CN101692080B - 一种检测乳品中多种抗生素残留的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测乳品中多种抗生素残留的方法，通过对传感器表面进行特定修饰，采用分子标记物的抗体或特异性吸附蛋白进行配体固定；对乳品样品采取一系列预处理，对样品中的抗生素进行两次竞争抑制，将预处理后的样品通入传感器表面，使被分子标记的抗生素-抗体复合物和被分子标记的抗生素被吸附，通过测量分子标记的抗生素-抗体复合物间接测量样品中抗生素的含量；并对传感器表面进行重建，对其它抗生素预处理，进行另一种抗生素测量。本发明实现了同一传感器对多种抗生素的检测，大大节省了传感器的使用数量和传感器配体固定所需的时间，促进了基于表面等离子体共振的抗生素残留检测技术的推广和实际应用的发展。
Description
技术领域
本发明涉及一种食品中兽药残留检测技术。特别是涉及在采用表面等离子体共振传感器进行乳品中抗生素残留检测过程中的样品处理及传感器修饰方法。
背景技术
抗生素在乳制品中的残留越来越引起关注。除了一些常见的炎症疾病，奶牛尤其易患乳腺炎，因此兽医常采用抗生素进行治疗。由于一般抗生素能耐高温，现有的加热杀菌工艺根本无法完全消除牛奶中的抗生素残留。长期饮用含有微量抗生素的牛奶，会增加人体内细菌的耐药性，降低或完全抵消抗生素类药物的疗效，另外，对于特定人群，含有超量抗生素的牛奶还可能会引起抗生素过敏反应。
目前鲜奶中抗生素残留的检测方法大致分为三类，分别是：生物测定法(微生物测定法和放射受体测定法等)、理化分析法(波谱法和色谱及联用技术等)、免疫法(放射免疫法、荧光免疫法和酶联免疫法等)。由于生物测定法和理化分析法都具有测量程序复杂、时间长等缺点，不适宜广泛推广，因此，一些基于免疫法的检测技术得到了快速发展，有代表性的有酶联免疫法、免疫传感器等等。这些检测技术采用抗生素与其抗体的特异性反应，能够快速、准确的检测出乳品中的抗生素残留，检测限达到了欧盟对乳品中抗生素残留的最高检测限(Maxmum Residue Limit，MRL)。
这些免疫法的检测技术也存在缺点，检测用的试剂盒和传感器往往具有专一性。如在酶联免疫试剂盒中，针对青霉素的试剂盒是无法检测其他抗生素的，因为试剂盒中的酶标抗体只针对青霉素抗体。而在免疫传感器中，无论是直接法还是间接法，传感器上只针对待检测的抗生素进行配体固定，对其他类的抗生素也不再适用(同类的结构相似的抗生素除外)。因此，检测用的试剂盒和传感器作为免疫法的耗材需要量很大，而它们的成本往往都很高。例如，采用表面等离子体共振原理检测的仪器BIACore，其常用的传感器芯片CM5成本为2000多元人民币，有4个通道可以使用，最多检测4种抗生素。免疫法的耗材成本高也是其无法广泛推广的主要原因。
在采用表面等离子体共振技术的传感器进行抗生素的检测时，有两种方法，直接法和竞争法，这两种方法中，传感器均具有专一性。在采用直接法进行抗生素检测时，需要在传感器表面固定相应抗生素的单克隆/多克隆抗体，当含有该抗生素的牛乳流过时，传感器对抗生素进行吸附，光学信号发生变化，产生响应。由于抗生素的分子量很小(几百Da)，其信号与仪器噪声水平接近，因此，一般的表面等离子体共振传感器的检测极限无法检出该信号，随着一些高精度仪器的发展，可以进行某些抗生素在最高限量值附近的检测，但是对于一些限量值极低的抗生素(如，青霉素G的最高限量值为4ppb)仍然无法实现。竞争法需要在传感器表面固定待检测的抗生素或者抗生素偶联物，在样品中加入定量的该抗生素的单克隆/多克隆抗体进行竞争抑制，当样品流经传感器时，可以特异性的吸附未与抗生素结合的多余抗体，由于抗体分子量很大(几万-几十万Da)，因此，检测信号很大，而多余抗体的量也间接的反应了样品中抗生素的含量。因此，竞争法通过转换测量对象，大大增加了传感器的响应，是被广泛采用的方法，但传感器的专一性问题仍然存在。
有文献报道，采用地高辛(digoxigenin，DIG)标记氨苄青霉素进行竞争法的检测，与本文所述的检测方法有类似之处，但是由于DIG为小分子，采用DIG对其他抗生素进行标记几乎很难实现，未见过标记成功的报道，而该文献也未提出将DIG标记的检测方法推广到多种抗生素的检测。因此，采用DIG标记的方法仅限于某些特殊的可被DIG的少数抗生素。有些抗生素可以采用生物素进行标记，但是也仅限于很少的几种抗生素。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种采用同一表面等离子体共振传感器检测乳品中多种抗生素残留的方法，解决现有技术中传感器专一，不能测量多种抗生素的问题
本发明的技术方案为：一种采用同一表面等离子体共振生物传感器实现多种乳品中抗生素残留检测的方法，包括以下步骤：
(1)对传感器表面进行修饰，采用分子标记物的抗体或特异性吸附蛋白进行配体固定；
(2)对乳品样品采取预处理，对样品中的抗生素进行两次竞争抑制，如图1所示，包括：
首先，向样品中加入适量的待测抗生素的单克隆/多克隆抗体进行一段时间的孵化，使得样品中的抗生素与其抗体充分反应，其中抗体为过量；
其次，继续向样品中加入适量的被分子探针标记的待测抗生素，进行一段时间孵化，样品中剩余的抗体又与新加入的被分子标记的抗生素反应，其中分子探针标记的抗生素相对上步中加入的抗体量为过量；
(3)测量环节：将预处理后的样品通入传感器表面，使被分子标记的抗生素-抗体复合物和被分子标记的抗生素被吸附，通过测量分子标记的抗生素-抗体复合物间接测量样品中抗生素的含量；
(4)对传感器表面进行重建，对其它抗生素预处理，进行另一种抗生素测量。
所述分子标记物为多肽或蛋白质。
所述步骤(3)测量环节包括如下步骤：
(1)通入磷酸盐或者盐酸盐或者硼酸盐缓冲液作为测量基准；
(2)用缓冲液配置不同所测抗生素浓度的溶液；
(3)按照权利要求1步骤(1)所述方法，对配置的溶液进行预处理；
(4)将预处理后的溶液通入传感器一段时间，再通入缓冲液冲洗，记录通入溶液前后的传感器响应差值；
(5)对传感器的表面进行重建，并通入缓冲液冲洗；
(6)依次通入其他浓度的溶液，均记录传感器响应值；
(7)将各个浓度下的传感器响应绘制工作曲线，并进行二次多项式曲线拟合，获得回归曲线的方程；
(8)对于未知抗生素浓度的奶制样品进行测量，同样按照步骤(4)、(5)进行，获得样品通入前后的传感器差值；
(9)将传感器响应值代入回归曲线方程，预测出样品的抗生素浓度值。
所述蛋白质为牛血清白蛋白或卵清蛋白或匙孔血蓝蛋白等。
所述步骤(4)中传感器表面的重建是通入一定浓度的酸或碱或高离子强度电解质溶液，用以破坏抗原抗体的结合。
本发明引入分子探针技术，将表面等离子体共振传感器对待测抗生素的测量转换为对分子探针的测量，采用可对抗生素进行标记的分子探针的单克隆/多克隆抗体或者特异性吸附蛋白对表面等离子体共振传感器进行化学修饰，从而实现传感器的通用性，对任意可被分子探针标记的抗生素均可进行测量。具体测量的转换环节是通过样品的预处理实现的。
所述的测量环节是采用分子间相互作用原理实现的，采用分子探针的抗体或者特异性吸附蛋白对传感器表面进行修饰，将预处理后的样品通入传感器表面时，被分子标记的抗生素-抗体复合物和被分子标记的抗生素均被吸附。由于被吸附的两种分子，其总量是不变的，各自的含量成互补关系，若分子标记的抗生素含量多，则分子标记的抗生素-抗体量少，此时引起的传感器响应越小。在对不同抗生素浓度的样品进行测量时，抗生素含量越多，传感器吸附的分子标记的抗生素-抗体量越少，因此传感器响应越小。这样，就实现了测量对象的转换，通过测量分子标记的抗生素-抗体复合物间接测量样品中的抗生素。由于抗体的分子量很大，因此，传感器的响应很大，测量极限较低。配置不同浓度抗生素含量的样品获得其传感器响应，建立标准工作曲线，即可确定出样品中的抗生素残留量。具体测量原理见附图2。
所述的传感器对多种抗生素测量是通过对样品进行不同的预处理实现的，而测量环节是相同的，均是通过分子探针的抗体对其的特异性吸附实现的。对不同抗生素的检测，在预处理环节只需要在步骤(1)、(2)分别加入待测量的该抗生素的单克隆/多克隆抗体和分子探针标记的该抗生素即可。值得注意的是，要保证抗生素标记所使用的分子探针是相同的。
在测量步骤(2)中，配置的抗生素浓度选择依据为：围绕该抗生素的最高限量值MRL展开，覆盖0到2倍MRL，选择适当的浓度梯度即可。
本发明提供的采用表面等离子体共振传感器检测乳品中多种抗生素残留的方法，借助分子探针技术，解决了在表面等离子体共振传感器进行抗生素残留检测过程中的传感器专一性问题。通过对抗生素进行适当的分子标记，并通过样品的预处理将抗生素的检测转换为对分子探针的测量，实现了同一传感器对多种抗生素的检测。这一发明，增加了检测过程中所需的试剂，但大大节省了传感器的使用数量和传感器配体固定所需的时间，促进了基于表面等离子体共振的抗生素残留检测技术的推广和实际应用的发展。
附图说明
图1是本发明所述的待测样品的预处理方法流程图；其中(a)为样品中含有抗生素
(b)为样品中不含抗生素；△代表抗生素；
代表抗生素抗体；◆代表分子探针；
代表分子标记的抗生素。
图2是本发明所述的抗生素检测原理图；其中(a)为样品中含有抗生素
(b)为样品中不含抗生素；△代表抗生素；
代表抗生素抗体；◆代表分子探针；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作以详细描述。
实施例主要针对分子探针为大分子量(＞10000Da)的标记物进行说明，如多肽、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、匙孔血蓝蛋白(KLH)等生物大分子。
具体实例分子探针以BSA为例，两种抗生素以氨苄青霉素和链霉素为例，具体操作方法如下：
(1)传感器配体修饰方法
表面等离子体共振传感器表面为一层金或者银的金属薄膜，通常采用的方法是在其表面通过化学键修饰一层羧甲基葡聚糖，然后通过胺连接或者硫醇连接将配体固定到传感器表面，并封闭位点，形成待测表面。
本例采用BSA抗体作为配体，采用胺连接进行固定，用以吸附BSA标记后的抗生素。该方法属通用方法，不再赘述。
(2)氨苄青霉素的BSA标记
采用碳化二亚胺(EDC)法或者戊二醛法对氨苄青霉素进行BSA的标记处理，待用。或者直接购买氨苄青霉素-BSA偶联物待用。
(3)含氨苄青霉素的样品预处理方法
样品在进行测量之前需要进行两步预处理：
1)向样品中加入相对于氨苄青霉素含量过量的氨苄青霉素单克隆抗体，混合均匀，孵化15分钟；
2)向样品中加入相对于1)中抗体量过量的氨苄青霉素-BSA偶联物，混合均匀，孵化15分钟。
(4)氨苄青霉素的测量方法
对处理好的样品，可采用(1)中修饰好的传感器进行测量，具体测量步骤为：
1)通入磷酸盐缓冲液作为测量基准；
2)用磷酸盐缓冲液配置不同氨苄青霉素浓度的溶液，依次为0，1ng/ml，2ng/ml，4ng/ml，6ng/ml，8ng/ml，即约为0，0.25MRL，0.5MRL，1MRL，1.5MRL，2MRL。氨苄青霉素的MRL为4ppb。
3)按照(3)所述，对配置的溶液进行相同预处理；
4)将预处理后的溶液通入传感器10分钟，再通入缓冲液冲洗5分钟，记录通入溶液前后的传感器相应差值；
5)对传感器的表面通入进行重建，NaOH溶液(0.1mol/L)10分钟，用以破坏抗原抗体的结合，并通入缓冲液冲洗；
6)依次通入2)中配置的其他浓度的溶液，记录下通入前后的缓冲液的传感器响应差值；
7)将各个浓度下的传感器响应绘制工作曲线，并进行二次多项式曲线拟合，获得回归曲线的方程；
8)对于未知抗生素浓度的奶制样品进行测量，同样按照步骤(4)、(5)进行，获得样品通入前后的传感器差值；
9)将传感器响应值代入回归曲线方程，预测出样品的抗生素浓度值。
(5)对传感器表面进行重建，NaOH溶液(0.1mol/L)10分钟，对待测的另一种抗生素链霉素溶液进行预处理，将抗体变为链霉素单克隆抗体，而氨苄青霉素-BSA偶联物变为链霉素-BSA偶联物。
链霉素溶液的测量方法与(4)相同，步骤2)中配置的溶液浓度改为0，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml，300ng/ml，400ng/ml，即约为0，0.25MRL，0.5MRL，1MRL，1.5MRL，2MRL。链霉素的MRL为200ppb。
本发明传感器表面重建所用溶液还可以是盐酸溶液或弱酸弱碱溶液或高离子强度电解质溶液，用以破坏抗原抗体的结合。
本发明为了叙述的准确和方便，在实施例中均以氨苄青霉素和链霉素为例进行详细描述，但本发明同样适用于其他抗生素，如青霉素类和氨基糖苷类的其他抗生素、四环素类、大环内酯类等抗生素的精确检测和定性分析，因此上述内容均在本发明保护范围之内。
尽管本发明的组合和方法已通过详细实施过程进行了描述，但是本领域技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本申请所述的方法进行拼接或改动，或增减某些附加方法，更具体地说，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容之中。
Claims (4)
1.一种检测乳品中多种抗生素残留的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对传感器表面进行修饰，采用分子标记物的抗体或特异性吸附蛋白进行配体固定；
（2）对乳品样品采取预处理，对样品中的待测抗生素进行两次竞争抑制，包括：
首先，向样品中加入适量的待测抗生素的单克隆或多克隆抗体进行一段时间的孵化，使得样品中的抗生素与其抗体充分反应，其中抗体为过量；
其次，继续向样品中加入适量的被分子探针标记的待测抗生素，进行一段时间孵化，样品中剩余的抗体又与新加入的被分子探针标记的待测抗生素反应，其中分子探针标记的待测抗生素相对上步中加入的抗体量为过量；
（3）测量环节：将预处理后的样品通入传感器表面，使被分子探针标记的待测抗生素-抗体复合物和被分子标记的抗生素被吸附，通过测量分子标记的抗生素-抗体复合物间接测量样品中待测抗生素的含量；
所述测量环节包括如下步骤：
a)通入磷酸盐或者盐酸盐或者硼酸盐缓冲液作为测量基准；
b)用缓冲液配置不同所测抗生素浓度的溶液；
c)按照步骤（2）所述方法，对配置的溶液进行预处理；
d)将预处理后的溶液通入传感器一段时间，再通入缓冲液冲洗，记录通入溶液前后的传感器响应差值；
e)对传感器的表面进行重建，并通入缓冲液冲洗；
f)依次通入其他浓度的溶液，均记录传感器响应值；
g)将各个浓度下的传感器响应绘制工作曲线，并进行二次多项式曲线拟合，获得回归曲线的方程；
h)对于未知抗生素浓度的奶制样品进行测量，同样按照步骤d）、e）进行，获得样品通入前后的传感器差值；
i）将传感器响应值代入回归曲线方程，预测出样品的抗生素浓度值；
（4）对传感器表面进行重建，对其它抗生素预处理，进行另一种抗生素测量。
2.根据权利要求1所述检测乳品中多种抗生素残留的方法，其特征在于，所述分子标记物为多肽或蛋白质。
3.根据权利要求2所述检测乳品中多种抗生素残留的方法，其特征在于，所述蛋白质为牛血清白蛋白或卵清蛋白或匙孔血蓝蛋白。
4.根据权利要求1所述检测乳品中多种抗生素残留的方法，其特征在于，所述步骤（4）中传感器表面的重建是通入一定浓度的高离子强度电解质溶液。
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