JP2022512565A - 細胞ベースのクロストリジウム神経毒アッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
a. C末端側検出可能標識を含むポリペプチドを発現するヒト神経細胞の試料を提供する工程であって、前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒によって切断可能である工程と、
b. 前記細胞の標的遺伝子の発現を変更する工程と、
c. 前記細胞を前記クロストリジウム神経毒と接触させる工程と、
d. C末端側検出可能標識の量を測定し、それによってクロストリジウム神経毒活性を定量する工程と、
e. その定量されたクロストリジウム神経毒活性が、前記標的遺伝子の発現が未変更のときに定量されたクロストリジウム神経毒活性と異なる場合に、前記標的遺伝子をクロストリジウム神経毒活性の制御因子として同定する工程と、
を含む方法を提供する。
a. C末端側検出可能標識を含むポリペプチドを発現するヒト神経細胞の試料を提供する工程であって、前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒によって切断可能である工程と、
b. 前記細胞を前記クロストリジウム神経毒及び剤と接触させる工程であって、その接触は順次的に又は同時である工程と、
c. C末端側検出可能標識の量を測定し、それによってクロストリジウム神経毒活性を定量する工程と、
d. その定量されたクロストリジウム神経毒活性が、前記剤の非存在下で定量されたクロストリジウム神経毒活性と異なる場合に、前記剤をクロストリジウム神経毒活性の制御因子として同定する工程と、
を含む方法を提供する。
i. クロストリジウム神経毒の細胞への結合、
ii. クロストリジウム神経毒の内在化、
iii. クロストリジウム神経毒L鎖のエンドソーム外への転位置(L鎖とH鎖との間のジスルフィド結合の還元を含む)、
iv. 触媒作用(例えば、SNARE切断の阻害若しくは活性化)、又は
v. 効果(例えば、細胞の細胞質内のL鎖活性の持続)の持続時間
のレベルの直接的制御であり得る。
a. C末端側検出可能標識を含むポリペプチドを発現するヒト神経細胞の複数の試料を提供する工程であって、前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒によって切断可能である工程と、
b. 前記複数の試料の各々において異なる標的遺伝子の発現を変更する工程であって、前記標的遺伝子が細胞の各試料において異なる工程と、
c. 前記細胞をクロストリジウム神経毒と接触させる工程と、
d. C末端側検出可能標識の量を測定することによって、クロストリジウム神経毒活性を定量する工程と、
e. その定量されたクロストリジウム神経毒活性が、1つ以上の標的遺伝子の発現が未変更のときに定量されたクロストリジウム神経毒活性と異なる場合に、その1つ以上の標的遺伝子をクロストリジウム神経毒活性の制御因子として同定する工程、又は
f. その定量されたクロストリジウム神経毒活性が、1つ以上の標的遺伝子の発現が未変更のときに定量されたクロストリジウム神経毒活性と同等である場合に、その1つ以上の標的遺伝子がクロストリジウム神経毒活性の制御因子ではないと同定する工程と、
を含む。
a. C末端側検出可能標識を含むポリペプチドを発現するヒト神経細胞の複数の試料を提供する工程であって、前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒によって切断可能である工程と、
b. 前記細胞をクロストリジウム神経毒及び剤と接触させる工程であって、その接触は順次的に又は同時であり、及び前記試料の各々は異なる剤と接触される工程と、
c. C末端側検出可能標識の量を測定し、それによってクロストリジウム神経毒活性を定量する工程と、
d. その定量されたクロストリジウム神経毒活性が、1つ以上の剤の非存在下で定量されたクロストリジウム神経毒活性と異なる場合に、その1つ以上の剤をクロストリジウム神経毒活性の制御因子として同定する工程、又は
e. その定量されたクロストリジウム神経毒活性が、1つ以上の剤の非存在下で定量されたクロストリジウム神経毒活性と同等である場合に、その1つ以上の剤はクロストリジウム神経毒活性の制御因子ではないと同定する工程と、
を含む。
a. クロストリジウム神経毒と、
b. GDNF、細胞浸透性の環状アデノシン一リン酸(cAMP)、CaCl2、及びKClを含む、バッファと、
を含む、組成物を提供する。
同一性の一致の総数
__________________________________________ x 100
[長い方の配列の長さ+2つの配列をアラインメントするために長い方の配列に導入されたギャップの数]
アルギニン
リジン
ヒスチジン
酸性:
グルタミン酸
アスパラギン酸
極性:
グルタミン
アスパラギン
疎水性:
ロイシン
イソロイシン
バリン
芳香族:
フェニルアラニン
トリプトファン
チロシン
小:
グリシン
アラニン
セリン
トレオニン
メチオニン
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promoter: プロモータ
truncated: トランケート型
Linker: リンカー
Modified Lentivirus generation protocol: 改変レンチウィルス生成プロトコル
Fluorescence activated cell sorting: 蛍光活性化セルソーティング
[図2]
No Toxin:毒なし
Merged:重ね合わせ
対照(毒なし)に対するGFP/RFP百分率
残存構築物百分率
[図3]
Degradation: 分解
[図4]
Normal media: 標準培地
ReDS media: ReDS培地
Merged:重ね合わせ
% GFP/RFP normalized to ctrl: 対照に対して標準化されたGFP/RFP百分率
Normal:標準
[図5]
siRNA control: siRNA対照
% TrxR1 knockdown relative to NT3: NT3に対するTrxR1ノックダウン百分率
% GFP/RFP relative to ctrl (no tox): 対照(毒なし)に対するGFP/RFP百分率
[図6]
Surface SV2A: 表面SV2A
Merged:重ね合わせ
Nornal: 標準
Surface SV2: 表面SV2
Internalized SV2: 内在化SV2
Low surface SV2: 低い表面SV2
Lower surface SV2: より低い表面SV2
Rescued surface SV2: レスキューされた表面SV2
[図7]
Seed cells in laminin-coated Perkin Elmer CellCarrier 384 UltraTM imaging plate: 細胞をラミニンコーティングPerkin Elmer CellCarrier 384 Ultra(商標)イメージングプレートに播種する
Enhanced differentiation with withdrawal of EGF and FGF2, addition of GDNF and d-CAMP: EGF及びFGF2を断ち、GDNF及びd-CAMPを加えて分化を増強
Prepare siRNA assay library plates from stock plate using Agilent BravoTM Liquid handling platform: Agilent Bravo(商標)液体ハンドリングプラットフォームを用いてストックプレートからsiRNAアッセイライブラリプレートを調製する
Complex siRNA with LipofectamineTM RNAiMAX: siRNAをLipofectamine(商標) RNAiMAXと複合化する
siRNA forward transfection: transfer siRNA complexes into cell plate using Integra VIAFLOTM 384: siRNAフォワードトランスフェクション:Integra VIAFLO(商標) 384を用いてsiRNA複合体をセルプレートへ移行する
Addition of BoNT/A prepared in stimulation buffer (+KCL, +CaCl2): 刺激バッファ(+KCL、+CaCl2)中で調製されたBoNT/Aを添加
Plates are fixed and imaged using OperaTM Phenix High content screen microscope: プレートを固定し、Opera(商標) Phenixハイコンテントスクリーニング顕微鏡を用いて画像化する
Images are quantified using ColumbusTM software: Columbus(商標)ソフトウェアを用いて画像を定量する
Claims (50)
- クロストリジウム神経毒活性を制御する遺伝子を同定する方法であって、以下の工程を含む方法:
a. C末端側検出可能標識を含むポリペプチドを発現するヒト神経細胞の試料を提供する工程であって、前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒によって切断可能である工程と;
b. 前記細胞の標的遺伝子の発現を変更する工程と;
c. 前記細胞を前記クロストリジウム神経毒と接触させる工程と;
d. C末端側検出可能標識の量を測定し、それによってクロストリジウム神経毒活性を定量する工程と;
e. その定量されたクロストリジウム神経毒活性が、前記標的遺伝子の発現が未変更のときに定量されたクロストリジウム神経毒活性と異なる場合に、前記標的遺伝子をクロストリジウム神経毒活性の制御因子として同定する工程、又は
f. その定量されたクロストリジウム神経毒活性が、前記標的遺伝子の発現が未変更のときに定量されたクロストリジウム神経毒活性と同等である場合に、前記標的遺伝子がクロストリジウム神経毒活性の制御因子ではないと同定する工程。 - 発現が前記標的遺伝子の発現を下方制御することによって変更される、請求項1に記載の方法。
- その定量されたクロストリジウム神経毒活性が、前記標的遺伝子の発現が未変更のときに定量されたクロストリジウム神経毒活性よりも小さい場合に、前記標的遺伝子がクロストリジウム神経毒活性の正の制御因子として同定される、請求項2に記載の方法。
- その定量されたクロストリジウム神経毒活性が、前記標的遺伝子の発現が未変更のときに定量されたクロストリジウム神経毒活性よりも大きい場合に、前記標的遺伝子がクロストリジウム神経毒活性の負の制御因子として同定される、請求項2又は3に記載の方法。
- ヒト神経細胞の複数の試料が提供され、及びヒト神経細胞の各試料において異なる標的遺伝子の発現が変更される、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 異なる標的遺伝子の前記発現が、ヒトRNAiライブラリを用いた各試料において変更される、請求項5に記載の方法。
- 前記標的遺伝子がクロストリジウム神経毒活性の直接的な制御因子であるのかクロストリジウム神経毒活性の間接的な制御因子であるのかを決定する工程をさらに含む、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記直接的な制御因子は以下のレベルにおいてクロストリジウム神経毒活性を制御する、請求項7に記載の方法:
i. クロストリジウム神経毒の細胞への結合;
ii. クロストリジウム神経毒の内在化;
iii. クロストリジウム神経毒のL鎖のエンドソーム外への転位置;
iv. 触媒作用; 及び/又は
v. 細胞の細胞質内のL鎖活性の持続。 - 前記間接的な制御因子は、クロストリジウム神経毒受容体の細胞輸送を制御する、請求項7又は8に記載の方法。
- 前記決定する工程は、前記標的遺伝子の発現が変更された場合の前記細胞のクロストリジウム神経毒受容体の有無を検出する工程を含む、請求項7~9のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項7~10のいずれか1項に記載の方法であって、
前記標的遺伝子の発現が変更された(好ましくは下方制御された)場合に、前記標的遺伝子の発現が未変更であるクロストリジウム神経毒と接触された同等細胞と比較して、前記細胞の表面上でクロストリジウム神経毒受容体の減少された量を検出することが、前記標的遺伝子がクロストリジウム神経毒活性を間接的に制御することを示し、又は
前記標的遺伝子の発現が変更された(好ましくは下方制御された)場合に、前記標的遺伝子の発現が未変更であるクロストリジウム神経毒と接触された同等細胞と比較して、前記細胞の表面上でクロストリジウム神経毒受容体の同等又はより多くの(好ましくはより多くの)量を検出することが、前記標的遺伝子がクロストリジウム神経毒活性を直接的に制御することを示す、
方法。 - 前記クロストリジウム神経毒受容体はシナプス小胞糖タンパク質2A(SV2)である、請求項9~11のいずれか1項に記載の方法。
- クロストリジウム神経毒活性を制御する剤を同定する方法であって、以下の工程を含む方法:
a. C末端側検出可能標識を含むポリペプチドを発現するヒト神経細胞の試料を提供する工程であって、前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒によって切断可能である工程と;
b. 前記細胞をクロストリジウム神経毒及び剤と接触させる工程であって、その接触は順次的に又は同時である工程と;
c. C末端側検出可能標識の量を測定し、それによってクロストリジウム神経毒活性を定量する工程と;
d. その定量されたクロストリジウム神経毒活性が、前記剤の非存在下で定量されたクロストリジウム神経毒活性と異なる場合に、前記剤をクロストリジウム神経毒活性の制御因子として同定する工程、又は
e. その定量されたクロストリジウム神経毒活性が、前記剤の非存在下で定量されたクロストリジウム神経毒活性と同等である場合に、前記剤がクロストリジウム神経毒活性の制御因子ではないと同定する工程。 - その定量されたクロストリジウム神経毒活性が、前記剤の非存在下で定量されたクロストリジウム神経毒活性よりも小さい場合に、前記剤がクロストリジウム神経毒活性の負の制御因子として同定される、請求項13に記載の方法。
- その定量されたクロストリジウム神経毒活性が、前記剤の非存在下で定量されたクロストリジウム神経毒活性よりも大きい場合に、前記剤がクロストリジウム神経毒活性の正の制御因子として同定される、請求項13又は14に記載の方法。
- 前記剤がクロストリジウム神経毒活性の直接的な制御因子であるかクロストリジウム神経毒活性の間接的な制御因子であるかを決定する工程をさらに含む、請求項13~15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記直接的な制御因子は以下のレベルにおいてクロストリジウム神経毒活性を制御する、請求項16に記載の方法:
i. クロストリジウム神経毒の細胞への結合;
ii. クロストリジウム神経毒の内在化;
iii. クロストリジウム神経毒のL鎖のエンドソーム外への転位置;
iv. 触媒作用; 及び/又は
v. 細胞の細胞質内のL鎖活性の持続。 - 前記間接的な制御因子は、クロストリジウム神経毒受容体の細胞輸送を制御する、請求項16又は17に記載の方法。
- 前記決定する工程は、前記細胞が前記剤により標的化された場合の前記細胞のクロストリジウム神経毒受容体の有無を検出する工程を含む、請求項16~18のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項16~19のいずれか1項に記載の方法であって、
前記細胞が前記剤と接触された場合に、前記剤と接触されなかったクロストリジウム神経毒と接触された同等細胞と比較して、前記細胞の表面上でクロストリジウム神経毒受容体の減少された量を検出することが、前記剤がクロストリジウム神経毒活性を間接的に制御することを示し、又は
前記細胞が前記剤と接触された場合に、前記剤と接触されなかったクロストリジウム神経毒と接触された同等細胞と比較して、前記細胞の表面上でクロストリジウム神経毒受容体の同等又はより多くの(好ましくはより多くの)量を検出することが、前記剤がクロストリジウム神経毒活性を直接的に制御することを示す、
方法。 - 前記クロストリジウム神経毒受容体がシナプス小胞糖タンパク質2A(SV2)である、請求項18~20のいずれか1項に記載の方法。
- ポリペプチドを発現するヒト神経細胞であって、前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒によって切断可能であり及びC末端側検出可能標識を含む、ヒト神経細胞。
- 前記ヒト神経細胞は非癌細胞である、請求項1~21のいずれか1項に記載の方法又は請求項22に記載の細胞。
- 前記ヒト神経細胞は不死化されたヒト神経前駆細胞であり、又は好ましくは前記ヒト神経細胞は不死化されたヒト神経前駆細胞から誘導された(例えば分化された)、請求項1~23のいずれか1項に記載の方法若しくは細胞。
- 前記ポリペプチドはN末端側検出可能標識をさらに含み、及び前記N末端側検出可能標識は前記C末端側検出可能標識とは異なる、請求項1~24のいずれか1項に記載の方法若しくは細胞。
- 前記検出可能標識のうちの1つは赤色蛍光タンパク質(RFP)であり、及び前記検出可能標識のうちの1つは緑色蛍光タンパク質(GFP)、シアン蛍光タンパク質(CFP)、及び黄色蛍光タンパク質(YFP)から選択される、請求項25に記載の方法若しくは細胞。
- 前記ポリペプチドはN末端側RFP及びC末端側GFPを含む、請求項1~26のいずれか1項に記載の方法若しくは細胞。
- 請求項1~27のいずれか1項に記載の方法若しくは細胞: ここで、
a. 前記ポリペプチドは以下を含むヌクレオチド配列によってコードされ、
i. 配列番号3に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ii. 配列番号9に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、及び/若しくは
iii. 配列番号11に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列; 又は
b. 前記ポリペプチドは配列番号1に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ; 又は
c. 前記ポリペプチドは以下を含むポリペプチド配列を含み、
i. 配列番号4に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列、
ii. 配列番号10に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列、及び/若しくは
iii. 配列番号12に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列; 又は
d. 前記ポリペプチドは配列番号2に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。 - 請求項1~28のいずれか1項に記載の方法若しくは細胞: ここで、
a. 前記ポリペプチドは以下を含むヌクレオチド配列によってコードされ、
i. 配列番号3に対して少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ii. 配列番号9に対して少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、及び/若しくは
iii. 配列番号11に対して少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列; 又は
b. 前記ポリペプチドは配列番号1に対して少なくとも80%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ; 又は
c. 前記ポリペプチドは以下を含むポリペプチド配列を含み、
i. 配列番号4に対して少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列、
ii. 配列番号10に対して少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列、及び/若しくは
iii. 配列番号12に対して少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列; 又は
d. 前記ポリペプチドは配列番号2に対して少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。 - 請求項1~29のいずれか1項に記載の方法若しくは細胞: ここで、
a. 前記ポリペプチドは以下を含むヌクレオチド配列によってコードされ、
i. 配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
ii. 配列番号9に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、及び/若しくは
iii. 配列番号11に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列; 又は
b. 前記ポリペプチドは配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ; 又は
c. 前記ポリペプチドは以下を含むポリペプチド配列を含み、
i. 配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列、
ii. 配列番号10に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列、及び/若しくは
iii. 配列番号12に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列; 又は
d. 前記ポリペプチドは 配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。 - 請求項1~30のいずれか1項に記載の方法若しくは細胞: ここで、
a. 前記ポリペプチドは以下を含むヌクレオチド配列によってコードされ、
i. 配列番号3、
ii. 配列番号9、及び
iii. 配列番号11; 又は
b. 前記ポリペプチドは配列番号1を含むヌクレオチド配列によってコードされ; 又は
c. 前記ポリペプチドは以下を含み、
i. 配列番号4、
ii. 配列番号10、及び
iii. 配列番号12; 又は
d. 前記ポリペプチドは配列番号2を含む。 - ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、前記ポリペプチドはクロストリジウム神経毒によって切断可能であり並びにN末端側RFP及びC末端側GFPを含み、前記ヌクレオチド配列は、
a. 配列番号3に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
b. 配列番号9に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、及び
c. 配列番号11に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列、
を含む、ヌクレオチド配列。 - 前記ヌクレオチド配列は配列番号1に対して少なくとも70%の配列同一性を有する、請求項32に記載のヌクレオチド配列。
- 前記ヌクレオチド配列は配列番号1に対して少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項32又は33に記載のヌクレオチド配列。
- 前記ヌクレオチド配列は配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項32~34のいずれか1項に記載のヌクレオチド配列。
- 前記ヌクレオチド配列は配列番号1を含む、請求項32~35のいずれか1項に記載のヌクレオチド配列。
- 前記ヌクレオチド配列は配列番号1からなる、請求項1~31のいずれか1項に記載の方法若しくは細胞又は請求項32~36のいずれか1項に記載のヌクレオチド配列。
- 請求項32~37のいずれか1項に記載のヌクレオチド配列を含む、ベクター。
- クロストリジウム神経毒によって切断可能であり並びにN末端側RFP及びC末端側GFPを含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、
a. 配列番号4に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列、
b. 配列番号10に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列、及び
c. 配列番号12に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド配列、
を含む、ポリペプチド。 - 前記ポリペプチド配列は配列番号2に対して少なくとも70%の配列同一性を有する、請求項39に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチド配列は配列番号2に対して少なくとも80%の配列同一性を有する、請求項39又は40に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチド配列は配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項39~41のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチド配列は配列番号2を含む、請求項39~42のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチド配列は配列番号2からなる、請求項1~31若しくは37のいずれか1項に記載の方法若しくは細胞又は請求項39~43のいずれか1項に記載のポリペプチド。
- 前記方法は、前記細胞を、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、細胞浸透性の環状アデノシン一リン酸(cAMP)、CaCl2、及びKClを含むバッファと接触させる工程を含む、請求項1~31、37、若しくは44のいずれか1項に記載の方法。
- 前記GDNFは1~100ng/mlの濃度で前記バッファ中に存在し、cAMPは0.1~5mMの濃度で前記バッファ中に存在し、CaCl2は0.1~7mMの濃度で前記バッファ中に存在し、及び/又はKClは1~100mMの濃度で前記バッファ中に存在する、請求項45に記載の方法。
- キットであって、
a. 請求項22~31、37、若しくは44のいずれか1項に記載の細胞、又は
b. 請求項32~37のいずれか1項に記載のヌクレオチド配列、又は
c. 請求項38に記載のベクターと、
c. 随意によりそれらの使用のための指示と、
を含む、キット。 - バッファをさらに含み、前記バッファは、GDNF、細胞浸透性の環状アデノシン一リン酸(cAMP)、CaCl2、及びKClを含む、請求項47に記載のキット。
- 組成物であって、
a. クロストリジウム神経毒と
b. バッファであって、GDNF、細胞浸透性の環状アデノシン一リン酸(cAMP)、CaCl2、及びKClを含むバッファと、
を含む、組成物。 - 前記GDNFは1~100ng/mlの濃度で前記バッファ中に存在し、cAMPは0.1~5mMの濃度で前記バッファ中に存在し、CaCl2は0.1~7mMの濃度で前記バッファ中に存在し、及びKClは1~100mMの濃度で前記バッファ中に存在する、請求項48に記載のキット又は請求項49に記載の組成物。
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