-
Technisches
Gebiet
-
Die
Erfindung betrifft allgemein enzymatische Verfahren und Kits für den Nachweis
an Betalactam-haltigen Verbindungen und insbesondere die Verwendung
eines Biosensors, um die Anwesenheit eines Betalactam-Antibiotikums
in einer flüssigen
Probe festzustellen, und Kits für
seine Anwendung.
-
Hintergrund
der Erfindung
-
Antibiotische
Verunreinigung von Milch und verwandten Molkereiprodukten ist ein
großes
Problem in der Milchwirtschaft. Eine größere Quelle für solche
Verunreinigung sind Betalactam-Antibiotika (z. B. Penicilline und
Cephalosporine), die Kühen
zur Behandlung von Mastitis oder anderen Infektionen gegeben wurden. Allgemein
werden große
Mengen an Milch und verwandten Molkereiprodukten wegen Verunreinigung
mit Betalactam-Antibiotika jedes Jahr weggeschüttet, was beträchtliche
wirtschaftliche Verluste verursacht.
-
Es
gibt verschiedene bekannte Verfahren zum Nachweis von Betalactam-Antibiotika
in einer flüssigen Probe,
bekannte Verfahren wie mikrobiologische und chemische Techniken,
Hochleistungs-Flüssigchromatographie
und Enzymimmunoassays. Zum Beispiel erlauben mikrobiologische Techniken
(Agardiffusion) den Nachweis von etwa 0,1 bis 0,5 Mikrogramm Antibiotikum
pro Milliliter Probe (d. h. μg/ml),
aber solche Techniken sind ziemlich zeitaufwendig (siehe z. B. Bennett
et al., "Simplified
Accurate Method For Antibiotic Assay of Clinical Specimens," Appl. Microbiol.
14: 170–177,
1966; Cole et al., "Metabolism
of Penicillins to Penicilloc Acids and 6-APA in Man and its Significance in Assessing
Penicillin Absorption," Antimicrob.
Agents Chemother. 3: 463–468,
1973; und Spyker et al., "Pharmacokinetics
of Amoxicillin: Dose Dependence After Intravenous, Oral and Intramuscular
Administration," Antimicrob.
Agents Chemother. 11: 132–141,
1977). Chemische Verfahren sind im allgemeinen etwas schneller,
sind aber typischerweise viel weniger empfindlich (siehe z. B. Marelli,
L. P., "Analytical
Procedures For Cephalosporins" in
E. H. Flynn (ed.), Cepha losporins and Penicillins, Academic Press,
Inc., New York, 1972, S. 609–635).
Hochleistungs-Flüssigchromatographie
wurde verwendet zum quantitativen Bestimmen von Amoxycillin und
Ampicillin in Sera und Urinen (siehe z. B. Vrée et al., "Rapid Determination
of Amoxycillin (clamoxyl) and Ampicillin (penbritin) in Body Fluids
of Many By Means of High Performance Liquid Chromatography," J. Chromatogr. 145:
496–501,
1978) und Cephalosporin C in Fermentationsmedien (siehe z. B. Alemanni
et al., "HPLC Routine
Analysis of Biosynthetic Active Compounds in Fermentation Media," Chromatographia
12: 396–398,
1979); bei diesen Chromatographietechniken sind jedoch Mindestkonzentrationen
von etwa 0,5 μg/ml
im allgemeinen nötig.
Schließlich
wurde ein Enzymimmonoassay entwickelt, der Ampicillin bei Konzentrationen
von nur 10 ng/ml nachweist; Betalactam-Antibiotika außer Ampicillin
wurden jedoch mit dieser Technik nicht aufgefunden (siehe z. B.
Kitagawa et al., "Novel
Enzyme Immunoassay of Three Antibiotics: New Methods For Preparation
of Antisera to the Antibiotics and for Enzyme Labeling Using a Combination
of Two Hetero-Bisfunctional Reagents," S. B. Pai (ed.), Enzyme Labelled Immunoassay
of Hormones and Drugs, Walter de Gruyter, Inc., Hawthorne, N. Y.,
1978, S. 59–66).
-
EP-A-0
186 944 offenbart ein Verfahren zum Nachweis von Betalactam-Antibiotika
in einer flüssigen Probe,
wobei das Reaktionsmedium durch Zugabe der Probe zu einer vorbestimmten
Menge einer trockenen Reagenzformulierung gebildet wird, die D,D-Carboxypeptidase,
ein Substrat für
D,D-Carboxypeptidase,
das D-Alanin mit endständiger
Carboxylgruppe enthält,
und ein Reagenzsystem, das eine Farbreaktion in Anwesenheit von
D-Alanin erzeugt. Nachdem das Reaktionsmedium eine bestimmte Zeitspanne
inkubiert wurde, wurde ein Material, das die farbbildende Reaktion
abschreckt, zugesetzt, und die Farbe des Reaktionsmediums festgestellt.
Ein Reagenzkit zum Nachweis von Betalactam-Antibiotika in Milch
enthält
ein festes Substrat, das die oben genannte Trockenreagenzformulierung
trägt,
Substrat und Reagenzsystem, wobei letzteres z. B. D-Aminasäureoxidase
enthält,
die D-Alanin desaminiert.
-
Zusätzlich zu
diesen bekannten Verfahren wurden verschiedene kommerzielle Methoden
zum Nachweis von Betalactam-Antibiotika in Milch entwickelt. Zum
Beispiel beschreiben die US-Patente Nr. 4,239,745 und 4,239,852,
Charm, kommerzielle Methoden zum Nachweis eines Antibiotikums in
einer flüssigen
Probe (z. B. Milch), die auf der konkurrierenden Bindung zwischen
der antibiotischen Verunreinigung und einem markierten Antibiotikum
an Rezeptorplätzen
von bakteriellen Zellen basiert. Diese kommerziellen Versuche basieren wie
einige andere vorgeschlagene Versuche auf immunochemischen Reaktionen
und wenden Antikörper
an, die gegen spezifische Betalactam-Antibiotika gerichtet sind.
Mit diesen Typen von Assays sind jedoch verschiedene Nachteile verbunden,
z. B: (1) aus der Probe müssen
im allgemeinen störende
Materialien entfernt werden und (2) die Probenzusätze benötigen im
allgemeinen ein Gemisch von Antikörpern, das spezifisch für verschiedene
Betalactam-Antibiotika ist und hohe Affinität hierfür aufweist.
-
Von
den kommerziellen Methoden, die zum Nachweis der Anwesenheit von
Betalactam-Antibiotika entwickelt wurden, sind besonders die enzymatischen
Methoden, die auf der Fähigkeit
von Betalactam-Antibiotika beruhen, ein spezifisches D,D-Carboxypeptidase-Bakterium
Actinomadura-R39 zu inaktivieren, besonders interessant (siehe z.
B. Frere et al., "Enzymatic
Method for Rapid and Sensitive Determination of β-Lactam Antibiotics," Antimicrobial Agents
and Chemotherapy, S. 506–510,
1980). Es ist zwar bekannt, dass andere bakterielle D,D-Carboxypeptidasen
durch Betalactam-Antibiotika
reversibel inhibiert werden, jedoch wurde das Enzym R39 bevorzugt
verwendet, da seine Inaktivierungsrate sehr schnell ist und die
Umkehrung der Inhibierung sehr langsam ist. Daher ergibt über eine
kurze Zeit hin das Aussetzen von Betalactam-Antibiotikum an Enzym
R39 einen stoichiometrischen Verlust von R39-katalytischer Aktivität. Entsprechend
ergibt das Messen der verbliebenen R39-Aktivität nach Einwirkung auf Testproben
(von denen man den Gehalt an Betalactam-Antibiotika vermutet) einen
Assay zum Nachweis des Antibiotikums.
-
Insbesondere
ist der von Frère
et al. beschriebene Assay ähnlich
einem kommerziellen Test, der als PENZYMTM bekannt
ist und von UCB Bioproducts (Brüssel,
Belgien) vertrieben wird. Jedoch ist dieser kommerzielle Test ziemlich
zeitaufwendig und benötigt
eine Anzahl von Schritten und verschiedene Reagenzien. Der erste
Schritt umfasst eine Inkubation (z. B. fünf Minuten) der Testprobe mit
Carboxypeptidase. Wenn die Testprobe ein Be talactam-Antibiotikum
enthält,
wird eine gewisse Menge des Enzyms während der Inkubation inaktiviert
in Abhängigkeit
von der anwesenden Menge an Antibiotikum. Die nächsten zwei Stufen umfassen die
Zugabe des Substrats für
die Carboxypeptidase, die ein Peptid mit D-Alanin-D-Alanin mit endständiger Carboxylgruppe
ist. Darauf folgt eine weitere Inkubation (z. B. 15 Minuten), während der
das endständige
D-Alanin von dem Substrat abgespalten wird. Andere Reagenzien werden
während
dieser Inkubationsperiode zugesetzt, um die Menge an gespaltenem
D-Alanin zu messen. Das freigesetzte D-Alanin wird von einem D-Aminosäureoxidase-Enzym
zu Brenztraubensäure
oxydiert unter gleichzeitiger Bildung von Wasserstoffperoxid. Das
Wasserstoffperoxid oxydiert einen organischen Redoxindikator (z.
B. o-Dianisidin), was einen colorimetrischen Messwert gibt. Am Ende
der Inkubationsperiode wird Schwefelsäure zugesetzt, um die Reaktion
zu beenden und die Farbbildung zu stabilisieren.
-
Der
PENZYMTM-Kit wird mit sieben getrennten
Reagenzien vertrieben, einschließlich: (1) diesen D,D-Carboxypeptidasen;
(2) Puffer für
die D,D-Carboxypeptidase; (3) Substrat für die D,D-Carboxypeptidase ((Acetyl)2-L-Lys-D-ala-D-ala);
(4) Flavinadenindinucleotid, Cofaktor für die D-Aminosäureoxidase;
(5) Peroxidase; (6) o-Dianisidin und (7) D-Aminosäureoxidase.
Die Verwendung dieses Kits hat jedoch einige Nachteile. Erstens
wird die aufeinander folgende Zugabe von Reagenzien in verschiedenen
Schritten benötigt.
Zweitens wird die benötigte
Zeitdauer zur Vervollständigung
des Assay (d. h. etwa 20 bis 30 Minuten) als unangemessen lang angesehen,
insbesondere von den Milchwagenfahrern. Schließlich muss eine übermäßige Anzahl
von einzeln verpackten Reagenzien gehandhabt werden.
-
Entsprechend
besteht ein Bedürfnis
in der Fachwelt für
verbesserte Methoden zum Bestimmen Betalactam-haltiger Verbindungen,
insbesondere im Zusammenhang mit dem Nachweis der Anwesenheit eines Betalactam-Antibiotikums in
einer flüssigen
Probe.
-
Die
vorliegende Erfindung befriedigt diese Bedürfnisse und weist weitere Vorteile
in diesem Zusammenhang auf.
-
Zusammenfassung der Erfindung
-
Kurz
gesagt betrifft die vorliegende Erfindung allgemein den Nachweis
von Betalactam-haltigen Verbindungen, und insbesondere Verfahren
und Kits zum Nachweis eines Betalactam-Antibiotikums in einer Probe.
-
In
einer Ausführungsform
dieser Erfindung werden Verfahren zur Bestimmung einer Betalactam-haltigen
Verbindung in einer Probe durch Kontaktieren der Probe mit einer
D,D-Carboxypeptidase und einem Substrat mit einem Carboxyl-endständigen D-Alanin-D-Alanin
zur Bildung eines Reaktionsgemisches offenbart, worin die D,D-Carboxypeptidase
das endständige
D-Alanin von dem Substrat unter Bildung eines gespaltenen Substrats
abspalten kann.
-
Gegebenenfalls
wird das Reaktionsgemisch weiterhin mit einem Liganden, der für das gespaltene Substrat
spezifisch ist, oder einem Liganden, der für das Substrat spezifisch ist,
zur Bildung einer modifizierten Reaktionsmischung in Kontakt gebracht,
in der der Ligand, der für
das gespaltene Substrat spezifisch ist, an das gespaltene Substrat
binden kann zur Bildung eines Ligand/gespaltenes Substrat-Komplexes,
und wobei der für
das Substrat spezifische Ligand an das Substrat unter Bildung eines
Ligand/Substrat-Komplexes binden kann. Dieser fakultative Schritt
kann in einem Schritt im Anschluss an die Bildung des Reaktionsgemisches oder
bei der Ausführungsform,
in der ein für
das gespaltene Substrat spezifischer Ligand verwendet wird, gleichzeitig
mit der Bildung des Reaktionsgemisches erfolgen.
-
Die
Verfahren umfassen dann das Einfangen auf einer Messoberfläche (i)
des gespaltenen Substrats oder des Substrats des Reaktionsgemisches,
oder (ii) des Komplexes Ligand/gespaltenes Substrat oder des Komplexes
Ligand/Substrat des modifizierten Reaktionsgemisches, oder (iii)
des Liganden, der spezifisch für das
gespaltene Substrat ist, oder des Liganden, der spezifisch für das Substrat
des modifizierten Reaktionsgemisches ist, durch einen oberflächengebundenen
Bindungspartner an (i) oder (ii) oder (iii).
-
In
spezifischeren Ausführungsformen
ist die Probe, die die Betalactam-haltige Verbindung enthält, eine
flüssige
Probe, wie z. B. ein flüssiges
Nahrungsmittelprodukt. Jedoch kann die Probe auch eine feste Form
sein, d. h. entweder extrahiert von einer flüssigen Probe oder suspendiert
in einer flüssigen
Probe. In einer bevorzugten Ausführungsform
ist die flüssige
Probe Milch und die nachzuweisende Betalactam-haltige Verbindung
ein Betalactam-Antibiotikum, wie z. B. Penicillin oder Cephalosporin.
-
Die
D,D-Carboxypeptidase wird typischerweise von Actinomandura Stamm
R39 oder Streptomyces Stamm R61 erhalten, und das Substrat ist ein
Peptid mit AA-D-Alanin-D-Alanin am Carboxyende des Peptids, wobei
AA eine oder mehrere Aminosäure(n)
oder modifizierte Aminosäure(n)
wie z. B. N,N-Diacetyl-L-Lysyl-D-Alanin-D-Alanin oder N-Acetyl-L-Lysyl-D-Alanin-D-Alanin bedeutet.
In dem fakultativen Schritt zur Bildung des modifizierten Reaktionsgemisches
ist der Ligand, der für
das gespaltene Substrat spezifisch ist, oder ein Ligand, der für das Substrat
spezifisch ist, ein Antikörper.
-
An
der Messoberfläche
hängt die
Wahl des oberflächengebundenen
Bindungspartners von der Natur des dadurch zu bindenden Targets
ab. Wenn z. B. das gespaltene Substrat oder das Substrat des Reaktionsgemisches
eingefangen werden soll, ist der oberflächengebundene Bindungspartner
typischerweise ein oberflächengebundener
Antikörper,
der für
das gespaltene Substrat oder das Substrat spezifisch ist. Ähnlich ist, wenn
der Komplex Ligand/gespaltenes Substrat oder der Komplex Ligand/Substrat
des modifizierten Reaktionsgemisches nachgewiesen werden soll, der
oberflächengebundene
Bindungspartner typischerweise ein oberflächengebundener Antikörper, der
spezifisch für
den Komplex Ligand/gespaltenes Substrat oder den Komplex Ligand/Substrat
ist. Wenn dagegen der Ligand, der spezifisch für das gespaltene Substrat ist,
oder der Ligand, der für
das Substrat des modifizierten Reaktionsgemisches spezifisch ist,
eingefangen werden soll (z. B. ein Antikörper), ist der oberflächengebundene
Bindungspartner typischerweise ein oberflächengebundenes gespaltenes
Substrat bzw. ein oberflächengebundenes
Substrat.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist die Messoberfläche
eine Oberfläche
eines Affinitäts-Biosensors
und insbesondere eine Messoberfläche
eines Biosensors, der die Oberflächenplasmonresonanz
verwendet, wie z. B. das "BIOCORE
Instrument", das
im folgenden näher
diskutiert wird.
-
In
einer anderen Ausführungsform
enthält
das Verfahren weiterhin den Schritt der Beendigung der Reaktion
zwischen der D,D-Carboxypeptidase und dem Substrat in dem Reaktionsgemisch
oder in dem modifizierten Reaktionsgemisch. Die Beendigung kann
vor dem Schritt des Einfangens erfolgen, um Konsistenz von Messung
zu Messung vorzusehen, insbesondere wenn verschiedene Zeitlängen zwischen
dem Kontaktierungsschritt und dem Einfangschritt auftreten können.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung werden Kits zum Nachweis einer Betalactam-haltigen
Verbindung in einer Probe offenbart.
-
Ein
repräsentatives
Kit gemäß der Erfindung
enthält
(1) ein Substrat mit einem D-Alanin-D-Alanin mit endständiger Carboxygruppe,
(2) eine D,D-Carboxypeptidase,
die das endständige
D-Alanin von dem Substrat zur Erzeugung eines abgespaltenen Substrats
abspalten kann, (3) einen für
das abgespaltene Substrat spezifischen Liganden, und (4) einen Bindungspartner
von (3) oben, wobei der Bindungspartner an eine Messoberfläche eines
Biosensors gebunden werden kann. In bevorzugten Ausführungsformen
ist der für
das gespaltene Substrat spezifische Ligand ein Antikörper und
der Bindungspartner ein oberflächengebundenes
gespaltenes Substrat. In Zusammenhang mit dem BIACORE Instrument
enthält
das Kit vorzugsweise eine Messoberfläche mit einem oberflächengebundenen
gespaltenen Substrat. Die erfindungsgemäßen Kits können auch geeignete Puffer
und/oder Träger
für die
oben genannten Komponenten wie auch für die Reaktionsmischungen und
modifizierten Reaktionsmischungen enthalten.
-
Dieser
und andere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden im Zusammenhang
mit der beigefügten
Figur und der folgenden detaillierten Beschreibung verdeutlicht.
-
Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
-
Wie
oben erwähnt
ist die vorliegende Erfindung auf Verfahren und Kits zum Nachweis
von Betalactam-haltigen Verbindungen gerichtet. Der Ausdruck "Betalactam-haltige
Verbindungen" repräsentiert
eine Klasse von Verbindungen, die wenigstens einen Betalactamrest
enthalten, wie von der Struktur (I) unten dargestellt. Daher bedeutet
in der Praxis der vorliegenden Erfindung jede Verbindung, die wenigstens
einen Betalactamrest enthält,
eine Betalactam-haltige Verbindung. In einer spezielleren Ausführungsform
ist die Betalactam-haltige Verbindung ein Antibiotikum, wie z. B.
Penicilline oder Cephalosporine. Zum Beispiel enthalten Penicilline
einen Betalactamrest, wie in Struktur (II) dargestellt, wobei A
verschiedene Reste in Abhängigkeit
von der spezifischen Natur des Penicillins bedeutet (z. B. Penicillin
G, N, O, S, V usw.), während
Struktur (III) Cephalosporine darstellt, in der B/B' verschiedene Reste
in Abhängigkeit
von der spezifischen Natur des Cephalosporins oder ähnlicher
Verbindung (z. B. Cephalosporin C, Cephalothin, Cephamycin, Cephaparin, Cephradine
usw.) bedeuten.
-
-
Betalactam-haltige
Verbindungen der vorliegenden Erfindung inhibieren die Aktivität von D,D-Carboxypeptidasen
auf Substraten, die hierdurch spaltbar sind, insbesondere Substraten
mit D-Carboxy endständigem
Alanin.
-
Wenn,
in anderen Worten, eine Probe, die eine Betalactam-haltige Verbindung
enthält,
in Kontakt mit einer D,D-Carboxypeptidase und einem Substrat gebracht
wird, hängt
die Menge an Substrat, das von D,D-Carboxypeptidase zu dem gespaltenen
Substrat gespalten wird, von der Menge der Betalactam-haltigen Verbindung
in der Probe ab. Während
bekannt ist, dass Betalactam-haltige Antibiotika eine Anzahl von D,D-Carboxypeptidasen
reversibel inhibieren, ist in der Praxis dieser Erfindung eine bevorzugte
D,D-Carboxypeptidase eine solche, in der die Rate der Inaktivierung
sehr schnell ist, während
die Rate der Rückreaktion der
Inhibierung sehr langsam ist. Zu diesem Zweck gehören zu bevorzugten
D,D-Carboxypeptidasen (ohne hierauf beschränkt zu sein) die D,D-Carboxypeptidase,
die von dem Bakterienstamm Antinomadura R39 (UCB Bioproducts, Brüssel, Belgien)
(im nachfolgenden mit "R39
Enzym" bezeichnet)
isoliert ist, und die D,D-Carboxypeptidase, die von dem Bakterienstamm
Streptomyces R61 (Frère
et al., Methods Enzymol, 45B: 610–636, 1976) (im nachfolgenden
mit "R61 Enzym" bezeichnet).
-
In
der Praxis der vorliegenden Erfindung wird die Menge an Betalactam-haltiger
Verbindung in einer Probe nachgewiesen, indem man die Probe mit
einer D,D-Carboxypeptidase und einem Substrat mit D-Alanin-D-Alanin
mit endständiger
Carboxygruppe in Kontakt bringt. Die Probe selbst kann eine flüssige Probe sein,
wie z. B. ein flüssiges
Nahrungsmittelprodukt, oder eine feste Probe, die in Lösung gebracht
wurde oder anders extrahiert wurde, um eine flüssige Probe zu ergeben. Während die
vorliegende Erfindung über
einen weiten Anwendungsbereich hin von Nutzen ist, ist bei einer
bevorzugten Ausführungsform
die Probe eine flüssige
Probe, die für
den menschlichen Verbrauch vorgesehen ist, wie z. B. Milch und verwandte
Milchprodukte, wie z. B. Käse
und Joghurt. Zum Beispiel werden im Fall von Milch Betalactam-Antibiotika
den Milchkühen
zur Behandlung von Mastitis verabreicht, jedoch werden solche Antibiotika
als Verunreinigungen in Milch und verwandten Molkereiprodukten angesehen
und müssen
auf einen annehmbaren niedrigen Wert fallen, bevor sie an Menschen
verkauft werden können.
Daher hat ein Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit (oder Abwesenheit)
eines Betalactam-haltigen Antibiotikums in z. B. Milch einen beträchtlichen
kommerziellen Wert.
-
Frühere Techniken
zum Nachweis von Betalactam-Antibiotika in Milch, wie z. B. die
von Frére
et al. beschriebenen, wie oben im Abschnitt "Hintergrund der Erfindung" diskutiert, verwenden
eine D,D-Carboxypeptidase und Substrat, aber weisen die Bildung
des gespaltenen D-Alanins durch eine Serie von zeitaufwendigen und
mehrstufigen Verfahren, die eine Anzahl von Reagenzien benötigen, nach.
Die vorliegende Erfindung vermeidet diese Nachteile durch Nachweis
des gespaltenen Substrats (oder Substrats). In diesem Zusammenhang
bedeutet "gespaltenes
Substrat" den Teil
des Substrats, der nach Abspalten des D-Alanins mit endständiger Carboxygruppe
zurückbleibt.
Alternativ und in einer mehr bevorzugten Ausführungsform, wird das gespaltene
Substrat (oder Substrat) mit einem Liganden, der für das gespaltene
Substrat (oder Substrat) spezifisch ist, zur Bildung eines Komplexes
Ligand/gespaltenes Substrat (oder eines Komplexes Ligand/Substrat)
in Kontakt gebracht. Jeder zurückbleibende
Ligand, der nicht mit dem gespaltenen Substrat- (oder dem Substrat)
Komplex gebunden ist, wird dann nachgewiesen. Da der Ligand, der
typischerweise ein Antikörper ist,
eine größere Masse
als das gespaltene Substrat (oder als das Substrat) besitzt, ergibt
der Nachweis des Liganden durch eine auf die Masse ansprechende
Technik eine größere Empfindlichkeit
der Nachweismethode. Alternativ kann auch der Komplex aus Ligand
und gespaltenem Substrat (oder der Komplex aus Ligand und Substrat)
nachgewiesen werden.
-
Insbesondere
sind die erfindungsmäßigen Verfahren
auf den Nachweis einer Betalactam-haltigen Verbindung in einer Probe
durch Inkontaktbringen der Probe mit einer D,D-Carboxypeptidase
und einem Substrat mit einem D-Alanin-D-Alanin
mit endständiger
Carboxygruppe zur Bildung eines Reaktionsgemisches gerichtet. Wie
oben erwähnt
umfassen die bevorzugten D,D-Carboxypeptidasen
gemäß der Erfindung
das Enzym R39 und das Enzym R61, während bevorzugte Substrate
Peptide oder modifizierte Peptide sind, die die Struktur AA-D-Alanin-D-Alanin
an der endständigen
Carboxygruppe besitzen, wobei AA eine oder mehrere Aminosäure(n) oder
modifizierte Aminosäure(n)
wie z. B. N,N-Diacetyl-L-Lysyl-D-Alanin-D-Alanin oder N-Acetyl-L-Lysyl-D-Alanin-D-Alanin
bedeuten.
-
Die
Probe, die potentiell das Betalactam enthält, kann entweder in flüssiger oder
in fester Form vorliegen. Im Falle von Feststoffen wird die Probe
zuerst solubilisiert, gelöst,
extrahiert, suspendiert oder auf andere Weise in eine flüssige Form
gebracht. Die flüssige
Probe wird dann mit der D,D-Carboxypeptidase und Substrat in Kontakt
gebracht, typischerweise durch Zugabe von spezifischen Mengen hiervon
in ein bekanntes Probevolumen. Die Menge an D,D-Carboxypeptidase
und Substrat, die einem gegebenen Volumen einer Probe zugesetzt
wird, liegt normalerweise im Bereich von 10 bis 50 pmol D,D-Carboxypeptidase
und von 50 bis 1.000 nmol Substrat auf 0,5 bis 2,0 ml Probe. Das
Verhältnis
von Substrat zu Carboxypeptidase wird vorzugsweise im Bereich von
1.000 bis 50.000 gewählt
(d. h. ein klarer Überschuss
von Substrat aufgrund des enzymatischen Umsatzes durch die Peptidase).
Die Reaktionslösung
wird vorzugsweise 2 bis 15 Minuten lang bei 35 bis 45°C inkubiert.
-
Wenn
die D,D-Carboxypeptidase zu einer Probe zugesetzt wird, die keine
Betalactam-haltige Verbindung enthält, spaltet die D,D-Carboxypeptidase
das Substrat ungehindert vom hindernden Effekt der Betalactam-haltigen
Verbindung. Das ganze Substrat in der Probe wird durch die D,D-Carboxypeptidase
gespalten und ergibt gespaltenes Substrat, wenn es nicht vor Vervollständigung
der Reaktion gestoppt wird. In dem Ausmaß, in dem die Probe eine Betalactam-haltige
Verbindung enthält,
behindert im Gegensatz dazu die Betalactam-haltige Verbindung die
D,D-Carboxypeptidase, und verlangsamt so die Bildungsrate (und die
entsprechende Konzentration) des gespaltenen Substrats in dem Reaktionsgemisch.
Durch Nachweis der Menge des gespaltenen Substrats in dem Reaktionsgemisch
(oder der Menge an Substrat, die in dem Reaktionsgemisch verbleibt),
kann die Menge an Betalactam-haltiger Verbindung in der Probe bestimmt
werden.
-
Alternativ
und in einer stärker
bevorzugten Ausführungsform
wird das gespaltene Substrat mit einem Liganden, der für das gespaltene
Substrat spezifisch ist, in Kontakt gebracht unter Bildung eines
Komplexes Ligand/gespaltenes Substrat. In diesem Zusammenhang ist "der Ligand" jeder Bindungspartner
für das
gespaltene Substrat und typischerweise ein für das gespaltene Substrat spezifischer
Antikörper,
und "der Komplex" ist das daraus entstandene
Reaktionspaar. Der für
das gespaltene Substrat spezifische Ligand kann der Probe gleichzeitig
mit der D,D-Carboxypeptidase und Substrat zugegeben werden (in welchem
Fall das modifizierte Reaktionsgemisch gleichzeitig mit dem Reaktionsgemisch
gebildet wird), oder kann im Anschluss an die Bildung des Reaktionsgemisches
zugesetzt werden.
-
In
einer weiteren alternativen Ausführungsform
wird das Substrat mit einem Liganden der für das Substrat spezifisch ist,
zur Bildung eines Komplexes Ligand/Substrat in Kontakt gebracht.
Jedoch wird bei dieser Ausführungsform
der für
das Substrat spezifische Ligand vorzugsweise nach der Bildung des
Reaktionsgemisches zugesetzt, um eine Beeinflussung der Einwirkung
der D,D-Carboxypeptidase auf das Substrat zu verhindern.
-
Nachfolgend
auf die Bildung des Reaktionsgemisches durch Inkontaktbringen der
D,D-Carboxypeptidase mit dem Substrat und ggf. nachfolgend auf die
Bildung des modifizierten Reaktionsgemisches durch Kontakt mit dem
Liganden, der für
das gespaltene Substrat (oder das Substrat) spezifisch ist, kann
der Nachweis des gewünschten
Targets durch Verwendung eines geeigneten oberflächengebundenen Bindungspartners vervollständigt werden.
Wenn der Nachweis des gespaltenen Substrats (oder Substrats) des
Reaktionsgemisches gewünscht
wird, ist der oberflächengebundene
Bindungspartner ein Ligand, der für das gespaltene Substrat (oder
Substrat) spezifisch ist, typischerweise ein oberflächengebundener
Antikörper
für das
gespaltene Substrat (oder Substrat).
-
Wenn
andererseits ein modifiziertes Reaktionsgemisch gebildet wird, kann
entweder der Ligand selbst oder der Komplex Ligand/gespaltenes Substrat
(oder der Komplex Ligand/Substrat) nachgewiesen werden. In der Ausführungsform,
in der der für
das gespaltene Substrat (oder Substrat) spezifische Ligand nachgewiesen werden
soll, ist der oberflächengebundene
Bindungspartner ein Analyt, an den der Ligand zur Bildung eines Bindungspaares
bindet. Typischerweise ist der oberflächengebundene Bindungspartner
ein gespaltenes Substrat, das nach Kontakt mit dem Liganden ein
oberflächengebundenes
Bindungspaar gespaltenes Substrat/Ligand bildet. In der Ausführungsform,
in der der Komplex Ligand/gespaltenes Substrat (oder der Komplex
Ligand/Substrat) nachgewiesen werden soll, ist der oberflächengebundene
Bindungspartner ein Ligand, der spezifisch den gebildeten Komplex
Ligand/Substrat, an den der Komplex zur Bildung eines Bindungspaares bindet,
erkennt. Typischerweise ist der oberflächenbindende Partner ein Antikörper, der
nach Kontakt mit dem Komplex ein oberflächengebundenes Bindungspaar
Antikörper/Komplex
bildet.
-
Der
oberflächengebundene
Bindungspartner kann an eine Messoberfläche mittels einer Vielfalt
von bekannten Techniken gebunden werden, wie z. B. durch bekannte
Ligand-Immobilisierungstechniken über native -NH2,
-SH, -CHO und -COOH-Gruppen. Solche Techniken sind im Stand der
Technik wohlbekannt und geeignete Reagenzien und Verfahren zur Erzielung
der gewünschten
Immobilisierung der Bindungspartner stehen ohne weiteres zur Verfügung. Dementsprechend
kann eine Messoberfläche
gemäß der vorliegenden
Erfindung einen festen Metallträger
(z. B. Gold oder Silber) der darauf eine Beschichtung einer dicht
gepackten organischen Monoschicht enthält (wie im US-Patent 5,436,161
beschrieben) enthalten. Die Messoberfläche kann ferner eine bioverträgliche poröse Matrix,
wie z. B. ein Hydrogel (z. B. ein Polysaccharid wie Dextran) enthalten,
die mit der Beschichtung der organischen Monoschicht gekuppelt ist.
Ein solches Hydrogel kann dann auf geeignete Weise derivatisiert
werden, um Hydroxyl-, Carboxyl-, Amino-, Aldehyd-, Carbonyl-, Epoxy- oder
Vinylgruppen zur Immobilisierung des Bindungspartners enthalten,
was einen oberflächengebundenen Bindungspartner
ergibt.
-
In
einer typischen Ausführungsform
der Erfindung ist die Messoberfläche
eine Oberfläche
eines Biosensors (oder Biomessfühlers),
der die gewünschten
Bindungspartner immobilisiert enthält, und die Nachweistechniken
umfassen das Kontaktieren des immobilisierten Bindungspartners mit
dem Reaktionsgemisch oder dem modifizierten Reaktionsgemisch. Typischerweise
gehören
zu solchen Nachweistechniken, ohne hierauf beschränkt zu sein,
Methoden zum Nachweis der Masse, wie z. B. piezoelektrische, optische,
thermo-optische und oberflächenakustische-Wellen
(SAW)-Apparateverfahren
und elektrochemische Verfahren, wie z. B. potentiometrische, conductometrische,
amperometrische und kapazitive Verfahren. Im Betreff optischer Nachweismethoden
gehören
zu repräsentativen
Methoden solche, die die Oberflächenkonzentration
der Masse feststellen, wie z. B. optische Reflexionsmethoden, einschließlich sowohl
interner als auch externer Reflexionsmethoden, Winkel-, Wellenlänge- oder
Phasen aufgelöst,
z. B. ellipsometrische und Dämpfungswellen-Spektroskopie
(EWS), wobei letztere Oberflächenplasmonresonanz
(SPR) Spektroskopie, Brewster Winkelrefraktometrie, kritische Winkel-Refraktometrie,
frustrierte Totalreflexion (FTR), Dämpfungswellen-Ellipsometrie,
gestreute Totalinnenreflexion (STIR), optische Wellenleitersensoren,
auf gedämpfte
Wellen basierendes Abbilden, wie z. B. kritische Winkel aufgelöstes Abbilden,
Brewster-Winkel aufgelöstes
Abbilden, SPR-Winkel aufgelöstes
Abbilden usw. Ferner können
photometrische Methoden, die z. B. auf gedämpfte Fluoreszenz (TIRF) und
Phosphorreszenz basieren, eingesetzt werden, wie auch Wellenleiterinterferometer. Während gewisse
Aspekte der vorliegenden Erfindung im folgenden im Zusammenhang
mit dem BIACORE Instrument (BIACORE AB, Uppsala, Schweden) zusammen
mit seiner SPR-basierenden Technologie illustriert werden, ist darauf
hinzuweisen, dass die vorliegende Erfindung nicht auf solche Systeme
beschränkt
ist.
-
Insbesondere
ist darauf hinzuweisen, dass der Ausdruck "Biosensor", so wie er im Zusammenhang mit der
vorliegenden Erfindung verwendet wird, breit ausgelegt werden muss
und jede analytische Vorrichtung umfasst, die biomolekulare Interaktionen
zwischen dem interessierenden Target in dem Reaktionsgemisch oder
modifizierten Reaktionsgemisch und den oberflächengebundenen Bindungspartner
des Biosensors umfasst, vorausgesetzt, dass die Vorrichtung wenigstens
ein an einen Sensor gekoppeltes Messelement umfasst. Entsprechend
umfasst der Ausdruck "Biosensor" nicht nur analytische
Vorrichtungen, die Fließsysteme
zum Kontaktieren einer Probe mit einer oder mehreren Messoberflächen anwenden
(wie die mikrofluiden Strukturen des unten diskutierten BIACORE-Instruments),
sondern umfasst auch analytische Vorrichtungen, die nicht fließende Systeme
verwenden, um eine Probe mit einer oder mehreren Messoberflächen in
Kontakt zu bringen, wie z. B. Cuvetten-Anordnung, die bei einigen
Biosensor-Instrumenten verwendet wird. Als solche ist die vorliegende
Erfindung sowohl auf Fließsysteme
als auch auf Nichtfließ-
oder stationäre
Systeme anwendbar.
-
In
dieser Hinsicht wird eine repräsentative
Klasse von Biosensorinstrumenten unter der Marke BIACORE® (im
folgenden als "BIACORE
Instrument" bezeichnet)
von BIACORE AB (Uppsala, Schweden) vertrieben. Das BIACORE Instrument
umfasst eine Leuchtdiode, einen mit einem dünnen Goldfilm beschichteten
Messchip, eine integrierte Flüssigkeitspatrone
und einen Fotodetektor. Von der Diode einfallendes Licht wird am Goldfilm
reflektiert und vom Fotodetektor gemessen. In einem gewissen Einfallswinkel
("dem SPR-Winkel") wird eine Oberflächenplasmonwelle
in der Goldschicht erzeugt, die als Intensitätsverlust oder "Durchhang, Dip" in dem reflektierten
Licht beobachtet wird (eine vollständigere Beschreibung dieses
repräsentativen
BIACORE Instruments einschließlich
seiner mikrofluiden Blockeinheit für fließende Lösungen darin sind in dem US-Patent
5,313,264 zu finden).
-
Der
SPR-Winkel hängt
von dem Brechungsindex des Mediums dicht an der Goldschicht ab.
In dem BIACORE Instrument ist Dextran typischerweise mit der Goldoberfläche gekoppelt
und ein Ligand ist an der Dextranschicht gebunden. Der interessierende
Analyt wird in Lösungsform
durch eine Flüssigkeitspatrone
auf diese Messoberfläche
injiziert. Da der Brechungsindex in der Nähe des Goldfilms von (1) dem
Brechungsindex der Lösung
(der konstant ist), und (2) der Menge des Materials, das an die
Oberfläche
gebunden wird, abhängt, wird
die Interaktion zwischen dem gebundenen Liganden und dem Analyt
als Funktion der Änderung
des SPR-Winkels kontrolliert.
-
Ein
typischer Output des BIACORE Instruments ist ein "Sensorgramm", was ein Diagramm
des Response (gemessen in "Resonanzeinheiten" oder "RU") als eine Funktion
der Zeit ist. Eine Erhöhung
um 1.000 RU entspricht einem Anstieg der Masse auf der Sensoroberfläche von
etwa 1 ng/mm2. Wenn eine Probe, die einen
Analyt enthält,
in Kontakt mit der Sensoroberfläche
gelangt, reagiert der Ligand, der an die Sensoroberfläche gebunden
ist, mit dem Analyten in einem Schritt, der als "Assoziation" bezeichnet wird. Dieser Schritt auf
dem Sensorgramm wird durch ein Ansteigen von RU angezeigt, wenn
die Probe anfangs in Kontakt mit der Sensoroberfläche gebracht
ist. Im Gegensatz dazu geschieht eine "Dissoziation" gewöhnlich,
wenn der Probenfluss durch z. B. einen Pufferfluss ersetzt wird.
Dieser Schritt wird in dem Sensorgramm durch ein Abfallen von RU
mit der Zeit, wenn der Analyt von dem oberflächengebundenen Liganden dissoziiert,
angezeigt.
-
Dementsprechend
kann in einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung der Nachweis von gespaltenem Substrat
(oder Substrat) des Reaktionsgemisches durch Verwendung des BIACORE
Instruments, das einen geeigneten Liganden, der spezifisch für das gespaltene
Substrat (oder Substrat) an der Messoberfläche immobilisiert enthält, durchgeführt werden.
Alternativ kann der Nachweis des Liganden, der spezifisch für das gespaltene
Substrat (oder Substrat) ist, durch Verwendung des BIACORE Instruments
mit einem geeigneten Bindungspartner, wie z. B. gespaltenem Substrat
(oder Substrat), das an der Messoberfläche immobilisiert ist, durchgeführt werden.
In einer noch weiteren Ausführungsform
kann der Nachweis des Komplexes Ligand/gespaltenes Substrat (oder
des Komplexes Ligand/Substrat) durch Verwendung des BIACORE Instruments
mit einem geeigneten Bindungspartner, wie z. B. einem Antikörper, der
auf der Messoberfläche
immobilisiert ist, durchgeführt
werden. Eine quantitative Bestimmung wird vorzugsweise durch Erzeugung
einer Eichkurve mit Standardproben mit bekannten Mengen an Betalactam
durchgeführt.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
enthält
das Verfahren der vorliegenden Erfindung weiterhin einen Schritt
zur Beendigung der Reaktion zwischen der D,D-Carboxypeptidase und
dem Substrat in dem Reaktionsgemisch oder modifizierten Reaktionsgemisch.
Diese Beendigungsstufe kann durch Zugabe eines Überschusses an Betalactam ausgeführt werden,
wodurch die Aktivität
der D,D-Carboxypeptidase inhibiert wird. Alternativ kann eine Substanz
oder können
Bedingungen, die bekannt sind, die enzymatische Aktivität der D,D-Carboxypeptidase
zu zerstören,
dem Reaktionsgemisch oder modifizierten Reaktionsgemisch zugesetzt oder
hierauf angewandt werden. Repräsentative
Beispiele sind, ohne hierauf beschränkt zu sein, Zugabe von starker
Säure oder
Base, denaturierendem Detergenz, organischen Lösungsmitteln oder Kühlung auf
dem Eisbad, was die enzymatische Reaktion beträchtlich verlangsamt oder zum
Halten bringt. Der Beendigungsschritt wird typischerweise angewandt,
um den Versuch unter Bedingungen durchzuführen, bei denen zahlreiche
Proben zu verschiedenen Zeitpunkten untersucht werden.
-
In
einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden Kits zur Durchführung der
oben genannten Methoden offenbart. Solche Kits enthalten wenigstens
die folgenden Komponenten: (1) eine D,D-Carboxypeptidase, (2) ein
Substrat mit carboxyendständigem
D-Alanin-D-Alanin und (3) einen Bindungspartner für das gewünschte Target,
das auf der Messoberfläche
eingefangen werden soll. In der Ausführungsform, in der das gespaltene
Substrat (oder Substrat) des Reaktionsgemisches eingefangen werden
soll, ist der Bindungspartner ein Bindungspartner des gespaltenen
Substrats (oder des Substrats). Alternativ ist in der Ausführungsform,
in der der Ligand, der spezifisch für das gespaltene Substrat (oder
das Substrat) der modifizierten Reaktionsmischung ist, gefangen
werden soll, der Bindungspartner ein Bindungspartner des für das gespaltene
Substrat (oder das Substrat) spezifische Ligand. In der Ausführungsform,
in der der Komplex Ligand/gespaltenes Substrat (oder der Komplex
Ligand/Substrat) eingefangen werden soll, ist der Bindungspartner
ein Bindungspartner für
den Komplex Ligand/gespaltenes Substrat (oder dem Komplex Ligand/Substrat).
-
Zusätzlich zu
den oben genannten Komponenten kann das Kit ferner geeignete Puffer
und/oder Träger für die oben
genannten Komponenten wie auch für
die Reaktion und für
modifizierten Reaktionsgemische enthalten.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
enthält
das Kit: (1) ein Substrat mit carboxyendständigem D-Alanin-D-Alanin, (2)
eine D,D-Carboxypeptidase, die das endständige D-Alanin von dem Substrat
abspalten kann unter Erzielung eines gespaltenen Substrats, (3)
einen für
das gespaltene Substrat spezifischen Liganden, und (4) einen Bindungspartner
für (3)
oben, wobei der Bindungspartner an eine Messoberfläche eines Biosensors
gebunden werden kann. Vorzugsweise ist der Bindungspartner gespaltenes
Substrat und insbesondere ist er auf einer geeigneten Messoberfläche immobilisiert.
Zum Beispiel enthält
in Zusammenhang mit dem BIACORE Instrument das Kit vorzugsweise
ein Sensorchip, auf dem gespaltenes Substrat immobilisiert ist.
In diesem Zusammenhang geeignete Messchips basieren auf dem CM5-Chip, das von BIACORE
erhältlich ist,
auf dem das gespaltene Substrat oder ein Derivat hiervon immobilisiert
ist, das den für
das gespaltene Substrat spezifischen Liganden binden kann. Alternativ
enthält
das Kit den CM5-Chip, Kupplungsreagenzien zur Immobilisierung des
gespaltenen Substrats (oder eines Derivats hiervon) und das gespaltene
Substrat (oder ein Derivat hiervon), das zur Immobilisierung auf
dem CM5-Chip geeignet ist.
-
Das
folgende Beispiel dient zur Erläuterung,
nicht zur Begrenzung.
-
Beispiele
-
Beispiel 1
-
Nachweis von Penicillin
in Milch
-
Dieses
Beispiel verdeutlicht eine repräsentative
Methode gemäß der vorliegenden
Erfindung zum Nachweis der Anwesenheit und Menge von Penicillin
in einer Rohmilchprobe.
-
Eine
Rohmilchprobe (90 Mikroliter), die das vermutete Betalactam enthält, wird
mit 90 Mikrolitern eines 100 mM HEPES Puffer (pH 7,5) der 200 mM
NaCl, 6 mM MgCl2 und 150 nmol Ac2-L-Lys-D-Ala-D-Ala enthält, gemischt. Dem Reaktionsgemisch
werden 5,0 pmol Enzym R39 (in 20 Mikroli tern von 100 mM HEPES Puffer (pH
7,5), die 200 mM NaCl und 6 mM MgCl2 enthalten)
zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde fünf Minuten lang bei 40°C inkubiert.
Das Gemisch wird dann schnell auf einem Eisbad gekühlt und
zur Analyse in ein BIACORE 2000 Instrument gegeben. Das BIACORE
Instrument ist mit einem CM5 Sensorchip ausgerüstet, auf dem L-Lys-D-Ala-D-Ala unter Verwendung
eines Standardaminkupplungsverfahrens, das einen EDC/NHS Aktivierungsschritt
enthält,
immobilisiert worden ist. Unter Verwendung der Autosamplereinheit
in BIACORE 2000 werden 100 Mikroliter der Reaktionslösung mit
100 Mikroliter einer Antikörperlösung (1
pmol in 50 mM HEPES Puffer enthaltend 100 mM NaCl) gemischt und über den
Messchip injiziert. Der verwendete Antikörper wird so ausgewählt, dass
er spezifisch für
den Teil des Substrats ist, der die Struktur L-Lys-D-Ala-D-Ala enthält. Ein Respons
wird von dem BIACORE Instrument für eine Kontaktzeit von zwei
Minuten registriert. Das Niveau des Responses wird mit einer Eichkurve
verglichen, die auf ähnliche
Weise von Proben mit bekannten Mengen an Betalactam erhalten wurde,
woraus der Betalactamgehalt in der Milch bestimmt wird.
-
Es
wurden die Verfahren und Kits der vorliegenden Erfindung im Zusammenhang
mit den darin verdeutlichten und beschriebenen Ausführungsformen
beschrieben; die Erfindung kann jedoch auf andere spezifische Weisen
oder in anderen spezifischen Formen durchgeführt werden, ohne von ihrem
Sinn oder wesentlichen Merkmalen abzuweichen. Daher werden die beschriebenen
Ausführungsformen
in jeder Hinsicht als erläuternd
und nicht einschränkend
betrachtet. Das Ausmaß der
Erfindung wird daher eher durch die folgenden Ansprüche als
durch die voranstehende Beschreibung angegeben und alle Änderungen,
die innerhalb der Bedeutung und des Bereichs von Äquivalenz
der Ansprüche
liegen, werden von dem Umfang der Ansprüche umfasst.
