JP2022544265A - クロストリジウム神経毒に対して高度に感受性の細胞 - Google Patents
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Abstract
クロストリジウム神経毒に対して高度に感受性である細胞の集団を作製する方法であって、(a)指標タンパク質を発現する組換え細胞をクロストリジウム神経毒と接触させることと、(b)このような接触後に、指標タンパク質の切断を示す細胞を選択することとを含む、方法。上記の方法を使用して生成された集団に由来する細胞。修飾されたまたは組換え神経毒の活性を決定するアッセイであって、このような細胞を修飾または組換え神経毒と、細胞において野生型クロストリジウム神経毒のプロテアーゼドメインが指標タンパク質を切断することを可能にするのに十分である条件下および時間の間接触させることと、指標タンパク質の切断に起因する生成物の存在を決定することとを含む、アッセイ。【選択図】図14
Description
本発明は、概して、クロストリジウム神経毒、例えば、ボツリヌス神経毒およびテタヌス神経毒に対して高度に感受性である細胞の集団を生成する方法に関する。
嫌気性のグラム陽性菌であるクロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)は、ボツリヌス神経毒(BoNT)およびテタヌス神経毒(TeNT)を含む種々の異なる種類の神経毒を産生する。
BoNTは、公知の最も強力な毒素であり、血清型に応じて0.5～5ng/kgの範囲のマウスの半致死量(LD50)値を有する。BoNTは、胃腸管において吸着され、全身循環に入った後、コリン作動性神経末端のシナプス前膜に結合し、神経伝達物質アセチルコリンの放出を妨げる。
BoNTは、弛緩性筋肉麻痺を引き起こすその能力についてよく知られている。前記筋肉弛緩特性のために、BoNTが、眉間の線または運動過剰性の顔の線、頭痛、片側顔面痙攣、膀胱の運動亢進、多汗、ほうれい線、頸部ジストニア、眼瞼痙攣および痙縮の処置を含む、さまざまな医学的および美容的手順において使用されることとなった。
現在、少なくとも8種の異なるクラスのBoNT、すなわち、BoNT血清型A、B、C、D、E、F、GおよびH(それぞれ、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/GおよびBoNT/Hとして知られている)があり、そのすべては、類似の構造および作用様式を共有する。異なるBoNT血清型は、特異的中和抗血清による不活性化に基づいて区別することができ、このような血清型による分類は、アミノ酸レベルでの配列同一性パーセンテージと相関する。所与の血清型のBoNTタンパク質は、アミノ酸配列同一性パーセンテージに基づいて異なる亜型にさらにわけられる。
BoNTの異なる血清型は、引き起こされる麻痺の重症度および持続期間に関して影響を受ける動物種が異なる。例えば、BoNT/Aは、すべての公知の生物学的物質の中で最も致死的であり、麻痺に関して、BoNT/Bよりも、ラットでは500倍より強力である。さらに、マウスにおけるBoNT/A注射後の麻痺の持続期間は、BoNT/Eの注射後の持続期間よりも10倍長い。
天然では、クロストリジウム神経毒は、単鎖ポリペプチドとして合成され、これがタンパク質分解による切断事象によって翻訳後修飾されて、ジスルフィド結合によって一緒につなげられた2つのポリペプチド鎖を形成する。切断は、鎖間ジスルフィド結合を提供するシステイン残基間に位置する、「活性化部位」と呼ばれることが多い特定の切断部位で起こる。毒素の活性形態は、この二本鎖形態である。2つの鎖は、およそ100kDaの分子量を有する重鎖(H鎖)およびおよそ50kDaの分子量を有する軽鎖(L鎖)と呼ばれる。H鎖は、「標的化部分」として知られるC末端側標的化成分および「転位置ドメイン」として知られるN末端側転位置成分を含む。活性化部位は、露出したループ領域中の、L鎖と転位置ドメイン成分の間に位置する。標的化部分のその標的ニューロンへの結合およびエンドソームによる結合された毒素の細胞への内部移行後、転位置ドメインは、L鎖をエンドソーム膜を越えてサイトゾル中に転位置する。
L鎖は、「プロテアーゼドメイン」として知られるプロテアーゼ成分を含む。非細胞傷害性プロテアーゼ機能を有し、SNAREタンパク質として知られる細胞内輸送タンパク質をタンパク質分解性に切断することによって作用する-Gerald K (2002) “Cell and Molecular Biology” (4th edition) John Wiley & Sons, Inc.を参照されたい。頭字語SNAREは、可溶性NSF付着受容体(Soluble NSF Attachment Receptor)という用語に由来し、ここで、NSFは、N-エチルマレイミド感受性因子(N-ethylmaleimide-Sensitive Factor)を意味する。プロテアーゼドメインは、亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性を有し、SNAREタンパク質に対して高い基質特異性を示す。
種々の異なるクロストリジウム神経毒は、そのそれぞれのプロテアーゼドメインによって異なるSNAREタンパク質を切断する。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F、BoNT/GおよびTeNTは、別名、小胞関連膜タンパク質(VAMP)としても知られるシナプトブレビンを切断する。BoNT/A、BoNT/CおよびBoNT/Eは、25kDaのシナプトソーム関連タンパク質(SNAP-25)を切断する。BoNT/Cは、シンタキシンを切断する。
SNAREタンパク質は、分泌小胞の膜または細胞膜のいずれかと会合しており、分泌小胞の細胞膜との融合を媒介し、ひいては、小胞の内容物が細胞の外側に排出されることを可能にすることによって分子のエキソサイトーシスを促進する。このようなSNAREタンパク質の切断は、このようなエキソサイトーシスを、ひいては、細胞からの神経伝達物質の放出を阻害する。その結果として、横紋筋は麻痺し、汗腺はその分泌を停止する。
したがって、クロストリジウム神経毒は、ひとたび所望の標的細胞に送達されると、標的細胞からの細胞性分泌を阻害可能である。
クロストリジウム神経毒をその特性を変更するように修飾することは当技術分野で公知である。修飾は、アミノ酸修飾、例えば、アミノ酸(複数可)の付加、欠失および/もしくは置換ならびに/または化学的修飾、例えば、リン酸もしくは炭水化物の付加もしくはジスルフィド結合の形成を含み得る。修飾はまた、クロストリジウム神経毒の成分の並べ替え、例えば、プロテアーゼ成分を転位置成分および標的化成分と隣接させることも含み得る。修飾はまた、神経毒の活性化部位の修飾を含み得る(これでは、神経毒は切断されて活性二本鎖形態を形成する)。このような修飾は、神経毒の、ある特定の環境(例えば、修飾された活性化部位を切断するプロテアーゼが存在する環境)においてのみ活性化される能力または活性化を可能にする能力を増大または減少し得る。さらに、修飾は、神経毒の成分を別の神経毒に由来するものと置き換えることを含み得る(例えば、BoNT/AのプロテアーゼドメインをBoNT/E由来のプロテアーゼドメインと置き換えることによるBoNT/Aの修飾)。
組換えクロストリジウム神経毒は、遺伝的に産生される。それらは野生型クロストリジウム神経毒と遺伝的に同一である場合も、または追加の、より少ないもしくは異なるアミノ酸を含有するという点で野生型クロストリジウム神経毒とは異なっている場合もある。例えば、上記の修飾されたクロストリジウム神経毒のうちいずれかを反映する組換えクロストリジウム神経毒を作製できる。組換えクロストリジウム神経毒はまた、上記のように化学的に修飾され得る。
しかし、修飾および組換えクロストリジウム神経毒と、その野生型対応物の間の相違は、神経毒の所望のSNAREタンパク質切断特性に影響を及ぼす可能性がある。したがって、このような相違が、このような活性を改善、低減または排除するか否かを決定することは重要であり得る。
当業者が、これらの修飾または組換えクロストリジウム神経毒が標的化されたSNAREタンパク質を切断する所望の活性を有するか否かを確認することを可能にする種々の従来のアッセイが利用可能である。これらのアッセイは、SNAREタンパク質の切断の結果生じる生成物の存在について試験することを含む。例えば、細胞の、修飾または組換え神経毒との接触後、細胞を溶解し、SDS-PAGEによって分析し、切断生成物の存在を検出できる。あるいは、細胞溶解物を抗体と接触させることによって、切断生成物を検出できる。
このようなアッセイでは、通常の集団に由来する細胞を使用することが知られているが、このような細胞はクロストリジウム神経毒に対して限定された感受性のみを有する場合があるので、アッセイは、高濃度の細胞の使用を必要とすることが多い。
したがって、このようなアッセイにおいて使用するためのクロストリジウム神経毒に対する感受性が増大した細胞の集団が必要である。
本発明は、幾分かは、クロストリジウム神経毒に対して高度に感受性である細胞の集団を作製する方法に関し、方法は、
(a)指標タンパク質を発現する組換え細胞を、クロストリジウム神経毒と接触させることと、
(b)その後、指標タンパク質の切断を示す細胞を選択することと
を含む。
(a)指標タンパク質を発現する組換え細胞を、クロストリジウム神経毒と接触させることと、
(b)その後、指標タンパク質の切断を示す細胞を選択することと
を含む。
本発明の一態様は、クロストリジウム神経毒に対して感受性を示す細胞の集団を進化させる方法を提供し、方法は、
(a)細胞の集団をクロストリジウム神経毒と接触させるステップであって、前記集団が
i.クロストリジウム神経毒によって切断可能である指標タンパク質、および
ii.クロストリジウム神経毒に対して結合親和性を有する受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体およびガングリオシド)
を発現する細胞を含むステップと、
(b)指標タンパク質の切断を示す細胞を同定するステップと、
(c)ステップb)で同定された細胞を単離するステップと、
(d)前記一連のステップ(a)～(c)の反復を少なくとも1回実施するステップとを含み、ステップ(a)で使用される細胞の集団が、ステップ(c)で単離された細胞および/もしくはその子孫の細胞を含む、またはからなり、
(e)随意により、前記少なくとも1回の反復の前に、先行するステップc)で単離された細胞を、前記細胞の数が先行するステップa)における細胞の数と実質的に同等となるまで培養する。
(a)細胞の集団をクロストリジウム神経毒と接触させるステップであって、前記集団が
i.クロストリジウム神経毒によって切断可能である指標タンパク質、および
ii.クロストリジウム神経毒に対して結合親和性を有する受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体およびガングリオシド)
を発現する細胞を含むステップと、
(b)指標タンパク質の切断を示す細胞を同定するステップと、
(c)ステップb)で同定された細胞を単離するステップと、
(d)前記一連のステップ(a)～(c)の反復を少なくとも1回実施するステップとを含み、ステップ(a)で使用される細胞の集団が、ステップ(c)で単離された細胞および/もしくはその子孫の細胞を含む、またはからなり、
(e)随意により、前記少なくとも1回の反復の前に、先行するステップc)で単離された細胞を、前記細胞の数が先行するステップa)における細胞の数と実質的に同等となるまで培養する。
本発明の一態様は、クロストリジウム神経毒に対して感受性を示す細胞の集団を進化させる方法を提供し、方法は、
(a)細胞の集団をクロストリジウム神経毒と接触させるステップであって、前記集団が、
i.クロストリジウム神経毒によって切断可能である指標タンパク質、および
ii.クロストリジウム神経毒に対して結合親和性を有する受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体およびガングリオシド)
を発現する細胞を含むステップと、
(b)指標タンパク質の切断を示す細胞を同定するステップと、
(c)ステップb)で同定された細胞を単離するステップと、
(d)前記一連のステップ(a)～(c)の反復を少なくとも1回実施するステップとを含み、ステップ(a)で使用される細胞の集団が、ステップ(c)で単離された細胞および/もしくはその子孫の細胞を含む、またはからなり、
(e)随意により、各反復の前に、先行するステップc)で単離された細胞を、前記細胞の数が先行するステップa)における細胞の数と実質的に同等となるまで培養する。
(a)細胞の集団をクロストリジウム神経毒と接触させるステップであって、前記集団が、
i.クロストリジウム神経毒によって切断可能である指標タンパク質、および
ii.クロストリジウム神経毒に対して結合親和性を有する受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体およびガングリオシド)
を発現する細胞を含むステップと、
(b)指標タンパク質の切断を示す細胞を同定するステップと、
(c)ステップb)で同定された細胞を単離するステップと、
(d)前記一連のステップ(a)～(c)の反復を少なくとも1回実施するステップとを含み、ステップ(a)で使用される細胞の集団が、ステップ(c)で単離された細胞および/もしくはその子孫の細胞を含む、またはからなり、
(e)随意により、各反復の前に、先行するステップc)で単離された細胞を、前記細胞の数が先行するステップa)における細胞の数と実質的に同等となるまで培養する。
「その子孫の細胞」という用語は、ステップc)で単離された細胞の後代(例えば、前駆細胞)を意味し、適宜、ステップcで単離された細胞の突然変異体および/または時間の隔たりがあるバリアント(例えば、サイクルに再導入して戻すことができる)を包含する。「その子孫の細胞」という用語は、好ましくは、細胞がステップc)の細胞株と同一の細胞株に由来することを表す。
本発明の一態様は、クロストリジウム神経毒に対して感受性を示す細胞の集団を進化させる方法を提供し、方法は、
(a)細胞株をクロストリジウム神経毒と接触させるステップであって、前記細胞株が、
i.クロストリジウム神経毒によって切断可能である指標タンパク質、および
ii.クロストリジウム神経毒に対して結合親和性を有する受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体およびガングリオシド)
を発現する細胞を含む(またはからなる)ステップと、
(b)指標タンパク質の切断を示す細胞を同定するステップと、
(c)ステップb)で同定された細胞を単離するステップと、
(d)前記一連のステップ(a)～(c)の反復を少なくとも1回実施するステップとを含み、ステップ(a)で使用される細胞株が、ステップ(c)で単離された細胞および/もしくはその子孫の細胞を含む、またはからなり、
(e)随意により、前記少なくとも1回の反復の前に(好ましくは、各反復の前に)、先行するステップc)で単離された細胞を、前記細胞の数が先行するステップa)における細胞の数と実質的に同等となるまで培養する。
(a)細胞株をクロストリジウム神経毒と接触させるステップであって、前記細胞株が、
i.クロストリジウム神経毒によって切断可能である指標タンパク質、および
ii.クロストリジウム神経毒に対して結合親和性を有する受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体およびガングリオシド)
を発現する細胞を含む(またはからなる)ステップと、
(b)指標タンパク質の切断を示す細胞を同定するステップと、
(c)ステップb)で同定された細胞を単離するステップと、
(d)前記一連のステップ(a)～(c)の反復を少なくとも1回実施するステップとを含み、ステップ(a)で使用される細胞株が、ステップ(c)で単離された細胞および/もしくはその子孫の細胞を含む、またはからなり、
(e)随意により、前記少なくとも1回の反復の前に(好ましくは、各反復の前に)、先行するステップc)で単離された細胞を、前記細胞の数が先行するステップa)における細胞の数と実質的に同等となるまで培養する。
本発明の一態様は、クロストリジウム神経毒に対して感受性を示す細胞の集団を進化させる方法を提供し、方法は、
(a)細胞の集団をクロストリジウム神経毒と接触させるステップであって、前記集団が、
i.クロストリジウム神経毒によって切断可能である指標タンパク質、および
ii.クロストリジウム神経毒に対して結合親和性を有する受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体およびガングリオシド)
を発現する細胞を含むステップと、
(b)指標タンパク質の切断を示す細胞を同定するステップと、
(c)ステップb)で同定された細胞を単離するステップと、
(d)ステップa)～c)の反復を少なくとも1回実施するステップとを含み、
前記少なくとも1回の反復では、ステップa)の細胞が、先行するステップc)において単離された細胞の前駆細胞を含み(またはからなり)、
随意により、前記少なくとも1回の反復の前に(好ましくは、各反復の前に)、先行するステップc)において単離された細胞を、前記細胞の数が先行するステップa)における細胞の数と実質的に同等となるまで培養する。
(a)細胞の集団をクロストリジウム神経毒と接触させるステップであって、前記集団が、
i.クロストリジウム神経毒によって切断可能である指標タンパク質、および
ii.クロストリジウム神経毒に対して結合親和性を有する受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体およびガングリオシド)
を発現する細胞を含むステップと、
(b)指標タンパク質の切断を示す細胞を同定するステップと、
(c)ステップb)で同定された細胞を単離するステップと、
(d)ステップa)～c)の反復を少なくとも1回実施するステップとを含み、
前記少なくとも1回の反復では、ステップa)の細胞が、先行するステップc)において単離された細胞の前駆細胞を含み(またはからなり)、
随意により、前記少なくとも1回の反復の前に(好ましくは、各反復の前に)、先行するステップc)において単離された細胞を、前記細胞の数が先行するステップa)における細胞の数と実質的に同等となるまで培養する。
本発明の一態様は、クロストリジウム神経毒に対して感受性を示す細胞の集団を進化させる方法を提供し、方法は、
(a)細胞の集団(好ましくは、組換え細胞の集団)をクロストリジウム神経毒と接触させるステップであって、前記集団が、
i.クロストリジウム神経毒によって切断可能である指標タンパク質、および
ii.クロストリジウム神経毒に対して結合親和性を有する受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体およびガングリオシド)
を発現する細胞を含むステップと、
(b)指標タンパク質の切断を示す細胞を同定するステップと、
(c)ステップb)で同定された細胞を単離するステップと、
(d)ステップa)～c)の反復を少なくとも1回実施するステップとを含み、当該反復の先行回のステップc)において単離された細胞が、ステップa)のその後の反復において細胞の集団として提供され、
(e)随意により、ステップa)～c)の前記少なくとも1回の反復の前に(好ましくは、各反復の前に)、先行するステップc)において単離された細胞を、前記細胞の数が先行するステップa)における細胞の数と実質的に同等となるまで培養する。
(a)細胞の集団(好ましくは、組換え細胞の集団)をクロストリジウム神経毒と接触させるステップであって、前記集団が、
i.クロストリジウム神経毒によって切断可能である指標タンパク質、および
ii.クロストリジウム神経毒に対して結合親和性を有する受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体およびガングリオシド)
を発現する細胞を含むステップと、
(b)指標タンパク質の切断を示す細胞を同定するステップと、
(c)ステップb)で同定された細胞を単離するステップと、
(d)ステップa)～c)の反復を少なくとも1回実施するステップとを含み、当該反復の先行回のステップc)において単離された細胞が、ステップa)のその後の反復において細胞の集団として提供され、
(e)随意により、ステップa)～c)の前記少なくとも1回の反復の前に(好ましくは、各反復の前に)、先行するステップc)において単離された細胞を、前記細胞の数が先行するステップa)における細胞の数と実質的に同等となるまで培養する。
その後の反復は、指標タンパク質の切断を示す細胞数が、例えば、感受性細胞を(さらに)濃縮するために選択圧をかけるための閾値未満であると思われる場合に実施され得る。
一実施形態では、前記少なくとも1回の反復は、ステップc)で単離された細胞数が、ステップa)における細胞数の10%、20%、30%、40%、50%または60%未満(好ましくは、20%未満である)である場合に実施され得る。
本発明の一態様は、クロストリジウム神経毒に対して感受性を示す細胞の集団を進化させる方法を提供し、方法は、
(a)細胞の集団をクロストリジウム神経毒と接触させるステップであって、前記集団が、
i.クロストリジウム神経毒によって切断可能である指標タンパク質、および
ii.クロストリジウム神経毒に対して結合親和性を有する受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体およびガングリオシド)
を発現する細胞を含むステップと、
(b)指標タンパク質の切断を示す細胞を同定するステップと、
(c)ステップb)で同定された細胞を単離するステップと、
(d)ステップc)で単離された細胞数が、ステップa)における細胞数の10%、20%、30%、40%、50%または60%未満(好ましくは、20%未満である)である場合に、
i.前記一連のステップ(a)～(c)の反復を少なくとも1回実施するステップであって、ステップ(a)において使用される細胞の集団が、ステップ(c)で単離された細胞および/もしくはその子孫の細胞を含む、またはからなるステップとを含み、随意により、前記少なくとも1回の反復の前に、先行するステップc)で単離された細胞を、前記細胞の数が先行するステップa)における細胞の数と実質的に同等となるまで培養する。
(a)細胞の集団をクロストリジウム神経毒と接触させるステップであって、前記集団が、
i.クロストリジウム神経毒によって切断可能である指標タンパク質、および
ii.クロストリジウム神経毒に対して結合親和性を有する受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体およびガングリオシド)
を発現する細胞を含むステップと、
(b)指標タンパク質の切断を示す細胞を同定するステップと、
(c)ステップb)で同定された細胞を単離するステップと、
(d)ステップc)で単離された細胞数が、ステップa)における細胞数の10%、20%、30%、40%、50%または60%未満(好ましくは、20%未満である)である場合に、
i.前記一連のステップ(a)～(c)の反復を少なくとも1回実施するステップであって、ステップ(a)において使用される細胞の集団が、ステップ(c)で単離された細胞および/もしくはその子孫の細胞を含む、またはからなるステップとを含み、随意により、前記少なくとも1回の反復の前に、先行するステップc)で単離された細胞を、前記細胞の数が先行するステップa)における細胞の数と実質的に同等となるまで培養する。
「実質的に同等な」という用語(例えば、「先行するステップc)において単離された細胞を、前記細胞の数が先行するステップa”)における細胞の数と実質的に同等となるまで培養する」という用語の関連で)は、先行するステップc)において単離された細胞を、前記細胞の数が、先行するステップa)における細胞の数の少なくとも約80%、90%または95%(好ましくは、少なくとも約90%)となるまで培養することを意味する場合がある。好ましい実施形態では、「実質的に同等な」とは、先行するステップc)において単離された細胞を、前記細胞の数が先行するステップa)における細胞の数と同一となるまで培養することを意味する。
好ましくは、細胞(例えば、ステップa)の)は、クロストリジウム神経毒によって切断可能である前記指標タンパク質をコードする外因性核酸を含む。好ましくは、細胞(例えば、ステップa)の)は、クロストリジウム神経毒に対して結合親和性を有する前記受容体をコードする外因性核酸を含む。好ましくは、細胞(例えば、ステップa)の)は、クロストリジウム神経毒に対する結合親和性を有する前記ガングリオシドの発現を提供する外因性核酸を含む。好ましい実施形態では、細胞(例えば、ステップa)の)は、前記指標タンパク質をコードする外因性核酸、前記受容体をコードする外因性核酸、前記ガングリオシドの発現を提供する外因性核酸を含む。
ガングリオシドは、例えば、1つ以上のシアル酸が糖鎖上で連結されたスフィンゴ糖脂質からなる分子である。ガングリオシドは、一般に、ポリペプチドではなく、従って、核酸によって直接的にコードされない。
「クロストリジウム神経毒に対する結合親和性を有する前記ガングリオシドの発現を提供する核酸(好ましくは、外因性核酸)」という用語は、ポリペプチドをコードする核酸を意味し、前記ポリペプチドは、細胞におけるガングリオシドの産生(例えば、発現)に影響を及ぼす、またはそれを触媒する。ペプチドは、ガングリオシド合成経路の酵素または酵素の触媒活性を有するそのバリアントもしくは断片であり得る。ガングリオシド合成経路の好ましい酵素は以下に記載されている。
本文を通して、「ガングリオシドを発現すること」への言及は、細胞がガングリオシドを産生または合成すること(好ましくは、ガングリオシド合成経路の酵素または酵素の触媒活性を有するそのバリアントもしくは断片を介して)を意味する。
指標タンパク質は、SNAREドメイン(例えば、シンタキシン、シナプトブレビンまたはSNAP-25のアミノ酸配列または野生型クロストリジウム神経毒のプロテアーゼ成分によるタンパク質分解に対して感受性であるそのバリアントもしくは断片)を含むタンパク質である。
ある特定の実施形態では、指標タンパク質の切断を示す細胞を選択することは、指標タンパク質の切断が生じたか否かを決定することを含む。
ある特定の実施形態では、方法は、例えば細胞中に指標タンパク質をコードする核酸を導入することによって組換え細胞を生成することをさらに含む。
ある特定の実施形態では、組換え細胞は、クロストリジウム神経毒受容体もしくはクロストリジウム神経毒に結合する能力を有するそのバリアントもしくはその断片および/またはガングリオシド合成経路の酵素もしくは酵素の触媒活性を有するそのバリアントもしくは断片を発現するように遺伝子改変される。
本発明はまた、幾分かは、上記の方法を使用して生成された集団に由来する細胞に関する。言い換えれば、本発明の一態様は、上記の方法によって得ることができる細胞集団に関する。
有利には、本明細書において記載される製造方法によって(例えば、その間に進化した)提供される細胞集団は、クロストリジウム神経毒の活性を決定する方法、またはクロストリジウム神経毒製剤の活性を特性決定する方法または治療的(および/または美容的)使用に適しているクロストリジウム神経毒製剤を同定する方法において使用できる。
本発明はさらに、幾分かは、修飾または組換え神経毒の活性を決定するアッセイに関する。アッセイは、上記の方法によって生成された集団に由来する細胞を修飾または組換え神経毒と、細胞において野生型クロストリジウム神経毒のプロテアーゼドメインが指標タンパク質を切断することを可能にするのに十分である条件下および時間の間接触させることならびに指標タンパク質の切断に起因する生成物の存在を決定することを含む。
本発明の別の態様は、クロストリジウム神経毒製剤の活性を特性決定する、または治療的(および/または美容的)使用のためのクロストリジウム神経毒製剤を同定するin vitro法に関し、前記方法は、
a.上記の本発明の方法(例えば、クロストリジウム神経毒に対して高度に感受性である細胞の集団を作製する方法またはクロストリジウム神経毒に対して感受性を示す細胞の集団を進化させる方法)によって調製された細胞集団を提供することと、
b.前記細胞集団をクロストリジウム神経毒製剤と接触させることと、
c.クロストリジウム神経毒製剤との接触後の指標タンパク質の切断のレベルを、クロストリジウム神経毒製剤との接触前の切断のレベルと比較することと、
d.(i)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが増大される場合に、クロストリジウム神経毒製剤を治療的(および/もしくは美容的)使用に適していると同定することもしくは(ii)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが増大される場合に、活性の存在を同定すること、または
e.(i)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが増大されない場合に、クロストリジウム神経毒製剤を治療的(および/または美容的)使用に適していないと同定することもしくは(ii)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが増大されない場合に、活性の非存在を同定することと
を含む。
a.上記の本発明の方法(例えば、クロストリジウム神経毒に対して高度に感受性である細胞の集団を作製する方法またはクロストリジウム神経毒に対して感受性を示す細胞の集団を進化させる方法)によって調製された細胞集団を提供することと、
b.前記細胞集団をクロストリジウム神経毒製剤と接触させることと、
c.クロストリジウム神経毒製剤との接触後の指標タンパク質の切断のレベルを、クロストリジウム神経毒製剤との接触前の切断のレベルと比較することと、
d.(i)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが増大される場合に、クロストリジウム神経毒製剤を治療的(および/もしくは美容的)使用に適していると同定することもしくは(ii)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが増大される場合に、活性の存在を同定すること、または
e.(i)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが増大されない場合に、クロストリジウム神経毒製剤を治療的(および/または美容的)使用に適していないと同定することもしくは(ii)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが増大されない場合に、活性の非存在を同定することと
を含む。
本発明の別の態様は、クロストリジウム神経毒製剤の活性を特性決定する、または治療的(および/または美容的)使用に適しているクロストリジウム神経毒製剤を同定するin vitro法を提供し、前記方法は、
a.上記の本発明の方法(例えば、クロストリジウム神経毒に対して高度に感受性である細胞の集団を作製する方法またはクロストリジウム神経毒に対して感受性を示す細胞の集団を進化させる方法)によって調製された細胞集団を提供することと、
b.前記細胞をクロストリジウム神経毒製剤と接触させることと、
c.クロストリジウム神経毒製剤との接触後の指標タンパク質の切断のレベルを、対照クロストリジウム神経毒製剤との接触後の切断のレベルと比較することと、
d.(i)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが、対照クロストリジウム神経毒製剤との接触後の切断のレベルに対して増大されるか、もしくは同等である場合に、クロストリジウム神経毒製剤を治療的(および/または美容的)使用に適していると同定することもしくは(ii)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが、対照クロストリジウム神経毒製剤との接触後の切断のレベルに対して増大されるか、もしくは同等である場合に、活性の存在を同定すること、または
e.(i)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが対照クロストリジウム神経毒製剤との接触後の切断のレベルに対して増大されないか、もしくは同等である場合に、クロストリジウム神経毒を治療的(および/または美容的)使用に適していないと同定することもしくは(ii)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが対照クロストリジウム神経毒製剤との接触後の切断のレベルに対して増大されないか、もしくは同等ではない場合に、活性の非存在を同定することと
含む。
a.上記の本発明の方法(例えば、クロストリジウム神経毒に対して高度に感受性である細胞の集団を作製する方法またはクロストリジウム神経毒に対して感受性を示す細胞の集団を進化させる方法)によって調製された細胞集団を提供することと、
b.前記細胞をクロストリジウム神経毒製剤と接触させることと、
c.クロストリジウム神経毒製剤との接触後の指標タンパク質の切断のレベルを、対照クロストリジウム神経毒製剤との接触後の切断のレベルと比較することと、
d.(i)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが、対照クロストリジウム神経毒製剤との接触後の切断のレベルに対して増大されるか、もしくは同等である場合に、クロストリジウム神経毒製剤を治療的(および/または美容的)使用に適していると同定することもしくは(ii)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが、対照クロストリジウム神経毒製剤との接触後の切断のレベルに対して増大されるか、もしくは同等である場合に、活性の存在を同定すること、または
e.(i)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが対照クロストリジウム神経毒製剤との接触後の切断のレベルに対して増大されないか、もしくは同等である場合に、クロストリジウム神経毒を治療的(および/または美容的)使用に適していないと同定することもしくは(ii)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが対照クロストリジウム神経毒製剤との接触後の切断のレベルに対して増大されないか、もしくは同等ではない場合に、活性の非存在を同定することと
含む。
「接触後の指標タンパク質の切断のレベルが増大されない場合」という用語は、切断のレベルの実質的に増大がないことを意味する。「接触後の指標タンパク質の切断のレベルが増大されない場合」という用語の関連で本明細書で使用される場合「実質的に」という用語は、好ましくは、統計的に有意な増大はないということを意味する。前記増大(実質的ではない)は、30%、25%、20%、15%、10%、5%または1%未満、好ましくは、20%未満の増大である場合がある。前記増大(実質的ではない)は、5%、2%、1%または0.5%未満、好ましくは、0.1%未満の増大である場合がある。より好ましくは、「接触後の指標タンパク質の切断のレベルが増大されない場合」という用語は、本明細書で使用される場合、接触後の指標タンパク質の切断のレベルが全く低下しない(すなわち、切断のレベルの増大が0%である)ことを意味する。
受容体および/またはガングリオシドは、細胞において過剰発現される場合がある。
有利には、本発明の方法および細胞は、クロストリジウム神経毒に対して結合親和性を有する受容体および/またはガングリオシドの発現または過剰発現を提供することによって、偽陰性結果(例えば、プロテアーゼドメインの低活性よりも、結合に対するクロストリジウム神経毒の低親和性およびアッセイに使用される細胞中への転位置の結果として、低切断活性が不正確に検出される)の低減を可能にする。さらに、本発明は、このようなアッセイにおいて使用できるより広範囲の細胞種を提供し、例えば、in vitroで培養することが困難である場合がある神経細胞(例えば、十分なレベルの受容体/ガングリオシドを天然に発現する)への依存を低減する。これらの利点は、無細胞系(プロテアーゼ活性のみを特性決定する)とは対照的に、細胞ベースのアッセイ(結合、転位置およびプロテアーゼ活性の特性決定を可能にする)の関連で提供される。
本明細書において記載される細胞において発現される受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体)のレベルは、好ましくは、クロストリジウム神経毒の天然標的(例えば、神経細胞)において発現される受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体)のレベルに対して同等であるか、またはそれより高い。例えば、本明細書において記載される細胞において発現される受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体)のレベルは、クロストリジウム神経毒の天然標的(例えば神経細胞)において発現される受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体)のレベルに対して≧10%、≧20%、≧30%、≧40%、≧50%、≧60%、≧70%、≧80%、≧90%または≧100%であり得る。
本明細書において記載される細胞において発現される受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体)のレベルは、好ましくは、前記外因性核酸を欠く細胞において発現される受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体)のレベルよりも高い場合がある。例えば、本明細書において記載される細胞において発現される受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体)のレベルは、前記外因性核酸を欠く細胞(例えば、そうでなければ同等の細胞)において発現される受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体)のレベルに対して≧10%、≧20%、≧30%、≧40%、≧50%、≧60%、≧70%、≧80%、≧90%または≧100%であり得る。
一実施形態では、本明細書において記載される任意の態様または実施形態の関連で使用される「過剰発現」という用語は、好ましくは、クロストリジウム神経毒の天然標的(例えば、神経細胞)において発現される受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体)のレベルに対して≧10%、≧20%、≧30%、≧40%、≧50%、≧60%、≧70%、≧80%、≧90%または≧100%の発現を意味する。一実施形態では、本明細書において記載される任意の態様または実施形態の関連で使用されるような「過剰発現」という用語は、好ましくは、前記外因性核酸を欠く細胞(例えば、そうでなければ同等の細胞)において発現される受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体)のレベルに対して≧10%、≧20%、≧30%、≧40%、≧50%、≧60%、≧70%、≧80%、≧90%または≧100%の発現を意味する。
一実施形態では、クロストリジウム神経毒は、BoNT/A(またはBoNT/A HCCドメインを含むBoNT)である場合があり、好ましくは、受容体は、SV2A、SV2Bおよび/またはSV2C(好ましくは、SV2A)であり得る。
さらにまたはあるいは、クロストリジウム神経毒は、BoNT/B(またはBoNT/B HCCドメインを含むBoNT)である場合があり、好ましくは、受容体は、Syt-Iおよび/またはSyt-IIであり得る。
さらにまたはあるいは、クロストリジウム神経毒は、BoNT/E(またはBoNT/E HCCドメインを含むBoNT)である場合があり、好ましくは、受容体は、SV2Aおよび/またはSV2B(好ましくは、SV2A)であり得る。
さらにまたはあるいは、クロストリジウム神経毒は、BoNT/G(またはBoNT/G HCCドメインを含むBoNT)である場合があり、好ましくは、受容体は、Syt-Iおよび/またはSyt-IIであり得る。
適した受容体/ガングリオシドに関するさらなる情報については、参照により本明細書に組み込まれる、Binz and Rummel (Journal of Neurochemistry, volume 109, Issue 6, June 2009, Pages 1584-1595)を参照されたい。
クロストリジウム神経毒は、細菌クロストリジウム・ボツリヌムによって天然に産生される神経毒である。
本発明のある特定の実施形態では、クロストリジウム神経毒は、ボツリヌス神経毒(BoNT)またはテタヌス神経毒(TeNT)である。本明細書で使用される場合、「クロストリジウム神経毒」、「BoNT」および「TeNT」という用語は、それぞれ、クロストリジウム・ボツリヌム以外の株によって産生されるものを含む野生型クロストリジウム神経毒ならびに修飾および組換えクロストリジウム神経毒を指す。
修飾クロストリジウム神経毒は、野生型クロストリジウム神経毒と比較して、アミノ酸修飾および/または化学修飾を含む1つ以上の修飾を含有し得る。アミノ酸修飾は、1個以上のアミノ酸残基の欠失、置換または付加を含む。化学修飾は、1個以上のアミノ酸残基に行われる修飾、例えば、リン酸もしくは炭水化物の付加またはジスルフィド結合の形成を含む。
ある特定の実施形態では、修飾は、クロストリジウム神経毒の特性を変更するように行うことができる。クロストリジウム神経毒への修飾は、その生物活性を増大または低下させることができる。
クロストリジウム神経毒の生物活性は、少なくとも3つの別個の活性を包含する。第1の活性は、神経毒のプロテアーゼ成分中に存在する「タンパク質分解活性」であり、細胞膜融合の調節に関与する1つ以上のSNAREタンパク質のペプチド結合の加水分解を担う。第2の活性は、神経毒の転位置成分中に存在する「転位置活性」であり、エンドソーム膜を超える、および細胞質中への神経毒の輸送に関与する。第3の活性は、神経毒の標的化成分に存在する「受容体結合活性」であり、神経毒の、標的細胞上の受容体への結合に関与する。
ある特定の実施形態では、神経毒の修飾は、クロストリジウム神経毒の末端切断成分(複数可)を含む場合があり、このような成分(複数可)の活性を依然として維持する。例えば、神経毒は、タンパク質分解活性にとって必要であるプロテアーゼ成分の部分(複数可)のみ、転位置活性にとって必要である転位置成分の部分(複数可)のみおよび/または受容体結合活性にとって必要である標的化成分の部分(複数可)のみを含むように修飾され得る。
クロストリジウム神経毒は、不活性の単鎖ポリペプチドとして最初に産生され、その活性化部位での神経毒の切断後にその活性二本鎖形態で配置される。このような切断は、転位置および標的化成分を含む重鎖(H鎖)ならびにプロテアーゼ成分を含む軽鎖(L鎖)を有する二本鎖タンパク質をもたらす。
ある特定の実施形態では、クロストリジウム神経毒の生物活性は、神経毒の活性化部位を修飾することによって修飾される。神経毒の、活性化される能力は、それによって増大、低下され得るか、または同一のままであり得る。ある特定の実施形態では、クロストリジウム神経毒の生物活性は、より容易に切断され、ひいては、神経毒を活性化するように活性化部位を修飾することによって、増大されるまたは引き起こされる。ある特定の環境または細胞においてのみ活性化が望まれる実施形態では、活性化部位は、このような環境または細胞中に存在するプロテアーゼによってのみ切断されるように修飾され得る。ある特定の他の環境では、あまり容易に切断されないように活性化部位を修飾することによって、神経毒の生物活性が減少されるまたは不活性化される。
ある特定の実施形態では、クロストリジウム神経毒の生物活性は、神経毒のプロテアーゼ成分を修飾することによって修飾される。神経毒のタンパク質分解活性は、それによって増大、低下され得るか、または同一のままであり得る。ある特定の実施形態では、プロテアーゼ成分を、異なるクロストリジウム神経毒またはそのバリアントもしくは断片に由来するプロテアーゼ成分と置き換えることができる。例えば、BoNT/Aは、そのプロテアーゼ成分をBoNT/Eのプロテアーゼ成分と置き換えることによって修飾され得る。
ある特定の実施形態では、クロストリジウム神経毒の生物活性は、神経毒の転位置成分を修飾することによって修飾される。神経毒の転位置活性は、それによって増大、低下され得るか、または同一のままであり得る。ある特定の実施形態では、転位置成分は、異なるクロストリジウム神経毒またはそのバリアントもしくは断片に由来する転位置成分と置き換えることができる。例えば、BoNT/Aは、その転位置成分をBoNT/Eの転位置成分と置き換えることによって修飾され得る。
ある特定の実施形態では、クロストリジウム神経毒の生物活性は、神経毒の標的化成分を修飾することによって修飾される。神経毒の標的化能力は、それによって増大、低下され得るか、または同一のままであり得る。ある特定の実施形態では、標的化成分は、異なるクロストリジウム神経毒またはそのバリアントもしくは断片に由来する標的化成分と置き換えることができる。例えば、BoNT/Aは、その標的化成分をBoNT/Eの標的化成分と置き換えることによって修飾され得る。ある特定の他の実施形態では、標的化成分は、非クロストリジウムポリペプチド、例えば、抗体と置き換えられ得る。
また、修飾は、クロストリジウム神経毒の成分の並べ替え、例えば、プロテアーゼ成分を、転位置成分および標的化成分と隣接させることを含み得る。
組換えクロストリジウム神経毒は、遺伝的に産生される。それらは野生型クロストリジウム神経毒と遺伝的に同一であるか、または追加の、より少ないもしくは異なるアミノ酸を含有するという点で野生型クロストリジウム神経毒とは異なっている場合もある。例えば、上記の修飾されたクロストリジウム神経毒のうちいずれかを反映する組換えクロストリジウム神経毒を作製できる。組換えクロストリジウム神経毒はまた、それらが野生型クロストリジウム神経毒において配置されるものとは異なる順序で配置された成分を有する場合がある。組換えクロストリジウム神経毒はまた、上記のように化学的に修飾され得る。
ある特定の実施形態では、修飾または組換えクロストリジウム神経毒は、野生型クロストリジウム神経毒、例えば、血清型A、B、C、D、E、F、GもしくはHのBoNTまたはTeNTと少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
異なる配列を比較するための、さまざまなアルゴリズムに基づく一連のプログラムが当業者に利用可能である。これに関連して、NeedlemanおよびWunschまたはSmithおよびWatermanのアルゴリズムは、特に信頼できる結果をもたらす。配列アラインメントを実施し、本明細書において列挙された配列同一性値を算出するために、アルゴリズムClustal Wに基づいた市販のプログラムDNASTAR Lasergene MegAlignバージョン7.1.0を、以下の設定を用い、全配列領域にわたって使用した。ペアワイズアラインメントパラメータ、ギャップペナルティー、10.00、ギャップ長ペナルティー、0.10、タンパク質重み行列Gonnet 250、これらは、特に断りのない限り、配列アラインメントのための標準設定として常に使用されるべきである。
BoNT/A血清型は、少なくとも6種の亜血清型(亜型としても知られる)、BoNT/A1～BoNT/A6にわけられ、これは、少なくとも84%、最大98%のアミノ酸配列同一性を共有する。所与の亜型内のBoNT/Aタンパク質は、より高いアミノ酸配列同一性パーセンテージを共有する。
クロストリジウム神経毒は、受容体への結合によってニューロンを標的とする。クロストリジウム神経毒の受容体は、タンパク質受容体および細胞膜ガングリオシドを含む。
「接触させること」という用語は、本明細書で使用される場合、物理的および/または化学的相互作用を可能にするために、細胞(例えば、細胞の集団)およびクロストリジウム神経毒を物理的に近接させることを指す。接触させることは、ポリペプチドと、野生型クロストリジウム神経毒によるタンパク質分解に対して感受性であるタンパク質(例えば、SNAREタンパク質)との相互作用を可能にするのに十分である条件下および時間の間実施される。
ある特定の実施形態では、このような接触させることは、ポリペプチドを含有する培地中で細胞を培養することによってであり得る。ポリペプチドは、通常、0.0001nM～10,000nM、0.0001～1,000nM、0.0001～100nM、0.0001～10nM、0.0001～1nM、0.0001～0.1nM、0.0001～0.01nMまたは0.0001～0.001nMの濃度で培地中に存在する。このような培養することは、例えば、2時間以上、4時間以上、6時間以上、12時間以上、18時間以上、24時間以上、30時間以上、36時間以上、40時間以上または48時間以上であり得る。
ある特定の他の実施形態では、このような接触することは、ポリペプチドをコードする外因性核酸を細胞にトランスフェクトすること(例えば、一過性トランスフェクション)によってであり得る。
このようなアッセイにおける使用を可能にするために、細胞は、野生型クロストリジウム神経毒によるタンパク質分解に対して感受性であるタンパク質を含む。これらのタンパク質は、本明細書において「指標タンパク質(複数可)」と呼ばれる。指標タンパク質は、内因性(例えば、内因性SNAREタンパク質)である場合もあり、細胞が、指標タンパク質を発現または過剰発現するように遺伝子改変される場合もある。
上記で論じたように、SNAREタンパク質、例えば、SNAP-25、シナプトブレビンおよびシンタキシンは、クロストリジウム神経毒によるタンパク質分解に対して感受性であることが知られている。例えば、BoNT/A、BoNT/CおよびBoNT/Eは、SNAP-25を切断すると知られており、BoNT/Cはまた、シンタキシンを切断すると知られており、他のBoNT血清型およびTeNTは、シナプトブレビンを切断すると知られている。したがって、本発明は、このような指標タンパク質が、このようなSNAREタンパク質のアミノ酸配列を含み得るということを企図する。本発明はまた、指標タンパク質が、このようなSNAREタンパク質のバリアントまたは断片のアミノ酸配列を代わりに含むことができ、ただし、バリアントまたは断片は、野生型クロストリジウム神経毒によるタンパク質分解に対して感受性であるということを企図する。ある特定の実施形態では、バリアントは、SNAREタンパク質と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%の配列同一性を有し得る。SNAREタンパク質またはそのバリアントもしくは断片のアミノ酸配列を有する指標タンパク質の部分は、本明細書において指標タンパク質の「SNAREドメイン」と呼ばれる。
「タンパク質分解に対して感受性」という用語は、タンパク質が、野生型クロストリジウム神経毒のプロテアーゼ成分によってタンパク質分解性に切断可能であることを意味する。言い換えれば、このようなタンパク質は、プロテアーゼ認識および切断部位を含み、それが野生型クロストリジウム神経毒のプロテアーゼ成分によって認識および切断されることを可能にする。
ある特定の実施形態では、指標タンパク質は標識される。例えば、Oyler et al.のU.S. Patent No. 8,940,482には、クロストリジウム神経毒の活性を評価するための細胞ベースのアッセイが記載されており、これでは、細胞は、SNAP-25に融合された蛍光タンパク質ドメインを含む標識された融合タンパク質を発現するように改変されている。蛍光タンパク質ドメインは、SNAP-25ドメインのC末端側であり、クロストリジウム神経毒によるSNAP-25の切断後に結果として生じるC末端側断片の一部になる。Oylerによって記載されたアッセイでは、全長融合タンパク質は、細胞中で容易に分解されないが、得られたC末端側断片は、蛍光タンパク質の分解をもたらす。これは、得られた断片のN末端側に、切断によって露出される場合にのみデグロンとして役立つ残基が、SNAP-25に存在することによる。このような「N-デグロン」は、ユビキチンリガーゼによってタグ付けされ、従って、断片は、分解のためにプロテアソームによって標的化される。
したがって、本発明は、細胞が、全長形態では容易に分解されない、標識された指標タンパク質を発現するように改変される、Oylerに記載されたものなどの実施形態を企図する。このような実施形態では、切断は、細胞において容易に分解される標識された断片をもたらす(例えば、N-デグロンの存在のために)。指標タンパク質は、容易に分解される断片を形成する部分で標識され、標識は断片とともに分解される。このような実施形態では、ポリペプチドの、細胞においてSNAREタンパク質を切断する能力は、細胞がポリペプチドと接触した後の標識からのシグナルの存在(またはその欠如)によって決定できる。
ある特定のこのような実施形態では、指標タンパク質はまた、切断後に、他の断片ほど容易に分解しない断片を形成する指標タンパク質の部分上に標識を含む。例えば、指標タンパク質は、2つの標識と、SNAREドメインに隣接する標識を有するSNAREドメインとを含む融合タンパク質であり得る。細胞では全長指標タンパク質が容易に分解されないが、その切断後に、得られた断片のうち1つが容易に分解される実施形態では、SNAREタンパク質の切断は、容易に分解可能な断片上の標識から得られたシグナルを、あまり容易には分解可能ではない断片上の標識からのシグナルと比較することによって決定できる。例えば、切断に起因するC末端側断片は容易に分解可能であるが、N末端側断片は容易に分解可能ではないOylerにおけるものなどの実施形態では、切断は、C末端側断片上の標識から得られたシグナルを、N末端側断片上の標識からのシグナルと比較することによって決定できる。このような実施形態では、互いにより明確に識別可能である(例えば、赤色と緑色または赤色とシアン)蛍光シグナルを発する標識が選択され得る。
「標識」という用語は、本明細書で使用される場合、検出可能なマーカーを意味し、例えば、放射性標識、抗体および/または蛍光標識を含む。試験基質および/または切断生成物の量は、例えば、少なくとも2つの標識間のエネルギー共鳴移動に基づく方法、例えば、FRETアッセイ(以下にさらに論じられる)を含む、オートラジオグラフィーまたは分光法の方法によって決定できる。あるいは、ウエスタンブロットまたはELISAなどの免疫学的方法を、検出のために使用できる。
本発明の実施において使用できる標識の例として、放射性同位体、蛍光標識、リン光標識、発光標識および標識された結合パートナーに結合可能な化合物が挙げられる。蛍光標識の例として、黄色蛍光タンパク質(YFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、例えば、NeonGreen、赤色蛍光タンパク質(RFP)、例えば、mScarlet、シアン蛍光タンパク質(CFP)およびその蛍光発光突然変異体が挙げられる。発光標識の例として、発光タンパク質、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケおよびガウシア(Gaussia)ルシフェラーゼ、化学発光化合物および電気化学発光(ECL)化合物が挙げられる。発せられるシグナルが、互いにより容易に識別可能であるように、N末端側標識およびC末端側標識が選択される、上記で論じられるような実施形態では、このような標識対の例として、RFPおよびGFPおよびRFPおよびCFPを挙げることができる。例えば、mScarletなどのRFPは、N末端側標識として役立つ可能性があり、NeonGreenなどのGFPまたはCFPは、C末端側標識として役立つ可能性がある。
ある特定の実施形態では、標識は、タンパク質標識、例えば、抗体、蛍光タンパク質、発光タンパク質およびルシフェラーゼである。
本明細書で使用される場合、「N末端側標識」とは、タンパク質であるか否かに関わらず、クロストリジウム神経毒切断部位のN末端側である指標タンパク質の部分上に位置する標識を指し、「C末端側標識」とは、タンパク質であるか否かに関わらず、クロストリジウム神経毒切断部位のC末端側である指標タンパク質の部分上に位置する標識を指す。標識は、N末端側またはC末端側標識と呼ばれるべき指標タンパク質のN末端またはC末端である必要はない。むしろ、これらの用語は、クロストリジウム神経毒切断部位に対する標識の位置を指す。本発明のある特定の実施形態では、RFP、例えば、mScarletが、N末端側標識として使用され、GFP、例えば、NeonGreenまたはCFPが、C末端側標識として使用される。
別のアッセイとして、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)アッセイがある。このようなアッセイでは、指標タンパク質は、切断部位の一方の側にドナー標識を、もう一方の側にアクセプター標識を含む。ドナー標識は、エネルギーを吸収し、その後、それをアクセプター標識に移す。エネルギーの移動は、ドナー発色団の蛍光強度の低減およびアクセプター発色団の発光強度の増大をもたらす。基質の切断の結果、エネルギーの移動の成功が少なくなる。したがって、切断の成功は、この移動が起こる能力の低減に基づいて決定できる。このような実施形態では、YFPおよびCFPは、RFPおよびGFPができるように、FRET対として対を形成できる。
本発明のある特定の実施形態では、指標タンパク質は、SNAREドメインを含む融合タンパク質である。融合タンパク質はまた、標識ドメインなどのさらなるドメインを含み得る。標識ドメインは、タンパク質標識のアミノ酸配列を有し得る。このような融合タンパク質の一例は、N末端側標識ドメイン、例えば、mScarletのアミノ酸配列、SNAREドメイン、例えば、SNAP-25のアミノ酸配列およびC末端側標識ドメイン、例えば、NeonGreenのアミノ酸配列を含む。
融合タンパク質はまた、選択マーカー(以下にさらに論じられる)などの他のドメインを含み得る。このような実施形態では、選択マーカードメインは、翻訳後に選択マーカーと指標タンパク質の残部との分離を可能にするように切断され得るリンカーによって、残りのドメイン(例えば、SNAREドメインおよび標識ドメイン(複数可))を含有する融合タンパク質部分から分離され得る。リンカーは、例えば、自己切断性である場合もある(例えば、2A自己切断性ペプチド)。
このようなアッセイはまた、通常、指標タンパク質のその切断生成物(複数可)への変換の程度を決定するステップを含む。ポリペプチドを指標タンパク質と接触させた後に生じた1つ以上の切断生成物(複数可)の観察または切断生成物(複数可)の量の増大の観察が、ポリペプチドのタンパク質分解活性を示す。
決定するステップは、全長指標タンパク質と切断生成物(複数可)を比較することを含み得る。比較することは、全長指標タンパク質の量および/または1つ以上の切断生成物(複数可)の量を決定することを含む場合があり、また全長指標タンパク質および切断生成物(複数可)の比を算出することを含む場合がある。さらに、タンパク質分解活性を決定するためのアッセイは、アッセイされているポリペプチドと指標タンパク質の接触後に現れる切断生成物(複数可)と、対照を比較するステップを含み得る。対照は、例えば、同一指標タンパク質を切断可能であるとわかっているクロストリジウム神経毒の接触後に現れる切断生成物(複数可)であり得る。
宿主細胞、例えば、細菌細胞を溶解するために使用される方法および技術は、当技術分野で公知である。例として、超音波処理またはフレンチプレスの使用が挙げられる。
ある特定の実施形態では、全長指標タンパク質は、細胞中で容易に分解されないが、その切断後に、結果として生じた断片のうち1つは容易に分解される。これは、例えば、得られた断片のN末端側に、切断によって露出される場合にのみデグロンとして役立つ残基が存在することによる可能性がある。
このような実施形態では、指標タンパク質は、切断後により容易に分解されるその部分上で標識され得る。標識は、断片の分解が生じる場合に標識も分解されるように選択されるべきである。このような実施形態では、切断が生じるか否かを、標識からのシグナルを測定することに基づいて決定できる。
受け取られたシグナルを対照と比較できる。
切断後に形成された別の断片が同様に容易には分解されないある特定のこのような実施形態では、指標タンパク質はまた、切断後にその断片を形成する指標タンパク質の部分上に標識を含み得る。したがって、このような実施形態では、切断が生じるか否かは、より容易に分解可能な断片上の標識からのシグナルを、対照として役立つあまり容易には分解可能ではない断片上の標識からのシグナルと比較することによって決定できる。
標識(複数可)からのシグナル(複数可)は、蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用して分析できる。例えば、全長指標タンパク質および切断後に形成されるそのN末端側断片が細胞内では容易に分解可能ではないが、切断から得られたC末端側断片は容易に分解可能であり、N末端側標識がmScarletであり、C末端側標識がNeonGreenである実施形態では、切断の成功後の細胞のFACS分析は、赤色発光と比較して、より低い緑色発光を示す。対照的に、切断が生じない場合には、赤色および緑色蛍光は、等しく広がるべきである。
代替法では、細胞の蛍光顕微鏡写真を撮ることができる。上記のものなどの実施形態では、切断の成功は、プロテアーゼに曝露されていない対照細胞と比較して、細胞において発せられるより少ない緑色蛍光をもたらすであろう。対照的に、赤色蛍光は、対照と同一のままであるべきである。
また、ある特定の実施形態では、アッセイは、FRETアッセイであり得る。これまでに論じられたように、このようなアッセイでは、指標タンパク質は、N末端側標識およびC末端側標識を含み、一方の標識は、ドナー標識であり、もう一方は、アクセプター標識である。ドナー標識とアクセプター標識間のエネルギーの移動は、ドナー標識の蛍光強度の低減およびアクセプター標識の発光強度の増大をもたらす。このような移動の成功は、極めて接近したままである標識に依存する。指標タンパク質の切断は、これらの標識をより遠位にする傾向があり、したがって、このような移動は、あまり成功しない。したがって、切断の成功は、エネルギーの移動が起こる能力の低減に基づいて決定できる。
上記に加えて、切断が生じたか否かを決定するために指標タンパク質からの蛍光を分析するための当技術分野で公知の任意の他の手段を、本発明の実施において使用できる。
ある特定の実施形態では、指標タンパク質のうち20%以上、50%以上、75%以上、80%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上または99%以上が、1分未満、5分未満、20分未満、40分未満、60分未満または120分未満で切断生成物(複数可)に変換される場合に、ポリペプチドはタンパク質分解的に活性と見なされる。
配列の説明
配列番号1は、N末端側mScarlet標識、SNAP-25、C末端側NeonGreen標識およびC末端側ルシフェラーゼを含む融合タンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列である。
配列番号2は、N末端側mScarlet標識、SNAP-25、C末端側CFP標識およびC末端側ルシフェラーゼを含む融合タンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列である。
配列番号3は、N末端側CFPおよびBoNT/Aの軽鎖を含む融合タンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列である。
配列番号4は、GD3シンターゼ、SV2C、シンタキシンおよびアミノグリコシド3’-ホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を有するドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列である。融合タンパク質では、各ドメインは、2A自己切断性ペプチドによって互いにわけられる。
配列番号5は、GD3シンターゼ、SV2A、シンタキシンおよびアミノグリコシド3’-ホスホトランスフェラーゼのアミノ酸配列を有するドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸のヌクレオチド配列である。融合タンパク質では、各ドメインは、2A自己切断性ペプチドによって互いにわけられる。
配列番号6は、GD3シンターゼのアミノ酸配列である。
配列番号7は、配列番号4および5によってコードされる2A自己切断性ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号8は、SV2Aのアミノ酸配列である。
配列番号9は、SV2Bのアミノ酸配列である。
配列番号10は、SV2Cのアミノ酸配列である。
配列番号11は、SV2Aの第4の管腔ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号12は、SV2Bの第4の管腔ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号13は、SV2Cの第4の管腔ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号14は、シナプトタグミンIのアミノ酸配列である。
配列番号15は、シナプトタグミンIIのアミノ酸配列である。
配列番号16は、MScarletのアミノ酸配列である。
配列番号17は、NeonGreenのアミノ酸配列である。
配列番号18は、CFPのアミノ酸配列である。
配列番号19は、SNAP-25のアミノ酸配列である。
配列番号20は、アミノグリコシド3’-ホスホトランスフェラーゼ(Neo)のアミノ酸配列である。
配列番号21は、ピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼ(PuroR)のアミノ酸配列である。
配列番号22は、ルシフェラーゼのアミノ酸配列である。
本発明は、本明細書において記載される実施形態に制限されない。実際、多数の変形、変更および置換は、本発明から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替案が、本発明を実施する際に使用され得る。
本発明の説明では、一実施形態に関してある範囲の値が提供される場合、各介在する値は実施形態内に包含される。
本明細書で使用される場合、タンパク質またはポリペプチドの「バリアント」とは、参照タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%または99.9%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドを指す。
「配列同一性」とは、本明細書で使用される場合、配列が、最高次の一致が得られるようにアラインされる、参照アミノ酸またはヌクレオチド配列と、クエリーアミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一性を指し、これは、例えば、BLASTP、BLASTN、FASTA(Altschul 1990, J. Mol. Biol. 215:403)などのコンピュータプログラムで体系化された公開された技術または方法を使用して算出できる。
本明細書で使用される場合、タンパク質またはポリペプチドの「断片」とは、タンパク質もしくはポリペプチドの末端切断型またはタンパク質もしくはポリペプチドのバリアントの末端切断型を指す。
「接触させること」という用語は、本明細書で使用される場合、物理的および/または化学的相互作用を可能にするために、細胞およびポリペプチド(例えば、野生型、修飾された、または組換えクロストリジウム神経毒)を物理的に近接させることを指す。接触させることは、細胞においてポリペプチドと指標タンパク質(本明細書においてさらに論じられる)との相互作用を可能にするのに十分である条件下および時間の間実施される。
「指標タンパク質」は、クロストリジウム神経毒によって切断可能であるタンパク質である。適切には、指標タンパク質は、クロストリジウム(clostrididal)神経毒またはそのタンパク質分解活性ドメインの不在下で切断されない。「指標タンパク質は、クロストリジウム(clostrididal)神経毒の不在下で切断されない」という用語は、好ましくは、指標タンパク質は、クロストリジウム神経毒の不在下で実質的な切断がないことを示すことを意味する。「実質的な切断がない」という用語は、細胞中に存在する指標タンパク質のうち≦5%、≦2%または≦1%(好ましくは、≦1%)がクロストリジウム神経毒の不在下で切断されることを意味する場合がある。好ましい実施形態では、「実質的な切断がない」とは、細胞中に存在する指標タンパク質が、クロストリジウム神経毒の不在下で切断されないことを意味する。適切には、指標タンパク質は、細胞中で容易に分解されないが、その切断後に、得られた断片のうち1つが容易に分解される(好ましくは、C末端側断片が容易に分解される)。例えば、クロストリジウム神経毒の不在下で、細胞中で≦5%、≦2%または≦1%(好ましくは、≦1%、より好ましくは、なし、例えば、0%)が分解され得る。
本発明は、幾分か、クロストリジウム神経毒に対して高度に感受性の組換え細胞の集団を生成する方法に関する。細胞は、ポリペプチド(例えば、修飾または組換えクロストリジウム神経毒)の活性を決定するアッセイにおいて使用され得る。ある特定の実施形態では、本発明の方法は、
(a)指標タンパク質を発現する組換え細胞を、クロストリジウム神経毒と接触させることと、
(b)その後、指標タンパク質の切断を示す細胞を選択することと
を含む。
(a)指標タンパク質を発現する組換え細胞を、クロストリジウム神経毒と接触させることと、
(b)その後、指標タンパク質の切断を示す細胞を選択することと
を含む。
本発明の一態様は、クロストリジウム神経毒に対する感受性を示す細胞を(集団から)単離することと、その後、前記「単離細胞」から感受性のままである細胞のみを選択することによって、クロストリジウム神経毒に対する感受性の増大を実証する細胞の集団を進化させることができるという驚くべき知見に基づいている。このプロセスは、必要なだけ何回も繰り返す(反復する)ことができ、各反復(interation)によってクロストリジウム神経毒に対して長期の/高い感受性を有する細胞が「濃縮される」。
例えば、遺伝子工学によって(例えば、クロストリジウム神経毒受容体をコードするまたはクロストリジウム神経毒ガングリオシドの発現を提供する核酸を導入することによって)、(元の)細胞の集団がクロストリジウム神経毒に対して感受性にされた場合、反復選択によって、一過性の感受性(例えば、一過性発現)のみを示す細胞を廃棄することを可能にしながら、感受性を保持する(例えば、クロストリジウム神経毒受容体をコードするまたはクロストリジウム神経毒ガングリオシドの発現を提供する核酸からの発現を保持する)前駆細胞を選択することが可能となる。
本発明の一態様は、クロストリジウム神経毒に対して感受性を示す細胞の集団を進化させる方法を提供し、方法は、
(a)細胞の集団をクロストリジウム神経毒と接触させるステップであって、前記集団が
i.クロストリジウム神経毒によって切断可能である指標タンパク質、および
ii.クロストリジウム神経毒に対して結合親和性を有する受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体およびガングリオシド)
を発現する細胞を含むステップと、
(b)指標タンパク質の切断を示す細胞を同定するステップと、
(c)ステップb)で同定された細胞を単離するステップと、
(d)ステップa)～c)の反復を少なくとも1回実施するステップと
を含み、
前記少なくとも1回の反復において、ステップa)の細胞が、先行するステップc)で単離された細胞の前駆細胞を含み(またはからなり)、
随意により、前記少なくとも1回の反復の前に(好ましくは、各反復の前に)、先行するステップc)で単離された細胞を、前記細胞の数が先行するステップa)における細胞の数と実質的に同等となるまで培養する。
(a)細胞の集団をクロストリジウム神経毒と接触させるステップであって、前記集団が
i.クロストリジウム神経毒によって切断可能である指標タンパク質、および
ii.クロストリジウム神経毒に対して結合親和性を有する受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体およびガングリオシド)
を発現する細胞を含むステップと、
(b)指標タンパク質の切断を示す細胞を同定するステップと、
(c)ステップb)で同定された細胞を単離するステップと、
(d)ステップa)～c)の反復を少なくとも1回実施するステップと
を含み、
前記少なくとも1回の反復において、ステップa)の細胞が、先行するステップc)で単離された細胞の前駆細胞を含み(またはからなり)、
随意により、前記少なくとも1回の反復の前に(好ましくは、各反復の前に)、先行するステップc)で単離された細胞を、前記細胞の数が先行するステップa)における細胞の数と実質的に同等となるまで培養する。
本発明の一態様は、クロストリジウム神経毒に対して感受性を示す細胞の集団を進化させる方法を提供し、方法は、
(a)細胞の集団(好ましくは、組換え細胞の集団)をクロストリジウム神経毒と接触させるステップであって、前記集団が、
i.クロストリジウム神経毒によって切断可能である指標タンパク質、および
ii.クロストリジウム神経毒に対して結合親和性を有する受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体およびガングリオシド)
を発現する細胞を含むステップと、
(b)指標タンパク質の切断を示す細胞を同定するステップと、
(c)ステップb)で同定された細胞を単離するステップと、
(d)ステップa)～c)の反復を少なくとも1回実施するステップと
を含み、当該反復の先行回のステップc)において単離された細胞が、ステップa)のその後の反復における細胞の集団として提供され、
(e)随意により、ステップa)～c)の前記少なくとも1つの反復の前に(好ましくは、各反復の前に)、先行するステップc)において単離された細胞を、前記細胞の数が先行するステップa)における細胞の数と実質的に同等となるまで培養する。
(a)細胞の集団(好ましくは、組換え細胞の集団)をクロストリジウム神経毒と接触させるステップであって、前記集団が、
i.クロストリジウム神経毒によって切断可能である指標タンパク質、および
ii.クロストリジウム神経毒に対して結合親和性を有する受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体およびガングリオシド)
を発現する細胞を含むステップと、
(b)指標タンパク質の切断を示す細胞を同定するステップと、
(c)ステップb)で同定された細胞を単離するステップと、
(d)ステップa)～c)の反復を少なくとも1回実施するステップと
を含み、当該反復の先行回のステップc)において単離された細胞が、ステップa)のその後の反復における細胞の集団として提供され、
(e)随意により、ステップa)～c)の前記少なくとも1つの反復の前に(好ましくは、各反復の前に)、先行するステップc)において単離された細胞を、前記細胞の数が先行するステップa)における細胞の数と実質的に同等となるまで培養する。
「少なくとも1回の反復」あるいは「反復を少なくとも1回」という用語は、少なくとも1回、2回、3回、4回、5回または6回(好ましくは、少なくとも2回)の反復を意味する場合がある。一実施形態では、「少なくとも1回の反復」とは、1回、2回、3回、4回、5回または6回の反復、例えば、2回の反復を意味する。好ましくは、「少なくとも1回の反復」とは、1回の反復を意味する。
有利には、各反復の接触ステップの間、クロストリジウム神経毒の濃度は、それ以前の接触ステップにおいて(例えば、先行する反復において)使用されたクロストリジウム神経毒の濃度よりも低いものであり得る。これが選択圧をかけ、従って、クロストリジウム神経毒に対して特に高い感受性を有する細胞を選択する(例えば、濃縮する)。
一実施形態では、ステップ(a)の各反復で、細胞を、それらがそれ以前のステップ(a)の間(例えば、先行するステップ(a)の反復回の間)に接触したものよりも少ない(例えば、少なくとも2倍少ない、少なくとも5倍少ない、または少なくとも10倍少ない)クロストリジウム神経毒と接触させる。一実施形態では、前記少なくとも1回の反復において、細胞を、それらが先行するステップ(a)の間(例えば、先行するステップ(a)の反復回の間)に接触したものよりも少ないクロストリジウム神経毒と接触させる。
一実施形態では、前記少なくとも1回の反復において、細胞を、それらが先行するステップ(a)の間(例えば、ステップ(a)の先行する反復回の間)に接触したものよりも少なくとも2倍少ない、少なくとも5倍少ない、または少なくとも10倍少ないクロストリジウム神経毒と接触させる。好ましい実施形態では、前記少なくとも1回の反復において、細胞を、それらがそれ以前のステップ(a)の間(例えば、ステップ(a)の先行する反復回の間)に接触したものよりも少なくとも5倍少ないクロストリジウム神経毒と接触させる。
ある特定の実施形態では、このような接触は、クロストリジウム神経毒を含有する培地で細胞を培養することを含み得る。クロストリジウム神経毒は、通常、約0.0001～約100,000pM、0.0001～約10,000pM、約0.0001～約1,000pM、約0.0001～約500pM、約0.0001～約300pM、約0.0001～約100pM、約0.0001～約10pMまたは約0.0001～約1pMの濃度で培地中に存在する。このような培養は、例えば、約2時間以上、約4時間以上、約6時間以上、約12時間以上、約24時間以上、約36時間以上、約48時間以上、約60時間以上、約72時間以上、約84時間以上、約96時間以上、約108時間以上または約120時間以上の間であり得る。
一実施形態では、ステップa)(例えば、細胞の集団をクロストリジウム神経毒と接触させるステップまたは指標タンパク質を発現する組換え細胞をクロストリジウム神経毒と接触させるステップ)において、クロストリジウム神経毒は、約0.0001～約100,000pM、約0.0001～約50,000pM、約0.0001～約20,000pM、0.0001～約10,000pM、約0.0001～約1,000pM、約0.0001～約500pM、約0.0001～約300pM、約0.0001～約100pM、約0.0001～約10pMまたは約0.0001～約1pMの濃度で存在する。例えば、クロストリジウム神経毒は、約0.0001～約100,000pMの濃度で存在する。
好ましくは、ステップa)(例えば、細胞の集団をクロストリジウム神経毒と接触させるステップまたは指標タンパク質を発現する組換え細胞をクロストリジウム神経毒と接触させるステップ)におけるクロストリジウム神経毒濃度は以下のとおりに個別化される:
-0.0001～約100,000pM
-0.0001～約1,000pM
-約1～約500pM
-約45～約300pM
-約50～約250pM。
-0.0001～約100,000pM
-0.0001～約1,000pM
-約1～約500pM
-約45～約300pM
-約50～約250pM。
前記濃度は、好ましくは、ステップa)の第1の実施の間の(例えば、少なくとも1回の反復の前)濃度を指す。ステップa)の各反復における濃度は、例えば、1/2、1/5、1/10、好ましくは、約1/5に低減され得る。
ある特定の他の実施形態では、このような接触することは、ポリペプチドをコードする外因性核酸を細胞にトランスフェクトすること(例えば、一過性トランスフェクション)によってであり得る。
指標タンパク質の切断を示す細胞を選択するステップは、指標タンパク質の切断(以下にさらに論じられる)が生じたか否かを決定することを含む。このようなことは、当技術分野で公知の任意の手段によって達成され得る。例えば、全長指標タンパク質がその切断生成物に変換されたか否かを決定することが可能である任意の方法を使用できる。
ある特定の実施形態では、全長指標タンパク質は、細胞中で容易に分解されないが、その切断後に、得られた断片のうち1つは容易に分解される。これは、例えば、得られた断片のN末端側に、切断によって露出される場合にのみデグロンとして役立つ残基が存在することによる可能性がある。
このような実施形態では、指標タンパク質は、切断後により容易に分解されるその部分上で標識され得る。標識は、断片の分解が生じる場合に標識も分解されるように選択されるべきである。このような実施形態では、切断が生じるか否かおよびこのような切断のレベル(すなわち、切断されている指標タンパク質の量)を、標識からのシグナルを測定することに基づいて決定できる。
切断後に形成された別の断片が同様に容易には分解されないある特定のこのような実施形態では、指標タンパク質はまた、切断後にその断片を形成する指標タンパク質の部分上に標識を含み得る。したがって、このような実施形態では、切断が生じるか否かおよびこのような切断のレベルは、より容易に分解可能な断片上の標識からのシグナルを、対照として役立つあまり容易には分解可能ではない断片上の標識からのシグナルと比較することによって決定できる
一実施形態では、指標タンパク質は、C末端側標識を含み、C末端側標識は、クロストリジウムの不在下で指標タンパク質から放出(例えば、切断除去)されない。
一実施形態では、指標タンパク質はC末端側標識を含み、全長指標タンパク質は、細胞中で容易に分解されないが、その切断後に、得られたC末端側断片は容易に分解され、C末端側断片の分解は、C末端側標識の分解をもたらす。
一実施形態では、指標タンパク質は、C末端側標識を含み、全長指標タンパク質は、細胞中で容易に分解されないが、その切断後に、得られたC末端側断片は容易に分解され、C末端側断片の分解は、C末端側標識の分解をもたらし、指標タンパク質の切断は、細胞をクロストリジウム神経毒と接触させた後のC末端側標識からのシグナルを測定することによって決定され、好ましくは、クロストリジウム神経毒との接触の間またはその後の(例えば、ステップ(a)の間またはその後の)C末端側標識の減少は、指標タンパク質の切断を示す。
標識(複数可)からのシグナル(複数可)は、蛍光活性化細胞選別(FACS(登録商標))を使用して分析できる。例えば、全長指標タンパク質および切断後に形成されるそのN末端側断片が細胞内では容易に分解可能ではないが、切断から得られたC末端側断片は容易に分解可能である実施形態では、切断の成功後の細胞のFACS(登録商標)分析は、N末端側標識からの発光は切断前の発光から容易には変更されないままであるが、C末端側標識からの発光が低減されることを示す。対照的に、切断が生じない場合には、両標識からの発光は、容易に変化されないままであるべきである。
代替法では、細胞の蛍光顕微鏡写真を撮ることができる。上記のものなどの実施形態では、切断の成功は、プロテアーゼに曝露されていない対照細胞と比較して、細胞において発せられるより少ない緑色蛍光をもたらすであろう。対照的に、赤色蛍光は、対照と同一のままであるべきである。
また、ある特定の実施形態では、アッセイは、FRETアッセイであり得る。これまでに論じられたように、このようなアッセイでは、指標タンパク質は、N末端側標識およびC末端側標識を含み、一方の標識は、ドナー標識であり、もう一方は、アクセプター標識である。ドナー標識とアクセプター標識間のエネルギーの移動は、ドナー標識の蛍光強度の低減およびアクセプター標識の発光強度の増大をもたらす。このような移動の成功は、極めて接近したままである標識に依存する。指標タンパク質の切断は、これらの標識をより遠位にする傾向があり、したがって、このような移動は、あまり成功しない。したがって、切断の成功およびこのような切断のレベルは、エネルギーの移動が起こる能力の低減に基づいて決定できる。
上記に加えて、切断が生じたか否かおよびこのような切断のレベルを決定するために当技術分野で公知の任意の他の手段を、本発明の実施において使用できる。
ある特定の実施形態では、選択される細胞は、切断された指標タンパク質の量によって測定されるようなより高いレベルの切断を示す細胞である。例えば、ある特定の実施形態では、細胞中に存在する指標タンパク質の20%以上、50%以上、75%以上、80%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上または99%以上が切断生成物(複数可)に変換される細胞が選択される。
切断される(例えば、切断生成物(複数可)に変換される)指標タンパク質のパーセンテージは、ウエスタンブロット解析によって決定できる。本発明の方法は、指標タンパク質の20%以上、50%以上、75%以上、80%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上または99%以上(好ましくは、少なくとも20%)が切断されることを確認するステップを含む場合がある。
一実施形態では、クロストリジウム神経毒との接触後に、細胞を溶解し、得られた細胞溶解物を、切断生成物に結合する少なくとも1つの抗体(好ましくは、さらに、切断されていない形態の指標タンパク質に結合する抗体)と接触させ、ウエスタンブロットを実施して、例えば、指標タンパク質の20%以上、50%以上、75%以上、80%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上または99%以上(好ましくは、少なくとも20%)が切断されることを確認することができる。
細胞の選択は、選択された細胞を分離して、クロストリジウム神経毒に対する細胞の平均感受性が、最初の集団の細胞の平均感受性と比較して高い細胞の集団を形成することを含み得る。これは、当技術分野で公知の手段によって達成できる。例えば、細胞を分析するために使用されるフローサイトメトリー選別法も、切断が生じたか否かおよび/または測定された切断のレベル(ひいては、クロストリジウム神経毒に対する細胞の感受性)に基づいた細胞の選別をもたらすであろう。
ある特定の実施形態では、ステップ(a)および(b)が、ステップ(b)で選択された細胞を用いて少なくとも1回繰り返される。これらのステップを、クロストリジウム神経毒に対して所望の平均感受性を有する細胞の集団が作出されるまで必要なだけ何回も、例えば、2回以上繰り返すことができる。各反復を用いることで、ステップ(b)で選択された細胞は、クロストリジウム神経毒に対して増大した平均感受性を有するはずであるということが予想される。
ある特定の実施形態では、ステップ(a)が繰り返される場合、細胞をそれらがステップ(a)の当該反復の先行回の間に接触したものよりも少ないクロストリジウム神経毒(例えば、より低濃度のクロストリジウム神経毒)と接触させる。選択について、その先行する反復回において使用されたものと同一資格(例えば、指標タンパク質の20%以上が切断される細胞)がステップ(b)において使用されると過程すると、より低濃度のクロストリジウム神経毒に対する細胞の曝露後に選択された細胞は、曝露がより高いレベルのクロストリジウム神経毒に対してであった先行する反復回において選択された細胞と比較して、クロストリジウム神経毒に対する増大した平均感受性を有するはずである。
ある特定の実施形態では、ステップ(a)および(b)が繰り返される前に、ステップ(b)で選択された細胞を、例えば、最初の細胞の集団中に存在したおよその細胞の数まで増殖させる。これは当技術分野で公知の手段によって、例えば、細胞を培養することによって達成できる。
本発明の方法において使用される組換え細胞は、外因性指標タンパク質を発現するように遺伝子改変される。本明細書で使用される場合、「指標タンパク質」とは、SNAREタンパク質または野生型クロストリジウム神経毒によるタンパク質分解に対して感受性であるそのバリアントもしくは断片を含むタンパク質を指す。ある特定の実施形態では、バリアントは、SNAREタンパク質と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%または少なくとも95%の配列同一性を有し得る。SNAREタンパク質のアミノ酸配列を有する指標タンパク質の部分、またはそのバリアントもしくは断片は、本明細書において、指標タンパク質の「SNAREドメイン」と呼ばれる。
「タンパク質分解に対して感受性である」という用語は、タンパク質が、野生型クロストリジウム神経毒のプロテアーゼ成分によってタンパク質分解的に切断可能であることを意味する。言い換えれば、このようなタンパク質は、野生型クロストリジウム神経毒のプロテアーゼ成分によって認識および切断されることが可能となるプロテアーゼ認識および切断部位を含む。
これまでに記載されたように、本発明は、細胞が、全長形態では細胞中で容易に分解されないが、切断後に、得られた断片が細胞中で容易に分解される(例えば、N-デグロンの存在のために)指標タンパク質を発現するように改変される、Oyler et al.のU.S. Patent No. 8,940,482に記載されたものなどの実施形態を企図する。指標タンパク質は、容易に分解される断片を形成する部分で標識され、標識は断片とともに分解される。このような実施形態では、ポリペプチドの、細胞においてSNAREタンパク質を切断する能力は、細胞がクロストリジウム神経毒と接触した後の標識からのシグナルの存在(またはその欠如)によって決定できる。
切断がまた(上記の容易に分解可能な断片と比較して)比較的分解可能ではない断片をもたらすある特定のこのような実施形態では、指標タンパク質はまた、あまり容易に分解可能ではない断片を形成する部分で標識され得る。このような実施形態では、SNAREタンパク質の切断は、容易に分解可能な断片上の標識から得られたシグナルを、あまり容易には分解可能ではない断片上の標識からのシグナルと比較することによって決定できる。例えば、切断に起因するC末端側断片は容易に分解可能であるが、N末端側断片はあまり容易に分解可能ではない実施形態では、切断は、C末端側断片上の標識から得られたシグナルを、N末端側断片上の標識からのシグナルと比較することによって決定できる。N末端側断片上の標識からのシグナルが、C末端側断片からのシグナルよりも強い場合には、切断が生じている。このような実施形態では、互いにより明確に識別可能である(例えば、赤色と緑色または赤色とシアン)蛍光シグナルを発する標識が選択され得る。
「標識」という用語は、本明細書で使用される場合、検出可能なマーカーを意味し、例えば、放射性標識、抗体および/または蛍光標識を含む。試験指標タンパク質および/または切断生成物の量は、例えば、少なくとも2つの標識間のエネルギー共鳴移動に基づく方法、例えば、FRETアッセイ(以下にさらに論じられる)を含む、オートラジオグラフィーまたは分光法の方法によって決定できる。あるいは、ウエスタンブロットまたはELISAなどの免疫学的方法を、検出のために使用できる。
本発明の実施において使用できる標識の例として、放射性同位体、蛍光標識、リン光標識、発光標識および標識された結合パートナーに結合可能な化合物が挙げられる。蛍光標識の例として、黄色蛍光タンパク質(YFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、例えば、NeonGreen、赤色蛍光タンパク質(RFP)、例えば、mScarlet、シアン蛍光タンパク質(CFP)およびその蛍光発光突然変異体が挙げられる。発光標識の例として、発光タンパク質、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケおよびガウシア(Gaussia)ルシフェラーゼ、化学発光化合物および電気化学発光(ECL)化合物が挙げられる。発せられるシグナルが、互いにより容易に識別可能であるように、N末端側標識およびC末端側標識が選択される、上記で論じられるような実施形態では、このような標識対の例として、RFPおよびGFPおよびRFPおよびCFPを挙げることができる。例えば、mScarletなどのRFPは、N末端側標識として役立つ可能性があり、NeonGreenなどのGFPまたはCFPは、C末端側標識として役立つ可能性がある。
ある特定の実施形態では、標識は、タンパク質標識、例えば、抗体、蛍光タンパク質、発光タンパク質およびルシフェラーゼである。
本明細書で使用される場合、「N末端側標識」とは、タンパク質であるか否かに関わらず、クロストリジウム神経毒切断部位のN末端側である指標タンパク質の部分上に位置する標識を指し、「C末端側標識」とは、タンパク質であるか否かに関わらず、クロストリジウム神経毒切断部位のC末端側である指標タンパク質の部分上に位置する標識を指す。標識は、N末端側またはC末端側標識と呼ばれるべき指標タンパク質のN末端またはC末端である必要はない。むしろ、これらの用語は、クロストリジウム神経毒切断部位に対する標識の位置を指す。本発明のある特定の実施形態では、RFP、例えば、mScarletが、N末端側標識として使用され、GFP、例えば、NeonGreenまたはCFPが、C末端側標識として使用される。
本発明のある特定の実施形態では、指標タンパク質は、SNAREドメインおよび追加のドメイン(複数可)、例えば、標識ドメインを含む融合タンパク質である。標識ドメインは、タンパク質標識のアミノ酸配列を有し得る。このような融合タンパク質の一例は、N末端側標識ドメイン、例えば、mScarletのアミノ酸配列、SNAREドメイン、例えば、SNAP-25のアミノ酸配列およびC末端側標識ドメイン、例えば、NeonGreenのアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、指標タンパク質は、mScarletのアミノ酸配列およびNeonGreenのアミノ酸配列で標識される。
一実施形態では、指標タンパク質は、N末端側標識としてmScarletの、およびC末端側標識としてNeonGreenのアミノ酸配列で標識される。
一実施形態では、指標タンパク質の切断は、C末端側標識からのシグナルを測定することによって検出され、好ましくは、クロストリジウム神経毒との接触の間またはその後の(例えば、ステップ(a)の間またはその後の)C末端側標識の減少が、指標タンパク質の切断を示す。
本明細書において記載される方法は、指標タンパク質をコードする核酸を組換え細胞または細胞の集団(例えば、ステップaの)へ導入することを含み得る。
融合タンパク質はまた、他のドメイン、例えば、選択マーカー(以下にさらに論じられる)を含み得る。このような実施形態では、選択マーカードメインは、翻訳後に選択マーカーと指標タンパク質の残部の分離を可能にするように切断され得るリンカーによって、残りのドメイン(例えば、SNAREドメインおよび標識ドメイン(複数可))を含有する融合タンパク質部分から分離され得る。リンカーは、例えば、自己切断性である場合もある(例えば、2A自己切断性ペプチド)。
ある特定の実施形態では、より高いレベルの指標タンパク質の発現を有する組換え細胞が、本発明の方法において組換え細胞の最初の集団において使用するために選択される。このような細胞の選択は、当技術分野で公知の手段によって達成できる。例えば、指標タンパク質が標識される実施形態では、より大きな標識(複数可)からのシグナルを示す細胞を選択できる。これは、例えば、FACS(登録商標)を使用してこのような細胞を選別することによって達成できる。指標タンパク質の発現の増大した細胞を選択するために、このような選別を必要なだけ何回も繰り返すことができる。
ある特定の実施形態では、組換え細胞はまた、クロストリジウム神経毒に対して増大した感受性を有するように遺伝子改変される。これは、このような細胞でのクロストリジウム神経毒の受容体の発現を増大させることによって達成される。クロストリジウム神経毒の受容体は、タンパク質受容体および細胞膜ガングリオシドを含む。
ガングリオシドは、ラクトシルセラミド由来のオリゴグリコシルセラミドであり、シアル酸残基、例えば、N-アセチルノイラミン酸(Neu5Ac)、N-グリコリル-ノイラミン酸(Neu5Gc)または3-デオキシ-D-グリセロ-D-ガラクト-ノヌロソン酸(KDN)を含有する。ガングリオシドは、細胞表面上に存在し、濃縮され、セラミド部分の2つの炭化水素鎖が細胞膜中に包埋され、オリゴ糖は細胞外表面に位置し、そこでそれらは細胞外分子または隣接細胞の表面の認識点を提示する。ガングリオシドはまた、ウイルスに、および細菌毒素、例えば、クロストリジウム神経毒に特異的に結合する。
ガングリオシドは、M、D、TおよびQがそれぞれ、モノ-、ジ-、トリ-およびテトラシアロガングリオシドを指し、数字1、2、3などが、薄層クロマトグラフィーでのガングリオシドの泳動の順序を指す命名法システムによって定義される。例えば、モノシアロガングリオシドの泳動の順序は、GM3>GM2>GM1である。基本構造内の変動を示すために、さらなる用語が付加される、例えば、GM1a、GD1bなど。内部ガラクトースユニットに連結された0、1、2および3個のシアル酸残基を有するスフィンゴ糖脂質は、それぞれアシアロ-(または0-)、a-、b-およびc-シリーズガングリオシドと呼ばれ、一方で内部N-ガラクトサミン残基に連結されたシアル酸残基を有するガングリオシドは、a-シリーズガングリオシドとして分類される。0-、a-、b-およびc-シリーズのガングリオシドの生合成の経路は、例えば、Ledeen et al., Trends in Biochemical Sciences, 40: 407-418 (2015)に例示されるようにシアリルトランスフェラーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼの連続的な活性を含む。各シリーズの、炭水化物鎖中の異なる位置でのさらなるシアル化が起こる場合があり、ますます複雑な、不均一な範囲の生成物、例えば、内部N-アセチルガラクトサミン残基に連結されたシアル酸残基(複数可)を有するa-シリーズガングリオシドをもたらす。ガングリオシドは、小胞形成を含む輸送システムによって細胞膜の外部リーフレットに移動される。
これまでに、脊椎動物組織において200近くのガングリオシドが同定されている。共通ガングリオシドとして、GM1、GM2、GM3、GD1a、GD1b、GD2、GD3、GT1b、GT3およびGQ1が挙げられる。
一実施形態では、クロストリジウム神経毒は、ボツリヌス神経毒(例えば、BoNT)である。クロストリジウム神経毒は、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/GおよびBoNT/Hから選択され得る。例えば、クロストリジウム神経毒は、BoNT/Aであり得る。クロストリジウム神経毒は、BoNT/Eであり得る。
クロストリジウム神経毒は、ガングリオシドのHCCドメイン中に2つの独立した結合領域およびニューロンタンパク質受容体を有する。BoNT/A、BoNT/B、BoNT/E、BoNT/FおよびBoNT/Gは、「E(Q)...H(K)...SXWY...G」モチーフから構成されるHCCドメイン中に保存されたガングリオシド結合部位を有するが、BoNT/CおよびBoNT/Dは、2つの独立したガングリオシド結合部位を示す。Lam et al., Progress in Biophysics and Molecular Biology, 117:225-231 (2015)。ほとんどのBoNTは、オリゴ糖コアのGal4に付着された、2,3-連結されたN-アセチルノイラミン酸残基(Sia5と表される)を有するガングリオシドにのみ結合するが、TeNT上の対応するガングリオシド結合ポケットはまた、GM1a、Sia5糖残基を欠くガングリオシドにも結合できる。BoNT/Dは、GM1aおよびGD1aに結合するとわかっている。Kroken et al., Journal of Biological Chemistry, 286:26828-26837 (2011)を参照されたい。ガングリオシド欠損マウス由来のデータおよび生化学アッセイを組み合わせると、BoNT/A、BoNT/E、BoNT/FおよびBoNT/Gは、GD1aおよびGT1b中に存在する末端NAcGal-Gal-NAcNeu部分に優先を示すが、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/DおよびTeNTは、GD1b、GT1bおよびGQ1b中に見られるジシアリルモチーフを必要とする。したがって、大量の複雑なポリシアロガングリオシド、例えば、GD1a、GD1bおよびGT1bが、中毒の第1のステップとして神経細胞の表面にすべてのBoNT血清型およびTeNTを特異的に蓄積するために不可欠であると思われる。Rummel, Andreas, “Double receptor anchorage of botulinum neurotoxins accounts for their exquisite neurospecificity,” Botulinum Neurotoxins, Springer Berlin Heidelberg (2012) 61-90を参照されたい。
上記を考慮して、本発明のある特定の実施形態では、細胞は、ガングリオシドを発現または過剰発現するように遺伝子改変される。特定の実施形態では、細胞は、GM1a、GD1a、GD1b、GT1bおよび/またはGQ1bを発現または過剰発現するように遺伝子改変される。ある特定の実施形態では、細胞は、GD1a、GD1bおよび/またはGT1bを発現または過剰発現するように改変されている。ある特定の実施形態では、細胞は、GD1bおよび/またはGT1bを発現または過剰発現するように改変されている。
一実施形態では、ガングリオシドは、GM1a、GD1a、GD1b、GT1bおよびGQ1bから選択され、好ましくは、細胞(例えば、ステップaの)は、GM1a、GD1a、GD1b、GT1bおよび/またはGQ1bを発現または過剰発現するように遺伝子改変されている。
一実施形態では、ガングリオシドは、GD1a、GD1bおよびGT1bから選択され、好ましくは、細胞(例えば、ステップa)の)は、GD1a、GD1bおよび/またはGT1bを発現または過剰発現するように遺伝子改変されている。
一実施形態では、ガングリオシドは、GD1bおよびGT1bから選択され、好ましくは、細胞(例えば、ステップa)の)は、GD1bおよび/またはGT1bを発現または過剰発現するように遺伝子改変されている。
ステップa)の細胞は、ガングリオシド合成経路の酵素(またはこのような酵素の触媒活性を有するそのバリアントもしくは断片)をコードする外因性核酸を含み得る。
ガングリオシドは、セラミドから出発して合成される。セラミドから、ある経路は、グルコシルセラミドシンターゼによってグルコースユニットを付加してグルコシルセラミド(GlcCer)を形成することを含む。β1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼI(GalT-I)は、次いで、GlcCerへのガラクトースユニットの付加を触媒して、ラクトシルセラミド(LacCer)を形成する。LacCerから、GalNAc-トランスフェラーゼ(GalNAcT)がN-アセチルガラクトサミンを付加して、GA1を形成する場合もあり、GM3シンターゼが、シアル酸を付加してGM3を形成する場合もある。GM3から、GD3シンターゼによるさらなるシアル酸の付加によってGD3が形成され得る。GT3シンターゼによるなおさらなるシアル酸の付加によって、GD3からGT3が形成され得る。別個の経路では、ガラクトースユニットは、ガラクトシルセラミドシンターゼによってLacCerに付加されて、ガラクトシルセラミド(GalCer)を形成する。次いで、GM4シンターゼによってさらなる炭水化物基が付加されて、GM4を形成する。次いで、GM3、GD3およびGT3は修飾されて、それぞれ「a」、「b」または「c」シリーズのより複雑なガングリオシドを形成し得る。このような反応は、GalNAcT、β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼII(GalT-II)、α2,3-シアリルトランスフェラーゼIV(ST-IV)またはα2,8-シアリルトランスフェラーゼV(ST-V)によって触媒される。例えば、GD3から、「b」シリーズガングリオシドGD1b、GT1bおよびGQ1bが形成される。
したがって、本発明の細胞は、ガングリオシドにつながる生合成経路の酵素を発現または過剰発現するように改変されることによって、所望のガングリオシドを発現または過剰発現するように改変され得る。例えば、細胞は、このような酵素をコードする外因性核酸を含有するように改変され得る(すなわち、トランスフェクションによって)。したがって、ある特定の実施形態では、細胞は、グルコシルセラミドシンターゼ、GalT-I、GalNAcT、GM3シンターゼ、GD3シンターゼ、GT3シンターゼ、ガラクトシルセラミドシンターゼ、GM4シンターゼ、GalT-II、ST-IVおよび/またはST-Vを発現または過剰発現するように改変されている。
ステップa)の細胞は、グルコシルセラミドシンターゼ、GalT-I、GalNAcT、GM3シンターゼ、GD3シンターゼ、GT3シンターゼ、ガラクトシルセラミドシンターゼ、GM4シンターゼ、GalT-II、ST-IVまたはST-Vまたはこのような酵素の触媒活性を有するそのバリアントもしくは断片、好ましくは、GD3シンターゼまたはGD3シンターゼの触媒活性を有するそのバリアントもしくは断片、より好ましくは、GD3シンターゼをコードする外因性核酸を含み得る。
一実施形態では、細胞(例えば、ステップa)の)は、前記核酸を欠く(好ましくは、前記外因性核酸を欠く)細胞と比較した場合に、より多くの受容体および/またはガングリオシドを発現する(例えば、ガングリオシド合成経路の酵素またはこのような酵素の触媒活性を有するそのバリアントもしくは断片を介して)。
当業者ならば、その所望の触媒活性を保持するこのような酵素のバリアントまたは断片が、目的のガングリオシドの合成において役割を果たし得るということを理解するであろう。したがって、ある特定の実施形態では、細胞は、その酵素の能力を保持するガングリオシド合成経路の酵素のバリアントまたは断片を発現または過剰発現するように遺伝子改変されている。例えば、ある特定の実施形態では、細胞は、セラミドにグルコースを付加する能力を有するグルコシルセラミドシンターゼのバリアントまたは断片、GlcCerにガラクトースユニットを付加する能力を有するGalT-Iのバリアントもしくは断片、LacCerにN-アセチルガラクトサミンを付加する能力を有するGalNAcTのバリアントもしくは断片、LacCerにシアル酸を付加する能力を有するGM3シンターゼのバリアントもしくは断片、GM3にシアル酸を付加する能力を有するGD3シンターゼのバリアントもしくは断片、GD3にシアル酸を付加する能力を有するGT3シンターゼのバリアントもしくは断片、LacCerにガラクトースユニットを付加する能力を有するガラクトシルセラミドシンターゼのバリアントもしくは断片および/またはGalCerに炭水化物基を付加する能力を有するGM4シンターゼのバリアントを発現または過剰発現するように遺伝子改変されている。
ある特定の実施形態では、バリアントは、ガングリオシドにつながる生合成経路の酵素のものと、少なくとも80%、85%、90%、95%、98%または99%の配列同一性を有し、このような酵素の所望の触媒活性を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質である。ある特定のこのような実施形態では、バリアントは、グルコシルセラミドシンターゼ、GalT-I、LacCer、GalNAcT、GD3シンターゼ、GT3シンターゼ、ガラクトシルセラミド、GM4シンターゼ、GalT-II、ST-IVおよび/またはST-Vと少なくとも80%、85%、90%、95%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、その酵素の所望の触媒活性を保持するタンパク質である。
断片は、例えば、50個以下のアミノ酸、40個以下のアミノ酸、30個以下のアミノ酸、20個以下のアミノ酸または10個以下のアミノ酸を有し得る。
どのバリアントまたは断片が、所望の触媒活性を有するかを決定するために使用できるアッセイは、当技術分野で公知である。例えば、当業者は、GD3シンターゼのバリアントまたは断片が、GM3にシアル酸を付加する能力を有するか否かを決定するために使用できるアッセイを承知しているであろう。
当業者ならば、上記の酵素はまた、当技術分野で公知である保存的置換によって上記の外因性核酸とは異なる核酸によってコードされ得るということを理解するであろう。当業者ならばまた、酵素のバリアントは、例えば、野生型酵素をコードする核酸と、少なくとも80%、85%、90%、95%、98%または99%の配列同一性を有する核酸によってコードされ得るということを理解するであろう。したがって、本発明はまた、上記の酵素のうち1つをコードする核酸および/または保存的置換によってのみこのような酵素をコードする野生型核酸とは異なる核酸と、少なくとも80%、85%、90%、95%、98%または99%の配列同一性を有する外因性核酸を含有するように遺伝子改変されている細胞を企図し、コードされるタンパク質は、野生型酵素または野生型酵素の触媒活性を保持するバリアントである。
ある特定の実施形態では、細胞は、所望のガングリオシドの生合成において律速段階であると決定されているものを触媒するために役立つ酵素、またはこのような酵素の所望の触媒活性を有するそのバリアントもしくは断片を発現または過剰発現するように改変される。例えば、GD3シンターゼは、「b」シリーズガングリオシドの生合成における律速段階、具体的には、GM3へのシアル酸の付加を触媒する酵素である。したがって、GD1b、GT1bおよび/またはGQ1bの発現または過剰発現が望まれる実施形態では、細胞は、GM3にシアル酸を付加する能力を有するGD3シンターゼまたはそのバリアントもしくは断片を発現または過剰発現するように改変される。
例えば、細胞は、GD3シンターゼをコードする核酸または上記のように、このような核酸と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%もしくは99%の配列同一性を有する核酸、例えば、その触媒活性を保持するGD3シンターゼのバリアントをコードするものまたは保存的置換においてのみ野生型GD3シンターゼと異なっているものを用いてトランスフェクトされ得る。
細胞へのある特定のクロストリジウム神経毒の結合はまた、タンパク質受容体への結合に依存するものであり得る。BoNT/A、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/FおよびTeNTは、シナプス小胞タンパク質2(SV2)に結合し、BoNT/Aは、その3つのアイソフォームすべて(SV2A、SV2BおよびSV2C)に結合可能であり、BoNT/Eは、SV2AおよびSV2Bアイソフォームのみに結合可能である。BoNT/BおよびBoNT/Gは、シナプトタグミンの両アイソフォーム(IおよびII)に結合する。シナプトタグミンおよびSV2は、シナプス小胞上に局在し、小胞がシナプス前膜と融合すると、細胞外間隙に露出されるようになる。クロストリジウム神経毒がそのタンパク質受容体に結合するのは、この期間の間である。
したがって、本発明の細胞は、所望のタンパク質受容体、例えば、SV2(例えば、SV2A、SV2BおよびSV2C)またはシナプトタグミン(例えば、シナプトタグミンIおよびシナプトタグミンII)を発現または過剰発現するように改変され得る。例えば、細胞は、このようなタンパク質受容体をコードする外因性核酸を含有するように改変され得る(例えば、トランスフェクションによって)。
一実施形態では、受容体は、SV2(例えば、SV2A、SV2BおよびSV2C)またはシナプトタグミン(例えば、シナプトタグミンIおよびシナプトタグミンII)またはクロストリジウム神経毒に結合する能力を有するそのバリアントまたは断片である。一実施形態では、受容体は、SV2(またはクロストリジウム神経毒に結合する能力を有するそのバリアントもしくは断片)である。受容体は、SV2AまたはSV2C、好ましくは、SV2A(またはクロストリジウム神経毒に結合する能力を有するそのバリアントもしくは断片)であり得る。一実施形態では、受容体は、SV2AまたはSV2Cの第4の管腔ドメインである。
本発明はまた、このようなタンパク質受容体とは異なるが、依然として、クロストリジウム神経毒に結合する能力を保持するタンパク質を企図する。このようなタンパク質は、クロストリジウム神経毒に結合する受容体の能力を保持するこのようなタンパク質受容体のバリアントもしくは断片であり得る。したがって、ある特定の実施形態では、細胞は、BoNT/A、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/Fおよび/またはTeNTに結合するSV2のバリアントまたは断片を発現または過剰発現するように改変されている。また、ある特定の実施形態では、細胞は、BoNT/Bおよび/またはBoNT/Gに結合するシナプトタグミンのバリアントまたは断片を発現または過剰発現するように改変されている。
ある特定の実施形態では、バリアントは、クロストリジウム神経毒に結合するタンパク質受容体のものと、少なくとも80%、85%、90%、95%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。ある特定のこのような実施形態では、バリアントは、SV2(例えば、SV2A(配列番号8)、SV2B(配列番号9)およびSV2C(配列番号10))またはシナプトタグミン(例えば、シナプトタグミンI(配列番号14)およびシナプトタグミンII(配列番号15))と、少なくとも80%、85%、90%、95%、98%または99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。
断片は、例えば、50個以下のアミノ酸、40個以下のアミノ酸、30個以下のアミノ酸、20個以下のアミノ酸または10個以下のアミノ酸を有し得る。
ある特定の実施形態では、バリアントまたは断片は、神経毒に結合する野生型タンパク質受容体のドメインを含む。例えば、バリアントまたは断片は、野生型SV2(例えば、SV2A、SV2BおよびSV2C)または野生型シナプトタグミン(例えば、シナプトタグミンIおよびシナプトタグミンII)の管腔ドメイン(複数可)を含み得る。ある特定のこのような実施形態では、バリアントもしくは断片は、野生型SV2の第4の管腔ドメイン、例えば、SV2Aの第4の管腔ドメイン(配列番号11)、SV2Bの第4の管腔ドメイン(配列番号12)またはSV2Cの第4の管腔ドメイン(配列番号13)を含み得る。
どのバリアントまたは断片が、所望のクロストリジウム神経毒結合活性を有するかを決定するために使用できるアッセイは、当技術分野で公知である。例えば、当業者は、アッセイを、SV2Cのバリアントまたは断片がBoNT/Aに結合する能力を有するか否かを決定するために使用できることを承知しているであろう。
当業者ならば、上記の酵素はまた、当技術分野で公知である保存的置換によって上記の外因性核酸とは異なる核酸によってコードされ得るということを理解するであろう。当業者ならばまた、タンパク質受容体のバリアントは、例えば、野生型タンパク質受容体をコードする核酸と、少なくとも80%、85%、90%、95%、98%または99%の配列同一性を有する核酸によってコードされ得るということを理解するであろう。したがって、本発明はまた、上記のタンパク質受容体のうち1つをコードする核酸および/または保存的置換によってのみこのようなタンパク質受容体をコードする野生型核酸とは異なる核酸と、少なくとも80%、85%、90%、95%、98%または99%の配列同一性を有する外因性核酸を含有するように遺伝子改変されている細胞を企図し、コードされるタンパク質は、野生型タンパク質受容体またはクロストリジウム神経毒に結合する能力を保持するバリアントである。
SV2Cは、BoNT/Aに対して最も感受性である。そのようなものとして、BoNT/Aに対する感受性が望まれるある特定の実施形態では、細胞は、SV2CまたはBoNT/Aに結合可能であるそのバリアントもしくは断片を発現または過剰発現するように遺伝子改変される。しかし、SV2Cは、BoNT/Eには結合せず、それは代わりに、SV2AおよびSV2Bに結合する。そのようなものとして、BoNT/Eに対する感受性が望まれるある特定の実施形態では、細胞は、SV2Aおよび/またはSV2BまたはBoNT/Eに結合可能であるそのバリアントもしくは断片を発現または過剰発現するように遺伝子改変される。
本発明は、細胞は、2つ以上のタンパク質受容体、ガングリオシド合成経路の2つ以上の酵素またはガングリオシド合成経路のタンパク質受容体(複数可)および酵素(複数可)を発現または過剰発現するように改変され得るということを企図する。例えば、細胞は、SV2AおよびSV2Cを発現または過剰発現するように改変され得る。このような細胞は、例えば、BoNT/AおよびBoNT/Eに対して増大された感受性を有し得る。また、細胞は、GD3シンターゼならびにSV2Aおよび/またはSV2Cを発現または過剰発現するように改変され得る。
さらに、キメラ受容体は、神経毒に結合可能であるということが知られている。例えば、別の受容体、例えば、LDL受容体の膜貫通ドメインに融合された神経毒(例えば、SV2の第4の管腔ドメイン)に結合する上記のタンパク質受容体のドメインを含むキメラ受容体は、BoNTに結合し、細胞へのその内部移行を可能にすると知られている。したがって、本発明はまた、細胞をこのようなキメラ受容体を発現するように改変することを企図する。
本発明において使用される細胞は、上記のような、ガングリオシドおよび/またはタンパク質受容体を発現可能な任意の細胞、原核生物のものまたは真核生物のものであり得る。このような細胞の例として、神経細胞、神経内分泌細胞(例えば、PC12)、胚性腎臓細胞(例えば、HEK293細胞)、乳癌細胞(例えば、MC7)、神経芽細胞腫細胞(例えば、Neuro2a(N2a)、M17、IMR-32、N18およびLA-N-2細胞)および神経芽細胞腫-神経膠腫ハイブリッド細胞(例えば、NG108細胞)が挙げられる。ある特定の実施形態では、細胞は、神経芽細胞腫または神経芽細胞腫-神経膠腫細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、NG108、M17またはIMR-32細胞である。特定の実施形態では、細胞は、NG108細胞である。
本発明はまた、幾分か、上記の組換え細胞を作製する方法に関する。
方法は、細胞に、指標タンパク質をコードする外因性核酸を導入することを含む。当業者ならば、外因性指標タンパク質(複数可)を発現させるためにどの核酸が使用されるべきであるかを承知しているであろう。このような核酸の一例として、配列番号1があり、これは、N末端側標識としてmScarlet、SNAREドメインとしてSNAP-25、C末端側標識としてNeonGreen、追加の標識ドメインとしてルシフェラーゼ、選択マーカーとしてピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼおよび2A自己切断性ペプチドを有する融合タンパク質を発現する。このような核酸の別の例として配列番号2があり、これは、N末端側標識としてmScarlet、SNAREドメインとしてSNAP-25、C末端側標識としてCFP、追加の標識ドメインとしてルシフェラーゼ、選択マーカーとしてピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼおよび2A自己切断性ペプチドを有する融合タンパク質を発現する。
さらに、目的の追加のタンパク質(複数可)をコードする核酸(複数可)を細胞に導入できる。例えば、核酸(複数可)は、クロストリジウム神経毒受容体もしくはクロストリジウム神経毒に結合する能力を有するそのバリアントもしくは断片および/またはガングリオシド合成経路の酵素もしくはこのような酵素の触媒活性を有するそのバリアントもしくは断片をコードし得る。
ある特定の実施形態では、方法は、細胞にこのような核酸(複数可)を形質転換することを含む。このような形質転換は、トランスフェクションによってであり得る。
ある特定の実施形態では、核酸は、2つ以上のドメインを含む融合タンパク質をコードし、各ドメインは、目的のタンパク質(例えば、指標タンパク質、クロストリジウム神経毒受容体もしくはそのバリアントもしくは断片またはガングリオシド合成経路の酵素もしくはそのバリアントもしくは断片)のアミノ酸配列を有する。例えば、核酸は、タンパク質受容体(例えば、SV2AまたはSV2C)のアミノ酸配列およびガングリオシド合成経路の酵素(例えば、GD3シンターゼ)のアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードし得る。別の例では、核酸は、タンパク質受容体のアミノ酸配列、ガングリオシド合成経路の酵素のアミノ酸配列および選択マーカーのアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードし得る。さらに別の例では、核酸は、タンパク質受容体のアミノ酸配列、ガングリオシド合成経路の酵素のアミノ酸配列、指標タンパク質のアミノ酸配列および選択マーカーのアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードし得る。
このような実施形態では、ドメインは、リンカーによって互いに分離され得る。リンカーは、例えば、細胞中で酵素によって切断可能であるか、または自己切断性ペプチド(例えば、2A自己切断性ペプチド)を含有し、個々のドメインが細胞中で別個のタンパク質を形成することを可能にし得る。
核酸は、随意により、調節エレメントを含み得る。「調節エレメント」という用語は、本明細書で使用される場合、転写および翻訳を含む遺伝子発現の調節エレメントを指し、TATAボックス、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、シャイン・ダルガノ配列、IRES領域、ポリアデニル化シグナル、末端キャップ構造などといったエレメントを含む。調節エレメントは、1つ以上の異種調節エレメントまたは1つ以上の相同調節エレメントを含み得る。「相同調節エレメント」とは、核酸分子が由来する野生型細胞の調節エレメントであり、野生型細胞において核酸分子またはポリペプチドの遺伝子発現の調節に関与する。「異種調節エレメント」は、野生型細胞において核酸分子またはポリペプチドの遺伝子発現の調節に関与しない調節エレメントである。誘導性発現の調節エレメント、例えば、誘導プロモーターも使用され得る。
核酸分子は、例えば、hnRNA、mRNA、RNA、DNA、PNA、LNAおよび/または修飾された核酸分子であり得る。核酸分子は、環状、線状である場合があり、ゲノム中に組み込まれるか、またはエピソーム性であり得る。また、3、4、5、6、7、8、9または10のポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする鎖状体が包含される。さらに、核酸分子は、細胞内輸送のためのシグナル配列、例えば、細胞内コンパートメント中への輸送のための、または細胞膜を越える輸送のためのシグナルをコードする配列を含有し得る。
核酸は、宿主細胞において高レベルの発現を提供するように設計され得る。宿主細胞においてタンパク質発現を増大するように核酸分子を設計する方法は、当技術分野で公知であり、コードする核酸配列において「遅いコドン」の頻度(出現数)を減少させることを含む。
核酸は、当技術分野で公知の任意の手段を使用して導入され得る。例えば、核酸を細胞中に導入するために使用されるベクター(例えば、プラスミド)中に含まれ得る。
細胞において核酸の発現を可能にするために当技術分野で公知の任意のベクターを使用できる。ベクターは、目的のタンパク質のin vitroおよび/またはin vivo発現に適したものであり得る。ベクターは、一過性のおよび/または安定した遺伝子発現のためのベクターであり得る。ベクターは、調節エレメントおよび/または選択マーカーをさらに含み得る。ベクターは、例えば、人工的なもの、またはウイルス起源のもの、ファージ起源のもの、または細菌起源のものであり得る。本発明における使用のためのベクターの例として、アデノウイルスベクター、ワクシニアベクター、SV-40ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、λ-誘導体およびプラスミドが挙げられる。本発明における使用のためのプラスミドの例として、pD2500またはpcDNA3.1骨格を有するプラスミドが挙げられる。
細胞中に核酸を導入するためにベクターを使用する方法は、当技術分野で公知である。Laura Bonetta, “The Inside Scoop - Evaluating Gene Delivery Methods,” Nature Methods 2: 875-883 (2005)を参照されたい。
宿主細胞は、目的のタンパク質の発現の誘導物質を含み得る。このような発現の誘導物質は、核酸分子またはポリペプチドまたは小さい化学実体を含む化学実体であり得る。発現の誘導物質は、例えば、目的のタンパク質をコードする核酸分子の転写または翻訳を増大し得る。誘導物質は、例えば、当業者に公知の組換え手段によって発現され得る。あるいは、誘導物質は、細胞、例えば、クロストリジウム細胞から単離され得る。
ある特定の実施形態では、成功裏に形質転換されている細胞を、選択マーカーの存在を決定することによって決定できる。このような実施形態では、所望のタンパク質をコードする外因性核酸を含有するベクターはまた、選択マーカーをコードする核酸も含有し得る。
ある特定の実施形態では、選択マーカーは、検出可能なタグである。このようなタグの例として、Hisタグ、GSTタグ、StrepタグおよびSBPタグが挙げられる。タグは、目的のタンパク質も含む融合タンパク質の一部として発現され得る。このような実施形態では、タグは、1つ以上のプロテアーゼ切断部位または自己切断性ペプチドと隣接し得る。このようなことが、タグが翻訳後にタンパク質から切断されることを可能にする。
ある特定の他の実施形態では、選択マーカーは、抗生物質に対する耐性を付与する。このような選択マーカーの例として、ピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼ(ピューロマイシンに対する耐性)、アミノグリコシド3’f3-ホスホトランスフェラーゼ(G418に対する耐性)、ブラストサイジンSデアミナーゼ(ブラストサイジンSに対する耐性)およびハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ(ハイグロマイシンBに対する耐性)が挙げられる。したがって、細胞の形質転換の成功は、細胞を関連抗生物質に曝露することによって決定できる。
ある特定の実施形態では、ガングリオシドおよび/またはクロストリジウム神経毒に結合するタンパク質受容体を発現または過剰発現するように遺伝子改変される細胞の形質転換の成功は、このような細胞をクロストリジウム神経毒と接触させることおよびその中で指標タンパク質の切断が生じたか否かを決定することによって決定できる。
本発明はまた、幾分か、上記の方法を使用して生成された集団に由来する細胞に関する。これまでに論じたように、本発明の細胞は、ポリペプチド(例えば、修飾または組換えクロストリジウム神経毒)の活性を決定するアッセイにおいて使用され得る。このようなアッセイは、細胞をポリペプチドと、細胞において野生型クロストリジウム神経毒のプロテアーゼドメインが指標タンパク質を切断することを可能にするのに十分である条件下および時間の間接触させること、ならびに指標タンパク質の切断が生じたか否かを決定することを含む。
さらに、本発明は、治療的/美容的使用のためのクロストリジウム神経毒のバッチの活性を試験/評価する方法を包含する。このような方法は、有利なことに、保存の間の毒素活性モニタリングおよび活性を経時的に追跡することにおいて有用性を見出す。さらなる利点は、最適保存条件(例えば、活性レベルを下げない)を決定する能力である。方法は、組換えクロストリジウム神経毒の活性(例えば、細胞結合/SNARE切断能)を特性決定するために特に有利である。
本発明の別の態様は、クロストリジウム神経毒製剤の活性を特性決定する、または治療的(および/または美容的)使用のためのクロストリジウム神経毒製剤を同定するin vitro法に関し、前記方法は、
a.上記の本発明の方法(例えば、クロストリジウム神経毒に対して高度に感受性である細胞の集団を作製する方法またはクロストリジウム神経毒に対して感受性を示す細胞の集団を進化させる方法)によって調製された細胞集団を提供することと、
b.前記細胞集団をクロストリジウム神経毒製剤と接触させることと、
c.クロストリジウム神経毒製剤との接触後の指標タンパク質の切断のレベルを、クロストリジウム神経毒製剤との接触前の切断のレベルと比較することと、
d.(i)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが増大される場合に、クロストリジウム神経毒製剤を治療的(および/または美容的)使用に適していると同定することもしくは(ii)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが増大される場合に、活性の存在を同定すること、または
e.(i)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが増大されない場合に、クロストリジウム神経毒製剤を治療的(および/または美容的)使用に適していないと同定することもしくは(ii)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが増大されない場合に、活性の非存在を同定することと
を含む。
a.上記の本発明の方法(例えば、クロストリジウム神経毒に対して高度に感受性である細胞の集団を作製する方法またはクロストリジウム神経毒に対して感受性を示す細胞の集団を進化させる方法)によって調製された細胞集団を提供することと、
b.前記細胞集団をクロストリジウム神経毒製剤と接触させることと、
c.クロストリジウム神経毒製剤との接触後の指標タンパク質の切断のレベルを、クロストリジウム神経毒製剤との接触前の切断のレベルと比較することと、
d.(i)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが増大される場合に、クロストリジウム神経毒製剤を治療的(および/または美容的)使用に適していると同定することもしくは(ii)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが増大される場合に、活性の存在を同定すること、または
e.(i)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが増大されない場合に、クロストリジウム神経毒製剤を治療的(および/または美容的)使用に適していないと同定することもしくは(ii)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが増大されない場合に、活性の非存在を同定することと
を含む。
本発明の別の態様は、クロストリジウム神経毒製剤の活性を特性決定する、または治療的(および/または美容的)使用に適しているクロストリジウム神経毒製剤を同定するin vitro法を提供し、前記方法は、
a.上記の本発明の方法(例えば、クロストリジウム神経毒に対して高度に感受性である細胞の集団を作製する方法またはクロストリジウム神経毒に対して感受性を示す細胞の集団を進化させる方法)によって調製された細胞集団を提供することと、
b.前記細胞をクロストリジウム神経毒製剤と接触させることと、
c.クロストリジウム神経毒製剤との接触後の指標タンパク質の切断のレベルを、対照クロストリジウム神経毒製剤との接触後の切断のレベルと比較することと、
d.(i)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが、対照クロストリジウム神経毒製剤との接触後の切断のレベルに対して増大されるか、もしくは同等である場合に、クロストリジウム神経毒製剤を治療的(および/または美容的)使用に適していると同定することもしくは(ii)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが、対照クロストリジウム神経毒製剤との接触後の切断のレベルに対して増大されるか、もしくは同等である場合に、活性の存在を同定すること、または
e.(i)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが対照クロストリジウム神経毒製剤との接触後の切断のレベルに対して増大されないか、もしくは同等である場合に、クロストリジウム神経毒を治療的(および/または美容的)使用に適していないと同定することもしくは(ii)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが対照クロストリジウム神経毒製剤との接触後の切断のレベルに対して増大されないか、もしくは同等ではない場合に、活性の非存在を同定することと
を含む。
a.上記の本発明の方法(例えば、クロストリジウム神経毒に対して高度に感受性である細胞の集団を作製する方法またはクロストリジウム神経毒に対して感受性を示す細胞の集団を進化させる方法)によって調製された細胞集団を提供することと、
b.前記細胞をクロストリジウム神経毒製剤と接触させることと、
c.クロストリジウム神経毒製剤との接触後の指標タンパク質の切断のレベルを、対照クロストリジウム神経毒製剤との接触後の切断のレベルと比較することと、
d.(i)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが、対照クロストリジウム神経毒製剤との接触後の切断のレベルに対して増大されるか、もしくは同等である場合に、クロストリジウム神経毒製剤を治療的(および/または美容的)使用に適していると同定することもしくは(ii)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが、対照クロストリジウム神経毒製剤との接触後の切断のレベルに対して増大されるか、もしくは同等である場合に、活性の存在を同定すること、または
e.(i)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが対照クロストリジウム神経毒製剤との接触後の切断のレベルに対して増大されないか、もしくは同等である場合に、クロストリジウム神経毒を治療的(および/または美容的)使用に適していないと同定することもしくは(ii)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが対照クロストリジウム神経毒製剤との接触後の切断のレベルに対して増大されないか、もしくは同等ではない場合に、活性の非存在を同定することと
を含む。
細胞をポリペプチドと接触させることは、ポリペプチドを含む培地で細胞を培養することによって達成できる。ポリペプチドは、例えば、約0.0001nM～約1,000nM、約0.0001nM～約100nM、約0.0001nM～約10nM、約0.0001nM～約1nM、約0.0001nM～約0.1nM、約0.0001nM～約0.01nMまたは約0.0001nM～約0.001nMの濃度で培地中に存在し得る。細胞は、例えば、最大120時間、最大96時間、最大72時間、最大48時間、最大24時間、最大12時間または最大6時間の間培養され得る。
切断が生じたか否かについて決定することは、これまでに記載された方法を使用して(例えば、標識された指標タンパク質を使用して、得られた容易に分解可能な断片上の標識からのシグナルを測定して)行うことができる。アッセイ後の細胞の生存力が重要ではない場合には、切断を決定する追加の方法は、当技術分野で周知である。例えば、細胞をポリペプチドと接触させた後に、細胞を溶解し、ゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングによって分析できる。例えば、SNAP-25のN末端側に結合する抗SNAP-25抗体を、全長SNAP-25および切断されたSNAP-25(全長SNAP-25とは別個のバンドで移動する)の存在を決定するためにウエスタンブロットにおいて使用できる。
ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、指標タンパク質の20%超、50%超、75%超、80%超、90%超、95%超、97%超、98%超または99%超が切断生成物(複数可)に変換される場合に、タンパク質分解活性であると思われる。
切断は、触媒活性を経時的にたどるために間隔を置いて測定され得る。
一実施形態では、細胞(例えば、ステップaの)は、神経細胞、非神経細胞、神経内分泌細胞、胚性腎臓細胞、乳癌細胞、神経芽細胞腫細胞または神経芽細胞腫-神経膠腫ハイブリッド細胞、好ましくは、非神経細胞である。例えば、細胞(例えば、ステップaの)は、神経芽細胞腫細胞または神経芽細胞腫-神経膠腫細胞であり得る。好ましくは、細胞(例えば、ステップaの)は、神経芽細胞腫-神経膠腫細胞である。一実施形態では、細胞(例えば、ステップaの)は、NG108細胞であり得る。
本明細書において引用されたすべての参考文献は、その全開示内容に関して参照により本明細書に組み込まれる。
実施例1 - 指標細胞株の作出のための最適親細胞株の選択
安定トランスフェクト細胞株の開発のために最適親細胞株を選択する目的で、Neuro2A(N2a、ATCC CCL-131)、BE(2)-M17(M17、ATCC CRL-2267)、IMR-32(ATCC CCL-127)およびNG108-15[108CC15](ATCC HB-12317)細胞を研究した。
送達時に、細胞は回復し、増殖することを可能にされた。次いで、細胞のストックを凍結し、液体窒素中に保存した。細胞ストックの十分なバイアルが作製されると、細胞を、BoNT/Aに対するその感受性についてアッセイした。
細胞を、BoNT/A(Metabiologics、Inc.)を含有する培地中で8または24時間培養した。8時間培養した細胞を、0.1nM、1nMまたは10nM BoNT/Aを含有する培地中で培養した。24時間培養した細胞を、1nM、0.1nMまたは0.01nM BoNT/Aを含有する培地中で培養した。
内因性SNAP-25の切断を、抗SNAP-25抗体(Sigma番号S9684)を使用するウエスタンブロットによって、標準プロトコールを用いて分析した(図1)。NG108細胞は、BoNT/Aに対して、他の細胞よりも大きな感受性を示し、N2a細胞は、最も感受性が低かった。したがって、NG108細胞株を、安定にトランスフェクトされた指標細胞株の開発のための主要な候補として選択した。M17およびIMR-32細胞株は、試験した濃度および時間でBoNT/Aに対して類似の感受性を示した。培養の容易さおよび親密性のために、M17をNG108のバックアップとして選択した。
実施例2 - 指標構築物を含有するプラスミドを用いる、細胞のトランスフェクション
ピューロマイシン(InvivoGen番号ANT-PR)およびG418(VWR番号97064-358)に対するNG108細胞およびM17細胞の感受性を決定した。細胞を約50%コンフルエンシーに増殖させ、次いで、種々の濃度のピューロマイシンおよびG418とともに培養した。両細胞株は、ピューロマイシンおよびG418に対して類似の感受性を示した。
プラスミド(pD2500、Atum)を、ピューロマイシン-N-アセチルトランスフェラーゼ(PuroR)、キメラタンパク質および2A自己切断性ペプチドをコードする核酸配列を含有するように改変した。発現された生成物では、2A自己切断性ペプチドは、PuroRとキメラタンパク質の間に位置していた。キメラタンパク質は、N末端側およびC末端側蛍光タンパク質およびルシフェラーゼ(C末端に位置する)の間に隣接するSNAP-25を含有していた。PuroRは、ピューロマイシンに対する耐性を与えた。蛍光タンパク質によって促進される分解の蛍光ベースの測定に加えて、ルシフェラーゼによって、分解の発光測定が可能になった。N末端側蛍光タンパク質はmScarletであり、C末端側蛍光タンパク質は、NeonGreen、緑色蛍光タンパク質またはシアン蛍光タンパク質(CFP)のいずれかであった。PuroR、2A自己切断性ペプチドならびにmScarlet、SNAP-25、NeonGreenおよびルシフェラーゼを含有する構築物(mScarlet-SNAP25-GeNluc)をコードする核酸を含有するプラスミド挿入物は、配列番号1のヌクレオチド配列を有していた。PuroR、2A自己切断性ペプチドならびにmScarlet、SNAP-25、CFPおよびルシフェラーゼを含有する構築物(mScarlet-SNAP25-CyanNluc)をコードする核酸を含有するプラスミド挿入物は、配列番号2のヌクレオチド配列を有していた。
NeonGreenを、その励起/発光スペクトラムおよび強度のために選択した。指標タンパク質の切断時にNeonGreenが十分に分解しなかった場合には、CFPを、指標タンパク質が切断されると迅速に分解されるということを示すこれまでのデータのために、バックアップとして選択した。
NG108細胞およびM17細胞に、mScarlet-SNAP25-GeNluc構築物またはmScarlet-SNAP25-CyanNluc構築物のいずれかを含有するプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションは、標準プロトコールを使用してLipofectamine 3000(ThermoFisher)またはポリエチレンイミンを用いて行った。
トランスフェクションの24時間後、細胞を蛍光顕微鏡によって分析して、トランスフェクションの効率および指標タンパク質の正しい発現を確認した(図2A～B、NeonGreenを含有する指標タンパク質を発現する細胞の例が示されている)。過剰発現のために、指標タンパク質の多くは、細胞質ゾルであった。それぞれ、指標タンパク質のN末端およびC末端を表す赤色および緑色が容易に検出され、両末端が共局在していることを示した。両細胞種において高い一過性発現が見られ、>70%のトランスフェクション効率を有していた。
細胞が効率的にトランスフェクトされ、指標タンパク質が正しく発現されたことを確認すると、トランスフェクトされた細胞を、2.5μg/mlのピューロマイシンを用いて選択するか、または最初の高用量の20μg/mlのピューロマイシンを用いて1日間「ショックを与え」、次いで、5～10μg/mlのピューロマイシン中で培養した。両処置によって、蛍光性のピューロマイシン耐性細胞のプールを得た。
これと同時に、両指標構築物を用いていくつかのさらなるトランスフェクションを行い、ピューロマイシン耐性について選択を実施して、蛍光性のピューロマイシン耐性細胞のさらなるプールを得た。これは、約6の蛍光性のピューロマイシン耐性NG108細胞の独立プールおよび2のピューロマイシン耐性蛍光M17細胞の独立プールを最終的にもたらした。プールを拡大し、ストックを凍結し、解凍生存力について試験した。
ピューロマイシン耐性細胞を分析して、指標構築物の安定トランスフェクションを確認した(図3)。NeonGreenを含有する指標構築物が安定にトランスフェクトされたNG108細胞では、mScarlet(赤色)およびNeonGreen(緑色)の両方が共局在していた。これは、全長の無傷のタンパク質が作られ、細胞内に分配されたということを示した。さらに、蛍光は、主に細胞膜で見られ、これは、タンパク質が正しく局在していることを示した(SNAP-25の存在のために)。
実施例3 - 指標タンパク質の切断の確認
プラスミド(pcDNA3.1)を、BoNT/A軽鎖、CFPおよびN末端側SBPタグをコードする配列番号3を含有するように改変した。BoNT/A軽鎖をコードする核酸は、DNA2.0(Atum)を使用して合成した。
指標構築物(mScarlet-SNAP25-GeNlucまたはmScarlet-SNAP25-CyanNluc)を安定にトランスフェクトされた実施例2から得た細胞に、CFP-BoNT/A構築物を含有する発現ベクターを一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの24および48時間後に緑色またはシアンではなく多数の赤色細胞が実証され、これは、指標タンパク質が切断され、C末端側断片が迅速に分解されたことを示した。
実施例4 - 指標タンパク質の切断の確認
mScarlet-SNAP25-GeNluc指標構築物を安定にトランスフェクトされた実施例2から得たNG108細胞を、完全DMEM培地(Corning番号50-013-PB)中で96ウェル光学プレート(ThermoFisher番号165305)にプレーティングし(ウェルあたり20～30K個細胞)、4時間接着させた。次いで、培地をNeurobasal Plus(ThermoFisher番号A35829)に変更し、細胞をさらに20時間培養し、その後、培地を、BoNT/Aを0(対照)、0.1または1.0nMで含有するNeurobasal Plus培地と変更した。細胞をさらに24時間培養した。次いで、細胞をトリプシン処理し、培地で1回洗浄し、10ユニットのベンゾナーゼ(Benzonase)/mlを有するDMEM/FBS培地またはDPBSに約2×106個細胞/mlで再懸濁した。次いで、細胞を、SY3200(Sony Biotechnologies)セルソーターでNeonGreenおよびmScarletのための適当なレーザー/フィルターを使用して分析した。
図4は、BoNT/Aを用いる24時間の処置後の、mScarlet-SNAP25-GeNlucを発現するNG108細胞のHPFあたりの緑色細胞数を表す。1nM BoNT/Aを用いて処置された細胞のプールにおいて、HPFあたりの緑色陽性細胞のおよそ25%の低減が示された。
実施例5 - 指標タンパク質の切断の確認
mScarlet-SNAP25-GeNluc指標構築物を安定にトランスフェクトされた実施例2から得た代表的なNG108およびM17細胞を、トリプシン処理し、培地で1回洗浄し、10ユニットのベンゾナーゼ(Benzonase)/mlを有するDMEM/FBS培地またはDPBSに約2×106個細胞/mlで再懸濁した。次いで、細胞を、SY3200(Sony Biotechnologies)セルソーターでNeonGreenおよびmScarletのための適当なレーザー/フィルターを使用して分析した。
NG108細胞を488nMで励起して、mScarletを最小にしか励起せずに、NeonGreenを直接励起した。蛍光発光をさまざまな波長で測定した。さらに、側方散乱および前方散乱光強度を測定して、細胞の亜集団を同定した。図5Aは、x軸に側方散乱(SS)およびy軸に前方散乱(FS)を示す散布図を表し、分布は、細胞粒度/複雑度(SS)および細胞の大きさ(FS)の変動を例示する。図5Bは、525nM(FITCフィルター)で測定された発光蛍光強度の細胞分布を示すヒストグラムを表す。図5Cは、585nM(PEフィルター)で測定された発光蛍光強度の細胞分布を示すヒストグラムを表す。図5Dは、617nM(PE-テキサスレッドフィルター)で測定された発光蛍光強度の細胞分布を示すヒストグラムを表す。図5Eは、665nM(7AADフィルター)で測定される発光蛍光強度の細胞分布を示すヒストグラムを表す。図5Fは、785nM(PE-Cy7フィルター)で測定された発光蛍光強度の細胞分布を示すヒストグラムを表す。図5Gは、x軸に665nM(7AADフィルター)で、y軸に側方散乱(SS)で測定された細胞の細胞発光蛍光を示す散布図を表す。ヒストグラムは、蛍光の2つの別個のピークを示し、少ない蛍光ピークは、非発現細胞を表し、多い蛍光ピークは、指標タンパク質を発現する細胞を表す。発光読み取りのすべての波長で、蛍光は高いままである。これは、発せられた光のほとんどがFRETによるものである、785nMで発光が測定された場合(図5F)を含んでおり、したがって、NeonGreenとmScarletの間のFRETが確認された。N108プールにおける高蛍光細胞のパーセンテージ割合は、61%～93%の範囲であった。
M17細胞を488nMで励起して、mScarletを最小にしか励起せずに、NeonGreenを直接励起した。蛍光発光をさまざまな波長で測定した。さらに、側方散乱および前方散乱光強度を測定して、細胞の亜集団を同定した。図6Aは、x軸に側方散乱(SS)およびy軸に前方散乱(FS)を示す散布図を表し、分布は、細胞粒度/複雑度(SS)および細胞の大きさ(FS)の変動を例示する。図6Bは、525nM(FITCフィルター)で測定された発光蛍光強度の細胞分布を示すヒストグラムを表す。図6Cは、585nM(PEフィルター)で測定された発光蛍光強度の細胞分布を示すヒストグラムを表す。図6Dは、617nM(PE-テキサスレッドフィルター)で測定された発光蛍光強度の細胞分布を示すヒストグラムを表す。図6Eは、665nM(7AADフィルター)で測定される発光蛍光強度の細胞分布を示すヒストグラムを表す。図6Fは、785nM(PE-Cy7フィルター)で測定された発光蛍光強度の細胞分布を示すヒストグラムを表す。図6Gは、x軸に665nM(7AADフィルター)で、y軸に側方散乱(SS)で測定された細胞の細胞発光蛍光を示す散布図を表す。ヒストグラムは、蛍光の2つの別個のピークを示し、少ない蛍光ピークは、非発現細胞を表し、多い蛍光ピークは、指標タンパク質を発現する細胞を表す。発光読み取りのすべての波長で、蛍光は高いままである。これは、発せられた光のほとんどがFRETによるものである、785nMで発光が測定された場合(図6F)を含んでおり、したがって、NeonGreenとmScarletの間のFRETが確認された。M17プールにおける高蛍光細胞のパーセンテージ割合は、14%～24%の範囲であり、すなわち、M17細胞プールにおいて蛍光タンパク質を発現する細胞の割合は、NG108細胞プールと比較して小さかった。
mScarlet-SNAP25-GeNluc指標構築物を安定にトランスフェクトされた実施例2から得たNG108細胞を、実施例4に記載される方法でBoNT/Aを0(対照)、0.1または1.0nMで用いて処置した。
安定にトランスフェクトされたNG108細胞のプールからの蛍光を、SY3200(Sony Biotechnologies)アナライザーを使用して測定した。細胞を488nMで励起して、mScarletを最小にしか励起せずに、NeonGreenを直接励起した。蛍光発光を、NeonGreen蛍光を検出するが、mScarlet蛍光を検出しない530nM(FITCフィルター)で測定した。図7Aは、525nMで測定された未処置(対照)細胞からの発光蛍光強度の分布を示すヒストグラムを表す。図7Bは、525nMで測定された0.1nM BoNT/Aを用いて処置された細胞からの発光蛍光強度の分布を示すヒストグラムを表す。図7Cは、525nMで測定された1nM BoNT/Aを用いて処置された細胞からの発光蛍光強度の分布を示すヒストグラムを表す。NeonGreenの蛍光は、未処置対照(図7A)と比較して、1nM BoNT/Aを用いる処置後(図7C)の細胞プールにおいて約15%減少し(ゲートR2中の細胞の平均蛍光)、これは、得られたNeonGreenを含有するC末端側断片が切断後に分解されることを示唆した。
FRET発光の喪失のフローサイトメトリー決定も実施した。安定にトランスフェクトされたNG108細胞のプールからの蛍光を、SY3200(Sony Biotechnologies)アナライザーを使用して測定した。細胞を488nMで励起して、mScarletを最小にしか励起せずに、NeonGreenを直接励起した。蛍光発光を、mScarlet蛍光を検出するが、NeonGreen蛍光を検出しない785nM(Cy7フィルター)で測定した。図8Aは、785nMで測定された未処置(対照)細胞からの発光蛍光強度の分布を示すヒストグラムを表す。図8Bは、785nMで測定された0.1nM BoNT/Aを用いて処置された細胞からの発光蛍光強度の分布を示すヒストグラムを表す。図8Cは、785nMで測定された1nM BoNT/Aを用いて処置された細胞からの発光蛍光強度の分布を示すヒストグラムを表す。FRET強度は、未処置対照(図8A)と比較して、1nM BoNT/Aを用いる処置後(図8C)に16%減少し(ゲートR6中の細胞の平均蛍光)、NeonGreen分解と一致した。
実施例6 - 切断の確認
mScarlet-SNAP25-GeNluc指標構築物を安定にトランスフェクトされた実施例2から得たNG108細胞でウエスタンブロットを実施し、実施例4に記載される方法で、毒素なし(対照)、1nMもしくは8nM BoNT/Aまたは1nM、10nMもしくは100nM BoNT/Eを用いて処置した(図9)。
標準ブロッティング技術およびウサギ抗SNAP25一次抗体を使用して、SNAP-25(内因性または外因性のいずれか)の切断について細胞株を試験した。
M-PER試薬(ThermoFisher番号78501)を、製造業者の推奨に従って使用して細胞を溶解した。溶解物を15kgで10分間清澄化し、10μlのサンプルを、200VでMOPSバッファー(ThermoFisher番号NP0001)中でNuPage 12% Bis-Trisゲル(ThermoFisher番号NP0341BOX)で流した。タンパク質をXCell IIブロッティングシステムおよびNu-Pageトランスファープロトコールを使用してPVDFメンブレン(ThermoFisher番号LC2005)にトランスファーした。得られたブロットを1% BSA/0.05% Tween20/PBS、一次抗体1:3,000抗SNAP-25、二次抗体1:5,000アルカリホスファターゼがコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ(ThermoFisher番号31340)中でブロッキングし、NBT/BCIP基質(ThermoFisher番号34042)中で発色させた。発色したブロットをスキャンし、ImageJを使用してデンシトメトリー算出し、MS Excelでプロットした。
指標タンパク質は、すべての溶解物において検出された。対照サンプルでは、明らかな切断生成物は検出されなかった。BoNT/AまたはBoNT/Eのいずれかで処置した細胞は、切断生成物を生成し、より高い投与量を用いた場合に増大した。興味深いことに、細胞は、BoNT/Aに対してとほぼ同じようにBoNT/Eに対して感受性であると思われる。
実施例7 - 受容体構築物を用いるトランスフェクション
プラスミド(pD2500、Atum)を受容体構築物GD3-SV2C-Sytおよびアミノグリコシド3’-ホスホトランスフェラーゼ(Neo)をコードする核酸(配列番号4)を含有するように改変した。核酸は、GD3シンターゼ、SV2CおよびシンタキシンならびにNeoを含む融合タンパク質を発現し、各ドメインは、2A自己切断性ペプチドによって互いから分離される。シンタキシンを、BoNTの他のアイソフォームとともに使用するために融合タンパク質中に改変した。Neoは、G418に対する耐性を与えた。
mScarlet-SNAP25-GeNluc指標構築物を安定にトランスフェクトされた実施例2から得たNG108細胞を、T75フラスコ中で約60%コンフルエンシーまで増殖させた。次いで、標準プロトコールに従って5mlのOptiMem/ポリエチレンイミン中の受容体構築物を含有するプラスミド(2μg/ml)を一晩それらにトランスフェクトした。朝に、細胞を新鮮完全DMEM培地で1回洗浄し、完全DMEM培地でさらに24～48時間培養した。次いで、培地を500μg/mlのG418を有する完全DMEM培地に変更し、細胞をさらに1～2週間培養し、培地/G418は必要に応じて変更する。細胞は、G418添加の3日後までに死滅し始め、約1週間継続することが観察された(約60%の細胞死)。約2週間後に残った細胞は、G418耐性であった。
実施例8 - 細胞の定向進化
実施例7から得た細胞を2回のソートに付して、指標タンパク質の最高蛍光、ひいては、最高発現を有していた細胞を単離した。
実施例9 - 細胞の定向進化
実施例8において指標タンパク質の高発現について選択された細胞を、BoNT/Aについて0.1nM、1nMもしくは10nMで、または10nM BoNT/Eで72時間、実施例4に記載された方法で処置した。処置後、細胞を3回洗浄し、トリプシン処理し、新鮮培地に再懸濁し、選別した。細胞のスクリーニングは、BoNT/Aに対して明確な用量感受性応答を示した(図10A)。蛍光顕微鏡は、同レベルの赤色蛍光を維持しながら、細胞が処置の用量とともに緑色蛍光も減少したことを示した(図10B)。結果はBoNT/A感受性の増大を明確に示したが、BoNT/Eについて類似の増大は見られなかったことが留意された。
1,000pM(1nM)のBoNT/Aに対して感受性であった細胞が選択された。
実施例10 - 細胞の定向進化
野生型NG108細胞(すなわち、レポーターまたは受容体構築物がトランスフェクトされていない)を選別した(図11A)。これらの細胞は、緑色蛍光も赤色蛍光も示さない。
1,000pM(1nM)のBoNT/Aに対して感受性であった実施例9から得た細胞を拡大し、これまでに論じられた方法で100pM BoNT/Aを用いて処置した、または処置しなかった(対照)。48または96時間の処置後、細胞を3回洗浄し、トリプシン処理し、新鮮培地に再懸濁し、選別した。図11B～Dは、それぞれ、対照、100pM BoNT/Aを用いて48時間処置された細胞および100pM BoNT/Aを用いて96時間処置された細胞のフローサイトメトリーデータを表す。
指標構築物の高発現について2回選別されたが、実施例9において1,000pMのBoNT/Aに対する感受性について選別に付されていない実施例8から得た細胞を、100pM BoNT/Aを用いて、これまでに論じられた方法で96時間処置した、または処置しなかった(対照)。図11E～Fは、それぞれ、対照および100pM BoNT/Aを用いて96時間処置された細胞のフローサイトメトリーデータを表す。
図11A～Fでは、ほぼ円形のゲートが、赤色蛍光も緑色蛍光も示さない細胞(すなわち、指標タンパク質を発現しない細胞)を強調し、ほぼ楕円のゲートは、赤色蛍光および緑色蛍光の両方を示す細胞(すなわち、指標タンパク質を発現し、指標タンパク質が切断されていない細胞)を強調し、四辺形のゲートは、赤色蛍光を示すが、比較的減少した緑色蛍光を示す細胞(すなわち、指標タンパク質を発現するが、指標タンパク質が切断されている細胞)を強調する。
1nM BoNT/Aに対する感受性について以前に選択された細胞(図11D)は、そのように選択されなかった細胞(図11F)よりも、100pMのBoNT/Aに対して有意に高い感受性(より多くの切断)を示した。
処置の96時間後に100pMのBoNT/Aに対して感受性であった細胞(野生型NG108よりも、2対数を超えてより感受性である)を選択した。
実施例11 - 細胞の定向進化
処置の96時間後に100pMのBoNT/Aに対して感受性であった実施例10から得た細胞を、拡大し、これまでに論じられた方法で10pM BoNT/Aを用いて96時間処置した、または処置しなかった(対照)。処置後、細胞を3回洗浄し、トリプシン処理し、新鮮培地で再懸濁し、選別した。
図12A～Bはそれぞれ、対照および10pM BoNT/Aで処置した細胞のフローサイトメトリーデータを表す。より高濃度の毒素を用いた場合に見られるほど劇的ではないが、処置された細胞の蛍光において注目すべき移動があった。
実施例12 - BoNT/Eの受容体構築物
BoNT/Eに対する感受性を与えるために、mScarlet-SNAP25-GeNluc指標構築物を安定にトランスフェクトされた実施例2から得たNG108細胞に、GD3-SV2A-Syt受容体構築物を含有するプラスミド(配列番号5)を実施例2に記載されたトランスフェクション手順を使用してトランスフェクトした。このプラスミドは、HiFiキット(New England Biolabs)、IDT由来のオリゴヌクレオチドおよびGeneArtによって合成されたSV2A配列を使用して、GD2-SV2C-Syt受容体構築物を含有するプラスミドを修飾することによって構築した。
これらの細胞およびGD3-SV2C-Syt受容体構築物を発現した実施例7から得た細胞を、0(対照)、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、0.001nMのBoNT/Aまたは0nM(対照)BoNT/Aまたは100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nMもしくは0nM(対照)のBoNT/Eのいずれかを含有する培地中で培養した。細胞を16、40、64または88時間処置した。処置後、細胞を溶解し、抗SNAP-25抗体を使用して抗SNAP-25ウエスタンブロットを実施した。ブロットからのデンシトメトリーデータを、切断されたSNAP-25のパーセントとしてプロットした(図13)。SV2Aを発現する細胞の、BoNT/AおよびBoNT/E両方に対する感受性において、SV2Cを発現する細胞と比較して著しい増大があり、これによって、BoNT/E感受性を与えるためのSV2Aの必要性が確認された。
実施例13 - 細胞の定向進化
mScarlet-SNAP-25-GeNluc指標およびGD3-SV2C-Syt受容体構築物を発現したNG108細胞を、実施例2および7のプロトコールを使用して調製した。
次いで、これらの細胞を、補給したDMEM培地(90%(v/v)DMEM:Gibco 11960-044、2%(v/v)HAT:Fisher Scientific 21060-017、5%(v/v)FBS:Fisher Scientific 10099-141、2%(v/v)重炭酸ナトリウム溶液:Fisher Scientific 25080-094、1%(v/v)Glutamax:Fisher Scientific 35050-038)中で、T75またはT150フラスコ(Corning番号430641Uおよび番号430825)中に播種し(フラスコあたり1～2m細胞)、3～4日間増殖させた。次いで、培地を、補給したNeurobasal Plus培地(95%(v/v)Neurobasal Plus:ThermoFisher A35829-01、2%(v/v)B27 Plus:ThermoFisher A35828-01、2%(v/v)HAT:Fisher Scientific 21060-017、1%(v/v)Glutamax:Fisher Scientific 35050-038)に変更し、細胞をさらに1～2日間培養し、その後培地を0(対照)、50pMもしくは250pMのBoNT/Aを含有する補給したNeurobasal Plus培地と変更した。細胞をさらに3日間培養した。次いで、細胞をトリプシン処理し、補給したDMEM培地に再懸濁した。次いで、細胞を150×gで6分間遠心分離し、10Uのベンゾナーゼ(Benzonase)/mlを含有する補給したNeurobasal Plus培地におよそ2×106個細胞/mlで再懸濁した。
次いで、細胞をBD流入セルソーター(BD Biosciences)で分析した。細胞を506nMで励起してNeonGreenを励起し、569nMで励起して、mScarletを励起した。蛍光発光を517nM(NeonGreen蛍光)および594nM(mScarlet蛍光)で測定した。
得られたデータは、図14A～Cに示されている。ゲートは、赤色蛍光を示したが、比較的減少した緑色蛍光を示した細胞を強調し、これは、それらの細胞において指標タンパク質の切断が生じたことを示す。毒素で処置されなかった全細胞の0.7%しか、ゲート内に入らなかったが、一方で50pM BoNT/Aで処置された細胞の14.2%が入り、250pM BoNT/Aで処置された細胞の35.5%が入った。
250pM BoNT/Aを用いる処置に応答した細胞(図14Cにおいてゲートによって強調されるような)を選別し、回収した。次いで、このサブプールの細胞を拡大し、最初の処置に使用された同一プロトコールを使用して第2ラウンドの毒素処置およびフローサイトメトリー分析に付した。
得られたデータは、図14D～Fに示されている。ゲートは、赤色蛍光を示したが、比較的減少した緑色蛍光を示した細胞を強調し、これは、それらの細胞において指標タンパク質の切断が生じたことを示す。毒素で処置されなかった全細胞の0.2%しか、ゲート内に入らなかったが、一方で50pM BoNT/Aで処置された細胞の26.1%が入り、250pM BoNT/Aで処置された細胞の65.6%が入った。実証されるように、毒素処置されたプールの大きな割合が、第2ラウンドの毒素処置後に応答し、応答は、最初の毒素処置後の応答と比較してより顕著であった。
配列表
配列番号1
ATGGTGTCGAAGGGGGAAGCGGTGATCAAGGAGTTCATGAGGTTTAAAGTGCATATGGAGGGATCTATGAACGGACACGAGTTTGAGATCGAAGGGGAAGGAGAGGGGCGCCCATACGAAGGCACCCAGACTGCCAAGCTGAAAGTCACAAAGGGTGGACCCTTGCCCTTCTCGTGGGATATTCTGAGCCCGCAATTCATGTACGGGTCCCGGGCCTTCACCAAGCACCCTGCTGACATTCCGGATTACTATAAGCAGAGCTTCCCGGAAGGCTTCAAATGGGAGCGAGTGATGAACTTCGAGGATGGAGGCGCCGTGACCGTGACTCAGGACACTTCACTGGAAGATGGCACTCTGATCTACAAGGTCAAGCTGCGGGGCACCAACTTCCCACCGGACGGACCGGTCATGCAGAAAAAGACCATGGGATGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCGAAGATGGAGTCCTCAAGGGGGACATCAAGATGGCCCTGCGGCTCAAGGATGGTGGAAGATACCTGGCTGACTTCAAGACCACGTACAAGGCCAAGAAGCCAGTCCAGATGCCCGGCGCGTACAATGTGGATCGCAAGCTGGACATCACTTCCCACAACGAGGACTACACCGTGGTGGAGCAGTACGAACGGTCCGAGGGTCGGCACTCCACTGGTGGCATGGACGAGCTGTACAAAATGGCCGAGGATGCAGACATGAGAAACGAACTGGAAGAAATGCAGCGGAGAGCAGACCAGCTCGCGGACGAATCACTGGAATCGACCCGCCGGATGCTTCAACTGGTCGAGGAATCAAAGGACGCGGGTATCCGGACCCTTGTGATGCTGGACGAACAGGGAGAGCAGCTGGAGAGGATCGAAGAGGGAATGGACCAGATTAACAAGGACATGAAGGAAGCGGAAAAGAACCTCACCGACCTTGGAAAGTTCTGCGGGTTGTGCGTGTGTCCGTGCAACAAGCTGAAGTCCTCCGACGCCTACAAGAAGGCCTGGGGAAACAACCAGGACGGTGTCGTGGCTTCCCAACCCGCACGGGTGGTGGATGAGCGGGAACAGATGGCGATTTCCGGAGGCTTCATTAGACGCGTGACCAACGACGCCCGCGAAAACGAGATGGACGAAAACCTGGAACAAGTGTCGGGAATCATCGGAAACTTGAGACACATGGCCCTCGACATGGGCAACGAAATTGATACACAGAACCGGCAGATTGACCGGATCATGGAAAAGGCAGACTCAAACAAGACTCGGATTGACGAAGCGAACCAGAGGGCCACTAAGATGTTGGGTTCCGGGATGGTGTCAAAGGGAGAAGAAGACAACATGGCATCACTGCCCGCCACCCACGAGCTGCACATCTTCGGTTCCATCAACGGGGTCGACTTCGACATGGTCGGCCAGGGAACTGGAAACCCGAATGACGGTTATGAAGAACTGAACCTTAAATCAACCAAGGGGGACCTTCAGTTCTCGCCCTGGATTTTGGTCCCTCACATTGGATACGGATTCCATCAGTATCTGCCGTACCCCGACGGAATGAGCCCGTTCCAGGCTGCCATGGTGGACGGATCGGGATACCAGGTCCACCGCACCATGCAGTTTGAAGATGGCGCAAGCCTGACCGTGAACTACCGGTATACCTACGAGGGCTCACACATCAAGGGGGAAGCCCAAGTCAAGGGTACCGGCTTCCCGGCCGACGGACCAGTGATGACCAACTCCTTGACCGCCGCCGACTGGTGCCGCAGCAAGAAAACTTACCCCAACGATAAGACAATCATCTCCACTTTCAAGTGGTCCTACACCACGGGCAACGGCAAACGCTACCGAAGCACTGCACGGACCACCTACACTTTCGCGAAGCCTATGGCCGCCAACTACCTGAAGAACCAGCCGATGTACGTGTTCAGAAAGACGGAACTCAAGCACTCCAAAACCGAACTGAACTTTAAGGAGTGGCAGAAGGCTTTCACTGGATTCGAGGACTTTGTCGGCGACTGGCGCCAGACTGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTGCTCGAACAGGGGGGTGTCTCCAGCCTCTTCCAAAATCTGGGCGTGTCCGTGACCCCGATCCAGCGGATCGTGCTCAGCGGGGAAAACGGCCTGAAGATCGATATCCACGTCATCATCCCGTACGAGGGACTGAGCGGCGACCAGATGGGTCAGATCGAAAAGATTTTCAAGGTGGTCTATCCCGTGGATGACCACCACTTCAAAGTGATCCTGCATTACGGGACCCTCGTGATCGACGGCGTCACCCCGAACATGATTGATTACTTCGGACGGCCTTATGAAGGGATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACCGTGACTGGCACCCTGTGGAACGGAAATAAGATCATTGACGAGCGGCTGATCAACCCAGACGGGTCGCTGCTGTTCCGCGTGACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAGCGCATCCTCGCCTGATAG
配列番号2
ATGGTGTCGAAGGGGGAAGCGGTGATCAAGGAGTTCATGAGGTTTAAAGTGCATATGGAGGGATCTATGAACGGACACGAGTTTGAGATCGAAGGGGAAGGAGAGGGGCGCCCATACGAAGGCACCCAGACTGCCAAGCTGAAAGTCACAAAGGGTGGACCCTTGCCCTTCTCGTGGGATATTCTGAGCCCGCAATTCATGTACGGGTCCCGGGCCTTCACCAAGCACCCTGCTGACATTCCGGATTACTATAAGCAGAGCTTCCCGGAAGGCTTCAAATGGGAGCGAGTGATGAACTTCGAGGATGGAGGCGCCGTGACCGTGACTCAGGACACTTCACTGGAAGATGGCACTCTGATCTACAAGGTCAAGCTGCGGGGCACCAACTTCCCACCGGACGGACCGGTCATGCAGAAAAAGACCATGGGATGGGAGGCCTCCACCGAGCGCCTGTACCCCGAAGATGGAGTCCTCAAGGGGGACATCAAGATGGCCCTGCGGCTCAAGGATGGTGGAAGATACCTGGCTGACTTCAAGACCACGTACAAGGCCAAGAAGCCAGTCCAGATGCCCGGCGCGTACAATGTGGATCGCAAGCTGGACATCACTTCCCACAACGAGGACTACACCGTGGTGGAGCAGTACGAACGGTCCGAGGGTCGGCACTCCACTGGTGGCATGGACGAGCTGTACAAAATGGCCGAGGATGCAGACATGAGAAACGAACTGGAAGAAATGCAGCGGAGAGCAGACCAGCTCGCGGACGAATCACTGGAATCGACCCGCCGGATGCTTCAACTGGTCGAGGAATCAAAGGACGCGGGTATCCGGACCCTTGTGATGCTGGACGAACAGGGAGAGCAGCTGGAGAGGATCGAAGAGGGAATGGACCAGATTAACAAGGACATGAAGGAAGCGGAAAAGAACCTCACCGACCTTGGAAAGTTCTGCGGGTTGTGCGTGTGTCCGTGCAACAAGCTGAAGTCCTCCGACGCCTACAAGAAGGCCTGGGGAAACAACCAGGACGGTGTCGTGGCTTCCCAACCCGCACGGGTGGTGGATGAGCGGGAACAGATGGCGATTTCCGGAGGCTTCATTAGACGCGTGACCAACGACGCCCGCGAAAACGAGATGGACGAAAACCTGGAACAAGTGTCGGGAATCATCGGAAACTTGAGACACATGGCCCTCGACATGGGCAACGAAATTGATACACAGAACCGGCAGATTGACCGGATCATGGAAAAGGCAGACTCAAACAAGACTCGGATTGACGAAGCGAACCAGAGGGCCACTAAGATGTTGGGTTCCGGGATGGTGTCAAAGGGAGAAGAACTGTTCACTGGAGTGGTGCCCATCCTGGTGGAGCTGGATGGCGATGTGAACGGCCATAAATTCTCAGTCAGCGGAGAGGGAGAGGGCGATGCGACTTACGGAAAGCTGACTTTGAAGTTTATCTGCACTACCGGAAAGCTGCCTGTGCCATGGCCTACCCTCGTGACCACCCTGTCCTGGGGCGTCCAATGTTTCGCACGCTACCCTGACCATATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAGGGCTACGTGCAGGAACGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGGAACTACAAAACCAGGGCTGAAGTGAAGTTCGAGGGAGACACCCTGGTCAATCGGATTGAATTGAAGGGAATCGATTTCAAGGAAGATGGAAACATCCTGGGACATAAGCTTGAGTACAACTACTTCTCCGACAACGTGTACATCACGGCCGATAAGCAGAAGAACGGAATCAAAGCTAACTTCAAGATTCGGCACAACATTGAGGACGGCGGCGTCCAGCTGGCGGACCATTATCAGCAGAATACCCCTATTGGGGATGGACCGGTGCTGCTCCCGGACAACCATTACCTGTCCACCCAATCTAAGCTGAGCAAGGACCCAAACGAGAAGCGCGATCACATGGTGCTGCTCGAGTTCGTGACTGCCGCCGGGCTTCACACACTTGAGGACTTTGTCGGCGACTGGCGCCAGACTGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTGCTCGAACAGGGGGGTGTCTCCAGCCTCTTCCAAAATCTGGGCGTGTCCGTGACCCCGATCCAGCGGATCGTGCTCAGCGGGGAAAACGGCCTGAAGATCGATATCCACGTCATCATCCCGTACGAGGGACTGAGCGGCGACCAGATGGGTCAGATCGAAAAGATTTTCAAGGTGGTCTATCCCGTGGATGACCACCACTTCAAAGTGATCCTGCATTACGGGACCCTCGTGATCGACGGCGTCACCCCGAACATGATTGATTACTTCGGACGGCCTTATGAAGGGATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACCGTGACTGGCACCCTGTGGAACGGAAATAAGATCATTGACGAGCGGCTGATCAACCCAGACGGGTCGCTGCTGTTCCGCGTGACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAGCGCATCCTCGCCTGATAG
配列番号3
ATGACCATGGATGAGCAGCAATCGCAGGCTGTAGCCCCGGTATATGTCGGTGGTATGGATGAGAAAACGACTGGGTGGCGGGGTGGACACGTCGTCGAGGGCCTGGCAGGCGAACTTGAACAACTGCGGGCTCGCTTGGAGCACCACCCGCAAGGACAGCGCGAGCCGTCCATGGTGTCAAAGGGGGAGGAACTGTTTACTGGGGTCGTCCCTATCTTGGTGGAACTCGACGGGGATGTGAACGGACACAAGTTTTCGGTATCCGGGGAAGGCGAGGGGGATGCCACgTATGGAAAGCTCACACTTAAGTTCATCTGCACGACAGGGAAGCTCCCAGTGCCTTGGCCCACGTTGGTGACTACGCTCACATGGGGTGTCCAGTGCTTCGCACGGTATCCCGACCAcATGAAGCAGCATGATTTCTTTAAGTCAGCCATGCCGGAGGGATATGTACAAGAAAGGACCATCTTCTTCAAAGATGACGGTAACTACAAGACCAGAGCCGAGGTAAAGTTTGAAGGCGACACTCTCGTGAACAGGATTGAGCTGAAGGGAATTGATTTCAAAGAGGATGGGAACATCCTTGGTCACAAATTGGAGTACAATGCCATTTCGGATAACGTGTACATTACAGCGGATAAGCAGAAGAATGGGATCAAAGCGAATTTCAAAATCAGGCATAACATCGAGGACGGGTCGGTGCAGCTCGCCGACCATTACCAGCAGAATACGCCCATCGGAGATGGACCCGTACTTCTGCCCGACAATCATTATCTGTCAACGCAATCAGCGCTTAGCAAAGATCCCAATGAGAAAAGGGACCACATGGTGCTCCTCGAATTtGTGACGGCAGCGGGAATTACCCTCGGGATGGACGAACTGTACAAAAGCGGGTTGAGACTCGAGCGCTGAACTCGAGATGCCTTTTGTCAACAAGCAGTTTAACTATAAGGATCCCGTGAATGGTGTGGACATTGCCTACATCAAGATTCCAAACGCTGGACAAATGCAGCCCGTCAAGGCTTTCAAAATTCACAACAAGATCTGGGTGATCCCGGAGAGGGACACCTTTACCAATCCAGAAGAGGGCGACCTTAACCCTCCGCCAGAGGCCAAACAGGTGCCCGTGAGCTATTACGACTCAACTTATCTCTCCACCGACAACGAAAAGGACAATTACCTCAAGGGAGTCACCAAGCTGTTCGAACGGATCTACTCTACCGATCTCGGCAGGATGCTCCTGACTTCTATCGTGCGGGGCATCCCCTTCTGGGGTGGGAGCACCATTGACACCGAACTGAAGGTGATTGATACCAATTGCATCAACGTCATCCAGCCAGACGGTTCCTACCGGTCTGAGGAGCTCAATCTTGTGATTATTGGCCCGTCAGCTGATATCATCCAGTTCGAATGCAAGTCTTTCGGACACGACGTGCTTAATCTCACCCGCAATGGTTACGGAAGCACCCAGTACATCAGATTCTCTCCGGACTTTACTTTCGGATTTGAAGAGTCACTGGAAGTCGACACCAATCCTCTGCTCGGAGCCGGAAAGTTCGCCACCGACCCTGCAGTGACCCTTGCTCACGAGCTGATTCATGCAGAGCATCGCCTGTACGGGATCGCCATCAATCCTAACCGCGTGTTTAAGGTCAATACCAACGCTTACTATGAAATGAGCGGACTGGAGGTGTCCTTCGAGGAACTGCGCACCTTCGGAGGTCATGACGCTAAGTTCATCGACTCACTGCAAGAGAATGAGTTCCGGCTGTACTATTACAACAAGTTTAAGGATGTCGCCTCAACTCTGAACAAGGCCAAAAGCATCATCGGCACCACCGCCAGCCTGCAATACATGAAAAACGTGTTCAAGGAAAAGTACCTTCTTAGCGAAGATACTTCCGGGAAGTTTTCAGTCGACAAACTGAAGTTCGACAAGCTGTACAAGATGCTCACCGAAATCTACACCGAGGACAATTTTGTGAACTTCTTCAAAGTGATTAACAGAAAGACCTATCTGAACTTCGACAAAGCCGTGTTCCGGATTAACATTGTGCCCGATGAGAACTACACTATCAAGGACGGGTTCAACCTTAAGGGTGCAAATCTTTCAACTAATTTCAACGGACAGAATACTGAGATCAATTCAAGGAACTTCACTAGACTCAAGAATTTCACTGGGCTTTTCGAGTTCTATAAGCTGCTGTGTGTCCGCGGAATTATCCCCTTCAAGTGAAGCTTCGTCAATGA
配列番号4
ATGTCCCCATGTGGACGAGCGCGCAGACAGACCTCAAGAGGAGCGATGGCCGTGCTGGCCTGGAAGTTCCCGAGGACTCGCCTGCCCATGGGAGCCTCTGCTCTGTGTGTGGTCGTGCTGTGTTGGCTGTACATCTTCCCGGTGTACCGGCTGCCTAACGAAAAGGAAATTGTGCAGGGCGTGCTCCAGCAGGGGACCGCTTGGCGGCGCAACCAGACCGCTGCGAGGGCTTTTCGGAAGCAGATGGAAGATTGTTGCGACCCCGCCCATCTTTTCGCGATGACCAAGATGAACAGCCCGATGGGAAAGTCCATGTGGTACGACGGAGAGTTCCTGTATTCCTTCACCATTGACAACAGCACTTACTCACTGTTCCCGCAAGCCACCCCCTTCCAACTGCCGCTTAAGAAGTGCGCCGTCGTGGGGAACGGCGGCATCCTCAAGAAGTCCGGATGCGGGCGCCAGATTGATGAAGCCAACTTCGTGATGCGGTGCAATCTCCCGCCACTCTCGTCCGAGTACACCAAGGACGTGGGGTCAAAGTCGCAGCTCGTCACCGCCAACCCTTCGATCATCAGACAACGGTTCCAGAACCTTCTGTGGAGCCGGAAAACATTTGTGGATAACATGAAGATCTACAACCATTCCTACATCTATATGCCTGCCTTCTCCATGAAAACTGGAACCGAACCCTCCCTGAGAGTGTACTACACCCTGTCCGACGTGGGCGCAAACCAGACCGTCCTTTTCGCCAACCCCAACTTCCTGCGCTCCATCGGAAAGTTCTGGAAGTCCAGAGGCATTCACGCGAAACGCTTGTCCACTGGATTGTTCTTGGTGTCCGCCGCTCTGGGCCTGTGCGAGGAAGTGGCCATATACGGATTCTGGCCTTTCTCCGTCAACATGCACGAGCAGCCCATCTCCCACCATTATTACGACAATGTCCTGCCTTTCTCGGGATTTCACGCGATGCCCGAGGAGTTCTTGCAACTGTGGTACCTTCACAAGATCGGTGCCCTGCGGATGCAGCTGGACCCTTGCGAGGACACCTCGCTGCAACCCACCTCGGAGCAGAAACTCATTTCCGAAGAGGATCTGAACGGGGAGCAGAAGCTCATCTCCGAGGAGGACCTGAACGGAGAACAGAAGCTGATTAGCGAAGAGGACCTGGGCAGCGGTGCCACCAATTTTTCTCTGCTCAAGCAGGCCGGAGATGTGGAAGAGAACCCGGGTCCCATGGAGGACTCCTACAAAGATCGGACTTCTCTGATGAAGGGAGCCAAGGACATCGCCAGGGAAGTGAAGAAGCAAACCGTCAAGAAGGTCAACCAGGCCGTGGACAGAGCCCAGGACGAGTACACCCAGCGGTCGTACTCGCGGTTCCAGGATGAAGAGGATGACGACGACTACTACCCTGCCGGCGAAACCTATAATGGGGAAGCCAACGATGACGAAGGCTCCAGCGAAGCCACTGAAGGACACGACGAGGACGACGAAATCTACGAAGGAGAATACCAGGGCATCCCTTCGATGAATCAGGCCAAAGATTCAATTGTGTCAGTGGGACAGCCTAAGGGCGACGAGTACAAGGACCGGAGAGAGCTCGAAAGCGAGCGGAGGGCCGACGAAGAGGAACTGGCACAACAGTACGAGCTGATCATCCAGGAGTGTGGGCACGGCCGGTTCCAGTGGGCGCTGTTCTTCGTGCTCGGAATGGCACTGATGGCCGACGGCGTGGAAGTGTTCGTGGTCGGATTCGTGCTGCCCTCGGCCGAAACCGACCTCTGCATTCCCAACTCCGGCTCGGGATGGCTGGGGTCCATCGTGTACCTGGGAATGATGGTCGGCGCCTTCTTCTGGGGTGGCCTGGCAGACAAGGTCGGCCGGAAGCAGTCCCTCTTGATCTGCATGAGCGTCAACGGATTTTTCGCCTTCCTGTCATCATTCGTGCAAGGTTACGGGTTCTTCCTTTTCTGCCGCCTGCTGTCCGGCTTTGGGATCGGCGGGGCTATTCCGACTGTGTTCTCCTACTTTGCCGAAGTGCTGGCTCGCGAAAAACGGGGCGAACACCTTTCCTGGCTGTGTATGTTCTGGATGATCGGCGGCATCTACGCCTCGGCCATGGCCTGGGCTATTATCCCGCATTATGGGTGGTCCTTCTCAATGGGAAGCGCATACCAGTTCCATTCGTGGCGGGTGTTCGTGATCGTGTGCGCCCTCCCGTGTGTGTCCTCCGTGGTGGCTCTGACATTCATGCCGGAGTCACCTCGGTTCTTGTTGGAAGTCGGGAAGCACGACGAAGCCTGGATGATTCTGAAGCTGATCCACGACACTAATATGCGGGCCCGGGGACAGCCTGAGAAAGTGTTCACCGTCAACAAGATTAAGACCCCGAAGCAAATCGATGAACTGATTGAAATTGAGTCCGACACCGGAACTTGGTACCGCCGGTGCTTCGTGCGGATTCGCACCGAGCTGTACGGAATCTGGCTCACCTTCATGCGCTGCTTCAACTACCCCGTGCGCGACAACACCATCAAGCTGACCATCGTGTGGTTCACTCTGTCTTTCGGCTACTATGGGCTGTCAGTGTGGTTCCCGGATGTCATCAAGCCGCTCCAATCCGATGAATACGCCCTGCTGACCCGCAATGTGGAGAGAGACAAATACGCCAACTTCACCATCAATTTCACCATGGAAAACCAGATTCACACCGGAATGGAGTACGACAATGGACGATTCATCGGAGTGAAGTTCAAGAGCGTGACCTTCAAGGACTCGGTGTTCAAGTCCTGTACCTTCGAGGACGTGACCAGCGTGAACACTTATTTTAAGAATTGCACCTTCATCGATACTGTGTTCGATAACACCGACTTCGAGCCCTATAAGTTCATTGACTCGGAGTTCAAGAACTGTTCATTCTTCCACAACAAGACTGGTTGCCAGATCACCTTCGATGACGACTACAGCGCCTACTGGATCTACTTTGTGAACTTTTTGGGAACTCTCGCAGTGCTTCCTGGCAACATTGTGTCCGCACTCCTGATGGATCGGATTGGCAGGCTCACGATGCTTGGGGGGTCCATGGTCCTCTCCGGGATCTCGTGCTTCTTCCTGTGGTTCGGCACCTCGGAGTCCATGATGATCGGAATGTTGTGCCTGTACAACGGTCTGACCATCAGCGCCTGGAACAGCCTCGACGTGGTCACCGTCGAGCTGTATCCTACCGACCGGCGCGCGACAGGCTTCGGATTCCTGAACGCACTGTGCAAGGCAGCCGCGGTCCTGGGAAATCTGATCTTTGGTTCGCTGGTGTCCATCACTAAGAGCATCCCTATTCTGCTCGCCTCCACGGTGCTCGTGTGTGGTGGCCTGGTCGGGCTGTGCCTGCCCGACACTCGCACCCAAGTGCTCATGGACTACAAGGATGACGATGATAAGGGAGACTACAAGGACGATGACGACAAGGGGGATTACAAGGACGACGATGACAAAGGAAGCGGCGCCACTAACTTTTCCCTGCTGAAGCAGGCCGGGGACGTCGAAGAAAACCCCGGGCCAATGCGCAACATTTTCAAGCGGAATCAGGAGCCTATCGTGGCCCCGGCCACCACTACCGCCACTATGCCTATTGGACCTGTCGACAACTCCACGGAATCAGGCGGCGCCGGCGAATCCCAAGAGGACATGTTCGCCAAGCTGAAGGAGAAACTGTTCAACGAAATCAACAAGATTCCCCTCCCGCCGTGGGCCCTGATCGCTATCGCTGTCGTCGCCGGACTGCTGCTGCTTACTTGCTGCTTCTGCATTTGCAAGAAGTGTTGTTGCAAGAAAAAGAAAAACAAGAAGGAAAAGGGGAAGGGAATGAAGAACGCCATGAATATGAAGGACATGAAGGGCGGACAGGATGATGATGATGCTGAAACTGGGCTGACTGAGGGCGAAGGAGAGGGCGAAGAGGAGAAGGAACCTGAGAACCTGGGAAAGCTCCAATTCTCCCTGGATTACGACTTCCAAGCCAACCAGCTGACTGTGGGAGTGTTGCAAGCCGCCGAGCTGCCAGCCCTGGACATGGGCGGCACCTCCGACCCCTATGTGAAGGTGTTCTTGCTGCCTGACAAGAAGAAGAAGTACGAAACCAAGGTGCACCGCAAGACCCTGAACCCCGCTTTCAACGAAACCTTCACTTTCAAAGTGCCCTACCAAGAGCTCGGGGGAAAGACTCTCGTGATGGCGATCTACGACTTCGACCGGTTCAGCAAGCACGATATCATCGGGGAGGTCAAGGTCCCGATGAACACCGTGGACCTTGGCCAACCGATTGAAGAATGGCGCGATCTCCAGGGTGGCGAAAAGGAGGAGCCCGAGAAACTGGGTGACATCTGTACATCACTGCGCTACGTGCCGACCGCCGGGAAGCTCACTGTCTGCATCCTGGAGGCCAAGAACCTGAAGAAAATGGACGTGGGCGGGCTCTCCGACCCTTACGTGAAGATCCACCTGATGCAGAACGGAAAGCGGCTGAAGAAGAAGAAAACCACTGTGAAGAAAAAGACTCTGAACCCCTACTTCAACGAGTCGTTCTCCTTCGAAATCCCGTTTGAGCAAATCCAGAAGGTCCAAGTGGTCGTGACTGTGCTTGACTACGACAAGCTCGGAAAGAACGAGGCCATTGGCAAAATCTTCGTGGGATCGAACGCAACTGGCACCGAGCTGAGACACTGGTCTGACATGCTCGCCAACCCAAGGCGGCCGATTGCTCAGTGGCACTCCTTGAAACCTGAGGAAGAAGTGGATGCCCTTCTTGGAAAGAACAAGATGTACCCCTACGACGTCCCTGATTACGCGGGATACCCGTACGATGTGCCTGACTATGCCGGCTACCCGTACGATGTGCCAGACTACGCTGGCTCCGGAGCCACGAACTTTTCGCTGCTGAAACAGGCCGGCGACGTGGAAGAAAATCCCGGTCCAATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCTGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACATGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAGGAACATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAGGAACTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGATAG
配列番号5
ATGTCCCCATGTGGACGAGCGCGCAGACAGACCTCAAGAGGAGCGATGGCCGTGCTGGCCTGGAAGTTCCCGAGGACTCGCCTGCCCATGGGAGCCTCTGCTCTGTGTGTGGTCGTGCTGTGTTGGCTGTACATCTTCCCGGTGTACCGGCTGCCTAACGAAAAGGAAATTGTGCAGGGCGTGCTCCAGCAGGGGACCGCTTGGCGGCGCAACCAGACCGCTGCGAGGGCTTTTCGGAAGCAGATGGAAGATTGTTGCGACCCCGCCCATCTTTTCGCGATGACCAAGATGAACAGCCCGATGGGAAAGTCCATGTGGTACGACGGAGAGTTCCTGTATTCCTTCACCATTGACAACAGCACTTACTCACTGTTCCCGCAAGCCACCCCCTTCCAACTGCCGCTTAAGAAGTGCGCCGTCGTGGGGAACGGCGGCATCCTCAAGAAGTCCGGATGCGGGCGCCAGATTGATGAAGCCAACTTCGTGATGCGGTGCAATCTCCCGCCACTCTCGTCCGAGTACACCAAGGACGTGGGGTCAAAGTCGCAGCTCGTCACCGCCAACCCTTCGATCATCAGACAACGGTTCCAGAACCTTCTGTGGAGCCGGAAAACATTTGTGGATAACATGAAGATCTACAACCATTCCTACATCTATATGCCTGCCTTCTCCATGAAAACTGGAACCGAACCCTCCCTGAGAGTGTACTACACCCTGTCCGACGTGGGCGCAAACCAGACCGTCCTTTTCGCCAACCCCAACTTCCTGCGCTCCATCGGAAAGTTCTGGAAGTCCAGAGGCATTCACGCGAAACGCTTGTCCACTGGATTGTTCTTGGTGTCCGCCGCTCTGGGCCTGTGCGAGGAAGTGGCCATATACGGATTCTGGCCTTTCTCCGTCAACATGCACGAGCAGCCCATCTCCCACCATTATTACGACAATGTCCTGCCTTTCTCGGGATTTCACGCGATGCCCGAGGAGTTCTTGCAACTGTGGTACCTTCACAAGATCGGTGCCCTGCGGATGCAGCTGGACCCTTGCGAGGACACCTCGCTGCAACCCACCTCGGAGCAGAAACTCATTTCCGAAGAGGATCTGAACGGGGAGCAGAAGCTCATCTCCGAGGAGGACCTGAACGGAGAACAGAAGCTGATTAGCGAAGAGGACCTGGGCAGCGGTGCCACCAATTTTTCTCTGCTCAAGCAGGCCGGAGATGTGGAAGAGAACCCGGGTCCCATGGAGGACTCCTACAAAGATCGGACTTCTCTGATGAAGGGAGCCAAGGACATCGCCAGGGAAGTGAAGAAGCAAACCGTCAAGAAGGTCAACCAGGCCGTGGACAGAGCCCAGGACGAGTACACCCAGCGGTCGTACTCGCGGTTCCAGGATGAAGAGGATGACGACGACTACTACCCTGCCGGCGAAACCTATAATGGGGAAGCCAACGATGACGAAGGCTCCAGCGAAGCCACTGAAGGACACGACGAGGACGACGAAATCTACGAAGGAGAATACCAGGGCATCCCTTCGATGAATCAGGCCAAAGATTCAATTGTGTCAGTGGGACAGCCTAAGGGCGACGAGTACAAGGACCGGAGAGAGCTCGAAAGCGAGCGGAGGGCCGACGAAGAGGAACTGGCACAACAGTACGAGCTGATCATCCAGGAGTGTGGGCACGGCCGGTTCCAGTGGGCGCTGTTCTTCGTGCTCGGAATGGCACTGATGGCCGACGGCGTGGAAGTGTTCGTGGTCGGATTCGTGCTGCCCTCGGCCGAAACCGACCTCTGCATTCCCAACTCCGGCTCGGGATGGCTGGGGTCCATCGTGTACCTGGGAATGATGGTCGGCGCCTTCTTCTGGGGTGGCCTGGCAGACAAGGTCGGCCGGAAGCAGTCCCTCTTGATCTGCATGAGCGTCAACGGATTTTTCGCCTTCCTGTCATCATTCGTGCAAGGTTACGGGTTCTTCCTTTTCTGCCGCCTGCTGTCCGGCTTTGGGATCGGCGGGGCTATTCCGACTGTGTTCTCCTACTTTGCCGAAGTGCTGGCTCGCGAAAAACGGGGCGAACACCTTTCCTGGCTGTGTATGTTCTGGATGATCGGCGGCATCTACGCCTCGGCCATGGCCTGGGCTATTATCCCGCATTATGGGTGGTCCTTCTCAATGGGAAGCGCATACCAGTTCCATTCGTGGCGGGTGTTCGTGATCGTGTGCGCCCTCCCGTGTGTGTCCTCCGTGGTGGCTCTGACATTCATGCCGGAGTCACCTCGGTTCTTGTTGGAAGTCGGGAAGCACGACGAAGCCTGGATGATTCTGAAGCTGATCCACGACACTAATATGCGGGCCCGGGGACAGCCTGAGAAAGTGTTCACCGTCAACAAGATTAAGACCCCGAAGCAAATCGATGAACTGATTGAAATTGAGTCCGACACCGGAACTTGGTACCGCCGGTGCTTCGTGCGGATTCGCACCGAGCTGTACGGAATCTGGCTCACCTTCATGCGCTGCTTCAACTACCCCGTGCGCGACAACACCATCAAGCTGACCATCGTGTGGTTCACTCTGTCTTTCGGCTACTATGGGCTGTCAGTGTGGTTCCCGGATGTCATCAAGCCGCTCCAATCCGATGAATACGCCCTGCTGACCCGCAATGTGGAGAGAGACAAATACGCCAACTTCACCATCAATTTCACCATGGAAAACCAGATTCACACCGGAATGGAGTACGACAATGGACGATTCATCGGAGTGAAGTTCAAGAGCGTGACCTTCAAGGACTCGGTGTTCAAGTCCTGTACCTTCGAGGACGTGACCAGCGTGAACACTTATTTTAAGAATTGCACCTTCATCGATACTGTGTTCGATAACACCGACTTCGAGCCCTATAAGTTCATTGACTCGGAGTTCAAGAACTGTTCATTCTTCCACAACAAGACTGGTTGCCAGATCACCTTCGATGACGACTACAGCGCCTACTGGATCTACTTTGTGAACTTTTTGGGAACTCTCGCAGTGCTTCCTGGCAACATTGTGTCCGCACTCCTGATGGATCGGATTGGCAGGCTCACGATGCTTGGGGGGTCCATGGTCCTCTCCGGGATCTCGTGCTTCTTCCTGTGGTTCGGCACCTCGGAGTCCATGATGATCGGAATGTTGTGCCTGTACAACGGTCTGACCATCAGCGCCTGGAACAGCCTCGACGTGGTCACCGTCGAGCTGTATCCTACCGACCGGCGCGCGACAGGCTTCGGATTCCTGAACGCACTGTGCAAGGCAGCCGCGGTCCTGGGAAATCTGATCTTTGGTTCGCTGGTGTCCATCACTAAGAGCATCCCTATTCTGCTCGCCTCCACGGTGCTCGTGTGTGGTGGCCTGGTCGGGCTGTGCCTGCCCGACACTCGCACCCAAGTGCTCATGGACTACAAGGATGACGATGATAAGGGAGACTACAAGGACGATGACGACAAGGGGGATTACAAGGACGACGATGACAAAGGAAGCGGCGCCACTAACTTTTCCCTGCTGAAGCAGGCCGGGGACGTCGAAGAAAACCCCGGGCCAATGCGCAACATTTTCAAGCGGAATCAGGAGCCTATCGTGGCCCCGGCCACCACTACCGCCACTATGCCTATTGGACCTGTCGACAACTCCACGGAATCAGGCGGCGCCGGCGAATCCCAAGAGGACATGTTCGCCAAGCTGAAGGAGAAACTGTTCAACGAAATCAACAAGATTCCCCTCCCGCCGTGGGCCCTGATCGCTATCGCTGTCGTCGCCGGACTGCTGCTGCTTACTTGCTGCTTCTGCATTTGCAAGAAGTGTTGTTGCAAGAAAAAGAAAAACAAGAAGGAAAAGGGGAAGGGAATGAAGAACGCCATGAATATGAAGGACATGAAGGGCGGACAGGATGATGATGATGCTGAAACTGGGCTGACTGAGGGCGAAGGAGAGGGCGAAGAGGAGAAGGAACCTGAGAACCTGGGAAAGCTCCAATTCTCCCTGGATTACGACTTCCAAGCCAACCAGCTGACTGTGGGAGTGTTGCAAGCCGCCGAGCTGCCAGCCCTGGACATGGGCGGCACCTCCGACCCCTATGTGAAGGTGTTCTTGCTGCCTGACAAGAAGAAGAAGTACGAAACCAAGGTGCACCGCAAGACCCTGAACCCCGCTTTCAACGAAACCTTCACTTTCAAAGTGCCCTACCAAGAGCTCGGGGGAAAGACTCTCGTGATGGCGATCTACGACTTCGACCGGTTCAGCAAGCACGATATCATCGGGGAGGTCAAGGTCCCGATGAACACCGTGGACCTTGGCCAACCGATTGAAGAATGGCGCGATCTCCAGGGTGGCGAAAAGGAGGAGCCCGAGAAACTGGGTGACATCTGTACATCACTGCGCTACGTGCCGACCGCCGGGAAGCTCACTGTCTGCATCCTGGAGGCCAAGAACCTGAAGAAAATGGACGTGGGCGGGCTCTCCGACCCTTACGTGAAGATCCACCTGATGCAGAACGGAAAGCGGCTGAAGAAGAAGAAAACCACTGTGAAGAAAAAGACTCTGAACCCCTACTTCAACGAGTCGTTCTCCTTCGAAATCCCGTTTGAGCAAATCCAGAAGGTCCAAGTGGTCGTGACTGTGCTTGACTACGACAAGCTCGGAAAGAACGAGGCCATTGGCAAAATCTTCGTGGGATCGAACGCAACTGGCACCGAGCTGAGACACTGGTCTGACATGCTCGCCAACCCAAGGCGGCCGATTGCTCAGTGGCACTCCTTGAAACCTGAGGAAGAAGTGGATGCCCTTCTTGGAAAGAACAAGATGTACCCCTACGACGTCCCTGATTACGCGGGATACCCGTACGATGTGCCTGACTATGCCGGCTACCCGTACGATGTGCCAGACTACGCTGGCTCCGGAGCCACGAACTTTTCGCTGCTGAAACAGGCCGGCGACGTGGAAGAAAATCCCGGTCCAATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCTGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACATGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAGGAACATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAGGAACTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGATAG
配列番号6
MSPCGRARRQTSRGAMAVLAWKFPRTRLPMGASALCVVVLCWLYIFPVYRLPNEKEIVQGVLQQGTAWRRNQTAARAFRKQMEDCCDPAHLFAMTKMNSPMGKSMWYDGEFLYSFTIDNSTYSLFPQATPFQLPLKKCAVVGNGGILKKSGCGRQIDEANFVMRCNLPPLSSEYTKDVGSKSQLVTANPSIIRQRFQNLLWSRKTFVDNMKIYNHSYIYMPAFSMKTGTEPSLRVYYTLSDVGANQTVLFANPNFLRSIGKFWKSRGIHAKRLSTGLFLVSAALGLCEEVAIYGFWPFSVNMHEQPISHHYYDNVLPFSGFHAMPEEFLQLWYLHKIGALRMQLDPCEDTSLQPTS
配列番号7
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
配列番号8
MEEGFRDRAAFIRGAKDIAKEVKKHAAKKVVKGLDRVQDEYSRRSYSRFEEEDDDDDFPAPSDGYYRGEGTQDEEEGGASSDATEGHDEDDEIYEGEYQGIPRAESGGKGERMADGAPLAGVRGGLSDGEGPPGGRGEAQRRKEREELAQQYEAILRECGHGRFQWTLYFVLGLALMADGVEVFVVGFVLPSAEKDMCLSDSNKGMLGLIVYLGMMVGAFLWGGLADRLGRRQCLLISLSVNSVFAFFSSFVQGYGTFLFCRLLSGVGIGGSIPIVFSYFSEFLAQEKRGEHLSWLCMFWMIGGVYAAAMAWAIIPHYGWSFQMGSAYQFHSWRVFVLVCAFPSVFAIGALTTQPESPRFFLENGKHDEAWMVLKQVHDTNMRAKGHPERVFSVTHIKTIHQEDELIEIQSDTGTWYQRWGVRALSLGGQVWGNFLSCFGPEYRRITLMMMGVWFTMSFSYYGLTVWFPDMIRHLQAVDYASRTKVFPGERVEHVTFNFTLENQIHRGGQYFNDKFIGLRLKSVSFEDSLFEECYFEDVTSSNTFFRNCTFINTVFYNTDLFEYKFVNSRLINSTFLHNKEGCPLDVTGTGEGAYMVYFVSFLGTLAVLPGNIVSALLMDKIGRLRMLAGSSVMSCVSCFFLSFGNSESAMIALLCLFGGVSIASWNALDVLTVELYPSDKRTTAFGFLNALCKLAAVLGISIFTSFVGITKAAPILFASAALALGSSLALKLPETRGQVLQ
配列番号9
MEDSYKDRTSLMKGAKDIAREVKKQTVKKVNQAVDRAQDEYTQRSYSRFQDEEDDDDYYPAGETYNGEANDDEGSSEATEGHDEDDEIYEGEYQGIPSMNQAKDSIVSVGQPKGDEYKDRRELESERRADEEELAQQYELIIQECGHGRFQWALFFVLGMALMADGVEVFVVGFVLPSAETDLCIPNSGSGWLGSIVYLGMMVGAFFWGGLADKVGRKQSLLICMSVNGFFAFLSSFVQGYGFFLFCRLLSGFGIGGAIPTVFSYFAEVLAREKRGEHLSWLCMFWMIGGIYASAMAWAIIPHYGWSFSMGSAYQFHSWRVFVIVCALPCVSSVVALTFMPESPRFLLEVGKHDEAWMILKLIHDTNMRARGQPEKVFTVNKIKTPKQIDELIEIESDTGTWYRRCFVRIRTELYGIWLTFMRCFNYPVRDNTIKLTIVWFTLSFGYYGLSVWFPDVIKPLQSDEYALLTRNVERDKYANFTINFTMENQIHTGMEYDNGRFIGVKFKSVTFKDSVFKSCTFEDVTSVNTYFKNCTFIDTVFDNTDFEPYKFIDSEFKNCSFFHNKTGCQITFDDDYSAYWIYFVNFLGTLAVLPGNIVSALLMDRIGRLTMLGGSMVLSGISCFFLWFGTSESMMIGMLCLYNGLTISAWNSLDVVTVELYPTDRRATGFGFLNALCKAAAVLGNLIFGSLVSITKSIPILLASTVLVCGGLVGLCLPDTRTQVLM
配列番号10
MDDYKYQDNYGGYAPSDGYYRGNESNPEEDAQSDVTEGHDEEDEIYEGEYQGIPHPDDVKAKQAKMAPSRMDSLRGQTDLMAERLEDEEQLAHQYETIMDECGHGRFQWILFFVLGLALMADGVEVFVVSFALPSAEKDMCLSSSKKGMLGMIVYLGMMAGAFILGGLADKLGRKRVLSMSLAVNASFASLSSFVQGYGAFLFCRLISGIGIGGALPIVFAYFSEFLSREKRGEHLSWLGIFWMTGGLYASAMAWSIIPHYGWGFSMGTNYHFHSWRVFVIVCALPCTVSMVALKFMPESPRFLLEMGKHDEAWMILKQVHDTNMRAKGTPEKVFTVSNIKTPKQMDEFIEIQSSTGTWYQRWLVRFKTIFKQVWDNALYCVMGPYRMNTLILAVVWFAMAFSYYGLTVWFPDMIRYFQDEEYKSKMKVFFGEHVYGATINFTMENQIHQHGKLVNDKFTRMYFKHVLFEDTFFDECYFEDVTSTDTYFKNCTIESTIFYNTDLYEHKFINCRFINSTFLEQKEGCHMDLEQDNDFLIYLVSFLGSLSVLPGNIISALLMDRIGRLKMIGGSMLISAVCCFFLFFGNSESAMIGWQCLFCGTSIAAWNALDVITVELYPTNQRATAFGILNGLCKFGAILGNTIFASFVGITKVVPILLAAASLVGGGLIALRLPETREQVLM
配列番号11
FPDMIRHLQAVDYASRTKVFPGERVEHVTFNFTLENQIHRGGQYFNDKFIGLRLKSVSFEDSLFEECYFEDVTSSNTFFRNCTFINTVFYNTDLFEYKFVNSRLINSTFLHNKEGCPLDVTGTGEGAY
配列番号12
WFPDMIRYFQDEEYKSKMKVFFGEHVYGATINFTMENQIHQHGKLVNDKFTRMYFKHVLFEDTFFDECYFEDVTSTDTYFKNCTIESTIFYNTDLYEHKFINCRFINSTFLEQKEGCHMDLEQDNDFLIY
配列番号13
WFPDVIKPLQSDEYALLTRNVERDKYANFTINFTMENQIHTGMEYDNGRFIGVKFKSVTFKDSVFKSCTFEDVTSVNTYFKNCTFIDTVFDNTDFEPYKFIDSEFKNCSFFHNKTGCQITFDDDYSAY
配列番号14
MVSESHHEALAAPPVTTVATVLPSNATEPASPGEGKEDAFSKLKEKFMNELHKIPLPPWALIAIAIVAVLLVLTCCFCICKKCLFKKKNKKKGKEKGGKNAINMKDVKDLGKTMKDQALKDDDAETGLTDGEEKEEPKEEEKLGKLQYSLDYDFQNNQLLVGIIQAAELPALDMGGTSDPYVKVFLLPDKKKKFETKVHRKTLNPVFNEQFTFKVPYSELGGKTLVMAVYDFDRFSKHDIIGEFKVPMNTVDFGHVTEEWRDLQSAEKEEQEKLGDICFSLRYVPTAGKLTVVILEAKNLKKMDVGGLSDPYVKIHLMQNGKRLKKKKTTIKKNTLNPYYNESFSFEVPFEQIQKVQVVVTVLDYDKIGKNDAIGKVFVGYNSTGAELRHWSDMLANPRRPIAQWHTLQVEEEVDAMLAVKK
配列番号15
MRNIFKRNQEPIVAPATTTATMPIGPVDNSTESGGAGESQEDMFAKLKEKLFNEINKIPLPPWALIAIAVVAGLLLLTCCFCICKKCCCKKKKNKKEKGKGMKNAMNMKDMKGGQDDDDAETGLTEGEGEGEEEKEPENLGKLQFSLDYDFQANQLTVGVLQAAELPALDMGGTSDPYVKVFLLPDKKKKYETKVHRKTLNPAFNETFTFKVPYQELGGKTLVMAIYDFDRFSKHDIIGEVKVPMNTVDLGQPIEEWRDLQGGEKEEPEKLGDICTSLRYVPTAGKLTVCILEAKNLKKMDVGGLSDPYVKIHLMQNGKRLKKKKTTVKKKTLNPYFNESFSFEIPFEQIQKVQVVVTVLDYDKLGKNEAIGKIFVGSNATGTELRHWSDMLANPRRPIAQWHSLKPEEEVDALLGKNK
配列番号16
MVSKGEAVIKEFMRFKVHMEGSMNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFSWDILSPQFMYGSRAFTKHPADIPDYYKQSFPEGFKWERVMNFEDGGAVTVTQDTSLEDGTLIYKVKLRGTNFPPDGPVMQKKTMGWEASTERLYPEDGVLKGDIKMALRLKDGGRYLADFKTTYKAKKPVQMPGAYNVDRKLDITSHNEDYTVVEQYERSEGRHSTGGMDELYK
配列番号17
MASLPATHELHIFGSINGVDFDMVGQGTGNPNDGYEELNLKSTKGDLQFSPWILVPHIGYGFHQYLPYPDGMSPFQAAMVDGSGYQVHRTMQFEDGASLTVNYRYTYEGSHIKGEAQVKGTGFPADGPVMTNSLTAADWCRSKKTYPNDKTIISTFKWSYTTGNGKRYRSTARTTYTFAKPMAANYLKNQPMYVFRKTELKHSKTELNFKEWQKAFTGFEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQ
配列番号18
LFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLSWGVQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYFSDNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGGVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSKLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGL
配列番号19
MAEDADMRNELEEMQRRADQLADESLESTRRMLQLVEESKDAGIRTLVMLDEQGEQLERIEEGMDQINKDMKEAEKNLTDLGKFCGLCVCPCNKLKSSDAYKKAWGNNQDGVVASQPARVVDEREQMAISGGFIRRVTNDARENEMDENLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRIDEANQRATKMLGSG
配列番号20
MIEQDGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDAAVFRLSAQGRPVLFVKTDLSGALNELQDEAARLSWLATTGVPCAAVLDVVTEAGRDWLLLGEVPGQDLLSSHLAPAEKVSIMADAMRRLHTLDPATCPFDHQAKHRIERARTRMEAGLVDQDDLDEEHQGLAPAELFARLKARMPDGEDLVVTHGDACLPNIMVENGRFSGFIDCGRLGVADRYQDIALATRDIAEELGGEWADRFLVLYGIAAPDSQRIAFYRLLDEFF
配列番号21
MTEYKPTVRLATRDDVPRAVRTLAAAFADYPATRHTVDPDRHIERVTELQELFLTRVGLDIGKVWVADDGAAVAVWTTPESVEAGAVFAEIGPRMAELSGSRLAAQQQMEGLLAPHRPKEPAWFLATVGVSPDHQGKGLGSAVVLPGVEAAERAGVPAFLETSAPRNLPFYERLGFTVTADVEVPEGPRTWCMTRKPGA
配列番号22
HTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILA
[図4]
Average Cell counts in HPF: HPF中の平均細胞数
Toxin concntrations: 毒素濃度
[図5、図6、図7、図8]
FS Lin: FS線形
SS Log: SS対数
FITC Log: FITC対数
PE Log: PE対数
PE-Texas Red Log: PE-テキサスレッド対数
7AAD Log: 7AAD対数
PE-Cy7 Log: PE-Cy7対数
Regi...: 領域
Count: カウント
% Hist: ヒストグラム%
Mean: 平均
Total: 全体
[図9]
NG108 mScarlet-SNAP25-GeNluc 2a Puro R BoNT/A and /E cleavage experiment: NG108 mScarlet-SNAP25-GeNluc 2a Puro R BoNT/Aおよび/E切断実験
Indicator with puro R: Puro Rを有する指標
Indicator without puro R: Puro Rを有さない指標
Indicator N-terminal cleavage product BoNT/A: 指標N末端側切断生成物BoNT/A
Endogenous SNAP25 and cleavage product: 内因性SNAP25および切断生成物
Indicator N-terminal cleavage products BoNT/E: 指標N末端側切断生成物BoNT/E
No Toxin: 毒素なし
[図10F]
merge: マージ
[図13]
Percent SNAP25 Cleavaed: 切断されたSNAP25パーセント
[図14]
Untreated: 未処置
Red Fluorescence: 赤色蛍光
Green Fluorescence: 緑色蛍光
Sort gate Single Cells: ソートゲートシングルセル
Sort gage: ソートゲート
Average Cell counts in HPF: HPF中の平均細胞数
Toxin concntrations: 毒素濃度
[図5、図6、図7、図8]
FS Lin: FS線形
SS Log: SS対数
FITC Log: FITC対数
PE Log: PE対数
PE-Texas Red Log: PE-テキサスレッド対数
7AAD Log: 7AAD対数
PE-Cy7 Log: PE-Cy7対数
Regi...: 領域
Count: カウント
% Hist: ヒストグラム%
Mean: 平均
Total: 全体
[図9]
NG108 mScarlet-SNAP25-GeNluc 2a Puro R BoNT/A and /E cleavage experiment: NG108 mScarlet-SNAP25-GeNluc 2a Puro R BoNT/Aおよび/E切断実験
Indicator with puro R: Puro Rを有する指標
Indicator without puro R: Puro Rを有さない指標
Indicator N-terminal cleavage product BoNT/A: 指標N末端側切断生成物BoNT/A
Endogenous SNAP25 and cleavage product: 内因性SNAP25および切断生成物
Indicator N-terminal cleavage products BoNT/E: 指標N末端側切断生成物BoNT/E
No Toxin: 毒素なし
[図10F]
merge: マージ
[図13]
Percent SNAP25 Cleavaed: 切断されたSNAP25パーセント
[図14]
Untreated: 未処置
Red Fluorescence: 赤色蛍光
Green Fluorescence: 緑色蛍光
Sort gate Single Cells: ソートゲートシングルセル
Sort gage: ソートゲート
Claims (55)
- クロストリジウム神経毒に対して感受性を示す細胞の集団を進化させる方法であって、
(a)細胞の集団をクロストリジウム神経毒と接触させるステップであって、前記集団が以下を発現する細胞を含むステップと、
i.クロストリジウム神経毒によって切断可能である指標タンパク質、および
ii.クロストリジウム神経毒に対して結合親和性を有する受容体および/またはガングリオシド(好ましくは、受容体およびガングリオシド)
(b)指標タンパク質の切断を示す細胞を同定するステップと、
(c)ステップb)で同定された細胞を単離するステップと、
(d)前記一連のステップ(a)～(c)の反復を少なくとも1回実施するステップとを含み、ステップ(a)で使用される細胞の集団が、ステップ(c)で単離された細胞および/もしくはその子孫の細胞を含む、またはからなり、
随意により、各反復の前に、先行するステップc)で単離された細胞を、この細胞の数が先行するステップa)における細胞の数と実質的に同等となるまで培養する、方法。 - クロストリジウム神経毒に対して高度に感受性である細胞の集団を作製する方法であって、
(a)指標タンパク質を発現する組換え細胞を、クロストリジウム神経毒と接触させることと、
(b)その後、指標タンパク質の切断を示す細胞を選択することと
を含む、方法。 - ステップ(a)が、クロストリジウム神経毒を含む培地中で細胞を培養することを含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
- ステップ(a)が、約0.0001～約10,000pMの濃度のクロストリジウム神経毒を含む培地中で細胞を培養することを含む、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)が、クロストリジウム神経毒を含む培地中で細胞を約2時間以上培養することを含む、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)が、指標タンパク質の切断が生じたか否かを決定することを含む、請求項2から5のいずれか一項に記載の方法。
- 指標タンパク質が、SNAREドメインを含む、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 指標タンパク質が、(i)シンタキシン、(ii)シナプトブレビン、(iii)SNAP-25、または(iv)そのバリアントもしくは断片であって野生型クロストリジウム神経毒のプロテアーゼ成分によるタンパク質分解に対して感受性であるもの、好ましくは、SNAP-25のアミノ酸配列を含む、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 指標タンパク質が標識される、好ましくは、1以上の蛍光タンパク質標識のアミノ酸配列で標識される、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 指標タンパク質が、C末端側標識、好ましくは、N末端側標識およびC末端側標識を含み、好ましくは、N末端側標識およびC末端側標識が識別可能である、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 指標タンパク質が、(i)SNAP-25またはそのバリアントもしくは断片、(ii)N末端側標識、および(iii)C末端側標識のアミノ酸配列を含む、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 指標タンパク質が、mScarletのアミノ酸配列およびNeonGreenのアミノ酸配列で標識される、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 指標タンパク質が、N末端側標識としてmScarletの、およびC末端側標識としてNeonGreenのアミノ酸配列で標識される、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 指標タンパク質の切断が、C末端側標識からのシグナルを測定することによってアッセイされ、好ましくは、クロストリジウム神経毒との接触の間またはその後の(例えば、ステップ(a)の間またはその後の)C末端側標識の減少が、指標タンパク質の切断を示し、好ましくは、クロストリジウム神経毒との接触の間またはその後の(例えば、ステップ(a)の間またはその後の)C末端側標識の減少によって、指標タンパク質の切断が確認される、請求項10から13のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が、指標タンパク質を発現(または過剰発現)するように遺伝子改変されている、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞中に指標タンパク質をコードする核酸を導入することによって、細胞の集団または組換え細胞(例えば、ステップ(a)の)が生成される、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 組換え細胞または細胞の集団(例えば、ステップaの)中に指標タンパク質をコードする核酸を導入することをさらに含む、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 指標タンパク質が、クロストリジウム神経毒またはそのタンパク質分解活性ドメインの不在下で切断されない、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 指標タンパク質が、細胞において容易に分解されないが、その切断後、得られた断片のうち1つ(好ましくは、C末端側断片)が分解される、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 指標タンパク質がC末端側標識を含み、C末端側標識が、クロストリジウム神経毒またはそのタンパク質分解活性ドメインの不在下で指標タンパク質から放出(例えば、切断除去)されない、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 指標タンパク質がC末端側標識を含み、細胞では全長指標タンパク質が容易に分解されないが、その切断後に、得られたC末端側断片が分解され、C末端側断片の分解がC末端側標識の分解をもたらす、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 指標タンパク質がC末端側標識を含み、細胞では全長指標タンパク質が容易に分解されないが、その切断後に、得られたC末端側断片が分解され、C末端側断片の分解がC末端側標識の分解をもたらし、指標タンパク質の切断が、細胞(複数可)をクロストリジウム神経毒と接触させた後のC末端側標識からのシグナルを測定することによって決定され、好ましくは、クロストリジウム神経毒との接触の間またはその後の(例えば、ステップ(a)の間またはその後の)C末端側標識の減少が、指標タンパク質の切断を示し、より好ましくは、クロストリジウム神経毒との接触の間またはその後の(例えば、ステップ(a)の間またはその後の)C末端側標識の減少によって、指標タンパク質の切断が確認される、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 接触後、細胞を溶解し、得られた細胞溶解物を抗体と接触させ、ウエスタンブロットを実施する、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ステップa)の細胞が、クロストリジウム神経毒に対して結合親和性を有する受容体をコードする外因性核酸および/またはクロストリジウム神経毒に対して結合親和性を有するガングリオシドの発現を提供する外因性核酸、好ましくは、前記受容体をコードする外因性核酸および前記ガングリオシドの発現を提供する外因性核酸を含む、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の接触ステップ(例えば、ステップa))の前に、細胞中に、クロストリジウム神経毒受容体もしくはそのバリアントもしくは断片であってクロストリジウム神経毒に結合する能力を有するもの、および/または、ガングリオシド合成経路の酵素もしくはそのバリアントもしくは断片であってこのような酵素の触媒活性を有するもの、をコードする外因性核酸を導入すること含む、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ステップa)の細胞が、ガングリオシド合成経路の酵素(またはそのバリアントもしくは断片であってこのような酵素の触媒活性を有するもの)をコードする外因性核酸を含む、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ステップa)の細胞が、グルコシルセラミドシンターゼ、GalT-I、GalNAcT、GM3シンターゼ、GD3シンターゼ、GT3シンターゼ、ガラクトシルセラミドシンターゼ、GM4シンターゼ、GalT-II、ST-IVまたはST-Vまたはそのバリアントもしくは断片であってこのような酵素の触媒活性を有するもの、好ましくは、GD3シンターゼまたはそのバリアントもしくは断片であってGD3シンターゼの触媒活性を有するもの、より好ましくは、GD3シンターゼをコードする外因性核酸を含む、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞(例えば、ステップ(a)の)が、前記核酸を欠く(好ましくは、前記外因性核酸を欠く)細胞と比較した場合に、より多くの受容体および/またはガングリオシドを発現する(例えば、ガングリオシド合成経路の酵素またはそのバリアントもしくは断片であってこのような酵素の触媒活性を有するものを介して)、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞が、クロストリジウム神経毒に結合する能力を有するタンパク質受容体またはそのバリアントもしくは断片を発現または過剰発現するように遺伝子改変されている、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 受容体が、SV2またはシナプトタグミン(またはそのバリアントもしくは断片であってクロストリジウム神経毒に結合する能力を有するもの)である、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 受容体が、SV2(またはそのバリアントもしくは断片であってクロストリジウム神経毒に結合する能力を有するもの)である、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 受容体が、SV2AまたはSV2C、好ましくは、SV2A(またはそのバリアントもしくは断片であってクロストリジウム神経毒に結合する能力を有するもの)である、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 受容体が、SV2AまたはSV2Cの第4の管腔ドメインである、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸(好ましくは、外因性核酸)が、トランスフェクションによって導入される、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞を、(i)クロストリジウム神経毒受容体もしくはそのバリアントもしくは断片であってクロストリジウム神経毒に結合する能力を有するもの、および/または(ii)ガングリオシド合成経路の酵素もしくはそのバリアントもしくは断片であってこのような酵素の触媒活性を有するものを発現するように遺伝子改変することによって、組換え細胞が生成される、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 選択または単離された細胞が、細胞中に存在する指標タンパク質の20%以上が、切断生成物に変換されているものである、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)および(b)が、それ以前のステップ(b)の反復回において選択された細胞を使用して少なくとも1回繰り返される、請求項2から36のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)の各反復で、細胞を、それらが先行する反復回のステップ(a)の間に接触したものよりも少ないクロストリジウム神経毒と接触させる、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(a)および(b)が繰り返される前に、先行するステップ(b)の反復回において選択された細胞を、このような細胞の数が、最初の組換え細胞の集団中に存在した数とおよそ同一となるまで培養し、および/または前記少なくとも1回の反復の各々の前に、指標タンパク質の切断を示す細胞を単離するという先行するステップにおいて選択された細胞を、このような細胞の数が、最初の細胞の集団中に存在した数とおよそ同一となるまで培養する、請求項37または38に記載の方法。
- 細胞(例えば、ステップaの)が、神経細胞、非神経細胞、神経内分泌細胞、胚性腎臓細胞、乳癌細胞、神経芽細胞腫細胞または神経芽細胞腫-神経膠腫ハイブリッド細胞、好ましくは、非神経細胞である、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞(例えば、ステップaの)が、神経芽細胞腫細胞または神経芽細胞腫-神経膠腫細胞である、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞(例えば、ステップaの)が、神経芽細胞腫-神経膠腫細胞である、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞(例えば、ステップaの)が、NG108細胞である、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ガングリオシドが、GM1a、GD1a、GD1b、GT1bおよびGQ1bから選択され、好ましくは、細胞(例えば、ステップaの)が、GM1a、GD1a、GD1b、GT1bおよび/またはGQ1bを発現または過剰発現するように遺伝子改変されている、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ガングリオシドが、GD1a、GD1bおよびGT1bから選択され、好ましくは、細胞(例えば、ステップ(a)の)が、GD1a、GD1bおよび/またはGT1bを発現または過剰発現するように遺伝子改変されている、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- ガングリオシドが、GD1bおよびGT1bから選択され、好ましくは、細胞(例えば、ステップ(a)の)が、GD1bおよび/またはGT1bを発現または過剰発現するように遺伝子改変されている、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- クロストリジウム神経毒がボツリヌス神経毒である、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- クロストリジウム神経毒が、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/GおよびBoNT/Hから選択される、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- クロストリジウム神経毒がBoNT/Aである、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- クロストリジウム神経毒がBoNT/Eである、請求項1から48のいずれか一項に記載の方法。
- ステップa)(例えば、細胞の集団をクロストリジウム神経毒と接触させるステップまたは指標タンパク質を発現する組換え細胞をクロストリジウム神経毒と接触させるステップ)において、クロストリジウム神経毒が、約0.0001～約100,000pM、約0.0001～約50,000pM、約0.0001～約20,000pM、0.0001～約10,000pM、約0.0001～約1,000pM、約0.0001～約500pM、約0.0001～約300pM、約0.0001～約100pM、約0.0001～約10pMまたは約0.0001～約1pMの濃度で存在する、前記の請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から51のいずれか一項に記載の方法によって生成された集団に由来する細胞。
- 請求項1から51のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる細胞集団。
- 修飾されたまたは組換え神経毒の活性を決定するアッセイであって、
(a)請求項52または53に記載の細胞を修飾または組換え神経毒と、細胞において野生型クロストリジウム神経毒のプロテアーゼドメインが指標タンパク質を切断することを可能にするのに十分である条件下および時間の間、接触させることと、
(b)指標タンパク質の切断に起因する生成物の存在を決定することと
を含む、アッセイ。 - クロストリジウム神経毒製剤の活性を特性決定する、または治療的(および/または美容的)使用のためのクロストリジウム神経毒製剤を同定するin vitro法であって、
a.請求項1から51のいずれか一項に記載の方法によって調製された細胞集団または請求項52もしくは53に記載の細胞集団を提供することと、
b.前記細胞集団をクロストリジウム神経毒製剤と接触させることと、
c.クロストリジウム神経毒製剤との接触後の指標タンパク質の切断のレベルを、クロストリジウム神経毒製剤との接触前の切断のレベルと比較することと、
d.(i)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが増大される場合に、クロストリジウム神経毒製剤を治療的(および/または美容的)使用に適していると同定することもしくは(ii)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが増大される場合に、活性の存在を同定すること、または
e.(i)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが増大されない場合に、クロストリジウム神経毒製剤を治療的(および/または美容的)使用に適していないと同定することもしくは(ii)接触後の指標タンパク質の切断のレベルが増大されない場合に、活性の非存在を同定することと
を含む、in vitro法。
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