KR20070051257A

KR20070051257A - 단백질 가수분해 활성과 관련된 진단과 스크리닝 방법 및키트

Info

Publication number: KR20070051257A
Application number: KR1020077001581A
Authority: KR
Inventors: 타우시프 알. 버트; 알레한드로 베르날
Original assignee: 프로겐라 인코포레이티드
Priority date: 2004-06-21
Filing date: 2005-06-21
Publication date: 2007-05-17
Also published as: IL180201A0; AU2005258000A1; ATE488766T1; JP2008503219A; WO2006002100A3; US7842460B2; EP1792181B1; JP5031560B2; EP1792181A4; EP1792181A2; WO2006002100A2; AU2005258000B2; CA2570959C; IL180201A; CN1989411B; US20060040335A1; DE602005024833D1; CN1989411A; CA2570959A1

Abstract

단백질 분해효소 활성 및 그것의 모듈레이터의 효과를 평가하는 방법 및 키트는 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-같은 단백질과 신호생성 구조물을 사용한다. 상응하는 융합 폴리뉴클레오티드는 임의로 세포, 식물 또는 동물을 기능적 단편-수용체 융합 폴리뉴클레오티드에 결합된 유비퀴틴, UBL- 또는 그들의 C -말단으로 형질변환하는, 안정한 트란스펙션에 의해 생산될 수 있는 유전자전환 세포, 식물 및 동물의 생산을 위해 사용된다. 질병 또는 질환을 진단하는 방법은 질병 또는 병태로 감염되었다고 예상되는 개체로부터 얻은 샘플을 세포, 식물 또는 동물에 접촉 또는 트여하고, 샘플의 존재하에 리포터에 의해 생성된 어느 신호를 검출하고, 그리고 신호를 0% 및 100% 신호와 비교하는 것을 포함한다.

유비퀴틴, 단백질 분해효소, 진단방법

Description

단백질 가수분해 활성과 관련된 진단과 스크리닝 방법 및 키트{DIAGNOSTIC AND SCREENING METHODS AND KITS ASSOCIATED WITH PROTEOLYTIC ACTIVITY}

본 발명은 출원일 2004년 6월 21일, 발명의 명칭 "이소펩티다제 활성을 위한 방법"의 미국 가출원 60/580,900의 우선권을 주장한다.

발명의 분야

본 발명은 신규한 효소의 발견 뿐만 아니라 유비퀴틴(ubiquitin) 및 유비퀴틴-같은 단백질 가수분해 효소 활성의 정성적 및 정량적 평가를 위한, 단백질 가수분해 효소 활성에 대한 그것들의 효과를 위해 화합물을 평가하고 그리고/또는 스크리닝하기 위한, 그리고 생물학적 샘플에서 활성을 검출하기 위한 물질 및 방법을 제공하고, 이것은 변경된 효소 수준, 양, 서열 및/또는 활성과 관련된 병(conditions) 및 질병의 진단에 유용하다. 이 기술은 또한 트랜스제닉 세포, 식물 및 동물의 형태로 질병 모델에 병합된다.

발명의 배경

유비퀴틴(Ub) 이소펩티다제는 10년 이상 전에 처음으로 클로닝되었다. 하지만, 이 순간까지, Ub 또는 유비퀴틴-같은 단백질(UBL)에 대해 특이적인 단백질 가수분해 효소를 위한 또는 효소의 조정자 또는 억제자의 신속한 스크리닝을 위한 적 절한 분석이 존재하지 않았다. 현재 사용 중인 대부분의 분석은 E.coli, 예를 들면, 테트라-Ub, Ub-CEP52, Ub-GSTP1, Ub-DHFR, Ub-PESTc, 등에서 또한 생성되는, 선형 Ub-융합의 분할에 의존하거나, 화학적으로 합성된다. 이 분석에서 반응 생성물은 겔 전기영동에 의해 또한 분석되거나, 선택적으로 침전된 후 액체 섬광 분광계에 의해 분석된다.

이 분석은, 예를 들면 겔-기초 접근은 노동집약적이고 값비싸다는 것과 같은, 중대한 결점을 가지고 있다. 선택적 침전/섬광 계수는 정량적 결과를 제공하고 겔-기초 분석보다는 더 많은 샘플의 처리를 허용하지만, 그것은 원심분리, 및 상청 분리를 필요로 한다. 유비퀴틴-7-아미도-4-메틸코우마린 (Ub-AMC)는 상업적으로 이용가능하고 사용하기 용이한 High Throughput Screening (HTS)을 위한 플루오로제닉(fluorogenic) 기질이다. 하지만, 유비퀴틴 C-터미널 가수분해효소UCHs)와는 달리, 대부분의 유비퀴틴 특이 프로테아제(USPs)는 유비퀴틴(Ub) 분자로부터 작은 군들을 분할하지 않는다. 게다가, AMC는 꽤 소수성이고, 실험 화합물과의 그 자신의 상호작용에 기초가 두어지고, 스크리닝에서 가짜 현실(false positives)를 일으킬 수 있다. 예를 들면, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 질량측정법과 같은, 분할을 검출하는 다른 방법들은 또한 그것들은 그 자신의 결점을 가지지만 사용되어왔다. 더욱이, 당업의 이전의 방법들 중 어느 것도 high throughput 스크리닝에 적절하거나 적합할 수 없었고, 이것은 멀티-웰 플레이트를 사용하여 행해질 수 있는 단순한(최소한의 단계) 분석들을 필요로 하고, 그것의 종말점은 플레이트로부터 직접 읽힌다.

그러므로, 동시에 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-같은 단백질(UBL) 단백질 가수분해 효소의 조정자를 위한 high throughput 스크리닝을 수행하는데 적절하면서 간단하고 비교적 저렴한 분석 및 키트에 대한 필요가 있다.

발명의 요약

본 발명의 하나의 양상은 단백질 가수분해 효소 활성을 평가하기 위한 방법에 관한 것이고, 본 방법은 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-같은 단백질(UBL) 또는 그것의 기능적 C-터미널 분절을 포함하는 첫번째 폴리머 및 검출을 위해 요구되는 자유(free) N-터미털 아미노산을 포함하는 두번째 폴리머를 포함하는 융합 폴리머를 제공하는 단계; (여기서 첫번째 및 두번째 폴리머는 UBL, C-말단 및 두번째 폴리머 N-말단(terminus)을 통해 실효적으로(operatively) 서로 연결된다);

UBL C-말단을 분할하는 단백질 가수분해 효소와 융합 폴리머를 접촉시키는 단계;

분할된 폴리머의 양 또는 활성과 관련된 신호를 검출하는 단계; 그리고

단백질 가수분해 효소의 활성에 대한 분할된 폴리머의 신호 사이의 상호관계를 수립하는 단계를 포함한다.

상기 방법의 실행을 위해 본 특허는 단백질 가수분해 효소 활성을 평가하는 키트를 제공하고, 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-같은 단백질 (UBL) 또는 그것의 C-터미널 분절을 포함하는 첫번째 폴리머 및 검출을 위한 자유 N-아미노산 말단을 필요로 하는 폴리펩티드를 포함하는 두번째 폴리머를 포함하는 융합 폴리머; (여기서 첫번째 및 두번째 폴리머는 UBL C-말단 및 두번째 폴리머 N-말단을 통해 실효적으로(operatively) 서로 연결된다); 및

단백질 가수분해 효소 분석을 수행하는 단계, 첫번째 및/또는 두번째 폴리머의 양 또는 활성과 관련된 신호를 검출하고, 효소의 단백질 가수분해 활성에 대한 검출된 신호의 상호관계를 수립하기 위한 지침; 및

임의로 UBL C-말단 및 여러 다른 성분에서 분할하는 단백질 가수분해 효소의 출처(source)를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양상은 단백질 가수분해 활성에 대한 그것들의 효과에 대해 스크리닝하기 위한 방법에 관한 것이고, 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-같은 단백질 (UBL) 또는 그것의 결합 기능적 C-터미널 분절을 포함하는 첫번째 폴리머 및 자유 N-말단 아미노산을 포함하는 두번째 폴리머를 포함하는 융합 폴리머를 얻는 단계;( 여기서 첫번째 및 두번째 폴리머는 N-C-말단을 통해 실효적으로(operatively) 서로 연결된다);

분할이 일어나기 효과적인 조건 하에 UBL C-말단 분할 단백질 가수분해 효소와 융합 폴리머를 접촉시키는 단계;

100% 분할 신호를 얻도록 분할의 양과 관련된 신호를 검출하는 단계;

0% 분할 신호를 얻도록 단백질 가수분해 효소 활성의 완전한 억제자의 존재 하에 접촉 및 검출 단계를 반복하는 단계;

화합물의 세트를 얻는 단계;

분할 신호를 얻도록 각각의 화합물의 존재 하에 융합 폴리머를 얻는, 접촉하는 및 검출하는 단계를 개별적으로 반복하는 단계;

0% 및 100% 분할 신호와 관련하여 각 화합물 분할 신호를 표준화하는 단계를 포함한다.

이 두번째 방법의 실행을 위해 본 발명은 단백질 가수분해 효소 활성 조정자 스크리닝 키트를 제공하고,

유비퀴틴 또는 유비퀴틴-같은 단백질 (UBL) 또는 그것의 C-터미널 분절을 포함하는 첫번째 폴리머 및 검출을 위한 자유 N-아미노산 말단을 포함하는 두번째 폴리머를 포함하는 융합 폴리머; (여기서 첫번째 및 두번째 폴리머는 유비퀴틴 또는 UBL C-말단 및 두번째 폴리머 N-말단을 통해 실효적으로(operatively) 서로 연결된다); 및

단백질 가수분해 효소 분석을 수행하기 위한, 첫번째 및/또는 두번째 폴리머의 양 또는 활성과 관련된 신호를 검출하기 위한, 및 복수의 조정자 및 조절을 위한 효소의 단백질 가수분해 활성에 대해 검출된 신호의 상호관계를 수립하기 위한 지침; 및

임의로 유비퀴틴 또는 UBL C-말단, 및 다른 구현예에 적절한 다른 성분에서 분할하는 단백질 가수분해 효소의 출처를 포함한다.

본 발명은 트랜스제닉 세포, 식물 또는 동물에 관한 것이고, 세포, 식물 또는 동물의 염색체에 임의로 통합된 유비퀴틴- 또는 UBL-리포터 융합 폴리뉴클레오티드를 포함하는데; 여기서 유비퀴틴 또는 UBL-특이 이소펩티다제는 특이 질병 또는 병 또는 그것의 일족과 연관된다.

트랜스제닉 세포, 식물 또는 동물은 세포, 식물 또는 동물을 얻는 단계;

유비퀴틴-, UBL- 또는 C-터미널 결합 기능적 단편-리포터 융합 폴리뉴클레오티드를 얻는 단계;

벡터에 실효적으로 연결된 하이브리드 폴리뉴클레오티드를 지닌 하이브리드 벡터를 얻는 단계; 및

하이브리드 벡터를 세포, 식물 또는 동물 내로 안정하게 트랜스팩션하는 단계에 의해 생성될 수 있다.

질병 및 병을 진단하는 방법이 또한 본 발명에 기술되어 있고, 본 발명의 세포, 식물 또는 동물, 또는 그것의 단편 또는 조직을 얻는 단계, (여기서 유비퀴틴 또는 UBL-특이 이소펩티다제는 질병 또는 병과 관련된다);

세포, 식물 또는 동물이 갖는 질병 또는 병으로 시달린다고 의심되는 대상으로부터 얻어진 샘플을 접촉시키거나 투여하는 단계;

샘플의 존재 하에 리포터에 의해 생성된 어떤 신호를 검출하는 단계; 및

그 신호를 0% 및 100% 신호를 위한 신호와 비교하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 목적, 장점 및 특징은 하기 논의로부터 당업자에게 분명해질 것이다.

발명의 바람직한 구현예의 상세한 설명

본 발명은 유비퀴틴 및 유비퀴틴-같은 단백질 (UBL)과 관련된 단백질 가수분해 효소 활성을 분석하기 위한, 종래의 당업계의 방법을 개선시키고자 하는 발명자의 욕구에 의해 비롯되었다. 존재하는 방법에 내재된 결점의 관찰 시, 발명자들은 쉽게 측정가능한 종말점을 갖는, high through 스크리닝, 자동화 및 데이터 수집의 컴퓨터화에 적절하거나 적합할 수 있는 간단한 방법을 제공할 기회를 위한 분야를 연구했다. 본 효소 활성 분석 및 키트는 상대적으로 저렴한 요소를 사용하고, 소수의 작동을 필요로 하며, 멀티-웰 플레이트를 사용하여 행할 수 있어서 자동화될 수 있고, 그것들의 종말점은 그로부터 직접 읽힐 수 있고 데이터 수집 및 분석이 컴퓨터화될 수 있다. 이들은 또한 본 발명의 특징이고 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-같은 단백질(집합적으로 UBL) 단백질 가수분해 효소의 조정자의 high throughput 스크리닝을 위한 키트이다. 본 기술은 UBL 효소의 활성을 분석하기 위한 신속하고, 저렴하고, 선택적이고 간단한 방법을 제공함으로서 조사 및 건강 관리 산업에 대답하고, 이것은 UBL 단백질 가수분해 효소 조정자를 위한 high-throughput 스크리닝에 적응가능하고, 이소펩티다제 등과 같은, UBLs 단백질 가수분해 효소와 관련된 질병 및 병을 진단하는데, 그리고 새로운 효소 및 UBL 효소 조정자를 위한 스크리닝에 유용하다.

본 발명은 효소 활성, 그것의 조정 및 검출 분야에, 그리고 더 구체적으로는 유비퀴틴 및 유비퀴틴-같은 단백질 (UBL) 가수분해, 예를 들면 이소펩티다제/가수분해 효소/프로타제의 활성, 그것들의 조정 및 검출에 관한 것이다. 본 특허는 UBL 단백질 가수분해 효소 활성의 정성적 및/또는 정량적 평가를 위한 키트 및 방법, 효소 활성에 대한 그것들의 효과에 대한 화합물 및 제제들을 평가하거나 스크리닝하기 위한 방법, 및 생물학적 샘플에서의 활성을 검출하기 위한 방법을 제공한다. 유비퀴틴-프로테아소멀(proteasomal) 경로는 불응성 재발 다발 골수종(refractory relapsed multiple myeloma)의 치료에서 Velcade^®의 도입 및 임상적 성공에 의해 확인되었다. Adams (2002) 참조.

이 경로는 세포 내용물 및/또는 대부분의 단백질의 구획화(compartmentalization)를 조정하도록 의도되고, 약물 발견을 위해 하-사용된 아레나(under-exploited arena)를 통해, 약속한다. Ciechanover(2001); Ciechanover(2003) 참조. 어느 주어진 시간에 단백질의 세포 내용물은, 각 단백질이 적당한 세포 기능을 보장하도록 합성 및 분해(degradation)의 특징적 패턴을 가지면서, 그것의 합성 및 분해 비율의 조합에 의해 조정된다고 믿어진다. 분해는 다른 방법으로 일어난다고 믿어진다. 세포 외 또는 막-관련 단백질은 그것들이 골지-엔도소멀 아파라티(apparati)에 의해 지시되는, 용해소체에서 일반적으로 분해된다고 믿어진다. SoUBLe, 세포질 단백질은 유비퀴틴-프로테아소멀 경로를 통해 조정된 방식으로 분해된다고 믿어진다. 후자의 경로는 모든 비정상적, 잘못 접혀진(misfolded) 단백질 및 세포 내에서 대부분의 짧게-생존된, 조정 단백질의 약 90%까지의 분해를 설명한다고 생각된다. 게다가, 프로테아솜은 또한 대부분의 더 길게-생존된 단백질의 붕괴(breakdown)에 관련된다고 믿어진다. 유비퀴틴-프로테아솜 경로는 세포 단백질 붕괴의 80~90%를 설명할 수 있다고 추정된다. Lee and Goldberg (1998) 참조. 유비퀴틴-프로테아솜 경로의 표적은 많은 다른 것들 중의, 세포 순환 및 분할 조정자, 이온 채널, 종양 억제자 및 전사 인자를 포함한다. Hershko and Ciechanover(1998); Vu and Sakamoto(2000); Conaway, et al. (2002) 참조. 이것은 기질들의 넓은 영역을 나타내기 때문에, 그것은 다른 기능들 중에서, 세포 순환 진행에서의 Ub-프로테아솜 경로, 세포자멸사, 면역 반응, 발달, 전사적 조정, 신호 전달, 및 수용체 다운(down)-조정의 연루의 함축으로서 취해진다. 경로는 세포 처리에서 그러한 중심적 역할을 점유하기 때문에, 다른 것들 중, 여러 질병, 예를 들면 파킨슨병, 자궁경부암, 및 본히펠린다우증후군과 관련된 발병기전은 이 경로의 변형(aberrations)에 연결되었다. 예를 들면, Kitada, et al. (1998); Leroy, et al. (1998); Kato (1999); Swinney (2001) 참조.

유비퀴틴은 가장 보존된 진핵 구조인 것 같은 76 아미노산 단백질이다. 그것은 모노머로서 코딩된다고 밝혀지지 않았지만, 오히려, C-터미널 연장 단백질로서 발현된다고 밝혀졌다. 예를 들면, 포유류 리보솜 단백질 중 둘이 유비퀴틴 융합 단백질로서 코딩된다. 모든 진핵 세포는 강력한 유비퀴틴 C-터미널 가수분해효소를 함유한다고 믿어지고, 그것의 모두는 유비퀴틴 카르복시 (C-) 말단에서 이들 융합 단백질을 분할한다. 게다가, 유비퀴틴 유전자 생성물의 인위적 융합은 진핵 세포에서 발현되고 분할될 수 있다는 것이 보여졌다. 원핵생물, 예를 들면, E. coli는 유비퀴틴이나 유비퀴틴 경로를 함유하지 않는다는 것이 보여졌다. 예를 들면, 다른 것들 중의, SUMO Nedd8, ISG15, Apg8, Apg12, FAT10, Urm1, Hub, GDX, HCG-1, BMSC-UBP, 및 UBi와 같은, 유비퀴틴에 대해 상동인 많은 단백질이 알려져 있다. 유비퀴틴에 대한 이들 유비퀴틴-같은 단백질 (UBL)의 상동은 일반적으로 그것들의 아미노산 서열의 약 15%~30%로 제한되고, 그들 중 많은 것이 전구체 단백질로서 코딩되고 그리고/또는 C-터미널 연장을 함유하도록 제한된다. 진핵 세포에 의해 생성된 이들 "융합"은 아주 특이적 가수분해효소에 의해 즉시 처리되고, UBL 가수분해효소(프로테아제)는 성숙 UBLs의 수준을 조절하는데 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 유비퀴틴의 C-터미널은 다양한 효소에 의해 표적 단백질의 N-아미노 기들에 공유적으로 컨쥬게이트된다. 그것의 표적 단백질로의 단일 분자의 결찰 후, 유비퀴틴 분자의 사슬이 발생될 수 있고 폴리-유비퀴틴 사슬을 형성하도록 그것의 6 라이신 N-아미노 기 중 하나로의 유비퀴틴의 C-말단의 공유 컨쥬게이션에 의해 연장될 수 있다. 폴리유비퀴틴화는 단백질분해에 대한 신호로서 작용한다고 믿어지고, 유비퀴틴화된 단백질은 프로테아솜에 의해 인식되고 분해되고, 유비퀴틴 분자는 재활용된다고 생각된다. 많은 UBLs이 유비퀴틴과 유사한 방식으로 이소펩티드 결합을 통해 표적 단백질로 공유적으로 컨쥬게이트된다. 그것들의 실제 기능이 완전히 이해되지는 않았지만, UBLs은 그것들의 표적 단백질에 컨쥬게이트되는 것 같고, 당업계에 알려진 정교한 경로를 포함하는 아주 조정된 방식으로, 그들로부터 탈-컨쥬게이트(de-conjugated)되는 것으로 보인다. 예를 들면, Glickman and Clechanover (2002) 참조.

65개를 초과하는 이소펩티다제 유전자가 인간 게놈에 존재한다고 추정된다. 이소펩티다제는 UBUBL-수정된 단백질의 운명을 조정하는데 있어서 중요한 역할을 한다고 믿어진다. 예를 들면, 유비퀴틴은 이소펩티다제에 의해 탈-컨쥬게이트될 수 있다. 이것이 일어나면, 표적 단백질은 더이상 채널링될(channeled) 수 없고 분해에 대해 프로테아솜에 의해 인식될 수 없고, 따라서, 세포에서 분해되지 않은 채 유지될 것이다. 따라서, 이소펩티다제는 유비퀴틴 기능을 편집하는데 있어서 그리고 그것의 결과로서 발전될 수 있는 세포 병리학에 있어서 중요한 역할을 한다고 생각된다. 단백질 분해를 위한 신호로서 작용하는 것 이외에, 단백질의 단일-유비퀴틴화는 다양한 세포 활성, 예를 들면, 세포내 이입, 염색질 리모델링, 신호 전달, 및 많은 다른 것들의 조절에 연관된다고 믿어진다. 많은 UBL 컨쥬게이션 및 탈-컨쥬게이션의 정확한 역할은 매핑되도록(mapped) 유지되지만, 개개 UBL 단백질 가수분해 효소, 예를 들면, 이소펩티다제 및 가수분해효소는 그 과정에 분명히 연관된다.

본 발명은 특이적 융합 폴리머, 예를 들면, 유비퀴틴, 유비퀴틴-같은 단백질 (UBLs)을 갖는 예에 의해 특이적으로 뿐만 아니라, 일반적으로 설명될 것이고, 둘 다는 집합적으로 UBLs로 일컬어지고, 융합 단백질에서 UBL C-말단을 인식하고 분할하는 계통발생을 따라 모든 단백질 분해 효소이다. 이들 UBL은 모든 리포터 단백질과 같은 리포터 또는 시그널링 분자, 모든 결합 쌍, 등에 묶일 수(bound) 있고, 불활성 융합 폴리머를 형성하는 예에 의해 하기에 설명된다. 본 특허는 이들 구성원들이 분자에 대해 할당되고 기술된 기능적 항목에 속하는 한, 융합 구성원 및 단백질 분해 효소의, 속의 모든 구성원, 종의 모든 구성원, 등을 넓게 포함한다. UBL, 예를 들면, Ran-gap 단백질에 대한 SUMO의 공유 컨쥬게이션은 예를 들면, 핵과 세포질액 간의 단백질의 전위(translocation)를 조절한다고 믿어진다. 이러한 유형의 메커니즘은 치료 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 잠복 세포질액 전사 인자의 SUMO화(SUMOylation)는 핵으로 활성 단백질을 전위시키고, 그 곳에서 그것은 종양 억제 유전자를 작동시키도록 작용할 수 있다. 외인성 제제, 예를 들면, 이 경우에, 작은 분자에 의한 SUMO 프로테아제의 억제는 SUMO 융합을 안정화시킬 수 있고, 따라서, 항-암 활성을 나타낸다. SUMO 프로테아제, 예를 들면, Ulp1의 조정, 작은 분자에 의한 작용은 치료적 항-암 혜택을 초래할 수 있다. 유사하게, 다른 UBLs, 예를 들면, ISG-15, Apg8, 또는 Nedd8의 컨쥬게이션 및 탈-컨쥬게이션은 그것들의 각각의 단백질 가수분해 효소, 예를 들면, 각각, UBP43/, Apg4, 및 NUB1-연결된 C 터미널 가수분해효소/NEDP1/UCH-L1/UCH-L3/COP9을 포함하는 가수분해효소(프로테아제)에 의해 조절될 수 있다. 이것은 그것들의 각각의 단백질 수식(modification) 경로의 기능들의 조정을 초래한다. ISG15는 신호 전달의 중요한 조정자에 컨쥬게이트된 바이러스 감염에 대한 염증 반응의 중요한 조정자이다. Malakov (2003) 참조. ISG15는 인터페론(IFN) 치료 후 가장 강하게 유도된 유전자 중 하나이고, 인플루엔자 B 바이러스, 리포폴리사카라이드(LPS), 및 제노톡식(genotoxic) 스트레스에 의해 두드러지게 유발된다. 그것은 17kDa 전구체로부터 처리되고, 보존된 유비퀴틴-컨쥬게이션 경로에서 특이적 단백질에 컨쥬게이트된다. ISG15-특이적 이소펩티다제, UBP43은 본 발명에 의한 사용에 또한 적절하다. Malakhov et al (2002); Malakhova et al (2002) 참조.

유비퀴틴은 유비퀴틴 이소펩티다제, 또는 유비퀴틴 가수분해 효소, 프로테아제, 또는 탈-유비퀴틴화(de-ubiquitinating) 효소 ("DUBs")라고 일반적으로 일컬어지는 단백질 가수분해 효소에 의해 기질로부터 분할된다. 이소펩티다제는 일반 구조 Ub-X의 유비퀴틴-유도된 기질을 특이적으로 분할하는 시스테인 가수분해효소(프로테아제)의 일족(family)이고, 여기서 X= 작은 티올 및 아민으로부터 Ub 및 다른 단백질에 이르는 이탈기의 수이다. 예를 들면, Dang, et al. (1998) 참조. 따라서, 이소펩티다제와 같은 단백질 가수분해 효소는 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-같은 단백질에 의한 단백질의 수식을 거스르도록 작용한다고 믿어진다. Wilkinson (2000) 참조. 단백질 가수분해 효소 일족들 중, 이소펩티다제의 두 주요한 일족이 있다: 유비퀴틴 C-터미널 가수분해 효소 (UCH) 및 유비퀴틴-특이 프로테아제 (USP), 그것 둘 다는 티올 활성 부위 프로테아제이다. 게다가, 독특한 JAMM (Jab1/MPN 도메인) 이소펩티다제 활성 부위를 함유한 메탈로프로테아제 이소펩티다제의 알려진 일족이 있다. Lundgren, et al. (2003); Hochstrasser (2002); Verma, et al. (2002); Yao and Cohen (2002) 참조. 게다가, 그것은, 일부가 알려진 유비퀴틴 이소펩티다제에 대한 서열 상동을 갖지 않는 것 같지만, 아주 특이적 유비퀴틴 이소펩티다제인 것 같은 오투바인(otubains)으로 일컬어지는 시스테인 프로테아제의 일족의 알려진 존재이다. Balakirev, et al. (2003) 참조. 유비퀴틴-같은 단백질 (UBLs)에 특이적인 프로테아제가 또한 알려져 있다.

UCH 효소 일족은 짧은 C-터미널 연장으로 존재할 때 Ub를 주로 분할한다고 믿어진다. 하지만, 이들 프로테아제는 작은 아민 및 티올을 갖는 Ub 전구체 및 Ub 부가물(adduct)을 포함하여, 더 큰 단백질 기질과 연관될 수 있고, 세포 시그널링 및 핵-세포질액 수송과 연관된다고 믿어진다. Layfield, et al. (1999) 참조. USP 효소 일족은 UCHs에 대해 상동을 나타내지 않고, 단백질 기질의 범위로부터 유비퀴틴을 분할할 수 있다. 예를 들면, Wilkinson (1997); D'Andrea and Pellman (1998); Wilkinson (1998); Chung and Baek (1999); Yan, et al. (2000) 참조. USPs가 크기 및 아미노산 서열에서 중대한 차이를 보여주는 동안, 그것들은 촉매 활성에 요구되는 잔류물 주위에 여러 아주 상동성의 패치를 분배한다. 인간 게놈의 서열분석은 53 USP 인코딩 유전자 및 4 UCH 유전자를 밝혀주었다. UCHs 및 USPs 둘다는 치료적 시술(intervention)을 위한 잠재적 표적이다. 모노- 및 폴리-유비퀴틴화의 처리과정은 매우 역동적이고, 단백질로부터 유비퀴틴의 급속한 첨가 및/또는 제거에 의해 특징지워진다. UCH 효소 일족은 일반적으로, 상대적으로 작은, 약 20-~30 kDa의, 얼마간의 예외를 갖는 단백질, 예를 들면 UCH37, 37 kDa 프로테아솜-결합된(bound) 효소, 및 BAP1, BRCA1에 결합된 81 kDa 단백질을 포함한다. Jensen, et al. (1998) 참조. 그것들의 주요한 기질들은 아민 및 티올 잔기를 함유하는 작은 분자를 갖는 Ub 전구체 및 Ub 부가물(adduct)이라고 믿어진다. Layfield, et al. (1999). 인간 UCHL1 및 UCHL3는 α-연결된 펩티드 결합뿐만 아니라 Ub C-말단에서 ε-연결된 아미드 결합을 가수분해할 수 있다. Johnston et al. (1997) 참조. UCH 일족은 효모 YUH1, 또한 PGP9.5로서 알려진 포유류 UCHL1, UCH-L3, UCH37, Bap1, 및 다른 종의 대응하는 효소 일족뿐만 아니라 많은 다른 것들을 포함한다. 예를 들면, Day, et al. (1990); Larsen, et al. (1996) 참조. USP 일족은 일반적으로 UCHs에 대해 거의 상동성을 거의 나타내지 않는, 더 큰, 41 kDa 이상의 단백질을 포함하고, 단백질 기질의 범위로부터 유비퀴틴을 분할한다. Wilkinson (1997); D'Andrea and Pellman (1998); Wilkinson (1998); Chung and Baek (1999); Yan, et al. (2000) 참조. 대부분의 USPs이 선형 Ub 융합, 예를 들면, α NH-펩티드 결합을 가수분해할 수 있지만, 그것들의 주요한 역할은 라이신 측 사슬에 의한 εNH2-이소펩티드 연결에 의해 단백질에 컨쥬게이트된 Ub 분자의 제거라고 믿어진다. 유비퀴틴-같은 단백질과 관련된 이소펩티다제가 또한 있다. 예를 들면, 여러 효모 및 인간 프로테아제, 예를 들면, ULP1 및 ULP2, 및 인위적 선형 SUMO 융합으로부터 뿐만 아니라 ε-아미노 라이신 기로부터 SUMO를 제거할 수 있는 SENP1 및 SENP2가 있다. Li and Hochstrasser (1999); Li and Hochstrasser (2000); Gong, et al. (2000) 참조. 인간 이소펩티다제의 예가 하기 표 1에 보여진다. 하지만, 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-같은 단백질의 C-말단을 인식하는 다른 인간 단백질 가수분해 효소는 다른 종, 원핵 또는 진핵과 유사한 효소이다.

표 1: 인간 이소펩티다제의 실시예

이소펩티다아제 같은 단백질 분해 효소들은 세포 생존, 증식 및 분화에 중요한 역할을 한다. 초파리 FAF (지질 개안) 유전자 내의 변이는 각 개안내에서 빛 수용기의 세포의 수를 증가시키고 배발생에서 모계 영향을 갖는 것으로 알려졌다. Huang, et al. (1995)를 참고하라. FAF는 발달하는 혼합물 눈에서 신경 세포의 결정의 음성 조절을 위해 요구되는 USP를 암호화하는 것으로써 기재되어 있다. 게다가, FAF는 탈유비퀴틴화하고 LQF를 안정화한다고 생각된다. Chen, et al. (2002)를 참고하라. 탈-유비퀴틴화 효소를 암호화하는 이스트 DOA4 유전자는 프로테오솜과 상호 작용하는 것으로 알려졌고, 그것들이 상기 프로테오솜에 의해 분해되기 직전에 결합된 단백질들로부터 Ub를 분할하고, 따라서 Ub를 재순환한다. 이것은 DOA4 음성 세포 주요 생화학적 표현형, 즉 Ub에 유리되고 결합된 양의 감소와 일치한다. 변이 세포들은 더딘 생장 및 비정상적인 DNA 손상을 포함하는 다수의 장애를 갖는다. Papa 및 Hochstrasser (1993; Papa, Amerik et al. (1999)를 참고하라. 인간 USP-M은 염색체와, 유사 분할의 개시에서 인산화 및 중기/후기 단계 동안의 탈-인산화와 관련되어진다고 알려졌다. Cai, et al. (1999)를 참고하라. 효소는 히스톤들을 디-유비퀴티네이트하고 크로마틴 응축에 영향을 미치고 세포 사멸에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려졌다. Mimnaugh, et al. (2001)을 참고하라. DUB-1 및 DUB-2는 시토킨-자극 림프구 세포 증식의 분석 동안에 확인되었다. 이들 유전자들의 높은 수준의 발현은 세포 주기 억제에 기인할 수 있다. 실제로, DUB-1 및 DUB-2는 결정적인 성장 조절자의 분해율을 조절할 수 있다. Zhu, et al. (1996); Zhu, et al. (1997)을 참고하라. USP7은 비-특이적 전사 활성제 Vmw110과 상호 작용하는 것으로 나타나고, 암 억제 p53을 탈유비퀴틴화시키고 안정화시키는 HAUSP 효소로써 또한 개시되어왔다. Everett, et al. (1997); Li, et al. (2002); Wood (2002)를 참고하라. 마우스 Unp 유전자는 원종양 형성 유전자 (proto-oncogene)로써 개시되어왔고, NIH3T3 세포에서 그것의 과-발현은 형질변환을 유발시킨다. Gupta, et al.(1994)를 참고하라. 1차 인간 폐 종양 조직의 연구에서 인간 UNP는 상승된 유전자 발현 수준을 갖고, 따라서 종양 형성 (neoplasia)에서 이러한 USP 에 대한 원인이 되는 역할을 갖는 것으로 나타났다. Gray, et al. (1995)를 참고하라. 세포계에서, UNP 단백질 수준은 감소되는 것으로 나타났고, 따라서 UNP가 종양 억제 유전자로 나타났다. Frederick, et al. (1998)을 참고하라. 종양 억제 유전자 PTEN의 과-발현은 인간 UNP를 상승-조절하는 것을 나타낸다.

Hong, et al. (2000)을 참고하라. DUBS의 억제자는 발생학적 발현 패턴, 생화학적 특성, 세포 위치 패턴, 조직 분포, 선호되는 표적, 세포적 기능 특성을 갖는다. Park et al. (2000); Layfield et al. (1999); Cai et al. (1999); Lin et al. (2000); Gong et al. (2000); Park et al. (2000); Hemelaar et al. (2004); Wilkinson (2000); Lin et al. (2001); Li et al. (2002); Hochstrasser (1996); Chung 및 baek (1999); Weissman (2001)을 참고하라. USP 기질의 하기 군들은 완전히 개시되어왔다: Ub 전구체, 즉 리보솜 단백질과 함께 자연적으로 발생하는 융합; 단일-유비퀴네이트된 단백질과의 결합, 즉 단백질 분해에 대해 결정되지 않은 단백질, Ub에 결합되어 단백질의 다양한 생화학적 특성을 변경하는 것, 예를 들면, 복합체 형성 또는 세포 운반; 잘못된-유비퀴티네이트된 단백질, 예를 들면, 교정; 다-유비퀴티네이트된 단백질을 프로테아솜에 결합시키는 것, 예를 들면, Ub 재순환; 및 폴리-유비퀴틴 사슬들, 예를 들면, 모노머 분해 및 재순환. 더욱이, 상기 유비퀴틴-단백질분해 경로는 최근에 약물 발견으로 확인되어왔다. 프로테아솜 억제제는 다-골수종에 대하여 (벨케이드) 암 세포들의 여러 종류의 생장을 선택적으로 억제하는 것으로 최근에 확인되었고 (Almond 및 Cohen 2002; Shah, Potter et al. 2002) (Adams 2002), 임상적인 반응을 성취하였다. (Adams 2002; Adams 2002; Adams 2002) 벨케이드의 치료적 효과의 상세 설명은 충분히 설명되어야 하지만, 그것은 선택성 진행형 암세포에 관해 세포사면을 유발시키는 것으로 나타난다. 그럼에도 불구하고, 그것의 효과는 독성에 의해 제한되고, 이것은 임상 시험에서 환자의 유순성에 부정적인 영향이 있다. (Adams 2002)

본 발명은 USPs 및 UCHs 억제제 같은 유비퀴틴-프로테아솜 경로와 관련된 화합물의 활성에 더 나은 치료적 지표를 갖는 화합물의 선택에서 개선에 대한 수단을 제공한다. 한 구현예에서, 본 발명은 벨케이드®의 경우에서와 같이 모든 단백질 분해를 억제하는 것보다 더 선택적이고 효과적인 수단으로써 유비퀴틴 대사작용 경로를 선택적인 목표로 삼는다. 유비퀴틴-같은 단백질 및 유비퀴틴은 점점 더 질병과 연관 또는 관련이 있다. 예를 들면, 신경퇴행은 SUMO와 추가로 헌팅턴 (Htt) 병원성 단백질 Httex의 병원성 단편에 의해 악화되었다. Steffan et al. (2004)를 참고하라. 본 발명자들은 이것과 SUMO 가수분해 효소의 활성제가 헌팅턴병에서 치료적 효용을 갖는 다른 자료를 근거로 해서 완성하였다.

발명의 방법

본 특허에 기재된 분석은 어떠한 약제 또는 "리포터", 예를 들면, 효소, 단백질, 등을 사용하는데 이것은 예를 들면, 활성에서 신호를 생산하기 위한 유리 N-말단 아미노산 잔기를 필요로 한다. 이 약제는 다른 단백질의 그것의 N-말단에서 C-말단을 통해서 융합에 의해 불활성화된다. 예로써, 트립신계 같은 프로테아제 효소, 예를 들면, factor X는 활성 위치 펩티드 분할에 가담하기 위해 유리 N-말단 리신을 필요로 한다. 본 발명의 분석은 단백질 분해 효소, 예를 들면 UBL 가수분해 효소와 더욱 관련있고, UBL-수용체 융합 단백질을 형성하는데, 이것은 단백질 분해효소에 의해 분할된다. 이 융합 단백질의 분할은 유비퀴틴 및 유비퀴틴-같은 단백질 (총체적으로 UBL로 언급됨) 또는 유리 C-말단을 갖는 그것들의 기능적 단편과 결합, 유리 N-말단을 갖는 "리포터" 모두를 자유롭게 한다. 본 분석의 또 다른 구현예에서, 현재 그것들의 활성 형태에서 UBL과 리포터는 둘 다 공지된 다양한 수단, 예를 들면, 방사성, 발색성, 형광, 인광성, 화학 발광성, 그리고 다른 레벨 및/또는 기질의 도움으로 의해 탐지될 수 있다. 이 분석은 반응이 일어난 장소에서 마이크로타이터 판의 도움으로 수행될 수 있다. 본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서, 단백질 분해 효소 모듈레이터의 스크리닝을 위해 설계된 각 화합물은 반응 혼합물의 다른 구성 성분 보다 먼저 마이크로 타이터 웰에 더해질 수 있다. 분할이 완료된 곳의 대조군과 비교하여, 양성 스크리닝 또는 "히트"는 신호, 예를 들면, 색 또는 형광의 손실로 인식될 수 있는데, 적은 UBL를 나타내거나 리포터가 자유롭게 된다. 한 구현예에서, 융합 폴리머는 융합 단백질, 상기 리포터 단백질의 N-말단은 UBL의 어떠한 다양한 C-말단 또는 그것들의 단편과 혼합될 수 있는데, 이것은 단백질 분해 효소, 예를 들면, 프로테아제 또는 데-유비퀴티나아제 같은 가수 분해 효소로 인식되거나 분할될 수 있다. 또 다른 구현예에서 본 발명의 분석은 단백질 분해 효소의 다른 출처, 예를 들면, 정제된 가수분해 효소, 세포의 융합물 또는 효소 활성으로부터의 추출물은 반드시 정제되어야한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 단백질 분해 효소의 상이한 추정된 출처를 치환시키고 융합 폴리머, 예를 들면 융합 단백질 상의 그것의 효과를 시험함으로써 기관의 다앙성으로부터 신규한 단백질 분해 효소의 발견에 적용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 분석의 구현예에서, 약제 또는 리포터는 UBL 또는 그것들의 활성 단편에 융합되는 비활성 전구체 단백질일 수 있다. 이 구현예에서, 융합 단백질은 단백질 활성에 기인하고, 이것은 단백질의 활성에 근거한 양성신호를 일으킬수 있고, 종기 관련 신호, 예를 들면, 크로모제닉 종기의 생산으로 이끌어진다. 이러한 전구체의 예는 치모겐, 예를 들면, 피브리노겐 및 플라스미노겐, 응고 인자 예를 들면, 프로트롬빈, 및 바이러스 폴리프로테인, 예를 들면, 인간 라이노바이러스 및 폴리오바이러스, 등이다. 최근의 예에서 이소펩티다아제는 E.coli.에서 폴리오바이러스 RNA-의존 RNA 폴리메라아제 (3Dpol)를 함유하는 거대 폴리프로테인의 분할을 매개한다. 이것은 RNA-의존 RNA 폴리메라아제가 활성을 위해 유리 N-말단을 필요로 하고, 이 활성은 쉽게 분석할 수 있거나 탐지할 수 있기 때문에 가능하다. 따라서, RdRp 및 이소펩티다아제의 활성은 결합되었기 때문에 폴리오바이러스계는 본 분석에서 유비퀴틴 이소펩티다아제 활성을 평가하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명에 의해 요구되는 세포가 단백질 분해 효소를 암호화하는 한, 예를 들면, 이소펩티다아제 또는 가수분해효소 (프로테아제), 등은 공지 기술에 의해 알려지거나 또는 기재되었다. 이들 효소는 특이적으로 UBL 서열을 인식하고, 접합점에서 UBL C-말단과 유리 리포터 N-말단을 발생시키기 위한 상기 리포터의 N-말단 사이의 접합 (juntion)에서 분할되고, 상기 리포터는 따라서 활성화되고, 이것은 신호를 등록할 수 있거나 탐지할 수 있도록 한다. 상기 전술된 요건을 만족하는 어떠한 모든 리포터 효소가 본 발명의 분석에서 사용하기에 적합하다. 리포터 효소의 예는 오직 설명을 위한 목적으로 표 2에 나타냈다.

표 2: 활성을 위해 유리 NH ₂ -말단을 요구하는 효소

단백질 류	특이적 예
세린 프로테아제	트롬빈, 디펩티딜 펩티다아제, HtrA2
프로호르몬 전구체	뉴로피신, 바소프레신
서브틸리신/켁신-같은 프로호르몬 전환효소	퓨린
카르복시펩티다아제	카르복시펩티다아제 B, 카르복시펩티다아제 Y
ADAMTS	vWF-분할 프로테아제/ADAMTS 13
ADAM	ADAM 1, ADAM 2
시스테인 아스파테아제	캐스패이즈
아스파틱 프로테이나아제	펩신, 레닌, 카텝신 D, 메이슨-파이저 원숭이 바이러스 프로테이나아제
MMPs	MMP20, MMP26
RNA-의존 RNA 폴리메라아제	3D^pol
N-말단 구핵성 (Ntn) 가수분해효소	글리코실아스파르기네이즈, 20s 프로테오솜 ㅁ-서브유닛, 글루타민 PRPP 아미도트랜스퍼레이즈
4-옥살로크로토네이트 토토머레아제 패밀리	YdcE, YwhB
코리스메이트 신타아제	코리스메이트 신타아제
β-락탐 아실라아제	세팔로스포린 아실레이즈, 페니실린 아실레이즈
바이러스 역전사효소	CaMV 역전사효소
포스폴리파아제	포스폴리파아제 A₂
시그마 전사 인자	σ^K

일반적으로, 단순한 펩티드 결합은 '이소펩티드 결합'과는 다르다. 직선 펩티드 결합이 순환하는 -NH-CR-CO-NH-CR'CO-구조를 갖는데 비해, NH- 운반 탄소에 관하여 COOH 탄소는 α 위치이다. 이소펩티드 결합은 일반적으로 아미노산을 운반하는 탄소 원자와 카르복시기 사이에서 더 큰 간격을 갖는데, 예를 들면, 비- α 위치, 카복실기에 관해서 예를 들면 β,γ,δ,ε, 등에서 아민기를 갖는 적어도 하나의 아미노산과 연관될 때, 이소펩티드 결합을 일으킨다. 후자의 예는 아스파르트 산 (β 위치), 글루타믹 산 (γ 위치), 리신 (ε)위치와 같은 아미노산이다. 많은 펩티다아제 및 이소펩티다아제는 선형 UBL 융합을 분할시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 유전자의 스크린의 구조에서 세포에 적용될 수 있는 그것의 N-말단의 노출에 의해 리포터를 활성화시킬 수 있다. 효소 글루타민 포스포리보실파이로포스페이트 아미도트랜스퍼레이즈 (GPATase)는 퓨린 뉴클레오키드 생합성의 개시 단계를 촉진시키고, 이것은 상기 경로의 효소의 주요 조절이다. GPATase 유전자는 E.coli.의 purF 위치에 의해 암호화된다. Mei 및 Zalkin (1990)을 참고하라. 이 유전자의 결실은 E.coli.의 생장을 늦춘다. 외인성 퓨린을 배지 (아데닌)에 더하면 세포 생장은 회복된다. 숫자 2의 예에서, GPATase에서 유리 N-말단 Cyc의 발생은 그것의 활성에서 필수적이기 때문에, GPATase 효소는 Ub 또는 UBL 이소펩티다아제 활성을 관찰하기위해 우수한 리포터로써 사용될 수 있다는 것을 입증했다. 유사하게도, 다른 N-말단 구핵성 (Ntn) 가수 분해 효소 (표 12를 참조하라) 예를 들면, 아스파라긴 합성효소 (Andrulis I et al (1989)를 참고하라) 및 글루타메이트 합성효소 (Oliver et al (1987)을 참고하라)는 그것의 생물학적 활성을 위해 또한 요구되는 그것들의 N-말단이 있기 때문에 본 발명에서 또한 사용된다.

생물학적 선택 방법은 purF 유전자 자리가 결실된 세포계에서 이동된 Ub-GPATase 또는 UBL-GPATase 융합 단백질에서 포함된다. 이들 균주는 아데닌을 포함하는 배지에서 성장할 수 있다. 같은 균주는 플라스미드가 발현되는 Ub 프로테아제, 예를 들면, 이소펩티다아제, 또는 UBL 프로테아제, 예를 들면, 이소펩티다아제로 또한 형질 변환될 수 있다. 이중 플라스미드를 포함하는 상기 세포들은 합성 배지에서 아데닌 첨가에 독립적으로 성장할 수 있다. 따라서 세포 생장은 Ub 또는 UBL 프로테아제의 의한 활성 GPATase의 산출에 조절을 받게 된다. 만일 변이 Ub 또는 UBL 프로테아제가 E.coli. 균주 거처가 되는 GPATase로 형질변환된다면, 상기 세포들은 아스파라긴 합성효소 및 글루타메이트 합성효소 각각의 경우로써 아데닌, 또는 글루타메이트 또는 아스파라긴 없이 생장할 수 없다. 이 선택 시스템은 Ub-GPATase 또는 UBL-GPATase 분할을 할 수 있는 신규한 프로테아제를 복제하기 위해 사용될 수 있다. 상기 시스템과 유사한 것으로 효소, 예를 들면, 가장 좋은 효소는 활성 GPATase 또는 선택의 다른 효소를 발생시킴으로써 성장의 회복을 위한 Ub 또는 UBL-융합 단백질을 분할하는 실수 유발성 PCR 라이브러리로부터 선택하기 위해서 또한 사용될 수 있다.

상기 방법의 다른 구현예에서는 단백질의 기능 및/또는 표현형을 갖는 N-말단 아미노산이 효과를 평가하기 위해 UB/UBL-융합 단백질을 사용한다. Bachmair (1968); Bachmair (1989)를 참고하라. 합성 N-말단 유비퀴틴 융합 단백질은 N-말단 잔기로 명명된 단백질을 생산하기 위해 진핵 생물의 생체내에서 급속한 분할을 겪는다. 일반적으로, N-말단 규칙에 의해 언급된 것과 같이, 특정 N-말단 잔기를 갖는 단백질은 연속적인 유비퀴틴-매개된 분해에 더욱 민감할 수 있다. Varshavsky (1996)을 참고하라. 이 특정 구현예에서 융합 단백질의 N-말단은 단백질 안정성을 변경하기 위해서 수정되고, 상이한 생체 내 단백질 수준을 생성하고, 따라서 그것들의 표현형, 예를 들면, 세포 기능이 단백질의 수준에 의해 영향을 받는 경우, 예를 들면, 이스트 내에서, 알파-인자에 대한 Ard1 민감성 또는 우라실-결핍 배지 상의 생존을 위한 Ura3을 억제한다. Park et al (1992)를 참고하라. 본 방법은 N-말단 SUMO, ISG15, 또는 NEDD8과 함께 융합을 수단으로 함으로써 생체 내의 단백질 수준 및 표현형에 영향을 주기 위해 적용될 수 있다. 융합 단백질의 이러한 예는 생체 내에서 분할될 수 있고 유리된 N-말단 단백질 잔기는 그 단백질의 수준을 결정할 수 있고 따라서 상기 표현형은 N-말단 규칙에 의해 확립된 것으로써 단백질 (비)안정성과 관련되어있다. 특이적 단백질 잔기들은 원하는 단백질 수준, 예를 들면, 불안정성에 대한 아르기닌, 안정성에 대한 메티오닌, 또는 기관에 사용된 종류에서 안정성의 원하는 수준에 대해 적절한 다른 잔기를 발생시킬 수 있는 본 발명에 따른 융합 구조를 설계하기 위해 선택될 수 있다.

본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서는 생체 내에서 단백질 분해 효소, 예를 들면, 이소펩티다아제 활성과 관련된 광학 이미지화를 위해 적절한 리포터를 함유하는 융합 단백질을 사용한다.

예로써, Weissleder (1999)에 기재된 것처럼 (기술된 방법과 조영제와 관련된 본문은 그것의 전부가 여기에 병합되었다) 유비퀴티네이팅된 효소가 여기에서 특이적 효소와 단지 상호 작용 후에 형광성인 조영제의 도움으로 프로테아제 활성의 근-적외선 (near IR) 광학 이미지화를 사용하는 종양 탐지에서 도구로써 사용된다. 이러한 프로테아제 중 하나인, 카텝신 D는 휴지기 또는 비활성 형광 색소의 분할에 따라 방출할 수 있고, 따라서 분자내의 광학 형광 해소를 절단함으로써 형광 색소를 활성화한다. Ching-Hsuan Tung et al. (1999)를 참고하라. 따라서, 유비퀴틴 및/또는 UBLs은 시험관 내, 생체 외 및/또는 생체 내의 디유비퀴티네이팅 효소 및 활성화 및/또는 억제된 활성의 정확한 위치를 분석하기 위해 사용될 수 있는 감지 탐침으로 형광 색소로부터 분자 내 광학 형광 해소를 보강하기 위해 작용한다. 유비퀴틴의 사용과 UBL 형광 탐침은 여러 단백질 분해 효소들, 예를 들면, 이소펩티다아제가 하기에 기술되는 특이적 질병과 관련되어 있기 때문에, 초기 종양 감지 및 치료의 효용성을 추적하기 위한 추적 시험을 위해 중요하다.

UBL은 그것들의 유비퀴틴-같은 구조상 층의 중대한 보존을 나타낸다. 그것들의 구형 구조는 반으로, 즉 C-말단 단편과 N-말단 단편으로 잘라진다. 예를 들면, SUMO 분자는 잘라진다. 리포터 단백질이 C-말단 반쪽 부분 SUMO (CTHS)로 융합되면, 그것은 SUMO 프로테아제에 의해 분할되지 않는다. 그러나, CTHS-리포터 융합 단백질이 N-말단 반쪽 부분 SUMO (NTHS) 와 혼합될 경우, 상기 효소는 리포터와 융합되고 분할한다. 따라서 리포터 신호는 단지 SUMO의 두 부분이 관련되어 있을 때, 관찰된다. 관련되어 있을 때, 상기 구조는 프로테아제 효소에 의해 인식되고, 이것은 후에 분할될 수 있고 활성 리포터를 발생시킨다. 이 특이적인 적용에서, 본 분석의 SUMO 구현예의 잘려진 부분이 분자로, 예를 들면, 대사 산물, 호르몬 및 약물같은 특이적인 수용기에 결합하는 작은 분자로 탐지를 위해 사용될 수 있다. 유비퀴틴 및 UBLs에 대한 분할 특이성을 갖는 프로테아제는 스위치 또는 센서로서의 사용을 위해 또한 적절한데, 예를 들면, 유비퀴틴 또는 UBL CTHS-수용체에 부착된 수용기 분자가 NTHS 상에서 호르몬, 약물, 또는 리간드 등 (총체적으로 리간드로 언급됨)과 접촉하고 결합하고, 단백질-단백질 또는 단백질-소형 분자 상호 작용은 활성 수용기의 급속한 분할을 유도한다. 이 구현예에서 바람직하게도 유비퀴틴 및 UBL 프로테아제가 리간드 (수용기 센서)에 대한 효과적인 스위치가 되는 두가지 조건이 제공되었다. 상기 유비퀴틴 또는 UBL-수용체는 수용기가 그것의 리간드, 예를 들면, 호르몬에 의해 결합될 때, 프로테아제에 의해 바람직하게 분할된다. 리간드의 결합은 그것의 프로테아제에 의해 유비퀴틴 또는 UBL의 분할을 촉진하는 유비퀴틴 또는 UBL 구조내의 변화로 바람직하게도 촉진한다. 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인 (ER-LBD)는 어러한 적용의 예이다. 이 구현예에서, 광범위한 적용을 갖지만, 여기의 에스트로겐 수용기의 참고에 의해 예시된다. 에스트로겐 수용기 (ER)는 조-활성인자 분자와 높은 친화력으로 상호 작용한다. 그러나, 이 상호 작용은 에스트로겐 호르몬 결합과 에스트로겐 수용기 (ER)의 리간드 결합 도메인 (LBD)에 전적으로 의존한다. 본 방법의 이러한 구현예에서, ER의 리간드-결합 도메인은 SUMO의 N-말단 반쪽 부분 (NTHS) 또는 어떠한 다른 UBL과 함께 융합 폴리머 (단백질)로써 발현되고, CTHS는 ERdp 대해 높은 친화력을 갖는 단백질의 조-활성인자 부분에 융합된다. 조-활성인자-CTHS 리포터 융합 단백질 및 ER-LBD-NTHS 융합 단백질은 세포계 내에서, 예를 들면, E.coli에서 발현될 수 있고, 임의로 정제된다. 상기 단백질 혼합물은 후에 SUMO 프로테아제의 존재 하에 테스트 기질에서 배양될 수 있다. 에스트로겐 호르몬이 ER-LBD-NTHS 융합 중에서 그것의 수용기와 결합하면, 그것은 조-활성인자 분자와 함께 상호작용을 촉진시킨다. 결과의 복합체는 리포터의 분할을 이끌고, 이것은 리포터 활성을 위한 신호의 생산을 산출하거나 만들 수 있다. 효소적 활성에 의한 리포터 신호의 증폭을 위한 능력은 이 에스트로겐-ER 쌍 센서의 발달을 보강한다. 신호가 효소적으로 증폭되기 때문에, 센서가 단편 UBLs, 예를 들면, SUMO 및 다른 UBLs의 상보성에 의해 작용하는 것은 에스트로겐 뿐만 아니라 다른 호르몬 및 전통적인 ELISA 키트에 의한 것보다 훨씬 민감성을 갖는 작용 산물에 의해 탐지될 수 있다. 조-활성인자는 분자쌍, 예를 들면, 호르몬 의존 조-활성인자, 및 리간드-리간드-수용체 쌍, 예를 들면, 호르몬 및 호르몬 수용기쌍은 인간 수용기의 다양성에 대한 센서로써 사용되고, 예를 들면, 핵 수용체, 매우 극소량을 탐지할 수 있는, 예를 들면, 피코몰라는 에스트로겐, 안드로겐, 갑상선 호르몬, 또는 1,25-디히드록시 비타민 D에 의존한다. 마찬가지로, 모든 UBLs은 알파-1 헬릭스 및 베타 3 스트랜드 사이의 루프 내의 어느 영역에서, 예를 들면, 두 쪽 부분은 단편으로 나누어지고, 이것은 예를 들어, 가수분해 효소인 그것들의 각각의 단백질 분해 효소의 도움으로 센서를 구성하기 위해 사용될 수 있는 또 다른 것에 대한 높은 친화력을 갖는다. 본 분석의 센서 구현에에서 신호 생산은 유리 N-말단의 발생 또는 그것의 신호 생산 결과의 결합에 의해 신호 생산을 의존한다.

이소펩티다제 효소는 식물과 동물계 전체에 존재하고, 이들 모두는 본 발명에 사용하기에 알맞다고 간주된다. 예를 들면, 이스트 SUMO 프로타제 효소(ULP1)는 특히 그 분열 특성에서 확실하고 신뢰가능하고, 본 발명에 제공되는 예시적 내용 모두에서 사용된다. 예를 들면, Malakhov 참조(2004). 본 발명의 검사의 구현예는 여러 UBL에 대하여 알려진 다른 이소펩티다아제를 사용하여 확인되었고, 요구사항은 유리되고 비-용융된 리포터 아미노 말단의 생성에 대한 주어진 신호에 절대적으로 의존하는 것이고 이것은 본 실시예에서 이소펩티다아제 효소 SUMO 프로타아제(ULP1)에 의해 생성된다. 모듈레이터, 예를 들면 스크린된 화합물들에 의해 수행되는 이소펩티다제 활성의 어느 억제는 효소활성의 감쇄를 가져온다. 여기에 기재된 본 발명의 검사를 수행하기 위한 요소들의 조합의 다른 예들은 SUMO에 융합되고 ULP1으로 분할된 폴리오바이러스 3D RNA-의존 RNA 폴리머라제, SUMO에 융합되고 ULP1으로 분할된 글루타민 포스포리보실 피로포스페이트 아미도트랜스퍼라제(GPAT), SUMO에 융합되고 ULP1으로 분할된 트립타제, 및 이스트와 인간 SUMO, 유비퀴논, Nedd8, Rub1 및 ISG15에 융합되고 ULP1, Senp2, USP2, Den1 및 여러 세포 추출물로 분할된 포스포리파아제 A₂이다. 그러나 이들은 본 발명의 검사 및 키트에 적당한 여러 조합물의 단순한 예에 불과하다.

그러므로, 본 발명은 여러 주요 구현예의 형태로 본 명세서에 제공되고, 이것은 유비퀴틴과 유비퀴틴-같은 단백질 하이드로라제, 예를 들면 프로테아제의 활성을 모니터링하는 UBL-리포터 융합 폴리머, UBL-리포터 융합 폴리머, 및 프로테아제와 같은 UBL 가수분해효소와 같은 단백질 분해 효소 및 인간, 다른 동물, 세포 및 세포 분획물에서의 그들의 활성을 모니터하는 프로브로서의 신호생성 프리 리포터 구조물을 포함한다. 이들 중에서 가장 강력한 것은 UBL-리포터 융합 폴리머라제의 사용 및 UBL 가수분해효소, 예를 들면 프로테아제, 진핵세포 및 원핵세포 기관을 위한 적절한 마커로서의 활성과 같은 단백질 분해 효소 활성의 평가이다. 또 다른 중요한 구현예는 UBL-리포터 분자, 예를 들면, 효소 및 적당한 단백질 분해 효소, 단백질-단백질 상호작용과 작은 분자-단백질 상호작용을 검출하기 위한 예를 들면 가수분해효소 및 프로테아제로 분할될 수 있는 센서로서 그들의 키메릭 구조물에 의지한다. 또 다른 구현예에서, UBL-리포터 효소는 단백질 분해 효소, 예를 들면 UBL 가수분해효소 및 프로테아제의 활성의 모니터링과 분석용 키트의 제조에 사용된다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예의 몇몇은 그들의 활성을 보고하는데 특정 N-터미날 잔기를 필요로 하는 효소, 폴리머라제, 프로테아제, 리파아제, 아실라제와 같은 "리포터" 구조물의 변화물을 사용한다. 다른 구현예는 융합 폴리머의 발현에 의존하고, 여기서 UBL의 C-터미날은 리포터의 불활성 형태를 가져오는 융합 폴리머에서 리포터의 N-터미날에 연결되고, 여기서 프리 N-터미날 리포터 구조물은 단백질 분해 효소의 작용, 예를 들면 UBL 가수분해효소 또는 프로테아제가 리포터 활성을 가져오는 작용을 생성한다. 리포터는 효소일 수 있고, 또는 다른 존재와의 상호작용에 의해 또는 그들 스스로에 의해 존재를 생성하는 다른 신호일 수 있다.

또 다른 바람직한 구현예는 활성 리포터 또는 효소를 생산하는 활성 신호를 발생하기 위한 UBL 가수분해효소, 프로테아제 또는 이소펩티다제와 같은 단백질 분해 효소에 의해 예를 들면 인 비트로에서 분할되고 예를 들면 E.coli와 같은 다른 소스로부터 얻어지고 발현되고 정제되는 단백질과 같은 UBL-리포터 융합 폴리머를 사용한다. 이와 같이 생성된 신호 및/또는 리포터 효소 활성은 단백질 분해 효소, 예를 들면 UBL 가수분해효소 또는 프로테아제의 측정가능한 산출물로서 전체적 스크리닝 방법에서의 활성 및 단백질 분해효소, 예를 들면 가수분해 효소 또는 프로테아제를 억제 또는 활성화하는 작은 분자와 같은 효소 활성의 모듈레이터를 확인하는 키트로서 사용될 수 있다. 추가의 구현예에서, UBL-하이드라제 또는 프로테아제와 같은 단백질 분해 효소는 인 비보에서 신호생성 효소와 같은 리포터 신호를 생성하기 위해 및 UBL 가수분해효소 또는 프로테아제와 같은 특정 단백질 분해 효소에 대한 세포-기준 분석을 개발하기 위해 사용된다. 가장 바람직한 구현예에서, UBL-리포터 융합 폴리머는 예를 들면, 여러 기관, 세포, 박테리아, 균류, 및 동물과 식물 조직과 세포 분획물에서의 가수분해효소와 프로테아제와 같은 특정 단백질 분해 효소의 활성을 추적하기 위한 센서로서 사용하기 위한 세포 염색체에 병합되는 트란스제닉 구조물로 사용된다. 또 다른 구현예는 UBL 가수분해효소와 프로테아제와 같은 여러 단백질 분해 효소용 친화성 시약 또는 매트릭스로서 프로-효소와 같은 UBL-프로-리포터 구조물을 이용한다. 추가로, UBL-리포터 융합 구조물은 본 발명의 검사와, UBL-도메인 구조물과 같은 포함되지 않은 신규한 단백질 분해 효소 구조물에 대한 키트로서 사용될 수 있다. 본 발명의 방법 및 키트는 또한 돌연변이 또는 변형된 유비퀴틴 또는 UBL 구조물 또는 그들에 결합된 기능적 단편, 및 대응하는 돌연변이된 UBL-리포터 융합 폴리머의 도움으로 신규의 개선된 단백질 분해 효소, 예를 들면 UBL 가수분해효소 및 프로테아제를 발견하고 발명하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 극히 바람직한 구현예에서, 검사 및 키트는 원핵생물 또는 진핵생물 성장 및/또는 페노타입 검출을 위한 선택 마커로서 사용되는 UBL-리포터 융합 단백질에 의존한다. 추가의 구현예는 신규한 UBL-리포터 효소를 스크리닝하기 위한 프로브로서 UBL-리포터 융합 구조물을 사용하는 방법과 키트를 제공한다. 이들 키트는 UBL-가수분해효소 및 프로테아제와 같은 단백질 분해 효소의 활성을 분석하기 위한 다른 시약과 함께 UBL-융합물을 포함할 것이다.

다른 구현예에서, 본 발명은 예를 들면 효소인 더 나은 신호 리포터를 생산하기 위한 수단으로서 UBL-리포터 융합 구조물을 사용하는 방법 및 키트를 제공한다. 또 다른 본 발명의 구현예는 활성 N-터미날로 프로라인을 요구하는, 타우토머라제와 같은 효소의 경우, 그것의 프리 N-터미날에 대한 특정 요구사항을 갖는 리포터를 사용하는 본 발명이 방법 및 키트를 제공한다. 이 경우, 방법과 키트는 신규한 단백질 분해 효소, 예를 들면 UBL-프로라인 융합 결합에 특정한 가수분해효소와 프로테아제를 발현하기 위해 UBL-N-프로라인 리포터의 리포터를 사용한다. 본 발명은 그들의 유비퀴틴 또는 그들의 N-터미날을 통해 융합된다면 UBL-융합 배열에서 불활성이고 그들의 N-터미날의 자유로 인해 유비퀴틴 또는 UBL 프로테아제에 의해 분할된 후 활성화된 "리포터" 효소를 동정하고 분석하기 위한 검사 형태 및 키트에 관한 종래기술을 넘는 명백한 개선을 제공한다. 상기 표2는 생리적 활성을 위해 유리 N-터미날을 요구하는 리포터 효소들의 여러 종류의 예를 기재한다. 여러 경우에, N-터미날 잔기는 촉매적 부위의 일부이거나 또는 촉매 메카니즘에 필수적이다. 이런 이유로, 그들의 N-터미날의 유비퀴닌 또는 UBL에 대한 융합은 역방법으로 효소를 불활성화하고, 반면 유니퀴닌 또는 UBL의 제거는 그들의 활성을 신속히 회복한다. 그러므로, 활성 리포터 효소의 발생은 각각의 프로테아제의 직접 작용이다. 추가의 구현예에서, 유비퀴닌과 UBL-리포터 융합 유전자는 알려진 수단으로 어느 유기체에 전이될 수 있고, 임의로 숙주의 염색체에 병합되고, 형질도입 식물과 동물을 생성할 수 있다. 표2에 보고된 여러 효소들은 독특한 기질을 가지므로, 그들은 이런 효소가 존재하는 조직 또는 세포에서 신호 생성 검사, 예를 들면 형광 또는 발색 신호에 사용될 수 있다. 쉽게 검출되는 기질과 결합된 UBL-리포터는 신규한 생화학적 및 유전적 마커로서 작용하여, 단백질 분해 효소, 예를 들면 이소펩티다제와 프로테아제의 독특한 활성을 보고한다. 이 특허의 유비퀴틴과 UBL-융합 유전자는 또한 선택가능한 마커로서 유용하다. 예를 들면, 유비퀴닌 또는 UBL-융합 유전자에의 퓨린 생합성에 필수적인 E. coli 글루타민-PRPP-아미도트람스퍼라제(GPAT) 유전자의 N-터미날 융합은 예를 들면 플라즈미드 벡터로 결찰될 수 있고, 그것의 염색체 GPAT 유전자가 결실 또는 돌연변이된 세포에 트란스펙트될 수 있다. 그러므로, GPAT 효소는 활성화되기위해 유리 N-터미날이 요구되고, 융합 단백질의 이소펩티다아제 분할은 다시 퓨린 생합성 경로를 회복하는 것을 요구한다. UBL-마커 유전자와 같은 세포 수확은 적당한 이소펩티다아제 또는 프로테아제 유전자를 운반하는 플라즈미드의 선택을 허용한다. 그러므로, 프로테아제 유전자는 세포 활성화에 필수 단백질의 활성화하는 스위치로서 작용할 수 있다. 정제된 불활성 유비퀴틴 및 UBL-리포터 융합 단백질은 예를 들면, 프로테아제와 이소펩티다아제와 같은 신규한 단백질 분해 효소의 인 비트로 스트리닝을 위해 적용된다. 본 검사는 또한 유비퀴틴 또는 UBL류의 유비퀴틴 하나 이상의 멤버의 선택적 분할을 나타내는 프로테아나제의 혼합물의 활성을 모니터링하는데 적절하다. 예를 들면, SUMO-X 리포터는 ULP1(SUMO 프로테나아제)에 대한 적절한 기질인 반면, SUMO-Y 리포터는 Ulp2, 제2, 별개의 SUMO 프로테아제를 위한 슈퍼 기질일 수 있다.

더욱 특별히 본 발명은 본 발명의 제1 면에서 단백질 분해 효소를 조립하는 방법을 제공하고, 상기 방법은

-유비퀴틴 또는 유비퀴틴-같은 단백질(UBL) 또는 그것의 기능적 C-터미날 단편을 포함하는 제1 폴리머 및 검출을 위해 요구되는 유리 N-터미날 아미노산을 포함하는 제2 폴리머를 포함하는 융합 폴리머를 제공하고: 여기서 제 1및 제2 폴리머는 UBL C-터미날과 제2 폴리머 N-터미날을 통해 서로에 대하여 기능적으로 연결되고;

융합 단백질은 UBL-C- 터미날에서 분할되는 효소를 포함하는 또는 포함하는 것으로 예상되는 단백질 분해 효소 또는 샘플과 접촉하고;

분할된 폴리머의 양 또는 활성과 연결된 신호를 검출하고; 그리고

프로토올리틱 효소의 활성에 대한 분할된 폴리머의 신호 사이의 관계를 확립하는 것을 포함한다.

한 구현예에서, 상기 방법은 여러 형태로 그리고 다른 목적을 위해 실시될 수 있다. 또한 본 방법은 참조에 의해 각 효소 또는 샘플 분할 신호를 0% ~ 100% 분할 신호로 표준화하고 각 효소 또는 그것의 샘플에 단백질 분해 효소 활성값을 할당하는 것을 포함할 수 있고: 여기서, 얻어진 효소 활성이 컷-오프 값 미만이면 이것은 효쇼 또는 샘플이 불활성이라고 말하여지고, 컷-오프 값 이상이면 활성이다. 0% 및 100% 신호는 공지의 방법으로 얻어질 수 있고, 100% 및 0% 분할 신호를 얻는 것은 완전한 분할의 접촉, 검출 및 확립단계의 반복 및 단백질 분해 효소 활성의 완전한 억제를 통해 얻어진다. 표준화 단계는 통상적으로 각 효소 또는 샘플 분할 신호를 참조에 의해 효소 활성 분할치의 커브로 표준화 및 단백질 분해 효소활성을 그들의 각 효소 또는 샘플에 할당함으로서 수행되고; 여기서 얻어진 효소 활성이 컷-오프 값 미만이면 그 효소 또는 샘플은 불활성이고, 컷-오프 값 이상이면 활성으로 말하여진다. 비록, 블랭크 및/또는 대조 등을 표준화하는 다른 방법이 또한 의도된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 제1 폴리머는 여러 다른 것 중에서 또는 C-터미날에 그것의 α-나선 1 및 β-스트랜드 3이 연결된 UBL-루프내의 아미노산을 포함하는 결합된 기능적 C-터미날 단편 중에서 단백질 유비퀴틴, SUMO, Nedd8, ISG15, Apg8, Apg12, FAT10, Urm1, Hub, Ubi, Rub1, ISG15을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 제2 폴리머는 다양한 구조물들을 포함할 수 있고, 가장 바람직한 것은 리포터 단백질 또는 효소, 전사 인자 또는 그것의 신호적 기능적 단편이고, 및/또는 제1 폴리머는 UBL, 즉 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-같은 단백질, 또는 C-터미날에 그것의 α-나선 1 및 β-스트랜드 3이 연결된 UBL- 루프 중에서 아미노산을 포함하는 결합된 기능적 C-터미날을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법의 한 형태에서, 제1 또는 제2 폴리머 또는 둘 다는 단백질 분해 효소 분할 후 검출가능해질 수 있다. 제1 및/또는 제2 폴리머(들)는 그것이 운반하는 신호의 활성화 및/또는 검출가능한 신호에의 결합 또는 발생에 의해 검출가능해질 수 있다. 통상적으로, 신호는 방사성, 형광성, 인광성, 발색성, 초음파 또는 화학발광 신호이다. 그러나, 다른 형태도 본 발명의 범위내이다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 방법은 또한 C-터미날에 그것의 α-나선 1 및 β-스트랜드 3에 결합된 UBL-루프내의 아미노산 또는 UBL C- 터미날 단편으로 UBL을 형성하기 위한 나머지 아미노산 단편을 포함하는 UBL N-터미날 단편을 얻는 것을 포함한다: UBL N-터미날 단편은 기능적으로 제1 및 제2 결합 파트너의 하나에 연결되고; 및 제2 결합 파트너를 얻는 것을 포함한다. 이 형태에서, 융합 폴리머는 통상적으로 제1 및 제2 결합 파트너의 결합 후 분열되고, 이것은 바람직하기는 수용체와 수용체 결합 약제를 포함한다. 다른 수용체 결합 약제는 약물, 호르몬, 항원, 리간드 또는 그것이 수용체 결합 기능적 단편을 포함할 수 있고; 반면, 상응하는 수용체는 또한 약물 수용체, 호르몬 수용체, 항체, 리간드 결합 수용체, 또는 그것의 결합 기능적 단편을 포함할 수 있다. 이 구현예에서, UBL N- 및 C-터미날의 결합은 단백질 분해 효소에 의해 C-터미날에서 UBL 배열과 폴리머 분열의 인식이 가능하다. 특히 중요한 것은 제1과 제2 폴리머가 서로에 대해 공유결합되는 방법의 형태이다. 또 다른 제1 및 제2 폴리머는 통상적으로 링커를 통해 서로에 대하여 기능적으로 연결되고, 이것은 적어도 하나의 단백질을 포함한다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 웅합 폴리머는 융합단백질을 포함하고, 단백질 분해 효소는 통상적으로 이소펩티다아제 또는 그것의 분할 기능적 단편을 포함한다.

단백질 분해효소의 예는 유비퀴틴 C-터미날 가수분해효소 및 유비퀴틴-특이 프로테아제 또는 그것의 분할 기능적 단편이다. 다른 예 중에서, 많은 것은 ULP1, ULP2, SENP1, SENP2, 이스트 YUH1, 포유동물 UCHL1, UCH-L3, UCH37, Bap1, USP-M, DUB-1, DUB-2, USP7, UNP, CYLD, CYLD1, KIAA0849, USP9X, DFFRX, USP9, FAFX, USP9Y, DFFRY, USP10, FAFY, OTUB1, OTB1, OTU1, HSPC263, OTUB2, C14irf137, OTB2, OTU2, USP10, KIAA0190, USP11, USP11, UHX1, USP12, UBH1m, USP12l1, USP13, ISOT3, USP14, TGT, USP15, KIAA0529, USP16, UBP16, UBPM, USP18,UBP43, USP19, KIAA0891, ZMYND9, USP20, KIAA1003, LSFR3A, USP21, USP23, NEDD8-특이 프로테나제, USP22, KIAA1063, USP24, KIAA1057, USP25, USP26, USP28, USP29, USP30, USP32, USP33, KIAA1097, VDU1, USP35, KIAA1372, USP34, USP36, KASS1453, KIAA1594, USP38, KIAA1891, USP40, USP42, USP44, USP46, USP49, USP51, UBP1, USP1, UBP2, UBP41, UBP3, USP3, UBP4, USP4, UNP, UNPH, UBP5, USP5, ISOT, UBP6, USP6, TRE2, UBP7, HAUSP, UBP8, USP8, KIAA0055, UBPY, VCIP, VCIP135, KIAA1850, cazanne1, cazanne2, A20, UCH-L1, Park5, UCH-L3, UCH-L5, UCH-37, ATXN3, ATX3, MJD, MJD1, SCA3, POH1, PSMD14, CSN5, COPS5, JAB1, SENP1, SENP2, SENP3, SSP3, SUSP3, SENP5, FKSG45, SENP6, FKSG6, KIAA0797, SSP1, SUSP1, SENP7, KIAA1707, SSP2, SUSP2, SENP8, VCIP, VCIP135, KIAA1850, A20, UCH-L1, Park5, UCH-L3, UCH-L5, UCH-L37, ATXN3,ATX3, MJD, MJD1, SCA3, POH1, PSMD14, CSN5, COPS5, JAB1, SENP1, SENP2, SENP3, SSP3, SUSP3, SENP5, FKSG45, SENP6, FKSG6, KIAA0797, SSP1, SUSP1, SENP7, KIAA1707, SSP2, SUSP2, SENP8, FKSG8, PRSC2, DUB1, DUB2, DUB3, 또는 DUB4 또는 그것의 기능적 단편과 같은 하나 이상의 분할 기능적 효소를 포함하는 구조물이다. 비록 몇몇 예가 제공되었지만, 많은 것들이 본 분야에 알려져 있고, 포함되지 않은 것은 그들이 필요한 특성을 나타내는 한 역시 적절하다.

본 발명의 방법은 "수용체" 또는 세린 프로테아제, 프로-호르몬 전구체, 서브틸리신/헥신-형 프로-호르몬 전환체, 카르복시펩티다제, 트롬보스포딘 타입 I 모티브를 갖는 디스인테그린-같은 및 메탈로프로타아제 도메인(리프롤리신-타입)(ADAMTS), 디스인테그린 및 메탈로프로테아제 도메인(ADAM), 시스테인 아스파라타제, 아스르트산 프로테이나제, 매트릭스 메탈로프로테나아제(MMP), RNA-의존-RNA 폴리머라제, N-터미날 뉴클레오파일(Ntn) 가수분해효소, 4-옥살로크로토네이트 타우토머라제, 코리스메이트 합성효소, β-락탐 아크릴라제, 역 전사제, 포스포리파아제, 전사인자, 또는 그것이 결합 또는 신호기능적 단편과 같은 효소를 포함하는 신호 생성 구조물을 포함하는 제2 폴리머로 실시될 수 있다. 다른 예는, 제2 폴리머는 바이러스성 역전사제, 시그마 전사요소, 글루타민 포스포리보실피로포스페이트(PRPP)아미도트란스퍼라제(GPATase), 응집 인자 Xa, 3Dpol RNA-의존 RNA 폴리머라제, 글루타민 5-포스포리보실-1-피로포스페이트 아미도트란스퍼라제, 페니실린 아크릴라제, 역전사제, 코리스메이트 합성효소, 트립타제, 키마아제, 엔테로키나아제, 전사인자 σ^κ, 트롬빈, 디펩티딜 펩티다아제, HtrA2, 뉴로피신, 바소프레신, 퓨린, 카르복실펩티다아제 B, 카르복실펩티다아제 Y, vWF-분할 프로테아제/ADAMTS13, ADAM1, ADAM2, 카스파제, 펩신, 렌닌, 카테프신 D, Mason-Pfizer 원숭이 바이러스 프로테나아제, MMP20, MMp26, 글리코실아스파라기나아제, 20S 프로테아솜β 서브유니트, 글루타민 PRPP 아미도트란스퍼라제, YdcE, YwhB, 세팔로스포린 아실라제, CaMV 리버스 트란스크립타제, 포스포리파아제 A₂, 또는 그들의 결합 및 신호 기능적 단편을 포함한다.

본 발명의 방법은 또한 융합 단백질을 제공하는 수단으로서 그것의 발현에 효과적인 조건하에서 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 더욱 발현하는 것으로 실시될 수 있다. 이와 같은 뉴클레오티드는 원핵세포 뿐 아니라 진핵세포에서 또는 조직 또는 그것의 추출물에서 발현될 수 있다. 이 형태로, 이와 같은 얻은 융합 단백질은 분리될 수 있고, 임의로 효소 검사 전에 정제될 수 있다. 더우기, 본 방법은 추가로 단백질 분해 효소 활성 변환기를 포함하는 것으로 추측되는 샘플의 존재하에 접촉, 검출 및 확립을 반복하고, 샘플의 부재하에 얻은 상응하는 효소 활성 신호에 대한 샘플의 신호를 참조로, 진핵 효소 활성에 대한 샘플의 효과에 대한 값을 측정하는 것을 포함한다. 통상적으로 검사를 겪은 샘플은 생리적 유체, 조직 샘플, 세포, 세포 분획 또는 추출물 또는 그것의 분획을 포함한다. 분명히, 하나 이상의 단계가 인 비트로, 인 비보, 엑스 비보, 세포 내 또는 조직 배양물 내, 또는 세포 또는 반응의 조직 추출물 상에서, 그들 중에서 실시될 수 있다. 비록 다양한 신호 및 검출방법이 적용되지만, 일반적인 것은 세포성장 검출, 발색성, 방사성, 형광성, 인광성 또는 화학발광 신호의 사용이다. 접촉 검출, 확립 및 검출 단계는 단백질 분해 효소에 대한 샘플의 효과를 얻기 위한 단백질 분해 효소 활성 변환기를 포함하는 것으로 추측되는 다수의 샘플에 대해 개별적으로 실시될 수 있고 상기 방법은 자동화될 수 있다. 후자의 경우, 각 샘플과 대조군으로부터 얻은 정보의 수집, 처리 및 보고는 컴퓨터처리 된다. 미국 가출원 60/580,900 및 WO 03/057174 A2 및 WO 2005/003313 A2의 내용은 본 출원에 소스, 제조방법, 예 및 다른 조건 및 생성물의 가능함에 대한 적당한 요소들, 본 발명에 적용되는 그들의 부분 및 방법을 제공하기 위해 본 발명에 병합된다.

상기와 같이, 본 발명의 방법은 식물 또는 동물 모델에서 단백질 분해 효소, 변환기 및 다른 인 비보 조절자의 존재 또는 다양성을 평가하는데 적용될 수 있다. 이 목적을 위해, 본 발명자들은 세포, 식물 또는 동물의 염색체에 임의로 병합될 수 있는 유비퀴틴- 또는 UBL-리포터 융합 유전자를 포함하는 유전자 세포, 식물 또는 동물을 고안하였다. 다른 구현예에서, 융합 폴리뉴클레오티드는 상기 특성을 갖는 유비퀴틴 또는 UBL의 C-터미날 단편을 암호화하는 폴리뉴클레인산을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 "스위치 및 센서" 모드는 이 면에 병합될 수 있다. 병합 유전자는 본 발명의 다른 것에 기재된 바에 따라 또는 본 분야에 알려진 여러 방법에 따라 구성될 수 있다. Sambrook, et al(1989) 참조. 이것은 이 후 벡터, 예를 들면 플라즈미드에 클론되고 그리고 세포, 식물 또는 동물로 트란스펙션된다. 본 발명은 또한 단백질 분해 효소 활성을 평가하는 키트를 제공하고, 상기 키트는 그 기본 골격 형태에서,

유비퀴틴 또는 유비퀴틴-같은 단백질(UBL) 또는 그것의 C-터미날 단편을 포함하는 제1 폴리머와 검출을 위해 프리 N-아미노산 터미날을 요구하는 폴리펩티드를 포함하는 제2 폴리머를 포함하는 융합 폴리머; 여기서 상기 제1 및 제2 폴리머는 유비퀴틴 또는 유비퀴틴 C-터미날 및 제2 폴리머 N-터미날을 통해 서로 기능적으로 연결되고; 그리고

단백질 분해 효소 검사의 수행, 제1 및/또는 제2 폴리머의 양 및 활성과 관련된 신호의 검출, 및 효소의 단백질 분해 활성과 검출된 신호의 상관관계의 확립을 위한 지침을 포함한다.

키트는 임의로 UBL C-터미날에서 분할되는 단백질 분해 효소의 소스를 포함할 수 있고 또는 상기 효소는 개별적으로 구입할 수 있다. 유사하기는, 키트의 다른 특성은 본 발명의 검사를 수행하기 위한 플라스틱 제품, 시약, 등의 병합물일 수 있다. 키트는 추가로 하나 이상의

제1 및 제2 결합 파트너, 여기서 제1 파트너는 기능적으로 UBL N-터미날 단편에 연결될 수 있고, 여기서 제1 및 제2 결합 파트너가 서로에 결합된다면, UBL-C 터미날 단편은 UBL 배열을 확립하는 UBL N-터미날 단편에 결합하고, 단백질 분해 효소는 융합 폴리머로 분할되고;

효소 분할 단계를 실시하기 위한 시약;

검출단계를 실시하기 위한 수단; 및

검출 신호를 단백질 분해 효소 활성과 그들의 변화와의 상관관계를 얻기 위한 수단을 포함한다.

이 형태의 키트에서, 융합 폴리머는 통상적으로 융합 단백질, 또는 선택적으로 융합 단백질을 암호화하는 융합 폴리뉴클레오티드, 및 임의로 폴리뉴클레오티드 및/또는 융합 단백질 대신에 적용될 때 뉴클레오티드를 발현하기 위한 그들의 세포 또는 분획 또는 추출물을 발현하는 하나 이상의 약제를 포함한다. 키트의 더욱 완전한 형태는 다수의 샘플을 개별적으로 함유하는 수단, 및 자동적으로 분석을 수행하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 이 형태에서, 키트는 각 샘플에 대한 자료의 자동적 처리를 위한 수단 및 그것의 사용에 대한 지침을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 적용은 화합물은 단백질분해 활성에 대한 그들의 효과에 대하여 스크리닝하는 방법으로, 상기 방법은

유비퀴틴 또는 유비퀴틴-같은 단백질(UBL) 또는 그것의 결합 기능적 C-터미날 단편을 포함하는 제1 폴리머와 프리 N-터미날 아미노산을 포함하는 제2 폴리머를 포함하는 융합단백질을 얻고; 여기서 제1 및 제2 폴리머는 N-C-터미날을 통해 서로에 대해 기능적으로 결합되고;

분할이 일어나기에 효과적인 조건하에서 융합 단백질을 UBL C-터미날 분할 단백질 분해 효소와 접촉시키고;

100% 분할 신호를 얻기 위해 분할의 양과 관련된 신호를 검출하고;

0% 분할 신호를 얻기 위해 단백질 분해 효소의 완전 억제제의 존재하에 접촉 및 검출 단계를 반복하고;

화합물의 세트를 얻고;

각 화합물의 존재하에 분할 신호를 얻기 위해 융합 단백질을 얻고, 접촉시키고 및 검출하는 단계를 개별적으로 반복하고;

0% 및 100% 분할 신호를 참조로 하여 각 화합물 분할 신호를 표준화하고 단백질 분해 효소 활성치를 각 화합물에 할당하는 것을 포함한다.

상기 방법은 0% 및 100% 분할 신호 대신 0-포인트 분할 대조신호를 얻기 위해 알려진 단백질 분해 효소 활성 모듈레이터로 접촉 및 검출단계를 수행하고;

모듈레이터의 부재하에 얻어진 상응하는 효소 활성치를 참조로 모듈레이터에 대한 단백질 분해 효소 활성치를 측정하고; 그리고

대조 분할 신호를 참조로 각 화합물의 분할 신호를 표준화하고 각 화합물에 대해 단백질 분해 활성치를 할당하는 것으로 수행될 수 있다.

통상적으로 이와 같은 모듈레이터는 단백질 분해 효소 활성자 또는 억제제를 포함할 수 있다. 본 방법의 형태에서, 하나 이상의 단계는 인 비트로, 인 비보, 엑스 비보, 세포 또는 조직 배양물 내, 세포 또는 조직 분획물 또는 추출물 상에서 수행될 수 있다. 검출을 위해 관찰되는 몇몇 계수들은 세포 성장, 발색성, 방사성, 형광, 인광 또는 화학발광 검출 신호를 포함한다.

본 발명의 한 구현예에서, 표준화 단계는 효소 활성 분할치의 곡선을 참조로 각 화합물 분할 신호를 표준화하고 각 화합물에 대해 단백질분해 효소 활성을 할당하는 것으로 수행될 수 있고; 여기서 얻어진 효소 활성이 컷-오프 값 미만이면 이것은 상기 화합물이 불활성이라고 말해지고, 컷-오프 값 이상이면 활성이라고 말해진다. 이 방법에서, 컷-오프 값는 50% 단백질 분해 효소 활성이 되도록 선택될 것이고, 화합물의 존재하에 효소 활성이 적어도 50% 감소되면, 이 화합물은 억제제로 불리우고, 효소 활성이 적어도 50% 강화되면, 이 화합물은 강화제로 불리운다. 또한, 본 발명은 억제제 및/또는 강화제로서 효소 활성 강화를 평가하기 위해, 효소 활성을 억제(IC50) 및/또는 강화(EC50)하는 화합물의 농도를 화합물의 IC₅₀ 및/또는 EC₅₀과 비교하여 50%까지 측정하는 것을 포함한다. 본 발명의 이 형태는 화합물의 라이브러리에 적용될 수 있고, 및 서로에 대하여 화합물의 상대적 강도를 평가하기 위해 모든 IC₅₀ 및/또는 EC₅₀가 비교될 수 있다.

상기와 같이, 일반적으로 제1 폴리머는 유비퀴틴, SUMO, Nedd8, ISG15, Apg8, Apg12, FAT10, Urm1, Hub, ubi, Rub1, Isg15, 또는 그것의 α-나선 1과 β-스트랜드 3이 C-터미날에 연결된 UBL-루프 내의 아미노산을 포함하는 결합 기능적 C-터미날 단편을 포함한다. 후자는 특히 본 발명의 "스위치와 센서" 모드에 특히 유용하고, 단백질의 N-터미날 단편에 적용되고, 이것은 통상적으로 결합 쌍의 하나에 결합할 수 있고, 결합 쌍의 두번째 멤버는 본 발명의 다른 곳에 기재된 바와 같이 서로에 대한 쌍 부재의 결합 후에 상응하는 C-터미날 단편에 결합하기 위한 N-터미날 단편의 방출을 용이하게 하는 공동활성화제에 결합할 수 있다. 본 발명의 방법의 이 형태에 참여하기 위한 남은 요소는 상기와 같고, 이 특정 적용을 위해 반복될 필요가 없다.

이 형태에서 본 방법은 추가로 그것의 α-나선 1 및 β-쌍 3을 그것의 N-말단으로 연결하는 UBL의 루프 내의 아미노산을 포함하는 결합 기능적 N-말단 UBL 구역을 포함하고, 여기서 N-말단 구연 및 C-말단 구역이 다른 것으로 결합될 때 이들은 완전한 UBL, 및 제 1 및 제 2 결합 쌍의 하나와 유효하게 연결되고, 기재한 대로, 제 2 결합 쌍을 얻는 UBL N-말단 구역을 형성하고; 여기서 융합 폴리머, 즉 단백질은 전형적으로 제 1 및 제 2 결합 쌍의 결합 상에서, 공동-활성화제의 보조 여부에 관계없이 분열된다. 상기 기재한 것처럼, 이러한 형태의 분석은 또한 인 시추(in situ)에서, 융합 폴레뉴클레오티드로 형질 전환된 원핵 또는 진핵세포에서 또는 유전자 이식 식물 또는 동물 모델에서 그것을 부호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 융합 단백질을 얻는 것에 의해 수행될 것이다. 따라서, 얻어진 융합 단백질은 단리될 것이고, 임의로 정화될 것이다. 본 발명의 이러한 형태는 또한 자동화될 것이고, 수집, 공정 및 각각의 조정자 및 대조군을 위해 얻어진 정보 상에서 만들어진 보고는 시판되는 적절한 소프트웨어를 이용하여 컴퓨터화된 형태에서 수행되고, 또는 주요한 복잡성 없이 고안될 것이다.

상기 기재된 본 방법은 단백질 가수 분해성 효소 활성 조정 스크리닝 키트의 도움으로 수행되고,

유비퀴틴 또는 유비퀴틴과-같은 단백질 (UBL) 또는 그것의 C-말단 구역을 포함하는 제 1 폴리머 및 검출을 위한 유리 N-아미노 산 말단을 요구하는 폴리펩티드를 포함하는 제 2 폴리머를 포함하는 융합 폴리머; 여기서 제 1 및 제 2 폴리머는 유비퀴틴 또는 UBL C- 말단 및 제 2 폴리머 N-말단을 통해 다른것으로 유효하게 연결되고; 및

단백질 가수 분해성 효소 분석의 수행, 제 1 및/또는 제 2 폴리머의 양 또는 활성과 관련된 신호의 검출, 및 다수의 조정자 및 대조군에서 검출된 신호 대 효소의 단백질 가수 분해성 활성의 비교를 확립하기 위한 지시; 및

유비퀴틴 또는 UBL C-말단에서 분열되는 단백질 가수 분해성 효소를 임의로 포함할 것이다.

이러한 형태의 키트는 또한 제 1 쌍은 UBL N-말단 구역으로 유효하게 연결될 것이고, 제 1 및 제 2 결합 쌍들이 다른 것에 결합할 때 UBL C-말단 구역은 UBL 배열, 단백질 가수 분해성 폴리머는 융합 폴리머의 분열을 가능하게 하는 UBL N-말단 구역으로 연결되는, 하나 이상의 제 1 및 제 2 결합 쌍; 융합 폴리머의 UBL C-말단 효소 분열을 수행하기 위한 시약; 제 1 및/또는 제 2 분열된 폴리머에 의해 방출된 신호(들)을 검출하기 위한 수단; 및 단백질 가수 분해성 효소 활성 또는 대조군의 결합에 의한 그것의 변화의 검출가능한 신호의 비교를 위한 수단을 제공할 것이다. 키트의 바람직한 형태는 융합 폴리머, 또는 융합 단백질과 그것을 부호화하는 융합 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 키트는 융합 폴리머, 및 임의로 폴리뉴클레오티드 발현을 위한 하나 이상의 시약, 및/또는 융합 단백질 대신에, 사용될 때 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위한 세포(들) 또는 그것의 부분 또는 추출물로 치환된다. 특히 중요한 형태의 키트는 또한 다수의 시료를 개별적으로 포함하는 방법, 및 분석을 자동화적으로 수행하기 위한 지시와 병합되고, 또한 각각의 시료를 위한 데이터의 자동화적 처리를 위한 방법; 및 그것의 사용을 위한 지시를 포함할 것이다.

유전자 이식 세포, 식물 또는 동물은 또한 임의로 세포, 식물 또는 동물의 염색체로 통합될 유비퀴틴- 또는 UBL-리포터 융합 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 여기서 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-특이적 단백질 가수 분해성 효소, 즉 이소펩티다제 (isopeptidase)는 특이 질병 또는 질병 또는 그것의 군과 관련되는 것인 본 특허에 의해 제공된다. 유전자 이식 세포, 식물 또는 동물은 전형적으로 특이 질병 또는 질병 또는 그것의 군과 관련된 유비퀴틴- 또는 UBL-리포터 융합 단밸질을 발현할 수 있다. 그것은 혼성 벡터의 형성에 의해, 융합 폴리뉴클레오티드를 벡터로 복제하고 세포, 식물 또는 동물을 혼성 벡터로 트랜스팩트함에 의해 얻어질 것이다. 하나의 바람직한 구현예에서 벡터는 플라스미드를 포함하고, 그리고 세포는 진핵 세포를 포함한다. 그러나, 다른 벡터 및 세포의 종류는 또한 적절한, 원핵 세포를 포함한다. 본 발명의 유전자 이식 세포, 식물 또는 동물은 더욱이 질병 또는 질병을 위한 세포, 식물 또는 동물 모델로서 제공되기 위해 변형될 것이다. 특별한 구현예에서 특이 질병 또는 유비퀴틴 또는 UBL-이소펩티다제 질병을 진단하기에 적절한 것은 자가-면역성, 종양성, 신진대사성, 혈관내, 신경퇴행성 또는 다른 유전자적 질환 또는 질병과 관련된다. 신호를 생산하기 위한 알려진 또는 특이적 유비퀴틴 또는 UBL-특이적 이소펩티다제와 상호 작용하도록 결정되어질 다른 모든 질환들은 또한 본 출원에 포함된다. 질환 및 질병의 특별한 예는 암, 예를 들면, 및 루푸스 (lupus), 당뇨병, IBD, 파킨슨씨 및 심장 혈관성 질환 뿐 아니라 혈관모세포종 (Hemangioblastomas), 크롬 친화 세포종 (Pheochromocytomas), 및 낭샘종 (cystadenoma)과 같은 다수의 암을 유발하는 본 히펠-린다우 질환 (Von Hippel-Lindau disease)과 관련된 암, 유방암, 전립선암이다. 질환과 관련한 이소펩티다제/비-유비키틴화 효소는 다음을 포함한다:

VDU1 /2 및 암

본 히펠-린다우 질환은 VHL 유전자의 생식세포 돌연변이에 의해 유발된 유전성 암 증후군이다. Slims (2001)를 참조하라. 그것은 CNS 및 망막에서 혈관 모세포종, 투명 세포 신장 암종, 부신의 크롬 친화 세포종, 췌장 종양, 부고환의 낭샘종, 및 속귀의 종양을 포함하는 다양한 종양의 질환을 유발한다. Li et al (2002);Maher and Kaelin을 참조하라. VHL 단백질 (p VHL) 은 유비퀴틴 E3 연결효소로서 작용하는, 복합체, VCB-CUl2를 형성하기 위한 엘론긴 C, 엘론긴 B 및 쿨린-2와 관련된다. 변이된 pVHL이 악성으로 연관되기 때문에, 연결효소는 종양 억제제 및 그것의 기질 내부적 발암성 분자로 고려될 수 있다. VCB-CUL2의 기질로 알려진 저산소-유발 인자 (HIF-α)는 VEGF 유도를 통해 혈관 모세포종의 발생, 및 전신에서 종양 혈관 형성을 한다. Ohh el al (2000); Tyres et al (1999) and Benjamin et al (1997)을 참조하라. 또한 pVHL과 상호 작용하기 위해 스크리닝하는 효모 2에 의해 발견된 그것의 기질 중에서 유비퀴틴 이소펩티다제, VDU1이다. 높은 상동의 프로테아제, VDU2는 또한 비록 그것이 pVHL 관련성의 관점에서 연구되지는 않았지만, VDU2는 VDU1과 공통으로 생리학적 기질을 갖는다고 알려져 있다. Curcio-Morelli et al (2003)를 참조하라. 자연적으로 변이가 일어나는 곳인 p-VHL의 β-영역 구역은 VDU1 상호작용의 좌위이고, 그리고 VDU1은 VCB-CUL1 복합체에서 공동-면역침전될 것이다. 유비퀴틴화 및 pVHl-종속 경로에 의한 VDU1의 분해는 VDU1과의 상호작용을 붕괴시키는 VHL 변이에 의해 폐기된다. 따라서, pVHL에 의한 VDU1의 지정된 분해는 종양 형성의 억제 및/또는 유지에 중요하고, 그리고 VDU1은 기능적 연결효소의 부재에서 노출된 발암 활성을 갖을 것이다. 따라서, VDU1은 변이된 pVHL (VHL 질환 (상염색체 우성)을 갖는 환자의 100%), 및 산발성 신장 투명 세포 암종의 환자 다수의 50 내지 80%를 특징으로 하는 종양성 질환에서 중요하다. 예를 들어, Stolle et al (1998); Gnarra et al (1994)를 참조하라. VDU1의 억제는 야생형 종양 억제제 pVHL의 활성과 기능적으로 흡사하다.

USP7 , USP2a 및 암

비-유비퀴틴화 효소는 특정 단백질을 예비로 하고, 또는 적어도 초기의 유비퀴틴 태그를 제거하여, 단백질 분해 효소성 분해를 예방하여 그들의 세포의 생존 주기를 연장시키기 위해 제공될 것이다. 그러한 이소펩티다제, 또한 HAUSP로 알려진 USP7는 종양 억제제 p53을 안정화하는 것으로 알려져 있다. Li et al (2002)를 참조하라. 다른 이소펩티다아제, USP2a는 지방산 신타아제 (FAS)의 조절, 전립성 암의 분자 서명과 관련된다. Rossi et al (2003); Agostini et al (2004); Graner et al (2004)를 참조하라. USP2a는 안드로겐-조절되었고 그리고 전립선암에서 과-발현되었고, 그리고 따라서 발암성 단백질이다. 따라서, 그들의 기질의 역할에 따라, 비-유비퀴틴화제 효소는 활성화되거나 또는 치료적 효과를 달성하기 위해 억제될 수 있다.

이소펩티다제 T 및 심장혈관 질환

비-유비퀴틴화 효소 이소펩티다제 T는 다양한 심장 결합을 포함하는 염색체 22q11 결실 증후군을 갖는 환자에서 하향 조절된다. Yamagishi et al (1999)를 참조하라. UFD1과 함께, 이소펩티다제 T는 심부전 환자의 근육세포에서 하향-조절된다. Korstin et al (2003)을 참조하라. 이 이소펩티다제는 유비퀴틴-단백질 결합으로부터 폴리유비퀴틴 사슬을 제거하고 그리고 단백질 분해를 자극하는 것으로 알려져 있고, 그리고 그것의 부재는 폴리유비퀴틴화된 단백질에서의 축적 및 유비퀴틴-단백질 분해 효소성 분해 경로의 분열을 생성하고, 자가 탐식 세포의 사멸을 초래한다. Hadari et al (1992); Johnson et al (1995); Stefanis et al (2001)을 참조하라.

JAMM 모티프 이소펩티다제 AMSH 및 폐질환 및 폐암

단백질 함유-JAMM 영역은 적혈구 내 분류, 즉 EGF 수용체의 세포막 및 적혈구 내/리소솜 내 구획 사이의 단백질의 번역 후의 변형과 관련된 신호 형질 도입과 연결된다. 이 단백질은, AMSH (STAM의 SH3-영역과 관련된 분자, 엔도솜에서 리포터 분류를 조절하는 단백질)이다. McCullough et al (2004); Clague and Urbe (2001)을 참조하라. EGFR은 신호 형질 도입 연쇄 반응을 초기화하여 다수의 세포성 기능을 조절한다. Lockhart and Berlin (2005); von Ahsen and Bomer (2005); Le Roy and Wrana (2005); Spano et al (2005)를 참조하라. EGFR의 세포 생존 주기 동안에, 그것은 그것이 산 프로테아제에 의해 분해되는, 후기의 엔도솜 및 리소좀까지 분류되기 위해 최후에 선택되기 전에, 세포막에서 초기 (분류) 엔도솜까지 재생한다. EGFR은 세포막에서 그리고 초기의 엔도솜 구획 둘 다에서 신호적 형질 도입에 관여한다. 다수의 신호화가 세포 성장 및 다른 기능의 조절하는 동안에, 신호적 형질 도입의 한 성분은 EGFR 그것의 번역 후 변형을 조절한다. E3 연결 효소 Cb1은 인산화된 EGPR의 유비퀴틴화를 매개한다. 그 후의 신호화는 후기의 엔도솜/리소좀의 수용체의 분해를 생성한다. Ub-EGFR은 EGFR이 리소좀에서 프로테아제 분해를 행하는 적혈구 내 표면에서 단백질 Hrs, 및 다중-소포체 (MVB)의 내부 소포로의 형질 도입을 생성하는 유비퀴틴에 의해 매개되는, 전달을 요구하는 적혈구 내-관련된 복합물 (ESCTRT)와의 추가적 상호 작용에 의해 인정된다. EGFR의 Cb1 매개된 유비퀴틴화의 마지막 결과인 분해는, 유비퀴틴 이소펩티다제, AMSH에 의해 폐기될 것이고, 즉, 세포와 SiRNA의 배양에 의해 AMSH의 활성의 제거는 증가된 EGFR 분해를 이끌고; 정제된 AMSH는 인 비트로(in vitro)에서 EGFR-Ub를 비-유비퀴틴화한다. McCullough et al (2004), Ciardiello and Tortora (2001); LoRusso et al (2003)를 참조하라. 기관지 천식과 관련된 기도염증 및 점액 과다 분비의, 중요한 필요성이 요구되지 않는 다른 질환 영역은 또한 FGFR 활성과 관련된다. 천식이 다인자성 질환인 동안에, 백혈구 침윤과 관련된 기관지 상피의 손상 및 증가된 기도 대응성은 일관된 특징이다. Puddicombe et al (2000)을 참조하라. EFGR 시스템은 폐에서 상피 및 결합 조직 세포의 성장 및 분화에 중요한 역할을 하도록 요구되어 왔다. EGFR 및 그것의 리간드들은 천식의 발명 동안에 증가되고, 이 시스템의 유도는 천식 기도에서 술잔 세포의 증식과 관련된다. Takeyama et al (2001)을 참조하라. 초기의 상피 세포 손상의 어떠한 시도된 복구는 EGFR 및 EGFR 활성에 연결되는 반응의 과다 증식 및 분화를 초래한다. Bonner (2002)를 참조하라. 천식은 손상되지 않은 상피에서도 만성적인 높은 수준의 EGFR을 발전시키는 것으로 나타난다. 이것은 일정한 염증 질병을 유지하고, 그리고 기도 폐쇄, 천식에서 이환율 및 치사율, COPD, 및 다른 폐 질환과 관련된 섬유화 및 점액 과다 분비를 초래한다.

UCHL1 및 파킨슨씨 병

UCHL1, 또는 유비퀴틴 카르복시 말단 가수 분해 효소는, 유전적으로 파킨슨씨 병과 관련된다. Chung et al (2003); Toda et al (2003); Maraganore et al (2004)를 참조하라. UCHL1에서의 변이는 유비퀴틴 단백질 분해 효소성 경로에서 교란은 PD의 도파민 뉴런의 사멸에서 중요한 역할을 한다는 일관된 견지에서, 상염색체 우성 PD를 유발한다. 다른 단백질 분해 효소는 종래 기술에서 알려진 다른 질환과 관련된다. 다양한 예는 하기에 나타낸 표 3에서 포함된다.

표 3 : 생리학, 질환 & 효소 생리학과 관련된 비- 유비퀴틴화 효소

USP2a	전립선 암
Ap-UCH	아플리시아(Aplysia)에서 장-기 기억에 필수적임
BAP1	종양 억제제 (BRCA1과 관련됨)
CYLD1	종양 억제제
DUB-1	시토카인-유발, B-세포 선택적
DUB-2	시토카인-유발, T-세포 선택적
D-ubp-64E	위치-효과 다양성의 초파리 억제제
FAF (지방 단면)	초파리 눈 발달
FAM	예비-재이식 마우스 배아 발달
HAUSP (US97)	종양 억제제 (p53 안정화)
Tre-2 (USP6)	종양 단백질
Ubp3	효모에서 전사 침묵의 억제제
UBP41	아포토시스, 뼈 형성
UBP43	IFN 신호화, 조혈작용에서의 음성적 조절제
UBP45	근육발생
UBP69	근육발생
UbpB (딕티오스테리움)	발달적 타이밍 및 공간적 양식
UBP-M (USP16)	세포 주기 조절 (염색질 응축)
UBPY	세포 주기/세포 성장
USP14 (아탁시아)	시냅스 기능
UCH-L1 (PGP9.5)	파킨슨씨 병, 널판 축삭 퇴행
VDU1/VDU2	종양 발생 (본 히펠-린다우 단백질과 관련됨)

상기 기재된 본 발명의 혼성 세포, 식물 또는 동물은 다음을 포함하는 많은 방법에 의해 생산될 것이다

세포, 식물 또는 동물의 획득;

유비퀴틴-, UBL- 또는 그들의 C-말단 결합 기능적 단편-리포터 융합 폴리뉴클레오티드의 획득;

벡터에 유효하게 연결된 혼성 폴리뉴클레오티드를 전달하는 혼성 벡터의 획득; 및

혼성 벡터를 세포, 식물 또는 동물로 안정되게 트랜스펙션함.

하나의 구현예에서 융합 폴리뉴클레오티드는 세포, 식물 또는 동물의 염색체로 결합되고, 그리고 완전하게 안정화된다. 다른 구현예에서 융합 폴리뉴클레오티드는 융합 데옥시리보뉴클레오티드를 포함한다.

본 세포, 식물 및 동물은 예를 들어,

청구항 71에서, 리포터는 질환 또는 질병과 관련된 것인, 세포, 식물 또는 동물, 그것의 분율 및 조직의 획득;

세포, 식물 또는 동물과 질환 또는 질병으로 고통받는 것으로 의심되는 환자로부터 얻은 시료를 접촉 또는 투여;

시료의 존재에서 리포터에 의해 생성된 어떠한 신호의 검출; 및

신호와 대조군을 0% 내지 100%의 신호와 비교

의 질환 또는 질병을 진단하는데 수행될 것이다.

본 발명에서 일반적으로 기재되어온 것과, 동일한 것이, 그렇게 특정화되지 않았다면, 오직 설명의 목적을 위해 포함된 그리고 본 발명 또는 그것의 어떠한 구현예를 제한하기 위해 의도되지 않은, 특정한 실시예와 결합되어 더 잘 이해될 것이다.

하기의 실시예들은 본 발명을 설명하는 것이고 그리고 그것의 제한을 의도하지 않는다. 만약 나타내지 않았다면, 모든 비율은 최종 조성물의 100 중량%에 근거한다.

실시예 1 : 폴리오바이러스 프로테아제

하기의 실시예는 본 발명에 따른 바람직한 이소펩티다제 분석을 설명한다. 리포터 효소 RNA-종속 RNA 폴리머라제 (3D^pol)는 활성을 위해 유리 N-말단을 요구한 다. Gohara, et al (1999)를 참조하라. 폴리머라제는 그것에 의해 N-말단을 차단하는, Smt3와 융합되었다. 이 융합 단백질이 SUMO 이소펩티다아제 유리 3D^pol과 처리될 때, N-말단이 발생되었다. Ibid. Gohara, et al (1999). 융합 분열에 뒤이어, 3Dpol 활성은 하기에 언급된 것처럼 폴리머라제 분석을 사용하여 정량될 수 있다. 따라서, 폴리오바이러스 RNA-종속 RNA 폴리머라제의 이소펩티다제-매개된 분열은 인 비트로에서 폴리머라제 활성을 위해 요구되고, 그리고 폴리오바이러스 RdRp 활성은 이소펩티다제 활성의 대리 측정이다.

플라스미드 구조, 발현 및 정제

Smt3-3D^pol(Mahoney Strain) 융합은 Malakhov et al (2004, 7번)에 의해 기재된 그것과 유사한 방법으로 구성되었고, 발현되었고 그리고 정제되었다.

간단히, 폴리오바이러스 (Mahoney Strain)3D^pol유전자 구역은 pET24-6H-SUMO 벡터로 복제를 촉진하기 위해 5' 말단에서 BsaI 위치 및 3'말단에서 BamHI 위치를 병합하는 합성 프라이머를 사용하는 Gohara et al. (1999)에 의해 기재된 pET26b-Ub-3D-GSSG-6H 플라스미드로 이전에 기재된 것으로부터 증폭된 PCT이다. 프라이머의 서열은 다음과 같았다:

5'-GCAGGTCTCAAGGTGGTGAAATCCAGTGGATGAG-3'

5'-GCAGGATCCCTAGTGGTGGTGGTG-3'

최종 구조인, pET24-6H-SUMO-3Dpol의 구조는 DNA 서열화에 의해 입증되었다.

효모 ULP1 효소를 사용한 분열

C-말단 히스-태그된 SUMO 프로테아제 1, ULP1 (403-621)p는 Rosetta-(DE3)pLysS (Novagen)으로부터 발현되었고, Ni-NTA 레진에 의해 정제되었다. Li and Hochstrasser (1999) and Mossessova and Lima (2000)을 참조하라. UIp 및 분열 반응은 Malakhov et al. (2004, 7번)에 의해 기재된 것처럼 표준 조건 하에서 완료되었다. 반응은 종결되었고, 그리고 시료는 5분간 가열되었고, SDS-PAGE로 종속되었다. 활성은 SDS-PAGE에 의한 분열된 융합의 정량화에 의해 평가되었다. 얻어진 겔은 정량적으로 활성을 평가하기 위해 Scion Image Software를 사용하여 스캔되었다.

3 Dpol ( 폴리머라제 ) 활성 분석

3Dpol의 폴리머라제 활성 및 그것의 융합 유도체는 뉴클레오티드 병합 또는 프라이머 확대에 의해 분석되었다. Arnold and Cameron (1999)를 참조하라. 뉴클레오티드 병합 분석은 하기의 반응 혼합물과 라디오 뉴클레오티드로 수행되었다: 50mM HEPES pH 7.5, 10mM β-머캅토에탄올, 5mM MgCl₂, 60μM ZnCl₂, 500μM UTP, 0.4μCi/μL [α-³²P]UTP, 1.8μM dT15/0.15 μM폴리(rA)400프라이머/모형 및 3Dpol. 모든 반응은 30℃에서 5분간 정제된 3Dpol의 250ng을 사용하여 25μL의 총 부피에서 수행되었다. 반응은 0.5M EDTA의 첨가에 의해 냉각되고, 냉각된 반응의 10μL가 DE81 여과 종이 디스크 상에 점적되었고, 그리고 완전히 건조되었다. 그 후 디스크는 5% 이염기 소듐 포스페이트의 250mL로 10 분간 3 회 세척되었고 그리고 무수 에탄올로 수세되었다. 각각의 필터에 결합된 방사능은 섬광 유체의 5mL에 서 액체 섬광 분광에 의해 정량되었다. 프라이머 확대 반응은 3D 효소의 50mM HEPES pH 7.5, 10mM β-ME, 5mM MgCl₂, 500μM ATP, 1μM sym/sub-U, 0.14μg/μL, 및 +/-1μL ULP1 (25μL 총 반응 부피)를 함유한다.

ULP1 에 의한 인 비트로 분열

Smt3-3Dpol UIP-1 융합은 1, 2, 4, 10, 20, 30 및 60 분 동안 표준 조건 하에서 배양되었고, SDS-PAGE 및 Coomassie Blue 염색에 의해 확인된 것처럼 3Dpol의 분열의 100%를 생성한다. 3Dpol 활성은 상기 분석을 사용한 라디오 뉴클레오티드에 의해 분석되었다. 얻어진 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

표 4 : 라디오뉴클레오티드 병합 분석에서 3 D ^pol 활성

표 4에서 볼 수 있는 것처럼 상기 3Dpol 활성은 UIp1과의 융합의 공동배양에 의해 증가되었고 그리고 라디오 뉴클레오티드 분석을 수행하고 그리고 UIp1과의 융합과의 예비 배양에 의해 추가로 증가되고 그리고 라디오뉴클레오티드 병합 분석을 연이어 수행한다. 효모 UIp1 SUMO 프로테아제와 3Dpol 융합의 처리는 3Dpol을 활성 화하는 처리인 표 X로부터 명백하다.

실시예 2 : 글루타민 포스포리보실피로포스페이트 아미도트랜스퍼라제 ( GPATase )

이 실시예는 본 발명에 따른 GPATase를 수행하는 바람직한 이소펩티다제적 분석을 설명한다. 효소 글루타민 포스포리보실피로포스페이트 아미도트랜스퍼라제 (GPATase)는 퓨린 뉴클레오티드 생합성의 초기 단계를 촉진하고, 경로의 주요한 조절 효소이다. GPATase는 포스포리보실 아민, 피로포스페이트, 및 글루타민을 수득하는, 글루타민 아미드 니트로겐 (유리 NH3)를 포스포리보실피로포스페이트 (PRPP)로 전달한다. GPATase는 생합성 목적을 위한 글루타민의 아미드 니트로겐의 이용을 수반하는 16 글루타민 아미도 트랜스퍼라제의 군에 속한다. Zalkin (1993); Tso et al. (1982)를 참조하라. E.coli GPATase는 동일한 하위 구성단위로 만들어진 테트라머 또는 트리머의 형태일 것이고 그리고 조류, 포유류, 또는 고초균 GPATase와 달리 철을 함유하지 않는다. Mantsala and Zalkin (1976)을 참조하라. 활성 위치 시스테인이 촉매 기작의 중요한 단계인, 글루타민 아미드의 전이를 위해 요구된다. 이 시스테인은 또한 성숙 GPATase의 N-말단 잔류이기 때문에, 효소가 촉매 활성을 위한 유리 N-말단을 요구로 한다는 것이 명백하다. Tso et al (1982)를 참조하라. 반응은 하기 나타낸 것처럼 λ=363nm에서 NADH 반응 생성물의 흡착을 측정하여 GPATase 활성의 평가를 허용하는, NAD⁺ --> NADH 반응으로 커플링된다.

방법: Smt3 - GPATase 의 플라스미드 구조, 발현 및 정제

Smt3-GPATase 융합은 Malakhov et al (2004, 7번)에 의해 기재된 그것과 유사한 방법으로 구성되었고, 발현되었고 그리고 정제되었다. 글루타민 포스포 리보실 피로포스페이트 아미도트랜스퍼라제 (GPATase)를 부호화하는 E.coli purF 유전자는 하기의 합성 프라이머를 사용한 Bera et al., J.B.C.275, 7975-7979 (2000)에 의해 기재된 pETpurF 플라스미드를 수행하는 PCT-증폭되었다:

전방: 5'-GTCAGGTCTCAAGGTTGCGGTATTGTCGGTATCGT-3'

후방: 5'-GTCAGGATCCTCATCCTTCGTTATGCATTT-3'

이들 프라이머 서열은 pET24-6H-SUMO 벡터로 복제를 촉진하기 위해 5' 말단에서 BsaI 위치 및 purF 서열의 3'말단에서 BamHI 위치를 병합한다. 이 구조는 아미노산 위치 2에서 시스테인 잔류인, SUMO C-말단-Gly 아미노산 서열이 직접적으로 성숙 GPATase N-말단에 결합되는 융합 단백질의 반응에 직접적으로 고안되었다. 최종 구조인, pET24-6H-SUMO-GPATase는 DNA 서열화에 의해 입증되었다.

효모 ULP1 효소를 수행하는 SUMO - GPATase 의 분열

SUMO 단백질은 효모 ULP1 단백질 (SUMO 프로테아제 촉매적 영역)과의 처리에 의해 SUMO-GPATase로부터 분열되었다. 대략 5㎍의 SUMO-GPATase는 30℃에서 3 시간 동안 트리스-HCl pH 7.5, 1mM EDTA, 10 mM DTT를 함유하는 반응 혼합물에서 ULP1 효소의 증가하는 농도로 배양되었다. 반응은 SDS-PAGE 시료 버퍼의 첨가로 냉각되었고, 가열되었고, 그리고 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에 직접적으로 부하되었고, 전기이동화되었다. 전기 이동 후에, 겔은 단백질을 시각화하기 위해 유지되었다. SDS-PAGE 분석은 UIP1의 .009 단위만큼 작은 융합의 분열로 입증하였지만; 그 러나, 상기 분열은 78.3 유니트 만큼 많이 완전하게 달성되지는 못했다. 융합 단백질을 절단하기 위한 ULP1 효소의 이러한 불활성은 분열 위치 주위의 입체적 장애의 발생, 또는 결합 서열의 부분적 변형, 즉 GPATase의 아미노-말단에서 시스테인 잔류의 산화를 반영할 것이다.

인 비트로 GPATase 활성 검사

GPATase, 글루타미나제 효소는 5-포스포 리보실 피로포스페이트(PRPP) 생성 글루타민, 5-포스포 리보실-(b)1-아민(PRA), 및 피로포스페이트(PPi)를 가수분해한다. 이 글루타미나제 반응은 Messenger 및 Zalkin(1979)에 의하여 설명된 표준 반응 조건 하의 커플화 글루타메이트 디하이드로게나제(GDH) 검사에 의한 글루타메이트 생성을 측정하여 관찰되었다.

융합 단백질이 Ulp1과 함께 30분 동안 배양되고, 상기 반응액이 GDH 기질에 더해졌을 때, 교대로 GPATase 활성을 지시하는 활성 글루타메이트의 지표인 OD363 판독에서의 흡광도가 증가되었다. Ulp1이 없을 때, 이들 흡광도는 증가되지 않았다. 또한, Smt3-GPATase의 농도가 증가할 때, 융합은 증가에 따라 증가하였다.

하기의 추가 실험은 Ulp1-절단된 SUMO-GPATase와 미처리된 융합 단백질 사이의 이러한 차이를 더 정량화시키고 확고하게 하였다.

GPATase를 측정하기 위하여 사용된 커플화 GDH 검사가 정확성을 위하여 조사되었다. Ulp1 SUMO 프로테아제에 의하여 미처리되거나 절단되어 정제된 SUMO-GPATase 융합 단백질의 증가량이 정해진 기간 동안 글루타메이트와 PRPP의 존재하에서 배양된 다음 완료된 반응액이 GDH 검사에서 기질로 사용되었다. 이들 결과는 GPATase 효소 농도와 363에서의 GDH 반응 흡광도 판독 사이에 선형 관계가 있다는 것을 나타내었다. 이는 특히 1㎍ 또는 그 미만의 효소 농도에서 그렇다. 따라서, GDH 반응에서 감소된 NAD⁺의 양은 초기 반응에서의 활성 GPATase 효소의 양과 직접적으로 관련된다. 또한, 지금까지 SUMO-GPATase의 단지 부분적 절단만이 관찰되었다는 사실에도 불구하고, Ulp1으로의 처리는 GPATase의 글루타미나제 활성이 적어도 10배 증가하게 한다.

실시예 3 : 트립타아제 검사

하기의 실시예는 본 발명에 따라 제공되는 바람직한 이소펩티다제 검사를 설명한다. 트립타아제는 134kDa의 분자량을 갖는 중성 세린 프로테아제이다. 이 효소는 4개의 비공유 결합된 서브유니트로 이루어지고, 각 서브유니트는 하나의 활성 부위를 가진다. 이 군에는 서로 약 90%의 서열 동일성을 갖는 α-트립타아제와 β-트립타아제라는 주로 두 개의 성분이 있다. 트립타아제는 불활성 전구체로서 합성되고 다른 단백질 분해효소와 함께 활성 효소로서 분비 과립에 저장된다. 또한, α-프로트립타아제로 명명된 본질적으로 발현되어 분비되는 형태도 있다. β-트립타아제의 활성은 두 개의 단백질 분해 공정이며, 이로 인하여 초기 절단은 요구되는 테트라머의 형성을 억제하는 N-터미날에서 디펩티드와 함께 형성되는 모노머를 유발하는 자가촉매적 분자간 절단이다. 그것이 성숙한 트립타아제 구조가 형성될 수 있고, 활성을 50배 증가시키는 N-터미날로부터 디-펩티드를 절단하기 위한 디펩티딜 펩티다아제 I의 역할이다.

곤충 세포내의 트립타아제 유전자 융합의 발현

재조합 인간 트립타아제는 O'Reilly(1992)에 의하여 설명된 바쿨로바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus(AcNPV)) 곤충 세포(Spodoptera frugiperda(Sf9))계에서 발현되었다. cDNA 코드 인간 트립타아제는 N-터미날에서 6개의 히스티딘 잔기(6×His)를 운반하는 유비퀴틴(Ub) 또는 SUMO 중 하나를 코드하는 서열의 3' 단부에서 골격내로 융합되었다. 그 다음 이 하이브리드 유전자는 바쿨로바이러스 분비된 외피 당단백질(envelope glycoprotein) gp67을 위한 시그날 서열의 바로 하류에 삽입되었다. 이 유전자 융합체의 발현은 폴리헤드린 p10이나 기본 단백질 AcNPV 유전자 프로모터에 의하여 조절되었다. 바쿨로바이러스 전달 벡터로의 이 유전자 융합체를 클로닝한 다음, 재조합 플라즈미드 운반 Ub/UBL-트립타아제 구조물이 곤충 세포 내로 AcNPV 바쿨로바이러스 DNA와 함께 트란스펙션되었다. 수일 후, 전달 벡터와 AcNPV 디옥시리보핵산(DNA)의 상동성 재조합에 의하여 발생된 재조합 바이러스가 선별되어, 플라크 정제되고 증식되었다.

정제된 재조합 바쿨로바이러스로 감염된 곤충세포는 배양액 1리터당 융합 단백질의 밀리그램 양을 제조할 수 있다. Ub/SUMO-트립타아제 단백질이 gp67 시그날 서열없는 인택트(intact) 융합 단백질로서 상기 배양액으로 분비되었다. N-터미날 6×His 태그의 존재가 SDS-PAGE에 의하여 확인된 크기와 Ni-NTA 아가로즈(금속 친화성 크로마토그래피) 상의 단백질의 이어지는 정제를 용이하게 하였다. 적절한 이소펩티다아제로의 절단시, 적절한 드롭아웃(dropout) 밴드가 생겼다.

트립타아제 효소적 활성 검사

인간 트립타아제의 활성이 발색성 또는 형광성 효소 검사, 또는 이들 양자를 모두 사용하여 측정되었다. 정제된 융합 단백질이 트립타아제를 활성화하는 적절한 UBL 가수분해효소/프로테아제에 의하여 절단되었다. 트립타아제 활성은 410nm에서의 흡광도 변화의 측정에 의하여 가수분해가 관찰되는, 펩티드 발색성 기질을 사용하여 검사되었다. Schechter et al.(1998) 참조. Ulp1으로 정제된 Smt3-트립타아제를 절단할 때, 증가된 트립타아제 활성이 Schechter와 그의 동료의 프로토콜에 따라 관찰되었다. 이소펩티다아제에 의한 절단에 앞서, 유비퀴틴-트립타아제나 SUMO-트립타아제 어느 것도 트립타아제 활성을 가지지 않았다. 이소펩티다아제에 의한 절단 시에만 본 발명자들은 트립타아제 활성을 보았다. 따라서, 트립타아제 융합은 이소펩티다아제 활성을 동정하는 유용한 도구이다.

실시예 4 : 포스포리파아제 A ₂ 검사

하기의 실시예는 포스포리파아제 A₂를 사용하는 본 발명에 따른 검사의 바람직한 형태를 설명한다. 포스포리파아제는 뱀독에서 처음 동정된 효소의 군이며, 후에 상위 유기체까지 보존되는 것으로 발견되었다. 포스포리파아제는 그들의 크기, 발현 패턴, 및 공동-인자에의 의존성에 따라 하위군으로 분류된다. 분비된 포스포리파아제 A₂(sPLA₂) 효소 하위군은 시토졸릭, 세포내 성분 및 Ca² ⁺-비의존성 PLA₂ 이소형태와 같은 PLA₂ 하위그룹과는 이들이 촉매 분해를 위하여 Ca² ⁺의 밀리몰 농도를 요구하는 디설파이드 풍부 14-16kDa 단백질이라는 점에서 구별될 수 있다. Gelb(1995) 참조. 포유류 시스템에는, IB, ⅡA, ⅡC, ⅡD, ⅡE, ⅡF, Ⅲ, Ⅴ, Ⅹ, ⅩⅡA, 및 ⅩⅡB와 같은 과량의 11개 sPLA₂ 효소가 있다. sPLA₂는 다른 극성 헤드기와 지방산 사슬을 갖는 인지질에 대한 광범위한 특이성을 가진다. sPLA₂군의 효소는 유리 지방산과 리소포스포리피드를 제공하는 SN-2 부위에서 포스포리피드 절단을 촉진한다. Dennis(1994) 참조.

sPLA₂ 효소는 촉매적으로 불활성인 프로효소로서 생성된다. Dijkstra(1981) 참조. 트립신과 같은 프로테아제를 가공하여 분비 및 절단될 때, N-터미날 프로펩티드는 원하는 N-터미날을 가지는 활성 효소를 생산하도록 절단된다. Cupillard(1997) 참조. 그것이 수소 결합과 계면 결합에 포함되기 때문에 촉매적 활성에 요구되는 유리 N-터미날이다. Dijkstra(1984); Yuan(1999); Grataroli et al.(1982) 참조.

유비퀴틴 / UBL - PLA ₂ mX 플라즈미드 구축

대장균 내 발현을 위한 모든 플라즈미드 구조물은 pET24d(+) 발현 벡터(Novagen)에서 유래되었다. 유비퀴틴/UBL-융합 발현 벡터는 Malakov et al(2004)에 의하여 설명된 바에 따라 구축되었다. 마우스 그룹 X PLA₂가 전체 PLA₂ 효소 그룹을 위한 예로 선택되었다. 융합 구조물은 가공된 활성 그룹 X PLA₂ 효소 형태만을 증식시키는 디자인 프라이머를 갖는 쥐과 PLA₂ 그룹 X 유전자의 PCR 증폭법에 의하여 만들어졌다. 독특한 BsaI과 BamHI 제한 부위가 각각 5'과 3' 프라이머 내에 포 함되었다. 이는 유비퀴틴/UBL 유전자의 삽입 하류, 및 이로 인한 융합 단백질의 인 플레임 번역을 허용하였다. 이 프라이머들은 다음과 같았다.

포워드: 5'-GATCGGTCTCAAGGTGGACTCCTGGAGCTGGCAGGG-3'

리버스: 5'-GATCGGATCCTCAATTGCACTTGGGAGAGTC-3'

결국, 유비퀴틴/UBL-PLA₂mX, (효모 SUMO) Smt3-PLA₂mX, 인간 SUMO3-PLA₂mX, ISG15-PLA₂mX, 인간 Nedd8-PLA₂mX, 및 효모 Rub1-PLA₂mX 융합물들이 상기한 바와 같은 프로토콜을 사용하여 만들어졌다. 발현에 앞서, 발현 플라즈미드는 인 플레임 번역 생성물을 수정하기 위하여 검증된 서열이었다.

대장균 내 유비퀴틴 / UBL - PLA ₂ mX 의 발현 및 정제

유비퀴틴/UBL 융합 단백질의 박테리아 발현은 두 종류 대장균 숙주 균주, BL21(DE3) 또는 Rosetta(DE3) 중 하나로 변형된 후 실시되었다. SoUBLe와 insoUBLe 분획이 침전되어, SDS-PAGE 겔 상에 전기 영동되었고, 각 융합체의 크기 및 발현을 검증하기 위하여 쿠마시 블루로 염색되었다. 그 다음 유비퀴틴/UBL-PLA₂mX가 NiNTA 수지(Qiagen) 크로마토그래피에 의하여 insoUBLe로부터 정제되고, 버퍼 교환으로 48시간 동안 투석되었다. 모든 분획이 수집된 다음 SDS-PAGE에 의하여 전기 영동되고, 쿠마시 블루로 염색되었다. 각 구조물이 하기 표 5에 나타난 바와 같이 원하는 대로 적절하게 사이징된 밴드를 발현하였다.

PLA ₂ 검사

지질의 sn-2 부위 상에 컨쥬게이트된 형광발색단을 갖는 포스파티딜콜린이 PLA₂ 활성을 검사하기 위하여 기질로 사용되었다. 활성 PLA₂에 의한 sn-2 아실 결합의 절단 시 방출된 혈광발색단이 특정 여기와 방출 파장에서 감지되었다. 두 종류의 형광발색단이 사용되었다: NDB(ex:460nm/em:534nm) 및 BODIPY FL(ex:503nm/em:512nm)(분자 프로브/Invitrogen). 지질 기질은 최종 농도 5㎛로 PLA₂ 검사 버퍼(10mM Tris, pH 8, 100mM KCl, 및 2mM Ca² ⁺)에 희석되었다. 절단 반응은 96 웰 블랙 플레이트 또는 1.5ml 에펜도르프 튜브에서 실행되었고, 그 다음 지질 기질이 첨가되었다. 절단 생성물 또는 유비퀴틴/UBL-이소펩티다제의 첨가시, 총 30분 동안 15초 간격으로 400밀리세컨드 판독이 기록되었다. 사용된 다른 프로토콜에서, 세포 추출물이나 이소펩티다제 중 하나의 PLA₂-융합 구조물 및 기질을 함께 첨가하여 96 웰 플레이트에 모았다. 연속적 판독이 30분 동안 원하는 시점까지 이루어졌다. 이들 융합체의 절단은 절단된 지질 기질의 형광이 증가하는 것으로 감지되었다.

전 세포 및 식물 추출물로 유비퀴틴 / UBL - PLA ₂ mX 절단

다양한 유비퀴틴/UBL-PLA₂ 융합의 절단은 전 세포 추출물로 수행하였다. 이 절단은 적절하거나 원하는 크기의 드롭아웃 밴드를 만들어 내는 것으로 결정되었다. 두개의 밴드가 쿠마시 블루 염색된 겔에 보였다: 일정한 14kDa PLA₂mX 밴드, 및 사이즈가 UBL 융합 파트너 의존인 유비퀴틴/UBL 융합 파트너 사이즈 밴드. 얻어진 결과는 아래 표 5에 나타내었다.

표 5: 인택트 유비퀴틴/UBL-융합체 및 절단 생성물의 크기

절단 반응액 각각은 5㎍ 융합 단백질, 및 비슷한 양의 곤충 세포, 래빗 망상 적혈구 분획 II, 인간 U20S 골육종 세포, 대장 암 세포주 DLD1 및 HCT116, 인간 비-소형 세포 폐암 H460 세포, 인간 배아 신장 293T 세포, 쥐과 T 헬퍼 림프구 클론, 또는 밀 배아 세포 추출물을 함유하였다. 반응 혼합물 샘플이 밤새 배양되어 제거되고, 15% SDS-PAGE 겔에 전기 영동되고, 절단의 분석을 위하여 쿠마시 블루로 염색되었다. 이 결과를 아래 표 6에 나타내었다.

표 6: 세포 및 식물 추출물의 절단 활성 프로파일

또한, 상기한 BODIPY FL 표지된 지질 기질을 사용하여 PLA₂ 활성을 측정하기 위하여 상기한 바와 같이 PLA₂ 검사가 실시되었으며, 추출물이 융합 단백질 그 자체를 넘어 융합 단백질에 첨가되는 활성 비로서 나타내었다. 그 결과는 아래 표 7에 나타내었다.

표 7: 세포 및 식물 추출물에 의한 절단된 융합체로부터 PLA₂ 활성의 비

상기한 표 7에 나타낸 데이타로부터 볼 수 있는 바와 같이, 유비퀴틴/UBL-PLA₂mX 융합 단백질 절단은 PLA₂ 활성과 상관관계가 잘 나타났다. ISG15-PLA2mX 활성을 위하여 UBP43, ISG15-특이적 이소펩티다아제를 발현하도록 트란스펙션된 HEK293T 세포로부터 전 세포 추출물을 사용하였다. 이들 검사에서, ISG15 융합체는 UBP43 트란스펙션된 추출물로 배양되고, 비-트란스펙션된 대조 추출물과 절단체 및 형광체를 실시간으로 관찰하였다. 비록 UBP43 트란스펙션된 세포 추출물내 PLA₂ 활성이 비-트란스펙션된 세포의 활성보다 먼저 나타났지만, 양쪽 조건에서 형광 활성이 있었다. ISG15는 처음에는 15kDa으로 가공된 17kDa 전구체이기 때문에, 이는 내 생성, 본질적으로 발현된 프로세싱 프로테아제에 기여할 수 있다. 따라서, 훨씬 낮은 친화성에서 ISG15를 위한 UBP43의 친화성이 PLA₂ 검사에서 지연된 형광 판독을 나타내기는 하지만, 프로세싱 프로테아제는 ISG15-PLA₂ 융합을 위한 어느 정도의 친화성을 가질 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 검사는 ISG15 융합을 향하여 유도된 UBP 활성을 감지할 수 있었다. UBP43의 존재에서, ISG15-이소펩티다제 활성을 감지하여 ISG15-PLA 2 융합의 유용성을 나타내는 PLA₂ 활성의 비율이 4배 증가된다.

유비퀴틴 / UBL -특이 이소펩티다제를 사용한 유비퀴틴 / UBL - PLA ₂ mX 절단이 PLA ₂ 활성을 제공함.

이들 실험에서는 리포터 융합 단백질이 특이적 유비퀴틴이나 UBL 모이어티를 표적으로 하는 이소펩티다아제의 존재 또는 부재하에서 배양되고, SDS-PAGE에 의한 융합체 절단을 감독하거나 PLA₂ 활성을 감지하는 방법으로 이소펩티다제 활성을 검사하였다. 효모 Ulp1 이소펩티다제가 효모 Smt3 유전자 생성물에 특이성을 가지기 때문에, 효모 Smt3 융합 단백질의 절단을 위하여 사용되었다. 마찬가지로, SENP2 이소펩티다제는 인간 SUMO3 융합 단백질의 절단을 위해 사용되었고, USP2a 또는 USP2b 중 하나인 스플라이스 USP2 생성물의 할당된 코어 효소적 도메인(Lin et al. (2000) 참조)이 유비퀴틴 융합 단백질의 절단을 위하여 사용되었다. 그리고, 마지막으로, Den1, Nedd8-특이적 이소펩티다제가 Nedd8-PLA₂mX 융합 단백질을 절단하는데 사용되었다. Gab-Erdene(2003) 참조.

효모 Smt3-PLA₂mX 10㎍이 1시간동안 1㎍ Ulp-1으로 배양되고, SDS-PAGE에 의하여 분석되었다. 상기 겔의 분석은 리포터 융합 단백질의 완전한 절단을 나타내어 분리된 성분, Smt3(21kDa에서) 및 14kDa PLA₂mX를 제공하였다. 동일한 실험이 Ulp1 부재시에 실시되었을 때, 자가촉매적 활성은 없었다. 인택트 32KDa 융합체만이 보였다. 효모 Ulp1 효소는 SUMO-융합 단백질에 대한 특이성을 보이는 유비퀴틴-PLA₂mX 융합 단백질을 절단하지 못했다. 10㎍의 hSUMO3-PLA₂mX가 1㎍의 SENP2와 함께 배양되었을 때, SDS-PAGE로 관찰된 샘플은, 융합 단백질의 완전한 절단을 나타내는, 적절한 사이즈의 hSUMO3(21kDa)과 PLA₂mX(14kDa) 밴드로 나타났다. SENP2 효소는, 이전에는 Ulp1과 함께 관찰된 바와 같이, 유비퀴틴-PLA₂mX 융합 단백질을 절단하지 못하고, SUMO를 위한 이소펩티다제 활성의 특이성을 나타내었다. 10㎍의 유비퀴틴-PLA₂mX 융합체가 3㎍의 USP2 코어 도메인과 함께 배양되었을 때, 융합된 Ub-PLA₂mX의 완전한 절단이 나타났다. 14kDa의 PLA₂mX 밴드와 9kDa의 유비퀴틴 밴드가 나타난 반면, 모체(융합 단백질) 24kD 밴드는 보이지 않았다. Nedd8-PLA₂mX 융합 단백질이 Nedd-8 특이적 이소펩티다제 Den1과 함께 배양되었을 때, Nedd8-융합 단백질은 절단되었고, 14kDa의 PLA₂mX와 9kDa의 Nedd8 밴드가 나타났다. 인 비트로 PLA₂ 검사는 특정 이소펩티다아제에 의한 유비퀴틴/UBL 융합 단백질의 절단에 의하여 PLA₂mX 활 성을 특정하기 위하여 실시되었다. 유비퀴틴/UBL-PLA₂mX 융합과 특정 이소펩티다아제의 공동-배양이 14kDa PLA₂mX 밴드의 절단과 생성을 유도하는 모든 경우에 있어서, 형광 강도 증가에 의하여 보여지는 바와 같이 높아진 PLA₂ 활성이 있었다. UBL-특이적 이소펩티다아제가 융합체를 절단하는 상기한 모든 경우에 있어서, PLA₂ 활성이 또한 관찰되었고, UBL-특이적 이소펩티다아제와 함께, 그리고 이것 없이 배양된 융합체로부터 PLA₂ 활성의 비를 아래 표 8에 나타내었다.

표 8: UBL-특이적 이소펩티다아제 활성으로부터의 PLA₂ 활성의 비

이 실시예는 이소펩티다아제와 같은 단백질 가수분해 활성을 감지하기 위하여 유비퀴틴/UBL-PLA₂ 융합 단백질의 유용성을 나타낸다. 이소펩티다아제 활성이 전혀 없을 때, 융합 단백질 단독으로는 어떠한 신호도 생기지 않았다. 이소펩티다아제 활성 또는 더욱 특이적으로는 정제된 재조합 이소펩티다아제를 함유하는 세포 추출물의 존재 중에서, 융합 단백질은 절단되어, 상당한 수준의 PLA₂ 활성을 제공한 다.

많은 효소가 그들의 표적 단백질이나 선형 융합 단백질로부터 유비퀴틴이나 UBLs을 절단할 수 있는 것으로 알려져 있다. 계통발생학을 통한 게놈 서열화는 다른 예를 만들고 있다. 현재까지, 활성을 조절하는 화합물의 선별이나 이들 효소의 빠르고 정확하고 선택적인 선별에 적절한 직접적인 기능성 검사는 존재하지 않았다. 현재 유용한 검사는 어려우며, 이소펩티다아제나 가수분해효소(프로테아제)와 같은 단백질 가수 분해 효소 활성을 쉽게 검사하는 유비퀴틴과 UBLs을 함유하는 이소펩티드-관련 기질을 생산하는 데 많은 단계를 요구하였다. 본 발명에 따른 표적 단백질로부터 유비퀴틴 또는 UBLs을 제거하는 것이 에스턴 블롯팅으로 관찰될 수 있지만, 그러나, 선행 기술 분야의 검사는 낮은 민감도와 작업량에 특징이 있다. 유비퀴틴과 UBLs과 같은 UBL이 GST와 같은 단백질 도메인에 융합되고, 이어서 고체 지지체에 고정화되어 절단될 수 있고, 생성물 중 하나는 변형된 고 생성율의 ELISA 검사에 의하여 여과되거나 측정되었다. 그러나, 선행 기술의 방법은 비교적 낮은 민감도를 나타내며, 다단계를 포함하고, ELISA 시약을 요구하기 때문에 비용이 비싸다. 또한, 예를 들어 GST-융합 또는 다른 어떤 효소에 의한 융합이 사용된다면, 선행기술 분야의 방법은 UBL-융합 상태에서조차 활성이 남아있는 항체 및/또는 효소에 의하여 인지될 단백질이어야만 하는 인공 산물이 될 수도 있다.

상기한 바와 같은 본 발명은 다양한 방법으로 변형되거나 다양화될 수 있다. 이러한 변형과 다양화는 본 발명의 범위를 벗어나는 것으로 여겨지지 않으며, 모든 변형과 다양화는 하기의 청구항의 범위에 포함되는 것으로 해석된다.

하기 참고문헌은 해당 기술분야의 일반적인 수준에 대한 지표로서 인용되어 이와 관련하여 본 발명을 이해하는 것을 돕기 위하여 사용된다. 본 출원에서 참고문헌으로 인용된 것은 본 발명의 특허성에 대한 실체를 자인하는 것으로 해석되어서는 아니되며, 어떠한 참고문헌도 선행 기술이라고 자인으로 해석되어서도 아니된다.

참고문헌

Claims

단백질분해 효소 활성의 평가 방법으로,

유비퀴틴 또는 유비퀴틴-같은 단백질 (UBL) 또는 그것의 작용성 C-말단 절편을 포함하는 제1 폴리머 및 방향성에 요구되는 자유 N-말단 아미노산을 포함하는 제2 폴리머를 포함하는 융합 폴리머를 제공하고, 여기서 제1 및 제2 폴리머들은 UBL C-말단 및 제2 폴리머 N-말단을 통하여 서로 작동가능하게 연결되어 있고;

UBL C-말단을 절단하는 단백질분해 효소와 상기 융합 폴리머를 접촉시키고;

절단된 폴리머의 양 또는 활성중 어느 하나에 연관된 신호, 또는 상기 효소를 포함한다고 의심되는 시료를 검출하고; 그리고

절단된 효소의 신호와 단백질분해 효소의 활성과의 관련성을 수립하는 것을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 추가로 0% 및 100% 절단 신호를 참조로 각각의 효소 또는 시료 절단 신호를 표준화하고, 단백질분해 활성 값을 각각의 효소 또는 그것의 시료로 할당하고; 여기서 얻어진 효소 활성이 컷-오프 값 미만일때, 효소 또는 시료는 불활성이고, 그것이 컷-오프 이상일때, 그것은 활성이라 언급될 수 있는 것인 방법.
제 2항에 있어서, 상기 0% 및 100% 절단 신호는 0% 및 100% 절단 신호를 얻 기 위해 단백질분해 효소 활성의 완전 절단 및 완전 저해를 위해 접촉, 검출 및 수립 단계들을 반복함에 의해 얻어지는 것인 방법.
제 2항에 있어서, 상기 표준화 단계는 효소 활성 절단 값들의 곡선을 참조하여 각각의 효소 또는 시료 절단 신호를 표준화하고 그리고 단백질분해 효소 활성을 각각의 효소 또는 그것의 시료에 할당하는 것에 의해 수행되고; 여기서 얻어진 효소 활성이 컷-오프 값 미만일때, 효소 또는 시료는 불활성이고, 그것이 컷-오프 이상일때, 그것은 활성이라 언급될 수 있는 것인 방법.
제 1항에 있어서, 제 1 폴리머는 유비퀴틴, SUMO, Nedd8, ISG15, Apg8, Apg12, FAT10, Urm1, Hub, UBi, Rub1, ISG15, 또는 C-말단에 그것의 α-나선 1 및 β-스트랜드 3 연결하는 UBL의 루프 내의 아미노산을 포함하는 그것의 결합 작용성 C-말단 절편을 포함하는 것인 방법.
제 1항에 있어서,

상기 제2 폴리머는 리포터 단백질, 항원, 전사인자 또는 그것의 작용성 단편을 포함하고; 그리고/또는

제1 폴리머는 UBL 또는 C-말단에 그것의 α-나선 1 및 β-스트랜드 3 연결하는 UBL의 루프 내의 아미노산을 포함하는 결합 작용성 C-말단 절편을 포함하는 것인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 폴리머(들)는 단백질분해 효소 절단시에 검출가능하게 되는 것인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 폴리머(들)는 그것(그것들)이 지니는 신호의 활성화에 의해 그리고/또는 검출가능한 신호에 결합 또는 검출가능한 신호의 생성에 의해 검출가능하게 되는 것인 방법.
제 1항에 있어서, 검출가능한 신호는 방사활성, 형광성, 인광성, 발색성, 소노제닉(sonogenic) 또는 화학발광성 신호를 포함하는 것인 방법.
제 6항에 있어서,

C-말단에 그것의 α-나선 1 및 β-스트랜드 3 연결하는 UBL의 루프 내의 아미노산을 포함하는 UBL N-말단 절편, 또는 UBL C-말단 절편을 가진 UBL을 형성하기 위한 잔여 아미노산 절편을 얻고; 상기 UBL N-말단 절편은 제1 및 제2 결합 파트너 중 하나에 작동가능하게 연결되어 있고; 그리고

제2 결합 파트너를 얻고, 그리고

여기서 상기 융합 폴리머는 제1 및 제2 결합 파트너의 결합시에 절단되는 것인 방법.
제 10항에 있어서, 상기 결합 파트너들은 수용체 및 수용체 결합제를 포함하는 것인 방법.
제 11항에 있어서, 상기 수용체 결합제는 약물, 호르몬, 항원, 리간드, 또는 그것의 수용체 결합 작용성 단편을 포함하고; 그리고

상기 수용체는 약물 수용체, 호르몬 수용체, 항체, 리간드 결합 수용체, 또는 그것의 결합 적용성 단편을 포함하는 것인 방법.
제 10항에 있어서, UBL N- 및 C-말단의 결합은 UBL 구조의 인식 및 단백질분해 효소에 의해 C-말단에서 폴리머 절단을 가능하게 하는 것인 방법.
제 1항에 있어서, 제1 및 제2 폴리머는 서로 공유결합으로 연결되는 것인 방법.
제 1항에 있어서, 제1 및 제2 폴리머는 링커를 통하여 작동가능하게 연결되어 있는 것인 방법.
제 15항에 있어서, 상기 링커는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 것인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 융합 폴리머는 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단백질분해 효소는 이소펩티다제 또는 그것의 작용성 단편을 포함하는 것인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단백질분해 효소는 유비퀴틴 C-말단 하이드롤라제, 유비퀴틴-특이적 프로테아제 또는 그것의 작용성 단편을 포함하는 것인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단백질분해 효소는

또는 그것의 작용성 단편을 포함하는 것인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 제2 폴리머는 세린 프로테아제, 프로-호르몬 전구체, 서브틸리신/헥신-같은 프로-호르몬 컨버타제, 카르복시펩티다제, 트롬보스포딘 타입 I 모티프 (ADAMTS)를 갖는 A 디스인테그린-같은 및 메탈로프로테아제 도메인 (레프로라이신-같은), A 디스인테그린 및 메탈로프로테아제 도메인(ADAM), 시스테인 아스파르타제, 아스팔틱 프로테인아제, 매트릭스 메탈로프로테인아제 (MMP), RNA-의존 RNA 폴리머라제, N-말단 뉴클레오필 (Ntn) 하이드롤라제, 4-옥살로크로토네이트 타우토메라제, 코리스메이트 합성효소, β-락탐 아실라제, 역 전사효소, 포스포리파제, 전사인자, 또는 그것의 작용성 단편을 포함하는 것인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 제2 폴리머는 바이러스 역전사효소, 시그마 전사인자, 글루타민 포스포리보실피로포스페이트 (PRPP) 아미도트랜스퍼라제 (GPATase), 응집 인자 Xa, 3Dpol RNA-의존 RNA 폴리머라제, 글루타민 5-포스포리보실-1-피로포스페이트 아미도트랜스퍼라제, 페니실린 아실라제, 역전사효소, 코리스메이트 합성효소, 트립타제, 키마제, 엔테로키나제, 전사인자 σ^k, 트롬빈, 디펩티딜 펩티다제, HtrA2, 뉴로피신, 바소프레신, 유린, 카르복시펩티다제 B, 카르복시펩티다제 Y, vWF-절단 프로테아제/ADAMTS 13, ADAM 1, ADAM 2, 카스페이스, 펩신, 레닌, 카텝신 D, 마손-화이자 원숭이 바이러스 프로테인아제, MMP20, MMP26, 글리코실아스파라기나제, 20S 프로테아좀 β 서브유니트, 글루타민 PRPP 아미도트렌스퍼라제, YdcE, YwhB, 세팔로스포린 아실라제, CaMV 역전사효소, 포스포리파제 A₂, 또는 그것의 작 용성 단편을 포함하는 것인 방법.
제 1항에 있어서, 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 그것의 발현에 효과적인 조건하에서 발현시키는 것을 포함하는 방법.
제 23항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 진핵세포, 또는 그것의 분획 또는 추출물에서 발현되는 것인 방법.
제 23항에 있어서, 추가로 그렇게 얻어진 융합 단백질을 단리하고; 그리고 임의로 융합 단백질을 정제하는 것을 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 단백질분해 효소 활성 조정자를 포함하는 것으로 의심되는 시료의 존재하에서 접촉, 검출 및 수립 단계들을 반복하고, 그리고

시료의 부존재에서 얻어진 대응하는 효소 활성 신호에 대해 시료 신호를 참조하여 단백질분해 효소 활성에 대한 시료의 효과를 위한 값을 결정하는 것을 포함하는 방법.
제 25항에 있어서, 상기 시료는 생리학적 액체, 조직 시료, 세포, 또는 세포 분획을 포함하는 것인 방법.
제 1항에 있어서, 하나 이상의 단계들이 시험관내, 생체내, 생체외, 세포 또는 조직 배양에서, 세포 또는 조직 추출물 상에서 수행되는 것인 방법.
제 1항에 있어서, 검출 단계는 세포 성장, 또는 발색성, 방사활성, 형광성, 인광성, 또는 화학발광성 신호의 검출을 포함하는 것인 방법.
제 26항에 있어서, 접촉, 검출, 수립 및 결정 단계들을 단백질분해 효소 활성 조정자를 포함하는 것으로 의심되는 다수의 시료에 대하여 별도로 행하여 단백질분해 효소 활성에 대한 시료의 효과 값을 얻는 것인 방법.
제 30항에 있어서, 자동화되어 있는 것인 방법.
제 30항에 있어서, 각각의 시료 및 대조구에 대해 얻어진 정보를 수집하고, 처리하고 그리고 보고하는 것인 방법.
단백질분해 효소 활성을 평가하기 위한 키트로,

유비퀴틴 또는 유비퀴틴-같은 단백질 (UBL) 또는 그것의 C-말단 절편을 포함하는 제1 폴리머 및 방향성을 위한 자유 N-아미노산 말단을 요구하는 폴리펩티드를 포함하는 제2 폴리머를 포함하는 융합 폴리머, 여기서 제1 및 제2 폴리머들은 유비퀴틴 또는 UBL C-말단 및 제2 폴리머 N-말단을 통하여 서로 작동가능하게 연결되어 있고; 그리고

단백질분해 효소 분석, 제1 및/또는 제2 폴리머의 양 또는 활성과 연관된 신호의 검출, 및 효소의 단백질분해 활성에 대해 검출된 신호의 관련성을 수립하기 위한 지시서; 및

임의로 UBL C-말단에서 절단하는 단백질분해 효소의 공급원을 포함하는 것인 키트.
제 33항에서, 추가로 하기 중에서 하나 이상을 포함하는 것인 키트:

제1 및 제2 결합 파트너, 여기서 제1 결합 파트너는 UBL N-말단 절편에 작동가능하게 연결될 수 있고, 그리고 상기 제1 및 제2 결합 파트너는 UBL 구조를 가능하게 하는 UBL N-말단 절편에 결합하는 UBL C-말단 절편과 서로 결합하고, 상기 단백질분해 효소는 융합 폴리머를 절단하고;

효소 절단 단계를 수행하기 위한 반응제;

검출 단계를 수행하기 위한 수단; 및

단백질분해 효소 활성 또는 그것의 변화에 대한 검출가능한 신호와 관련시키는 수단.
제 33항에 있어서,

상기 융합 폴리머는 융합 단백질을 포함하고; 상기 키트는 추가로

융합 폴리머를 위해 치환된 그것을 암호화하는 융합 폴리뉴클레오티드; 및

임의로 하나 이상의

폴리뉴클레오티드를 발현하기 위한 반응제; 및/또는

융합 단백질 대신에 채용될때, 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위한 세포 또는 그것의 분획 또는 추출물을 포함하는 키트.
제 33항에 있어서, 추가로 다수의 시료를 별개로 함유하는 수단; 및 분석을 자동적으로 수행하기 위한 지시서를 포함하는 키트.
제 33항에 있어서, 각각의 시료를 위한 데이터를 자동적으로 처리화 위한 수단; 및 그것의 사용을 위한 지지서를 포함하는 것인 키트.
단백질분해 활성에 대한 화합물들의 효과를 검색하기 위한 방법으로,

유비퀴틴 또는 유비퀴틴-같은 단백질 (UBL) 또는 그것의 결합 작용성 C-말단 절편을 포함하는 제1 폴리머 및 자유 N-말단 아미노산을 포함하는 제2 폴리머를 포함하는 융합 폴리머를 얻고, 여기서 제1 및 제2 폴리머들은 N-C-말단을 통하여 서로 작동가능하게 연결되어 있고;

UBL C-말단을 절단하는 단백질분해 효소와 상기 융합 폴리머를 절단이 일어나기에 효과적인 조건하에 접촉시키고;

100% 절단 신호를 얻기 위해 절단의 양과 연관된 신호를 검출하고;

O% 절단 신호를 얻기 위하여 단백질분해 효소 활성의 완전 저해의 존재하에 서 접촉 및 검출 단계들을 반복하고;

일련의 화합물들을 얻고;

절단 신호를 얻기 위하여 각각의 화합물의 존재하에서 융합 폴리머 얻기, 접촉 및 검출 단계들을 별도로 반복하고;

0% 및 100% 절단 신호를 참조로 각각의 화합물 절단 신호를 표준화하고, 그리고 단백질분해 효소 활성값을 각각의 화합물에 할당하는 것을 포함하는 방법.
제 38항에 있어서,

0% 및 100% 절단 신호 대신에, 하나의-점 절단 신호를 얻기 위하여 알려진 단백질분해 활성 조정자와 접촉 및 검출 단계들을 수행하고;

조정자의 부존재 하에서 얻어진 상응하는 효소 활성값을 참조하여 조정자에 대한 단백질분해 효소 활성값을 결정하고; 그리고

대조구 절단 신호를 참조하여 각각의 화합물의 절단 신호를 표준화하고 그리고 각각의 화합물에 대한 단백질분해 효소 활성값을 할당하는 것을 포함하는 방법.
제 38항에 있어서, 상기 표준화 단계는 효소 활성 절단 값들의 곡선을 참조하여 각각의 화합물 절단 신호를 표준화하고 그리고 단백질분해 효소 활성을 각각의 화합물에 할당하는 것으로 수행되고; 여기서 얻어진 효소 활성이 컷-오프 값 미만일때, 화합물은 불활성이고, 그것이 컷-오프 이상일때, 그것은 활성이라 언급될 수 있는 것인 방법.
제 37항에 있어서, 컷-오프 값이 50% 단백질분해 효소 활성이고, 그리고 효소활성이 화합물 존재시에 적어도 50%로 감소될 때, 화합물은 저해제이고, 효소활성이 적어도 50%로 증진되었을 때, 화합물은 증진제라고 언급될 수 있는 것인 방법.
제 38항에 있어서, 추가로

50%로 효소활성을 저해하고 (IC₅₀) 그리고/또는 증진하는 (EC₅₀) 화합물 농도를 결정하고; 그리고

저해제 및/또는 증진제로서 그것의 효소 활성 강도를 평가하기 위하여 화합물의 IC₅₀ 및/또는 EC₅₀을 비교하는 것을 포함하는 방법.
제 38항에 있어서, 상기 조정자는 단백질분해 효소 활성 활성제를 포함하는 것인 방법.
제 38항에 있어서, 상기 조정자는 단백질분해 효소 활성 저해제를 포함하는 것인 방법.
제 38항에 있어서, 하나 이상의 단계들이 시험관내, 생체내, 생체외, 세포 또는 조직 배양에서, 세포 또는 조직 추출물 상에서 수행되는 것인 방법.
제 38항에 있어서, 검출단계는 세포성장, 발색성, 방사활성, 형광성, 인광성, 소노제닉 또는 화학발광성 검출을 포함하는 것인 방법.
제 38항에 있어서, 제 1 폴리머는 유비퀴틴, SUMO, Nedd8, ISG15, Apg8, Apg12, FAT10, Urm1, Hub, UBi, Rub1, ISG15, 또는 C-말단에 그것의 α-나선 1 및 β-스트랜드 3 연결하는 UBL의 루프 내의 아미노산을 포함하는 결합 작용성 C-말단 절편을 포함하는 것인 방법.
제 38항에 있어서,

상기 제2 폴리머는 리포터 단백질, 또는 그것의 결합성 작용성 절편을 포함하고; 그리고/또는

제1 폴리머는 C-말단에 그것의 α-나선 1 및 β-스트랜드 3 연결하는 UBL의 루프 내의 아미노산을 포함하는 결합 작용성 C-말단 절편을 포함하는 것인 방법.
제 38항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 폴리머는 단백질분해 효소 절단시에 검출가능하게 되는 것인 방법.
제 38항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 폴리머는 그것(그것들)이 지니는 신호의 활성화에 의해 그리고/또는 검출가능한 신호에 결합 또는 검출가능한 신호의 생성에 의해 검출가능하게 되는 것인 방법.
제 38항에 있어서, 검출가능한 신호는 방사활성, 형광성, 인광성, 발색성, 소노제닉 또는 화학발광성 신호를 포함하는 것인 방법.
제 45항에 있어서, 추가로 그것의 N-말단에 그것의 α-나선 1 및 β-스트랜드 3 연결하는 UBL의 루프 내의 아미노산을 포함하는 결합성 작용성 N-말달 UBL 절편을 얻고, 여기서 N-말단 절편 및 C-말단 절편은 완전 UBL을 형성하기 위하여 서로 결합되고, 상기 UBL N-말단 절편은 제1 및 제2 결합 파트너 중 하나에 작동가능하게 연결되어 있고; 그리고

제2 결합 파트너를 얻고, 그리고

여기서 상기 융합 폴리머는 제1 및 제2 결합 파트너의 결합시에 절단되는 것인 방법.
제 52항에 있어서, 상기 결합 파트너들은 수용체 및 수용체 결합제를 포함하는 것인 방법.
제 52항에 있어서,

상기 수용체 결합제는 약물, 호르몬, 항원, 리간드, 또는 그것의 작용성 단 편을 포함하고; 그리고

상기 수용체는 약물 수용체, 호르몬 수용체, 항체, 리간드 결합 수용체, 또는 그것의 적용성 단편을 포함하는 것인 방법.
제 52항에 있어서, UBL N- 및 C-말단의 결합은 UBL 구조의 인식 및 단백질분해 효소에 의해 폴리머 절단을 가능하게 하는 것인 방법.
제 38항에 있어서, 제1 및 제2 폴리머는 서로 공유결합으로 연결되는 것인 방법.
제 38항에 있어서, 제1 및 제2 폴리머는 링커를 통하여 작동가능하게 연결되어 있는 것인 방법.
제 57항에 있어서, 상기 링커는 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 것인 방법.
제 38항에 있어서, 상기 융합 폴리머는 융합 단백질을 포함하는 것인 방법.
제 38항에 있어서, 상기 단백질분해 효소는 이소펩티다제 또는 그것의 작용성 단편인 것인 방법.
제 38항에 있어서, 상기 단백질분해 효소는 유비퀴틴 C-말단 하이드롤라제, 유비퀴틴-특이적 프로테아제 또는 그것의 작용성 단편을 포함하는 것인 방법.
제 38항에 있어서, 상기 단백질분해 효소는

또는 그것의 작용성 단편을 포함하는 것인 방법.
제 38항에 있어서, 제2 폴리머는 세린 프로테아제, 프로-호르몬 전구체, 서브틸리신/헥신-같은 프로-호르몬 컨버타제, 카르복시펩티다제, 트롬보스포딘 타입 I 모티프 (ADAMTS)를 갖는 A 디스인테그린-같은 및 메탈로프로테아제 도메인 (레프로라이신-같은), A 디스인테그린 및 메탈로프로테아제 도메인(ADAM), 시스테인 아 스파르타제, 아스팔틱 프로테인아제, 매트릭스 메탈로프로테인아제 (MMP), RNA-의존 RNA 폴리머라제, N-말단 뉴클레오필 (Ntn) 하이드롤라제, 4-옥살로크로토네이트 타우토메라제, 코리스메이트 합성효소, β-락탐 아실라제, 역 전사효소, 포스포리파제, 전사인자, 또는 그것의 작용성 단편을 포함하는 것인 방법.
제 38항에 있어서, 제2 폴리머는 바이러스 역전사효소, 시그마 전사인자, 글루타민 포스포리보실피로포스페이트 (PRPP) 아미도트랜스퍼라제 (GPATase), 응집 인자 Xa, 3Dpol RNA-의존 RNA 폴리머라제, 글루타민 5-포스포리보실-1-피로포스페이트 아미도트랜스퍼라제, 페니실린 아실라제, 역전사효소, 코리스메이트 합성효소, 트립타제, 키마제, 엔테로키나제, 전사인자 σ^k, 트롬빈, 디펩티딜 펩티다제, HtrA2, 뉴로피신, 바소프레신, 유린, 카르복시펩티다제 B, 카르복시펩티다제 Y, vWF-절단 프로테아제/ADAMTS 13, ADAM 1, ADAM 2, 카스페이스, 펩신, 레닌, 카텝신 D, 마손-화이자 원숭이 바이러스 프로테인아제, MMP20, MMP26, 글리코실아스파라기나제, 20S 프로테아좀 β 서브유니트, 글루타민 PRPP 아미도트렌스퍼라제, YdcE, YwhB, 세팔로스포린 아실라제, CaMV 역전사효소, 포스포리파제 A₂, 또는 그것의 작용성 단편을 포함하는 것인 방법.
제 59항에 있어서, 융합 단백질은 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 얻어지는 것인 방법.
제 65항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 진핵세포, 또는 그것의 분획 또는 추출물에서 발현되는 것인 방법.
제 65항에 있어서, 추가로 그렇게 얻어진 융합 단백질을 단리하고; 그리고 임의로 융합 단백질을 정제하는 것을 포함하는 방법.
제 38항에 있어서, 자동화되어 있는 것인 방법.
제 68항에 있어서, 각각의 조정자 및 대조구에 대해 얻어진 정보를 수집하고, 처리하고 그리고 보고하는 것인 방법.
단백질분해 효소 활성 조정자 검색 키트로,

유비퀴틴 또는 유비퀴틴-같은 단백질 (UBL) 또는 그것의 C-말단 절편을 포함하는 제1 폴리머 및 방향성을 위한 자유 N-아미노산 말단을 포함하는 제2 폴리머를 포함하는 융합 폴리머, 여기서 제1 및 제2 폴리머들은 유비퀴틴 또는 UBL C-말단 및 제2 폴리머 N-말단을 통하여 서로 작동가능하게 연결되어 있고; 및

단백질분해 효소 분석의 수행, 제1 및/또는 제2 폴리머의 양 또는 활성과 연관된 신호의 검출, 다수의 조정자 및 대조구를 위한 효소의 단백질분해 활성에 대해 검출된 신호의 관련성을 수립하기 위한 지시서; 및

임의로 유비퀴틴 또는 UBL C-말단을 절단하는 단백질분해 효소의 공급원을 포함하는 것인 키트.
제 70항에서, 추가로 하기 중에서 하나 이상을 포함하는 것인 키트:

제1 및 제2 결합 파트너, 여기서 제1 결합 파트너는 UBL N-말단 절편에 작동가능하게 연결될 수 있고, 그리고 상기 제1 및 제2 결합 파트너는 UBL 구조를 가능하게 하는 UBL N-말단 절편에 결합하는 UBL C-말단 절편과 서로 결합하고, 상기 단백질분해 효소는 융합 폴리머를 절단하고;

융합 폴리머의 UBL C-말단 효소 절단을 수행하기 위한 반응제;

제1 및/또는 제2 절단된 폴리머들에 의해 방출되는 신호를 검출하기 위한 수단; 및

대조구를 참조하여 단백질분해 효소 활성 또는 그것의 변화에 대한 검출가능한 신호와 관련시키는 수단.
제 70항에 있어서, 추가로

상기 융합 폴리머는 융합 단백질을 포함하고; 상기 키트는 추가로

융합 단백질을 위해 치환된 그것을 암호화하는 융합 폴리뉴클레오티드; 및

임의로 하나 이상의

폴리뉴클레오티드를 발현하기 위한 반응제; 및/또는

융합 단백질 대신에 채용될때, 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위한 세포 또는 그것의 분획 또는 추출물을 포함하는 키트.
제 70항에 있어서, 추가로 다수의 시료를 별개로 함유하는 수단; 및 분석을 자동적으로 수행하기 위한 지시서를 포함하는 키트.
제 70항에 있어서, 각각의 시료를 위한 데이터를 자동적으로 처리화 위한 수단; 및 그것의 사용을 위한 지지서를 포함하는 것인 키트.
세포, 식물 또는 동물의 염색체로 작동가능하게 통합되어 있는 유비퀴틴- 또는 UBL-리포터 융합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 트랜스제닉 세포, 식물 또는 동물로, 여기서 상기 리포터는 특이적 질병 또는 질환 또는 그들의 패밀리와 연관되어 있는 것인 트랜스제닉 세포, 식물 또는 동물.
제 75항에 있어서, 유비퀴틴 또는 UBL-리포터 융합 단백질을 발현할 수 있는 것인 트랜스제닉 세포, 식물 또는 동물.
제 76항에 있어서, 융합 폴리뉴클레오티드를 벡터로 클로닝함에 의해 하이브리드 벡터를 형성하고, 그리고 하이브리드 벡터로 세포, 식물 또는 동물을 트랜스펙션하는 것에 의해 얻어지는 것인 트랜스제닉 세포, 식물 또는 동물.
제 77항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드를 포함하고, 상기 세포는 진핵세포를 포함하는 것인 트랜스제닉 세포, 식물 또는 동물.
제 70항에 있어서, 질병 또는 질환을 위한 세포, 식물 또는 동물로서 역할하도록 추가로 변형되는 것인 트랜스제닉 세포, 식물 또는 동물.
제 79항에 있어서, 이소펩티다제는 자가-면역, 신생물, 유전적 돌연변이, 대사, 심혈관 또는 신경퇴행성 질병 또는 질환과 연관되어 있는 것인 트랜스제닉 세포, 식물 또는 동물.
제 80항에 있어서, 상기 질병 또는 질환은 암, 루프스, 당뇨병, IBD, 심혈관질환, 신경퇴행성 또는 염증질환을 포함하는 것인 트랜스제닉 세포, 식물 또는 동물.
제 75항의 트랜스제닉 세포, 식물 또는 동물의 생성 방법으로,

세포, 식물 또는 동물을 얻고;

유비퀴틴, UBL-, 또는 그들의 C-말단 결합 작용성 단편-리포터 융합 폴리뉴클레오티드를 얻고;

벡터에 작동가능하게 연결된 하이브리드 폴리뉴클레오티드를 지니는 하이브리드 벡터를 얻고; 그리고

하이브리드 벡터로 세포, 식물 또는 동물을 안정하게 트랜스펙션하는 것을 포함하는 방법.
제 82항에 있어서, 상기 융합 폴리뉴클레오티드는 세포, 식물 또는 동물의 염색체로 통합되는 것인 방법.
제 82항에 있어서, 상기 융합 폴리뉴클레오티드는 융합 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
질병 또는 질환의 진단 방법으로,

제 75항의 세포, 식물 또는 동물, 그것의 분획 또는 조직을 얻고, 여기서 상기 리포터는 질병 또는 질환과 연관되어 있고;

상기 질병 또는 질환이 걸린 개체로부터 얻은 시료를 상기 세포, 식물 또는 동물과 접촉시키거나 투여하고;

시료 존재하에서 리포터에 의해 생성된 모든 신호를 검출하고; 그리고

0% 및 100% 신호를 위한 대조구와 신호를 비교하는 것을 포함하는 방법.