KR20190068582A - 보툴리눔 신경독소의 활성을 측정하기 위한 시험관내 및 세포 기반 검정 - Google Patents

보툴리눔 신경독소의 활성을 측정하기 위한 시험관내 및 세포 기반 검정 Download PDF

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Abstract

본 명세서에는 보툴리눔 신경독소(BoNT) 또는 파상풍 신경독소와 같은 신경독소의 검출 및 특징분석을 위한 수단이 개시되어 있다. 본 개시내용은 시험관내에서 그리고 생체내에서 신경독소의 효능 및 활성을 결정하는 방법을 제공한다. 또한, 신경독소 분할 부위를 포함하는 링커에 의해 분할된 리포터 단백질의 N-말단 단편 및 C-말단 단편을 포함하는 폴리펩타이드가 개시되어 있다. 신경독소에 의한 링커의 분할은 리포터 단백질 활성을 감소시켜, 신경독소의 활성을 나타낸다. 개시된 폴리펩타이드, 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, 및 이러한 폴리펩타이드를 발현시키는 세포를 포함하는 조성물 및 키트가 또한 개시되어 있다.

Description

보툴리눔 신경독소의 활성을 측정하기 위한 시험관내 및 세포 기반 검정
관련 출원에 대한 상호 참조문헌
본 출원은 2016년 10월 20일자로 출원된 미국 가출원 제62/410558호의 이익을 주장하며, 이러한 문헌의 내용은 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 명세서는 서열 목록(.txt 파일명 "0342941_0630_SL.TXT"으로 전자적으로 제출됨)을 참조한다. .txt 파일은 2017년 10월 13일자로 생성되었고, 크기가 34,305 바이트이다. 서열 목록 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
기술 분야
본 명세서에 기술된 기술은 신경독소, 예를 들어, 보툴리눔 독소(botulinum toxin)의 활성을 결정하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
보툴리눔 신경독소(Botulinum neurotoxin; BoNT)는 생물테러(bioterrorism) 문제뿐만 아니라 치료 적용 둘 모두에 대해 고려되는 제제이다. 전통적으로, BoNT의 검출 및 특징분석은 샘플을 마우스에 투여하여 상당한 용량에서 마우스의 사망을 유발시킴으로써 수행되었다. 세포에서 또는 시험관내에서 수행될 수 있는 검정은 탐구되었지만, 민감성 또는 특이성이 부족하여, 종종 임상 샘플의 공통 구성성분과의 반응의 결과로서 양성 신호를 유발시킨다.
본 명세서에는 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 BoNT의 활성을 검출하고 측정하기 위해 개발된 신규한 검정이 기술된다. 본 검정은 예를 들어, BoNT 활성에 대한 센서로서 역할을 하도록 조작된 BoNT의 기질을 통해 연결된 분할 루시페라제를 특징으로 하는 독특한 단일 사슬 폴리펩타이드를 사용한다. BoNT의 존재 하에서, 링커 영역은 독소에 의해 분할되어, 루시페라제 활성을 감소시키며, 이는 용이하게 검출된다.
임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는, N-말단에서 C-말단으로, a) 리포터 단백질(reporter protein)의 N-말단 단편; b) 신경독소 분할 부위(neurotoxin cleavage site)를 포함하는 링커; 및 c) 리포터 단백질의 C-말단 단편을 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드로서, N-말단 단편 및 C-말단 단편은 총괄적으로, 기능성 리포터 단백질 서열을 포함하며; 링커는 기능성 리포터 융합 단백질을 형성하기 위해 N-말단 단편 및 C-말단 단편을 기능적으로 연결시키는 단일 사슬 폴리펩타이드가 기술된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 리포터 단백질은 루시페라제 단백질이다.
임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 a) 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 1 내지 159와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 N-말단 도메인(N-nano1-159); b) N-nano1 -159에 C-말단이 위치된 신경독소 분할 부위를 포함하는 링커; 및 c) 링커에 C-말단이 위치된 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 160 내지 170과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 C-말단 도메인(C-nano160-170)을 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드로서, 링커는 기능성 루시페라제 융합 단백질을 형성하기 위해 N-nano1 -159 및 C-nano160 -170을 기능적으로 연결시키는 단일 사슬 폴리펩타이드가 기술된다.
임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 a) 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 1 내지 159에 비해 10개 미만의 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 부가를 갖는 서열을 포함하는 N-말단 도메인(N-nano1 -159); b) N-nano1 -159에 C-말단이 위치된 신경독소 분할 부위를 포함하는 링커; 및 c) 링커에 C-말단이 위치된, 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 160 내지 170에 비해 3개 미만의 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 부가를 갖는 서열을 갖는 C-말단 도메인(C-nano160 - 170)을 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드로서, 링커는 기능성 루시페라제 융합 단백질을 형성하기 위해 N-nano1 -159와 C-nano160 -170을 기능적으로 연결시키는 단일 사슬 폴리펩타이드가 기술된다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, N-말단 도메인은 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 1 내지 159의 서열(N-nano1 - 159)을 가지며, C-말단 도메인은 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 160 내지 170의 서열(C-nano160 - 170)을 갖는다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 신경독소 분할 부위는 C. 보툴리눔(C. botulinum) 신경독소(BoNT) 및/또는 파상풍 신경독소 분할 부위이다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 BoNT 분할 부위와 N-말단 단편 또는 도메인 사이에, 신경독소 분할 부위와 C-말단 단편 또는 도메인 사이에, 또는 이들의 조합에 위치된 하나 이상의 스페이서를 더 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 BoNT 및/또는 파상풍 신경독소에 대한 수용체의 결합 단편을 더 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 결합 단편은 N-말단 단편 또는 도메인과 BoNT 분할 부위 사이에 위치된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 결합 단편과 BoNT 분할 부위 사이에 위치된 스페이서를 더 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 스페이서는 글리신 및 세린으로 이루어진다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 스페이서는 5 내지 15개의 아미노산이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 스페이서는 서열번호 4-9로부터 선택된다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, BoNT는 A, E, C, B, D, F 또는 G이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, BoNT 분할 부위는 SNARE 단백질로부터의 것이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, SNARE 단백질은 SNAP-25, 시냅토브레빈(VAMP), 또는 신탁신(syntaxin)이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, BoNT 분할 부위는 인간 SNAP-25b의 아미노산 141 내지 206이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, BoNT 분할 부위는 인간 VAMP1의 아미노산 35 내지 96이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 수용체는 인간 SV2C이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 결합 단편은 인간 SV2C의 아미노산 529 내지 566, 또는 인간 SV2C의 아미노산 529 내지 566과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열, 또는 인간 SV2C의 아미노산 529 내지 566에 비해 10개 이하의 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 부가를 갖는 서열이다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 폴리히스티딘 친화력 태그를 더 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 폴리히스티딘 친화력 태그는 폴리펩타이드의 C-말단에 위치되어 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 N-말단 단편 또는 도메인과 BoNT 분할 부위 사이에 완전한 제2 루시페라제 폴리펩타이드를 더 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 제2 루시페라제 폴리펩타이드는 반딧불이 루시페라제(예를 들어, 포티누스 피랄리스), 박테리아 루시페라제(예를 들어, 비브리오 피셔리, 비브리오 하베이), 바다 팬지 루시페라제(레닐라 레니포르미스), 와편모충 루시페라제, 가우시아 루시페라제, 또는 요각류 루시페라제이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 제2 루시페라제 폴리펩타이드와 BoNT 분할 부위 사이에 위치된 스페이서를 더 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 스페이서는 5 내지 15개의 아미노산이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 스페이서는 GSSGGGGSGGGGSSG(서열번호 4), GSSGGGGSGGGSSG(서열번호 5), 또는 GGGGS(서열번호 6)이다.
임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 a) 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 1 내지 159(N-nano1 -159); b) (i) 5 내지 15개의 아미노산의 제1 스페이서; (ii) 제1 스페이서에 C-말단이 위치된 SV2C의 아미노산 529 내지 566으로 이루어진 결합 단편; (iii) 결합 단편에 C-말단이 위치된 제2 스페이서; (iv) 제2 스페이서에 C-말단이 위치된 인간 SNAP25b의 아미노산 141 내지 206을 포함하는 BoNT 분할 부위; (v) BoNT 분할 부위에 C-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제3 스페이서를 포함하는 N-nano1 -159에 C-말단이 위치된 링커; c) 링커에 C-말단이 위치된 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 160 내지 170(C-nano160 - 170)을 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드로서, 링커는 기능성 루시페라제 융합 단백질을 형성하기 위해 N-nano1 -159 및 C-nano160 -170을 기능적으로 연결시키는 단일 사슬 폴리펩타이드가 기술된다.
임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 a) 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 1 내지 159(N-nano1 -159); b) (i) 5 내지 15개의 아미노산의 제1 스페이서; (ii) 제1 스페이서에 C-말단이 위치된 인간 SNAP25b의 아미노산 141 내지 206을 포함하는 BoNT 분할 부위; (iii) BoNT 분할 부위에 C-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제2 스페이서를 포함하는 N-nano1 -159에 C-말단이 위치된 링커; 및 c) 링커에 C-말단이 위치된 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 160 내지 170(C-nano160-170)을 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드로서, 링커는 기능성 루시페라제 융합 단백질을 형성하기 위해 N-nano1 -159 및 C-nano160 -170을 기능적으로 연결시키는 단일 사슬 폴리펩타이드가 기술된다.
임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 a) 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 1 내지 159(N-nano1 -159); b) (i) 5 내지 15개의 아미노산의 제1 스페이서; (ii) 제1 스페이서에 C-말단이 위치된 인간 VAMP1의 아미노산 35 내지 96을 포함하는 BoNT 분할 부위; (iii) BoNT 분할 부위에 C-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제2 스페이서를 포함하는 N-nano1 -159에 C-말단이 위치된 링커; 및 c) 링커에 C-말단이 위치된 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 160 내지 170(C-nano160-170)을 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드로서, 링커는 기능성 루시페라제 융합 단백질을 형성하기 위해 N-nano1 -159 및 C-nano160 -170을 기능적으로 연결시키는 단일 사슬 폴리펩타이드가 기술된다.
임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 a) 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 1 내지 159(N-nano1-159); b) (i) 제2 기능성 루시페라제 폴리펩타이드; (ii) 제 루시페라제 폴리펩타이드의 C-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제1 스페이서; (iii) 제 스페이서에 C-말단이 위치된 인간 SNAP25b의 아미노산 1 내지 206을 포함하는 BoNT 분할 부위; (iv) BoNT 분할 부위에 C-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제2 스페이서를 포함하는 N-nano1 -159에 C-말단이 위치된 링커; 및 c) 링커에 C-말단이 위치된 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 160 내지 170(C-nano160-170)을 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드로서, 링커는 기능성 루시페라제 융합 단백질을 형성하기 위해 N-nano1 -159 및 C-nano160 -170을 기능적으로 연결시키는 단일 사슬 폴리펩타이드가 기술된다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 스페이서는 GSSGGGGSGGGGSSG(서열번호 4), GSSGGGGSGGGSSG(서열번호 5), 또는 GGGGS(서열번호 6)이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 C-말단에 위치된 His6 서열(서열번호 12)을 더 포함한다.
임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 본 명세서에 기술된 단일 사슬 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이 기술된다. 임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 본 명세서에 기술된 단일 사슬 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 핵산 벡터가 기술된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 벡터는 발현 벡터이고, 발현 가능한 형태의 핵산 서열을 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 발현 벡터, 원핵 발현 벡터, 효모 발현 벡터, 곤충 발현 벡터, 또는 포유류 발현 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
임의의 실시형태의 일 양태에서, 상기 문단의 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포가 기술된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 세포는 본 명세서에 기술된 바와 같이 단일 사슬 폴리펩타이드를 발현시킨다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 세포는 원핵 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 동물 세포이다.
임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 BoNT 활성에 대해 적절한 조건 하에서 본 명세서에 기술된 바와 같은 단일 사슬 폴리펩타이드에 신경독소를 접촉시키는 단계; 및 기준으로서 비교하여 폴리펩타이드의 루시페라제 활성을 결정하여 효능을 결정하는 단계를 포함하는, 보툴리눔 신경독소의 효능을 결정하는 방법이 기술된다.
임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 BoNT 활성에 대해 적절한 조건 하에서 본 명세서에 기술된 바와 같은 단일 사슬 폴리펩타이드에 샘플을 접촉시키는 단계; 및 샘플의 부재 하에서 폴리펩타이드의 루시페라제 활성과 비교하여, 폴리펩타이드의 루시페라제 활성을 결정하는 단계로서, 루시페라제 활성의 감소가 샘플에서 BoNT 활성을 지시하는 단계를 포함하는, 샘플에서 C. 보툴리눔 신경독소(BoNT) 활성을 검출하는 방법이 기술된다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본 방법은 시험관내에서 수행된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 접촉은 50mM HEPES, 20μM ZnCl2, 2mM DTT, 1 ㎎/㎖ BSA, pH 7.1의 완충제에서 일어난다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 샘플에 접촉된 단일 사슬 폴리펩타이드의 농도는 약 30nM 내지 300nM이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 샘플에 접촉되는 단일 사슬 폴리펩타이드의 농도는 약 30nM이다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 루시페라제 활성은 단일 사슬 폴리펩타이드에 루시페라제 기질의 첨가 및 생성된 발광 신호의 정량적 측정에 의해 결정된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 조건은 약 37℃에서 약 1시간 내지 약 36시간의 기간 동안의 항온처리를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 조건은 약 37℃에서 약 1시간 내지 약 24시간의 기간 동안의 항온처리를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 조건은 약 37℃에서 약 4시간 내지 약 24시간의 기간 동안의 항온처리를 포함한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 5 내지 15개의 아미노산의 제1 스페이서, 제1 스페이서에 C-말단이 위치되고 BoNT 분할 부위에 N-말단이 위치된 인간 SV2C의 아미노산 529 내지 566의 결합 단편, 및 BoNT 분할 부위에 C-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제2 스페이서를 포함하며, 여기서, BoNT 분할 부위는 인간 SNAP25의 아미노산 141 내지 206을 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 BoNT 분할 부위에 N-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제1 스페이서, 및 BoNT 분할 부위에 C-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제2 스페이서를 포함하며, 여기서, BoNT 분할 부위는 인간 SNAP25의 아미노산 141 내지 206을 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 BoNT 분할 부위에 N-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제1 스페이서, BoNT 분할 부위에 C-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제2 스페이서를 포함하며, 여기서, BoNT 분할 부위는 인간 VAMP1의 아미노산 35 내지 96을 포함한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 단일 사슬 폴리펩타이드는 신경 세포에 의해 발현되며, 본 방법은 접촉시키는 단계 후에, 신경 세포를 약 12시간 내지 약 60시간의 기간 동안 항온처리하는 단계 및 신경 세포로부터 용해물을 수확하는 단계를 더 포함한다.
임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 샘플에서 C. 보툴리눔 신경독소(BoNT) 활성을 검출하는 방법이 기술되되, 해당 방법은, a) 분리되고 N-nano1 -159에 C-말단이 위치되고 C-nano160 -170에 N-말단이 위치된 BoNT 분할 부위를 포함하는 링커에 의해 기능적으로 연결된, 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 1 내지 159(N-nano1 -159), 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 160 내지 170(C-nano160 - 170)을 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드를 발현시키는 신경 세포에 샘플을 접촉시키는 단계; b) 신경 세포를 약 12시간 내지 약 60시간의 기간 동안 항온처리시키는 단계; c) 신경 세포로부터 용해물을 수확하는 단계; 및 d) 샘플의 부재 하에서 동일하게 처리된 신경 세포에서의 루시페라제 활성과 비교하여, 용해물에서의 루시페라제 활성을 측정하는 단계로서, 루시페라제 활성의 감소가 샘플에서 BoNT 활성을 지시하는 단계를 포함한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 N-nano1 -159와 분할 부위 사이에 위치된 완전한 제2 루시페라제 폴리펩타이드를 더 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 제2 루시페라제 폴리펩타이드는 반딧불이 루시페라제(포티누스 피랄리스), 박테리아 루시페라제(비브리오 피셔리, 비브리오 하베이), 바다 팬지 루시페라제(레닐라 레니포르미스), 와편모충 루시페라제, 가우시아 루시페라제, 또는 요각류 루시페라제이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 샘플에서 제2 루시페라제 폴리펩타이드의 루시페라제 활성은 수확된 용해물에 존재하는 전체 단일 사슬 폴리펩타이드의 지시제로서 결정되고 사용된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 신경 세포는 바이러스 발현 벡터로부터 단일 사슬 폴리펩타이드를 발현시킨다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 단일 사슬 폴리펩타이드는 단계 a) 이전에 6일 동안 발현된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 바이러스 발현 시스템은 렌티바이러스 발현 시스템이다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 항온처리하는 단계는 약 48시간이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 수확하는 단계는 용해 완충제의 첨가에 의한 것이다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, BoNT 분할 부위는 SNAP-25, 시냅토브레빈(VAMP), 또는 신탁신으로부터의 것이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, BoNT 분할 부위는 BoNT A, E 및 C에 의해 특이적으로 인식되거나, BoNT B, D, F 및 G에 의해 특이적으로 인식된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 상이한 BoNT 분할 부위들을 갖는 단일 사슬 폴리펩타이드들의 조합이 사용된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, BoNT 분할 부위는 인간 SNAP-25의 a.a.141-206, 또는 인간 VAMP1의 a.a. 35-96, 인간 SNAP35의 a.a. 1-206, 또는 VAMP1의 a.a. 1-96이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 BoNT 수용체의 결합 단편을 더 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 수용체는 SV2C이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 결합 단편은 인간 SV2C의 아미노산 529 내지 566을 포함한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 제2 루시페라제 폴리펩타이드, 제2 루시페라제 폴리펩타이드의 C-말단이 위치되고 BoNT 분할 부위의 N-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제1 스페이서, BoNT 분할 부위에 C-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제2 스페이서를 포함하며, 여기서, BoNT 분할 부위는 인간 SNAP25의 아미노산 1 내지 206을 포함하고, 제1 스페이서에 C-말단이 위치되어 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 루시페라제 활성의 측정은 루시페라제에 대해 특이적인 기질의 첨가 및 얻어진 발광 신호의 정량적 검출에 의해 달성된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 서열번호 1의 루시페라제에 대한 기질은 푸리마진(2-퓨란일메틸-데옥시-코엘렌테라진)이다.
일 양태에서, 본 명세서에는 a) 각각 또는 조합이 별도의 용기 내에 패키징된 하나 이상의 본 명세서에 기술된 바와 같은 단일 사슬 폴리펩타이드; b) 각각 또는 조합이 별도의 용기 내에 패키징된 하나 이상의 본 명세서에 기술된 바와 같인 핵산 또는 핵산 벡터; 및/또는 c) 각각 또는 조합이 별도의 용기 내에 패키징된 하나 이상의 본 명세서에 기술된 바와 같은 세포를 포함하는 키트가 기술된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 키트는 별도의 용기 내에 패키징된 루시페라제 기질을 더 포함한다.
도 1은 분할된 루시페라제 기반 독소 센서의 개략적 도면을 도시한 것이다. 좌측 패널: NANOLUC™ 루시페라제는 2개의 상보적 단편, N-nano 및 C-nano으로 분리된다. 이러한 2개의 단편은 독소 기질을 기초로 한 링커와 함께 연결된다(SNAP-25(또한 p25로서 알려짐) 또는 VAMP1/2/3(예를 들어, 시냅토브레빈)). 우측 패널: BoNT에 의한 링커 영역의 분할은 NANOLUC™ 루시페라제의 두 부분을 분리시키고, 발광 신호를 폐지한다.
도 2A 및 도 2B는 BoNT/A의 시험관내 검출 검정을 나타낸다. 2개의 센서 단백질은 BoNT/A 독소 검출을 위해 설계되고 조사되었다. 하나는 NNano-SV2C-L4-p25-CNano이며, 다른 하나는 NNano-p25-CNano이다. 이러한 것은 BoNT/A가 1nM에서 1fM까지 10배로 희석되면서 30㎕ 부피에서 30nM로 제조되었다. 음성 대조군은 센서 단백질 용액에 첨가된 BoNT/B이었다. 곡선(도 2A)은 NANOLUC™ 루시페라제의 발광의 백분율을 기준으로 하여 플롯팅되었다. BoNT/A에 대해 NNano-SV2C-p25-CNano를 이용한 EC50은 4시간 후에 9.73pM, 및 24시간 후에 7.86pM이며, NNano-p25-CNano를 사용한 EC50은 37℃에서 4시간 후에 48.26pM 및 24시간 후에 35.87pM이다. BoNT/A 결합 도메인인 SV2C-L4를 함유한 센서 단백질은 EC50의 대략 5배 증가를 나타내었다(도 2B).
도 3A 및 도 3B는 4시간 및 24시간 후에 BoNT/B의 시험관내 검출 검정을 나타낸다. 센서 단백질 NNano-VAMP1-CNano는 BoNT/B가 10nM에서 1fM까지 10배씩 희석되면서 30㎕ 부피에서 30nM로 제조되었다. 음성 대조군은 센서 단백질 용액에 첨가된 BoNT/A이었다. 곡선(도 3A)은 NANOLUC™ 루시페라제의 발광의 백분율을 기준으로 하여 플롯팅되었다. BoNT/B에 대한 EC50은 37℃에서 4시간 동안 75.7pM이고, 24시간 후에 3.9pM이다(도 3B).
도 4는 바이러스 감염된 신경 세포를 사용하여 BoNT/A의 시험관내 검출 검정을 나타낸다. 각 신경 세포 용해물 샘플에 대하여, 반딧불이 신호 및 NANOLUC™ 루시페라제 신호 둘 모두가 측정되었으며, 비율(NANOLUC™/반딧불이)이 계산되었다. 그 후에, 각 샘플의 비율의 백분율은 기준 대조군으로서 독소 노출을 사용하기 않고 형성되었다. EC50 = 2.9pM, 독소 단백질이 접종되고 48시간 후에 LD50의 30배와 동일함.
본 명세서에는 효소 활성을 측정하고/하거나 검출하는 것과 관련한 조성물 및 방법이 기술된다. 특히, 본 조성물 및 방법은 신경독소, 예를 들어, C. 보툴리눔 신경독소(BoNT)의 검출 및/또는 측정에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "C. 보툴리눔 신경독소(C. botulinum neurotoxin)" 또는 "BoNT"는 C. 보툴리눔 독소가 뉴런에 진입하고 신경전달물질 방출을 억제하는 전체 세포 메커니즘을 실행할 수 있는 임의의 폴리펩타이드를 지칭하고, 낮은 또는 높은 친화력 수용체 복합물에 대한 C. 보툴리눔 독소의 결합, 독소의 내재화, 독소 경쇄의 세포질 내로의 전위 및 C. 보툴리눔 독소 기질의 효소적 변형을 포함한다.
클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum)의 균주는 7개의 항원적으로 구별되는 타입의 보툴리눔 독소(BoNT)를 형성하며, 이는 인간(BoNT/A, /B, /E 및 /F), 동물(BoNT/C1 및 /D), 또는 토양으로부터의 단리물(BoNT/G)에서 보툴리즘 발병(botulism outbreak)을 조사함으로써 동정되었다. 모두 7개의 BoNT 혈청형은 유사한 구조 및 약리학적 성질을 갖지만, 각각은 또한 이종 세균학적 특징을 나타낸다. C. 보툴리눔 균주의 유전적 다양성은 문헌[Hill et al. (Journal of Bacteriology, Vol. 189, No. 3, p. 818-832 (2007))]에 상세히 기술되며, 이러한 문헌의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, BoNT는 균주 A, E, C, B, D, F 또는 G의 BoNT이다. 다양한 비-자연발생 C. 보툴리눔 신경독소는 또한, 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 국제특허공개 WO95/32738호, WO96/33273호, WO98/07864호 및 WO99/17806호에 기술되어 있으며, 이러한 문헌 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다.
다양한 C. 보툴리눔으로부터의 독소는 동일한 기능성 도메인 조직 및 전체 구조적 아키텍쳐(structural architecture)를 공유한다. C. 보툴리눔 독소는 각각, 후속하여 천연발생 프로테아제, 예를 들어, 내인성 C. 보툴리눔 독소 프로테아제 또는 환경에서 형성된 천연발생 프로테아제에 의해 다이설파이드 루프 내의 단백질분해 분열(proteolytic scission)에 의해 분열되는 대략 150 kDa의 단일 사슬 폴리펩타이드로서 번역된다. 이러한 번역후 처리는 단일 다이설파이드 결합 및 비공유 상호작용에 의해 함께 유지되는 대략 50 kDa 경쇄(LC) 및 대략 100 kDa 중쇄(HC)를 포함하는 2-사슬 분자를 산출한다. 각각의 성숙한 2-사슬 분자는 3개의 기능적으로 구별되는 도메인을 포함한다: 1) 신경전달물질 방출 기관(neurotransmitter release apparatus)의 코어 성분을 특이적으로 표적화하는 아연-의존 엔도펩티다아제 활성을 함유한 메탈로프로테아제 영역을 포함하는 LC에 위치된 단백질분해 도메인; 2) 세포내 소포에서 표적 세포의 세포질 내로 LC의 방출을 촉진시키는 HC의 아미노-말단 절반(HN) 내에 함유된 전위 도메인; 및 3) 표적 세포의 표면에 위치된 수용체 복합물에 독소의 결합 활성 및 결합 특이성을 결정하는 HC의 카복실-말단 절반 내에서 발견된 결합 도메인.
이러한 3개의 기능성 도메인의 결합, 전위 및 프로테아제 활성 모두는 독성에 대해 필수적이다. 혈청형 또는 아형과는 무관하게, C. 보툴리눔 독소가 뉴런에 진입하고 신경전달물질 방출을 억제하는 전체 세포 중독(중독) 메커니즘이 유사하다. 이론에 의해 제한하고자 하는 것은 아니지만, 중독 메커니즘은 적어도 4 단계를 수반한다: 1) 수용체 결합, 2) 복합물 내재화, 3) 경쇄 전위, 및 4) 프로테아제 표적 변형. 본 공정은 C. 보툴리눔 독소의 HC 도메인이 표적 세포의 원형질 막 표면 상에 위치된 독소-특이적 수용체에 결합할 때 개시된다. 수용체 복합물의 결합 특이성은 부분적으로, 강글리오사이드 및 단백질 수용체의 특정 조합에 의해 달성되는 것으로 사료된다. 결합된 직후에, 독소/수용체 복합물은 엔도시토시스(endocytosis)에 의해 내재화되며, 내재화된 소포는 특정 세포내 경로로 분류된다. 전위 단계는 소포 구획의 산성화에 의해 촉발된다. 전위된 직후에, 독소의 경쇄 엔도펩티다아제는 세포내 소포에서 사이토솔로 방출되며, 여기서, 이는 신경전달물질 방출 기관의 코어 성분으로서 공지된 세 개의 단백질(소포-rh관련 막 단백질(VAMP)/시냅토브레빈, 25 kDa의 시냅토좀-관련 단백질(SNAP-25) 및 신탁신) 중 하나를 특이적으로 표적화한다.
이러한 코어 성분은 신경 말단에서 시냅스 소포 도킹(synaptic vesicle docking) 및 융합을 위해 필요하고, 가용성 N-에틸말레이미드-민감성 인자-부착 단백질-수용체(SNARE) 패밀리의 구성원을 구성한다. BoNT/A 및 BoNT/E는 카복실-말단 영역에서 SNAP-25를 분할하여, 각각 9개 또는 26개 아미노산 세그먼트를 방출하며, BoNT/C1은 또한, 카복실-말단 부근에서 SNAP-25를 분할한다. 보툴리눔 혈청형 BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F 및 BoNT/G, 및 파상풍 독소는 VAMP의 보존된 중심 부분에서 작용하고, 사이토솔 내로 VAMP내로 아미노-말단 부분을 방출한다. BoNT/C1은 사이토솔 원형질 막 표면 부근의 단일 부위에서 신탁신을 분할한다. 시냅스 SNARE의 선택적 단백질분해는 생체내에서 C. 보툴리눔 독소에 의해 야기된 신경전달물질 방출의 차단을 설명한다. C. 보툴리눔 독소의 SNARE 단백질 표적은 다양한 비-뉴런 타입에서 엑소사이토시스에 공통적이며, 이러한 세포에서, 뉴런에서와 같이, 경쇄 펩티다아제 활성은 엑소사이토시스를 억제한다[예를 들어, 문헌[Yann Humeau et al., How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release, 82(5) Biochimie. 427-446 (2000); Kathryn Turton et al., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558. (2002); Giovanna Lalli et al., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431-437, (2003)] 참조].
본 명세서에는 리포터 단백질이 링커 세그먼트에 의해 이의 서열에서 분할되거나 중단되는 단일 사슬 폴리펩타이드가 기술된다. 분할된 리포터 단백질은 기능적이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단일 사슬"은 폴리펩타이드를 지칭할 때, 알파-아미노와 인접한 잔기의 카복시기 간의 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된, 일련의 아미노산 잔기를 갖는 단일 폴리펩타이드 분자를 지칭한다. 즉, 단일 사슬 폴리펩타이드의 각 인용된 구성요소는 펩타이드 결합에 의해 다른 구성요소(들)에 연결된다. 이는 폴리펩타이드 복합물을 형성하기 위해, 예를 들어, 수소 결합 또는 다이설파이드 결합을 통해 서로 결합할 수 있는 다수의 단일 사슬 폴리펩타이드를 포함하는 다중-사슬 폴리펩타이드와는 상반되는 것이다.
본 명세서에 기술된 단일 사슬 폴리펩타이드는 루시페라제 및/또는 이의 부분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 리포터 단백질은 루시페라제일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "루시페라제"는, 예를 들어, 루시페린의 산화를 촉매화하고 빛을 방출하고 옥시루시페린을 방출함으로써 생물발광 반응을 촉매화하는 촉매를 지칭한다. 루시페라제는 자연발생하거나 조작될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "기능성" 루시페라제는 적합한 기질의 존재 하에서 반응을 촉매화할 수 있는 루시페라제이다. 예를 들어, 반딧불이 루시페라제(포티누스 피랄리스)(예를 들어, 서열번호 13 참조), 박테리아 루시페라제(비브리오 피셔리, 비브리오 하베이), 바다 팬지 루시페라제(레닐라 레니포르미스), 와편모충 루시페라제, 바다반딧불 루시페라제, 딱정벌레 루시페라제, 가우시아 루시페라제(예를 들어, 문헌[Heise, K., et al, "Dual luciferase assay for secreted luciferase based on Gaussia and NANOLUC" Assay Drug Dev. Technol.(2013)] 참조, 이러한 문헌은 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨), 요각류 루시페라제(예를 들어, 문헌[Takenaka, Y., et al, "Computational analysis and functional expression of ancestral copepod luciferase" Gene (2013)] 참조, 이러한 문헌은 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨) 및 NANOLUC™ 루시페라제를 포함하는 루시페라제의 여러 변형예 및 실시형태가 이용 가능하다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 루시페라제는 NANOLUC™ 루시페라제일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "NANOLUC 루시페라제"는 기질로서 푸리마진 또는 코엘렌테라진을 사용할 수 있고 서열번호 1의 서열을 갖는 오플로포러스 그라실리로스트리스(Oplophorus gracilirostris) 루시페라제로부터 유도된 19.1 kDa 루시페라제를 지칭한다. NANOLUC™ 루시페라제의 변이체는 또한, 본 명세서의 방법 및 조성물의 임의의 양태 및 실시형태에서 사용될 수 있고, 예를 들어, 미국특허 제8,557,970호에 기술되어 있으며, 이는 본 명세서에 전문이 참고로 포함된다.
임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 N-말단에서 C-말단으로, 리포터 단백질의 N-말단 단편; 신경독소 분할 부위를 포함하는 링커; 및 리포터 단백질의 C-말단 단편을 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드가 기술된다. 본 명세서에서 사용되는 "단편"은 분자의 일부 또는 부분, 예를 들어, 폴리펩타이드의 일부 또는 부분을 지칭한다. 본 명세서에 기술된 단일 사슬 폴리펩타이드에서, 리포터 단백질의 N-말단 단편 및 C-말단 단편은 총괄적으로 기능성 리포터 단백질 서열을 포함하지만, 개별적으로, 기능성 리포터 단백질 서열을 포함하지 않는다. 예를 들어, 링커 서열에 의해 기능적으로 연결되어 있는 동일한 단일 사슬 폴리펩타이드에 존재할 때, 리포터 단백질의 N-말단 단편 및 C-말단 단편은 기능성 리포터 융합 단백질을 형성한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 리포터 단백질은 루시페라제 단백질이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 단편은 자연발생 서열, 본 명세서에 기술된 리포터 단백질 서열, 및/또는 당해 분야에 공지된 리포터 단백질 서열의 변이체 또는 유도체일 수 있으며, 예를 들어, 이러한 것은 리포터 단백질 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 가지거나, 리포터 단백질 서열에 비해 10개 이하의 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 부가를 가질 수 있다.
임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에서 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 1 내지 159과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 N-말단 도메인(N-nano1-159); N-nano1 -159에 C-말단이 위치된 신경독소 분할 부위를 포함하는 링커; 및 링커에 C-말단이 위치된, 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 160 내지 170과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 C-말단 도메인(C-nano160 - 170)을 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드로서, 링커는 기능성 루시페라제 융합 단백질을 형성하기 위해 N-nano1 -159 및 C-nano160 -170을 기능적으로 연결시키는 단일 사슬 폴리펩타이드가 기술된다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 리포터 단백질의 도메인 또는 단편은 리포터 단백질 서열과, 예를 들어, 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 1 내지 159(N-nano1-159) 또는 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 160 내지 170(C-nano160-170)과 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 가질 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 변이체 아미노산은 보존적 치환 변형일 수 있다.
임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 1 내지 159에 비해 10개 미만의 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 부가를 갖는 서열을 포함하는 N-말단 도메인(N-nano1 -159); N-nano1 -159에 C-말단이 위치된 신경독소 분할 부위를 포함하는 링커; 및 링커에 C-말단이 위치된, 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 160 내지 170에 비해 3개 미만의 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 부가를 갖는 서열을 갖는 C-말단 도메인(C-nano160 - 170)을 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드로서, 링커는 기능성 루시페라제 융합 단백질을 형성하기 위해 N-nano1-159 및 C-nano160 -170을 기능적으로 연결시키는, 단일 사슬 폴리펩타이드가 기술된다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 리포터 단백질의 도메인 또는 단편은 리포터 단백질 서열, 예를 들어, 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 1 내지 159(N-nano1-159) 또는 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 160 내지 170(C-nano160 - 170)에 비해 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개의 결실, 삽입, 또는 치환을 갖는 서열일 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 치환된 아미노산은 보존적 치환 변이체일 수 있다. 임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 a) NANOLUC™ 루시페라제의 아미노산 1 내지 159(N-nano1 -159); b) N-nano1 -159에 C-말단이 위치된 신경독소 분할 부위를 포함하는 링커; 및 c) 링커에 C-말단이 위치된 NANOLUC™ 루시페라제의 아미노산 160 내지 170(C-nano160 - 170)을 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드로서, 링커는 기능성 루시페라제 융합 단백질을 형성하기 위해 N-nano1 -159 및 C-nano160 -170을 기능적으로 연결시키는 단일 사슬 폴리펩타이드가 기술된다.
본 명세서에서 입증된 바와 같이, 루시페라제 단백질은 기능성 루시페라제를 여전히 제공하면서 링커 서열에 의해 중단될 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 서열 번호 1의 잔기 159 및 160에 해당하는 잔기들 사이에 제공된다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 서열번호 1의 잔기 159와 잔기 160 사이에 제공된다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 단일 사슬 폴리펩타이드는 서열번호 1의 잔기 1 내지 159에 해당하는 서열을 포함하는 N-말단 도메인, 및 서열번호 1의 잔기 160 내지 170에 해당하는 서열을 포함하는 C-말단 도메인을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 단일 사슬 폴리펩타이드는 서열번호 1의 잔기 1 내지 159에 해당하는 서열을 필수적으로 포함하는 N-말단 도메인 및 서열번호 1의 잔기 160 내지 170에 해당하는 서열을 필수적으로 포함하는 C-말단 도메인을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 단일 사슬 폴리펩타이드는 서열번호 1의 잔기 1 내지 159를 포함하는 N-말단 도메인 및 서열번호 1의 잔기 160 내지 170을 포함하는 C-말단 도메인을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 단일 사슬 폴리펩타이드는 서열번호 1의 잔기 1 내지 159를 필수적으로 포함하는 N-말단 도메인 및 서열번호 1의 잔기 160 내지 170을 필수적으로 포함하는 C-말단 도메인을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 단일 사슬 폴리펩타이드는 서열번호 1의 잔기 1 내지 159로 이루어진 N-말단 도메인 및 서열번호 1의 잔기 160 내지 170으로 이루어진 C-말단 도메인을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 단일 사슬 폴리펩타이드에서, 링커 도메인은 N-말단 도메인과 C-말단 도메인 사이에 발견된다. 본 명세서에서 사용되는 "링커"는 리포터 단백질(예를 들어, 루시페라제 효소)에 대해 외인성인 서열을 지칭하고, 리포터 단백질의 N-말단 도메인 및 C-말단 도메인을 기능적으로 연결시키도록 조작된다. 링커는, 예를 들어, 하나 이상의 분할 부위, 하나 이상의 스페이서, 하나 이상의 결합 단편, 및 하나 이상의 추가적인 루시페라제 효소를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "기능적으로 연결시키다(functionally join)"는 개재 서열이 3개의 단편이 개재 서열이 활성 및 기능성 3차 구조를 형성하는 것을 방지하지 않는 방식으로 리포터 단백질, 예를 들어, 루시페라제의 2개의 단편을 연결시키는 것을 지칭한다. 기능적으로 연결된 2개의 단편은 링커 서열의 부재 하에서 단백질을 특징분석하는 활성을 나타낼 것이다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 하나 이상의 분할 부위, 예를 들어, 하나 이상의 효소의 작용에 의해 특이적으로 분할되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 분할 부위는 신경독소 분할 부위일 수 있다. 이에 따라, 신경독소 분할 부위는 적어도 하나의 신경독소에 의해 특이적으로 분할된 서열을 포함한다. 신경독소는 신경 조직의 기능을 저해하고/하거나 신경 조직을 사멸시키는 화합물이다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 신경독소는 시냅스 소포 방출의 저해제일 수 있다. 예시적인 비제한적인 신경독소 분할 부위는 C. 보툴리눔 신경독소(BoNT) 및/또는 파상풍 신경독소 분할 부위를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 다수의 신경독소 분할 부위를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 이는 다수의 신경독소에 의해 분할될 수 있고, 이에 의해, 다수의 신경독소의 검출 및/또는 측정을 가능하게 한다.
BoNT는 SNARE 단백질을 분할시킴으로써 작용한다. 이에 따라, BoNT 분할 부위는 SNARE 단백질로부터의 것일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "SNARE 단백질"은 뉴런에서 시냅스전 막의 시냅스 소포의 융합을 포함하는, 소포 융합을 매개하는 단백질의 수퍼패밀리(superfamily)를 지칭한다. SNARE 단백질은 비제한적인 예로서, SNAP-25(예를 들어, NCBI Gene ID: 6616, 또한, 인간 SNAP25b의 경우 NCBI 기준 서열: NP_570824.1 및 래트 SNAP25b의 경우 NCBI 기준 서열: NP_112253.1 참조), 시냅토브레빈(VAMP)(예를 들어, NCBI Gene ID No: 6843; 6844; 6845; 8673; 8674; 9341; 9554; 10652; 10791; 및 26984) 및 신탁신(예를 들어, NCBI Gene ID No. 2054; 6804; 6809; 6810; 6811; 8417; 8675; 8676; 8677; 9482; 10228; 23673; 53407; 55014; 112755; 및 415177)를 포함한다. 클로스트리듐 신경독소에 의해 분할된 SNARE 잘라지기 쉬운 결합(scissile bond)은 예를 들어, 문헌[Binz, Th. et al. "Clostridial neurotoxins: mechanism of SNARE cleavage and outlook on potential substrate specificity reengineering." Toxins 2.4 (2010): 665-682]에 기술된다. 바람직하게는, BoNT 분할 부위는 인간 SNARE 단백질로부터의 것이다. 인간 SNARE 잘라지기 쉬운 결합의 예는 표 1에 제공된다.
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일 실시형태에서, 링커는 적어도 하나의 클로스트리듐 신경독소 분할 부위, 바람직하게는, 인간 신경독소 분할 부위를 포함한다. 클로스트리듐 신경독소 분할 부위는 SNARE, 바람직하게는, 인간 SNARE의 적어도 아미노산 잔기 P3P2P1P1'P2'P3'를 포함하는 서열로서 규정될 수 있으며, 여기서, P1 및 P1'는 클로스트리듐 신경독소에 의해 분할된 잘라지기 쉬운 결합 펩타이드 결합의 어느 한 측면 상에 위치된 잔기, 예를 들어, BoNT/A의 경우 인간 SNAP25에서 Gln197 및 Arg198이다.
바람직한 실시형태에서, 클로스트리듐 신경독소 분할 부위는 SNARE의 적어도 아미노산 잔기 P4P3P2P1P1'P2'P3'P4'를 포함한다. 더욱 바람직한 실시형태에서, 클로스트리듐 신경독소 분할 부위는 SNARE의 적어도 아미노산 잔기 P5P4P3P2P1P1'P2'P3'P4'P5', 더욱 바람직하게는, 적어도 아미노산 잔기 P6P5P4P3P2P1P1'P2'P3'P4'P5'P6'를 포함한다.
일 실시형태에서, 링커는 적어도 하나의 BoNT/A 분할 부위를 포함하며, 여기서, 상기 BoNT/A 분할 부위는 인간 SNAP25(서열번호 23)의 잔기 195 내지 200, 바람직하게는, 194 내지 201, 193 내지 202 또는 192 내지 203을 포함한다.
일 실시형태에서, 링커는 적어도 하나의 BoNT/B 분할 부위를 포함하며, 여기서, 상기 BoNT/B 분할 부위는 인간 VAMP-1(서열번호 24)의 잔기 76 내지 81, 바람직하게는, 75 내지 82, 74 내지 83 또는 73 내지 84를 포함한다.
일 실시형태에서, 링커는 적어도 하나의 BoNT/B 분할 부위를 포함하며, 여기서, 상기 BoNT/B 분할 부위는 인간 VAMP-2(서열번호 25)의 잔기 74 내지 79, 바람직하게는, 73 내지 80, 72 내지 81 또는 71 내지 82를 포함한다.
일 실시형태에서, 링커는 적어도 하나의 BoNT/B 분할 부위를 포함하며, 여기서, 상기 BoNT/B 분할 부위는 인간 VAMP-3(서열번호 26)의 잔기 57 내지 62, 바람직하게는, 56 내지 63, 55 내지 64 또는 54 내지 65를 포함한다.
일 실시형태에서, 링커는 적어도 하나의 BoNT/C1 분할 부위를 포함하며, 여기서, 상기 BoNT/C1 분할 부위는 인간 SNAP25(서열번호 23)의 잔기 196 내지 201, 바람직하게는, 195 내지 202, 194 내지 203 또는 193 내지 204를 포함한다.
일 실시형태에서, 링커는 적어도 하나의 BoNT/C1 분할 부위를 포함하며, 여기서, 상기 BoNT/C1 분할 부위는 인간 신탁신 1A(서열번호 27)의 잔기 251 내지 256, 바람직하게는, 250 내지 257, 249 내지 258 또는 148 내지 259를 포함한다.
일 실시형태에서, 링커는 적어도 하나의 BoNT/C1 분할 부위를 포함하며, 여기서, 상기 BoNT/C1 분할 부위는 인간 신탁신 1B(서열번호 28)의 잔기 252 내지 257, 바람직하게는, 251 내지 258, 249 내지 259 또는 149 내지 260을 포함한다.
일 실시형태에서, 링커는 적어도 하나의 BoNT/D 분할 부위를 포함하며, 여기서, 상기 BoNT/D 분할 부위는 인간 VAMP-1(서열번호 24)의 잔기 59 내지 64, 바람직하게는, 58 내지 65, 57 내지 66 또는 56 내지 67을 포함한다.
일 실시형태에서, 링커는 적어도 하나의 BoNT/D 분할 부위를 포함하며, 여기서, 상기 BoNT/D 분할 부위는 인간 VAMP-2(서열번호 25)의 잔기 57 내지 62, 바람직하게는, 56 내지 63, 55 내지 64 또는 54 내지 65를 포함한다.
일 실시형태에서, 링커는 적어도 하나의 BoNT/D 분할 부위를 포함하며, 여기서, 상기 BoNT/D 분할 부위는 인간 VAMP-3(서열번호 26)의 잔기 40 내지 45, 바람직하게는, 39 내지 46, 38 내지 47 또는 37 내지 48을 포함한다.
일 실시형태에서, 링커는 적어도 하나의 BoNT/E 분할 부위를 포함하며, 여기서, 상기 BoNT/E 분할 부위는 인간 SNAP25(서열번호 23)의 잔기 178 내지 183, 바람직하게는, 177 내지 184, 176 내지 185 또는 175 내지 186을 포함한다.
일 실시형태에서, 링커는 적어도 하나의 BoNT/F 분할 부위를 포함하며, 여기서, 상기 BoNT/F 분할 부위는 인간 VAMP-1(서열번호 24)의 잔기 58 내지 63, 바람직하게는, 57 내지 64, 56 내지 65 또는 55 내지 66을 포함한다.
일 실시형태에서, 링커는 적어도 하나의 BoNT/F 분할 부위를 포함하며, 여기서, 상기 BoNT/F 분할 부위는 인간 VAMP-2(서열번호 25)의 잔기 56 내지 61, 바람직하게는, 55 내지 62, 54 내지 63 또는 53 내지 64를 포함한다.
일 실시형태에서, 링커는 적어도 하나의 BoNT/F 분할 부위를 포함하며, 여기서, 상기 BoNT/F 분할 부위는 인간 VAMP-3(서열번호 26)의 잔기 39 내지 44, 바람직하게는, 38 내지 45, 37 내지 46 또는 36 내지 47을 포함한다.
일 실시형태에서, 링커는 적어도 하나의 BoNT/G 분할 부위를 포함하며, 여기서, 상기 BoNT/G 분할 부위는 인간 VAMP-1(서열번호 24)의 잔기 81 내지 86, 바람직하게는, 80 내지 87, 79 내지 88 또는 78 내지 89를 포함한다.
일 실시형태에서, 링커는 적어도 하나의 BoNT/G 분할 부위를 포함하며, 여기서, 상기 BoNT/G 분할 부위는 인간 VAMP-2(서열번호 25)의 잔기 79 내지 84, 바람직하게는, 78 내지 85, 77 내지 86 또는 76 내지 87을 포함한다.
일 실시형태에서, 링커는 적어도 하나의 BoNT/G 분할 부위를 포함하며, 여기서, 상기 BoNT/G 분할 부위는 인간 VAMP-3(서열번호 26)의 잔기 62 내지 67, 바람직하게는, 61 내지 68, 60 내지 69 또는 59 내지 70을 포함한다.
일 실시형태에서, 링커는 적어도 하나의 BoNT/B 분할 부위를 포함하며, 여기서, 상기 TeNT 분할 부위는 인간 VAMP-1(서열번호 24)의 잔기 76 내지 81, 바람직하게는, 75 내지 82, 74 내지 83 또는 73 내지 84를 포함한다.
일 실시형태에서, 링커는 적어도 하나의 TeNT 분할 부위를 포함하며, 여기서, 상기 TeNT 분할 부위는 인간 VAMP-2(서열번호 25)의 잔기 74 내지 79, 바람직하게는, 73 내지 80, 72 내지 81 또는 71 내지 82를 포함한다.
일 실시형태에서, 링커는 적어도 하나의 TeNT 분할 부위를 포함하며, 여기서, 상기 BoNT/B 분할 부위는 인간 VAMP-3(서열번호 26)의 잔기 57 내지 62, 바람직하게는, 56 내지 63, 55 내지 64 또는 54 내지 65를 포함한다.
SNARE 단백질에서 적합한 BoNT 분할 부위의 예는 비제한적인 예로서, 인간 SNAP-25b(예를 들어, 서열번호 10)의 아미노산 141 내지 206; 및 인간 VAMP1의 아미노산 35 내지 96(예를 들어, NCBI Gene ID: 6843)을 포함한다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 인간 VAMP1의 아미노산 35 내지 96은 서열번호 16의 아미노산 35 내지 96일 수 있다. SNARE 단백질에서 BoNT 분할 부위의 추가의 비제한적인 예는 인간 VAMP2의 아미노산 60 내지 87, 인간 VAMP 3의 아미노산 43 내지 70, 및 인간 VAMP1의 아미노산 62 내지 89를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 인간 VAMP2의 아미노산 60 내지 87은 서열번호 19의 서열일 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 인간 VAMP3의 아미노산 43 내지 70은 서열번호 20의 서열일 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 인간 VAMP1의 아미노산 62 내지 89는 서열번호 21의 서열일 수 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, BoNT 분할 부위는 본 명세서에서 인용된 임의의 특정 서열의 변이체, 예를 들어, SNARE 단백질에서 발견된 천연 BoNT 분할 부위의 변이체일 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, BoNT 분할 부위는 서열번호 10의 아미노산 141 내지 206 또는 서열번호 16의 아미노산 35 내지 96의 변이체일 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, BoNT 분할 부위는 SNARE 단백질에서 발견된 천연 BoNT 분할 부위와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 가질 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, BoNT 분할 부위는 서열번호 10의 아미노산 141 내지 206 또는 서열번호 16의 아미노산 35 내지 96과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 가질 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 변이체는 보존적 치환 변이체일 수 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, BoNT 분할 부위는 SNARE 단백질에서 발견된 천연 BoNT 분할 부위에 비해 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개의 결실, 삽입, 또는 치환을 갖는 서열일 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, BoNT 분할 부위는 SNARE 단백질에서 발견된 천연 BoNT 분할 부위에 대해 다양한 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개의 잔기를 갖는 서열일 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, BoNT 분할 부위는 서열번호 10의 아미노산 141 내지 206 또는 서열번호 16의 아미노산 35 내지 96에 비해 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 결실, 삽입 또는 치환을 갖는 서열일 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, BoNT 분할 부위는 서열번호 10의 아미노산 141 내지 206 또는 서열번호 16의 아미노산 35 내지 96에 대해 다양한 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개의 잔기를 갖는 서열일 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, BoNT 분할 부위는 인간 SNAP-25b(예를 들어, 서열번호 10)의 아미노산 141 내지 206; 인간 VAMP1의 아미노산 35 내지 96; VAMP1의 아미노산 1 내지 96; 인간 SNAP25; 및/또는 인간 SNAP25b (서열번호 14)의 아미노산 1 내지 206을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, BoNT 분할 부위는 BoNT A, B, C, D, E, F, 및/또는 G에 의해 특이적으로 인식(예를 들어, 분열)될 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, BoNT 분할 부위는 BoNT A, E 및 C에 의해 특이적으로 인식(예를 들어, 분열)될 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, BoNT 분할 부위는 BoNT B, D, F 및 G에 의해 특이적으로 인식(예를 들어, 분열)될 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 하나 이상의 스페이서를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "스페이서(spacer)"는 동일한 펩타이드 사슬에서 2개의 다른 서열을 분리시킬 구조적 목적의 역할을 하는 아미노산 서열을 지칭한다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 스페이서 서열은 가요성 펩타이드 서열일 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 스페이서는 글리신 및 세린 잔기를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 스페이서는 글리신 및 세린 잔기를 필수적으로 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 스페이서는 글리신 및 세린 잔기로 이루어질 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 스페이서는 약 2 내지 약 30개의 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 스페이서는 2 내지 30개의 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 스페이서는 약 3 내지 약 20개의 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 스페이서는 3 내지 20개의 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 스페이서는 약 5 내지 약 15개의 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 스페이서는 5 내지 15개의 아미노산의 길이를 가질 수 있다.
예시적인, 비제한적인 스페이서는 GSSGGGGSGGGGSSG(서열번호 4); GSSGGGGSGGGSSG(서열번호 5); GGGGS(서열번호 6); (GGGGS)n(n=1 내지 3)(서열번호 7); KESGSVSSEQLAQFRSLD(서열번호 8); 및 EGKSSGSGSESKST(서열번호 9)를 포함할 수 있다. 링커 설계, 선택, 및 추가의 예시적인 링커는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Chen, X., et al, "Fusion protein linkers: proterty, design and functionality" Adv. Drug Deliv. Rev. (2013)]에 기술되어 있으며, 이러한 문헌은 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 신경독소 결합 단편, 에를 들어, 신경독소에 의해 결합되고/되거나 신경독소에 결합하고 신경독소에 의해 분할되지 않는 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 신경독소 결합 단편은 신경독소 수용체, 예를 들어, BoNT 및/또는 파상풍 신경독소에 대한 수용체의 단편일 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 신경독소 수용체는 인간, 마우스, 래트, 또는 영장류 신경독소 수용체일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 신경독소 수용체는 인간 신경독소 수용체이다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 신경독소 수용체는 SV2C, 예를 들어, 인간 SV2C(NCBI Gene ID: 22987; GenBank: AAI00828.1)일 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 수용체의 신경독소 결합 단편은 인간 SV2C(SV2C-L4, 예를 들어, 서열번호 11)의 아미노산 529 내지 566에 상응하는 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 신경독소 결합 단편은 인간 SV2C(SV2C-L4, 예를 들어, 서열번호 11)의 아미노산 529 내지 566을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 신경독소 수용체는 SYTI(NCBI Gene ID: 6857) 또는 SYT2(NCBI Gene ID: 127833)일 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 수용체의 신경독소 결합 단편은 SYTI(예를 들어, 서열번호 17)의 아미노산 32 내지 52 또는 SYT2(서열번호 18)의 아미노산 40 내지 60에 해당하는 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 완전한 제2 루시페라제 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 제2 루시페라제는, 예를 들어, 신경독소에 의한, 단일 사슬 폴리펩타이드의 분할 전 및/또는 후에 활성적이다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 제2 루시페라제는 제1 루시페라제와 구별될 수 있으며, 예를 들어, 이는 상이한 기질 상에서 작용하고/하거나, 광의 상이한 파장을 형성한다. 예를 들어, 제1 루시페라제가 NANOLUC인 경우에, 제2 루시페라제는 반딧불이 루시페라제(예를 들어, 포티누스 피랄리스), 박테리아 루시페라제(예를 들어, 비브리오 피셔리, 비브리오 하베이), 바다 팬지 루시페라제(예를 들어, 레닐라 레니포르미스), 와편모충 루시페라제, 또는 가우시아 루시페라제일 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 제2 루시페라제는 서열번호 13에 해당하는 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 제2 루시페라제는 서열번호 13을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 N-말단 리포터 단백질 도메인과 적어도 하나의 분할 부위 사이에 위치된 완전한 제2 루시페라제 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 N-nano1 -159와 BoNT 분할 부위 사이에 위치된 완전한 제2 루시페라제 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 결합 단편은 적어도 하나의 분할 부위의 N-말단이 위치될 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 결합 단편은 N-nano1 -159와 BoNT 분할 부위 사이에 위치될 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 N-말단에서 C-말단으로, 적어도 하나의 결합 단편, 적어도 하나의 스페이서, 및 적어도 하나의 분할 부위를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 N-말단에서 C-말단으로, 적어도 하나의 결합 단편, 적어도 하나의 스페이서, 및 적어도 하나의 BoNT 분할 부위를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 N-말단에서 C-말단으로, 하나 이상의 스페이서 및 적어도 하나의 분할 부위를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 N-말단에서 C-말단으로, 하나 이상의 스페이서, 적어도 하나의 분할 부위, 및 하나 이상의 스페이서를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 N-말단에서 C-말단으로, 적어도 하나의 분할 부위, 및 하나 이상의 스페이서를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 BoNT 분할 부위와 N-nano1 -159 사이에, 신경독소 분할 부위와 C-nano160 -170 사이에, 또는 이들의 조합에 위치된 하나 이상의 스페이서를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 제2 루시페라제 폴리펩타이드와 분할 부위 사이에 스페이서를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 N-말단에서 C-말단으로, 제2 루시페라제 폴리펩타이드, 적어도 하나의 스페이서, 및 적어도 하나의 분할 부위를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 제2 루시페라제 폴리펩타이드와 BoNT 분할 부위 사이에 위치된 스페이서를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 단일 사슬 폴리펩타이드는 폴리히스티딘 친화력 태그, 예를 들어, His6(서열번호 12)을 더 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 폴리히스티딘 친화력 태그는 폴리펩타이드의 C-말단, 예를 들어, 리포터 단백질 C-말단 도메인의 C-말단에 위치된다.
임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 a) NANOLUC™ 루시페라제의 아미노산 1 내지 159(N-nano1 -159); b) (i) 5 내지 15개의 아미노산의 제1 스페이서; (ii) 제1 스페이서에 C-말단이 위치된 SV2C의 아미노산 529 내지 566으로 이루어진 결합 단편; (iii) 결합 단편에 C-말단이 위치된 제2 스페이서; (iv) 제2 스페이서에 C-말단이 위치된 인간 SNAP25b의 아미노산 141 내지 206를 포함하는 BoNT 분할 부위; v) BoNT 분할 부위에 C-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제3 스페이서를 포함하는 N-nano1 -159에 C-말단이 위치된 링커; 및 c) 링커에 C-말단이 위치된 NANOLUC™ 루시페라제의 아미노산 160 내지 170(C-nano160 - 170)을 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드로서, 링커는 기능성 루시페라제 융합 단백질을 형성하기 위해 N-nano1-159 및 C-nano160 -170을 기능적으로 연결시키는, 단일 사슬 폴리펩타이드가 기술된다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 NANOLUC™ 루시페라제의 아미노산 160 내지 170의 폴리히스티딘 친화력 태그 C-말단(C-nano160-170)을 더 포함한다.
임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 a) NANOLUC™ 루시페라제의 아미노산 1 내지 159(N-nano1 -159); b) (i) 5 내지 15개의 아미노산의 제1 스페이서; (ii) 제1 스페이서에 C-말단이 위치된 인간 SNAP25b의 아미노산 141 내지 206을 포함하는 BoNT 분할 부위; (iii) BoNT 분할 부위에 C-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제2 스페이서를 포함하는 N-nano1 -159에 C-말단이 위치된 링커; 및 c) 링커에 C-말단이 위치된 NANOLUC™ 루시페라제의 아미노산 160 내지 170(C-nano160 -170)을 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드로서, 링커는 기능성 루시페라제 융합 단백질을 형성하기 위해 N-nano1 -159 및 C-nano160 -170을 기능적으로 연결시키는, 단일 사슬 폴리펩타이드가 기술된다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 NANOLUC™ 루시페라제의 아미노산 160 내지 170의 폴리히스티딘 친화력 태그 C-말단(C-nano160-170)을 더 포함한다.
임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 a) NANOLUC™ 루시페라제의 아미노산 1 내지 159(N-nano1 -159); b) (i) 5 내지 15개의 아미노산의 제1 스페이서; (ii) 제1 스페이서에 C-말단이 위치된 인간 VAMP1의 아미노산 35 내지 96을 포함하는 BoNT 분할 부위; (iii) BoNT 분할 부위에 C-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제2 스페이서를 포함하는 N-nano1 -159에 C-말단이 위치된 링커; 및 c) 링커에 C-말단이 위치된, NANOLUC™ 루시페라제의 아미노산 160 내지 170(C-nano160 - 170)을 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드로서, 링커는 기능성 루시페라제 융합 단백질을 형성하기 위해 N-nano1 -159 및 C-nano160 -170을 기능적으로 연결시키는 단일 사슬 폴리펩타이드가 기술된다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 NANOLUC™ 루시페라제의 아미노산 160 내지 170의 폴리히스티딘 친화력 태그 C-말단(C-nano160-170)을 더 포함한다.
임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 a) NANOLUC™ 루시페라제의 아미노산 1 내지 159(N-nano1 -159); b) (i) 제2 기능성 루시페라제 폴리펩타이드; (ii) 제2 루시페라제 폴리펩타이드의 C-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제1 스페이서; (iii) 제1 스페이서에 C-말단이 위치된 인간 SNAP25b(예를 들어, 서열번호 14)의 아미노산 1 내지 206을 포함하는 BoNT 분할 부위; (iv) BoNT 분할 부위에 C-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제2 스페이서를 포함하는 N-nano1-159에 C-말단이 위치된 링커; 및 c) 링커에 C-말단이 위치된, NANOLUC™ 루시페라제의 아미노산 160 내지 170(C-nano160 - 170)을 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드로서, 링커는 기능성 루시페라제 융합 단백질을 형성하기 위해 N-nano1 -159 및 C-nano160 -170을 기능적으로 연결시키는, 단일 사슬 폴리펩타이드가 기술된다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 NANOLUC™ 루시페라제의 아미노산 160 내지 170의 폴리히스티딘 친화력 태그 C-말단(C-nano160-170)을 더 포함한다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 본 명세서에 기술된 바와 같은 단일 사슬 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 서열이 기술된다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 핵산은 서열번호 15, 29, 30 또는 31을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 본 명세서에 기술된 핵산 분자를 포함하는 핵산 벡터에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 벡터는 발현 벡터이다. 이러한 발현 벡터는 본 명세서에서 발현 작제물로서 지칭되고, 세포 또는 무세포 추출물에서 핵산 분자를 발현시키기 위해 유용한 발현 벡터에 작동 가능하게 연결된 본 명세서에 개시된 핵산 분자를 포함한다. 광범위한 발현 벡터는 비제한적으로, 바이러스 발현 벡터; 원핵 발현 벡터; 진핵 발현 벡터, 예를 들어, 예컨대, 효모 발현 벡터, 곤충 발현 벡터 및 포유류 발현 벡터; 및 무세포 추출물 발현 벡터를 포함하는, 본 발명의 단일 사슬 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법의 양태를 실행하기 위해 유용한 발현 벡터가 보존적, 조직-특이적, 세포-특이적 또는 유도 가능한 프로모터 구성요소, 인헨서 구성요소 또는 둘 모두의 제어 하에서 단일 사슬 폴리펩타이드를 발현시키는 것을 포함할 수 있다는 것이 추가로 이해된다. 이러한 발현 벡터로부터 발현 작제물을 제조하고 사용하기 위한 잘 확립된 시약 및 조건과 함께, 발현 벡터의 비제한적인 예는 비제한적으로, BD Biosciences-Clontech(캘리포니아주 팔토 알토 소재); BD Biosciences Pharmingen(캘리포니아주 샌디에고 소재); Invitrogen, Inc(캘리포니아주 카를로비 소재); EMD Biosciences-Novagen(위스콘신주 매디슨 소재); QIAGEN, Inc.(캘리포니아주 발렌시아 소재); 및 Stratagene(캘리포니아주 라호이아 소재)를 포함하는 상업적 판매 회사(commercial vendor)로부터 용이하게 입수 가능하다. 적절한 발현 벡터의 선택, 제조, 및 사용은 당업자의 범위 내에서 그리고 본 명세서의 교시로부터 일상적인 절차이다.
임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 본 명세서에 기술된 바와 같은 단일 사슬 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 핵산 벡터가 기술된다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 핵산은 서열번호 15를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 벡터는 발현 벡터일 수 있고, 발현 가능한 형태의 핵산 서열을 포함한다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 벡터는 바이러스 발현 벡터, 원핵 발현 벡터, 효모 발현 벡터, 곤충 발현 벡터, 또는 포유류 발현 벡터일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터(vector)"는 세포로의 전달 또는 상이한 세포 간의 전달을 위해 설계된 핵산 작제물을 지칭한다. 표적 세포 내로 외인성 유전자를 전달하기 위해 유용한 여러 벡터가 이용 가능하며, 예를 들어, 벡터는 에피솜, 예를 들어, 플라스미드, 바이러스 유도 벡터일 수 있거나, 동종 재조합(homologous recombination) 또는 랜덤 통합(random integration)을 통해, 표적 세포 게놈 내로 통합될 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "발현 벡터"는 세포에서 이종 핵산 단편을 도입하고 발현시키는 능력을 갖는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 추가적인 구성요소를 포함할 수 있다. 벡터 내에 도입된 핵산은 발현 제어 서열이 그러한 폴리뉴클레오타이드 서열의 전사 및 번역을 제어하고 조절할 때 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 본 명세서에 기술된 핵산 분자 또는 발현 작제물을 포함하는 세포에 관한 것이다. 세포는 핵산의 전파 또는 핵산의 발현, 또는 둘 모두를 위한 것일 수 있다. 임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 본 명세서에 기술된 바와 같은 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 세포가 기술된다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 세포는 본 명세서에 기술된 바와 같은 단일 사슬 폴리펩타이드를 발현시킨다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 세포는 원핵 세포, 대장균 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 동물 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 마우스 세포, 영장류 세포, 및/또는 신경 세포일 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 세포는 뉴런 세포, 특히, BoNT에 대한 고민감성을 갖는 세포이다.
BoNT에 대한 고민감성을 갖는 세포는 BoNT 중독에 대해 취약한 세포이다. 일부 실시형태에서, BoNT에 대한 고민감성을 갖는 세포는, 예를 들어, 약 500pM 이하, 약 400pM 이하, 약 300pM 이하, 약 200pM 이하, 약 100pM 이하, 약 90pM 이하, 약 80pM 이하, 약 70pM 이하, 약 60pM 이하, 약 50pM 이하, 약 40pM 이하, 약 30pM 이하, 약 20pM 이하 A, 약 10pM 이하, 약 9pM 이하, 약 8pM 이하, 약 7pM 이하, 약 6pM 이하, 약 5pM 이하, 약 4pM 이하, 약 3pM 이하, 약 2pM 이하, 약 1pM 이하, 약 0.9pM 이하, 약 0.8pM 이하, 약 0.7pM 이하, 약 0.6pM 이하, 약 0.5pM 이하, 약 0.4pM 이하, 약 0.3pM 이하, 약 0.2pM, 약 0.1pM 이하의 BoNT, 약 90fM 이하의 BoNT, 약 80fM 이하의 BoNT, 약 70fM 이하의 BoNT, 약 60fM 이하의 BoNT, 약 50fM 이하의 BoNT, 약 40fM 이하의 BoNT, 약 30fM 이하의 BoNT, 약 20fM 이하의 BoNT, 또는 약 10fM 이하의 BoNT 정도로, BoNT 중독에 대해 취약한 세포이다.
일부 실시형태에서, 세포는 BoNT에 대해 고민감성을 갖는 1차 신경 세포, 예를 들어, 피질 뉴런, 해마 뉴런 및/또는 척수 뉴런이다.
일부 실시형태에서, 세포는 BoNT에 대한 고민감성을 갖는 신경 세포주, 예를 들어, BE(2)-M17, Kelly, LA1-55n, N1 E-115, N4TG3, N18, Neuro-2a, NG108-15, PC12, SH-SY5Y, SiMa, 및/또는 SK-N-BE(2)-C로부터 유래된 것이다.
일부 실시형태에서, 세포는 줄기 세포로부터, 특히, 유도된 다능성 줄기 세포(iPS 세포), 예를 들어, i-Cell® Neurons, i-Cell® DopaNeurons iCell Glutamatergic Neurons, iCell MotoNeurons(Cellular dynamics Inc) Cerebral Cortical Neurons, Neural Stem Cells(Axol Biosciences), Peri.4U 뉴런, CNS.4U 뉴런, Dopa.4UNeurons(Axiogenesis) MNP 세포(Lonza), Cortical Neurons, Motor Neurons(iStem), 및/또는 iPSC-Derived Neural Cells(MTI-GlobalStem)로부터 유도된 신경 세포이다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 세포는 비제한적으로, 호기성, 미호기성, 호이산화탄소성, 조건성, 혐기성, 그람-음성 및 그람-양성 박테리아 세포의 균주를 포함하는 원핵 세포, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 박테로이드 프라길리스(Bacteroides fragilis), 클로스트리듐 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 카울로박터 크레센투스(Caulobacter crescentus), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 메틸로박테륨 엑토르쿠엔스(Methylobacterium extorquens), 네이세리아 메닌기룰스(Neisseria meningirulls), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium); 및 비제한적으로, 효모 균주를 포함하는 진핵 세포, 예를 들어, 예컨대, 피챠 파스토리스(Pichia pastoris), 피챠 메타놀리카(Pichia methanolica), 피챠 안구스타(Pichia angusta), 쉬조사카로마이스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사챠로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 야로비아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)로부터 유래된 것; 곤충 세포 또는 곤충으로부터 유래된 세포주, 예를 들어, 예컨대, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda), 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni), 드로소필라 멜라노가스테르(Drosophila melanogaster) 및 만두카 섹타(Manduca sexta)로부터 유래된 것; 또는 포유류 세포 또는 포유류 세포로부터 유래된 세포주, 예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 소, 말, 영장류 및 인간일 수 있다. 세포주는 미국 미생물 보존센터(American Type Culture Collection), 유럽 세포 배양물 보존센터(European Collection of Cell Cultures) 및 독일 미생물 및 세포 배양물 보존센터(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)로부터 얻어질 수 있다. 적절한 세포주를 선택, 제조 및 사용하기 위한 특정 프로토콜의 비제한적인 예는, 예를 들어, 문헌[INSECT CELL CULTURE ENGINEERING (Mattheus F. A. Goosen et al. eds., Marcel Dekker, 1993); INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS (J. M. Vlak et al. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison & Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE (Cambridge University Press, 1997); CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Alan Doyle et al eds., John Wiley and Sons, 1998); R. Ian Freshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE (Wiley-Liss, 4.sup.th ed. 2000); ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John R. W. Masters ed., Oxford University Press, 3.sup.rd ed. 2000); MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, supra, (2001); BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH (John M. Davis, Oxford Press, 2.sup.nd ed. 2002); 및 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, supra, (2004)]에 기술되어 있다. 이러한 프로토콜은 당업자의 범위 내에서 그리고 본 명세서의 교시로부터의 일상적인 절차이다.
본 명세서에 기술된 조성물은 예를 들어, 신경독소(예를 들어, BoNT)의 존재, 효능, 및/또는 활성을 검출하고/하거나 측정하는 방법에서 사용될 수 있다. BoNT의 존재 하에서, BoNT 분할 부위를 갖는 단일 사슬 폴리펩타이드는 링커 서열에서 분할되어, 분할된 리포터 단백질(예를 들어, 루시페라제)의 활성을 파괴할 것이다. 이에 따라, 리포터 단백질의 활성의 감소는 BoNT의 존재를 지시한다. 임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 샘플에서 C. 보툴리눔 신경독소(BoNT) 활성을 검출하는 방법으로서, a) BoNT 활성을 위해 적절한 조건 하에서 본 명세서에 기술된 바와 같은 단일 사슬 폴리펩타이드에 샘플을 접촉시키는 단계; 및 b) 샘플의 부재 하에서 폴리펩타이드의 루시페라제 활성과 비교하여 폴리펩타이드의 루시페라제 활성을 결정하는 단계로서, 루시페라제 활성의 감소가 샘플에서 BoNT 활성을 지시하는 단계를 포함하는 방법이 기술된다. 임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 보툴리눔 신경독소의 효능을 결정하는 방법으로서, a) BoNT 활성에 대해 적절한 조건 하에서 본 명세서에 기술된 바와 같은 단일 사슬 폴리펩타이드에 신경독소를 접촉시키는 단계; 및 b) 기준과 비교하여 폴리펩타이드의 루시페라제 활성을 결정하여, 효능을 결정하는 단계를 포함하는 방법이 기술된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본 방법은 배치 방출을 위해, 예를 들어, 배치 방출 시험 및/또는 로트 방출 시험을 위해 적합하다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법은 시험관 내에서 수행될 수 있다.
임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 샘플에서 C. 보툴리눔 신경독소(BoNT) 활성을 검출하는 방법으로서, a) BoNT 활성을 위해 적절한 조건 하에서 본 명세서에 기술된 바와 같은 단일 사슬 폴리펩타이드에 샘플을 접촉시키는 단계; 및 b) 샘플의 부재 하에서 폴리펩타이드의 루시페라제 활성과 비교하여, 폴리펩타이드의 루시페라제 활성을 결정하는 단계로서, 루시페라제 활성의 감소가 샘플에서 BoNT 활성을 지시하는 단계를 포함하는 방법이 기술된다. 임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 샘플에서 C. 보툴리눔 신경독소(BoNT) 활성을 검출하는 방법으로서, a) BoNT 활성을 위해 적절한 조건 하에서, N-nano1 -159에 C-말단이 위치되고 C-nano160 -170에 N-말단이 위치된 BoNT 분할 부위를 포함하는 링커에 의해 분리되고 기능적으로 연결된, NANOLUC™ 루시페라제의 아미노산 1 내지 159(N-nano1 -159), NANOLUC™ 루시페라제의 아미노산 160 내지 170(C-nano160 - 170)을 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드에 샘플을 접촉시키는 단계; 및 b) 샘플의 부재 하에서 폴리펩타이드의 루시페라제 활성과 비교하여, 폴리펩타이드의 루시페라제 활성을 결정하는 단계로서, 루시페라제 활성의 감소가 샘플에서 BoNT 활성을 지시하는 단계를 포함하는 방법이 기술된다.
임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는, 샘플에서 C. 보툴리눔 신경독소(BoNT) 활성을 검출하는 방법으로서, a) BoNT 활성을 위해 적절한 조건 하에서, N-nano1 -159에 C-말단이 위치되고 C-nano160 -170에 N-말단이 위치된 BoNT 분할 부위를 포함하는 링커에 의해 분리되고 기능적으로 연결된, NANOLUC™ 루시페라제의 아미노산 1 내지 159(N-nano1 -159), NANOLUC™ 루시페라제의 아미노산 160 내지 170(C-nano160-170)을 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드에 샘플을 접촉시키는 단계; 및 b) 샘플의 부재 하에서 폴리펩타이드의 활성과 비교하여, 폴리펩타이드의 루시페라제 활성을 결정하는 단계로서, 루시페라제 활성의 감소가 샘플에서 BoNT 활성의 지시인 단계를 포함하는 방법이 기술된다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 5 내지 15개의 아미노산의 제1 스페이서, 제1 스페이서에 C-말단이 그리고 BoNT 분할 부위에 N-말단이 위치된 인간 SV2C의 아미노산 529 내지 566의 결합 단편, 및 BoNT 분할 부위에 C-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제2 스페이서를 포함하며, 여기서, BoNT 분할 부위는 인간 SNAP25의 아미노산 141 내지 206을 포함한다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 BoNT 분할 부위에 N-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제1 스페이서, 및 BoNT 분할 부위에 C-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제2 스페이서를 포함하며, 여기서, BoNT 분할 부위는 인간 SNAP25의 아미노산 141 내지 206을 포함한다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 BoNT 분할 부위에 N-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제1 스페이서, 및 BoNT 분할 부위에 C-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제2 스페이서를 포함하며, 여기서, BoNT 분할 부위는 인간 VAMP1의 아미노산 35 내지 96을 포함한다.
임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 BoNT의 EC50을 결정하는 방법으로서, a) BoNT 활성을 위해 적절한 조건 하에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 단일 사슬 폴리펩타이드를 제1 농도에서 BoNT와 접촉시키고, 샘플의 부재 하에서 폴리펩타이드의 루시페라제 활성과 비교하여, 폴리펩타이드의 루시페라제 활성을 결정하는 단계; b) EC50이 결정될 수 있을 때까지 BoNT의 상이한 농도에서 단계 a)를 반복하는 단계를 포함하는 방법이 기술된다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, BoNT의 상이한 농도는 적어도 10배 차이를 포함한다.
당해 분야에 공지된 바와 같이, "반수 유효 농도(half maximal effective concentration)(EC50)"는 일부 특정된 노출 시간 후에 기준선과 최대치 사이의 반응 중간(response halfway)을 유도하는 약물, 항체 또는 독성물의 농도를 지칭한다. 이는 약물 효능의 척도로서 일반적으로 사용된다. 이에 따라, 등급 용량 반응 곡선(graded dose response curve)의 EC50은 이의 최대 효과의 50%가 관찰되는 화합물의 농도를 나타낸다. 계수적 용량 반응 곡선의 EC50은 특정 노출 기간 후에, 집단의 50%가 반응을 나타내는 화합물의 농도를 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 "BoNT 활성을 위해 적절한 조건"은 BoNT가 BoNT 분할 부위를 특이적으로 분할할 수 있는 조건(예를 들어, 온도, pH, 보조인자, 등)을 지칭한다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, BoNT 활성을 위해 적절한 조건은 HEPES, 20μM ZnCl2, 2mM DTT, 1 ㎎/㎖ BSA, pH 7.1의 완충제를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, BoNT 활성을 위해 적절한 조건은 HEPES, 10 내지 30μM ZnCl2, 1 내지 3mM DTT, 0.5 내지 2 ㎎/㎖ BSA, pH 6.5 내지 7.5의 완충제를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, BoNT 활성을 위해 적절한 조건은 HEPES, 5 내지 50μM ZnCl2, 0.1 내지 10mM DTT, 0.1 내지 10 ㎎/㎖ BSA, pH 6.5 내지 7.5의 완충제를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 조건은 약 37℃에서 약 1시간 내지 약 36시간의 기간 동안의 항온처리를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 조건은 약 37℃에서 1시간 내지 36시간의 기간 동안의 항온처리를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 조건은 약 37℃에서 약 1시간 내지 약 24시간의 기간 동안의 항온처리를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 조건은 약 37℃에서 1시간 내지 24시간의 기간 동안의 항온처리를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 조건은 약 37℃에서 약 4시간 내지 약 24시간의 기간 동안의 항온처리를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 조건은 약 37℃에서 4시간 내지 24시간의 기간 동안의 항온처리를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 단일 사슬 폴리펩타이드는 약 3nM 내지 약 300nM의 농도로 존재한다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 단일 사슬 폴리펩타이드는 3nM 내지 300nM의 농도로 존재한다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 단일 사슬 폴리펩타이드는 약 30nM 내지 약 300nM의 농도로 존재한다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 단일 사슬 폴리펩타이드는 30nM 내지 300nM의 농도로 존재한다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 단일 사슬 폴리펩타이드는 약 30nM의 농도로 존재한다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 단일 사슬 폴리펩타이드는 30nM의 농도로 존재한다.
BoNT 활성은 또한, 세포에서, 예를 들어, 신경 세포에서 검출될 수 있다. 임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 샘플에서 C. 보툴리눔 신경독소(BoNT) 활성을 검출하는 방법으로서, a) 본 명세서에 기술된 바와 같은 단일 사슬 폴리펩타이드를 발현시키는 신경 세포에 샘플을 접촉시키는 단계; b) 신경 세포를 약 12시간 내지 약 60시간의 기간 동안 항온처리하는 단계; c) 신경 세포로부터 용해물을 수확하는 단계; 및 d) 샘플의 부재 하에서 동일하게 처리된 신경 세포에서 NANOLUC™ 루시페라제 활성과 비교하여, 용해물에서 NANOLUC™ 루시페라제 활성을 측정하는 단계로서, NANOLUC™ 루시페라제 활성의 감소가 샘플에서 BoNT 활성을 지시하는 단계를 포함하는 방법이 기술된다. 임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 샘플에서 C. 보툴리눔 신경독소(BoNT) 활성을 검출하는 방법으로서, a) N-nano1-159에 C-말단이 그리고 C-nano160 -170에 N-말단이 위치된 BoNT 분할 부위를 포함하는 링커에 의해 분리되고 기능적으로 연결된, NANOLUC™ 루시페라제의 아미노산 1 내지 159(N-nano1 -159), NANOLUC™ 루시페라제의 아미노산 160 내지 170(C-nano160-170)을 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드를 발현시키는 신경 세포에 샘플을 접촉시키는 단계; b) 신경 세포를 약 12시간 내지 약 60시간의 기간 동안 항온처리하는 단계; c) 신경 세포로부터 용해물을 수확하는 단계; 및 d) 샘플의 부재 하에서 동일하게 처리된 신경 세포에서 NANOLUC™ 루시페라제 활성과 비교하여, 용해물에서 NANOLUC™ 루시페라제 활성을 측정하는 단계로서, NANOLUC™ 루시페라제 활성의 감소가 샘플에서 BoNT 활성을 지시하는 단계를 포함하는 방법이 기술된다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 링커는 N-nano1 -159와 분할 부위 사이에 위치된 완전한 제2 루시페라제 폴리펩타이드를 더 포함한다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 신경 세포는 바이러스 발현 벡터로부터 단일 사슬 폴리펩타이드를 발현시킨다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 신경 세포는 단계 이전 적어도 3일 동안 바이러스 발현 벡터로부터 단일 사슬 펩타이드를 발현시킨다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 신경 세포는 접촉시키는 단계 이전 적어도 4일 동안 바이러스 발현 벡터로부터 단일 사슬 펩타이드를 발현시킨다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 신경 세포는 접촉시키는 단계 이전 적어도 6일 동안 바이러스 발현 벡터로부터 단일 사슬 펩타이드를 발현시킨다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 신경 세포는 접촉시키는 단계 이전 6일 동안 바이러스 발현 벡터로부터 단일 사슬 펩타이드를 발현시킨다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 바이러스 발현 시스템은 렌티바이러스 발현 시스템이다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 항온처리하는 단계 b)는 약 12시간 내지 약 72시간이다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 항온처리하는 단계 b)는 약 48시간이다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 항온처리하는 단계 b)는 48시간이다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 용해물을 수확하는 단계는 용해 완충제의 첨가를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 용해물을 수확하는 단계를 원심분리 및/또는 침강을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 방법은 각각이 상이한 BoNT 분할 부위를 갖는 단일 사슬 폴리펩타이드들의 조합, 및/또는 BoNT 분할 부위들의 조합의 사용을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "루시페라제 활성을 결정하는 것"은 루시페라제 기질의 존재 하에서 루시페라제(또는 기능성 루시페라제를 함유할 수 있는 샘플)에 의해 생성된 광의 수준을 검출하고, 정량적으로 또는 정성적으로 검출하는 것을 지칭한다. 발광은 당해 분야에 공지된 임의의 수단에 의해, 예를 들어, 발광 현미경, 광도계, 발광 플레이트 판독기, 증배관 검출기, 등에 의해 검출될 수 있다.
루시페라제 기질은 천연발생 루시페린뿐만 아니라 조작된 기질을 포함할 수 있다. 루시페린은 예를 들어, 반딧불이 루시페린, 바다반딧불[또한, 바르굴라(Vargula)로서 알려짐] 루시페린 [코엘렌테라진], 박테리아 루시페린뿐만 아니라, 이러한 기질의 합성 유사체를 포함한다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 루시페린은 코엘렌테라진 및 이의 유사체이다. 이는 미국특허 제6,436,682호(전문이 본 명세서에 참고로 포함됨), 및 예를 들어, 문헌[Zhao et al, (2004), Mol Imaging, 3;43-54]에서의 분자를 포함한다. 추가적인 기질은 예를 들어, 미국특허 5,374,534호; 5,098,828호; 6,436,682호; 5,004,565호; 5,455,357호; 및 4,950,588호에 기술되어 있으며, 이러한 문헌 각각은 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 루시페라제 활성은 단일 사슬 폴리펩타이드에 루시페라제 기질의 첨가 및 형성된 발광 신호의 정량적 측정에 의해 결정될 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, NANOLUC™ 루시페라제에 대한 기질은 푸리마진 (2-퓨란일메틸-데옥시-코엘렌테라진)일 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본 방법은 단일 사슬 폴리펩타이드에 의해 포함된 제2 루시페라제의 활성을 측정하는 것을 더 포함할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 제2 루시페라제의 활성은 세포 용해물에서 측정될 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 제2 루시페라제의 활성은 샘플, 세포, 세포 집단, 및/또는 웰을 가로질러 단일 사슬 폴리펩타이드의 발현의 정규화를 허용할 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 샘플에서 제2 루시페라제 폴리펩타이드의 루시페라제 활성은 수확된 용해물에 존재하는 전체 단일 사슬 폴리펩타이드의 지시제로서 결정되고 사용된다.
임의의 실시형태의 일 양태에서, 본 명세서에는 a) 각각 또는 조합이 별도의 용기 내에 패키징된 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 이상의 단일 사슬 폴리펩타이드; 각각 또는 조합이 별도의 용기 내에 패키징된 본 명세서에 기술된 하나 이상의 핵산 또는 핵산 벡터; 및/또는 각각 또는 조합이 별도의 용기 내에 패키징된 본 명세서에 기술된 하나 이상의 세포를 포함하는 키트가 기술된다.
키트는 적어도 하나의 시약, 예를 들어, 단일 사슬 폴리펩타이드, 단일 사슬 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 단일 사슬 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 임의의 제조물(manufacture)(예를 들어, 패키지 또는 용기)이며, 이러한 제조물은 본 명세서에 기술된 방법 또는 검정을 수행하기 위한 유닛으로서 판촉, 배포, 또는 판매된다.
본 명세서에 기술된 키트는 리포터, 예를 들어, 한 타입 이상의 루시페라제의 활성 수준의 검정을 가능하게 하는 시약 및/또는 성분을 포함한다. 이러한 시약은 단일 사슬 폴리펩타이드 이외에, 예를 들어, 완충 용액, 기질, 또는 세척액, 등을 포함한다. 또한, 키트는 소정 양의 신경독소, 예를 들어, BoNT, 또는 키트의 보정을 위해 또는 내부 조절로서 사용될 수 있는 루시페라제를 포함할 수 있다. 추가적으로, 키트는 지시 리플릿(instruction leaflet)을 포함할 수 있고/거나, 얻어진 결과의 관련성에 관한 정보를 제공할 수 있다.
편의상, 본 명세서, 실시예, 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 일부 용어 및 구의 의미는 하기에 제공된다. 달리 기술하지 않는 한, 또는 문맥으로부터 함축되지 않는 한, 하기 용어 및 구는 하기에 제공되는 의미를 포함한다. 이러한 정의는 특정 실시형태를 기술하는 것을 보조하기 위해 제공되고, 본 발명의 범위가 단지 청구범위에 의해 제한되기 때문에, 청구된 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 달리 규정하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 당해 분야에서 용어의 사용과 본 명세서에 제공된 이의 정의 사이에 명백한 불일치가 존재하는 경우에, 명세서 내에 제공된 정의가 우선한다.
편의상, 본 명세서에서, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 특정 용어들은 여기에서 수집된다.
용어 "감소하다(decrease)", "줄어든(reduced)", "감소(reduction)", 또는 "저해하다(inhibit)"는 모두 본 명세서에서, 통계학적으로 유의미한 양까지의 감소를 의미하기 위해 사용된다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, "줄어들다(reduce)," "감소" 또는 "감소하다" 또는 "저해하다"는 통상적으로, 기준 수준(예를 들어, 제공된 처리 또는 제제의 부재)과 비교하여 적어도 10% 감소를 의미하고, 예를 들어, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 그 이상까지의 감소를 포함할 수 있다.
용어 "증가된(increased)", "증가하다(increase)", "향상하다(enhance)", 또는 "활성화하다(activate)" 모두는 본 명세서에서 통계학적으로 유의미한 양까지의 증가를 의미하기 위해 사용된다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 용어 "증가된", "증가하다", "향상하다" 또는 "활성화하다"는 기준 수준과 비교하여 적어도 10%의 증가, 예를 들어, 기준 수준과 비교하여, 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 100%까지 및 100%를 포함하는 증가, 또는 10 내지 100%의 임의의 증가, 또는 기준 수준과 비교하여 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가, 또는 2배 내지 10배 또는 그 초과의 임의의 증가를 의미할 수 있다. 마커의 문맥에서, "증가"는 이러한 마커 수준에서 통게학적으로 유의미한 증가이다.
본 명세서에서 사용되는 "대상체(subject)"는 인간 또는 동물을 의미한다. 대개, 동물은 척추동물, 예를 들어, 영장류, 설치류, 가축 또는 게임 동물이다. 영장류는 침팬지, 시노몰로구스 원숭이, 스파이더 원숭이, 및 마카크, 예를 들어, 레수스(Rhesus)를 포함한다. 설치류는 마우스, 래트, 우드척(woodchuck), 흰담비(ferret), 토끼 및 햄스터를 포함한다. 가축 및 게임 동물은 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이 종, 예를 들어, 애완용 고양이(domestic cat), 개 종, 예를 들어, 개(dog), 여우, 늑대, 조류 종, 예를 들어, 닭, 에뮤(emu), 타조, 및 어류, 예를 들어, 송어, 메기 및 연어를 포함한다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 대상체는 포유류, 예를 들어, 영장류, 예를 들어, 인간이다. 용어 "개체(individual)", "환자(patient)" 및 "대상체"는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다.
바람직하게는, 대상체는 포유류이다. 포유류는 인간, 비인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 말, 또는 소일 수 있지만, 이러한 예로 제한되지 않는다. 인간 이외의 포유류는 유리하게, 보툴리눔 활성의 동물 모델을 나타내는 대상체로서 사용될 수 있다. 대상체는 수컷 또는 암컷일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "결합 활성"은 하나의 분자가 비제한적으로, 공유 결합, 이온 결합, 금속성 결합, 수소 결합, 소수성 상호작용, 반데르발스 상호작용, 등, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 적어도 하나의 분자내 또는 분자간 힘을 통해 다른 분자와 접촉하는 것을 의미한다. "결합된(bound)" 및 "결합하다(bind)"는 결합에 대한 용어로 여겨진다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 단일 사슬 폴리펩타이드는 단리되거나 정제될 수 있다. "단리된(isolated)"은 이의 천연 상태에서 발견되는 바와 같이 일반적으로 동반되는 성분으로부터 자유도가 다른 물질을 의미한다. "단리하다(isolate)"는 원 소스 또는 주변으로부터, 예를 들어, 세포 또는 세포 용해물로부터 분리 정도를 나타낸다.
용어 "정제된(purified)"은 제조물의 다른 성분(예를 들어, 다른 폴리펩타이드)와 관련하여, "실질적으로 순수한" 폴리펩타이드와 같은 물질을 지칭한다. 이는 다른 성분과 관련하여, 적어도 약 50%, 60%, 70%, 또는 75%, 바람직하게는, 적어도 약 85%, 더욱 바람직하게는, 적어도 약 90%, 및 가장 바람직하게는, 적어도 약 95% 순수한 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다. 재구성하면(recast), 폴리펩타이드와 관련하여, 용어 "실질적으로 순수한(substantially pure)" 또는 "필수적으로 정제된(essentially purified)"은 약 20% 이하, 더욱 바람직하게는, 약 15%, 10%, 8%, 7% 이하, 가장 바람직하게는, 약 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하, 또는 1% 미만의 하나 이상의 다른 성분(예를 들어, 다른 폴리펩타이드 또는 세포 성분)을 함유한 제조물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "접촉하는(contacting)"은 샘플 또는 제제를 본 명세서에 기술된 바와 같은 단일 사슬 폴리펩타이드(또는 상기 폴리펩타이드를 포함하는 세포)로 전달하거나 노출시키기 위한 임의의 적합한 수단을 지칭한다. 예시적인 전달 방법은 샘플로 또는 세포 배양 배지로의 직접 전달, 관류, 주입, 또는 당업자에게 공지된 다른 전달 방법을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "샘플(sample)" 또는 "시험 샘플(test sample)"은 임의의 소스, 예를 들어, 생물학적, 환경적, 산업적, 또는 그밖의 소스로부터 얻어지거나 단리된 샘플을 나타낸다. 이러한 용어는 또한, 상기 언급된 샘플들의 혼합물을 포함한다. 용어 "시험 샘플"은 또한, 미처리되거나 전처리된(또는 사전가공된) 샘플을 포함한다. 시험 샘플은 소스로부터 샘플을 제거함으로써 얻어질 수 있지만, 또한, (예를 들어, 이전 시점에 단리되고 동일한 또는 다른 사람에 의해 단리된) 종래에 단리된 샘플을 사용함으로써 달성될 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 시험 샘플은 미처리된 시험 샘플일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 구 "미처리된 시험 샘플"은 용액 중의 희석 및/또는 현탁을 제외하고 임의의 종래 샘플 전처리되지 않은 시험 샘플을 지칭한다. 시험 샘플을 처리하기 위한 예시적인 방법은 원심분리, 여과, 초음파처리, 균질화, 가열, 냉동 및 해동, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 시험 샘플은 냉동된 시험 샘플, 예를 들어, 냉동된 환경 샘플, 냉동된 산업 샘플, 또는 냉동된 조직일 수 있다. 냉동된 샘플은 본 명세서에 기술된 방법, 검정 및 시스템을 사용하기 전에 해동될 수 있다. 해동 후에, 냉동된 샘플은 본 명세서에 기술된 방법, 검정 및 시스템으로 처리되기 전에 원심분리될 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 시험 샘플은 예를 들어, 원심분리 및 상청액의 수집에 의해 제조된 정제된 시험 샘플이다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 시험 샘플은 원심분리, 여과, 해동, 정제, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 처리로부터 얻어진 전처리된 시험 샘플, 예를 들어, 상청액 또는 여액일 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 시험 샘플은 화학적 및/또는 생물학적 시약으로 처리될 수 있다. 화학적 및/또는 생물학적 시약은 처리하는 동안, 안에 생체 분자(예를 들어, 단백질)를 포함하는, 샘플의 안정성을 보호하고/하거나 유지하기 위해 사용될 수 있다. 당업자는 본 명세서에 기술된 발현 산물의 수준의 결정을 위해 요망되는 생물학적 샘플의 전처리에 적합한 방법 및 공정을 잘 인지하고 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "신경 세포" 또는 "뉴런(neuron)"은 신경 신호로서 정보를 수용하고, 처리하고, 전달하기 위해 특화된 신경계에서 발견되는 세포를 지칭한다. 뉴런은 중앙 세포체 또는 소마(soma)를 포함할 수 있으며, 두 가지 타입의 돌기, 즉, 일반적으로, 대다수의 신경 신호가 세포체로 이동되는 수상 돌기, 및 일반적으로, 대부분의 신경 신호가 세포체에서 원심 세포, 예를 들어, 표적 뉴런 또는 근육으로 이동되는 액손을 포함할 수 있다. 뉴런은 정보를 조직 및 장기에서 중추신경계(구심 또는 감각 뉴런)로 이동시키고, 신호를 중추신경계에서 이펙터 세포(원심 또는 운동 뉴런)로 전달할 수 있다. 인터뉴런으로 명명되는 다른 뉴런은 신경 시스템 내에서 뉴런을 연결시킨다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "특이적(specific)"은 2개의 분자 간의 특정 상호작용(예를 들어, 결합 및/또는 분열)을 지칭하며, 여기서, 제1 독립체는 비-표적인 제3 독립체와 상호작용하는 것보다 더 큰 특이성 및 친화력을 갖는 제2의 표적 독립체와 상호작용한다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 특이적은 제3 비표적 독립체와의 상호작용보다 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배, 적어도 1000배 또는 그 초과인 제2 표적 독립체와 제1 독립체의 상호작용을 지칭할 수 있다. 제공된 표적에 대해 특이적인 시약은 사용되는 검정의 조건 하에서 그러한 표적에 대한 특이적 결합 또는 사용되는 검정의 조건 하에서 표적 서열의 특이적 분열을 나타내는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 알파-아미노와 인접한 잔기의 카복시기 간의 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된, 일련의 아미노산 잔기를 지칭하기 위해 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다. 용어 "단백질," 및 "폴리펩타이드"는 이의 크기 또는 기능과는 무관하게, 변형된 아미노산(예를 들어, 포스포릴화, 글리케이트화된, 글리코실화된, 등) 및 아미노산 유사체를 포함하는, 아미노산의 폴리머를 지칭한다. "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 비교적 큰 폴리펩타이드를 참조하여 종종 사용되며, 용어 "펩타이드"는 종종 작은 폴리펩타이드를 참조하여 사용되지만, 당해 분야에서 이러한 용어들의 사용은 중첩된다. 용어 "단백질" 및 "폴리펩타이드"는 유전자 산물 및 이의 단편을 지칭할 때 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다. 이에 따라, 예시적인 폴리펩타이드 또는 단백질은 유전자 산물, 천연발생 단백질, 동족체, 오쏘로그(ortholog), 파라로그(paralog), 단편 및 다른 균등물, 상기 기술된 것의 변이체, 단편, 및 유사체를 포함한다.
본 명세서에 기술된 다양한 실시형태에서, 또한, 기술된 임의의 특정 폴리펩타이드의 변이체(천연발생 또는 다른 것), 대립 형질, 동족체, 보존적으로 변형된 변이체, 및/또는 보존적 치환 변이체가 포함된다는 것이 고려된다. 아미노산 서열로서, 당업자는 암호화된 서열에서 단일 아미노산 또는 작은 백분율의 아미노산을 변경시키는 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질 서열에 대한 개별적인 치환, 결실 또는 부가가 변경이 하나의 아미노산의 화학적으로 유사한 아미노산으로의 치환을 야기시키고 폴리펩타이드의 요망되는 활성을 보유하는 "보존적으로 변형된 변이체"라는 것을 인식할 것이다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 개시내용과 일치하는 다형성 변이체, 종간 동족체, 및 대립 형질에 추가하거나 이를 배제하지 않는다.
제공된 아미노산은 유사한 물리화학적 특징을 갖는 잔기에 의해 대체되어, 예를 들어, 하나의 지방족 잔기를 다른 것(예를 들어, 서로 간에 Ile, Val, Leu, 또는 Ala)으로 치환하거나, 하나의 극성 잔기를 다른 것(예를 들어, Lys와 Arg; Glu와 Asp; 또는 Gln과 Asn 간)으로 치환할 수 있다. 다른 이러한 보존적 치환, 예를 들어, 유사한 소수성 특징을 갖는 전체 영역의 치환은 널리 공지되어 있다. 보존적 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드는 그러한 요망되는 활성을 확인하기 위해 본 명세서에 기술된 검정들 중 임의의 하나에서 시험될 수 있으며, 예를 들어, 천연 또는 기준 폴리펩타이드의 폴리펩타이드의 결합 활성 및 특이성이 보유된다.
아미노산은 이의 측쇄의 성질의 유사성에 따라 그룹핑될 수 있다[A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)]: (1) 비극성: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) 비하전된 극성: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q); (3) 산성: Asp (D), Glu (E); (4) 염기성: Lys (K), Arg (R), His (H). 대안적으로, 천연발생 잔기는 일반적인 측쇄 성질을 기초로 하여 그룹으로 나눠질 수 있다: (1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe. 비보존적 치환은 이러한 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다. 특정 보존적 치환은 에를 들어, Ala의 Gly로 또는 Ser로; Arg의 Lys로; Asn의 Gln로 또는 His로; Asp의 Glu로; Cys의 Ser로; Gln의 Asn으로; Glu의 Asp로; Gly의 Ala로 또는 Pro로; His의 Asn으로 또는 Gln로; Ile의 Leu로 또는 Val로; Leu의 Ile로 또는 Val로; Lys의 Arg로, Gln로 또는 Glu로; Met의 Leu로, Tyr로 또는 Ile로; Phe의 Met로, Leu로 또는 Tyr로; Ser의 Thr로; Thr의 Ser로; Trp의 Tyr로; Tyr의 Trp로; 및/또는 Phe의 Val로, Ile로 또는 Leu로를 포함한다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩타이드(또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산)는 본 명세서에 기술된 아미노산 서열 중 하나의 기능성 단편일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "기능성 단편(functional fragment)"은 본 명세서의 하기에 기술된 검정에 따라 야생형 기준 폴리펩타이드의 활성의 적어도 50%를 보유하는 펩타이드의 단편 또는 세그먼트이다. 기능성 단편은 본 명세서에 개시된 서열의 보존적 치환을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 폴리펩타이드는 본 명세서에 기술된 서열의 변이체일 수 있다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 변이체는 보존적으로 변형된 변이체이다. 보존적 치환 변이체는, 예를 들어, 천연 뉴클레오타이드 서열의 돌연변이에 의해 얻어질 수 있다. 본 명세서에서 지칭되는 "변이체(variant)"는 천연 또는 기준 폴리펩타이드와 실질적으로 상동성이 있지만, 하나 또는 복수의 결실, 삽입 또는 치환으로 인해 천연 또는 기준 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 다른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이다. 변이체 폴리펩타이드-암호화 DNA 서열은 천연 또는 기준 DNA 서열과 비교할 때 뉴클레오타이드의 하나 이상의 첨가, 결실, 또는 치환을 포함하지만, 활성을 보유하는 변이체 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 서열을 포함한다. 광범위한 PCR-기반 부위-특이적 돌연변이유발 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 당업자에 의해 적용될 수 있다.
변이체 아미노산 또는 DNA 서열은 천연 서열 또는 기준 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 초과 동일할 수 있다. 천연 서열과 돌연변이 서열 간의 상동성 정도(동일성 백분율)는, 예를 들어, 월드 와이드 웹(world wide web) 상에서 이러한 목적으로 위해 통상적으로 사용되는 자유롭게 이용 가능한 컴퓨터 프로그램(예를 들어, 디폴트 셋팅을 갖는 BLASTp 또는 BLASTn)을 이용하여 2개의 서열을 비교함으로써 결정될 수 있다.
천연 아미노산 서열의 변경은 당업자에게 알려진 임의의 수의 기술에 의해 달성될 수 있다. 돌연변이는, 예를 들어, 천연 서열의 단편에 대한 결창을 가능하게 하는 제한 부위에 의해 인접된, 돌연변이 서열을 함유한 올리고뉴클레오타이드를 합성함으로써 특정 유전자좌에 도입될 수 있다. 결찰 이후에, 얻어진 재구성된 서열은 요망되는 아미노산 삽입, 치환, 또는 결실을 갖는 유사체를 암호화한다. 대안적으로, 올리고뉴클레오타이드-지시 부위-특이적 돌연변이유발 절차는 요망되는 치환, 결실, 또는 삽입에 따라 변경된 특정 코돈을 갖는 변경된 뉴클레오타이드 서열을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 변형을 하는 기술은 매우 잘 확립되었고, 예를 들어, 문헌[Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); 및 미국특허 4,518,584호 및 4,737,462호]에 개시된 것을 포함하며, 이러한 문헌은 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 폴리펩타이드의 적절한 형태를 유지하는 데 관여하지 않은 임의의 시스테인 잔기는 또한, 분자의 산화 안정성을 개선시키고 이상 가교를 방지하기 위해 일반적으로 세린으로 치환될 수 있다. 상반되게, 시스테인 결합(들)은 이의 안정성을 개선시키거나 올리고머화를 촉진시키기 위해 폴리펩타이드에 첨가될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 임의의 분자, 바람직하게는, 폴리머 분자, 리보핵산, 데옥시리보핵산 또는 이의 유사체의 도입 단위를 지칭한다. 핵산은 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 단일 가닥 핵산은 변성된 이중 가닥 DNA의 하나의 핵산 가닥일 수 있다. 대안적으로, 이는 임의의 이중 가닥 DNA로부터 유래되지 않은 단일 가닥 핵산일 수 있다. 일 양태에서, 핵산은 DNA일 수 있다. 다른 양태에서, 핵산은 RNA일 수 있다. 적합한 DNA는, 예를 들어, 게놈 DNA 또는 cDNA를 포함할 수 있다. 적합한 RNA는, 예를 들어, mRNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기술되는 폴리펩타이드, 핵산, 또는 세포는 조작될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "조작된(engineered)"은 인간의 손으로 조작된 양태를 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 적어도 하나의 양태, 예를 들어, 이의 서열이 자연에서 존재하는 양태와 다르도록, 인간의 손으로 조작되었을 때 "조작된" 것으로 여겨진다. 일반적일 실무이고, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 조작된 세포의 자손은 통상적으로, 여전히, 실제 조작이 종애 실체에 대해 수행되었더라도 "조작된" 것으로서 지칭된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포로의 전달을 위해 또는 상이한 숙주 세포 사이로의 전달을 위해 설계된 핵산 작제물을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 벡터는 바이러스성이거나 비-바이러스성일 수 있다. 용어 "벡터"는 적절한 조절 요소와 결합될 때 복제할 수 있고 유전자 서열을 세포로 전달할 수 있는 임의의 유전 요소를 포함한다. 벡터는 클로닝 벡터, 발현 벡터, 플라스미드, 파지, 트랜스포손, 코스미드, 크로모솜, 바이러스, 비리온, 등을 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발현 벡터"는 벡터 상에 전사 조절 서열에 연결된 서열로부터 RNA 또는 폴리펩타이드의 발현을 유도하는 벡터를 지칭한다. 발현된 서열은 종종, 세포에 이종성일 것이지만, 이는 필수적인 것은 아니다. 발현 벡터는 추가적인 요소를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 발현 벡터는 2개의 복제 시스템을 가져서, 이를 2개의 유기체에서, 예를 들어, 발현을 위한 인간 세포에서 및 클로닝 및 증폭을 위한 원핵 숙주에서 유지될 수 있다. 용어 "발현(expression)"은 예를 들어, 적용 가능한 경우, 전사, 전사체 처리, 번역 및 단백질 폴딩, 변형 및 처리를 포함하지만, 이로 제한되지 않는, RNA 및 단백질을 형성하고 적절한 경우에, 단백질을 분비하는 데에 관여된 세포 과정을 지칭한다. "발현 산물(expression product)"은 유전자로부터 전사된 RNA, 및 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역에 의해 얻어진 폴리펩타이드를 포함한다. 용어 "유전자(gene)"는 적절한 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 때 시험관내에서 생체내에서 RNA로 전사된(DNA) 핵산 서열을 의미한다. 유전자는 코딩 영역 이전 및 이후 영역, 예를 들어, 5' 비번역된(5'UTR) 또는 "리더" 서열 및 3'UTR 또는 "트레일러" 서열뿐만 아니라, 개별 코딩 세그먼트(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "바이러스 벡터(viral vector)"는 바이러스 기원의 적어도 하나의 구성요소를 포함하고 바이러스 벡터 입자 내에 패키징되는 능력을 갖는 핵산 벡터 작제물을 지칭한다. 바이러스 벡터는 비필수 바이러스 유전자 대신에 본 명세서에 기술된 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 함유할 수 있다. 벡터 및/또는 입자는 시험관 내에서 또는 생체내에서 임의의 핵산을 세포 내로 전달할 목적을 위해 사용될 수 있다. 여러 형태의 바이러스 벡터가 당해 분야에 공지되어 있다.
"재조합 벡터(recombinant vector)"는 이종 핵산 서열, 또는 생체 내에서 발현할 수 있는 "이식 유전자(transgene)"를 포함하는 벡터를 의미한다. 본 명세서에 기술된 벡터가 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 다른 적합한 조성물 및 치료법과 조합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에 기술된 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 벡터는 에피솜이다. 적합한 에피솜 벡터의 사용은 염색체 통합의 잠재적인 효과를 제거하는 높은 복사체 수의 추가 염색체 DNA에서의 대상체 또는 세포에서 고려되는 뉴클레오타이드를 유지하는 수단을 제공한다.
용어 "통계학적으로 유의미한" 또는 "유의미하게"는 통계 유의성을 의미하고, 일반적으로 2의 표준 편차(2SD) 또는 이것 초과의 차이를 의미한다.
작동예 이외에, 또는 달리 명시하지 않는 경우, 본 명세서에 사용된 성분 또는 반응 조건의 분량을 나타내는 모든 수는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "약"은 백분율과 함께 사용될 때, ±1%를 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "포함하는" 또는 "포함한다"는, 방법 또는 조성물에 본질적이지만, 본질적이든 또는 아니든 기재되지 않은 요소의 포함에 개방적인, 조성물, 방법 및 이의 각각의 성분(들)을 언급하여 사용된다.
용어 "이루어진"은 실시형태의 설명에 인용되지 않은 임의의 요소를 배제한 명세서에 기재된 바와 같은 조성물, 방법 및 이의 각각의 성분을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "...을 필수적으로 포함하는"은 소정의 실시형태에 필요한 이들 요소를 의미한다. 상기 용어는 그 실시형태의 기본적이고 신규한 또는 기능적 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 요소의 존재를 허용한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "...에 해당하는"은 제1 폴리펩타이드 또는 핵산에서 나열된 위치에서의 아미노산 또는 뉴클레오타이드, 또는 제2 폴리펩타이드 또는 핵산에서 나열된 아미노산 또는 뉴클레오타이드와 균등한 아미노산 또는 뉴클레오타이드를 지칭한다. 균등한 나열된 아미노산 또는 뉴클레오타이드는 당해 분야에 공지된 어느 정도 동일한 프로그램, 예를 들어, BLAST를 이용한 후보 서열의 정렬에 의해 결정될 수 있다.
단수 용어 "일", "하나" 및 "이"는, 문맥이 명확히 다르게 표시하지 않는 한, 복수 지시어를 포함한다. 유사하게, 단어 "또는"은, 문맥이 명확히 다르게 표시하지 않는 한, "및"을 포함하도록 의도된다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 개시내용의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기 기재되어 있다. 약어, "예를 들어"는 라틴어 exempli gratia로부터 파생되고, 비제한적인 예를 표시하도록 본 명세서에서 사용된다. 따라서, 약어 "예를 들어"는 용어 "예컨대"와 동의어이다.
본 명세서에 달리 정의되지 않은 한, 본 명세서와 관련하여 사용된 과학 용어 및 기술 용어는 본 개시내용이 속하는 당해 분야의 숙련자에 의해 흔히 이해되는 의미를 가져야 한다. 본 발명이 본 명세서에 기재된 특정한 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않고 그래서 변할 수 있다고 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용된 전문용어는 오직 특정한 실시형태를 기술할 목적을 위한 것이고, 청구항에 의해 오직 한정되는 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다. 분자 생물학에서의 공통 용어의 정의는 문헌[The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin's Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014　 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; 및 Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737](이들의 내용은 모두 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨)에서 발견될 수 있다.
다른 용어들은 본 명세서에서 본 발명의 다양한 양태의 설명 내에서 규정된다.
본 명세서에 걸쳐 인용된 문헌 참조, 등록 특허, 공개 특허 출원 및 계류 중인 특허 출원을 포함하는 모든 특허 및 다른 공보는, 예를 들어 본 명세서에 기재된 기법과 연결되어 사용되는 이러한 공보에 기재된 방법론을 기재하고 개시할 목적을 위해 본 명세서에 참고로 명확히 포함된다. 이들 공보는 본 명세서의 출원일 전에 이들 개시내용에 대해 오직 제공된다. 이와 관련하여 어떤 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 이러한 개시내용에 앞선다고 자격 부여되지 않는다는 인정으로 해석되지 않아야 한다. 날짜에 관한 모든 성명 또는 이들 문헌의 내용에 관한 표시는 출원인에게 이용 가능한 정보에 기초하고, 이들 문헌의 날짜 또는 내용의 정확성에 관한 어떠한 시인을 구성하지 않는다.
본 개시내용의 실시형태의 설명은 철저하고 개시된 정확한 형태로 본 개시내용을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 개시내용의 구체적인 실시형태 및 본 개시내용에 대한 예는 예시적인 목적을 위해 본 명세서에 기재되어 있지만, 다양한 균등한 변형은 당해 분야의 숙련자가 인식하는 것처럼 본 개시내용의 범위 내에 가능하다. 예를 들어, 방법 단계 또는 기능이 소정의 순서로 제시되어 있지만, 대안적인 실시형태는 상이한 순서로 기능을 수행할 수 있거나, 기능은 실질적으로 동시에 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공된 개시내용의 교시는 적절한 바대로 다른 절차 또는 방법에 적용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 다양한 실시형태는 조합되어 추가의 실시형태를 제공할 수 있다. 개시내용의 양태는 필요한 경우 변형되어 상기 문헌 및 출원의 조성물, 기능 및 개념을 이용하여 본 개시내용의 다른 추가의 실시형태를 제공할 수 있다. 더구나, 생물학적 기능 균등성 고려로 인해, 종류 또는 양에서 생물학적 또는 화학적 작용에 영향을 미치지 않으면서 단백질 구조에 약간의 변경이 이루어질 수 있다. 이들 및 다른 변경은 상세한 설명의 견지에서 본 개시내용에 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
임의의 상기 실시형태의 특정 구성요소는 다른 실시형태에서의 구성요소와 조합되거나 이로 치환될 수 있다. 또한, 본 개시내용의 특정 실시형태와 관련한 장점이 이러한 실시형태의 문맥에 기술되었지만, 또한, 다른 실시형태가 이러한 장점을 나타낼 수 있으나, 모든 실시형태가 본 개시내용의 범위 내에 속하는 이러한 장점을 반드시 나타낼 필요는 없다.
본 명세서에 기술된 기술은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이러한 실시예는 어떠한 방식으로도 추가로 한정적인 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1: 보툴리눔 신경독소의 활성을 측정하기 위한 새로운 시험관내 및 세포-기반 검정
보툴리눔 신경독소는 7개의 박테리아 독소(BoNT/A-G)의 패밀리이다. 이러한 것들은 6개의 카테고리 A 잠재적 생물테러 제제(bioterrorism agent) 중 하나이다. 이러한 독소는 또한, 20억 달러가 넘는 시장을 갖는, 증가하고 있는 의학적 질환의 리스트를 치료하기 위해 널리 사용되고 있다. BoNT의 검출 및 특징분석은 전통적인 마우스 치사 용량(LD50) 검정에 의존적이다. 두 생체방어 목적으로부터 그리고 의학 제품 개발을 위해 동물 검정을 더욱 편리하고, 민감하고, 정확한 시험관내 및 세포-기반 검정으로 대체할 시급한 요구가 존재한다.
다양한 감도를 갖는, 독소 활성을 검출하고 특징분석하기 위한 현재 이용 가능한 시험관내 검정이 개발되었다. 2개의 주요 상업화된 검정이 존재하는데, 이러한 검정 둘 모두는 독소의 효소 도메인에 의한 기질의 분할의 형광 검출을 기초로 한 것이다. 이러한 검정 중 제1 검정은 SNAPtide™(List Biologics)이며, 이는 BoNT에 대한 천연 분할 부위를 함유하고 2개의 형광 염료로 라벨링된 합성 펩타이드의 사용을 포함한다. 형광 신호는 일반적으로, 2개의 염료 사이에 켄칭되며, 신호는 펩타이드가 BoNT에 의해 분할되자마자 발생한다. 제2 검정은 BoTest™(BioSentinel LLC)이다. 시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein: CFP)은 펩타이드 서열을 통해 황색 형광 단백질(yellow fluorescent protein: YFP)에 연결된다. BoNT에 의한 링커의 분할은 검출될 수 있는 CFP와 YFP 간의 형광 공명 에너지 전달(fluorescence resonance energy transfer: FRET)을 폐지한다.
두 검정 모두는 독소를 검출하고 독소 활성을 특징분석하는 민감하고 편리한 방법을 제공하고, 현재 실험실에서 널리 사용되고 있다. 이러한 검정이 갖는 상당한 단점은 이러한 형광 검정이 독소 및 임상 샘플의 약제학적 제품에서 높은 수준으로 존재하는 혈청 알부민 단백질로 방해받기 쉽다는 것이다. 현재의 해법은 이러한 형광 검정 이전에 특정 독소 항체로 이러한 샘플로부터의 독소를 정제하는 것이지만, 이는 검정에 대한 상당한 비용을 부가하고, 용이하게 이용 가능하지 않는 특별한 제제(독소 항체)를 필요로 한다.
현재, 제약 회사에 의해 독소 활성을 정량화하기 위해 매년 많은 마우스가 사용되고 있다. BoNT의 생산에서 동물의 사용을 감소시키기 위해, 마우스 바이오-검정을 대체하기 위한 세포 기반 검정을 개발할 긴급한 요구가 존재한다. 세포 기반 검정은 수용체 결합, 멤브레인 전위, 및 효소 활성을 포함하는, 독소 활성의 모든 양태를 시험하는 능력을 제공한다. 이러한 양태는 임의의 시험관내 검정에 의해 캡처되지 않는다. 현재, 주요 제약 회사(Allergan)에 의해 잘 규명된 단지 하나의 세포 기반 검정이 존재한다. 이러한 검정은 BoNT/A에 의해 분할된 SNAP-25 단백질을 인식하는 단클론성 항체를 사용하는 것을 기반으로 한 ELISA-타입 검정이다. 간단하게, 세포를 BoNT/A에 노출시키고, 분할된 SNAP-25를 풀다운시키고(pull down), 전장 단백질이 아닌 분할된 SNAP-25만을 인식하는 특별한 항체에 의해 고정하였다. 고정된 SNAP-25는 이후에, 제2의 SNAP-25 항체에 의해 검출된다. 이러한 검정은 양호한 감도를 제공하고, 마우스 검정을 잠재적으로 대체할 수 있다. 이는 독소 제품을 정량화하기 위해 FDA에 의해 승인된다. 주요 단점은 Allergan에 의해 생성된 특별한 항체에 의존한다는 것이다.
개발 중인 대안적인 검정은 세포에서 기질로서 CFP-SNAP-25-YFP를 사용하는 것을 포함한다(BioSentinel LLC). 세포에서 이러한 융합 단백질의 분할은 CFP와 YFP 간의 FRET 신호를 폐지한다. 주요 단점은 이러한 검정이 또한, 형광 현미경과 같은 복잡한 장비를 필요로 한다는 것이다.
본 명세서에는 시험관내 및 생체내에서 BoNT의 활성을 검출하고 측정하기 위해 개발된 신규한 검정이 기술된다. 이러한 검정은 분할된 형태의 루시페라제의 개발을 기초로 한 것이다. NANOLUC™ 루시페라제는 최고의 단백질 안정성 및 크게 증가된 발광 신호(전통적인 반딧불이 루시페라제보다 100배 초과 더 높음)를 갖는 새로운 세대의 루시페라제이다. 이러한 루시페라제는 2개의 조각으로 분할될 수 있다. 이러한 2개의 조각은 서로 가까이 있을 때, 이러한 것들은 발광 신호를 발생시키는 완전 활성 형태로 재구성할 수 있다. 이러한 2개의 조각이 서로 분리될 때 발광 신호가 폐지된다. 도 1에 도시된 예시적인 실시형태에서, 독소 기질(BoNT/A, E, 및 C에 대한 SNAP-25, BoNT/B, D, F, G에 대한 시냅토브레빈)로부터 유래된 링커 영역을 NANOLUC™ 루시페라제의 2개의 단편들 사이에 삽입하였다. BoNT에 의한 이러한 링커 영역의 분할은 NANOLUC™ 루시페라제의 2개의 단편을 분리시키고, 이의 활성을 폐지하여, 발광 신호의 감소를 야기시킨다. 이러한 방법의 타당성을 입증하기 위해, 하기 독소 센서를 설계하고 시험하였다.
시험관내 독소 센서: 3개의 상이한 시험관내 프로토타입 독소 센서를 생성시키고 시험하였다(도 2A 및 도 2B, 도 3A 및 도 3B). 제1 센서는 2개의 분할된 NANOLUC™ 단편들(각각 N-nano 및 C-nano, 도 2A 및 도 2B) 사이에서 BoNT/A, E, 및 C에 의해 분할될 수 있는 SNAP-25 단편을 함유한다. 제2 센서는 독소 수용체로서 역할을 하는 SV2C의 추가적이 단편을 함유하며, 이는 독소와 센서 간의 상호작용을 향상시킴으로써 분할 효율을 증가시킬 수 있다. 제3 버전은 BoNT/B, D, F, 및 G에 의해 분할될 수 있는 시냅토프레빈 단편을 함유한다(도 3A 및 도 3B).
이러한 센서 단백질을 재조합 단백질로서 정제하였다. SNAP-25를 함유한 2가지 버전의 센서를 4 또는 24시간 동안 소정 구배의 농도의 BoNT/A와 함께 항온처리하였다. 나머지 루시페라제 활성을 측정하였고, 도 2A에 도시된 바와 같이 플롯팅하였다. 대조군으로서, BoNT/B가 이러한 2개의 센서의 루시페라제 활성에 영향을 미치지 않고, BoNT/A에 대한 이러한 2개의 센서의 특이성을 나타낸다는 것이 확인되었다. 도 2B에 도시된 바와 같이, SV2C 단편을 함유한 센서는 4시간의 항온처리 후에 9.7pM에서 EC50을 갖는다. 이는 SV2C 없는 센서보다 대략 5배 이상 민감하며, 이는 독소 수용체의 단편의 포함이 더욱 민감한 독서 센서를 야기시킬 수 있음을 나타낸다.
제3 센서 단백질을 소정 구배의 BoNT/B와 함께 항온처리하였다. 잔류 루시페라제 활성을 측정하였고, 도 3A에 도시된 바와 같이 플롯팅하였다. 도 3B에 나열된, EC50은 4시간 항온처리 후에 대략 75.7pM이다. 24시간 동안 독소를 센서와 함께 항온처리하는 것은 EC50을 3.9pM까지 유의미하게 개선시켰다.
이용 가능한 시험관내 센서와 비교한 장점: 이러한 루시페라제 기반 독소 센서는 형광 기반 센서와 유사한 감도를 제공한다. 이러한 분할된 루시페라제 기반 센서의 주요 장점은 이러한 것이 혈청 알부민 단백질의 존재에 의해 영향을 받지 않는다는 것이다.
세포 기반 검정: 세포 기반 검정을 위한 센서의 예시적인 실시형태는 도 4에 예시되어 있다. 이는 분할된 NANOLUC™ 루시페라제 단편들 사이에 전장 SNAP-25를 함유한다. 또한, 이는 또한, N-nano와 SNAP-25 사이에 반딧불이 루시페라제를 함유하며, 이는 세포에서 센서 단백질의 발현 수준에 대한 내부 대조군을 제공한다. 이러한 센서 단백질을 렌티바이러스 매개 감염을 통해 뉴런에서 발현하였다. 이후에, 뉴런을 다양한 농도의 BoNT/A에 노출시켰다. 세포 용해물을 48시간 후에 수확하였으며, 반딧불이 루시페라제 및 NANOLUC™ 루시페라제 둘 모두의 루시페라제 활성을 측정하였다. NANOLUC™ 루시페라제의 수준은 반딧불이 루시페라제 신호를 이용하여 정규화되고, 이후에, 임의의 독소에 노출되지 않은 대조 뉴런에 대해 정규화된다(도 4). 독소와 함께 뉴런의 항온처리는 NANOLUC™ 루시페라제의 신호를 감소하였으며(도 4), EC50은 2.9pM이다.
이용 가능한 세포 기반 검정과 비교한 장점: 본 명세서에 기술된 검정은 Allergan에 의해 입증된 ELISA 기반 검정과 유사한 감도를 제공한다. 본 검정의 주요 장점은 임의의 특수한 항체를 필요로 하지 않는다는 것이다. 이는 또한, ELISA 검정보다 더 용이하고, 더 저렴하며, 더 빠르다.
본 명세서에서는, 본 명세서에 기술된 독소 센서 및 세포 기반 검정이 BoNT/A 및 BoNT/B의 활성을 측정하고 정량화하기 위해 제약 회사를 위한 더 빠르고, 더 저렴하고, 더 용이한 방식을 제공하여 마우스 바이오-검정을 잠재적으로 대체한다는 것이 특별히 고려된다.
BoNT 검출을 위한 시험관내 및 생체내 작제물. BoNT/A 검출을 위하여, 작제물을 NocI/NotI를 갖는 pET28a 벡터 내로 클로닝하였으며, 인서트(insert)는 Nnano-SV2C(529-566)-G4S-SNAP25(141-206)-Cnano 및 Nnano-SNAP25(141-206)-Cnano(서열번호 6으로서 개시된 "G4S")이다. 분할된 NANOLUC™ 루시페라제 서열는 Promega로부터 입수 가능하다. 중첩 PCR을 이용하여 완전한 인서트를 수득하였고, 이후에, 인서트를 절단 벡터(cut vector) 내에 결찰시켰다. BoNT/B 검출을 위하여, 작제물은 Nnano-VAMP(35-96)-Cnano이었다.
BoNT/A 생체내 검출을 위하여, 분할된 반딧불이 또는 분할된 NANOLUC을 사용하여 작제물을 설계하였고, 이후에, 내부 대조군으로서 레닐라 및 반딧불이를 별도로 적용하였다. 내부 대조군을 SNAP25(전장) 바로 앞에 위치시켰다. 벡터는 pcDNA3.1 및 syn-lox 렌티바이러스 벡터를 기초로 한 것이다.
시험관내 검정 작제물의 클로닝
센서 1: NNano-SV2C-p25-CNano
NcoI-Nnano(1-159)-GSSGGGGSGGGGSSG-SacI-SV2C(529-566)-GGGGS-P25(141-206)-EcoRI-GSSGGGGSGGGSSG-Cnano(160-170)-NotI-His6-정지(서열번호 4로서 개시된 "GSSGGGGSGGGGSSG", 서열번호 6으로서 개시된 "GGGGS", 서열번호 5로서 개시된 "GSSGGGGSGGGSSG" 및 서열번호 12로서 개시된 "His6")
센서 2: NNano-p25-CNano
NcoI-Nnano-(1-159)-GSSGGGGSGGGGSSG-SacI-p25(141-206)-EcoRI-GSSGGGGSGGGSSG-Cnano(160-170)-NotI-His6-정지(서열번호 4로서 개시된 "GSSGGGGSGGGGSSG", 서열번호 5로서 개시된 "GSSGGGGSGGGSSG", 및 서열번호 12로서 개시된 "His6")
센서 3: NNano-hVAMP1-CNano
NcoI-Nnano-(1-159)-GSSGGGGSGGGGSSG-SacI-인간VAMP1(35-96)-EcoRI-GSSGGGGSGGGSSG-Cnano(160-170)-NotI-His6-정지(서열번호 4로서 개시된 "GSSGGGGSGGGGSSG", 서열번호 5로서 개시된 "GSSGGGGSGGGSSG", 및 서열번호 12로서 개시된 "His6")
생체내 검정 작제물의 클로닝
BamHI-Nnano-(1-159)-GSSGGGGSGGGSSG-SacI-반딧불이(전장)-GGGGS-p25(전장)-EcoRI-GSSGGGGSGGGSSG-Cnano(160-170)-NotI(정지 코돈)(서열번호 6으로서 개시된 "GGGGS" 및 서열번호 5로서 개시된 "GSSGGGGSGGGSSG")
시험관내 검정에서 센서 단백질의 IMAC 정제. 센서 단백질의 상이한 작제물을 고정된 금속 친화력 칼럼(Immobilized Metal Affinity Column: IMAC)을 이용하여 정제하였다. His6 taG(서열번호 12)를 C 말단에서 pET28a 벡터 내로 클로닝하였다. 시험관내 작제물의 BL21 함유 정확한 플라스미드를 밤에 접종하고, 대략 0.6 내지 0.8의 O.D.까지 37℃에서 배양하고, 이후에, 20℃에서 밤 동안에 0.25mM의 IPTG(최종 농도)에 의해 유도하였다. 4500 g에서 10분 동안 원심분리함으로써 세포를 수확하였다. 그 후에, 세포 펠렛을 50mM HEPES, 150mM NaCl, pH7.4 완충제에 용해시키고, 이후에, 3분 동안 초음파처리하였다. 세포 용해물의 상청액을 저장하고, 4℃에서 회전시키면서 1시간 동안 Ni2+ 비드와 혼합하였다. 이후에, 혼합물을 칼럼 내에 로딩하고, 수지를 50mM HEPES, 150mM NaCl, pH7.4 완충제 중 10배의 20mM 이미다졸의 층 칼럼으로 세척하였다. 마지막으로, 단백질을 50mM HEPES, 150mM NaCl, pH7.4 완충제 중 4배의 층 칼럼 500mM 이미다졸에서 용해시켰다. 바로 검정을 수행하기 위해 정제된 센서 단백질을 50mM HEPES, pH 7.1 완충제 내로 투석하였다.
독소 검출의 시험관내 검정. 센서 단백질 농도를 기준물로서 표준 BSA와 함께 SDS-PAGE에 의해 추정하였다. 30nM의 센서 단백질을 50mM HEPES, 20μM ZnCl2, 2mM DTT, 1 ㎎/㎖ BSA, pH 7.1 완충제 중에서 제조하였다. 보툴리눔 독소 A를 희석시키고, 10의 희석 인자로 1nM 내지 1fM의 일련 농도를 갖는 센서 단백질 용액 내에 첨가하였다. 37℃에서 4시간 및 24시간 항온처리 후에, Nano-Glo™ 기질(Promega)을 동일한 부피로 각 샘플 내에 첨가하였다. 발광 신호를 플레이트 판독기에서 측정하였다. 검정을 2회 수행하였다. 음성 대조군을 또한, 설계하고, 수행하였다. BoNT/A를 Nnano-VAMP-Cnano 센서 단백질과 혼합하거나, BoNT/B를 Nnano-SV2C-p25-Cnano 센서 단백질과 혼합하였다.
독소 검출의 생체내 검정(세포 기반 검정). 이중 루시페라제 작제물(내부 대조군으로서 반딧불이 및 분열 검출을 위한 분할된 NANOLUC™)의 바이러스를 7일 신경 세포 내에 첨가하고, 이후에, 300pM 내지 1pM의 일련 농도의 보툴리눔 독소 A를 13일 신경 세포 내에 세 벌로 첨가하였다. 독소 접종하고 48시간 후에, 200㎕ 수동 용해 완충제(Promega)를 첨가함으로써 신경 세포를 용해하고, 실온에서 20분 동안 항온처리하였다. 50㎕의 세포 용해물을 50㎕ 반딧불이 루시페라제 기질(ONE-Glo (TM) EX 시약)과 혼합하고, 광 방출을 측정하였다. 후속하여, 50㎕ NANOLUC™ 루시페라제 기질(NanoDLR™ Stop & Glo (R) 시약)을 첨가하고, 광 방출을 측정하였다.
Figure pct00006
SEQUENCE LISTING <110> PRESIDENT AND FELLOWS OF HARVARD COLLEGE <120> IN VITRO AND CELL BASED ASSAYS FOR MEASURING THE ACTIVITY OF BOTULINUM NEUROTOXINS <130> WO 2018/075783 <140> PCT/US2017/057411 <141> 2017-10-19 <150> US 62/410,558 <151> 2016-10-20 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 170 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 1 Met Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Glu Gln Thr Ala 1 5 10 15 Ala Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu 20 25 30 Leu Gln Asn Leu Ala Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Arg 35 40 45 Ser Gly Glu Asn Ala Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr 50 55 60 Glu Gly Leu Ser Ala Asp Gln Met Ala Gln Ile Glu Glu Val Phe Lys 65 70 75 80 Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu Pro Tyr 85 90 95 Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Leu Asn Tyr Phe 100 105 110 Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe 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Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 31 atggtcttca cactcgaaga tttcgttggg gactgggaac agacagccgc ctacaacctg 60 gaccaagtcc ttgaacaggg aggtgtgtcc agtttgctgc agaatctcgc cgtgtccgta 120 actccgatcc aaaggattgt ccggagcggt gaaaatgccc tgaagatcga catccatgtc 180 atcatcccgt atgaaggtct gagcgccgac caaatggccc agatcgaaga ggtgtttaag 240 gtggtgtacc ctgtggatga tcatcacttt aaggtgatcc tgccctatgg cacactggta 300 atcgacgggg ttacgccgaa catgctgaac tatttcggac ggccgtatga aggcatcgcc 360 gtgttcgacg gcaaaaagat cactgtaaca gggaccctgt ggaacggcaa caaaattatc 420 gacgagcgcc tgatcacccc cgacggctcc atgctgttcc gagtaaccat caacagtggg 480 agttccggtg gtggcgggag cggaggtgga ggctcgagcg gtggagctca ggaagatgcc 540 aaaaacatta agaagggccc agcgccattc tacccactcg aagacgggac cgccggcgag 600 cagctgcaca aagccatgaa gcgctacgcc ctggtgcccg gcaccatcgc ctttaccgac 660 gcacatatcg aggtggacat tacctacgcc gagtacttcg agatgagcgt tcggctggca 720 gaagctatga agcgctatgg gctgaataca aaccatcgga tcgtggtgtg cagcgagaat 780 agcttgcagt tcttcatgcc cgtgttgggt gccctgttca tcggtgtggc tgtggcccca 840 gctaacgaca tctacaacga gcgcgagctg ctgaacagca tgggcatcag ccagcccacc 900 gtcgtattcg tgagcaagaa agggctgcaa aagatcctca acgtgcaaaa gaagctaccg 960 atcatacaaa agatcatcat catggatagc aagaccgact accagggctt ccaaagcatg 1020 tacaccttcg tgacttccca tttgccaccc ggcttcaacg agtacgactt cgtgcccgag 1080 agcttcgacc gggacaaaac catcgccctg atcatgaaca gtagtggcag taccggattg 1140 cccaagggcg tagccctacc gcaccgcacc gcttgtgtcc gattcagtca tgcccgcgac 1200 cccatcttcg gcaaccagat catccccgac accgctatcc tcagcgtggt gccatttcac 1260 cacggcttcg gcatgttcac cacgctgggc tacttgatct gcggctttcg ggtcgtgctc 1320 atgtaccgct tcgaggagga gctattcttg cgcagcttgc aagactataa gattcaatct 1380 gccctgctgg tgcccacact atttagcttc ttcgctaaga gcactctcat cgacaagtac 1440 gacctaagca acttgcacga gatcgccagc ggcggggcgc cgctcagcaa ggaggtaggt 1500 gaggccgtgg ccaaacgctt ccacctacca ggcatccgcc agggctacgg cctgacagaa 1560 acaaccagcg ccattctgat cacccccgaa ggggacgaca 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Claims (75)

  1. 단일 사슬 폴리펩타이드(single chain polypeptide)로서,
    N-말단에서 C-말단까지,
    a) 리포터 단백질(reporter protein)의 N-말단 단편;
    b) 신경독소 분할 부위(neurotoxin cleavage site)를 포함하는 링커; 및
    c) 상기 리포터 단백질의 C-말단 단편을 포함하며,
    상기 N-말단 단편 및 C-말단 단편은 총괄적으로 기능성 리포터 단백질 서열을 포함하며, 상기 링커는 기능성 리포터 융합 단백질을 생성하기 위해 상기 N-말단 단편과 C-말단 단편을 기능적으로 연결시키는, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 리포터 단백질은 루시페라제 단백질인, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  3. 단일 사슬 폴리펩타이드로서,
    a) 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 1 내지 159와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 N-말단 도메인(N-nano1-159);
    b) 상기 N-nano1-159에 C-말단이 위치된 신경독소 분할 부위를 포함하는 링커; 및
    c) 상기 링커에 C-말단이 위치된 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 160 내지 170과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 C-말단 도메인(C-nano160-170)을 포함하되,
    상기 링커는 기능성 루시페라제 융합 단백질을 생성하기 위해 상기 N-nano1 -159와 상기 C-nano160-170을 기능적으로 연결시키는, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  4. 단일 사슬 폴리펩타이드로서,
    a) 서열번호 1의 상기 루시페라제의 아미노산 1 내지 159에 비해 10개 미만의 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 부가를 갖는 서열을 포함하는 N-말단 도메인(N-nano1-159);
    b) 상기 N-nano1 -159에 C-말단이 위치된 신경독소 분할 부위를 포함하는 링커; 및
    c) 상기 링커에 C-말단이 위치된 서열번호 1의 상기 루시페라제의 아미노산 160 내지 170에 비해 3개 미만의 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 부가를 갖는 서열을 갖는 C-말단 도메인(C-nano160-170)을 포함하되,
    상기 링커는 기능성 루시페라제 융합 단백질을 생성하기 위해 상기 N-nano1 -159와 상기 C-nano160-170을 기능적으로 연결시키는, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 N-말단 도메인은 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 1 내지 159의 서열(N-nano1-159)을 가지며, 상기 C-말단 도메인은 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 160 내지 170의 서열(C-nano160-170)을 갖는, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경독소 분할 부위는 C. 보툴리눔(C. botulinum) 신경독소(BoNT) 및/또는 파상풍 신경독소 분할 부위(Tetanus neurotoxin cleavage site)인, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 상기 BoNT 분할 부위와 상기 N-말단 단편 또는 도메인 사이에, 상기 신경독소 분할 부위와 상기 C-말단 단편 또는 도메인 사이에, 또는 이들의 조합에 위치된 하나 이상의 스페이서를 더 포함하는, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 상기 BoNT 및/또는 파상풍 신경독소에 대한 수용체의 결합 단편을 더 포함하는, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 결합 단편은 상기 N-말단 단편 또는 도메인과 상기 BoNT 분할 부위 사이에 위치된, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 링커는 상기 결합 단편과 상기 BoNT 분할 부위 사이에 위치된 스페이서를 더 포함하는, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 스페이서가 글리신 및 세린으로 이루어진, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 스페이서가 5 내지 15개의 아미노산인, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 스페이서가 서열번호 4-9로부터 선택되는, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  14. 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BoNT는 A, E, C, B, D, F 또는 G인, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  15. 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BoNT 분할 부위는 SNARE 단백질로부터 얻어진, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  16. 제15항에 있어서, 상기 SNARE 단백질은 SNAP-25, 시냅토브레빈(VAMP), 또는 신탁신인, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  17. 제6항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BoNT 분할 부위는 인간 SNAP-25b의 아미노산 141 내지 206인, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  18. 제6항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BoNT 분할 부위는 인간 VAMP1의 아미노산 35 내지 96인, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  19. 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용체는 인간 SV2C인, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  20. 제19항에 있어서, 상기 결합 단편은 인간 SV2C의 아미노산 529 내지 566, 또는 인간 SV2C의 아미노산 529 내지 566과 적어도 90% 동일성을 갖는 서열, 또는 인간 SV2C의 아미노산 529 내지 566에 비해 10개 이하의 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 부가를 갖는 서열인, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리히스티딘 친화력 태그를 더 포함하는, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  22. 제21항에 있어서, 상기 폴리히스티딘 친화력 태그는 상기 폴리펩타이드의 C-말단에 위치된, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 상기 N-말단 단편 또는 도메인과 상기 BoNT 분할 부위 사이에 위치된 완전한 제2 루시페라제 폴리펩타이드(intact second luciferase polypeptide))를 더 포함하는, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  24. 제23항에 있어서, 상기 제2 루시페라제 폴리펩타이드는 반딧불이 루시페라제(예를 들어, 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis)), 박테리아 루시페라제(예를 들어, 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri), 비브리오 하베이(Vibrio harveyi)), 바다 팬지 루시페라제(sea pansy luciferase)(레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis)), 와편모충 루시페라제(dinoflagellate luciferase), 가우시아 루시페라제(Gaussia luciferase), 또는 요각류 루시페라제(copepod luciferase)인, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 링커는 상기 제2 루시페라제 폴리펩타이드와 상기 BoNT 분할 부위 사이에 위치된 스페이서를 더 포함하는, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  26. 제25항에 있어서, 상기 스페이서는 5 내지 15개의 아미노산인, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 스페이서는 GSSGGGGSGGGGSSG(서열번호 4), GSSGGGGSGGGSSG(서열번호 5), 또는 GGGGS(서열번호 6)인, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  28. 단일 사슬 폴리펩타이드로서,
    a) 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 1 내지 159(N-nano1 -159);
    b) (i) 5 내지 15개의 아미노산의 제1 스페이서;
    (ii) 상기 제1 스페이서에 C-말단이 위치된 SV2C의 아미노산 529 내지 566으로 이루어진 결합 단편;
    (iii) 상기 결합 단편에 C-말단이 위치된 제2 스페이서;
    (iv) 상기 제2 스페이서에 C-말단이 위치된 인간 SNAP25b의 아미노산 141 내지 206을 포함하는 BoNT 분할 부위;
    (v) 상기 BoNT 분할 부위에 C-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제3 스페이서를 포함하는 상기 N-nano1-159에 C-말단이 위치된 링커; 및
    c) 상기 링커에 C-말단이 위치된 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 160 내지 170(C-nano160-170)을 포함하되,
    상기 링커는 기능성 루시페라제 융합 단백질을 생성하기 위해 상기 N-nano1 -159와 상기 C-nano160-170을 기능적으로 연결시키는, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  29. 단일 사슬 폴리펩타이드로서,
    a) 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 1 내지 159(N-nano1 -159);
    b) (i) 5 내지 15개의 아미노산의 제1 스페이서;
    (ii) 상기 제1 스페이서에 C-말단이 위치된 인간 SNAP25b의 아미노산 141 내지 206을 포함하는 BoNT 분할 부위;
    (iii) 상기 BoNT 분할 부위에 C-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제2 스페이서를 포함하는 상기 N-nano1-159에 C-말단이 위치된 링커; 및
    c) 상기 링커에 C-말단이 위치된 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 160 내지 170(C-nano160-170)을 포함하되,
    상기 링커는 기능성 루시페라제 융합 단백질을 생성하여 상기 N-nano1 -159와 상기 C-nano160-170을 기능적으로 연결시키는, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  30. 단일 사슬 폴리펩타이드로서,
    a) 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 1 내지 159(N-nano1 -159);
    b) (i) 5 내지 15개의 아미노산의 제1 스페이서;
    (ii) 상기 제1 스페이서에 C-말단이 위치된 인간 VAMP1의 아미노산 35 내지 96을 포함하는 BoNT 분할 부위;
    (iii) 상기 BoNT 분할 부위에 C-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제2 스페이서를 포함하는 상기 N-nano1-159에 C-말단이 위치된 링커; 및
    c) 상기 링커에 C-말단이 위치된 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 160 내지 170(C-nano160-170)을 포함하되,
    상기 링커는 기능성 루시페라제 융합 단백질을 생성하기 위해 상기 N-nano1 -159와 상기 C-nano160-170을 기능적으로 연결시키는, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  31. 단일 사슬 폴리펩타이드로서,
    a) 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 1 내지 159(N-nano1 -159);
    b) (i) 제2 기능성 루시페라제 폴리펩타이드;
    (ii) 상기 제2 루시페라제 폴리펩타이드의 C-말단에 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제1 스페이서;
    (iii) 상기 제1 스페이서에 C-말단이 위치된 인간 SNAP25b의 아미노산 1 내지 206을 포함하는 BoNT 분할 부위;
    (iv) 상기 BoNT 분할 부위에 C-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제2 스페이서를 포함하는 상기 N-nano1-159에 C-말단이 위치된 링커; 및
    c) 상기 링커에 C-말단이 위치된 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 160 내지 170(C-nano160-170)을 포함하되,
    상기 링커는 기능성 루시페라제 융합 단백질을 생성하기 위해 상기 N-nano1 -159와 상기 C-nano160-170을 기능적으로 연결시키는, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 스페이서가 GSSGGGGSGGGGSSG(서열번호 4), GSSGGGGSGGGSSG(서열번호 5), 또는 GGGGS(서열번호 6)인, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C-말단에 위치된 His6 서열(서열번호 12)을 더 포함하는, 단일 사슬 폴리펩타이드.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 단일 사슬 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산.
  35. 제34항의 핵산을 포함하는 핵산 벡터.
  36. 제35항에 있어서, 발현 벡터이고 발현 가능한 형태의 핵산 서열을 포함하는, 핵산 벡터.
  37. 제36항에 있어서, 바이러스 발현 벡터, 원핵 발현 벡터, 효모 발현 벡터, 곤충 발현 벡터, 또는 포유류 발현 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는, 핵산 벡터.
  38. 제34항의 상기 헥산 또는 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항의 핵산 벡터를 포함하는 세포.
  39. 제38항에 있어서, 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 단일 사슬 폴리펩타이드를 발현시키는 세포.
  40. 제39항에 있어서, 원핵 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 동물 세포인 세포.
  41. 보툴리눔 신경독소의 효능을 결정하는 방법으로서,
    a) BoNT 활성에 대해 적절한 조건 하에서 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 단일 사슬 폴리펩타이드에 상기 신경독소를 접촉시키는 단계; 및
    b) 기준(reference)과 비교하여, 상기 폴리펩티드의 루시페라제 활성을 결정하여, 상기 효능을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  42. 샘플에서 C. 보툴리눔 신경독소(BoNT) 활성을 검출하는 방법으로서,
    a) BoNT 활성을 위해 적절한 조건 하에서 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 단일 사슬 폴리펩타이드에 상기 샘플을 접촉시키는 단계; 및
    b) 샘플의 부재 하에서 상기 폴리펩타이드의 루시페라제 활성과 비교하여, 상기 폴리펩타이드의 루시페라제 활성을 결정하는 단계로서, 루시페라제 활성의 감소가 상기 샘플에서 BoNT 활성을 지시하는, 상기 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 시험관내에서 수행되는, 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉이 50mM HEPES, 20μM ZnCl2, 2mM DTT, 1 ㎎/㎖ BSA, pH 7.1의 완충제에서 일어나는, 방법.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플에 접촉된 상기 단일 사슬 폴리펩타이드의 농도가 약 30nM 내지 300nM인, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 샘플에 접촉된 단일 사슬 폴리펩타이드의 농도가 약 30nM인, 방법.
  47. 제41항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 루시페라제 활성은 상기 단일 사슬 폴리펩타이드에 루시페라제 기질의 첨가 및 형성된 발광 신호의 정량적 측정에 의해 결정되는, 방법.
  48. 제41항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조건은 약 37℃에서 약 1시간 내지 약 36시간의 기간 동안의 항온처리를 포함하는, 방법.
  49. 제41항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조건은 약 37℃에서 약 1시간 내지 약 24시간의 기간 동안의 항온처리를 포함하는, 방법.
  50. 제41항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조건은 약 37℃에서 약 4시간 내지 약 24시간의 기간 동안의 항온처리를 포함하는, 방법.
  51. 제41항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 5 내지 15개의 아미노산의 제1 스페이서, 상기 제1 스페이서에 C-말단이 위치되고 상기 BoNT 분할 부위에 N-말단이 위치된 인간 SV2C의 아미노산 529 내지 566의 결합 단편, 및 상기 BoNT 분할 부위에 C-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제2 스페이서를 포함하며, 상기 BoNT 분할 부위는 인간 SNAP25의 아미노산 141 내지 206을 포함하는, 방법.
  52. 제41항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 상기 BoNT 분할 부위에 N-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제1 스페이서, 및 상기 BoNT 분할 부위에 C-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제2 스페이서를 포함하며, 상기 BoNT 분할 부위는 인간 SNAP25의 아미노산 141 내지 206을 포함하는, 방법.
  53. 제41항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 상기 BoNT 분할 부위에 N-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제1 스페이서, 상기 BoNT 분할 부위에 C-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제2 스페이서를 포함하며, 상기 BoNT 분할 부위는 인간 VAMP1의 아미노산 35 내지 96을 포함하는, 방법.
  54. 제41항 내지 제53항에 있어서, 상기 단일 사슬 폴리펩타이드는 신경 세포에 의해 발현되며, 상기 방법은, 상기 접촉시키는 단계 후에,
    상기 신경 세포를 약 12시간 내지 약 60시간의 기간 동안 항온처리하는 단계 및
    상기 신경 세포로부터 용해물을 수확하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  55. 샘플에서 C. 보툴리눔 신경독소(BoNT) 활성을 검출하는 방법으로서,
    a) 분리되고 N-nano1 -159에 C-말단이 위치되고 상기 C-nano160 -170에 N-말단이 위치된 BoNT 분할 부위를 포함하는 링커에 의해 기능적으로 연결된, 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 1 내지 159(N-nano1 -159), 서열번호 1의 루시페라제의 아미노산 160 내지 170(C-nano160 - 170)을 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드를 발현시키는 신경 세포에 상기 샘플을 접촉시키는 단계;
    b) 상기 신경 세포를 약 12시간 내지 약 60시간의 기간 동안 항온처리하는 단계;
    c) 상기 신경 세포로부터 용해물을 수확하는 단계;
    d) 상기 샘플의 부재 하에서 동일하게 처리된 신경 세포에서 루시페라제 활성과 비교하여 용해물에서 루시페라제 활성을 측정하는 단계로서, 상기 루시페라제 활성의 감소가 상기 샘플에서 BoNT 활성을 지시하는, 상기 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
  56. 제41항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 상기 N-nano1 -159와 상기 분할 부위 사이에 위치된 완전한 제2 루시페라제 폴리펩타이드를 더 포함하는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 제2 루시페라제 폴리펩타이드는 반딧불이 루시페라제(포티누스 피랄리스), 박테리아 루시페라제(비브리오 피셔리(vibrio fischiri), 비브리오 하베이), 바다 팬지 루시페라제(레닐라 레니포르미스), 와편모충 루시페라제, 가우시아 루시페라제, 또는 요각류 루시페라제인, 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 샘플에서 상기 제2 루시페라제 폴리펩타이드의 루시페라제 활성이 상기 수확된 용해물에 존재하는 전체 단일 사슬 폴리펩타이드의 지시제로서 결정되고 사용되는, 방법.
  59. 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 세포는 바이러스 발현 벡터로부터 상기 단일 사슬 폴리펩타이드를 발현시키는, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 단일 사슬 폴리펩타이드는 단계 a) 이전에 6일 동안 발현되는, 방법.
  61. 제59항에 있어서, 상기 바이러스 발현 시스템은 렌티바이러스 발현 시스템인, 방법.
  62. 재54항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항온처리하는 단계는 약 48시간인, 방법.
  63. 제54항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수확하는 단계는 용해 완충제의 첨가에 의한 것인, 방법.
  64. 제41항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BoNT 분할 부위는 SNAP-25, 시냅토브레빈(VAMP) 또는 신탁신으로부터 얻어진 방법.
  65. 제41항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BoNT 분할 부위는 BoNT A, E 및 C에 의해 특이적으로 인식되거나, BoNT B, D, F 및 G에 의해 특이적으로 인식되는, 방법.
  66. 제41항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 BoNT 분할 부위를 갖는 단일 사슬 폴리펩타이드들의 조합이 사용되는, 방법.
  67. 제41항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BoNT 분할 부위는 인간 SNAP-25의 a.a.141-206, 또는 인간 VAMP1의 a.a. 35-96, 인간 SNAP35의 a.a. 1-206, 또는 VAMP1의 a.a. 1-96인, 방법.
  68. 제41항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 BoNT 수용체의 결합 단편을 더 포함하는, 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 수용체는 SV2C인, 방법.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 상기 결합 단편은 인간 SV2C의 아미노산 529 내지 566을 포함하는, 방법.
  71. 제41항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 제2 루시페라제 폴리펩타이드, 상기 제2 루시페라제 폴리펩타이드에 C-말단이 위치되고 상기 BoNT 분할 부위에 N-말단이 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제1 스페이서, 상기 BoNT 분할 부위에 C-말단에 위치된 5 내지 15개의 아미노산의 제2 스페이서를 포함하며, 상기 BoNT 분할 부위는 인간 SNAP25의 아미노산 1 내지 206을 포함하고, 상기 제1 스페이서에 C-말단이 위치되어 있는, 방법.
  72. 제41항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 루시페라제 활성을 측정하는 것이 상기 루시페라제에 대해 특이적인 기질의 첨가 및 얻어진 발광 신호의 정량적 검출에 의한 것인, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 서열번호 1의 루시페라제에 대한 기질이 푸리마진 (2-퓨란일메틸-데옥시-코엘렌테라진)인, 방법.
  74. 키트로서,
    a) 제1항 내지 제33항에 기술된 하나 이상의 단일 사슬 폴리펩타이드로서, 상기 단일 사슬 폴리펩타이드 각각 또는 이들의 조합이 별도의 용기 내에 패키징되어 있는, 상기 하나 이상의 단일 사슬 폴리펩타이드;
    b) 제34항 내지 제37항에 기술된 하나 이상의 핵산 또는 핵산 벡터로서, 상기 핵산 또는 핵산 벡터 각각 또는 이들의 조합이 별도의 용기 내에 패키징되어 있는, 상기 하나 이상의 핵산 또는 핵산 벡터; 및/또는
    c) 제38항 내지 제40항에 기술된 하나 이상의 세포로서, 상기 세포 각각 또는 이들의 조합이 별도의 용기 내에 패키징되어 있는, 상기 하나 이상의 세포를 포함하는, 키트.
  75. 제74항에 있어서, 별도의 용기 내에 패키징되어 있는 루시페라제 기질을 더 포함하는, 키트.
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