WO2022259904A1 - プロテアーゼ活性測定用の融合タンパク質基質 - Google Patents

プロテアーゼ活性測定用の融合タンパク質基質 Download PDF

Info

Publication number
WO2022259904A1
WO2022259904A1 PCT/JP2022/022041 JP2022022041W WO2022259904A1 WO 2022259904 A1 WO2022259904 A1 WO 2022259904A1 JP 2022022041 W JP2022022041 W JP 2022022041W WO 2022259904 A1 WO2022259904 A1 WO 2022259904A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protease
protein
fusion protein
activity
region
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/022041
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
健司 小川
Original Assignee
国立研究開発法人理化学研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立研究開発法人理化学研究所 filed Critical 国立研究開発法人理化学研究所
Priority to JP2023527625A priority Critical patent/JPWO2022259904A1/ja
Publication of WO2022259904A1 publication Critical patent/WO2022259904A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase

Definitions

  • the present invention relates to a fusion protein substrate for protease activity measurement, a protease activity measurement kit, and a method for measuring protease activity.
  • the ISG15 protein contains two ubiquitin-like domains, and like ubiquitin, it is used for post-translational modification (ISG15 modification) by being added to target proteins in cells.
  • ISG15 protein expression is induced by interferon stimulation and viral infection, and ISG15 modification is known to play an important role in innate immunity such as antiviral immunity.
  • ISG15 modification is important for antiviral activity against influenza virus, herpes virus, togavirus, and the like (Non-Patent Document 1).
  • ISG15 conjugation contributes to resistance to intracerebral inoculation of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) and vesicular stomatitis virus (VSV) (Non-Patent Document 2).
  • LCMV lymphocytic choriomeningitis virus
  • VSV vesicular stomatitis virus
  • De-ISG15ylation is a reaction that cleaves portions of the ISG15 protein from the ISG15-modified protein.
  • De-ISG15ase is a type of protease enzyme, examples of which include the Nsp3 protein of coronaviruses and the L protein of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus. Inhibition of the de-ISG15ase activity of viral proteins is expected to inhibit viral replication and at the same time activate the host's immunity.
  • An object of the present invention is to provide a new method for measuring protease activity that is capable of high throughput and that enables activity measurement based on the full-length amino acid sequence of protease.
  • the present inventors created a new fusion protein substrate for measuring protease activity, containing a signal sequence, reporter region, protease target region, and transmembrane domain.
  • this fusion protein substrate is introduced into cells together with viral protease and expressed on the membrane, fragments cleaved by protease activity are released outside the cells. Protease activity can be measured by detecting the reporter activity of the released fragment in the cell supernatant.
  • a protease of coronavirus SARS-CoV2 the present inventors succeeded in detecting its de-ISG15ase activity.
  • a fusion protein substrate for measuring protease activity in order from the N-terminal side, Said fusion protein substrate comprising (i) a signal sequence, a reporter region, a protease targeting region and a membrane binding region or (ii) a signal sequence, a protease targeting region, a reporter region and a membrane binding region.
  • the viral protease belongs to the family Coronaviridae, Retroviridae, Asphaviridae, Flaviviridae, Caliciviridae, Picornaviridae, Poxviridae, Herpesviridae, Adenoviridae, Togaviridae, or The fusion protein substrate according to (2), derived from the family Matonaviridae.
  • the fusion protein substrate of (3), wherein the target region of a viral protease from the Coronaviridae family comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, 12, or 13.
  • the target region of a viral protease derived from Flaviviridae comprises any amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 73-77, 80-84, and 86-90; The described fusion protein substrate.
  • the fusion protein substrate of (2), wherein the target region of the deubiquitinating enzyme comprises ubiquitin protein, SUMO protein, or ISG15 protein.
  • the ubiquitin protein has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 or 59, an amino acid sequence having 90% or more amino acid identity to either of them, or one or more amino acids missing in any of them;
  • the SUMO protein has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 47, 56, 48, 57, 49, 58, or 60, an amino acid sequence having 90% or more amino acid identity with any of them, or any of them
  • the ISG15 protein has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 55, an amino acid sequence having 90% or more amino acid identity to either one, or one or more amino acids missing in either one.
  • (16) A host cell containing the gene expression vector of (15).
  • the fusion protein substrate according to any one of (1) to (13), the nucleic acid according to (14), the gene expression vector according to (15), and the host according to (16) and (17) A protease activity measurement kit comprising one or more selected from the group consisting of cells.
  • a method for measuring protease activity comprising reacting a host cell expressing a fusion protein substrate for protease activity measurement in solution with a protease to be tested, wherein the fusion protein substrate is on the N-terminal side.
  • a recovery step of recovering a supernatant from the solution after the reaction comprising a signal sequence, a reporter region, a protease target region, and a membrane-binding region in order from , and a measurement step of measuring the reporter activity based on the reporter region in the supernatant.
  • the above method comprising (20) A method for measuring protease activity, comprising reacting a host cell expressing a fusion protein substrate for protease activity measurement in solution with a protease to be tested, wherein the fusion protein substrate is on the N-terminal side.
  • the method comprises a signal sequence, a protease target region, a reporter region, and a membrane binding region in order from , and a measuring step of measuring reporter activity based on the reporter region in host cells after reaction.
  • a new protease activity measurement method that enables high-throughput and activity measurement based on the full-length amino acid sequence of the protease.
  • FIG. 2 shows an alignment of the amino acid sequences of ISG15 proteins.
  • FIG. 3 shows the structure of the ssISG sensor expression plasmid and ssISG sensor.
  • Figure 2A shows the structure of the ssISG sensor expression plasmid.
  • Figure 2B shows the structure of the ssISG sensor.
  • FIG. 2 shows the structure of the coronavirus polyprotein PP1ab.
  • the PP1ab protein is cleaved by the protease activity of the Nsp3 and Nsp5 proteins into 15 nonstructural proteins (Nsp1-Nsp16). Gray triangles indicate cleavage sites of the Nsp3 protein, and black triangles indicate cleavage sites of the Nsp5 protein.
  • FIG. 3 shows the structure of the ssISG sensor expression plasmid and ssISG sensor.
  • Figure 2A shows the structure of the ssISG sensor expression plasmid.
  • Figure 2B shows the structure of
  • FIG. 3 shows the structure of the ssNsp3 expression plasmid and ssNsp3 protein.
  • Figure 4A shows the structure of the ssNsp3 expression plasmid.
  • Figure 4B shows the structure of the ssNsp3 protein.
  • PL2 pro exhibits a papain-like protease domain.
  • FIG. 2 is a diagram showing exemplary principles and results of a method for evaluating de-ISG15 activity.
  • FIG. 5A shows an example of the principle of the method for evaluating de-ISG15 activity.
  • FIG. 5B shows the results of detection of luciferase activity in the culture supernatant of cells expressing ssNsp3(WT) protein or ssNsp3(CHAA) protein together with the ssISG sensor.
  • FIG. 5C shows the result of detecting luciferase activity in the culture supernatant of cells expressing ssNsp3(WT) protein with a signal sequence on the N-terminal side or Nsp3(-ss) protein without a signal sequence together with the ssISG sensor. .
  • FIG. 2 shows the structure of ssISG sensors and the results of evaluating the de-ISG15 activity for each ssISG sensor.
  • FIG. 6A shows the structures of ssISG sensor (GG), ssISG sensor (AA), ssISG sensor ( ⁇ D1), and ssISG sensor ( ⁇ D1+2).
  • FIG. 2 shows the structures of the coronavirus polyprotein PP1ab and ssPRO-TM sensor.
  • the PP1ab protein is cleaved by the protease activity of the Nsp3 and Nsp5 proteins into 15 nonstructural proteins (Nsp1-Nsp16). Gray triangles indicate cleavage sites of the Nsp3 protein, and black triangles indicate cleavage sites of the Nsp5 protein. The sequences of cleavage sites between Nsp4/Nsp5 and between Nsp5/Nsp6 are shown on the right side of the figure. The lower part of the figure shows the structure of the PRO-TM sensor. Fig.
  • FIG. 3 shows the structures of the HTLV-1 polyprotein GAG-PRO-POL and ssPRO-TM sensor. GAG-PRO-POL proteins are cleaved by the protease activity of PRO proteins into individual proteins such as GAG proteins and PRO proteins. The center of the figure shows the 7 sequences cleaved by the PRO protein. Fig.
  • FIG. 4 shows the results of evaluating the inhibitory activity of the protease inhibitor GC376.
  • Figure 11A shows the structure of the protease inhibitor GC376.
  • FIG. 11B shows the results of protease activity evaluation of SARS-CoV2 Nsp3 and Nsp5 proteins and HTLV-1 PRO protein under different GC376 concentration conditions.
  • FIG. 11C shows the results of measuring cell viability after culture using the WST8 assay.
  • FIG. 2 shows the structures of African swine fever virus polyproteins pp220 and pp60.
  • the pp220 protein is cleaved by the S273R protease to yield 5 proteins.
  • the pp60 protein also gives rise to three proteins.
  • a black triangle indicates the cleavage site of the S273R protease.
  • FIG. 2 shows the structure of ssPRO-TM sensor containing the target sequence of S273R protease. The 6 types of sequences to be cleaved are shown at the top of the figure.
  • Fig. 2 shows the results of detection of luciferase activity in the culture supernatant of cells expressing the pS273R (WT or C232A) protein together with the ssPRO-TM sensor.
  • FIG. 4 shows the results of evaluating the structure and protease activity of each sensor.
  • FIG. 15A shows the structures of hSUMO-1 sensor, hSUMO-2 sensor, hISG15 sensor and 2xUb sensor.
  • a first aspect of the present invention is a fusion protein substrate for measuring protease activity.
  • the fusion protein substrates of the present invention comprise an N-terminal signal sequence and a C-terminal membrane binding region, with a reporter region and a protease targeting region in between. A fragment containing the reporter region is detected when the fusion protein substrate of this embodiment is cleaved by a protease.
  • ISG15 Interferon-Stimulated Gene 15 kDa protein
  • ISG15 protein is a protein containing ubiquitin-like domain 1 and ubiquitin-like domain 2 (Fig. 1). Like ubiquitin, ISG15 protein functions in post-translational modification by being attached to other proteins.
  • ISG15 proteins include ISG15 proteins derived from any species. Specific examples include human ISG15 protein (for example, mature human ISG15 protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, or precursor human ISG15 protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 34), and orthologs thereof. Examples of orthologues of the human ISG15 protein include the precursor porcine ISG15 protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 35, the feline ISG15 protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36, and the bovine ISG15 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37. proteins (Fig. 1).
  • porcine and human ISG15 proteins are produced as precursor proteins, the amino acid sequence on the C-terminal side of the "LRLRGG” sequence (in humans, the sequence consists of 8 amino acids) is removed to give mature ISG15 proteins.
  • feline and bovine ISG15 proteins are produced as mature forms with the C-terminal sequence "LRLRGG” (Fig. 1).
  • the "ISG15 gene” is a gene that encodes the ISG15 protein.
  • Specific examples of the ISG15 gene include the ISG15 gene encoding the mature or precursor ISG15 protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 34, such as the human ISG15 gene consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 38 or 39. mentioned.
  • ISG15 modification refers to protein modification in which an ISG15 protein is added to a target protein.
  • ISG15 protein covalently binds mainly to lysine residues of the target protein.
  • ISG15 modification is a post-translational modification, and like ubiquitination, it is catalyzed by three types of enzymes: ubiquitin activating enzyme (E1), ubiquitin conjugating enzyme (E2), and ubiquitin ligase (E3).
  • E1 ubiquitin activating enzyme
  • E2 ubiquitin conjugating enzyme
  • E3 ubiquitin ligase
  • ISG15 demodification is a reaction that breaks the bond between the ISG15 protein and its bound target protein.
  • the amide bond is cleaved at the C-terminal position of the "LRLRGG” sequence usually located at the C-terminal of the mature ISG15 protein by hydrolysis or elimination reaction.
  • De-ISG15ylation modification is involved in the protease reaction.
  • ISG15 de-ISG15 enzyme is an enzyme that catalyzes ISG15 de-modification.
  • De-ISG15ase is a kind of protease.
  • De-ISG15 enzymes include virus-derived enzymes and host-derived enzymes. Examples of virus-derived de-ISG15 enzymes include the Nsp3 protein of coronavirus and the L protein of Crimea-Congo hemorrhagic fever virus.
  • host-derived de-ISG15 enzymes include USP18 (ubiquitin-specific peptidase 18) protein. USP18 is also known as a deubiquitinating enzyme.
  • Protease is a generic term for enzymes that catalyze the cleavage or degradation of peptides or proteins, and is also called peptidase or proteinase. Proteases generally cleave substrates by hydrolysis or elimination of amide bonds. Proteases include cysteine proteases, serine proteases, threonine proteases, aspartic proteases, metalloproteases (metalloproteases), glutamic proteases, and asparagine peptide lyases.
  • serine proteases examples include plasmin, thrombin, subtilisin, chymotrypsin, trypsin, elastase, kallikrein, granzyme, chymase, FSAP protein, and V8 protein.
  • cysteine proteases include papain, cathepsin B, cathepsin H, cathepsin L, and calpain, as well as papain-like proteases such as the Nsp3 protein described below, and 3C-like proteases such as the Nsp5 protein.
  • aspartic proteases examples include pepsin and renin.
  • metalloproteases examples include collagenase, gelatinase, thermolysin, ACE protein, and ADAMTS protein.
  • proteases include deubiquitinase, deISG15ase, signal peptidases, secretases (eg, ⁇ -secretase, ⁇ -secretase, and ⁇ -secretase), cathepsins, meprin A, and meprin B.
  • protease may be a full-length protease or an active fragment thereof.
  • viral protease includes proteases derived from any virus. It is known that viral proteases may be involved in polyprotein cleavage during viral replication. Specific examples of viruses from which viral proteases are derived include the viruses described below. Examples of viral proteases include NSP2 protein, NSP3 protein, NSP5 protein, L protease, 3C protease, NS6 protease, NS2B-NS3 protease, and S273R protease (pS273R).
  • viral proteases in single-stranded positive-strand RNA viruses include the NSP2 protein of the order Nidoviridae (e.g., Arteriviridae); the NSP3 and NSP5 proteins of the Coronaviridae; L protease and 3C protease; NS6 protease of Caliciviridae (e.g., norovirus); NS2B-NS3 protease of Flaviviridae (e.g., Japanese encephalitis virus, Zika virus, dengue virus, hepatitis C virus, and swine fever virus); Examples include proteases of the Retroviridae family (eg, human immunodeficiency virus (HIV), human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1), and bovine leukemia virus (BLV)).
  • HIV human immunodeficiency virus
  • HTLV-1 human T-cell leukemia virus type 1
  • BLV bovine leukemia virus
  • deubiquitinating enzyme refers to an enzyme that catalyzes a deubiquitinating reaction.
  • 95 kinds of deubiquitinating enzymes are known, and those classified as cysteine proteases or metalloproteases are known.
  • Examples of deubiquitinases include the USP superfamily, OTU superfamily, MJD superfamily, UCH superfamily, and deSUMOylases.
  • Specific examples of deubiquitinating enzymes belonging to the USP superfamily include USP1, USP2, USP3, USP4, USP5, USP6, USP7, USP8, USP9X, and USP9Y in addition to the aforementioned USP18 protein, which can also catalyze de-ISG15 modification.
  • deubiquitinating enzymes belonging to the OTU superfamily include OTUB1 and OTUB2 proteins.
  • deubiquitinating enzymes belonging to the MJD superfamily include ATXN3 and ATXN3L proteins.
  • enzymes belonging to the UCH superfamily include BAP1, UCHL1, UCHL3, and UCHL5 proteins.
  • deSUMOylase include SENP1 and SENP2 proteins.
  • fusion protein substrate is a fusion protein that can function as a substrate for a protease.
  • the fusion protein substrate contains at least a sequence that can be targeted for protease cleavage, and may contain a functional module (e.g., a transmembrane domain) such as a reporter region for detecting fragments generated after cleavage by a protease and a localization signal. can.
  • Virus as used herein is not limited, and may be either a DNA virus or an RNA virus.
  • DNA viruses include Asphaviridae, Poxviridae (eg, smallpox virus), Herpesviridae (eg, herpes simplex virus, EB virus, and varicella-zoster virus), and Adenoviridae.
  • RNA viruses include Retroviridae (e.g., human T-cell leukemia virus type 1, and human immunodeficiency viruses (e.g., HIV-1 and HIV-2)), Togaviridae, Coronaviridae (e.g., SARS-CoV). and SARS-CoV2), Flaviviridae (e.g.
  • Caliciviridae e.g. norovirus, feline calicivirus
  • Filoviridae e.g. Ebola virus
  • Matonaviridae e.g. rubella virus
  • Picornaviridae eg, poliovirus, foot-and-mouth disease virus
  • Coronavirus is a virus belonging to the Coronaviridae family, and is a relatively large RNA virus whose genome is a positive-strand RNA with a total length of about 30kb. Viruses in the coronavirus family are broadly divided into the Retovirinae and the Orthocoronavirus subfamilies.
  • the Orthocoronavirus subfamily includes Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Deltacoronavirus, Gammacoronavirus, and the like. Examples of viruses belonging to the Alphacoronavirus genus include human coronavirus NL63, human coronavirus 229E, feline coronavirus, swine epidemic diarrhea virus, and the like.
  • viruses belonging to the genus Betacoronavirus include MERS CoV (Middle East respiratory syndrome coronavirus), SARS-CoV (SARS coronavirus), and SARS-CoV2 (new coronavirus; nCoV) or Wuhan seafood market pneumonia. virus (also known as Wuhan seafood market pneumonia virus).
  • viruses belonging to the genus Gammacoronavirus include avian infectious bronchitis virus.
  • the viral genome of coronavirus has an approximately 20-kb ORF1ab gene that encodes 15 types of nonstructural proteins (Nsp1 to Nsp16 proteins) at the 5' end (Fig. 3).
  • the ORF1ab gene produces a large polyprotein, pp1ab, of approximately 7,000 amino acid residues containing the Nsp1-Nsp16 proteins.
  • the pp1ab protein is then cleaved into 15 independent proteins (Nsp1-Nsp16 proteins).
  • the 14 cleavages between the Nsp1-Nsp16 proteins are catalyzed by the papain-like protease Nsp3 protein (also called PL pro ) and the 3C-like protease Nsp5 protein (also called 3CL pro ).
  • the Nsp5 protein is also called the "main protease” because it catalyzes 11 cleavages.
  • Nsp3, Nsp4, and Nsp6 proteins have transmembrane domains and are involved in the formation of double membrane vesicles (DMVs) that are important for replication of coronaviruses.
  • DMVs double membrane vesicles
  • the Nsp3 protein which is involved in the cleavage of the pp1ab protein at three sites, is known to have de-ISG15 activity and participate in the evasion of host immunity based on ISG15 modification.
  • the structure of the Nsp3 protein can vary depending on the viral species.
  • the Nsp3 proteins of viruses belonging to the alphacoronavirus and betacoronavirus clade A contain PL1 pro and PL2 pro as two papain-like protease domains (Fig. 3).
  • the Nsp3 proteins of viruses classified into the genus Betacoronavirus clade B, clade C, and clade D, including SARS-CoV2, and the genus Deltacoronavirus do not contain PL1 pro , but only PL2 pro (Fig. 3). ).
  • retrovirus is not limited as long as it belongs to the Retroviridae family. Examples thereof include human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1) and human immunodeficiency virus (HIV).
  • HTLV-1 human T-cell leukemia virus type 1
  • HAV human immunodeficiency virus
  • African swine fever virus is the only virus known to belong to the Asphaviridae family.
  • African swine fever virus is the virus that infects pigs and wild boars and carries African swine fever, a highly fatal contagious disease characterized by fever and systemic hemorrhagic lesions.
  • African swine fever virus can be transmitted by tick vectors and animal-to-animal contact.
  • the African swine fever virus has a linear double-stranded DNA of approximately 170 kb to 190 kb as its genome.
  • Polyprotein pp220 (also called CP2475L) encoded in the viral genome of African swine fever virus is cleaved by S273R protease to yield five independent proteins (p5, p34, p14, p37, and p150).
  • the viral genome-encoded polyprotein pp60 (also called CP530R) is cleaved by the S273R protease to produce three independent proteins (p15, p35, and p8).
  • linker peptide is a peptide that can be inserted between portions in the fusion protein substrate of the present invention so that each portion to be fused fulfills its intended function.
  • the length of the linker peptide is not limited, it is usually 3 to 100 amino acids long, preferably 5 to 50 amino acids long. Peptides containing many amino acids with relatively small side chains, such as serine and glycine, are often used.
  • a "tag peptide” is a peptide that can be used to label a protein, and is usually a short peptide consisting of tens of amino acids to several tens of amino acids, and is used for protein detection or purification. Usually, labeling is carried out by ligating a base sequence encoding a tag peptide to the 5'-end or 3'-end of a gene encoding a protein to be labeled and expressing it as a fusion protein with the tag peptide.
  • tag peptides have been developed in the field, and any tag peptide may be used.
  • a tag peptide may be an epitope tag. Specific examples of tag peptides include FLAG, HA, His, DAP, PA, GST, myc, MBP tag, streptavidin, and the like.
  • the term "active fragment” includes a partial region of the protein, and the fragment is 1% or more, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% of the activity of the full-length protein. or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 95% or more, 98% or more, or equivalent or more.
  • the amino acid length of the active fragment is not particularly limited as long as it retains the activity of the protein.
  • plural refers to an integer of 2 or more, for example, an integer of 2 to 10, 2 to 7, 2 to 5, 2 to 4, or 2 to 3.
  • amino acid identity refers to the amino acid sequences of two polypeptides to be compared, so that the number of matching amino acid residues is maximized, if necessary, one or both It refers to the ratio (%) of the number of matching amino acid residues to the total number of amino acid residues when aligned with appropriate gaps inserted.
  • Base identity nucleotide sequence identity
  • amino acid substitution refers to substitution between 20 types of amino acids that constitute natural proteins. Amino acid substitutions are preferably within conservative amino acid groups with similar properties such as charge, side chain, polarity and aromaticity. For example, uncharged polar amino acids with low polarity side chains (Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Cys, Tyr), branched chain amino acids (Leu, Val, Ile), neutral amino acids (Gly, Ile , Val, Leu, Ala, Met, PRO), neutral amino acids with hydrophilic side chains (Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids ( Arg, Lys, His), substitutions within the group of aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp).
  • uncharged polar amino acids with low polarity side chains Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Cys, Tyr
  • branched chain amino acids Leu, Val, Ile
  • neutral amino acids Gly, I
  • the fusion protein substrate of the present invention comprises an N-terminal signal sequence and a C-terminal membrane binding domain, with a reporter domain and a protease targeting domain in between.
  • the reporter region can be located either N-terminally or C-terminally to the protease target region.
  • the fusion protein substrate of the present invention comprises a signal sequence, a reporter region, a protease target region, and a membrane binding region in order from the N-terminus. This arrangement is useful when the size of the protease target region is relatively small, e.g.
  • 200 amino acids or less 150 amino acids or less, 100 amino acids or less, 50 amino acids or less, 40 amino acids or less, 30 amino acids or less, 20 amino acids or less, or 10 amino acids or less, and/or 100 kDa or less, 90 kDa or less, 80 kDa or less, 70 kDa or less, It is preferably 60 kDa or less, 50 kDa or less, 40 kDa or less, 30 kDa or less, 20 kDa or less, 15 kDa or less, 10 kDa or less, 5 kDa or less, 4 kDa or less, 3 kDa or less, 2 kDa or less, or 1 kDa or less.
  • the fusion protein substrate of the present invention comprises a signal sequence, protease target region, reporter region, and membrane binding region in order from the N-terminus. This arrangement is useful when the size of the protease target region is relatively large, e.g.
  • the reporter activity of the reporter region may be suppressed or inhibited by the presence of the protease target region, so that its release after cleavage may increase the reporter activity. Protease activity can be assessed by detecting changes in reporter activity.
  • signal sequence refers to an extracellular translocation signal necessary for extracellular secretion of a protein biosynthesized by gene expression, and is also called a signal peptide.
  • a signal sequence may comprise a region composed of hydrophobic amino acids. After translation, the signal sequence is cleaved off by a signal peptidase before it is translocated out of the cell. Signal sequences are present at the N-termini of many secretory and membrane proteins and are, for example, 15-30 amino acids long. Signal sequences may be derived from any species and may be human or non-human, such as insect cells or viruses. Examples of signal sequences of human origin include the signal sequence of the immunoglobulin kappa light chain (SEQ ID NO: 1) and variants thereof having insertions, deletions, substitutions and/or additions of one or more amino acids. .
  • reporter region refers to a fragment produced by protease cleavage from the fusion protein substrate of the present invention (if the reporter region is located on the N-terminal side of the protease target region, the extracellularly released fragment corresponds to If the reporter region is located on the C-terminal side of the protease target region, the fragment that remains immobilized on the membrane corresponds to this region).
  • a polypeptide corresponds to a polypeptide capable of determining the presence or absence of a fragment of interest based on the reporter activity contained therein, or a polypeptide capable of measuring its abundance.
  • reporter regions include fluorescent proteins, luminescent proteins, and enzymatic proteins.
  • reporter activity refers to an activity that is contained in the reporter region and enables detection of the reporter region. Examples thereof include fluorescence activity of fluorescent proteins, luminescence activity of photoproteins, and enzymatic activity of enzyme proteins.
  • Fluorescent protein refers to a protein that emits fluorescence of a specific wavelength when irradiated with excitation light of a specific wavelength. It may be either natural or non-natural. Also, the excitation wavelength and fluorescence wavelength are not particularly limited. Specifically, for example, CFP, BFP, RFP, mCherry, DsRed (including derivatives such as 3xP3-DsRed), YFP, PE, PerCP, APC, GFP (including derivatives such as EGFP and 3xP3-EGFP) ) and the like.
  • Photoprotein refers to a substrate protein capable of emitting light without the need for excitation light or an enzyme that catalyzes the luminescence of that substrate protein.
  • Examples include luciferin or aequorin as substrate proteins and luciferases (eg, Renilla luciferase, Gaussia luciferase, firefly luciferase, and bacterial luciferase) as enzymes.
  • a "chromoprotein” is a protein involved in the biosynthesis of a pigment, or a protein that enables chemical detection by a pigment upon application of a substrate, usually an enzyme.
  • specific examples of such enzymes include horseradish peroxidase (HRP), alkaline phosphatase (AP), ⁇ -galactosidase (LacZ), ⁇ -glucuronidase (GUS), and melanin pigment synthetic protein.
  • tag peptides and epitope sequences that can be detected by antibodies and the like can also be used as reporter regions.
  • protease target region refers to a region that can be a target for protease cleavage.
  • protease target regions include regions that can be targeted by any of the proteases described above.
  • the protease target region may be, for example, a viral protease target region, a deubiquitinase target region, or a deISG15ase target region.
  • viral protease target regions include, but are not limited to, the target sequence of the coronavirus Nsp3 protein (e.g., the amino acid sequence of the mature or precursor form of the human ISG15 protein shown in SEQ ID NO: 4 or 34); target sequence of the viral Nsp5 protein (e.g. SEQ ID NO: 12 or 13), human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1) protease PRO protein target sequence (e.g.
  • SEQ ID NOs: 21-27 African swine fever virus (ASFV) protease pS273R protein target sequence (for example, pp220 p5/p34 cleavage site, pp220 p34/p14 cleavage site, pp220 p14/p37 cleavage site, pp220 p37/ p150 cleavage site, pp60 p15/p35 cleavage site, and pp60 p35/p8 cleavage site), target sequences of Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) protease (SEQ ID NO: 61) (e.g., SEQ ID NOS, respectively) HIV MA/CA cleavage site, HIV CA/p2 cleavage site, HIV p2/NC cleavage site, HIV NC/p1 cleavage site, HIV p1/p6 cleavage site, HIV TF/PR cleavage site consisting of the amino acid sequences
  • target regions of deubiquitinating enzymes include ubiquitin proteins, SUMO proteins, and ISG15 proteins.
  • the species from which the ubiquitin protein, SUMO protein, and ISG15 protein are derived is not particularly limited.
  • ubiquitin proteins include human ubiquitin protein (SEQ ID NO:33), mouse ubiquitin protein (SEQ ID NO:33), and yeast ubiquitin protein (SEQ ID NO:59).
  • Ubiquitin protein can be the target sequence of USP18 protein.
  • the SUMO protein is not limited as long as it is a SUMO family protein. Examples: human SUMO-2 protein (SEQ ID NO: 48), mouse SUMO-2 protein (SEQ ID NO: 57)), SUMO-3 protein (e.g.
  • ISG15 proteins include mature human ISG15 protein (SEQ ID NO: 4) and mouse ISG15 protein (SEQ ID NO: 55).
  • the ubiquitin protein, SUMO protein, and ISG15 protein have the amino acid sequences shown in any of the above (e.g., human ubiquitin protein (SEQ ID NO: 33), human SUMO-1 protein (SEQ ID NO: 47), human SUMO-2 protein (SEQ ID NO: 48), 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more to human SUMO-3 protein (SEQ ID NO: 49) or human ISG15 protein (SEQ ID NO: 4)) , 98% or more, or 99% or more amino acid identity, or deletion, substitution or addition of one or more amino acids in any of them.
  • human ubiquitin protein SEQ ID NO: 33
  • human SUMO-1 protein SEQ ID NO: 47
  • human SUMO-2 protein SEQ ID NO: 48
  • target region of de-ISG15 enzyme include the target sequences of the above-mentioned coronavirus Nsp3 protein and USP18 protein.
  • the protease target region is not necessarily limited to the region that is actually cleaved by the protease, and may be a region that may become a cleavage target, such as a candidate sequence thereof.
  • membrane binding region refers to a region that stably incorporates or attaches the fusion protein substrate of the present invention to a membrane.
  • membrane-binding domains include membrane proteins or fragments thereof described later, and artificial transmembrane domains mainly containing hydrophobic amino acid residues.
  • membrane proteins include integral membrane proteins, superficial membrane proteins, and lipid-anchored proteins.
  • an "integral membrane protein” is a protein at least part of which can be embedded in a membrane, and includes integral monotopic proteins and transmembrane proteins. Integral monotopic proteins are membrane proteins that do not span the entire membrane and protrude to only one side of the membrane.
  • a transmembrane protein is a membrane protein that spans the entire membrane. Transmembrane proteins are divided into single transmembrane proteins having one transmembrane domain and multiple transmembrane proteins having two or more transmembrane domains.
  • a specific example of a single transmembrane protein is an immunoglobulin heavy chain. Specific examples of multi-transmembrane proteins include choline transporters, histamine H1 receptors, and G protein-coupled receptors.
  • a "surface protein” is a protein that is not itself embedded in the membrane, but is anchored to the membrane by binding to lipids or integral membrane proteins.
  • a "lipid-anchored protein” is a protein that is anchored to the membrane by lipids added by lipid modification. Specific examples include GPI (glycosylphosphatidylinositol)-, prenylated, cholesterylated, and fatty acid-acylated (eg, S-palmitoylated and N-myristoylated) proteins.
  • GPI glycosylphosphatidylinositol
  • prenylated prenylated
  • cholesterylated cholesterylated
  • fatty acid-acylated eg, S-palmitoylated and N-myristoylated
  • a fragment of a membrane protein includes a portion of any of the above membrane proteins that can be fixed to the membrane. Examples include fragments containing one or more transmembrane domains in a transmembrane protein. Examples include the transmembrane domains of CD3, CD4, CD8, CD28, and IL-2 receptors.
  • the membrane-binding region may be derived from the same biological species and/or the same protein as the signal sequence.
  • the fusion protein substrate of the present invention can contain linker peptides, tag peptides, etc. as necessary, in addition to the signal sequence, reporter region, protease target region, and membrane binding region described above.
  • the fusion protein substrate of the present invention contains a signal sequence, a reporter region, a protease target region, and a membrane binding region in order from the N-terminal side, a fragment containing the reporter region is released outside the cell by cleavage at the protease target region. , reporter activity can be detected in the cell supernatant.
  • the fusion protein substrate of the present invention comprises, in order from the N-terminal side, a signal sequence, a protease target region, a reporter region, and a membrane binding region, a change in reporter activity suppressed or released by cleavage in the protease target region is It can be detected in cells.
  • a second aspect of the invention is a nucleic acid encoding a fusion protein substrate.
  • nucleic acid encoding a fusion protein substrate may be any nucleic acid encoding any of the fusion protein substrates described in the first aspect.
  • the base sequences of such nucleic acids are not limiting. Examples include codon-optimized base sequences and base sequences with an initiation codon (ATG) added to the 5'-end side.
  • Specific examples of nucleic acids encoding fusion protein substrates include nucleic acids consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS:8, 15, 17, 29 and 32.
  • a third aspect of the present invention is a gene expression vector (hereinafter referred to as a "fusion protein substrate expression vector") containing a nucleic acid encoding the fusion protein substrate according to the second aspect in an expressible state.
  • the gene expression vector of this embodiment can be introduced into cells, such as mammalian cells, to express the inducible protein substrate.
  • the gene expression vector of this aspect is a gene expression vector that includes the nucleic acid of the second aspect and a promoter, and is capable of expressing a fusion protein substrate in cells.
  • the gene expression vector may optionally contain constituent elements such as a marker gene, an intron, an enhancer, a terminator, an origin of replication, and/or a poly A signal. .
  • gene expression vector refers to a vector that contains a gene or gene fragment (hereinafter referred to as "gene, etc.”) in an expressible state and that contains an expression unit that can control the expression of the gene, etc. .
  • a gene expression vector may be a plasmid vector or a viral vector.
  • the term "state capable of expression” means that a gene or the like to be expressed is arranged in the downstream region of the promoter under the control of the promoter.
  • Vectors include plasmid vectors, virus vectors, and the like, and any vector can be used. Plasmid vectors that can be easily manipulated for gene recombination are usually sufficient.
  • the plasmid vector may be a commercially available expression vector for mammalian cells such as pSI vector from PROmega, or a shuttle vector that is replicable between mammalian cells and bacteria such as E. coli.
  • Viral vectors include retroviral vectors (including oncoretroviral vectors, lentiviral vectors, and pseudotyped vectors), adenoviral vectors, adeno-associated virus (AAV) vectors, simian virus vectors, vaccinia virus vectors, Sendai virus vectors, Epstein - Viral vectors such as Barr virus (EBV) vectors and HSV vectors can be used.
  • retroviral vectors including oncoretroviral vectors, lentiviral vectors, and pseudotyped vectors
  • adenoviral vectors including oncoretroviral vectors, lentiviral vectors, and pseudotyped vectors
  • AAV adeno-associated virus
  • simian virus vectors simian virus vectors
  • vaccinia virus vectors Sendai virus vectors
  • Epstein - Viral vectors such as Barr virus (EBV) vectors
  • HSV vectors can be used.
  • Viral vectors may be used that are replication deficient so that
  • promoter refers to a gene expression regulatory region capable of controlling the expression of genes, etc. placed downstream (3' end side) in cells into which a gene expression vector has been introduced. Promoters can be classified into ubiquitous promoters (systemic promoters) and site-specific promoters, based on where genes under expression control are expressed.
  • a ubiquitous promoter is a promoter that controls the expression of a target gene or the like (target gene or the like) in all cells, that is, in the entire host individual.
  • a site-specific promoter is a promoter that controls the expression of a target gene or the like only in specific cells or tissues.
  • promoters are classified into constitutively active promoters, expression-inducible promoters, and time-specific active promoters based on the timing of expression.
  • a constitutively active promoter can constantly express a target gene or the like in a cell.
  • An expression-inducible promoter can induce the expression of a target gene or the like in cells at any time.
  • the time-specific active promoter can induce the expression of a target gene or the like in cells only at a specific time during the developmental stage. Both promoters can be understood as overexpression type promoters because they can bring about overexpression of target genes in host cells.
  • the promoter is a promoter capable of inducing expression of a nucleic acid encoding a fusion protein substrate in cells.
  • the target cells into which the gene expression vector of the present invention is introduced are preferably mammalian cells, such as human-derived cells, and promoters capable of expressing downstream genes in these cells are exemplified. Specific examples include CMV promoter (CMV-IE promoter), SV40 early promoter, RSV promoter, EF1 ⁇ promoter, Ub promoter and the like.
  • a "marker gene” is a gene that encodes a marker protein, also called a selectable marker or reporter protein.
  • the term "marker protein” refers to a peptide that can determine the presence or absence of expression of a marker gene based on its activity. Detection of the activity may be carried out by directly detecting the activity of the labeled protein itself, or indirectly through metabolites such as dyes generated by the activity of the labeled protein. good.
  • Detection includes biological detection (including detection by binding of peptides such as antibodies and aptamers and nucleic acids), chemical detection (including enzymatic detection), physical detection (including behavioral analysis detection), or detection Any sensory detection of a person (including detection by sight, touch, smell, hearing, and taste) may be used.
  • labeling protein encoded by the labeling gene is not particularly limited as long as its activity can be detected by a method known in the art.
  • Label proteins that are less invasive to transformants for detection are preferred. Examples thereof include tag peptides, drug-resistant proteins, chromoproteins, fluorescent proteins, and luminescent proteins.
  • a "drug-resistant protein” is a protein that imparts resistance to drugs such as antibiotics added to the medium, etc., and is often an enzyme.
  • ⁇ -lactamase confers resistance to ampicillin
  • aminoglycoside 3′ phosphotransferase confers resistance to kanamycin
  • tetracycline efflux transporter confers resistance to tetracycline
  • chloramphenicol examples include CAT (chloramphenicol acetyltransferase) that imparts resistance.
  • the “enhancer” is not particularly limited as long as it can enhance the expression efficiency of the gene or fragment thereof in the vector.
  • a "terminator” is a sequence capable of terminating transcription of a gene or the like expressed by the activity of the promoter.
  • the type of terminator is not particularly limited. A terminator derived from the same species as the promoter is preferred. A terminator paired with the promoter on the genome in a single gene expression control system is particularly preferred.
  • a fourth aspect of the present invention is a host cell.
  • the host cell of this aspect comprises the fusion protein substrate expression vector of the third aspect.
  • the host cell of this embodiment contains a fusion protein substrate expression vector as an essential component and a protease expression vector as an optional component. Since the essential components of the fusion protein substrate expression vector are as described in the third embodiment, the host cells and optional components are described below.
  • the type of host cell is not limited.
  • the host cell may be any cell in which the fusion protein substrate is expressed on its membrane and capable of being cleaved by a protease, and thus is not limited to mammalian cells.
  • Host cells can be either prokaryotic or eukaryotic.
  • prokaryotic cells include bacterial cells such as E. coli cells.
  • eukaryotic cells include fungal cells (e.g. yeast cells), algal cells, plant cells, protozoan cells, insect cells, nematode cells, fish cells, avian cells (e.g. chicken cells), and mammalian cells (e.g. , mouse cells, chimpanzee cells, and human cells).
  • Mammalian cells are preferred.
  • mammalian cells include, but are not limited to, CHO cells, COS cells, Vero cells, HEK293 cells, HeLa cells, NIH3T3 cells, and the like.
  • the host cells may be either adherent or suspension cells, but adherent cells are more preferred.
  • a “protease expression vector” is a gene expression vector that contains a protease-encoding nucleic acid with a signal sequence added to the N-terminus if necessary, and a promoter, and that is capable of expressing the protease in cells.
  • the protease expression vector contains constituent elements such as a marker gene (selection marker), an enhancer, an intron, a terminator, a replication origin, and/or a poly A signal, in addition to the nucleic acid and promoter which are the constituent elements. You can stay.
  • a protease expression vector may be a plasmid vector or a viral vector.
  • the protease expressed by the protease expression vector is a protease that cleaves or has the potential to cleave the protease target region contained in the fusion protein substrate that is co-introduced into the host cell.
  • protease activity assay kit 5-1 A fifth aspect of the present invention is a protease activity assay kit.
  • the protease activity measurement kit of this embodiment contains one or more selected from the group consisting of the substrate of the first embodiment, the nucleic acid of the second embodiment, the expression vector of the third embodiment, and the host cell of the fourth embodiment. According to the protease activity measurement kit of this aspect, protease activity can be evaluated by quantifying it.
  • the protease activity measurement kit of this aspect includes the fusion protein substrate of the first aspect, the nucleic acid encoding the fusion protein substrate of the second aspect, the fusion protein substrate expression vector of the third aspect, and the fusion protein substrate expression vector of the fourth aspect.
  • one or more selected from the group consisting of host cells comprising The construction of the substrate, nucleic acid, gene expression vector and host cell are as described in the first to fourth aspects. Therefore, detailed description is omitted here.
  • the protease activity measurement kit of this aspect includes a cell culture medium, a gene introduction reagent, an agent such as an antibiotic to be added to the medium, etc.
  • a luminescent substrate, a chromogenic substrate, or an antibody for detecting reporter activity, or instructions for use, etc. may be included.
  • protease activity measurement method 6-1 is a method for measuring protease activity.
  • protease activity can be assayed for the full-length amino acid sequence of protease. Since the measuring method of the present invention does not require destruction of host cells for measuring protease activity, the viability of host cells can also be measured after measuring protease activity.
  • Protease inhibitory activity can also be evaluated when the reaction step in the assay method of the present invention is performed in the presence of a protease inhibitor.
  • Each step of the method for measuring protease activity of this embodiment has different specific configurations depending on whether the reporter region is located on the N-terminal side or the C-terminal side of the protease target region in the fusion protein substrate used for protease activity measurement. Therefore, two cases will be described below.
  • the fusion protein substrate consists of the signal sequence, the reporter region, and the protease target in order from the N-terminal side. domain, and membrane-associated domain.
  • the measurement method of this embodiment includes a reaction step, a collection step, and a measurement step as essential steps, and a vector introduction step as an optional step. Each step will be specifically described below.
  • the “vector introduction step” is a step of introducing the fusion protein substrate expression vector according to the third aspect and/or the protease expression vector described above into a host cell. Specific configurations of the fusion protein substrate expression vector and the protease expression vector conform to the descriptions of the third and fourth aspects.
  • the method for introducing each vector into host cells is not particularly limited.
  • each vector is a plasmid vector
  • gene introduction methods transformation methods
  • lipofection method electroporation method, microinjection method, calcium phosphate method, DEAE-Dextran method, particle bombardment and the like
  • lipofection method electroporation method, microinjection method, calcium phosphate method, DEAE-Dextran method, particle bombardment and the like
  • each vector is a viral vector
  • methods for virus infection of cells are known in the art.
  • functional substances that improve viral infection efficiency such as fibronectin and fibronectin fragments (for example, retronectin (registered trademark) or Vecofusin-1 (registered trademark), which are fibronectin fragments having a heparin-binding site), etc. of functional substances may be used.
  • reaction step is a step of reacting a host cell expressing a fusion protein substrate for measuring protease activity in a solution with a test subject protease.
  • the purpose of this step is to react the subject protease against the fusion protein substrate on the membrane of the host cell.
  • the host cells to be reacted with the test subject protease in this step conform to the description of the fourth aspect.
  • host cells into which a fusion protein substrate expression vector and/or a protease expression vector have been introduced in the vector introduction step which is the optional step described above, may be used.
  • the subject protease to be reacted with the host cell in this step is not limited.
  • the subject protease may cleave, or may or may not cleave, a fusion protein substrate expressed in the host cell.
  • the protease to be tested may be a full-length amino acid sequence or an active fragment having protease activity.
  • the method of providing the test subject protease in the solution is not limited.
  • the subject protease can be co-expressed in a host cell that expresses the fusion protein substrate.
  • This method can be used whether the protease to be tested is a membrane protein or a secreted protein, but is particularly preferred when the protease to be tested is a membrane protein.
  • the subject protease may be expressed in a host cell that is different from the host cell that expresses the fusion protein substrate.
  • the method of providing the solution into the solution can be easily determined by those skilled in the art according to the type of protease to be tested, such as membrane protein, secretory protein, or other protein (e.g., cytoplasmic protein). can be done.
  • it may be provided in a solution as a host cell expressing the protease to be tested, its culture supernatant, its cell lysate, or a protein isolated or purified from either of them.
  • the subject protease is a recombinant protein and can be added in solution.
  • the type of solution that reacts in this step is not limited as long as the fusion protein substrate and protease can react.
  • the solution may be, for example, a medium capable of maintaining host cells as living cells.
  • the medium may be any medium commonly used in cell culture and known in the art.
  • the medium may be a basal medium, a serum-free medium, a low-serum medium, or a serum-supplemented medium, but usually a basal medium such as a standard cell culture medium.
  • standard cell culture medium refers to a highly versatile basal medium mainly used for culturing various types of mammal-derived cells.
  • Eagle Minimum Essential Medium Eagle Minimum Essential Medium
  • DMEM Densibecco's Modified Eagle Medium
  • Ham F10 Ham's Nutrient Mixture F10
  • Ham's Nutrient Mixture F12 Ham's Nutrient Mixture F12
  • M199 medium performance improvement 199 medium (High Performance Medium 199)
  • RPMI-1640 Roswell Park Memorial Institute-1640
  • DMEM/F12 Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's Nutrient Mixture F12
  • the mixing ratio is not particularly limited.
  • DMEM and F12 may be mixed in a weight concentration ratio of the components in the range of 6:4 to 4:6.
  • Specific compositions of standard cell culture media are known in the art and can therefore be found in appropriate literature (e.g. Kaech S. and Banker G., 2006, Nat. PROtoc., 1(5): 2406 -2415).
  • media commercially available from manufacturers such as Thermo Fisher Scientific and Wako Pure Chemical Industries may be used.
  • reaction conditions for this step culture conditions known in the art can be used according to the type and origin of the host cell. Reactions can typically be run at 37° C. in 5% CO 2 .
  • reaction time of this step varies depending on the host cell, the type of protease, etc., but in order to achieve the above purpose of this step, it is usually 1 hour to 72 hours, preferably 24 hours to 48 hours.
  • the reaction in this step can be performed in the presence of a test substance that is a candidate substance for a protease inhibitor.
  • the measuring method of the present invention can be a method for measuring the protease inhibitory activity of a protease inhibitor.
  • the type of test substance is not particularly limited.
  • the test substance is any substance, specifically, natural molecules (e.g., amino acids, peptides, oligopeptides, polypeptides, proteins, nucleic acids, lipids, carbohydrates (sugars, etc.), steroids, glycopeptides, glycoproteins, proteoglycans, etc.
  • RNAi double-stranded RNA
  • non-natural molecules such as small compounds (e.g., small inorganic compounds and low-molecular-weight organic compounds); and mixtures thereof.
  • test substance a single test substance may be tested independently, or a mixture of several candidate test substances (for example, a library, etc.) may be tested.
  • Libraries containing multiple test substances include synthetic compound libraries and peptide libraries (combinatorial libraries, etc.).
  • test substances under several conditions. Such conditions include time or period of treatment with the test substance, amount (large or small), number of times, and the like. For example, multiple doses can be set by preparing dilution series of the test substance.
  • the “recovery step” is a step of recovering the supernatant from the solution after the reaction. The purpose of this step is to obtain a supernatant that may contain extracellularly released fragments cleaved from the fusion protein substrate in the reaction step described above, and to separate the supernatant from the host cells containing the uncleaved fusion protein substrate. .
  • the recovery method in this step is not limited as long as the supernatant containing the fragment containing the reporter region released extracellularly in the reaction step can be separated from the host cells.
  • the supernatant containing the reporter region-containing fragment can be obtained by centrifugation, filtration, sedimentation, decantation, pipetting, or a combination thereof. All of them may be performed basically according to the ordinary method in the relevant field. If the host cells are adherent cells, the supernatant can also be easily collected with a pipette.
  • the “measurement step” is a step of measuring reporter activity based on the reporter region in the supernatant.
  • the protease activity can be quantitatively analyzed by detecting and quantifying the reporter activity contained in the supernatant.
  • the measurement method in this step varies depending on the type of reporter activity contained in the reporter region, but any of them can be easily determined by those skilled in the art.
  • the reporter region is derived from a fluorescent protein
  • fluorescence activity contained in the supernatant can be measured based on the excitation wavelength and fluorescence wavelength according to the type of fluorescent protein.
  • a luminescent substrate eg, luciferin
  • the reporter region is based on an enzyme such as HRP
  • a chromogenic substrate e.g., HRP substrates such as TMB, 4-CN, DAB, AP substrates such as BCIP/NBT, and LacZ substrates such as X-Gal. Enzyme activity in the supernatant can be measured.
  • the viability of host cells can be measured after the measuring step.
  • Methods for measuring host cell viability are known.
  • cell viability can be measured by detecting cellular uptake of dyes such as neutral red, trypan blue, or ALAMAR blue.
  • protease inhibitory activity can be obtained from the protease activity measured in this step, and the test substance can be identified as a protease inhibitor based on the results. can. For example, if the measured protease activity is 100% or less, 90% or less, 80% or less, 70% or less, 60% or less, 50% or less, 20% or less, 10% or less, compared to the value without treatment with the test substance. % or less, 5% or less, 1% or less, or 0.1% or less, the test substance can be identified as a protease inhibitor.
  • the fusion protein substrate consists of the signal sequence, the protease target region, and the reporter in order from the N-terminus. domain, and membrane-associated domain.
  • the measurement method of this embodiment includes a reaction step and a measurement step as essential steps, and a vector introduction step as an optional step.
  • the vector introduction step and the reaction step are the same as "(1) vector introduction step” and "(2) reaction Process", and here only the configuration of the measurement process will be described below.
  • the "measurement step” is a step of measuring the reporter activity based on the reporter region in the host cell after the reaction step. Since this step detects changes in the reporter activity whose suppression or inhibition is released by cleavage in the protease target region in the host cell, the obtained reporter activity is used as a reference reporter activity such as a control that is not reacted with the protease of the test subject. It is preferable to compare with
  • the method for measuring the reporter activity in this step is the method for measuring the reporter activity in the supernatant in the above "6-2-1.
  • the reporter region is located on the N-terminal side of the protease target region. It should be applied to In the method for measuring reporter activity in this step, the supernatant after the reaction step may or may not be removed.
  • the reporter activity is measured when the subject protease is not reacted with the host cell expressing the fusion protein substrate, and this can be used as a negative control. Protease activity of the protease under test can be assessed by comparison to the reporter activity of the negative control.
  • protease activity can be evaluated by detecting reporter activity based on the reporter region in the supernatant or in host cells.
  • the inhibitory effect on protease activity can also be evaluated by performing the reaction step in the presence of the test substance.
  • the advantage of the measurement method of the present invention is that the protease activity can be measured in living cells without destroying the host cells. Based on this advantage, the method of the invention also allows measuring cell viability after the measuring step. For example, if protease inhibitory effects are confirmed in the presence of a test substance in drug screening, it is necessary to distinguish between direct inhibitory effects on proteases and other indirect effects (e.g., inhibitory effects on cell viability). , the method of the present invention can provide a method with extremely high throughput in this respect as well.
  • Example 1 Development of evaluation method for de-ISG15 activity> (Purpose) Develop a method to evaluate de-ISG15 activity. Furthermore, the de-ISG15 activity of Nsp3 protein, a protease of SARS-CoV2, is detected.
  • ssISG sensor expression plasmid An ssISG sensor was prepared as a fusion protein that serves as a substrate for detecting deISG15 activity.
  • the ssISG sensor is a fusion protein formed by linking the following (a) to (f) in order from the N-terminal side.
  • FIG. 2B illustrates the structure of the ssISG sensor.
  • SEQ ID NO: 7 shows the full-length amino acid sequence of the ssISG sensor.
  • the ssISG sensor gene (SEQ ID NO: 8), which encodes this ssISG sensor and whose nucleotide sequence is codon-optimized using the codon usage frequency of human cells as an index, was inserted into a mammalian expression vector pCI (Promega).
  • the structure of the constructed ssISG sensor expression plasmid is shown in FIG. 2A.
  • Fig. 5A illustrates the principle of the method for evaluating de-ISG15 activity using the ssISG sensor and the ssNSP3 protein described later.
  • ISG sensors can be cleaved by de-ISG15ase activity, eg, in the endoplasmic reticulum, secretory vesicles, and/or on the cell membrane.
  • the ssNsp3 (WT) protein contains an immunoglobulin ⁇ light chain signal sequence (SEQ ID NO: 1) on the N-terminal side and wild-type SARS-CoV2 (nCoV) Nsp3 (SEQ ID NO: 9) on the C-terminal side, and its full length
  • SEQ ID NO: 10 Figure 4B.
  • the ssNsp3(WT) gene (SEQ ID NO: 11), which encodes the ssNsp3(WT) protein and whose nucleotide sequence is codon-optimized using the codon usage frequency of human cells as an index, was inserted into the mammalian expression vector pCI (Promega).
  • the structure of the constructed ssNsp3(WT) expression plasmid is shown in FIG. 4A.
  • ssNsp3 ssNsp3 protein in which both cysteine at position 111 and histidine at position 272, which are assumed to be the active site of Nsp3 protein, are substituted with alanine (herein, "ssNsp3 (C111A / H272A) protein"
  • ssNsp3 (C111A / H272A) protein an ssNsp3(CHAA) expression plasmid containing the ssNsp3(CHAA) gene encoding the ssNsp3(CHAA) protein was prepared.
  • a total of 10 ⁇ g of DNA was transiently introduced into 1 ⁇ 10 6 HeLa cells by electroporation using a gene introduction device “Nepa21” (Nepagene).
  • the cells were suspended in 10% FBS-added DMEM at 4 ⁇ 10 5 cells/mL and cultured in a 96-well plate at 0.1 mL/well for 24 hours. After that, the culture supernatant was separated from the cells, and the luciferase activity in the culture supernatant was measured.
  • Nsp3 SARS-CoV2-derived wild-type Nsp3 protein
  • ssNsp3(WT) expression plasmid or Nsp3(-ss) expression plasmid was introduced into HeLa cells together with the ssISG sensor expression plasmid, and the luciferase activity in the culture supernatant was measured.
  • Fig. 5C The results are shown in Fig. 5C.
  • Cells co-transfected with the ssNsp3(WT)-expressing plasmid exhibited high levels of luciferase activity in the culture supernatant, whereas cells co-transfected with the Nsp3(-ss)-expressing plasmid showed luciferase activity above background levels. No increase in activity was observed.
  • Nsp3 proteins lacking a signal sequence would not enter secretory vesicles and would not efficiently associate with the ISG sensor.
  • Example 2 Examination of the region necessary for de-ISG15 modification in the ISG15 protein> (Purpose) A modified ssISG sensor is prepared by modifying the ssISG sensor constructed in Example 1. By evaluating the deISG15-reducing activity of the ssNsp3 protein against the modified ssISG sensor, we examine the region required for de-ISG15 modification in the ssISG sensor.
  • 'ssISG sensor (AA)' is a 'LRLRAA' mutant in which both glycines in the 'LRLRGG' sequence flanking the cleavage site of the de-ISG15 modification in ssISG sensor (GG) are replaced with alanines (Fig. 6A, "2) AA").
  • ssISG sensor ( ⁇ D1) is a mutant in which ubiquitin-like domain 1 (the region from positions 7 to 71 in SEQ ID NO: 4) is deleted in ssISG sensor (GG) (Fig. 6A, "3) ⁇ D1” ).
  • ssISG sensor ( ⁇ D1+2) is a ssISG sensor (GG) in which both ubiquitin-like domains 1 and 2 (regions from positions 7 to 148 in SEQ ID NO: 4) are deleted, and the "LRLRGG” sequence is included. It is a mutant in which only amino acids are left (Fig. 6A, "4) ⁇ D1+2").
  • modified ssISG sensor expression plasmids containing modified ssISG sensor genes were prepared.
  • ISG15 de-ISG15 not only recognizes the short amino acid sequence ⁇ LRLRGG'', but also recognizes the structure of the ISG15 protein containing two ubiquitin-like domains and de-ISG15-modifies it. It has been shown. Therefore, conventional in vitro evaluation methods using short peptide substrates are insufficient for evaluating the activity of proteases with de-ISG15 deactivating activity and for screening compounds that inhibit their function. Not possible. In contrast, the ssISG sensor-based method for evaluating de-ISG15 deactivation activity of the present invention uses a fusion protein containing mature full-length ISG15 protein as a substrate, and is significantly superior to conventional methods. Law.
  • ssPRO-TM sensor was prepared as a fusion protein that serves as a substrate for detecting protease activity.
  • the ssPRO-TM sensor is a fusion protein in which (d) the portion corresponding to the mature human ISG15 protein in the ssISG sensor described above is replaced with the cleavage target sequence of the feline coronavirus (FeCoV)-derived Nsp5 protein (3CLpro). Specifically, it is a fusion protein in which the following (a) to (f) are linked in order from the N-terminal side (Fig. 7, bottom).
  • the ssPRO-TM sensor is "ssNsp4/5-TM sensor” or “ssNsp5/6-TM", respectively. sensor”.
  • SEQ ID NO: 14 shows the full-length amino acid sequence of ssNsp4/5-TM sensor
  • SEQ ID NO: 15 shows the nucleotide sequence of the ssNsp4/5-TM sensor gene encoding ssNsp4/5-TM sensor.
  • SEQ ID NO: 16 shows the full-length amino acid sequence of ssNsp5/6-TM sensor
  • SEQ ID NO: 17 shows the base sequence of the ssNsp5/6-TM sensor gene encoding ssNsp6/7-TM sensor.
  • the principle of the protease activity evaluation method will be exemplified.
  • the ssPRO-TM sensor ssNsp4/5-TM sensor or ssNsp5/6-TM sensor
  • the PRO consisting of the above (b) to (f) -TM sensor (Nsp4/5-TM sensor or Nsp5/6-TM sensor).
  • the ssNsp5 (WT) protein contains an immunoglobulin ⁇ light chain signal sequence (SEQ ID NO: 1) on the N-terminal side and a FeCoV wild-type Nsp5 (SEQ ID NO: 18) on the C-terminal side, and its full-length amino acid sequence is SEQ ID NO: indicated by 19. Furthermore, in order to express the ssNsp5(WT) protein, an ssNsp5(WT) expression plasmid containing the ssNsp5(WT) gene (SEQ ID NO: 20) was constructed.
  • ssNsp5 (C144A) protein As a negative control for the ssNsp5 (WT) protein, an inactive Nsp5 protein in which cysteine at position 144, which is assumed to be the active site of the Nsp5 protein, is substituted with alanine (referred to herein as "ssNsp5 (C144A) protein" etc.
  • ssNsp5 (C144A) protein alanine
  • the ssNsp4/5-TM sensor expression plasmid or ssNsp5/6 sensor expression plasmid was transfected into HeLa cells together with the ssNsp5(WT) expression plasmid or ssNsp5(C144A) expression plasmid, and cultured for 24 hours. After that, the culture supernatant was separated from the cells, and the luciferase activity in the culture supernatant was measured.
  • luciferase activity in the culture supernatant of the cells co-transfected with the ssNsp5(WT) expression plasmid was attenuated to the same level as the cells transfected with the empty vector.
  • the PRO-TM sensor can measure the activity of viral proteases in cells.
  • Example 4 Development of method for evaluating HTLV-1 protease activity> (Purpose) To develop a method to evaluate the activity of a protease derived from human T-cell leukemia virus type 1 (HTLV-1).
  • HTLV-1 human T-cell leukemia virus type 1
  • ssPRO-TM sensor expression plasmid ssPRO-TM sensor was prepared as a fusion protein that serves as a substrate for detecting the protease activity of PRO protein, which is a protease of HTLV-1.
  • the ssPRO-TM sensor in this example is a fusion protein in which the site corresponding to (d) in the ssPRO-TM sensor of Example 3 is replaced with the cleavage target sequence of the PRO protein of HTLV-1. Specifically, it is a fusion protein in which the following (a) to (f) are linked in order from the N-terminal side (FIG. 9, bottom).
  • any one of the following (d1) to (d7) was used as the PRO cleavage target sequence of (d) above.
  • (d1) In the HTLV-1 polyprotein GAG-PRO-POL, an amino acid sequence consisting of 20 amino acids before and after the boundary between MA and CA (illustrated as “MA/CA cleavage site” in FIG. 9, the cleavage position is "
  • (d2) Amino acid sequence consisting of 20 amino acids before and after the boundary between CA and NC in the HTLV-1 polyprotein GAG-PRO-POL (illustrated as "CA/NC cleavage site" in FIG.
  • the cleavage position is "
  • an amino acid sequence consisting of 20 amino acids before and after the boundary between p1 and RT (illustrated as "p1/RT cleavage site” in FIG. 9, the cleavage position is "
  • an amino acid sequence consisting of 20 amino acids before and after the boundary between RT and RH (illustrated as "RT/RH cleavage site” in FIG.
  • the cleavage position is "
  • an amino acid sequence consisting of 20 amino acids before and after the boundary between RH and IN illustrated as "RH/IN cleavage site” in FIG. 9, the cleavage position is "
  • the ssPRO-TM sensor when the PRO cleavage target sequence in (d) above consists of the amino acid sequence described in (d1) above is denoted as ssMA/CA-TM sensor, etc., and in the case of (d2) to (d7) are also written in the same way.
  • the full-length amino acid sequence of ssPRO-TM sensor corresponding to (d1) above is shown in SEQ ID NO:28.
  • the ssPRO-TM sensors corresponding to (d2) to (d7) above have the same amino acid sequence as (d1) except for the PRO cleavage target sequence.
  • the nucleotide sequence of the ssPRO-TM sensor gene corresponding to (d1) above is shown in SEQ ID NO:29.
  • the nucleotide sequences of the ssPRO-TM sensor gene corresponding to (d2) to (d7) above are the same as (d1) except for the PRO cleavage target sequence.
  • the principle of the protease activity evaluation method will be exemplified.
  • the ssPRO-TM sensor for example, ssMA/CA-TM sensor
  • the PRO-TM sensor consisting of the above (b) to (f) (for example, MA /CA-TM sensor).
  • the PRO-TM sensor is cleaved at the central position of (d) above by protease activity, a fragment containing (b) to (c) above containing luciferase activity is released extracellularly, and based on this released fragment Luciferase activity is detected in the cell supernatant.
  • the ssGAG-PRO (WT) protein has an immunoglobulin ⁇ light chain signal sequence (SEQ ID NO: 1) on the N-terminal side and a wild-type GAG-PRO protein (SEQ ID NO: 30) derived from HTLV-1 on the C-terminal side. , whose full-length amino acid sequence is shown in SEQ ID NO:31. Furthermore, in order to express the ssGAG-PRO(WT) protein, a wild-type ssGAG-PRO(WT) expression plasmid containing the ssGAG-PRO(WT) gene (SEQ ID NO: 32) was constructed.
  • ssGAG-PRO (WT) protein an ssGAG-PRO protein in which aspartic acid at position 32, which is assumed to be the active site of the PRO protein, is substituted with alanine (herein, "ssGAG-PRO (D32A) protein" A ssGAG-PRO(D32A) expression plasmid containing the ssGAG-PRO(D32A) gene encoding .
  • the PRO-TM sensor can be widely applied to measure viral protease activity.
  • GC376 Evaluation of protease inhibitory activity of GC376> (Purpose)
  • the protease inhibitor GC376 (FIG. 11A) against the Nsp5 protein of FeCoV is evaluated for its inhibitory activity against the Nsp3 and Nsp5 proteins of SARS-CoV2 and the PRO protein of HTLV-1.
  • GC376 is a known 3C-like protease inhibitor that inhibits replication of swine epidemic diarrhea virus (Ye G., et al., Viruses, 2020, 12(2):240).
  • GC376 inhibited protease activity of Nsp5 protein derived from SARS-CoV2 in a dose-dependent manner. On the other hand, it was shown that it does not affect the activities of the SARS-CoV2-derived Nsp3 protein and the HTLV-1-derived PRO protein.
  • WST8 assay was used to measure cell viability after culture. Add an equal volume of 4% WST8 solution (viable cell counting reagent SF (Nacalai Tesque, 07553-44)) to the cell culture medium and culture at 37°C for 2 hours in the presence of 5% CO 2. After that, the absorbance (450 nm and 650 nm) was measured. As a result, no effect of inhibiting cell survival was observed under any condition (Fig. 11C).
  • Example 6 Development of activity evaluation method for protease derived from African swine fever virus> (Purpose) A method is developed to assess the activity of the protease pS273R derived from African swine fever virus (ASFV).
  • a method is developed to assess the activity of the protease pS273R derived from African swine fever virus (ASFV).
  • ssPRO-TM sensor expression plasmid ssPRO-TM sensor was prepared as a fusion protein that serves as a substrate for detecting the protease activity of S273R protease (also referred to as "pS273R protein"), which is a protease of ASFV.
  • S273R protease also referred to as "pS273R protein”
  • the ssPRO-TM sensor in this example is a fusion protein in which the site corresponding to (d) in the ssPRO-TM sensor of Example 3 is replaced with the cleavage target sequence of the pS273R protein of ASFV. Specifically, it is a fusion protein in which the following (a) to (f) are linked in order from the N-terminal side (Fig. 13, bottom).
  • any one of the following (d1) to (d6) was used as the pS273R cleavage target sequence of (d) above.
  • (d1) to (d6) below correspond to pS273R cleavage sites in polyproteins pp220 and pp60 of ASFV shown in FIG. (d1)
  • Amino acid sequence consisting of 23 amino acids before and after the boundary between p5 and p34 in the ASFV polyprotein pp220 illustrated as "pp220 p5/p34 cleavage site" in FIG.
  • the ssPRO-TM sensor can detect the activity of viral proteases derived from ASFV.
  • Example 7 Evaluation of cleavage activity for SUMO protein, ISG15 protein, and ubiquitin protein> (Purpose)
  • the protease activity of pS273R protein is evaluated using UMO protein, ISG15 protein, and ubiquitin protein as cleavage targets.
  • hSUMO-1 sensor Construction of hSUMO-1 sensor, hSUMO-2 sensor, hISG15 sensor, and 2xUb sensor
  • Various sensors shown in Fig. 15A were constructed.
  • Each sensor is a fusion protein in which the following (a) to (f) are linked in order from the N-terminal side (Fig. 15A).
  • any one of the following (d1) to (d4) was used as the cleavage target sequence of (d) above.
  • the sensors including each of (d1) to (d4) are called “hSUMO-1 sensor”, “hSUMO-2 sensor”, “hISG15 sensor” and “2xUb sensor”, respectively.
  • An expression plasmid expressing each sensor was constructed.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

ハイスループット化が可能であり、かつプロテアーゼの全長アミノ酸配列に基づく活性測定を可能とする新たなプロテアーゼ活性測定方法を提供することである。　プロテアーゼ活性測定用の融合タンパク質基質であって、N末端側から順に、(i)シグナル配列、レポーター領域、プロテアーゼ標的領域、及び膜結合領域、又は(ii)シグナル配列、プロテアーゼ標的領域、レポーター領域、及び膜結合領域 を含む、前記融合タンパク質基質を提供する。

Description

プロテアーゼ活性測定用の融合タンパク質基質
　本発明は、プロテアーゼ活性測定用の融合タンパク質基質、プロテアーゼ活性測定キット、及びプロテアーゼ活性を測定する方法に関する。
　ISG15タンパク質は、2つのユビキチン様ドメインを含み、細胞内ではユビキチンと同様に標的タンパク質に対して付加されることで翻訳後修飾（ISG15化修飾）に用いられている。
　ISG15タンパク質の発現はインターフェロンの刺激やウイルス感染等によって誘導され、ISG15化修飾は抗ウイルス免疫等の自然免疫において重要な役割を果たすことが知られている。ISG15欠損マウスを用いた研究では、ISG15化修飾がインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、及びトガウイルス等に対する抗ウイルス活性に重要であることが報告されている（非特許文献１）。また、ISG15化修飾がリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（LCMV）及び水疱性口内炎ウイルス（VSV）の脳内接種に対する抵抗性に寄与することも報告されている（非特許文献２）。
　一方、ISG15化修飾に基づく宿主の免疫を回避するために、脱ISG15化修飾に働くウイルスタンパク質も知られている。脱ISG15化修飾は、ISG15で修飾されたタンパク質からISG15タンパク質の部分を切断する反応である。脱ISG15化酵素はプロテアーゼ酵素の一種であり、その例としては、コロナウイルスのNsp3タンパク質やクリミヤコンゴ出血熱ウイルスのLタンパク質が挙げられる。ウイルスタンパク質の脱ISG15化活性を阻害すればウイルス複製を阻害すると同時に宿主の免疫を活性化することが期待されるため、脱ISG15化酵素は格好の創薬標的と考えられる。
　これまでISG15化修飾及び脱ISG15化修飾を検出する方法として、抗ISG15抗体等の抗体に基づくウエスタンブロッティングが用いられてきた。この方法は細胞内のISG15化修飾及び脱ISG15化修飾を直接検出することができるという利点を有する反面、スループット性を欠くため、創薬スクリーニングには応用できないという問題があった。
　また、プロテアーゼ活性をin vitroで評価する一般的な方法として、蛍光標識した基質ペプチドに対して精製した組換えタンパク質を反応させる方法が知られている。しかし、この方法では活性を有する組換えタンパク質の精製が必要となるため、分子量の大きなプロテアーゼや膜貫通部位を有するプロテアーゼの場合には部分断片を使用することが必要となり、基質として使用するタンパク質も短いペプチドに限定されてしまう弊害がある。それ故、この方法では適用可能なプロテアーゼ及び基質タンパク質の範囲が限定される上、検出される活性が本来のプロテアーゼ活性を十分に反映しないという問題があった。
　したがって、ハイスループット化が可能であり、かつプロテアーゼの全長アミノ酸配列に基づく活性測定を可能とする新たなプロテアーゼ活性測定方法が必要とされている。
Lenschow D.J., et al., PROc Natl Acad Sci USA, 2007, 104: 1371-1376. Ritchie K.J., et al., Nature Medicine, 2004, 10: 1374-1378.
　本発明の目的は、ハイスループット化が可能であり、かつプロテアーゼの全長アミノ酸配列に基づく活性測定を可能とする新たなプロテアーゼ活性測定方法を提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、シグナル配列、レポーター領域、プロテアーゼ標的領域、及び膜貫通ドメインを含む、プロテアーゼ活性測定用の新たな融合タンパク質基質を作製した。この融合タンパク質基質をウイルスプロテアーゼと共に細胞に導入して膜上に発現させると、プロテアーゼ活性によって切断された断片が細胞外に放出される。放出された断片のレポーター活性を細胞上清中で検出すれば、プロテアーゼ活性を測定することができる。本発明者らは、この方法をコロナウイルスSARS-CoV2のプロテアーゼであるNsp3タンパク質に適用することで、その脱ISG15化活性を検出することに成功した。続いて、この方法をネココロナウイルス（FeCoV）、ヒトT細胞白血病ウイルス1型（HTLV-1）、及びアフリカ豚熱ウイルス由来のプロテアーゼに適用することでプロテアーゼ全般の活性を極めて高い感度で検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は、上記研究成果に基づくものであって、以下を提供する。
（１）プロテアーゼ活性測定用の融合タンパク質基質であって、N末端側から順に、
　(i)シグナル配列、レポーター領域、プロテアーゼ標的領域、及び膜結合領域、又は
　(ii)シグナル配列、プロテアーゼ標的領域、レポーター領域、及び膜結合領域
を含む、前記融合タンパク質基質。
（２）前記プロテアーゼが、ウイルスプロテアーゼ又は脱ユビキチン化酵素である、（１）に記載の融合タンパク質基質。
（３）前記ウイルスプロテアーゼが、コロナウイルス科、レトロウイルス科、アスファウイルス科、フラビウイルス科、カリシウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、アデノウイルス科、トガウイルス科、又はマトナウイルス科に由来する、（２）に記載の融合タンパク質基質。
（４）前記コロナウイルス科に由来するウイルスプロテアーゼの標的領域が、配列番号4、12、又は13で示すアミノ酸配列を含む、（３）に記載の融合タンパク質基質。
（５）前記レトロウイルス科に由来するウイルスプロテアーゼの標的領域が、配列番号21～27及び62～70からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含む、（３）に記載の融合タンパク質基質。
（６）前記アスファウイルス科に由来するウイルスプロテアーゼの標的領域が、配列番号41～46からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含む、（３）に記載の融合タンパク質基質。
（７）前記フラビウイルス科に由来するウイルスプロテアーゼの標的領域が、配列番号73～77、80～84、及び86～90からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含む、（３）に記載の融合タンパク質基質。
（８）前記カリシウイルス科に由来するウイルスプロテアーゼの標的領域が、配列番号104～108及び110～113からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含む、（３）に記載の融合タンパク質基質。
（９）前記ピコルナウイルス科に由来するウイルスプロテアーゼの標的領域が、配列番号93～102からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含む、（３）に記載の融合タンパク質基質。
（１０）前記脱ユビキチン化酵素の標的領域が、ユビキチンタンパク質、SUMOタンパク質、又はISG15タンパク質を含む、（２）に記載の融合タンパク質基質。
（１１）前記ユビキチンタンパク質が、配列番号33又は59で示すアミノ酸配列、そのいずれかに対して90％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、又はそのいずれかにおいて1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、（１０）に記載の融合タンパク質基質。
（１２）前記SUMOタンパク質が、配列番号47、56、48、57、49、58、又は60で示すアミノ酸配列、そのいずれかに対して90％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、又はそのいずれかにおいて1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、（１０）に記載の融合タンパク質基質。
（１３）前記ISG15タンパク質が、配列番号4又は55で示すアミノ酸配列、そのいずれかに対して90％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、又はそのいずれかにおいて1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、（１０）に記載の融合タンパク質基質。
（１４）（１）～（１３）のいずれかに記載の融合タンパク質基質をコードする核酸。
（１５）（１４）に記載の核酸を発現可能な状態で含む遺伝子発現ベクター。
（１６）（１５）に記載の遺伝子発現ベクターを含む宿主細胞。
（１７）前記プロテアーゼ標的領域を切断するプロテアーゼをコードする塩基配列を発現可能な状態で含む遺伝子発現ベクターをさらに含む、（１６）に記載の宿主細胞。
（１８）（１）～（１３）のいずれかに記載の融合タンパク質基質、（１４）に記載の核酸、（１５）に記載の遺伝子発現ベクター、並びに（１６）及び（１７）に記載の宿主細胞からなる群から選択される１以上を含む、プロテアーゼ活性測定キット。
（１９）プロテアーゼ活性を測定する方法であって、溶液中でプロテアーゼ活性測定用の融合タンパク質基質を発現する宿主細胞を被験対象のプロテアーゼと反応させる反応工程、ここで前記融合タンパク質基質はN末端側から順にシグナル配列、レポーター領域、プロテアーゼ標的領域、及び膜結合領域を含み、反応後の溶液から上清を回収する回収工程、並びに前記上清中の前記レポーター領域に基づくレポーター活性を測定する測定工程を含む、前記方法。
（２０）プロテアーゼ活性を測定する方法であって、溶液中でプロテアーゼ活性測定用の融合タンパク質基質を発現する宿主細胞を被験対象のプロテアーゼと反応させる反応工程、ここで前記融合タンパク質基質はN末端側から順にシグナル配列、プロテアーゼ標的領域、レポーター領域、及び膜結合領域を含み、並びに反応後の宿主細胞において前記レポーター領域に基づくレポーター活性を測定する測定工程を含む、前記方法。
（２１）前記被験対象のプロテアーゼが前記融合タンパク質基質を切断する、（１９）又は（２０）に記載の方法。
（２２）前記測定工程後に宿主細胞の生存率を測定する、（１９）～（２１）のいずれかに記載の方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2021-095348号の開示内容を包含する。
　本発明の融合タンパク質基質によれば、ハイスループット化が可能であり、かつプロテアーゼの全長アミノ酸配列に基づく活性測定を可能とする新たなプロテアーゼ活性測定方法が提供される。
ISG15タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。 ssISG sensor発現プラスミド及びssISG sensorの構造を示す図である。図2Aは、ssISG sensor発現プラスミドの構造を示す。図2Bは、ssISG sensorの構造を示す。 コロナウイルスのポリプロテインPP1abの構造を示す図である。PP1abタンパク質はNsp3タンパク質及びNsp5タンパク質のプロテアーゼ活性によって切断され、15種類の非構造タンパク質（Nsp1～Nsp16）となる。灰色の三角印はNsp3タンパク質の切断箇所を示し、黒色の三角印はNsp5タンパク質の切断箇所を示す。 ssNsp3発現プラスミド及びssNsp3タンパク質の構造を示す図である。図4Aは、ssNsp3発現プラスミドの構造を示す。図4Bは、ssNsp3タンパク質の構造を示す。PL2proはパパイン様プロテアーゼドメインを示す。 脱ISG15化活性評価方法の例示的な原理と結果を示す図である。図5Aは脱ISG15化活性評価方法の原理の一例を示す。図5Bは、ssISG sensorと共にssNsp3(WT)タンパク質又はssNsp3(CHAA)タンパク質を発現する細胞の培養上清においてルシフェラーゼ活性を検出した結果を示す。図5Cは、ssISG sensorと共に、N末端側にシグナル配列を有するssNsp3(WT)タンパク質又はシグナル配列を有しないNsp3(-ss)タンパク質を発現する細胞の培養上清においてルシフェラーゼ活性を検出した結果を示す。NSPタンパク質のN末端におけるシグナル配列(ss)の有無を+/-で示す。結果はn=6の実験の平均値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。 ssISG sensorの構造及び各ssISG sensorに対する脱ISG15化活性を評価した結果を示す図である。図6Aは、ssISG sensor (GG)、ssISG sensor (AA)、ssISG sensor (ΔD1)、及びssISG sensor (ΔD1+2)の構造を示す。図6Bは、各ssISG sensorと共にssNsp3(WT)タンパク質又はssNsp3(CHAA)タンパク質を発現する細胞の培養上清においてルシフェラーゼ活性を検出した結果を示す。結果はn=6の実験の平均値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。 コロナウイルスのポリプロテインPP1ab及びssPRO-TM sensorの構造を示す図である。PP1abタンパク質はNsp3タンパク質及びNsp5タンパク質のプロテアーゼ活性によって切断され、15種類の非構造タンパク質（Nsp1～Nsp16）となる。灰色の三角印はNsp3タンパク質の切断箇所を示し、黒色の三角印はNsp5タンパク質の切断箇所を示す。図の右側にNsp4/Nsp5間及びNsp5/Nsp6間の切断部位の配列を示す。図の下側にPRO-TM sensorの構造を示す。 ssNsp4/5-TM sensor又はssNsp5/6-TM sensorと共にssNsp5(WT)タンパク質又はssNsp5(C144A)タンパク質を発現する細胞の培養上清においてルシフェラーゼ活性を検出した結果を示す。結果はn=6の実験の平均値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。 HTLV-1のポリプロテインGAG-PRO-POL及びssPRO-TM sensorの構造を示す図である。GAG-PRO-POLタンパク質はPROタンパク質のプロテアーゼ活性によって切断され、GAGタンパク質やPROタンパク質等の個々のタンパク質となる。図の中央にPROタンパク質によって切断される7箇所の配列を示す。 ssPRO-TM sensorと共にssGAG-PRO(WT又はD32A)タンパク質を発現する細胞の培養上清においてルシフェラーゼ活性を検出した結果を示す。結果はn=4の実験の平均値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。 プロテアーゼ阻害剤GC376の阻害活性を評価した結果を示す図である。図11Aは、プロテアーゼ阻害剤GC376の構造を示す。図11Bは、異なるGC376濃度条件下にて、SARS-CoV2のNsp3タンパク質及びNsp5タンパク質、並びにHTLV-1のPROタンパク質のプロテアーゼ活性を評価した結果を示す。図11Cは、WST8アッセイを用いて培養後の細胞生存率を測定した結果を示す。 アフリカ豚熱ウイルスのポリプロテインpp220及びpp60の構造を示す図である。pp220タンパク質は、S273Rプロテアーゼにより切断され、5つのタンパク質を生じる。pp60タンパク質は同様に3つのタンパク質を生じる。黒色の三角印はS273Rプロテアーゼの切断箇所を示す。 S273Rプロテアーゼの標的配列を含むssPRO-TM sensorの構造を示す図である。切断される6種類の配列を図において上側に示す。 ssPRO-TM sensorと共にpS273R(WT又はC232A)タンパク質を発現する細胞の培養上清においてルシフェラーゼ活性を検出した結果を示す。結果はn=4の実験の平均値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。 各sensorの構造及びプロテアーゼ活性を評価した結果を示す図である。図15Aは、hSUMO-1 sensor、hSUMO-2 sensor、hISG15 sensor、及び2xUb sensorの構造を示す。図15Bは、各sensorのみ、又は各sensorと共にpS273R(WT又はC232A)タンパク質を発現する細胞の培養上清においてルシフェラーゼ活性を検出した結果を示す。結果はn=6の実験の平均値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
１．プロテアーゼ活性測定用の融合タンパク質基質
１－１．概要
　本発明の第1の態様は、プロテアーゼ活性測定用の融合タンパク質基質である。本発明の融合タンパク質基質は、N末端側のシグナル配列、及びC末端側の膜結合領域を含み、その間にレポーター領域及びプロテアーゼ標的領域を含む。本態様の融合タンパク質基質がプロテアーゼによって切断されるとレポーター領域を含む断片が検出される。
１－２．定義
　本明細書で頻用する以下の用語について定義する。
　本明細書において「ISG15（Interferon-Stimulated Gene 15kDa:インターフェロン刺激遺伝子15kDa）タンパク質」とは、ユビキチン様ドメイン1及びユビキチン様ドメイン2を含むタンパク質である（図1）。ISG15タンパク質は、ユビキチンと同様に他のタンパク質に付加されることで翻訳後修飾において機能している。
　本明細書においてISG15タンパク質には、任意の生物種に由来するISG15タンパク質が含まれる。具体的には、ヒトISG15タンパク質（例えば、配列番号4で示すアミノ酸配列からなる成熟型ヒトISG15タンパク質、又は配列番号34で示すアミノ酸配列からなる前駆体型ヒトISG15タンパク質）、及びそのオルソログが挙げられる。ヒトISG15タンパク質のオルソログの例としては、配列番号35で示すアミノ酸配列からなる前駆体型ブタISG15タンパク質、配列番号36で示すアミノ酸配列からなるネコISG15タンパク質、及び配列番号37で示すアミノ酸配列からなるウシISG15タンパク質が挙げられる（図1）。ブタ及びヒトのISG15タンパク質は前駆体タンパク質として産生された後、「LRLRGG」配列よりC末端側のアミノ酸配列（ヒトでは8アミノ酸からなる配列）が除かれて成熟型ISG15タンパク質となる。一方、ネコ及びウシのISG15タンパク質は、C末端の配列が「LRLRGG」である成熟型として産生される（図1）。
　本明細書において「ISG15遺伝子」は、ISG15タンパク質をコードする遺伝子である。ISG15遺伝子の具体例として、配列番号4又は34で示されるアミノ酸配列からなる成熟型又は前駆体型のISG15タンパク質をコードするISG15遺伝子、例えば配列番号38又は39で示される塩基配列からなるヒトISG15遺伝子が挙げられる。
　本明細書において「ISG15化修飾」とは、ISG15タンパク質が標的タンパク質に付加されるタンパク質修飾をいう。ISG15化修飾では、ISG15タンパク質は標的タンパク質の主にリジン残基に共有結合する。ISG15化修飾は翻訳後修飾であり、ユビキチン化と同様にユビキチン活性化酵素（E1）、ユビキチン結合酵素（E2）、及びユビキチンリガーゼ（E3）の3種類の酵素によって触媒される。タンパク質のISG15化修飾を触媒する酵素を「ISG15化酵素」という。
　本明細書において「脱ISG15化修飾」とは、ISG15タンパク質とそれが結合した標的タンパク質との間の結合を切断する反応である。脱ISG15化修飾では、通常、成熟型ISG15タンパク質のC末端に位置する「LRLRGG」配列のC末端側の位置でアミド結合が加水分解や脱離反応によって切断される。脱ISG15化修飾はプロテアーゼ反応に含まれる。
　本明細書において「脱ISG15化酵素」とは、脱ISG15化修飾を触媒する酵素である。脱ISG15化酵素はプロテアーゼの一種である。脱ISG15化酵素には、ウイルス由来の酵素と宿主由来の酵素が挙げられる。ウイルス由来の脱ISG15化酵素の例として、コロナウイルスのNsp3タンパク質、及びクリミヤコンゴ出血熱ウイルスのLタンパク質が挙げられる。宿主由来の脱ISG15化酵素の例として、USP18（ユビキチン特異的ペプチダーゼ18）タンパク質が挙げられる。USP18は脱ユビキチン化酵素としても知られている。
　「プロテアーゼ」は、ペプチド又はタンパク質の切断又は分解を触媒する酵素の総称であり、ペプチダーゼ又はプロテイナーゼとも呼ばれる。一般的にプロテアーゼは、アミド結合の加水分解や脱離反応によって基質を切断する。プロテアーゼには、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、金属プロテアーゼ（メタロプロテアーゼ）、グルタミン酸プロテアーゼ、及びアスパラギンペプチドリアーゼが包含される。セリンプロテアーゼの例として、プラスミン、トロンビン、サブチリシン、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、カリクレイン、グランザイム、キマーゼ、FSAPタンパク質、及びV8タンパク質が挙げられる。システインプロテアーゼの例として、パパイン、カテプシンB、カテプシンH、カテプシンL、及びカルパインに加えて、後述のNsp3タンパク質等のパパイン様プロテアーゼ、及びNsp5タンパク質等の3C様プロテアーゼが挙げられる。アスパラギン酸プロテアーゼの例として、ペプシン、及びレニンが挙げられる。メタロプロテアーゼの例として、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、サーモリシン、ACEタンパク質、及びADAMTSタンパク質が挙げられる。プロテアーゼのさらなる例として、脱ユビキチン化酵素、脱ISG15化酵素、シグナルペプチダーゼ、セクレターゼ（例えば、α-セクレターゼ、β-セクレターゼ、及びγ-セクレターゼ）、カテプシン、メプリンA、及びメプリンBが挙げられる。プロテアーゼは、ペプチド又はタンパク質のN末端又はC末端の1アミノ酸を切断するエキソペプチダーゼと、内部のペプチド結合を切断するエンドペプチダーゼに分けられるが、本明細書において好ましいプロテアーゼはエンドペプチダーゼである。プロテアーゼは全長のプロテアーゼ又はその活性断片であってもよい。
　本明細書において「ウイルスプロテアーゼ」には、任意のウイルスに由来するプロテアーゼが包含される。ウイルスプロテアーゼは、ウイルス複製の過程でポリプロテインの切断に関与し得ることが知られている。ウイルスプロテアーゼが由来するウイルスの具体例として、後述するウイルスの例が挙げられる。ウイルスプロテアーゼの例としては、NSP2タンパク質、NSP3タンパク質、NSP5タンパク質、Lプロテアーゼ、3Cプロテアーゼ、NS6プロテアーゼ、NS2B-NS3プロテアーゼ、及びS273Rプロテアーゼ（pS273R）が挙げられる。一本鎖プラス鎖RNAウイルスにおけるウイルスプロテアーゼの具体例として、ニドウイルス目（例えば、アルテリウイルス科）のNSP2タンパク質；コロナウイルス科のNSP3タンパク質及びNSP5タンパク質；ピコルナウイルス目（例えば、口蹄疫ウイルス）のLプロテアーゼ及び3Cプロテアーゼ；カリシウイルス科（例えば、ノロウイルス）のNS6プロテアーゼ；フラビウイルス科（例えば、日本脳炎ウイルス、ジカウイルス、デングウイルス、C型肝炎ウイルス、及び豚熱ウイルス）のNS2B-NS3プロテアーゼ；並びにレトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ヒトT細胞白血病ウイルス1型（HTLV-1)、及びウシ白血病ウイルス（BLV））のプロテアーゼ等が挙げられる。
　本明細書において「脱ユビキチン化酵素」とは、脱ユビキチン化反応を触媒する酵素をいう。ヒトでは95種類の脱ユビキチン化酵素が知られており、システインプロテアーゼ又はメタロプロテアーゼに分類されるものが知られている。脱ユビキチン化酵素の例として、USPスーパーファミリー、OTUスーパーファミリー、MJDスーパーファミリー、UCHスーパーファミリー、及び脱SUMO化酵素が挙げられる。USPスーパーファミリーに属する脱ユビキチン化酵素の具体例としては、脱ISG15化修飾も触媒し得る上述のUSP18タンパク質に加えて、USP1、USP2、USP3、USP4、USP5、USP6、USP7、USP8、USP9X、USP9Y、USP10、USP11、USP12、USP13、USP14、USP15、USP16、USP17、USP17L2、USP17L3、USP17L4、USP17L5、USP17L7、USP17L8、USP19、USP20、USP21、USP22、USP23、USP24、USP25、USP26、USP27X、USP28、USP29、USP30、USP31、USP32、USP33、USP34、USP35、USP36、USP37、USP38、USP39、USP40、USP41、USP42、USP43、USP44、USP45、及びUSP46タンパク質が挙げられる。OTUスーパーファミリーに属する脱ユビキチン化酵素の具体例としては、OTUB1及びOTUB2タンパク質が挙げられる。MJDスーパーファミリーに属する脱ユビキチン化酵素の具体例としては、ATXN3、及びATXN3Lタンパク質が挙げられる。UCHスーパーファミリーに属する酵素の具体例としては、BAP1、UCHL1、UCHL3、及びUCHL5タンパク質が挙げられる。脱SUMO化酵素の具体例としては、SENP1及びSENP2タンパク質が挙げられる。脱ユビキチン化酵素による脱ユビキチン化では、上述の脱ISG15化修飾と同様に、通常はユビキチンのC末端に位置する「LRLRGG」配列のC末端側の位置でアミド結合が加水分解や脱離反応によって切断される。
　本明細書において「融合タンパク質基質」とは、プロテアーゼの基質として機能し得る融合タンパク質である。融合タンパク質基質は、少なくともプロテアーゼ切断の標的となり得る配列を含み、プロテアーゼによる切断後に生じる断片を検出するためのレポーター領域や、局在化シグナル等の機能モジュール（例えば、膜貫通ドメイン）を含むことができる。
　本明細書において「ウイルス」は限定せず、DNAウイルス又はRNAウイルスのいずれであってもよい。DNAウイルスの例として、アスファウイルス科、ポックスウイルス科（例えば、天然痘ウイルス）、ヘルペスウイルス科（例えば、単純ヘルペスウイルス、EBウイルス、及び水痘・帯状疱疹ウイルス）、及びアデノウイルス科等が挙げられる。RNAウイルスの例として、レトロウイルス科（例えば、ヒトT細胞白血病ウイルス1型、及びヒト免疫不全ウイルス（例えばHIV-1及びHIV-2））、トガウイルス科、コロナウイルス科（例えば、SARS-CoV及びSARS-CoV2）、フラビウイルス科（例えば、デングウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、及び豚熱ウイルス）、カリシウイルス科（例えば、ノロウイルス、ネコカリシウイルス）、フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）、マトナウイルス科（例えば、風疹ウイルス）、及びピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、口蹄疫ウイルス）等が挙げられる。
　「コロナウイルス」は、コロナウイルス科に属するウイルスであり、全長約30kbのポジティブ鎖RNAをゲノムとする比較的大型のRNAウイルスである。コロナウイルス科のウイルスは、レトウイルス亜科とオルトコロナウイルス亜科に大きく分けられる。オルトコロナウイルス亜科には、アルファコロナウイルス属、ベータコロナウイルス属、デルタコロナウイルス属、及びガンマコロナウイルス属等が含まれる。アルファコロナウイルス属に属するウイルスの例として、ヒトコロナウイルスNL63、ヒトコロナウイルス229E、猫コロナウイルス、豚流行性下痢ウイルス等が挙げられる。ベータコロナウイルス属に属するウイルスの例として、MERS CoV（中東呼吸器症候群コロナウイルス）、SARS-CoV（SARSコロナウイルス）、及びSARS-CoV2（新型コロナウイルス（new coronavirus; nCoV）又は武漢海鮮市場肺炎ウイルス（Wuhan seafood market pneumonia virus）としても知られている）が挙げられる。ガンマコロナウイルス属に属するウイルスの例として、鶏伝染性気管支炎ウイルスが挙げられる。
　コロナウイルスのウイルスゲノムには、5'末端側に15種類の非構造タンパク質（Nsp1～Nsp16タンパク質）をコードする約20kbのORF1ab遺伝子が存在する（図3）。ORF1ab遺伝子から、Nsp1～Nsp16タンパク質を含む約7,000アミノ酸残基からなる巨大なポリプロテインpp1abが産生される。その後、pp1abタンパク質は切断されて15種類の独立したタンパク質（Nsp1～Nsp16タンパク質）となる。Nsp1～Nsp16タンパク質間の14箇所の切断は、パパイン様プロテアーゼであるNsp3タンパク質（PLproとも呼ばれる）及び3C様プロテアーゼであるNsp5タンパク質（3CLproとも呼ばれる）によって触媒される。Nsp1/Nsp2、Nsp2/Nsp3、及びNsp3/Nsp4の3箇所の切断はNsp3タンパク質によって触媒され、残りの11箇所の切断はNsp5タンパク質によって触媒される。Nsp5タンパク質は11箇所の切断を触媒するため、「main protease」とも呼ばれている。Nsp3タンパク質、Nsp4タンパク質、及びNsp6タンパク質には膜貫通ドメインが存在し、コロナウイルスの複製に重要な二重膜小胞（Double membrane vesicle、DMV）の形成に関与する。また、pp1abタンパク質の3箇所の切断に関与するNsp3タンパク質は、脱ISG15化活性を有し、ISG15化修飾に基づく宿主免疫の回避に関与することが知られている。
　コロナウイルス科では、ウイルス種によってNsp3タンパク質の構造が異なり得る。アルファコロナウイルス属及びベータコロナウイルス属クレードAに属するウイルスのNsp3タンパク質は、2つのパパイン様プロテアーゼドメインとしてPL1pro及びPL2proを含む（図3）。一方、SARS-CoV2を含むベータコロナウイルス属クレードB、クレードC、及びクレードD、並びにデルタコロナウイルス属に分類されるウイルスのNsp3タンパク質は、PL1proを含まず、PL2proのみを含む（図3）。
　本明細書において「レトロウイルス」は、レトロウイルス科に属するウイルスであれば、限定しない。例えば、ヒトT細胞白血病ウイルス1型（HTLV-1）、及びヒト免疫不全ウイルス（HIV）等が挙げられる。
　本明細書において「アスファウイルス」は、アスファウイルス科に属するウイルスであれば、限定しない。アスファウイルス科に属するウイルスとしては、アフリカ豚熱ウイルス（African swine fever virus; ASFV）のみが知られている。アフリカ豚熱ウイルスは、ブタやイノシシに感染し、発熱や全身の出血性病変を特徴とする致死性の高い伝染病として知られるアフリカ豚熱を媒介するウイルスである。アフリカブタ熱ウイルスは、ダニによる媒介や動物間の接触により感染し得る。アフリカブタ熱ウイルスは、約170 kb～190 kbの直鎖状二本鎖DNAをゲノムとして有する。アフリカブタ熱ウイルスのウイルスゲノムにコードされるポリプロテインpp220（CP2475Lとも呼ばれる）は、S273Rプロテアーゼにより切断されて5種類の独立したタンパク質（p5、p34、p14、p37、及びp150）を生じる。ウイルスゲノムにコードされるポリプロテインpp60（CP530Rとも呼ばれる）は、S273Rプロテアーゼにより切断されて3種類の独立したタンパク質（p15、p35、及びp8）を生じる。
　「リンカーペプチド」とは、本発明の融合タンパク質基質において、融合される各部分が目的の機能を果たすために、各部分の間に挿入され得るペプチドである。リンカーペプチドの長さは限定しないが、通常は3～100アミノ酸長、好ましくは5～50アミノ酸長が例示される。側鎖が比較的小さいアミノ酸、例えばセリンやグリシンを多く含むペプチドが用いられる場合が多い。
　「タグペプチド」とは、タンパク質を標識化することのできるペプチドであり、通常は十数アミノ酸～数十アミノ酸からなる短ペプチドであって、タンパク質の検出用又は精製用として用いられる。通常は、標識すべきタンパク質をコードする遺伝子の5’末端側又は3’末端側にタグペプチドをコードする塩基配列を連結し、タグペプチドとの融合タンパク質として発現させることで標識化する。タグペプチドは、当該分野で様々な種類が開発されているが、いずれのタグペプチドを使用してもよい。タグペプチドはエピトープタグであってもよい。タグペプチドの具体例として、FLAG、HA、His、DAP、PA、GST、myc、MBPタグ、及びストレプトアビジン等が挙げられる。
　本明細書において「活性断片」とは、タンパク質の一部領域を含み、かつその断片が全長タンパク質の活性の1％以上、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上、又は同等以上を保持するポリペプチド断片をいう。活性断片のアミノ酸長は、タンパク質の活性を保持する限り特に制限しない。
　本明細書において「複数個」とは、2以上の整数、例えば、2～10個、2～7個、2～5個、2～4個又は2～3個の整数をいう。
　本明細書において「アミノ酸同一性（アミノ酸配列同一性）」とは、比較する2つのポリペプチドのアミノ酸配列において、アミノ酸残基の一致数が最大となるように、必要に応じて一方又は双方に適宜ギャップを挿入して整列化（アラインメント）したときに、全アミノ酸残基数における一致アミノ酸残基数の割合（％）をいう。「塩基同一性（塩基配列同一性）」も同様に決定することができる。
　本明細書において「アミノ酸の置換」とは、天然のタンパク質を構成する20種類のアミノ酸間の置換をいう。アミノ酸の置換は、好ましくは電荷、側鎖、極性、芳香族性等の性質の類似する保存的アミノ酸群内での置換である。例えば、低極性側鎖を有する無電荷極性アミノ酸群（Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Cys, Tyr）、分枝鎖アミノ酸群（Leu, Val, Ile）、中性アミノ酸群（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, PRO）、親水性側鎖を有する中性アミノ酸群（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys）、酸性アミノ酸群（Asp, Glu）、塩基性アミノ酸群（Arg, Lys, His）、芳香族アミノ酸群（Phe, Tyr, Trp）内での置換が挙げられる。
１－３．構成
　本発明の融合タンパク質基質は、N末端側のシグナル配列、及びC末端側の膜結合領域を含み、その間にレポーター領域及びプロテアーゼ標的領域を含む。レポーター領域は、プロテアーゼ標的領域のN末端側又はC末端側のいずれかに位置し得る。
　一実施形態において、本発明の融合タンパク質基質は、N末端側から順に、シグナル配列、レポーター領域、プロテアーゼ標的領域、及び膜結合領域を含む。この配置は、プロテアーゼ標的領域のサイズが比較的小さい場合、例えばプロテアーゼ標的領域が1000アミノ酸以下、900アミノ酸以下、800アミノ酸以下、700アミノ酸以下、600アミノ酸以下、500アミノ酸以下、400アミノ酸以下、300アミノ酸以下、200アミノ酸以下、150アミノ酸以下、100アミノ酸以下、50アミノ酸以下、40アミノ酸以下、30アミノ酸以下、20アミノ酸以下、又は10アミノ酸以下、及び／又は100kDa以下、90kDa以下、80kDa以下、70kDa以下、60kDa以下、50kDa以下、40kDa以下、30kDa以下、20kDa以下、15kDa以下、10kDa以下、5kDa以下、4kDa以下、3kDa以下、2kDa以下、又は1kDa以下である場合に好ましい。
　別の実施形態では、本発明の融合タンパク質基質は、N末端側から順に、シグナル配列、プロテアーゼ標的領域、レポーター領域、及び膜結合領域を含む。この配置は、プロテアーゼ標的領域のサイズが比較的大きい場合、例えばプロテアーゼ標的領域が、10アミノ酸以上、20アミノ酸以上、30アミノ酸以上、40アミノ酸以上、50アミノ酸以上、100アミノ酸以上、150アミノ酸以上、200アミノ酸以上、300アミノ酸以上、400アミノ酸以上、500アミノ酸以上、600アミノ酸以上、700アミノ酸以上、800アミノ酸以上、900アミノ酸以上、又は1000アミノ酸以上、及び／又は1kDa以上、2kDa以上、3kDa以上、4kDa以上、5kDa以上、10kDa以上、15kDa以上、20kDa以上、30kDa以上、40kDa以上、50kDa以上、60kDa以上、70kDa以上、80kDa以上、90kDa以上、又は100kDa以上である場合に好ましい。そのような場合、レポーター領域のレポーター活性がプロテアーゼ標的領域の存在によって抑制又は阻害され得るため、切断後にそれが解除されることによってレポーター活性が増大し得る。レポーター活性の変化を検出することで、プロテアーゼ活性を評価することができる。
　本明細書において「シグナル配列」とは、遺伝子発現によって生合成されたタンパク質を細胞外に分泌させる際に必要となる細胞外移行シグナルであり、シグナルペプチドとも呼ばれる。シグナル配列は、疎水性アミノ酸で構成される領域を含み得る。シグナル配列は、翻訳後、細胞外に移行する前にシグナルペプチダーゼによって切断除去される。シグナル配列は、多くの分泌タンパク質及び膜タンパク質のN末端に存在し、例えば15～30アミノ酸長である。シグナル配列は、任意の生物種に由来してもよく、ヒト又は非ヒト、例えば昆虫細胞又はウイルス由来であってもよい。ヒト由来のシグナル配列の例として、免疫グロブリンκ軽鎖のシグナル配列（配列番号1）、並びに１又は複数個のアミノ酸の挿入、欠失、置換、及び／又は付加を有するその変異体が挙げられる。
　本明細書において「レポーター領域」とは、本発明の融合タンパク質基質からプロテアーゼ切断によって生じる断片（レポーター領域がプロテアーゼ標的領域のN末端側に位置する場合は細胞外に放出される断片が該当し、レポーター領域がプロテアーゼ標的領域のC末端側に位置する場合は膜に固定されて残る断片が該当する）を検出する際に標識となり得る領域である。通常は、それに含まれるレポーター活性に基づいて、目的とする断片の存在の有無を判別できるポリペプチドや、その存在量を測定できるポリペプチドが該当する。レポーター領域の例として、蛍光タンパク質、発光タンパク質、及び酵素タンパク質が挙げられる。
　本明細書において「レポーター活性」とは、レポーター領域に含まれ、レポーター領域の検出を可能とする活性である。例えば、蛍光タンパク質の蛍光活性、発光タンパク質の発光活性、酵素タンパク質の酵素活性が挙げられる。
　「蛍光タンパク質」は、特定波長の励起光を照射したときに特定波長の蛍光を発するタンパク質をいう。天然型及び非天然型のいずれであってもよい。また、励起波長、蛍光波長も特に限定はしない。具体的には、例えば、CFP、BFP、RFP、mCherry、DsRed（3xP3-DsRedのような派生物を含む）、YFP、PE、PerCP、APC、GFP（EGFP、3xP3-EGFP等の派生物を含む）等が挙げられる。
　「発光タンパク質」とは、励起光を必要とすることなく発光することのできる基質タンパク質又はその基質タンパク質の発光を触媒する酵素をいう。例えば、基質タンパク質としてのルシフェリン又はイクオリン、酵素としてのルシフェラーゼ（例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、及びバクテリアルシフェラーゼ）が挙げられる。
　「色素タンパク質」は、色素の生合成に関与するタンパク質、又は基質の付与により色素による化学的検出を可能にするタンパク質であり、通常は酵素である。そのような酵素の具体例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ（AP）、β-ガラクトシダーゼ（LacZ）、β-グルクロニターゼ（GUS）、及びメラニン系色素合成タンパク質等が挙げられる。
　レポーター領域として、上記の例以外に、抗体等により検出可能なタグペプチドやエピトープ配列を使用することもできる。
　本明細書において「プロテアーゼ標的領域」とは、プロテアーゼの切断標的となり得る領域である。プロテアーゼ標的領域の例としては上述したいずれかのプロテアーゼの標的となり得る領域が挙げられる。プロテアーゼ標的領域は、例えば、ウイルスプロテアーゼの標的領域、脱ユビキチン化酵素の標的領域、又は脱ISG15化酵素の標的領域であってもよい。
　ウイルスプロテアーゼの標的領域の具体例としては、以下に限定はしないが、コロナウイルスNsp3タンパク質の標的配列（例えば、配列番号4又は34で示す成熟型又は前駆体型のヒトISG15タンパク質のアミノ酸配列）、コロナウイルスNsp5タンパク質の標的配列（例えば、配列番号12又は13）、ヒトT細胞白血病ウイルス1型（HTLV-1）プロテアーゼであるPROタンパク質の標的配列（例えば、配列番号21～27）、アフリカ豚熱ウイルス（ASFV）プロテアーゼであるpS273Rタンパク質の標的配列（例えば、それぞれ配列番号41～46で示すアミノ酸配列からなるpp220 p5/p34切断部位、pp220 p34/p14切断部位、pp220 p14/p37切断部位、pp220 p37/p150切断部位、pp60 p15/p35切断部位、及びpp60 p35/p8切断部位）、ヒト免疫不全ウイルス1（Human Immunodeficiency Virus 1、HIV-1）プロテアーゼ（配列番号61）の標的配列（例えば、それぞれ配列番号62～70で示すアミノ酸配列からなるHIV MA/CA切断部位、HIV CA/p2切断部位、HIV p2/NC切断部位、HIV NC/p1切断部位、HIV p1/p6切断部位、HIV TF/PR切断部位、HIV PR/RT切断部位、HIV RT/RH切断部位、及びHIV RH/IN切断部位）、C型肝炎ウイルス（Hepatitis C virus、HCV）のプロテアーゼであるHCV NS2-3タンパク質（配列番号71）又はHCV NS3タンパク質（配列番号72）の標的配列（例えば、それぞれ配列番号73～77で示すアミノ酸配列からなるHCV NS2/NS3切断部位、HCV NS3/NS4A切断部位、HCV NS4A/NS4B切断部位、HCV NS4B/NS5A切断部位、及びHCV NS5A/RdRp切断部位）、豚熱ウイルス（Classical swine fever virus、CSFV)のプロテアーゼであるCSFV Nproタンパク質（配列番号78）又はCSFV NS3タンパク質（配列番号79）の標的配列（例えば、それぞれ配列番号80～84で示すアミノ酸配列からなるCSFV Npro/C切断部位、CSFV NS3/NS4A切断部位、CSFV NS4A/NS4B切断部位、CSFV NS4B/NS5A切断部位、及びCSFV NS5A/RdRp切断部位）、日本脳炎ウイルス（Japanese encephalitis virus、JEV）のプロテアーゼであるJEV NS3タンパク質（配列番号85）の標的配列（例えば、それぞれ配列番号86～90で示すアミノ酸配列からなるJEV C/pr切断部位、JEV NS2B/NS3切断部位、JEV NS3/NS4A切断部位、JEV NS4A/NS4B切断部位、及びJEV NS4B/NS5切断部位）、口蹄疫ウイルス（Foot-and-mouth disease virus、FMDV）のプロテアーゼであるFMDV Nproタンパク質（配列番号91）又はFMDV 3Cproタンパク質（配列番号92）の標的配列（例えば、それぞれ配列番号93～102で示すアミノ酸配列からなるFMDV L/VP4切断部位、FMDV VP3/VP1切断部位、FMDV VP1/2A切断部位、FMDV 2B/2C切断部位、FMDV 2C/3A切断部位、FMDV 3A/3B切断部位、FMDV 3B1/3B2切断部位、FMDV 3B2/3B3切断部位、FMDV 3B/3C切断部位、及びFMDV 3C/3D切断部位）、ノロウイルス（Norovirus、NoV）のプロテアーゼであるNoV NS6タンパク質（配列番号103）の標的配列（例えば、それぞれ配列番号104～108で示すアミノ酸配列からなるNoV NS2/NS3切断部位、NoV NS3/NS4切断部位、NoV NS4/NS5切断部位、NoV NS5/NS6切断部位、及びNoV NS6/NS7切断部位）、ネコカリシウイルス（Feline calicivirus、FCV）のプロテアーゼであるFCV Proタンパク質（配列番号109）の標的配列（例えば、それぞれ配列番号110～113で示すアミノ酸配列からなるFCV p32/p39切断部位、FCV p39/p30切断部位、FCV p30/p13切断部位、及びFCV p13/Pro切断部位）が挙げられる。
　脱ユビキチン化酵素の標的領域の具体例としては、ユビキチンタンパク質、SUMOタンパク質、及びISG15タンパク質が挙げられる。ユビキチンタンパク質、SUMOタンパク質、及びISG15タンパク質の由来生物種は、特に限定しない。ユビキチンタンパク質の例として、ヒトユビキチンタンパク質（配列番号33）、マウスユビキチンタンパク質（配列番号33）、及び酵母ユビキチンタンパク質（配列番号59）が挙げられる。なお、ユビキチンタンパク質は、USP18タンパク質の標的配列となり得る。SUMOタンパク質はSUMOファミリータンパク質であれば限定せず、例えば、SUMO-1タンパク質（例：ヒトSUMO-1タンパク質（配列番号47）、マウスSUMO-1タンパク質（配列番号56））、SUMO-2タンパク質（例：ヒトSUMO-2タンパク質（配列番号48）、マウスSUMO-2タンパク質（配列番号57））、SUMO-3タンパク質（例：ヒトSUMO-3タンパク質（配列番号49）、マウスSUMO-3タンパク質（配列番号58））、及び酵母SMT3タンパク質（配列番号60）が挙げられる。ISG15タンパク質の例として、成熟型のヒトISG15タンパク質（配列番号4）及びマウスISG15タンパク質（配列番号55）が挙げられる。ユビキチンタンパク質、SUMOタンパク質、及びISG15タンパク質は、上記のいずれかで示すアミノ酸配列（例えば、ヒトユビキチンタンパク質（配列番号33）、ヒトSUMO-1タンパク質（配列番号47）、ヒトSUMO-2タンパク質（配列番号48）、ヒトSUMO-3タンパク質（配列番号49）、又はヒトISG15タンパク質（配列番号4））に対して80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、又は99％以上のアミノ酸同一性を有するものや、そのいずれかにおいて1個又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたものであってもよい。
　脱ISG15化酵素の標的領域の具体例としては、上述のコロナウイルスNsp3タンパク質やUSP18タンパク質の標的配列が挙げられる。
　なお、プロテアーゼ標的領域は、必ずしもプロテアーゼによって実際に切断される領域に限定されず、その候補配列等、切断標的となる可能性のある領域であってもよい。
　本明細書において「膜結合領域」とは、本発明の融合タンパク質基質を膜に安定的に組み込むか又は付着させる領域である。膜結合領域の例には、後述する膜タンパク質又はその断片や、疎水性アミノ酸残基を主に含む人工的な膜貫通ドメインが挙げられる。
　本明細書において「膜タンパク質」には、内在性膜タンパク質、表在性膜タンパク質、及び脂質アンカー型タンパク質が含まれる。
　「内在性膜タンパク質」は、その少なくとも一部が膜中に埋め込まれ得るタンパク質であり、一体型モノトピックタンパク質及び膜貫通型タンパク質が包含される。一体型モノトピックタンパク質は、膜を完全には貫通しておらず、膜の片側のみに突き出す膜タンパク質である。膜貫通型タンパク質は、膜を完全に貫通している膜タンパク質である。膜貫通型タンパク質は、膜貫通ドメインを1つ有する1回膜貫通型タンパク質、及び2つ以上有する複数回膜貫通型タンパク質に分けられる。1回膜貫通型タンパク質の具体例としては、免疫グロブリン重鎖が挙げられる。複数回膜貫通型タンパク質の具体例としては、コリントランスポーター、ヒスタミンH1受容体、及びGタンパク質共役型受容体が挙げられる。
　「表在性タンパク質」は、そのタンパク質自体は膜中に埋め込まれていないが、脂質や内在性膜タンパク質との結合によって膜に固定されているタンパク質である。
　「脂質アンカー型タンパク質」は、脂質修飾によって付加された脂質によって膜に固定されているタンパク質である。具体例としては、GPI（グリコシルホスファチジルイノシトール）化タンパク質、プレニル化タンパク質、コレステロール化タンパク質、及び脂肪酸アシル化（例えば、S-パルミトイル化及びN-ミリストイル化）タンパク質が挙げられる。
　膜タンパク質の断片は、上記いずれかの膜タンパク質の一部であって、膜に固定され得るものが挙げられる。例えば、膜貫通型タンパク質中の1又は2以上の膜貫通ドメインを含む断片が挙げられる。例えば、CD3、CD4、CD8、CD28、及びIL-2受容体の膜貫通ドメインが挙げられる。
　一実施形態において、膜結合領域は、シグナル配列と同一生物種に由来していてもよく、及び／又は同一のタンパク質に由来していてもよい。
　本発明の融合タンパク質基質は、上述のシグナル配列、レポーター領域、プロテアーゼ標的領域、及び膜結合領域以外に、必要に応じてリンカーペプチドやタグペプチド等を含むことができる。
１－４．効果
　本発明の融合タンパク質基質が、N末端側から順に、シグナル配列、レポーター領域、プロテアーゼ標的領域、及び膜結合領域を含む場合、プロテアーゼ標的領域における切断によってレポーター領域を含む断片が細胞外に放出され、レポーター活性が細胞上清中で検出され得る。
　本発明の融合タンパク質基質が、N末端側から順に、シグナル配列、プロテアーゼ標的領域、レポーター領域、及び膜結合領域を含む場合、プロテアーゼ標的領域における切断によって抑制又は阻害が解除されたレポーター活性の変化が細胞において検出され得る。
２．融合タンパク質基質をコードする核酸
２－１．概要
　本発明の第2の態様は、融合タンパク質基質をコードする核酸である。
２－２．構成
　「融合タンパク質基質をコードする核酸」は、第1態様に記載のいずれかの融合タンパク質基質をコードする核酸であればよい。そのような核酸の塩基配列は、限定はしない。例えば、コドン最適化した塩基配列や、5’末端側に開始コドン（ATG）が付加された塩基配列も例示される。融合タンパク質基質をコードする核酸の具体例として、配列番号8、15、17、29、及び32で示す塩基配列からなる核酸が挙げられる。
３．融合タンパク質基質をコードする核酸を含む遺伝子発現ベクター
３－１．概要
　本発明の第3の態様は、前記第2態様に記載の融合タンパク質基質をコードする核酸を発現可能な状態で含む遺伝子発現ベクター（以下、「融合タンパク質基質発現ベクター」と表記する）である。本態様の遺伝子発現ベクターは、哺乳動物細胞等の細胞に導入して、誘導タンパク質基質を発現させることができる。
３－２．構成
　本態様の遺伝子発現ベクターは、第2態様に記載の核酸、及びプロモーターを含み、細胞内で融合タンパク質基質を発現可能な遺伝子発現ベクターである。遺伝子発現ベクターは、前記構成要素である核酸及びプロモーターに加えて、必要に応じて、標識遺伝子、イントロン、エンハンサー、ターミネーター、複製起点、及び／又はポリAシグナル等の構成要素を含んでいてもよい。
　本明細書において「遺伝子発現ベクター」とは、遺伝子や遺伝子断片（以下「遺伝子等」と表記する）を発現可能な状態で含み、その遺伝子等の発現を制御できる発現単位を包含するベクターをいう。遺伝子発現ベクターは、プラスミドベクターやウイルスベクターであってもよい。
　本明細書において「発現可能な状態」とは、プロモーターの制御下にあるプロモーター下流域に、発現すべき遺伝子等を配置していることをいう。ベクターには、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が知られるが、いずれのベクターも利用することができる。通常は、遺伝子組換え操作の容易なプラスミドベクターであればよい。
　プラスミドベクターは、PROmega社のpSIベクター等の市販の哺乳動物細胞用発現ベクターや、哺乳動物細胞と大腸菌等の細菌間とで複製可能なシャトルベクターであってもよい。
　ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター（オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及び偽型ベクターを含む）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター、エプスタイン－バーウイルス（EBV）ベクター、及びHSVベクター等のウイルスベクターが使用可能である。感染細胞内で自己複製しないように複製能を欠くウイルスベクターを使用してもよい。
　本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子発現ベクターを導入した細胞において、下流（3’末端側）に配置された遺伝子等の発現を制御することのできる遺伝子発現調節領域である。プロモーターは、発現制御下にある遺伝子等を発現させる場所に基づいて、ユビキタスプロモーター（全身性プロモーター）と部位特異的プロモーターに分類することができる。ユビキタスプロモーターは、全細胞、すなわち宿主個体全体で対象とする遺伝子等（対象遺伝子等）の発現を制御するプロモーターである。また、部位特異的プロモーターは、特定の細胞又は組織でのみ対象遺伝子等の発現を制御するプロモーターである。
　また、プロモーターは、発現の時期に基づいて構成的活性型プロモーター、発現誘導型プロモーター又は時期特異的活性型プロモーターに分類される。構成的活性型プロモーターは、細胞内で対象遺伝子等を恒常的に発現させることができる。発現誘導型プロモーターは、細胞内で対象遺伝子等の発現を任意の時期に誘導することができる。また、時期特異的活性型プロモーターは、細胞内で対象遺伝子等を発生段階の特定の時期にのみに発現誘導することができる。いずれのプロモーターも、宿主細胞内で対象遺伝子の過剰な発現をもたらし得ることから過剰発現型プロモーターと解することができる。
　本態様の遺伝子発現ベクターにおいてプロモーターは、融合タンパク質基質をコードする核酸を細胞内で発現誘導できるプロモーターである。本発明の遺伝子発現ベクターを導入する標的細胞は、哺乳動物細胞、例えばヒト由来の細胞が好ましいこととから、それらの細胞内で下流の遺伝子を発現できるプロモーターが例示される。具体的には、CMVプロモーター（CMV-IEプロモーター）、SV40初期プロモーター、RSVプロモーター、EF1αプロモーター、Ubプロモーター等が挙げられる。
　本明細書において「標識遺伝子」は、選択マーカー又はレポータータンパク質とも呼ばれる標識タンパク質をコードする遺伝子である。「標識タンパク質」とは、その活性に基づいて標識遺伝子の発現の有無を判別することのできるペプチドをいう。活性の検出は、標識タンパク質の活性そのものを直接的に検出するものであってもよいし、色素のような標識タンパク質の活性によって発生する代謝物を介して間接的に検出するものであってもよい。検出は、生物学的検出（抗体、アプタマー等のペプチドや核酸の結合による検出を含む）、化学的検出（酵素反応的検出を含む）、物理的検出（行動分析的検出を含む）、又は検出者の感覚的検出（視覚、触覚、嗅覚、聴覚、味覚による検出を含む）のいずれであってもよい。
　標識遺伝子がコードする標識タンパク質の種類は、当該分野で公知の方法によりその活性を検出可能な限り、特に限定はしない。検出に際して形質転換体に対する侵襲性の低い標識タンパク質は好ましい。例えば、タグペプチド、薬剤耐性タンパク質、色素タンパク質、蛍光タンパク質、発光タンパク質等が挙げられる。
　「薬剤耐性タンパク質」は、培地等に添加された抗生物質等の薬剤に対する抵抗性を細胞に付与するタンパク質であり、多くは酵素である。例えば、アンピシリンに対して抵抗性を付与するβラクタマーゼ、カナマイシンに対して抵抗性を付与するアミノグリコシド3’ホスホトランスフェラーゼ、テトラサイクリンに対して抵抗性を付与するテトラサイクリン排出トランスポーター、クロラムフェニコールに対して抵抗性を付与するCAT（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）等が挙げられる。
　本明細書において「エンハンサー」は、ベクター内の遺伝子又はその断片の発現効率を増強できるものであれば特に限定はされない。
　本明細書において「ターミネーター」は、前記プロモーターの活性により発現した遺伝子等の転写を終結できる配列である。ターミネーターの種類は、特に限定はしない。好ましくはプロモーターと同一生物種由来のターミネーターである。一遺伝子発現制御系においてゲノム上で前記プロモーターと対になっているターミネーターは特に好ましい。
４．遺伝子発現ベクターを含む宿主細胞
４－１．概要
　本発明の第4の態様は、宿主細胞である。本態様の宿主細胞は、前記第3態様に記載の融合タンパク質基質発現ベクターを含む。
４－２．構成
　本態様の宿主細胞は、必須成分として融合タンパク質基質発現ベクターを含み、選択的成分としてプロテアーゼ発現ベクターを含む。必須成分の融合タンパク質基質発現ベクターは第3態様に記載に準じるため、以下では宿主細胞と選択的成分について説明する。
　本明細書において、宿主細胞の種類は、限定しない。宿主細胞は、融合タンパク質基質が膜上に発現し、かつプロテアーゼによって切断され得る細胞であればよく、そのため哺乳動物細胞に限定されない。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞のいずれであってもよい。原核細胞の例としては、大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。真核細胞の例としては、真菌細胞（例えば酵母細胞）、藻類細胞、植物細胞、原生動物細胞、昆虫細胞、線虫細胞、魚類細胞、鳥類細胞（例えばニワトリ細胞）、及び哺乳動物細胞（例えば、マウス細胞、チンパンジー細胞、及びヒト細胞）が挙げられる。好ましくは哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞の具体例として、限定しないが、CHO細胞、COS細胞、Vero細胞、HEK293細胞、HeLa細胞、NIH3T3細胞等が挙げられる。宿主細胞は接着細胞又は浮遊細胞のいずれであってもよいが、接着細胞がより好ましい。
　「プロテアーゼ発現ベクター」とは、必要に応じてシグナル配列をN末端側に付加したプロテアーゼをコードする核酸、及びプロモーターを含み、細胞内でプロテアーゼを発現可能な遺伝子発現ベクターである。プロテアーゼ発現ベクターは、前記構成要素である核酸及びプロモーターに加えて、必要に応じて、標識遺伝子（選択マーカー）、エンハンサー、イントロン、ターミネーター、複製起点、及び／又はポリAシグナル等の構成要素を含んでいてもよい。プロテアーゼ発現ベクターは、プラスミドベクターやウイルスベクターであってもよい。
　プロテアーゼ発現ベクターによって発現されるプロテアーゼは、宿主細胞に共導入される融合タンパク質基質に含まれるプロテアーゼ標的領域を切断する、又は切断する可能性のあるプロテアーゼである。
５．プロテアーゼ活性測定キット
５－１．概要
　本発明の第5の態様は、プロテアーゼ活性測定キットである。本態様のプロテアーゼ活性測定キットは、第1態様の基質、第2態様の核酸、第3態様の発現ベクター、及び第4態様の宿主細胞からなる群から選択される１以上を含む。本態様のプロテアーゼ活性測定キットによれば、プロテアーゼ活性を数値化して評価することができる。
５－２．構成
　本態様のプロテアーゼ活性測定キットは、第1態様の融合タンパク質基質、第2態様の融合タンパク質基質をコードする核酸、第3態様の融合タンパク質基質発現ベクター、並びに第4態様の融合タンパク質基質発現ベクターを含む宿主細胞からなる群から選択される１以上を含む。前記基質、核酸、遺伝子発現ベクター及び宿主細胞の構成は、第1～4態様に記載の通りである。したがって、ここでの具体的な説明は省略する。
　本態様のプロテアーゼ活性測定キットは、前記基質、核酸、遺伝子発現ベクター及び／又は宿主細胞の他に、細胞培養用の培地、遺伝子導入用試薬、培地等に添加するための抗生物質等の薬剤、レポーター活性を検出するための発光基質、発色基質、若しくは抗体、又は使用説明書等を含んでいてもよい。
６．プロテアーゼ活性測定方法
６－１．概要
　本発明の第6の態様は、プロテアーゼ活性測定方法である。本発明の測定方法によれば、プロテアーゼの全長アミノ酸配列を対象としてプロテアーゼ活性を測定することができる。本発明の測定方法はプロテアーゼ活性測定に宿主細胞の破壊を必要としないため、プロテアーゼ活性の測定後に宿主細胞の生存率を測定することもできる。本発明の測定方法における反応工程をプロテアーゼ阻害剤の存在下で行う場合、プロテアーゼ阻害活性を評価することもできる。
６－２．方法
　本態様のプロテアーゼ活性測定方法の各工程は、プロテアーゼ活性測定に用いる融合タンパク質基質においてレポーター領域がプロテアーゼ標的領域のN末端側又はC末端側に位置する場合で具体的な構成が異なる。したがって、以下では2つの場合に分けて説明する。
６－２－１．レポーター領域がプロテアーゼ標的領域のN末端側に位置する場合
　融合タンパク質基質においてレポーター領域がプロテアーゼ標的領域のN末端側に位置する場合、融合タンパク質基質はN末端側から順にシグナル配列、レポーター領域、プロテアーゼ標的領域、及び膜結合領域を含む。この場合、本態様の測定方法は、必須工程として反応工程、回収工程、及び測定工程を含み、選択的工程としてベクター導入工程を含む。以下、各工程を具体的に説明する。
（１）ベクター導入工程
　「ベクター導入工程」とは、宿主細胞に、第3態様に記載の融合タンパク質基質発現ベクター及び／又は上述のプロテアーゼ発現ベクターを導入する工程である。融合タンパク質基質発現ベクター及びプロテアーゼ発現ベクターの具体的な構成は第3態様及び第4態様の記載に準じる。
　各ベクターを宿主細胞に導入する方法は、特に限定はしない。
　各ベクターがプラスミドベクターである場合、Green ＆ Sambrook、2012、Molecular Cloning： A Laboratory Manual Fourth Ed．、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York等に記載された当該分野で公知の遺伝子導入方法（形質転換方法）を用いればよい。例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、DEAE-Dextran法、粒子衝撃等が挙げられる。
　各ベクターがウイルスベクターである場合、細胞へのウイルス感染方法は当該技術分野で公知である。ウイルスベクターの導入には、ウイルス感染効率を向上させる機能性物質、例えば、フィブロネクチンやフィブロネクチンフラグメント（例えば、ヘパリン結合部位を有するフィブロネクチンフラグメントであるレトロネクチン（登録商標）又はVecofusin-1（登録商標））等の機能性物質を使用してもよい。
（２）反応工程
　「反応工程」とは、溶液中でプロテアーゼ活性測定用の融合タンパク質基質を発現する宿主細胞を被験対象のプロテアーゼと反応させる工程である。本工程は、宿主細胞の膜上で融合タンパク質基質に対して被験対象のプロテアーゼを反応させることを目的とする。
　本工程で被験対象のプロテアーゼと反応させる宿主細胞は、第4態様の記載に準じる。例えば、上述の選択的工程であるベクター導入工程で融合タンパク質基質発現ベクター及び／又はプロテアーゼ発現ベクターを導入した宿主細胞を用いてもよい。
　本工程で宿主細胞と反応させる被験対象のプロテアーゼは、限定しない。例えば、被験対象のプロテアーゼは、宿主細胞において発現される融合タンパク質基質を切断するものであってもよく、切断する可能性のあるもの、又は切断するかどうか不明のもののいずれでもよい。また、被験対象のプロテアーゼは、全長アミノ酸配列であってもよく、又はプロテアーゼ活性を有する活性断片であってもよい。
　被験対象のプロテアーゼを溶液中に提供する方法は、限定しない。
　一実施形態では、被験対象のプロテアーゼは、融合タンパク質基質を発現する宿主細胞に共発現させることができる。この方法は、被験対象のプロテアーゼが膜タンパク質又は分泌タンパク質のいずれの場合でも使用できるが、被験対象のプロテアーゼが膜タンパク質である場合に特に好ましい。
　別の実施形態では、被験対象のプロテアーゼは、融合タンパク質基質を発現する宿主細胞とは異なる宿主細胞に発現させてもよい。この場合、溶液中への提供の方法は、被験対象のプロテアーゼの種類、例えば膜タンパク質、分泌タンパク質、又はそれ以外のタンパク質（例えば細胞質タンパク質）に応じて、当業者であれば容易に決定することができる。例えば、被験対象のプロテアーゼを発現する宿主細胞、その培養上清、その細胞破砕物、又はそのいずれかから単離又は精製されたタンパク質等として、溶液中に提供すればよい。
　さらなる実施形態では、被験対象のプロテアーゼは組換えタンパク質であり、溶液中に添加することができる。
　本工程で反応を行う溶液の種類は、融合タンパク質基質とプロテアーゼが反応し得るものであれば、限定しない。溶液は、例えば宿主細胞を生細胞として維持可能な培地であってもよい。
　培地は、細胞培養において一般的に用いられる当該分野で公知の培地であればよい。培地は基本培地、無血清培地、低血清培地、及び血清添加培地のいずれであってもよいが、通常は基本培地、例えば標準細胞培養培地であってもよい。ここでいう「標準細胞培養用培地」とは、主として哺乳動物由来の様々な種類の細胞の培養に用いられる汎用性の高い基本培地をいう。具体的には、例えば、イーグルMEM（Eagle Minimum Essential Medium）、DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）、ハムF10（Ham's Nutrient Mixture F10）培地、ハムF12（Ham's Nutrient Mixture F12）培地、M199培地、高性能改良199培地（High Performance Medium 199）、RPMI-1640（Roswell Park Memorial Institute-1640）培地、DMEM/F12（Dulbecco's Modified Eagle Medium/ Ham's Nutrient Mixture F12）培地が挙げられる。DMEM/F12培地の場合、その混合比率は、特に制限しない。好ましくは、構成成分の重量濃度比でDMEMとF12を6：4～4：6の範囲で混合すればよい。標準細胞培養用培地の具体的な組成については、当該分野で公知であり、それ故、適当な文献（例えば、Kaech S. and Banker G., 2006, Nat. PROtoc., 1(5): 2406-2415）に記載の組成に基づいて調製すればよい。又は、Thermo Fisher Scientifics社, Wako Pure Chemical Industries社等の各メーカーで市販の培地を用いてもよい。
　本工程の反応条件として、宿主細胞の種類及び由来に応じた当該分野で公知の培養条件を用いることができる。通常は、5％CO2、37℃で反応を行うことができる。
　本工程の反応時間は、宿主細胞及びプロテアーゼの種類等に応じて異なるが、本工程の上記目的を達成するためには、通常1時間～72時間、好ましくは24時間～48時間でよい。
　一実施形態において、本工程の反応は、プロテアーゼ阻害剤の候補物質である被験物質の存在下で行うことができる。この場合、本発明の測定方法は、プロテアーゼ阻害剤によるプロテアーゼ阻害活性の測定方法とすることができる。被験物質の種類は特に限定されない。被験物質は、任意の物質、具体的には、天然分子（例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物（糖等）、ステロイド、グリコペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン等）、天然分子の合成アナログ又は誘導体（例えば、ペプチド擬態物、核酸分子（アプタマー、アンチセンス核酸、二本鎖RNA（RNAi）等））、及び低分子化合物等の非天然分子（例えば低分子無機化合物及び低分子有機化合物）等；並びにそれらの混合物を挙げることができる。
　また、被験物質としては単一の被験物質を独立に試験しても、いくつかの候補となる被験物質の混合物（例えばライブラリ等）について試験をしてもよい。複数の被験物質を含むライブラリとしては、合成化合物ライブラリやペプチドライブラリ（コンビナトリアルライブラリ等）等が挙げられる。
　また、被験物質の効果及び有効性は、いくつかの条件で検討することも可能である。そのような条件としては、被験物質で処置する時間又は期間、量（大小）、回数等が挙げられる。例えば、被験物質の希釈系列を調製する等して複数の用量を設定することができる。
（３）回収工程
　「回収工程」とは、反応後の溶液から上清を回収する工程である。本工程は、上述の反応工程において融合タンパク質基質から切断されて細胞外に放出された断片を含み得る上清を取得し、未切断の融合タンパク質基質を含む宿主細胞から分離することを目的とする。
　本工程における回収方法は、反応工程で細胞外に放出されたレポーター領域を含む断片を含む上清を宿主細胞から分離し得る方法であれば限定しない。例えば、遠心分離、濾過、沈降、デカンテーション、ピペッティング、又はそれらの組合せによりレポーター領域を含む断片を含む上清を取得することができる。いずれも、基本的には当該分野の常法に従って行えばよい。宿主細胞が接着細胞である場合、上清をピペットにより容易に回収することもできる。
（４）測定工程
　「測定工程」とは、上清中のレポーター領域に基づくレポーター活性を測定する工程である。本工程では、上清に含まれるレポーター活性を検出し、定量することによって、プロテアーゼ活性を定量解析することができる。
　本工程の測定方法はレポーター領域に含まれるレポーター活性の種類によって異なるが、いずれも当業者であれば容易に決定することができる。レポーター領域が蛍光タンパク質に由来する場合は、蛍光タンパク質の種類に応じた励起波長及び蛍光波長に基づいて、上清中に含まれる蛍光活性を測定することができる。レポーター領域が発光タンパク質に由来する場合は、発光タンパク質の発光基質（例えば、ルシフェリン）を付与して上清中の発光活性を測定することができる。レポーター領域がHRP等の酵素に基づく場合は、発色基質（例えば、TMB、4-CN、DAB等のHRP基質、BCIP/NBT等のAP基質、及びX-Gal等のLacZ基質）を付与して上清中の酵素活性を測定することができる。
　一実施形態において、測定工程後に宿主細胞の生存率を測定することができる。宿主細胞の生存率の測定方法は公知である。例えば、ニュートラルレッド、トリパンブルー、又はALAMARブルー等の色素の細胞への取込みを検出することによって細胞生存率を測定することができる。
　また、上述の反応工程を被験物質の存在下で行う場合には、本工程で測定されたプロテアーゼ活性からプロテアーゼ阻害活性が得られ、その結果に基づいて被験物質をプロテアーゼ阻害剤として同定することができる。例えば、被験物質で処置しない場合の値と比較して、測定されたプロテアーゼ活性が100％以下、90％以下、80％以下、70％以下、60％以下、50％以下、20％以下、10％以下、5％以下、1％以下、又は0.1％以下である場合に、被験物質をプロテアーゼ阻害剤として同定することができる。
６－２－２．レポーター領域がプロテアーゼ標的領域のC末端側に位置する場合
　融合タンパク質基質においてレポーター領域がプロテアーゼ標的領域のC末端側に位置する場合、融合タンパク質基質はN末端側から順にシグナル配列、プロテアーゼ標的領域、レポーター領域、及び膜結合領域を含む。この場合、本態様の測定方法は、必須工程として反応工程、及び測定工程を含み、選択的工程としてベクター導入工程を含む。ここで、ベクター導入工程及び反応工程は、上述の「６－２－１．レポーター領域がプロテアーゼ標的領域のN末端側に位置する場合」における「（１）ベクター導入工程」及び「（２）反応工程」に記載の通りであり、ここでは測定工程の構成のみを以下で説明する。
　「測定工程」とは、反応工程後の宿主細胞において前記レポーター領域に基づくレポーター活性を測定する工程である。本工程は、プロテアーゼ標的領域における切断によって抑制又は阻害が解除されたレポーター活性の変化を宿主細胞において検出するため、得られるレポーター活性を、被験対象のプロテアーゼと反応させない対照等の基準となるレポーター活性と比較することが好ましい。
　本工程におけるレポーター活性の測定方法は、上述の「６－２－１．レポーター領域がプロテアーゼ標的領域のN末端側に位置する場合」において上清においてレポーター活性を測定する方法を、そのまま宿主細胞に対して適用すればよい。本工程におけるレポーター活性の測定方法では、反応工程後の上清を除去しても、又は除去しなくてもよい。
　本工程におけるレポーター活性の測定方法では、融合タンパク質基質を発現する宿主細胞に対して被験対象のプロテアーゼを反応させない場合のレポーター活性を測定し、これを陰性対照とすることができる。陰性対照のレポーター活性と比較することにより、被験対象のプロテアーゼのプロテアーゼ活性を評価することができる。
６－３．効果
　本発明の測定方法によれば、上清中又は宿主細胞においてレポーター領域に基づくレポーター活性を検出することによってプロテアーゼ活性を評価することができる。また、反応工程を被験物質の存在下で行うことによって、プロテアーゼ活性に対する阻害効果を評価することもできる。
　本発明の測定方法の利点は、宿主細胞を破壊せずに生細胞のままでプロテアーゼ活性を測定できる点である。この利点に基づき、本発明の方法では測定工程後に細胞生存率を測定することもできる。例えば、薬剤スクリーニングにおいて被験物質存在下でプロテアーゼ阻害効果が確認されると、プロテアーゼに対する直接的な阻害効果とその他の間接的効果（例えば細胞生存率に対する阻害効果等）とを区別する必要があるが、本発明の方法はこの点でも極めてスループット性の高い方法を提供することができる。
＜実施例１：脱ISG15化活性評価方法の開発＞
（目的）
　脱ISG15化活性を評価する方法を開発する。さらに、SARS-CoV2のプロテアーゼであるNsp3タンパク質の脱ISG15化活性を検出する。
（方法と結果）
（１）ssISG sensor発現プラスミドの作製
　脱ISG15化活性を検出するための基質となる融合タンパク質としてssISG sensorを作製した。ssISG sensorは、以下の(a)～(f)をN末端側から順に連結してなる融合タンパク質である。
　(a)ヒト免疫グロブリンκ軽鎖のシグナル配列（配列番号1）
　(b)Gaussia princeps由来の分泌型ルシフェラーゼ（ssGluc）（配列番号2）
　(c)フレキシブルリンカー（GGGGS；配列番号3）
　(d)成熟型ヒトISG15タンパク質（配列番号4）
　(e)フレキシブルリンカー（3×GGGGS；配列番号5）
　(f)免疫グロブリン重鎖由来の膜貫通ドメイン（配列番号6）
　図2BにssISG sensorの構造を図示する。また、ssISG sensorの全長アミノ酸配列を配列番号7で示す。
　このssISG sensorをコードし、ヒト細胞のコドン使用頻度を指標として塩基配列をコドン最適化したssISG sensor遺伝子（配列番号8）を哺乳動物発現ベクターpCI（プロメガ社）に挿入した。作製したssISG sensor発現プラスミドの構造を図2Aに示す。
（２）脱ISG15化活性評価方法の原理の例示
　脱ISG15化活性評価方法の原理を例示的に説明する。
　上記(a)～(f)からなるssISG sensorは膜に移行すると共に上記(a)のシグナル配列が切断除去され、上記(b)～(f)からなるISG sensorとなる。なお、本明細書ではシグナル配列切断後の(b)～(f)からなるタンパク質を「ISG sensor」と表記し、シグナル配列切断前の「ssISG sensor」と区別する。
　脱ISG15化活性によってISG sensorが上記(d)と上記(e)の間（「LRLRGG」配列のC末端側の位置）で切断されると、ルシフェラーゼ活性を含む上記(b)～(d)からなる断片が細胞外に放出される。この放出された断片は、ルシフェラーゼ活性に基づき細胞上清中で検出される。一方、ISG sensorが上記(d)と上記(e)の間で切断されない場合には、ISG sensorは細胞膜表面に留まるため、細胞上清中でルシフェラーゼ活性は検出されない。
　ssISG sensor及び後述のssNSP3タンパク質を用いた脱ISG15化活性評価方法の原理を図5Aに例示する。ISG sensorは、例えば小胞体内、分泌小胞内、及び／又は細胞膜上で脱ISG15化活性によって切断され得る。
（３）野生型又は不活性型のssNsp3発現プラスミドの作製
　脱ISG15化活性の測定対象としてSARS-CoV2のNsp3タンパク質を発現させるために、SARS-CoV2の野生型Nsp3タンパク質のN末端側にシグナル配列を付加したssNsp3タンパク質（本明細書において「ssNsp3(WT)タンパク質」等と表記する）を発現するssNsp3(WT)発現プラスミドを作製した。
　ssNsp3(WT)タンパク質は、N末端側に免疫グロブリンκ軽鎖のシグナル配列（配列番号1）、及びC末端側に野生型のSARS-CoV2（nCoV）Nsp3（配列番号9）を含み、その全長アミノ酸配列は配列番号10で示される（図4B）。
　ssNsp3(WT)タンパク質をコードし、ヒト細胞のコドン使用頻度を指標として塩基配列をコドン最適化したssNsp3(WT)遺伝子（配列番号11）を哺乳動物発現ベクターpCI（プロメガ社）に挿入した。作製したssNsp3(WT)発現プラスミドの構造を図4Aに示す。
　さらに、ssNsp3(WT)の陰性対照として、Nsp3タンパク質の活性部位と想定される111位システインと272位ヒスチジンが共にアラニンに置換されたssNsp3タンパク質（本明細書において「ssNsp3(C111A/H272A)タンパク質」又は「ssNsp3(CHAA)タンパク質」等と表記する）をコードするssNsp3(CHAA)遺伝子を含むssNsp3(CHAA)発現プラスミドを作製した。
（４）脱ISG15化活性の評価
　ssNsp3(WT)発現プラスミド又はssNsp3(CHAA)発現プラスミドをssISG sensor発現プラスミドと共にHeLa細胞に導入した。
　具体的には、HeLa細胞1×106個に対して合計10μgのDNAを、遺伝子導入装置「Nepa21」（ネッパジーン社）を用いてエレクトロポレーション法で一過性に導入した。導入したDNAの比率は、ssISG sensor発現プラスミド：ssNsp3(WT又はCHAA)発現プラスミド＝1：9とした。
　細胞は10％FBS添加DMEMで4×105細胞／mLに懸濁し、96ウェルプレートで0.1mL/ウェルにて24時間培養した。その後、細胞から培養上清を分離し、培養上清中のルシフェラーゼ活性を測定した。
　その結果、ssNsp3(WT)発現プラスミドを共導入した細胞において、培養上清中に高レベルのルシフェラーゼ活性が認められ（図5B、「WT」）、空ベクターを導入した陰性対照（図5B、「-」）に対して約45.3倍のSignal/Background比を示した。一方、ssNsp3(CHAA)発現プラスミドを共導入した細胞の培養上清では、空ベクターを導入した場合を超えるルシフェラーゼ活性は検出されなかった（図5B、「CHAA」）。
（５）シグナル配列の必要性の検討
　ssNsp3タンパク質においてシグナル配列の必要性を検討するために、N末端側にシグナル配列が付加されていないSARS-CoV2由来の野生型Nsp3タンパク質（以下、「Nsp3(-ss)タンパク質」と表記する）を発現するNsp3(-ss)発現プラスミドを作製した。上記（４）と同様の方法によって、ssNsp3(WT)発現プラスミド又はNsp3(-ss)発現プラスミドをssISG sensor発現プラスミドと共にHeLa細胞に導入し、培養上清におけるルシフェラーゼ活性を測定した。
　結果を図5Cに示す。ssNsp3(WT)発現プラスミドを共導入した細胞では培養上清中に高レベルのルシフェラーゼ活性が認められたが、Nsp3(-ss)発現プラスミドを共導入した細胞では、バックグラウンドレベルに比してルシフェラーゼ活性の上昇は認められなかった。シグナル配列を欠くNsp3タンパク質は分泌小胞に入らず、ISG sensorと効率的に会合しないものと考えられる。
＜実施例２：ISG15タンパク質において脱ISG15化修飾に必要な領域の検討＞
（目的）
　実施例１で構築したssISG sensorを改変した改変型ssISG sensorを作製する。ssNsp3タンパク質の改変型ssISG sensorに対する脱ISG15化活性を評価することによって、ssISG sensorにおいて脱ISG15化修飾に必要な領域を検討する。
（方法と結果）
（１）改変型ssISG sensorの構築
　実施例１で構築したssISG sensor（以下、「ssISG sensor (GG)」と表記する）に基づき、改変型ssISG sensorとして以下のssISG sensor (AA)、ssISG sensor (ΔD1)、及びssISG sensor (ΔD1+2)を作製した。
　「ssISG sensor (AA)」は、ssISG sensor (GG)において脱ISG15化修飾の切断位置に隣接する「LRLRGG」配列の2つのグリシンを共にアラニンに置換した「LRLRAA」変異体である（図6A、「2) AA」）。
　「ssISG sensor (ΔD1)」は、ssISG sensor (GG)においてユビキチン様ドメイン1（配列番号4において7位～71位の領域）を欠失させた変異体である（図6A、「3) ΔD1」）。
　「ssISG sensor (ΔD1+2)」は、ssISG sensor (GG)においてユビキチン様ドメイン1及び2の両方（配列番号4において7位～148位の領域）を欠失させ、「LRLRGG」配列を含む15アミノ酸のみを残した変異体である（図6A、「4) ΔD1+2」）。
　上記の改変型ssISG sensorの各々を発現させるために、改変型ssISG sensor遺伝子を含む改変型ssISG sensor発現プラスミドをそれぞれ作製した。
（２）改変型ssISG sensorに対する脱ISG15化活性の検討
　実施例１の（４）と同様の方法で、ssISG sensor発現プラスミド又は改変型ssISG sensor発現プラスミドをssNsp3(WT)発現プラスミド又はssNsp3(CHAA)発現プラスミドと共にHeLa細胞に導入し、脱ISG15化活性を評価した。
　結果を図6Bに示す。その結果、ISG sensor (GG)とssNsp3(WT)タンパク質を共発現させた細胞では、培養上清中に高レベルのルシフェラーゼ活性が検出された。一方、「LRLRGG」配列を「LRLRAA」配列に置換したssISG sensor (AA)では、ルシフェラーゼ活性がほとんど検出されず、脱ISG15化活性がほぼ完全に消失していた。また、ユビキチンドメイン1を欠失させたssISG sensor (ΔD1)では、ルシフェラーゼ活性が大幅に低下しており、脱ISG15化活性が減弱していた。ユビキチン様ドメイン1及び2の両方を欠失させたssISG sensor (ΔD1+2)では、ルシフェラーゼ活性がほとんど検出されず、脱ISG15化活性が認められなかった。
　以上の結果から、脱ISG15化酵素は、単に「LRLRGG」という短いアミノ酸配列のみを認識しているのではなく、2つのユビキチン様ドメインを含むISG15タンパク質の構造を認識して脱ISG15化修飾することが示された。したがって、短いペプチド基質を用いる従来のin vitro評価法は、脱ISG15化活性を有するプロテアーゼの活性評価やその機能を阻害する化合物等のスクリーニングには不十分であり、脱ISG15化活性を正確に検出できないと考えられる。これに対して、本発明のssISG sensorに基づく脱ISG15化活性評価方法は、成熟型の全長ISG15タンパク質を含む融合タンパク質を基質として使用するものであり、従来法に比して格段に優れた評価法である。
＜実施例３：FeCoVプロテアーゼ活性評価方法の開発＞
（目的）
　ネココロナウイルス（FeCoV）のプロテアーゼであるNsp5タンパク質のプロテアーゼ活性を評価する方法を開発する。
（方法と結果）
（１）ssPRO-TM sensor発現プラスミドの作製
　プロテアーゼ活性を検出するための基質となる融合タンパク質としてssPRO-TM sensorを作製した。ssPRO-TM sensorは、上述のssISG sensorにおける(d)成熟型ヒトISG15タンパク質に相当する部分をネココロナウイルス（FeCoV）由来Nsp5タンパク質（3CLpro）の切断標的配列に置換した融合タンパク質である。具体的には、以下の(a)～(f)をN末端側から順に連結してなる融合タンパク質である（図7、下側）。
　(a)ヒト免疫グロブリンκ軽鎖のシグナル配列（配列番号1）
　(b)Gaussia princeps由来の分泌型ルシフェラーゼ（ssGluc）（配列番号2）
　(c)フレキシブルリンカー（GGGGS；配列番号3）
　(d)Nsp5切断標的配列（具体的には、後述の(d1）又は(d2)のいずれか）
　(e)フレキシブルリンカー（3×GGGGS；配列番号5）
　(f)免疫グロブリン重鎖由来の膜貫通ドメイン（配列番号6）
　ここで、上記(d)のNsp5切断標的配列として、以下の(d1)と(d2)のいずれかを用いた。
　(d1)FeCoVのポリプロテインPP1abにおいて、Nsp4とNsp5の境界を含む前後20アミノ酸からなるアミノ酸配列（図7において「Nsp4/Nsp5 cleavage site」として図示し、切断位置は「｜」で示す；配列番号12）
　(d2)FeCoVのポリプロテインPP1abにおいて、Nsp5とNsp6の境界を含む前後20アミノ酸からなるアミノ酸配列（図7において「Nsp5/Nsp6 cleavage site」として図示し、切断位置は「｜」で示す；配列番号13）
　なお、上記(d)のNsp5切断標的配列が上記(d1)又は(d2)に記載のアミノ酸配列からなる場合のssPRO-TM sensorをそれぞれ「ssNsp4/5-TM sensor」又は「ssNsp5/6-TM sensor」と表記する。ssNsp4/5-TM sensorの全長アミノ酸配列を配列番号14、及びssNsp4/5-TM sensorをコードするssNsp4/5-TM sensor遺伝子の塩基配列を配列番号15で示す。また、ssNsp5/6-TM sensorの全長アミノ酸配列を配列番号16、及びssNsp6/7-TM sensorをコードするssNsp5/6-TM sensor遺伝子の塩基配列を配列番号17で示す。
（２）プロテアーゼ活性評価方法の原理の例示
　プロテアーゼ活性評価方法の原理を例示的に説明する。
　上記(a)～(f)からなるssPRO-TM sensor（ssNsp4/5-TM sensor又はssNsp5/6-TM sensor）はシグナル配列が切断除去された後、上記(b)～(f)からなるPRO-TM sensor（Nsp4/5-TM sensor又はNsp5/6-TM sensor）となる。PRO-TM sensorがプロテアーゼ活性によって上記(d)の中央位置で切断されると、ルシフェラーゼ活性を含む上記(b)～(c)を含む断片が細胞外に放出され、この放出された断片に基づくルシフェラーゼ活性が細胞上清中で検出される。
（３）野生型又は不活性型のssNsp5発現プラスミドの作製
　プロテアーゼ活性の測定対象としてネココロナウイルス（FeCoV）由来のNsp5タンパク質を発現させるために、野生型Nsp5タンパク質のN末端側にシグナル配列を付加したssNsp5タンパク質（以下、「ssNsp5(WT)タンパク質」等と表記する）を発現するssNsp5(WT)発現プラスミドを作製した。
　ssNsp5(WT)タンパク質は、N末端側に免疫グロブリンκ軽鎖のシグナル配列（配列番号1）、及びC末端側にFeCoVの野生型Nsp5（配列番号18）を含み、その全長アミノ酸配列は配列番号19で示される。さらに、ssNsp5(WT)タンパク質を発現させるために、ssNsp5(WT)遺伝子（配列番号20）を含むssNsp5(WT)発現プラスミドを作製した。
　さらに、ssNsp5(WT)タンパク質の陰性対照として、Nsp5タンパク質の活性部位と想定される144位システインをアラニンに置換した不活性型Nsp5タンパク質（本明細書において「ssNsp5(C144A)タンパク質」等と表記する）をコードするssNsp5(C144A)遺伝子を含むssNsp5(C144A)発現プラスミドを作製した。
（４）プロテアーゼ活性の評価
　ssNsp4/5-TM sensor発現プラスミド又はssNsp5/6 sensor発現プラスミドを、ssNsp5(WT)発現プラスミド又はssNsp5(C144A)発現プラスミドと共にHeLa細胞に遺伝子導入し、24時間培養した。その後、細胞から培養上清を分離し、培養上清中のルシフェラーゼ活性を測定した。
　結果を図8に示す。ssNsp5(WT)発現プラスミドを共導入した細胞において、空ベクターを導入した細胞に比して高いレベルのルシフェラーゼ活性が培養上清中に認められた。一方、ssNsp5(C144A)発現プラスミドを共導入した細胞では、培養上清中のルシフェラーゼ活性は、空ベクターを導入した細胞と同程度まで減弱していた。
　以上の結果から、PRO-TM sensorは、細胞内におけるウイルスプロテアーゼの活性を測定できることが示された。
＜実施例４：HTLV-1プロテアーゼ活性評価方法の開発＞
（目的）
　ヒトT細胞白血病ウイルス1型（HTLV-1）に由来するプロテアーゼの活性を評価する方法を開発する。
（方法と結果）
（１）ssPRO-TM sensor発現プラスミドの作製
　HTLV-1のプロテアーゼであるPROタンパク質のプロテアーゼ活性を検出するための基質となる融合タンパク質としてssPRO-TM sensorを作製した。本実施例におけるssPRO-TM sensorは、実施例３のssPRO-TM sensorにおける(d)に相当する部位をHTLV-1のPROタンパク質の切断標的配列に置換した融合タンパク質である。具体的には、以下の(a)～(f)をN末端側から順に連結してなる融合タンパク質である（図9、下側）。
　(a)ヒト免疫グロブリンκ軽鎖のシグナル配列（配列番号1）
　(b)Gaussia princeps由来の分泌型ルシフェラーゼ（ssGluc）（配列番号2）
　(c)フレキシブルリンカー（GGGGS；配列番号3）
　(d)PRO切断標的配列（具体的には、後述の(d1)～(d7)のいずれか）
　(e)フレキシブルリンカー（3×GGGGS；配列番号5）
　(f)免疫グロブリン重鎖由来の膜貫通ドメイン（配列番号6）
　ここで、上記(d)のPRO切断標的配列として、以下の(d1)～(d7)のいずれかを用いた。
　(d1)HTLV-1のポリプロテインGAG-PRO-POLにおいて、MAとCAの境界を含む前後20アミノ酸からなるアミノ酸配列（図9において「MA/CA cleavage site」として図示し、切断位置は「｜」で示す；配列番号21）
　(d2)HTLV-1のポリプロテインGAG-PRO-POLにおいて、CAとNCの境界を含む前後20アミノ酸からなるアミノ酸配列（図9において「CA/NC cleavage site」として図示し、切断位置は「｜」で示す；配列番号22）
　(d3)HTLV-1のポリプロテインGAG-PRO-POLにおいて、TF1とPRの境界を含む前後20アミノ酸からなるアミノ酸配列（図9において「TF1/PR cleavage site」として図示し、切断位置は「｜」で示す；配列番号23）
　(d4)HTLV-1のポリプロテインGAG-PRO-POLにおいて、PRとp1の境界を含む前後20アミノ酸からなるアミノ酸配列（図9において「PR/p1 cleavage site」として図示し、切断位置は「｜」で示す；配列番号24）
　(d5)HTLV-1のポリプロテインGAG-PRO-POLにおいて、p1とRTの境界を含む前後20アミノ酸からなるアミノ酸配列（図9において「p1/RT cleavage site」として図示し、切断位置は「｜」で示す；配列番号25）
　(d6)HTLV-1のポリプロテインGAG-PRO-POLにおいて、RTとRHの境界を含む前後20アミノ酸からなるアミノ酸配列（図9において「RT/RH cleavage site」として図示し、切断位置は「｜」で示す；配列番号26）
　(d7)HTLV-1のポリプロテインGAG-PRO-POLにおいて、RHとINの境界を含む前後20アミノ酸からなるアミノ酸配列（図9において「RH/IN cleavage site」として図示し、切断位置は「｜」で示す；配列番号27）
　なお、上記(d)のPRO切断標的配列が上記(d1)に記載のアミノ酸配列からなる場合のssPRO-TM sensorをssMA/CA-TM sensor等と表記し、(d2)～(d7)の場合も同様に表記する。上記(d1)に対応するssPRO-TM sensorの全長アミノ酸配列を配列番号28に示す。上記(d2)～(d7)に対応するssPRO-TM sensorは、PRO切断標的配列以外のアミノ酸配列は(d1)と同一である。上記(d1)に対応するssPRO-TM sensor遺伝子の塩基配列を配列番号29に示す。上記(d2)～(d7)に対応するssPRO-TM sensor遺伝子の塩基配列は、PRO切断標的配列以外の塩基配列は(d1)と同一である。
（２）プロテアーゼ活性評価方法の原理の例示
　プロテアーゼ活性評価方法の原理を例示的に説明する。
　上記(a)～(f)からなるssPRO-TM sensor（例えばssMA/CA-TM sensor）はシグナル配列が切断除去された後、上記(b)～(f)からなるPRO-TM sensor（例えばMA/CA-TM sensor）となる。PRO-TM sensorがプロテアーゼ活性によって上記(d)の中央位置で切断されると、ルシフェラーゼ活性を含む上記(b)～(c)を含む断片が細胞外に放出され、この放出された断片に基づくルシフェラーゼ活性が細胞上清中で検出される。
（３）野生型又は不活性型のssGAG-PRO発現プラスミドの作製
　プロテアーゼ活性の測定対象としてHTLV-1由来のGAG-PROタンパク質を発現させるために、野生型GAG-PROタンパク質のN末端側にシグナル配列を付加したssGAG-PROタンパク質（以下、「ssGAG-PRO(WT)タンパク質」等と表記する）を発現するssGAG-PRO(WT)発現プラスミドを作製した。
　ssGAG-PRO(WT)タンパク質は、N末端側に免疫グロブリンκ軽鎖のシグナル配列（配列番号1）、及びC末端側にHTLV-1に由来する野生型GAG-PROタンパク質（配列番号30）を含み、その全長アミノ酸配列は配列番号31で示される。さらに、ssGAG-PRO(WT)タンパク質を発現させるために、ssGAG-PRO(WT)遺伝子（配列番号32）を含む野生型ssGAG-PRO(WT)発現プラスミドを作製した。
　さらに、ssGAG-PRO(WT)タンパク質の陰性対照として、PROタンパク質の活性部位と想定される32位アスパラギン酸をアラニンに置換したssGAG-PROタンパク質（本明細書において「ssGAG-PRO(D32A)タンパク質」等と表記する）をコードするssGAG-PRO(D32A)遺伝子を含むssGAG-PRO(D32A)発現プラスミドを作製した。
（４）プロテアーゼ活性の評価
　7種類のssPRO-TM sensor発現プラスミドのいずれかを、ssGAG-PRO(WT又はD32A)発現プラスミドと共にHeLa細胞に遺伝子導入し、24時間培養した。その後、細胞から培養上清を分離し、培養上清中のルシフェラーゼ活性を測定した。
　その結果、7種類のssPRO-TM sensor発現プラスミドを導入したいずれの場合でも、ssGAG-PRO(WT)発現プラスミドを共導入した細胞では、空ベクターを導入した細胞に比して高レベルのルシフェラーゼ活性が培養上清に認められた（図10、「WT」 vs. 「-」）。一方、ssGAG-PRO(D32A)発現プラスミドを導入した細胞では、培養上清中のルシフェラーゼ活性は、空ベクターを導入した細胞と同程度まで減弱していた（図10、「D32A」 vs. 「-」）。
　よって、PRO-TM sensorは、ウイルスプロテアーゼの活性測定に幅広く応用できることが示された。
＜実施例５：GC376のプロテアーゼ阻害活性評価＞
（目的）
　FeCoVのNsp5タンパク質に対するプロテアーゼ阻害剤GC376（図11A）について、SARS-CoV2のNsp3タンパク質及びNsp5タンパク質、並びにHTLV-1のPROタンパク質に対する阻害活性を評価する。GC376は豚流行性下痢ウイルスの複製を阻害する公知の3C様プロテアーゼ阻害剤である（Ye G., et al., Viruses, 2020, 12(2):240）。
（方法と結果）
　実施例１で作製したssISG sensor発現プラスミド及びssNsp3(WT)発現プラスミド；実施例３で作製したssNsp4/5-TM sensor発現プラスミド及びssNsp5(WT)発現プラスミド；又は実施例４で作製したssPR/p1-TM sensor発現プラスミド及びssGAG-PRO(WT)発現プラスミドの各組合せをHeLa細胞に遺伝子導入し、図に示す濃度のGC376（Carbosynth社、BG167367）の存在下で24時間培養した。その後、培養上清中におけるルシフェラーゼ活性を測定した。ヒト免疫グロブリンκ軽鎖シグナル配列を付加したssGlucを導入した細胞を陰性対照として用いた。
　結果を図11Bに示す。GC376は、SARS-CoV2由来のNsp5タンパク質のプロテアーゼ活性を濃度依存的に阻害した。一方、SARS-CoV2由来のNsp3タンパク質やHTLV-1由来のPROタンパク質の活性には影響しないことが示された。
　また、WST8アッセイを用いて培養後の細胞生存率を測定した。細胞培養液に等量の4％WST8液（生細胞数測定試薬SF（ナカライテスク、07553-44））を添加し、5％CO2存在下、37℃で2時間培養後、吸光度（450nm及び650nm）を測定した。その結果、いずれの条件においても細胞の生存を阻害する効果は認められなかった（図11C）。
　以上の結果から、GC376はssGlucの分泌や活性自体には影響せず、細胞の生存を阻害する活性を示さないこと、それ故、SARS-CoV2由来のNsp5タンパク質のプロテアーゼ活性を特異的に阻害することが示された。以上の結果から、本発明の方法がプロテアーゼ阻害剤の探索にも有用であることが示された。
＜実施例６：アフリカ豚熱ウイルスに由来するプロテアーゼの活性評価方法の開発＞
（目的）
　アフリカ豚熱ウイルス（ASFV）に由来するプロテアーゼpS273Rの活性を評価する方法を開発する。
（方法と結果）
（１）ssPRO-TM sensor発現プラスミドの作製
　ASFVのプロテアーゼであるS273Rプロテアーゼ（「pS273Rタンパク質」とも表記する）のプロテアーゼ活性を検出するための基質となる融合タンパク質としてssPRO-TM sensorを作製した。本実施例におけるssPRO-TM sensorは、実施例３のssPRO-TM sensorにおける(d)に相当する部位をASFVのpS273Rタンパク質の切断標的配列に置換した融合タンパク質である。具体的には、以下の(a)～(f)をN末端側から順に連結してなる融合タンパク質である（図13、下側）。
　(a)ヒト免疫グロブリンκ軽鎖のシグナル配列（配列番号1）
　(b)Gaussia princeps由来の分泌型ルシフェラーゼ（ssGluc）（配列番号2）
　(c)フレキシブルリンカー（GGGGS；配列番号3）
　(d)pS273R切断標的配列（具体的には、後述の(d1)～(d6)のいずれか）
　(e)フレキシブルリンカー（3×GGGGS；配列番号5）
　(f)免疫グロブリン重鎖由来の膜貫通ドメイン（配列番号6）
　ここで、上記(d)のpS273R切断標的配列として、以下の(d1)～(d6)のいずれかを用いた。なお、以下の(d1)～(d6)は、図12に示されるASFVのポリプロテインpp220及びpp60におけるpS273R切断位置の各々に対応する。
　(d1)ASFVのポリプロテインpp220において、p5とp34の境界を含む前後23アミノ酸からなるアミノ酸配列（図13において「pp220 p5/p34 cleavage site」として図示し、切断位置は「｜」で示す；配列番号41）
　(d2)ASFVのポリプロテインpp220において、p34とp14の境界を含む前後23アミノ酸からなるアミノ酸配列（図13において「pp220 p34/p14 cleavage site」として図示し、切断位置は「｜」で示す；配列番号42）
　(d3)ASFVのポリプロテインpp220において、p14とp37の境界を含む前後23アミノ酸からなるアミノ酸配列（図13において「pp220 p14/p37 cleavage site」として図示し、切断位置は「｜」で示す；配列番号43）
　(d4)ASFVのポリプロテインpp220において、p37とp150の境界を含む前後23アミノ酸からなるアミノ酸配列（図13において「pp220 p37/p150 cleavage site」として図示し、切断位置は「｜」で示す；配列番号44）
　(d5)ASFVのポリプロテインpp60において、p15とp35の境界を含む前後23アミノ酸からなるアミノ酸配列（図13において「pp60 p15/p35 cleavage site」として図示し、切断位置は「｜」で示す；配列番号45）
　(d6)ASFVのポリプロテインpp60において、p35とp8の境界を含む前後23アミノ酸からなるアミノ酸配列（図13において「pp60 p35/p8 cleavage site」として図示し、切断位置は「｜」で示す；配列番号46）
（２）野生型又は不活性型のpS273R発現プラスミドの作製
　プロテアーゼ活性の測定対象としてASFV由来のpS273Rタンパク質を発現させるために、配列番号53で示すアミノ酸配列からなる野生型pS273Rタンパク質のN末端側にシグナル配列を付加したpS273R(WT)タンパク質を発現するpS273R(WT)発現プラスミドを作製した。
　さらに、pS273R(WT)タンパク質の陰性対照として、pS273Rタンパク質の活性部位と想定される232位システイン残基をアラニン残基に置換したpS273R(C232A)タンパク質をコードするpS273R(C232A)遺伝子を含むpS273R(C232A)発現プラスミドを作製した。
（３）プロテアーゼ活性の評価
　6種類のssPRO-TM sensor発現プラスミドのいずれかを、pS273R(WT又はC232A)発現プラスミドと共にHeLa細胞に遺伝子導入し、24時間培養した。その後、細胞から培養上清を分離し、培養上清中のルシフェラーゼ活性を測定した。
　その結果、6種類のssPRO-TM sensor発現プラスミドを導入したいずれの場合でも、pS273R(WT)発現プラスミドを共導入した細胞では、空ベクターを導入した細胞に比して高レベルのルシフェラーゼ活性が培養上清に認められた（図14、「pS273R WT」 vs. 「-」）。一方、pS273R(C232A)発現プラスミドを導入した細胞では、培養上清中のルシフェラーゼ活性は、空ベクターを導入した細胞よりも低かった（図14、「pS273R C232A」vs. 「-」）。
　よって、ssPRO-TM sensorは、ASFVに由来するウイルスプロテアーゼの活性を検出できることが示された。
＜実施例７：SUMOタンパク質、ISG15タンパク質、及びユビキチンタンパク質に対する切断活性の評価＞
（目的）
　UMOタンパク質、ISG15タンパク質、及びユビキチンタンパク質を切断標的として、pS273Rタンパク質のプロテアーゼ活性を評価する。
（方法と結果）
（１）hSUMO-1 sensor、hSUMO-2 sensor、hISG15 sensor、及び2xUb sensorの構築
　図15Aに示す各種sensor（hSUMO-1 sensor、hSUMO-2 sensor、hISG15 sensor、及び2xUb sensor）を構築した。各種sensorは、以下の(a)～(f)をN末端側から順に連結してなる融合タンパク質である（図15A）。
　(a)ヒト免疫グロブリンκ軽鎖のシグナル配列（配列番号1）
　(b)Gaussia princeps由来の分泌型ルシフェラーゼ（ssGluc）（配列番号2）
　(c)フレキシブルリンカー（GGGGS；配列番号3）
　(d)切断標的配列（具体的には、後述の(d1)～(d4)のいずれか）
　(e)フレキシブルリンカー（3×GGGGS；配列番号5）
　(f)免疫グロブリン重鎖由来の膜貫通ドメイン（配列番号6）
　ここで、上記(d)の切断標的配列として、以下の(d1)～(d4)のいずれかを用いた。(d1)～(d4)の各々を含むsensorをそれぞれ「hSUMO-1 sensor」、「hSUMO-2 sensor」、「hISG15 sensor」、及び「2xUb sensor」という。各sensorを発現する発現プラスミドをそれぞれ作製した。
　(d1)ヒトSUMO-1（hSUMO-1）タンパク質（配列番号47）
　(d2)ヒトSUMO-2（hSUMO-2）タンパク質（配列番号48）
　(d3)成熟型ヒトISG15タンパク質（配列番号4）
　(d4)2×ユビキチン配列（配列番号52）
（２）S273Rプロテアーゼによる各種sensorに対するプロテアーゼ活性の評価
　実施例１の（４）と同様の方法で、各種sensor発現プラスミドをpS273R(WT又はC232A)発現プラスミドと共にHeLa細胞に導入し、プロテアーゼ活性を評価した。
　結果を図15Bに示す。各種sensorとpS273R(WT)タンパク質を共発現させた細胞では、空ベクターを導入した細胞に比して高レベルのルシフェラーゼ活性が培養上清に認められた（図15B、「pS273R WT」 vs. 「-」）。一方、pS273R(C232A)発現プラスミドを導入した細胞では、培養上清中のルシフェラーゼ活性は、空ベクターを導入した細胞よりも低かった（図15B、「pS273R C232A」vs. 「-」）。以上の結果から、S273RプロテアーゼはSUMOタンパク質、ISGタンパク質、及びユビキチンタンパク質のいずれをも切断することができることが示された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (15)

  1. 　プロテアーゼ活性測定用の融合タンパク質基質であって、N末端側から順に、
    　(i)シグナル配列、レポーター領域、プロテアーゼ標的領域、及び膜結合領域、又は
    　(ii)シグナル配列、プロテアーゼ標的領域、レポーター領域、及び膜結合領域
    を含む、前記融合タンパク質基質。
  2. 　前記プロテアーゼが、ウイルスプロテアーゼ又は脱ユビキチン化酵素である、請求項１に記載の融合タンパク質基質。
  3. 　前記ウイルスプロテアーゼが、コロナウイルス科、レトロウイルス科、アスファウイルス科、フラビウイルス科、カリシウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、アデノウイルス科、トガウイルス科、又はマトナウイルス科に由来する、請求項２に記載の融合タンパク質基質。
  4. 　前記コロナウイルス科に由来するウイルスプロテアーゼの標的領域が、配列番号4、12、又は13で示すアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の融合タンパク質基質。
  5. 　前記レトロウイルス科に由来するウイルスプロテアーゼの標的領域が、配列番号21～27及び62～70からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の融合タンパク質基質。
  6. 　前記アスファウイルス科に由来するウイルスプロテアーゼの標的領域が、配列番号41～46からなる群から選択されるいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の融合タンパク質基質。
  7. 　前記脱ユビキチン化酵素の標的領域が、ユビキチンタンパク質、SUMOタンパク質、又はISG15タンパク質を含む、請求項２に記載の融合タンパク質基質。
  8. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質基質をコードする核酸。
  9. 　請求項８に記載の核酸を発現可能な状態で含む遺伝子発現ベクター。
  10. 　請求項９に記載の遺伝子発現ベクターを含む宿主細胞。
  11. 　前記プロテアーゼ標的領域を切断するプロテアーゼをコードする塩基配列を発現可能な状態で含む遺伝子発現ベクターをさらに含む、請求項１０に記載の宿主細胞。
  12. 　請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質基質、請求項８に記載の核酸、請求項９に記載の遺伝子発現ベクター、並びに請求項１０及び１１に記載の宿主細胞からなる群から選択される１以上を含む、プロテアーゼ活性測定キット。
  13. 　プロテアーゼ活性を測定する方法であって、
    　溶液中でプロテアーゼ活性測定用の融合タンパク質基質を発現する宿主細胞を被験対象のプロテアーゼと反応させる反応工程、ここで前記融合タンパク質基質はN末端側から順にシグナル配列、レポーター領域、プロテアーゼ標的領域、及び膜結合領域を含み、
    　反応後の溶液から上清を回収する回収工程、並びに
    　前記上清中の前記レポーター領域に基づくレポーター活性を測定する測定工程
    を含む、前記方法。
  14. 　プロテアーゼ活性を測定する方法であって、
    　溶液中でプロテアーゼ活性測定用の融合タンパク質基質を発現する宿主細胞を被験対象のプロテアーゼと反応させる反応工程、ここで前記融合タンパク質基質はN末端側から順にシグナル配列、プロテアーゼ標的領域、レポーター領域、及び膜結合領域を含み、並びに
    　反応後の宿主細胞において前記レポーター領域に基づくレポーター活性を測定する測定工程
    を含む、前記方法。
  15. 　前記測定工程後に宿主細胞の生存率を測定する、請求項１４に記載の方法。
PCT/JP2022/022041 2021-06-07 2022-05-31 プロテアーゼ活性測定用の融合タンパク質基質 WO2022259904A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023527625A JPWO2022259904A1 (ja) 2021-06-07 2022-05-31

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021095348 2021-06-07
JP2021-095348 2021-06-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022259904A1 true WO2022259904A1 (ja) 2022-12-15

Family

ID=84424936

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/022041 WO2022259904A1 (ja) 2021-06-07 2022-05-31 プロテアーゼ活性測定用の融合タンパク質基質

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2022259904A1 (ja)
WO (1) WO2022259904A1 (ja)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002543797A (ja) * 1999-05-05 2002-12-24 ベーリンガー インゲルハイム ファルマ コマンディトゲゼルシャフト 膜結合基質を特異的に切断するプロテアーゼを発見する方法
JP2008503219A (ja) * 2004-06-21 2008-02-07 プロウジェンラ インコーポレーテッド タンパク質分解活性に関連する診断およびスクリーニング方法ならびにキット
JP2013512692A (ja) * 2009-12-07 2013-04-18 シナプティック リサーチ，リミテッド ライアビリティ カンパニー プロテアーゼ活性阻害剤の同定とプロテアーゼ活性の存在を測定するための方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002543797A (ja) * 1999-05-05 2002-12-24 ベーリンガー インゲルハイム ファルマ コマンディトゲゼルシャフト 膜結合基質を特異的に切断するプロテアーゼを発見する方法
JP2008503219A (ja) * 2004-06-21 2008-02-07 プロウジェンラ インコーポレーテッド タンパク質分解活性に関連する診断およびスクリーニング方法ならびにキット
JP2013512692A (ja) * 2009-12-07 2013-04-18 シナプティック リサーチ，リミテッド ライアビリティ カンパニー プロテアーゼ活性阻害剤の同定とプロテアーゼ活性の存在を測定するための方法

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2022259904A1 (ja) 2022-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2002330756B2 (en) System for detecting protease
Carpp et al. Interaction between the yellow fever virus nonstructural protein NS3 and the host protein Alix contributes to the release of infectious particles
US20180127800A1 (en) Compositions and methods for identifying zika enzyme inhibitors
JP4782927B2 (ja) 代理細胞ベースシステム及びｃ型肝炎ウイルスｎｓ３プロテアーゼの活性を評価する方法
Austin et al. The substrate specificity of Metarhizium anisopliae and Bos taurus carboxypeptidases A: Insights into their use as tools for the removal of affinity tags
WO2022259904A1 (ja) プロテアーゼ活性測定用の融合タンパク質基質
US20050214890A1 (en) Novel "Cleave-N-Read" system for protease activity assay and methods of use thereof
US20230341397A1 (en) Protease biosensors and methods of virus detection
US10006077B2 (en) Compositions and cell-based methods for monitoring the activity of a Dengue Virus protease
US20190048391A1 (en) Compositions and methods for identifying enzyme modulators or inhibitors
EP3438267B1 (en) Recombinant polynucleotide coding for polypeptide comprising reporter moiety, substrate moiety and destabilizing moiety, host cell comprising same and use of same
US20080233558A1 (en) Inhibitors of viral entry screening method
US20040042961A1 (en) Development of an in vivo functional assay for proteases
Prchal et al. Expression and purification of myristoylated matrix protein of Mason-Pfizer monkey virus for NMR and MS measurements
Löw et al. A novel cell‐based sensor detecting the activity of individual basic proprotein convertases
US6506557B2 (en) Methods and compositions for identifying a protease
US20240043943A1 (en) Methods and compositions for protease reporter assays and modulators
Kusunoki et al. The N93D mutation of the human T-cell leukemia virus type 1 envelope glycoprotein found in symptomatic patients enhances neuropilin-1 b1 domain binding
WO2002010430A2 (en) Detecting anti-viral drug candidates and resistance
AU766501B2 (en) Methods for identifying a protease inhibitor
CN116171281A (zh) 结合细胞受体ace2并防止病毒进入细胞的新型类肽化合物
CN117241819A (zh) 用于蛋白酶报告基因检测方法和蛋白酶报告基因调节剂的方法和组合物
McArthur Molecular and cellular studies of host-mediated proteolytic maturation of dengue virus serotypes 1–4
TW200424215A (en) Systems for screening anti-hepatitis drugs
Khamo Monitoring proteolytic cleavage of West Nile Virus non-structural 2B/3 protease in the cytosol

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22820086

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023527625

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 22820086

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1