JP2017535274A - 神経毒ポリペプチドの生物学的活性を測定する方法 - Google Patents
神経毒ポリペプチドの生物学的活性を測定する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017535274A JP2017535274A JP2017527367A JP2017527367A JP2017535274A JP 2017535274 A JP2017535274 A JP 2017535274A JP 2017527367 A JP2017527367 A JP 2017527367A JP 2017527367 A JP2017527367 A JP 2017527367A JP 2017535274 A JP2017535274 A JP 2017535274A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- neurotoxin
- protein
- bont
- cells
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 title claims abstract description 264
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 title claims abstract description 261
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 title claims abstract description 249
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 80
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 title claims abstract description 60
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title description 86
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title description 86
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title description 86
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 166
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 160
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 99
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 99
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 48
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 48
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 29
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 278
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 claims description 114
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 31
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 18
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 claims description 11
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 claims description 11
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 claims description 9
- 229960001231 choline Drugs 0.000 claims description 9
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 8
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 8
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 claims description 8
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 8
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 8
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 8
- 102000003834 Histamine H1 Receptors Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000110 Histamine H1 Receptors Proteins 0.000 claims description 7
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 6
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 6
- 108091006275 SLC5A7 Proteins 0.000 claims description 6
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 241000239290 Araneae Species 0.000 claims description 3
- 108010065693 Clostridium perfringens theta-toxin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 101710183389 Pneumolysin Proteins 0.000 claims description 3
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 claims description 3
- BQSPOPBPQURHDF-QVYRLLROSA-N (4s)-2-amino-5-[(1r)-2-amino-1-hydroxyethyl]-4,5-dihydro-1h-imidazole-4-carboxylic acid Chemical compound NC[C@@H](O)C1NC(N)=N[C@@H]1C(O)=O BQSPOPBPQURHDF-QVYRLLROSA-N 0.000 claims description 2
- BQSPOPBPQURHDF-UHFFFAOYSA-N Streptolidine Natural products NCC(O)C1NC(N)=NC1C(O)=O BQSPOPBPQURHDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract description 2
- 229940053031 botulinum toxin Drugs 0.000 description 94
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 38
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 31
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 26
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 24
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 24
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 22
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 22
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 22
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 17
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 17
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 16
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 11
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 11
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 9
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 102100030552 Synaptosomal-associated protein 25 Human genes 0.000 description 8
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 8
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 8
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 8
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 8
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 8
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 108010057722 Synaptosomal-Associated Protein 25 Proteins 0.000 description 7
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 7
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 7
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 7
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 7
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 7
- 231100001103 botulinum neurotoxin Toxicity 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 description 6
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 5
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 5
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 4
- 101000584505 Homo sapiens Synaptic vesicle glycoprotein 2A Proteins 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 102100030701 Synaptic vesicle glycoprotein 2A Human genes 0.000 description 4
- 108030001722 Tentoxilysin Proteins 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 210000002243 primary neuron Anatomy 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 201000009051 Embryonal Carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 3
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000004031 neuronal differentiation Effects 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 3
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 3
- 108010075210 streptolysin O Proteins 0.000 description 3
- 210000002504 synaptic vesicle Anatomy 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 108700020534 tetracycline resistance-encoding transposon repressor Proteins 0.000 description 3
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 3
- HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N (4S)-2-(6,7-dihydro-5H-pyrrolo[3,2-f][1,3]benzothiazol-2-yl)-4,5-dihydro-1,3-thiazole-4-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(=N1)c1nc2cc3CCNc3cc2s1 HBZBAMXERPYTFS-SECBINFHSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 2
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 2
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 102000000583 SNARE Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010041948 SNARE Proteins Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000004350 Strabismus Diseases 0.000 description 2
- 108010057266 Type A Botulinum Toxins Proteins 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 206010005159 blepharospasm Diseases 0.000 description 2
- 230000000744 blepharospasm Effects 0.000 description 2
- -1 cells Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 231100000189 neurotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M rubidium chloride Chemical compound [Cl-].[Rb+] FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108090000363 Bacterial Luciferases Proteins 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 101710117542 Botulinum neurotoxin type A Proteins 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000002110 C2 domains Human genes 0.000 description 1
- 108050009459 C2 domains Proteins 0.000 description 1
- XMWRBQBLMFGWIX-UHFFFAOYSA-N C60 fullerene Chemical class C12=C3C(C4=C56)=C7C8=C5C5=C9C%10=C6C6=C4C1=C1C4=C6C6=C%10C%10=C9C9=C%11C5=C8C5=C8C7=C3C3=C7C2=C1C1=C2C4=C6C4=C%10C6=C9C9=C%11C5=C5C8=C3C3=C7C1=C1C2=C4C6=C2C9=C5C3=C12 XMWRBQBLMFGWIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 208000014094 Dystonic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 208000008454 Hyperhidrosis Diseases 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241000254158 Lampyridae Species 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 101710164436 Listeriolysin O Proteins 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 108010063737 Myristoylated Alanine-Rich C Kinase Substrate Proteins 0.000 description 1
- 102000015695 Myristoylated Alanine-Rich C Kinase Substrate Human genes 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 241001483952 Peach chlorotic mottle virus Species 0.000 description 1
- 108010056995 Perforin Proteins 0.000 description 1
- 102000004503 Perforin Human genes 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010044074 Torticollis Diseases 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 108010079650 abobotulinumtoxinA Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 108091006088 activator proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001042 autoregulative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 1
- 230000009141 biological interaction Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940089093 botox Drugs 0.000 description 1
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000002866 cervical dystonia Diseases 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000013500 data storage Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 229940098753 dysport Drugs 0.000 description 1
- 208000010118 dystonia Diseases 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003617 erythrocyte membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 229910003472 fullerene Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-UHFFFAOYSA-N gentamicin Chemical compound O1C(C(C)NC)CCC(N)C1OC1C(O)C(OC2C(C(NC)C(C)(O)CO2)O)C(N)CC1N CEAZRRDELHUEMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 231100000767 hemotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037315 hyperhidrosis Effects 0.000 description 1
- 229960004716 idoxuridine Drugs 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 108010024001 incobotulinumtoxinA Proteins 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000007422 luminescence assay Methods 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229960003248 mifepristone Drugs 0.000 description 1
- VKHAHZOOUSRJNA-GCNJZUOMSA-N mifepristone Chemical compound C1([C@@H]2C3=C4CCC(=O)C=C4CC[C@H]3[C@@H]3CC[C@@]([C@]3(C2)C)(O)C#CC)=CC=C(N(C)C)C=C1 VKHAHZOOUSRJNA-GCNJZUOMSA-N 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 230000023105 myelination Effects 0.000 description 1
- 230000007498 myristoylation Effects 0.000 description 1
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003757 neuroblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 230000003957 neurotransmitter release Effects 0.000 description 1
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000005868 ontogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000026792 palmitoylation Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000004197 pelvis Anatomy 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 108010094020 polyglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 210000000063 presynaptic terminal Anatomy 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000006862 quantum yield reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000003571 reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229940102127 rubidium chloride Drugs 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 1
- 208000001608 teratocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 230000007888 toxin activity Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
- 229940018272 xeomin Drugs 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6806—Determination of free amino acids
- G01N33/6809—Determination of free amino acids involving fluorescent derivatizing reagents reacting non-specifically with all amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70571—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for neuromediators, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/33—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Clostridium (G)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本発明は、神経毒の生物学的活性を測定する方法に関し、該方法は、（ａ）神経毒感受性細胞において、（ｉ）アンカー型タンパク質と、（ｉｉ）レポータータンパク質と、（ｉｉｉ）該アンカー型タンパク質と該レポータータンパク質との間に介在する神経毒切断部位とを含む融合タンパク質を発現させ、（ｂ）（ａ）の神経毒感受性細胞を神経毒とともにインキュベートし、その細胞を、神経毒がその生物学的活性を示すことができる条件下で培養し、（ｃ）（ｂ）の神経毒感受性細胞への透過処理を、該透過処理した神経毒感受性細胞からレポータータンパク質は遊離するがアンカー型タンパク質は遊離しない条件下で行い、かつ（ｄ）細胞から遊離したレポータータンパク質の活性を定量化し、これにより神経毒の生物学的活性を測定するステップを含む。さらに、本発明は、神経毒感受性細胞において、神経毒の生物学的活性を測定するための、（ｉ）アンカー型タンパク質と、（ｉｉ）レポータータンパク質と、（ｉｉｉ）該アンカー型タンパク質と該レポータータンパク質との間に介在する神経毒切断部位とを含む融合タンパク質に関する。本発明は、本発明の融合タンパク質を含むキットをさらに包含する。最後に、本発明は、神経毒感受性細胞において、神経毒の生物学的活性を測定するために本発明の融合タンパク質を使用することに関する。【選択図】なし
Description
本発明は、神経毒の生物学的活性を測定する方法であって、（ａ）（ｉ）アンカー型タンパク質と、（ｉｉ）レポータータンパク質と、（ｉｉｉ）該アンカー型タンパク質と該レポータータンパク質との間に介在する神経毒切断部位とを含む融合タンパク質を神経毒感受性細胞において発現させ、（ｂ）（ａ）の神経毒感受性細胞を神経毒とともにインキュベートし、その細胞を、神経毒がその生物学的活性を示すことができる条件下で培養し、（ｃ）（ｂ）の神経毒感受性細胞への透過処理を、該透過処理した神経毒感受性細胞からレポータータンパク質は遊離するがアンカー型タンパク質は遊離しない条件下で行い、かつ（ｄ）かかる細胞から遊離したレポータータンパク質の活性を定量化し、これにより神経毒の生物学的活性を測定するステップを含む方法に関する。さらに、本発明は、神経毒感受性細胞において、神経毒の生物学的活性を測定するための、（ｉ）アンカー型タンパク質と、（ｉｉ）レポータータンパク質と、（ｉｉｉ）アンカー型タンパク質とレポータータンパク質との間に介在する神経毒切断部位とを含む融合タンパク質に関する。本発明により、本発明の融合タンパク質を含むキットがさらに包含される。最後に、本発明は、神経毒感受性細胞において、神経毒の生物学的活性を測定するために本発明の融合タンパク質を使用することに関する。
ボツリヌス菌および破傷風菌はそれぞれ、非常に強力な神経毒、すなわちボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）および破傷風毒素（ＴｅＮＴ）を産生する。これらのクロストリジウム神経毒（ＣＮＴ）は、神経細胞に特異的に結合して神経伝達物質の放出を攪乱する。それぞれの毒素は、不活性でプロセシングを受けていない、約１５０ｋＤａの一本鎖タンパク質として合成される。翻訳後プロセシングには、ジスルフィド架橋の形成、および細菌プロテアーゼ（複数可）によるタンパク質限定分解（解裂（ｎｉｃｋｉｎｇ））が関与する。活性である神経毒は、ジスルフィド結合によって結合している約５０ｋＤａのＮ末端軽鎖と約１００ｋＤａの重鎖の２本の鎖からなる。ＣＮＴは、構造的および機能的に３つのドメイン、すなわち触媒軽鎖、重鎖に包含される移行ドメイン（Ｎ末端側半分）および受容体結合ドメイン（Ｃ末端側半分）からなり、例えば、Krieglstein 1990, Eur. J. Biochem. 188, 39; Krieglstein 1991, Eur. J. Biochem. 202, 41; Krieglstein 1994, J. Protein Chem. 13, 49を参照されたい。ボツリヌス神経毒素は、１５０ｋＤａの神経毒タンパク質と会合無毒タンパク質とを含む分子複合体として合成される。複合体の大きさは、そのクロストリジウム菌株と、３００ｋＤａから、５００ｋＤａ超、９００ｋＤａの範囲にある神経毒の血清型の種類によって異なる。これらの複合体の無毒タンパク質は、神経毒を安定化させて分解から保護する。Silberstein 2004, Pain Practice 4, S19 - S26を参照されたい。
ボツリヌス菌は、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）のＡ〜Ｇ型と呼ばれる、抗原性の異なる７種の血清型を分泌する。いずれの血清型も、破傷風菌が分泌する関連破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）とともに、Ｚｎ２＋−エンドプロテアーゼであり、ＳＮＡＲＥタンパク質を切断することによりシナプスの開口放出を遮断する。Couesnon, 2006, Microbiology, 152, 759を参照されたい。ＣＮＴは、ボツリヌス菌および破傷風菌に見られる弛緩性筋麻痺を引き起こす。Fischer 2007, PNAS 104, 10447を参照されたい。
その毒性作用にもかかわらず、ボツリヌス毒素複合体は、多数の疾患において治療剤として使用されてきた。ボツリヌス毒素の血清型Ａは、斜視、眼瞼痙攣、および他の障害の治療についてヒトへの使用が１９８９年米国で承認された。これは、ボツリヌス毒素Ａ（ＢｏＮＴ／Ａ）タンパク質製剤として、例えば、BOTOX（アラガン社）またはDYSPORT/RELOXIN（イプセン（Ipsen）社）の商品名で市販されている。改善された、複合体を含まないボツリヌス毒素Ａ製剤は、商品名XEOMIN（メルツファーマシューティカルズ社）として市販されている。治療用途の場合、治療すべき筋肉内に製剤を直接注入する。生理的ｐＨで毒素がタンパク質複合体から遊離し、所望の薬理学的作用が生じる。ボツリヌス毒素の効果は一時的にすぎず、それ故、治療効果を維持するためにボツリヌス毒素の反復投与が必要になり得る。
クロストリジウム神経毒は随意筋強度を弱めるので、斜視、頸部ジストニアなどの局所性ジストニア、および良性の本態性眼瞼痙攣に有効な治療法である。クロストリジウム神経毒は、片側顔面痙攣、および局所性痙攣を軽減すること、さらには、広範囲の他の適応、例えば胃腸障害、多汗症、および美容的しわ補正に有効であることがさらにわかっている。Jost 2007, Drugs 67, 669を参照されたい。
クロストリジウム神経毒の製造工程中は、前記神経毒の定性的および定量的な測定、ならびに生物学的に活性な神経毒ポリペプチドの品質管理が特に重要である。さらに、政府機関は、簡便で、信頼性があり、かつ妥当性が確認されたボツリヌス毒素活性アッセイしか認めない。現在のところ、致死量試験であるマウスＬＤ５０バイオアッセイは、医薬品製造業者がその調製物の力価を分析するために使用する「至適基準」となっている。Arnon et al. (2001), JAMA 285, 1059-1070を参照されたい。しかし、近年、動物試験の必要性ならびに動物を用いたアッセイに伴うあらゆる短所、コストおよび倫理的問題を解決する代替法を探索すべく相当の試みがなされてきている。さらに、規制当局は、ボツリヌス神経毒素の力価試験に３「Ｒ」原則、すなわち「Ｒｅｄｕｃｅ（使用数削減）、Ｒｅｆｉｎｅ（苦痛軽減）、Ｒｅｐｌａｃｅ（代替法使用）」を適用するよう製薬企業に対し要求している。Straughan, Altern. Lab. Anim. (2006), 34, 305-313を参照されたい。その結果、生きた動物を使用する方法に代わる妥当な代替法を提供するべく細胞ベースの試験系が開発されている。しかし、神経毒ポリペプチドに対する十分な感受性が示されている、神経毒の生物学的活性の測定に利用可能な細胞試験系はこれまでに３法しかない。これらの細胞ベース試験系には、インビトロで分化させるげっ歯類胚から単離した初代神経細胞（Pellett et al. (2011), Biochem. Biophys. Res. Commun. 404, 388-392）、神経細胞に分化した人工多能性幹細胞（Whitemarsh et al. (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35）、およびＳｉＭａ細胞株のサブクローン（国際公開第２０１０／１０５２３４Ａ１号）の使用を含む。
しかし、初代神経細胞を単離するには動物を殺傷する必要があり、また労力を要する上に時間がかかる。さらに、試験系で使用する初代神経細胞が異なると大きなばらつきが見られる。同様に、神経細胞に分化した人工多能性幹細胞の作製は困難かつ時間がかかる。その上、そうした細胞の保管には非常に問題がある。腫瘍細胞株を使用するアッセイは、ＢｏＮＴに対し十分に感受性でないことが多い。また、前記腫瘍細胞株には複雑な分化プロトコルが必要とされ、そのため前記細胞株を使用するアッセイのばらつきが大きくなり、かつ／または失敗率が高くなる。
以上のことに鑑み、政府機関に許容される、神経毒ポリペプチド活性を測定するためのさらなる試験系が非常に望ましい。さらには、動物を用いた試験系の代替法が必要とされている。
したがって、本発明の根底にある技術的課題は、前述のニーズに対応する手段および方法の提供であると見なしてよい。かかる技術的課題を、請求の範囲および以下の記載で特徴づけられる実施形態により解決する。
本発明は、第１の態様では、神経毒の生物学的活性を測定する方法であって、
（ａ）（ｉ）アンカー型タンパク質と、（ｉｉ）レポータータンパク質と、（ｉｉｉ）アンカー型タンパク質とレポータータンパク質との間に介在する神経毒切断部位とを含む融合タンパク質を神経毒感受性細胞に発現させ、
（ｂ）（ａ）の神経毒感受性細胞を神経毒とともにインキュベートし、神経毒がその生物学的活性を示すことができる条件下で神経毒感受性細胞を培養し、
（ｃ）（ｂ）の神経毒感受性細胞への透過処理を、該透過処理した神経毒感受性細胞からレポータータンパク質は遊離するがアンカー型タンパク質は遊離しない条件下で行い、かつ
（ｄ）（ｃ）の透過処理した神経毒感受性細胞から遊離したレポータータンパク質の活性を定量化し、これにより神経毒の生物学的活性を測定するステップを含む方法に関する。
（ａ）（ｉ）アンカー型タンパク質と、（ｉｉ）レポータータンパク質と、（ｉｉｉ）アンカー型タンパク質とレポータータンパク質との間に介在する神経毒切断部位とを含む融合タンパク質を神経毒感受性細胞に発現させ、
（ｂ）（ａ）の神経毒感受性細胞を神経毒とともにインキュベートし、神経毒がその生物学的活性を示すことができる条件下で神経毒感受性細胞を培養し、
（ｃ）（ｂ）の神経毒感受性細胞への透過処理を、該透過処理した神経毒感受性細胞からレポータータンパク質は遊離するがアンカー型タンパク質は遊離しない条件下で行い、かつ
（ｄ）（ｃ）の透過処理した神経毒感受性細胞から遊離したレポータータンパク質の活性を定量化し、これにより神経毒の生物学的活性を測定するステップを含む方法に関する。
当技術分野で記載がある、神経毒ポリペプチドの生物学的活性測定のための細胞ベース試験系では、神経毒ポリペプチドに対する十分な感受性を得るために、細胞を神経細胞に分化させる。続いて、これらの細胞を、神経毒ポリペプチドとインキュベートする。その後、切断された神経毒基質の量を、通常は特定の抗体を使用して測定する。神経毒ポリペプチドの生物学的活性を正確に測定するには、神経毒基質特異的な質の高い３つの抗体を、異なる３種の宿主種から得る必要がある。これには、ＢｏＮＴ／Ａ基質ＳＮＡＰ−２５のような神経毒ポリペプチドの基質をもう一方の細胞タンパク質から分離するための捕捉抗体が含まれる。捕捉抗体は、神経毒基質のＮ末端領域、例えば、ＳＮＡＰ−２５のＮ末端領域に対して向けられることが多い。さらに、神経毒が切断された基質、例えば、ＢｏＮＴ／Ａが切断されたＳＮＡＰ２５を検出するためのネオエピトープ特異的抗体が必要である。神経毒基質の総量または切断されていない神経毒基質の量を測定して標準化できるようにするために、一般に神経毒基質のＣ末端領域、例えば、ＳＮＡＰ２５のＣ末端領域に対して向けられる、別の検出抗体が必要になる。
本発明の神経毒ポリペプチドの生物学的活性を測定する方法は、本発明の新規な融合タンパク質を発現するよう遺伝子を改変された神経毒感受性細胞を基にしている。神経毒感受性細胞は、腫瘍細胞株、初代細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞または本明細書の他の箇所で定義されている他の細胞から得た、またはそれらに由来する細胞であり得る。「に由来する」とは、指示されている細胞から生じる神経毒感受性細胞を意味し、例えばクローンまたはそのサブクローンが含まれる。そのようなクローンまたはサブクローンは、親細胞と比較して、改変されなくても、または遺伝子改変されてもよい。特定の態様では、神経毒感受性細胞は神経細胞に分化できる。これらの場合、神経毒感受性細胞を、該神経毒感受性細胞が神経分化細胞に分化できる条件下かつ期間で培地中にて分化させる。本発明の融合タンパク質は、本明細書の他の箇所でより具体的に定義されるように、アンカー型タンパク質、神経毒ポリペプチド切断部位およびレポータータンパク質を含む。例えば、融合タンパク質は、アンカー型タンパク質としての膜貫通型タンパク質または膜結合タンパク質、レポータータンパク質および神経毒切断部位を包含する。神経毒ポリペプチドの切断部位は、アンカー型タンパク質とレポータータンパク質の間に位置する。本発明の方法の第１のステップでは、既述の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を神経毒感受性細胞に導入し、その後、該細胞を、（生物学的に活性な）融合タンパク質が発現される条件下で培養する。本発明の方法の特定の態様では、本発明の融合タンパク質の発現を、当技術分野で公知の誘導型発現系、例えば、テトラサイクリン誘導発現系（Zhou, X., Vink, M., Klave, B., Berkhout, B. & Das, A. T. (2006) Optimization of the Tet-On system for regulated gene expression through viral evolution. Gene Ther. 13(19): 1382-1390）、ミフェプリストン誘導発現系（Wang, Y., B.W. O'Malley, J., Tsai, S. Y., and O'Malley, B. W. (1994). A Regulatory System for Use in Gene Transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8180-8184）、エクジソン誘導発現系（No D, Yao TP, Evans RM. Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Apr 16; 93(8): 3346-51； Meyer-Ficca ML, Meyer RG, Kaiser H, Brack AR, Kandolf R, Kupper JH. Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies. Anal Biochem. 2004 Nov 1; 334(1): 9-19）または市販されている同様のもの（クロンテック；ライフテクノロジーズ；アジレント製）により誘導する。続いて、神経毒感受性細胞を神経毒ポリペプチドとインキュベートし、神経毒がその生物学的活性を示すことができる条件下で、ある期間（約２４〜７２時間など）培養する。神経毒ポリペプチドのタンパク質分解活性により融合タンパク質の神経毒ポリペプチド切断部位で切断されると、レポータータンパク質が細胞内に遊離する。中毒ステップの後に任意選択で洗浄ステップが続いてよい。その後、神経毒感受性細胞の透過処理を、該透過処理した神経毒感受性細胞からレポータータンパク質は遊離するがアンカー型タンパク質は遊離しない条件下で、ある期間、例えば溶血毒により行う。続いて、レポータータンパク質を含む上清を回収し、必要に応じてさらなる処理、例えば、ろ過または遠心分離を行ってから、レポータータンパク質の活性を測定する。細胞から遊離したレポータータンパク質の活性を定量化することにより、神経毒ポリペプチドの生物学的活性を測定することができる。
本発明の神経毒ポリペプチドの生物学的活性を試験する方法では、当技術分野で公知の方法と比較して感受性の改善が示された。さらに、本発明の方法は、取扱いが簡便なため、高い精度と頑健性を示した。本発明の方法のこうした技術的また定性的な利点を以下の実施例において実証する。
クロストリジウム神経毒は、シナプス前神経終末からの神経伝達物質分泌を特異的に阻害することを特徴とする。末梢神経細胞の選択性は、ＳＶ２およびＧＴ１ｂという２つの異なる受容体の認識により媒介される。神経毒の生理的作用は、受容体の結合および神経毒軽鎖の移行に続く、タンパク質、いわゆるＳＮＡＲＥ複合体の切断に基づいている。ＢｏＮＴの生物学的活性の測定は、前記神経毒タンパク質の特性を明らかにするうえで重要な側面であり、特に、規制当局はＢｏＮＴ含有製品のクリアランスのためにこの測定を要求している。したがって、ＢｏＮＴの生物学的活性を測定する信頼できる試験は、ＢｏＮＴ含有製品の研究、開発およびマーケティングにとって根底をなす。さらに、これまでの主流であった動物試験は、倫理上の理由から、細胞ベースの試験系に置き換えられていくことになろう。このような細胞ベースの試験系を確立するためには、神経細胞または細胞株がボツリヌス神経毒素に対して十分に感受性が高いことが必須である。しかし、これまでのところ、そのような高感受性を得るためには、労力を要する神経細胞株分化方法が必要とされる。その結果、未だ上述のような少数の細胞ベース試験系しか利用できない。医薬品中のボツリヌス毒素の生物学的活性を測定するためには、神経細胞または細胞株は、以下の特性を有していなければならない。第一に、細胞は、可能な限り標的、つまりヒト患者に酷似させるためにヒト細胞であり神経細胞由来であること。第二に、細胞系は、最終製品中の添加物に対し頑健であり、好ましくは、製造工程の各中間段階（工程管理）における不純物に対しても頑健であること。第三に、細胞ベースの試験系は、バイアル中（例えば、５０Ｕ、１００Ｕまたは２００Ｕ ＢｏＮＴ／Ａ）のＢｏＮＴの生物学的活性を正確に測定できるよう動的測定範囲を示すことである。添加物の溶解度、細胞培養培地等のような技術的要因を考慮すると、１ｐＭ未満のＢｏＮＴ濃度を正確に測定できなければならない。発明者らが知る限りでは、これまでのところ、ＢｏＮＴに対して十分に高い感受性を示す利用可能な細胞ベース試験系は３種だけである。これらには、本明細書の他の箇所ですでに言及したように、げっ歯類胚の初代神経細胞、神経細胞に分化した人工多能性幹細胞およびＳｉＭａ細胞株のサブクローンが含まれる。ただし、前記細胞または細胞株は十分に高い感受性を示すことが報告されてはいるが、複雑で手間のかかる分化プロトコルを実施した後に限られており、それらには大きなばらつきが伴うことが多い。対照的に、本発明は、上述の要件を満たし、また、当技術分野で記載がある細胞試験系と比較して感受性に関してさらに改善された、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）の生物学的活性を測定するための簡便で信頼性があり、かつ頑健な細胞ベース試験系を提供する。
本明細書で使用する「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、他の宿主細胞ポリペプチドを本質的に含まない、単離または精製されたポリペプチドを包含する。上述の用語には融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質またはキメラタンパク質（文字通り、供給源の異なる部分で作製されている）は、元来別々のタンパク質にコードされる２つ以上の遺伝子を結合させることにより創製されるタンパク質である。この融合遺伝子が翻訳されると、元のタンパク質それぞれに由来する機能的特性を備えた単一タンパク質が得られる。組換え型融合タンパク質は、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術により人工的に創製される。例えば、Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, third edition, 2001を参照されたい。キメラタンパク質またはキメラは、通常、機能または物理化学的パターンの異なるポリペプチドでできたハイブリッドタンパク質とされる。さらに、一態様では、用語「融合タンパク質」には、化学的に修飾した融合タンパク質が含まれる。そのような修飾は、変異、例えば点変異、置換、欠失、挿入等のような人工的修飾、または翻訳後修飾、例えばグリコシル化、リン酸化、パルミトイル化、ミリストイル化等のような天然に生じる修飾であってよい。融合タンパク質は、本明細書における生物学的特性を有することになる。具体的には、本明細書で使用する「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」という用語は、アンカー型タンパク質、レポータータンパク質および神経毒切断部位を含む。本明細書で使用する「アンカー型タンパク質」は、形質膜に安定して結合するかまたは形質膜内に安定して組み込まれ、かつ神経毒感受性細胞のサイトゾルと接触しているポリペプチドである。したがって、アンカー型タンパク質は、膜貫通型もしくは内在性の膜タンパク質または膜結合タンパク質であり得る。融合タンパク質のアンカー型タンパク質は、形質膜内（膜貫通型タンパク質または内在性膜タンパク質の場合）または形質膜に（膜結合タンパク質の場合）位置し、どちらも未切断状態および神経毒切断状態にある。当業者には、形質膜に一時的に結合している、または形質膜に部分的にしか会合していないタンパク質は、アンカー型タンパク質として好適ではないことは直ちに明白である。形質膜には、細胞膜および小胞膜が含まれる。膜貫通型タンパク質は、例えば、コリントランスポーター（ＮＰ＿０６８５８７）、ヒスタミンＨ１受容体（Ｈ１−受容体、ＮＰ＿００１０９１６８３）、または他の任意のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ；例えば、ＡＡＩ２８１２４、ＮＰ＿０００６７５、Ｐ０８１７２）もしくはＳＶ２（ＮＰ＿０５５６６４）である。膜結合タンパク質は、例えば、ＳＮＡＰ−２５（Ｐ６０８８０）、ＭＡＲＣＫＳタンパク質（ＮＰ＿００２３４７）、またはＣ２ドメインを含んでいるタンパク質（例えば、ＮＰ＿００２７２８；ＮＰ＿００２７３０）であり得る。また、そのようなアンカー型タンパク質で既述の生物学的特性を有するものの断片も包含される。本明細書で使用する「神経毒切断部位」は、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／ＧまたはＴｅＮＴの切断部位、好ましくはＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１またはＢｏＮＴ／Ｅの切断部位である。神経毒切断部位は、神経毒ポリペプチドにより認識され切断される。神経毒切断部位の対応する配列は当技術分野で公知であり、例えば、Binz et al. (2010), Toxins, 2(4), pp. 665-682、国際公開第２０１０／１２４９９８号または国際公開第２０１０／１０５２３４Ａ１号に記載されており、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。神経毒切断部位は、アンカー型タンパク質とレポータータンパク質の間に位置し、神経毒感受性細胞のサイトゾルから神経毒ポリペプチドがアクセスできる。神経毒ポリペプチドのタンパク質分解活性により融合タンパク質の神経毒ポリペプチド切断部位で切断されると、レポータータンパク質は神経毒感受性細胞のサイトゾル内に遊離するが、アンカー型タンパク質は形質膜内または形質膜に残る。本明細書で使用する「レポータータンパク質」または「検出タンパク質」（両用語とも同義である）は、検出可能マーカー、例えば、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはホースラディッシュペルオキシダーゼのような酵素である。別法として、レポータータンパク質は、蛍光タンパク質、例えば、ＧＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰなどであり得る。融合タンパク質のレポータータンパク質は形質膜に未切断状態で位置し、神経毒ポリペプチドによる切断と同時にサイトゾル内に遊離する。また、そのようなレポータータンパク質で既述の生物学的特性を有するものの断片も包含される。融合タンパク質の配列は、アンカー型タンパク質−神経毒切断部位−レポータータンパク質であるか、またはレポータータンパク質−神経毒切断部位−アンカー型タンパク質であり得る。融合タンパク質は、ポリ−グリシンリンカー等のようなリンカー領域１つ以上をさらに含み得る。リンカーを使用して、例えば、融合タンパク質のアンカー型タンパク質と神経毒切断部位、または神経毒切断部位とレポータータンパク質を連結できる。融合タンパク質では、例えば、１つのリンカーをアンカー型タンパク質と神経毒切断部位の間に、さらなるリンカーを神経毒切断部位とレポータータンパク質の間に、というように２つ以上のリンカーの使用も想定される。リンカーは同一であって異なっていてもよい。１つ以上（例えば、２つ、３つ、またはそれ以上）の神経毒切断部位（複数可）を含み得る、アンカー型タンパク質とレポータータンパク質の間のリンカーも包含される。本明細書で使用する「リンカー」または「リンカー領域」という用語は、短いセグメントのアミノ酸配列であるポリリンカーを意味する。対応するＤＮＡ配列によってコードされる好適なリンカー配列は、例えば、Schiavo G, Matteoli M, Montecucco C: Neurotoxins affecting neuroexocytosis. Physiol. Rev. 2000, 80: 717-66に記載されている。リンカーは、機能性タンパク質同士を連結するという基本的な役割（柔軟または堅固なリンカーの場合）以外に、生物学的活性の改善、発現収量の増加、および望ましい薬物動態プロファイルの達成といった、融合タンパク質を製造するための多くの利点を他にも提供し得る。例えば、Chen et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2013, 65(10), pp.1357-69を参照されたい。さらに、融合タンパク質は、例えば、レポータータンパク質などのタグ付き融合タンパク質またはその構成成分の効率的な単離および／または精製を可能にする好適なタグ、例えば、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグまたはＧＳＴタグを包含し得る。タグ（複数可）は、必要に応じ、リンカーを介して融合タンパク質に結合させることができる。融合タンパク質に標準化因子または正規化因子を含めることも本発明の範囲により想定される。標準化因子または正規化因子を、必要に応じ、リンカーを介して融合タンパク質に結合させることもできる。例えば、本発明のコリントランスポーター−ＧＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ルシフェラーゼの融合タンパク質では、標準化因子または正規化因子としてＧＦＰを使用する。このようなさらなる成分の導入を、各測定または測定値の正規化または補正のために使用して、個々の測定の統計上のばらつきを減らすことができる。アッセイの過程では、発現率、細胞数、材料損失の相違等が不規則または体系的に生じるであろう。そのため測定値に統計上の誤差が出やすい。補正係数の導入により、個々の測定同士をより容易に比較することができる。例えば、細胞培養中に発現率に相違が生じる、または洗浄ステップ中に細胞材料の損失に相違がある場合、補正係数を測定することでこれを予測できるようになる。一態様では、融合タンパク質を、当業者に周知の化学合成または組換え型分子生物学技術によって製造することができる。例えば、Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, third edition, 2001を参照されたい。一態様では、融合タンパク質のそのような製造方法は、（ａ）本明細書の他の箇所に詳述されている宿主細胞を培養し、（ｂ）前記宿主細胞から融合タンパク質を得ることを含む。この方法の一態様では、融合タンパク質は、アフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび／または予備的ゲル電気泳動を含む従来の精製技術により、例えば、宿主細胞溶解物から得ることができる。別の態様において用語「ポリペプチド」または「タンパク質」には、融合タンパク質および他のタンパク質をさらに含むポリペプチド調製物が含まれる。
本明細書で使用する用語「神経毒感受性細胞」は、神経毒ポリペプチドに特徴的な生物学的特性、すなわち、本明細書の他の箇所で言及されている（ａ）受容体結合、（ｂ）内在化、（ｃ）エンドソーム膜を貫通する、サイトゾルへの移行、および／または（ｄ）細胞内タンパク質分解による、シナプス小胞の膜融合に関与するタンパク質の切断を示す神経毒ポリペプチドに対し感受性である細胞を意味する。したがって、本明細書における「神経毒感受性細胞」は神経毒中毒に対し感受性である。神経毒中毒に対し感受性である細胞は、本明細書に定義されるように、生物学的に活性であるかまたは成熟した神経毒ポリペプチドに感受性であることが好ましい。定義により、「神経毒中毒に対し感受性である細胞」は、少なくとも１つの神経毒受容体および少なくとも１つの神経毒基質を発現するかまたは発現するよう操作されていることが必要である。神経毒の受容体および基質は当技術分野で記載がある。本明細書で使用する用語「神経毒感受性細胞」は、本明細書に定義されるように、細胞もしくは細胞株、例えば、単離した、初代細胞もしくはその細胞株または樹立細胞株の細胞もしくは樹立細胞株、例えば神経芽腫細胞もしくは神経芽腫細胞株を含む。本明細書で言う神経毒感受性細胞には、適切な細胞培養条件で、神経細胞に分化することのできる細胞、例えば腫瘍細胞が含まれる。そのような細胞には、例えば、腫瘍細胞株由来の細胞（例えば、Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞、ＰＣ１２細胞、ＮＧ１０８ １５細胞、Ｐ１９細胞、ＳｉＭａ細胞またはＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞）、初代細胞、幹細胞、人工多能性幹細胞、それらに由来する細胞または本明細書の他の箇所で定義され、また以下の例で使用する他の細胞が包含される。本明細書で言う「神経毒中毒に対し感受性である」という用語は、神経毒ポリペプチド（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ）が神経毒基質（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ基質ＳＮＡＰ−２５）を切断し、かつ、神経毒とその対応する受容体との結合（例えば、ＢｏＮＴ／ＡのＢｏＮＴ／Ａ受容体への結合）、神経毒／受容体複合体の内在化、細胞内小胞から細胞質への神経毒軽鎖の移行、および／またはタンパク質分解による神経毒基質の切断、好ましくは、言及した全機序を包含する細胞機序全般を受けることができる細胞を意味する。当業者に理解されるように、神経毒感受性細胞は、好ましくは、最初に神経毒を取り込んでから上述した細胞機序全般を受けることができる。本明細書で使用する神経毒感受性細胞は、例えば、約１００ナノモル（ｎＭ）、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ピコモル（ｐＭ）、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１０ｐＭ、約９ｐＭ、約８ｐＭ、約７ｐＭ、約６ｐＭ、約５ｐＭ、約４ｐＭ、約３ｐＭ、約２ｐＭ、約１ｐＭ、約０．５ｐＭ、もしくは約０．１ｐＭの神経毒ポリペプチド、またはここに示した値の１つよりさらに小さい神経毒ポリペプチドを取り込むことができる。１００ｐＭを超えるＥＣ５０値が文献で報告されている。好ましくは、本明細書で使用する「神経毒感受性細胞」は、神経毒中毒に対する感受性が、例えば、約１ｎＭ以下、５００ｐＭ以下、約４００ｐＭ以下、約３００ｐＭ以下、約２００ｐＭ以下、約１００ｐＭ以下、約９０ｐＭ以下、約８０ｐＭ以下、約７０ｐＭ以下、約６０ｐＭ以下、約５０ｐＭ以下、約４０ｐＭ以下、約３０ｐＭ以下、約２０ｐＭ以下、約１０ｐＭ以下、約９ｐＭ以下、約８ｐＭ以下、約７ｐＭ以下、約６ｐＭ以下、約５ｐＭ以下、約４ｐＭ以下、約３ｐＭ以下、約２ｐＭ以下、約１ｐＭ以下、約０．９ｐＭ以下、約０．８ｐＭ以下、約０．７ｐＭ以下、約０．６ｐＭ以下、約０．５ｐＭ以下、約０．４ｐＭ以下、約０．３ｐＭ以下、約０．２ｐＭ以下、さらには約０．１ｐＭ以下である。神経毒ポリペプチドの生物学的活性を測定するアッセイは当技術分野において周知であり、本明細書の他の箇所にも記載がある（例えば、Pellett et al., Withemarsh et al. Toxicological Sciences 126(2), 426-435 (2012)、国際公開第２０１０／１０５２３４Ａ１号を参照されたい）
当技術分野で公知のように、「半数有効濃度（ＥＣ５０）」とは、ある特定の曝露時間の後、ベースラインと最大の中間の反応を誘導する薬物、抗体または毒薬の濃度を指す。これは薬物力価の尺度として一般に使用される。したがって、段階的な用量反応曲線のＥＣ５０は、ある化合物の最大効果の５０％が観察された時の化合物濃度を表す。悉無的（ｑｕａｎｔａｌ）用量反応曲線のＥＣ５０は、ある特定の持続時間曝露させた後に母集団の５０％が反応を示す化合物の濃度を表す。
神経毒中毒に対し感受性であり、かつ／または神経毒取込み能を有する細胞もしくは細胞株、すなわち、本明細書に定義されるような神経毒感受性細胞を同定および／または単離する方法は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第２０１２／０１２２１２８Ａ１号を参照されたい。一態様では、神経毒ポリペプチドの生物学的活性は、前述の生物学的特性のすべてから生じる。神経毒の生物学的活性を測定する当技術分野で公知の細胞ベース系は、本明細書の他の箇所に示されている。神経毒の生物学的活性を評価するインビボアッセイには、例えば、既述のマウスＬＤ５０アッセイならびにPearceらおよびDressierらの記載にあるようなエキソビボでのマウス片側横隔膜アッセイが含まれる。Pearce 1994, Toxicol. Appl. Pharmacol. 128: 69-77 and Dressier 2005, Mov. Disord. 20:1617-1619を参照されたい。当業者に公知のように、神経毒の生物学的活性は一般にマウスユニット（ＭＵ）で表される。１ＭＵは、腹腔内注射後に、特定のマウス集団の５０％を死亡させる神経毒成分の量、すなわちマウスｉ．ｐ．ＬＤ５０である。本発明の方法は、当技術分野で記載がある複雑な分化プロトコルを必要とする細胞試験系よりも神経毒ポリペプチドに対する感受性が高い、簡便で信頼性のある頑健な細胞ベースの試験系を提供する。したがって、本発明の方法は、当技術分野の細胞試験系に代わる、神経毒の生物学的活性を測定する改善された代替法を提供する。さらに、本発明の方法は、動物を用いたアッセイの代替として使用可能である。
本明細書で使用する「分化」、「分化する」または「分化した」という用語は、特殊化していない、または特殊化が比較的進んでいない細胞が、比較的特殊化が進んだ状態になる過程を意味する。細胞の個体発生学において、形容詞「分化した」は相対的な用語である。そのため、「分化した細胞」とは、特定の発生経路を、比較対象細胞よりもさらに下方へ進んだ細胞である。分化した細胞は、例えば、最終分化細胞、すなわち、特殊化した、生物の各種組織および臓器の機能を担う、完全に特殊化した細胞であってよく、必ずしも有糸分裂後でなくてもよい。別の例では、分化細胞は、さらに増殖および／または分化できる、分化系統内にある前駆細胞であってもよい。同様に、ある細胞が特定の発生経路を、比較対象細胞よりもさらに下方へ進んでいれば、その細胞は「特殊化が比較的進んでおり（relatively more specialized）」、その場合、比較対象細胞は「特殊化していない（unspecialized）」または「特殊化が比較的進んでいない（relatively less specialized）」と見なされる。特殊化が比較的進んだ細胞は、例えば、特定の細胞成分または産物（例えば、ＲＮＡ、タンパク質、特定の細胞マーカーもしくは他の物質）の発現の有無もしくは発現レベル、特定の生化学経路の活性、形態学的外観、増殖能および／もしくは増殖動態、分化能、ならびに／または分化シグナルに対する応答等といった明らかな表現型の特徴の１つ以上が、特殊化していない細胞または特殊化が比較的進んでいない細胞と異なっていてよく、その場合、かかる特徴は、特殊化が比較的進んだ細胞が、前記発生経路に沿ってさらに進行していることを意味する。
本明細書で使用する用語「神経分化細胞」は、最終的に神経分化の状態に達した細胞を意味する。例えば、マウス胚性癌細胞Ｐ１９は、まず神経前駆細胞に分化してから、神経細胞へとさらに分化していく。神経分化過程は、例えば、表現型により（位相差観察法による）および／または神経分化細胞マーカーの発現により追跡可能である。例えば、Babuska et al. (2010), Prague Medical Report 111, 289-299またはMigliore and Shepherd, Nature Reviews Neuroscience 6, 810-818 (2005)を参照されたい。前記神経分化細胞マーカーの発現測定に使用できるアッセイには、例えば、当技術分野で公知であるＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ウェスタンブロットもしくはドットブロット、免疫沈降解析、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）またはＦＡＣＳ解析が含まれる。例えば、Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, third edition, 2001を参照されたい。神経分化細胞のさらなる特徴を検討するアッセイも当技術分野で公知である。
本明細書で使用する「神経細胞に分化することのできる腫瘍細胞」という用語は、例えば、神経芽腫細胞、胚性癌細胞、奇形癌細胞、神経ハイブリッド細胞（例えば、神経細胞×膠芽腫細胞）、または線維芽腫細胞を意味する。神経細胞に分化することのできるそのような腫瘍細胞の例として、マウスおよびヒトの腫瘍細胞、すなわちＰ１９（マウス胚性癌）細胞、ＳｉＭａ（ヒト神経芽腫）細胞またはＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ヒト神経芽腫）が挙げられる。
本明細書で使用する用語「神経芽腫」は、体のいくつかの領域に見られる神経細胞から発達する癌を意味する。神経芽腫は、神経細胞と起源が類似し腎臓の上にある副腎の内部または周辺に最もよく発生する。しかし、神経芽腫は、神経細胞群が存在する、腹部の他の領域ならびに胸部、頸部および骨盤部にも発生し得る。本明細書で使用する用語「神経芽腫細胞」は、神経毒感受性で、かつ神経細胞に分化する能力のある、１つ以上の神経芽腫細胞を含む。神経芽腫細胞は、初代神経芽腫細胞または初代神経芽腫細胞株であり得る。樹立した神経芽腫細胞または細胞株もまた前記用語により包含される。神経芽腫細胞は、哺乳類の神経芽腫細胞、例えば、ラットまたはマウスの神経芽腫細胞のようなげっ歯類神経芽腫細胞、また、アカゲザル、マカクザル、もしくはカニクイザルの神経芽腫細胞のようなサル神経芽腫細胞またはチンパンジー神経芽腫細胞もしくは、好ましくは、ヒト神経芽腫細胞のような霊長類の神経芽腫細胞であり得る。樹立した神経芽腫細胞株の例には、例えば、Ｎｅｕｒｏ−２ａ（マウス神経芽腫）、Ｋｅｌｌｙ（ヒト神経芽腫）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ヒト神経芽腫）またはＳｉＭａ（ヒト神経芽腫）が包含される。神経毒感受性の神経分化細胞を作製するために、好ましくは、ヒト神経芽腫細胞を本発明の方法で使用する。より好ましくは、本明細書に定義する神経芽腫細胞はＳｉＭａ細胞またはＳｉＭａ細胞株である。これは、ＳｉＭａ細胞は、ＢｏＮＴ感受性形態での導入が容易なことが理由である。その上、これらの細胞はＢｏＮＴに対する感受性が高い。また、ＳｉＭａ細胞の分化プロトコルは、他の神経芽腫細胞または細胞株の場合に比べて簡便で短い。本発明の方法で使用するＳｉＭａ細胞は、親ＳｉＭａ細胞またはそれに由来する（サブ）クローンであり得る。
本発明の方法に従って使用する「接触させる」という用語は、物理的および／または化学的および／または生物学的な相互作用が可能になるよう、前述の神経毒感受性細胞および神経毒を物理的に近接させることを指す。神経毒ポリペプチドは、天然の神経毒ポリペプチド、組換え型の神経毒ポリペプチド、単離された神経毒ポリペプチド、修飾された神経毒ポリペプチド、本質的に精製されているか、もしくは精製された神経毒ポリペプチドまたはその多様体であり得る。別法として、神経毒は、試料、好ましくは、生体試料、例えば細胞、細胞溶解物、血液、血漿、血清またはリンパ液に含ませることができる。特定の相互作用を可能にする好適な条件は、熟練従事者に周知である。前記条件は、本発明の方法に適用される細胞および神経毒に依存することとなり、当業者はそれ以上の手間を掛けずに条件を合わせることができる。さらに、相互作用させるに十分な時間も、熟練従事者が常套的実験をすること決定できる。例えば、特定の量の、本明細書に定義する単離または組換えを行った神経毒ポリペプチドもしくはその多様体、または神経毒ポリペプチドを含む試料を神経毒感受性細胞に加えることができる。その後、かかる細胞と神経毒ポリペプチドとを、神経毒ポリペプチドがその生物学的活性を示すことができる条件下で少なくとも２４時間、好ましくは４８時間、より好ましくは７２時間インキュベートする。本明細書で使用する「神経毒ポリペプチドがその生物学的活性を示すことができる条件」は、当技術分野で公知である。
本発明で使用する「神経毒」、「神経毒ポリペプチド」または「神経毒タンパク質」という用語は、ボツリヌス神経毒素の７種の血清型、すなわち、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、ならびに破傷風神経毒素（ＴｅＮＴ）、および本明細書に定義するそれらの多様体を指す。対応する核酸配列およびアミノ酸配列は、当技術分野で公知であり（例えば、ＵｎｉｐｒｏｔもしくはＴＲＥＭＢＬ配列データベースまたは国際公開第２０１０／１２４９９８号を参照されたい）、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。好ましくは、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｃ１またはＢｏＮＴ／Ｅを本発明の方法で使用する。前記神経毒の対応する受容体および基質は、当技術分野で十分に記載されている。神経毒ポリペプチドは、天然に生じる神経毒または天然には生じない神経毒であり得る。天然に生じる神経毒ポリペプチドは、例えば、翻訳後修飾で生成されたアイソフォーム、選択的にスプライシングを受けた転写または自然変異およびサブタイプなどの天然に生じるプロセスにより生成される。例えば、ＢｏＮＴ／Ａのサブタイプは、ＢｏＮＴ／Ａ１サブタイプ、ＢｏＮＴ／Ａ２サブタイプ、ＢｏＮＴ／Ａ３サブタイプ、ＢｏＮＴ／Ａ４サブタイプまたはＢｏＮＴ／Ａ５サブタイプである。天然に生じる神経毒ポリペプチドには、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００またはそれ以上のアミノ酸残基の付加、置換または欠失がなされている上述の配列が含まれる。市販の医薬組成物、本明細書の導入部分ですでに言及した天然に生じるＢｏＮＴ／Ａを含む。天然には生じない神経毒ポリペプチドは、人為的操作によって構造が修飾された任意の神経毒ポリペプチドを意味し、それらには、例えば、ランダム変異誘発または合理的設計法を使用する遺伝子工学技術により得られた改変アミノ酸配列を有する神経毒ポリペプチドおよび化学合成により生成された神経毒ポリペプチドなどが含まれる。天然には生じないそのような神経毒ポリペプチドは、当技術分野で記載されている。
本発明の別の態様では、神経毒ポリペプチドは、本明細書に定義されるように、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、または破傷風神経毒素のアミノ酸配列と少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一なアミノ酸配列を有する。神経毒ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた想定され、その場合、かかるポリヌクレオチドは、本明細書に定義されるように、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ、または破傷風神経毒素のポリヌクレオチド配列と少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一な配列を有する。本発明で、同一とは、最大数の一致が得られるよう配列アライメントを行った場合の、ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の配列同一性を指す。これは、公開されている、例えばBLASTP, BLASTN, FASTA, Altschul 1990, J. Mol. Biol. 215, 403などのコンピュータプログラムに体系化された技術または方法を使用して達成可能である。一態様では、パーセント同一性値を、アミノ酸配列全体にわたって計算する。熟練従事者には異なる配列を比較するための多種多様なアルゴリズムに基づいた一連のプログラムが利用可能である。その場合、NeedlemanとWunschまたはSmithとWatermanのアルゴリズムでは特に信頼できる結果が得られる。配列のアラインメントの実施には、ＧＣＧソフトウェアのパケット（Genetics Computer Group 1991；５３７１１ アメリカ合衆国ウィスコンシン州マディソン市サイエンスドライブ５７５）に含まれる、PileUpプログラム（1987, J. Mol. Evolution 25, 351; Higgins 1989 CABIOS 5, 151）またはGapおよびBestFitといったプログラム（Needleman and Wunsch 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith and Waterman 1981, Adv. Appl. Math. 2, 482）を使用する。本発明の一態様では、上述のパーセント（％）で記載した配列同一性値は、配列領域全体にわたってGapプログラムを使用して決定し、設定値は以下の通り、ギャップ重み：５０、長さ重み：３、一致平均：１０．０００およびミスマッチ平均：０．０００とし、特に明記しない限り、配列アラインメントの標準設定値として常にこれが使用される。本発明の一態様では、前述の多様体には、神経毒の生物学的特性が少なくとも１つ保持され、一態様では、本明細書で引用した神経毒ポリペプチドの生物学的特性のすべてが保持されることを理解されるであろう。さらなる態様では、多様体は、例えば、酵素の認識および／または切断について改善された基質において切断部位を認識し、切断し得るか、または受容体結合について改善されているような、改善もしくは改変された生物学的特性を有しているか、または上記で指定した他の任意の特性を有している神経毒であり得る。
原則として、本明細書における神経毒はＮ末端の軽鎖およびＣ末端の重鎖を含む。神経毒を一本鎖の前駆体分子として作製し、これを「プロセシングを受けていない神経毒ポリペプチド」と呼ぶ。その後のプロセシングの結果として、「プロセシングを受けた神経毒ポリペプチド」を得る。前記プロセシングを受けた神経毒ポリペプチドは、神経毒に特徴的な生物学的特性、すなわち、（ａ）受容体結合、（ｂ）内在化、（ｃ）エンドソーム膜を貫通する、サイトゾルへの移行、および／または（ｄ）細胞内タンパク質分解による、シナプス小胞の膜融合に関与するタンパク質の切断を示す。したがって、プロセシングを受けた神経毒ポリペプチドは、生物学的に活性であるかまたは成熟した神経毒ポリペプチドであるとされる。一態様では、神経毒ポリペプチドの生物学的活性は、本明細書の他の箇所に記載のように、前述の生物学的特性すべてから生じる。
本明細書で使用する用語「透過処理」は、神経毒感受性細胞の血漿または細胞膜を透過性にする処理を意味する。細胞透過処理の一方法では、神経毒感受性細胞の血漿または細胞膜の透過処理を、溶血毒、例えば、ストレプトリジンＯ（Barry, E. et al., Biotechniques, 15, 1016 (1993); Graves, J.D. et al., Biochem. J., 265, 407-413 (1990); Sekiya K, Satoh R, Danbara H, Futaesaku Y. A ring-shaped structure with a crown formed by streptolysin O on the erythrocyte membrane. J Bacteriol. 1993 Sept.; 175(18): 5953-61)）、パーフリンゴリジンＯ（Prepore to pore transition of a cholesterol-dependent cytolysin visualized by electron microscopy. Dang, T.X., Hotze, E.M., Rouiller, I., Tweten, R.K., Wilson-Kubalek, E.M. J. Struct. Biol. (2005)）、ニューモリシン（Tilley SJ, Orlova EV, Gilbert RJ, Andrew PW, Saibil HR (April 2005). "Structural basis of pore formation by the bacterial toxin pneumolysin". Cell 121 (2): 247-56）、リステリオリシンＯ（Vazquez-Boland JA, Kuhn M, Berche P, Chakraborty T, Dominguez-Bernal G, Goebel W, Gonzalez-Zorn B, Wehland J, Kreft J. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clin Microbiol Rev. 2001 July; 14(3): 584-640）、細菌性溶血素またはヘビもしくはクモ由来の膜孔形成毒素とのインキュベーションにより行う。多くの溶血毒は膜孔形成毒素、すなわち、細胞の細胞質膜上に孔を形成して、細胞に浸透できる毒素である。溶血毒を使用して細胞に透過処理を行う方法およびプロトコルは当技術分野で公知であり、例えば上記の刊行物に記載されている。神経毒感受性細胞を透過処理した細胞からレポータータンパク質は遊離させるがアンカー型タンパク質は遊離させない条件下で透過処理する。当業者に理解されるように、溶血毒による透過処理を使用することで、血漿または細胞膜は無傷のままである。膜結合タンパク質または膜タンパク質は所定の位置に残り、可溶性タンパク質のみが細胞膜を通過でき、また細胞内部から離れることができる。透過処理後、切断されていない融合タンパク質は細胞膜と会合してその場にとどまる。切断された融合タンパク質から、測定可能なシグナル、すなわちレポータータンパク質を含む部分は、細胞内部から離れることができるため、細胞から物理的に分離される。
本明細書で使用する用語「量」は、例えば、レポータータンパク質または神経毒ポリペプチドの絶対量、前記タンパク質またはポリペプチドの相対量または濃度、ならびにそれに相関するかまたはそれに由来し得る任意の値もしくはパラメータを包含する。
例えば、レポータータンパク質または神経毒ポリペプチドの「量を測定する」という用語は、例えばレポータータンパク質または神経毒ポリペプチドの、絶対量、相対量または濃度を、定量的または半定量的に測定することに関する。検出の好適な尺度は当業者に周知である。一態様では、レポータータンパク質または神経毒ポリペプチドの量の測定には、事前に規定された量のレポータータンパク質または神経毒ポリペプチドを用いた標準法を適用して方法を校正することも必要であることを理解されるであろう。このような校正を実施する方法は当業者に周知であり、以下の実施例も参照されたい。
本明細書における「レポータータンパク質」または「検出タンパク質」（両用語とも同義である）は、一態様では、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、およびホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素である。例えば、ルシフェラーゼは、発光反応を触媒できる酵素クラスに属する。ルシフェラーゼはホタルルシフェラーゼまたは細菌ルシフェラーゼとして天然に生じる。各種ルシフェラーゼおよびそれらのサブユニットならびにそれらをコードする核酸配列の構造は当技術分野において周知であり、例えば、Chon 1985, J. Biol. Chem. 260(10): 6139-46 and Johnston 1986, J. Biol. Chem. 261(11): 4805-11に記載されている。ルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼ基質の酵素変換を測定することにより決定できる。ルシフェラーゼ基質の酵素変換は、変換反応の間に発生した光強度を検出することにより測定できる。ルシフェラーゼに触媒された変換反応中に発生した発光を測定する好適な装置およびキットは当技術分野において周知であり、また市販されている（事業者は、例えば、タカラ・クロンテック、サーモサイエンティフィック、およびプロメガであり、刊行物、例えば、Gailey, P. C., Miller, E. J. & Griffin, G. D. (1997) Low-cost system for real-time monitoring of luciferase gene expression. BioTechniques 22: 528-534；Gould, S. J. & Subramani, S. (1988) Firefly luciferase as a tool in molecular and cell biology. Analyt. Biochem. 175:5-13 Fulton, R. & Van Ness, B. (1993) Luminescent reporter gene assays for luciferase and beta-galactosidase using a liquid scintillation counter. BioTechniques 14:762-763； Lemasters, J. J. & Hackenbrock, C. R. (1977) Kinetics of product inhibition during firefly luciferase luminescence. Biochemistry 16(3): 445-447；Nguyen, V. T., Morange, M. & Bensaude, O. (1988) Firefly luciferase luminescence assays using scintillation counters for quantitation in transfected mammalian cells. Analyt. Biochem. 171: 404-408；Seliger, H. H. & McElroy, W. D. (1960) Spectral emission and quantum yield of firefly bioluminescence. Arch. Biochem. Biophys. 88:136-141；Vieites, J. M., Navarro-Garcia, F., Perez-Diaz, R., Pla, J. & Nombela, C. (1994) Expression and in vivo determination of firefly luciferase as gene reporter in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 10:1321-1327も参照されたい）。酸化還元反応でルシフェラーゼにより仲介された輝度は、試料中の神経毒ポリペプチドの量に等しい。したがって、細胞から遊離したルシフェラーゼの活性を定量化することによって神経毒の生物学的活性を決定できる。既知の神経毒ポリペプチド濃度の標準曲線を、対照基準として使用できる。さらなる基準として、場合により異なり得る試料中のルシフェラーゼによるシグナルと細胞数とを一致させるために、タンパク質測定を実施できる。この方法は当技術分野では常套的であり、上述の本発明の活性アッセイと並行させて実施可能である。レポータータンパク質として使用できる別の好適な酵素はβガラクトシダーゼである。この酵素を使用するアッセイも市販されており、当技術分野で記載がある（サーモサイエンティフィック、ライフテクノロジーズ、プロメガ；Nielsen, D. A., Chou, J., MacKrell, A. J., Casadaban, M. J. and Steiner, D. F. (1983) Proc Natl Acad Sci U S A 80(17): 5198-202）。別法として、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰまたはＲＦＰなどの蛍光タンパク質をレポータータンパク質として利用できる。前記レポータータンパク質を使用するアッセイは当技術分野で公知である。本明細書で使用する用語「レポータータンパク質の活性を定量化する」とは、神経毒感受性細胞の透過処理後に可溶性上清中に残存する本発明の切断された融合タンパク質のレポータータンパク質活性、または、神経毒感受性細胞内もしくは神経毒感受性細胞に残存する、本発明の切断されていない融合タンパク質の残留レポータータンパク質活性、または本発明の融合タンパク質の総レポータータンパク質活性を測定することを意味する。レポータータンパク質の総活性の測定の場合、透過処理した細胞中のレポータータンパク質の活性を決定することも、または上清除去後の残存レポータータンパク質全体の活性を測定することも可能である。別法として、本発明のコリントランスポーター−ＧＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ルシフェラーゼ融合タンパク質中のＧＦＰのような標準化因子または正規化因子を測定し、本発明の融合タンパク質の初期総量とすることができる。細胞から遊離したレポータータンパク質の活性を定量化することにより、神経毒ポリペプチドの生物学的活性を測定することができる。
本明細書で使用する用語「神経毒ポリペプチドの生物学的活性を測定する」とは、神経毒タンパク質の生物学的活性、すなわち、（ａ）受容体結合、（ｂ）内在化、（ｃ）エンドソーム膜を貫通する、サイトゾルへの移行、および／または（ｄ）細胞内タンパク質分解による、シナプス小胞の膜融合に関与するタンパク質の切断を測定することを意味する。具体的には、神経毒（例えば、ＢｏＮＴ／Ａ）により神経毒基質（例えば、ＳＮＡＰ−２５）が切断される細胞機序全般には、神経毒とその対応する受容体との結合（例えば、ＢｏＮＴ／ＡのＢｏＮＴ／Ａ受容体への結合）、神経毒／受容体複合体の内在化、細胞内小胞から細胞質への神経毒軽鎖の移行およびタンパク質分解による神経毒基質の切断が包含される。神経毒ポリペプチドの生物学的活性を測定するインビトロおよびインビボでのアッセイは当技術分野において周知であり、本明細書の他の箇所で言及されている（例えば、Pellett et al., Withemarsh et al Toxicol. Sciences 126(2), 426-435 (2012)、国際公開第２０１０／１０５２３４Ａ１号を参照されたい）。
本発明において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈で特に明示されない限り、単数および複数両方の表現を含む。例として、「ａ ｃｅｌｌ（細胞）」とは、１個の細胞というより１個以上の細胞を指す。
本発明において、記述項目、数、パーセンテージ、または期間の値を修飾する場合の用語「約」は、記述項目、数、パーセンテージ、または期間の値に１０パーセント、９パーセント、８パーセント、７パーセント、６パーセント、５パーセント、４パーセント、３パーセント、２パーセントまたは１パーセント加算または減算した範囲を指す。好ましい範囲は、１０パーセント加算または減算した範囲である。
本明細書で使用する用語「本質的に精製された」とは、神経毒ポリペプチドが他の宿主細胞のポリペプチドを本質的に含まない、すなわち、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％の宿主細胞ポリペプチド不純物を含有し得ることを意味する。
本明細書で使用する「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ（含む）」という用語は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（含む）」、「ｅｎｃｏｍｐａｓｓｉｎｇｉｎｇ（包含する）」、「ｅｎｃｏｍｐａｓｓｅｓ（包含する）」または「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」、「ｃｏｎｔａｉｎｓ（含有する）」と同義であり、かつ、包含的または非制限的であり、追加の未記述の構成要素、要素または方法ステップを除外するものではない。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」が用語「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ（からなる）」を包含することは明らかである。具体的には、本明細書で使用する用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」とは、そのクレームに、列挙した要素または方法ステップのすべてが包含されるが、追加の未指名の要素または方法ステップが含まれ得ることを意味する。例えば、ステップａ）、ｂ）およびｃ）を含む方法とは、その最も狭い意味において、ステップａ）、ｂ）およびｃ）からなる方法を包含する。語句「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ（からなる）」とは、組成物（またはデバイス、または方法）は、記述された要素（またはステップ）以外のものを有していないことを意味する。対照的に、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」は、ステップａ）、ｂ）およびｃ）に加え、さらなるステップ、例えば、ステップｄ）およびｅ）を含んでいる方法も包含できる。
本明細書で、「化合物Ｘを０．１〜０．５マイクロモル濃度で」のように数値範囲が使用されている場合、その範囲には、０．１および０．５マイクロモルだけではなく、０．１〜０．５マイクロモルの間にあるいかなる数値も、例えば、０．２、０．３、０．４マイクロモルも含まれる。
本明細書で使用する用語「インビトロ」は、動物またはヒトの体の外側、または外部を意味する。本明細書で使用する用語「インビトロ」には、「エキソビボ」が含まれることを理解されるべきである。用語「エキソビボ」とは、典型的に、動物またはヒトの体から取り出して、体外、例えば、培養容器内で維持または増殖される組織または細胞を指す。本明細書で使用する用語「インビボ」は、動物またはヒトの体の内側または内部を意味する。
特定の態様では、本発明の方法は、
（ａ）（ｉ）アンカー型タンパク質と、（ｉｉ）レポータータンパク質と、（ｉｉｉ）アンカー型タンパク質とレポータータンパク質との間に介在する神経毒切断部位とを含む融合タンパク質を、神経細胞に分化することのできる神経毒感受性細胞に発現させ、
（ｂ）ステップ（ａ）の神経毒感受性細胞が神経分化細胞に分化する条件下および時間でステップ（ａ）の神経毒感受性細胞を培地中にて分化させ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の神経分化細胞を神経毒とともにインキュベートし、該細胞を、神経毒がその生物学的活性を示すことができる条件下で培養し、
（ｄ）ステップ（ｃ）の神経分化細胞の透過処理を、該透過処理した神経分化細胞からレポータータンパク質は遊離させるがアンカー型タンパク質は遊離させない条件下で行い、
（ｅ）ステップ（ｄ）の細胞から遊離したレポータータンパク質の活性を定量化し、これにより神経毒の生物学的活性を測定する各ステップを含む。
（ａ）（ｉ）アンカー型タンパク質と、（ｉｉ）レポータータンパク質と、（ｉｉｉ）アンカー型タンパク質とレポータータンパク質との間に介在する神経毒切断部位とを含む融合タンパク質を、神経細胞に分化することのできる神経毒感受性細胞に発現させ、
（ｂ）ステップ（ａ）の神経毒感受性細胞が神経分化細胞に分化する条件下および時間でステップ（ａ）の神経毒感受性細胞を培地中にて分化させ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の神経分化細胞を神経毒とともにインキュベートし、該細胞を、神経毒がその生物学的活性を示すことができる条件下で培養し、
（ｄ）ステップ（ｃ）の神経分化細胞の透過処理を、該透過処理した神経分化細胞からレポータータンパク質は遊離させるがアンカー型タンパク質は遊離させない条件下で行い、
（ｅ）ステップ（ｄ）の細胞から遊離したレポータータンパク質の活性を定量化し、これにより神経毒の生物学的活性を測定する各ステップを含む。
この特定の態様では、神経毒感受性細胞は神経細胞に分化することができる。好ましくは、神経細胞に分化することのできる前記神経毒感受性細胞は腫瘍細胞である。本発明の方法のいくつかの態様では、前記神経細胞に分化することのできる腫瘍細胞はＳｉＭａ細胞であり、例えば、ＤＳＭＺ（German collection of Microorganisms and Cell cultures：ドイツ微生物・培養細胞収集）からＡＣＣ寄託番号：１６４として利用可能である。ＳｉＭａ細胞株のＤＳＭＺ ＡＣＣ１６４は親ＳｉＭａ細胞株としても知られる。本発明の方法で使用するＳｉＭａ細胞は、親ＳｉＭａ細胞またはその（サブ）クローンであり得る。そのようなサブクローンも当技術分野で公知であり、例えば、国際公開第２０１０／１０５２３４号、米国特許第８，４７６，０６８Ｂ２号またはEster Fernandez-Salas, Joanne Wang, Yanira Molina, Jeremy B. Nelson, Birgitte P. S. Jacky, K. Roger Aoki - PloSOne; 2012 7(11) e49516を参照されたい。他の態様では、神経細胞に分化することのできる腫瘍細胞は、Ｐ１９細胞（Jones-Villeneuve EM, McBurney MW, Rogers KA, Kalnins VI. Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. J Cell Biol. 1982 Aug; 94(2): 253-62；Staines WA, Craig J, Reuhl K, McBurney MW. Retinoic acid treated P19 embryonal carcinoma cells differentiate into oligodendrocytes capable of myelination. Neuroscience. 1996 Apr; 71(3): 845-53）またはＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（Encinas, Mario, et al. "Sequential Treatment of SH‐SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain‐Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor‐Dependent, Human Neuron‐Like Cells." Journal of neurochemistry 75.3 (2000): 991-1003）である。さらなる神経毒感受性細胞は本明細書の他の箇所で言及されている。前記細胞は、ＤＭＳＺのプロトコルにしたがって培養可能である。本方法の他の特定の態様では、神経細胞に分化することのできる神経毒感受性細胞は、初代細胞、幹細胞または人工多能性幹細胞であるか、またはそれに由来する。前記細胞を神経細胞に分化させるプロトコルは当技術分野で記載があり、例えば、引用刊行物を参照されたい。
本発明の方法の特定の態様では、アンカー型タンパク質は膜貫通型タンパク質である。好ましくは、膜貫通型タンパク質は、コリントランスポーター、Ｈ１−受容体（ヒスタミンＨ１受容体）、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）およびＳＶ２からなる群から選択される。
本発明の方法の特定の態様では、神経毒切断部位は、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／ＧおよびＴｅＮＴの切断部位からなる群から選択される。本発明の融合タンパク質に含まれている神経毒切断部位は、該融合タンパク質があることによって神経毒ポリペプチドが利用できるようになるので、神経毒のプロテアーゼは、好適な条件下で、神経毒感受性細胞内の本発明の融合タンパク質を認識して結合し切断できることを理解されるであろう。当業者は、融合タンパク質内の好適な配列を設計できる方法について十分に理解していよう。さらに、融合タンパク質は、付随する例に記載のように、神経毒感受性細胞内のタンパク質分解活性である神経毒ポリペプチドによって切断について試験することができる。
本発明の方法の別の特定の態様では、レポータータンパク質は、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、およびホースラディッシュペルオキシダーゼからなる群から選択される酵素であるか、またはＧＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰおよびＲＦＰからなる群から選択される蛍光タンパク質である。
本発明の方法のさらなる特定の態様では、細胞の透過処理に溶血毒を使用する。神経毒感受性細胞の透過処理を、該透過処理した神経毒感受性細胞からレポータータンパク質を遊離させるがアンカー型タンパク質は遊離させない条件下で行う。
溶血毒は、好ましくは、ストレプトリジンＯ、パーフリンゴリジンＯ、ニューモリシン、細菌性溶血素、およびヘビまたはクモ由来の膜孔形成毒素からなる群から選択される。細胞透過処理における溶血毒の使用および関連プロトコルは、当技術分野で十分に記載されている。
本発明の方法の特定の態様では、融合タンパク質は、コリントランスポーター−ＧＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ルシフェラーゼ、Ｈ１−受容体−ＳＮＡＰ−２５−ＨＲＰおよびＨ１−受容体−ＳＮＡＰ−２５−ルシフェラーゼからなる群から選択される融合タンパク質を含むか、またはそれで構成される。さらに、一態様では、配列番号２もしくは４に示すようなアミノ酸配列、または配列番号２もしくは配列番号４に対する配列同一性が少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質が包含される。２つの配列間の配列同一性を測定する手段および方法は、本明細書の他の箇所で言及されている。一態様では、パーセント同一性値は、参照配列、すなわち配列番号２または４のアミノ酸配列全体にわたって計算される。配列番号２（コリントランスポーター−ＧＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ルシフェラーゼ；ＣＨＴ−ＧＦＰ−ＳＮＡＰ−ＬＵＣ）に示されるアミノ酸配列は、配列番号１および５に示される核酸配列によりコードされ、配列番号４（Ｈ１−受容体−ＳＮＡＰ−２５−ルシフェラーゼ；Ｈ１Ｒ−ＳＮＡＰ−ＬＵＣ）に示されるアミノ酸配列は、配列番号３に示される核酸配列によりコードされる。対応する配列は配列表に示されている。
本発明の方法のさらなる態様では、レポータータンパク質の活性の定量は、レポータータンパク質の活性を標準化することを含む。
本発明の方法の特定の態様では、レポータータンパク質の活性の標準化は、神経毒感受性細胞内もしくは神経毒感受性細胞に残存する切断されていない融合タンパク質の残留レポータータンパク質活性または融合タンパク質の総レポータータンパク質活性を測定することにより行う。
さらに、本発明は、神経毒感受性細胞において神経毒の生物学的活性を測定するための（ｉ）アンカー型タンパク質と、（ｉｉ）レポータータンパク質と、（ｉｉｉ）アンカー型タンパク質とレポータータンパク質との間に介在する神経毒切断部位とを含む融合タンパク質に関する。好ましくは、神経毒感受性細胞は神経細胞に分化することができる。
本発明の方法に関する定義および実施形態は、本発明の融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞およびキットに準用する。
本発明の融合タンパク質の特定の態様では、アンカー型タンパク質は、コリントランスポーター（ＣＨＴ）、Ｈ１−受容体、ＧＰＣＲおよびＳＶ２からなる群から選択され、レポータータンパク質は、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、およびホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）からなる群から選択される酵素であるか、またはＧＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰおよびＲＦＰからなる群から選択される蛍光タンパク質であり、また、神経毒切断部位は、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／ＧおよびＴｅＮＴの切断部位からなる群から選択される。本発明の融合タンパク質においてさらに包含されるのは、既述のアンカー型タンパク質、レポータータンパク質および神経毒切断部位の任意の組み合わせである。好ましくは、本発明の融合タンパク質の配列は、Ｎ末端からＣ末端へ向かって、アンカー型タンパク質−神経毒切断部位−レポータータンパク質という配列である。標準化因子を使用する場合、本発明の融合タンパク質の配列は、好ましくは、Ｎ末端からＣ末端へ向かって、アンカー型タンパク質−標準化因子−神経毒切断部位−レポータータンパク質という配列である。
本発明の融合タンパク質のさらに別の特定の態様では、融合タンパク質は、コリントランスポーター−ＧＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ルシフェラーゼ（ＧＦＰを標準化因子または正規化因子として含む）、Ｈ１−受容体−ＳＮＡＰ−２５−ルシフェラーゼおよびＨ１−受容体−ＳＮＡＰ−２５−ＨＲＰからなる群から選択される融合タンパク質を含むか、またはそれで構成される。さらに、一態様では、配列番号２もしくは４に示すようなアミノ酸配列、または配列番号２もしくは配列番号４に対する配列同一性が少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるアミノ酸配列を含む融合タンパク質が包含される。２つの配列間の配列同一性を測定する手段および方法は、本明細書の他の箇所に示されている。一態様では、パーセント同一性値は、参照配列、すなわち配列番号２または４のアミノ酸配列全体にわたって計算される。配列番号２（コリントランスポーター−ＧＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ルシフェラーゼ；ＣＨＴ−ＧＦＰ−ＳＮＡＰ−ＬＵＣ）に示されるアミノ酸配列は、配列番号１および５に示される核酸配列によりコードされ、配列番号４（Ｈ１−受容体−ＳＮＡＰ−２５−ルシフェラーゼ；Ｈ１Ｒ−ＳＮＡＰ−ＬＵＣ）に示されるアミノ酸配列は、配列番号３に示される核酸配列によりコードされる。対応する配列は配列表に示されている。
本発明はまた、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにも関する。
本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」または「核酸（分子）」という用語は、一本鎖ＤＮＡ分子または二本鎖ＤＮＡ分子ならびにＲＮＡ分子を指す。前記用語により、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ならびにそのような分子種の天然に生じるかまたは人工修飾した誘導体すべてが包含される。一態様では、ポリヌクレオチドは、直鎖の分子または環状分子であってよい。かかるポリヌクレオチド配列は本発明の融合タンパク質をコードする。さらに、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列に加え、本明細書で使用するポリヌクレオチドは、適切な転写および／または翻訳に必要な、５’ＵＴＲ配列または３’ＵＴＲ配列などのさらなる配列を含んでよい。本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列は、当業者がそれ以上の手間を掛けずにアミノ酸配列から得ることができる。遺伝暗号の縮重の観点から、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列において最適化したコドンを使用してよい。これにより、至適発現が、例えば神経毒感受性細胞で、達成され得る。
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターにも関する。一態様では、前記ベクターは発現ベクターである。
用語「ベクター」は、好ましくは、ファージ、プラスミド、ウイルスまたはレトロウイルのスベクターならびに、細菌人工染色体または酵母人工染色体などの人工染色体を包含する。さらに、かかる用語は、標的に向かう構成体を無作為または部位指向的にゲノムＤＮＡ内に組込ませる、かかる標的に向かう構成体にも関する。このような標的構成体は、好ましくは、相同組換えまたは異種組換えに十分な長さのＤＮＡを含む。一態様では、本発明のポリヌクレオチドを包含するベクターは、宿主または宿主細胞内の増殖および／または選択についての選択可能なマーカーをさらに含む。ベクターを、当技術分野において周知のさまざまな技術によって宿主細胞内に組み込んでよい。例えば、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物または塩化ルビジウム沈殿物などの沈殿物にして、または荷電脂質との複合体もしくはフラーレンのような炭素クラスターにして導入可能である。別法として、熱ショックまたは電気穿孔法によってプラスミドベクターを導入してよい。ベクターがウイルスの場合、宿主細胞に使用する前に、適切なパッケージング細胞株を使用してインビトロでウイルスをパッケージングしてよい。レトロウイルスベクターは、複製可能であっても複製欠損であってもよい。複製欠損の場合、一般に、宿主／細胞を補わないとウイルス増殖は起こらないことになる。さらに、本発明の一態様では、前記ベクターにおいてポリヌクレオチドは原核生物宿主細胞もしくは真核生物宿主細胞またはその単離画分に発現させる発現制御配列と機能的に連結されている。ポリヌクレオチドの発現は、翻訳可能なｍＲＮＡへのポリヌクレオチドの転写を含む。宿主細胞での発現を確実にする調節エレメントは当技術分野において周知である。一態様では、調節エレメントは、転写を確実に開始させる制御配列および／または転写の終結および転写の安定化を確実に行うポリ−Ａシグナルを含む。さらなる調節エレメントとして、転写および翻訳のエンハンサーが含まれてよい。原核生物宿主細胞での発現を可能にする、可能な調節エレメントは、例えば大腸菌のｌａｃ−、ｔｒｐ−もしくはｔａｃ−プロモーターを含み、また、真核生物の宿主細胞での発現を可能にする調節エレメント例は、酵母のＡＯＸ１−もしくはＧＡＬ１−プロモーターまたはＣＭＶ−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶ−エンハンサー、ＳＶ４０−エンハンサーまたは哺乳類および他の動物細胞のグロビンイントロンである。本発明により想定される他の発現系により、ポリヘドリンプロモーターを用いた系などの昆虫細胞での発現が可能になるであろう。
さらに、誘導可能な発現制御配列を本発明により包含される発現ベクターで使用してよい。誘導型発現系および好適な発現制御配列は当技術分野において周知である。例えば、転写促進活性化のためのテトラサイクリン応答性調節システムは、Zhu Z, Zheng T, Lee CG, Homer RJ, Elias JA: Tetracycline-controlled transcriptional regulation systems: advances and application in transgenic animal modeling. Semin. Cell Dev. Biol. 2002, 13:121-8；またはShockett P, Schatz D: Inducible gene expression using an autoregulatory, tetracycline-controlled system. Curr. Protoc. Mol. Biol. 2002, Chapter 16: Unit 16.14に記載されている。このような誘導型ベクターは、ｔｅｔまたはｌａｃオペレーター配列または熱ショックもしくは当技術分野で記載がある他の環境の因子により誘導可能な配列を含んでよい。例えば、一般に使用されている誘導型発現系は、Tet-OffおよびTet-Onの２つであり、Bujard and Gossen, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (12): 5547-51を参照されたい。それらは、ＴｅｔリプレッサーとＶＰ１６活性化ドメインとの融合体からなり、リプレッサーというよりむしろ転写活性化タンパク質（転写活性化因子）を創製する。Tet-OffまたはTet-Onタンパク質と誘導プロモーター内部に位置するテトラサイクリン応答配列（ＴＲＥ）とが結合すると、遺伝子発現が活性化される。違いは、より安定なテトラサイクリン類似体であるドキシサイクリン（Ｄｏｘ）に対する両者それぞれの応答に関係しており、Tet-Offは、Ｄｏｘが存在しない場合に発現を活性化するが、Tet-Onは、Ｄｏｘの存在下で発現を活性化する。好適なベクターが市販されている。例えば、クロンテック製Tet-On 3Gベクターセットを使用して、厳密に制御され応答性の高いテトラサイクリン（Ｔｅｔ）誘導型哺乳類発現系を創製でき、これは培地にドキシサイクリンを添加することにより稼働する。pCMV-Tet3GベクターはTet-On 3Gを発現する。Tet-On 3Gはテトラサイクリン制御性転写活性化因子であり、誘導物質ドキシサイクリンの存在下で高活性を示し、その非存在下では非常に活性が低い。Tet-On 3Gは、変異型Ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）のアミノ酸１〜２０７と、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６タンパク質由来の３つの「Ｆ」型転写活性化最小ドメインを形成する３９アミノ酸との融合から得られる。ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＰＣＭＶ ＩＥ）によりTet-On 3Gの構成的な発現が起こる。さらに、ＣＭＶプロモーターがサイレンシングされる細胞株用にＥＦ１アルファのバージョンが利用可能である。詳細については、クロンテックのカタログ番号６３１１６３およびその引用参考文献を参照されたい。転写開始に関与するエレメントに加え、そのような調節エレメントは、ポリヌクレオチドの下流にＳＶ４０−ポリ−Ａ部位またはｔｋ−ポリ−Ａ部位のような転写終結シグナルも含む。これに関連し、好適な発現ベクターが当技術分野で公知であり、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（ファルマシア）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン）またはｐＳＰＯＲＴ１（インビトロジェン）またはバキュロウイルス由来ベクターなどがある。好ましくは、前記ベクターは発現ベクターおよび遺伝子導入または遺伝子標的ベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルスなどのウイルス由来の発現ベクターを、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの標的細胞集団内への送達に使用してよい。当業者に周知の方法を使用して組換えウイルスベクターを構築することができ、例えば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), (2001) N.Y.およびAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)に記載の技術を参照されたい。
本発明は、さらに、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは融合タンパク質を含む宿主細胞に関する。
本明細書で使用する用語「宿主細胞」は、原核生物および真核生物の宿主細胞、好ましくは、原核生物および真核生物の単離した宿主細胞を包含する。好ましくは、宿主細胞は真核生物の宿主細胞である。本明細書で使用する真核生物の宿主細胞は、動物の細胞であり、好ましくは、本発明の融合タンパク質の作製に好適な、哺乳類またはヒトの細胞株である。本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、宿主細胞のゲノムに安定に組み込むことも、または宿主細胞により一過性に発現させることも可能である。したがって、本明細書でいう宿主細胞は、一態様では、初代細胞であっても細胞株であっても、酵母細胞、ヒト細胞など哺乳類細胞、植物細胞または昆虫細胞を包含する。例えば、本明細書における神経毒感受性細胞を宿主細胞として使用できる。
本発明の融合タンパク質を、当業者に周知の化学合成技術または分子生物学的組み換え技術により製造することができ、例えば、Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, third edition, 2001を参照されたい。一態様では、本発明の融合タンパク質のそのような製造方法は、（ａ）本明細書の他の箇所に記載の宿主細胞を培養し、かつ（ｂ）前記宿主細胞から融合タンパク質を得ることを含む。この方法の一態様では、本発明の融合タンパク質を、アフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよび／または予備的ゲル電気泳動など、宿主細胞溶解物をもとにした従来の精製技術により得ることができる。融合タンパク質には、本発明の融合タンパク質および他の追加タンパク質を含むポリペプチド調製物が含まれることが本発明の範囲により想定される。
さらに、本発明は、本発明の融合タンパク質、該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ベクターおよび／または宿主細胞を含むキットに関する。本明細書で使用する用語「キット」とは、本発明の既述の構成要素を含む手段の集まりを指し、本発明の方法を実施するために即時使用できるよう別々または共通のバイアル内に提供される。一態様では、キットは、本発明の方法を実施するためのさらなる手段を含み、一態様では、神経毒ポリペプチドを含む校正用標準溶液および／または、レポータータンパク質もしくは前記レポータータンパク質により変換された基質の検出薬のような、レポータータンパク質活性（例えば、ルシフェラーゼ活性）の測定手段を含む。さらに、キットは、本発明の方法を実施するための指示書を含む。これらの指示書は、使用説明書として提供されても、またはデータ記憶媒体上のコンピュータ実施可能アルゴリズム（computer-implementable algorithm）の形態で提供されてもよく、その場合、実施時、本発明の方法の１つ以上のステップを管理できる。一態様では、上述の本発明の方法を実施するためにキットが使用される。
最後に、本発明は、神経毒感受性細胞において、神経毒の生物学的活性を測定するために、本発明の融合タンパク質、該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ベクターおよび／または宿主細胞を使用することに関する。
本発明を以下の実施例により説明していくが、本発明の範囲を限定するものとして解釈されないものとする。
配列番号２（コリントランスポーター−ＧＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ルシフェラーゼ；ＣＨＴ−ＧＦＰ−ＳＮＡＰ−ＬＵＣ）に示されるアミノ酸配列をコードする配列番号５に示す配列を有するＤＮＡ分子を新たに合成し、その後、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（ライフテクノロジーズ）内にクローニングする。さらに、プラスミド（構成体が挿入されたＤＮＡベクター）を増幅させ、抽出および精製を行う。ライフテクノロジーズ製GeneArtによりＤＮＡ合成、クローニング、増幅および単離を実施する。
プラスミドを、Lipofectamine 2000（ライフテクノロジーズ）を使用してＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２６６）内にトランスフェクションする。事業者の指示書にしたがって細胞培養およびトランスフェクションを実施する。
プラスミドのトランスフェクション後、プラスミド含有細胞を選択的に増殖させるために、細胞をゲンタマイシン（Gentamicine）存在下で培養する。培養で細胞数が約５００万に達し次第、限定希釈の方法を用いて単一細胞クローニングを実施する。これにより、約４００個のクローンを創製し、接着の質、増殖率、プラスミド発現率およびＢｏＮＴ／Ａに対する感受性について試験する。Pellett S, Tepp WH, Clancy CM, Borodic GE, Johnson EA. FEBS Lett. 2007 Oct 16; 581(25): 4803-8にしたがって、ＧＦＰの蛍光を測定して発現率を決定し、ウェスタンブロットのＳＮＡＰ−２５切断アッセイによりＢｏＮＴ／Ａ感受性を試験する。接着および増殖率が良好で、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ親細胞に匹敵するかまたはそれより優れたＢｏＮＴ／Ａ感受性を示すクローンから、ＧＦＰ発現率の最も高いものを選択して細胞バンクに保管する。
ＢｏＮＴ／Ａレポーターアッセイの場合、細胞を９６ウェルプレート上に播種し、その後、Ｒａｓｅｔｔｉ−Ｅｓｃａｒｇｕｅｉｌら（Enhanced sensitivity to Botulinum type A neurotoxin of human neuroblastoma SH-SY5Y cells after differentiation into mature neuronal cells by C. Rasetti-Escargueil, C.B. Machado, R. Preneta-Blanc, R.A. Fleck, D. Sesardic The Botulinum J. (TBJ), Vol. 2, No. 1, 2011）にしたがって分化させる。対数増殖段階において、分化した細胞を、培地中にて最終濃度０．０１〜１０ｐＭまで希釈したＢｏＮＴ／Ａと共に７２時間インキュベートする。インキュベーション後、ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて細胞を１回洗浄し、ストレプトリジンＯ溶液５０μｌ（１０ｍＭリン酸ナトリウム、０．９％ＮａＣｌ、ジチオトレイトール１０ｍＭ、ストレプトリジンＯ５０Ｕ／ｍＬ、ｐＨ７．４）を用いて透過処理を行う。３７℃で１５分インキュベーションした後、事業者の指示書（シグマアルドリッチＬＵＣ１−１ＫＴ）にしたがって、各ウェルの上清を白色９６ウェルプレートに移してルシフェラーゼ活性を測定する。培養プレート上に残存している細胞をＰＢＳで１回洗浄し、マイクロプレートリーダーでＧＦＰ蛍光を測定する。単一ウェルそれぞれについて、シグナル測定値を除算してＬｕｃ／ＧＦＰ比を計算する。未知の試料の用量反応曲線と対照標準の曲線それぞれとを比較して、例えば平行線検定法により、ＢｏＮＴ／Ａの生物学的活性を計算する。
Claims (15)
- 神経毒の生物学的活性を測定する方法であって、
（ａ）（ｉ）アンカー型タンパク質と、（ｉｉ）レポータータンパク質と、（ｉｉｉ）前記アンカー型タンパク質と前記レポータータンパク質との間に介在する神経毒切断部位とを含む融合タンパク質を神経毒感受性細胞に発現させ、
（ｂ）（ａ）の神経毒感受性細胞を神経毒とともにインキュベートし、前記神経毒がその生物学的活性を示すことができる条件下で前記神経毒感受性細胞を培養し、
（ｃ）（ｂ）の神経毒感受性細胞への透過処理を、前記透過処理した神経毒感受性細胞から前記レポータータンパク質は遊離するが、前記アンカー型タンパク質は遊離しない条件下で行い、且つ
（ｄ）（ｃ）の透過処理した神経毒感受性細胞から遊離した前記レポータータンパク質の活性を定量化し、
これにより前記神経毒の生物学的活性を測定するステップ、
を含む、前記方法。 - 前記神経毒感受性細胞が、腫瘍細胞株、初代細胞、幹細胞又は人工多能性幹細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
- 前記アンカー型タンパク質が、コリントランスポーター、Ｈ１−受容体、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）及びＳＶ２から成る群から選択される膜タンパク質である、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記神経毒切断部位が、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ及びＴｅＮＴの切断部位から成る群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記レポータータンパク質が、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、及びホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）から成る群から選択される酵素であるか、又はＧＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ及びＲＦＰから成る群から選択される蛍光タンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記神経毒感受性細胞の透過処理のために溶血毒を使用する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記溶血毒が、ストレプトリジンＯ、パーフリンゴリジンＯ、ニューモリシン、細菌性溶血素、及びヘビ又はクモ由来の膜孔形成毒素から成る群から選択される、請求項６に記載の方法。
- 前記融合タンパク質が、コリントランスポーター−ＧＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ルシフェラーゼ、Ｈ１−受容体−ＳＮＡＰ−２５−ルシフェラーゼ及びＨ１−受容体−ＳＮＡＰ−２５−ＨＲＰから選択される融合タンパク質を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記レポータータンパク質の活性の定量化が、前記レポータータンパク質の活性を標準化することを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記レポータータンパク質の活性の標準化を、前記神経毒感受性細胞内若しくは前記神経毒感受性細胞上に残存する切断されていない融合タンパク質の残留レポータータンパク質活性又は前記融合タンパク質の総レポータータンパク質活性を測定することにより行う、請求項９に記載の方法。
- 神経毒感受性細胞において神経毒の生物学的活性を測定するための、（ｉ）アンカー型タンパク質と、（ｉｉ）レポータータンパク質と、（ｉｉｉ）前記アンカー型タンパク質と前記レポータータンパク質との間に介在する神経毒切断部位とから成る融合タンパク質。
- 前記アンカー型タンパク質が、コリントランスポーター、Ｈ１−受容体、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）及びＳＶ２から成る群から選択され、前記レポータータンパク質が、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼから成る群から選択される酵素であるか、又はＧＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ及びＲＦＰから成る群から選択される蛍光タンパク質であり、且つ、前記神経毒切断部位が、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ１、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／Ｇ及びＴｅＮＴの切断部位から成る群から選択される、請求項１１に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質が、コリントランスポーター−ＧＦＰ−ＳＮＡＰ−２５−ルシフェラーゼ、Ｈ１−受容体−ＳＮＡＰ−２５−ルシフェラーゼ及びＨ１−受容体−ＳＮＡＰ−２５−ＨＲＰから選択される融合タンパク質を含む、請求項１１又は１２に記載の融合タンパク質。
- 請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含むキット。
- 神経毒感受性細胞において、神経毒の生物学的活性を測定するための、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP14194265 | 2014-11-21 | ||
| EP14194265.6 | 2014-11-21 | ||
| PCT/EP2015/077245 WO2016079310A1 (en) | 2014-11-21 | 2015-11-20 | Methods for the determination of the biological activities of neurotoxin polypeptides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2017535274A true JP2017535274A (ja) | 2017-11-30 |
| JP6682532B2 JP6682532B2 (ja) | 2020-04-15 |
Family
ID=51945763
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2017527367A Active JP6682532B2 (ja) | 2014-11-21 | 2015-11-20 | 神経毒ポリペプチドの生物学的活性を測定する方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10634683B2 (ja) |
| EP (1) | EP3221699B1 (ja) |
| JP (1) | JP6682532B2 (ja) |
| KR (1) | KR102409293B1 (ja) |
| CN (1) | CN107003310B (ja) |
| AU (1) | AU2015348254B2 (ja) |
| CA (1) | CA2968284C (ja) |
| WO (1) | WO2016079310A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2022512565A (ja) * | 2018-09-28 | 2022-02-07 | イプセン バイオファーム リミテッド | 細胞ベースのクロストリジウム神経毒アッセイ |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SG11201510685UA (en) | 2013-06-28 | 2016-01-28 | Merz Pharma Gmbh & Co Kgaa | Means and methods for the determination of the biological activity of neurotoxin polypeptides in cells |
| US10408837B2 (en) * | 2013-12-09 | 2019-09-10 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Peptide substrates recognizable by type E botulinum neurotoxin |
| TWI704156B (zh) * | 2015-03-04 | 2020-09-11 | 德商曼茲法瑪股份有限公司 | 用於增進肉毒桿菌神經毒素進入細胞之特定攝取的方法 |
| JP6493316B2 (ja) | 2016-06-21 | 2019-04-03 | 東亜ディーケーケー株式会社 | 変異型甲虫ルシフェラーゼ、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、及び変異型甲虫ルシフェラーゼの製造方法 |
| GB201702500D0 (en) | 2017-02-16 | 2017-04-05 | Univ Sheffield | Stable vamp reporter assay |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7374896B2 (en) | 2001-08-28 | 2008-05-20 | Allergan, Inc. | GFP-SNAP25 fluorescence release assay for botulinum neurotoxin protease activity |
| WO2005076785A2 (en) | 2003-12-19 | 2005-08-25 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method and compositions for detecting botulinum neurotoxin |
| GB0426397D0 (en) * | 2004-12-01 | 2005-01-05 | Health Prot Agency | Fusion proteins |
| WO2009035476A1 (en) * | 2007-09-14 | 2009-03-19 | Biosentinel, Llc | Resonance energy transfer assay with cleavage sequence and spacer |
| HUE046037T2 (hu) * | 2008-03-14 | 2020-01-28 | Allergan Inc | Immun-alapú, A szerotípusú botulinum toxin aktivitás vizsgálati eljárások |
| CN102439138B (zh) | 2009-03-13 | 2018-03-30 | 阿勒根公司 | 可用于基于免疫的肉毒杆菌毒素血清a型活性测定的细胞 |
| ES2647243T3 (es) | 2009-04-27 | 2017-12-20 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Medios y métodos para la determinación de la cantidad de polipéptido Neurotoxina y de sus actividades catalíticas y proteolíticas |
| CA2866595A1 (en) | 2012-03-07 | 2013-09-12 | Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa | Means and methods for determining neurotoxin activity based on a modified luciferase |
| RU2015123810A (ru) * | 2012-11-21 | 2017-01-10 | Мерц Фарма Гмбх Унд Ко. Кгаа | Средства и способы определения биологической активности ботулинического нейротоксина |
-
2015
- 2015-11-20 WO PCT/EP2015/077245 patent/WO2016079310A1/en active Application Filing
- 2015-11-20 KR KR1020177013483A patent/KR102409293B1/ko active IP Right Grant
- 2015-11-20 CA CA2968284A patent/CA2968284C/en active Active
- 2015-11-20 CN CN201580062143.8A patent/CN107003310B/zh active Active
- 2015-11-20 JP JP2017527367A patent/JP6682532B2/ja active Active
- 2015-11-20 US US15/528,219 patent/US10634683B2/en active Active
- 2015-11-20 EP EP15798407.1A patent/EP3221699B1/en active Active
- 2015-11-20 AU AU2015348254A patent/AU2015348254B2/en active Active
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2022512565A (ja) * | 2018-09-28 | 2022-02-07 | イプセン バイオファーム リミテッド | 細胞ベースのクロストリジウム神経毒アッセイ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3221699B1 (en) | 2020-06-17 |
| KR102409293B1 (ko) | 2022-06-14 |
| CA2968284C (en) | 2023-11-14 |
| WO2016079310A1 (en) | 2016-05-26 |
| AU2015348254A1 (en) | 2017-05-25 |
| KR20170084098A (ko) | 2017-07-19 |
| AU2015348254B2 (en) | 2021-03-25 |
| JP6682532B2 (ja) | 2020-04-15 |
| CN107003310B (zh) | 2019-07-19 |
| EP3221699A1 (en) | 2017-09-27 |
| US10634683B2 (en) | 2020-04-28 |
| CN107003310A (zh) | 2017-08-01 |
| US20180045733A1 (en) | 2018-02-15 |
| CA2968284A1 (en) | 2016-05-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6682532B2 (ja) | 神経毒ポリペプチドの生物学的活性を測定する方法 | |
| US11788069B2 (en) | In vitro and cell based assays for measuring the activity of botulinum neurotoxins | |
| CA2604039C (en) | Lipophilic dye-based fret assays for clostridial toxin activity | |
| AU2013349725B2 (en) | Means and methods for determination of botulinum neurotoxin biological activity | |
| EP1920248B1 (en) | Clostridial toxin activity assays | |
| JP2015509372A (ja) | 修飾ルシフェラーゼに基づいて神経毒活性を測定するための手段および方法 | |
| Hubbard et al. | Functional evaluation of biological neurotoxins in networked cultures of stem cell-derived central nervous system neurons | |
| RU2694191C2 (ru) | Ганглиозиды для стандартизации и повышения чувствительности клеток к нейротоксинам ботулизма в тест-системах in vitro | |
| US20220235105A1 (en) | Methods and compositions for visualizing sumo |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426 Effective date: 20171205 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20171205 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180802 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20190624 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190709 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191008 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200317 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200325 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6682532 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |