CN115850504A - 一种蛋白酶生物传感器及其在蛋白酶检测和抑制剂筛选中的应用 - Google Patents
一种蛋白酶生物传感器及其在蛋白酶检测和抑制剂筛选中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115850504A CN115850504A CN202210882903.1A CN202210882903A CN115850504A CN 115850504 A CN115850504 A CN 115850504A CN 202210882903 A CN202210882903 A CN 202210882903A CN 115850504 A CN115850504 A CN 115850504A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protease
- biosensor
- luciferase
- energy transfer
- resonance energy
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种蛋白酶生物传感器及其在蛋白酶检测和抑制剂筛选中的应用,该生物传感器通过基因融合表达以及柔性linker引入的方式,缩短BRET供/受体对的空间距离,提高了生物发光共振能量转移效率,使传感器的生物发光共振能量转移效率BRET ratio能高于3.0。同时还可以进一步引入蛋白酶特异性识别剪切短肽用于检测蛋白酶或用于相应蛋白酶抑制剂的筛选工作,特异性强,检测灵敏度高,检测限LOD可以达到pM级别(0.732pM),具有极高的实用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器领域,具体涉及一种蛋白酶生物传感器及其在蛋白酶检测和抑制剂筛选中的应用。
背景技术
纤溶酶属于丝氨酸蛋白酶家族,是人体中参与纤溶系统和凝血系统功能调节一种蛋白水解酶,纤溶酶及其抑制剂往往共同协调,在组织增殖、伤口愈合、排卵受精、细胞黏附、迁移、分化、凋亡、病原体侵袭、肿瘤侵袭、转移等多种生物生理过程中发挥关键作用。此外,纤溶酶还与多种疾病如辐射所致创伤、心血管疾病、肺栓塞炎症、癌症、阿尔茨海默病、艾滋病及严重呼吸道感染冠状病毒2019(Covid-19)等有关。因此,纤溶酶检测及其药物抑制剂筛选在重大疾病的体外诊断及临床治疗指导等方面具有十分重要的意义。
传统检测蛋白酶的方法主要有紫外分光光度法、比色法、免疫法、荧光法、放射性元素标记法、高效液相色谱法和质谱法等,但紫外分光光度和比色法检测灵敏度和重复性较差;免疫法的抗体使用成本过高,难以实现高通量应用;荧光法和放射性元素标记法存在需要对酶或底物进行标记并反复洗涤,操作复杂等问题。近年来发展的基于荧光小分子AMC修饰底物实现检测纤溶蛋白酶(plasmin)的商业化试剂盒,检测灵敏度较高,但试剂盒价格昂贵,相对检测成本过高;高效液相色谱法和质谱法存在检测灵敏度低及分析成本高等问题。而一些非常规方法,如基于新型磁性纳米材料、纳米棒及电化学材料修饰的生物传感器和电化学传感器等方法都需要对目标物进行特异性修饰,也会存在需要多步化学偶联及反复洗涤纯化等问题。
生物发光共振能量转移(BRET)是在非辐射能量转移基础上,当供体荧光素酶的酶学反应产生的激发态到基态的发光频率与受体蛋白荧光基团的吸收频率相重叠,且供体和受体之间的空间距离小于10nm,荧光素酶供体和受体蛋白之间发生能量转移,进而诱发受体蛋白产生荧光信号。该方法作为一种高效的光学“分子标尺”,被广泛应用于蛋白质相互作用研究,其特点是无需外部激发光源、背景信号低、无需反复洗涤、操作简单等,并可以实现活体内光学成像研究。
蛋白酶药物抑制剂主要包括内源性抑制剂,合成肽类以及天然产物等,随着生物医学及有机化学的巨大发展,以蛋白酶作为靶点的药物抑制剂文库筛选工作也越来越繁重,采用计算机辅助药物设计,基于结构的虚拟筛选,使得新药研发工作得到了大力发展,但同时对检测筛选技术也提出了新挑战。因此,发展高灵敏、高特异性的蛋白酶检测及蛋白酶药物抑制剂高通量筛选技术,除了对重大疾病的早期诊断和治疗提供指导,同时是新药研发工作的重要基础支撑。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明提出一种蛋白酶生物传感器构建方法及其抑制剂筛选应用。本发明中构建得到的蛋白酶生物传感器能够定性或定量检测样品中的蛋白酶,且特异性强,检测灵敏度高,且检测时无需外源激发光源,仅通过生物自发光提供能量,大大减少发射光源带来的背景干扰信号。
本发明的第一个方面,提供一种生物传感器,所述生物传感器包括生物发光共振能量转移供体、蛋白酶识别剪切短肽和生物发光共振能量转移受体;其中,所述蛋白酶识别剪切短肽通过linker片段分别连接生物传感器中的生物发光共振能量转移供体和生物发光共振能量转移受体。
在本发明的一些实施方式中,所述linker片段为疏水性其具有伸展柔性linker。
在本发明的一些实施方式中,所述linker片段包括(GGS)n、(GS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n中的至少一种。当然,本领域技术人员可以根据实际使用需求,选择其他linker片段,包括但不限于(GGS)n、(GS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n。
在本发明的一些实施方式中,所述生物发光共振能量转移供体包括荧光素酶、荧光素酶功能片段或其生物活性变体。
当然,需要理解的是,BRET供体实际上可为任意的生物发光蛋白而并不局限与荧光素酶,其仅需要发挥“作用于合适的底物,并通过催化底物的化学反应发出可见光”的功能,其实质上是将能量以光的形式释放的同时不产生热量等其他能量转移方式。在本领域中,常见的生物发光蛋白一般是从发光生物体中分离出来的,且大部分为海洋生物,少部分为陆上发光生物,如细菌,原生动物,昆虫及其幼虫,肠腔动物,环节动物,软体动物,蛛类,多足类,鱼类,真菌,甲壳类动物等。
在本发明的一些实施方式中,所述荧光素酶包括NanoLuc荧光素酶、萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶、腔肠动物荧光素酶、北美蓝光萤荧光素酶、叩头虫荧光素酶、细菌荧光素酶、水母发光荧光素酶、Gaussia荧光素酶、长腹水蚤荧光素酶、苹果蝇蛆荧光素酶。当然,本领域技术人员可以根据实际使用需求,选择其他荧光素酶,包括但不限于NanoLuc荧光素酶、萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶、腔肠动物荧光素酶、北美蓝光萤荧光素酶、叩头虫荧光素酶、细菌荧光素酶、水母发光荧光素酶、Gaussia荧光素酶、长腹水蚤荧光素酶、苹果蝇蛆荧光素酶。
在本发明中,术语“BRET受体”是指具有荧光发光结构域或功能基团的荧光物质。
在本发明的一些实施方式中,所述生物发光共振能量转移受体包括荧光蛋白,小分子荧光染料,荧光纳米材料,荧光微球,以及标记有上述荧光蛋白、小分子荧光染料、荧光纳米材料、荧光微球中的至少一种的物质中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中,所述荧光蛋白包括mNeonGreen绿色荧光蛋白、Clover系列绿色荧光蛋白、GFP绿色荧光蛋白、BFP蓝色荧光蛋白、CFP青色荧光蛋白、YFP黄色荧光蛋白、EGFP增强型绿色荧光蛋白、Venus、mOrange、Topaz、DsRed、mTFP1、mRFP1、mCherry、TagRFP、TurBoFB,或者其中任何一种的功能片段或生物活性变体。当然,本领域技术人员可以根据实际使用需求,选择其他荧光蛋白,包括但不限于mNeonGreen绿色荧光蛋白、Clover系列绿色荧光蛋白、GFP绿色荧光蛋白、BFP蓝色荧光蛋白、CFP青色荧光蛋白、YFP黄色荧光蛋白、EGFP增强型绿色荧光蛋白、Venus、mOrange、Topaz、DsRed、mTFP1、mRFP1、mCherry、TagRFP、TurBoFB。
在本发明实施例中,发明人采用基因融合表达手段,选择光学性能优良的BRET供体和受体对,将荧光素酶基因,荧光蛋白基因以及在2个基因中间设计引入不同长度的具有柔性和疏水性linker基因,并通过基因融合、经过表达后,荧光素酶和荧光蛋白在柔性linker的作用下,可以在三维空间自由摆动,大大增加BRET供体和受体的碰撞几率,提高了生物发光共振能量转移效率,从而获得了一种稳定的生物发光共振能量转移传感器。
根据本发明的第二个方面,在本发明的一些实施方式中,所述蛋白酶识别剪切短肽能够特异性结合蛋白酶,并被蛋白酶剪切。
在本发明的一些实施方式中,所述蛋白酶包括纤溶蛋白酶、凝血酶、细胞凋亡蛋白酶、基质金属蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、冠状病毒主蛋白酶、衣壳蛋白酶。其中,细胞凋亡蛋白酶包括细胞凋亡蛋白酶3、细胞凋亡蛋白酶8、细胞凋亡蛋白酶9。基质金属蛋白酶包括基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9。当然,本领域技术人员可以根据实际使用需求,选择其他蛋白酶,包括但不限于上述的纤溶蛋白酶、凝血酶、细胞凋亡蛋白酶、基质金属蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、冠状病毒主蛋白酶、衣壳蛋白酶。
当然,本领域技术人员可以根据实际使用需求,选择其他识别剪切短肽用于特定物质的检测,包括但不限于上述的蛋白酶识别剪切短肽。
在本发明实施例中,发明人在本发明第一个方面所述的生物发光共振能量转移传感器的基础上,采用基因融合表达手段,通过在linker基因中搭载特定蛋白酶识别位点元件,得到了能够针对特定蛋白酶的生物发光共振能量转移传感器。该传感器通过高亮度生物荧光素酶及与之光谱性能匹配的荧光强度高的荧光蛋白作为BRET供体和受体对,有效的实现了多种蛋白酶的高灵敏度和高特异性的快速检测。
在本发明的一些实施方式中,在2个柔性linker之间引入不同蛋白酶特异性识别短肽。当蛋白酶不存在时,在有荧光素酶底物作用下,生物发光共振能量转移效率最大。加入蛋白酶后,随着蛋白酶浓度逐渐增加,短肽会被蛋白酶特异性识别并水解剪切,从而逐渐降低生物发光共振能量转移效率,共振荧光发光信号强度减弱,直至完全不发生能量转移并达到饱和。通过对这种荧光信号变化进行读取,能够实现对于特定蛋白酶的高灵敏度高特异性定性或定量检测。
在本发明的一些实施方式中,所述蛋白酶特异性识别剪切短肽的氨基酸序列为:KKYKVKE。该蛋白酶特异性识别剪切短肽为纤溶蛋白酶特异性识别剪切短肽,即当体系中存在纤溶蛋白酶时,纤溶蛋白酶会识别该短肽并将其肽段切断。在本发明的一些实施方式中,所述荧光素酶底物包括肠腔素及其衍生物。肠腔素是一类咪唑并吡嗪酮类发光底物,包括但不限于肠腔素400a,furimazine,天然肠腔素,肠腔素h,肠腔素cp,肠腔素f,肠腔素hcp,肠腔素n,肠腔素e等。
在本发明的一些实施方式中,根据荧光素酶的选择,荧光素酶生物发光的产生还需要辅因子,辅因子包括但不必限于ATP,氧气,钙离子,镁离子等,或者它们中任何两种或多种组合形式。
在本发明的一些实施方式中,荧光信号的收集装置包括但不限于多功能微孔板酶标仪。使用多功能微孔板酶标仪收集荧光信号时,其滤光方式可以为波长连续可调的光栅式,固定波长的滤光片式,或者多种融合光路组合形式,相应的参数设置视情况需进行优化调整。
本发明的第二个方面,提供一种生物传感器的制备方法,包括如下步骤:
(1)按照权利要求1~7中任一项所述的生物传感器中的功能单元连接顺序在表达载体中进行重组连接;所述功能单元包括生物发光共振能量转移供体、linker片段、生物发光共振能量转移受体、蛋白酶识别剪切短肽;
(2)筛选阳性克隆,提取质粒,转化至感受态细胞中并诱导蛋白表达。
(3)破碎细胞,提取粗蛋白,即为生物传感器。
在本发明的一些实施方式中,所述生物传感器的制备方法具体为:
(1)按照本发明第一个方面中的生物传感器中的功能单元连接顺序在载体细胞中进行重组连接;所述功能单元包括生物发光共振能量转移供体、linker片段、生物发光共振能量转移受体、蛋白酶识别剪切短肽;
(2)筛选阳性克隆,提取质粒,转化至大肠杆菌感受态细胞中并诱导蛋白高效表达。
(3)破碎细胞提取粗蛋白液,经过多种分离纯化方式得到生物传感器。
在本发明的一些实施方式中,将以下各种功能团的氨基酸序列如SEQ ID NO:1(mNeonGreen),SEQ ID NO:2(NanoLuc),SEQ ID NO:3(Linker)和SEQ ID NO:4(纤溶蛋白酶识别剪切短肽)进行重组连接后,得到的生物传感器的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
当然,本领域技术人员可以在不影响其功能的基础上,加入其他修饰性序列,如标签序列等,以实现固定、筛选、定量或示踪等目的。所述修饰性序列包括但不限于His6组氨酸标签、抗性标签。
在本发明的一些实施方式中,各功能单元的连接方式包括但不限于基于PCR扩增的重组连接。
在本发明的一些实施方式中,阳性克隆的筛选基于卡那霉素的LB平板,当然,也可以根据实际使用需求,使用其他抗性标签对应的平板进行筛选。筛选得到的阳性克隆在提取质粒后可采用测序手段进行再次验证或筛选。
在本发明的一些实施方式中,表达诱导剂使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷,当然,也可以根据实际使用需求,使用其他合适的表达诱导剂诱导生物传感器的表达。
根据本发明的第二个方面,在本发明的一些实施方式中,步骤(3)中还包括破碎细胞后使用柱分离和纯化。
在本发明的一些实施方式中,在柱分离之前,可采用离心等手段去除不溶性蛋白及细胞碎片等。
在本发明的一些实施方式中,分离纯化采用Akta pure及HisTrap excel柱。并在HisTrap excel柱分离后洗脱蛋白,然后使用PD-10脱盐柱脱盐去除咪唑,盐类等小分子,以进一步纯化生物传感器(获得的生物传感器纯度可达95%)。当然,也可以根据实际使用需求,使用其他合适的分离纯化方式得到高纯度的生物传感器。
在本发明的一些实施方式中,所述生物传感器的表达载体包括但不限于大肠杆菌、酵母菌。或采用特定的细胞分泌表达或昆虫表达等方式。
本发明的第三个方面,提供本发明第二个方面所述的生物传感器在如下(1)~(3)任一项中的应用;
(1)蛋白酶定性或定量检测;
(2)蛋白酶抑制剂或靶向物质的筛选;
(3)蛋白酶抑制剂或靶向物质活性的量化比较或效果评估。
在本发明的一些实施方式中,发明人制备得到的生物传感器是以纤溶蛋白酶作为靶标蛋白,当体系中纤溶蛋白酶未达到检测限或不存在纤溶蛋白酶时,在有荧光素酶底物作用下,生物发光能量发生完全转移。而当纤溶蛋白酶达到检测限以上时,在有荧光素酶底物作用下,生物发光能量发生部分转移或完全不转移。通过对这种荧光信号变化进行读取,能够实现对于特定蛋白酶的高灵敏度高特异性定性或定量检测。
纤溶酶属于丝氨酸蛋白酶家族,是人体中参与纤溶系统和凝血系统功能调节一种蛋白水解酶,纤溶酶及其抑制剂往往共同协调,在组织增殖、伤口愈合、排卵受精、细胞黏附、迁移、分化、凋亡、病原体侵袭、肿瘤侵袭、转移等多种生物生理过程中发挥关键作用。此外,纤溶酶还与多种疾病如辐射所致创伤、心血管疾病、肺栓塞炎症、癌症、阿尔茨海默病、艾滋病及严重呼吸道感染冠状病毒2019(Covid-19)等有关。因此,纤溶酶检测及其药物抑制剂筛选在重大疾病的体外诊断及临床治疗指导等方面具有十分重要的意义。
在本发明的一些实施方式中,本发明中的生物传感器还可以针对性的筛选不同的蛋白酶靶标药物或蛋白酶抑制剂,如小分子化合物或蛋白复合物等等。当体系中的蛋白酶浓度固定在一定的阈值时,在有荧光素酶底物作用下,生物发光能量发生部分转移或者完全不发生转移。而随着蛋白酶抑制剂或靶标药物的加入,蛋白酶活性会被抑制,使得短肽无法被蛋白酶有效识别并剪切,此时生物发光共振能量转移效率会逐渐增加,通过采集荧光信号的变化可以筛选出针对特定蛋白酶的高效靶标药物或抑制剂。
在本发明的一些实施方式中,蛋白酶浓度阈值可以根据生物传感器和蛋白酶在体系中的使用量进行优化调整。
在本发明的一些实施方式中,检测体系中加入目标检测物或其抑制剂后应进行充分孵育,孵育时间至少≥10min。在本发明的一些实施方式中,孵育时间为30min。
在一些实施方案中,所述的检测中最大动态范围为传感器和纤溶酶的孵育时间为30min的,该动态范围是随着两者的孵育时间长短而变化的,且随着时间延长,动态范围是变大的。
在一些实施方案中,所述多功能微孔板酶标仪收集荧光信号,该酶标仪的滤光方式可以为波长连续可调的光栅式,固定波长的滤光片式,或者多种融合光路组合形式,相应的参数设置视情况需进行优化调整。
当然,本领域技术人员可以基于本发明中的设计原理,通过调整引入的识别剪切短肽为其他特异性物质,可使本发明中的生物传感器具有检测其他物质的效果,目标检测物包括但不限于蛋白酶,蛋白质,抗原,抗体,核酸,细菌,病毒或重金属等,或者它们任何组合形式。
本发明的有益效果是:
1.本发明提供了一种稳定的生物发光共振能量转移传感器,其通过基因融合表达以及柔性linker引入的方式,缩短BRET供/受体对的空间距离,提高了生物发光共振能量转移效率,使传感器的生物发光共振能量转移效率BRET ratio能高于3.0。
2.本发明提供了一种高灵敏度高特异性的蛋白酶生物发光共振能量转移传感器,该传感器中插入有蛋白酶特异性识别剪切短肽,在光信号能量转移的同时能实现蛋白酶特异性识别和剪切,使得能量转移效率发生改变(相比于传统传感器,提高了BRET动态范围,大大降低了EC50及LOD),实现不同蛋白酶检测,检测范围为10-100pM,检测限LOD可以达到pM级别(0.732pM),半数效应浓度(EC50)为0.241nM。其中,基于其构建得到的纤溶酶BRET生物传感器具有高特异性,具体为仅对plasmin表现出高特异性,而对其他不同蛋白酶特异性较低,其最大动态范围为440.7±14.3%,相比现有的BRET6检测技术存在显著的效果提升。
3.本发明中的纤溶酶BRET生物传感器的表观亲和力常数(Kd,app)为0.225nM,对于纤溶酶具有极高的亲和力。
4.本发明提供了一种生物发光共振能量转移传感器构建方法,该方法性能优异可控,操作简单,易于使用,无需反复洗涤,加样孵育检测即可完成。且通过引入不同蛋白酶特异性识别剪切位点实现不同的蛋白酶检测目的,且检测时无需外源激发光源,仅通过生物自发光提供能量,大大减少发射光源带来的背景干扰信号。
5.本发明中的生物传感器可以有效应用与药物及靶标物质的筛选,通过能量转移效率的改变可以拟合计算半抑制浓度IC50,从而实现快速有效的高通量筛选,且操作简单且易于重复,对于内源性抑制剂anti-plasmin、抑肽酶aprotinin和亮抑酶肽leupeptin均具有极好的筛选效果。
附图说明
图1为实施例1中的生物发光共振能量转移传感器的组成示意图。
图2为实施例1中的生物发光共振能量转移传感器不同情况下的能量转移效率曲线。
图3为实施例1中的生物发光共振能量转移传感器对10nM不同蛋白酶的检测结果曲线图(a)与柱状图(b)。
图4为BLI动力学检测10nM不同蛋白酶的检测结果曲线图。
图5为实施例1中的生物发光共振能量转移传感器对不同浓度的不同蛋白酶的检测结果曲线图与柱状图。
图6为实施例1中的生物发光共振能量转移传感器对不同孵育时间下的纤溶酶检测评估效果,其中,a为不同孵育时间下纤溶酶BRET生物传感器的光谱现象图,b为不同孵育时间下纤溶酶BRET生物传感器的能量转移效率评估。
图7为实施例1中的生物发光共振能量转移传感器对PBS缓冲液中纤溶酶检测效果,其中,a为纤溶酶BRET生物传感器的检测光谱图;b为半数效应浓度EC50非线性拟合曲线;c为工作浓度标准曲线;d为表观亲和力非线性拟合曲线;e为对应的BLI抑制动力学曲线。
图8为实施例1中的生物发光共振能量转移传感器对血浆中纤溶酶检测效果,其中,a为半数效应浓度EC50非线性拟合曲线;b为工作浓度标准曲线;c为表观亲和力非线性拟合曲线。
图9为实施例1中的生物发光共振能量转移传感器对anti-plasmin的半抑制浓度IC50非线性拟合曲线(a)和对应的BLI抑制动力学曲线(b)。
图10为实施例1中的生物发光共振能量转移传感器对抑肽酶aprotinin的半抑制浓度IC50非线性拟合曲线(a)和对应的BLI抑制动力学曲线(b)。
图11为实施例1中的生物发光共振能量转移传感器对亮抑酶肽leupeptin的半抑制浓度IC50非线性拟合曲线(a)和对应的BLI抑制动力学曲线(b)。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰,以下结合具体实施方式,对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是,本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明,并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂,若无特别说明,均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
实施例1一种纤溶蛋白酶生物传感器
(1)生物传感器的制备:
在本发明实施例中,所构建的生物传感器为生物发光共振能量转移传感器,其具体结构如图3所示,该生物传感器的功能元件单元包括生物发光共振能量转移(BRET)供体、BRET受体、连接BRET供/受体的linker片段和纤溶蛋白酶(plasmin)识别剪切短肽KKYKVKE(SEQ ID NO:4)。
在本发明实施例中,BRET供体为荧光素酶NanoLuc,BRET受体为绿色荧光蛋白mNeonGreen,linker片段为柔性长疏水linker(GGS)n。
结构示意图如图1所示。
其中,mNeonGreen的氨基酸序列为:
MVSKGEEDNMASLPATHELHIFGSINGVDFDMVGQGTGNPNDGYEELNLKSTKGDLQFSPWILVPHIGYGFHQYLPYPDGMSPFQAAMVDGSGYQVHRTMQFEDGASLTVNYRYTYEGSHIKGEAQVKGTGFPADGPVMTNSLTAADWCRSKKTYPNDKTIISTFKWSYTTGNGKRYRSTARTTYTFAKPMAANYLKNQPMYVFRKTELKHSKTELNFKEWQKAFTDVMGMDELYK(SEQ ID NO:1)。
NanoLuc的氨基酸序列为:
MVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILA(SEQ ID NO:2)。
linker片段的的氨基酸序列为:
GGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:3)。
具体制备方法为:
在mNeonGreen基因的N端连接His6组氨酸标签和SH3结构域,在mNeonGreen基因的C端连接具有疏水性和一定伸展性的柔性肽链(GGS)n、Plasmin识别剪切短肽、另一段具有疏水性和一定伸展性的柔性肽链(GGS)n、NanoLuc基因,通过PCR扩增手段将上述多个基因片段进行重组并通过一步克隆的方法将重组的基因片段与已经线性化的大肠杆菌表达载体于37℃连接30min,随后通过42℃热处理转化到DH5a感受态细胞,经37℃摇床培养复苏并涂布到含有卡那霉素的LB平板进行筛选,挑取单个菌落进行菌落PCR和双酶切鉴定,对菌落进行液体LB培养基(包含卡那霉素)扩大培养并提取质粒,通过上海生工基因测序找到与目标序列100%—致的基因即为阳性克隆。
其中,目标序列为:
MVSKGEEDNMASLPATHELHIFGSINGVDFDMVGQGTGNPNDGYEELNLKSTKGDLQFSPWILVPHIGYGFHQYLPYPDGMSPFQAAMVDGSGYQVHRTMQFEDGASLTVNYRYTYEGSHIKGEAQVKGTGFPADGPVMTNSLTAADWCRSKKTYPNDKTIISTFKWSYTTGNGKRYRSTARTTYTFAKPMAANYLKNQPMYVFRKTELKHSKTELNFKEWQKAFTDVMGMDELYKGGSGGSGGSGGSGGSGGSKKYKVKEGGSGGSGGSGGSGGSGGSMVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILA(SEQ ID NO:5)。
将测序鉴定正确的质粒42℃热处理转化到BL21(DE3)感受态细胞,经37℃摇床培养复苏并涂布到含有卡那霉素的LB平板进行筛选,挑取单个菌落即为大肠杆菌表达菌株,通过液体LB培养基(包含卡那霉素)于37℃,200rpm扩大培养提取质粒,并进行甘油菌保种冻存-80℃以备用。
取冻存的甘油菌液接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中37℃,200rpm培养过夜活化菌株,其次将活化的菌液按2%接种到新鲜的含有卡那霉素的LB液体培养基中培养至菌液0D600达到0.4-0.6,即到达菌种的对数生长期,然后加入0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导剂于16℃,180rpm下诱导基因高速表达24h。
表达后的菌株于4℃,8000rpm离心15min收集菌体,并弃去上清LB培养基,加入一定量的结合缓冲液(20mM Tris-HCl,150mM氯化钠,20mM咪唑)悬浮菌体后经高压均质机破碎细胞,于4℃,20000rpm高速离心30min分离去除不溶性蛋白及细胞碎片等,获得上清可溶性粗蛋白液。采用Akta pure及HisTrap excel柱分离纯化目的蛋白,HisTrap excel柱中的镍填料与组氨酸标签融合蛋白能特异性结合的原理去除杂蛋白,再通过洗脱缓冲液(20mMTris-HCl,150mM氯化钠,500mM咪唑)线性梯度洗脱的高浓度咪唑竞争性结合到镍填料,逐渐将组氨酸融合蛋白从柱子上洗脱下来,得到的蛋白经PD-10脱盐柱脱盐去除咪唑,盐类等小分子得到纯化的目的蛋白(即为生物传感器),经过蛋白电泳鉴定后,分装液氮速冻后贮存于-80℃备用。
(2)生物传感器性能评估:
取本实施例制备得到的生物传感器,使用多功能微孔板酶标仪测定其光谱学性能。具体操作为:取96孔无吸附白色不透明板配制反应体系,其中,反应体系包括依次加入的1nM生物传感器和10nM不同的蛋白酶(纤溶蛋白酶(Plasmin)、纤维蛋白原(Fibrinogen)、凝血酶(Thrombin)、凝血因子Xa(或称Xa因子蛋白酶,Factor Xa)、尿激酶(Urokinase)),并于常温振荡孵育30min,加入25μM肠腔素400a底物(余量用PBS磷酸缓冲液(pH 7.4)补足),总反应体积为100μL。在加入肠腔素400a底物后立即进行荧光信号检测。设置酶标仪参数为扫描范围400-600nm,步长为1nm,增益值为100。BRET能量转移效率以比值法进行评估,即受体荧光蛋白在500-550nm处的荧光强度除以供体荧光素酶在415-465nm处的荧光强度比值计算得到BRET能量转移效率(BRET ratio)。
结果如图2所示。
可以发现,实施例1中的生物传感器的能量转移效率(BRET ratio)最高能大于3.0。
为了进一步分析其检测动力学,采用Fortebio octet生物膜层光学干涉技术(BLI)进行检测。具体操作步骤为:使用市售NTA传感器(NTA sensor,购于Satorius)特异性识别本实施例制备得到的生物传感器中的His6组氨酸标签,洗涤除去未结合的物质。然后分别使用不同的蛋白酶溶液(10nM)作为目标检测物进行结合,实时监测动力学变化曲线。
结果如图3~4所示。
可以发现,使用实施例1中的生物传感器对纤溶蛋白酶的特异性结合非常强,在10nM纤溶蛋白酶的特异性识别和剪切作用下,能量转移效率能降低81.8%,而该生物传感器对其他蛋白酶的特异性识别较弱。在具体的变化上,凝血酶的能量转移效率仅降低了7.2%,凝血因子Xa仅降低了22.0%,尿激酶则仅仅降低了9.6%,而纤维蛋白原则无降低,说明实施例1中的生物传感器对其他的蛋白酶不具有特异性结合能力(或特异性结合能力较低)。BLI检测结果(图4)与上述检测结果相符,发现上述生物传感器仅对纤溶蛋白酶具有较好的特异性,从而可以说明上述实施例中的生物传感器可以用于纤溶蛋白酶的特异性检测。
为了充分证明上述结果的有效性,发明人采用与上述上述实施例中相同的检测方法分别检测不同浓度(0、1、10和100nM)的不同蛋白酶。其中,体系余量可用PBS磷酸缓冲液或含有0.1%人血浆的PBS磷酸缓冲液均可。
结果如图5所示。
可以发现,即便蛋白酶的浓度发生显著变化,该生物传感器也并不会因此受到干扰,说明上述实施例中的生物传感器具有较好的抗干扰能力,能够准确检测纤溶蛋白酶。
发明人采用与上述相同的检测方法分别基于不同的孵育时间测试上述实施例中的生物传感器的检测效果,其中,纤溶酶浓度设置为10nM,温度为常温,孵育时间分别为0、5、10。20、30、45、60和120min。
结果如图6所示。
可以发现,当孵育时间达到10min时,BRET Ratio的动态范围有很明显的变化。在10-30min趋于稳定,但在孵育时间高于45min后,动态开始呈趋势性下降,说明随着孵育时间延长,检测动态范围会逐渐增大的。而且,基于该结果,发现纤溶酶的快速检测时间至少需要≥10min才能达到比较充足的BRET动态范围,以实现有效的检测。同时,结合图2来看,在孵育时间为30min时,10nM纤溶酶检测的最大动态范围为440.7±14.3%,相比现有的BRET6(最大动态范围约为70%)检测技术提高了约6.3倍左右。
同时,为了评估上述生物传感器对于纤溶蛋白酶的检测灵敏度,发明人以0~100pM的纤溶蛋白酶标准溶液作为检测样品,采用上述检测方法进行检测,并根据BRETratio绘制标准曲线和半数效应浓度EC50非线性拟合曲线。
结果如图7所示。
可以发现,通过将上述生物传感器和10nM的纤溶酶在常温下孵育不同的时间后进行荧光信号收集检测,当孵育时间达到10min时,BRET ratio的动态范围有很明显的变化。在10-30min区间内,BRET ratio趋于稳定。但在孵育时间高于45min后,BRET ratio动态开始呈趋势性下降,说明随着孵育时间延长,检测动态范围会逐渐增大的,而纤溶酶的快速检测时间至少需要≥10min,才能达到比较充足的BRET动态范围实现有效的检测。在孵育时间为30min时,纤溶酶检测的最大动态范围为440.7±14.3%,其相比现有的BRET6(最大动态范围约为70%)检测技术提高了6.3倍左右。
进一步绘制得到的生物传感器对于纤溶蛋白酶的标准浓度工作曲线为:
Y=-0.006310X+2.065;
其中,Y为BRET ratio,X为纤溶蛋白酶标准浓度。R2为0.9712。采用3σ标准评估上述工作曲线可以得到生物传感器的检测范围为10-100pM,最低检测限(LOD)为0.732pM,该LOD比现有BRET6检测技术降低了99.09%(0.732pM vs 0.08nM)。采用GraphPad Prism 9.0数据软件将纤溶蛋白酶浓度及其响应值进行非线性拟合后获得的半数效应浓度(EC50)为0.241nM,表观亲和力常数(Kd,app)为0.225nM,其中EC50相比现有BRET6检测技术降低了49.8%(0.241nM vs 0.48nM),且亲和力常数为nM级别,说明该传感器的亲和力和检测的灵敏度相比现有技术有显著提高,从而可以说明本发明实施例中的生物传感器更适合于纤溶蛋白酶的精准测定。
进一步配制含有0.1%plasmin的人血浆样品,采用上述检测方法进行检测。
结果如图8所示。
可以发现,绘制得到的生物传感器对于纤溶蛋白酶的标准浓度工作曲线为:
Y=-0.009663X+2.240;
其中,Y为BRET ratio,X为纤溶蛋白酶标准浓度。R2为0.9916。采用3σ标准评估上述工作曲线可以得到生物传感器的检测范围为10-100pM,最低检测限(LOD)为0.644pM,该LOD比以PBS缓冲液为背景的检测值降低了13.7%(0.644pM vs 0.732pM)。采用GraphPadPrism 9.0数据软件将纤溶蛋白酶浓度及其响应值进行非线性拟合后获得的半数效应浓度(EC50)为0.374nM,表观亲和力常数(Kd,app)为0.273nM,两者并未产生显著变化,说明上述实施例中的生物传感器在不同的缓冲体系或背景中与蛋白酶的结合力无显著变化,但由于动态范围DR在0.1%血浆中比在PBS缓冲液中高1.2倍(515.8±22.0%vs 440.7±14.3%),但由于表观亲和力Kd,app增大了1.2倍,所以检测灵敏度仅降低了13.7%。
上述生物传感器在蛋白酶抑制剂或相关靶向药物的筛选或效果评估中的应用
为了充分说明上述生物传感器在蛋白酶抑制剂或相关药物的筛选或效果评估中的可行性,发明人分别以2种不同的已知的纤溶蛋白酶靶向抑制剂作为试验对象进行测试。
在下述实施例中,所用生物传感器均为实施例1中的生物传感器。
(1)生物传感器对其内源性抑制剂anti-plasmin的抑制效率评估效果:
反总应体系设置为100μL。取终浓度为10nM的纤溶蛋白酶,加入终浓度为1nM的生物传感器和不同浓度(0、1、4、8、10、15和20nM)的纤溶蛋白酶内源性抑制剂anti-plasmin,于常温振荡孵育30min后,迅速加入25μM肠腔素400a底物,余量使用PBS磷酸缓冲液(pH7.4)进行补足。在加入肠腔素400a底物采用多功能微孔板酶标仪进行荧光信号检测。BRET能量转移效率以比值法进行评估,即受体荧光蛋白在500-550nm处的荧光强度除以供体荧光素酶在415-465nm处的荧光强度比值计算得到BRET能量转移效率(BRET ratio)。采用GraphPad Prism 9.0数据软件将plasmin浓度及其活性抑制率进行非线性拟合。并采用Fortebio octet生物膜层光学干涉技术(BLI)进行动力学检测验证。
结果如图9所示。
可以发现,使用本发明实施例中的生物传感器测得的半抑制浓度(IC50)为10.83nM,而BLI验证结果证实,在anti-plasmin浓度高于10nM时,纤溶蛋白酶的活性基本能被抑制,此时生物传感器与纤溶蛋白酶也处于无结合的状态,而随着抑制剂的浓度降低,纤溶蛋白酶的抑制作用减弱,纤溶蛋白酶对生物传感器的剪切识别能力恢复,剪切后生物传感器的解离速率会逐渐加快。上述结果表明,本发明实施例中的生物传感器能够有效用于测试anti-plasmin对于纤溶蛋白酶的抑制效果,且检测结果准确。
(2)生物传感器对多肽抑制剂抑肽酶aprotinin的抑制效率评估效果:
试验方法同(1),其中,aprotinin的测试浓度设置为0、1、4、8、10、15和20nM。
结果如图10所示。
可以发现,使用本发明实施例中的生物传感器测得的半抑制浓度(IC50)为19.96nM,而BLI验证结果证实,随着抑肽酶aprotinin浓度的增加,纤溶蛋白酶的活性能明显被抑制,纤溶蛋白酶对生物传感器的剪切识别能力变弱,导致剪切后生物传感器的解离速率逐渐减慢。上述结果表明,本发明实施例中的生物传感器能够有效用于测试抑肽酶aprotinin对于纤溶蛋白酶的抑制效果,且检测结果准确。
(3)生物传感器对亮抑酶肽leupeptin的抑制效率评估效果:
试验方法同(1),其中,leupeptin的0nM、1nM、1μM和5μM。
结果如图11所示。
可以发现,使用本发明实施例中的生物传感器测得的半抑制浓度(IC50)为3.941μM,而BLI验证结果证实,随着亮抑酶肽leupeptin浓度的增加,纤溶蛋白酶的活性能明显被抑制,纤溶蛋白酶对生物传感器的剪切识别能力变弱,导致剪切后生物传感器的解离速率逐渐减慢。上述结果表明,本发明实施例中的生物传感器能够有效用于测试亮抑酶肽leupeptin对于纤溶蛋白酶的抑制效果,且检测结果准确。
(4)生物传感器在蛋白酶抑制剂筛选中的应用效果:
在本实施例中,通过内源性抑制剂anti-plasmin和多肽抑制剂抑肽酶aprotinin进行竞争性抑制纤溶蛋白酶活性来模拟正常的药物筛选。
内源性抑制剂anti-plasmin、多肽抑制剂抑肽酶aprotinin和多肽抑制剂亮抑酶肽leupeptin对纤溶蛋白酶活性的抑制试验方法同(1)~(3)。
结果发现,内源性抑制剂anti-plasmin、多肽抑制剂抑肽酶aprotinin和多肽抑制剂亮抑酶肽leupeptin对10nM纤溶蛋白酶的抑制活性存在显著差异,其中,内源性抑制剂anti-plasmin的IC50为10.83nM,多肽抑制剂抑肽酶aprotinin的IC50为19.96nM,多肽抑制剂亮抑酶肽leupeptin的IC50为3.941μM,即抑制相同浓度的plasmin,需要的抑肽酶aprotinin比内源性抑制剂anti-plasmin高1.8倍,需要亮抑酶肽leupeptin比内源性抑制剂anti-plasmin高363.9倍,说明内源性抑制剂anti-plasmin相比抑肽酶aprotinin抑制效果更好,特别是比亮抑酶肽leupeptin的抑制效果有数量级的提升。因此,可以说明使用上述实施例中的生物传感器高效、大通量、快速筛选以纤溶蛋白酶作为药物靶点蛋白的相关抑制剂或药物是可行的,且这种方法可以同样适合于其他不同种类抑制剂的筛选。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种生物传感器,其特征在于,所述生物传感器包括生物发光共振能量转移供体、蛋白酶识别剪切短肽和生物发光共振能量转移受体;
其中,所述蛋白酶识别剪切短肽通过linker片段分别连接生物传感器中的生物发光共振能量转移供体和生物发光共振能量转移受体。
2.根据权利要求1所述的生物传感器,其特征在于,所述蛋白酶识别剪切短肽特异性结合蛋白酶,并被蛋白酶剪切。
3.根据权利要求2所述的生物传感器,其特征在于,所述蛋白酶包括纤溶蛋白酶、凝血酶、细胞凋亡蛋白酶、基质金属蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、冠状病毒主蛋白酶、衣壳蛋白酶。
4.根据权利要求1所述的生物传感器,其特征在于,所述linker片段为疏水性其具有伸展柔性linker,包括(GGS)n、(GS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的生物传感器,其特征在于,所述生物发光共振能量转移供体包括荧光素酶、荧光素酶功能片段或其生物活性变体。
6.根据权利要求5所述的生物传感器,其特征在于,所述荧光素酶包括NanoLuc荧光素酶、萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶、腔肠动物荧光素酶、北美蓝光萤荧光素酶、叩头虫荧光素酶、细菌荧光素酶、水母发光荧光素酶、Gaussia荧光素酶、长腹水蚤荧光素酶、苹果蝇蛆荧光素酶。
7.根据权利要求1所述的生物传感器,其特征在于,所述生物发光共振能量转移受体包括荧光蛋白,小分子荧光染料,荧光纳米材料,荧光微球,标记有荧光蛋白、小分子荧光染料、荧光纳米材料、荧光微球中的至少一种的物质中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的生物传感器,其特征在于,所述荧光蛋白包括mNeonGreen绿色荧光蛋白、Clover系列绿色荧光蛋白、GFP绿色荧光蛋白、BFP蓝色荧光蛋白、CFP青色荧光蛋白、YFP黄色荧光蛋白、EGFP增强型绿色荧光蛋白、Venus、mOrange、Topaz、DsRed、mTFP1、mRFP1、mCherry、TagRFP、TurBoFB,或者其中任何一种的功能片段或生物活性变体。
9.一种生物传感器的制备方法,包括如下步骤:
(1)按照权利要求1~7中任一项所述的生物传感器中的功能单元连接顺序在表达载体中进行重组连接;所述功能单元包括生物发光共振能量转移供体、linker片段、生物发光共振能量转移受体、蛋白酶识别剪切短肽;
(2)筛选阳性克隆,提取质粒,转化至感受态细胞中并诱导蛋白表达。
(3)破碎细胞,提取粗蛋白,即为生物传感器。
10.权利要求1~8任一项所述的生物传感器在如下(1)~(3)任一项中的应用;
(1)蛋白酶定性或定量检测;
(2)蛋白酶抑制剂或靶向物质的筛选;
(3)蛋白酶抑制剂或靶向物质活性的量化比较或效果评估。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210882903.1A CN115850504A (zh) | 2022-07-26 | 2022-07-26 | 一种蛋白酶生物传感器及其在蛋白酶检测和抑制剂筛选中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210882903.1A CN115850504A (zh) | 2022-07-26 | 2022-07-26 | 一种蛋白酶生物传感器及其在蛋白酶检测和抑制剂筛选中的应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115850504A true CN115850504A (zh) | 2023-03-28 |
Family
ID=85660381
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210882903.1A Pending CN115850504A (zh) | 2022-07-26 | 2022-07-26 | 一种蛋白酶生物传感器及其在蛋白酶检测和抑制剂筛选中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115850504A (zh) |
-
2022
- 2022-07-26 CN CN202210882903.1A patent/CN115850504A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR100896987B1 (ko) | 앱타머를 이용한 표적 단백질 검출 방법 및 검출키트 | |
Yao et al. | Quantum dot/bioluminescence resonance energy transfer based highly sensitive detection of proteases | |
KR20230079494A (ko) | 구조적 보완에 의한 바이오발광성의 활성화 | |
KR20070051257A (ko) | 단백질 가수분해 활성과 관련된 진단과 스크리닝 방법 및키트 | |
CN108796041B (zh) | 一种基于生物发光共振能量转移的信号扩增系统及其检测方法 | |
JP2008521442A (ja) | プロテアーゼ活性決定のための、装置および方法。 | |
Felber et al. | Evaluation of the CFP-substrate-YFP system for protease studies: advantages and limitations | |
EP2687847B1 (en) | Probe for analyzing biological tissue and method for utilizing same | |
JP6419576B2 (ja) | プロテアーゼadamts13を切断するフォン・ヴィレブランド因子の検出用ポリペプチド基体 | |
Pang et al. | Bioscreening specific peptide-expressing phage and its application in sensitive dual-mode immunoassay of SARS-CoV-2 spike antigen | |
Deo et al. | Bioluminescence detection of proteolytic bond cleavage by using recombinant aequorin | |
CN115850504A (zh) | 一种蛋白酶生物传感器及其在蛋白酶检测和抑制剂筛选中的应用 | |
CA2415458A1 (en) | Two coloured fluorimetric protease assay | |
CN113025586B (zh) | 一种经改造的萤光素酶突变体蛋白、生物发光探针、探针组、制备方法和检测方法 | |
CN112831479B (zh) | 用于序列特异性蛋白酶检测的分子开关 | |
KR102525012B1 (ko) | 근접 단백질가수분해 반응에 기반한 표적 핵산 검출방법 | |
US10527610B2 (en) | Methodologies for measuring isopeptidase activity in biological samples in a high throughput manner | |
CN112375775A (zh) | 一种基于片段化萤光素酶-dna嵌合体互补的发光体系、构建方法及其应用 | |
Van Damme et al. | Disentanglement of protease substrate repertoires | |
US6566062B1 (en) | Method for identifying a nucleic acid | |
CN113528412B (zh) | 一种基于大肠杆菌细胞表面展示技术的爆炸物可视化生物传感器及其制备方法和应用 | |
CN116068198B (zh) | Ppi原位检测方法及其载体、诊断试剂、试剂盒和应用 | |
WO2023109981A9 (zh) | 新型桡足类荧光素酶突变体及其应用 | |
WO2024000408A1 (zh) | 荧光素酶突变体及其应用 | |
KR101674447B1 (ko) | 프로테아제 센서 및 이를 이용한 프로테아제의 활성 측정 방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |