CN103468822B - 一种腰椎间盘退变相关snp的检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种腰椎间盘退变相关SNP的检测试剂盒。该试剂盒包括以下成分：特异性引物、特异性探针、标准DNA模板、荧光定量PCR反应液。本发明还公开了一种检测腰椎间盘退变相关SNP荧光定量PCR试剂盒的使用方法。利用该试剂盒可以快速定量检测SNP位点的突变情况，从而预测腰椎间盘退变发生情况。本发明操作简便、快速、结果稳定、灵敏度高且特异性强。

Description

一种腰椎间盘退变相关SNP的检测试剂盒

技术领域：

本发明涉及一种SNP检测试剂盒。具体而言，本发明涉一种检测腰椎间盘退变相关SNP的检测试剂盒。

背景技术

腰背部疼痛是临床上的常见疾病和多发病，主要症状是后背的腰骶部的疼痛或不适感，可伴有或不伴有下肢的放射痛，是引起失能最常见原因。在一生中，约80％人群饱受腰背部疼痛的困扰，严重影响了他们的日常工作和生活。其中腰椎间盘退变(lumbar disc degeneration，LDD)为诱因的约占下腰痛的50％，是引起腰背部疼痛的主要原因之一。虽然LDD疾病的发生是遗传和环境因素的共同作用，但具有很大程度的遗传易感性，可能与人群中存在的基因单核酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)有关[Valdes A M，Hassett G，Hart D J，et al.Radiographic progression of lumbar spine disc degeneration is influenced byvariation at inflammatory genes：a candidate SNP association study in the Chingfordcohort[J].Spine，2005，30(21)：2445-2451.]。SNP分布广泛，数量多而且相对稳定地存在于人类染色体上。ADAMTS5基因单核苷酸多态性在腰椎间盘退变性疾病的发生中扮演着非常重要的角色，因而有必要对潜在的发病群体进行筛选，以进一步阐明ADAMTS5基因单核苷酸多态性(SNP)与腰椎间盘退变关系，为预防和诊断疾病提供指导。

基因诊断技术的出现，改变了过去临床上仅依靠相关临床特征为判断依据，有利于疾病的提前预防和确诊。由于腰椎间盘退变是骨科的常见病及多发病之一，其病因复杂，到目前为止还没有诊断腰痛的公认标准，因此对根据相关基因变异，进行分子检测是预防和诊断该病的有效措施。可以作为一个潜在的定量检测和敏感的标记物评估早期腰椎间盘退变的方法。研究表明早期腰椎间盘退变时采用干细胞再生移植，将会是治疗椎间盘退变的最有效的手段，从而缓解腰背部疼痛，因此对腰椎间盘退变的早期诊断和评价十分重要。

发明内容：

为了能够检测出整个社会人群中易患LDD的群体，为易感人群做出预警，尽早采取应对措施，避免LDD的发生，本发明公开了一种可以检测与腰椎间盘退变相关的SNP荧光定量PCR试剂盒。

本发明通过检测489例腰椎间盘退变患者和558份正常人的ADAMTS基因在病例及对照(case-control)中的分布研究，结果显示ADAMTS的3个SNP位点：rs151058(SNP10)，rs229052(SNP11)，rs162502(SNP18)与腰椎间盘退变具有高度相关性。在LDD人群中ADAMTS-5的rs151058(SNP10)处由A突变成G，rs229052(SNP11)处由A突变成G，或rs162502(SNP18)处由G突变成A，而正常人非常小的概率在上述位点发生上述的突变。

本发明根据基因ADAMTS-5的SNP10、SNP11、SNP18三个突变位点区域的DNA序列设计并合成3对引物和位于正反引物之间的荧光探针，所述的荧光探针包括阳性探针和阴性探针，各自标记不同的荧光，阳性探针与突变的DNA链杂交，阴性探针与正常DNA链杂交。上述探针在设计时尽量使不同探针的Tm值尽量位于(45±5)℃，使探针长度位于14-20bp，使每对探针所检测的基因位点位于探针序列中部或中部附近，使探针与相应单链靶基因的结合部位尽量靠近单链靶基因的5’端至中部区域之间以保障杂交效率。探针的5’端有氨基修饰基团，以便与醛基修饰芯片相结合：不同探针的综合参数(探针长度、GC％及Tm值)尽量接近，为了减少杂交时的空间位阻。

本发明公开了针对上述3个ADAMTS-5基因SNP位点rs151058(SNP10)，rs229052(SNP11)和rs162502(SNP18)突变的荧光定量PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括：检测SNP10的引物和探针：上游引物1其序列如序列表SEQ IDNO.1所示；下游引物2其序列如序列表SEQ ID NO.2所示；阳性特异性荧光探针3，其序列如序列表SEQ ID NO.3所示；阴性特异性荧光探针4，其序列如序列表SEQ ID NO.4所示；检测SNP11的引物和探针：上游引物5其序列如序列表SEQ ID NO.5所示；下游引物6其序列如序列表SEQ ID NO.6所示；阳性特异性荧光探针7，其序列如序列表SEQ ID NO.7所示；阴性特异性荧光探针8，其序列如序列表SEQ ID NO.8所示；检测SNP11的引物和探针：上游引物9其序列如序列表SEQ ID NO.9所示，下游引物10其序列如序列表SEQ ID NO.10所示，阳性特异性荧光探针11，其序列如序列表SEQ ID NO.11所示；阴性特异性荧光探针12，其序列如序列表SEQ ID NO.12所示。本发明的试剂盒还包括：荧光定量PCR mix(DBI)；含上述3个SNP位点的突变和未突变的DNA标准品。

所述的荧光探针为Taqman-MGB荧光探针，或者用Taqman荧光探针。

本发明最佳的方式是将荧光定量PCR技术结合Taqman-MGB荧光探针来定量检测ADAMTS-5的点突变。Taqman-MGB荧光探针是一种寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团R和一个淬灭荧光基团Q。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，分离后的报告基团会发出荧光，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

本发明所述的阳性探针5’端标记VIC荧光，阴性探针5’端标记FAM荧光；或者阴性探针5’端标记VIC荧光，阳性探针5’端标记FAM荧光，阳性探针3’端和阴性探针3’端标有荧光淬灭基团BHQ-1。

本发明所述荧光定量PCR试剂盒的使用方法，具体步骤如下：

A)对基因组DNA待测样品在相同反应条件下分别加入阳性或阴性探针进行PCR扩增，监测反应体系中荧光信号的变化；

B)根据浓度已知的标准样品绘制标准曲线，其中横坐标表示起始拷贝数的对数，纵坐标表示Ct值，Ct值为每个反应中的荧光信号到达预设域值时经历的循环数，根据标准曲线与待测样本的曲线进行模板初浓度的测定；

C)根据标准曲线求取不同探针显示的DNA初始反应拷贝数，求取每个探针的至少三个反应所得拷贝数的平均值，确定突变比例，该突变比例为阳性探针荧光显示的拷贝数与两种探针荧光显示的拷贝数之和的比值；不同浓度的样品测得的拷贝数不同，而同一样品的突变比例是不变的，由此可确证样本待检测位点是否发生了突变。

本发明的所述试剂盒具有以下有益效果：

1)本发明所述的试剂盒采用阳性探针和阴性探针组合使用，提高了对待检测基因的灵敏度和准确率。

2)本发明所述的试剂盒将目前难以诊断的腰椎间盘退变检测提高到新的水平，有利于进一步对该疾病进行早期诊断和患病风险的预测。

具体实施方式

实施例1ADAMTS-5基因突变与LDD的相关性及引物开发

1.材料：489份彼此间无血缘关系的LDD患病和558份正常人的外周血，其中240位女性，249位男性，以及558个正常对照，分别为271位女性，287位男性的受测群体；提取外周血DNA，对群体的ADAMTS基因进行克隆。

2.方法：对群体的ADAMTS-5基因进行比对，挖掘SNP位点，利用置信区间模型的统计方法，对不同SNP位点进行群体分析，本发明选取ADAMTS-5的以下20个SNP位点为研究对象：rs229070(SNP1)，rs151065(SNP2)，rs229079(SNP3)，rs226794(SNP4)，rs2830585(SNP5)，rs2830586(SNP6)，rs162499(SNP7)，rs162495(SNP8)，rs162489(SNP9)，rs151058(SNP10)，rs229052(SNP11)，rs229054(SNP12)，rs9984329(SNP13)，rs2249350(SNP14)，rs233896(SNP15)，rs162509(SNP16)，rs162506(SNP17)，rs162502(SNP18)，rs2132824(SNP19)和rs1974415(SNP20)；其中SNP1和SNP2在3’UTR区域，SNP5在外显子区域，SNP19和SNP20在靠近5’区域，其他SNP位点都分布在内含子区域。

3、结果：

1)首先检测本发明选择ADAMTS-5的20个SNP位点与LDD的相关性，结果如表1所示：

表1ADAMTS-5不同SNP位点与LDD关联性分析

LDD：腰椎间盘退变；CTR：对照组；OR：比值；N：数量；％：百分比；95％CI：95％ 置信区间；

*代表P<0.05；

上述结果显示SNP10(P＝0.010)，SNP11(P＝0.095)，SNP18(P＝0.028)与LDD具有很强的关联性；其中SNP10(P＝0.010)，SNP18(P＝0.028)与LDD具有显著的关联性，即在LDD人群中ADAMTS-5的rs151058(SNP10)处由A突变成G，rs229052(SNP11)处由A突变成G，或rs162502(SNP18)处由G突变成A，而正常人非常小的概率在上述位点发生上述的突变。本发明对上述数据进行了10000次排列检验，结果表明LDD与控制群体的基因型的关联性P值为0.0419；

2)对上述ADAMTS-5基因的20个SNP位点在case-control实验中的分布进行LD区域检验，根据置信区间模型发现共有6个连锁不平衡区域：分布于SNP1-SNP2；SNP3-SNP8；SNP10-SNP11；SNP12-SNP14；SNP15-SNP16；SNP18-SNP19(D’>0.9and r2>0.8)。

3)在对上述与LDD有较高关联性的3个SNP(SNP10、SNP11、SNP18间的相互作用研究时，发现SNP10位点与SNP18位点相互作用时，在case-control分析中都与LDD显示出了极高的相关性(在95％置信区间达到显著水平)，在位点相互作用关系的分析结果如表2所示：

表2 ADAMTS-5的3个SNP点相互作用研究

LDD：腰椎间盘退变；CTR：对照；OR：比率；95％CI：95％置信区间；

^#□2＝4.940,df=2，10000次排列检验调整后P＝0.085；

^$□2＝9.233,df＝2，10000次排列检验调整后P＝0.019；

以上结果显示位点SNP10和位点SNP18均发生突变时，该情况下显示出与LDD病变非常显著的关联性。

实施2 检测ADAMTS-5多位点突变的荧光定量PCR试剂盒的组装

根据实施例1所述的ADAMTS-53个SNP位点：SNP10、SNP11、SNP18及其附近的DNA序列设计的两对正反引物，引物间的序列设计阴性和阳性探针；位点1检测SNP10：上游引物1其序列如序列表SEQ ID NO.1所示，下游引物2其序列如序列表SEQ ID NO.2所示，阳性特异性荧光探针3，其序列如序列表SEQ ID NO.3所示；阴性特异性荧光探针4，其序列如序列表SEQ ID NO.4所示；位点2检测SNP11：上游引物5其序列如序列表SEQ ID NO.5所示，下游引物6其序列如序列表SEQ ID NO.6所示，阳性特异性荧光探针7，其序列如序列表SEQ ID NO.7所示；阴性特异性荧光探针8，其序列如序列表SEQ ID NO.8所示；位点3检测SNP18：上游引物9其序列如序列表SEQ ID NO.9所示；下游引物10其序列如序列表SEQ ID NO.10所示；阳性特异性荧光探针11，其序列如序列表SEQ ID NO.11所示；阴性特异性荧光探针12，其序列如序列表SEQID NO.12所示；引物及荧光探针均由上海生物工程公司合成；荧光定量PCR mix(DBI)；标准样品：含上述3个SNP位点的突变和为突变DNA。序列如SEQNO.1-12所示的PCR引物及探针分装，荧光定量PCR mix组配后制得试剂盒。上述阳性探针5’端优选标记VIC荧光，阴性探针5’端优选标记FAM荧光；阳性探针3’端和阴性探针3’端标有荧光淬灭基团BHQ-1。

试剂盒可使用10、20、50的反应体系：

10ul反应体系：

反应条件为：

50℃，2分钟；92℃，10分钟；94℃，30秒；60℃，30秒；后两步共50个循环。

20ul反应体系：

反应条件为：

50℃，2分钟；92℃，10分钟；94℃，30秒；60℃，30秒；后两步共50个循环。

50ul反应体系：

反应条件为：

50℃，2分钟；92℃，10分钟；94℃，30秒；60℃，30秒；后两步共50个循环。

上述模板为：标准样品或待测样品的DNA；上述反应体系中荧光探针为阳性探针或者阴性探针；以上实施例中，荧光定量PCR反应基础试剂选用2*MasterMix，可购买自美国Applied Biosystems公司，或者选用自制的或其他公司提供的荧光定量PCR反应基础试剂。

本发明的前期实验证明通过阳性探针与阴性探针对同一样品同时检测，可使对样品的检测的准确性达到100％。

实施例3 检测ADAMTS多位点突变的荧光定量PCR试剂盒的临床检测

为检测实施例2所述的试剂盒对LDD疾病的检测效率，选取临床200例患者和200例正常人检测，结果显示200例患者中有196例SNP10位点突变(即rs151058位点由A突变成G)、198例SNP11位点突变(即rs229052位点由A突变成G)、有197例SNP18位点突变(即rs162502处由G突变成A)，193例患者其SNP10位点和SNP18位点都发生了突变。200例正常人中有2例发生SNP10突变，1例发生SNP11突变，1例发生SNP18突变，未发现有SNP10、SNP11和SNP183位点都突变的样本个体。

以上结果与基因测序结果完全相同，说明本发明的试剂盒的准确率达100％。

Claims (7)

1.一种针对SNP位点检测的试剂在制备检测腰椎间盘退变试剂盒中的应用，其特征在于，所述SNP位点为以下位点的一个或多个，其在GeneBank中的编号分别为：rs151058、rs229052、rs162502；所述试剂为检测SNP位点突变的特异性引物及特异性探针；所述特异性引物包括上游引物和下游引物，所述特异性探针包括阳性探针和阴性探针；

对于rs151058来说，所述特异性引物及特异性探针分别为上游引物1其序列如序列表SEQ ID NO.1所示，下游引物2其序列如序列表SEQ ID NO.2所示，阳性特异性荧光探针3，其序列如序列表SEQ ID NO.3所示，阴性特异性荧光探针4，其序列如序列表SEQ IDNO.4所示；

对于rs229052来说，所述特异性引物及特异性探针分别为上游引物5其序列如序列表SEQ ID NO.5所示，下游引物6其序列如序列表SEQ ID NO.6所示，阳性特异性荧光探针7，其序列如序列表SEQ ID NO.7所示，阴性特异性荧光探针8，其序列如序列表SEQ ID NO.8所示；

对于rs162502来说，所述特异性引物及特异性探针分别为上游引物9其序列如序列表SEQ ID NO.9所示，下游引物10其序列如序列表SEQ ID NO.10所示，阳性特异性荧光探针11，其序列如序列表SEQ ID NO.11所示，阴性特异性荧光探针12，其序列如序列表SEQ ID NO.12所示。

2.一种检测ADAMTS-5基因SNP位点突变的特异性引物及特异性探针，其特征在于，所述的特异性引物及特异性探针为3组，其中每组特异性引物包括上游引物和下游引物，特异性探针包括阳性探针和阴性探针；

其中第一组特异性引物及特异性探针分别为上游引物1其序列如序列表SEQ ID NO.1所示，下游引物2其序列如序列表SEQ ID NO.2所示，阳性特异性荧光探针3，其序列如序列表SEQ ID NO.3所示，阴性特异性荧光探针4，其序列如序列表SEQ ID NO.4所示；

其中第二组特异性引物及特异性探针分别为上游引物5其序列如序列表SEQ ID NO.5所示，下游引物6其序列如序列表SEQ ID NO.6所示，阳性特异性荧光探针7，其序列如序列表SEQ ID NO.7所示，阴性特异性荧光探针8，其 序列如序列表SEQ IDNO.8所示；

其中第三组特异性引物及特异性探针分别为上游引物9其序列如序列表SEQ ID NO.9所示，下游引物10其序列如序列表SEQ ID NO.10所示，阳性特异性荧光探针11，其序列如序列表SEQ ID NO.11所示，阴性特异性荧光探针12，其序列如序列表SEQ ID NO.12所示。

3.根据权利要求2所述的检测ADAMTS-5基因SNP位点突变的特异性引物及特异性探针，其特征在于，所述的阳性探针5’端标记VIC荧光，阴性探针5’端标记FAM荧光，阳性探针3’端和阴性探针3’端标有荧光淬灭基团BHQ-1；或者阴性探针5’端标记VIC荧光，阳性探针5’端标记FAM荧光，阳性探针3’端和阴性探针3’端标有荧光淬灭基团BHQ-1。

4.权利要求2或3中任意一项所述的检测ADAMTS-5基因SNP位点突变的特异性引物及特异性探针，在制备检测腰椎间盘退变试剂盒中的用途。

5.一种检测腰椎间盘退变的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求2所述的任意一组、或多组特异性引物及特异性探针。

6.根据权利要求5所述的一种检测腰椎间盘退变的荧光定量PCR试剂盒，还包括：荧光定量PCR mix；含ADAMTS-5基因rs151058位点、rs162502位点和rs229052的突变和未突变的DNA标准品。

7.一种非诊断目的的检测ADAMTS-5基因rs151058位点、rs229052位点和/或rs162502位点的方法，具体包括以下步骤：

A)对基因组DNA待测样品在相同反应条件下分别加入阳性或阴性探针进行PCR扩增，监测反应体系中荧光信号的变化；对于rs151058位点来说，PCR扩增过程中，使用的扩增引物序列如下：上游引物序列如序列表SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如序列表SEQ ID NO.2所示；特异性探针序列如下：阳性特异性荧光探针序列如序列表SEQ ID NO.3所示，阴性特异性荧光探针序列如序列表SEQ ID NO.4所示；对于rs229052位点来说，PCR扩增过程中，使用的 扩增引物序列如下：上游引物序列如序列表SEQ ID NO.5所示，下游引物序列如序列表SEQ ID NO.6所示；特异性探针序列如下：阳性特异性荧光探针序列如序列表SEQ ID NO.7所示，阴性特异性荧光探针序列如序列表SEQ ID NO.8所示；对于rs162502位点来说，上游引物序列如序列表SEQ ID NO.9所示，下游引物序列如序列表SEQ IDNO.10所示；特异性探针序列如下：阳性特异性荧光探针序列如序列表SEQ ID NO.11所示，阴性特异性荧光探针序列如序列表SEQ ID NO.12所示;

B)根据浓度已知的标准样品绘制标准曲线，其中横坐标表示起始拷贝数的对数，纵坐标表示Ct值，Ct值为每个反应中的荧光信号到达预设域值时经历的循环数，根据标准曲线与待测样本的曲线进行模板初浓度的测定;

C)根据标准曲线求取不同探针显示的DNA初始反应拷贝数，求取每个探针的至少三个反应所得拷贝数的平均值，确定突变比例，该突变比例为阳性探针荧光显示的拷贝数与两种探针荧光显示的拷贝数之和的比值；不同浓度的样品测得的拷贝数不同，而同一样品的突变比例是不变的，由此可确证样本待检测位点是否发生了突变。