. Tales pigmentos de cianina pueden prepararse por la síntesis directa, como se describe, por ejemplo, en Gruber et al., Bioconj . Chem. 11:161-166 (2000). Un fluoróforo donante útil en un substrato de toxina clostridial también puede ser por ejemplo, un átomo de lantánido, también conocido como un elemento de tierra rara. Las lantanidas tales como terbio (Tb) , europio (Eu) , disprosio (Dy) y samario (Sm) tienen longitudes de onda agudamente afiladas, tiempos de vida de milisegundos después de un pulso de excitación no son polarizadas y tiene rendimientos de cuantum altos . Un fluoróforo donante del lantanida tal como un quelato de terbio o europio pueden combinarse con una variedad de aceptores que incluyen aceptores de pigmentos orgánicos. Un fluoróforo donante de Eu-quelato puede combinarse, por ejemplo, con alofococianina (APC) , y un fluoróforo donante Tb-quelato puede combinarse, por ejemplo, con tetrametilrodamina . La fluorescencia de respaldo debido a la excitación directa se elimina temporalmente; las vidas medias de los aceptores orgánicos generalmente están en el rango de nanosegundos , mientras que la emisión sensibilizada sigue al curso de vida del fluoróforo donante y está en el orden microsegundos a milisegundos (ver Selvin, supra, 2000) . De esta manera la determinación de transferencia de energía de resonancia puede iniciarse después de la excitación siguiente, después de que se ha desvanecido la fluorescencia que interfiere no específicamente. Los quelatos de lantánidos son bien conocidos en la técnica y están comercialmente disponibles, por ejemplo de EG&G* Wallac (Turku, Finlandia) . Un fluoróforo donante útil en la invención también puede ser el fluoróforo bien conocido (7-metoxicumarin-4-il) acetil (Mea) , que puede combinarse con un aceptor tal como el apagador 2 , 4 -dinitrofenil (Dnp) . Ver, por ejemplo, Kakiuchi et al., J. Virol. Methods 80: 77-84 (1999). Cuando Mea se combina con el apagador apropiado tal como Dnp en el substrato de toxina clostridial, la fluorescencia de emisor de donante aumentada de Mea ( Em 393 nm) se detecta durante el desdoblamiento en el sitio de desdoblamiento de toxina clostridial e indica la actividad de toxina. Un fluoróforo donante útil en la invención también puede ser, por ejemplo, un grupo 2 -aminobenzoil (Abz), que puede combinarse, si se desea, con el apagador tal como 2,4-dinitrofenil (Dnp) . En un substrato de toxina clostridial intacto, el grupo Dnp apaga por transferencia de energía de resonancia, la fluorescencia del grupo Abz; el desdoblamiento proteolítico del substrato libera el apagado y resulta en un incremento en la fluorescencia proporcional a la concentración para el fragmento Abz liberado. El substrato de toxina clostridial que contiene, por ejemplo, Abz en la terminación amino y un residuo derivado de Dnp tal como lisina puede prepararse por métodos de rutina como se describe, por ejemplo, en Le Bonniec et al,m Biochemistry 35: 7114-7122 (1996) ) . El fluoróforo donante o aceptor útil en la invención también puede ser un pigmento Alexa Fluor* disponible comercialmente de Molecular Porbes (Eugene, OR) . Los ® pigmentos Alexa Fluor útiles en las composiciones de substratos células y métodos de la invención incluyen, por ejemplo, Alexa Fluor* 350, Alexa Fluor* 430, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor* 532, Alexa Fluor* 546, Alexa Fluor0 568, Alexa Fluor8 594, Alexa Fluor* 633, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor1' 660 y Alexa Fluor 680. Un fluoróforo donante o aceptor útil en la invención también puede ser un pigmento codificado genéticamente (ver arriba) . Se entenderá que los pigmentos genéticamente codificados tales como GFP, BFP, CFP o YFP pueden formar pares FRET uno con el otro, o pueden combinarse con otros fluoró oros o aceptores donantees apropiados . En una modalidad, el substrato de toxina clostridial incluye en fluoróforo genéticamente codificado y un aceptor genéticamente codificado. En otra modalidad, el substrato de toxina clostridial incluye un fluoróforo con un curso de vida de fluorescencia relativamente largo de al menos 1 microsegundo . Tal aceptor permite mediciones de resolución de tiempo de la emisión de fluorescencia debido a los cursos de vida de fluorescencias de las impurezas y puede aumentar la señal para la relación de ruidos. Un par fluoróforo donante/aceptor útil para fluorescencia de resolución en tiempo, puede ser por ejemplo, un fluoróforo donante de criptato de europio tal como criptato de Eu- trisbipiridina (TBP-EU3+, ??? 337 nm) combinado con el fluoróforo aceptor de ficobiliproteína 105 kDa, aloficocianina (Sittampalam et al., Curr. Opin. Chem. Biol . 1:384-391 (1997)). El criptato de EU-trisbipiridina tiene dos grupos bipiridilo que cosechan luz y la canalizan para el EU3+ enjaulado; este fluoróforo donante tiene un curso de vida de fluorescencia larga y transferencia de energía no radiactivas para la aloficocianina cuando está en aproximidad cercana al aceptor, exhibiendo más del 50% de eficiencia de transferencia en la distancia fluoróforo donante/aceptor de 9.5 nra. Tanto TBP-EU3+ como la aloficocianina y sus características espectroscópicas son muy estables en el medio biológico, y la aloficocianina emite (???= 665 nm) con el curso de vida larga del donante, permitiendo la detección resuelta en tiempo (Kolb et al., J. Biomol . Screening 1:203-210 (1996) ) . Los métodos para preparar substratos que contienen tales pares fluoróforo donante/aceptor son bien conocidos en la técnica tales como se describen, por ejemplo, en Kolb et al., supra, 1996, and Sittampalam et al., supra, 1997. En una modalidad adicional, la invención se refiere a un substrato de toxina clostridial que contiene un aceptor no fluorescente, algunas veces designado un "apagador verdadero". Un aceptor no fluorescente puede ser útil, por ejemplo, para eliminar la fluorescencia de respaldo que resulta de la excitación del aceptor directa (no sensibilizada) . Una variedad de aceptores no fluorescentes se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, pigmentos DABCYL y QSYC 7 (ver Molecular Probes, supra, 1996) .
El substrato de toxina clostridial útil en la invención contiene un sitio de desdoblamiento de toxina clostridial que se coloca entre el fluoroforo donante y un aceptor. En una modalidad, el fluoroforo donante se coloca en la terminal amino del sitio de desdoblamiento, mientras que el aceptor se coloca en la terminal carboxi del sitio de desdoblamiento. En otra modalidad, el fluoroforo donante se coloca en la terminal carboxi del sitio de desdoblamiento, mientras que el aceptor se coloca en la terminal amino del sitio de desdoblamiento. Alguien experto en la técnica entenderá que hay varias consideraciones al seleccionar y colocar un fluoroforo donante y aceptor en un substrato de toxina clostridial útil en la invención. El fluoroforo donante y aceptor generalmente se coloca para minimizar la interferencia con el enlace del substrato a, o proteolisis por, la toxina clostridial. De esta manera, el fluoroforo donante y aceptor puede seleccionarse y colocarse, por ejemplo, de manera que minimicen la disrupción del enlace y las interacciones no enlazadas que son importantes para unir, y para minimizar la obstrucción estérica. Además, la distancia espacial entre el aceptor y el fluoroforo donante generalmente se limita para realizar una transferencia de energía eficiente del fluoroforo donante al aceptor. En la nomenclatura estándar, la secuencia que rodea el sitio de desdoblamiento de toxina clostridial se denota P5-P-?3-?2-??-??' -?2' -P3' -? ' -Ps' - con P1-P1' representando el enlace hendible. En modalidades particulares, la invención proporciona una composición de substrato, célula o método que incluye un substrato de toxina clostridial en el cual el residuo en la posición ??' -P2' -P3* -?4' -P5' P,s está substituido con un aminoácido conjugado a un fluoróforo donante o aceptor, y en el cual el residuo en la posición -P2' -P3 ' -P4' -P5' o P 5' se substituye con un aminoácido conjugado a un fluoróforo donante o aceptor. En otras modalidades, la invención proporciona una composición de substrato, célula o método que incorpora un substrato de toxina clostridial en el cual el residuo en la posición ??' , ?3' , ?4' o P>5 está substituido con aminoácido conjugado a un fluoróforo donante o aceptor, y en el cual el residuo en la posición P2' , P3' , P5' o P>5' está substituido con un aminoácido conjugado a un fluoróforo donante o aceptor. Se entenderá además que la cadena lateral de aminoácido del residuo conjugado al fluoróforo donante o aceptor puede ser de otra manera idéntica al residuo presente en la posición correspondiente de la proteína objetivo que se presenta naturalmente, o puede contener, por ejemplo, una cadena lateral diferente. Se proporciona además por la invención una composición de substrato, célula o método que incorpora un substrato de toxina clostridial en el cual el residuo en P3, P o P>5 está substituido con un aminoácido conjugado a un fluoróforo donante o aceptor y en el cual el residuo en la posición P2', ?3' , P5' o P>5' está substituido con un aminoácido conjugado a un fluoróforo donante o aceptor. Nuevamente, la cadena lateral de aminoácido del residuo conjugado al fluoróforo donante o aceptor puede ser de otra manera idéntica al residuo presente en la posición correspondiente de la proteína objetivo que se presenta naturalmente, o puede contener, por ejemplo, una cadena lateral diferente. Como se discute arriba, la eficiencia de transferencia de energía del fluoróforo donante al aceptor depende, en parte, de la separación espacial del fluoróforo donante y moléculas aceptoras . Cuando la distancia entre el fluoróforo donante y aceptor se incrementa, hay menos transferencia de energía al aceptor y la señal de fluorescencia del donante por lo tanto se incrementa, aún antes del desdoblamiento. El incremento general en el rendimiento de fluorescencia del fluoróforo donante, durante el desdoblamiento del substrato depende de muchos factores, incluyendo la distancia de separación entre el fluoróforo donante y aceptor en el substrato, el traslape espectral entre el fluoróforo donante y aceptor y la concentración de substrato. Alguien experto en la técnica entenderá que, como la concentración del substrato se incrementa, el apagado intramolecular del donante, aún después del desdoblamiento proteolitico puede volverse un factor. Este fenómeno se denota el "efecto de filtrado interno" . Alguien experto en la técnica entenderá además que la concentración intracelular del substrato puede controlarse , por ej emplo , a través del uso de un promotor inducible o la concentración externa del substrato a l as cuales las células se exponen . La distancia Fórster, que es la separación entre el f luoróforo donante y un aceptor por el 50 % de transferencia de energía , representa una separación espacial entre el f luoróforo donante y el aceptor que proporciona una buena sensibilidad . Para los substratos péptidos, los residuos adyacentes se separan por una distancia de aproximadamente 3 .6 Á en la conformación más extendida . Por ejemplo, la distancia Fórster calculada para un par fluoresceína/tetrametilrodamina es 55Á que representará una separación espacial entre la fluoresceína y tetrametilrodamina de alrededor de 15 residuos en la conformación más extendida . Debido a que los péptidos y peptidomiméticos en la solución raramente tiene una conformación completamente extendida, los fluoróforos donantees y aceptores pueden ser más ampliamente separados que lo que se espera con base en el cálculo realizado usando 3 .6Á por residuo y todavía se mantienen dentro de la distancia Fórster como se muestra , por ej emplo , por la presentación de FRET entre los pares donante -aceptor separados por alrededor de 50 aminoácidos (Graham et al . , Analyt , Biochem . 296 : 208 - 217 ( 2001 ) ) . La teoría Fórster se basa en interacciones muy débiles entre el f luoróforo donante y un aceptor ; propiedades espectroscópicas tales como absorción de un fluoróforo no deberían alterarse en presencia del otro, definiendo el rango de distancia más corto sobre el cual la teoría es válida. Se entenderá que, para muchos pares fluoróforo donante-aceptor , la teoría Fórster es válida cuando los fluoróforos donantees y aceptores se separan por alrededor 10Á hasta 100Á. Sin embargo, para pares fluoróforo donante-aceptor particular, la teoría Fórster es válida bajo 10Á como se determina por técnicas de subpicosegundo (Kaschke and Ernsting, Ultra ast Phenomenon in Spectroscopy (Klose and Wilhelmi (Eds.)) Springer-Verlag , Berlín 1990. De esta manera, en modalidades particulares, la invención proporciona una composición de substrato, célula o método que incorpora un substrato de toxina clostridial en el cual el fluoróforo donante se separa del aceptor por una distancia de más de 100Á. En otras modalidades, la invención proporciona una composición de substrato, célula o método que incorpora un substrato de toxina clostridial en el cual el fluoróforo donante se separa del aceptor por una distancia de al menos 90Á, 80Á, 70Á, 60Á, 50Á, 40Á, 30Á o 20Á. En modalidades adicionales, la invención proporciona una composición de substrato, célula o método que incorpora un substrato de toxina clostridial en el cual el fluoróforo donante se separa del aceptor por una distancia de 10Á a 100Á, 10Á a 80Á, 10Á a 60Á, 10Á a 40Á, 10Á a 20Á, 20 a 100Á, 20Á a 80Á, 20Á a 60Á, 20Á a 40Á, 40Á a 100Á, 40Á a 80Á o 40Á a 60Á. Todavía en modalidades adicionales, la invención proporciona una composición de substrato, célula o método que incorpora un substrato de toxina clostridial en el cual el fluoróforo donante y el aceptor se separan por a lo más 6 residuos, a lo más 8 residuos, a lo más 10 residuos, a lo más 12 residuos, a lo más 15 residuos, a lo más 20 residuos, a lo más 25 residuos, a lo más 30 residuos, a lo más 35 residuos, a lo más 40 residuos, a lo más 45 residuos, a lo más 50 residuos, a lo más 60 residuos, a lo más 70 residuos, a lo más 80 residuos, a lo más 90 residuos, a lo más 100 residuos, a lo más 150 residuos, a lo más 200 residuos, o hasta la longitud completa de una proteína objetivo de toxina clostridial que se presenta naturalmente. Alguien experto en la técnica entenderá que el substrato de toxina clostridial útil en la invención puede designarse para optimizar la eficiencia de FRET así como la capacidad para detectar actividad de proteasa. Alguien experto en la técnica entenderá que el fluoróforo donante puede seleccionarse, si se desea, con un rendimiento quantum alto, y el aceptor puede seleccionare, si se desea, con un coeficiente de extinción alto para maximizar la distancia Fórster. Alguien experto en la técnica entenderá además que la fluorescencia que se erige de la excitación directa de un aceptor puede dificultar el distinguir la fluorescencia resultante de la transferencia de energía de resonancia. De esta manera se reconoce que el fluoróforo donante y aceptor pueden seleccionarse de manera que tengan un traslape relativamente pequeño de su espectro de excitación de tal manera que el donante puede excitarse a una longitud de onda que no resulte en una excitación directa del aceptor. Se reconoce además que el substrato de toxina clostridial útil en la invención puede designarse de manera que el espectro de emisión del fluoróforo donante y aceptor traslape relativamente poco de tales 2 emisiones puede distinguirse fácilmente. Si se desea, un aceptor que tiene un rendimiento quantum fluorescente alto puede seleccionarse, tal aceptor puede utilizarse ventajosamente donde la emisión de fluorescencia del aceptor se va a detectar como el único indicador de actividad toxina clostridial, o como parte ce una relación de emisión como se discute arriba. Se entenderá que el fluoróforo donante, aceptor o ambos, pueden localizarse dentro de la cavidad de sitio activo de la holoenzima de toxina de tétanos o botulinum. Alguien experto en la técnica entenderá que, si se desea, el substrato de toxina clostridial útil en la invención puede designarse de manera que, cuando se enlaza por toxina el fluoróforo donante, aceptor o ambos, se excluye de la cavidad del sitio activo de holoenzima de toxina. Como un ejemplo, el substrato de toxina clostridial puede incluir una substrato de toxina de botulinum o un substrato de toxina de tétanos en el cual, cuando se enlaza por toxina, el fluoróforo donante, aceptor o ambos, se excluye de la cavidad del sitio activo de la holoenzima de toxina. La invención proporciona, por ejemplo, una composición de substrato, célula o método que incorpora un substrato BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G o TeNT en el cual, cuando se enlaza por toxina, el fluoróforo donante, aceptor o ambos, se excluye de la cavidad de sitio activo de la holoenzima de toxina. En una modalidad, el substrato BoNT/A contiene al menos 6 residuos de SNAP-25 humano, donde los 6 residuos incluyen Gln197-Argi98 , y además contiene un fluoróforo donante, aceptor o ambos, que se coloca fuera del residuo Arg191 a Met2o2 que puede estar dentro de la cavidad del sitio activo de la holoenzima de BoNT/A. En otra modalidad, el substrato BoNT/B contiene 6 residuos de VAMP-2 donde los 6 residuos incluyen Gln7S-Phe77, y además incluye un fluoróforo donante, aceptor o ambos, que se coloca fuera de los residuos Leu70 a Ala91 de VAMP-2, que puede estar dentro del sitio activo de la holoenzima BoNT/B.
En un complejo de substrato VAMP y la cadena ligera de BoNT/B (LC/B) , casi todos los residuos VAMP dentro de las cadenas laterales contienen aceptores de enlace de hidrógeno o donantees donde se enlaza el hidrogeno con el LC/B. de esta manera, se entenderá que el substrato de toxina clostridial útil en la invención puede prepararse, si se desea, en el cual el potencial para el enlace de hidrógeno, por ejemplo, por residuos Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu, Asn Gln no se disminuye en el substrato de toxina clostridial cuando se compara con la sensibilidad de proteína nativa al desdoblamiento de la toxina. En modalidades particulares, la presente invención proporciona una composición de substrato, célula o método que incorpora el substrato de toxina clostridial en el cual el potencial para el enlace de hidrógeno no disminuye en el substrato comparado con la sensibilidad de proteína nativa para desdoblar por la toxina clostridial correspondiente. Se entenderá que, además del fluoróforo donante, aceptor y una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial, el substrato de toxina clostridial útil en la invención puede incluir opcionalmente uno o más componentes adicionales. Como un ejemplo, una secuencia espaciadora flexible tal como (SEQ ID NO: 40) puede incluirse en el substrato de toxina clostridial útil en la invención. El substrato de toxina clostridial útil puede incluir además, sin limitación, uno o más de los siguientes: etiqueta de afinidad tal como HIS6, biotina, o un epitopo tal como FLAG, hemaglutinina (HA) , c-myc, o AU1 ; una región de articulación de immunoglobulina ; un enlazador de N-hidroxisuccinimida ; un péptido o un peptidomimético de horquilla de vuelta; o una secuencia hidrofílica, u otro componente o secuencia que promueva la solubilidad o estabilidad del substrato de toxina clostridial.
Los métodos para modificar proteínas, péptidos y peptidomiméticos para contener un fluoróforo donante o aceptor son bien conocidos en la técnica (Fairclough and Cantor, ethods Enzymol . 48: 347-379 (1978); Glaser et al., Chemical Modification of Proteins Elsevier Biochemical Press, Ámsterdam (1975) ; Haugland, Excited States of Biopolymers (Steiner Ed.) pp. 29-58, Plenum Press, New York (1983); Means and Feeney, Bioconjugate Chem. 1:2-12 (1990); Matthews et al., Methods Enzymol. 208: 468-496 (1991); Lundblad, Chemical eagents for Protein Modification 2nd Ed., CRC Press, Boca Ratón, Florida (1991); Haugland, supra, 1996) . Una variedad de grupos puede usarse para acoplar el fluoróforo donante o aceptor, por ejemplo, a un péptido o peptidomimético que contiene una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial . Un grupo tiol, por ejemplo, puede usarse para acoplar el fluoróforo donante o aceptor a la posición deseada en el péptido o peptidomimético para producir un substrato de toxina clostridial útil en las composiciones de substrato, células y métodos de la invención. Los reactivos etiquetados en haloacetilo y maleimida también pueden usarse para acoplar fluoróforos donantees o aceptores en la preparación de un substrato de toxina clostridial útil en la invención (Ver, por ejemplo, Wu and Brand, supra, 1994). Los fluoróforos donantees y aceptores que incluyen proteínas tales como GFP y aloficocianina (APC) , pueden enlazarse a una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial por una variedad de medios. El fluoroforo donante o aceptor pueden enlazarse por medios químicos, por ejemplo, usando una porción reticulada. Los reticuladores son bien conocidos en el arte, e incluyen reticuladores homo y hetero-bifuncionales tales como BMH y SPDP. Alguien de experiencia en la técnica entenderá que los substratos contaminantes que contienen solo el fluoroforo donante pueden resultar en un respaldo de fluorescencia alto. Tal respaldo puede reducirse o prevenirse, por ejemplo, al usar un exceso relativo de aceptor al fluoroforo donante en la preparación del substrato de toxina clostridial . Donde el fluoroforo donante o aceptor es una proteína, pueden emplearse métodos químicos bien conocidos para moléculas específicamente enlazadas a las terminaciones amino o carboxi de una proteína. Ver, por ejemplo, "Chemical Approaches to Protein Engineering" in Protein Engineering: A Practical Approach Rees et al. (eds) Oxford University Press, 1992. Es bien conocido en la técnica que las toxinas clostridiales tienen sitios de desdoblamiento específicos y distintos. BoNT/A desdobla un enlace Gln-Arg,- BoNT-B y TeNT desdoblan un enlace Gln-Phe; BoNT/Cl desdobla un enlace Lys-Ala o Arg-Ala; BoNT/D desdobla un enlace Lys-eu; BoNT/E desdobla un enlace Arg-Ile; BoNT-F desdobla un enlace Gln-Lys; y BoNT/G desdobla un enlace Ala-Ala (Ver tabla D) . En la nomenclatura estándar, la secuencia que rodea el sitio de desdoblamiento de toxina clostridial se denota P5-P4-P3-P2-P1-??' -P2' -P3' -P4' -P5' , con P1-P1' representando el enlace hendible. Se entenderá que un sitio Pi o Pj , o ambos, pueden substituirse con otro aminoácido o aminoácido mimético en lugar del residuo que se presenta naturalmente. Como un ejemplo, los substratos BoNT/A se han preparado en los cuales la posición Pi (Gln) se modifica para ser una alanina, ácido 2-aminobutírico o residuo de asparagina; estos substratos se hidrolizan por BoNT/A en el enlace Px-Arg (Schmidt and Bostian, J. Protein Chem. 16: 19-26 (1997)) . Si bien se reconoce que las substituciones pueden introducirse en la posición Pi del enlace hendible, por ejemplo, el enlace hendible BoNT/A, se reconoce además que la conservación del residuo i' puede ser ventajosa (Vaidyanathan et al., J. Neurochem. 72: 327-337 (1999)). De esta manera, en modalidades particulares, la invención proporciona una composición de substrato, célula o método que se refiere a un substrato de toxina clostridial que tiene una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial en la cual el residuos Pi' no se modifica o substituye con relación al residuo que se presenta naturalmente en la proteína objetivo desdoblada por la toxina clostridial. En otras modalidades, la invención proporciona una composición de substrato, célula o método que se refiere a un substrato de toxina clostridial que tiene una secuencia de reconocimiento en la cual el residuo Pi se modifica o se substituye en relación al residuo que se presenta naturalmente en una proteína objetivo desdoblada por la toxina clostridial ; tal substrato de toxina clostridial mantiene la susceptibilidad a un desdoblamiento de enlace péptido entre los residuos Px y Pi' . Tabla D Enlaces desdoblados en VAMP-2 humano, SNAP-2 o sintaxina ?Enlace hendible mostrado en negritas SNAP-25, VAMP y sintaxina comparten una porción corta localizada dentro de las regiones predichas para adoptar una conformación de hélice-a (Ver Figura 4) . Esta porción se presenta en las isoformas SNAP-25, VAMP y sintaxina expresadas en animales sensibles a la neurotoxinas . En contraste, la drosofila y levaduras homologas que son resistentes a estas neurotoxinas e isoformas de sintaxina no están involucradas en la exocitosis que contiene variaciones de secuencia en las regiones de porción de hélice a de estas proteínas VAMP y sintaxina. Las repeticiones múltiples de la porción de hélice a se presentan en proteínas sensibles al desdoblamiento por toxinas clostriales: Cuatro copias se presentan naturalmente en SNAP-25; 2 copias se presentan naturalmente en VAMP; y 2 copias se presentan naturalmente en sintaxina (Ver figura 4A) . Adicionalmente , los péptidos que corresponden a la secuencia específica a los porciones hélices a pueden inhibir la actividad de neurotoxina in vitro e in vivo, y tales péptidos pueden inhibir de manera cruzada diferentes neurotoxinas. Además, los anticuerpos erigidos contra tales péptidos pueden reaccionar de manera cruzada entre las tres proteínas objetivo, lo que indica que esta porción de hélice a se expone a la superficie celular y adopta una configuración similar en cada una de las tres proteínas objeto. Consistente con estos hallazgos, las neurotoxinas específicas de SNAP-25, específicas de VAMP y específicas de sintaxina inhiben de manera cruzada cada una de las otras al competir por el mismo sitio de enlace, no obstante que no desdoblan objetivos no específicamente. Estos resultados indican que la secuencia de reconocimiento de toxina clostridial puede incluir, si se desea, al menos una porción de hélice a. Se reconoce que una porción de hélice a no se requiere para desdoblar por la toxina clostridial, como se evidencia por los substratos 16-mero y 17-mero para BoNT/A, como se discute además a continuación. No obstante que las múltiples porciones de hélice a se encuentran en proteínas objetivo SNAP-25, VAMP y sintaxina que se presentan naturalmente, la secuencia de reconocimiento de toxina clostridial útil en las composiciones de substrato, células y métodos de la invención, puede ser una porción de hélice a sencilla. En modalidades particulares, la invención se refiere a una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que incluye dos o más porciones de hélice a. Una secuencia de reconocimiento BoNT/A o BoNT/E puede incluir, por ejemplo, la porción de hélice S4 , sola o combinada con una o más porciones de hélice adicionales; la secuencia de reconocimiento BoNT/B, BoNT/G o TeNT puede incluir, por ejemplo, la porción de hélice a V2 , sola o combinada con uno o más porciones de hélice a adicionales; la secuencia de reconocimiento BoNT/Cl puede incluir, por ejemplo, la porción de hélice a S4, sola o combinada con una o más porciones de hélice a, o la porción de hélice a X2 , sola o combinada con otras porciones de hélice a adicionales; y la secuencia de reconocimiento BoNT/D o BoNT/F puede incluir, por ejemplo, la porción de hélice a VI, sola o combinada con una o más porciones de hélice a adicionales (Ver Figura 4A) . Son útiles una variedad de substratos BonNT/A en la invención. El substrato BoNT/A útil en las composiciones de substrato, células y métodos de la invención, puede incluir, por ejemplo, al menos seis residuos consecutivos de SNAP-25, donde los 6 residuos consecutivos incluyen Gln-Arg, o un pept idomimét i co del mismo. Tal substrato BoNT/A puede contener, por ejemplo, al menos 6 residuos consecutivos de SNAP-25 humano, donde los 6 residuos consecutivos incluyen Glni97 -Arg198 , o un pept idomimét i co del mismo. Tal substrato BoNT/A puede incluir, por ejemplo, la secuencia de aminoácido Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys ( SEQ ID NO: 41) o, por ejemplo, los residuos 187 hasta 203 de SNAP-25 (SEQ ID NO: 4) humano. El substrato BoNT/A además puede incluir, si se desea, una amida de terminal carboxi .
Como se usa en la presente, el término "secuencia de reconocimiento de serotipo A de toxina de botulim" es sinónimo con secuencia de reconocimiento BoNT/A" y significa un enlace hendible junto con los elementos de reconocimiento adyacentes y no adyacentes suficientes para la proteolisis detectable en el enlace hendible por un BoNT/A bajo condiciones apropiadas para la actividad proteasa de toxina clostridial . El desdoblamiento del enlace hendible por BoNT/A puede ser, por ejemplo, Gln-Ala. Una variedad de secuencias de reconocimiento BoNT/A son bien conocidas en la técnica y son útiles en la invención. una secuencia de reconocimiento BoNT/A puede tener, por ejemplo, residuos 134 hasta 206 o residuos 137 hasta 206 de SNAP-25 humano (Ekong et al. , supra, 1997; Patente E.U.A. No. 5,962,637) . La secuencia de reconocimiento BoNT/A también puede incluir, sin limitación, la secuencia Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (SEQ ID NO: 49) o un pept i domimé t ico del mismo, que corresponde a los residuos 190 hasta 202 de SNAP-25 humano; Ser-Asn-Lys-Thr-Arg- I 1 e - Asp - Glu - Al a - Asn-Gln- Arg-Ala - Thr -Lys (SEQ ID NO: 50) o un pept idomimét i co del mismo, que corresponde a los residuos 187 hasta 201 de SNAP-25; humano; S er - Asn - Lys - Thr - Arg - 11 e - Asp -Glu-Ala - Asn -Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (SEQ ID NO: 51) o un pept idomimét ico del mismo, que corresponde a los residuos 187 hasta 202 de SNAP-25 humano; Ser-Asn-Lys-Thr-Arg-Ile-Asp-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met-Leu (SEQ ID NO: 52) o un pept idomimét i co del mismo, que corresponde a los residuos 187 hasta 203 de SNAP-25 humano; Asp - Ser- Asn- Lys - Thr -Arg - 11 e -Asp -Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met (SEQ ID NO: 53) o un peptidomimético del mismo, que corresponde a los residuos 186 hasta 202 de SNAP-25 humano; o Asp-Ser-Asn - Lys -Thr-Arg- Ile-As'p-Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met-Leu (SEQ ID NO: 54) o un peptidomimético del mismo, que corresponde a los residuos 186 hasta 203 se SNAP-25 humano. Ver, por ejemplo, Schmidt and Bostian, J. Protein Chem. 14: 703-708 (1995) ; Schmidt and Bostian, supra, 1997; Schmidt et al., FEBS Letters 435: 61-64 (1998) ; y Schmidt and Bostian, Patente E.U.A. No. 5,965,699) . Si se desea, puede prepararse una secuencia de reconocimiento BoNT/A similar de un segmento correspondiente (homólogos) de otra isoforma SNAP-25 sensible al BoNT/A u homólogo, tal como, por ejemplo, SNAP-25 de murino, rata, pez dorado, o pez cebra, o puede ser cualesquiera de los péptidos descritos en la presente o conocidos en el arte, por ejemplo, en la patente E.U.A. No. ,965,699. La secuencia de reconocimiento BoNT/A útil en la invención puede corresponder a un segmento de una proteína que es sensible al desdoblamiento por el serotipo A de toxina de botulinum, o puede ser subst anc i alment e similar a un segmento de una proteína sensible a BoNT/A. Como se ilustra en la tabla E, una variedad de proteínas que se presentan naturalmente sensibles al desdoblamiento por BoNT/A se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, de humano, ratón y rata SNAP-25; y SNAP-25A y SNAP-25B de pez dorado. De esta manera, la secuencia de reconocimiento BoNT/A útil en la invención puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de SNAP-25 humano, SNAP-25 de ratón, SNAP-25 de rata, SNAP-25A de pez dorado o 25B, u otra proteína que se presenta naturalmente sensible al desdoblamiento por BoNT/A. Adicionalmente , en comparación con las secuencias de aminoácido SNAP-25 nativo desdoblada por BoNT/A revela que tales secuencias no se conservan absolutamente (Ver tabla E y figura 5) , lo que indica que una variedad de substituciones de aminoácido y modificaciones con relación a la secuencia BoNT/A sensible a SNAP-25 que se presenta naturalmente puede tolerarse en una secuencia de reconocimiento BoNT/A útil en la invención.
Tabla E Desdoblamiento de SNAP-25 y proteínas relacionadasa,b,c,d Especies Isoforma Sitios de desdoblamiento Resistencia al desdoblado por BoNT/E ? BoNT/A T r BoNT/C Especies Isoforma Sitios de desdoblamiento Resistencia al desdoblado por BoNT/S -j BoNT/A -, r BoNT/C ? TT Fin C-elegans SNAP-25 qnrqid ti Ihdkqsnevrvesank rakhlitk BoNT/A & C 63 Fin BoNT/E i A* Drosofila SNAP-25 qnrqid hrkgesneariavan bralhqllk Fin Sanguijuela — SNAP-25 qnrqvdkrilinkmtenqlrisdan krjjskllke BoNT/A' a = Desdoblamiento in vitro de SNAP-25 requiere una concentración de BoNT/C 1000 veces mayor que BoNT/A o /E. b = La substitución de pl82r, o kl85dd (cuadros) induce la susceptibilidad hacia boNT/E. c = Resistencia a BoNT/A posiblemente debido a que la substitución dl89 o el89 por vl89, ver cuadro. d = Notar que el torpedo es susceptible a BoNT/A. e = Notar que la presencia de varias mutaciones no conservadoras alrededor de los sitios de desdoblamiento supuesto . El substrato de toxina clostridial, tal como el substrato BoNT/A, puede tener una o múltiples modificaciones comparadas con la secuencia que se presenta naturalmente que se desdobla por la toxina clostridial correspondiente. Como un ejemplo, comparado con la 17-mer que corresponde a los residuos 187 hasta 203 de SNAP-25 humano, la substitución de Aspl93 con Asn en el substrato BoNT/A resulta en una relación relativa de proteolisis de 0.23; la substitución de Glul94 con Gln resulta en una relación relativa de 20.8; la substitución de Alal95 con ácido 2 -aminobutírico resulta en una relación relativa de 0.38; y la substitución de Glnl97 con Asn, ácido 2 -aminobutírico o Ala resulta en una relación relativa de 0.66, 0.25, o 0.19, respectivamente (ver, tabla F) . Adicionalmente , la substitución de Alal99 con ácido 2-aminobutírico resulta en una relación relativa de 0.79; la substitución de Thr200 con Ser o ácido 2 -aminobutírico resulta en una relación relativa de 0.26 ó 1.20, respectivamente; la substitución de Lys201 con Ala resulta en una relación relativa de 0.12; y la substitución de Met202 con Ala o norleucina resulta en una relación relativa de 0.38 ó 1.20, respectivamente. Ver, Schmidt and Bostian, supra, 1997. Estos resultados indican que una variedad de residuos pueden substituirse en el substrato de toxina clostridial como se compara con una secuencia sensible a la toxina que se presenta naturalmente. En el caso de BoNT/A, estos resultados indican que los residuos incluyen, pero no se limitan a, Glul94, Alal95, Glnl97, Alal99, Thr200 y Met202, Leu203, Gly204, Ser205, y Gly206, así como residuos más distales del enlace hendible Gln-Arg, que puede substituirse o conjugarse para un fluoróforo donante o aceptor en el substrato BoNT/A útil en la invención. Tal substrato BoNT/A se proteolisa detectablemente en el enlace hendible por un BoNT/A bajo condiciones apropiadas para la actividad de proteasa de toxina clostridial. De esta manera, un substrato BoNT/A puede incluir, si se desea, una o varias substituciones de aminoácido, adiciones o eliminaciones con relación a la secuencia SNAP-25 que se presenta naturalmente.
Tabla F Parámetros cinéticos de los substratos de péptido sintético BoNT/A Péptido Secuencia SEQ ID NO: Relación relativa [1-15] SNKTRIDEANQRATK 66 0.03 [1-16] SNKTRIDEANQRATKM 67 1.17 [1-1 ] SNKTRIDEANQRATKML 68 1.00 M16A SNKTRIDEANQRATKAL 69 0.38 M16X SNKTRIDEANQRATKXL 70 1.20 K15A SNKTRIDEANQRATA L 71 0.12 T14S SNKTRIDEANQRASKML 72 0.26 T14B SNKTRIDEANQRABKML 73 1.20 A13B SNKTRIDEANQRBTKML 74 0.79 Q11A SNKTRIDEANARATKML 75 0.19 Q11B SNKTRIDEANBRATKML 76 0.25 Q11N SNKTRIDEANNRATKML 77 0.66 N10A SNKTRIDEAAQRATKML 78 0.06 A9B SNKTRIDEBNQRATKML 79 0.38 E8Q SNKTRIDOANQRATKML 80 2.08 D7N SNKTRINEANQRATKML 81 0.23 aLas abreviaturas de aminoácido no estándar son: B, ácido 2 -aminobutírico; X, ácido 2 -aminohexanoico (norleucina) bLas relaciones de hidrólisis inicial con relación al péptido [1-17]. Concentraciones de péptido fueron 1.0 mM. Una variedad de substratos BoNT/B son útiles en la invención. El substrato BoNT/B útil en la invención puede tener, por ejemplo, al menos seis residuos consecutivos de VAMP, donde los seis residuos consecutivos incluyen Gln-Phe, o peptidomimético del mismo. Como un ejemplo, el substrato BoNT/B puede contener al menos seis residuos consecutivos de VAMP-2 humanos, los seis residuos consecutivos incluyen Gln76-Phe77, o un peptidomimético del mismo. En una modalidad, el substrato BoNT/B incluye la secuencia de aminoácido Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser (SEQ ID NO: 42) , o un peptidomimético del mismo. En otras modalidades, el substrato BoNT/B incluye residuos de 55 hasta 94 de VAMP-2 (SEQ ID NO: 11) humano; residuos 60 hasta 94 de VAMP-2 (SEQ ID NO: 11) humano o residuos 60 hasta 88 VAMP-2 (SEQ ID NO: 11) o un peptidomimético de una de estas secuencias. Como se usa en la presente, el término "secuencia de reconocimiento de serotipo B de toxina de botulinum" es sinónimo con "secuencia de reconocimiento BoNT/B" y significa un enlace hendible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes suficientes para la proteolisis detectable en el enlace hendible por un BoNT/B bajo condiciones apropiadas. El enlace hendible desdoblado por BoNT/B puede, por ejemplo, ser Gln-Phe.
Una variedad de secuencias de reconocimiento BoNT/B son bien conocidas en la técnica o pueden modificarse por métodos de rutina. Tal secuencia de reconocimiento BoNT/B puede incluir, por ejemplo, una secuencia que corresponde a algunos o todos los núcleos hidrofílicos de la proteína VAMP tal como VAMP-1 humano o VAMP-2 humano. La secuencia de reconocimiento BoNT/B que puede incluir sin limitación residuos 33 hasta 94 residuos 45 hasta 94, residuos 55 hasta 94, residuos 60 hasta 94, residuos 65 hasta 94, residuos 60 hasta 88 o residuos 65 hasta 88 de VAMP-2 (SEQ ID NO: 11) humano, o residuos 60 hasta 90 de VAMP-1 ( SEQ ID NO: 10) humano. Ver por ejemplo, Shone, et al., Eur . J. Biochem. 217: 965-971 (1993) . Y patente de E.U.A No. 5,962,637. Si se desea puede prepararse una secuencia de reconocimiento BoNT/B similar del segmento correspondiente (homologas) de otra isoforma VAMP sensible a BoNT/B homólogo tal como un VAMP-1 de rata o VAMP-2 de pollo. De esta manera se entenderá que la secuencia de reconocimiento BoNT/B puede corresponder a un segmento de una proteína que es sensible al desdoblamiento por el serotipo B de toxina de botulinum, o puede ser substancialmente similar a tal segmento de una proteína sensible a BoNT/B. Como se muestra en la Tabla G una variedad de proteínas que se presentan naturalmente sensibles al desdoblamiento por BoNT/B se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, VAMP-1 y VAMP-2 de humano ratón y bovino; VA P-2 de rata; celubrevina de rata VAMP-2 de pollo; VAMP-1 de torpedo; VAMP de erizo de mar; VAMP de Aplisia; VAMP de calamar; VAMP de C. elegans; n-syb de Drosofila; y VAMP de sanguijuela. De esta manera una secuencia de reconocimiento BoNT/B incluida en un substrato BoNT/B puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de VAMP-1 o VAMP-2 humano, VAMP-1 o VAMP-2 de ratón, VAMP-1 o VAMP-2 de bovino, VAMP-2 de rata, celubrevina de rata, VAMP-2 de pollo, VAMP-1 de torpedo, VAMP de erizo de mar, VAMP de Aplisia, VAMP de calamar, VAMP de C elegans n-syb de Drosofila, VAMP de sanguijuela u otra proteína que presenta naturalmente sensible al desdoblamiento por BoNT/B. Adicionalmente como se muestra en la Tabla G, la comparación de secuencias de aminoácido VAMP nativas desdobladas por BoNT/B revela tales secuencias que no están absolutamente conservadas (ver también, figura 6) , lo que indica que una variedad de substituciones y modificaciones de aminoácidos en relación a una secuencia VAMP que se presenta naturalmente pueden tolerarse en un substrato BoNT/B por ejemplo, en un composición de substrato BoNT/B de la invención. Varios substratos BoNT/Cl son útiles en la invención. El substrato BoNT/Cl útil en la invención puede tener por ejemplo, al menos seis residuos consecutivos de sintaxina, los seis residuos consecutivos incluyen Lys-Ala, o un peptidomimético del mismo. Como un ejemplo el substrato BoNT/Cl puede tener al menos seis residuos consecutivos de sintaxina humana, los seis residuos consecutivos incluyen Lys253-Ala25 o un peptidomimético del mismo. En una modalidad, el substrato BoNT/Cl contiene la secuencia de aminoácido Asp-Thr-Lys-Lys-Ala-Val-Lys-Tyr (SEQ ID NO: 43) , o un peptidomimético del mismo. El substrato BoNT/Cl también puede contener por ejemplo, al menos seis residuos consecutivos de SNAP-25, donde los seis residuos consecutivos incluyen Arg-Ala, o un peptidomimético del mismo. Tal substrato BoNT/Cl puede tener por ejemplo, al menos seis residuos consecutivos de SNAP-25 humano, los seis residuos consecutivos humanos incluyen Arg-i98-Ala19g, o un peptidomimético del mismo. En una modalidad, el substrato BoNT/Cl contiene residuos 93 hasta 202 de SNAP-25 humano (SEQ ID NO: 4) o un peptidomimé ico del mismo. Como se usa en la presente, el término secuencia de reconocimiento de serotipo Cl de toxina de botulinum es sinónimo con secuencia de reconocimiento BoNT/Cl y significa un enlace hendible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes suficientes para la proteolisis detectable en el enlace hendible por un BoNT/Cl bajo condiciones apropiadas. El enlace hendible desdoblado por BoNT/Cl puede ser, por ejemplo, Lys-Ala o Arg-Ala. Tabla G Desdoblamiento de VAMP*, * Especies Isoforma Sitios de desdoblamiento SSQ Resistencia ID a> desdoblado NO i por BoHT/B BoNT/P-, |-BoNT/D ?ß??? rBoNT/0 be lddradalqagas bf klkrkyww " 82 ninfluna humano VAMP-1 dkvl«d| ratón bovino VAMP -2 " dkvlerd bklbelddradalqagaa bf le beba Iklkrkyww ·* B3 91 TeNT £ VAMP- 1 d lerdbklkelddradalqagaevfWesbapclkrkyww " ß4 BON /B VAMP- 2 dkvlerdbklUelddradalqagas fclkrkyww " 85 ninguna Cel brevina cUcvaerdbklleelddradalqagaebf Wtsbabilkrkyww " 86 TI-VAMP dlvaqrgerlLllidktenlvdsevtf D ttsr' nlaramcm 175 97 Tabla S Desdoblamiento de VAMP*, flEQ Resistencia ID al desdoblado NO l por BoNT/B ????/G? Bo T/D TaHT-|. rBoNT/ O TeNT ft VAMP —erdbkl |se lddradalqagas yf ptlkr- -- BoNT/B pollo VAMP ninguna erdbkllae lddradalqagas ktebaiklkr 89 ninguna Torpedo VAMP- 1 dkvlerdbkllselddradalqagae bf leseBajklkrkyww Bo T/F. D 6 erizo de mar dkvldrd ballsvlddradalqqgas bf letnag lkrkyww VAMP 91 G BoNT/G Aplisia VAMP ekvldrdbki iqlddraealqagas bf eekgpclkrkyvw " 92 Tabla G Desdoblamiento de VAMP*, Especies Isoterma Sitios de desdoblamiento SBQ Resistencia ID al desdoblado NO i por BoNT/B BoHT/F-| j-BoNT/D ?*»?? rBoHT/a C. eleg sanguijuela a - Secuencia corregida en la posición 93 (£»a) . b · Secuencia corregida en la posición 68 (t>s) .
Se entenderá que la secuencia de reconocimiento BoNT/Cl puede corresponder al segmento de la proteina que es sensible al desdoblamiento por sero tipo Cl de toxina de botulin, o puede ser substancialmente similar al segmento de una proteina sensible a BoNT/Cl. Como se muestra en la Tabla H una variedad de proteínas que se presentan naturalmente sensibles al desdoblamiento por BoNT/Cl se conoce en la técnica e incluye por ejemplo, sintaxina 1A y IB de humano, rata, ratón, y bovino; sintaxinas 2 y 3 de rata; sintaxina de erizo de mar; sintaxina 1 de aplysia; sintaxina de calamar; Dsyntl de drosofila; sintaxina 1 de sanguijuela. De esta manera la secuencia de reconocimiento BoNT/Cl útil en el substrato BoNT/Cl puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de sintaxina 1A o IB de humano, rata, ratón, o bovino, sintaxina 2 de rata, sintaxina 3 de rata, sintaxina de erizo de mar, sintaxina de 1 aplysia, sintaxia de calamar, Dsyntl de drosofila, sintaxina 1 de sanguijuela u otra proteína que se presenta naturalmente sensible al desdoblamiento por BoNT/Cl. Adicionalmente , la comparación de la secuencias de aminoácidos de sintaxina nativa desdobladas por BoNT/Cl revela que tales secuencias no están absolutamente conservadas (ver Tabla H y Figura 7) , lo que indica que una variedad de substituciones y modificaciones de aminoácido con relación a las secuencia de sintaxina sensible a BoNT/Cl que se presenta naturalmente pueden tolerarse en el substrato BoNT/Cl útil en la invención. Una variedad de proteínas SNAP-25 que se presentan naturalmente también son sensibles al desdoblamiento por BoNT/Cl, incluyendo SNAP-25 de humano, ratón y rata; SNAP-25 y 25B de pez dorado; y SNAP-25 de drosofila y sanguijuelas. De esta manera, una secuencia de reconocimiento BoNT/Cl útil en un substrato BoNT/Cl puede corresponder, por ejemplo, a un segmento de SNAP-25 humano, ratón, o rata, SNAP-25A o SNAP-25B de pez dorado, SNAP-25 de torpedo, SNAP-25 de pez cebra, SNAP-25 de drosofila, SNAP-25 de sanguijuela, u otra proteína que se presenta naturalmente sensible al desdoblamiento por BoNT/Cl . Como se discute arriba con respecto de las variantes de la secuencias de sintaxina que se presenta naturalmente, la comparación de las secuencias de aminoácido SNAP-25 nativas desdobladas por BoNT/Cl revela una viabilidad de secuencia importante (ver Tabla E y Figura 5 arriba) , lo que indica que una variedad de substituciones y modificaciones de aminoácido con relación a la secuencia BoNT/Cl sensible a SNAP-25 que se presentan naturalmente pueden tolerarse en el substrato BoNT/Cl útil en el invención. Alguien experto en la técnica apreciará que una variedad de substratos BoNT/D son útiles en la invención. El substrato BoNT/D útil en la invención puede tener, por ejemplo, al menos seis residuos consecutivos de VAMP, los residuos consecutivos incluyen Lys-Leu, o un peptidomimético del mismo. En una modalidad, el substrato BoNT/D contiene al menos seis residuos consecutivos de VAMP humano, los seis residuos consecutivos incluyen Lys59-Leu60, o un peptidomimético del mismo. En otra modalidad, el substrato BoNT/D contiene la secuencia de aminoácido Arg-Asp-Gln-Lys-leu-Ser-Glu-Leu (SEQ ID NO: 44) , o un peptidomimético del mismo. En una modalidad adicional, el substrato BoNT/D incluye los residuos 27 hasta 116 de VAMP-2 de rata (SEQ ID NO: 109), o un peptidomimético del mismo. El termino "secuencia de reconocimiento del serotipo D de toxina de botulinum" es sinónimo con "secuencia de reconocimiento BoNT/D" y significa un enlace hendible junto con los elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes suficientes para una proteolosis detectable en enlace hendible por un BoNT/D bajo condiciones apropiadas. El enlace hendible se desdoblado por BoNT/D puede ser, por ejemplo, Lys-Leu. Tabla H Desdoblamiento de sintaxina Especie Isoterma Sitios de desdoblamiento SBQ ID Resistencia al desdoblamiento por BoHT/C 98 no humano, rata sintaxina 1A eravsdtkka vkyqskar ratón bovino sintaxina IB eravsdtkkakrkyqekar 99 no sintaxina 2 ehakeetkka ikyqakar 100 no sintaxina 3 ekardetrkaknkyqgqar 101 no sintaxina 4 ergqehvkdaflenqXJcar 102 si pollo sintaxina IB perado vpevfvtk I jvmyqcksr 103 es erizo de mar sintaxina vrrqndtk.1ka krkyqekar 104 no Aplysia sintaxina 1 etakmdtk krkyqskar 105 no calamar sintaxina etakvdtkka Ivkyqekar 106 no Droso h la Deynt 1 qtatqdtkk llkyqekar 107 no sanguijuela sintaxina 1 etaaadt kahkyqeaar 108 no Una diversidad de secuencias de reconocimiento BoNT/D son bien conocidas en la técnica o se pueden definir por métodos de rutina. Una secuencia de reconocimiento BoNT/D puede incluir por ejemplo los residuos 27 hasta 116; residuos 37 hasta 116; residuos 1 hasta 86; residuos 1 hasta 76 o los residuos 1 hasta 69 o el VAMP-2 de rata (SEQ ID NO: 109; Yamasaki et al., J. Biol . Chem. 269:12764-12772 (1994)). Así, una secuencia de reconocimiento BoNT/D puede incluir por ejemplo los residuos 27 hasta 69 o los residuos 37 hasta 69 del VAMP-2 de rata (SEQ ID NO: 109) . Si se desea, se puede preparar una secuencia de reconocimiento similar BoNT/D a partir de un segmento correspondiente (homólogo) de otra isoforma VAMP sensible a BoNT/D o un homólogo de tal VAMP-1 humano o VAMP- 2 humano . Una secuencia de reconocimiento BoNT/D puede corresponder a un segmento de proteína que sea sensible al desdoblamiento por el serotipo D de la toxina del botulinum, o puede ser substancialmente similar a un segmento de una proteina sensible a BoNT/D. Como se muestra en la tabla H, se conocen una diversidad de proteínas que se presentan naturalmente sensible al desdoblamiento por BoNT/D en la técnica e incluyen por ejemplo VAMP-1 y VAMP-2 de humano de ratón y de bovino, VAMP-1 y VAMP-2 de rata; celubrevina de rata; VAMP-1 y VAMP-2 de pollo; Torpedo VAMP-1; Aplasia VAMP; VAMP de calamar; syb y n-syb de drosophila; y VAMP de sanguijuela. Así, una secuencia de reconocimiento BoNT/D puede corresponder por ejemplo a un segmento de VAMP-1 o VAMP-2 humano, VAMP-1 o VAMP-2 de ratón, VAMP-1 o VAMP-2 de bovino, VAMP-1 o VAMP-2 de rata, celubrevina de rata, VAMP-1 o VAMP-2 de pollo, Torpedo VAMP-1, Aplasia VAMP, VAMP de calamar, syb o n-syb de drosophila, VAMP de sanguijuela u otra proteína que se presente naturalmente sensible al desdoblamiento por BoNT/D. Adicionalmente, como se muestra en la Tabla H anterior, la comparación de las secuencias nativas del aminoácido VAMP desdobladas por BoNT/D revela una variación importante de secuencias (ver también la figura 6) , lo que indica que una variedad de substituciones y modificaciones de aminoácidos con relación a un secuencia BoNT/D sensible a VAMP que se presenta naturalmente se puede tolerar en un substrato BoNT/D útil en la invención. Son útiles en la invención una diversidad de substratos BoNT/E. Un substrato BoNT/E puede contener por ejemplo al menos 6 residuos consecutivos de SNAP-25, los 6 residuos consecutivos incluyen Arg-Ile o un peptidomimético del mismo. Tal substrato BoNT/E puede tener, por ejemplo, al menos 6 residuos consecutivos de SNAP-25 humano, los 6 residuos consecutivos incluyen Argi30-Ilei8i, o un peptidomimético del mismo. En modalidades particulares un substrato BoNT/E incluye la secuencia de aminoácidos Gln-Ile-Asp-Arg-Ile-Met-Glu-Lys (SEQ ID NO: 45), o un peptidomimé ico del mismo. En otras modalidades, un substrato BoNT/E incluye los residuos 156 hasta 186 del SNAP-25 humano (SEQ ID NO: 4) o un peptidomimético de los mismos. Como se usa en la presente, el término "secuencia de reconocimiento del serotipo E de la toxina del botulinum" es sinónimo de "secuencia de reconocimiento BoNT/E" y significa un enlace hendible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes suficientes para una proteolisis detectable en el enlace hendible por un BoNT/E bajo condiciones adecuadas. Un enlace hendible desdoblado por BoNT/E puede ser por ejemplo Arg-Ile. Alguien experto en la técnica aprecia que la secuencia de reconocimiento de BoNT/E puede corresponder a un segmento de una proteína que es sensible al desdoblamiento de la toxina del botulinum o puede ser substancialmente similar a un segmento de la proteína sensible a BoNT/E. Una diversidad de proteínas que se presentan naturalmente sensibles al desdoblamiento por BoNT/E se conocen en la técnica e incluyen por ejemplo SNAP-25 de humano, ratón y rata; SNAP-23 de ratón; SNAP-25 de pollo; SNAP-25A y SNAP-25B del pez dorado; SNAP-25 del pez cebra; SNAP-25 de C. elegans; y SNAP-25 de la sanguijuela (ver Tabla E) . Así, una secuencia de reconocimiento de BoNT/E puede corresponder por ejemplo a un segmento de SNAP-25 humano, SNAP-25 de ratón, SNAP-25 de rata, SNAP-23 de ratón, SNAP-25 de pollo, SNAP-25A o 25B de pez dorado, SNAP-25 de C. elegans, SNAP-25 de sanguijuela u otra proteína que se presente naturalmente sensible al desdoblamiento por BoNT/E. Adicionalmente, como se muestra en la tabla E y la figura 5 anterior, la comparación de las secuencias de aminoácidos SNAP-23 y SNAP-25 nativas desdobladas por BoNT/E revela que tales secuencias no se conservan absolutamente, lo que indica que una diversidad de substituciones y modificaciones de aminoácidos con relación a una secuencia BoNT/E sensible a SNAP-23 o SNAP-25 que se presenta naturalmente se puede tolerar de un substrato BoNT/E útil en la invención. Pueden ser útiles en la invención una diversidad de substratos útiles BoNT/F. Tales substratos BoNT/F pueden incluir por ejemplo al menos 6 residuos consecutivos de VAMP, los 6 residuos consecutivos incluyen Gln-Lys, o un peptidomimético del mismo. En una modalidad, un substrato BoNT/F tiene al menos 6 residuos consecutivos del VAMP humano, los 6 residuos consecutivos incluyen Gln58-Lys59, o un peptidomimético del mismo. En otra modalidad un substrato BoNT/F incluye los residuos 27 hasta 116 de VAMP-2 de rata (SEQ ID NO: 109) o un peptidomimético del mismo. En una modalidad adicional, un substrato de BoNT/F incluye la secuencia de aminoácidos Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu (SEQ ID NO: 46) o un peptidomimético del mismo. El término "secuencia de reconocimiento del serotipo F de la toxina de botulinum" como se usa en la presente, es sinónimo con "secuencia de reconocimiento BoNT/F" y significa un enlace hendible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes suficientes para una proteolisis detectable en el enlace hendible por un BoNT/F bajo condiciones adecuadas. Un enlace hendible desdoblado por BoNT/F puede ser por ejemplo Gln-Lys.
Una diversidad de secuencias de reconocimiento BoNT/F son bien conocidas en la técnica o se pueden definir por métodos de rutina. Una secuencia de reconocimiento BoNT/F puede incluir por ejemplo, los residuos 27 hasta 116; residuos 37 hasta 116; residuos 1 hasta 86; residuos 1 hasta 76; o residuos 1 hasta 69 de VAMP-2 de rata (SEQ ID NO: 109; Yamasaki et al., supra, 1994) . Una secuencia de reconocimiento BoNT/F también puede incluir por ejemplo los residuos 27 hasta 69 o residuos 37 hasta 69 del VAMP-2 de rata (SEQ ID NO: 109) . Se entiende que una secuencia de reconocimiento BoNT/F o similar se puede preparar si se desea a partir de un segmento correspondiente (homólogo) de otra isoforma BoNT/F sensible a VAMP u homólogo tal como el VAMP-1 humano o VAMP-2 humano. Una secuencia de reconocimiento BoNT/F puede corresponder a un segmento de una proteína que sea sensible al desdoblamiento por el serotipo F de la toxina del botulinum o puede ser substancialmente similar a un segmento de la proteína sensible a BoNT/F. Una variedad que proteínas que se presentan naturalmente sensibles al desdoblamiento por BoNT/F se conocen en la técnica e incluyen por ejemplo VAMP-1 y VAMP-2 de humano, ratón y de bovino, VAMP-1 y VAMP-2 de rata; celubrevina de rata; VAMP-1 y VAMP-2 de pollo; VAMP-1 de Torpedo; VAMP de Aplysia; Drosophila syb; y VAMP de sanguijuela (ver tabla H) . Así, una secuencia de reconocimiento BoNT/F puede corresponder por ejemplo a un segmento de VAMP-1 o VAMP-2 humano, VAMP-1 o VAMP-2 de ratón, VAMP-1 o VAMP-2 de bovino, VAMP-1 o VAMP-2 de rata, celubrevina de rata, VAMP-1 o VAMP-2 de pollo, VAMP-1 de Torpedo; VAMP de Aplysia; Drosophila syb; y VAMP de sanguijuela u otra proteína que se presente naturalmente sensible a el desdoblamiento por BoNT/F. Adicionalmente , como se muestra en la tabla H anterior la comparación de las secuencias nativas de aminoácidos VAMP desdobladas por BoNT/F revela que tales secuencias no se conservan absolutamente, (ver también figura 6) , lo que indica que una diversidad de sustituciones de aminoácidos y modificaciones relativas a una secuencia BoNT/F sensible a VAMP que se presenta naturalmente se puede tolerar en un substrato BoNT/F útil en la invención. Como para otros substratos de toxina clostridial, se pueden ser útil una diversidad de substratos BoNT/G. Un substrato BoNT/G útil en la invención puede tener por ejemplo al menos 6 residuos consecutivos de VAMP, los 6 residuos consecutivos incluyen Ala-Ala o un peptidomimético del mismo. Tal substrato BoNT/G puede tener por ejemplo al menos 6 residuos consecutivos de VAMP humano, los 6 residuos consecutivos incluyen Ala83-Ala84, o un peptidomimético del mismo. En una modalidad, un substrato BoNT/G contiene la secuencia de aminoácido Glu-Thr-Ser-Ala-Ala-Lys-Leu-Lys (SEQ ID NO: 47), o un peptidomimético del mismo.
Como se usa en la presente, el término "secuencia de reconocimiento del serotipo G de la toxina del botulinum" es sinónimo con "secuencia de reconocimiento de BoNT/G" y significa un enlace hendible junto con elementos de reconocimiento adyacentes o no adyacentes suficientes para una proteolisis detectable en el enlace hendible BoNT/G bajo condiciones adecuadas. Un enlace hendible desdoblado por BoNT/G puede ser por ejemplo Ala-Ala. Una secuencia de reconocimiento BoNT/G puede corresponder a un segmento de proteína que es sensible al desdoblamiento por el serotipo G de la toxina del botulinum o puede ser substancialmente similar a tal segmento sensible de BoNT/G. Como ilustración en la tabla H anterior una diversidad de proteínas que se presentan naturalmente sensibles al desdoblamiento por BoNT/G se conocen en la técnica e incluye por ejemplo, VAMP-1 y VAMP-2 humano de ratón y de bovino, VAMP-1 y VAMP-2 de rata, celubrevina de rata, VAMP-1 y VAMP-2 de pollo, y VAMP-1 de torpedo. Así, una secuencia de reconocimiento de BoNT/G puede corresponder por ejemplo, a un segmento de VAMP-1 o VAMP-2 humano VAMP-1 o VAMP- 2 de ratón, VAMP-1 o VAMP-2 de bovino, VAMP-1 o VAMP-2 de rata, celubrevina de rata, VAMP-1 o VAMP-2 de pollo, VAMP-1 torpedo u otra proteína que se presenta naturalmente sensible al desdoblamiento por BoNT/G. Además como se muestra en la Tabla H anterior la comparación de las secuencias de aminoácidos VAMP nativas desdobladas por BoNT/G revela que tales secuencias no se conservan absolutamente (ver también Figura 6) , lo que indica que una diversidad de substituciones y modificaciones de aminoácidos con relación a una secuencia BoNT/G sensible a VAMP que se presentan naturalmente se puede tolerar en un substrato BoNT/G útil en la invención. Una diversidad de substratos TeNT pueden ser útiles en las composiciones y métodos aquí descritos. Un substrato TeNT útil en la invención puede tener por ejemplo, al menos seis residuos consecutivos de VAMP los seis residuos consecutivos incluyen Gln-Phe, o un peptidomimético del mismo. Como un ejemplo tal substrato TeNT puede tener al menos seis residuos consecutivos de VAMP-2 humano, los seis residuos consecutivos incluyen Gln76-Phe7-7 o un peptidomimético del mismo. En una modalidad, un substrato TeNT contiene la secuencia de aminoácidos Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser (SEQ ID NO: 48), o un peptidomimético del mismo. En otra modalidad, el substrato TeNT contiene los residuos 33 hasta 94 del VAMP-2 humano (SEQ ID NO: 11) ; residuos 25 hasta 93 del VAMP-2 humano (SEQ ID NO: 11); o los residuos 27 hasta 116 del VAMP-2 (SEQ ID NO: 109) de rata o un peptidomimético de una de esta secuencia. Como se en la presente el termino "secuencia de reconocimiento de la toxina del tétanos" significa un enlace hendible junto con el elemento de reconocimiento adayacentes o no adyacentes suficientes para una proteolisis detectable en el enlace hendible por una toxina del tétanos bajo condiciones adecuadas. Un enlace hendible desdoblado por TeNT puede ser por ejemplo, Gln-Phe. Son bien conocidos en la técnica una diversidad de secuencias de reconocimiento TeNT o se pueden definir por métodos de rutina incluyen secuencias que corresponden algunos o todos del núcleo hidrofílico de una proteína VAMP tal como VAMP-1 humano o VAMP-2 humana. Una secuencia de reconocimiento TeNT puede incluir por ejemplo, los residuos 25 hasta 93 o los residuos 33 hasta 94 VAMP-2 humano (SEQ ID NO: 11; Cornille et al., Eur . J. Biochem. 222:173-181 (1994); Foran et al., Biochem. 33: 15365-15374 (1994)); residuos 51 hasta 93 o residuos 1 hasta 86 de rata VAMP-2 (SEQ ID NO: 109; Yamasaki et al., supra, 1994); o residuos 33 hasta 94 de VAMP-1 humano (SEQ ID NO: 10) . Una secuencia de reconocimiento TeNT también puede incluir por ejemplo, los residuos 25 hasta 86 residuos 33 hasta 86 o residuos 51 hasta 86 de VAMP-2 humano (SEQ ID NO: 11) o VAMP-2 de rata (SEQ ID NO: 109) . Se entiende que una secuencia de reconocimiento TeNT similar se pueden preparar si se desea a partir de un segmento correspondiente (homólogos) de otra isoforma TeNT sensible a VAMP o especies homologas tales como el VAMP-1 humano o el erizo de mar o VAMP de Aplysia. Así, una secuencia de reconocimiento TeNT puede corresponder a un segmento de una proteína que sea sensible al desdoblamiento por la toxina del tétanos o que pueda ser substancialmente similar a un segmento de una proteína sensible a TeNT. Como se muestra en la Tabla H anterior, una diversidad de proteínas que se presentan naturalmente sensibles al desdoblamiento por TeNT se conocen en la técnica e incluyen por ejemplo, VAMP-1 y VAMP-2 de humano de ratón y de bovino, VAMP-2 de rata, celubrevina de rata; VAMP-2 de pollo, VAMP-1 de torpedo, VAMP de erizo de mar, Aplysia VAMP; VAMP de calamar; VAMP de C. elegans; Drosophila n-syb; y VAMP de sanguijuela. Así una secuencia de reconocimiento de TeNT puede corresponder por ejemplo, a un segmento de VAMP-1 o VAMP-2 humano, VAMP-1 o VAMP-2 de ratón, VAMP-1 o VAMP-2 de bovino, VAMP-2 de rata, celubrevina dé rata, VAMP-2 de pollo, VAMP-1 torpedo, VAMP de erizo de mar, VAMP de Aplysia, VAMP de calamar, VAMP C. elegans, Drosophila n-syb, VAMP de sanguijuela u otra proteína que se presente naturalmente sensible al desdoblamiento por TeNT. Adicionalmente , la comparación de la secuencias de aminoácidos nativas de VAMP desdobladas por TeNT revela que tales secuencias no se conservan absolutamente (Tabla H y Figura 6) , lo que indica que una diversidad de substituciones de aminoácidos y modificaciones con relación a secuencia TeNT sensible a VAMP que se presenta naturalmente se puede tolerar en un substrato TeNT útil en la invención.
Un substrato de toxina crostidial útil en una composición de substratos, " célula o método de la invención puede incluir uno o más sitios de desdoblamiento de la toxina crostidial para toxinas crostidiales iguales o diferentes. En modalidades particulares, la invención proporciona una composición de substrato, célula o método en el cual el substrato de toxina clostridial contiene un sitio de desdoblamiento de la toxina clostridial sencillo. En otras modalidades la invención proporciona una composición, célula o método de un substrato en el cual el substrato de toxina clostridial contiene sitios de desdoblamiento múltiples para la misma toxina clostridial . Estos sitios de desdoblamiento se pueden acompañar por secuencias de reconocimiento de la toxina clostridial iguales o diferentes. Como ejemplo una composición de substrato de la invención puede incluir un substrato de toxina clostridial que tenga sitios de desdoblamientos múltiples para la misma toxina clostridial que intervienen entre el mismo fluoróforo del donante y el aceptor. Un substrato de toxina clostridial útil en una composición de substrato, célula o método de la invención puede contener por ejemplo, dos o más, tres o más, cinco o más, o diez o más, sitios de desdoblamiento para la misma toxina clostridial. Un substrato de toxina clostridial útil en la invención también puede tener por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez sitios de desdoblamiento para la misma toxina clostridial ; los sitios de desdoblamiento múltiples pueden intervenir entre pares de aceptor y fluoróforo de donante iguales o diferentes . Un substrato de toxina clostridial útil en una composición de substrato célula o método de la invención también pueden incluir sitios de desdoblamiento y secuencias de reconocimiento para toxinas clostridiales diferentes. En modalidades particulares la invención proporciona una composición de substrato célula o método en el cual el substrato de la toxina clostridial incluye sitios de desdoblamiento múltiples para toxinas clostridiales diferentes que intervienen todas entre el mismo par del aceptor y fluoróforo del donante. Una composición del substrato, célula o método de la invención puede incluir un substrato de toxina clostridial que tiene por ejemplo, sitios de desdoblamiento para dos o más, tres o más, o para cinco o más toxinas clostridiales diferentes que intervienen todas en el mismo par de aceptor y fluoróforo del donante. Una composición de substrato, célula o método de la invención también puede incorporar un substrato de toxina clostridial en el cual por ejemplo, los sitios de desdoblamiento para dos o más, tres o más, cinco o más toxinas clostridiales y diferentes intervienen entre menos dos pares de aceptor y fluoróforo del donante. En modalidades particulares la invención proporciona una composición de substrato célula o método que incluye un substrato de toxina clostridial que tiene sitios de desdoblamiento para dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, toxinas clostridiales diferentes y donde los sitios de desdoblamiento tiene entre pares iguales o diferentes de aceptor y fluoróforo de donante. En modalidades adicionales, la invención proporciona una composición de substrato célula o método en el cual el substrato de la toxina clostridial tiene por ejemplo, cualquier combinación de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, u ocho sitios de desdoblamiento para cualquier combinación de las siguientes toxinas clostridiales BoNT/A, BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, y TeNT. Todos los artículos de revistas, referencias y citas de patentes antes mencionadas en paréntesis o de otra manera ya sea que se establezca o no previamente se incorporan como referencia en su totalidad. Aunque la invención se ha descrito con referencia a los ejemplos antes proporcionados se entenderá que se pueden hacer diversas modificaciones sin alejarse del espíritu de la invención. De esta manera, la invención se limita solamente por las siguientes reivindicaciones. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (82)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Una composición de substrato caracterizada porque comprende un agente de administración y un substrato de toxina clostridial, el substrato de toxina clostridial comprende : (a) un fluoróforo donante (b) un aceptor que tiene un espectro de absórbansela que traslapa el espectro de emisión del fluoróforo donante; y (c) una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que comprende un sitio de desdoblamiento, en donde el sitio de desdoblamiento interviene entre el fluoróforo donante y el aceptor y en donde, bajo condiciones apropiadas, la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoróforo donante y aceptor.
  2. 2. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el agente de suministro se enlaza convalentemente al substrato de toxina clostridial .
  3. 3. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el agente de suministro en una proteína, péptido o peptidomimético .
  4. 4. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque es una proteína quimérica, péptido o peptidomimético que comprende el agente de suministro fusionado operativamente al substrato de toxina clostridial .
  5. 5. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el agente de suministro en una proteína de antenapedia o fragmento activo de la misma.
  6. 6. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la proteína de antenapedia o fragmento activo de la misma tiene la secuencia de aminoácido RQIKI FQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 1).
  7. 7. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el agente de suministro es una proteína TAT de VIH o fragmento activo de la misma.
  8. 8. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la proteína de TAT de VIH o fragmento activo de la misma tiene la secuencia de aminoácido YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2) .
  9. 9. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el agente de suministro es una proteína VP22 del virus del herpes simplex o un fragmento activo de la misma.
  10. 10. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la proteína VP22 de virus de herpes simplex tiene la secuencia de aminoácido SEQ ID NO : 3.
  11. 11. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el agente de suministro se asocia no covalentemente con el substrato de toxina clostridial.
  12. 12. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el agente de suministro se selecciona del grupo que consiste de Chariot™ y el péptido MPG.
  13. 13. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque comprende un substrato de toxina de botulinum que comprende una secuencia de reconocimiento de toxina de botulinum.
  14. 14. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende un substrato BoNT/A que comprende una secuencia de reconocimiento BoNT/A.
  15. 15. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el substrato BoNT/A comprende al menos seis residuos consecutivos de SNAP-25, los seis residuos consecutivos comprenden Gln-Arg o un peptidomimético del mismo.
  16. 16. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende un substrato BoNT/B que comprende una secuencia de reconocimiento BoNT/B .
  17. 17. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el substrato BoNT/B comprende al menos seis residuos consecutivos de VAMP los seis residuos consecutivos comprenden Gln-Phe, o un peptidomimético del mismo.
  18. 18. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende un substrato BoNT/Cl que comprende una secuencia de reconocimiento BoNT/Cl .
  19. 19. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el substrato BoNT/Cl comprende al menos seis residuos consecutivos de sintaxina, los seis residuos consecutivos comprenden Lys-Ala o un peptidomimético del mismo.
  20. 20. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el substrato BoNT/Cl comprende al menos seis residuos consecutivos de SNAP-25, los seis residuos consecutivos comprenden Arg-Ala o un peptidomimético del mismo.
  21. 21. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende un substrato BoNT/D que comprende una secuencia de reconocimiento BoNT/D.
  22. 22. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el substrato BoNT/D comprende al menos seis residuos consecutivos de VAMP, los seis residuos consecutivos comprende Lys-Leu o un peptidomimético del mismo.
  23. 23. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende un substrato BoNT/E que comprende una secuencia de reconocimiento BoNT/E.
  24. 24. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el substrato BoNT/E comprende al menos seis residuos consecutivos de SNAP-25, los seis residuos consecutivos comprenden Arg-Ile o un peptidomimético del mismo.
  25. 25. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende un substrato BoNT/F que comprende una secuencia de reconocimiento BoNT/F.
  26. 26. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque el substrato BoNT/F comprende al menos seis residuos consecutivos de VAMP, los seis residuos consecutivos comprende Gln-Lys o un peptidomimético del mismo.
  27. 27. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque comprende un substrato BoNT/G que comprende una secuencia de reconocimiento BoNT/G.
  28. 28. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque el substrato BoNT/G comprende al menos seis residuos consecutivos de VAMP, los seis residuos consecutivos comprenden Ala-Ala o un peptidomimético del mismo.
  29. 29. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende un substrato TeNT que comprende una secuencia de reconocimiento TeNT.
  30. 30. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el substrato TeNT comprende al menos seis residuos consecutivos de VAMP, los seis residuos consecutivos comprenden Gln-Phe o un peptidomimético del mismo.
  31. 31. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el fluoróforo donante se selecciona del grupo que consiste de fluoresceína, Alexa Fluor* 488, DABCYL y BODIPY.
  32. 32. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el aceptor es un fluoróforo aceptor.
  33. 33. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque el fluoróforo aceptor tiene un curso de vida de fluorescencia de al menos un microsegundo.
  34. 34. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el aceptor se selecciona del grupo que consiste de tetrametilrodamina, EDANS y QSY® 7.
  35. 35. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el aceptor no es fluorescente .
  36. 36. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque es un péptido o peptidomimetico que tiene como máximo 100 residuos.
  37. 37. La composición de substrato de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque es un péptido o peptidomimético que tiene como máximo 50 residuos.
  38. 38. Una célula caracterizada porque comprende un substrato de toxina clostridial, el substrato de toxina clostridial comprende: (a) un fluoróforo donante (b) un aceptor que tiene un espectro de absorbencia que traslapa el espectro de emisión del fluoróforo donante; y (c) una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que comprende un sitio de desdoblamiento, en donde el sitio de desdoblamiento interviene entre el fluoróforo donante y el aceptor y en donde, bajo condiciones apropiadas, la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoróforo donante y aceptor.
  39. 39. La célula de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque es una célula transíectada .
  40. 40. La célula de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque es una célula establemente transfectada .
  41. 41. La célula de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque es una célula primaria.
  42. 42. La célula de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque es una célula establecida.
  43. 43. La célula de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque es una célula humana.
  44. 44. La célula de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 38 hasta 41, caracterizada porque es una neurona .
  45. 45. La célula de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque es una neurona del sistema nervioso central (SNC) .
  46. 46. La célula de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque es una neurona periférica.
  47. 47. La célula de conformidad con la reivindicación 39 o 40, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de neuroblastoma, neurona de médula espinal, neurona de ganglio de raíz dorsal, neurona de corteza cerebral, neurona cerebelar, neurona de hipocampo, y neurona motora.
  48. 48. La célula de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada porque es una célula de neuroblastoma.
  49. 49. La célula de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque es una célula no neuronal .
  50. 50. La célula de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque es una célula acinar pancreática.
  51. 51. Una célula, caracterizada porque comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para un substrato de toxina clostridial, el substrato de toxina clostridial comprende : (a) un fluoroforo donante (b) un aceptor que tiene un espectro de absorbencia que traslapa el espectro de emisión del fluoroforo donante; y (c) una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que comprende un sitio de desdoblamiento, en donde el sitio de desdoblamiento interviene entre el fluoroforo donante y el aceptor y en donde, bajo condiciones apropiadas, la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoroforo donante y aceptor.
  52. 52. La célula de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico se transfecta establemente.
  53. 53. La célula de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque es una célula humana.
  54. 54. La célula de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque es una célula neuronal .
  55. 55. La célula de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque es una célula no neuronal .
  56. 56. La célula de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico se enlaza a un elemento regulatorio constitutivo.
  57. 57. La célula de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico se enlaza a un elemento regulatorio inducible.
  58. 58. La célula de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque el promotor inducible es un elemento regulatorio regulado de tetraciclina .
  59. 59. La célula de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque el promotor inducible es un elemento regulatorio inducible de ecdisona.
  60. 60. La célula de conformidad con la reivindicación 51, 52, 56 ó 57, caracterizada porque el substrato de toxina clostridial comprende una proteína fluorescente verde (PFV) .
  61. 61. Un método para determinar la actividad de la toxina clostridial, caracterizado porque comprende las etapas de (a) poner contacto una célula con una muestra, la célula comprende un substrato de toxina clostridial que comprende (i) un fluoróforo donante; (ii) un aceptor que tiene un espectro de absorbencia que traslapa el espectro de emisión del fluoróforo donante; y (iii) una secuencia de reconocimiento de toxina clostridial que comprende un sitio de desdoblamiento, el sitio de desdoblamiento interviene entre el fluoróforo donante y el aceptor, en donde bajo las condiciones apropiadas, la transferencia de energía de resonancia se exhibe entre el fluoróforo donante y el aceptor; (b) excitar el fluoróforo donante; y (c) determinar la transferencia de energía de resonancia de la célula puesta en contacto con relación a la célula de control, en donde la diferencia en la transferencia de energía de resonancia de la célula puesta en contacto cuando se compara con la célula de control, indica una actividad de toxina clostridial.
  62. 62. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el substrato de toxina clostridial es un substrato de toxina de botulinum.
  63. 63. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el substrato de toxina de botulinum es un substrato BoNT/A que comprende una secuencia de reconocimiento BoNT/A.
  64. 64. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el substrato de toxina de botulinum es un substrato BoNT/B que comprende una secuencia de reconocimiento BoNT/B.
  65. 65. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el substrato de toxina de botulinum es un substrato BoNT/Cl que comprende una secuencia de reconocimiento BoNT/Cl.
  66. 66. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el substrato de toxina de botulinum es un substrato BoNT/D que comprende una secuencia de reconocimiento BoNT/D.
  67. 67. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el substrato de toxina de botulinum es un substrato BoNT/E que comprende una secuencia de reconocimiento BoNT/E.
  68. 68. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el substrato de toxina de botulinum es un substrato BoNT/F que comprende una secuencia de reconocimiento BoNT/F.
  69. 69. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el substrato de toxina de botulinum es un substrato BoNT/G que comprende una secuencia de reconocimiento BoNT/G.
  70. 70. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el substrato de toxina clostridial es un substrato de toxina TeNT que comprende una secuencia de reconocimiento TeNT.
  71. 71. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la muestra es un lisado de célula crudo.
  72. 72. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la muestra es toxina clostridial aislada.
  73. 73. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la muestra es un producto de toxina clostridial formulada.
  74. 74. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la muestra es BOTOX ®.
  75. 75. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la muestra es un alimento.
  76. 76. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la etapa C comprende detectar la intensidad de fluorescencia del donante de la célula puesta en contacto, en donde la intensidad de fluorescencia del donante aumentada de la célula puesta en contacto como se compara con la célula de control, indica una actividad de toxina clostridial.
  77. 77. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la etapa C comprende detectar la intensidad de fluorescencia del aceptor de la célula puesta en contacto, en donde la intensidad de fluorescencia del aceptor reducida de la célula puesta en contacto como se compara con la célula de control, indica una actividad de toxina clostridial .
  78. 78. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la etapa C comprende detectar un máximo de emisión del aceptor y un máximo de emisión del fluoróforo donante de la célula puesta en contacto, en donde un cambio en los máximos de emisión desde cerca del máximo de emisión de aceptor hasta cerca del máximo de emisión del fluoróforo donante indica una actividad de toxina clostridial .
  79. 79. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la etapa C comprende detectar la relación de amplitudes de fluorescencia cercanas a una máxima de emisión del aceptor para las amplitudes de fluorescencia cercana a una máxima de emisión del fluoróforo donante, en donde una relación reducida en la célula puesta en contacto cuando se compara con la célula de control indica una actividad de toxina clostridial .
  80. 80. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la etapa C comprende detectar el curso de vida de estado excitado de fluoróforo donante en la célula puesta en contacto, en donde un curso de vida en estado excitado de fluoróforo donante incrementado en la célula puesta en contacto cuando se compara con la célula control indica una actividad de toxina clostridial.
  81. 81. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque comprende además repetir la etapa C en uno o más intervalos de tiempo posteriores.
  82. 82. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque las condiciones apropiadas para una actividad de toxina clostridial se seleccionan de tal manera que el ensayo es lineal.
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