KR20170026624A - 조직 샘플에서 절단된 snap25를 검출하는 방법 - Google Patents

조직 샘플에서 절단된 snap25를 검출하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20170026624A
KR20170026624A KR1020177003275A KR20177003275A KR20170026624A KR 20170026624 A KR20170026624 A KR 20170026624A KR 1020177003275 A KR1020177003275 A KR 1020177003275A KR 20177003275 A KR20177003275 A KR 20177003275A KR 20170026624 A KR20170026624 A KR 20170026624A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
snap25
antibody
ser
bont
thr
Prior art date
Application number
KR1020177003275A
Other languages
English (en)
Inventor
론 에스. 브로디
브라이언 카이
에스터 페르난데즈-살라스
조셉 프란시스
캐서린 래이움
Original Assignee
알러간, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 알러간, 인코포레이티드 filed Critical 알러간, 인코포레이티드
Priority claimed from PCT/US2015/039372 external-priority patent/WO2016007508A1/en
Publication of KR20170026624A publication Critical patent/KR20170026624A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/5695—Mycobacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/952—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

조직 또는 조직 샘플에서 BoNT/A 효소적 활성을 검출하기 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에 기재된다. 본 발명은 조직 샘플에서 무손상(비절단) SNAP25에 비해, BoNT/A 절단된 SNAP25에 우선적으로 결합하고, BoNT/A 절단된 SNAP25를 우선적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다.

Description

조직 샘플에서 절단된 SNAP25를 검출하는 방법{METHOD OF DETECTING CLEAVED SNAP25 IN TISSUE SAMPLES}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은, 모두 본 명세서에 전체가 참고로 포함된, 2014년 7월 7일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/021,379호; 2015년 5월 8일자로 출원된 제62/158,900호; 및 2015년 5월 19일자로 출원된 제62/163,829호의 유익을 주장한다.
기술분야
본 개시내용은 조직 샘플에서 절단된 SNAP25, 예컨대 SNAP25의 보툴리눔균 신경독소 절단을 검출하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 보툴리눔균 신경독소 혈청형 A에 의해 생성된 SNAP25 절단을 포함하는 절단된 SNAP25에 결합되는 항체를 추가로 제공한다.
보툴리눔균 신경독소 A형(BoNT/A)의 치료적 효용은 과거 수십년에 걸쳐 상당히 성장되었고, 엘러간사(Allergan)의 제품인 오나보툴리눔독소 A(onabotulinumtoxinA)는 전세계적으로 다양한 신경근 장애(Ramirez-Castaneda, J. and Jankovic, J., (2014). "Long-term efficacy, safety, and side effect profile of botulinum toxin in dystonia: a 20-year follow-up." Toxicon 90, 344-348.; Yablon, S.A., Brin, M.F., VanDenburgh, A.M., Zhou, J., Garabedian-Ruffalo, S.M., Abu-Shakra, S., and Beddingfield, F.C., III (2011). "Dose response with onabotulinumtoxinA for post-stroke spasticity: a pooled data analysis." Mov Disord . 26, 209-215), 평활근 및 자율신경 실조증(Ellsworth, P. and Travis, M., (2014). "Onabotulinum toxin A: a therapeutic option for refractory neurogenic detrusor overactivity and idiopathic overactive activity." Urol . Nurs . 34, 165-171.; Grunfeld, A., Murray, C.A., and Solish, N., (2009). "Botulinum toxin for hyperhidrosis: a review." Am .J. Clin . Dermatol . 10, 87-102)에 대해 그리고 침해성 통증 증후군(Aoki, K.R. and Francis, J., (2011). "Updates on the antinociceptive mechanism hypothesis of botulinum toxin A." Parkinsonism . Relat Disord . 17 Suppl 1, S28-S33.; Burstein, R., Zhang, X., Levy, D., Aoki, K.R., and Brin, M.F., (2014). "Selective inhibition of meningeal nociceptors by botulinum neurotoxin type type A: therapeutic implications for migraine and other pains." Cephalalgia 34, 853-869)에 대한 치료를 포함하는 11가지의 주된 치료적 및 미용적 적응증에 대해 현재 승인되어 있다.
시냅스전 신경말단에서 BoNT/A에 대한 일반적 작용 메커니즘(MoA)이 잘 확립되었지만(Montal, M., (2010). "Botulinum neurotoxin: a marvel of protein design." Annu .Rev. Biochem . 79, 591-617), 독소의 세포내 수송 패턴 및 일반적 '생활환'에 관한 다수의 답이 나오지 않은 질문이 있다. 이들 문제를 해결하는 것은 세포 내에서 독소의 위치, 분포 및 이동을 정확하게 검출하는 능력에 부분적으로 의존한다. 항체를 이용하는 BoNT/A의 직접적 검출은 그의 높은 효능 때문에 어려움이 있고, 따라서 뉴런 내에서 극도로 저농도이다. BoNT/A의 존재를 검출하기 위한 대안의 접근은 절단된 SNAP25 산물(SNAP25197)에 대한 면역염색을 통해 그의 효소적 활성을 추적하는 것이었다. 상업적 항체와 등록상표 항체는 둘 다 전장 SNAP25(SNAP25206) 또는 BoNT/A-절단된 SNAP25(SNAP25197)의 발현을 추적하기 위해 사용되었다. 그러나, BoNT/A 절단 후 생성된 SNAP25197의 말단 에피토프는 무손상(intact) SNAP25 단백질을 또한 인식하는 일 없이 항체에 의해 특이적으로 표적화하는 것이 어렵다(Mort, J.S. and Buttle, D.J., (1999). "The use of cleavage site specific antibodies to delineate protein processing and breakdown pathways." Mol.Pathol. 52, 11-18). 결과적으로, 면역-염색 결과는 일부 항체가 분석 의존적이지만, 다른 항체는 조직-특이적이라는 오해의 소지가 있었다. 따라서 BoNT/A에 대한 노출 후 임의의 조직 유형에서 그리고 다중 분석에서 SNAP25197을 동정할 수 있는 BoNT/A-절단된 SNAP25에 대해 매우 선택적인 항체에 대한 필요가 있다.
본 개시내용은 SNAP25197에 대해 고도로 특이적인 재조합 단클론성 항체(rMAb)를 이용하는 면역조직화학과 같지만, 이것으로 제한되지 않는 다양한 상이한 분석에서 BoNT/A 절단된 SNAP25 및 '197'번 위치에서 SNAP25를 절단하는 임의의 다른 BoNT/A-관련 화합물을 포함하는, 보툴리눔 독소 절단 SNAP25를 검출하기 위한 방법 및 조성물을 제공함으로써 이들 문제를 처리한다. 이들 항체는 인간과 같지만, 제한되지 않는 상이한 종으로부터의 다양한 조직에서 SNAP25197를 검출하는데 사용할 수 있다. 이들 항체는 또한 오나보툴리눔독소 A와 같지만, 이들로 제한되지 않는 신경독소로 처리된 인간으로부터의 조직 내 활성 및 효능을 진단하기 위한 도구로서 사용될 수 있다.
본 발명은 항-SNAP25 항체를 포함하되, 항체는 BoNT/A 절단된 SNAP25에 우선적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-SNAP25 항체는 보툴리눔 독소 혈청형 A의 효소적(경쇄) 활성을 지니는 재조합 보툴리눔 독소에 의해 절단된 SNAP25에 우선적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 항-SNAP25 항체는 전장 또는 비절단 SNAP25에 결합되지 않는다.
다른 실시형태에서, 항-SNAP25 항체는 조직 내 BoNT/A 절단된 SNAP25(또는 보툴리눔 독소 혈청형 A의 효소적(경쇄) 활성을 지니는 재조합 보툴리눔 독소에 의해 절단된 SNAP25)를 검출할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조직은 생검 샘플이다. 다른 실시형태에서, 조직은 피부 펀치이다.
일부 실시형태에서, 항-SNAP25 항체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 경쇄 서열을 포함하고, 재조합 뮤린 항체이다. 다른 실시형태에서, 항-SNAP25 항체는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 중쇄 서열을 포함하며, 재조합 뮤린 항체이다. 다른 실시형태에서, 항-SNAP25 항체는 서열번호 5 또는 서열번호 6의 경쇄 서열을 포함하고, 재조합 인간 항체이다. 다른 실시형태에서, 항-SNAP25 항체는 서열번호 7 또는 서열번호 8의 중쇄를 포함하고, 재조합 인간 항체이다. 다른 실시형태에서, 항-SNAP25 항체는 서열번호 1 내지 8의 하나 이상의 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄를 지니는 항체의 동일한 에피토프에 결합하는 항체이다.
본 발명은 또한 BoNT/A 효소적 활성에 노출된 것으로 의심되는 조직 샘플을 항-SNAP25 항체와 접촉시키는 단계로서 항체가 BoNT/A 절단된 SNAP25에 우선적으로 결합하는 상기 접촉시키는 단계; 및 항-SNAP25 항체가 조직 샘플에 결합되는지의 여부를 검출하는 단계로서, 조직 샘플에 대한 항-SNAP25 항체 결합의 존재는 조직 샘플이 BoNT/A 효소적 활성에 노출되었음을 나타내는, 상기 검출하는 단계를 포함하는, 조직이 BoNT/A 효소적 활성에 노출되었는지의 여부를 진단하는 방법을 포함한다. 일부 실시형태에서, BoNT/A 효소적 활성은 천연 BoNT/A로부터 유래된다. 다른 실시형태에서, BoNT/A 활성은 보툴리눔 독소 혈청형 A의 효소적(경쇄) 활성을 지니는 재조합 보툴리눔 독소로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 본 방법에서 사용된 항-SNAP25 항체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 경쇄 서열을 포함하고, 재조합 뮤린 항체이다. 다른 실시형태에서, 본 방법에서 사용되는 항-SNAP25 항체는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 중쇄 서열을 포함하며, 재조합 뮤린 항체이다. 다른 실시형태에서, 본 방법에서 사용되는 항-SNAP25 항체는 서열번호 5 또는 서열번호 6의 경쇄 서열을 포함하고, 재조합 인간 항체이다. 다른 실시형태에서, 본 방법에서 사용되는 항-SNAP25 항체는 서열번호 7 또는 서열번호 8의 중쇄를 포함하고, 재조합 인간 항체이다. 다른 실시형태에서, 본 방법에서 사용되는 항-SNAP25 항체는 서열번호 1 내지 8의 하나 이상의 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄를 지니는 항체의 동일한 에피토프에 결합하는 항체이다.
다른 양상에서, 본 발명은 조직이 항-SNAP25 항체를 포함하는 BoNT/A 효소적 활성에 노출되었는지의 여부를 진단하기 위한 키트를 포함하되, 항체는 BoNT/A 절단된 SNAP25에 우선적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, BoNT/A 효소적 활성은 천연 BoNT/A로부터 유래된다. 다른 실시형태에서, BoNT/A 활성은 보툴리눔 독소 혈청형 A의 효소적(경쇄) 활성을 지니는 재조합 보툴리눔 독소로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 본 키트에서 사용된 항-SNAP25 항체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 경쇄 서열을 포함하고, 재조합 뮤린 항체이다. 다른 실시형태에서, 본 키트에서 사용되는 항-SNAP25 항체는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 중쇄 서열을 포함하며, 재조합 뮤린 항체이다. 다른 실시형태에서, 본 키트에서 사용되는 항-SNAP25 항체는 서열번호 5 또는 서열번호 6의 경쇄 서열을 포함하고, 재조합 인간 항체이다. 다른 실시형태에서, 본 키트에서 사용되는 항-SNAP25 항체는 서열번호 7 또는 서열번호 8의 중쇄를 포함하고, 재조합 인간 항체이다. 다른 실시형태에서, 본 키트에서 사용되는 항-SNAP25 항체는 서열번호 1 내지 8의 하나 이상의 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄를 지니는 항체의 동일한 에피토프에 결합하는 항체이다.
도 1은 SNAP25197에 대해 인간화된 항체 및 뮤린 재조합 단클론성 항체에 대한 추정적 에피토프의 다이어그램 표현을 도시한 도면. 다이어그램은 12-잔기 펩타이드 - 본래의 단클론성 항체를 생성하기 위해 사용한 N-말단의 시스테인 잔기(키홀 림펫 헤모사이아닌에 대한 컨쥬게이션을 위해 사용함)를 나타낸다.
도 2(A 내지 F)는 3nM 농도에서 BoNT/A로 처리한(L3) 또는 이것 없이 처리한(L2) 래트 배아 파질 세포 용해물 중에서 전장 SNAP25206 및 절단된 SNAP25197를 검출하기 위한 상이한 항체의 특이성과 비교하는 웨스턴 블롯 분석을 도시한 도면. (A) SNAP25의 전장(206) 형태와 절단된(197) 형태를 둘 다 인식하는 상업적으로 입수 가능한 항-SNAP25 mAb(SMI-81R)로 프로빙된 블롯. 레인 2에서, SNAP25206만이 검출된 반면, 레인 3에서, SNAP25206(화살)과 SNAP25197(화살촉)이 둘 다 검출된다. (B) SNAP25206과 SNAP25197을 둘 다 보고적으로 인식하는 상업적으로 입수 가능한 항-SNAP25 mAb(MC-6050)를 보고적으로 인식하는 프로빙된 블롯. SNAP25197만이 레인 3에서 단일 밴드로서 나타난다(화살촉). (C) SNAP25197에 대해 보고적으로 특이적인 상업적으로 입수 가능한 항-SNAP25 mAb(MC-6053)로 프로빙된 블롯. 이 항체는 레인 3에서 얇고, 희미한 SNAP25197 밴드를 인식한다. (D) Ab632 항-SNAP25197 rMAb로 프로빙된 블롯. 레인 2에서, 결합은 검출되지 않은 반면, 레인 3에서 SNAP25197에 대한 단일 밴드가 검출된다(화살촉). (E) Ab635 항-SNAP25197 rMAb로 프로빙된 블롯. 레인 2에서, 결합은 검출되지 않은 반면, 레인 3에서 SNAP25197에 대한 단일 밴드가 검출된다(화살촉). (F) RGT-1092 항-SNAP25197 pAb로 프로빙된 블롯. 2개의 희미한 밴드가 SNAP25197 밴드 바로 위 및 아래에서 보이지만, 이 항체는 레인 3에서 SNAP25197을 주로 인식한다(화살촉). 레인 1, 단백질 사다리; 레인 2, 비처리 피질 세포 용해물; 레인 3, BoNT/A-처리(3nM) 피질 세포 용해물.
도 3(A 내지 F)은 3nM 농도에서 BoNT/A로 처리한(L3) 또는 이것 없이(L2) 처리한 SiMa 세포 용해물 중에서 전장 SNAP25206 및 절단된 SNAP25197를 검출하기 위한 상이한 항체의 특이성과 비교하는 웨스턴 블롯 분석을 도시한 도면. (A) SNAP25의 전장(206) 형태와 절단된(197) 형태를 둘 다 인식하는 상업적으로 입수 가능한 항-SNAP25 mAb(SMI-81R)로 프로빙된 블롯. 레인 2에서, SNAP25206만이 검출된 반면, 레인 3에서, SNAP25206(화살)과 SNAP25197(화살촉)이 둘 다 검출된다. (B) SNAP25206과 SNAP25197을 둘 다 보고적으로 인식하는 상업적으로 입수 가능한 항-SNAP25 mAb(MC-6050)로 프로빙된 블롯. SNAP25197만이 레인 3에서 단일 밴드로서 나타난다(화살촉). (C) SNAP25197에 대해 보고적으로 특이적인 상업적으로 입수 가능한 항-SNAP25 mAb(MC-6053)로 프로빙된 블롯. 항체는 임의의 밴드를 임식하는 것으로 나타나지 않는다. (D) Ab632 항-SNAP25197 rMAb로 프로빙된 블롯. 레인 2에서, 결합은 검출되지 않은 반면, 레인 3에서 SNAP25197에 대한 단일 밴드가 검출된다(화살촉). (E) Ab635 항-SNAP25197 rMAb로 프로빙된 블롯. 레인 2에서, 결합은 검출되지 않은 반면, 레인 3에서 SNAP25197에 대한 단일 밴드가 검출된다(화살촉). (F) RGT-1092 항-SNAP25197 pAb로 프로빙된 블롯. 2개의 희미한 밴드가 SNAP25197 밴드 바로 위 및 아래에서 보이지만, 이 항체는 레인 3에서 SNAP25197을 주로 인식한다(화살촉). 레인 1, 단백질 사다리; 레인 2, 비처리 SiMa 세포 용해물; 레인 3, BoNT/A-처리(0.01nM) SiMa 세포 용해물.
도 4(A, B)는 레인 2 및 3에서 샘플의 동일한 장입을 입증하는 항-GAPDH mAb로 프로빙한 도 2에서 피질 세포 연구 및 도 3에서 SiMa 세포 연구에 대한 대조군 웨스턴 블롯 분석을 도시한 도면. 레인 1, 단백질 사다리; 레인 2, 비처리 세포 용해물; 레인 3, BoNT/A-처리 (3nM) 피질 세포 용해물 및 (0.01nM) SiMa 세포 용해물. 도 4(C, D)는 BoNT/A(L3), BoNT/C(L4), BoNT/E(L5)로 처리되거나 또는 독소(L2)가 없는 SiMa 세포 용해물을 이용하는 Ab632-rMAb의 에피토프 특이성을 입증하는 웨스턴 블롯 분석을 나타내는 도면. (C) SNAP25의 전장(206)과 절단된(BoNT/A에 대해 197, BoNT/C에 대해 198 및 BoNT/E에 대해 180) 형태를 둘 다 인식하는 상업적으로 입수 가능한 항-SNAP25 mAb(SMI-81R)로 프로빙한 블롯. 레인 2에서, SNAP25206만이 검출된 반면, 레인 3에서, SNAP25206(화살표)과 SNAP25197을 둘 다 검출한다. 레인 4에서, SNAP25206(화살표)와 SNAP25198을 둘 다 레인 5에서 검출하고, SNAP25206 (화살표)와 SNAP25180을 둘 다 검출한다; (D) Ab632 항-SNAP25197 rMAb를 이용하여 프로빙한 블롯. 레인 2, 4 및 5에서, 결합은 검출되지 않은 반면, 레인 3에서 SNAP25197에 대한 단일 밴드가 검출된다. 레인 1, 단백질 사다리; 레인 2, 비처리 SiMa 세포 용해물; 레인 3, BoNT/A-처리 SiMa 세포 용해물; 레인 4, BoNT/C-처리 SiMa 세포 용해물; 레인 5, BoNT/E-처리 SiMa 세포 용해물.
도 5(A 내지 J)는 오나보툴리눔독소 A(10U/㎏) 또는 비히클 중 하나로 처리 후 래트 방광 박편에서 SNAP25에 대한 항체 특이성을 비교하는 면역조직학적 분석을 도시한 도면. (A 내지 E) 오나보툴리눔독소 A로 주사하고, (A) 전장(206) 및 절단된 (197) SNAP25에 대한 상업적 mAb(SMI-81R), (B) SNAP25197 및 SNAP25206에 대한 제2의 상업적 mAb(MC-6050), (C) SNAP25197에 대한 상업적 mAb(MC-6053), (D) SNAP25197에 대한 Ab632-rMAb 및 (E) SNAP25197에 대한 RGT-1092 pAb로 프로빙한 방광 배뇨근(DM)의 공초점 이미지. (F 내지 J) 비히클로 주사하고 동일한 5개 항체로 프로빙한 대조군 래트 방광의 공초점 이미지. 화살표(F 및 J)는 비히클 처리 래트 방광으로부터의 신경 섬유 내에서 IR-신호를 나타낸다. DM, 배뇨근; 축척 바 = 50㎛.
도 6(A 내지 J)은 오나보툴리눔독소 A(30U/㎏) 또는 비히클 중 하나로 처리 후 래트 평활 피부 박편에서 SNAP25에 대한 항체 특이성을 비교하는 면역조직학적 분석을 도시한 도면. (A 내지 E) 오나보툴리눔독소 A로 주사하고, (A) 전장(206) 및 절단된 (197) SNAP25에 대한 상업적 mAb(SMI-81R), (B) SNAP25197 및 SNAP25206에 대한 제2의 상업적 mAb(MC-6050), (C) SNAP25197에 대한 상업적 mAb(MC-6053), (D) SNAP25197에 대한 Ab632-rMAb 및 (E) SNAP25197에 대한 RGT-1092 pAb로 프로빙한 래트 피부의 공초점 이미지. (F 내지 J) 비히클로 주사하고 동일한 5개 항체로 프로빙한 대조군 래트 피부의 공초점 이미지. 화살표(F, G, H 및 J)는 비히클 처리 래트 피부로부터의 신경 섬유 내에서 IR-신호를 나타낸다. 별표(B, C, G 및 H)는 혈관의 내강 내에서 비특이적 IR-신호를 나타낸다. BV, 혈관; CT, 결합조직; 축척 바 = 50㎛.
도 7(A 내지 H)은 오나보툴리눔독소 A(30U/㎏) 또는 비히클 중 하나로 처리 후 래트 평활 피부 밑에 있는 골격근에서 SNAP25에 대한 항체 특이성을 비교하는 면역조직학적 분석을 도시한 도면. (A 내지 D) 오나보툴리눔독소 A를 주사하고 (A) 전장(206) 및 절단된(197) SNAP25에 대한 상업적 mAb(SMI-81R); (B) SNAP25197 및 SNAP25206에 대한 제2의 상업적 mAb(MC-6050); (C) SNAP25197에 대한 상업적 mAb(MC-6053) 및 (D) SNAP25197에 대한 Ab632-rMAb로 프로빙한 래트 발 밑에 있는 근육 내에서 운동 신경 말단(MNT, 화살표)을 나타내는 공초점 이미지; (E 내지 H) 비히클을 주사하고 동일한 4종의 항체로 프로빙한 대조군 래트 발로부터의 공초점 이미지. SNAP25-IR 신호는 녹색이고(흑백도면에서 회색으로서 나타냄), DIC 조명을 사용하여 밑에 있는 근섬유(MF)를 묘사하였다. 화살표(E)는 비히클 처리 래트 발로부터의 MNT 내의 IR-신호를 나타내고; 별표(B, C, F 및 G)는 근육 내에서 비특이적 IR-신호를 나타낸다. 축척 바 = 50㎛.
도 8(A 내지 T)은 보톡스(BOTOX)(등록상표) 또는 비히클 중 하나로 처리 후 래트 평활 피부(도 7A 내지 7J) 및 래트 방광(도 7K 내지 7T)의 박편에서 다양한 SNAP25197-특이적 항체의 특이성을 비교하는 면역조직화학적 분석을 도시한 도면. (A 내지 J) 보톡스(등록상표)로 주사하고 (A) 인간화된 Ab632-rMAb의 더 오래된 생성 로트(5/02/2011), (B) 인간화된 Ab632-rMAb의 더 최근의 로트, (C) 뮤린 Ab635-rMAb의 최근 로트, (D) Ab507 mAb(18383-CIP에서 세포 기반 분석을 위해 사용한 클론 2E2A6), 및 (E) 복수로부터 정제된 본래의 '비재조합' 3C1A5 mAb로 프로빙한 래트 피부의 공초점 이미지. (F 내지 J) 비히클로 주사하고 동일한 5개 항체로 프로빙한 대조군 래트 피부의 공초점 이미지. 화살표(A, B, C)는 혈관 주위의 신경 섬유 내에서 특이적 면역 반응 신호를 나타낸다. (K 내지 T) 보톡스(등록상표)로 주사하고 (K) 인간화된 Ab632-rMAb의 더 오래된 생성 로트(5/02/2011), (L) 인간화된 Ab632-rMAb의 더 최근의 로트, (M) 뮤린 Ab635-rMAb의 최근 로트, (N) Ab507 mAb (18383-CIP에서 세포 기반 분석을 위해 사용한 클론 2E2A6), 및 (O) 복수로부터 정제된 본래의 '비재조합' 3C1A5 mAb로 프로빙한 방광 평활근(SM)의 공초점 이미지. (P 내지 T) 비히클로 주사하고 동일한 5개 항체로 프로빙한 대조군 래트 방광의 공초점 이미지. 화살표(K, L, M 및 O)는 방광 평활근 내에서 신경섬유 내 특이적 면역반응 신호를 나타낸다. BV, 혈관; CT, 결합조직; SM, 배뇨근. 축척 바 = 50㎛.
도 9(A 내지 H)는 오나보툴리눔독소 A(10U) 또는 비히클 중 하나로 처리 후 인간 등 피부의 박편에서 SNAP25197 대 Ab635-rMAb에 대한 상업적으로 입수가능한 (MC-6053) mAb의 면역조직화학적 비교를 도시한 도면. (A, E) MC-6053 mAb 또는 (B, F) Ab635-rMAb 중 하나로 프로빙한 오나보툴리눔독소 A(A, B) 및 비히클-처리(E, F) 인간 피부에서 혈관의 공초점 이미지. (C, G) MC-6053 mAb 또는 (D, H) Ab635-rMAb 중 하나로 프로빙한 오나보툴리눔독소 A(C, D) 및 비히클-처리(G, H) 인간 피부에서의 땀샘. 화살표는 비히클 처리 인간 피부로부터의 신경 섬유 내의 IR 신호를 나타낸다. BV, 혈관; CT, 결합조직; SG, 땀샘; 축척 바 = 50㎛.
도 10(A 내지 F)는 상이한 형태의 SNAP25에 대한 항체로 프로빙한 BoNT/A(3nM)- 또는 비히클-처리 배근 신경절(DRG) 배양물의 공초점 이미지를 도시한 도면. (A 내지 C) BoNT/A에 대해 3시간 동안 노출되고, 이후에 (A) 전장(206) 및 절단된(197) SNAP25에 대한 상업적(SMI-81R) mAb, (B) SNAP25197에 대한 상업적(MC-6053) mAb 및 (C) SNAP25197에 대한 Ab632-rMAb로 염색된 DRG 배양물. (D 내지 F) 비히클에 노출되고, 동일한 3개 항체로 프로빙한 대조군 DRG 배양물. E의 화살촉은 배경 표지를 나타내는 뉴런 체세포를 나타낸다.
I. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가진다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 다음의 용어는 달리 구체화되지 않는 한 그들에게 주어진 의미를 가진다.
"BoNT/A"는 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum)에 의해 생성되는 보툴리눔 독소 혈청형 A를 지칭한다.
"오나보툴리눔독소 A"는 상표명 보톡스(등록상표)를 지칭하는데, 이는 900 kDa 보툴리눔균 신경독소 혈청형 A 복합체의 FDA-승인 제형이다.
항체 또는 폴리펩타이드에 대해 (본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되는) "특이적으로 결합하는" 또는 "우선적으로 결합하는" 에피토프는 당업계에서 잘 이해되는 용어이고, 이러한 구체적 또는 우성적인 결합을 결정하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 분자는 그것이 대안의 세포 또는 물질에 대해서보다 더 빈번하게, 더 빠르게, 더 큰 지속기간으로 그리고 더 큰 친화도로 특정세포 또는 물질과 반응 또는 회합된다면, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타내는 것으로 언급된다. 항체는 그것이 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합활성으로, 더 용이하게, 더 배타적으로 그리고/또는 더 큰 지속기간으로 결합한다면, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"이다. 예를 들어, 제1 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체(또는 모이어티 또는 에피토프)는 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수도 있거나 또는 결합하지 않을 수도 있다는 것이 본 정의에 의해 이해된다. 이러한 "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 배타적 결합을(포함할 수 있다고 해도) 반드시 필요로 하지는 않는다. 일반적으로, 그러나 필수적으로는 아닌, 본 명세서의 결합에 대한 언급은 우선적 결합을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "SNAP25197"은 전장 SNAP25 단백질이 보툴리눔 독소 혈청형 A의 효소적(경쇄) 활성을 지니는 보툴리눔 독소 혈청형 A 또는 재조합 보툴리눔 독소에 의해 절단될 때 생성된 25 kDa의 시냅토솜 결합 단백질(SNAP25)의 197개 아미노산 단편을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "SNAP25206"은 206개 아미노산을 함유하는 전장 SNAP25 단백질을 지칭한다.
본 발명은 그 자체로 다를 수 있는 이러한 항체를 이용하는 특히 예시적인 항체, 제형 또는 방법으로 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 또한 본 명세서에서 사용되는 기술적 용어는 단지 본 발명의 특정 실시형태를 설명하는 목적을 위한 것이며, 제한되는 것으로 의도되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.
II. SNAP25197에 결합하는 항체
시냅스 소포 당단백질 2C(SV2C), 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(FGFR3) 및 SNAP25206을 포함하는 BoNT/A 분자 표적은 광범위하게 발현되며, 래트 및 영장류 소변 방광 및 평활 피부를 포함하는 신체 전체적으로 자율 및 감각 신경 섬유에서 공동 국소화된다. 결과적으로, 신경 말단은 BoNT/A의 저해 효과에 민감하게 될 가능성이 있다. 항체가 BoNT/A의 다양한 분자 표적에 대해 존재하지만, 웨스턴 블롯팅 기법에서 그리고 또한 조직 샘플(예를 들어, 면역형광을 이용)에서 절단된(즉, BoNT/A 활성) SNAP25(예를 들어, SNAP25197 단편)를 검출하는데 유용한 최적의 항체는 동정되지 않았다.
본 개시내용의 양상은 ELISA 분석, 웨스턴 블롯 적용, 세포 배양 분석에서 그리고 조직 샘플에서 BoNT/A 활성을 검출하기 위해 사용될 수 있는 BoNT/A SNAP25 절단 생성물에 특이적인 항-SNAP25 항체를 부분적으로 포함한다. 본 발명의 다른 양상은 전장 SNAP25(SNAP25206)에 실질적으로 결합하지 않는 SNAP25197 단편의 카복시 말단에 대해 에피토프를 지니는 항-SNAP25 항체이다.
(단클론성 또는 다클론성) 항체의 제조방법은 당업계에 공지되어 있다. 사용될 수 있는 한 가지 방법은 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975)]의 방법 또는 이의 변형이다. 전형적으로, 단클론성 항체는 마우스와 같은 비인간 종에서 발생된다. 일반적으로, 마우스 또는 래트가 면역화에 대해 사용되지만, 다른 동물이 또한 사용될 수 있다. 또한, 일단 항체가 목적으로 하는 결합 특징을 갖는 것으로 동정되면, 그들의 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR)을 포함하는 항원-결합 부위는 인간을 포함하는 다른 종의 항체의 불변 도메인 또는 지지 프레임워크 영역에 융합될 수 있다. 일부 예에서, 이들 재조합 단클론성 항체를 생성하는 것은 이들 항체가 주사되는 환자 또는 숙주 동물에서 원치않는 면역학적 반응을 최소화할 수 있다. 다른 예에서, 이들 재조합 단클론성 항체를 생성하는 것은 상이한 종의 동물의 조직에서 BoNT/A 활성을 검출하기 위한 진단 또는 사용을 위한 특정 결합 특징을 지니는 특정 항체의 효용을 확장시킬 수 있다. 일부 예에서, 재조합 단클론성 항체는 관심 대상의 조직의 내인성 IgG와 매우 상이할 수 있는 CDR의 선택성뿐만 아니라, 재조합 IgG 골격에 기인하여 최소 "오프 표적" 신호의 이점을 가질 수 있다.
항-SNAP25197 항체가 생성되며, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제2012/0225436A1호에 기재되어 있다. 면역조직화학(IHC) 분석에서 우수한 성능에 대해 선택된 이들 단클론성 항체 중 하나의 CDR을 서열분석하고 나서, 인간(IgG1) 또는 뮤린(IgG2A) 유래의 면역글로불린 골격에 재조합적으로 공학처리하였다. 이들 항체를 웨스턴 블롯 분석에서 그리고 면역형광을 이용하는 조직 샘플(래트 조직 또는 인간 조직)에서의 사용을 위해 절단된 SNAP25(SNAP25197)에 대한 그들의 특이성에 대해 상업적으로 입수가능한 항체에 따라 추가로 특성규명하였다. 이하의 표 1은 이 비교에서 사용된 항-SNAP25의 목록을 포함한다.
항- SNAP25 항체의 목록
항체 특이성 공급업자 종/유형 IgG - 아이소타입 SNAP25 197 항원
SMI-81R SNAP25206 /197 뉴저지주 프린스턴에 소재한 코반스(Covance) 뮤린/mAb IgG1 비절단 SNAP25
MC-6050 SNAP25206 /197 네바다주 라스베가스에 소재한 R&D Abs 뮤린/mAb n/a 15-량체, COOH-말단
MC-6053 SNAP25197 네바다주 라스베가스에 소재한
R&D Abs		 뮤린/mAb n/a 15-량체, COOH-말단
Ab507 SNAP25197 엘러간 뮤린/mAb n/a 12-량체, COOH-말단
Ab632 SNAP25197 엘러간 r인간/ rMAb IgG1 12-량체, COOH-말단
Ab635 SNAP25197 엘러간 r뮤린/rMAb IgG2A 12-량체, COOH-말단
RGT-1092 SNAP25197 엘러간 토끼/pAb IgG 7-량체, COOH-말단
n/a = 이용 가능하지 않음; mAb = 마우스 단클론성 항체; rMAb = 재조합 단클론성 항체; pAb = 토끼 다클론성 항체
III. 항-SNAP25197 항체의 특성 규명
항-SNAP25 항체를 특성규명하기 위해 몇몇 방법을 사용할 수 있다. 한 가지 방법은 그것이 결합되는 에피토프를 동정하는 것이다. 에피토프 맵핑은 다양한 공급원, 예를 들어, 펩스캔 시스템즈(Pepscan Systems)(네덜란드 8219 PH 렐리스타트 에델허트버그 15에 소재)로부터 상업적으로 입수 가능하다. 에피토프 맵핑은 항-SNAP25 항체가 결합되는 서열을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 에피토프는 선형 에피토프, 즉, 아미노산의 단일 스트레치에 포함된 에피토프 또는 신호 스트레치에 반드시 포함되지 않을 수도 있는 아미노산의 3차원 상호작용에 의해 형성된 입체배좌 에피토프일 수 있다. 상이한 길이(예를 들어, 적어도 4 내지 6개 아미노산 길이)의 펩타이드는 단리되거나 또는 (예를 들어, 재조합적으로) 합성될 수 있고, 항-SNAP25 항체를 이용하는 결합 분석을 위해 사용된다. 항-SNAP25 항체가 결합되는 에피토프는 세포외 서열로부터 유래된 중복 펩타이드를 이용함으로써 그리고 항-SNAP25 항체에 의해 결합을 결정함으로써 전신 선별에서 결정될 수 있다.
항-SNAP25 항체를 특성규명하기 위해 사용될 수 있는 다른 방법은 동일한 항원 또는 심지어 동일한 항원 상의 동일한 에피토프에 결합된 다른 항체와의 경쟁 분석을 사용하는 것이다. 경쟁 분석은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
항-SNAP25 항체를 특성규명하는 다른 방법은 그것이 결합하는 항원에 의한다. 항-SNAP25 항체는 웨스턴 블롯에서 사용될 수 있다. 구체적으로, 일부 실시형태에서, 항-SNAP25 항체는 BoNT/A 절단된 SNAP25(SNAP25197)에 대한 그의 특이성을 결정하기 위해 웨스턴 블롯 분석에서 사용되었다. 웨스턴 블롯 분석에서 SNAP25197에 우선적으로 결합하는 항-SNAP25 항체 및 전장이 아닌(즉, 비절단) SNAP25는 본 개시내용의 바람직한 실시형태이다. 웨스턴 블롯 분석에서 항-SNAP25 항체의 특성규명을 이하의 실시예에서 상술한다.
IV. 조직 샘플에서 BoNT/A 활성을 진단하는 방법
BoNT/A 절단된 SNAP25(SNAP25197)에 결합된 항체는 다양한 조직에서 BoNT/A 활성의 존재 또는 부재를 동정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 조직은 골격근 및 평활근을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 털이 없는 또는 털이 있는 근육, 방광, 전립선, 누선, 내분비선 및 내분비선, 혈관, 척수 및 뇌를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 선상 조직(임의의 및 모든 이들 조직 내의 신경 섬유를 포함함)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 피부를 포함할 수 있다. 이러한 조직은 생검 또는 피부 펀치의 부분으로서 구해질 수 있다.
조직 내 BoNT/A 활성을 검출하기 위해 사용하는데 적합한 항체는 (1) SNAP25197에 대한 결합에 특이적이고 전장 또는 비절단 SNAP 25(SNAP25206)에 대해서는 특이적이지 않으며; 그리고 (2) 조직 샘플 내에서 SNAP25197을 우선적으로(전장 또는 비절단 SNAP25는 아님) 검출할 수 있을 필요가 있다. 바람직할 수 있는 다른 특징은 항체가 비특이적 항원(즉, 배경이 낮거나 또는 전혀 없는, 비특이적 결합)에 대해 실질적으로 결합하는 일 없이 조직 샘플 내 BoNT/A 절단된 SNAP25 (SNAP25197)에 우선적으로 결합한다는 점에서 바람직하다.
특정 조직 샘플 내 BoNT/A 또는 BoNT/A-유사 화합물 활성의 부재 또는 존재를 결정하는 것은 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 임상적 및 비임상적 진단 목적을 위해 중요할 수 있다: 1) 특정 조직 또는 임상 적응증에서 BoNT/A에 대한 작용 메커니즘의 이해; 2) BoNT/A 활성의 평가 및/또는 주사 부위 이상의 퍼짐; 3) BoNT/A에 대해 의심되는 면역의 평가; 4) BoNT/A의 국소 확산의 평가 및 이해(예를 들어, 주사 근육으로부터 이웃하는 근육 또는 조직까지); 5) 생검에 의해 수행되는 인간 보툴리눔 독소증의 상황에서 BoNT/A에 대한 잠재적 노출의 평가; 및 6) 임상 약리학적 연구.
일 실시형태에서, 상기 용도는 SNAP25197과 SNAP25197에 특이적으로 결합하는 항체 사이의 복합체의 형성을 수반할 수 있다. 본 발명의 진단 방법의 일 실시형태에서, 항-SNAP25197 항체는 검출가능한 표지를 보유할 수 있다. 사용될 수 있는 표지의 예는 방사성 제제, 형광단, 화학적 표지, 생물학적 제제, 예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 바이오틴/스트렙타비딘 검출 또는 효소적 기질 표지를 포함한다. 다른 실시형태에서, 검출 가능한 표지를 보유할 수 있는 다른 종의 2차 항체는 항-SNAP25197 항체를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 2차 항체의 사용은 일부 경우에, 1차 항-SNAP25197 항체의 신호를 촉진시킴으로써, 조직 샘플에서 낮은/더 낮은 수준의 BoNT/A 활성을 검출할 수 있다.
V. 본 발명의 조성물
본 발명은 또한 ELISA, 웨스턴 블롯 분석에서 및 조직 샘플에서 비절단 SNAP25(SNAP25206)를 검출하는 일 없이 BoNT/A 절단된 SNAP25를 우선적으로 검출할 수 있는 항-SNAP25197 항체를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-SNAP25197 항체는 CDR이 상이한 종의 항체의 지지 프레임워크와 융합된 재조합 단클론성 항체이다. 다른 실시형태에서, 항-SNAP25197 항체는 CDR이 동일한 종의 항체의 지지 프레임워크와 융합된 재조합 단클론성 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-SNAP25197 항체는 CDR이 인간 항체의 지지 프레임워크와 융합된 재조합 단클론성 항체이다. 일부 실시형태에서, 항-SNAP25197 항체는 CDR이 마우스 항체의 지지 프레임워크와 융합된 재조합 단클론성 항체이다.
앞서 미국 특허 제2012/0225436호에서 예비적으로 기재된 하나의 항체인 3C1A5가 BoNT/A-처리 조직에서 SNAP25197을 검출하는 그의 타고난 능력 때문에 본 발명에서 특히 유용하였다는 것을 발견하였다. 3C1A5는 면역 기반(예를 들어, ELISA) 분석에서 및/또는 세포 기반 분석에서 SNAP25197에 우선적으로 결합하는 것으로 알려졌다. 도 1은 SNAP25197 상의 3C1A5 항체의 추정적 에피토프 결합 부위의 도시를 나타낸다. 실시예에 상세하게 기재한 바와 같이, 이 항체(및 그의 재조합 인간 및 뮤린 형태)는 또한 웨스턴 블롯 분석에서 BoNT/A 절단된 SNAP25(SNAP25197)를 우선적으로 검출하였다(또는 결합한다). 놀랍게도, 이 항체(및 그의 재조합 인간 및 뮤린 형태)는 또한 래트 및 인간 조직 샘플에서 BoNT/A 절단된 SNAP25 (SNAP25197)를 우선적으로 검출할 수 있었다(또는 결합할 수 있었다). 실시예에 상세하게 나타낸 바와 같이 웨스턴 블롯 분석에서 그리고 조직 샘플에서 SNAP25197을 우선적으로 검출할 수 있는(또는 결합할 수 있는) 항-절단된 SNAP25 항체의 보고가 존재하지만, 3C1A5(또는 그의 재조합 인간 및 뮤린 형태)는 모든 분석에서 그리고 상이한 조직 상에서 SNAP25197을 일시적으로 검출한 유일한 항체이고, 다른 에피토프에 대한 비특이적 결합을 나타내지 않았다.
일부 경우에, 본 발명의 항체는 3C1A5이다. 다른 경우에, 본 발명의 항체는 3C1A5의 항원 결합 부위를 포함하는 재조합 항체이지만, 동일 또는 상이한 종으로부터의 다른 항체의 프레임워크 영역과 융합되었다.
일 실시형태에서, 항-SNAP25197 항체의 경쇄/중쇄는 이하의 표 2에 열거된 서열 중 하나 이상을 포함한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
일부 경우에, 본 발명의 항체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 경쇄 서열을 포함하고, 재조합 뮤린 항체이다. 다른 경우에서, 본 발명의 항체는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 중쇄 서열을 포함하며, 재조합 뮤린 항체이다. 다른 경우에서, 본 발명의 항체는 서열번호 5 또는 서열번호 6의 경쇄 서열을 포함하고, 재조합 인간 항체이다. 다른 경우에, 본 발명의 항체는 서열번호 7 또는 서열번호 8의 중쇄 서열을 포함하고, 재조합 인간 항체이다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체는 서열번호 1 내지 8의 하나 이상의 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄를 지니는 항체의 동일한 에피토프에 결합하는 항체이다. 일부 경우에, 본 발명의 항체는 서열번호 1 내지 8의 하나 이상의 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄를 지니는 항체의 동일한 에피토프에 결합을 위해 경쟁할 항체일 수 있다.
다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공되지만, 본 발명을 제한하지 않는다.
IV. 실시예
실시예 1. 웨스턴 블롯 비교
SNAP25 항체(표 1에서 열거)를 래트 배아 피질 세포 용해물로부터 그리고 BoNT/A로 그리고 없이 처리한 SiMa 세포 용해물에서 SNAP25의 전장(206) 또는 BoNT/A-절단된(197) 형태를 인식하는 그들의 능력에서 웨스턴 블롯 분석에 의해 처음 비교하였다(도 2 및 도 3 참조).
래트 피질 뉴런을 배아 새끼(E18)로부터 채취하고, 37℃에서 15분 동안 파파인 해리 시스템(뉴저지주 레이크우드에 소재한 워싱턴 바이오케미컬 코포레이션(Worthington Biochemical Corp.))에서 분해하여 개개 세포를 얻었다. 이어서, 피질 세포 B-27 보충물, 0.5mM L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 뉴로베이설(Neurobasal) 배지(캘리포니아주 칼스베드에 소재한 라이프 테크놀로지즈)에 옮겼다. 신생아 새끼(P7 내지 P14)로부터 채취한 래트 배근 신경절(DRG)을 풀링하고 나서, 37℃에서 15분 동안 파파인-함유 HBSS(1mM L-시스테인 중의 ㎖ 당 파파인 20 단위의 최종 농도) 중에서 분해시켰다. 신경절을 세척하고 나서, 후속적으로 1형 콜라게나제를 함유하는 Ca2+/Mg2+-유리 HBSS(1.7㎎/㎖, 미조리주 세인트 루이스에 소재한 시그마(Sigma)) 중에서 분해시키고 나서, 37℃에서 추가 15분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 신경절을 B-27 보충물, 0.5mM L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신 및 20ng/㎖ 2.5S 신경 섬유 인자(NGF)를 함유하는 뉴로베이설-A(Neurobasal-A) 배지(캘리포니아주 칼스베드에 소재한 라이프 테크놀로지즈)에서 세척하고 나서, 파스퇴르(Pasteur) 피펫을 통해 부드럽게 분말화시켰다. 피질 및 세포를 균질하게 분산시키고 나서, DRG 세포를 균질하게 분산시키고, 폴리-D-라이신/라미닌-코팅 12㎜ 커버슬립(캘리포니아주 산호세에 소재한 BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences)) 상에 플레이팅하고 나서, 100㎜ 배양 접시에 놓고, 처리 전 6 내지 7-DIV 동안 성장시켰다. 모든 동물 프로토콜 및 절차를 엘러간 실험동물운영위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인받고, NIH 가이드라인에 따라 수행하였다.
선택일에, 배양물을 37℃에서 3시간 동안 3nM BoNT/A(150 kDa; 위스콘신주 매디슨에 소재한 메타바이올로직스(Metabiologics))을 이용하여 또는 없이 처리하였다. 처리 후, 세포를 린스하고, 이어서, 새로운 배양 배지에서 밤새 인큐베이션시켰다. 이어서, 피질 세포를 PBS로 세척하고 나서, 20분 동안 얼음 상에서 새로 제조한 용해 완충제(20mM 트리스 pH 7.5, 0.15M 염화나트륨, 1nM EDTA, 1mM EGTA, 10% 트리톤 X-100 및 무 EDTA 프로테아제 저해제의 하나의 정제) 중에서 용해시키고, 이어서, 4000rpm에서 20분 동안 원심분리시켜 웨스턴 블롯(WB) 분석 전에 파편을 제거하였다. DRG 세포를 세척하고 나서, 4% 파라폼알데하이드를 이용하여 10 내지 15분 동안 고정시키고 나서, 이하의 프로토콜에 따라 면역세포화학을 위해 처리하였다.
SiMa 세포(독일에 소재한 DSMZ)를 통기 캡을 지니는 BD 바이오사이언시즈 상표 콜라겐 IV 플라스크(펜실베니아주 래드너에 소재한 VWR)에서 배양시켰다(Marini, P., MacLeod, R.A., Treuner, C., Bruchelt, G., Bohm, W., Wolburg, H., Schweizer, P., and Girgert, R., 1999. SiMa, a new neuroblastoma cell line combining poor prognostic cytogenetic markers with high adrenergic differentiation. Cancer Genet.Cytogenet. 112, 161-164). 성장 배지는 RPMI 1640, 0.1mM 비 필수 아미노산, 10mM HEPES, 1mM 피루브산나트륨, 100 U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 10% 소 태아 혈청으로 이루어졌다. 세포를 37℃에서 24시간 동안 BoNT/A(0.01nM)로 또는 이것 없이 처리하였다. 처리 후에, SiMa 세포를 PBS로 세척하고 나서, 얼음 상에서 20분 동안 새로 제조한 용해 완충제 중에서 용해시키고, 이어서, WB 분석 전에 파편을 제거하기 위해 4000rpm에서 20분 동안 원심분리시켰다.
WB 분석을 위해, 본 발명자들은 래트 배아 피질 뉴런뿐만 아니라 인간 신경아세포종 세포주(SiMa)를 사용하였는데, 이는 BoNT/A-매개 SNAP25 절단에 대한 그의 민감성에 대해 공지되어 있다(Fernandez-Salas, E., Wang, J., Molina, Y., Nelson, J.B., Jacky, B.P., and Aoki, K.R., 2012. Botulinum neurotoxin serotype A specific cell-based potency assay to replace the mouse bioassay. PLoS.One. 7, e49516). 이들 배양물로부터의 총 세포 용해물을 전기이동(Biorad TGX Any Kd 겔)에 의해 분리시키고, 겔을 PVDF 막 상에 옮겼다. 블롯을 실온에서 1시간 동안 완충제(1X TBS-0.1% 트윈-20 중의 5% 분유) 중에서 차단시키고, 이어서, 차단 완충제 중에서 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 세척 후, 블롯을 HRP-컨쥬게이팅된 2차 항체(캘리포니아주 허큘레스에 소재한 바이오 래드(Bio Rad))와 함께 인큐베이션시키고 나서, ECL 플러스(ECL Plus)(펜실베니아주 피츠버그에 소재한 GE 헬스케어(GE Healthcare))에 의해 개발하였다. 별개의 대조군 블롯을 글리세르알데하이드 3-인산염 탈수소효소(GAPDH)에 대해 프로빙하여 세포 용해물 샘플의 동일한 장입을 나타내었다. 가변 방식 GE 타이푼(Typhoon) 9410 이미저를 이용하여 웨스턴 블롯을 스캐닝하고 나서, 이미지퀀트(ImageQuant) TL v.2005 소프트웨어(펜실베니아주 피츠버그에 소재한 GE 헬스케어)를 이용하여 분석하였다.
처음에, SNAP25 단백질의 모든 형태에 관한 상업적으로 입수가능하고 널리 사용되는 단클론성 항체(SMI-81R)는 SNAP25206과 SNAP25197을 둘 다 인식하였다(도 2A). 대조적으로, SNAP25의 형태를 둘 다 인식하는 것으로 기재된 제2의 상업적으로 입수 가능한 단클론성 항체(MC-6050)는 놀랍게도 독소-처리 세포로부터의 용해물에서 SNAP25197에 대해 특이적이었다(도 2B). 더 나아가, BoNT/A-절단된 SNAP25만을 인식하는 것으로 기재된 동일한 회사로부터의 다른 항체(MC-6053)는 독소-처리 레인에서 얇고, 희미한 밴드를 배타적으로 나타내었다(도 2C).
BoNT/A-절단된 SNAP25에 관한 인간(Ab632) 및 뮤린(Ab635) rMAb는 SNAP25197에 대해 매우 특이적이었고; 단일 밴드만을 독소 처리 용해물에서 검출한 반면, 비처리, 대조군 레인에서 밴드는 검출되지 않았다(도 2D, 도 2E). 유사하게, SNAP25197만에 대해 본 발명자들의 조직내 토끼 pAb(RGT-1092)는 BoNT/A-처리 샘플에서 밴드를 검출하였지만, 대조군 레인에서 밴드는 검출되지 않았다(도 2F). 그러나, pAb는 2개의 추가적인 희미한 밴드를 인식하였는데(하나는 SNAP25197 밴드 바로 위이고, 다른 하나는 대략 20kDa에서 독소-처리 샘플 중에 존재함), 이는 용이하게 설명될 수 없었다는 것을 주목하였다. 그럼에도 불구하고, 상부 밴드는 무손상 SNAP25가 될 가능성이 없는데, 밴드가 비처리 레인에서 관찰되지 않기 때문이다. 대조군 또는 독소-처리 레인 중 하나에서 MC-6053에 대해 밴드가 관찰되지 않은 것을 제외하고(도 3C), BoNT/A-처리 및 비처리 SiMa 세포 배양물로부터의 용해물을 이용하여 유사한 WB 결과를 얻었다(도 3). GAPDH에 대해 프로빙한 대조군 블롯은 피질과 SiMa 세포 용해물 실험 둘 다에 대한 모든 샘플의 동일한 장입을 나타내었다(도 4A, 도 4B).
별도의 WB 분석을 수행하여 BoNT/A-처리 용해물에 비교한 BoNT/C- 및 BoNT/E-처리 SiMa 세포 용해물을 이용하는 본 발명자들의 rMAb의 에피토프 특이성을 시험하였다. BoNT/C는 아미노산(aa) 잔기 198에서 SNAP25를 절단한 반면, BoNT/E는 잔기 180에서 SNAP25를 절단하였다는 것은 잘 확립되어 있다[11]. SMI-81R mAb가 SNAP25의 전장과 BoNT-절단된 형태를 둘 다 인식하였지만(도 4C), 본 발명자들의 인간 rMAb는 예상한 바와 같이 BoNT/A-처리 용해물 샘플에서 단일 밴드만을 검출하였다(도 4D).
도 2는 BoNT/A로 처리한(L3) 또는 이것 없이 처리한(L2) 래트 배아 피질 신경세포 용해물을 이용하여 SNAP25에 대한 항체의 특이성을 비교하는 WB 분석을 나타낸다. (A) SNAP25의 전장(206) 형태와 절단된(197) 형태를 둘 다 인식하는 상업적으로 입수 가능한 항-SNAP25 mAb(SMI-81R)로 프로빙된 블롯. 레인 2에서, SNAP25206만이 검출된 반면, 레인 3에서, SNAP25206(화살)과 SNAP25197(화살촉)이 둘 다 검출된다. (B) SNAP25206과 SNAP25197을 둘 다 보고적으로 인식하는 상업적으로 입수 가능한 항-SNAP25 mAb(MC-6050)로 프로빙된 블롯. SNAP25197만이 레인 3에서 단일 밴드로서 나타난다(화살촉). (C) SNAP25197에 대해 보고적으로 특이적인 상업적으로 입수 가능한 항-SNAP25 mAb(MC-6053)로 프로빙된 블롯. 이 항체는 레인 3에서 얇고, 희미한 SNAP25197 밴드를 인식한다. (D) Ab632 항-SNAP25197 rMAb로 프로빙된 블롯. 레인 2에서, 결합은 검출되지 않은 반면, 레인 3에서 SNAP25197에 대한 단일 밴드가 검출된다(화살촉). (E) Ab635 항-SNAP25197 rMAb로 프로빙된 블롯. 레인 2에서, 결합은 검출되지 않은 반면, 레인 3에서 SNAP25197에 대한 단일 밴드가 검출된다(화살촉). (F) RGT-1092 항-SNAP25197 pAb로 프로빙된 블롯. 2개의 희미한 밴드가 SNAP25197 밴드 바로 위 및 아래에서 보이지만, 이 항체는 레인 3에서 SNAP25197을 주로 인식한다(화살촉). 레인 1, 단백질 사다리; 레인 2, 비처리 피질 세포 용해물; 레인 3, BoNT/A-처리(3nM) 피질 세포 용해물.
도 3은 BoNT/A로 처리한(L3) 또는 이것이 없는(L2) SiMa 세포 용해물을 이용하여 SNAP25에 대한 항체의 특이성을 비교하는 WB 분석을 나타낸다. (A) SNAP25의 전장(206) 형태와 절단된(197) 형태를 둘 다 인식하는 상업적으로 입수 가능한 항-SNAP25 mAb(SMI-81R)로 프로빙된 블롯. 레인 2에서, SNAP25206만이 검출된 반면, 레인 3에서, SNAP25206(화살)과 SNAP25197(화살촉)이 둘 다 검출된다. (B) SNAP25206과 SNAP25197을 둘 다 보고적으로 인식하는 상업적으로 입수 가능한 항-SNAP25 mAb(MC-6050)로 프로빙된 블롯. SNAP25197만이 레인 3에서 단일 밴드로서 나타난다(화살촉). (C) SNAP25197에 대해 보고적으로 특이적인 상업적으로 입수 가능한 항-SNAP25 mAb(MC-6053)로 프로빙된 블롯. 항체는 임의의 밴드를 인식하는 것으로 나타나지 않는다. (D) Ab632 항-SNAP25197 rMAb로 프로빙된 블롯. 레인 2에서, 결합은 검출되지 않은 반면, 레인 3에서 SNAP25197에 대한 단일 밴드가 검출된다(화살촉). (E) Ab635 항-SNAP25197 rMAb로 프로빙된 블롯. 레인 2에서, 결합은 검출되지 않은 반면, 레인 3에서 SNAP25197에 대한 단일 밴드가 검출된다(화살촉). (F) RGT-1092 항-SNAP25197 pAb로 프로빙된 블롯. 2개의 희미한 밴드가 SNAP25197 밴드 바로 위 및 아래에서 보이지만, 이 항체는 레인 3에서 SNAP25197을 주로 인식한다(화살촉). 레인 1, 단백질 사다리; 레인 2, 비처리 SiMa 세포 용해물; 레인 3, BoNT/A-처리(0.01nM) SiMa 세포 용해물.
도 4(A, B)는 레인 2 및 3에서 샘플의 동일한 장입을 나타내는 항-GAPDH mAb로 프로빙한 도 2에서 피질 세포 연구 및 도 3에서 SiMa 세포 연구에 대한 대조군 블롯을 도시한 도면. 레인 1, 단백질 사다리; 레인 2, 비처리 세포 용해물; 레인 3, BoNT/A-처리(3nM) 피질 세포 용해물 및 (0.01nM) SiMa 세포 용해물. 도 4(C, D)는 BoNT/A(L3), BoNT/C(L4), BoNT/E(L5)로 처리되거나 또는 독소(L2)가 없는 SiMa 세포 용해물을 이용하는 Ab632-rMAb의 에피토프 특이성을 입증하는 웨스턴 블롯 분석을 나타내는 도면. (C) SNAP25의 전장(206)과 절단된(BoNT/A에 대해 197, BoNT/C에 대해 198 및 BoNT/E에 대해 180) 형태를 둘 다 인식하는 상업적으로 입수 가능한 항-SNAP25 mAb(SMI-81R)로 프로빙한 블롯. 레인 2에서, SNAP25206만이 검출된 반면, 레인 3에서, SNAP25206(화살표)과 SNAP25197을 둘 다 검출한다. 레인 4에서, SNAP25206(화살표)와 SNAP25198을 둘 다 레인 5에서 검출하고, SNAP25206(화살표)와 SNAP25180을 둘 다 검출한다; (D) Ab632 항-SNAP25197 rMAb를 이용하여 프로빙한 블롯. 레인 2, 4 및 5에서, 결합은 검출되지 않은 반면, 레인 3에서 SNAP25197에 대한 단일 밴드가 검출된다. 레인 1, 단백질 사다리; 레인 2, 비처리 SiMa 세포 용해물; 레인 3, BoNT/A-처리 SiMa 세포 용해물; 레인 4, BoNT/C-처리 SiMa 세포 용해물; 레인 5, BoNT/E-처리 SiMa 세포 용해물.
실시예 2. 면역조직화학적 비교― 래트 조직
이어서, 오나보툴리눔독소 A 또는 식염수 중 하나로 처리하고, 주사 후 2일에 채취한 래트 방광 및 평활 피부에서 면역조직화학(IHC)을 이용하여 항체의 특이성을 시험하였다. 이들 IHC 연구 전체적으로, 1차 항체 없이 처리한 인접한 박편은 배경 염색만을 나타내었다(데이터 미제시).
수컷 스프래그 돌리 래트(매사추세츠주 윌밍턴에 소재한 찰스 리버 래버러토리즈(Charles River Laboratories))를 이 연구를 위해 사용하였다. 12시간 명암 주기로 음식 및 물에 대해 자유롭게 접근하면서 래트를 RD3 비바리움(vivarium)에 쌍별로 수용하였다. 모든 절차를 엘러간 실험동물운영위원회에 의해 승인받았고, NIH 가이드라인을 충실히 지켰다.
오나보툴리눔독소 A(보톡스(등록상표), 캘리포니아주 어바인에 소재한 엘러간 인코포레이티드) 및 BoNT/A(150kDa; 위스콘신주 메디슨에 소재한 메타바이올로직스(Metabiologics))의 작업 용액을 0.9% 식염수 또는 0.5% BSA/0.9% 식염수 중에서 각각 제조하였다. 방광 주사를 위해, 래트를 처음에 마취시키고 나서, 수술을 준비하였다. 하부 중앙 복부를 절개하여, 소변 방광, 정낭 및 전립선을 노출시켰다. 이어서, 소변 방광벽을 10㎕의 오나보툴리눔독소 A(2.5U/㎏)를 지니는 중앙선 환경을 따라 4개의 등거리 부위에서 주사하여 최종 독소 장입 10U/㎏을 수득하였다. 대조군 동물은 비슷한 표적 부위에 비히클(0.9% 식염수)의 10㎕ 주사를 받았다. 평활 피부 주사를 위해, 오나보툴리눔독소 A(30U/㎏) 또는 비히클을 족척 사이에서 오른쪽 뒷발 중심에 단일 진피내(ID) 주사(25㎕)로서 투여하였다.
래트를 주사 2일 후에 희생시키고 나서, 방광 또는 뒷발의 편평한 표면의 중앙 부분을 채취하고, 잠보니 정착액(Zamboni's fixative)(캘리포니아주 로디에 소재한 아메리칸 마스터테크(American MasterTech)) 중에서 밤새 4℃에서 고정시켰다. 조직을 세척하고 나서, 4℃에서 밤새 30% 수크로스/PBS 용액 중에서 동결보호시켰다. 방광 및 피부 샘플을 중앙선을 따라 반으로 자르고 나서, O.C.T(티슈-테크(Tissue-Tek))에서 포매시키고 나서, 박편화까지 -80℃에서 냉동저장시켰다. 조직 블록을 초저온(cryostat)-박편화(14㎛-두께)하고 나서, 슬라이드-장착하고, 슬라이드를 사용까지 -20℃에서 유지시켰다.
슬라이드 장착 조직 박편 및 세포 배양 커버슬립을 차단 완충제(1X PBS + 0.1% 트리톤 X-100 + 10% 정상 당나귀 혈청) 중에서 비특이적 신호에 대해 처음 차단시키고, 이어서, 4℃에서 밤새 차단 완충제 중에서 목적으로 하는 농도로 1차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 몇 회의 세척 후에, 박편 및 커버슬립을 4℃에서 2시간 동안 차단 완충제 중에서 희석시킨 2차 항체(펜실베니아주 웨스트 글로브에 소재한 잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch))와 함께 인큐베이션시키고, 이어서, 다시 세척하였다. 배양물을 지니는 커버슬립을 뒤집고 나서, 1.5㎍/㎖ DAPI를 함유하는 플루오로마운트-G(펜실베니아주 해트필드에 소재한 EM 사이언시즈(EM Sciences))를 이용하여 현미경 슬라이드에 장착하였다. 동일한 장착 배지를 이용하여 슬라이드 장착 박편을 커버슬립하였다. 1차 항체 없이 처리한 인접한 박편은 배경 신호를 나타내는 음성 대조군으로서 작용하였다. 더 양호한 해부학적 동정을 위해 대안의 절편을 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다.
이미지를 캡처하고 나서, ZEN 소프트웨어를 이용하는 제이스(Zeiss) LSM-710 공초점 현미경(뉴욕주 쏜 우드에 소재한 카를 제이스(Carl Zeiss)) 또는 올림푸스 FV1000 공초점 현미경(펜실베니아주 센터 밸리에 소재한 올림푸스(Olympus)) 중 하나를 이용하여 분석하였다. 신경 섬유의 정량적 분석을 위해 이마리스(Imaris)(등록상표)(코네티컷주 사우스 윈저에 소재한 비트플렌(Bitplane)) 소프트웨어를 이용하였다. 신경 섬유 유형을 그들의 형태 및 신경화학에 기반하여 동정하였다.
래트 방광에서, SNAP25에 대한 SMI-81R 항체는 배뇨근 전체적으로 신경 섬유에서의 IR-신호를 나타내었다. SNAP25-IR 패턴은 예상한 바와 같이 오나보툴리눔독소 A와 식염수-처리 방광 둘 다에서 동일하였다(도 5A, 도 5F). SNAP25의 무손상 형태와 BoNT/A-절단된 형태를 둘 다 인식하는 것으로 보고된 MC-6050 단클론성 항체는 웨스턴 블롯 분석으로부터의 결과와 비슷하게, 독소-처리되었지만, 식염수-처리되지 않은 방광의 배뇨근으로부터의 신경섬유에서 IR-신호를 보였다(도 5B, 도 5G). 마찬가지로, MC-6053 단클론성 항체는 독소-처리 방광에서만 IR-신호를 보였지만, 그러나 식염수-처리 방광은 그렇지 않았다(도 5C, 도 5H). WB 분석에서 검출된 특이성과 대조적으로, SNAP25197에 대해 생성된 RGT-1092 pAb는 독소-처리 방광과 식염수-처리 방광 둘 다에서 IR 신호를 보였다(도 5E, 도 5J). 가장 중요하게는, Ab632-rMAb는 독소-처리 방광의 배뇨근으로부터의 신경섬유에서 선명한 IR-신호를 나타내었지만(도 5D), 신호는 식염수-처리 대조군 방광에서 검출되지 않았다(도 5I). 게다가, 별도의 연구에서, Ab635-rMAb는 래트 방광에서 SNAP25197에 대해 Ab632-rMAb와 유사한 특이성을 나타내었다(도 8M, 도 8R)).
래트 평활 피부에서, SMI-81R 항체가 (피부 영역 중에서) 혈관 주위의 신경 섬유에서 IR-신호를 나타내었다. 이 연구에 대해 예상한 바와 같이, SNAP25-IR 패턴은 오나보툴리눔독소 A와 식염수-처리 피부 둘 다에서 동일하였다(도 6A, 도 6F). MC-6050 단클론성 항체는 주로 독소-처리 피부로부터의 신경 섬유에서 IR-신호를 나타내었다. 그러나, 약간의 IR-신호는 또한 식염수-처리 피부로부터의 신경 섬유에서 분명하였다(도 6B, 도 6G). MC-6050 항체는 또한 혈관 내강에서 강한 IR-신호를 나타내었다(도 6B, 도 6G). 그러나 이 특정 IR-신호가 다른 SNAP25 항체에 의해 결코 보여진 적이 없었기 때문에, 이는 비 특이적인 것으로 결정하였다. 유사하게, MC-6053 단클론성 항체는 독소와 식염수-처리 피부 둘 다로부터의 혈관 주위의 신경 섬유에서 IR-특이적 신호뿐만 아니라, 혈관 내강에서 비특이적 신호를 나타내었다(도 6C, 도 6H). 다시 한번, SNAP25197에 대해 생성된 RGT-1092 pAb가 독소처리와 식염수 처리 래트 피부 둘 다에서 IR-신호를 보였는데(도 6E, 도 6J), 이는 WB 분석에서 그의 특이성에도 불구하고, 이 항체가 IHC를 잘 받아들이지 않는다는 것을 시사한다. 분명하게 대조적으로, Ab632-rMAb는 독소-처리에서만 신경 섬유에서 IR-신호를 나타내었지만, 식염수-처리 피부에서는 그렇지 않았는데(도 6D, 도 6I) 이는 그의 최고의 특이성을 뒷받침한다.
래트 평활 피부의 본 발명자들의 샘플은 종종 밑에 있는 골격근을 포함하는데, 이는 운동 신경 말단(MNT) 내에서 BoNT/A-절단된 SNAP25를 인식하는 그들의 능력에 대해 본 발명자들의 rMAb를 입증하기 위한 우수한 기회를 제공한다. 항체 특이성에 대한 유사한 결과를 다른 피부 신경 섬유 유형에서와 같이 MNT에서 관찰하였다(도 7). SMI-81R mAb는 MNT 및 액손에서 SNAP25의 전장과 BoNT/A-절단된 형태를 둘 다 인식하였지만, 상업적 mAb, MC-6050 및 MC-6053은 독소-처리 피부로부터의 신경 섬유에서 주로 IR-신호를 입증하였다. 그러나, 비특이적 IR-신호는 또한 이들 상업적 mAb에 대한 식염수 처리 조직에서 관찰되었다(도 7F, 도 7G). 대조적으로, Ab632-rMAb는 독소-처리에서만 MNT 및 액손에서 IR-신호를 나타내었지만, 식염수-처리 피부에서는 그렇지 않았다(도 7D, 도 7H).
조직 내 SNAP25197에 대한 Ab632-rMAb의 우수한 특이성을 추가로 예시하기 위해, 본 발명자들은 Ab632 및 Ab635의 면역 반응성 신호를 인간 rMAb의 초기 배취 로트와 비교하였고(5/02/2011), 본래의 천연 3C1A5 mAb를 보톡스(등록상표)에 대한 엘러간의 세포 기반 효능 분석을 위해 사용한 복수 및 2E2A6(Ab507) mAb로부터 정제하였다(Fernandez-Salas, E., Wang, J., Molina, Y., Nelson, J.B., Jacky, B.P., and Aoki, K.R., 2012. Botulinum neurotoxin serotype A specific cell-based potency assay to replace the mouse bioassay. PLoS.One. 7, e49516). 이들 항체에 대한 IR 신호를 오나보툴리눔독소 A에 의한 처리 후 래트 평활 피부 및 방광 조직에서 비교하였다.
래트 평활 피부에서, Ab632와 Ab635는 보톡스(등록상표) 처리 후 둘 다 혈관 주위의 신경 섬유 및 다른 면적(데이터 미제시)에서 SNAP25197에 대해 강한 IR-신호를 나타내었지만(도 8B, 도 8C), 이 IR-신호는 비히클-처리 대조군으로부터의 신경 섬유에서 없었다(도 8G, 도 8H). 유사하게, 인간 rMAb의 더 오래되고 덜 정련된 배취는 독소 처리 후 피부 신경 세포에서 양호한 IR-신호를 나타내었지만(도 8A), 식염수-처리 대조군에서 그렇지 않았다(도 8F). 대조적으로, SNAP25197에 대한 특이적 IR-신호는 천연 3C1A5 mAb 또는 Ab507 mAb 중 하나를 이용하여 독소 처리된 피부 신경 섬유에서 검출되지 않았다(도 8D, 도 8E).
보톡스(등록상표) 처리 후 래트 방광에서 비슷한 결과를 입증하였다. 모두 3종의 rMAb(Ab632, Ab635 및 더 오래된 인간 배취 로트)는 방광의 배뇨근 전체적으로 신경 섬유에서 SNAP25197에 대해 특이적인 IR-신호를 나타내었다(도 8K, 도 8L, 도 8M). 천연 3C1A5 mAb를 지니는 래트 방광 신경 섬유에서 특이적 IR-신호를 또한 관찰하였다(도 8O). 그러나, 래트 평활 피부에서와 같이, 특이적 SNAP25197 IR-신호가 Ab507 mAb를 이용하여 독소-처리 방광에서 검출되지 않았는데(도 8N), 이를 보톡스(등록상표)에 대한 엘러간 세포 기반 효능 분석에서 사용한다. IR-신호는 이용한 임의의 항체에 의해 비히클-처리 대조군 래트 방광에서 검출되지 않았다(도 8P 내지 도 8T).
도 5는 오나보툴리눔독소 A(10U/㎏) 또는 비히클 중 하나로 처리 후 래트 방광 박편에서 SNAP25에 대한 항체 특이성을 비교하는 면역조직학적 분석을 나타낸다. (A 내지 E) 오나보툴리눔독소 A로 주사하고, (A) 전장(206) 및 절단된(197) SNAP25에 대한 상업적 mAb(SMI-81R), (B) SNAP25197 및 SNAP25206에 대한 제2의 상업적 mAb(MC-6050), (C) SNAP25197에 대한 상업적 mAb(MC-6053), (D) SNAP25197에 대한 Ab632-rMAb 및 (E) SNAP25197에 대한 RGT-1092 pAb로 프로빙한 방광 배뇨근(DM)의 공초점 이미지. (F 내지 J) 비히클로 주사하고 동일한 5개 항체로 프로빙한 대조군 래트 방광의 공초점 이미지. 화살표(F 및 J)는 비히클 처리 래트 방광으로부터의 신경 섬유 내에서 IR-신호를 나타낸다. DM, 배뇨근; 축척 바 = 50㎛.
도 6은 오나보툴리눔독소 A(30U/㎏) 또는 비히클 중 하나로 처리 후 래트 평활 피부 박편에서 SNAP25에 대한 항체 특이성을 비교하는 면역조직학적 분석을 나타낸다. (A 내지 E) 오나보툴리눔독소 A로 주사하고, (A) 전장(206) 및 절단된 (197) SNAP25에 대한 상업적 mAb(SMI-81R), (B) SNAP25197 및 SNAP25206에 대한 제2의 상업적 mAb(MC-6050), (C) SNAP25197에 대한 상업적 mAb(MC-6053), (D) SNAP25197에 대한 Ab632-rMAb 및 (E) SNAP25197에 대한 RGT-1092 pAb로 프로빙한 래트 피부의 공초점 이미지. (F 내지 J) 비히클로 주사하고 동일한 5개 항체로 프로빙한 대조군 래트 피부의 공초점 이미지. 화살표(F, G, H 및 J)는 비히클 처리 래트 피부로부터의 신경 섬유 내에서 IR-신호를 나타낸다. 별표(B, C, G 및 H)는 혈관의 내강 내에서 비특이적 IR-신호를 나타낸다. BV, 혈관; CT, 결합조직; 축척 바 = 50㎛.
도 7은 오나보툴리눔독소 A(30U/㎏) 또는 비히클 중 하나로 처리 후 래트 평활 피부 밑에 있는 골격근에서 SNAP25에 대한 항체 특이성을 비교하는 면역조직학적 분석을 나타낸다. (A 내지 D) 오나보툴리눔독소 A를 주사하고 (A) 전장(206) 및 절단된(197) SNAP25에 대한 상업적 mAb(SMI-81R); (B) SNAP25197 및 SNAP25206에 대한 제2의 상업적 mAb (MC-6050); (C) SNAP25197에 대한 상업적 mAb(MC-6053) 및 (D) SNAP25197에 대한 Ab632-rMAb로 프로빙한 래트발 밑에 있는 근육 내에서 운동 신경 말단(MNT, 화살표)을 나타내는 공초점 이미지; (E 내지 H) 비히클을 주사하고 동일한 4종의 항체로 프로빙한 대조군 래트 발로부터의 공초점 이미지. SNAP25-IR 신호는 녹색이고(흑백도면에서 회색으로서 나타냄), DIC 조명을 사용하여 밑에 있는 근섬유(MF)를 묘사하였다. 화살표(E)는 비히클 처리 래트 발로부터의 MNT 내의 IR-신호를 나타내고; 별표(B, C, F 및 G)는 근육 내에서 비특이적 IR-신호를 나타낸다. 축척 바 = 50㎛.
도 8은 보톡스(등록상표) 또는 비히클로 처리 후 래트 평활 피부(A 내지 J) 및 래트 방광(K 내지 T)의 박편에서 다양한 SNAP25197-특이적 항체의 특이성을 비교하는 면역조직화학적 분석을 도시한 도면. (A 내지 E) 보톡스(등록상표) 주사 후 래트 피부의 공초점 이미지는 모든 rMAb를 지니는 혈관 주위의 신경 섬유에서 SNAP25197에 대한 IR-신호를 나타낸다(오래된 배취 및 새로운 배취, 화살표). 2E2A6 클론(Ab507)과 3C1A5 복수 항체는 둘 다 이 조직에서 임의의 SNAP25197 신호를 검출하지 못하였다. (F 내지 J) 비히클-처리 대조군에서, SNAP25-IR은 임의의 항체에 의해 검출되지 않는다. (K 내지 O) SNAP25197-IR 신호는 2E2A6 클론을 제외한 모든 항체와 함께 보톡스(등록상표) 처리 후 래트 방광에서 배뇨근을 통한 신경 섬유 코싱(coursing)에서 검출된다(화살표). (P 내지 T) 비히클-처리 대조군에서, SNAP25197-IR은 임의의 항체에 의해 검출되지 않는다. BV, 혈관; CT, 결합조직; SM, 평활근.
실시예 3. 면역조직화학적 비교-인간 조직
SNAP25에 대한 상업적으로 입수 가능한 항체 중에서, SNAP25197을 표적화하는 MC-6053 단클론성 항체는 항체의 유형 및 종에 대해 본 발명자들의 뮤린 Ab635-rMAb와 가장 유사하다(표 1). 따라서 본 발명자들은 오나보툴리눔독소 A 및 식염수-처리 인간 등 피부의 생검 샘플에서 본 발명자들의 Ab635-rMAb와 MC-6053 mAb 사이의 SNAP25-IR 발현 패턴의 접전 비교를 수행하였다. 이는 마우스 항체를 이용하는 인간 조직의 프로브이기 때문에, 비특이적 IR 신호가(공급원과 상관없이) 최소인 것으로 추정되었다.
인간 피부 생검 샘플은 1상 앨러간 임상 연구를 통해 얻었다. 임상시험 실시기준 및 모든 적절한 지역 및 국가 프라이버시 가이드라인에 대한 안내 및 규제에 따라 연구를 수행하였다. 연구 프로토콜, 사전동의 및 모든 적절한 연구 관련 서류를 임상시험심사위원회/윤리 위원회(Institutional Review Board/Ethics Committee)에 의해 승인받았다.
성인 인간 등 피부에 10 U의 오나보툴리눔독소 A 또는 비히클을 이용하여 ID 주사하였다. 등 피부로부터의 펀치 생검 샘플을 처리 후 14일에 채취하고 나서, 동일한 정착액 중에서 밤새 고정시켰다. 조직을 세척하고 나서, 4℃에서 밤새 30% 수크로스/PBS 용액 중에서 동결보호시켰다. 피부 샘플을 중앙선을 따라 반으로 자르고 나서, O.C.T에서 포매시켰다. O.C.T(티슈-테크)에서 포매시키고 나서, 박편화까지 -80℃에서 냉동저장시켰다. 조직 블록을 초저온-박편화(14㎛-두께)하고 나서, 슬라이드-장착하고, 슬라이드를 사용까지 -20℃에서 유지시켰다. IHC 및 데이터 분석을 상기 약술한 바와 같이 수행하였다.
인간 등 피부에서, 항체 둘 다에 대한 IR-신호를 피부 내의 혈관 및 땀샘 주위에서 관찰하였다(도 9). MC-6053 mAb에 대한 IR-신호를 오나보툴리눔독소 A와 식염수-처리 등 피부로부터의 신경 섬유에서 관찰하였다. 상당히 대조적으로, 본 발명자들의 뮤린 Ab635-rMAb에 대한 IR-신호를 오나보툴리눔독소 A-처리로부터의 신경 섬유에서만 관찰하였지만, 식염수-처리 인간 등 피부에서는 관찰되지 않았는데(도 9), 이는 임상 진단 도구로서 그의 우수한 특이성 및 더 중요하게는 그의 효용을 입증한다.
도 9는 오나보툴리눔독소 A(10U) 또는 비히클 중 하나로 처리 후 인간 등 피부의 박편에서 SNAP25197 대 Ab635-rMAb에 대한 상업적으로 입수가능한 (MC-6053) mAb의 면역조직화학적 비교를 나타낸다. (A, E) MC-6053 mAb 또는 (B, F) Ab635-rMAb 중 하나로 프로빙한 오나보툴리눔독소 A(A, B) 및 비히클-처리(E, F) 인간 피부에서 혈관의 공초점 이미지. (C, G) MC-6053 mAb 또는 (D, H) Ab635-rMAb 중 하나로 프로빙한 오나보툴리눔독소 A(C, D) 및 비히클-처리(G, H) 인간 피부에서의 땀샘. 화살표는 비히클 처리 인간 피부로부터의 신경 섬유 내의 IR 신호를 나타낸다. BV, 혈관; CT, 결합조직; SG, 땀샘; 축척 바 = 50㎛.
세포 내에서 BoNT/A 위치 및 이동을 검출함에 있어서의 어려움을 고려하면, 사유화된 재조합 인간화 α-SNAP25197 및 사유화된 재조합 뮤린 α-SNAP25197을 다른 종에서의 SNAP25197을 교차 검출하는데 사용할 수 있다. 다른 α-SNAP25 항체를 검출할 수 있지만, 인간 조직에서 SNAP25197을 검출하기 위해 재조합 뮤린 α-SNAP25197을 이용하는 것 또는 뮤린에서 SNAP25197을 검출하기 위해 재조합 인간화된 α-SNAP25197을 이용하는 것은 다른 허용가능한 항체에 의해 가능하지 않은 BoNT/A 작용 메커니즘의 심층적 분석을 허용한다.
실시예 4. 면역세포화학적 비교
일부 항체는 다른 항체 이상으로 하나의 분석/적응증에 대해 더 양호하게 작용할 수 있다. 따라서, 본 발명자들의 분석과 경쟁하기 위해, 본 발명자들은 BoNT/A(3nM) 또는 식염수 중 하나로 처리한 DRG 세포 배양물에서의 몇몇 항체로부터의 IR-신호와 비교하였다.
DRG 세포 배양물을 준비하고 나서, 상기 약술한 바와 같이 처리하였다. 면역세포화학 및 데이터 분석을 상기 상술한 바와 같이 수행하였다.
조직에서와 같이, SMI-81R 항체는 BoNT/A와 식염수-처리 배양물 둘 다에서 강한 IR-신호를 나타내었다(도 10A, 도 10D). MC-6053 상업적으로 입수 가능한 mAb와 본 발명자들의 인간 Ab632-rMAb는 둘 다 BoNT/A-처리 배양물로부터의 뉴런 세포에서 특이적 SNAP25197-IR 신호를 입증하였다(도 10B, 도 10C). 식염수-처리 배양물에서 신호는 검출되지 않았다(도 10E, 도 10F). 그러나, MC-6053 mAb는 식염수-처리 배양물에서 뉴런 체세포 이상으로 희미한 배경 신호를 나타내었다(도 10E).
도 10은 상이한 형태의 SNAP25에 대한 항체로 프로빙한 BoNT/A(3nM)- 또는 비히클-처리 배근 신경절(DRG) 배양물의 공초점 이미지를 도시한 도면. (A 내지 C) BoNT/A에 대해 3시간 동안 노출되고, 이후에 (A) 전장(206) 및 절단된(197) SNAP25에 대한 상업적 (SMI-81R) mAb, (B) SNAP25197에 대한 상업적(MC-6053) mAb 및 (C) SNAP25197에 대한 Ab632-rMAb로 염색된 DRG 배양물. (D 내지 F) 비히클에 노출되고, 동일한 3개 항체로 프로빙한 대조군 DRG 배양물. E의 화살촉은 배경 표지를 나타내는 뉴런 체세포를 나타낸다.
SNAP25를 발현시키는 세포에서 활성 BoNT/A의 존재는 종종 절단된 기질(SNAP25197)에 대한 선택적 항체를 이용함으로써 결정될 수 있다. 본 연구에서, 본 발명자들은 SNAP25197에 대해 자체 개발된 몇몇 rMAb를 도입하고, 상이한 방법을 이용하여 상이한 항체에 대한 그들의 면역 반응 신호와 비교하였다(표 3). 본 발명자들의 인간 및 뮤린 rMAb는 둘 다 모든 분석에서 그리고 상이한 조직 상에서 SNAP25197을 지속적으로 검출하였고, 예상한 바와 같이 전장 SNAP25(SNAP25206)를 검출하지 않았다. 이는 다르게 알려진 대로의, 가변적 분석-의존적 특이성을 나타낸 SNAP25197-선택적 항체에 의한 경우가 아니었다. 이들 결과는 BoNT/A-절단된 SNAP25 에피토프가 무손상 SNAP25 단백질을 또한 인식하는 일 없이 항체에 의해 특이적으로 표적화하는 것이 어려운데, 적절한 대조군이 제자리에 있지 않다면 결과의 잠재적 오해를 야기할 수 있다는 것을 확인한다. 따라서, 임의의 주어진 SNAP25197 항체는 BoNT/A-절단된 SNAP25의 존재를 검출함에 있어서 그의 정확도를 보장하기 위해 다수의 조건 및 조직 유형 하에서 시험하여야 한다.
부위-특이적 항체는 시험관내와 생체내 분석 둘 다에 대해 점점 더 증가된다. 이들 항체는 인산화 부위 또는 효소적 절단 부위를 검출할 수 있고, 단백질의 성숙, 활성 및 분해의 본 발명자들의 이해를 위한 매우 유용한 도구이다(Mort, J.S. and Buttle, D.J., 1999. The use of cleavage site specific antibodies to delineate protein processing and breakdown pathways. Mol.Pathol. 52, 11-18.; Mort, J.S., Flannery, C.R., Makkerh, J., Krupa, J.C., and Lee, E.R., 2003. Use of anti-neoepitope antibodies for the analysis of degradative events in cartilage and the molecular basis for neoepitope specificity. Biochem.Soc.Symp. 107-114.; Nagata, K., Izawa, I., and Inagaki, M., 2001. A decade of site- and phosphorylation state-specific antibodies: recent advances in studies of spatiotemporal protein phosphorylation. Genes Cells 6, 653-664). 보툴리눔균 신경독소 분야 내에서, 절단 부위-특이적 항체는 다르게는 인식이 매우 어려울 수 있는 BoNT 경쇄의 미량(minute quantity)의 활성을 검출하게 할 수 있다. 이를 위하여, 혼합된 면역글로불린 집단이 생성될 수 있었기 때문에 다클론성 항체의 사용은 제한된 가치를 가질 수 있는데, 이들 중 모두가 절단된 에피토프에 대해 필요한 특이성을 갖지는 않는다(Mort, J.S. and Buttle, D.J., 1999. The use of cleavage site specific antibodies to delineate protein processing and breakdown pathways. Mol.Pathol. 52, 11-18). 더 나아가, 펩타이드 항원은 표적 에피토프로부터 멀리 떨어진 서열의 부분에 결합하는 항체를 생성할 가능성을 감소시키기 위해 상대적으로 짧아야 한다.
현재의 연구에 제시된 항-SNAP25197 mAb는 IHC 분석에서 그의 우수한 성능에 대해 처음에 선별하고 선택하였다. 이 항체로부터 후속적으로 생성된 rMAb(Ab632 및 Ab635)는 IHC를 포함하는 몇몇 상이한 분석에서 BoNT/A-절단된 SNAP25에 대해 우수한 특이성을 입증하였다. 더 나아가, 이들 rMAb는 시험한 다른 항체에 비해 우수한 SNAP25197 특이성을 나타내었다(표 3). 따라서, 본 발명자들의 rMAb는 세포 내에서 그리고 임상 샘플에서 BoNT/A 활성의 검출을 위한 효과적인 새로운 도구를 나타내며, 관심 대상의 조직에서 BoNT/A의 효능을 특성규명하기 위한 장래의 연구에서 이용될 것이다. 이들 항체에 대한 구체적 서열은 상기 표 2에 제시된다.
전반적으로, 웨스턴 블롯 분석, 조직에 대한 면역조직화학 및 세포에 대한 면역세포화학에서 시험한 항체는 BoNT/A 절단된 SNAP25(SNAP25197) 및 비절단 SNAP25(SNAP25206)에 대해 다양한 특이성을 나타내었다. 결과의 요약을 이하의 표 3에 나타낸다.
전장 SNAP25 (206) 또는 BoNT /A-절단된 SNAP25 (197)에 대한 항체 특이성의 요약된 결과.
항체 특이성 웨스턴 블롯 래트 방광 래트 피부 인간 피부 래트 DRG 배양물
SMI-81R SNAP25206 /197 206 + 197 206 + 197 206 + 197 n/t 206 + 197
MC-6050 SNAP25206 /197 197 197 206 + 197 + b n/t n/t
MC-6053 SNAP25197 197 197 206 + 197 + b 206 + 197 197 + b
Ab632 SNAP25197 197 197 197 n/t 197
Ab635 SNAP25197 197 197 n/t 197 n/t
RGT-1092 SNAP25197 197 206 + 197 206 + 197 n/t n/t
n/t = 시험하지 않음; b = 배경
본 명세서에 기재된 실시예 및 실시형태는 단지 예시적 목적을 위한 것이며, 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제안될 것이고, 본 출원의 정신 및 범위 내에 포함될 것으로 이해된다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개개 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참고로 포함되는 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> ALLERGAN, INC. <120> METHOD OF DETECTING CLEAVED SNAP25 IN TISSUE SAMPLES <130> WO/2016/007508 <140> PCT/US2015/039372 <141> 2015-07-07 <150> US 62/021,378 <151> 2014-07-07 <150> US 62/158,900 <151> 2014-05-08 <150> US 62/163,829 <151> 2014-05-19 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 219 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 1 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Thr 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Thr Trp Leu Ile Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser 85 90 95 Ser His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 180 185 190 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 195 200 205 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 2 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Thr 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Thr Trp Leu Ile Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser 85 90 95 Ser His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 3 <211> 436 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 3 Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Leu Phe Pro Gly Asn Gly Asn Phe Glu Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Tyr Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Lys Arg Met Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala 115 120 125 Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 130 135 140 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 145 150 155 160 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Glu Ser Asp Leu Tyr Thr Leu 165 170 175 Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val 180 185 190 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 195 200 205 Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro 210 215 220 Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu 225 230 235 240 Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser 245 250 255 Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu 260 265 270 Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 275 280 285 Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn 290 295 300 Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro 305 310 315 320 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln 325 330 335 Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val 340 345 350 Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val 355 360 365 Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln 370 375 380 Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn 385 390 395 400 Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val 405 410 415 Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His 420 425 430 Ser Pro Gly Lys 435 <210> 4 <211> 112 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 4 Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Leu Phe Pro Gly Asn Gly Asn Phe Glu Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Tyr Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Lys Arg Met Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 5 <211> 219 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Thr 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Thr Trp Leu Ile Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser 85 90 95 Ser His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 6 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Thr 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Thr Trp Leu Ile Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser 85 90 95 Ser His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 7 <211> 442 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Leu Phe Pro Gly Asn Gly Asn Phe Glu Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Tyr Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Lys Arg Met Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 115 120 125 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 130 135 140 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 145 150 155 160 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 180 185 190 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 195 200 205 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 340 345 350 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Leu Phe Pro Gly Asn Gly Asn Phe Glu Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Tyr Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Lys Arg Met Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 9 Asp Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln 1 5 10

Claims (11)

  1. 항-SNAP25 항체로서, BoNT/A 절단된 SNAP25에 우선적으로 결합하는, 항-SNAP25 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체는 전장 SNAP25에 결합하지 않는, 항-SNAP25 항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체는 조직 내에서 BoNT/A 절단된 SNAP25에 우선적으로 결합할 수 있는, 항-SNAP25 항체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 조직은 생검 샘플인, 항-SNAP25 항체.
  5. 항-SNAP25 항체로서, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 경쇄 서열을 포함하고, 재조합 뮤린 항체인, 항-SNAP25 항체.
  6. 항-SNAP25 항체로서, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 중쇄 서열을 포함하고, 재조합 뮤린 항체인, 항-SNAP25 항체.
  7. 항-SNAP25 항체로서, 서열번호 5 또는 서열번호 6의 경쇄 서열을 포함하고, 재조합 인간 항체인, 항-SNAP25 항체.
  8. 항-SNAP25 항체로서, 서열번호 7 또는 서열번호 8의 중쇄 서열을 포함하고, 재조합 인간 항체인, 항-SNAP25 항체.
  9. 항-SNAP25 항체로서, 서열번호 1 내지 8 중 하나 이상의 서열을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄를 지니는 항체의 동일한 에피토프에 결합하는, 항-SNAP25 항체.
  10. 조직이 BoNT/A 효소적 활성에 노출되었는지의 여부를 진단하는 방법으로서, BoNT/A 효소적 활성에 노출된 것으로 의심되는 조직 샘플을 항-SNAP25 항체와 접촉시키는 단계로서, 상기 항체가 BoNT/A 절단된 SNAP25에 우선적으로 결합하는, 상기 접촉시키는 단계; 및 상기 항-SNAP25 항체가 상기 조직 샘플에 결합되는지의 여부를 검출하는 단계로서, 상기 조직 샘플에 대한 상기 항-SNAP25 항체 결합의 존재는 상기 조직 샘플이 BoNT/A 활성에 노출되었음을 나타내는, 상기 검출하는 단계를 포함하는, 조직이 BoNT/A 효소적 활성에 노출되었는지의 여부를 진단하는 방법.
  11. 조직이 항-SNAP25 항체를 포함하는 BoNT/A 효소적 활성에 노출되었는지의 여부를 진단하기 위한 키트로서, 상기 항체는 BoNT/A 절단된 SNAP25에 우선적으로 결합하는, 조직이 항-SNAP25 항체를 포함하는 BoNT/A 효소적 활성에 노출되었는지의 여부를 진단하기 위한 키트.
KR1020177003275A 2014-07-07 2015-07-07 조직 샘플에서 절단된 snap25를 검출하는 방법 KR20170026624A (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462021379P 2014-07-07 2014-07-07
US62/021,379 2014-07-07
US201562158900P 2015-05-08 2015-05-08
US62/158,900 2015-05-08
US201562163829P 2015-05-19 2015-05-19
US62/163,829 2015-05-19
PCT/US2015/039372 WO2016007508A1 (en) 2014-07-07 2015-07-07 Method of detecting cleaved snap25 in tissue samples

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20170026624A true KR20170026624A (ko) 2017-03-08

Family

ID=55016834

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177003275A KR20170026624A (ko) 2014-07-07 2015-07-07 조직 샘플에서 절단된 snap25를 검출하는 방법

Country Status (6)

Country Link
US (2) US10527620B2 (ko)
EP (2) EP3166971B1 (ko)
JP (1) JP6630717B2 (ko)
KR (1) KR20170026624A (ko)
CN (1) CN107001451A (ko)
CA (1) CA2954504A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101983216B1 (ko) * 2018-11-29 2019-05-29 주식회사 에이비바이오 보툴리눔 독소 활성을 결정하기 위한 항체, 및 이를 이용한 활성 측정방법
WO2020111449A1 (ko) * 2018-11-29 2020-06-04 주식회사 에이비바이오 보툴리눔 독소 활성을 결정하는 세포 기반 방법

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUE046037T2 (hu) * 2008-03-14 2020-01-28 Allergan Inc Immun-alapú, A szerotípusú botulinum toxin aktivitás vizsgálati eljárások
WO2022043924A1 (en) * 2020-08-28 2022-03-03 Galderma Holding SA Novel x-aptamers for the use in detection of snap25

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5962637A (en) 1994-06-03 1999-10-05 Microbiological Research Authority Toxin assay
GB9411138D0 (en) 1994-06-03 1994-07-27 Microbiological Res Authority Toxin assay
GB9508204D0 (en) 1995-04-21 1995-06-07 Speywood Lab Ltd A novel agent able to modify peripheral afferent function
US20040219619A1 (en) 2000-07-21 2004-11-04 Ester Fernandez-Salas Methods of identifying compounds that alter toxin persistence and/or protease activity
WO2003011902A1 (en) * 2001-07-27 2003-02-13 Kenton S.R.L. Identification of specific tumour antigens by selection of cdna libraries with sera
US7332567B2 (en) 2001-08-28 2008-02-19 Allergan, Inc. Fret protease assays for clostridial toxins
US7208285B2 (en) 2001-08-28 2007-04-24 Allergan, Inc. Fret protease assays for botulinum serotype A/E toxins
US7183066B2 (en) 2002-09-27 2007-02-27 Allergan, Inc. Cell-based fluorescence resonance energy transfer (FRET) assays for clostridial toxins
ATE533853T1 (de) 2004-02-24 2011-12-15 Allergan Inc Botulinumtoxin-screening-assays
US7399607B2 (en) 2004-09-22 2008-07-15 Allergan, Inc. Fluorescence polarization assays for determining clostridial toxin activity
WO2006042149A2 (en) 2004-10-06 2006-04-20 Allergan, Inc. Determining and reducing immunoresistance to botulinum toxin therapy using botulinum toxin a peptides
DE602006014812D1 (de) 2005-04-05 2010-07-22 Allergan Inc Lostridientoxinaktivität
US20100227868A1 (en) 2007-09-20 2010-09-09 Johnson Brent A Treatment methods with brimonidine
HUE046037T2 (hu) 2008-03-14 2020-01-28 Allergan Inc Immun-alapú, A szerotípusú botulinum toxin aktivitás vizsgálati eljárások
KR101604515B1 (ko) * 2008-03-14 2016-03-17 알러간, 인코포레이티드 면역-기반 보툴리눔 독소 세로타입 ａ 활성 검정
CN102439138B (zh) 2009-03-13 2018-03-30 阿勒根公司 可用于基于免疫的肉毒杆菌毒素血清a型活性测定的细胞
JP5826635B2 (ja) * 2009-03-13 2015-12-02 アラーガン、インコーポレイテッドＡｌｌｅｒｇａｎ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ 免疫系調節エンドペプチターゼ活性アッセイ
EP2470169A4 (en) * 2009-08-25 2013-03-13 Berg Pharma Llc METHOD OF TREATING A SARCOME USING AN EPIMETABLIC SHIFTER (COENZYM Q10)
CN105683212B (zh) * 2013-08-21 2020-03-17 香港理工大学 高催化活性的基因改造梭菌属神经毒素

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101983216B1 (ko) * 2018-11-29 2019-05-29 주식회사 에이비바이오 보툴리눔 독소 활성을 결정하기 위한 항체, 및 이를 이용한 활성 측정방법
WO2020111449A1 (ko) * 2018-11-29 2020-06-04 주식회사 에이비바이오 보툴리눔 독소 활성을 결정하는 세포 기반 방법
US10823725B2 (en) 2018-11-29 2020-11-03 Hugel, Inc. Cell-based method for determining an activity of botulinum toxin
US10866232B2 (en) 2018-11-29 2020-12-15 Hugel, Inc. Cell-based method for determining an activity of botulinum toxin
US10908148B2 (en) 2018-11-29 2021-02-02 Hugel, Inc. Cell-based method for determining an activity of botulinum toxin
US11169144B2 (en) 2018-11-29 2021-11-09 Hugel, Inc. Cell-based method for determining an activity of botulinum toxin
US11360081B2 (en) 2018-11-29 2022-06-14 Hugel Inc. Cell-based method for determining an activity of botulinum toxin

Also Published As

Publication number Publication date
JP6630717B2 (ja) 2020-01-15
US20190317095A1 (en) 2019-10-17
JP2017524689A (ja) 2017-08-31
US20160003824A1 (en) 2016-01-07
EP3567055A1 (en) 2019-11-13
EP3166971A1 (en) 2017-05-17
CA2954504A1 (en) 2016-01-14
CN107001451A (zh) 2017-08-01
US10527620B2 (en) 2020-01-07
EP3166971B1 (en) 2019-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220113310A1 (en) Cellular vamp cleavage assay
US20190317095A1 (en) Method of detecting cleaved snap25 in tissue samples
ES2440597T3 (es) Ensayos de actividad de endopeptidasa re-dirigida basados en inmunología
RU2673910C2 (ru) Способ производства протеолитически процессированного полипептида
BR122012027456A2 (pt) Composição farmacêutica compreendendo sorotipo de neurotoxina botulínica a
US11360081B2 (en) Cell-based method for determining an activity of botulinum toxin
KR20170092583A (ko) 세포에서 BoNT/E의 생물학적 활성의 결정을 위한 수단 및 방법
KR101983216B1 (ko) 보툴리눔 독소 활성을 결정하기 위한 항체, 및 이를 이용한 활성 측정방법
WO2016007508A1 (en) Method of detecting cleaved snap25 in tissue samples
JPH09194502A (ja) 新規コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、そのコア蛋白質、それをコードするｄｎａおよびそれに対する抗体
KR20120005891A (ko) 유비퀴틴 특이적 프로테아제 44（ｕｓｐ４４）의 에피토프 펩타이드 및 이의 이용
RU2803123C2 (ru) Способ определения активности ботулотоксина с использованием клеток
RU2719164C1 (ru) Способы производства протеолитически процессированных полипептидов
RU2807994C2 (ru) Анализ расщепления клеточного vamp
Figiel et al. MMP-9 Signaling Pathways That Engage Rho GTPases in Brain Plasticity. Cells 2021, 10, 166
Wade A novel role for activated leukocyte cell adhesion molecule (ALCAM) in neurotrophin signalling in neurons
Ho et al. Identification and characterization of porcine NP-190, a novel protein that is specifically expressed in the axonal membrane during the embryonic period
WO2002068675A2 (en) Product, method and system for identifying collagenase-cleaved type ii collagen

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application