JP2003507080A - ベータラクタム含有化合物を検出するための方法およびキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 サンプル（典型的には牛乳のようなヒト消費のために意図される液体製品）中のベータラクタム含有化合物を検出するための方法およびキットが開示される。ベータラクタム含有化合物は、牛乳の所望されない混入物として存在し得るベータラクタム抗生物質のクラスを含む。この方法は、サンプルと、Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼおよびカルボキシ末端のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンを有する基質とを接触させて反応混合物を形成する工程を包含し、ここでＤ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼは基質から末端のＤ−アラニンを切断して、切断された基質を生じ得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は該して、ベータラクタム含有化合物を検出するための酵素学的な方法
およびキットに関し、そしてより具体的には、液体サンプル中のベータラクタム
抗生物質の存在を検出するためのバイオセンサーの使用に、およびそれと共に使
用するためのキットに関する。

【０００２】 （発明の背景） 牛乳および関連の乳製品の抗生物質混入は、乳製品製造業において重大な問題
である。このような混入の主な供給源は、ベータラクタム抗生物質（例えば、ペ
ニシリンおよびセファロスポリン）であり、これは乳腺炎または他の感染を処置
するためにウシに投与されている。より一般に、大量の牛乳および関連の乳製品
は、ベータラクタム抗生物質混入に起因して、毎年廃棄され、それによって実質
的な経済的損失を引き起こしている。

【０００３】 液体サンプル中のベータラクタム抗生物質を検出するためのいくつかの公知の
手順、例えば、微生物学的および化学的な技術、高速液体クロマトグラフィー、
ならびに酵素免疫アッセイのような公知の手順がある。例えば、微生物学的（寒
天拡散）技術は、１ミリリットルのサンプル当たり、約０．１〜０．５マイクロ
グラム（すなわち、μｇ／ｍｌ）の抗生物質の検出を可能にするが、このような
技術はどちらかといえば時間がかかりすぎる（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔら、「臨
床標本の抗生物質アッセイのための単純化された正確な方法」、Ａｐｐｌ．Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．１４：１７０−１７７、１９６６；Ｃｏｌｅら、「ヒトにおけ
るペニシリンからペニシリン酸および６−ＡＰＡへの代謝、ならびにペニシリン
吸収をアッセイするにおけるその重要性」、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔ
ｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、３：４６３−４６８、１９７３：およびＳｐｙｋｅｒ
ら、「アモキシシリンの薬物動態学：静脈内、経口、および筋肉内投与後の用量
依存性」、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、１１：
１３２−１４１、１９７７を参照のこと）。化学的手順は一般に、いくらかより
速いが、典型的に感度が非常に小さい（例えば、Ｍａｒｅｌｌｉ、Ｌ．Ｐ．、「
セファロスポリンについての分析的手順」Ｅ．Ｈ．Ｆｌｙｎｎ（編）、Ｃｅｐｈ
ａｌｏｓｐｏｒｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７２、６０９−６３５頁を参照の
こと）。高速液体クロマトグラフィーは、血清および尿中のアモキシシリンおよ
びアンピシリン（例えば、Ｖｒｅｅら、「高速液体クロマトグラフィーの手段に
よるヒトの体液中のアモキシシリン（クラモキシル）およびアンピシリン（ペン
ブリチン）の迅速な測定」、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１４５：４９６−５０
１、１９７８を参照のこと）、ならびに発酵培地中のセファロスポリンＣ（例え
ば、Ａｌｅｍａｎｎｉら、「発酵培地中の生合成的に活性な化合物のＨＰＬＣの
日常的分析」、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ １２：３９６−３９８、１９
７９を参照のこと）を見積もるために使用されているが；これらのクロマトグラ
フィー技術において、約０．５μｇ／ｍｌの最小濃度が一般的に必要である。最
後に、１０ｎｇ／ｍｌほどの低さの濃度でアンピシリンを検出する酵素免疫アッ
セイが考案されたが；この技術によってアンピシリン以外の他のベータラクタム
抗生物質は調査されていない（例えば、Ｋｉｔａｇａｗａら、「３つの抗生物質
の新規な酵素免疫アッセイ：抗生物質に対する抗血清を調製するためのおよび２
つのヘテロ二官能性試薬の組み合わせを使用して酵素を標識するための新規な方
法」、Ｓ．Ｂ．Ｐａｉ（編）、Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｏｂｅｌｌｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ
ａｓｓａｙ ｏｆ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇｓ、Ｗａｌｔｅｒ ｄ
ｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ、Ｉｎｃ．Ｈａｗｔｈｏｒｎｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７
８、５９−６６頁を参照のこと）。

【０００４】 これらの公知の手順に加えて、いくつかの商業的な方法が牛乳中のベータラク
タム抗生物質を検出するために開発された。例えば、Ｃｈａｒｍに対する米国特
許第４，２３９，７４５号および同第４，２３９，８５２号は、細菌細胞上のレ
セプター部位に対する、抗生物質混入物とタグ化抗生物質との間の競合的な結合
に基づく、液体サンプル（例えば、牛乳）中の抗生物質を検出するための商用的
な方法を記載する。これらの商業的なアッセイは、他のいくつかの提唱されるア
ッセイと同様に、免疫化学反応に基づき、そして特異的なベータラクタム抗生物
質に対して指向される抗体を利用する。しかし、これらのタイプのアッセイと関
連されるいくつかの不都合があり、以下が挙げられる：（１）サンプルは一般に
、妨害する物質の除去を必要とすること；および（２）サンプル添加物は一般に
、異なるベータラクタム抗生物質についての特異性および高い親和性を有する抗
生物質の混合物を必要とすること。

【０００５】 ベータラクタム抗生物質の存在を検出するために開発された商業的な方法のう
ち、ベータラクタム化合物が特定のＤ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼ細菌Ａｃｔ
ｉｎｏｍａｄｕｒａ−Ｒ３９を不活性化する能力に基づく酵素学的方法は特に重
要である（例えば、Ｆｒｅｒｅら、「β−ラクタム抗生物質の迅速かつ高感度の
検出のための酵素学的方法」、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａ
ｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、５０６−５１０頁、１９８０を参照のこと）
。他の細菌のＤ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼがまた、ベータラクタム抗生物質
によって可逆的に阻害されることが知られるが、Ｒ３９酵素が不活性化の速度が
非常に迅速であり、そして阻害の逆転が非常に遅いので、優先的に使用されてき
た。従って、短期間にわたる、ベータラクタム抗生物質へのＲ３９酵素の曝露は
、Ｒ３９触媒活性の化学量論的な損失を生じる。従って、試験サンプル（ベータ
ラクタム抗生物質を含有することが予測される）への曝露後の残存するＲ３９活
性の測定は、抗生物質を検出するためのアッセイを提供する。

【０００６】 より具体的には、Ｆｒｅｒｅらによって記載されるようなアッセイは、ＵＣＢ
Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって販売
されるＰＥＮＺＹＭ^TMとして知られる市販の試験に類似する。この市販の試験は
、しかし、どちらかといえば時間がかかりすぎ、そして多くの工程および別個の
試薬を含む。最初の工程は、試験サンプルとカルボキシペプチダーゼとのインキ
ュベーション（例えば、５分間）を包含する。試験サンプルがベータラクタム抗
生物質を含む場合、ある量の酵素が、存在する抗生物質の量に依存してインキュ
ベーションの間に不活性化される。次の２つの工程は、カルボキシペプチダーゼ
についての基質を添加する工程を包含し、この基質はカルボキシ末端のＤ−アラ
ニン−Ｄ−アラニンを含むペプチドである。これは別のインキュベーション（例
えば、約１５分間）に追随され、その間末端のＤ−アラニンは基質から切断され
る。別の試薬が、切断されたＤ−アラニンの量を測定するために、このインキュ
ベーションの期間の間に添加される。遊離されたＤ−アラニンは、Ｄ−アミノ酸
オキシダーゼ酵素によってピルビン酸に酸化され、過酸化水素の同時の形成を伴
う。過酸化水素は有機酸化還元指標（例えば、ｏ−ジアニシジン）を酸化し、こ
れは比色定量読み取りを提供する。反応を終結させ、そして色形成を安定化する
ために、インキュベーション期間の終わりに硫酸が添加される。

【０００７】 ＰＥＮＺＹＭ^TMキットは、以下を含む７つの別個の試薬とともに提供される；
（１）Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼ；（２）Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダー
ゼの緩衝液；（３）Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼの基質（（アセチル）₂−
Ｌ−Ｌｙｓ−Ｄ−ａｌａ−Ｄ−ａｌａ）；（４）フラビンアデニンジヌクレオチ
ド（Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの補因子）；（５）ペルオキシダーゼ；（６）ｏ
−ジアニシジン、および（７）Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ。このキットの使用は
、しかし、多くの不利益を被る。第１に、７つの異なる工程における試薬の連続
的な添加が必要とされる。第２に、アッセイを完了するために必要とされる時間
の量（すなわち、約２０〜３０分間）は、牛乳運搬会社によって特に過剰である
と考えられる。最後に、別々に梱包された過剰な試薬が扱われなくてはならない
。

【０００８】 従って、ベータラクタム含有化合物を、特に、液体サンプル中のベータラクタ
ム抗生物質の存在を検出する状況において、検出するための改善された方法につ
いての必要性が当該分野にある。本発明はこれらの必要性を満たし、そしてさら
に関連する利点を提供する。

【０００９】 （発明の要旨） 簡潔には、本発明は概して、ベータラクタム含有化合物の検出に関し、そして
より詳細には、サンプル中のベータラクタム抗生物質を検出するための方法およ
びキットに関する。本発明の１つの実施形態において、サンプルと、Ｄ，Ｄ−カ
ルボキシペプチダーゼおよびカルボキシ末端のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンを有
する基質とを接触させて反応混合物を形成することによって、サンプル中のベー
タラクタム含有化合物を検出するための方法が開示され、ここでＤ，Ｄ−カルボ
キシペプチダーゼは基質から末端のＤ−アラニンを切断して、切断された基質を
生じ得る。

【００１０】 １つの必要に応じた工程において、反応混合物はさらに、切断された基質に特
異的なリガンドまたは基質に特異的なリガンドと接触されて、改変された反応混
合物を形成し、ここで切断された基質に特異的なリガンドは切断された基質に結
合してリガンド／切断された基質複合体を形成し得、そしてここで基質に特異的
なリガンドは基質に結合してリガンド／基質複合体を形成し得る。この必要に応
じた工程は、反応混合物の形成後の工程において、または切断された基質に特異
的なリガンドが用いられる実施形態において、反応混合物の形成と同時に起こり
得る。

【００１１】 次いでこの方法は、（ｉ）反応混合物の切断された基質もしくは基質、または
（ｉｉ）改変された反応混合物のリガンド／切断された基質複合体もしくはリガ
ンド／基質複合体、または（ｉｉｉ）改変された反応混合物の切断された基質に
特異的なリガンドもしくは基質に特異的なリガンドを、（ｉ）もしくは（ｉｉ）
もしくは（ｉｉｉ）に対する表面に結合される結合対によってセンシング表面上
で捕獲する工程を包含する。

【００１２】 より特定の実施形態において、ベータラクタム含有化合物を含むサンプルは、
液体食品のような液体サンプルである。しかし、サンプルはまた、液体サンプル
によって抽出されるかまたは液体サンプル内に懸濁されるかのいずれかである固
体形態であり得る。好ましい実施形態において、液体サンプルは牛乳であり、検
出されるベータラクタム含有化合物は、ペニシリンまたはセファロスポリンのよ
うなベータラクタム抗生物質である。

【００１３】 Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼは典型的に、Ａｃｔｉｎｏｍａｎｄｕｒａ株
Ｒ３９またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ株Ｒ６１から得られ、そして基質は、ペ
プチドのカルボキシ末端にてＡＡ−Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンを有するペプチ
ドであり、ここでＡＡは１つ以上のアミノ酸、またはＮ，Ｎ−ジアセチル−Ｌ−
リジル−Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンもしくはＮ−アセチル−Ｌ−リジル−Ｄ−
アラニン−Ｄ−アラニンのような修飾されたアミノ酸を示す。改変された反応混
合物を形成するための必要に応じた工程において、切断された基質に特異的なリ
ガンドまたは基質に特異的なリガンドは抗体である。

【００１４】 センシング表面において、表面に結合される結合対の選択は、それによって結
合される標的の性質に依存する。例えば、反応混合物の切断された基質または基
質が捕獲される場合、表面に結合される結合対は典型的に、切断された基質また
は基質に特異的な表面結合抗体である。同様に、改変された反応混合物のリガン
ド／切断された基質複合体またはリガンド／基質複合体が検出される場合、表面
に結合される結合対は典型的に、リガンド／切断された基質複合体またはリガン
ド／基質複合体に特異的な表面結合抗体である。対照的に、改変された反応混合
物の切断された基質に特異的なリガンド、または基質に特異的なリガンドが捕獲
される場合（例えば、抗体）、表面に結合される結合対は典型的に、それぞれ、
表面に結合される切断された基質または表面に結合される基質である。

【００１５】 本発明の好ましい実施形態において、センシング表面はアフィニティーバイオ
センサーの表面であり、そしてより好ましくは以下により詳細に記載されるよう
に、「ＢＩＡＣＯＲＥ機器」のような表面プラズモン共鳴を利用するバイオセン
サーのセンシング表面である。

【００１６】 別の実施形態において、この方法はさらに、反応混合物または改変された反応
混合物中のＤ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼと基質との間の反応を終結させる工
程を包含する。終結は、測定間の一貫性を提供するために捕獲の工程の前に、特
に、接触させる工程と捕獲する工程との間に種々の時間の長さが生じ得る場合に
、用いられ得る。

【００１７】 本発明のなおさらなる実施形態において、サンプル中のベータラクタム含有化
合物を検出するためのキットが開示される。本発明の代表的なキットは、（１）
カルボキシ末端のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンを有する基質、（２）基質から末
端のＤ−アラニンを切断して切断された基質を生じ得るＤ，Ｄ−カルボキシペプ
チダーゼ、（３）切断された基質に特異的なリガンド、および（４）上述の（３
）の結合対、を含み、ここで結合対はバイオセンサーのセンシング表面に結合さ
れ得る。好ましい実施形態において、切断された基質に特異的なリガンドは抗体
であり、そして結合対は表面に結合される切断された基質である。ＢＩＡＣＯＲ
Ｅ機器の状況において、キットは好ましくは表面に結合される切断された基質を
有するセンサー表面を含む。本発明のキットはまた、上述の成分のため、ならび
に反応混合物および改変された反応混合物のための適切な緩衝液および／または
キャリアを含み得る。

【００１８】 本発明のこれらのおよび他の局面は添付の図面および以下の詳細な説明を参照
する際に明らかである。

【００１９】 （発明の詳細な説明） 上記のように、本発明は、ベータラクタム含有化合物を検出するための方法お
よびキットに関する。句「ベータラクタム含有化合物」は、以下の構造（Ｉ）に
よって示される少なくとも１つのベータラクタム部分を含む化合物のクラスを示
す。従って、本発明の実施において、少なくとも１つのベータラクタム部分を含
む任意の化合物は、ベータラクタム含有化合物を構成する。より特定の実施形態
において、ベータラクタム含有化合物は、ペニシリンまたはセファロスポリンの
ような抗生物質である。例えば、ペニシリンは構造（ＩＩ）によって示されるよ
うなベータラクタム部分を含み、ここでＡは、ペニシリン（例えば、ペニシリン
Ｇ、Ｎ、Ｏ、Ｓ，Ｖなど）の特定の性質に依存して種々の部分を示すのに対し、
構造（ＩＩＩ）はセファロスポリンを示し、ここでＢ／Ｂ’はセファロスポリン
または類似の化合物（例えば、セファロスポリンＣ、セファロチン、セファマイ
シン、セファパリン、セファラジンなど）の特定の性質に依存して種々の部分を
示す。

【００２０】

【化１】 本発明のベータラクタム含有化合物は、Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼの、
それらによって切断可能な基質、具体的にはＤ−カルボキシ末端アラニンを有す
る基質に対する活性を、阻害する。換言すれば、ベータラクタム含有化合物を含
むサンプルが、Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼおよび基質と接触される場合、
Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼによって切断されて、切断された基質を形成す
る基質の量は、サンプル中のベータラクタム含有化合物の量に依存する。ベータ
ラクタム含有抗生物質が多くのＤ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼを可逆的に阻害
することが知られるが、本発明の実施において、Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダー
ゼは好ましくは、不活性化の速度が非常に迅速であるが、阻害の逆転の速度は非
常に遅いＤ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼである。最後に、好ましいＤ，Ｄ−カ
ルボキシペプチダーゼは、細菌株Ａｎｔｉｎｏｍａｄｕｒａ−Ｒ３９（ＵＣＢ
Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）から単離される
Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼ（以後「Ｒ３９酵素」と呼ばれる）および細菌
株Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｒ６１（Ｆｒｅｒｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ、４５Ｂ：６１０−６３６、１９７６）（以後「Ｒ６１酵素」と呼ばれ
る）を包含する（がこれらに制限されない）。

【００２１】 本発明の実施において、サンプル中のベータラクタム含有化合物の量は、サン
プルと、Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼおよびカルボキシ末端のＤ−アラニン
−Ｄ−アラニンを有する基質とを接触させることによって検出される。サンプル
自身は、液体食品のような液体サンプル、または可溶化されるかもしくはそうで
なければ液体サンプルを生じるように抽出される固体サンプルであり得る。本発
明は広範な適用にわたる利用性を有するが、好ましい実施形態においてサンプル
は、牛乳、ならびに関連の乳製品（例えば、チーズおよびヨーグルト）のような
ヒト消費について意図される液体サンプルである。例えば、牛乳の場合において
、ベータラクタム抗生物質はしばしば、乳腺炎を処置するために乳牛に投与され
る。このような抗生物質は、しかし、牛乳および関連の乳製品中の混入物と考え
られ、そしてそれらがヒトに販売され得る前に容認される低い値に低下しなけれ
ばならない。従って、牛乳中のベータラクタム抗生物質の存在（または非存在）
を検出する方法は、例えば、重要な商業的価値がある。

【００２２】 背景の節において考察されるようなＦｒｅｒｅらによって開示される技術のよ
うな、牛乳中のベータラクタム抗生物質を検出する先行技術は、Ｄ，Ｄ−カルボ
キシペプチダーゼおよび基質を用いるが、多くの試薬を含む一連の時間がかかり
すぎる複数の工程手順を介して、切断されたＤ−アラニンの形成を検出する。本
発明は、切断された基質（または基質）を検出することによってこれらの欠点を
回避する。この状況において、「切断された基質」は、カルボキシ末端のＤ−ア
ラニンの切断後に残存する基質の部分である。あるいは、およびより好ましい実
施形態において、切断された基質（または基質）は切断された基質（または基質
）に特異的なリガンドと接触されて、リガンド／切断された基質複合体（または
リガンド／基質複合体）を形成する。次いで、切断された基質（または基質）と
複合体化されない任意の残存するリガンドが検出される。リガンドは、典型的に
抗体であり、切断された基質（または基質）よりも大きな分子量を有するので、
質量感受性の技術によるリガンドの検出は、検出法に対してより優れた感度を生
じる。あるいは、リガンド／切断された基質複合体（またはリガンド／基質複合
体）がまた検出され得る。

【００２３】 より具体的には、本発明の方法は、サンプルと、Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダ
ーゼおよびカルボキシ末端のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンを有する基質とを接触
させて反応混合物を形成することによって、サンプル内のベータラクタム含有化
合物を検出することに関する。上記のように、本発明の好ましいＤ，Ｄ−カルボ
キシペプチダーゼはＲ３９酵素およびＲ６１酵素を包含し、一方好ましい基質は
、カルボキシ末端にて構造ＡＡ−Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンを有するペプチド
または修飾されたペプチドであり、ここでＡＡは１つ以上のアミノ酸、またはＮ
，Ｎ−ジアセチル−Ｌ−リジル−Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンもしくはＮ−アセ
チル−Ｌ−リジル−Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンのような修飾されたアミノ酸を
示す。

【００２４】 潜在的にベータラクタムを含有するサンプルは、液体また固体の形態のいずれ
かであり得る。固体の場合において、サンプルは最初に可溶化されるか、溶解さ
れるか、抽出されるか、懸濁されるか、またはそうでなければ液体の形態にされ
る。次いで液体サンプルは、典型的に特定の量のそれぞれの、公知の容量のサン
プルへの添加によって、Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼおよび基質と接触され
る。所与の容量のサンプルに添加されるＤ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼおよび
基質の量は通常、０．５〜２．０ｍｌのサンプルに対して１０〜５０ｐｍｏｌの
Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼ、および５０〜１，０００ｎｍｏｌの基質の範
囲である。基質対カルボキシペプチダーゼの比率は好ましくは、１，０００〜５
０，０００の範囲にあるように選択される（すなわち、ペプチダーゼによる酵素
学的ターンオーバーに起因して明らかに過剰の基質）。反応溶液は好ましくは、
３５℃〜４５℃にて２〜１５分間インキュベートされる。

【００２５】 Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼがベータラクタム含有化合物を含まないサン
プルに添加される場合、Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼはベータラクタム含有
化合物の阻害的な効果によって妨げられない基質を切断する。完全な反応の前に
停止されない限り、サンプル中の基質の全てがＤ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼ
によって切断されて切断された基質を生成する。対照的に、サンプルがベータラ
クタム含有化合物を含む限り、ベータラクタム含有化合物はＤ，Ｄ−カルボキシ
ペプチダーゼを阻害し、それによって反応混合物中の切断された基質の形成の速
度（および得られる濃度）を遅延させる。反応混合物中の切断された基質の量（
または反応混合物中に残存する基質の量）を検出することによって、サンプル中
のベータラクタム含有化合物の量が決定され得る。

【００２６】 あるいは、およびより好ましい実施形態において、切断された基質は切断され
た基質に特異的なリガンドと接触されて、リガンド／切断された基質複合体を形
成する。この状況において、「リガンド」は切断された基質に対する任意の結合
対、そして典型的には切断された基質に特異的な抗体であり、「複合体」は、得
られる相互作用対である。切断された基質に特異的なリガンドは、Ｄ，Ｄ−カル
ボキシペプチダーゼおよび基質と同時にサンプルに添加され得るか（この場合、
改変された反応混合物は反応混合物と同時に形成される）、または反応混合物の
形成に続いて添加され得る。

【００２７】 さらなる代替の実施形態において、基質は基質に特異的なリガンドと接触され
て、リガンド／基質複合体を形成する。しかし、この実施形態において基質に特
異的なリガンドは好ましくは、基質に対するＤ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼの
作用を妨げることを回避するために反応混合物の形成後に添加される。

【００２８】 Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼと基質とを接触させることによる反応混合物
の形成後、および必要に応じて、切断された基質（または基質）に特異的なリガ
ンドとの接触による改変された反応混合物の形成後、所望の標的の検出は、適切
な表面に結合される結合対の使用によって達成され得る。反応混合物の切断され
た基質（または基質）の検出が所望される場合、表面に結合される結合対は、切
断された基質（または基質）に特異的なリガンド、典型的に切断された基質（ま
たは基質）に対する表面結合抗体である。

【００２９】 他方、改変された反応混合物が形成される場合、リガンド自身またはリガンド
／切断された基質複合体（もしくはリガンド／基質複合体）のいずれかが検出さ
れ得る。切断された基質（または基質）に特異的なリガンドが検出される実施形
態において、表面に結合される結合対はリガンドが結合して結合対を形成する分
析物である。典型的に、表面に結合される結合対は切断された基質であり、リガ
ンドとの接触の際、表面に結合される切断された基質／リガンド結合対を形成す
る。リガンド／切断された基質複合体（またはリガンド／基質複合体）が検出さ
れる実施形態において、表面に結合される結合対は、形成されたリガンド／基質
複合体を特異的に認識するリガンドであり、これに複合体が結合して結合対を形
成する。典型的に、表面に結合する結合対は抗体であり、複合体との接触の際に
、表面結合抗体／複合体結合対を形成する。

【００３０】 表面に結合される結合対は、例えば、ネイティブな−ＮＨ₂、−ＳＨ、−ＣＨ
Ｏ、および−ＣＯＯＨ基を介する公知のリガンド固定化技術のような任意の多様
な公知の技術によって、センシング表面に結合され得る。このような技術は当該
分野において周知であり、そして所望される結合対固定化を達成するための適切
な試薬および手順は容易に利用可能である。従って、本発明に従うセンシング表
面は、（本明細書中にその全体が参考として援用される米国特許第５，４３６，
１６１号において開示されるように）その上に密に詰められた有機単層のコーテ
ィングを有する固体の金属支持体（例えば、金または銀）を含み得る。センシン
グ表面はさらに、有機単層コーティングに結合された生体適合性の多孔性マトリ
クス様の、例えば、ヒドロゲル（例えば、デキストランのような多糖）を含み得
る。次いで、このようなヒドロゲルは、表面に結合される結合対を生じるための
結合対の固定化のために、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アルデ
ヒド基、カルボニル基、エポキシ基、またはビニル基を含むように適切に誘導体
化され得る。

【００３１】 本発明の典型的な実施形態において、センシング表面はバイオセンサーの表面
（その上に固定化される所望される結合対を有する）であり、そして検出技術は
、固定化された結合対と、反応混合物または改変された反応混合物とを接触させ
る工程を包含する。典型的に、このような検出技術としては、圧電法、光学法、
熱−光学法、および表面音響波（ＳＡＷ）装置法のような質量検出法、ならびに
電位差測定法、伝導率測定法、電流測定法、および電気容量法のような電気化学
法が挙げられるがこれらに制限されない。光学検出法に関して、代表的な方法と
しては、質量表面濃度を検出する方法（例えば、反射−光学法、内部および外部
反射法の両方を含む）、角度を測定する方法、波長を測定する方法、または分離
される相を測定する方法（例えば、偏光解析法および消散波分光法（ＥＷＳ））
が挙げられ、後者は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光法、Ｂｒｅｗｓｔｅｒ
角反射測定法、臨界角反射測定法、減衰全反射法（ＦＴＲ）、消散波偏光解析法
、散乱化全内部反射（ＳＴＩＲ）、光波ガイドセンサー、消散波ベースの画像化
（例えば、臨界角解像化画像、Ｂｒｅｗｓｔｅｒ角解像化画像、ＳＰＲ角解像化
画像などを含む。さらに、例えば、消散蛍光（ＴＩＲＦ）およびリン光に基づく
光測定法、ならびにウェーブガイド干渉計がまた用いられ得る。本発明のある局
面が以後、ＳＰＲベースの技術とともにＢＩＡＣＯＲＥ機器（ＢＩＡＣＯＲＥ
ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）の状況において説明されるが、本発明の
このような系に制限されないことが理解されるべきである。

【００３２】 より具体的には、本発明の状況内で使用されるように、用語「バイオセンサー
」は、反応混合物または改変された反応混合物中の目的の標的と、バイオセンサ
ーの表面に結合される結合対との間の生体分子相互作用を検出し得る任意の分析
的な装置を包含するように広範に解釈されるべきであるが、ただし装置はトラン
スデューサーに結合される少なくとも１つのセンシング要素を含む。従って、用
語バイオセンサーは、サンプルと１つ以上のセンシング表面（以下に考察される
ようなＢＩＡＣＯＲＥ機器の微量流体構造のような）とを接触させるための流動
系を使用する分析的装置のみでなく、サンプルと、いくつかのバイオセンサー機
器によって用いられるキュベット構造のような１つ以上のセンシング表面とを接
触させるための非流動系を使用する分析的装置もまた含む。従って、本発明は、
流動系および非流動系の両方のタイプに適応可能である。

【００３３】 これに関して、バイオセンサー機器の代表的なクラスは、商品名ＢＩＡＣＯＲ
Ｅ（登録商標）の下、ＢＩＡＣＯＲＥ ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）
によって販売される（「ＢＩＡＣＯＲＥ機器」と呼ばれる）。ＢＩＡＣＯＲＥ機
器は、発光ダイオード、薄い金フィルムで覆われたセンサーチップ、組み込まれ
た液体カートリッジ、および光検出器を備える。ダイオードからの入射光は金フ
ィルムにおいて反射され、そして光検出器によって検出される。ある入射角（「
ＳＰＲ角」）で、表面プラズモン波が金層において設定され、これは反射される
光における強度の喪失または「傾斜」として検出される。（溶液を流動させるた
めにその微量流体ブロックユニットをそこに備えるこの代表的なＢＩＡＣＯＲＥ
機器のより完全な記載は、米国特許第５，３１３，２６４号（これはその全体が
本明細書中に参考として援用される）において見いだされ得ることに留意のこと
）。

【００３４】 ＳＰＲ角は、金層に密接する媒体の屈折率に依存する。ＢＩＡＣＯＲＥ機器に
おいて、デキストランが典型的に金表面に結合され、そしてリガンドはデキスト
ラン層に結合される。目的の分析物は、液体カートリッジを介してセンサー表面
上に溶液形態で注入される。金フィルムの近位における屈折率は、（１）溶液の
屈折率（これは一定である）、および（２）表面に結合される材料の量に依存す
るので、結合されるリガンドと分析物との間の相互作用がＳＰＲ角における変化
の関数としてモニターされ得る。

【００３５】 ＢＩＡＣＯＲＥ機器からの典型的な出力は「センサグラム」であり、これは時
間の関数としての応答（「共鳴単位」または「ＲＵ」で測定される）のプロット
である。１０００ＲＵの増加は、約１ｎｇ／ｍｍ²のセンサー表面における質量
の増加に対応する。分析物を含有するサンプルがセンサー表面に接触すると、セ
ンサー表面に結合されるリガンドは、「会合」と呼ばれる工程において分析物と
相互作用する。この工程は、サンプルが最初にセンサー表面と接触するので、Ｒ
Ｕにおける増加によってセンサグラム上で示される。逆に、「解離」は通常、サ
ンプル流動が、例えば、緩衝液流動によって置き換えられる場合に生じる。この
工程は、分析物が表面に結合されるリガンドから解離するので、経時的にＲＵに
おける低下によってセンサグラム上で示される。

【００３６】 従って、本発明の１つの実施形態において、反応混合物の切断された基質（ま
たは基質）の検出は、センシング表面上に固定化された切断された基質（または
基質）に特異的な適切なリガンドを有するＢＩＡＣＯＲＥ機器の使用によって達
成され得る。あるいは、切断された基質（または基質）に特異的なリガンドの検
出は、センシング表面上に固定化された切断された基質（または基質）のような
適切な結合対を有するＢＩＡＣＯＲＥ機器の使用によって達成され得る。なおさ
らなる実施形態において、リガンド／切断された基質複合体（またはリガンド／
基質複合体）の検出が、センシング表面上に固定化された抗体のような適切な結
合対を有するＢＩＡＣＯＲＥ機器の使用によって達成され得る。定量的な測定は
好ましくは、ベータラクタムの公知の量を有する標準的なサンプルで検量線を作
成することによってなされる。

【００３７】 さらなる実施形態において、本発明の方法はさらに、反応混合物または改変さ
れた反応混合物中のＤ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼと基質との間の反応を終結
させる工程を包含する。この終結工程は、過剰のベーターラクタムの添加によっ
て達成され得、それによってＤ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼの活性を阻害する
。あるいは、Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼの酵素活性を破壊することが知ら
れる物質または条件が、反応混合物または改変された反応混合物に添加または適
用され得る。代表的な例としては、強酸もしくは強塩基、変性界面活性剤、有機
溶媒の添加、または氷浴上での冷却が挙げられ（しかし、これらに制限されない
）、これは著しく酵素反応を遅くしたり、中止したりする。終結工程は典型的に
、複数のサンプルが種々の時間でアッセイされる場合の条件下でアッセイを行う
ために用いられる。

【００３８】 本発明の別の実施形態において、キットが上述の方法を行うために開示される
。このようなキットは少なくとも以下の成分を含む：（１）Ｄ，Ｄ−カルボキシ
ペプチダーゼ、（２）カルボキシ末端のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンを有する基
質、および（３）センシング表面上に捕獲される所望の標的の結合対。反応混合
物の切断された基質（または基質）が捕獲される実施形態において、結合対は、
切断された基質（または基質）の結合対である。あるいは、改変された反応混合
物の切断された基質（または基質）に特異的なリガンドが捕獲される実施形態に
おいて、結合対は、切断された基質（または基質）に特異的なリガンドの結合対
である。リガンド／切断された基質複合体（またはリガンド／基質複合体）が捕
獲される実施形態において、結合対は、リガンド／切断された基質複合体（また
はリガンド／基質複合体）に対する結合対である。

【００３９】 上述の成分に加えて、キットはさらに上述の成分についての、ならびに反応混
合物および改変された反応混合物についての適切な緩衝液および／またはキャリ
アを含み得る。

【００４０】 好ましい実施形態において、キットは：（１）カルボキシ末端のＤ−アラニン
−Ｄ−アラニンを有する基質、（２）基質から末端のＤ−アラニンを切断して切
断された基質を生じ得るＤ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼ、（３）切断された基
質に特異的なリガンド、および（４）上述の（３）の結合対を含み、ここで結合
対は、バイオセンサーのセンシング表面に結合され得る。好ましくは、結合対は
切断された基質であり、そしてより好ましくは適切なセンサー表面上に固定化さ
れる。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ機器の状況において、キットは好ましくはそれら
の上に固定化される切断された基質を有するセンサーチップを含む。この状況に
おいて適切なセンシングチップは、切断された基質に特異的なリガンドを結合し
得る切断された基質またはそれらの誘導体がその表面上に固定化された、ＢＩＡ
ＣＯＲＥから利用可能なＣＭ５チップに基づく。あるいは、キットはＣＭ５チッ
プ、切断された基質（またはその誘導体）の固定化のためのカップリング試薬、
およびＣＭ５チップ上への固定化に適切な切断された基質（またはその誘導体）
を含む。

【００４１】 以下の実施例は、説明のために提供され、制限のために提供されない。

【００４２】 （実施例） （実施例１） （牛乳内のペニシリンの検出） 本実施例は、生乳サンプル内のペニシリンの存在および量を検出するための本
発明に従う代表的な方法を説明する。

【００４３】 推測されるベータラクタムを含有する生乳サンプル（９０マイクロリットル）
を、２００ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＭｇＣｌ₂、および１５０ｎｍｏｌ Ａｃ₂ −Ｌ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａを含有する９０マイクロリットルの１０
０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）と混合する。反応混合物に５．０ｐｍ
ｏｌ Ｒ３９酵素（２００ｍＭ ＮａＣｌおよび６ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含有する
２０マイクロリットルの１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中）を添
加する。反応混合物を、５分間４０℃でインキュベートした。次いで混合物を氷
浴上で迅速に冷却し、そして分析のためにＢＩＡＣＯＲＥ ２０００機器に置い
た。ＢＩＡＣＯＲＥ機器は、ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化工程を用いる標準的なアミン
カップリング手順を使用してＬ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａが固定化され
たＣＭ５センサーチップを備える。ＢＩＡＣＯＲＥ２０００においてオートサン
プラーユニットを使用して、１００マイクロリットルの反応溶液を１００マイク
ロリットルの抗体溶液（１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
緩衝液中の１ｐｍｏｌ）と混合し、そしてセンサーチップ上に注入する。用いら
れる抗体は構造Ｌ−Ｌｙｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａを含む基質の部分に特異的
であるように選択される。応答を、２分間の接触時間の間、ＢＩＡＣＯＲＥ機器
によって記録する。応答レベルは、公知の量のベータラクタムを有するサンプル
から類似の様式において得られる検量線と比較され、そこから牛乳中のベータラ
クタム含量が決定される。

【００４４】 本発明の方法およびキットは、本明細書中に説明されそして記載される実施形
態の状況において記載されたが、本発明は、本発明の精神または本質的な特徴か
ら逸脱することなく、他の特定の様式においてまたは他の特定の形態において具
体化され得る。それゆえ、記載される実施形態は、全ての点において例示的であ
るとして解釈されるべきであり、制限的であるとして解釈されるべきではない。
本発明の範囲は、それゆえ、上述の記載によってではなく、添付の特許請求の範
囲によって示され、そして特許請求の範囲の等価の意味および範囲内にある全て
の変化は、それらの範囲内に包含されるべきである。

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 サンプル中のベータラクタム含有化合物を検出するための方
   法であって、以下の工程： 該サンプルと、Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼおよびカルボキシ末端のＤ−
   アラニン−Ｄ−アラニンを有する基質とを接触させて反応混合物を形成する工程
   であって、ここで該Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼは該基質から末端のＤ−ア
   ラニンを切断して、切断された基質を生じ得る、工程； 必要に応じて、該反応混合物と、該切断された基質に特異的なリガンドまたは
   該基質に特異的なリガンドとを接触させて改変された反応混合物を形成する工程
   であって、ここで該切断された基質に特異的なリガンドは該切断された基質に結
   合してリガンド／切断された基質複合体を形成し得、そしてここで該基質に特異
   的なリガンドは該基質に結合してリガンド／基質複合体を形成し得る、工程；な
   らびに センシング表面において、（ｉ）該反応混合物の該切断された基質もしくは該
   基質、または（ｉｉ）該改変された反応混合物の該リガンド／切断された基質複
   合体もしくは該リガンド／基質複合体、または（ｉｉｉ）該改変された反応混合
   物の該切断された基質に特異的なリガンドもしくは該基質に特異的なリガンドを
   、表面に結合されるそれらに対する結合対によって捕獲する工程、 を包含する、方法。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記サンプルが液体
   サンプルである、方法。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記ベータラクタム
   含有化合物がベータラクタム抗生物質である、方法。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の方法であって、ここで前記ベータラクタム
   抗生物質が、ペニシリンまたはセファロスポリンである、方法。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の方法であって、ここで前記ベータラクタム
   抗生物質がペニシリンＧ、アンピシリン、アモキシシリン、クロキサシリン、セ
   フチフル、セファピリン、ジクロキサシリン、またはオキサシリンである、方法
   。
6. 【請求項６】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記サンプルが液体
   食品である、方法。
7. 【請求項７】 請求項６に記載の方法であって、ここで前記液体食品が牛乳
   または牛乳関連製品である、方法。
8. 【請求項８】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記サンプルが、液
   体キャリア中に可溶化された固体食品である、方法。
9. 【請求項９】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記Ｄ，Ｄ−カルボ
   キシペプチダーゼがＡｃｔｉｎｏｍａｎｄｕｒａ株Ｒ３９またはＳｔｒｅｐｔｏ
   ｍｙｃｅｓ株Ｒ６１から得られる、方法。
10. 【請求項１０】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記基質がペプチ
    ドのカルボキシ末端にてＡＡ₁−ＡＡ₂−Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンを有するペ
    プチドであり、ここでＡＡ₁およびＡＡ₂が同じかまたは異なるアミノ酸を示す、
    方法。
11. 【請求項１１】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記サンプルが液
    体サンプルであり、そして前記Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼおよび前記基質
    が該サンプルに直接的に添加されて前記反応混合物を形成する、方法。
12. 【請求項１２】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記改変された反
    応混合物が、前記サンプルと、前記Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼ、前記基質
    、および前記切断された基質に特異的なリガンドとを同時に接触させることによ
    って、前記反応混合物と同時に形成される、方法。
13. 【請求項１３】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記改変された反
    応混合物が、前記反応混合物の形成後に、前記サンプルと、前記Ｄ，Ｄ−カルボ
    キシペプチダーゼおよび前記基質とを接触させ、そして引き続いて該反応混合物
    と、前記切断された基質に特異的なリガンドまたは前記基質に特異的なリガンド
    とを接触させて該改変された反応混合物を形成することによって形成される、方
    法。
14. 【請求項１４】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記切断された基
    質に特異的なリガンドが抗体である、方法。
15. 【請求項１５】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記基質に特異的
    なリガンドが抗体である、方法。
16. 【請求項１６】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記切断された基
    質または前記基質を捕獲するための前記表面に結合される結合対が、表面結合抗
    体である、方法。
17. 【請求項１７】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記リガンド／切
    断された基質複合体または前記リガンド／基質複合体を捕獲するための前記表面
    に結合される結合対が、表面結合抗体である、方法。
18. 【請求項１８】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記切断された基
    質に特異的なリガンドを捕獲するための前記表面に結合される結合対が、表面に
    結合される切断された基質である、方法。
19. 【請求項１９】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記基質に特異的
    なリガンドを捕獲するための前記表面に結合される結合対が、表面に結合される
    基質である、方法。
20. 【請求項２０】 請求項１に記載の方法であって、ここで前記センシング表
    面がバイオセンサーの表面である、方法。
21. 【請求項２１】 請求項２０に記載の方法であって、ここで前記バイオセン
    サーが表面プラズモン共鳴を利用する親和性バイオセンサーである、方法。
22. 【請求項２２】 請求項１に記載の方法であって、前記反応混合物または前
    記改変された反応混合物中の前記Ｄ，Ｄ−カルボキシペプチダーゼと前記基質と
    の間の反応を、過剰のベータラクタムを添加することによって、または反応条件
    を有意に変化させることによって、終結させる工程をさらに包含する、方法。
23. 【請求項２３】 サンプル中のベータラクタム含有化合物を検出するための
    キットであって、以下： カルボキシ末端のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンを有する基質； 該基質から末端のＤ−アラニンを切断して切断された基質を生じ得るＤ，Ｄ−
    カルボキシペプチダーゼ；および 該基質または該切断された基質の結合対であって、ここで該結合対がセンシン
    グ表面上に結合され得る、結合対、 を含む、キット。
24. 【請求項２４】 請求項２３に記載のキットであって、ここで前記結合対が
    前記切断された基質の結合対である、キット。
25. 【請求項２５】 請求項２４に記載のキットであって、ここで前記結合対が
    前記切断された基質に対する抗体である、キット。
26. 【請求項２６】 請求項２３に記載のキットであって、ここで前記結合対が
    前記基質の結合対である、キット。
27. 【請求項２７】 請求項２４に記載のキットであって、ここで前記結合対が
    前記基質に対する抗体である、キット。
28. 【請求項２８】 サンプル中のベータラクタム含有化合物を検出するための
    キットであって、以下： カルボキシ末端のＤ−アラニン−Ｄ−アラニンを有する基質； 該基質から末端のＤ−アラニンを切断して切断された基質を生じ得るＤ，Ｄ−
    カルボキシペプチダーゼ； 該基質または該切断された基質に特異的なリガンド；および 該基質または該切断された基質に特異的なリガンドの結合対であって、ここで
    該結合対がセンシング表面上に結合され得る、結合対、 を含む、キット。
29. 【請求項２９】 請求項２８に記載のキットであって、ここで前記基質また
    は前記切断された基質に特異的なリガンドが抗体である、キット。
30. 【請求項３０】 請求項２８に記載のキットであって、ここで前記基質に特
    異的なリガンドの結合対が基質であり、そして前記切断された基質に特異的なリ
    ガンドの結合対が切断された基質である、キット。