JPH10504801A - 毒素アッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. ボツリヌス毒素または破傷風毒素についてのアッセイであって以下の工程 : (a) テスト化合物を、基質および抗体と結合させる工程、ここで、該 基質は該毒素に対する切断部位を有し、毒素により切断される場合に生産物を形 成し、ここで該抗体は該生産物には結合するが、該基質には結合しない、工程; および、 (b) 該生産物に結合する抗体の存在をテストする工程、ここで該生産 物は固相アッセイ成分に付着する、工程、 を包含する、アッセイ。 2. 前記毒素が、ボツリヌス毒素である、請求項1に記載のアッセイ。 3. 請求項1〜2のいずれかに記載のアッセイであって、前記基質が前記毒素 により切断され、N-およびC-末端を有する新規のペプチドを生じるペプチドまた はタンパク質である、アッセイ。 4. 請求項3に記載のアッセイであって、前記ペプチド基質が該アッセイの固 相成分に付着する、アッセイ。 5. 以下のアッセイ成分(a)および(b)を利用する、請求項1〜4のいずれかに 記載のアッセイであって: (a) 固相に連結されたペプチド、ここで該ペプチドは切断生産物を生 じるために前記毒素により切断され得、 (b) 該切断生産物には結合するが該ペプチドには結合しない抗体、 そしてここで該アッセイは以下の工程: (i) 該毒素を含み得るまたは該毒素から構成され得るテスト化合物を 、アッセイ混合物を形成するために該固相ペプチドと結合させる工程、 (ii) 該アッセイ混合物を該抗体と連続してまたは同時に結合させる工 程、および (iii) 該抗体と該切断生産物との間に任意のコンジュゲートが形成さ れているかどうかを連続してまたは同時に決定する工程、 を包含する、アッセイ。 6. 請求項5に記載のアッセイであって、ここで前記工程(i)が亜鉛化合物の存 在下で行われる、アッセイ。 7. 請求項6に記載のアッセイであって、ここで前記ペプチドはVAMP、SNAP-25 およびシンタキシンから選択される完全なペプチドまたはそのフラグメントから 選択される、アッセイ。 8. 請求項7に記載のアッセイであって、以下の工程: (i) 前記テスト化合物をVAMP、SNAP-25、シンタキシン、およびそのフ ラグメントから選択されるペプチドを含有する固相と結合させる工程、 (ii) 該固相から該テスト化合物を洗浄する工程、 (iii) 該固相と、毒素により切断されたペプチドと選択的に結合する ように適合された抗体とを結合させる工程、 (iv) 該抗体と切断されたペプチドとのコンジュゲートを検出する工程 、 を包含する、アッセイ。 9. 請求項1〜8のいずれかに記載のアッセイであって、ここで前記抗体が、 配列番号1〜7から選択されるペプチドに選択的に結合するように適合される、ア ッセイ。 10. 請求項7に記載のアッセイであって、以下の工程: (i)固定化ペプチドを含有するアッセイプレートにテスト溶液を加える 工程であって、該ペプチドはVAMP、SNAP-25、シンタキシンおよびそれらのフラ グメントから選択される、工程、 (ii) 該アッセイプレートをインキュベートする工程、 (iii) 該プレートを緩衝液で洗浄する工程、 (iv) 抗体溶液を該プレートに加える工程であって、該溶液は、(1) C- 末端が配列番号1、3、および5から選択されるペプチド、ならびに(2) N-末端が 配列番号2、4、および6から選択されるペプチド、から選択されるペプチドに選 択的に結合するように適合される抗体を含有する、工程、 (v) 該アッセイプレートをインキュベートする工程、 (vi) 該プレートを緩衝液で洗浄する工程、 (vii) 該アッセイプレート上の抗体の存在を測定する工程、 を包含する、アッセイ。 11. 請求項10に記載のアッセイであって、ここで前記抗体は酵素に連結さ れ、そして前記プレート上の抗体の存在が、酵素基質を加えることおよび該基質 の検出可能な生産物への転換を測定することにより測定される、アッセイ。 12. 請求項11に記載のアッセイであって、前記検出可能な生産物が発色し 、そして選択された波長での吸光度により測定される、アッセイ。 13. 前記テスト化合物中に存在する不活性毒素を活性毒素に転換する工程を 包含する、請求項1〜12のいずれかに記載のアッセイ。 14. プロテアーゼを前記テスト化合物に加える工程を包含する、請求項13 に記載のアッセイ。 15. 前記一次抗体に特異的なおよび酵素に連結されたさらなる抗体を用いて 抗体-ペプチドコンジュゲートを検出する工程を包含する、請求項1〜14のい ずれかに記載のアッセイ。 16. 抗体を得る方法であって、該抗体はボツリヌス毒素または破傷風毒素に ついてのアッセイにおいて使用され、該方法は、該毒素により切断生産物へ切断 される高分子を同定する工程、該切断生産物の1つに対して動物を免疫する工程 、該切断生産物の1つに結合する抗体を単離する工程、ならびに該高分子と交差 反応しない抗体を回収する工程を包含する、方法。 17. 請求項16に記載の抗体を得る方法であって、該方法は、以下の工程: (i) 該毒素により切断され、それにより少なくとも第一および第二の 切断生産物を形成する、高分子を同定する工程、 (ii) 選択された該切断生産物の1つで動物を免疫する工程、 (iii) 該選択された切断生産物に結合する抗体を該動物から単離する 工程、ならびに、 (iv) 該高分子に結合しない該抗体をチェックする工程、 を包含する、方法。 18. 請求項17に記載の方法であって、前記高分子がVAMP、SNAP-25、および シンタキシンから選択される、方法。 19. 以下の工程を包含する請求項17に記載の抗体を得る方法であって、以 下の工程: (i) (1)配列番号1〜6;および(2)(1)に連結したキャリア分子から選択 される抗原で動物を免疫する工程、ならびに、 (ii) 該抗原に結合する抗体を動物から単離する工程、 を包含する、方法。 20. キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、およびオボ アルブミンから選択されるキャリアタンパク質に連結された抗原で動物を免疫す る工程を包含する、請求項19に記載の方法。 21. VAMP、SNAP-25、およびシンタキシンから選択されるペプチドには結合し ないが、これらのペプチドの1つの前記毒素による切断生産物に結合することを 特徴とする、請求項1〜15のいずれかに記載のアッセイにおいて使用するため の抗体。 22. 配列番号1〜7から選択されるペプチドに結合するように適合される、請 求項21に記載の抗体。 23. 以下の式の抗原に結合するように適合される、請求項22に記載の抗体 であって: P-Q-X ここで、Xは配列番号1〜7から選択されるペプチドであり、P-Qに一端で共有結合 される、ならびにここで、P-Qは、Pがキャリアタンパク質であり、Qがアミノ酸 またはペプチドXをキャリアPに付着するように適合されるアミノ酸配列であるキ ャリアである、抗体。 24. 固相に固定化された完全なペプチドならびにVAMP、SNAP-25、およびシン タキシンのフラグメントから選択されるペプチドを含有する毒素アッセイの成分 。 25. 請求項24に記載のアッセイ成分であって、前記固相がアッセイプレー ト、アッセイウェル、ニトロセルロースメンブレン、ビーズ、ディップスティッ ク、および溶出カラムの成分から選択される、アッセイ成分。 26. 毒素アッセイキットであって、(1)請求項24〜25のいずれかに記載の アッセイ成分、(2)(a)酵素に連結されるかまたは酵素を含む請求項21〜23の いずれかに記載の抗体、あるいは(b)請求項21〜23のいずれかに記載の一次 抗体、および該一次抗体に結合するように適合され、そして酵素に連結されるか または酵素を含む二次抗体、ならびに(3)該酵素の基質、を含む、毒素アッセイ キット。
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