KR101226604B1 - 절단 서열 및 스페이서를 이용한 공명 에너지 전달 분석 - Google Patents
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Abstract
분자 컨스트럭트는 공여체 라벨, 수용체 라벨, 상기 공여체 및 상기 수용체 사이에 배치된 링커, 절단 부위 서열을 가진 링커, 및 하나 이상의 (a) 상기 공여체 및 상기 절단 부위 서열 및 (b) 상기 수용체 및 상기 절단부위 서열 사이의 스페이서를 포함한다. 바람직하게는, 상기 컨스트럭트는 CFP-(SGLRSRA)-SNAP-25-(SNS)-YFP, 및 CFP-(SGLRSRA)-시냅토브레빈-(SNS)-YFP으로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 상기 링커 펩티드는 보툴리눔 신경독소에 의해 인식되고 절단될 수 있는 시냅토브레빈(VAMP), 신택신 및 SNAP-25, 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 보툴리눔 신경독소의 기질이다. 유리하게도, 상기 스페이서는 스페이서 없는 상응하는 컨스트럭트에 비하여, 상기 공여체 라벨 및 수용체 라벨 사이의 전자 커플링을 증가시킨다.
Description
본원은 문헌 전체가 참조 문헌으로서 통합되는 2007.9.14일에 출원된, 가출원 제 60/972673에 대해 우선권을 주장한다.
본원 발명의 기술분야는 보툴리눔 독소(botulinum toxins) 및 파상풍 독소와 관련된 프로테아제 분석에 대한 형광 공명 에너지 전달이다.
보툴리눔 신경독소(BoNTs)는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)에 의해 생산되고 가장 강력한 독소로 공지되어 있다. 이 독소는 종종 심각한 피해 또는 심지어 피해자의 죽음도 유발하는 식중독의 원인으로 잘 인식되어 있다. 보툴리눔 신경독소 또는 혈청형(BoNT/A-G)이 존재하는데, 7개의 구조적으로 관련된 각각은 중쇄(약 100KD) 및 경쇄(약 50KD)로 구성되어 있다. 상기 중쇄는 수용체-매개 엔도시토시스를 통해 독소를 타겟 세포로 전달한다. 내재화된, 경쇄는 엔도좀 소포 루멘에서 시토졸로 자리옮김되고, 아연-의존성 프로테아제로서 소포-타겟 세포막 융합을 매개하는 단백질("기질 단백질")을 절단하는 역할을 한다.
상기 BoNT 기질 단백질은 원형질 막 단백질 신택신(syntaxin), 외재성 막 단백질 SNAP-25, 및 소포 막 단백질 시냅토브레빈(Syb)을 포함한다. 이 단백질은 집합적으로 SNARE(가용성 N-에틸말레이미드-민감 요소 부착 단백질 수용체) 단백질로 불린다. SNARE 단백질 절단은 원형질막과의 소포 융합을 막고, 신경근 연접(neuromuscular junction)에서 신경전달물질의 분비를 파괴한다. SNARE 단백질 가운데, 신택신 및 SNAP-25은 보통 타겟 세포막에 상주하고 있고 따라서, t-SNARE라고 불리는 반면 시냅토브레빈은 단독으로 시냅스소포와 함께 시냅스 안에서 발견되므로 v-SNARE라고 불린다. 종합해서, 상기 세 가지 단백질은 소포막과 원형질막 사이의 융합을 매개하는 최소의 조직으로 생각되는 복합체를 형성한다. 단일하지만 서로 다른 부위에서, BoNT/A, E, 및 C.sup.1은 SNAP-25을 절단하고, BoNT/B, D, F, G은 시냅토브레빈(Syb)을 절단한다. BoNT/C는 SNAP-25에 더하여 신택신 또한 절단한다.
식중독의 원인으로서의 및 바이오테러리즘 무기로서의 위협 때문에, BoNT를 민감하고 빠르게 검출하는 것이 필요하다. 현재, 독소를 검출하는데 가장 민감한 방법은 마우스에서 독성 분석을 수행하는 것이다. 이 방법은 많은 수의 마우스를 필요로 하고, 시간 소모적이며 독소 촉매 동역학 연구에는 이용될 수 없다. 독소에 대항한 항체 이용에 기반한 다수의 증폭된 면역분석법 시스템이 또한 발달하고 있으나, 이 시스템의 대부분은 복잡하고 값비싼 증폭공정을 필요로 하고, 독소 촉매 활성에도 사용될 수 없다. HPLC 및 면역분석법이 절단된 기질 분자 검출 및 이 독소의 효소 활성을 측정하는데 사용될 수 있다 할지라도, 이 방법은 일반적으로 시간 소모적이고 복잡하며, 이들 중 몇 가지는 특수화된 항체를 필요로 하고, 이는 이 방법을 거대한 스케일의 스크리닝에는 적용할 수 없게 만든다. 따라서, BoNT를 검출하기 위한 신규하고 개선된 방법 및 조성물이 필요하다.
FRET 분석에서, 두 개의 플루오로제닉(fluorogenic) 아미노산 유도체는 두 개의 본래 아미노산을 독소 절단 부위를 포함한 매우 짧은 합성 펩티드(20-35개의 아미노산) 안에서 대체하는데 사용된다. 한 아미노산 유도체의 형광신호는 또 다른 아미노산 유도체에 의해 이들이 서로 펩티드 안에서 가까워질 때 소멸 되고, 이 메카니즘을 "포스터 공명 에너지 전달(Forster resonance energy transfer, FRET)"라고 부른다. 상기 펩티드의 절단은 두 아미노산 유도체를 분리하고, 검출될 수 있는 FRET를 감소시킨다.
FRET 분석은 BoNT 검출에 성공적으로 사용되어 왔다(예를 들어, 미국특허출원 제 2004/0191887 호(Chapman, 2003년 10월 28일 출원된), 미국특허출원 제 2006/0134722 호(Chapman, 2004년 12월 20일 출원된), 미국특허출원 제 7208285호(Steward, 2007년 4월), 및 미국특허출원 제 7183066 호(Fernandez-Salas, 2007년 2월), 이들 각각은 문헌 전체가 참조 문헌으로서 본원에 통합된다. 통합된 참조 문헌에서의 용어의 사용 또는 정의가 본원에 제공된 용어의 정의와 일치하지 않거나 반대되는 곳에서는, 본원에서 제공된 상기 용어의 정의를 적용하고 참조 문헌에서의 용어 정의는 적용하지 않는다).
BoNT 검출에 대한 FRET 분석을 적용하여 일부 성공을 거두었음이 입증되었으나, 민감도 및 특이성은 충분하지 않다. 따라서 개선된 기구, 시스템 및 방법이 필요하다.
본원 발명은 분자 컨스트럭트가 공여체 라벨, 수용체 라벨, 상기 공여체 및 상기 수용체 사이에 배치된 링커 펩티드, 절단 부위 서열을 가지는 링커, 및 (a) 공여체 및 절단 부위 서열 및 (b) 수용체 및 절단 부위 서열 사이 중 적어도 하나 사이의 스페이서를 포함하는, 기구, 시스템 및 방법을 제공한다.
바람직한 구체예에서, 상기 공여체 및 상기 수용체 라벨은 상기 공여체 라벨이 상기 수용체 라벨에 쌍극자-쌍극자 커플링 메카니즘에 의해 에너지를 제공할 수 있도록, 전자 커플링(electronic coupling)을 제공하는 위치에 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 쌍극자-쌍극자 커플링 메카니즘은 포스터 공명 에너지 전달(Forster resonance energy transfer, FRET)이다.
상기 공여체 및 수용체 라벨은 색소체 또는 형광체 모이어티 모두가 될 수 있고, 상기 공여체 라벨의 방출 스펙트럼은 수용체 라벨의 여기 스펙트럼과 겹친다. 바람직하게는, 상기 공여체는 녹색 형광 단백질 또는 이의 변이체이고, 상기 수용체는 상응하는 녹색 형광 단백질의 변이체이다. 본원 발명에 대한 특히 바람직한 공여체 및 수용체 라벨(형광체 쌍)은 CFP-YFP이다.
바람직한 구체예에서, 링커 펩티드는 보툴리눔 신경독소에 의해 인식되고 절단될 수 있는, 시냅토브레빈(VAMP), 신택신 및 SNAP-25, 또는 이의 단편("절단가능 단편")으로 이루어진 군에서 선택된 보툴리눔 신경독소의 기질이다. 이 단백질은 집합적으로 SNARE(가용성 N-에틸말레이미드-민감 요소 부착 단백질 수용체) 단백질이라 불린다. 상기 링커는 예를 들어, 5 nm, 8 nm, 10 nm, 12 nm, 14nm, 및 20 nm 이상을 포함하는, 임의의 적당한 길이의 제 1차 구조의 길이를 가질 수 있다.
특히 바람직한 구체예에서, 전체 컨스트럭트는 CFP-(SGLRSRA)-SNAP-25-(SNS)-YFP, 또는 CFP-(SGLRSRA)-시냅토브레빈-(SNS)-YFP를 포함한다.
한 구체예에서, 링커 펩티드는 약 14개 이상의 아미노산 잔기 및 SEQ ID NO: 1-6(본원에서 논의됨)으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 링커 펩티드는 약 15개 이상, 또는 약 16개 이상, 또는 약 17개 이상, 또는 약 18개 이상, 또는 약 19개 이상, 또는 약 20개 이상, 또는 약 21개 이상, 또는 약 22개 이상, 또는 약 23개 이상, 또는 약 24개 이상, 또는 약 25개 이상, 또는 약 26개 이상, 또는 약 27개 이상, 또는 약 28개 이상, 또는 약 29개 이상의 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 서열은 SEQ ID NO: 1-6(본원에서 논의됨)으로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직한 구체예에서, 상기 링커 펩티드는 약 30개 이상의 아미노산 잔기 및 SEQ ID NO: 1-6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 링커 펩티드는 약 35개 이상의 아미노산 잔기, 또는 약 40개 이상의 아미노산 잔기, 또는 약 45개 이상의 아미노산 잔기, 또는 약 50개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 본원 발명의 컨스트럭트는 약 55개 이상의 아미노산 잔기, 또는 약 65개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 링커 펩티드를 포함한다.
본원 발명의 절단 부위 서열은 (a) SNARE 단백질, 모티프, 뮤테인(mutein) 및 (b) 5개 이상의 아미노산을 가지는 스페이서를 유리하게 포함할 수 있고, 상기 스페이서는 (GGGGS)n 및 (EAAAK)n(여기서 n은 1-3)으로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함한다.
단백질의 "뮤테인"은 본래의 단백질과 일치하고, 상응하는 본래의 단백질과 30％ 이상의 동일성을 가지는 것으로 본원에서 해석되어야 하고, 예를 들어, 본래의 단백질과 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 98%의 동일성을 가지는 조성물을 포함한다. 동일성에서의 변화는 첨가, 삭제 및 치환 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 계획된 뮤테인은 단편, 절단 및 융합 단백질을 포함한다.
본원 발명의 스페이서는 적당한 수의 아미노산을 포함하지만, 바람직하게는 3, 5, 7, 10, 12, 또는 15개 이상의 아미노산이다. 상기 스페이서는 (GGGGS)n 및 (EAAAK)n(여기서 n은 1-3)으로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 스페이서는 SNARE 모티프를 포함할 수 있다. 유리하게도, 상기 스페이서의 구성은 스페이서 없는 상응하는 컨스트럭트에 비하여, 공여체 라벨 및 수용체 라벨 사이의 전자 커플링을 증가시킨다.
본원 발명은 상기 상술한 컨스트럭트를 엔코딩하는 분리된 폴리누클레오티드 분자를 추가적으로 제공한다. 이 컨스트럭트는 바람직하게는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리누클레오티드 분자를 포함하는 발현벡터이다. 본원 발명의 바람직한 프로모터는 유도성 프로모터이다.
본원 발명은 또한 상기 상술한 분리된 폴리누클레오티드 분자를 포함하는 세포를 제공한다. 한 구체예에서, 상기 세포는 제 1차 배양된 신경세포, PC 12 세포 또는 이의 유도체, 제 1차 배양된 크로마핀 세포(chromaffin cell), 신경모세포종 세포, 인간 아드레날린성 SK-N-SH 세포, 및 NS-26 세포주로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직하게는, 상기 세포는 대뇌 피질의 신경세포, 해마 신경세포, 척수 운동 신경세포, 또는 콜린성 뮤린 신경 2a 세포이다.
추가적인 구체예에서, 본원 발명은 본원 발명의 컨스트럭트를 포함하는 적당한 용기의 키트를 제공한다.
공여체 라벨 및 수용체 라벨 사이의 에너지 전달 민감도를 증가시키는 계획된 방법은 (a) 링커를 통해 물리적으로 연결된 공여체 라벨 및 수용체 라벨을 포함하는 컨스트럭트를 제공하는 단계, (b) 상기 링커 내에 절단 부위 서열을 포함시키는 단계; 및 (c) 상기 공여체와 상기 절단 부위 서열 사이 및 상기 수용체와 상기 절단부위 서열 사이 중 적어도 하나 사이의 스페이서를 링커 내에 포함시키는 단계로서, 그로 인해 상기 공여체 및 상기 수용체 사이의 전자커플링이 증가되는 단계를 포함한다. 상기 계획된 컨스트럭트는 전체 세포, 용해물, 또는 활성 펩티다아제를 포함하는 임의의 물질에 적용될 수 있다.
임의의 특정 이론 또는 작용 메카니즘에 국한되는 것은 원하지 않으면서, 공여체 및 수용체 사이의 전자 커플링을 증가시킴으로서 상기 스페이서가 민감도 및 특이성을 증가시키며, 차례로 이것은 (a) 공여체 및 수용체 사이의 3차 컨스트럭트 거리를 감소시키고, (b) 공여체 및 수용체 사이의 전자 홉(hop)을 제공함으로서 야기되는 것으로 생각된다.
바람직한 구체예에서, 상기 컨스트럭트는 단백질-기반 컨스트럭트이고, 상기 링커는 펩티드 서열이고, 상기 절단 부위 서열은 SNARE 단백질, 또는 단편 또는 이의 뮤테인을 포함하고, 상기 스페이서는 3, 5, 7, 10, 12, 및 15개 이상의 아미노산을 포함한다. 상기 스페이서는 (GGGGS)n 및 (EAAAK)n(여기서 n은 1-3)으로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함할 수 있다.
또한 보툴리눔 신경독소를 검출하는 방법이 본원에 개시되는데, 이 방법은, (a) 링커가 검출되는 보툴리눔 신경독소와 상응하는 기질 단백질 또는 이의 절단가능한 단편인, 상기 컨스트럭트를 제공하는 단계, (b) 보툴리눔 신경독소가 단백질 기질 또는 이의 단편을 절단하는 조건하에서, 상기 컨스트럭트를 보툴리눔 신경독소를 포함하는 것으로 의심되는 샘플에 노출시키는 단계, (c) 상기 컨스트럭트가 샘플에 노출되기 전과 후에 FRET 신호를 검출하고 비교하는 단계로서, FRET의 감소가 샘플 안의 보툴리눔 신경독소의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 추가적인 Zn.sup.2＋가 검출된 샘플에 첨가된다. 본원 발명의 방법은 BoNT/A, E, 및 C로 이루어진 군에서 선택된 보툴리눔 신경독소의 검출에 적합하고, 상기 상응하는 기질 단백질은 SNAP-25 또는 이의 절단가능한 단편이다. 본원 발명의 방법은 또한 시냅토브레빈(Syb) 또는 이의 절단가능 단편을 상응하는 기질 단백질로서 이용하여 BoNT/B, D, F 또는 G의 검출에 적합하다. 유사하게, 본원 발명의 방법은 상응하는 기질 단백질로서 SNAP-25 또는 이의 절단가능 단편을 이용하여, BoNT/C을 검출하는데 적합하다.
바람직한 구체예에서, 본원 발명의 방법에서, FRET은 1) 수용체(A) 방출 파장 및 공여체(D) 방출 파장에서 방출된 형광물질을 측정하고, 각각의 방출 크기 비율에 의해 에너지 전달을 결정하는 방법; 2) D의 형광 지속시간을 측정하는 방법; 3) D의 광표백 속도를 측정하는 단계; 4) D 또는 A의 이방성(anisotropy)을 측정하는 방법; 및 5) 스토크 이동 모노머/엑시머 형광(Stokes shift monomer/excimer fluorescence)을 측정하는 방법으로 이루어진 군에서 선택된 방법에 의해 검출된다.
본원 발명은 또한 상기 기술된 컨스트럭트를 발현시키도록 유전적으로 조작된 세포의 제공하는 단계로서, 상기 컨스트럭트의 링커는 보툴리눔 신경독소에 상응하는 기질 펩티드인 단계; 상기 세포를 후보 억제제 화합물이 존재하는 보툴리눔 신경독소에 노출시키는 단계; 보툴리눔 신경독소에 노출하기 전과 후에 세포의 FRET 신호를 검출하는 단계로서, 상기 후보 억제제의 부재하에 보툴리눔 신경독소에 노출된 세포와 비교하여, 실질적으로 FRET의 감소가 관찰되지 않은 것은, 후보 억제제가 보툴리눔 신경독소를 억제할 수 있음을 나타내는 것인 단계를 포함하는 보툴리눔 신경독소 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 후보 화합물은 화합물 라이브러리(library) 가운데의 화합물이고, 상기 방법은 고 처리량 방법이다.
추가적 구체예에서, 본원 발명은 보툴리눔 신경독소 검출에 대한 방법을 제공하고, 상기 방법은 BoNT 타겟 펩티드층을 금속 표면상에 침착(deposit)시키는 단계, BoNT가 상기 금속 표면에서 타겟 펩티드를 절단하는 조건 하에서, BoNT 타겟 펩티드를 표면에 지니는 상기 금속 표면을 상응하는 BoNT를 포함하고 있다고 의심되는 샘플에 노출시키는 단계, 표면 플라즈몬 공명 영상에 따른 BoNT 절단 결과로서 금속 표면에 결합한 타겟 펩티드의 분자량의 감소를 측정하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 보툴리눔 신경독소 검출를 위한 방법인데, 상기 방법은 a) 링커가 검출되는 보툴리눔 신경독소에 상응하는 기질 단백질 또는 이의 절단가능 단편이고, 상기 링커 단백질이 공여체 및 수용체 형광체 사이에 FRET를 발생하는 컨스트럭트를 택하도록, 상기 컨스트럭트가 세포의 원형질막에 고정되는 본원에 상술한 컨스트럭트를 제공하는 단계, b) 보툴리눔 신경독소가 단백질 기질 또는 이의 단편을 절단하는 조건 하에서, 보툴리눔 신경독소가 포함되어 있다고 의심되는 샘플에 상기 컨스트럭트를 노출시키는 단계, c) 상기 컨스트럭트가 샘플에 노출되기 전과 후에 FRET 신호를 검출하고 비교하는 단계로서, FRET의 감소가 샘플 안의 보툴리눔 신경독소의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함한다.
본원 발명은 링커 펩티드, 제 1 형광체 모이어티 및 제 2 형광체 모이어티를 포함하는 분자 컨스트럭트를 추가적으로 제공하고, 상기 링커펩티드는 보툴리눔 신경독소에 의해 절단될 수 있는 시냅토브레빈, 신택신 및 SNAP-25 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 보툴리눔 신경독소의 기질이고, 상기 제 1 형광체 모이어티의 방출 스펙트럼은 제 2 형광체 모이어티의 여기 스펙트럼과 검출가능하게 서로 다르다. 바람직하게는, 상기 링커는 기질 시냅토브레빈의 전장 단백질, 신택신 또는 SNAP-25이다. 바람직하게는, 상기 컨스트럭트는 소포에 고정되어 있고, 세포 속에 존재하거나 존재하지 않는다. 본원 발명은 상기 폴리펩티드 컨스트럭트를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 컨스트럭트를 추가적으로 제공한다.
본원 발명은 보툴리눔 신경독소를 검출하는 방법을 추가적으로 제공하고, 이 방법은 a) 상기 펩티드 컨스트럭트를 제공하는 단계, b) 보툴리눔 신경독소가 단백질 기질 또는 이의 단편을 절단하는 조건 하에서 보툴리눔 신경독소가 포함되어 있다고 의심되는 샘플에 상기 컨스트럭트를 노출시키는 단계, 및 c) 제 1 및 제 2 형광체의 형광 신호의 공간적 분리를 검출하는 단계로서, 상기 공간적 분리의 발생은 샘플 속에 보툴리눔 신경독소의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 소포는 살아있는 세포 안에 존재하고, 상기 링커 펩티드는 SNAP-25(198-206)-YFP에 연결된 CFP-SNAP-25(1-197)이고, YFP 형광성이 아닌 CFP 형광성의 검출은 샘플 안에 보툴리눔 신경독소의 존재를 나타낸다.
독창적 발명 주제의 다양한 목적, 기능, 측면 및 이점은 유사 수치가 유사 구성요소를 나타내는 첨부된 도면과 더불어, 하기 바람직한 구체예의 상세한 설명으로부터 더욱 명확해 질 것이다.
도 1은 보툴리눔 신경독소 프로테아제 활성을 모니터링하기 위한 CFP-YFP 기반 바이오-센서의 개략도이다. 도 1A는 바이오 센서 컨스트럭트의 디자인이다. CFP 및 YFP는 시냅토브레빈의 단편(아미노산 33-94, 상단 패널), 또는 SNAP-25(아미노산 141-206, 하단 패널) 각각을 통해 연결된다. 이 단편에 있는 각 보툴리눔 신경독소의 절단 부위는 라벨링되어 있다. 도 1B는 CFP의 여기가 YFP 형광 방출을 야기하는(상단 패널), FRET의 공여체-수용체 쌍으로서의 CFP 및 YFP의 기능을 나타낸다. 연결된 CFP 및 YFP 사이의 에너지 전달은 보툴리눔 신경독소에 의한 시냅토브레빈 또는 SNAP-25 단편의 절단 후 파괴된다(하단 패널). CFP의 최적 여기 파장은 434nM이고, 방출 피크는 CFP는 470nM, YFP는 527nM이다.
도 2는 재조합 바이오 센서 단백질의 형광 방출 스펙트럼을 도시한다. 도 2A는 단독의 재조합 his.sub.6-태깅된 CFP 및 YFP(300nM)를 비롯한 이 두 가지 단백질의 혼합물(1:1)의 방출 스펙트럼을 도시한다. 상기 형광 신호를 Hepes 완충용액(50mM Hepes, 2mM DTT, 및 10.mu.M ZnCl.sub.2, pH 7.1) 중에서 PTIQM-1 형광계를 이용하여 450에서 550nM까지 수집하였다. CFP의 경우 최적의 여기 파장은 434nM이다. 상기 YFP 단백질은 434nM에서 직접 여기(direct excitation)에 의해 단지 적은 형광 신호를 유도한다. 도 2B는 도 2A 패널에서 상술한 바와 같이 수집된, 재조합 his.sub.6-태깅된 CFP-SybⅡ-YFP의 방출 스펙트럼을 도시한다. 화살표는 FRET에 의해 측정된 YFP 방출 피크를 나타낸다. 도 2C는 도 2A 패널에서 상술한 바와 같이 수집된, 재조합 his.sub.6-태깅된 CFP-SNAP-25-YFP의 방출 스펙트럼을 도시한다.
도 3은 보툴리눔 신경독소에 의한 바이오 센서 단백질의 절단이 방출 스펙트럼 스캔에 의해 시험관에서 실시간으로 모니터링될 수 있음을 도시한다. A): BoNT/B를 30분 동안 37℃에서, 372mM DTT, 10.mu.M ZnCl.sub.2에 의해 미리 절단(pre-reduced)시켰다. 50nM 독소를 Hepes 완충용액(50 mM Hepes, 2mM DTT, 10.mu.M ZnCl.sub.2) 중에 300nM CFP-SybⅡ-YFP을 함유한 큐벳 안으로 첨가하였다. 도. 2A에서 상술한 바와 같이 독소를 첨가하기 전 및 후의 지시된 시간에 방출 스펙트럼을 기록하였다(하단 패널). 30.mu.l 샘플을 각 방출 스캔 후 큐벳으로부터 꺼내고, SDS-로딩 완충용액과 혼합하였다. 상기 샘플에 SDS-페이지 및 강화된 화학발광(ECL)을 수행하였다. CFP-SybⅡ-YFP 융합 단백질의 절단은 융합 단백질 N-말단에서 his.sub.6 태그를 인지하는 항-his.sub.6 항체를 이용해 검출되었다(하단 패널). CFP-SybⅡ-YFP 융합 단백질의 절단은 YFP 형광의 감소 및 CFP 형광의 증가를 야기시켰다. 변화를 실시간으로 방출 스펙트럼 스캔으로 기록하였다. B): CFP-SybⅡ-YFP은 패널 A에서 상술한 바와 같이, BoNT/F 활성을 테스트하는데 사용된다. C): CFP-SNAP-25-YFP를 패널 A에서 상술한 바와 같이, BoNT/A 활성(10nM 독소가 사용됨)을 테스트하는데 사용하였다. D): CFP-SNAP-25-YFP를 패널 A에서 상술한 바와 같이, BoNT/E 활성(10nM 독소가 사용됨)을 테스트하는데 사용하였다.
도 4는 마이크로플레이트 형광분광광도계에서 바이오센서 단백질을 이용한 보툴리눔 신경독소 프로테아제 동역학의 모니터링을 도시한다. A): 보툴리눔 신경독소에 의한 바이오 센서 단백질의 절단 중의 형광 변화는 플레이트 리더를 사용하여 실시간으로 기록될 수 있다. 10nM BoNT/A를 300nM의 CFP-SNAP-25-YFP과 혼합하고, 웰 샘플 당 100.mu.l를 플레이트 리더를 이용하여 스캔하였다. 여기는 434nm이고, 각 데이타 포인트의 경우, 470nm(CFP 채널), 및 527nm(YFP 또는 FRET 채널)에서 두 가지의 방출 값을 수집하였다. 데이타 포인트당 30초 간격으로 한 시간 반 동안 상기 반응을 추적하였다. YFP 형광의 감소 및 CFP 형광의 증가를 실시간으로 모니터링 하였다. B): 절단의 속도는 신경독소의 농도에 의존한다. 다양한 농도의 보툴리눔 독소 A 및 E를 바이오 센서 단백질의 동일한 양을 절단하는 능력에 대해 테스트하였다. FRET 신호 변화(FRET 비율)를 동일한 데이타 포인트에서 YFP 방출 신호 및 CFP 방출 신호 사이의 비율에 의해 측정하였다. C): 단독의 CFP-SNAP-25-YFP 단백질, 및 CFP/YFP 단백질 혼합물(1:1)을 내부 대조군과 같이, 동일한 시간에 스캔하였다.
도 5는 플레이트 리더를 이용한 바이오 센서 분석 민감도를 도시한다. A): 300nM의 CFP-SNAP-25-YFP를 96-웰 플레이트에서 다양한 농도의 BoNT/A 또는 E와 혼합하였고, 전체 부피는 웰당 100.mu.l이다. 상기 플레이트를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였고 그 후 플레이트 리더에 의해 스캔하였다(상단 패널). FRET 비율을 독소 농도의 로그 값에 대하여 작도하였다. 각 곡선에 대한 EC.sub.50값을 하단 패널의 표 안에 나열하였다. 각 데이타 포인트는 세 가지 독립된 실험의 평균을 나타낸다. B): 300nM의 CFP-SybⅡ-YFP를 다양한 농도의 BoNT/B 또는 F와 혼합하였다. 데이타를 패널 A에서 상술한 바와 같이 수집하고 작도하였다.
도 6은 살아있는 세포에서 보툴리눔 신경독소 활성의 모니터링을 도시한 것이다. A): CFP-SNAP-25-YFP을 야생형 PC 12 세포에서 발현시켰다. BoNT/A(50nM)의 삽입(entry) 및 효소활성을 세포 안에서 CFP-SNAP-25-YFP 절단에 의해 야기된 FRET 비율 변화를 기록함으로서 모니터링하였다. FRET 비율은 전체 53개의 독소 처리된 세포 및 53개의 대조군 세포로부터 평균화시켰다. 72시간 동안 BoNT/A의 처리는 전체 세포 집단의 FRET 비율을 상당한 정도로 감소시켰다(P<1.47E-5). B) sytⅡ를 발현하는 PC 12 세포를 CFP-SybⅡ-YFP으로 형질감염시키고, BoNT/B(30nM)로 처리하였다. BoNT/B의 삽입 및 효소 활성을 패널(A)와 같이 FRET 비율 변화를 기록함으로서 모니터링하였다; 73개의 독소 처리된 세포 및 73개의 대조군 세포를 분석하였다. 72시간 동안 BoNT/B의 처리는 전체 세포 집단의 FRET 비율을 상당한 정도로 감소시켰다(P<2E-10).
도 7은 본원 발명에 따라 이용한 살아있는 세포에서의 BoNT/A 활성 모니터링을 도시한다. (a) 살아있는 세포에서 독소 센서의 FRET 신호 측정. CFP-SNAP-25(141-206)-YFP를 사용하여 PC 12 세포를 형질감염시켰다. 이 센서는 세포 속에서 용해가능한 것으로 드러났다. 서로 다른 필터 세트(CFP, FRET 및 YFP)를 이용한 세 가지 이미지를 각 세포에 대해 순차적으로 촬영하였는데, 정확하게 동일한 세팅을 이용하였다. 이미지는 왼쪽의 룩-업 테이블(look-up table)에 나타난 바와 같이, 형광 강도를 반영하기 위해 임의의 단위로 칼라 코드화되었다. 보정된 FRET 값은, 상기 방법들에서 상술한 바와 같이, FRET 필터 세트를 사용하여 수집된 신호에서 두 가지 CFP 및 YFP로부터의 누화(cross-talk)를 제외함으로서 계산되었다. (b) CFP-SNAP-25(141-206)-YFP으로 형질감염된 PC 12 세포를 사용하여 BoNT/A 활성을 검출하였다. 50nM의 BoNT/A 홀로독소(holotoxin)를 배양 배지에 첨가하고 80개의 세포를 96시간 후 분석하였다. 보정된 FRET 신호를 CFP 형광 신호로 표준화시키고 표시된 빈(bins)과 함께 막대그래프로 작도하였다. 대조군 세포는 동일한 센서로 형질감염되었으나 독소 처리가 되지 않았고, 이것을 병렬 분석하였다. BoNT/A와의 인큐베이션은 세포 집단 사이의 FRET 비율(보정된 FRET/CFP)을 이동(shift)시켰고, 이는 센서 단백질이 세포 안에서 BoNT/A에 의해 절단되었음을 나타낸다. 그러나, 상기 이동은 작았고, 이는 절단의 표시가 세포 속에서 충분하지 않았다는 것을 나타낸다. (c) 왼쪽 패널: 전장 SNAP-25(아미노산 1-206)을 통해 CFP 및 YFP를 연결함으로서 효율적인 독소 센서를 제작하고, 세포 속에서 BoNT/A 활성 검출를 위해 테스트하였다. 이 CFP-SNAP-25(FL)-YFP 융합 단백질은 4개의 시스테인에서 팔미토일화(palmitoylation)를 통해 세포 안의 원형질막에 주로 편재화되었다(왼쪽 패널, 중간 패널의 상단 프레임). 중간 패널: PC 12세포를 CFP-SNAP-25(FL)-YFP 센서로 형질감염시키고 BoNT/A 활성을 검출하기 위해 사용하였다. 50nM의 BoNT/A 홀로독소를 배양 배지에 첨가하고, 패널 (a)에 상술한 바와 같이 48 및 96시간 후 200개 세포의 FRET 신호를 분석하였다. 대조군 세포는 독소 센서에 의해 형질감염되었으나 독소 처리는 되지 않았고, 이것을 병렬 분석하였다. 대표적 세포의 이미지는 중간 패널에 도시되어 있다. 이 센서는 상당한 FRET를 산출하였다(중간 패널의 상단 "보정된 FRET" 프레임). 이 FRET 신호는 세포가 BoNT/A로 처리된 후 파괴되었다(96h, 중간 패널의 하단 "보정된 FRET" 프레임). 주의: 절단된 생산물 중 하나인, YFP으로 태깅된 SNAP-25의 C-말단은 독소 절단 후 분해(degradation)되었다. 따라서, YFP의 형광 신호는 독소-처리된 세포 안에서 상당히 감소 되었다(하단 "YFP" 프레임). 오른쪽 패널: FRET 비율을 패널(b)에서 상술한 바와 같이 표시된 빈과 함께 막대그래프로 작도하였다. (d) PC 12 세포를 CFP-SNAP-25(Cys-Ala)-YFP(Cys 85,88,90,92 Ala 돌연변이를 동반한 전장 SNAP-25, 왼쪽 패널)로 형질감염시켰다. 이 단백질은 시토졸 도처에 널리 분산되었고, CFP-SNAP-25(FL)-YFP에서 관찰된 강한 FRET 신호가 결여되었다(오른쪽 패널, "보정된 FRET" 프레임). (e) PC 12 세포를 CFP-SNAP-25(FL)-YFP 및 CFP-SNAP-25(Cys-Ala)-YFP로 형질감염시켰다. 세포를 그 후 BoNT/A(50nM, 72h)로 처리하거나(＋, 온전한 세포) 또는 처리하지 않고(－, 온전한 세포), 수확하였다. BoNT/A에 노출되지 않은 샘플로부터 추출한 상기 세포의 절반을 시험관 안에서 절단된(reduced) BoNT/A와 함께(＋, 시험관에서) 또는 없이(－, 시험관에서) 인큐베이션하였고(200nM, 30분, 37℃), 이것은 절단된 생산물(두 가지 절단 생산물이 화살표로 표시되었다)을 도시하기 위한 대조군 역할을 하였다. 각 샘플의 동일한 양(30.mu.g 세포 용해액)을 SDS-페이지 겔로 로딩하고 항-GFP 항체를 이용하여 면역블롯 검사(immunoblot analysis)를 수행하였다. CFP-SNAP-25(FL)-YFP는 온전한 세포에서 상당한 절단을 겪는 반면, 세포 안에서 CFP-SNAP-25(Cys-Ala)-YFP의 검출가능한 절단은 없었고, 이는 세포막 고정이 살아있는 세포에서 BoNT/A에 의한 효율적 절단에 매우 중요하다는 것을 나타낸다. 주의: 오직 하나의 절단 생성물(CFP-SNAP-25(1-197))이 독소를 처리한 세포에서 검출되었고, 이는 기타 절단 생성물(SNAP-25(198-206)-YFP)은 세포 안에서 대개 분해되었음을 제시한다.
도 8은 CFP-SNAP-25(141-206)-YFP 센서의 원형질막 고정이 세포 안에서 BoNT/A에 의해 효과적으로 절단되는 센서를 생성시킴을 보여준다. (a) 원형질막에 CFP-SNAP-25(141-206)-YFP를 타겟팅하도록 만들어진 컨스트럭트의 개략도이다. 팔미토일화 부위(잔기 83-120)을 포함하는 SNAP-25 단편을 CFP-SNAP-25(141-206)-YFP 센서의 N-말단과 융합시켰고, 이 단편은 상기 융합된 단백질을 원형질막에 타겟팅하였다. (b) PC 12 세포를 SNAP-25(83-120)-CFP-SNAP-25(141-206)-YFP으로 형질감염시켰다. 50nM의 BoNT/A 홀로독소를 배양 배지에 첨가하고, 도 7a에 상술된 바와 같이 96시간 후 80개 세포의 FRET신호를 분석하였다. 독소 센서로 형질감염되었으나 독소로 처리되지 않은, 대조군 세포를 병렬 분석하였다. 대표적인 세포의 이미지는 왼쪽 패널에 도시되어 있다. 이 센서는 상당한 FRET를 산출하였다(왼쪽 패널의 상단 "보정된 FRET" 프레임). 이 FRET 신호는 세포를 BoNT/A로 처리한 후 감소하였다(96h, 왼쪽 패널의 하단 "보정된 FRET" 프레임). 오른쪽 패널: 세포의 FRET 비율을 도 7b에서 상술한 바와 같이 표시된 빈과 함께 막대그래프로 작도하였다. (c) PC 12 세포를 다양한 CFP/YFP 컨스트럭트로 형질감염시키고 상응하는 FRET 비율을 도 7a에 상술한 바와 같이 결정하였다. 세포 안에서 CFP 및 YFP의 공동-발현은 본 발명자들의 분석 조건하에서 상당한 FRET를 야기하지 않았다. CFP-SNAP-25(FL)-YFP은 상당한 수준의 FRET를 나타내는 반면, 가용성 CFP-SNAP-25(Cys-Ala)-YFP은 그렇지 않았다.
도 9는 BoNT/B에 의한 Syb의 효율적인 절단은 소포에 Syb의 편재화가 필요함을 보여준다. (a) CFP-Syb(33-94)-YFP를 사용하여 안정하게 시냅토타그민 Ⅱ(synaptotagmin Ⅱ)를 발현하는 PC 12 세포주를 형질시켰다(Dong 등. synaptotagminⅠ and Ⅱ mediate entry of botulinum neurotoxin B into cells.J. Cell Biol. 162, 1293-1303 (2003)). 이 센서는 세포 안에서 용해 가능하며 강한 FRET 신호를 발생시킨다(상단 패널). CFP-Syb(33-94)-YFP로 형질감염된 PC 12 세포는 BoNT/B 활성을 검출하는데 사용되었다. 50nM의 BoNT/B 홀로독소를 배양 배지에 첨가하고 도 7b에서 상술한 바와 같이 96시간 후 80개의 세포를 분석하였다. 대조군 세포는 동일한 센서로 형질감염되었으나 독소가 처리되지 않았고, 그들을 병렬 분석하였다. BoNT/B와의 인큐베이션은 세포 집단 사이의 FRET 비율을 이동시켰고, 이는 센서 단백질이 세포 안에서 BoNT/B에 의해 절단되었음을 나타낸다. 그러나, 상기 이동은 작았고, 이는 이 절단이 세포 안에서 충분하지 않았음을 나타낸다. (b) YFP-Syb(FL)-CFP 센서의 개략도. 전장 Syb는 116개의 아미노산을 포함하고, 단일 트랜스멤브레인 도메인을 통해 소포에 편재화되었다. BoNT/B에 의한 Syb 절단은 YFP로 태깅된 Syb의 세포질 도메인을 소포로부터 방출시켰다. (c) 안정하게 시냅토타그민 Ⅱ를 발현하는 PC 12 세포를 YFP-Syb(FL)-CFP로 형질감염시키고, BoNT/B(50nM, 48h, 하단 프레임)로, 또는 독소 없이(대조군, 상단 프레임) 처리하였다. CFP 및 YFP 형광 이미지를 각 세포에 대해 수집하였고, 대표적 세포가 도시되어있다. 상기 두 CFP 및 YFP 형광 신호에 의해 입증되듯이(상단 프레임), 이 센서는 소포에 편재화되고, 살아있는 세포에서 핵으로부터 제거되었다. BoNT/B의 처리는 시토졸 안에서 용해가능하고 핵 안으로 들어간, YFP 신호의 재분배를 야기하였다. (d) Syb의 절단된 버전인, 잔기 33-116을 CFP 및 YFP을 연결하는데 사용하였다. 이 컨스트럭트는 동일한 세포질 영역(잔기 33-94, 패널(b))을 Syb 단편으로서 가용성 센서 CFP-Syb(33-96)-YFP 안에 포함하고, Syb의 트랜스멤브레인 도메인을 또한 포함한다. 시냅토타그민 Ⅱ를 발현하는 PC 12 세포를 CFP-Syb(33-116)-YFP 및 CFP-Syb(33-94)-YFP으로 형질감염시켰다. 세포를 그 후 BoNT/B(50nM, 48h)로 처리하거나(＋, 온전한 세포) 처리하지 않았고(－, 온전한 세포), 수확하였다. BoNT/B에 노출되지 않은 샘플로부터 추출한 상기 세포의 절반을 시험관 안에서 절단된 BoNT/B와 함께(＋, 시험관에서) 또는 없이(－, 시험관에서) 인큐베이션하였다(200nM, 30분, 37℃). 두 개의 절단 생산물은 별표로 표시되었다. 각 샘플의 동일한 양(30.mu.g 세포 용해액)을 SDS-페이지 겔로 로딩하고 항-GFP 항체를 이용한 면역블롯 분석을 수행하였다. CFP-Syb(33-116)-YFP는 온전한 세포에서 상당한 절단을 겪는 반면, CFP-Syb(33-94)-YFP의 검출가능한 절단은 없었고, 이는 소포에 편재화는 살아있는 세포에서 BoNT/B에 의한 효과적인 절단에 매우 중요하다는 것을 나타낸다.
도 10은 공여체 라벨 및 수용체 라벨 사이에 배치된 절단 부위 서열을 포함한 링커를 가진, 선행 기술 컨스트럭트의 개략도이다.
도 11a는 본원 발명 컨스트럭트의 한 구체예의 개략도로서, 절단 부위 서열 및 스페이서를 포함하는 링커를 가지고, 상기 스페이서는 절단 부위 서열과 수용체 라벨 사이에 배치되어 있다.
도 11b는 본원 발명 컨스트럭트의 대안적인 구체예의 개략도로서, 절단 부위 서열 및 스페이서를 포함하는 링커를 가지고, 상기 스페이서는 공여체 라벨 및 절단 부위 서열 사이에 배치되어 있다.
도 11c는 본원 발명 컨스트럭트의 또 다른 대체적 구체예의 개략도로서, 절단 부위 서열 및 스페이서를 포함하는 링커를 가지고, 상기 스페이서는 공여체와 절단 부위 서열 및 절단 부위 서열과 수용체 라벨 사이에 배치되어 있다.
도 12는 본원 발명의 컨스트럭트를 이용하여 공여체 라벨 및 수용체 라벨 사이의 에너지 전달 민감도를 향상시키는 방법의 단계를 설명한 블록 다이어그램이다.
도 13은 본원 발명의 컨스트럭트를 이용하여 보툴리눔 신경독소를 검출하기 위한 방법의 단계를 설명한 블록 다이어그램이다.
도 2는 재조합 바이오 센서 단백질의 형광 방출 스펙트럼을 도시한다. 도 2A는 단독의 재조합 his.sub.6-태깅된 CFP 및 YFP(300nM)를 비롯한 이 두 가지 단백질의 혼합물(1:1)의 방출 스펙트럼을 도시한다. 상기 형광 신호를 Hepes 완충용액(50mM Hepes, 2mM DTT, 및 10.mu.M ZnCl.sub.2, pH 7.1) 중에서 PTIQM-1 형광계를 이용하여 450에서 550nM까지 수집하였다. CFP의 경우 최적의 여기 파장은 434nM이다. 상기 YFP 단백질은 434nM에서 직접 여기(direct excitation)에 의해 단지 적은 형광 신호를 유도한다. 도 2B는 도 2A 패널에서 상술한 바와 같이 수집된, 재조합 his.sub.6-태깅된 CFP-SybⅡ-YFP의 방출 스펙트럼을 도시한다. 화살표는 FRET에 의해 측정된 YFP 방출 피크를 나타낸다. 도 2C는 도 2A 패널에서 상술한 바와 같이 수집된, 재조합 his.sub.6-태깅된 CFP-SNAP-25-YFP의 방출 스펙트럼을 도시한다.
도 3은 보툴리눔 신경독소에 의한 바이오 센서 단백질의 절단이 방출 스펙트럼 스캔에 의해 시험관에서 실시간으로 모니터링될 수 있음을 도시한다. A): BoNT/B를 30분 동안 37℃에서, 372mM DTT, 10.mu.M ZnCl.sub.2에 의해 미리 절단(pre-reduced)시켰다. 50nM 독소를 Hepes 완충용액(50 mM Hepes, 2mM DTT, 10.mu.M ZnCl.sub.2) 중에 300nM CFP-SybⅡ-YFP을 함유한 큐벳 안으로 첨가하였다. 도. 2A에서 상술한 바와 같이 독소를 첨가하기 전 및 후의 지시된 시간에 방출 스펙트럼을 기록하였다(하단 패널). 30.mu.l 샘플을 각 방출 스캔 후 큐벳으로부터 꺼내고, SDS-로딩 완충용액과 혼합하였다. 상기 샘플에 SDS-페이지 및 강화된 화학발광(ECL)을 수행하였다. CFP-SybⅡ-YFP 융합 단백질의 절단은 융합 단백질 N-말단에서 his.sub.6 태그를 인지하는 항-his.sub.6 항체를 이용해 검출되었다(하단 패널). CFP-SybⅡ-YFP 융합 단백질의 절단은 YFP 형광의 감소 및 CFP 형광의 증가를 야기시켰다. 변화를 실시간으로 방출 스펙트럼 스캔으로 기록하였다. B): CFP-SybⅡ-YFP은 패널 A에서 상술한 바와 같이, BoNT/F 활성을 테스트하는데 사용된다. C): CFP-SNAP-25-YFP를 패널 A에서 상술한 바와 같이, BoNT/A 활성(10nM 독소가 사용됨)을 테스트하는데 사용하였다. D): CFP-SNAP-25-YFP를 패널 A에서 상술한 바와 같이, BoNT/E 활성(10nM 독소가 사용됨)을 테스트하는데 사용하였다.
도 4는 마이크로플레이트 형광분광광도계에서 바이오센서 단백질을 이용한 보툴리눔 신경독소 프로테아제 동역학의 모니터링을 도시한다. A): 보툴리눔 신경독소에 의한 바이오 센서 단백질의 절단 중의 형광 변화는 플레이트 리더를 사용하여 실시간으로 기록될 수 있다. 10nM BoNT/A를 300nM의 CFP-SNAP-25-YFP과 혼합하고, 웰 샘플 당 100.mu.l를 플레이트 리더를 이용하여 스캔하였다. 여기는 434nm이고, 각 데이타 포인트의 경우, 470nm(CFP 채널), 및 527nm(YFP 또는 FRET 채널)에서 두 가지의 방출 값을 수집하였다. 데이타 포인트당 30초 간격으로 한 시간 반 동안 상기 반응을 추적하였다. YFP 형광의 감소 및 CFP 형광의 증가를 실시간으로 모니터링 하였다. B): 절단의 속도는 신경독소의 농도에 의존한다. 다양한 농도의 보툴리눔 독소 A 및 E를 바이오 센서 단백질의 동일한 양을 절단하는 능력에 대해 테스트하였다. FRET 신호 변화(FRET 비율)를 동일한 데이타 포인트에서 YFP 방출 신호 및 CFP 방출 신호 사이의 비율에 의해 측정하였다. C): 단독의 CFP-SNAP-25-YFP 단백질, 및 CFP/YFP 단백질 혼합물(1:1)을 내부 대조군과 같이, 동일한 시간에 스캔하였다.
도 5는 플레이트 리더를 이용한 바이오 센서 분석 민감도를 도시한다. A): 300nM의 CFP-SNAP-25-YFP를 96-웰 플레이트에서 다양한 농도의 BoNT/A 또는 E와 혼합하였고, 전체 부피는 웰당 100.mu.l이다. 상기 플레이트를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였고 그 후 플레이트 리더에 의해 스캔하였다(상단 패널). FRET 비율을 독소 농도의 로그 값에 대하여 작도하였다. 각 곡선에 대한 EC.sub.50값을 하단 패널의 표 안에 나열하였다. 각 데이타 포인트는 세 가지 독립된 실험의 평균을 나타낸다. B): 300nM의 CFP-SybⅡ-YFP를 다양한 농도의 BoNT/B 또는 F와 혼합하였다. 데이타를 패널 A에서 상술한 바와 같이 수집하고 작도하였다.
도 6은 살아있는 세포에서 보툴리눔 신경독소 활성의 모니터링을 도시한 것이다. A): CFP-SNAP-25-YFP을 야생형 PC 12 세포에서 발현시켰다. BoNT/A(50nM)의 삽입(entry) 및 효소활성을 세포 안에서 CFP-SNAP-25-YFP 절단에 의해 야기된 FRET 비율 변화를 기록함으로서 모니터링하였다. FRET 비율은 전체 53개의 독소 처리된 세포 및 53개의 대조군 세포로부터 평균화시켰다. 72시간 동안 BoNT/A의 처리는 전체 세포 집단의 FRET 비율을 상당한 정도로 감소시켰다(P<1.47E-5). B) sytⅡ를 발현하는 PC 12 세포를 CFP-SybⅡ-YFP으로 형질감염시키고, BoNT/B(30nM)로 처리하였다. BoNT/B의 삽입 및 효소 활성을 패널(A)와 같이 FRET 비율 변화를 기록함으로서 모니터링하였다; 73개의 독소 처리된 세포 및 73개의 대조군 세포를 분석하였다. 72시간 동안 BoNT/B의 처리는 전체 세포 집단의 FRET 비율을 상당한 정도로 감소시켰다(P<2E-10).
도 7은 본원 발명에 따라 이용한 살아있는 세포에서의 BoNT/A 활성 모니터링을 도시한다. (a) 살아있는 세포에서 독소 센서의 FRET 신호 측정. CFP-SNAP-25(141-206)-YFP를 사용하여 PC 12 세포를 형질감염시켰다. 이 센서는 세포 속에서 용해가능한 것으로 드러났다. 서로 다른 필터 세트(CFP, FRET 및 YFP)를 이용한 세 가지 이미지를 각 세포에 대해 순차적으로 촬영하였는데, 정확하게 동일한 세팅을 이용하였다. 이미지는 왼쪽의 룩-업 테이블(look-up table)에 나타난 바와 같이, 형광 강도를 반영하기 위해 임의의 단위로 칼라 코드화되었다. 보정된 FRET 값은, 상기 방법들에서 상술한 바와 같이, FRET 필터 세트를 사용하여 수집된 신호에서 두 가지 CFP 및 YFP로부터의 누화(cross-talk)를 제외함으로서 계산되었다. (b) CFP-SNAP-25(141-206)-YFP으로 형질감염된 PC 12 세포를 사용하여 BoNT/A 활성을 검출하였다. 50nM의 BoNT/A 홀로독소(holotoxin)를 배양 배지에 첨가하고 80개의 세포를 96시간 후 분석하였다. 보정된 FRET 신호를 CFP 형광 신호로 표준화시키고 표시된 빈(bins)과 함께 막대그래프로 작도하였다. 대조군 세포는 동일한 센서로 형질감염되었으나 독소 처리가 되지 않았고, 이것을 병렬 분석하였다. BoNT/A와의 인큐베이션은 세포 집단 사이의 FRET 비율(보정된 FRET/CFP)을 이동(shift)시켰고, 이는 센서 단백질이 세포 안에서 BoNT/A에 의해 절단되었음을 나타낸다. 그러나, 상기 이동은 작았고, 이는 절단의 표시가 세포 속에서 충분하지 않았다는 것을 나타낸다. (c) 왼쪽 패널: 전장 SNAP-25(아미노산 1-206)을 통해 CFP 및 YFP를 연결함으로서 효율적인 독소 센서를 제작하고, 세포 속에서 BoNT/A 활성 검출를 위해 테스트하였다. 이 CFP-SNAP-25(FL)-YFP 융합 단백질은 4개의 시스테인에서 팔미토일화(palmitoylation)를 통해 세포 안의 원형질막에 주로 편재화되었다(왼쪽 패널, 중간 패널의 상단 프레임). 중간 패널: PC 12세포를 CFP-SNAP-25(FL)-YFP 센서로 형질감염시키고 BoNT/A 활성을 검출하기 위해 사용하였다. 50nM의 BoNT/A 홀로독소를 배양 배지에 첨가하고, 패널 (a)에 상술한 바와 같이 48 및 96시간 후 200개 세포의 FRET 신호를 분석하였다. 대조군 세포는 독소 센서에 의해 형질감염되었으나 독소 처리는 되지 않았고, 이것을 병렬 분석하였다. 대표적 세포의 이미지는 중간 패널에 도시되어 있다. 이 센서는 상당한 FRET를 산출하였다(중간 패널의 상단 "보정된 FRET" 프레임). 이 FRET 신호는 세포가 BoNT/A로 처리된 후 파괴되었다(96h, 중간 패널의 하단 "보정된 FRET" 프레임). 주의: 절단된 생산물 중 하나인, YFP으로 태깅된 SNAP-25의 C-말단은 독소 절단 후 분해(degradation)되었다. 따라서, YFP의 형광 신호는 독소-처리된 세포 안에서 상당히 감소 되었다(하단 "YFP" 프레임). 오른쪽 패널: FRET 비율을 패널(b)에서 상술한 바와 같이 표시된 빈과 함께 막대그래프로 작도하였다. (d) PC 12 세포를 CFP-SNAP-25(Cys-Ala)-YFP(Cys 85,88,90,92 Ala 돌연변이를 동반한 전장 SNAP-25, 왼쪽 패널)로 형질감염시켰다. 이 단백질은 시토졸 도처에 널리 분산되었고, CFP-SNAP-25(FL)-YFP에서 관찰된 강한 FRET 신호가 결여되었다(오른쪽 패널, "보정된 FRET" 프레임). (e) PC 12 세포를 CFP-SNAP-25(FL)-YFP 및 CFP-SNAP-25(Cys-Ala)-YFP로 형질감염시켰다. 세포를 그 후 BoNT/A(50nM, 72h)로 처리하거나(＋, 온전한 세포) 또는 처리하지 않고(－, 온전한 세포), 수확하였다. BoNT/A에 노출되지 않은 샘플로부터 추출한 상기 세포의 절반을 시험관 안에서 절단된(reduced) BoNT/A와 함께(＋, 시험관에서) 또는 없이(－, 시험관에서) 인큐베이션하였고(200nM, 30분, 37℃), 이것은 절단된 생산물(두 가지 절단 생산물이 화살표로 표시되었다)을 도시하기 위한 대조군 역할을 하였다. 각 샘플의 동일한 양(30.mu.g 세포 용해액)을 SDS-페이지 겔로 로딩하고 항-GFP 항체를 이용하여 면역블롯 검사(immunoblot analysis)를 수행하였다. CFP-SNAP-25(FL)-YFP는 온전한 세포에서 상당한 절단을 겪는 반면, 세포 안에서 CFP-SNAP-25(Cys-Ala)-YFP의 검출가능한 절단은 없었고, 이는 세포막 고정이 살아있는 세포에서 BoNT/A에 의한 효율적 절단에 매우 중요하다는 것을 나타낸다. 주의: 오직 하나의 절단 생성물(CFP-SNAP-25(1-197))이 독소를 처리한 세포에서 검출되었고, 이는 기타 절단 생성물(SNAP-25(198-206)-YFP)은 세포 안에서 대개 분해되었음을 제시한다.
도 8은 CFP-SNAP-25(141-206)-YFP 센서의 원형질막 고정이 세포 안에서 BoNT/A에 의해 효과적으로 절단되는 센서를 생성시킴을 보여준다. (a) 원형질막에 CFP-SNAP-25(141-206)-YFP를 타겟팅하도록 만들어진 컨스트럭트의 개략도이다. 팔미토일화 부위(잔기 83-120)을 포함하는 SNAP-25 단편을 CFP-SNAP-25(141-206)-YFP 센서의 N-말단과 융합시켰고, 이 단편은 상기 융합된 단백질을 원형질막에 타겟팅하였다. (b) PC 12 세포를 SNAP-25(83-120)-CFP-SNAP-25(141-206)-YFP으로 형질감염시켰다. 50nM의 BoNT/A 홀로독소를 배양 배지에 첨가하고, 도 7a에 상술된 바와 같이 96시간 후 80개 세포의 FRET신호를 분석하였다. 독소 센서로 형질감염되었으나 독소로 처리되지 않은, 대조군 세포를 병렬 분석하였다. 대표적인 세포의 이미지는 왼쪽 패널에 도시되어 있다. 이 센서는 상당한 FRET를 산출하였다(왼쪽 패널의 상단 "보정된 FRET" 프레임). 이 FRET 신호는 세포를 BoNT/A로 처리한 후 감소하였다(96h, 왼쪽 패널의 하단 "보정된 FRET" 프레임). 오른쪽 패널: 세포의 FRET 비율을 도 7b에서 상술한 바와 같이 표시된 빈과 함께 막대그래프로 작도하였다. (c) PC 12 세포를 다양한 CFP/YFP 컨스트럭트로 형질감염시키고 상응하는 FRET 비율을 도 7a에 상술한 바와 같이 결정하였다. 세포 안에서 CFP 및 YFP의 공동-발현은 본 발명자들의 분석 조건하에서 상당한 FRET를 야기하지 않았다. CFP-SNAP-25(FL)-YFP은 상당한 수준의 FRET를 나타내는 반면, 가용성 CFP-SNAP-25(Cys-Ala)-YFP은 그렇지 않았다.
도 9는 BoNT/B에 의한 Syb의 효율적인 절단은 소포에 Syb의 편재화가 필요함을 보여준다. (a) CFP-Syb(33-94)-YFP를 사용하여 안정하게 시냅토타그민 Ⅱ(synaptotagmin Ⅱ)를 발현하는 PC 12 세포주를 형질시켰다(Dong 등. synaptotagminⅠ and Ⅱ mediate entry of botulinum neurotoxin B into cells.J. Cell Biol. 162, 1293-1303 (2003)). 이 센서는 세포 안에서 용해 가능하며 강한 FRET 신호를 발생시킨다(상단 패널). CFP-Syb(33-94)-YFP로 형질감염된 PC 12 세포는 BoNT/B 활성을 검출하는데 사용되었다. 50nM의 BoNT/B 홀로독소를 배양 배지에 첨가하고 도 7b에서 상술한 바와 같이 96시간 후 80개의 세포를 분석하였다. 대조군 세포는 동일한 센서로 형질감염되었으나 독소가 처리되지 않았고, 그들을 병렬 분석하였다. BoNT/B와의 인큐베이션은 세포 집단 사이의 FRET 비율을 이동시켰고, 이는 센서 단백질이 세포 안에서 BoNT/B에 의해 절단되었음을 나타낸다. 그러나, 상기 이동은 작았고, 이는 이 절단이 세포 안에서 충분하지 않았음을 나타낸다. (b) YFP-Syb(FL)-CFP 센서의 개략도. 전장 Syb는 116개의 아미노산을 포함하고, 단일 트랜스멤브레인 도메인을 통해 소포에 편재화되었다. BoNT/B에 의한 Syb 절단은 YFP로 태깅된 Syb의 세포질 도메인을 소포로부터 방출시켰다. (c) 안정하게 시냅토타그민 Ⅱ를 발현하는 PC 12 세포를 YFP-Syb(FL)-CFP로 형질감염시키고, BoNT/B(50nM, 48h, 하단 프레임)로, 또는 독소 없이(대조군, 상단 프레임) 처리하였다. CFP 및 YFP 형광 이미지를 각 세포에 대해 수집하였고, 대표적 세포가 도시되어있다. 상기 두 CFP 및 YFP 형광 신호에 의해 입증되듯이(상단 프레임), 이 센서는 소포에 편재화되고, 살아있는 세포에서 핵으로부터 제거되었다. BoNT/B의 처리는 시토졸 안에서 용해가능하고 핵 안으로 들어간, YFP 신호의 재분배를 야기하였다. (d) Syb의 절단된 버전인, 잔기 33-116을 CFP 및 YFP을 연결하는데 사용하였다. 이 컨스트럭트는 동일한 세포질 영역(잔기 33-94, 패널(b))을 Syb 단편으로서 가용성 센서 CFP-Syb(33-96)-YFP 안에 포함하고, Syb의 트랜스멤브레인 도메인을 또한 포함한다. 시냅토타그민 Ⅱ를 발현하는 PC 12 세포를 CFP-Syb(33-116)-YFP 및 CFP-Syb(33-94)-YFP으로 형질감염시켰다. 세포를 그 후 BoNT/B(50nM, 48h)로 처리하거나(＋, 온전한 세포) 처리하지 않았고(－, 온전한 세포), 수확하였다. BoNT/B에 노출되지 않은 샘플로부터 추출한 상기 세포의 절반을 시험관 안에서 절단된 BoNT/B와 함께(＋, 시험관에서) 또는 없이(－, 시험관에서) 인큐베이션하였다(200nM, 30분, 37℃). 두 개의 절단 생산물은 별표로 표시되었다. 각 샘플의 동일한 양(30.mu.g 세포 용해액)을 SDS-페이지 겔로 로딩하고 항-GFP 항체를 이용한 면역블롯 분석을 수행하였다. CFP-Syb(33-116)-YFP는 온전한 세포에서 상당한 절단을 겪는 반면, CFP-Syb(33-94)-YFP의 검출가능한 절단은 없었고, 이는 소포에 편재화는 살아있는 세포에서 BoNT/B에 의한 효과적인 절단에 매우 중요하다는 것을 나타낸다.
도 10은 공여체 라벨 및 수용체 라벨 사이에 배치된 절단 부위 서열을 포함한 링커를 가진, 선행 기술 컨스트럭트의 개략도이다.
도 11a는 본원 발명 컨스트럭트의 한 구체예의 개략도로서, 절단 부위 서열 및 스페이서를 포함하는 링커를 가지고, 상기 스페이서는 절단 부위 서열과 수용체 라벨 사이에 배치되어 있다.
도 11b는 본원 발명 컨스트럭트의 대안적인 구체예의 개략도로서, 절단 부위 서열 및 스페이서를 포함하는 링커를 가지고, 상기 스페이서는 공여체 라벨 및 절단 부위 서열 사이에 배치되어 있다.
도 11c는 본원 발명 컨스트럭트의 또 다른 대체적 구체예의 개략도로서, 절단 부위 서열 및 스페이서를 포함하는 링커를 가지고, 상기 스페이서는 공여체와 절단 부위 서열 및 절단 부위 서열과 수용체 라벨 사이에 배치되어 있다.
도 12는 본원 발명의 컨스트럭트를 이용하여 공여체 라벨 및 수용체 라벨 사이의 에너지 전달 민감도를 향상시키는 방법의 단계를 설명한 블록 다이어그램이다.
도 13은 본원 발명의 컨스트럭트를 이용하여 보툴리눔 신경독소를 검출하기 위한 방법의 단계를 설명한 블록 다이어그램이다.
본원 발명은 보툴리눔 신경독소를 검출하고 이것의 기질 절단 활성을 모니터링하기 위해, 바람직하게는 실시간으로 모니터링하기 위해, BoNT의 기질이자 독소에 의해 절단될 수 있는 펩티드 링커에 의해 연결된 형광체 사이의 형광 공명 에너지 전달(FRET)에 기반한 신규한 조성물 및 방법을 제공한다. 본원 발명의 조성물 및 방법은 시간 안에 피코-몰랄(poco-molar) 수준의 BoNT을 검출하도록 하고, 실시간으로 독소 효소 동역학을 추적할 수 있도록 한다. 상기 방법 및 조성물은 추가적으로, 배양된 세포를 이용하여 소포 막을 통한 자리옮김 및 독소 세포 삽입의 억제를 포함하는, 독소 억제제의 거대 스케일의 스크리닝을 위해 고 처리량 분석 시스템에서 사용될 수 있다. 본원 발명은 또한 살아있는 세포 및 핵에서 보툴리눔 신경독소 활성을 모니터링하는데 적합하다.
또 다른 구체예에서, 본원 발명은 링커로서 전장 SNAP-25 및 Syb 단백질을 포함하는 컨스트럭트 및, 살아있는 세포에서 독소 활성을 검출할 수 있는 형광 바이오센서로서, 상기 컨스트럭트를 이용하는 방법을 제공한다. SNAP-25의 절단은 CFP/YFP FRET 신호를 파괴하고 Syb의 절단은 세포 안에서 YFP 형광의 공간적 재분배를 야기하였다. 본원 발명은 독소 억제제의 세포 기반 스크리닝을 수행하는 수단 및 세포 안에서 독소 활성의 특징화에 대해 제공한다. 본원 발명은 또한 SNAP-25 및 Syb의 서브-세포 편재화(sub-cellular localization)는 세포 안에서, 각각 BoNT/A 및 B에 의한 효율적인 절단에 영향을 미친다는 사실을 개시한다.
형광 공명 에너지 전달(FRET)은 한 분자 및 또 다른 분자(예를 들어, 단백질 또는 핵산) 사이 또는 동일한 분자 내의 두 개의 위치 사이의 거리를 판단할 수 있도록 하는 수단이다. FRET는 현재 당업계에 널리 공지되어 있다(검토를 위해, 문헌[Matyus, (1992) J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 12:323]을 참조하라). FRET는 에너지가 여기 공여체 분자에서 수용체 분자로 전달되는 비 복사 과정(radiationless process)이다. 비 복사 에너지 전달은 제 1 형광체의 여기된 상태의 에너지가 실제 광자 방출 없이 제 2 형광체로 전달되는 양자-역학적 과정이다. 양자 역학적 원리는 문헌[Jovin and Jovin, 1989, Cell Structure and Function by Microspectrofluorometry, eds. E. Kohen and J. G. Hirschberg, Academic Press]에서 개괄되어 있다. 간략히, 형광체는 특정 파장에서 빛 에너지를 흡수한다. 이 파장은 또한 여기 파장으로 공지되어 있다. 형광체에 의해 흡수된 상기 에너지는 뒤이어 다양한 경로를 통해 방출되고, 광자의 방출은 형광을 생산한다. 방출된 빛의 파장은 방출 파장으로 공지되어 있고 이는 특정 형광체의 고유한 특성이다. FRET에서, 에너지는 제 2 형광체의 방출 파장에서 방출된다. 제 1 형광체는 일반적으로 공여체(D)로 불리고, 수용체(A)로 불리는 두 번째 형광체보다 더 높은 에너지의 여기된 상태를 가진다.
상기 과정의 필수 기능은 상기 공여체의 방출 스펙트럼이 수용체의 여기 스펙트럽과 겹친다는 것과, 상기 공여체 및 상기 수용체가 충분하게 가깝다는 것이다.
더욱이, D 및 A의 거리는 형광체 사이의 비 복사 에너지 전달이 가능하도록 충분히 작아야 한다. 에너지 전달 속도는 공여체 및 수용체 사이의 거리의 제 6 파워(sixth power)에 반비례하기 때문에, 에너지 전달 효율은 거리 변화에 극히 민감하다. 에너지 전달은 1-10nm 거리 범위에서 감지 가능한 효율로 발생된다고 언급되고 있으나, 일반적으로는 최적의 결과는 4-6nm이다. 비 복사 에너지 전달에 걸친 거리 범위는 공여체의 형광 양자 효율, 수용체의 흡광 계수, 이들 각각의 스펙트럼의 겹치는 정도, 배지의 굴절률, 및 두 형광체의 순간 전환의 상대적인 방향은 물론, 기타 많은 요소에 효과적으로 의존한다.
본원 발명은 상응하는 BoNT에 의해 절단 가능한 링커 펩티드("기질 펩티드")에 의해 연결된 형광체 FRET 공여체 및 수용체를 포함하는 컨스트럭트("FRET 컨스트럭트")를 제공한다. BoNT 존재하에서, 상기 링커 펩티드는 절단되고, 이에 의해 에너지 전달의 감소 및 공여체 형광체에 의한 빛의 방출의 증가를 야기한다. 이런 방법으로, 독소의 단백질 가수분해 활성은 실시간으로 모니터링되고 양이 평가될 수 있다.
공여체 및 상응하는 수용체 형광 모이어티에 대해 본원에서 사용된, "상응하는"은 공여체 형광 모이어티의 여기 스펙트럼과 겹치는 방출 스펙트럼을 가지는 수용체 형광 모이어티를 의미한다. 수용체 형광 모이어티의 최대 방출 스펙트럼 파장은 공여체 형광 모이어티의 최대 여기 스펙트럼 파장보다 최소한 100nm 초과여야 한다. 따라서, 효과적인 비-방사성(non-radioactive) 에너지 전달이 생산될 수 있다.
기질 펩티드 및 BoNT에 대해 본원에서 사용된, "상응하는"은 링커 펩티드에 작동할 수 있고 특정 절단 부위를 절단하는 BoNT 독소를 의미한다.
형광 공여체 및 상응하는 수용체 모이어티는 일반적으로 (a) 고효율 포스터 에너지 전달; (b) 넓은 최종 스토크 이동(Stokes shift)(>100nm); (c) 가시광선 스펙트럼의 적색 부분 안으로의 가능한 멀리 방출의 이동(>600nm); 및 (d) 공여체 여기 파장에서 여기됨으로서 생산된 라만 워터 형광 방출(Raman water fluorescent emission) 보다 더 높은 파장으로의 방출의 이동에서 선택된다. 예를 들어, 공여체 형광 모이어티는 레이저 라인 근처의 여기 최대(예를 들어 Helium-Cadmium 442nm 또는 Argon 488nm), 높은 흡광 계수, 높은 양자 수율, 및 상응하는 수용체 형광 모이어티 여기 스펙트럼과 이의 형광 방출의 좋은 겹침을 가진 것이 선택될 수 있다. 상응하는 수용체 형광 모이어티는 높은 흡광 계수, 높은 양자 수율, 공여체 형광 모이어티의 방출과 이의 여기의 좋은 겹침, 및 가시광선 스펙트럼의 적색 부분 안의 방출(>600nm)을 가진 것이 선택될 수 있다.
당업자는 많은 형광체 분자가 FRET에 적합하다는 것을 인식할 것이다. 바람직한 구체예에서, 형광 단백질이 형광체로서 사용된다. FRET 기술에서 다양한 수용체 형광 모이어티와 함께 사용될 수 있는 대표적인 공여체 형광 모이어티는 플루오레세인(fluorescein), 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), B-피코에리트린(B-phycoerythrin), 9-아크리딘이소티오시아네이트(9-acridineisothiocyanate), 루시퍼 옐로우 VS(Lucifer Yellow VS), 4-아세트아미도-4'-이소티오-시아나토스틸벤-2,2'-디설폰산, 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아나토페닐)-4-메틸쿠마린, 숙신이미딜 1-피렌부티레이트, 및 4-아세트아미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2,2'-디설폰산 유도체를 포함한다. 사용된 공여체 형광 모이어티에 의존하는, 대표적인 수용체 형광 모이어티는 LC-Red 640, LC-Red 705, Cy5, Cy5.5, 리스아민 로드아민 B 설포닐 염화물(Lissamine rhodamine B sulfonyl chloride), 테트라메틸 로드아민 이소티오시아네이트(tetramethyl rhodamine isothiocyanate), 로드아민 x 이소티오시아네이트(rhodamine x isothiocyanate), 에리트로신 이소티오시아네이트(erythrosine isothiocyanate), 플루오레세인, 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트 또는 기타 란탄계열 이온의 킬레이트(예를 들어, 유로퓸 또는 테르븀)를 포함한다. 공여체 및 수용체 형광 모이어티는, 예를 들어, 분자 프로브(Junction City, Oreg.) 또는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, Mo.)로부터 획득될 수 있다.
표 1은 본원 발명 안에서 사용하기에 적합한 화학적 형광체의 예를, 그의 여기 및 방출 파장과 함께 나열하였다.
트립토판과 같이, 자연적으로 발생하는 특정 아미노산은 형광이다. 아미노산 또한, 예를 들어, 형광기를 아미노산에 연결(AEDANS을 Cys에 연결하는것과 같이)함으로서, FRET에 대한 형광체 쌍을 창작하는데 유도될 수 있다. AEDANS-Cys 쌍은 단백질 컨스트럭트 변화 및 상호작용 검출에 일반적으로 사용된다. 또한 일부 다른 형태의 형광기는 아미노산을 변형시키거나 단백질 단편 내에서 FRET을 생성시키는데 사용된다(예를 들어, S-(N-[4-메틸-7-디메틸아미노-쿠마린-3-일]-카르복아미도메틸)-시스테인-을 동반한 2.4-디니트로페닐-리신).
또 다른 구체예에서, 특히 살아있는 세포에서 사용하기 적합한 녹색 형광 단백질(GFP) 및 이의 다양한 돌연변이는 형광체로서 사용된다. 그들 자신끼리 여기 및 방출 최대값이 변하는 형광 단백질의 예는 WO 97/28261(Tsien 등, 1997)의 표 1에 나열하였고, 이것은 참조로서 본원에 통합되었다. 이것은(각각 그 뒤에 나노미터로 표시된 [여기 최대/방출 최대] 파장) 야생형 녹색 형광 단백질[395(475)/508] 및 녹색 형광 단백질 변이체 P4의 복제된 돌연변이[383/447], P4-3[381/445], W7[433(453)/475(501)], W2[432(453)/408], S65T[489/511], P4-1[504(396)/480], S65A[471/504], S65C[479/507], S65L[484/510], Y66F[360/442], Y66W[458/480], IOc[513/527], WIB[432(453)/476(503)], Emerald[487/508] 및 Sapphire[395/511]를 포함한다. 558nm의 여기 최대값 및 583nm의 방출 최대값을 가지는 DsRed(Clontech)과 같은 적색 형광 단백질 또한 사용될 수 있다. 이 목록은 당업계에 공지된 형광 단백질을 모두 포함하지는 않는다; 추가적인 예가 Genbank 및 SwissPro 공용 데이타베이스에서 발견된다.
GFP는 27-30KD 단백질이고, 또 다른 단백질, 예를 들어 타겟 단백질과 융합될 수 있고, 이 융합 단백질은 예를 들어 E. coli와 같은 숙주 세포에서 발현되도록 조작될 수 있다. GFP 및 이의 다양한 돌연변이는 살아있는 세포 및 조직안에서 형광을 생성할 수 있다. GFP의 돌연변이 형태는 스펙트럼의 이동을 유발시키는 이의 형광 영역 안에서 약간의 아미노산 차이점을 가진다. 앞으로 더 많은 GFP 돌연변이가 독특한 스펙트럼을 가지도록 창작될 것으로 기대된다. 상기 GFP 변이체 중, BFP-YFP, BFP-CFP, CFP-YFP, GFP-DsRed가 단백질-단백질 상호작용을 검출하기 위해 FRET 공여체-수용체 쌍으로서 일반적으로 사용된다. 이 쌍은 또한 이 쌍을 연결하는 링커 영역의 프로테아제 절단을 검출하는데 적합하다.
형광 단백질의 이용은 약 60개 아미노산 잔기의 링커 단편을 사용할 수 있기 때문에 적합하다. 더 긴 단편은 보통 독소 인지 및 절단에 더욱 민감하므로, 따라서 독소 검출에 대해 높은 민감도를 야기한다. 하기 예에서 보여진 바와 같이, CFP-SNAP-YFP과 함께 4시간 인큐베이션 후의 BoNT/A 및 E의 EC50는 광범위하게 사용된 마이크로플레이트 형광분광광도계(Spectra Max Gemini, 분자 장치)를 이용하여 측정될 때, 15-20pM(1-2ng/ml)까지 떨어진다. BoNT/B 및 F의 EC50는 약 200-250pM이고, 민감도는 인큐베이션 시간을 증가시킴으로서 강화될 수 있다.
본원 발명의 실시예에 따라, FRET가 발생하도록, 두 개의 형광체가 적절한 길이의 링커에 의해 함께 연결되었다. 이 링커는 BoNT 기질 단백질의 단편이다. 링커 단편을 절단할 수 있는 BoNT에 노출된 경우, 상기 두 개의 형광체는 분리되고 FRET는 파괴된다. 본원 발명은 따라서 FRET의 변화를 감지함으로서 BoNT를 검출하는 방법을 제공한다. 많은 종으로부터의 SNARE 단백질은 아미노산 수준에서 보존되어 있다고 공지되어 있기 때문에, BoNT 독소에 대한 기질 단백질로서 적합하다. 많은 BoNT 기질 단백질이 공지되어 있고 본원 발명에 대한 적당한 링커 펩티드로서 사용하기 위해 변형되거나 사용되도록 이용할 수 있다. 몇 가지 기질 단백질 및 GenBank 기탁번호를 표 2에 나열하였다.
각 BoNT 독소는 독소 절단 부위 안의 특정한 두 아미노산 사이의 특정한 펩티드 결합을 절단하는 것으로 공지되어 있다. 하기 표 3은 각 BoNT 독소에 대한 아미노산 쌍을 나열한다. 하지만, 이 아미노산 서열 쌍은 독소 인지 및 절단에 충분하지 않다. 예를 들어, BoNT/A는 Q(15)-R(16)가 아닌, 래트 SNAP-25 서열(GenBank 기탁번호: NP.sub.--l12253)의 Q(197)-R(198)에서 SNAP-25을 절단한다. 일반적으로 인식부위로서 보존된 아미노산 서열은 없다; 오히려, 독소는 타겟 단백질의 제 1차 구조보다는 제 3차 구조를 인식하는 것으로 생각된다. 그럼에도 불구하고, 매우 짧은 기질 단백질 절편은 그들이 하기 표 3에 나열된 독소 절단 부위에서 두 개의 아미노산 잔기를 가지는 한, 종의 기원과 관계없이, 독소 인식 및 절단에 충분하다.
링커 단백질 또는 펩티드는 전장 BoNT 기질 단백질로 될 수 있다. 바람직하게는 상기 링커는 더 짧은 기질 단백질 단편이다. 전장 기질 링커는 효과적인 FRET을 위해서는 너무 길고, 더 짧은 단편이 더욱 효과적이고 전장 단백질보다 생산하기 쉽다. 반면에, 상기 지시된 바와 같이, 상기 링커 펩티드는 특정 최소 길이보다 커야 하는바, 이는 이 최소 길이 아래에서는 각 BoNT에 의한 링커 펩티드의 절단이 불충분하게 되기 때문이다.
예와 같이 sybⅡ 및 BoNT/B를 사용하여, 하기 표 4는 링커-펩티드 결합 길이 및 독소 절단 속도 사이의 관계를 설명한다. 전장 래트 sybⅡ 단백질(GenBank No: NP.sub.--036795)은 116개의 아미노산을 가지고, 이 중 아미노 말단의 1-94개의 아미노산은 세포질 도메인이고 나머지는 트랜스멤브레인 도메인이다. 표 1에서 명확하게 하듯이, 특정 제한 하에서, 더 짧은 단편은 더 낮은 속도로 독소에 의해 절단된다(Foran 등, Biochemistry 33:15365, 1994의 데이타).
표 4로부터 알 수 있듯이, 파상풍 신경독소(TeNT)는 최적의 절단을 위해 BoNT/B(55-94)보다 더 긴 단편(33-94)을 필요로 한다. 60-94개로 구성된 단편은 몇 개의 펩티드-기반 독소 분석 방법을 포함한 몇 가지 연구에서 사용되고 있다(Schmidt 등, 2003, supra, and Schmidt et al., 2001, Analytical Biochemistry, 296: 130-137).
BoNT/A의 경우, SNAP-25의 141-206 단편은 대부분의 독소 민감도를 유지하는데 필요하다(Washbourne 등, 1997, FEBS Letters, 418:1). 더 짧은 펩티드, SNAP25의 아미노산 187-203이 BoNT/A에 의해 절단되기에 충분하다는 기타 보고 또한 존재한다. BoNT/A의 최소 부위는: Glu-Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys (SEQ ID NO:1)이다. BoNT/A는 Gln-Arg를 절단한다.
예비 결과는, 전장 SNAP-25를 PC 12 세포 안의 CFP 및 YFP 사이의 링커 서열로서 사용하여, 획득된 FRET 신호는 더 짧은 단편을 사용하여 획득된 것보다 기존의 실험실 현미경을 사용하여 검출되기 충분할 정도로, 더 강하다는 것을 나타낸다. PC 12 세포 안에서 BONT/A에 의한 전장 SNAP-25의 절단 속도는 더 짧은 단편보다, 더 빠르고 세포에서 세포로 더욱 일관된다고 생각되는바, 이는 아마도 BoNT/A 경쇄가 타겟이 되거나 고정된 원형질막에서, 전장 SNAP-25가 타겟이 된다는 사실 때문인 것으로 추정된다.
BoNT/B의 경우, 잔기 60-94 사이만큼 짧은 단편이 잔기 33-94 사이의 단편만큼 효과적이라는 것이 발견되었다. 바람직하게는, 33-94 사이의 단편은 BoNT/B 및 TeNT에 사용된다. 상기 두 독소는 GIn 및 Phe 사이를 절단하고, 절단의 최소 서열은: Gly-Ala-Ser-Gln-Phe-Glu-Thr-Ser(SEQ ID NO:2)인 것으로 믿어진다. BoNT/B 경쇄가 시냅스 소포에 타겟이 되고 고정될 수 있다는 표시가 있으며, 신호서열을 통해, 세포 안에서 증가된 절단 효율을 성립하기 위해 시냅스 소포 안으로 본원 발명의 FRET 컨스트럭트를 또한 타겟으로 하는 것이 바람직하다.
BoNT/C는 SNAP25 및 신택신 두 가지 모두를 절단하고, 기질이 용액 상태일 경우 매우 느린 속도로 절단하는 것으로 생각된다. 세포막에 상주하는 본래의 SNAP25 및 신택신은 BoNT/C에 의해 가장 효과적으로 절단된다. SNAP25에 대한 최소 절단 서열은; Ala-Asn-Gln-Arg-Ala-Thr-Lys-Met(SEQ ID NO:3)이고, Arg-Ala 사이에서 절단이 발생하고; 신택신의 경우, 최소 절단 서열은 Asp-Thr-Lys-Lys-Ala- Val-Lys-Phe(SEQ ID NO:4)이고, Lys-Ala에서 절단이 발생한다.
BoNT/E는 Gln-Ile-Asp-Arg-Ile-Met-Glu-Lys(SEQ ID NO:5)의 최소 서열을 필요로 하고, Arg-Ile 사이를 절단한다.
BoNT/F는 Gln-Lys을 절단한다. Schmidt등(Analytical Biochemistry, 296: 130-137 (2001))은 sybⅡ의 37-75 단편은 대부분의 독소 민감도를 유지하고, 최소 서열은; Glu-Arg-Asp-Gln-Lys-Leu-Ser-Glu(SEQ ID NO:6)라고 보고하였다.
최소 절단 부위 및 FRET 신호 강도 및 링커 길이 사이, 및 절단 효율 및 링커 길이 사이의 관계에 대한 상기 논의로부터, 당업자는 FRET 신호 강도 및 절단 효율 사이에 최적의 균형을 맞추기 위한 적합한 링커 길이를 쉽게 선택할 수 있다.
바람직하게는, 상기 링커 길이는 약 8개 아미노산(a.a.) 내지 약 100개 아미노산 사이 어디든 가능하고, 바람직하게는 10-90개 사이, 더욱 바람직하게는 20-80개 사이, 30-70개 사이, 40-60개 사이 길이이고, 특정 기질 및 독소 조합물에 의존한다.
한 구체예에서, 링커 단백질 또는 이의 단편이 최초로 정제되거나, 또는 펩티드가 최초로 합성되었고, 그 후 형광기가 화학적 반응을 통해 특정 아미노산에 첨가되었다. 이하 상술한 바와 같이, 형광 라벨은 링커 펩티드에 부착되거나 비 부착되고, 형광 단백질은 인-프레임에서 링커 펩티드와 융합된다. 상기 논의는 짧은 기질 단편이 독소 검출 특이성에 바람직한 반면, 긴 단편은 증가된 신호 강도 또는 절단 효율에 바람직하다는 것을 명확하게 한다. 기질 단백질이 하나의 BoNT에 대해 하나 이상의 인식 부위를 포함하는 경우, 단독 순위 결과는 어떤 특정 독소가 샘플 안에 존재하는지 조사하는데 충분하지 않을 것이라는 사실은 이미 인식되어 있다. 본원 발명의 한 구체예에서, 더 긴 기질 단편, 특히 전장 기질 단백질이 사용된다면, 상기 기질은, 예를 들어, 위치 특이적 돌연변이 또는 당업자에게 잘 공지된 기타 분자 조작 방법을 통해, 하나의 독소/프로테아제 인지 부위만을 포함하도록 조작될 것이다. 예를 들어, [Zhang et al, 2002, Neuron 34:599-611 "Ca2+-dependent synaptotagmin binding to SNAP-25 is essential for Ca2 + triggered exocytosis"]을 참조하라(BoNT/E 절단 부위(Asp 179 내지 Lys)에서 돌연변이가 일어난 SNAP-25는 BoNT/E 절단에 내성이 있지만, SNARE 복합체 형성에 대해 테스트 될 때 정상적으로 행동한다고 도시함). 바람직한 구체예에서, 본원 발명의 방법은 특이적으로 조작한 조합체 및 최적의 신호 강도를 달성하기 위한 길이의 최적화, 절단 효율 및 독소/혈청형 특이성을 이용한다.
바람직한 구체예에서, 상기 형광체는 적절한 기질 펩티드에 의해 연결된 적당한 형광 단백질이다. FRET 컨스트럭트는, 상기 폴리펩티드 및 형광 단백질 라벨 둘 모두를 시험관 안에서 엔코딩하는 서열의 인-프레임 융합체를 포함하는 재조합 핵산 분자의 발현을 통해 생산될 수 있다(예를 들어, 무-세포 전사/번역 시스템을 사용하거나, 또는 당업자에게 잘 공지된 방법을 사용하여 형질감염 또는 형질전환된 배양된 세포를 대신 사용하여). FRET 컨스트럭트를 생성하기에 적합한 세포는 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물세포일 것이다. FRET 컨스트럭트는 또한 시험관 내, 예를 들어, 유전자 변형 식물, 또는 유전자 변형 동물(곤충, 양서류, 및 포유류를 포함하나 이에 제한되지는 않음)에서 생성될 수 있다. 본원 발명에서 사용되는 재조합 핵산 분자는 당업계에서 잘 공지된 분자적 방법에 의해 작제되고 발현될 수 있고, 쉽게 정제할 수 있는 태그(tag)(예를 들어, 히스티딘 태그), 링커, 분비 신호, 핵 위치 신호 또는, 이를 원한다면 특정 세포 위치에 상기 컨스트럭트를 타겟팅 할 수 있는 기타 제 1차 서열 신호를 엔코딩하는 서열을 추가적으로 포함하나 이에 제한되지는 않는 서열을 포함할 수 있다.
300nM 단백질까지는 마이크로플레이트 형광분광광도계를 이용하여 검출될 수 있는 충분한 형광 신호를 발생시키는데 충분하다. 상기 형광 신호 변화는 독소 프로테아제 효소 활성을 반영하도록 실시간으로 추적될 수 있다. 실시간 모니터링은 반응 공정에 따른 신호 변화를 측정하고, 양자 신속한 데이타 수집이 가능하게 하고, 다양한 조건하에서 반응 동역학에 관련된 정보를 산출한다. FRET 비율 변화 및 절단 정도는, 예를 들어, HPLC 분석과 같은 방법을 이용한 특정 형광분광광도계의 경우, FRET 비율로부터의 동역학 상수의 단위와 기질 농도를 연관시키기 위해, 서로 연관될 수 있다,
도 10은, 절단 부위 서열(140) 및 공여체 라벨(110) 및 수용체 라벨(120) 사이에 배치된 절단 부위(142)를 포함하는, 링커(130)를 가지고 있는 선행기술 컨스트럭트(100)의 개열이다. 상기 유형의 선행 기술 컨스트럭트는 BoNT 검출하는데에 상당히 잘 작동한다. 그러나 도 11a의 대표 컨스트럭트(100a)는, 놀랍게도, 링커(130a) 안에 스페이서(150a)를 포함함으로서 BoNT 검출에 대해 강화된 민감도를 가진다.
도 11a는 절단 부위 서열(140), 절단 부위(142), 및 스페이서(150a)를 포함하는 링커(130a)를 가지고 있는 본원 발명의 한 대표 컨스트럭트(100a)의 개략도이다. 스페이서(150a)는 절단 부위 서열(140) 및 수용체 라벨(120) 사이에 배치된다. 바람직하게는, 컨스트럭트(100a)는 CFP-(SGLRSRA)-SNAP-25-(SNS)-YFP, 및 CFP-(SGLRSRA)-시냅토브레빈-(SNS)-YFP으로 이루어진 군에서 선택된다.
공여체 라벨(110) 및 수용체 라벨(120)은 공여체 라벨이 수용체 라벨에 쌍극자-쌍극자 커플링 메카니즘에 의해 에너지를 전달할 수 있도록, 전자 커플링을 제공하는 위치에 있다(포스터 공명 에너지 전달(FRET)을 포함하나 이에 제한되지는 않음).
링커 펩티드(130a)는 보툴리눔 신경독소에 의해 인식되고 절단될 수 있는 시냅토브레빈(VAMP), 신택신 및 SNAP-25, 또는 이의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 보툴리눔 신경독소의 기질이다. 상기 단백질들은 집합적으로 SNARE 단백질이라고 불린다. 링커(130a)는 임의의 적당한 길이, 예를 들어, 5nm, 8nm, 10nm, 12nm, 14nm, 및 20nm 이상을 포함하는 제 1차 구조 길이를 가질 수 있다.
스페이서(150a)는 임의의 적당한 수, 그러나 바람직하게는 3, 5, 7, 10, 12, 또는 15개 이상의 아미노산을 가질 수 있다. 스페이서(150a)는 (GGGGS)n 및 (EAAAK)n(여기서 n은 1-3임)으로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 스페이서(150a)는 SNARE 단백질, 모티프, 또는 뮤테인을 포함할 수 있다. 스페이서(150a)가 공여체 라벨(110) 및 수용체 라벨(120) 사이의 1차 구조의 거리를 증가시킴에도 불구하고, 스페이서(150a)는 스페이서 없는 상응하는 컨스트럭트와 비교하여, 공여체 라벨(110) 및 수용체 라벨(120) 사이의 전자 커플링(FRET 효과)을 유리하게 증가시킨다. 스페이서(150a)가 공여체 라벨(110) 및 수용체 라벨(120) 사이의 제 3차 구조의 거리를 감소시키기 때문에 상기 강화된 전자 커플링이 발생하고, 따라서 전자 커플링이 증가되도록 하는 것이다.
절단 부위 서열(140)은 (a) SNARE 단백질, 모티프, 뮤테인, 및 (b) 5개 이상의 아미노산을 가지는 스페이서를 포함할 수 있고, 상기 스페이서는 (GGGGS)n 및 (EAAAK)n(여기서 n은 1-3임)으로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함한다.
도 11b의 컨스트럭트(100b)는 링커(130b)가 공여체 라벨(110) 및 절단 부위 서열(140) 사이에 배치된 스페이서(150b)를 가진 것을 제외하고는, 도 11a의 컨스트럭트(100a)와 유사하다.
도 11c의 컨스트럭트(100c)는 링커(130c)가 (a) 공여체 라벨(110) 및 절단 부위 서열(140) 사이에 배치된 스페이서(150c) 및 (b) 절단 부위 서열(140) 및 수용체 라벨(120) 사이에 배치된 스페이서(150d)를 가지는 것을 제외하고는, 도 11a의 컨스트럭트(100a)와 유사하다.
도 12는 공여체 라벨 및 수용체 라벨 사이에 에너지 전달의 민감도를 개선하기 위한 방법(200)의 단계를 도 11a-11c의 컨스트럭트를 이용하여 설명한다. 단계(210)는 링커를 통해 물리적으로 연결되어 있는 공여체 라벨 및 수용체 라벨을 포함하는 도 11a-11c에 따른 컨스트럭트를 제공하는 단계를 포함한다. 상기 컨스트럭트는 단백질 기반 컨스트럭트이고, 상기 링커는 펩티드 서열(212)이다. 단계(220)는 링커 안에 절단 부위 서열을 포함시키는 단계를 포함한다. 절단 부위 서열은 SNARE 단백질, 또는 단편 또는 이의 뮤테인, 및 5개 이상의 아미노산(222)을 포함하는 스페이서를 포함하거나 불포함한다. 단계(230)는 링커 안에, 공여체와 절단 부위 서열 사이 및 수용체와 절단 부위 서열 사이의 중 적어도 하나 사이의 스페이서를 포함시키는 단계로서, 그로 인해 상기 공여체 및 상기 수용체 사이의 전자 커플링은 (a) 공여체 및 수용체(234) 사이에 제 3차 구조의 거리를 감소시킴으로서, 및 (b) 공여체 및 수용체(236) 사이의 전자 홉을 제공함으로서 증가되는 단계를 포함한다. 상기 스페이서는 (GGGGS)n 및 (EAAAK)n(여기서 n은 1-3임)으로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함하거나 불포함한다.
도 13은 도 11a-11c의 컨스트럭트를 이용하여 보툴리눔 신경독소를 검출하는 방법(300)의 단계를 설명한다. 단계(310)는 청구항 제 1항의 컨스트럭트를 제공하는 단계로서, 상기 링커는 검출되는 보툴리눔 신경독소의 기질 단백질 또는 이의 절단 가능한 단편인 단계를 포함한다. 단계(320)는 보툴리눔 신경독소가 기질 단백질 또는 이의 단편을 절단하는 조건 하에서, 보툴리눔 신경독소를 포함하고 있다고 의심되는 샘플에 상기 컨스트럭트를 노출시키는 단계를 포함한다. 마지막 단계(330)는 상기 컨스트럭트가 샘플에 노출되기 전과 후의 FRET 신호를 검출하고 비교하는 단계로서, 상기 FRET의 감소는 샘플 안의 보툴리눔 신경독소의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함한다.
본원 발명의 방법은 민감도가 높고, 그 결과로서, 보툴리눔 박테리아 세포안에 프로톡신(protoxins)을 포함하고 있는 환경 샘플(environmental sample) 내의 미량의 BoNT를 검출하는데 직접적으로 사용될 수 있다. 따라서, 본원 발명은 직접적으로 환경 샘플을 이용한 독소 검출 방법 및 식별을 추가적으로 제공한다.
본원 발명은 본원에 상술한 시험관 시스템을 이용하여, BoNT 억제제를 스크리닝하는 방법을 추가적으로 제공한다. 높은 민감도, 신속한 판독, 및 사용의 편의성 때문에, 본원 발명에 기반한 시험관 시스템은 독소 억제제를 스크리닝하는데 또한 적합하다. 특히, 적당한 BoNT 기질-FRET 컨스트럭트는 후보 억제제 물질 존재하에, 상응하는 BoNT에 노출되고, 상기 후보 억제제가 BoNT의 활성을 억제하는지 여부를 측정하기 위해 FRET 신호의 변화가 모니터링된다.
본원 발명은 BoNT의 검출하기 위해 세포-기반 시스템을 이용하여 BoNT를 검출하는 방법 및 BoNT 억제제를 스크리닝하는 방법을 추가적으로 제공한다. 본원에 상술한 적절한 BoNT 기질-FRET 컨스트럭트는 세포 안에서 발현되고, 상기 세포는 BoNT를 포함하는 것으로 의심된 샘플에 노출되고, BoNT의 농도 또는 존재/부존재의 지표로서, FRET 신호 변화가 모니터링된다. 특히, FRET 신호의 감소는 상기 샘플이 상응하는 BoNT를 포함하는 것을 나타낸다.
세포-기반 고-처리량 스크리닝 분석은 독소의 단백질 분해 활성을 억제할 수 있는 시약뿐 아니라, 세포 수용체(들)에의 결합, 엔도좀 세포막을 거친 경쇄 자리옮김 및 자리옮김 후 시토졸 안에서의 경쇄 재접힘과 같은 독소의 작용의 기타 단계를 억제할 수 있는 시약 또한 드러낼 잠재력을 가진다.
본원 발명은 본원에 상술한 세포-기반 시스템을 이용하여 BoNT의 억제제를 스크리닝하는 방법을 추가적으로 제공한다. 특히, 적절한 BoNT 기질-FRET 컨스트럭트를 발현하는 세포는 후보 억제제 물질의 존재하에, 상응하는 BoNT에 노출되고, 상기 후보 억제제가 BoNT의 활성을 억제하는지 여부를 측정하기 위해 FRET 신호의 변화가 모니터링된다. 독소-기질 상호작용의 직접적인 억제제만을 식별할 수 있는 기타 시험관 기반 스크리닝 방법과의 비교하여, 본원 발명의 세포-기반 스크리닝 방법은, 독소-세포막 수용체 결합, 세포막 자리옮김, 및 세포 내 독소 운동과 같은(그러나 이에 제한되지는 않음), 기타 독소-관련 활성의 억제제에 대한 스크리닝을 추가적으로 허락한다
바람직한 구체예에 따라, BoNT 기질 폴리펩티드 및 두 개의 적당한 FRET-영향 형광 펩티드를 엔코딩하는, 재조합 핵산 분자, 바람직하게는 발현 벡터는 적당한 숙주 세포 안으로 도입된다. 당업자는 적당한 발현 벡터, 바람직하게는 본 발명을 위한 포유류 발현 벡터를 선택할 수 있고, 엄청난 수의 선택이 존재한다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, pCI 및 pSi(Promega, Madison, Wis.로부터), CDM8, pCeo4와 같은, pcDNA 시리즈의 벡터. 상기 벡터 대다수는 바이러스성 프로모터를 사용한다. 바람직하게는, BD Biosciences(San Jose, Calif)의 tet-오프 및 tet-온 벡터와 같은 유도성 프로모터가 사용된다.
세포주의 많은 선택은 본 발명을 위한 숙주 세포에 적합하다. 바람직하게는, 상기 세포는 각각의 BoNT가 자신의 독소 활성을 보이는 세포 유형 중 하나이다. 바꾸어 말하면, 상기 세포는 바람직하게는 적당한 세포막 수용체를 나타내거나, 또는 그 반대로 독소가 상기 세포 안으로 충분히 효과적으로 자리옮김되도록 허용하고, 상기 독소가 적당한 기질 폴리펩티드를 절단하도록 허용한다. 특정 실시예는 제 1차 배양된 신경세포(대뇌피질 신경세포, 해마 신경세포, 척수 운동 신경세포등); PC 12 세포 또는 유도된 PC 12 세포주; 제 1차 배양된 크롬친화 세포; 뮤린 콜린성 Neuro 2a 세포주, 인간 아드레날린성 SK-N-SH 세포주, 및 NS-26 세포주와 같은, 몇몇 배양된 신경모세포종 세포주를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Foster and Stringer (1999), Genetic Regulatory Elements Introduced Into Neural Stem and Progenitor Cell Populations, Brain Pathology 9: 547-567]을 참조.
기질-FRET 폴리펩티드에 대한 코딩 영역은 적당한 프로모터의 통제하에 있다. 사용된 숙주 세포의 유형에 의존한, 많은 적합한 프로모터가 공지되어있고 당업계에서 쉽게 이용가능하다. 이 프로모터는 유도성 또는 구조성(constitutive)일 수 있다. 구조성 프로모터는 본원 발명의 원하는 폴리펩티드의 발현을 유도하기 위해 선택될 수 있다. 상기 발현의 유도는 발현 숙주를 유도성 기질을 포함한 배지에서 배양시킬 필요성을 회피하기 때문에 추가적 이점을 제공할 수 있다. 적당한 프로모터의 예로는 포유류 시스템에서 LTR, SV40 및 CMV; 박테리아 시스템에서 E. coli lac 또는 trp; 곤충 시스템에서 배큘로바이러스 다각체(baculovirus polyhedron) 프로모터(polh) 및 기타 진핵 및 원핵 세포 또는 이들의 바이러스에서 발현을 조절하는 것으로 공지된 기타 프로모터일 것이다. 진균 발현 숙주에서 사용하기에 바람직한 강력한 구조성 및/또는 유도성 프로모터의 예는 자일라나제(xlnA), 피타아제, ATP-합성효소, 서브유닛 9(oliC), 트리오스 포스페이트 이성질화효소(tpi), 알콜 탈수소효소(AdhA), 알파-아밀라아제(amy), 아밀로글루코시다아제(AG--glaA gene에서 옴), 아세트아미다아제(amdS) 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(gpd) 프로모터의 진균 유전자로부터 획득가능하다. 강력한 효모 프로모터의 예는 알콜 탈수소효소, 락타아제, 3-포스포글리세레이트 키나아제 및 트리오스포스페이트 이성질화효소의 유전자로부터 획득가능하다. 강력한 박테리아 프로모터의 예는 SPO.sub.2 프로모터를 비롯하여 세포외 단백질분해효소 유전자에서 온 프로모터를 포함한다.
혼성 프로모터 또한 컨스트럭트 발현의 유도성 조절을 향상시키는데 사용될 수 있다. 상기 프로모터는 적당한 숙주에서의 발현을 증가시키거나 보증하는 특징을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 특징은 Pribnow Box 또는 TATA box와 같이 보존된 영역일 수 있다. 상기 프로모터는 심지어 본 발명의 누클레오티드 서열의 발현 수준에 영향을 끼치는(유지, 강화 또는 감소와 같은) 기타 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 적당한 기타 서열은 Shl-인트론 또는 ADH 인트론을 포함한다. 기타 서열은 유도성 인자(온도, 화학작용, 빛 또는 스트레스 유도 인자와 같은)를 포함한다. 또한, 전사 또는 번역을 강화시키는데 적당한 인자도 존재할 수 있다. 후자 인자의 예는 TMV 5' 신호 서열이다(문헌[Sleat, 1987, Gene 217: 217-225; 및 Dawson, 1993, Plant MoI. Biol. 23: 97] 참조).
상기 발현 벡터는 발현을 증폭하도록 프로모터에 작용하는 서열을 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, SV40, CMV, 및 폴리오마 cis-작용 인자(인핸서) 및 선택가능 마커는 선택을 위한 표현형 특징을 제공할 수 있다(예를 들어, 포유류 세포의 디하이드로폴레이트 환원효소 또는 네오마이신 저항성 또는 E. coli의 엠피실린/테트라실린 저항성). 적절한 프로모터 및 선택 마커를 포함하는 벡터의 선택은 충분히 당업자의 수준 내에 있다.
바람직하게는 기질-FRET 폴리펩티드의 코딩 영역은 유도성 프로모터의 통제하에 있다. 구조성 프로모터와 비교하여, 유도성 프로모터가 세포 내에서 리포터의 농도를 적절하게 통제시킬 수 있기 때문에 더 바람직하고, 따라서 FRET의 변화의 측정이 훨씬 용이해진다.
예를 들어, FRET 리포터는 Tet-온 및 Tet-오프 시스템(BD Biosciences, San Jose, Calif.)을 이용해 통제될 수 있다. 이 프로모터의 통제 하에, 유전자 발현은 정확하고, 가역적이며 정량적 방법으로 조절될 수 있다. 간략히, Tet-온 시스템의 경우, 하류(downstream) 유전자의 전사는 독시사이클린이 배양 배지 안에 존재할 때에만 일어난다. 특정 기간 동안의 전사 후, 본 발명자들은 독시사이클린을 고갈시키기 위해 배양 배지를 교환할 수 있고, 따라서 신규한 FRET 리포터 단백질의 합성을 중단시킬 수 있다. 따라서, 새롭게 합성된 FRET 단백질에서의 백그라운드가 존재하지 않고, 본 발명자들은 독소 처리 후 더 빠른 변화를 관찰할 수 있다.
형광 분석은, 예를 들어, 광자 계측 형광 현미경 시스템(특정 범위에서 형광 방출을 모니터링하기 위한 필터 및 적절한 이색성 거울을 포함하는), 광자 계측 광전자 배증관 시스템 또는 형광계를 이용하여 수행될 수 있다. 에너지 전달을 시작하기 위한 여기는 아르곤 이온 레이저, 고 강도 수은(Hg) 아크 램프, 광섬유 광원, 또는 원하는 범위에서 여기를 위해 적절하게 필터링된 기타 고 강도 광원을 이용하여 수행될 수 있다. 검출 민감도를 증가시키기 위한 광전자 배증관 방법과 통합됨으로서 여기/검출 평균이 증가될 수 있다는 것이 당업자에게 명백해질 것이다. 예를 들어, 상기 두 광자 교차 상관 방법은 단일-분자 스케일의 검출을 달성하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, [Kohl et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., 99:12161, 2002] 참조)
다수의 형광 산출의 파라미터가 측정될 수 있다. 이것은: 1) 수용체(A) 및 공여체(D)의 방출 파장에서 방출된 형광의 측정 및 이들의 방출 크기의 비율에 의해 에너지 전달 범위의 결정; 2) D의 형광 지속력의 측정; 3) D의 광표백 속도 측정; 4) D 및/또는 A의 이방성 측정; 또는 5) 스토크 이동 모노머/엑시머 형광의 측정을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Mochizuki et al., (2001) "Spatio-temporal images of grow-factor-induced activation of Ras and Rapl." Nature 411:1065-1068, Sato et al. (2002) "Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells." Nat Biotechnol. 20:287-294]을 참조하라.
또 다른 구체예에서, 본원 발명은 표면 플라즈몬 공명 영상(SPRi) 기술을 이용해 BoNT를 검출하는 방법을 제공한다. 표면 플라즈몬 공명(SPR)은 화학 결합을 지지하는 얇은 금속 필름(일반적으로 금) 내의 표면 플라즈몬의 생성에 기반한, 분자 결합의 검출을 위해 확립된 최적의 기술이다. 표면 플라즈몬은 금속 필름 내에 제한된 자유 전자의 집합적 진동이다. 이 전자는 높은 프리즘 굴절률로부터 빛 영역 입사(light field incident)에 의해 공명적으로 여기된다. 상기 공명 여기 발생을 거친 입사각 q는 상대적으로 좁고, 공명 입사각 qr에서 최소를 가지는 반사된 빛의 강도의 감소에 특징이 있다. 반사된 빛의 위상은 또한 이 영역에서 q에 관하여 거의 선형으로 변한다. qr 값은 소수의 나노미터의 금속 필름 안에 존재하는 배지의 굴절률에 민감하다. 분자의 필름에의 결합, 또는 결합된 분자의 분자량의 변화에 의한, 굴절률의 작은 변화가 각도의 변화로서 검출될 수 있다. 생체분자를 금속 표면에 고정시키기 위한, 이와 같은 고정을 검출하기 위한, 많은 방법이 당업계에 공지되어 있고, SPRi 측정이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 하기 문헌 참조[미국특허출원 제 6,127,129호, 미국특허출원 제 6,330,062호, 및 Lee et al., 2001, Anal. Chem. 73: 5527-5531, Brockman et al., 1999, J. Am. Chem. Soc. 121 : 8044-8051, 및 Brockman et al., 2000, Annu. Rev. Phys. Chem. 51: 41-63](이들 문헌은 전체 참조로서 본원에 통합된다).
실제로 BoNT 타겟 펩티드 층은 금속 위에 증착될 수 있다. 상응하는 BoNT를 포함하고 있는 것으로 의심된 샘플은 혼합물 표면에 적용되고, 만약 포함한다면, 독소가 결합된 타겟 펩티드를 절단하도록 인큐베이션된다. 상기 절단은 금속 표면에 결합된 펩티드의 분자량의 감소를 야기할 것이고, 그 후 이 감소는 표준 장비 및 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 결합 층 두께의 감소는 상기 샘플이 타겟 펩티드에 상응하는 독소를 포함하고 있고, 그 결과로 절단이 발생되었음을 나타낸다.
대안적으로, BoNT 단백질과 금속 표면에 고정된 이에 상응하는 기질 펩티드와의 결합은 또한 굴절률의 변화를 발생시킬 것이고, 공지된 SPRi 기술 및 장치에 의해 검출될 수 있다.
금속 표면 위에 펩티드 분자 또는 단백질의 고정 또는 증착에 대한 많은 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 여분의 Cys 잔기의 첨가는 펩티드의 말단에 첨가될 수 있고, 그 후 이것은 금속 표면에 교차 결합될 수 있다. 간접적으로, 항체는 금속 표면에 최초로 고정될 수 있고, 이 항체에 독소 기질이 결합할 수 있다. 항체를 통한 간접적인 고정은 항체-기질 결합이 독소가 기질의 절단 지점을 인식하고 접촉하는 것을 막지 않는 한, 본원 발명에 적합하다. 게다가, 니켈-NTA 또는 글루타티온은 각각 his6 또는 GST 융합 단백질을 억제하는데 사용될 수 있다. 금속 표면에 고정된 펩티드에 관한 추가적 정보는, 전체 참조로서 본원에 통합된, 문헌[Wegner et al, (2002) Characterization and Optimization of Peptide Arrays for the Study of pitope-Antibody Interactions Using Surface Plasmon Resonance Imaging" Analytical Chemistry 74:5161-5168]에서 찾아볼 수 있다.
분자량 3,000 내지 6,400d에 상응하는, 핵산 분자의 약 10-16개 염기의 변화는 SPR1에 의해 쉽게 검출될 수 있다. 이것은 펩티드 분자의 겨우 16개 아미노산 잔기의 변화도 검출될 수 있다는 것을 의미한다. 이 높은 민감도는 전장 독소 기질 단백질을 이용하는 대신에, 표면 위에서 짧은 펩티드 기질의 고정을 허용한다. 짧은 펩티드 단편은 더욱 안정하고, 준비하는데 덜 비싸고 더 높은 반응 특이성을 허용하기 때문에 선호된다.
실시예
재료 및 방법
생체 센서 DNA 컨스트럭트의 작제: YFP cDNA (Clontech)를 pECFP-YFP 벡터를 생성하기 위해 EcoRI 및 BamHI 부위를 이용하여 pECFP-C1 벡터(Clontech) 내부로 삽입시켰다. PCR을 이용하여 rat sybⅡ의 아미노산 33-94을 엔코딩하는 cDNA를 증폭시키고 이를 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있는 CFP-SybⅡ-YFP(또한 CFP-Syb(33-94)-YFP라고 불림) 컨스트럭트를 생성하기 위해, CFP 및 YFP 유전자 사이에 있는, XhoI 및 EcoRI 부위를 이용하여 pECFP-YFP 벡터 안으로 삽입시켰다. 컨스트럭트 CFP-SNAP-25-YFP(또한 CFP-SNAP-25(141-206)-YFP라고 불림)을 동일한 방법을 이용하여, 그러나 SNAP-25의 141-206 잔기를 이용하여, 작제하였다. 링커로서 전장 rat SNAP-25B을 이용한 컨스트럭트(CFP-SNAP25FL-YFP)를 또한 작제하였다. 박테리아 E. coli 이용하여 재조합 키메라 단백질을 정제하기 위해, 본 발명자들은 또한 CFP-SybⅡ-YFP 유전자 및 CFP-SNAP-25-YFP 유전자를 pECFP-YFP 벡터로부터, NheI 및 BamHI 부위를 이용한 pTrc-his (인비트로겐) 벡터 안으로 이동시켰다.
PCR을 이용한 위치-특이적 돌연변이에 의해 Ala에 SNAP-25의 4개의 Cys 잔기의 돌연변이를 일으켰고, 그 다음 상기 단편을 상기 상술한 CFP 및 YFP 사이에 삽입하였다. SNAP-25의 잔기 83-120을 엔코딩하는 cDNA 단편을 pE YFP-N1(Clontech)의 XhoⅠ/EcoRⅠ 지점 안으로 제일 먼저 삽입시키고, 그 후 EcoRⅠ/BamHⅠ을 이용한 하위 부위 안에서 CFP-SNAP-25(141-206) cDNA을 서브블로닝함으로서, SNAP-25(83-120)-CFP-SNAP-25(141-206)-YFP을 작제하였다. 전장 SybⅡ cDNA를 EcoRⅠ 및 BamHⅠ 부위의 pECFP-C1 벡터 안으로 제일 먼저 삽입하고, 전장 YFP cDNA를 XhoⅠ 및 EcoRⅠ 부위의 상단 안으로 삽입함으로서, YFP-Syb(FL)-CFP을 작제하였다. EcoRⅠ/BamHⅠ부위를 통해 YFP-Syb(FL)-CFP 컨스트럭트에서 전장 Syb를 교체함으로서, YFP-Syb(33-116)-CFP을 만들었다. 모든 cDNA 단편은 PCR을 통해 생성하였다.
단백질 정제 및 형광 스펙트럼 획득: His.sub.6-태깅된 CFP-SybⅡ-YEP 및 CFP-SNAP-25-YFP 단백질을 상술된 바와 같이 정제하였다(Chapman et al., A novel function for the second C2 domain of synaptotagmin. Ca.sup.2+-triggered dimerization. J. Biol. Chem. 271, 5844-5849 (1996)). 단백질을 HEPES 완충용액(50mM HEPES, pH 7.1)을 이용하여 밤새 투석하였다. 300nM 단백질을 2mM DTT 및 10.mu.M ZnCl.sub.2를 포함한 전체 부피 500.mu.l HEPES 완충용액 안의 큐벳 안에 넣었다. 450nM 내지 550nM의 방출 스펙트럼을 PTIQM-Ⅰ 형광계를 이용하여 수집하였다. 여기 파장은 434nM인데, 이것은 CFP의 경우 최적의 여기 파장이다.
보툴리눔 신경독소의 활성 및 생체-센서 단백질의 절단의 모니터링: 독소 중쇄로부터 경쇄를 감소시키기 위해, BoNT/ A, B, E 또는 F를 30분 동안 37℃에서, 2mM DTT 및 10.mu.M ZnCl.sub.2와 함께 인큐베이션시켰다. PTIQM-1 형광계를 이용한 실험의 경우, 10nM BoNT/A, E, 또는 50nM BoNT/B, F를 300nM의 상응하는 FRET 센서를 포함하는 큐벳 안으로 첨가하였다. 본원에 상술한 바와 같이, 독소 첨가 후 특정 시간 간격으로(예를 들어, 0, 2, 5, 10, 30, 60, 90분), 방출 스펙트럼을 수집하였다. 각 방출 스캔 마지막에서, 샘플의 적은 부분(30.mu.l)을 수집하고, SDS-로딩 완충용액과 혼합하고, 그 후 SDS-페이지 겔을 수행하였다. 상기 센서 단백질 및 상기 절단 생산물을 강화된 화학발광(ECL)(Pierce)을 이용하여 항-his.sub.6 항체와 함께 시각화하였다.
형광분광광도계를 이용한 실험의 경우, 300nM의 FRET 센서 단백질을 96-웰 플레이트에서 웰 당 100.mu.l 부피로 제조하였다. 다양한 농도의 BoNT를 각 웰에 첨가하고, 샘플을 434nM에서 여기시켰다. YFP 채널(527nM), 및 CFP 채널(470nM)의 방출 스펙트럼을 30초 간격으로 90분 동안 수집하였다. 각 데이타 포인트에 대한 YFP 채널 및 CFP 채널 사이의 비율에 의해 FRET 비율을 결정하였다.
독소 처리 후 살아있는 세포에서 FRET 비율의 변화를 측정: 전기천공법(Bio-Rad)을 이용하여 PC 12세포를 형질감염시키는데 DNA 컨스트럭트 pECFP-SNAP25-YFP을 사용하였다. 세포를 24시간 계대시키고, 형질감염 후, 50nM BoNT/A를 배양 배지 안에 첨가하였다. 72 시간 동안 독소와 함께 인큐베이션한 후, FRET 센서를 발현하는 세포의 형광 이미지를 Nikon TE-300 현미경을 이용하여 수집하였다. 각 세포의 두 개의 이미지(CFP 채널 및 FRET 채널)를 하기 필터 세트(Chroma Inc.)를 이용하여 수집하였다: CFP 채널: CFP 여기 필터(436/10nm), JP4 빔스프리터, CFP 방출 필터: (470/30nm); FRET 채널: CFP 여기 필터(436/10nm), JP4 빔스프리터, YFP 방출 필터(535/30nm). 백그라운드(세포를 포함하고 있지 않은 영역)를 각 이미지로부터 제외하고, 각 세포의 CFP 채널 및 FRET 채널의 형광 강도를 MetaMorph 소프트웨어를 이용하여 비교하였다. FRET 비율은 이미 상술한 바와 같이 FRET 채널 및 CFP 채널 사이의 강도 비율에 의해 결정된다. 대조군 세포는 독소로 처리하지 않았으나 동일한 방법으로 분석하였다. 살아있는 세포에서 BoNT/B를 테스트하기 위해, 본 발명자들은 본원에 상술한 것과 동일한 절차를 이용하여 sytⅡ를 발현하는 PC 12 세포주를 형질감염시켰다.
살아있는 세포 이미지화 및 FRET 분석: PC 12 세포를 전기천공법(Bio-Rad, CA)을 통해 해당 도면에 표시한 다양한 cDNA 컨스트럭트로 형질감염시켰다. 형광 이미지를 100배 오일-고배율 대물렌즈를 가진 Nikon TE-300 현미경을 이용하여 수집하였다. 살아있는 세포의 CFP/YFP FRET를 3개-필터 세트 방법을 이용한 확립된 방법을 이용하여 정량화하였다(Gordon et al., Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy. Biophys J. 74, 2702-2713 (1998); Sorkin et al., Interaction of EGF receptor and grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy. Curr. Biol. 10, 1395-1398 (2000)). 간략히, 3개 연속적인 이미지를 3개의 다른 필터 세트를 통해 각 세포에 대해 획득하였다: CFP 필터(여기, 436/10nm; 방출, 470/30nm), FRET 필터(여기, 436/10nm; 방출, 535/30nm), 및 YFP 필터(여기, 500/20nm, 방출, 535/30nm). JP4 빔스프리터(Set ID 86000, Chroma Inc. VT)를 사용하였다. 모든 이미지를 정확하게 동일한 세트(4.times.4 Binning, 200ms 노출 시간)를 이용하여 획득하였다. 형광 단백질의 높은 발현 수준으로부터 발생할 수 있는 농도-의존 FRET 신호를 배제하기 위해, 최대 12-비트 스케일(1-2097 그레이 스케일)의 반 값 이하의 CFP 및 YFP 강도를 가지는 세포만을 본 실험에서 계수하였다(Miyawaki et al., Monitoring protein conformations and interactions by fluorescence resonance energy transfer between mutants of green fluorescent protein. Methods Enzymol. 327, 472-500 (2000); Erickson et al., DsRed as a potential FRET partner with CFP and GFP. Biophys J 85, 599- 611 (2003)). FRET 값을 계산하기 전에, 각 원시 이미지로부터 백그라운드(세포를 포함하고 있지 않은 영역으로부터)를 제외하였다. 그 후 각 이미지의 형광 강도의 값을 획득하고 비교하였다. 상기 필터 세트에 대한 누화 값을 획득하기 위해, CFP 또는 YFP 단독으로 형질감염된 PC 12 세포를 우선 테스트하였다. FRET 필터 채널은 YFP의 경우 약 24%, 및 CFP의 경우 약 56-64%의 블리드-스루(bleed-through)를 나타낸다. YFP의 경우 CFP 필터를 이용하는 동안, 또는 CFP의 경우 YFP 필터를 이용하는 동안 실질적으로 누화가 존재하지 않고, 이것은 FRET 계산을 매우 단순화시킨다. 독소 센서를 발현하는 세포의 경우, "보정된 FRET" 값을 하기 방정식을 이용하여 계산하였다: FRET = FRET － (CFP.0.60) － (YFP.0.24), 여기서 FRET, CFP 및 YFP는 FRET, CFP 및 YFP 필터 세트, 각각을 통해 획득한 이미지의 형광 강도와 일치한다. FRET 필터 세트를 통해 이미지를 얻을 경우, CFP 및 YFP에서 나온 블리드-스루의 평균 소수부(fraction)는 각각 0.6 및 0.24이다. 시토졸에서 저하된(도 7c, e), CFP-SNAP25FL-YFP 센서의 독소 절단은 YFP 단편의 세포막 분리를 야기하기 때문에, 본 데이타 분석에서 사용된 FRET 비율은 "보정된 FRET"값을 CFP 형광 강도(보정된 FRET/CFP)만으로 표준화함으로서 계산되었다. 본 발명자들은 상기 계산에서 CFP 강도가 FRET가 발생 될 경우 공여체 급냉(quenching) 때문에 낮게 측정되었다는 것에 주의한다. 그러나, 공여체 급냉에 의한 CFP 형광의 감소가 약 5-10％ 뿐이라고 보고된바 있다(Gordon et al., Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy. Biophys J 74, 2702-2713 (1998); Sorkina et al., Oligomerization of dopamine transporters visualized in living cells by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J. Biol. Chem. 278, 28274-28283 (2003)). 모든 이미지 및 계산은 MetaMorph 소프트웨어(Universal Imaging Corp., PA)을 이용하여 수행하였다.
독소 처리에 관한 실험의 경우, 지시된 홀로독소를 다양한 시간동안 세포 배양 배지에 첨가하고, 그 후 세포를 본원에 상술한 바와 같이 분석하였다. 대조군 세포를 독소센서로 형질감염시켰으나 독소를 처리하지 않았고, 동일한 방법으로 분석하였다.
독소 기질 절단의 면역블롯 분석: 야생형 PC 12 세포 또는 SytⅡ＋PC 12 세포(Dong et al., 2003, supra)를 도면 설명에서 나타낸 바와 같은 다양한 독소 센서 cDNA 컨스트럭트로 형질감염시켰다. BoNT/A 또는 B를 형질감염 24시간 후 배양 배지에 첨가하고 세포를 또 다른 48시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후 세포를 수확하고, 세포 용해물에 이미 상술한 바와 같은 면역블롯 분석을 수행하였다. 대조군 세포를 동일한 cDNA 컨스트럭트로 형질감염시키고 독소로 처리되지 않은 것을 제외하고는 병렬 분석하였다. 대조군 세포 용해물의 3분의 1을 시험관에서 독소로 처리하고(200nM BoNT/A 또는 B, 30분, 37℃에서), 면역블룻 분석을 수행하였다. 내생성 SNAP-25 및 형질감염된 CFP-SNAP-25-YFP 센서를 항-SNAP-25 항체 26을 이용하여 분석하였다. CFP-SNAP-25-YFP 및 CFP-SybⅡ-YFP 센서 단백질 또한 GFP 폴리클로날 항체(Santa Cruz., CA)를 이용하여 분석하였다. 항-his6 항체(Qigen Inc., CA)를 재조합 센서 단백질 절단을 분석하는데 사용하였다.
실시예
1:
CFP
-
YFP
FRET
쌍 및 보툴리눔 신경독소 프로테아제 활성에 기반한 바이오 센서.
FRET 방법을 사용하여 보툴리눔 신경독소 프로테아제 활성을 모니터링하기 위해, CFP 및 YFP 단백질을 CFP-SybⅡ-YFP 및 CFP-SNAP-25-YFP 각각(도 1A)으로 표현된, sybⅡ 또는 SNAP-25 단편을 통해 연결시켰다. 거리 증가에 따라 기하급수적으로 감소하는, CFP-YFP 에너지 전달 효율을 최적화하기 위해, 독소 기질의 짧은 단편을 전장 단백질 대신에 사용하였다. 그러나, BoNT에 의한 절단 효율은 매우 짧아진 타겟 단백질 절편에 따라 상당히 감소한다. 따라서, 시냅토브레빈 서열의 아미노산 33-96을 포함하는 영역이, 전장 시냅토브레빈 단백질과 같이, BoNT/B, F, 및 TeNT에 의한 동일한 절단 속도를 유지한다고 보고되기 때문에 이를 사용하였다. 유사하게, 상기 컨스트럭트가 여전히 BoNT/A 및 E에 의해 인식되고 절단될 수 있다는 것을 보장하기 위해, SNAP-25의 잔기 141-206을 선택하였다.
FRET 분석을 도 1B에 도시하였다. 434nM(CFP의 최적의 여기 파장)에서 여기된 경우, CFP-SybⅡ-YFP 및 CFP-SNAP-25-YFP 키메라 단백질은 CFP-YFP 쌍 사이의 FRET 때문에 YFP 형광 방출을 유도할 것이다. 보툴리눔 신경독소는 CFP 및 YFP 사이의 짧은 기질 단편을 인식하고 절단할 수 있고, FRET 신호는 CFP 및 YFP가 분리된 후 파괴될 것이다. 이 키메라 단백질은 살아있는 세포에서 발현될 수 있기 때문에, 이것 또한 보툴리눔 신경독소에 대한 "바이오-센서"로서 표시된다.
본 발명자들은 CFP-SybⅡ-YFP, 및 CFP-SNAP-25-YFP의 his.sub.6-태깅된 재조합 키메라 단백질을 최초로 정제하였고, 이것의 방출 스펙트럼을 PTIQM-1 형광계를 이용하여 특징화하였다. 예상대로, 상기 두 바이오센서 단백질은 이들의 CFP가 434nM에서 여기될 때, 525nM에서 정확한 YFP 형광 피크를 보였다(도 2B, C). 반면에, YFP 단독은 434nM에서 직접적으로 여기될 때 적은 형광 신호만을 보냈다(도 2A). 개개의 CFP 및 YFP의 혼합물은 525nM에서 방출 피크를 가지지 않았다(도 2A). 이것은 바이오 센서 단백질을 이용하여 관찰된 YFP 형광 피크는 FRET에서 기인한다는 것을 설명하였다. FRET 비율(YFP 형광 강도/CFP 형광강도)은 완충용액 조성물, Zn.sup.2＋농도 및 환원제의 농도(데이타가 도시되지 않음)와 같은 많은 요인에 의해 영향을 받기 때문에, 그 후 실험은 모두 동일한 완충용액 조건(50mM Hepes, 2mM DTT, 10.mu.M ZnCl.sub.2, pH 7.1)에서 실행하였다. 보툴리눔 신경독소 프로테아제 활성을 최적화하기 위하여 2mM DTT 및 10.mu.M Zn.sup.2＋을 첨가하였다.
실시예
2: 시험관 내에서 보툴리눔 신경독소에 의한 바이오 센서 단백질 절단의
모니터링
300nM의 키메라 단백질 CFP-SybⅡ-YFP을 50nM의 미리-절단된(pre-reduced) BoNT/B 홀로독소와 큐벳 안에서 혼합하였다. BoNT/B를 첨가한 후 방출 스펙트럼을 각각 다른 시간 포인트에 수집하였다(0, 2, 5, 10, 30, 60 분 등). 각 스캔의 마지막에서, 샘플의 적은 부분(30.mu.l)을 큐벳으로부터 꺼내고 SDS-로딩 완충용액과 혼합하였다. 그 후 상기 샘플에 SDS-페이지 겔을 수행하고, 재조합 키메라 단백질 안의 his.sub.6 태그에 대항한 항체를 이용하여 키메라 단백질의 절단을 시각화하였다. 도 3A에 도시하였듯이, BoNT/B와 함께 바이오 센서 단백질의 인큐베이션은 YFP 방출의 감소 및 CFP 방출의 증가를 유발하였다. FRET 비율의 감소는 BoNT/B에 의한 키메라 단백질의 절단 정도와 일치한다(도 3A, 하단 패널). 이 결과는 바이오 센서 단백질의 절단은 FRET 비율의 변화를 기록함으로서 실시간으로 모니터링 될 수 있다는 사실을 설명한다.
BoNT/F에 의한 CFP-SybⅡ-YFP 절단, 및 BoNT/A 또는 E에 의한 CFP-SNAP-25-YFP 절단을 검출하기 위해 동일한 분석을 수행하였다(도 3B, C, D). BoNT/B를 이용한 실험에서 유사한 결과를 획득하였다. 모든 경우에 있어서, 본 발명자들은 광학 판독 및 면역블롯 블롯 분석 두 가지를 이용하여 동일한 기질 절단 동역학을 관찰하였다. BoNT/A 및 E는 상기 분석에서 그러한 것처럼 BoNT/B 및 F보다 훨씬 빠르게 그들의 키메라 기질을 절단하였다. 따라서, 처음 몇 분 안에 발생된 변화를 기록하기 위하여, BoNT/A 또는 E의 10nM만을 사용하였다. BoNT/B 및 F와 CFP-SNAP-25-YFP의 혼합, 또는 BoNT/A 및 E와 CFP-SybⅡ-YFP의 혼합은 어떠한 FRET 비율의 변화 또는 기질 절단을 야기하지 않았기 때문에(데이타 도시되지 않음), 키메라 단백질의 절단은 특이적이다.
실시예
3: 마이크로플레이트 형광분광광도계를 이용한 실시간 보툴리눔 신경독소 프로테아제 활성의
모니터링
상기 실험은 보툴리눔 신경독소의 활성은 그들의 타겟 바이오센서 단백질의 방출 스펙트럼의 변화를 모니터링함으로서 시험관내에서 검출될 수 있다는 것을 설명하였다. 따라서 본 발명자들은, 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 실시간으로 바이오 센서 단백질의 절단을 모니터링할 수 있는지 여부를 결정하였고--이것은 상기 분석을 미래의 고-처리량 스크리닝에 적합화시킬 수 있는 가능성을 입증할 것이다. 도 4A에 도시하였듯이, 300nM의 CFP-SNAP-25-YFP 키메라 단백질을 96-웰 플레이트에서 10nM BoNT/A와 혼합하였다. CFP를 436nm에서 여기시켰고 CFP 채널(470nM) 및 YFP 채널(527nM)의 형광을 30초 간격으로 90분에 걸쳐 기록하였다. BoNT/A의 첨가는 YFP 채널 방출의 감소 및 CFP 채널 방출의 증가를 야기하였다. 이 결과는 본 발명자들이 보툴리눔 신경독소의 효소 활성의 동역학을 여러 개의 샘플에서 실시간으로 추적할 수 있게 하였다. 예를 들어, 도 4B에서 도시했듯이, 다양한 농도의 BoNT/A 또는 E를 300nM의 CFP-SNAP-25-YFP에 첨가하고, 각 샘플의 FRET 정량을 도 4A에 도시하였듯이 동시에 모니터링하였다. FRET 비율의 변화는 독소 농도와 관련이 있었다--더 높은 독소 농도는 더 빠른 FRET 비율의 감소를 야기하였다. CFP-SNAP-25-YFP 단독이거나(도 4C, 왼쪽 패널) 또는 CFP 및 YFP 혼합물(도 4C, 오른쪽 패널)에서 어떠한 중요한 변화도 검출되지 않았기 때문에, 상기 FRET 비율의 변화는 특이적이다.
FRET 비율 변화를 이 단계에 있는 바이오센서 단백질의 실질적 절단과 서로 관련시키는 것은 어려움에도 불구하고, 상기 방법은 여러 개의 샘플 간에 상기 샘플이 동시에 제조되고 스캔 될 때 독소 절단 동역학을 비교하는 가장 쉬운 방법을 제공한다--이것은 어떻게 억제제가 독소 효소 활성에 영향을 미치는지에 대한 정보를 제공하기 때문에, 특히 고 처리량 스크리닝 독소 억제제에 유용하다. 본 발명자들은 상기 경우에 각 동역학 파라미터에 대한 단위는 기질 농도 대신에 FRET 비율일 것이라는 점에 주목하고 있다.
다양한 농도의 독소를 그들의 타겟 바이오 센서 단백질의 고정된 양과 함께 특정 기간 동안 인큐베이션 시킴으로서 FRET 기반 분석의 민감도를 결정하였다. 상기 FRET 비율을 마이크로플레이트 스펙트럼 형광계를 이용하여 기록하였고, 독소 농도에 대하여 작도하였다. 도 5A에서 도시했듯이, 이 방법은 4시간 인큐베이션 후 BoNT/A 및 E에 대해 유사한 민감도를 가지고(EC50은 BoNT/A의 경우 15pM, 및 BoNT/E의 경우 20pM, 상단 패널), 16시간 동안 인큐베이션은 검출 민감도를 약간 증가시켰다(도 5A, 하단 패널). BoNT/B 및 F에 대한 민감도는 서로 유사하지만, 4시간 인큐베이션한 BoNT/A 및 E보다 약 10배 낮다(도 5B, 상단 패널, EC50은 BoNT/B의 경우 242pM, 및 BoNT/F의 경우 207pM). 인큐베이션 기간의 16시간으로의 연장은 BoNT/B 및 BoNT/F 활성을 검출하는 능력을 각각 8배 및 2배 증가시켰다.
실시예
4: 살아있는 세포에서 보툴리눔 신경독소 활성의
모니터링
CFP-YFP 기반 바이오 센서 분석은 시험관 내에서 보툴리눔 신경독소를 검출하는데 사용될 뿐 아니라, 살아있는 세포에서도 사용될 수 있다. 상기 적용을 달성하기 위해, PC 12세포를 CFP-SNAP-25-YFP로 형질감염시켰다. PC 12 세포는 BoNT/A 및 E를 흡수할 수 있는 신경 내분비 세포주이다. 형질감염된 세포를 BoNT/A(50nM)와 함께 72시간 동안 인큐베이션 시키고, CFP-YFP FRET 검출을 위한 특별한 필터 세트를 갖춘 에피-형광 현미경을 이용하여, CFP-SNAP25-YFP를 발현하는 세포의 FRET 비율을 기록하였다. 간략히, FRET 비율은 두 개의 필터 세트(하나는 CFP(여기 437nm/방출 470nm), 및 또 다른 하나는 FRET(여기 437nm/방출 535nm))를 이용하여 수집된 동일한 세포로부터의 이미지의 형광광도 사이의 비율로서 계산되었다. 전체 53개의 세포를 수집하였고, 동일한 바이오센서 단백질을 발현하지만 독소에 노출시키지 않은 동일한 수의 대조군 세포와 비교하였다. 도 6A에서 도시했듯이, 72시간 동안 BoNT/A의 처리는 실험된 세포 집단의 FRET 비율을 상당히 감소시켰다(p<l.47E-05). 야생형 PC 12 세포는 BoNT/B 및 F에 민감하지 않다.
최근에 두 개의 시냅토타그민Ⅱ, BoNT/B의 수용체, 및 CFP-SybⅡ-YFP 바이오센서를 발현하도록 PC 12 세포주를 만들었다. 이 세포를 살아있는 세포에서 BoNT/B 활동을 검출하는데 사용하였다. 도 6B에서 도시했듯이, 72시간 동안 BoNT/B(30nM)의 처리는 세포안에서 발현된 바이오센서 단백질의 FRET 비율을 상당히 감소시켰다(p<2.1E-10). 본 발명자들은 여전히 두 개의 바이오센서 단백질에 대해 FRET 비율 변화를 보이지 않는 상당한 수의 세포가 존재한다는 것에 주목하였다. 몇 가지 가능한 해석이 있다. 첫째, 독소/바이오센서 단백질 비율이 상기 세포에서 매우 낮을 수 있고, 따라서, 바이오센서 단백질의 상당한 절단은 더 긴 인큐베이션 시간을 필요로 할 수 있다. 둘째, 상기 세포는 높은 수준의 단백질 합성 활성을 가질 수 있고, 따라서 신규한 바이오센서 단백질은 절단 생산물을 빠르게 대체하기 위한 합성물이다. 그럼에도 불구하고, 상기 실험은 살아있는 세포 및 신경세포에서 FRET 기반 분석을 택할 가능성을 설명한다.
실시예
5:
BoNT
의 세포 기반 검출
세포-기반 연구를 수행하기 위해, 본 발명자들은 우선 PC 12세포를 CFP-SNAP-25(141-206)-YFP 센서로 형질감염시켰다(도 7a). 상기 재료 및 물질 섹션에서 상술한 바와 같이, 도 2a에서 도시한 바와 같이, 에피-형광 현미경과 함께 확립된 세 가지 필터 세트 방법을 이용하여 살아있는 세포의 FRET 신호를 획득하였다(Gordon 등, Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy. Biophys. J. 74, 2702-2713 (1998); 및 Sorkin 등, Interaction of EGF receptor and grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer(FRET) microscopy. Curr. Biol. 10, 1395-1398 (2000)). 형질감염된 PC 12 세포를 96시간 동안 50nM BoNT/A로 처리하였다. 이들의 형광 이미지를 분석하고 표준화된 FRET 비율(보정된 FRET/CFP)를 도 7b에 블롯팅하였다. SNAP-25(141-206) 단편이 시험관 내에서 전장 SNAP-25와 유사한 독소 절단 속도를 가지는 것으로 보고되었으나(Washbourne 등, Botulinum neurotoxin types A and E require the SNARE motif in SNAP-25 for proteolysis. FEBS Lett. 418, 1-5 (1997)), CFP-SNAP-25(141-206)-YFP는 살아있는 세포에서 독소 기질이 부족한 것으로 나타났다. 96시간 동안의 BoNT/A(50nM)의 인큐베이션은 세포 집단 사이에서 매우 작은(그러나 중대한) FRET 비율의 이동을 나타냈고, 이는 상기 절단이 세포 안에서 불충분하고, 상기 센서는 세포 안에서 독소 검출에 실용적이지 않다는 것을 나타낸다.
놀랍게도, 본 발명자들은 SNAP-25가 206개의 아미노산 잔기 길이라는 사실에도 불구하고, 전장 SNAP-25를 CFP 및 YFP 사이에 링커로서의 이용하는 것은 PC 12 세포에서 발현되었을 때 상당한 수준의 FRET를 산출한다는 것을 발견하였다(도 7c, 및 8c). 이 FRET 신호는 SNAP-25 안의 팔미토일화 부위(Cys 85, 88, 90, 92 Ala)의 돌연변이가 단백질의 시토졸 분배를 야기하고(CFP-SNAP-25(Cys-Ala)-YFP로서 표시됨), FRET 신호를 상당히 감소시키기 때문에(도 7d), SNAP-25의 세포막 고정에 의존한다(Lane & Liu, Characterization of the palmitoylation domain of SNAP-25.J. Neurochem. 69, 1864-1869 (1997); Gonzalo 등, SNAP-25 is targeted to the plasma membrane through a novel membrane-binding domain.J. Biol. Chem. 274, 21313-21318 (1999); Koticha 등, Plasma membrane targeting of SNAP-25 increases its local concentration and is necessary for SNARE complex formation and regulated exocytosis.J. Cell Sci. 115, 3341-3351 (2002); Gonelle-Gispert 등, Membrane localization and biological activity of SNAP-25 cysteine mutanats in insulin-secreting cells.J. Cell Sci. 113 (Pt 18), 3197-3205 (2000)). 이 발견은 SNAP-25의 세포막 고정이 SNAP-25의 N-말단 및 C-말단을 서로에게 근접시키는 구조적 변화를 야기할 수 있음을 시사한다. 이 센서는 CFP-SNAP-25(FL)-YFP로 표시된다. 50nM BoNT/A와 CFP-SNAP-25(FL)-YFP을 발현하는 세포의 인큐베이션은 시간에 따른 FRET 비율의 단계적인 감소를 야기하였다(도 7c, 오른쪽 패널). 상기 센서의 BoNT/A 절단은 두 개의 단편을 야기하였다: 세포막에 남겨진 CFP로 태깅된 SNAP-25의 N-말단 단편(도 2c, 중간 패널), 및 독소 절단 후 시토졸 안으로 재분배된 것으로 예상된, YFP로 태깅된 SNAP-25의 짧은 C-말단 단편. 흥미롭게도, 본 발명자들은 C-말단 절단 생산물, SNAP-25(198-206)-YFP이 독소 절단 후 주로 사라진 것에 주목하였다(도 2c, 중간 패널에 "YFP" 프레임). 이 관찰은 면역블롯 분석에 의해 확인되었고(도 7e), 이는 상기 가용성 단편은 세포막에 남겨진 기타 단편보다 훨씬 빠르게 저하된다는 것을 나타낸다. 이 예상치 못한 결과는 CFP 및 YFP 형광 사이의 비율을 단순히 모니터링함으로서 살아있는 세포에서 독소 활성을 검출하는 대안적 방법을 제공한다.
BoNT/A 경쇄는 세포막 편재화 신호를 포함하고, 식별된 PC 12 세포안의 원형질막을 타겟으로 한다는 것이 최근 보고되었다(Fernandez-Salas 등, Plasma membrane localization signals in the light chain of botulinum neurotoxin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 3208-3213 (2004)). 따라서, 본 발명자들은 SNAP-25의 세포막 고정이 BoNT/A에 의한 효과적인 절단에 중요하다는 가능성을 조사하였다. 이 아이디어를 직접적으로 테스트하기 위해, 시토졸 내에 분포된 CFP-SNAP-25(Cys-Ala)-YFP(도 7d), 및원형질 막에 고정된 CFP-SNAP-25(FL)-YFP을 PC 12 세포를 형질감염시키는데 사용하였고, 세포 내의 BoNT/A에 의한 절단에 대해 병렬 분석하였다. 도 7e에서 나타냈듯이, BoNT/A과의 세포의 인큐베이션은 상당한 양의 CFP-SNAP-25(FL)-YFP 센서의 절단을 야기한 반면, 동일한 분석 조건하에서 CFP-SNAP-25(Cys-Ala)-YFP의 검출가능한 절단은 없었다.
이 발견을 추가적으로 확인하기 위하여, 본 발명자들은 또한 GFP를 원형질막에 타겟팅 할 수 있는 SNAP-25의 짧은 단편(잔기 83-120)을 이용하여 SNAP-25(141-206)을 포함하는 불충분한 센서를 원형질막에 타겟팅하였다(Gonzalo 등, SNAP-25 is targeted to the plasma membrane through a novel membrane-binding domain. J. Biol. Chem. 274, 21313-21318 (1999))(도 8a). 예상했듯이, 원형질막에 CFP-SNAP-25(141-206)-YFP 센서의 고정은 BoNT/A에 의한 효과적인 절단을 야기하였다(도 8b). 이 발견은 SNAP-25의 하위-세포 편재화는 세포 안에서 BoNT/A에 의한 효과적인 절단에 실제로 중요하다는 것을 나타낸다.
본 발명자들은 다음으로 CFP-Syb(33-94)-YFP 센서가 세포 안에서의 BoNT/B 활성을 분석하는데 사용될 수 있는지 여부에 대해 테스트하였다. 이 연구에서, 본 발명자들은 BoNT/B 삽입을 세포 안으로 매개하는 시냅토타그민Ⅱ를 발현시키는 PC 12 세포주를 사용하였다(Dong 등. Synaptotagmins Ⅰ and Ⅱ mediate entry of botulinum neurotoxin B into cells. J. Cell Biol. 162, 1293-1303 (2003)). 도 9a에서 도시했듯이(상단 패널), 형질감염된 CFP-Syb(33-94)-YFP는 상기 세포 도처에 존재하는 가용성 단백질이다. CFP-SNAP-25(141-206)-YFP의 경우와 유사하게, BoNT/B (50nM, 96hr)의 처리는 FRET 비율을 단지 약간 감소시켰고(도 9a, 하단 패널), 이는 상기 센서의 절단 또한 세포 안에서 불충분하다는 것을 나타낸다.
BoNT/A 센서를 이용한 본 실험은 Syb의 하위-세포 편재화가 BoNT/B에 의한 Syb 절단에 중요한지 여부를 조사하도록 본 발명자들을 자극하였다. 내생성 Syb는 116개 아미노산 잔기 길이이고, 단일 트랜스멤브레인 도메인(잔기 95-116, 도 9b)을 통해 분비 소포에 존재한다. 적당한 소포성 편재화를 보장하기 위해, 본 발명자들은 전장 Syb를 CFP 및 YFP 사이의 링커로 사용하였다. CFP는 상대적으로 소포 루멘에서 산성 환경에 저항적이기 때문에(Tsien, The green fluorescent protein. Annu. Rev Biochem 67, 509-544 (1998)), 상기 CFP는 Syb의 C-말단과 융합되고 소포 안에 존재하는 것으로 예측되는 반면, YFP는 Syb의 N-말단과 융합하고 시토졸을 향한다(도 9b). 이 센서는 YFP-Syb(FL)-CFP로 표시된다. FRET가 CFP 및 YFP 사이에서 발생할 가능성이 없기 때문에, BoNT/B에 의한 절단을 모니터링하기 위해 새로운 접근법을 수행하였다. YFP-Syb(FL)-CFP 센서의 절단은 시토졸 안으로 분비될 YFP으로 태깅된 N-말단 부분 및 소포 안에서 제한된 CFP로 태깅된 짧은 C-말단 부분을 포함하는, 두 개의 단편을 생성할 것이다. 따라서, 독소 활성은 세포 안의 YFP 형광의 재분배를 야기할 것이다. YFP-Syb(FL)-CFP는 세포 안의 효과적인 독소 센서임이 입증되었다. 도 9c에서 나타나듯이, BoNT/B의 처리는 소포로부터 YFP의 분해 및 시토졸 내로의 이것의 재분배를 야기하였다. 본 발명자들은 가용성 YFP 단편이 독소 처리에 앞서 형광 신호가 존재하지 않는(도 9c), 핵 안으로 들어갈 수 있고, 상기 핵은 YFP 재분배가 쉽게 검출될 수 있는 장소를 제공한다는 사실에 주목하였다. FRET 분석과 다르게, 이 검출 방법은 CFP 및 YFP 사이의 짧은 거리를 필요로 하지 않고, 따라서 살아있는 세포에서 프로테아제 활성을 모니터링하는 새로운 접근법을 제공하였다.
Syb(33-94) 단편을 포함하는 센서의 불충분한 절단이 N-말단의 32 아미노산의 결핍에 의한 것일 가능성을 배제하기 위해, N-말단 32개 잔기가 부족한 Syb의 절단된 형태(CFP-Syb(33-116)-YFP라고 표시됨)를 포함하는 센서를 만들었다. 상기 센서는 불충분한 센서와 함께 Syb의 동일한 세포질 도메인(잔기 33-94), 소포에 이를 고정하는, 트랜스멤브레인 도메인(잔기 95-116)을 추가하여 포함한다. 병렬 분석될 경우, 상당한 양의 CFP-Syb(33-116)-YFP가 48시간 후 BoNT/B에 의해 절단되었고, 반면 CFP-Syb(33-94)-YFP의 검출가능한 절단은 존재하지 않았고(도 9d), 이는 상기 소포 편재화가 세포 안에서 절단 효율을 결정한다는 것을 나타낸다. 이 결론은, 음으로 하전된 지질 혼합물의 존재가 시험관 안에서 BoNT/B, TeNT, and BoNT/F에 의한 Syb의 절단 속도를 강화하였다는 최근 보고에 의해 추가적으로 지지된다(Caccin 등, VAMP/synaptobrevin cleavage by tetanus and botulinum neurotoxins is strongly enhanced by acidic liposomes. FEBS Lett. 542, 132-136 (2003)). 독소가 세포 안에서 소포 세포막에 결합하는 것을 선호할 수 있고, 이에 따라서 소포 위에 편재화된 Syb으로 들어갈 기회가 증가한다. 대안적으로, 또한 트랜스멤브레인 도메인의 존재는 효과적 절단에서 요구되는 Syb의 적절한 구조적 상태를 유지하는데 중요할 수 있다는 것 또한 가능하다.
전장 SNAP-25 및 SybⅡ를 링커로서의 이용은 살아있는 세포에서 내생성 기질 절단을 반영할 수 있는 우수한 최적의 리포터를 제공하였다. 이 두 리포터는 전체 7개의 보툴리눔 신경독소 및 파상풍 신경독소(TeNT)를 검출할 수 있어야 한다. 상기 기질 링커 서열은 길이를 변화하거나 기타 독소 절단 또는 인식 부위를 돌연변이 시킴으로서, 개개의 BoNT 또는 TeNT에 대한 특이적 검출을 달성하도록, 쉽게 변형될 수 있다. 이 독소 바이오센서는 독소 억제제의 세포-기반 스크리닝 및 세포 안의 독소 기질 인식 및 절단의 연구를 가능하게 해야한다.
앞서 말한 상세한 설명 및 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위해 나열한 것일 뿐 이에 제한되기 위해 의도되지 않았다. 본 발명의 기질 및 사상에 통합한 개시된 구체예의 변형은 당업자가 생각할 수 있기 때문에, 본 발명은 덧붙인 청구항 및 이의 등가 범위 안에 떨어지는 모든 변형을 포함하도록 넓게 해석되어야 한다. 본원에 인용된 및/또는 하기 나열된 모든 참조는 특별히 참조로서 본원에 통합된다.
이미 상술된 것 이외에 더 많은 변형이 본원 발명 컨셉으로부터 벗어나지 않고 가능하다는 것이 당업자에게 분명해야 한다. 따라서, 본 발명의 발명 주제는 첨부된 특허청구범위의 기술사상을 제외하고 제한되지 않는다. 게다가, 상세한 설명 및 청구항 둘 모두의 해석에서, 모든 용어는 본문과 일치하는 가능한 가장 넒은 방법으로 해석되어야 한다. 특히, 용어 "포함한다" 및 "포함하는"은 인자, 성분, 또는 비 배타적 방법의 단계에 관한 것으로 해석되어야 하고, 이는 참조된 인자, 성분 또는 단계가 존재하거나, 이용되거나, 기타 인자, 성분 또는 특별히 참조되지 않은 단계와 결합되었음을 나타낸다. 명세서의 청구항이 A, B, C .... 및 N으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것을 인용하는 경우, 그러한 기재는 상기 그룹으로부터 단지 하나의 인자만을 필요로 하는 것으로서 해석되어야 한다(A 플러스 N 또는 B 플러스 N이 아님 등).
SEQUENCE LISTING
<110> BioSentinel, LLC
<120> Resonance Energy Transfer With Cleavage Sequence And Spacer
<130> 101666.0001US
<140> US 12/059,570
<141> 2008-03-31
<150> 60/972673
<151> 2007-09-14
<160> 10
<170> PatentIn version 3.4
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Putative minimum recognition sequence BoNT/A
<400> 1
Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Putative minimum recognition sequence BoNT/B
<400> 2
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Putative minimum recognition sequence BoNT/C (SNAP25)
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Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met
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<213> Artificial
<220>
<223> Putative minimum recognition sequence (syntaxin)
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<223> Putative minimum recognition sequence BoNT/F
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<213> Artificial
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<211> 5
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic linker (can be repeated between 1-3 times, inclusive)
<400> 8
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1 5
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<212> PRT
<213> Artificial
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> CFP is covalently attached to amino group of serine
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<221> MISC_FEATURE
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<220>
<223> Synthetic substrate
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> CFP is covalently attached to amino group of serine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(8)
<223> Synaptobrevin is covalently inserted between alanine and serine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> YFP is covalently attached to the carboxylic acid group of serine
<400> 10
Ser Gly Leu Arg Ser Arg Ala Ser Asn Ser
1 5 10
Claims (25)
- 공여체(donor)가 수용체(acceptor)에 쌍극자-쌍극자 커플링 메카니즘에 의해 에너지를 전달할 수 있도록, 전자 커플링을 제공하는 위치에 있는, 공여체 라벨 및 수용체 라벨;
절단 부위 서열을 지니는 공여체 및 수용체 사이에 배치된 링커와, 상기 공여체와 상기 절단 부위 서열 사이 및 상기 수용체와 상기 절단 부위 서열 사이 중 하나 이상의 사이에서의 스페이서;를 갖고,
상기 스페이서가 스페이서 없는 상응하는 컨스트럭트(construct)와 비교하여, 상기 공여체 라벨에서 상기 수용체 라벨까지의 에너지 전달에 기반한 분석의 증가된 민감도를 제공하기 위해 형성되고, 그리고 상기 링커 또는 스페이서는 SNARE 모티프를 포함하는 컨스트럭트. - 제 1항에 있어서, 하나 이상의 상기 공여체 및 상기 수용체가 하나 이상의 형광체(fluorophore) 및 색소체(chromophore)인, 컨스트럭트.
- 제 1항에 있어서, 상기 쌍극자-쌍극자 커플링 메카니즘이 포스터 공명 에너지 전달(Forster resonance energy transfer, FRET)인, 컨스트럭트.
- 제 1항에 있어서, 상기 링커가 5nm 이상의 1차 구조 길이를 가지는, 컨스트럭트.
- 제 1항에 있어서, 상기 링커가 8nm 이상의 1차 구조 길이를 가지는, 컨스트럭트.
- 제 1항에 있어서, 상기 링커가 12nm 이상의 1차 구조 길이를 가지는, 컨스트럭트.
- 제 1항에 있어서, 상기 링커가 3개 이상의 아미노산을 가지는 스페이서를 포함하는, 컨스트럭트.
- 제 7항에 있어서, 상기 링커가 SNARE 모티프를 포함하는, 컨스트럭트.
- 제 7항에 있어서, 상기 스페이서가 5개 이상의 아미노산을 가지는, 컨스트럭트.
- 제 7항에 있어서, 상기 스페이서가 n이 1-3인, (GGGGS)n을 포함하는, 컨스트럭트.
- 제 7항에 있어서, 상기 스페이서가 n이 1-3인, (EAAAK)n을 포함하는, 컨스트럭트.
- 제 1항에 있어서, 상기 스페이서가 10개 이상의 아미노산을 포함하고, 스페이서 없는 상응하는 컨스트럭트에 비하여 전자 커플링을 증가시키는, 컨스트럭트.
- 제 1항에 있어서, 상기 스페이서가 SNARE 모티프를 포함하는, 컨스트럭트.
- 제 1항에 있어서, 상기 절단 부위 서열이 SNARE 단백질 뮤테인(mutein)을 포함하는, 컨스트럭트.
- 제 1항에 있어서, 상기 절단 부위 서열이 (a) 하나 이상의 SNARE 단백질, 모티프, 뮤테인, 및 (b) 5개 이상의 아미노산을 지니는 스페이서를 포함하는, 컨스트럭트.
- 제 15항에 있어서, 상기 스페이서가 n이 1-3인, (GGGGS)n 및 (EAAAK)n으로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함하는, 컨스트럭트.
- 제 1항에 있어서, 상기 컨스트럭트가 CFP-(SGLRSRA)-SNAP-25-(SNS)-YFP, 및 CFP-(SGLRSRA)-시냅토브레빈-(SNS)-YFP으로 이루어진 군에서 선택된, 컨스트럭트.
- 공여체 라벨 및 수용체 라벨 사이의 에너지 전달 민감도를 향상시키는 방법으로서,
링커를 통해 물리적으로 연결된 상기 공여체 라벨 및 상기 수용체 라벨을 포함하는 컨스트럭트를 제공하는 단계, 여기서 상기 링커는 SNARE 모티프를 포함하고;
상기 링커 안에 절단 부위 서열을 포함시키는 단계; 및
상기 공여체와 상기 절단 부위 서열 사이 및 상기 수용체와 상기 절단 부위 서열 사이의 하나 이상의 사이에서의 스페이서를 상기 링커 안에 포함시켜, 그로인해 상기 스페이서가 형성됨으로서, 스페이서가 없는 상응하는 컨스트럭트와 비교하여, 상기 공여체 및 상기 수용체 사이에 증가된 전자 커플링을 제공하는 단계를 포함하는,
공여체 라벨 및 수용체 라벨 사이의 에너지 전달 민감도 향상 방법. - 제 18항에 있어서, 상기 컨스트럭트가 단백질-기반 컨스트럭트이고, 상기 링커가 펩티드 서열인, 방법.
- 제 18항에 있어서, 상기 절단 부위 서열이 SNARE 단백질, 또는 SNARE 단백질의 단편 또는 이의 뮤테인을 포함하고, 상기 스페이서가 5개 이상의 아미노산을 포함하는, 방법.
- 제 18항에 있어서, 상기 스페이서가 n이 1-3인, (GGGGS)n 및 (EAAAK)n으로 이루어진 군에서 선택된 서열을 포함하는, 방법.
- 제 18항에 있어서, 상기 스페이서가 3개 이상의 아미노산을 포함하고, 상기 공여체 및 상기 수용체 사이의 제 3차 구조의 거리를 감소시킴으로서, 상기 공여체 및 상기 수용체 사이의 상기 전자 커플링을 증가시키는, 방법.
- 제 18항에 있어서, 상기 스페이서가 3개 이상의 아미노산을 포함하고, 상기 공여체 및 상기 수용체 사이의 전자 홉(electronic hop)을 제공함으로서, 상기 공여체 및 상기 수용체 사이의 전자 커플링을 증가시키는, 방법.
- 제 18항에 있어서, 분석(assay)을 전체 세포에 적용시키는, 방법.
- 보툴리눔 신경독소를 검출하는 방법으로서,
a) 링커가 검출되는 보툴리눔 신경독소의 기질 단백질 또는 이의 절단 가능한 단편인, 제 1항의 컨스트럭트를 제공하는 단계,
b) 보툴리눔 신경독소가 상기 기질 단백질 또는 이의 단편을 절단하는 조건 하에서, 보툴리눔 신경독소가 포함되어 있다고 의심되는 샘플에 상기 컨스트럭트를 노출시키는 단계, 및
c) 상기 컨스트럭트가 샘플에 노출되기 전과 후의 FRET 신호를 검출하고 비교하는 단계로서, 상기 FRET의 감소가 샘플 안의 보툴리눔 신경독소의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함하는,
보툴리눔 신경독소 검출 방법.
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