JP2008503219A - タンパク質分解活性に関連する診断およびスクリーニング方法ならびにキット - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、「イソペプチダーゼ活性を評価する方法」と題される米国仮出願第60/580,900号の2004年6月21日の出願日の優先権を主張する。
ユビキチンまたはユビキチン様タンパク質(UBL)またはその機能性C末端セグメントを含む第一のポリマー、および検出のために必要とされる遊離N末端アミノ酸を含む第二のポリマーを含み;第一および第二のポリマーが、UBLのC末端および第二のポリマーのN末端を介して互いに動作可能に連結される融合ポリマーを供給すること;
UBLのC末端で切断するタンパク質分解酵素と、融合ポリマーを接触させること;
切断されたポリマーの量または活性のいずれかと関連するシグナルを検出すること;および
切断されたポリマーのシグナルおよびタンパク質分解酵素の活性との間の相関関係を確立することを含む。
ユビキチンまたはユビキチン様タンパク質(UBL)またはその機能性C末端セグメントを含む第一のポリマー、および検出のために必要とされる遊離N末端アミノ酸を含む第二のポリマーを含み;第一および第二のポリマーが、ユビキチンまたはUBLのC末端および第二のポリマーのN末端を介して互いに動作可能に連結される融合ポリマー;および
タンパク質分解酵素アッセイを行い、第一および/または第二のポリマーの量または活性に関連したシグナルを検出し、そして検出されるシグナルと酵素のタンパク質分解活性との間の相関関係を確立するための取扱説明書;および
任意には、UBLのC末端で切断するタンパク質分解酵素源およびいくつかの他の構成要素を含むキットを提供する。
ユビキチンまたはユビキチン様タンパク質(UBL)またはその結合機能性C末端セグメントを含む第一のポリマー、および遊離N末端アミノ酸を含む第二のポリマーを含み、第一および第二のポリマーがN−、C−末端を介して互いに動作可能に連結される融合ポリマーを取得すること;
切断が起こるのに有効な条件下で、融合ポリマーを、UBLのC末端切断タンパク質分解酵素と接触させること;
100%切断シグナルを得るために、切断の量に関連するシグナルを検出すること;
0%切断シグナルを得るためにタンパク質分解酵素活性の完全な阻害因子の存在下で、接触および検出工程を繰り返すこと;
1組の化合物を得ること;
切断シグナルを得るために各化合物の存在下で、融合ポリマーの取得、接触および検出工程を個別に繰り返すこと;
0%および100%切断シグナルを参照することにより、各化合物の切断シグナルを正規化すること、および各化合物にタンパク質分解酵素活性値を付与することを含む方法に関する。
ユビキチンまたはユビキチン様タンパク質(UBL)またはそのC末端セグメントを含む第一のポリマー、および検出のための遊離Nアミノ酸末端を必要とするポリペプチドを含む第二のポリマーを含み、第一および第二のポリマーがユビキチンあるいはUBLのC末端および第二のポリマーのN末端を介して互いに動作可能に連結される融合ポリマー;
タンパク質分解酵素アッセイを行い、第一および/または第二のポリマーの量または活性に関連したシグナルを検出し、そして酵素のタンパク質分解活性に対する検出されるシグナルの相関関係を確立するための取扱説明書;および
任意には、ユビキチンまたはUBLのC末端で切断するタンパク質分解酵素源および種々の態様に適した他の構成要素
を含む。
細胞、植物または動物を取得すること;
ユビキチン−、UBL−またはそれらのC末端結合機能性フラグメント−レポーター融合ポリヌクレオチドを取得すること;
ベクターに動作可能に連結したハイブリットポリヌクレオチドを担持するハイブリットベクターを取得すること;および、
そのハイブリットベクターを、細胞、植物または動物に安定にトランスフェクトすること
によって産生され得る。
その疾患または症状に罹っていると推測される対象から得られたサンプルを該細胞、植物または動物と接触させるか、または該細胞、植物または動物に投与すること;
サンプルの存在下でレポーターにより産生される任意のシグナルを検出すること;および
0%と100%シグナルのための対照とそのシグナルを比較すること
を含む、疾患または症状の診断方法である。
本出願で示されるアッセイは、シグナル、たとえば活性を産生するために遊離N末端アミノ酸残基を必要とするあらゆる試薬または「レポーター」、たとえば酵素、タンパク質等を使用する。この試薬は、別のタンパク質のC末端に対するそのN末端を介して、融合によって不活性化される。例を使用して、トリプシン・ファミリーのようなプロテアーゼ酵素、たとえば因子Xは、活性部位ペプチド切断に関与する遊離N末端リシンを必要とする。本発明のアッセイは、さらに、タンパク質分解酵素、たとえばUBL加水分解酵素を含み、タンパク質分解酵素により切断されるであろうUBL−レポーター融合タンパク質を形成する。融合タンパク質のこの切断は、ユビキチンとユビキチン様タンパク質(集約的にはUBLと称される)の両方を遊離する、またはその結合機能性フラグメントが遊離C末端および遊離N末端を伴う「レポーター」を保有する。本アッセイの様々の実施態様では、それらの活性形態でUBLとレポーターの両方が、当業界で知られる多様な手段により、たとえば、放射性、色素原、蛍光、リン光、化学発光、および他の標識および/または基質の助けで検出されうる。アッセイは、反応が起こるマイクロタイタープレートの助けで行われうる。タンパク質分解酵素調節因子のスクリーニングのために設計された本発明の方法の別の実施態様では、好ましくは反応混合物の他の構成要素より前に、各化合物を、マイクロタイターのウェルに添加しうる。切断が完了した対照と比較した場合、スクリーニング陽性あるいは「ヒット」は、シグナル、たとえば色または蛍光の損失によって識別され、より少ないUBLまたはレポーターが遊離されたことを示す。融合ポリマーが融合タンパク質である1つの実施態様では、レポータータンパク質のN末端を、多様なUBLまたはそのフラグメントの内のいずれかのC末端に融合させることができ、それはタンパク質分解酵素、たとえばプロテアーゼまたは脱ユビキチナーゼのような加水分解酵素によって識別および切断される。別の実施態様では、本発明のアッセイは、タンパク質分解酵素、たとえば精製加水分解酵素、酵素活性が精製されなければならない細胞溶解物または抽出物の様々な供給源で行われうる。別の実施態様では、本発明の方法は、タンパク質分解酵素の様々の推測供給源を置換し、融合ポリマー、たとえば融合タンパク質におけるその効果を試験することによって、多様な生物からの新規タンパク質分解酵素の発見に使用されうる。
サンプルの非存在下で得られる対応の酵素活性シグナルに対するサンプルシグナルを参照することによりタンパク質分解酵素活性におけるサンプルの影響に関する値を決定することを含みうる。そのアッセイにかけられたサンプルは、特に、生理学的流動体、組織サンプル、細胞、またはその抽出物または分画を含む。明らかに、その工程の1つまたは複数が、中でも、インビトロ、インビボ、エキソビボで、細胞または組織培養物内、細胞または反応の組織抽出物上で行われ得る。種々のシグナルおよび検出方法を使用しうるが、一般には、細胞成長の、あるいは発色性、放射性、蛍光、リン光または化学発光シグナルの検出である。接触、検出、確立および決定工程は、タンパク質分解酵素活性調節因子を含むことが推測される複数のサンプルについて別個に行われて、その方法は、自動化さえされうる。後者の方法では、各サンプルおよび対照について得られる情報の収集、処理および報告は、コンピュータ処理されうる。米国仮出願番号第60/580,900号の、および国際公開第03/057174号A2パンフレットの、国際公開第2005/003313号A2パンフレットは、本発明にそれらの全体により組込まれて、本発明で使用される製品の可能性にとって適合性のある供給源、製造の方法、例および他の条件および要素、それらの部品およびプロセスを提供する。
ユビキチンあるいはユビキチン様タンパク質(UBL)またはそのC末端セグメントを含む第一のポリマー、および検出のために遊離Nアミノ酸末端を必要とするポリペプチドを含む第二のポリマーを含み、第一および第二のポリマーが、ユビキチンあるいはUBLのC末端および第二のポリマーのN末端を介して互いに動作可能に連結される融合ポリマー;および
タンパク質分解酵素アッセイを行い、第一および/または第二のポリマーの量または活性に関連したシグナルを検出し、酵素のタンパク質分解活性に対する検出されるシグナルの相関関係を確立するための取扱説明書
を含む。
タンパク質分解酵素アッセイを行い、第一および/または第二のポリマーの量または活性に関連したシグナルを検出し、そして複数の調節因子および対照について、酵素のタンパク質分解活性に対する検出されるシグナルの相関関係を確立するための取扱説明書;および
任意には、UBLのC末端で切断するタンパク質分解酵素源
を含みうるタンパク質分解酵素活性調節因子スクリーニングキットの助けで行われうる。
バンピッペルリンダウ症候群は、VHL遺伝子の生殖系列突然変異により引起される遺伝性癌症候群である。シムズ(Sims)(2001年)を参照。それは、その疾患を示す者を、CNSおよび網膜における血管芽細胞腫、腎臓明細胞癌、副腎の褐色細胞腫、膵臓腫瘍、精巣上体の嚢胞腺腫、および内耳の腫瘍を含めた種々の腫瘍に罹りやすくする。リーら(2002年);マハー(Maher)およびカエリン(Kaelin)(1997年)を参照。VHLタンパク質(pVHL)は、エロンギンC、エロンギンB、およびクリン−2と結合して、複合体VCB−CUL2を形成し、そしてそれは、ユビキチンE3リガーゼとして作用する。リッツワン(Lisztwan)ら(1999年)を参照。突然変異したpVHLが悪性腫瘍と関連しているので、リガーゼは、腫瘍抑制剤およびその基質潜在性癌遺伝子分子と見なされうる。VCB−CUL2の基質として知られる低酸素症誘発性因子(HIF−α)は、血管芽細胞腫の発生、そして腫瘍でのように、一般に、VEGF誘導を介して血管形成に役割を果たす。オー(Ohh)ら(2000年);タイヤーズ(Tyers)およびベンジャミン(Benjamin)ら(1997年)を参照。さらに、その基質の中でも、pVHLと相互作用する酵母2ハイブリッドスクリーニングによって見出されたユビキチンイソペプチダーゼ、VDU1である。非常に相同性のプロテアーゼVDU2も知られている;それは、pVHL関連の点で研究されていないが、VDU2は、VDU1と共介して生理学上の基質を有する。クルシオ−モレリ(Curcio-Morelli)ら(2003年)を参照。天然に生じる突然変異の部位であるpVHLのβ−ドメイン領域は、VDU1相互作用の遺伝子座であり、そしてVDU1は、VCB−CUL2複合体における共免疫沈澱されうる。pVHL依存性経路によるVDU1のユビキチン化および分解は、VDU1との相互作用を中断するVHL突然変異により阻止される。したがって、pVHLによるVDU1の標的化分解は、腫瘍形成および/または維持を抑制する上で重要であり、そしてVDU1は、機能性リガーゼの非存在下で明らかにされる癌遺伝子活性を有しうる。したがって、VDU1は、突然変異されたpVHL(VHL(常染色体優勢)疾患)を有する患者の100%)によって特徴づけられる新生物疾患で、そして突発性腎臓明細胞癌を有する非常に多数の患者の50〜80%で重要である。たとえば、ストレ(Stolle)ら(1998年);グナラ(Gnarra)ら(1994年)を参照。VDU1の阻害は、野生型腫瘍抑制剤pVHLの活性を機能的に擬態する。
脱ユビキチン化酵素は、当初のユビキチンタグを除去し、それによりプロテアソームの分解を避けることによって、所定のタンパク質を控えるか、または少なくともそれらの細胞寿命を延長する役割を果たしうる。HAUSPとしても知られるこのようなイソペプチダーゼの1つUSP7は、腫瘍抑制剤p53を安定化させることが知られている。リーら(2002年)を参照。別のイソペプチダーゼであるUSP2aは、前立腺癌の分子特徴である脂肪酸シンターゼ(FAS)の制御に関与した。ロッシ(Rossi)ら(2003年);アゴスチニ(Agostini)ら(2004年);クラナー(Graner)ら(2004年)を参照。USP2aは、アンドロゲンで制御され、そして前立腺癌で過剰発現され、そしてしたがって、癌遺伝子タンパク質である。したがって、それらの基質の役割によって、脱ユビキチン化酵素は、治療効果を達成するために活性化されるか、または阻害されるかのいずれかでありうる。
脱ユビキチン化酵素イソペプチダーゼTは、染色体22q11欠失症候群を示す患者で下方制御され、そしてそれは、多様な心臓欠陥を含む。ヤマギシ(Yamagishi)ら(1999年)を参照。UFD1と一緒に、イソペプチダーゼTは、心不全を示す患者から得られる筋細胞で下方制御される。コスチン(Kostin)ら(2003年)を参照。このイソペプチダーゼは、ユビキチン−タンパク質接合体からポリユビキチン鎖を除去し、そしてタンパク質分解を刺激することが知られており、そしてその欠乏は、ポリユビキチン化タンパク質の蓄積、およびユビキチン−プロテアソーム分解経路の崩壊を引き起こし、それにより自食作用性の細胞死を導く。ハダリ(Hadari)ら(1992年);ジョンソン(Johnson)ら(1995年);ステファニス(Stefanis)ら(2001年)を参照。
JAMMドメイン含有タンパク質は、EGF受容体(EGFR)のエンドソームの選別、すなわち膜とエンドソーム/リソソームの区分とのあいだのトラフィキングに関連したシグナルトランスダクションに関連する。このタンパク質AMSH(エンドソームでの受容体選別を制御するタンパク質であるSTAMのSH3ドメインと結合した分子)。マククルーフ(Mccullough)ら(2004年);クラーグ(clague)およびウルベ(Urbe)(2001年)を参照。EGFRは、シグナルトランスダクションカスケードを開始させることによって、膨大な細胞機能を制御する。ロックハート(Lockhart)およびベルリン(Berlin)(2005年);バンアーセン(vonAhsen)およびボーマー(Bomer)(2005年);リロイおよびウラナ(Wrana)(2005年);スパノ(Spano)ら(2005年)を参照。EGFRの細胞寿命のあいだに、それが酸プロテアーゼにより分解される後期エンドソームおよびリソソームに選別するために最終的に選択される前に、それは、膜から初期(選別)エンドソームに再利用する。EGFRは、膜でと、そして初期エンドソーム区分での両方でシグナルトランスダクションに関与する。シグナル発生の大半が、細胞成長と他の機能の制御で考慮される一方で、シグナルトランスダクションの1つの構成要素は、それ自身のGFFRのトラフィキングを制御する。E3リガーゼCb1は、リン酸化EGFRのユビキチン化に介入する。連続シグナル発生事象は、後期エンドソーム/リソソームにおける受容体の分解を生じる。Ub−EGFRは、エンドソーム表面でタンパク質Hrsによって識別され、そしてさらに、ユビキチンにより介在される輸送のために要求されるエンドソーム関連複合体(ESCRT)と相互作用は、複数小胞体(MVB)の内部小胞への転位を生じ、そしてEFGRがリソソームでのプロテアーゼ分解に投入される。EGFRのCb1介在ユビキチン化の最終的結果である分解は、ユビキチンイソペプチダーゼAMSHによって阻止され、siRNAを用いた細胞のインキュベーションによるAMSH活性の除去は、EGFR分解が増大されることを導く;精製AMSHは、インビトロでEGFR−Ubを脱ユビキチン化する。マククルーフ(Mccullough)ら(2004年)を参照。GFRキナーゼ阻害剤および受容体結合拮抗剤は、最近、種々の癌について治験中である。シアルジエロ(Ciardiello)およびトルトラ(Tortora)(2001年);ロルッソ(LoRusso)ら(2003年)を参照。まだ対処されていない重要な必要性を示す他の疾患領域は、EGFR活性にも関連し、1つは、気管支喘息に関連した気道炎症および粘液過剰分泌である。喘息が、白血球細胞浸入と関連した気管支上皮の多因性疾患損傷であり、そして気道応答性が増大したことは、不変の特性である。プティコンベ(Puddicombe)ら(2000年)を参照。EFGRシステムは、肺における上皮および結合組織細胞型の成長および分化に重要な役割を果たすことが要求された。EGFRおよびそのリガンドは、喘息の病気発生のあいだに上昇され、そしてこのシステムの導入は、喘息性気道でのゴブレット細胞の過形成と相互に関連する。タケヤマら(2001年)を参照。当初の上皮細胞損傷のいずれかの試みられた修復は、EGFRおよびEGFR活性化に関連した過剰増幅および分化応答を導く。ボナール(Bonner)(2002年)を参照。喘息患者は、未損傷の上皮組織でさえ高レベルのEGFRを慢性的に発生させるように見える。これは、一定の炎症症状を受け、そして喘息、COPD、および他の肺疾患における気道梗塞、死亡率および致死に関連した繊維症および粘液過剰分泌に導く。
UCHL1、またはユビキチンカルボキシ末端加水分解酵素は、遺伝子でパーキンソン病(PD)に関連している。チャンら(2003年);トダら(2003年);マラガノル(Maraganore)ら(2004年)を参照。UCHL1での突然変異は、常染色体優性PDを引起し、ユビキチンプロテアソーム経路における混乱は、PDにおけるドーパミンニューロンの消滅に重要な役割を果たすという考えと一致する。他のタンパク質分解酵素は、当業界で知られるとおり他の疾患に関連する。種々の例は、下に示される表3に含まれる。
細胞、植物または動物を取得すること;
ユビキチン−、UBL−、またはそれらのC末端結合機能性フラグメント−レポーター融合ポリヌクレオチドを取得すること;ベクターに動作可能に連結したハイブリットポリヌクレオチドを担持するハイブリットベクターを取得すること;および、ハイブリットベクターを細胞、植物または動物に安定にトランスフェクトすることによることを含めて、多くの方法によって発生される。
以下の実施例は、本発明による好ましいイソペプチダーゼアッセイを説明するものである。レポーター酵素であるRNA依存性RNAポリメラーゼ(3Dpol)は、活性のための遊離N末端を必要とする。ゴハラ(Gohara)ら(1999年)を参照。ポリメラーゼをSmt3と融合させ、それによりそのN末端を遮断した。この融合タンパク質を、SUMOイソペプチダーゼで処理した場合、遊離3DpolN末端を生じた。前記ゴハラら(1999年)。融合物の切断に続いて、以下に記載されたようなポリメラーゼアッセイを用いて、3Dpol活性を定量化することができる。したがって、ポリオウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼのイソペプチダーゼ介在性切断は、インビトロにおけるポリメラーゼ活性のために必要とされ、ポリオウイルスRdRp活性は、イソペプチダーゼ活性の代理的測定値である。
Smt3−3Dpol(マホニー株)融合物を、マラコフ(2004年、7番)によって記載されたのと同様の方法で構築、発現および精製した。
5’−GCAGGTCTCAAGGTGGTGAAATCCAGTGGATGAG−3’
5’−GCAGGATCCCTAGTGGTGGTGGTG− 3’
C末端Higタグ付SUMOプロテアーゼ1、ULP1(403−621)pを、ロゼッタ−(DE3)pLysS(ノバジェン(Novagen))中のpET24dから発現させ、Ni−NTA樹脂で精製した。リーおよびホエストラッセル(1999年)およびモセソバ(Mossessova)およびリーマ(Lima)(2000年)を参照。Ulpおよび切断反応は、マラコフ(Makakhov)ら(2004年、7番)に記載されているように標準条件下で完了させた。反応を終結させ、サンプルを5分間沸騰させ、SDS−PAGEにかけた。SDS−PAGEによる切断された融合物の定量によって活性を評価した。活性を定量的に評価するためシオン画像ソフトウエアを使用して、得られたゲルを走査した。
ヌクレオチド組込みまたはプライマー伸長のいずれかによって、3Dpolおよびその融合誘導体のプロテアーゼ活性を評価した。アーノルド(Arnold)およびキャメロン(Cameron)(1999年)を参照。ヌクレオチド組込みアッセイは、以下の反応混合物と共に放射性ヌクレオチドを用いて行った:50mM HEPES(pH7.5)、10mMβ−メルカプトエタノール、5mM MgCl2、60μM ZnCl2、500μM UTP、0.4μCi/μL[α−32P]UTP、1.8μM dT15/0.15μMポリ(rA)400プライマー/テンプレートおよび3Dpol。すべての反応は、総量25μLで、250ngの精製3Dpolを使用し、5分間、30℃で行った。83mMに対して0.5M EDTAの添加により反応を止め、10μLの停止された反応物を、DE81ろ紙ディスクにスポットし、完全に乾燥させた。ディスクを、その後3回、10分間、250mLの5%二塩基性リン酸ナトリウムを用いて洗浄し、無水エタノールで洗った。5mLのシンチレーション流体において液体シンチレーション分光測定法によって各フィルターに結合した放射活性を定量した。プライマー伸長反応は、50mM HEPES(pH7.5)、10mM β−ME、5mM MgCl2、500μM ATP、1μM sym/sub−U、0.14μg/μLの3D酵素および+/−1μL ULP1(総反応容量25μL)を含有した。
Smt3−3Dpol Ulp−1融合物を、1、2、4、10、20、30および60分間、標準条件下でインキュベートし、そしてSDS−PAGEおよびクーマシーブルー染色によって確認されるとおり3Dpolの100%の切断を生じた。前述のアッセイを使用して、放射性ヌクレオチド組込みにより、3Dpolの活性を分析した。得られた結果を下記表4に示す。
この実施例は、GPATaseを使用する本発明による好ましいイソペプチダーゼアッセイを説明する。酵素グルタミンホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼ(GPATase)は、プリンヌクレオチド生合成の初期工程を触媒する、その経路の主要な制御酵素である。GPATaseは、グルタミンアミドの窒素(遊離NH3)を、ホスホリボシルピロリン酸塩(PRPP)に転移させ、そしてリン光体リボシルアミン、ピロリン酸塩およびグルタミン酸塩を生じる。GPATaseは、生合成の目的のためにグルタミンのアミド窒素の利用に関与する16種類のグルタミンアミドトランスフェラーゼのファミリーに属する。ザルキン(1993年);トソ(Tso)(1982年)を参照。大腸菌のGPATaseは、同一のサブユニットから形成されるが、鳥類、哺乳類またはBサブチリスGPATaseとは異なり鉄を含有しないテトラマーまたはトリマーの形態のいずれかにありうる。マントサラ(Mantosala)およびサルキン(1976年)を参照。活性部位システインは、グルタミンアミドの転移のために必要とされ、触媒機構の重要な工程である。このシステインは、成熟GPATaseのN末端残基でもあるので、酵素が、触媒活性のために遊離N末端を必要とすることは明らかである。トソ(Tso)ら(1982年)を参照。反応は、反応NAD+−>NADHにつながり、そしてそれは、下に示されるとおりλ=363nmでのNADH反応生成物の吸光度を測定することによって、GPATase活性の評価を可能にする。
マラコフら(2004年、7番)に記載されたのと同様の方法で、Smt3−GPATase融合物を構築、発現および精製した。グルタミンリン光体リボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼ(GPATase)をコードする大腸菌のpurF遺伝子を、以下の合成プライマーを使用し、ベラ(Bera)らのJ.B.C.275巻、7975〜7979頁(2000年)に記載されたpETpurFプラスミドを使用してPCR増幅させた。
フォワワード:5’−GTCAGGTCTCAAGGTTGCGGTATTGTCGGTATCGC−3’
リバース:5’−GTCAGGATCCTCATCCTTCGTTATGCATTT− 3’
酵母ULP1タンパク質(SUMOプロテアーゼ触媒ドメイン)を用いた処置により、SUMOタンパク質を、SUMO−GPATase融合タンパク質から切断した。50mMトリス−HCl(pH7.5)、1mM EDTA、10mM DTTを含有する反応混合物でのULP1酵素の濃度を増大させつつ、およそ5μgのSUMO−GPATaseを、3時間、30℃でインキュベートした。SDS−PAGEサンプル緩衝液の添加により反応を停止させ、加熱し、そして12%SDS−ポリアクリルアミドゲルに直接かけ、電気泳導した。電気泳導の後、ゲルを染色して、タンパク質を可視化した。SDS−PAGE分析は、0.009単位程度の少ないUlp1で融合物の切断を示した;しかし、その切断は、78.3単位程度の多さではけして完全には達成されなかった。融合タンパク質を切断するULP1酵素のこの能力の無さは、切断部位周辺での立体障害、または連結配列のある程度の部分的修飾、たとえばGPATaseのアミノ末端でのシステイン残基の酸化の発生に反映しうる。
グルタミナーゼ酵素であるGPATaseは、5−ホスホリボシルピロリン酸(PRPP)産生グルタミン、5−ホスホリボシル−(b)−アミン(PRA)およびピロリン酸(PPi)を水酸化する。メッセンジャー(Messenger)およびサルキン(1979年)によって示される標準反応条件下で結合グルタメートデヒドロゲナーゼ(GDH)アッセイの手段によりグルタミンの生成を測定することによって、このグルタミナーゼ反応を監視した。
以下の実施例は、本発明によって提供される好ましいイソペプチダーゼアッセイを示す。トリプターゼは、134kDaの分子量を示す天然のセリンプロテアーゼである。その酵素は、4つの非共有結合サブユニットから成り、各サブユニットは、単一活性部位を有する。このファミリーには、2つのあいだでおよそ90%配列同一性を示すα−トリプターゼおよびβ−トリプターゼという主に2つのメンバーがある。トリプターゼは、不活性前駆体として合成され、そして他のプロテアーゼと一緒に活性酵素として分泌顆粒中で保存される。さらに、同様にα−プロトリプターゼと称される、構成的に発現および分泌されるバージョンがある。β−トリプターゼの活性化は、それにより当初の切断が、形成されるべきモノマーを生じる自己触媒性分子間切断である2つのタンパク質分解過程であり、そしてN末端でのジペプチドが、必要とされる四量体の形成を阻害する。N末端からジペプチドを切断することが、ジペプチジルペプチダーゼの役割であり、そして成熟トリプターゼ構造の形成を可能にし、そして活性を50倍増大させる。
組換えヒトトリプターゼは、オレイリー(O'Reilly)(1992年)に記載されるようにバキュロウイルス(オートグラファ・カリフォルニカ・核多面体化ウイルス(AcNPV))昆虫細胞(ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda(Sf9))システムで発現された。cDNAコード化ヒトトリプターゼを、ユビキチン(Ub)またはSUMOのいずれかをコードし、N末端に6つのヒスチジン残基(6×His)タグを担持する配列の3’末端フレーム内で融合した。このハイブリッド遺伝子を、その後、バキュロウイルスで分泌されるエンベロープ糖タンパク質gp67についてのシグナル配列のすぐ下流に挿入した。ポリヘドリンp10または塩基性タンパク質AcNPV遺伝子プロモーターによって、その遺伝子融合物の発現を制御した。遺伝子融合物をバキュロウイルス移行ベクターにクローニングした後、Ub/UBL−トリプターゼ構築物を担持する組換えプラスミドを、AcNPVバキュロウイルスDNAと、昆虫細胞に同時トランスフェクトした。数日後、移行ベクターおよびAcNPVデオキシリボ核酸(DNA)の相同性組換えにより生じた組換えウイルスを選択し、プラーク精製し、そして増幅させた。
色素原または蛍光性酵素的アッセイのいずれか、あるいは両方を使用して、ヒトトリプシダーゼの活性を測定した。トリプターゼを活性化した適切なUBL加水分解酵素/プロテアーゼによって、精製融合タンパク質を切断した。その加水分解が410nmでの吸光度における変化の測定により監視されたペプチジル色素原基質を使用して、トリプターゼ活性を分析した。シェクター(Schechter)ら(1998 1998)を参照。シェクターおよび同僚のプロトコールにしたがって、Ulp1を用いた精製Smt3−トリプターゼの切断により、増大したトリプターゼ活性を測定した。イソペプチダーゼによる切断の前に、ユビキチン−トリプターゼもSUMO−トリプターゼのいずれも、なんらトリプターゼ活性を示さなかった。イソペプチダーゼによる切断によってのみ、トリプシダーゼ活性を見出した。したがって、トリプシダーゼ融合物は、イソペプチダーゼ活性を同定する有用な道具である。
以下の実施例は、ホスホリパーゼA2を使用する本発明のアッセイの好ましい形態を示す。ホスホリパーゼは、ヘビ毒で最初に同定された酵素のファミリーであり、そして後に、高等生物じゅうで保存されていることが発見された。ホスホリパーゼは、それらのサイズ、発現のパターン、およびコファクターへの依存性によりサブファミリーにグループ分けされる。分泌されたホスホリパーゼA2(sPLA2)酵素サブファミリーは、それらが、ミリモルの濃度の触媒用Ca2+を必要とするジスルフィドの豊富な14〜16kDaタンパク質である点で、細胞質ゾル性細胞間構成要素およびCa2+依存性PLA2異形態のような他のPLA2サブグループから分けられ得る。ゲルブ(Gelb)(1995年)参照。哺乳類系では、11のsPLA2酵素、たとえばIB、IIA、IIC、IID、IIE、IIF、III、V、X、XIIAおよびXIIBが過剰にある。sPLA2は、様々の極性頭部基および脂肪酸アシル鎖を有するリン脂質について広範な特異性を保持する。PLA2ファミリーの酵素は、sn−2位置でリン脂質切断を触媒して、遊離脂肪酸およびリソリン脂質を得る。デニス(Dennis)(1994年)を参照。
大腸菌での発現のための全てのプラスミド構築物は、pET24d(+)発現ベクター(ノバジェン)由来であった。ユビキチン/UBL−融合発現ベクターを、マラコフら(2004年)により詳説されるとおり構築した。マウス群XPLA2を、全PLA2酵素群についての例として選択した。処理された活性群XPLA2酵素形態を増幅するのみである指定されるプライマーを用いたネズミのPLA2群X遺伝子のPCR増幅によって、融合構築物を作製した。5’および3’プライマー内に含まれるのは、それぞれ、特徴的なBsaIおよびBamHI制限部位である。これは、ユビキチン/UBL遺伝子の下流で、そしてそれにより、融合タンパク質のフレーム翻訳で挿入を可能にした。使用されたプライマーは以下のとおりであった。
フォアワード:5’−GATCGGTCTCAAGGTGGACTCCTGGAGCTGGCAGGG−3’
リバース:5’−GATCGGATCCTCAATTGCACTTGGGAGAGTC−3’
BL21(DE3)またはロゼッタ(Rosetta)(DE3)のいずれかの2つの大腸菌宿主株への形質転換に続いて、ユビキチン/UBL融合タンパク質の細菌の発現を行った。SoUBLeおよびinsoUBLe分画を沈着させ、SDS−PAGEゲル上で電気泳動にかけ、そしてクーマシーブルーで染色して、各融合物のサイズおよび発現を立証した。その後、NiNTA樹脂(キアゲン社)でのクロマトグラフィーにより、ユビキチン/UBL−PLA2mXを、insoUBLe分画から精製し、そして48時間、緩衝液交換しながら塩析した。全分画を収集し、そしてその後、SDS−PAGEにより電気泳動にかけ、そしてクーマシーブルーで染色した。各構築物は、下の表5で示されるとおり、予想されるとおり適切にサイズ決めされたバンドを表した。
脂肪のsn−2位置で接合された発蛍光団を有するホスホチジルコリンを、PLA2活性を分析するための基質として使用した。活性PLA2に結合したsn−2アシルの切断により放出された発蛍光団を、その特定の励起および発生波長で検出した。2つの発蛍光団を使用した:NDB(たとえば:460nm/em:534nm)およびBODIPY FL(たとえば:503nm/em:512nm)(分子プローブ/インビトロゲン)。脂質基質を、5μmの最終濃度までPLA2アッセイ緩衝液(10nMトリス、pH8、100M KClおよび2mM Ca2+)で希釈した。切断反応は、96穴ブラックプレートで、または1.5mlエッフェンドルフ管でのいずれかで行い、そしてその後脂質基質を添加した。切断生成物またはユビキチン/UBL−イソペプチダーゼの添加により、400ミリ秒の読取を、総計30分間、15秒間隔で記録した。使用された別のプロトコールでは、PLA2−融合構築物を集約的に、細胞抽出物またはイソペプチダーゼのいずれか、および基質を添加することによって、切断反応を、96ウェルプレート中で組立てた。30分のような所望の時点まで、継続的読取を行った。融合物の切断は、切断脂質基質の蛍光における増加により検出された。
種々のユビキチン/UBL−PLA2融合物の切断は、全細胞抽出物の助けで行われた。この切断が、適切または予測されるサイズの脱落バンドを生じたことが確定された。2つのバンドは、クーマシーブルー染色ゲルで見られた。一定な14kDaPLA2mXバンド、およびユビキチン/UBL融合パートナーでサイズ決めされたバンドで、そのサイズは、UBL融合パートナーによる。得られた結果は、下の表5で示される。
これらの実験で、レポーター融合タンパク質を、ユビキチンまたはUBL部分を標的にするイソペプチダーゼの存在下または非存在下でインキュベートし、そしてSDS−PAGEにより融合切断を監視することによるか、またはPLA2活性を検出することによるかのいずれかによりイソペプチダーゼ活性について分析した。酵母Ulp1イソペプチダーゼは、酵母Smt3遺伝子生成物について特異性を示すので、それは、酵母Smt3融合タンパク質の切断のために使用された。同様に、SENP2イソペプチダーゼを、ヒトSUMO融合タンパク質の切断のために使用し、そして分断USP2生成物の共有コア酵素的ドメイン、USP2aまたはUSP2bのいずれかを、ユビキチン融合タンパク質の切断のために使用した。リン(Lin)ら(2000年)を参照。そして最後に、Den1、Nedd8特異的イソペプチダーゼを、Nedd8−PLA2mX融合タンパク質を切断するために使用した。ガン−エルデン(Gan-Erdene)(2003)を参照。
Claims (85)
- タンパク質分解酵素活性の評価方法であって、
ユビキチンまたはユビキチン様タンパク質(UBL)またはそれらの機能性C末端セグメントを含む第一のポリマー、および検出のために必要とされる遊離N末端アミノ酸を含む第二のポリマーを含有する融合ポリマーであり、該第一および第二のポリマーがUBLのC末端と第二のポリマーのN末端とを介して互いに動作可能に連結されている融合ポリマーを供給すること;
該融合ポリマーをUBLのC末端で切断するタンパク質分解酵素と接触させること;
切断されたポリマーの量もしくは活性のいずれか、またはその酵素を含むことが推測されるサンプルと関連するシグナルを検出すること;および
切断されたポリマーのシグナルとタンパク質分解酵素の活性との相関関係を確立すること
を含む方法。 - 0%および100%切断シグナルを参照することにより各酵素またはサンプルの切断シグナルを正規化すること、および各酵素またはそのサンプルにタンパク質分解酵素活性値を付与することをさらに含み、得られた酵素活性がカットオフ値より下である場合、酵素またはサンプルは不活性であり、カットオフ値より上である場合、それは活性であると判断され得る請求項1記載の方法。
- 100%および0%切断シグナルを得るため、タンパク質分解酵素活性の完全切断および完全阻害に関して、接触、検出および確立工程を繰り返すことによって、0%および100%切断シグナルが得られる請求項2記載の方法。
- 正規化工程が、酵素活性切断値の曲線を参照することにより各酵素またはサンプル切断シグナルを正規化し、各その酵素またはサンプルにタンパク質分解酵素活性を付与することによって行われ、得られた酵素活性がカットオフ値より下である場合、酵素またはサンプルは不活性であり、カットオフ値より上である場合、それは活性であると判断され得る請求項2記載の方法。
- 第一のポリマーが、ユビキチン、SUMO、Nedd8、ISG15、Apg8、Apg12、FAT10、Urm1、Hub、UBi、Rub1、ISG15、またはC末端にαへリックス1およびβストランド3を連結するUBLループ内のアミノ酸を含む、それらの結合機能性C末端セグメントを含む請求項1記載の方法。
- 第二のポリマーが、レポータータンパク質、抗原、転写因子またはそれらの機能性フラグメントを含み;および/または
第一のポリマーが、UBL、またはC末端にαへリックス1およびβストランド3を連結するUBLループ内のアミノ酸を含む、その結合機能性C末端セグメントを含む
請求項1記載の方法。 - 1つ以上の第一および/または第二のポリマーが、タンパク質分解酵素切断により検出可能となる請求項1記載の方法。
- 1つ以上の第一および/または第二のポリマーが、それが伝達するシグナルの活性化により、および/または検出可能なシグナルに結合するかまたはそれを発生することにより検出可能になる請求項1記載の方法。
- 検出可能なシグナルが、放射活性、蛍光、リン光、色素原、超音波、化学発光シグナルを含む請求項1記載の方法。
- C末端にαへリックス1およびβストランド3を連結するUBLループ内のアミノ酸を含むUBLのN末端セグメント、または前記UBLのC末端セグメントとUBLを形成する残りのアミノ酸セグメントであって、第一および第二結合パートナーの一方に動作可能に連結されるセグメントを取得すること;および
第二結合パートナーを取得すること、
を含み、融合ポリマーが、第一および第二結合パートナーの結合によって切断される請求項6記載の方法。 - 結合パートナーが、受容体および受容体結合剤を含む請求項10記載の方法。
- 受容体結合剤が、薬剤、ホルモン、抗原、リガンドまたはその受容体結合機能性フラグメントを含み、受容体が、薬剤受容体、ホルモン受容体、抗体、リガンド結合受容体またはそれらの結合機能性フラグメントを含む請求項11記載の方法。
- UBLのN−およびC−末端の結合が、UBLの立体構造の認識、およびタンパク質分解酵素によるC末端でのポリマー切断を可能にする請求項10記載の方法。
- 第一および第二のポリマーが、互いに共有結合で連結されている請求項1記載の方法。
- 第一および第二のポリマーが、リンカーを介して動作可能に連結されている請求項1記載の方法。
- リンカーが、少なくとも1つのアミノ酸を含む請求項15記載の方法。
- 融合ポリマーが、融合タンパク質を含む請求項1記載の方法。
- タンパク質分解酵素が、イソペプチダーゼまたはその機能性フラグメントを含む請求項1記載の方法。
- タンパク質分解酵素が、ユビキチンC末端加水分解酵素、ユビキチン特異的プロテアーゼまたはその機能性フラグメントを含む請求項1記載の方法。
- タンパク質分解酵素が、ULP1、ULP2、SENP1、SENP2、酵母YUH1、哺乳類UCHL1、UCH−L3、UCH37、Bap1、USP−M、DUB−1、DUB−2、USP7、UNP、CYLD、CYLD1、KIAA0849、USP9X、DFFRX、USP9、FAFX、USP9Y、DFFRY、USP10、FAFY、OTUB1、OTB1、OTU1、HSPC263、OTUB2、C14orf137、OTB2、OTU2、USP10、KIAA0190、USP11、UHX1、USP12、UBH1m、USP12L1、USP13、ISOT3、USP14、TGT、USP15、KIAA0529、USP16、UBPM、USP18、UBP43、USP19、KIAA0891、ZMYND9、USP20、KIAA1003、LSFR3A、USP21、USP23、NEDD8特異的プロテアーゼ、USP22、KIAA1063、USP24、KIAA1057、USP25、USP26、USP28、USP29、USP30、USP32、USP33、KIAA1097、VDU1、USP35、KIAA1372、USP34、USP36、KIAA1453、USP37、KIAA1594、USP38、KIAA1891、USP40、USP42、USP44、USP46、USP49、USP51、UBP1、USP1、UBP2、USP2、UBP41、UBP3、USP3、UBP4、USP4、UNP、UNPH、UBP5、USP5、ISOT、UBP6、USP6、TRE2、UBP7、USP7、HAUSP、UBP8、USP8、KIAA0055、UBPY、VCIP、VCIP135、KIAA1850、セザンヌ1、セザンヌ2、A20、UCH−L1、パーク5、UCH−L3、UCH−L5、UCH−37、ATXN3、ATX3、MJD、MJD1、SCA3、POH1、PSMD14、CSN5、COPS5、JAB1、SENP1、SENP2、SENP3、SSP3、SUSP3、SENP5、FKSG45、SENP6、FKSG6、KIAA0797、SSP1、SUSP1、SENP7、KIAA1707、SSP2、SUSP2、SENP8、VCIP、VCIP135、KIAA1850、A20、UCH−L1、パーク5、UCH−L3、UCH−L5、UCH−37、ATXN3、ATX3、MJD、MJD1、SCA3、POH1、PSMD14、CSN5、COPS5、JAB1、SENP1、SENP2、SENP3、SSP3、SUSP3、SENP5、FKSG45、SENP6、FKSG6、KIAA0797、SSP1、SUSP1、SENP7、KIAA1707、SSP2、SUSP2、SENP8、FKSG8、PRSC2、DUB1、DUB2、DUB3、DUB4、またはそれらの機能性フラグメントを含む請求項1記載の方法。
- 第二のポリマーが、セリンプロテアーゼ、プロホルモン前駆体、サブチリシン/ケクシン様プロホルモン変換酵素、カルボキシペプチダーゼ、トロンボスポンジンI型モチーフを有するジスインテグリン様およびメタロプロテアーゼドメイン(レプロリシン型)(ADAMTS)、ジスインテグリンおよびメタロプロテアーゼドメイン(ADAM)、システインアスパラターゼ、アスパラギン酸プロテイナーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)、RNA依存性RNAポリメラーゼ、N末端求核原子(Ntn)加水分解酵素、4−オキサロクロトン酸互変異性化酵素、コリスミン酸シンターゼ、β−ラクタムアシラーゼ、逆転写酵素、ホスホリパーゼ、転写因子、またはそれらの機能性フラグメントを含む請求項1記載の方法。
- 第二のポリマーが、ウイルス性逆転写酵素、シグマ転写因子、グルタミンホスホリボシルピロリン酸(PRPP)アミドトランスフェラーゼ(GPATase)、凝固因子Xa、3DpolRNA依存性RNAポリメラーゼ、グルタミン5−ホスホリボシル−1−ピロリン酸アミドトランスフェラーゼ、ペニシリンアシラーゼ、逆転写酵素、コリスミン酸シンターゼ、トリプターゼ、キマーゼ、エンテロキナーゼ、転写因子σK、トロンビン、ジペプチジルペプチダーゼ、HtrA2、ニューロフィシン、バソプレシン、フリン、カルボキシペプチダーゼB、カルボキシペプチダーゼY、vWF−切断プロテアーゼ/ADAMTS13、ADAM1、ADAM2、カスパーゼ、ペプシン、レニン、カテプシンD、マソン−ファイザー・サルウイルスプロテイナーゼ、MMP20、MMP26、グリコシルアスパラギナーゼ、20Sプロテアソームβサブユニット、グルタミンPRPPアミドトランスフェラーゼ、YdcE、YwhB、セファロスポリンアシラーゼ、CaMV逆転写酵素、ホスホリパーゼA2、またはそれらの機能性フラグメントを含む請求項1記載の方法。
- 融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現に有効な条件下で、該ポリヌクレオチドを発現することをさらに含む請求項1記載の方法。
- ポリヌクレオチドが、真核生物の細胞、またはその分画あるいは抽出物に発現される請求項23記載の方法。
- そのように得られた融合タンパク質を単離し、任意には、該融合タンパク質を精製することをさらに含む請求項23記載の方法。
- タンパク質分解酵素活性調節因子を含むことが推測されるサンプルの存在下で、接触、検出および確立工程を繰返すること;および
サンプルの非存在下で得られる対応の酵素活性シグナルをサンプルシグナルが参照することによりタンパク質分解酵素活性におけるサンプルの影響に関する値を決定することを含む請求項1記載の方法。 - サンプルが、生理学的流動体、組織サンプル、細胞または細胞分画を含む請求項25記載の方法。
- 1つ以上の工程が、インビトロ、インビボ、エキソビボ、細胞または組織培養物内、細胞または組織抽出物上で行われる請求項1記載の方法。
- 検出工程が、細胞増殖の、または色素原、放射性、蛍光、リン光もしくは化学発光シグナルの検出を含む請求項1記載の方法。
- 接触、検出、確立および決定工程が、タンパク質分解酵素活性調節因子を含むことが推測される複数のサンプルについて別個に行われ、タンパク質分解酵素活性に対するサンプルの影響に関する値を得る請求項26記載の方法。
- 自動化されている請求項30記載の方法。
- 各サンプルおよび対照について得られる情報を収集、処理および報告する請求項30記載の方法。
- ユビキチンもしくはユビキチン様タンパク質(UBL)またはそのC末端セグメントを含む第一のポリマー、および検出のための遊離Nアミノ酸末端を必要とするポリペプチドを含む第二のポリマーを含み、第一および第二のポリマーがユビキチンまたはUBLのC末端および第二のポリマーのN末端を介して互いに動作可能に連結される融合ポリマー;および
タンパク質分解酵素アッセイを行い、第一および/または第二のポリマーの量または活性に関連したシグナルを検出し、そして酵素のタンパク質分解活性に対する検出されるシグナルの相関関係を確立するための取扱説明書;および
任意には、UBLのC末端で切断するタンパク質分解酵素源
を含むタンパク質分解酵素活性を評価するためのキット。 - 1つ以上の
第一および第二の結合パートナーであり、第一のパートナーが、UBLのN末端セグメントに動作可能に連結され得、および第一および第二の結合パートナーが互いに結合し、UBLのC末端セグメントが、UBLの立体構造を可能にするUBLのN末端セグメントに結合するとき、タンパク質分解酵素が融合ポリマーを切断する、結合パートナー;
酵素切断工程を行うための試薬;
検出工程を行うための手段;および
検出可能なシグナルを、タンパク質分解酵素活性またはその変化と相互に関連させるための手段
をさらに含む請求項33記載のキット。 - 融合ポリマーが融合タンパク質を含み;
キットがさらに、
該融合ポリマーに代わる該融合タンパク質をコードする融合ポリヌクレオチド;および
任意には、1つ以上の
ポリヌクレオチドを発現するための試薬;および/または
融合タンパク質の代わりに使用される場合、ポリヌクレオチドを発現するための細胞またはその分画もしくは抽出物
を含む請求項33記載のキット。 - 複数のサンプルを別個に含有するための手段;および
アッセイを自動的に行うための取扱説明書
をさらに含む請求項33記載のキット。 - 各サンプルについてのデータを自動的に処理するための手段;および
その使用に関する取扱説明書
をさらに含む請求項33記載のキット。 - ユビキチンもしくはユビキチン様タンパク質(UBL)またはそれらの結合機能性C末端セグメントを含む第一のポリマー、および遊離N末端アミノ酸を含む第二のポリマーを含み、第一および第二のポリマーがN−、C−末端を介して互いに動作可能に連結される融合ポリマーを取得すること;
切断が起こるのに有効な条件下で、融合ポリマーを、UBLのC末端切断タンパク質分解酵素と接触させること;
100%切断シグナルを得るために、切断の量に関連するシグナルを検出すること;
0%切断シグナルを得るためにタンパク質分解酵素活性の完全阻害因子の存在下で、接触および検出工程を繰り返すこと;
1組の化合物を取得すること;
切断シグナルを得るために各化合物の存在下で、融合ポリマーの取得、接触および検出工程を個別に繰り返すこと;
0%および100%切断シグナルを参照することにより、各化合物切断シグナルを正規化すること、および各化合物にタンパク質分解酵素活性値を付与すること
を含む、タンパク質分解活性におけるそれらの効果について化合物をスクリーニングする方法。 - 0%および100%切断シグナルの代わりに、1点切断対照シグナルを得るため、既知タンパク質分解酵素活性調節因子を用いて接触および検出工程を行うこと;
該調節因子の非存在下で得られる対応する酵素活性値を参照することにより、タンパク質分解酵素活性値を決定すること;および
対照切断シグナルを参照することにより、各化合物の切断シグナルを正規化し、各化合物にタンパク質分解酵素活性値を付与すること
を含む請求項38記載の方法。 - 正規化工程が、酵素活性切断値の曲線を参照することにより、各化合物の切断シグナルを正規化し、そして各化合物にタンパク質分解酵素活性を付与することにより行われ、得られた酵素活性が、カットオフ値より下である場合、化合物は不活性であり、カットオフ値より上である場合、それは活性であると判断されうる請求項38記載の方法。
- カットオフ値が、50%タンパク質分解酵素活性であり、化合物の存在下での酵素活性が少なくとも50%まで減少する場合、前記化合物は阻害因子であり、そして酵素活性が少なくとも50%まで増強される場合、前記化合物はエンハンサーであると判断されうる請求項37記載の方法。
- 酵素活性を50%まで阻害する化合物濃度(IC50)および/または増強する化合物濃度(EC50)を決定すること;および
該化合物のIC50および/またはEC50を比較して、阻害因子および/またはエンハンサーとしてのその酵素活性強度を評価することをさらに含む請求項38記載の方法。 - 調節因子が、タンパク質分解酵素活性アクチベーターを含む請求項38記載の方法。
- 調節因子が、タンパク質分解酵素活性阻害因子を含む請求項38記載の方法。
- 1つ以上の工程が、インビトロ、インビボ、エキソビボ、細胞または組織培養物中で、細胞分画または組織抽出物上で行われる請求項38記載の方法。
- 検出工程が、細胞増殖、色素原、放射性、蛍光、リン光、超音波、化学発光検出を含む請求項38記載の方法。
- 第一のポリマーが、ユビキチン、SUMO、Nedd8、ISG15、Apg8、Apg12、FAT10、Urm1、Hub、UBi、Rub1、ISG15、またはC末端にαへリックス1およびβストランド3を連結するUBLループ内のアミノ酸を含む、結合機能性C末端セグメントを含む請求項38記載の方法。
- 第二のポリマーが、レポータータンパク質、またはその結合機能性フラグメントを含み;および/または
第一のポリマーが、C末端にαへリックス1およびβストランド3を連結するUBLループ内のアミノ酸を含む、結合機能性C末端セグメントを含む請求項38記載の方法。 - 1つ以上の第一および/または第二のポリマーが、タンパク質分解酵素切断により検出可能になる請求項38記載の方法。
- 1つ以上の第一および/または第二のポリマーが、それが伝達するシグナルの活性化により、および/または検出可能なシグナルに結合するか、またはそれを発生することにより検出可能になる請求項38記載の方法。
- 検出可能なシグナルが、放射活性、蛍光、リン光、色素原、超音波シグナルを含む請求項38記載の方法。
- N末端にαへリックス1およびβストランド3を連結するUBLループ内のアミノ酸を含む、結合機能性N末端UBLセグメントであって、N末端セグメントおよびC末端セグメントが互いに結合する場合、完全なUBLを形成し、第一および第二結合パートナーの一方に動作可能に連結されるN末端UBLセグメントを取得し;および
第二結合パートナーを取得すること
をさらに含み、融合ポリマーが、第一および第二結合パートナーの結合によって切断される請求項45記載の方法。 - 結合パートナーが、受容体および受容体結合剤を含む請求項52記載の方法。
- 受容体結合剤が、薬剤、ホルモン、抗原、リガンド、またはその受容体結合機能性フラグメントを含み;および受容体が、薬剤受容体、ホルモン受容体、抗体、リガンド結合受容体、またはその結合機能性フラグメントを含む請求項52記載の方法。
- UBLのN−およびC−末端の結合が、UBLの立体構造の認識、およびタンパク質分解酵素によるポリマー切断を可能にする請求項52記載の方法。
- 第一および第二のポリマーが、互いに共有結合で連結されている請求項38記載の方法。
- 第一および第二のポリマーが、リンカーを介して動作可能に連結されている請求項38記載の方法。
- リンカーが、少なくとも1つのアミノ酸を含む請求項57記載の方法。
- 融合ポリマーが、融合タンパク質を含む請求項38記載の方法。
- タンパク質分解酵素が、イソペプチダーゼまたはその機能性フラグメントを含む請求項38記載の方法。
- タンパク質分解酵素が、ユビキチンC末端加水分解酵素、ユビキチン特異的プロテアーゼまたはそれらの機能性フラグメントを含む請求項38記載の方法。
- タンパク質分解酵素が、ULP1、ULP2、SENP1、SENP2、酵母YUH1、哺乳類UCHL1、UCH−L3、UCH37、Bap1、USP−M、DUB−1、DUB−2、USP7、UNP、CYLD、CYLD1、KIAA0849、USP9X、DFFRX、USP9、FAFX、USP9Y、DFFRY、USP10、FAFY、OTUB1、OTB1、OTU1、HSPC263、OTUB2、C14orf137、OTB2、OTU2、USP10、KIAA0190、USP11、UHX1、USP12、UBH1m、USP12L1、USP13、ISOT3、USP14、TGT、USP15、KIAA0529、USP16、UBPM、USP18、UBP43、USP19、KIAA0891、ZMYND9、USP20、KIAA1003、LSFR3A、USP21、USP23、NEDD8特異的プロテアーゼ、USP22、KIAA1063、USP24、KIAA1057、USP25、USP26、USP28、USP29、USP30、USP32、USP33、KIAA1097、VDU1、USP35、KIAA1372、USP34、USP36、KIAA1453、USP37、KIAA1594、USP38、KIAA1891、USP40、USP42、USP44、USP46、USP49、USP51、UBP1、USP1、UBP2、USP2、UBP41、UBP3、USP3、UBP4、USP4、UNP、UNPH、UBP5、USP5、ISOT、UBP6、USP6、TRE2、UBP7、USP7、HAUSP、UBP8、USP8、KIAA0055、UBPY、VCIP、VCIP135、KIAA1850、セザンヌ1、セザンヌ2、A20、UCH−L1、パーク5、UCH−L3、UCH−L5、UCH−37、ATXN3、ATX3、MJD、MJD1、SCA3、POH1、PSMD14、CSN5、COPS5、JAB1、SENP1、SENP2、SENP3、SSP3、SUSP3、SENP5、FKSG45、SENP6、FKSG6、KIAA0797、SSP1、SUSP1、SENP7、KIAA1707、SSP2、SUSP2、SENP8、VCIP、VCIP135、KIAA1850、A20、UCH−L1、パーク5、UCH−L3、UCH−L5、UCH−37、ATXN3、ATX3、MJD、MJD1、SCA3、POH1、PSMD14、CSN5、COPS5、JAB1、SENP1、SENP2、SENP3、SSP3、SUSP3、SENP5、FKSG45、SENP6、FKSG6、KIAA0797、SSP1、SUSP1、SENP7、KIAA1707、SSP2、SUSP2、SENP8、FKSG8、PRSC2、DUB1、DUB2、DUB3、DUB4、またはそれらの機能性フラグメントを含む請求項38記載の方法。
- 第二のポリマーが、セリンプロテアーゼ、プロホルモン前駆体、サブチリシン/ケクシン様プロホルモン変換酵素、カルボキシペプチダーゼ、トロンボスポンジンI型モチーフを有するジスインテグリン様およびメタロプロテアーゼドメイン(レプロリシン型)(ADAMTS)、ジスインテグリンおよびメタロプロテアーゼドメイン(ADAM)、システインアスパラターゼ、アスパラギン酸プロテイナーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)、RNA依存性RNAポリメラーゼ、N末端求核基(Ntn)加水分解酵素、4−オキサロクロトン酸互変異性化酵素、コリスミン酸シンターゼ、β−ラクタムアシラーゼ、逆転写酵素、ホスホリパーゼ、転写因子、またはそれらの機能性フラグメントを含む請求項38記載の方法。
- 第二のポリマーは、ウイルス性逆転写酵素、シグマ転写因子、グルタミンホスホリボシルピロリン酸(PRPP)アミドトランスフェラーゼ(GPATase)、凝固因子Xa、3DpolRNA依存性RNAポリメラーゼ、グルタミン5−ホスホリボシル−1−ピロリン酸アミドトランスフェラーゼ、ペニシリンアシラーゼ、逆転写酵素、コリスミン酸シンターゼ、トリプターゼ、キマーゼ、エンテロキナーゼ、転写因子σK、トロンビン、ジペプチジルペプチダーゼ、HtrA2、ニューロフィシン、バソプレシン、フリン、カルボキシペプチダーゼB、カルボキシペプチダーゼY、vWF−切断プロテアーゼ/ADAMTS13、ADAM1、ADAM2、カスパーゼ、ペプシン、レニン、カテプシンD、マソン−ファイザー・サルウイルスプロテイナーゼ、MMP20、MMP26、グリコシルアスパラギナーゼ、20Sプロテアソームβサブユニット、グルタミンPRPPアミドトランスフェラーゼ、YdcE、YwhB、セファロスポリンアシラーゼ、CaMV逆転写酵素、ホスホリパーゼA2、またはそれらの機能性フラグメントを含む請求項38記載の方法。
- 融合タンパク質が、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現することによって取得される請求項59記載の方法。
- ポリヌクレオチドが、真核生物の細胞、またはその分画あるいは抽出物で発現される請求項65記載の方法。
- そのように得られた融合タンパク質を単離すること、および任意にその融合タンパク質を精製することをさらに含む請求項65記載の方法。
- 自動化されている請求項38記載の方法。
- 各サンプルおよび対照について得られる情報を収集、処理および報告する請求項68記載の方法。
- ユビキチンもしくはユビキチン様タンパク質(UBL)またはそのC末端セグメントを含む第一のポリマー、および検出のための遊離Nアミノ酸末端を必要とするポリペプチドを含む第二のポリマーを含み、第一および第二のポリマーは、ユビキチンまたはUBLのC末端および第二のポリマーのN末端を介して互いに動作可能に連結される融合ポリマー;および
タンパク質分解酵素アッセイを行い、第一および/または第二のポリマーの量または活性に関連したシグナルを検出し、そして酵素のタンパク質分解活性に対する検出されたシグナルの相関関係を確立するための取扱説明書;および
任意には、UBLのC末端で切断するタンパク質分解酵素源
を含むタンパク質分解酵素活性調節因子スクリーニングキット。 - 1つ以上の、
第一および第二の結合パートナーであり、第一のパートナーが、UBLのN末端セグメントに動作可能に連結され得、および第一および第二の結合パートナーが互いに結合し、UBLのC末端セグメントが、UBLの立体構造を可能にするUBLのN末端セグメントに結合するとき、タンパク質分解酵素が融合ポリマーを切断する、結合パートナー;
融合ポリマーのUBLのC末端酵素切断を行うための試薬;
第一および/または第二の切断ポリマーにより発生されるシグナルを検出ための手段;および
対照を参照することにより、1つ以上の検出可能なシグナルを、タンパク質分解酵素活性またはその変化と相互に関連させるための手段
をさらに含む請求項70記載のキット。 - 融合ポリマーが融合タンパク質を含み;
キットがさらに、
該融合ポリマーに代わる該融合タンパク質をコードする融合ポリヌクレオチド;および、
任意には、1つ以上の、
ポリヌクレオチド発現のための試薬;および/または
融合タンパク質の代わりに使用される場合に、ポリヌクレオチドを発現するための細胞またはその分画もしくは抽出物
を含む請求項70記載のキット。 - 複数のサンプルを別個に含有するための手段;および
アッセイを自動的に行うための取扱説明書
を含む請求項70記載のキット。 - 各サンプルについてのデータを自動的に処理するための手段;および
その使用法に関する取扱説明書
をさらに含む請求項70記載のキット。 - 任意には、細胞、植物または動物の染色体に統合されるユビキチン−またはUBL−レポーター融合ポリヌクレオチドを含むトランスジェニック細胞、植物または動物であって、レポーターが、特定の疾患または症状もしくはそれらのファミリーと関連しているトランスジェニック細胞、植物または動物。
- ユビキチンまたはUBL−レポーター融合タンパク質を発現することができる請求項75記載のトランスジェニック細胞、植物または動物。
- 融合ポリヌクレオチドをベクターにクローニングすることによりハイブリッドベクターを形成し、細胞、植物または動物をハイブリッドベクターでトランスフェクトすることによって得られる請求項76記載のトランスジェニック細胞、植物または動物。
- ベクターがプラスミドを含み、細胞が真核生物の細胞を含む請求項77記載のトランスジェニック細胞、植物または動物。
- 疾患または症状のための細胞、植物または動物モデルとしての役割を果たすようにさらに修飾されている請求項70記載のトランスジェニック細胞、植物または動物。
- イソペプチダーゼが、自己免疫、新生物、遺伝子突然変異、代謝、心臓血管または神経変性疾患または症状に関連している請求項79記載のトランスジェニック細胞、植物または動物。
- 疾患または症状が、癌、狼瘡、糖尿病、IBD、心臓血管疾患、神経変性、または炎症性疾患を含む請求項80記載のトランスジェニック細胞、植物または動物。
- 細胞、植物または動物を取得すること;
ユビキチン−、UBL−またはそれらのC末端結合機能性フラグメント−レポーター融合ポリヌクレオチドを取得すること;
ベクターに動作可能に連結したハイブリットポリヌクレオチドを担持するハイブリットベクターを取得すること;および
該ハイブリットベクターを、細胞、植物または動物に安定にトランスフェクトすること
を含む請求項75記載のトランスジェニック細胞、植物または動物の製造方法。 - 融合ポリヌクレオチドが、細胞、植物または動物の染色体に統合されるようになる請求項82記載の方法。
- 融合ポリヌクレオチドが、融合デオキシリボヌクレオチドを含む請求項82記載の方法。
- 疾患または症状の診断方法であって、
レポーターが疾患または症状に関連しているものである請求項75の細胞、植物もしくは動物、またはそれらの分画もしくは組織を取得すること;
該疾患および症状に罹っていることが推測される対象から得られたサンプルを、該細胞、植物または動物と接触させるか、または投与すること;
該サンプルの存在下でレポーターにより発生される任意のシグナルを検出すること;および
0%と100%シグナルの対照と前記シグナルを比較すること
を含む方法。
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